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JP2016124845A - ワサビ抽出物とその製造方法、及び整肌剤 - Google Patents

ワサビ抽出物とその製造方法、及び整肌剤 Download PDF

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JP2016124845A JP2015001351A JP2015001351A JP2016124845A JP 2016124845 A JP2016124845 A JP 2016124845A JP 2015001351 A JP2015001351 A JP 2015001351A JP 2015001351 A JP2015001351 A JP 2015001351A JP 2016124845 A JP2016124845 A JP 2016124845A
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Abstract

【課題】本発明は、安全性が高く、肌の状態を整えることができるワサビ抽出物及び整肌剤を提供すると共に、安全性が高く、肌の状態を整えることができ、かつ効率的な抽出が可能なワサビ抽出物の製造方法を提供する。【解決手段】葉ワサビの根部分、茎部分及び葉部分のそれぞれの機能性を評価した上で、葉部分に着目し、葉部分について抽出溶媒のエタノール濃度を変えて、更に詳細に調べ、葉ワサビの葉部分の機能を効率的に抽出することができるようにした。【選択図】なし

Description

本発明は、ワサビ抽出物とその製造方法、及び整肌剤に関する。詳しくは、安全性が高く、肌の状態を整えることができるワサビ抽出物及び整肌剤を提供すると共に、安全性が高く、肌の状態を整えることができ、かつ効率的な抽出が可能なワサビ抽出物の製造方法に関するものである。
ワサビは、独特の辛さ及び香りから、古来より薬味として珍重され、近代においては、刺身や寿司などを食する際には、不可欠な食材である。
また、ワサビの茎は、ワサビの醤油漬けや粕漬けとして利用され、花は高値で刺身を盛り付ける際の飾り花として使われる。
しかし、葉の部分は、硬くて苦みがあるので、食べづらく、廃棄処分にされており、いわゆる未利用資源であった。このため、ワサビの葉の部分を有効に活用する方法の発明が期待されており、例えば、特許文献1に示すように、ワサビの等の根菜類の根、茎及び葉から選択される1または2以上の部位からの抽出物に痩身の効果が見出されている。
特開2012−111740号公報
しかしながら、特許文献1の発明は、ワサビの根、茎及び葉の部分について、詳細な各部位ごとの比較を行ったものではなく、ワサビを全体として、単に根菜類の中の一つとして挙げているにすぎない。このため、ワサビの葉部分の機能を十分に解明したものとは言えず、ワサビの葉部分を有効に活用するには至っていない。
本発明は、以上の点に鑑みて発明されたものであり、ワサビ抽出物とその製造方法、及び整肌剤に関する。詳しくは、安全性が高く、肌の状態を整えることができるワサビ抽出物及び整肌剤を提供すると共に、安全性が高く、肌の状態を整えることができ、かつ効率的な抽出が可能なワサビ抽出物の製造方法を提供することを目的とする。
上記の目的を達成するために、本発明の保湿効果を有するワサビ抽出物は、エタノール若しくはエタノール含有溶媒を用いて、ワサビの葉部分から抽出される。
ここで、エタノール若しくはエタノール含有溶媒を用いることによって、ワサビの葉部分に含まれる脂溶性の物質が抽出されやすくなる。
また、ワサビの葉部分から抽出されることによって、自然由来の天然成分を抽出することとなり、安全性を確保しやすくなる。
また、保湿効果を有するワサビ抽出物が、20vol%から30vol%の間の値のエタノール濃度で抽出される場合には、ヒアルロン酸生産能を高めることができる。
また、保湿効果を有するワサビ抽出物が、70vol%から80vol%の間の値のエタノール濃度で抽出される場合にも、ヒアルロン酸産生能を高めることができる。
また、上記の目的を達成するために、本発明の抗菌活性を有するワサビ抽出物は、エタノール若しくはエタノール含有溶媒を用いて、ワサビの葉部分から抽出される。
ここで、エタノール若しくはエタノール含有溶媒を用いることによって、ワサビの葉部分に含まれる脂溶性の物質が抽出されやすくなる。
また、ワサビの葉部分から抽出されることによって、自然由来の天然成分を抽出することとなり、安全性を確保しやすくなる。
また、抗菌活性を有するワサビ抽出物が、70vol%以上のエタノール濃度で抽出される場合には、菌の増殖を効果的に抑えることができる。
また、上記の目的を達成するために、本発明の抗酸化活性を有するワサビ抽出物は、エタノール若しくはエタノール含有溶媒を用いて、ワサビの葉の部分から抽出される。
ここで、エタノール若しくはエタノール含有溶媒を用いることによって、ワサビの葉部分に含まれる脂溶性の物質が抽出されやすくなる。
また、ワサビの葉部分から抽出されることによって、自然由来の天然成分を抽出することとなり、安全性を確保しやすくなる。
また、抗酸化活性を有するワサビ抽出物が、40vol%から80vol%の間の値のエタノール濃度で抽出された場合には、活性酸素の発生を効果的に抑えることができる。
また、上記の目的を達成するために、本発明のリパーゼ阻害活性を有するワサビ抽出物は、エタノール若しくはエタノール含有溶媒を用いて、ワサビの葉部分から抽出される。
ここで、エタノール若しくはエタノール含有溶媒を用いることによって、ワサビの葉部分に含まれる脂溶性の物質が抽出されやすくなる。
また、ワサビの葉部分から抽出されることによって、自然由来の天然成分を抽出することとなり、安全性を確保しやすくなる。
また、リパーゼ阻害活性を有するワサビ抽出物が、90vol%から100vol%の間の値のエタノール濃度で抽出される場合には、脂肪の分解、吸収を抑えることができる。
また、抗菌活性、抗酸化活性、リパーゼ阻害活性及び保湿効果のうち、2以上の機能を有する場合には、多機能なワサビ抽出物及び整肌剤を製造することができる。
また、上記の目的を達成するために、本発明の整肌剤は、エタノール若しくはエタノール含有溶媒を用いて、ワサビの葉部分から抽出された、抗菌活性、抗酸化活性、リパーゼ阻害活性及び保湿効果のうち、少なくとも1つの機能を含むワサビ抽出物を有する。
ここで、エタノール若しくはエタノール含有溶媒を用いることによって、ワサビの葉部分に含まれる脂溶性の物質が抽出されやすくなる。
また、ワサビの葉部分から抽出されることによって、自然由来の天然成分を抽出することとなり、安全性を確保しやすくなる。
また、抗菌活性、抗酸化活性、リパーゼ阻害活性及び保湿効果のうち、少なくとも1つの機能を含むことによって、特定の機能に特化した整肌剤を製造することができる。
また、上記の目的を達成するために、本発明のワサビ抽出物の製造方法は、ワサビの葉部分を乾燥、粉末化したものからエタノール若しくはエタノール含有溶媒を用いて抽出する工程を備える。
ここで、ワサビの葉部分を乾燥、粉末化することによって、効率的に抽出できる。
また、エタノール若しくはエタノール含有溶媒を用いることによって、ワサビの葉部分に含まれる脂溶性の物質を抽出しやすくする。
また、ワサビの葉部分から抽出されることによって、自然由来の天然成分を抽出することとなり、安全性を確保しやすくなる。
本発明のワサビ抽出物及び整肌剤は、安全性が高く、肌の状態を整えることができ、本発明のワサビ抽出物の製造方法は、安全性が高く、肌の状態を整えることができ、かつ効率的な抽出が可能な方法となっている。
葉ワサビの抗酸化活性を、部位別に表した図である。 葉ワサビの抗菌活性を、部位別に表した図である。 葉ワサビの、メラノーマ細胞の細胞生存率とメラニン生合成量との対比図である。 葉ワサビのリパーゼ活性を、部位別に表した図である。 葉ワサビ抽出物にA23187を加え、βヘキソサミニダーゼの放出量を表した図である。 葉ワサビ抽出物に、抗原であるDNPを加え、βヘキソサミニダーゼの放出量を表した図である。 MTT試験による、葉ワサビ抽出物の細胞毒性を測定した結果を表した図である。 葉ワサビの葉部分のヒアルロン酸産生量と、神経が細胞の細胞生存率との対比図である。 葉ワサビの葉部分の抗菌活性を表した図である。 葉ワサビの葉部分のリパーゼ活性を表した図である。 葉ワサビの葉部分の抗酸化活性を表した図である。
以下、本発明の実施の形態について図1ないし図5を参照しながら説明し、本発明の理解に供する。
葉ワサビの各部位の機能性試験
本発明のワサビの抽出物について、発明者はまず、抗酸化活性、抗菌活性、メラニン生合成阻害活性、リパーゼ阻害活性、抗アレルギー、抗炎症の各機能性などの、肌の状態を整える機能の有無を調べるため、葉ワサビの葉、茎、根の部位をそれぞれ比較し、評価した。
〔抽出物の抽出方法〕
以下に行う試験に共通して用いられる試料は、以下のようにして得た。
葉ワサビを葉、茎、根に分け、マイナス20度で冷凍した後、凍結乾燥機にてフリーズドライになるまで凍結乾燥を行った。
凍結乾燥した各部位を、それぞれ2〜3gずつ秤量し、50vol%エタノール水溶液を100mlずつ添加した。その後、180rpmの速度で、48時間、振とう抽出した。
次に、この抽出物を濃縮し、乾固物を得た。
具体的には、上記の振とう抽出後、吸引濾過にて抽出液を回収した。そして、ロータリーエバポレータにて抽出液を濃縮し、溶媒除去を行った。その後、溶媒除去した濃縮液をマイナス80℃のディープフリーザにて冷凍後、凍結乾燥機で乾固し、試料を得た。
〔抗酸化活性試験〕
体内に取り入れられた酸素の一部は、活性酸素となることはすでに知られている。この活性酸素が過剰に生成されると、フリーラジカルとなり、細胞機能を攻撃し、慢性疾患や疫病が発生する。
一方、抗酸化物質などを用いて、活性酸素が過剰に生成されることを抑えることができれば、フリーラジカルの生成を抑えることができ、生体恒常性の維持を図ることができる。
<試験方法>
ORAC法を用いて、蛍光強度を図ることで抗酸化活性を測定した。
ORAC法は、フルオレセインの、485nmの波長を当てられて励起すると、520nm付近の波長の光を発するという性質を利用して行う測定法である。
具体的には、まず、ラジカル発生剤であるAAPH(2,2'−アゾビス(2−アミノプロパン)二塩酸塩)を用いて、ペルオキシラジカルを発生させる。ペルオキシラジカルによって、標識物質であるフルオレセインが酸化されると、フルオレセインから発していた光は、消光する。
ここで、抗酸化物質が存在すると、ペルオキシラジカルは消失され、ペルオキシラジカルによって酸化されるフルオレセインの消光スピードが遅くなる。この消光スピードの遅延する程度を測定し、抗酸化活性として評価する方法である。
<サンプル溶液の調整>
試料を秤量し、濃度が(1mg/1mL)になるよう、リン酸緩衝液に溶解し、これを原液として、希釈した。
<試験結果>
各部位の、抗酸化活性試験を行った結果を、図1に示す。図1は、抽出物 1mg中の相対ORAC値(平均±SD)(n=4)を表す。
図1において、もっとも高い、相対ORAC値を示したのが、葉部分の「0.041±0.0022(mgTE/mg)」であった。
このことから、葉ワサビの葉部分から高い抗酸化活性を有する成分が含まれていることが分かった。
〔抗菌活性試験〕
抗菌活性は、皮膚表面の常在菌である、アレルギーの原因となる菌の増殖を防ぐ性質を有する。本試験では、大腸菌(E.coli)、及び黄色ブドウ球菌(S.aureus)の増殖に与える影響から、各部位の抗菌活性を評価した。
<試験方法>
各部位の抽出物を、DMSO(dimethylsulfoxide ジメチルスルホキシド)に溶解させ、80mg/mLの濃度に調整した。また、抽出物を含まないDMSOをネガティブコントロールとして、ソルビン酸をポジティブコントロールとして用いた。
黄色ブドウ球菌や大腸菌を、5mLのNB(Nutrient broth 普通ブイヨン)培地に浸して菌液を作り、これを120rpm、37℃で約18時間、浸透培養させ、定常期の菌体を得た。
得られた定常期の培養液をNB培地で希釈し、OD660=0.4になるよう調製した(E.coli:10CFU/mL、S.aureus:10CFU/mL)。さらに、これを滅菌水で希釈し、菌濃度が10CFU/mLである菌液として、抗菌試験に用いた。なお、菌濃度は、660nmの波長の光を当て、菌液の濁り度から、菌液の濁度を測定して行った。この場合、濁り度が高いほど、菌の数が多いことになる。
更に、この菌液40μ?に、NB培地256μ?と葉ワサビの各部位の試料4μ?を加え、約5秒間攪拌した。なお、上記を混合した溶液の濃度は800μg/mlである。
その後、菌の濃度を均一に保ちながら、37℃で18時間、1150rpmの回転速度で、振とう培養し、630nmの波長の光を当て、菌液の濁度を測定した。
<試験結果>
黄色ブドウ球菌による濁度を、各部位ごとの試料を用いて測定した結果を図2示すように、葉部分の試料が、最も濁度が低いという結果が出た。なお、図2の( )内は最終濃度(μg/mL)を表し、コントロールと各抽出物間の有意差はt検定により判定した。( :*P<0.05 **P<0.01)
これにより、葉部分には、根部分や茎部分と比べて、黄色ブドウ球菌及び大腸菌に対して、強い増殖抑制作用(抗菌活性)を有することが分かった。
〔メラニン生合成阻害試験〕
皮膚に紫外線を浴びると、皮膚の基底層にあるメラノサイトからメラニンが作られ、シミの原因となる。メラニンは、メラノーマ細胞で作られるため、メラノーマ細胞のメラニン生合成を阻害することができれば、シミの発生を防止することができる。
<試験方法>
葉ワサビの各部位の50%エタノール抽出物をDMSOに溶解させ、濃度を80mg/mL、濃度40mg/mL、及び濃度20mg/mLの、3種類の試料を、葉、茎及び根の部位ごとに全部で9種類作った。
濃度1.0×10cells/mLのB16メラノーマ細胞を、ウェルプレートの各ウェルに1mLずつ播種し、37℃に設定された、5%COインキュベータ内で、24時間静置培養した。
ここで、培養したメラノーマ細胞の一部を、メラニン生成量を測定するための試験に用い、残りを、細胞生存率を測定するための試験に用いた。以下、それぞれに説明する。
〔メラニン生合成量 測定試験〕
上記のウェルプレートからEMEM培地(Eagle'S minimal essential medium イーグル最少必須培地)を除き、NaOH水溶液を加える。NaOH水溶液が強アルカリ性である性質を利用して、メラニンを溶出させるためである。
<細胞還元力 測定試験>
上記のウェルプレートからEMEM培地を除き、MTT−PBS溶液を加える。MTT−PBS溶液は、生きている細胞の中に取り込まれると、還元されて、色を発して沈殿する。この性質を利用して、生きた細胞の還元力を測定する。
また、細胞の還元力というのは、細胞の数に比例するので、細胞の還元力を測定することで、細胞の生存率を測定することができる。なお、塩酸を加えて、発色を強めることができるので、より測定しやすくしている。
<試験結果>
以上の試験を行ったサンプルを、プレートリーダで測定した。その結果を、図3に示す。
なお、図3の白い棒グラフは、細胞生存率を示し、黒い棒グラフは、メラニン含有量を示す。
図3から、根部分の、濃度160μg/mlのサンプルに、約80%の細胞生存率を保ったまま、メラニン生合成を約50%に抑える成分が含まれていることが分かった。
次に、葉部分の、濃度40μg/mlのサンプルに、根部分の、濃度160μg/mlのサンプルと同程度の細胞生存率(約80%)を保ちながら、メラニン生合成を約65%に抑える成分が含まれていることが分かった。
葉部分の、濃度160μg/ml及び濃度80μg/mlのサンプルでは、細胞生存率が約30%と極めて低いため、細胞毒性を有する成分が含まれていることが推認される。
また、茎部分は、全ての濃度において、細胞生存率は約90%と高いが、メラニン含有量も85〜110%と高いため、メラノーマ細胞のメラニン生合成を阻害する成分は含まれていないと考えられる。
また、根部分の濃度80μg/ml及び40μg/mlのサンプルでは、細胞生存率は90〜95%と高いが、メラニン含有量が80〜90%と高いため、メラノーマ細胞のメラニン生合成を充分に阻害するする成分は含まれていないと考えられる。
以上により、濃度160μg/mlの根部分、及び濃度40μg/mlの葉部分において、細胞にダメージを与えずに、効果的にメラニン生合成阻害する成分が含まれていることが確認された。
<リパーゼ阻害活性試験>
リパーゼは脂肪(トリグリセライド)を分解する酵素であることは、良く知られている。人間の皮膚に存在するリパーゼが、皮膚の脂肪分を分解すると、脂肪酸が産生され、毛穴の閉塞やニキビの原因となる。
ニキビが一旦発生してしまうと、ニキビ菌がリパーゼを出し、トリグリセライドを分解して、脂肪酸を遊離させる。このため、更にニキビ菌が繁殖しやすい環境が作られ、肌が荒れてしまう。
したがって、リパーゼが脂肪を分解する働きを阻害することができれば、ニキビ菌の繁殖を抑えることができ、肌の状態が整えられる。
<試験方法>
トリグリセライドが膵リパーゼ溶液と反応し、エステル結合の部分で分離すると、蛍光物質が生じる。この蛍光物質は、355nmの波長の光を当てると、励起し、460nmの蛍光色の光を発する。この光の蛍光強度を測定することで、リパーゼ活性に与える影響を評価する。
葉ワサビの葉部分の抽出物溶液25μLに、0.1mM4−methylumbelliferyl oleate(4−メチルウンベリフェリルオレアート;4−MUO 13mM Tris−HCl,150mM NaCl,1.3mM CaCl緩衝液)溶液50μLと、150μg/mL膵臓由来リパーゼ25μLとを混合した。
その後、25℃に設定されたインキュベータ内で約30分静置した。
<試験結果>
葉、茎及び根の各部位ごとにそれぞれ、濃度0.6mg/ml、1.2mg/ml及び2.4mg/mlの、3種類の濃度について測定した結果を、図4に示す。なお、ポジティブコントロールとして用いたorlistatの濃度の単位は、μg/mlである。
図4から、リパーゼ活性は、葉部分の濃度2.4mg/mlのサンプルが最も低い値を(約10%)を示した。また、葉部分の濃度1.2mg/mlのサンプルにおいても、リパーゼ活性が約35%という低い値を示した。
特に、葉部分のサンプルの中で最も高いリパーゼ活性を示した、濃度0.6mg/mlのサンプルであっても、根部分や茎部分のサンプルと比較すると、同等若しくはやや強いリパーゼ阻害活性を示し、根部分や茎部分と比較すると、非常に顕著な結果が得られた。
以上のことから、葉部分には、リパーゼ活性を阻害する成分が多く含まれることが考えられる。
<抗アレルギー・抗炎症試験>
細胞内にカルシウムが入り込み、生体内のカルシウムの濃度が高まると、アレルギー反応が引き起こされることは、既に知られている。
A23187(カルシウムイオノホア)は、カルシウムの透過性を高めるための試薬である。RBL−2H3細胞にA23187を加えると、培地中に含まれるカルシウムが、RBL−2H3細胞の中に入り込み、βヘキソサミニダーゼという酵素が放出(アレルギー反応)され、いわゆる脱顆粒という現象が起こる。
βヘキソサミニダーゼの放出を抑えることができる物質があれば、抗アレルギー作用があるとして、花粉症やアレルギー対策として用いることができると考えられる。
<試験方法>
アレルギーの反応は、現在さまざまなタイプのものが確認されている。このため、本試験においては、アレルギー反応の主要なメカニズムである、A23187によるβ―ヘキソサミニダーゼの放出率と、DNP−BSAと抗DNP IgEによるβ―ヘキソサミニダーゼの放出率について試験を行った。
RBL−2H3細胞(ラット肥満細胞様細胞株)からIgE刺激によって放出される、RBL−2H3細胞に含まれる顆粒中のβヘキソサミニダーゼ活性を測定し、その抑制作用を検討した。
ウェルプレートにRBL−2H3細胞を分注し、葉ワサビの試料に30分浸した後、A23187を加え、さらに30分浸した。そして、基質(p−nitrophenyl−n−acethyl−β−D−glucosaminide p−ニトロフェニル−N−アセチル−β−D−グルコサミニド)を50μ?添加し、室温で1時間、培養し、その後、405nmの波長を当て、吸光度を測定した。
ウェルプレートに、抗DNP IgEを分注し、葉ワサビの試料に30分浸した後、DNP−BSAを添加し、30分浸した。そして、基質(p−nitrophenyl−n−acethyl−β−D−glucosaminide)を50μL添加し、室温で1時間培養し、その後、405nmの波長を当て、吸光度を測定した。
<試験結果>
上記の試験の結果を図5Aないし図5Cに表わす。図5Aは、葉ワサビ抽出物にA23187を加え、βヘキソサミニダーゼの放出量を表した図である。図5Bは、葉ワサビ抽出物に、抗原であるDNPを加え、βヘキソサミニダーゼの放出量を表した図である。図5Cは、MTT試験による細胞毒性を測定した結果を表した図である。
なお、ネガティブコントロールは、A23187を添加していない試料を用いた結果であり、ポジティブコントロールは、A23187を添加した試料を用いた結果である。
また、試験結果の比較のため、抗炎症作用を有する医薬品である、Gallic acid(没食子酸)、及びQuercetin(クエルセチン)のデータを掲載した。
図5A及び図5Bから、葉部分の試料を用いた場合に、根部分及び茎部分よりも、βヘキソサミニダーゼ活性に対するもっとも強い抑制が見られた。
なお、図5Cに示すように、葉ワサビの抽出物の細胞毒性は確認されなかったことを付言する。
以上の、抗酸化試験、抗菌試験、メラニン生合成阻害活性試験、リパーゼ阻害活性試験、抗アレルギー、抗炎症試験において、葉部分の抽出物を試料として用いた場合が、もっとも顕著な値を示すことがわかった。
そこで、出願人は、葉ワサビの葉部分に着目し、葉部分の機能を、更に詳細に調べるため、エタノールの濃度を変えて抽出した試料を用いて、以下の試験を行った。
〔抽出物の抽出方法及び試料〕
葉ワサビの凍結乾燥物を約2g秤量し、エタノール0vol%(水100vol%)、エタノール25vol%(水75vol%)、エタノール50vol%(水50vol%)、エタノール75vol%(水25vol%)、エタノール100vol%(水0vol%)の、5種類の抽出溶媒それぞれについて、抽出を行った。
具体的な抽出方法を以下に述べる。
180rpmの回転速度で、48時間、浸透抽出を行った後、吸引濾過にて抽出液を回収した。さらに、抽出液をロータリーエバポレータにて濃縮後、デシケータ内でエタノールを完全に除去し、乾固物を得た。なお、エタノール0vol%(水100vol%)抽出の場合は、抽出後、遠心分離し、上澄みを凍結乾燥させて水抽出物とした。
〔ヒアルロン酸産生試験〕
繊維芽細胞は、ヒアルロン酸などの真皮の部分をつくりだすことで知られている。神経芽細胞の働きが落ちると、ヒアルロン酸は失われ、肌が保有する水分量が減少し、しわなどの原因となる。
神経芽細胞の働きを活発にし、ヒアルロン酸の産生能を高める物質があれば、肌の保湿やハリを保つことができる。
<試験方法>
上記の、5種類の各エタノール濃度で得た抽出物それぞれを、さらに、3つの濃度に調整し、合計で15個の試料を得た。
神経芽細胞をウェルプレートに播種し、5%CO、37℃の条件下で、24時間インキュベートした後、上記の試料を添加し、さらに72時間インキュベートした後、ヒアルロン酸量を、ELISAという方法で測定した。また、細胞生存率は、MTT法により行った。
<試験結果>
上記の試験の結果を、図6に示す。黒の棒グラフは、ヒアルロン酸産生量を示し、白の棒グラフは、細胞生存率を示す。折れ線グラフは、生存する細胞1個あたりのヒアルロン酸量を示す。
図6から、細胞生存率当たりのヒアルロン酸量が、最も高いサンプルは、エタノール75%抽出物(濃度12.5μg/ml)であり、コントロール(DMSO)を100%として、約135%であった。
また、細胞生存率当たりのヒアルロン酸量が二番目に高い試料は、エタノール25%抽出物(濃度25μg/ml)の試料であり、コントロール(DMSO)を100%として、約128%であった。
本試験により、葉ワサビの葉部分を、エタノール濃度75%で抽出し、濃度12.5μg/mlに調整すると、最も高いヒアルロン酸生産能を示すことがわかった。
〔抗菌活性試験〕
葉ワサビの各部位の機能性試験で行ったように、本試験においても、大腸菌(E.coli)と、黄色ブドウ球菌(S.aureus)の増殖に与える影響から、各抽出濃度の試料の抗菌活性を評価した。
<試験方法>
各エタノール濃度の抽出物を、DMSO(dimethylsulfoxide)に溶解させた。また、抽出物を含まないDMSOをネガティブコントロールとして、保存料であるソルビン酸をポジティブコントロールとして用いた。
黄色ブドウ球菌や大腸菌を、5mLのNB(Nutrient broth)培地に浸して菌液を作り、これを160rpm、37℃で約18時間、浸透培養させ、定常期の菌体を得た。
得られた定常期の培養液をNB培地で希釈し、OD660=0.4 になるよう調製した(E.coli:10CFU/mL、S.aureus:10CFU/mL)。さらに、これを滅菌水で希釈し、菌濃度が10CFU/mLである菌液として、抗菌試験に用いた。
更に、この菌液50μ?に、NB培地445μ? と葉ワサビの試料5μ?を加え、約5秒間攪拌した。なお、本試験における、サンプルの濃度は800μg/mlである。
その後、ウェルプレートに150μ?ずつ分注し、37℃で18時間、1150rpmの回転速度で、振とう培養した。その後、630nmの波長の光を当て、菌液の濁度を測定した。
<試験結果>
大腸菌及び黄色ブドウ球菌による濁度を、抽出濃度ごとの試料を用いて測定した結果を図7示す。なお、黒い棒グラフが大腸菌の濁度であり、白い棒グラフが黄色ブドウ球菌の濁度である。
図7に示すように、大腸菌及び黄色ブドウ球菌に対して、エタノール75vol%(水25vol%)の試料が、最も濁度が低く、強い抗菌活性を示すことがわかった。特に、黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性は、ソルビン酸よりも強く表れている。
また、大腸菌に対する抗菌活性も、エタノール濃度が50vol%以下の試料と比較すると、約3分の1から約2分の1であり、顕著な抗菌作用を示すことが分かった。
また、エタノール100vol%(水0vol%)で抽出された試料も濁度が低く、強い抗菌活性を示すことがわかった。特に、大腸菌に対する抗菌活性は、エタノール75vol%(水25vol%)の試料よりも強く表れている。
以上の試験結果から、葉ワサビの葉部分を、エタノール75%(水25%)から、エタノール100vol%(水0vol%)の間の濃度で抽出すると、黄色ブドウ球菌及び大腸菌に対して、強い抗菌活性を有することが分かった。
〔リパーゼ阻害活性試験〕
本試験においては、葉ワサビの葉部分の効率的な利用のため、上記の、5種類の各エタノール濃度で得た抽出物それぞれを、さらに2つの濃度(400mg/ml、800mg/ml)に調整し、合計で10個の試料を得た。
<試験方法>
抽出物溶液25μLを0.1mM4−methylumbellifery oleate(4−メチルウンベリフェリルオレアート;4−MUO 13mM Tris−HCl,150mM NaCl,1.3mM CaCl緩衝液)溶液50μLと、150μg/mL濃度の膵臓由来リパーゼ25μLを混合し、緩衝液に溶かした。
その後、25℃の条件下で約30分インキュベートした。そして、0.1Mクエン酸緩衝液(pH4.2)100μ?を加えて反応を停止させた後、355nmの光を当て、460nmの蛍光強度を測定した。
<試験結果>
上記の試験結果を図8に示す。なお、葉ワサビの葉部分の抽出物を含まずに試験を行った結果を、コントロール(BL)100%として表示し、抗肥満薬として用いられるオルレイスタット(Orl)の値も表示した。
図8から、抽出溶媒のエタノール濃度が高いほど、リパーゼ阻害活性が強いことが分かった。特に、エタノール100vol%(水0vol%)の濃度800mg/mlの試料においては、最もリパーゼ阻害活性が高く、コントロール値の約5分の1である。
以上の試験結果から、葉ワサビの葉部分を、より高いエタノール濃度で抽出すれば、より高いリパーゼ阻害活性が得られることがわかった。
〔抗酸化活性試験〕
<試験方法>
ラジカル発生剤であるAAPH(2,2'−アゾビス(2−アミノプロパン)二塩酸塩)を用いて、ペルオキシラジカルを発生させる。ペルオキシラジカルによって、蛍光色素の一種であるフルオレセインが酸化されると、フルオレセインから発していた光は、消光する。
ここで、抗酸化物質が存在すると、ペルオキシラジカルは消失され、ペルオキシラジカルによって酸化されるフルオレセインの消光スピードが遅くなる。この消光スピードの遅延する程度を、試料の抗酸化活性と関連付け、評価する方法である。
<サンプル溶液の調整>
試料を秤量し、濃度が(1mg/1mL)になるよう、リン酸緩衝液に溶解し、これを原液として、希釈した。
<試験結果>
上記の試験結果を図9に示す。エタノール濃度50vol%(水50vol%)で抽出した試料が最も抗酸化活性が高かった。なお、エタノール濃度75vol%(水25vol%)で抽出した試料は、二番目に抗酸化活性が高かった。
以上の試験結果から、葉ワサビの葉部分を、エタノール濃度50vol%(水50vol%)から75vol%(水25vol%)の間の値の濃度で抽出すれば、抗酸化活性を含む抽出物を抽出することができる。
<まとめ>
以上のすべての試験結果から、葉ワサビの葉部分は、抽出溶媒のエタノール濃度約75vol%(水25vol%)で抽出することで、ヒアルロン酸産生能、抗菌活性、リパーゼ阻害活性、抗酸化活性の機能を最も効率良く抽出することができることが明らかとなった。
上記の条件下で、葉ワサビの抽出物を抽出することで、ヒアルロン酸産生能、抗菌活性、リパーゼ阻害活性、抗酸化活性などの成分を複数含む抽出物を抽出することができる。
また、ヒアルロン酸産生能、抗菌活性、リパーゼ阻害活性、抗酸化活性などの成分を複数含む抽出物を化粧品の成分として利用すれば、肌の調子を効果的に整えることができる。
また、ヒアルロン酸産生能、抗菌活性、リパーゼ阻害活性、抗酸化活性などの成分は、葉ワサビという植物に含まれた成分であるので、合成薬品などが含まれる化粧品に比べて、安全性が高く、安心して利用することができる。
また、このような抽出方法により、葉ワサビの葉部分の機能を詳細に調べた文献は見当たらず、かつ、抽出溶媒を変えることで、葉ワサビの葉部分の機能を効率的に利用することはされていなかった。
したがって、化粧品等を扱う業界において、このような葉ワサビ抽出物を化粧品などの整肌剤として利用することは予測することは不可能であったと考えられる。

Claims (12)

  1. エタノール若しくはエタノール含有溶媒を用いて、ワサビの葉部分から抽出された
    保湿効果を有するワサビ抽出物。
  2. 20vol%から30vol%の間の値のエタノール濃度で抽出された
    請求項1に記載の保湿効果を有するワサビ抽出物。
  3. 70vol%から80vol%の間の値のエタノール濃度で抽出された
    請求項1に記載の保湿効果を有するワサビ抽出物。
  4. エタノール若しくはエタノール含有溶媒を用いて、ワサビの葉部分から抽出された
    抗菌活性を有するワサビ抽出物。
  5. 70vol%以上のエタノール濃度で抽出された
    請求項4に記載の抗菌活性を有するワサビ抽出物。
  6. エタノール若しくはエタノール含有溶媒を用いて、ワサビの葉部分から抽出された
    抗酸化活性を有するワサビ抽出物。
  7. 40vol%から80vol%の間の値のエタノール濃度で抽出された
    請求項6に記載の抗酸化活性を有するワサビ抽出物。
  8. エタノール若しくはエタノール含有溶媒を用いて、ワサビの葉部分から抽出された
    リパーゼ阻害活性を有するワサビ抽出物。
  9. 90vol%から100vol%の間の値のエタノール濃度で抽出された
    請求項8に記載のリパーゼ阻害活性を有するワサビ抽出物。
  10. 抗菌活性、抗酸化活性、リパーゼ阻害活性及び保湿効果のうち、2以上の機能を有する
    請求項1、請求項4、請求項6または請求項8に記載のワサビ抽出物。
  11. エタノール若しくはエタノール含有溶媒を用いて、ワサビの葉部分から抽出された、抗菌活性、抗酸化活性、リパーゼ阻害活性及び保湿効果のうち、少なくとも1つの機能を含むワサビ抽出物を有する
    整肌剤。
  12. ワサビの葉部分を乾燥し、粉末化したものからエタノール若しくはエタノール含有溶媒を用いて抽出する工程を備える
    ワサビ抽出物の製造方法。
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