[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

JP2015513903A - ブラジキニンｂ１受容体リガンドに対する抗体 - Google Patents

ブラジキニンｂ１受容体リガンドに対する抗体 Download PDF

Info

Publication number
JP2015513903A
JP2015513903A JP2015503318A JP2015503318A JP2015513903A JP 2015513903 A JP2015513903 A JP 2015513903A JP 2015503318 A JP2015503318 A JP 2015503318A JP 2015503318 A JP2015503318 A JP 2015503318A JP 2015513903 A JP2015513903 A JP 2015513903A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
antibody
antigen
amino acid
kallidin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2015503318A
Other languages
English (en)
Other versions
JP6779012B2 (ja
JP2015513903A5 (ja
Inventor
ハン・リー
ドロシア・コミノス
ジエ・ジャーン
アラ・プリッツカー
マシュー・ディヴィソン
ニコラ・ボラン
ゴヴィンダン・スブラマニアン
シン・チェン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanofi SA
Original Assignee
Sanofi SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=49261064&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP2015513903(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Sanofi SA filed Critical Sanofi SA
Publication of JP2015513903A publication Critical patent/JP2015513903A/ja
Publication of JP2015513903A5 publication Critical patent/JP2015513903A5/ja
Priority to JP2018218861A priority Critical patent/JP6912441B2/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6779012B2 publication Critical patent/JP6779012B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6843—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/18—Kallidins; Bradykinins; Related peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本開示は、カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンに特異的に結合する抗体を提供する。本開示はまた、医薬組成物、ならびに抗カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン抗体をコードする核酸、組換え発現ベクター、およびこのような抗体またはそのフラグメントを作成するための宿主細胞を提供する。本開示の抗体を用いてカリジンもしくはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン活性を変調し、またはカリジンもしくはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンを検出する方法、またはｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで、も本開示により提供される。本開示は、ｄｅｓ−Ａｒｇｇ−ブラジキニンおよびｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン様ペプチドに特異的に結合する抗体を作成する方法をさらに提供する。

Description

関連出願
本出願は、２０１２年３月２８日出願の米国仮出願第６１／６１６，８４５号、および２０１３年２月４日出願の仏国特許出願第１３５０９５３号の優先権を主張するものである。これら出願の内容は、その全文を参照によって本明細書に各々組み入れる。
ブラジキニンＢ１受容体は、炎症性疾患および慢性疼痛の病原に結び付けられている。組織炎症および腎線維症を変調することにより、Ｂ１受容体は、末期腎不全の主な原因である急性腎損傷および慢性腎疾患の病原にも関連している。
ヒトでは、ブラジキニンＢ１受容体の主なアゴニストはキニンである。キニンは、キニノゲンタンパク質のタンパク分解性の切断から生成される生理活性ペプチドである。ブラジキニンＢ１受容体の主なキニンアゴニストはデカペプチドのカリジン、およびノナペプチドのｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン（カリジンからＣ末端アルギニンのタンパク分解性の切断により形成される）である。したがって、カリジンおよびｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンのブラジキニンＢ１受容体に対する結合を阻害することができる薬剤には、ブラジキニンＢ１受容体媒介性の病態を処置または防止する可能性がある。
したがって、当技術分野において、ブラジキニンＢ１受容体媒介性のヒトの病態の処置において用いるための、カリジンおよびｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンのブラジキニンＢ１受容体に対する結合を阻害する新規な薬剤が必要とされている。
本発明は、カリジンおよびｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンに特異的に結合し、ブラジキニンＢ１受容体に対する結合を妨げる、抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。このような抗体は、カリジンおよびｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン関連の疾患または障害（例えば、疼痛もしくは線維症）を処置するのに特に有用である。本発明はまた、医薬組成物、ならびに抗カリジンおよびｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン抗体をコードする核酸、組換え発現ベクター、およびこのような抗体またはそのフラグメントを作成するための宿主細胞も提供する。ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏいずれかで、カリジンおよびｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンを検出するための、またはカリジンおよびｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン活性を変調するための、本発明の抗体またはそのフラグメントを用いる方法も、本発明によって包含される。本発明はまた、ｄｅｓ−Ａｒｇ９−ブラジキニンおよびｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン様ペプチドに特異的に結合する抗体を作成する方法も提供する。
したがって、一態様において、本発明は、
ａ）カリジンもしくはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンに特異的に結合するが、ブラジキニンもしくはｄｅｓ−Ａｒｇ９−ブラジキニンには特異的に結合しない；
ｂ）カリジンもしくはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンに、１×１０−１０Ｍ未満のＫＤで特異的に結合する；
ｃ）カリジンもしくはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンに、１×１０４ｓ−１未満のＫｏｆｆで特異的に結合する；または
ｄ）カリジンもしくはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンに特異的に結合し、ブラジキニン
Ｂ１受容体への結合を阻害する
単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
一実施形態において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンのＮ末端のリジン残基に結合する。
別の一実施形態において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンのブラジキニン−１受容体への結合を阻害する。
別の一実施形態において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、マウスのカリジン様ペプチド（ＫＬＰ）に特異的に結合する。
別の一実施形態において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、
ａ）配列番号７［Ｘ１ＹＸ２Ｘ３ＤＸ４ＨＡＭＸ５Ｙ］、
式中、
Ｘ１は、Ｙ、Ｆ、またはＨであり、
Ｘ２は、Ｒ、Ｄ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、またはＷであり、
Ｘ３は、Ｙ、Ｆ、Ｗ、またはＨであり、
Ｘ４は、Ｄ、Ｅ、またはＹであり、
Ｘ５は、ＤまたはＥである、
ｂ）配列番号６３［Ｘ１ＥＹＤＧＸ２ＹＸ３Ｘ４ＬＤＸ５］、
式中、
Ｘ１は、ＷまたはＦであり、
Ｘ２は、Ｎであり、またはアミノ酸はなく、
Ｘ３は、ＹまたはＳであり、
Ｘ４は、ＤまたはＰであり、
Ｘ５は、ＦまたはＹである、
ｃ）配列番号１３、
ｄ）配列番号３２、
ｅ）配列番号４０、
ｆ）配列番号４７、および
ｇ）配列番号５５
からなる群から選択されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
別の一実施形態において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、
ａ）配列番号８［ＹＦＸ１ＰＸ２ＮＧＮＴＧＹＮＱＫＦＲＧ］、
式中、
Ｘ１は、Ｄ、Ｒ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、またはＷであり、
Ｘ２は、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、またはＱである、
ｂ）配列番号６４［ＷＸ１ＤＰＥＮＧＤＸ２Ｘ３ＹＡＰＫＦＱＧ］、
式中、
Ｘ１は、ＩまたはＶであり、
Ｘ２は、ＴまたはＳであり、
Ｘ３は、ＧまたはＤである、
ｃ）配列番号１４、
ｄ）配列番号３３、
ｅ）配列番号４１、
ｆ）配列番号４８、および
ｇ）配列番号５６
からなる群から選択されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列を含む。
別の一実施形態において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、
ａ）配列番号９［ＧＹＳＦＴＤＹＸ１ＩＹ］、
式中、
Ｘ１は、Ｎ、Ｗ、またはＹである、
ｂ）配列番号６５［ＧＦＮＩＫＤＹＹＸ１Ｈ］、
式中、
Ｘ１は、ＬまたはＭである、
ｃ）配列番号１５、
ｄ）配列番号３４、
ｅ）配列番号４２、
ｆ）配列番号４９、および
ｇ）配列番号５７
からなる群から選択されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列を含む。
別の一実施形態において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、
ａ）配列番号１０［ＱＱＸ１Ｘ２ＳＸ３ＰＸ４Ｔ］、
式中、
Ｘ１は、Ｙ、Ｆ、またはＨであり、
Ｘ２は、Ｙ、Ｆ、Ｈ、またはＷであり、
Ｘ３は、Ｙ、Ｆ、Ｔ、またはＨであり、
Ｘ４は、Ｗ、Ｙ、Ｆ、Ｈ、またはＬである、
ｂ）配列番号６６［ＱＸ１Ｘ２Ｘ３ＳＸ４ＰＸ５Ｔ］、
式中、
Ｘ１は、ＱまたはＮであり、
Ｘ２は、Ｙ、Ｆ、Ｄ、またはＨであり、
Ｘ３は、Ｙ、Ｆ、Ｈ、またはＷであり、
Ｘ４は、Ｙ、Ｆ、Ｔ、またはＨであり、
Ｘ５は、Ｗ、Ｙ、Ｆ、Ｈ、またはＬである、
ｃ）配列番号６９［Ｘ１ＱＧＴＨＦＰＹＴ］、
式中、
Ｘ１は、ＬまたはＭである、
ｄ）配列番号１６、
ｅ）配列番号３５、
ｆ）配列番号４３、
ｇ）配列番号５０、および
ｈ）配列番号５８
からなる群から選択されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
別の一実施形態において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、
ａ）配列番号１１［ＷＡＳＴＲＸ１］、
式中、
Ｘ１は、Ｅ、Ｄ、ＱまたはＮである、
ｂ）配列番号６７［Ｘ２ＡＳＴＲＸ２］、
式中、
Ｘ１は、ＷまたはＧであり、
Ｘ２は、Ｅ、Ｄ、Ｑ、またはＮである、
ｃ）配列番号１７、
ｄ）配列番号３６、
ｅ）配列番号５１、および
ｆ）配列番号５９
からなる群から選択されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列を含む。
別の一実施形態において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、
ａ）配列番号１２［ＫＳＳＱＳＬＬＸ１ＳＳＮＱＫＮＸ２ＬＡ］、
式中、
Ｘ１は、Ｗ、Ｈ、Ｙ、またはＦであり、
Ｘ２は、ＨまたはＹである、
ｂ）配列番号６８［ＫＳＳＱＳＬＬＸ１Ｘ２ＳＸ３ＱＸ４ＮＸ５ＬＡ］、
式中、
Ｘ１は、Ｗ、Ｈ、Ｙ、またはＦであり、
Ｘ２は、ＳまたはＧであり、
Ｘ３は、ＮまたはＤであり、
Ｘ４は、ＫまたはＲであり、
Ｘ５は、ＨまたはＹである、
ｃ）配列番号７０［ＫＳＳＱＳＬＬＹＳＮＧＸ１ＴＹＬＮ］、
式中、
Ｘ１は、ＫまたはＥであり、
ｂ）配列番号１８、
ｃ）配列番号３７、
ｄ）配列番号４４、
ｅ）配列番号５２、および
ｆ）配列番号６０
からなる群から選択されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列を含む。
別の一実施形態において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、
ａ）配列番号１０［ＱＱＸ１Ｘ２ＳＸ３ＰＸ４Ｔ］、
式中、
Ｘ１は、Ｙ、Ｆ、またはＨであり、
Ｘ２は、Ｙ、Ｆ、Ｈ、またはＷであり、
Ｘ３は、Ｙ、Ｆ、Ｔ、またはＨであり、
Ｘ４は、Ｗ、Ｙ、Ｆ、Ｈ、またはＬである、
ｂ）配列番号６６［ＱＸ１Ｘ２Ｘ３ＳＸ４ＰＸ５Ｔ］、
式中、
Ｘ１は、ＱまたはＮであり、
Ｘ２は、Ｙ、Ｆ、Ｄ、またはＨであり、
Ｘ３は、Ｙ、Ｆ、Ｈ、またはＷであり、
Ｘ４は、Ｙ、Ｆ、Ｔ、またはＨであり、
Ｘ５は、Ｗ、Ｙ、Ｆ、Ｈ、またはＬである、
ｃ）配列番号６９［Ｘ１ＱＧＴＨＦＰＹＴ］、
式中、
Ｘ１は、ＬまたはＭである、
ｄ）配列番号１６、
ｅ）配列番号３５、
ｆ）配列番号４３、
ｇ）配列番号５０、および
ｈ）配列番号５８
からなる群から選択されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
別の一実施形態において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、
ａ）配列番号１１［ＷＡＳＴＲＸ１］、
式中、
Ｘ１は、Ｅ、Ｄ、Ｑ、またはＮである、
ｂ）配列番号６７［Ｘ２ＡＳＴＲＸ２］、
式中、
Ｘ１は、ＷまたはＧであり、
Ｘ２は、Ｅ、Ｄ、Ｑ、またはＮである、
ｃ）配列番号１７、
ｄ）配列番号３６、
ｅ）配列番号５１、および
ｆ）配列番号５９
からなる群から選択されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列を含む。
別の一実施形態において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、
ａ）配列番号１２［ＫＳＳＱＳＬＬＸ１ＳＳＮＱＫＮＸ２ＬＡ］、
式中、
Ｘ１は、Ｗ、Ｈ、Ｙ、またはＦであり、
Ｘ２は、ＨまたはＹである、
ｂ）配列番号６８［ＫＳＳＱＳＬＬＸ１Ｘ２ＳＸ３ＱＸ４ＮＸ５ＬＡ］、
式中、
Ｘ１は、Ｗ、Ｈ、Ｙ、またはＦであり、
Ｘ２は、ＳまたはＧであり、
Ｘ３は、ＮまたはＤであり、
Ｘ４は、ＫまたはＲであり、
Ｘ５は、ＨまたはＹである、
ｃ）配列番号７０［ＫＳＳＱＳＬＬＹＳＮＧＸ１ＴＹＬＮ］、
式中、
Ｘ１は、ＫまたはＥであり、
ｂ）配列番号１８、
ｃ）配列番号３７、
ｄ）配列番号４４、
ｅ）配列番号５２、および
ｆ）配列番号６０
からなる群から選択されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列を含む。
別の一実施形態において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号１３、１４、および１５にそれぞれ記載のＨＣＤＲ３、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ１領域のアミノ配列を含む重鎖可変領域、ならびにＫａｂａｔによるＨ１、Ｈ５、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１６、Ｈ３８、Ｈ４０、Ｈ４１、Ｈ４３、Ｈ４４、Ｈ６６、Ｈ７５、Ｈ７９、Ｈ８１、Ｈ８２Ａ、Ｈ８３、Ｈ８７、およびＨ１０８からなる群から選択される位置の１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む。
別の一実施形態において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号１６、１７、および１８にそれぞれ記載のＬＣＤＲ３、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ１領域のアミノ配列を含む軽鎖可変領域、ならびにＫａｂａｔによるＬ５、Ｌ９、Ｌ１５、Ｌ１８、Ｌ１９、Ｌ２１、Ｌ２２、Ｌ４３、Ｌ６３、Ｌ７８、Ｌ７９、Ｌ８３、Ｌ８５、Ｌ１００、およびＬ１０４からなる群から選択される位置の１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む。
別の一実施形態において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号１９、２０、２１、２２、２４、２５、３８、４５、５３、および６１からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変領域アミノ酸配列を含む。
別の一実施形態において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号２６、２７、２８、２９、２９、３０、３１、３９、４６、５４、および６２からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む。
別の一実施形態において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号２６、２７、２８、２９、２９、３０、３１、３９、４６、５４、および６２からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む。
別の一実施形態において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号１９、２０、２１、２２、２４、２５、３８、４５、５３、および６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
別の一実施形態において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号２６、２７、２８、２９、２９、３０、３１、３９、４６、５４、および６２からなる群から選択される軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む。
別の一実施形態において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号２６、２７、２８、２９、２９、３０、３１、３９、４６、５４、および６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
別の一実施形態において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号１９および２６、配列番号２０および２７、配列番号２１および２８、配列番号２２および２８、配列番号２３および２９、配列番号２４および３０、配列番号２５および３１、配列番号３８および３９、配列番号４５および４６、配列番号５３および５４、または配列番号６１および６２に記載の、それぞれ重鎖および軽鎖の可変領域アミノ酸を含む。
別の一態様において、本発明は、カリジンおよびｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンに対する結合を、配列番号１９および２６、配列番号３８および３９、配列番号４５および４６、配列番号５３および５４、または配列番号６１および６２に記載の、それぞれ重鎖および軽鎖の可変領域アミノ酸配列を含む抗体と競合する、カリジンおよびｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の一態様において、本発明は、カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンに対する結合を、請求項のいずれか１項に記載の抗体と競合し、ブラジキニンまたはｄｅｓＡｒｇ９−ブラジキニンに結合しない、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
別の一態様において、本発明は、ＫＤまたはＤＡＫＤのプロリン４にＩＩ型急カーブを含むＰｒｏ４キンクコンフォメーションを取る、カリジン（ＫＤ）またはｄｅｓＡｒｇ１０−カリジン（ＤＡＫＤ）のコンフォメーションエピトープに特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。一実施形態において、ＫＤまたはＤＡＫＤのＰｒｏ４キンクコンフォメーションは、アミノ酸の疎水性側鎖と空間的に積み重なってアラインしているＳ字形のアミノ酸リピートをさらに含む。別の一実施形態において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、（ａ）カリジンもしくはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンに特異的に結合するが、ブラジキニンもしくはｄｅｓ−Ａｒｇ９−ブラジキニンには特異的に結合せず、ｂ）カリジンもしくはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンに１×１０−１０Ｍ未満のＫＤで特異的に結合し、ｃ）カリジンもしくはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンに１×１０４ｓ−１未満のＫｏｆｆで特異的に結合する、またはｄ）カリジンもしくはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンに特異的に結合し、ブラジキニンＢ１受容体への結合を阻害する。
別の一態様において、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、診断薬または治療薬にコンジュゲートしている。
別の一態様において、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントのアミノ酸配列をコードする、単離された核酸を提供する。
別の一態様において、本発明は、本発明の核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。
別の一態様において、本発明は、本発明の組換え発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
別の一態様において、本発明は、本発明の宿主細胞を、カリジンおよびｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンに特異的に結合する抗体が宿主細胞によって生成される条件下で培養することを含む、カリジンおよびｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンに特異的に結合する抗体を生成する方法を提供する。
別の一態様において、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメント、および１つまたはそれ以上の薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物を提供する。
別の一態様において、本発明は、本発明の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、疾患または障害カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン関連の疾患または障害を処置するための方法を提供する。
一実施形態において、疾患または障害は慢性疼痛である。
別の一態様において、本発明は、ペプチドは配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなり、ｄｅｓ−Ａｒｇ９−ブラジキニン、ｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン、およびｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン様ペプチドに特異的に結合する抗体が動物の免疫系によって生成されるように、ペプチドのアミノ末端のアルギニンはリンカー部分によって担体部分に間接的にカップリングしている、ペプチドを含む免疫原で動物を免疫化することを含む、ｄｅｓ−Ａｒｇ９−ブラジキニンおよびｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン様ペプチドに特異的に結合する抗体を産生する方法を提供する。
別の一実施形態において、方法は、動物から、抗体、抗体をコードする核単離（ｎｕｃｌｅｉｃ ｉｓｏｌａｔｉｎｇ）、または抗体を発現する免疫細胞を単離することを含む。
一実施形態において、担体部分はタンパク質である。別の一実施形態において、タンパク質はキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）である。別の一実施形態において、リンカー部分は［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ］ｎを含み、ｎは少なくとも１である。
ＥＥ１抗体のキニンペプチドに対する結合を実証するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す図である。 抗体Ｆ１５１の示差走査熱量測定の結果を示す図である。 マウスおよびヒト化Ｆ１５１抗体の可変領域のアミノ酸配列アラインメントを示す図である。同一の残基を全てアラインメントにおいて列挙し、相同の残基を記号「＋」によって識別し、非相同の残基は空白のままである。 Ｆ１５１抗体／カリジン複合体の抗原結合性部位の電子密度マップを示す図である。 Ｆ１５１抗体／ｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン複合体の抗原結合性部位の電子密度マップを示す図である。 カリジンに結合しているＦ１５１のＦｖサブユニットを示す、リボンおよび棒で表す図である。 本発明の例示のマウス抗カリジン抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列アラインメントを示す図である。カリジンと相互作用するアミノ酸残基にアステリスクで印を付す。 本発明の例示のマウス抗カリジン抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列アラインメントを示す図である。カリジンと相互作用するアミノ酸残基にアステリスクで印を付す。 ホルマリン誘導性急性炎症性疼痛に対するＥＥ１抗体の効果を決定するｉｎ ｖｉｖｏ実験の結果を示す図である。 ＣＦＡ誘導性機械的過敏症に対するＥＥ１抗体の効果を決定するｉｎ ｖｉｖｏ実験の結果を示す図である。 ＣＦＡ誘導性熱的過敏症に対するＥＥ１抗体の効果を決定するｉｎ ｖｉｖｏ実験の結果を示す図である。 ＣＣＩ誘導性機械的過敏症に対するＥＥ１抗体の効果を決定するｉｎ ｖｉｖｏ実験の結果を示す図である。 ＣＣＩ誘導性熱的過敏症に対するＥＥ１抗体の効果を決定するｉｎ ｖｉｖｏ実験の結果を示す図である。 ヒト化Ｆ１５１バリアントＨＣ３ａ／ＬＣ３ａを産生するためのＶＬおよびＶＨ発現構築物の模式的マップを示す図であり、制限ＤＮＡエンドヌクレアーゼ部位を推定配列として太字体および下線で表した。パネルＡは軽鎖を表し、パネルＢは重鎖を表す。 Ｆ１５１の重鎖（Ａ）および軽鎖（Ｂ）のアミノ酸配列の、最も近いヒト生殖系列アミノ酸配列とのアラインメントを示す図である。 Ｆ１５１の重鎖（Ａ）および軽鎖（Ｂ）の、ＶＨ１サブファミリーの重鎖遺伝子座（１〜０８および１〜１８）ならびに軽鎖（Ｖ ＩＶ〜Ｂ３）遺伝子座とのアラインメントを示す図である。ＣＤＲとバーニア領域を太字で示し、ヒト化変異に下線を付す。 （Ｃ）プロリン４のＩＩ型タイトターンを含むＦ１５１抗体に結合しているカリジン（ＫＤ）の主鎖ポリペプチドバックボーンコンフォメーションの、（Ａ）二次構造および（Ｂ）四次構造を示す図である。
本発明は、カリジンおよびｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンに特異的に結合し、ブラジキニンＢ１受容体に対する結合を妨げる抗体を提供する。このような抗体は、カリジンおよびｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン関連の疾患または障害（例えば、疼痛）を処置するのに特に有用である。本発明はまた、医薬組成物、ならびに抗カリジンおよびｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン抗体をコードする核酸、組換え発現ベクター、ならびにこのような抗体またはそのフラグメントを作成するための宿主細胞も提供する。ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで、本発明の抗体を用いてカリジンおよびｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンを検出する方法、またはカリジンおよびｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン活性を変調するための方法も、本発明によって包含される。
Ｉ．定義
本発明がより容易に理解され得るために、ある種の語を最初に定義する。
本明細書で用いられる、「カリジン」の語は、アミノ酸配列ＫＲＰＰＧＦＳＰＦＲ（配列番号１）を含み、またはこれからなるペプチドを意味する。
本明細書で用いられる、「ｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン」の語は、アミノ酸配列ＫＲＰＰＧＦＳＰＦ（配列番号２）を含み、またはこれからなるペプチドを意味する。
本明細書で用いられる、「マウスカリジン」または「カリジン様ペプチド」の語は、アミノ酸配列ＲＲＰＰＧＦＳＰＦＲ（配列番号３）を含み、またはこれからなるペプチドを意味する。
本明細書で用いられる、「マウスｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン」または「ｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン様ペプチド」の語は、アミノ酸配列ＲＲＰＰＧＦＳＰＦ（配列番号４）を含み、またはこれからなるペプチドを意味する。
本明細書で用いられる、「ブラジキニン」の語は、アミノ酸配列ＲＰＰＧＦＳＰＦＲ（配列番号５）を含み、またはこれからなるペプチドを意味する。
本明細書で用いられる、「ｄｅｓ−Ａｒｇ９−ブラジキニン」の語は、アミノ酸配列ＲＰＰＧＦＳＰＦ（配列番号６）を含み、またはこれからなるペプチドを意味する。
本明細書で用いられる、「抗体」の語は、４本のポリペプチド鎖、すなわちジスルフィド結合によって相互接続されている２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖、ならびにその多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む免疫グロブリン分子を意味する。各重鎖は、重鎖可変領域（略してＶＨまたはＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨまたはＣＨ）を含む。重鎖定常領域はＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の３つのドメインを含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（略してＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬまたはＣＬ）を含む。軽鎖定常領域は１個のドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存されている領域が挿入されている、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分することができる。ＶＨおよびＶＬは各々、３個のＣＤＲおよび４個のＦＲから構成されており、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順番で配列されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
本明細書で用いられる、抗体の「抗原結合性フラグメント」の語は、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、あらゆる天然に存在する、酵素的に得ることができる、合成の、または遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合性フラグメントは、抗体可変ドメインおよび場合により定常ドメインをコードするＤＮＡのマニピュレーションおよび発現を伴う、タンパク分解性の消化または組換え遺伝子操作技術などのあらゆる適切な標準の技術を用いて、完全な抗体分子などに由来し得る。抗原結合性部分の非限定的な例には、（ｉ）Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント；（ｉｖ）Ｆｖフラグメント；（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント；および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域を擬するアミノ酸残基からなる最小認識単位（ｍｉｎｉｍａｌ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｕｎｉｔ）（例えば、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））が含まれる。他の操作された分子、例えば、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、およびミニボディも、「抗原結合性フラグメント」の表現の範囲内に包含される。
本明細書で用いられる、「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」の語は、重鎖および軽鎖両方のポリペプチドの可変領域内に見出される、非隣接の抗原結合性部位を意味する。これら特定の領域は、Ｋａｂａｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５２巻、６６０９〜６６１６頁（１９７７年）、およびＫａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．、（１９９１年）、およびＣｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１〜９１７頁（１９８７年）、およびＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６２巻、７３２〜７４５頁（１９９６年）によって記載されており、相互に対して比較した場合のアミノ酸残基の重複またはサブセットが定義に含まれる。上記に引用した各参考文献により規定されるＣＤＲを包含するアミノ酸残基は、比較のために記載するものである。本発明の一実施形態において、「ＣＤＲ」の語は、配列の比較に基づき、Ｋａｂａｔにより定義されるＣＤＲである。
本明細書で用いられる、「フレームワーク（ＦＲ）アミノ酸残基」の語は、Ｉｇ鎖のフレームワーク領域におけるアミノ酸を意味する。本明細書で用いられる、「フレームワーク領域」または「ＦＲ領域」の語は、可変領域の一部であるがＣＤＲの一部ではない（例えば、ＫａｂａｔのＣＤＲの定義を用いて）アミノ酸残基を含む。したがって、可変領域フレームワークは、アミノ酸の長さ約１００〜１２０の間であるが、ＣＤＲの外のアミノ酸だけを含む。
本明細書で用いられる、「に対して特異的に結合する」の語は、抗体またはその抗原結合性フラグメントが抗原に対して、少なくとも約１×１０−６Ｍ、１×１０−７Ｍ、１×１０−８Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、１×１０−１２Ｍ、またはそれを超えるＫｄで結合する能力を意味する。この語はまた、抗体またはその抗原結合性フラグメントが、抗原に対して、非特異的な抗原に対するその親和性よりも少なくとも２倍大きな親和性で結合する能力も意味することを包含する。しかしながら、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列において関連する２つ以上の抗原（例えば、カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンおよびマウスカリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン）に特異的に結合することができることを理解されたい。
本明細書で用いられる、「抗原」の語は、抗体またはその抗原結合性フラグメントによって認識される結合部位またはエピトープを意味する。
本明細書で用いられる、「ベクター」の語は、それが連結している別の核酸を輸送することができる核酸分子を意味するものとされる。一タイプのベクターは「プラスミド」であり、その中にさらなるＤＮＡセグメントがライゲートされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを意味する。別の一タイプのベクターはウイルスベクターであり、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノム中にライゲートされ得る。ある種のベクターは、その中にこれらが導入される宿主細胞で自律的に複製することができる（例えば、細菌のベクターは細菌の複製開始点および哺乳動物のエピソームベクターを有する）。他のベクター（例えば、哺乳動物の非エピソームベクター）は、宿主細胞中に導入される時に宿主細胞のゲノム中に組み入れられ得、それにより宿主のゲノムと一緒に複製される。さらに、ある種のベクターは、これらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターを、本明細書において「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ぶ。一般的に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターはプラスミドの形態であることが多い。「プラスミド」および「ベクター」の語は、交換可能に用いることができる。しかしながら、本発明には、同等の機能をもたらす、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）など、このような他の形態の発現ベクターも含まれるものとされる。
本明細書で用いられる、「宿主細胞」の語は、その中に組換え発現ベクターが導入される細胞を意味するものとされる。この語は、特定の対象の細胞だけではなくこのような細胞の子孫も意味するものとされることを理解されたい。変異または環境の影響のいずれかにより、継承される世代においてある種の修飾が起こり得るため、このような子孫は実際、親細胞と同一ではないことがあるが、依然として本明細書で用いられる「宿主細胞」の語の範囲内に含まれる。
本明細書で用いられる「処置する」、「処置の」、および「処置」の語は、本明細書に記載する治療的または防止的措置を意味する。「処置」の方法は、疾患もしくは障害の、または再発性の疾患もしくは障害の１つまたはそれ以上の症状を防ぎ、治癒し、遅らせ、重症度を低減し、または回復させるために、あるいはこのような処置の非存在下で予想されるものを超えて対象の生存を延長するために、対象への、例えば、カリジンおよびｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン関連の疾患もしくは障害（例えば、炎症性疾患）を有し、またはこのような疾患もしくは障害を有する素因がある対象への、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントの投与を使用する。
本明細書で用いられる「カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン関連の疾患または障害」の語には、変更されたレベルまたは活性のカリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンが見出される、疾患状態および／または疾患状態に関連する症状が含まれる。例示のカリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン関連の疾患または障害には、それだけには限定されないが、疼痛および線維症が含まれる。
本明細書で用いられる、「有効量」の語は、対象に投与した場合に、本明細書に記載するカリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン関連の疾患または障害の処置、予後診断、または診断をもたらすのに十分である、カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンに結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントの量を意味する。治療有効量は、処置される対象および疾患状態、対象の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与様式などに応じて変化し、当業者であれば容易に決定することができる。投与するための投与量は、例えば、本発明による抗体またはその抗原結合性フラグメント約１ｎｇから約１０，０００ｍｇ、約１ｕｇから約５，０００ｍｇ、約１ｍｇから約１，０００ｍｇ、約１０ｍｇから約１００ｍｇの範囲であってよい。投与量レジメンは、最適の治療反応をもたらすように調節することができる。有効量はまた、抗体またはその抗原結合性フラグメントのあらゆる毒性作用または有害作用（すなわち、副作用）が最小化され、または有益な作用が上回る量でもある。
本明細書で用いられる、「対象」の語は、あらゆるヒトまたは非ヒト動物を含む。
本明細書で用いられる、「エピトープ」の語は、パラトープとして知られる抗体分子の可変領域において特定の抗原結合性部位と相互作用する、抗原決定基を意味する。単一の抗原は１つを超えるエピトープを有し得る。このように、異なる抗体は抗原上の異なる領域に結合し得、異なる生物学的作用を有し得る。エピトープはコンフォメーション的、または直鎖状のいずれかであってよい。コンフォメーション的なエピトープは、直鎖状ポリペプチド鎖の異なるセグメントから空間的に並置されたアミノ酸によって生成される。直鎖状のエピトープは、ポリペプチド鎖において隣接するアミノ酸残基によって生成されるものである。
ここで、本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる単数形の「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに別の方法で指示しなければ複数の指示対象も含むことに留意されたい。
ＩＩ．抗カリジンまたは抗ｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン抗体
一態様において、本発明は、カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。本発明の抗体の例示のＶＨ、ＶＬ、およびＣＤＲのアミノ酸配列を表１に記載する。
Figure 2015513903
Figure 2015513903
Figure 2015513903
Figure 2015513903
Figure 2015513903
ある実施形態において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、３２、３３、３４、３５、３６、３７、４０、４１、４２、４３、４４、４７、４８、４９、５０、５１ ５２、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、および７０からなる群から選択される１つまたはそれ以上のＣＤＲ領域アミノ酸配列を含む。
他の実施形態において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、それぞれ、
ａ）配列番号７、８、および９、
ｂ）配列番号１３、１４、および１５、
ｃ）配列番号３２、３３、および３４、
ｄ）配列番号４０、４１、および４２、
ｅ）配列番号４７、４８、および４９、
ｆ）配列番号５５、５６、および５７、ならびに
ｇ）配列番号６３、６４、および６５
からなる群から選択される、ＨＣＤＲ３、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ１領域のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、それぞれ、
ａ）配列番号１０、１１、および１２、
ｂ）配列番号１６、１７、および１８、
ｃ）配列番号３５、３６、および３７、
ｄ）配列番号４３、１７、および４４、
ｅ）配列番号５０、５１、および５２、
ｆ）配列番号５８、５９、および６０、
ｇ）配列番号６６、６７、および６８、ならびに
ｈ）配列番号６９、２５、および７０、からなる群から選択される、ＬＣＤＲ３、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ１領域のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、それぞれ、
ａ）配列番号７、８、９、１０、１１、および１２、
ｂ）配列番号１３、１４、１５、１６、１７、および１８、
ｃ）配列番号３２、３３、３４、３５、３６、および３７、
ｄ）配列番号４０、４１、４２、４３、１７、および４４、
ｅ）配列番号４７、４８、４９、５０、５１、および５２、ならびに
ｆ）配列番号５５、５６、５７、５８、５９、および６０
からなる群から選択される、ＨＣＤＲ３、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ１、ＬＣＤＲ３、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ１領域のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態において、本発明は、本明細書に開示するマウス抗体から１つまたはそれ以上のＣＤＲ領域（もしくは保存的に修飾されているそのバリアント）を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。ヒト化のあらゆる方法を用いて、本発明のヒト化抗体を産生することができる。適切な方法を本明細書に開示し、実施例４に具体的に例示する。
特定の一実施形態において、ヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントは、
１３、１４、および１５にそれぞれ記載のＨＣＤＲ３、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ１領域のアミノ配列、ならびにＨ１、Ｈ５、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１６、Ｈ３８、Ｈ４０、Ｈ４１、Ｈ４３、Ｈ４４、Ｈ６６、Ｈ７５、Ｈ７９、Ｈ８１、Ｈ８２Ａ、Ｈ８３、Ｈ８７、およびＨ１０８からなる群から選択される位置に１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換を含む重鎖可変領域、ならびに／または、
１６、１７、および１８にそれぞれ記載のＬＣＤＲ３、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ１領域のアミノ配列、ならびにＬ５、Ｌ９、Ｌ１５、Ｌ１８、Ｌ１９、Ｌ２１、Ｌ２２、Ｌ４３、Ｌ６３、Ｌ７８、Ｌ７９、Ｌ８３、Ｌ８５、Ｌ１００、およびＬ１０４からなる群から選択される位置に１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換を含む軽鎖可変領域（Ｋａｂａｔの番号付けの規則にしたがって）
を含む。
他の実施形態において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号１９、２０、２１、２２、２４、２５、３８、４５、５３、および／または６１に記載のＶＨ領域アミノ酸配列を含む。
他の実施形態において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号２６、２７、２８、２９、２９、３０、３１、３９、４６、５４、および／または６２に記載のＶＬ領域アミノ酸配列を含む。
他の実施形態において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号１９および２６、配列番号２０および２７、配列番号２１および２８、配列番号２２および２８、配列番号２３および２９、配列番号２４および３０、配列番号２５および３１、配列番号３８および３９、配列番号４５および４６、配列番号５３および５４、または配列番号６１および６２からなる群からそれぞれ選択されるＶＨおよびＶＬ領域アミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、３２、３３、３４、３５、３６、３７、４０、４１、４２、４３、４４、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５５、５６、５７、５８、５９および６０からなる群から選択される１つまたはそれ以上のＣＤＲ領域アミノ酸配列を含み、１つまたはそれ以上のＣＤＲ領域アミノ酸配列は、少なくとも１つまたはそれ以上の保存的なアミノ酸置換を含む。
本発明はまた、本発明の抗体のＣＤＲアミノ酸配列（例えば、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、３２、３３、３４、３５、３６、３７、４０、４１、４２、４３、４４、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５５、５６、５７、５８、５９および６０）における「保存的なアミノ酸置換」、すなわち、カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンなどの抗原に対する抗体の結合を抑止しないアミノ酸配列の修飾も包含する。保存的なアミノ酸置換には、１クラスにおけるアミノ酸の同じクラスのアミノ酸による置換が含まれ、クラスは、標準のＤａｙｈｏｆｆ頻度交換マトリクスまたはＢＬＯＵＳＵＭマトリクスなどによって決定される通り、天然において見出される相同のタンパク質における、アミノ酸側鎖の共通の物理化学的性質および高頻度の置換によって規定される。一般的な６つのクラスのアミノ酸側鎖がカテゴリー化されており、クラスＩ（Ｃｙｓ）、クラスＩＩ（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ）、クラスＩＩＩ（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ）、クラスＩＶ（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）、クラスＶ（Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ）、およびクラスＶＩ（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）が含まれる。例えば、Ａｓｐの、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、またはＧｌｕなどのクラスＩＩＩの別の残基に対する置換が、保存的置換である。このように、抗カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン抗体における予想される非必須アミノ酸残基が、同じクラスからの別のアミノ酸残基で置換されるのが好ましい。抗原の結合を排除しないアミノ酸の保存的置換を同定する方法は、当技術分野においてよく知られている（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３２巻、１１８０〜１１８７頁（１９９３年）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、１２巻（１０）、８７９〜８８４頁（１９９９年）；およびＢｕｒｋｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４巻、４１２〜４１７頁（１９９７年）を参照されたい）。
別の一実施形態において、本発明は、それぞれ、配列番号１９、２０、２１、２２、２４、２５、３８、４５、５３、または６１に記載のＶＨ領域のアミノ酸配列、または配列番号２６、２７、２８、２９、２９、３０、３１、３９、４６、５４、または６２に記載のＶＬ領域アミノ酸配列に対して、約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性で、ＶＨおよび／またはＶＬ領域アミノ酸配列を含む、抗カリジンもしくはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン抗体またはこれらの抗原結合性フラグメントを提供する。
別の一実施形態において、本発明は、配列番号１９および２５、配列番号３８および３９、配列番号４５および４６、配列番号５３および５４、または配列番号６１および６２にそれぞれ記載のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列を含む抗体またはその抗原結合性フラグメントと同じエピトープに結合し、および／または交差競合（ｃｒｏｓｓ ｃｏｍｐｅｔｅ）する、抗カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン抗体を提供する。このような抗体は、例えば、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）ベースの競合アッセイを含めたルーチンの競合結合アッセイを用いて同定することができる。
ある実施形態において、本発明の抗体は、「Ｐｒｏ４キンク」コンフォメーションを取るカリジン（ＫＤ）またはｄｅｓＡｒｇ１０−カリジン（ＤＡＫＤ）のコンフォメーションのエピトープに結合する。図１７に示す通り、「Ｐｒｏ４キンク」コンフォメーションの特徴は、ＫＤまたはＤＡＫＤの主鎖ポリペプチドバックボーンにおけるプロリン４のＩＩ型タイトターンである。当業者には知られている通り、ＩＩ型タイトターンのコンフォメーションは３つの残基（Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３）を含み、残基Ｘ１のカルボニルは、残基Ｘ３（典型的にはグリシンである）のアミドＮと水素結合を形成する（参照によって本明細書に組み入れる、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ＪＳ．「Ｔｈｅ ａｎａｔｏｍｙ ａｎｄ ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．」、Ａｄｖ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．、１９８１年、３４巻、１６７〜３３９頁を参照されたい）。したがって、ある実施形態において、ＩＩ型タイトターンのコンフォメーションは、ＫＤまたはＤＡＤＫのＰｒｏ３−Ｐｒｏ４−Ｇｌｙ５モチーフによって形成される。より具体的な実施形態において、「Ｐｒｏ４キンク」コンフォメーションは、ＫＤ（１〜２および６〜９）またはＤＡＫＤの残りのアミノ酸の全部または実質的に全部が、空間的に積み重なって疎水性側鎖とアラインするＳ字形リピートを取ることにより、さらに規定される。
ＩＩＩ．修飾された抗カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン抗体
ある実施形態において、本発明の抗カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン抗体は、１つまたはそれ以上の修飾を含み得る。本発明の抗カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン抗体の修飾形態は、当技術分野において知られているあらゆる技術を用いて作成することができる。
ｉ）免疫原性の低減
ある実施形態において、本発明の抗カリジンもしくはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン抗体、またはこれらの抗原結合性フラグメントは、当技術分野において認められている技術を用いてこれらの免疫原性を低減するように修飾される。例えば、抗体またはそのフラグメントを、キメラ化、ヒト化、および／または脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）することができる。
一実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントはキメラであってよい。キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体およびヒト免疫グロブリン定常領域に由来する可変領域を有する抗体など、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する抗体である。キメラ抗体またはそのフラグメントを生成するための方法は、当技術分野において知られている。例えば、その全文を参照によって本明細書に組み入れる、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻、１２０２頁（１９８５年）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４巻、２１４頁（１９８６年）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１２５巻、１９１〜２０２頁（１９８９年）；米国特許第５，８０７，７１５号、第４，８１６，５６７号、および第４，８１６，３９７号を参照されたい。「キメラ抗体」を生成するために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８１巻、８５１〜８５５頁（１９８４年）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３１２巻、６０４〜６０８頁（１９８４年）；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ、３１４巻、４５２〜４５４頁（１９８５年））を、前記分子の合成に用いてもよい。例えば、マウス抗カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン抗体分子の結合特異性をコードする遺伝子配列を、適切な生物活性のヒト抗体分子からの配列と一緒に融合してもよい。本明細書で用いられる、キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体およびヒト免疫グロブリン定常領域に由来する可変領域を有する分子、例えば、ヒト化抗体など、異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。
別の一実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントはヒト化されている。ヒト化抗体は、非ヒト抗体からの１つまたはそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト抗体分子からのフレームワーク領域を含む結合特異性を有する。しばしば、ヒトフレームワーク領域におけるフレームワーク残基は、抗原の結合を改変し、好ましくは改善するために、ＣＤＲドナー抗体から相当する残基で置換される。これらのフレームワーク置換は、当技術分野においてよく知られている方法により、例えば、特定の位置の普通ではないフレームワーク残基を同定するために、ＣＤＲとフレームワーク残基との相互作用をモデリングして抗原結合および配列比較に重要なフレームワーク残基を同定することにより、同定される（例えば、その全文を参照によって本明細書に組み入れる、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻、３２３頁（１９８８年）を参照されたい）。抗体は、例えば、ＣＤＲグラフト化（ＥＰ２３９，４００；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７、米国特許第５，２２５，５３９号、第５，５３０，１０１号、および第５，５８５，０８９号）、ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（ＥＰ５９２，１０６；ＥＰ５１９，５９６；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２８巻（４／５）、４８９〜４９８頁（１９９１年）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７巻（６）、８０５〜８１４頁（１９９４年）；Ｒｏｇｕｓｋａ．ら、ＰＮＡＳ、９１巻、９６９〜９７３号（１９９４年））、および鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を含めた、当技術分野において知られている様々な技術を用いてヒト化することができる。
特定の一実施形態において、免疫認識の間および免疫認識時の抗体分子の柔軟性の影響に基づくヒト化方法が用いられる（その全文を参照によって本明細書に組み入れる、ＷＯ２００９／０３２６６１を参照されたい）。タンパク質の柔軟性は、タンパク質分子の分子運動に関連する。タンパク質の柔軟性は、全タンパク質、タンパク質の一部分、または単一のアミノ酸残基が、相互に著しく異なるコンフォメーションのアンサンブル（ｅｎｓｅｍｂｌｅ）を取る能力である。タンパク質の柔軟性に関する情報は、タンパク質のＸ線結晶学実験（例えば、Ｋｕｎｄｕら、２００２年、Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ、８３巻、７２３〜７３２号を参照されたい）、核磁気共鳴実験（例えば、Ｆｒｅｅｄｂｅｒｇら、Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ、１９９８年、１２０巻（３１）、７９１６〜７９２３頁を参照されたい）を行うことにより、または分子動力学（ＭＤ）シミュレーションを作動することにより得ることができる。タンパク質のＭＤシミュレーションはコンピュータ上で行われ、原子の相互の物理的相互作用を算出することにより、ある期間にわたる全タンパク質原子の運動を決定することができる。ＭＤシミュレーションの出力は、シミュレーションの期間にわたる、試験されるタンパク質の軌跡である。軌跡は、タンパク質のコンフォメーションのアンサンブルであり、スナップショットとも呼ばれ、シミュレーションの期間にわたって周期的に、例えば、１ピコ秒（ｐｓ）ごとにサンプリングされる。タンパク質のアミノ酸残基の柔軟性を定量化することができるのは、スナップショットのアンサンブルを分析することによる。このように、柔軟な残基は、その残基が内部に存在するポリペプチドとの関連では、異なるコンフォメーションのアンサンブルを取るものである。ＭＤ方法は当技術分野において知られており、例えば、Ｂｒｏｏｋｓら、「Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ａ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｆ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ」（Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８年）を参照されたい。Ａｍｂｅｒ（Ｃａｓｅら（２００５年）Ｊ Ｃｏｍｐ Ｃｈｅｍ、２６巻、１６６８〜１６８８頁を参照されたい）、Ｃｈａｒｍｍ（Ｂｒｏｏｋｓら、（１９８３年）Ｊ Ｃｏｍｐ Ｃｈｅｍ、４巻、１８７〜２１７頁；およびＭａｃＫｅｒｅｌｌら（１９９８年）「Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、１巻、２７１〜１７７頁、Ｓｃｈｌｅｙｅｒら編集、Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓを参照されたい）、またはＩｍｐａｃｔ（Ｒｉｚｚｏら、Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ、２０００年、１２２巻（５１）、１２８９８〜１２９００頁を参照されたい）など、いくつかのソフトウエアによりＭＤシミュレーションが可能になる。
ほとんどのタンパク質複合体は、比較的大きな、平面の埋もれた表面を共有し、結合パートナーが柔軟性であることがタンパク質複合体の可塑性の原因となり、そのためタンパク質複合体は相互にコンフォメーション的に適応できるようになることが示されている。（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（２０００年）８巻、Ｒ１３７〜Ｒ１４２頁）。したがって、「誘導適合」の例が、タンパク質−タンパク質の界面において支配的な役割を果たすことが示されている。さらに、タンパク質は、形状 サイズ、および組成の多様なリガンドに実際に結合すること（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００２年）１１巻、１８４〜１８７頁）、ならびにコンフォメーションの多様性は異なるパートナーを認識する能力の不可欠な成分であると考えられること（Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００３年）２９９巻、１３６２〜１３６７頁）を示す、着実に増大するデータ本体が存在する。柔軟な残基は、タンパク質−タンパク質パートナーの結合に関与する（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（２００６年）１４巻、６８３〜６９３頁）。
柔軟な残基は、メモリーＢ細胞によって認識される可能性があり、免疫原性反応を誘発する可能性がある、相互作用エリアのアンサンブルを提供する様々なコンフォメーションを取ることができる。このように、修飾された抗体により示されるコンフォメーションおよび認識エリアのアンサンブルが、それらのヒト抗体が取るアンサンブルにできるだけ類似するように、フレームワークから数々の残基を修飾することにより、抗体をヒト化することができる。これは、（１）親のｍＡｂのホモロジーモデルを構築し、ＭＤシミュレーションを作動することにより、（２）柔軟な残基、および非ヒト抗体分子の最も柔軟な残基の同一性を分析し、ならびに異種性または分解反応の起源である可能性がある残基またはモチーフを同定することにより、（３）親の抗体として認識エリアの最も類似するアンサンブルを示すヒト抗体を同定することにより、（４）変異させようとする柔軟な残基を決定し、異種性および分解の起源である可能性がある残基またはモチーフも変異させ、ならびに（５）知られているＴ細胞またはＢ細胞のエピトープの存在を調べることにより、限定された数の残基を修飾することにより実現することができる。柔軟な残基は、暗溶媒モデルを用いて本明細書において教示するＭＤ算出を用いて見出すことができ、暗溶媒モデルはシミュレーションの期間にわたる水溶媒のタンパク質原子との相互作用の説明となる。
柔軟な残基のセットを可変軽鎖および可変重鎖内で同定した後は、対象の抗体に近似する１セットのヒト重鎖および軽鎖可変領域フレームワークを同定する。これは、抗体ヒト生殖系列配列のデータベースに対して、柔軟な残基のセットに対するＢＬＡＳＴなどを用いて行うことができる。これは、親のｍＡｂの動力学を一ライブラリーの生殖系列の基準配列の動力学と比べることによっても行うことができる。ＣＤＲ残基および隣接する残基は、抗原に対する高親和性が確実に保存されるように、検索から除外する。次いで、柔軟な残基が置き換えられる。
いくつかのヒトの残基が類似のホモロジーを示す場合、選択は、ヒト化抗体の溶液挙動に影響を及ぼす可能性がある残基の性質によっても駆動される。例えば、疎水性残基にわたって暴露される柔軟性ループでは、極性の残基が好ましい。不安定性および異種性の潜在的な起源である残基は、これらがＣＤＲに見出されるとしてもやはり変異している。これら残基には、暴露されているメチオニンが含まれる、というのは、スルホキシド形成は、酸素ラジカル、酸に不安定な結合のタンパク分解性の切断（例えば、Ａｓｐ−Ｐｒｏジペプチドの切断）（Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ Ｒｅｓ（２００４年）６１巻、１３７〜１５４頁）、暴露されているアスパラギン残基とその後に続く小型のアミノ酸（例えば、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、またはＣｙｓ）に見出される脱アミノ部位（Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ（２００６年）８３７巻、３５〜４３頁）、およびＮ−グリコシル化部位（例えば、Ａｓｎ−Ｘ−ｓｅｒ／Ｔｈｒ部位）に起因し得るからである。暴露されているメチオニンはＬｅｕにより置換され、暴露されているアスパラギンはグルタミンまたはアスパラギン酸塩により置き換えられ、または後続の残基が変更されるのが典型的である。グリコシル化部位（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）に対して、ＡｓｎまたはＳｅｒ／Ｔｈｒ残基のいずれかが変更される。
得られる複合性の抗体配列を、知られているＢ細胞または直鎖状のＴ細胞エピトープの存在に対して点検する。例えば、公に入手できる免疫エピトープデータベース（ＩＥＤＰ）で検索を行う（ＰＬｏｓ Ｂｉｏｌ（２００５年）３巻（３）、ｅ９１）。知られているエピトープが複合性の配列内で見出されたら、別の一セットのヒト配列を回収し、置換する。このように、米国特許第５，６３９，６４１号の再浮上した方法と異なり、Ｂ細胞媒介性およびＴ細胞媒介性両方の免疫原性反応は、この方法によって対処される。この方法はまた、ＣＤＲグラフト化で時折観察される活性の喪失の問題を回避する（米国特許第５，５３０，１０１号）。さらに、安定性および溶解性の問題も、操作および選択プロセスにおいて考慮され、低免疫原性、抗原高親和性に対して最適化され、生物物理学的性質が改善された抗体がもたらされる。
いくつかの実施形態において、脱免疫化を用いて、抗体またはその抗原結合性フラグメントの免疫性を低減することができる。本明細書で用いられる、「脱免疫化」の語は、抗体またはその抗原結合性フラグメントがＴ細胞のエピトープを修飾する改変を含む（例えば、ＷＯ９８５２９７６Ａ１、ＷＯ００３４３１７Ａ２を参照されたい）。例えば、出発の抗体からＶＨおよびＶＬ配列を分析してもよく、相補性決定領域（ＣＤＲ）および配列内の他の主要な残基に関してエピトープの位置を示すヒトＴ細胞エピトープ「マップ」を各Ｖ領域から産生してもよい。最終の抗体の活性を改変する危険性の低い代替のアミノ酸置換を同定するために、Ｔ細胞エピトープマップから個々のＴ細胞のエピトープを分析する。アミノ酸置換の組合せを含むある範囲の代替のＶＨおよびＶＬ配列をデザインし、これらの配列を引き続き、本明細書に開示する診断方法および処置方法において用いるために、ある範囲のカリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン特異的抗体またはそのフラグメント中に組み入れ、次いでこれらを機能に対して試験する。１２個と２４個の間のバリアント抗体が産生され、試験されるのが典型的である。修飾されたＶ領域およびヒトＣ領域を含む完全な重鎖および軽鎖の遺伝子を、次いで、発現ベクター中にクローニングし、後続のプラスミドを、全抗体を生成するために細胞系中に導入する。次いで、抗体を適切な生化学アッセイおよび生物学的アッセイにおいて比較し、最適なバリアントを同定する。
ｉｉ）エフェクター機能およびＦｃ修飾
本発明の抗カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン抗体は、１つまたはそれ以上のエフェクター機能を媒介する、抗体定常領域（例えば、ＩｇＧ定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４定常領域）を含むことができる。例えば、補体のＣ１成分が抗体定常領域に結合すると、補体系を活性化し得る。補体の活性化は、オプソニン作用および細胞の病原体の溶解において重要である。補体の活性化はまた、炎症反応を刺激し、自己免疫過敏症にも関与し得る。さらに、抗体は、Ｆｃ領域によって様々な細胞上の受容体に結合し、抗体のＦｃ領域上のＦｃ受容体結合部位は細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する。ＩｇＧ（ガンマ受容体）、ＩｇＥ（イプシロン受容体）、ＩｇＡ（アルファ受容体）、およびＩｇＭ（ミュー受容体）を含めた、様々なクラスの抗体に特異的である数々のＦｃ受容体が存在する。抗体の、細胞表面上のＦｃ受容体に対する結合は、抗体がコーティングする粒子の貪食および破壊、免疫複合体のクリアランス、抗体がコーティングする標的細胞のキラー細胞による溶解（抗体依存性細胞媒介性傷害またはＡＤＣＣと呼ばれる）、炎症メディエーターの放出、胎盤通過、および免疫グロブリン生成の制御を含めた、数々の重要なおよび多様な生物学的応答を誘発する。好ましい実施形態において、本発明の抗体またはそのフラグメントは、Ｆｃ−ガンマ受容体に結合する。代替の実施形態において、本発明の抗カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン抗体は、１つもしくはそれ以上のエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ活性）を欠き、および／またはＦｃ受容体に結合することができない定常領域を含み得る。
本発明のある実施形態は、免疫原性がほぼ同じである非改変の全体の抗体と比べた場合、エフェクター機能の低減もしくは増強、非共有結合性に二量体化する能力、腫瘍部位に局在化する能力の増大、血清半減期の低減、または血清半減期の増大など、望ましい生化学的特徴をもたらすように、１つまたはそれ以上の定常領域ドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸が欠失され、またはその他の点で改変されている、抗カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン抗体を含む。例えば、本明細書に記載する診断方法および処置方法において用いるためのある種の抗体またはそのフラグメントは、免疫グロブリン重鎖に類似のポリペプチド鎖を含むが、１つまたはそれ以上の重鎖ドメインの少なくとも一部を欠く、ドメイン欠損抗体（ｄｏｍａｉｎ ｄｅｌｅｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）である。例えば、ある抗体において、修飾された抗体の定常領域の１ドメイン全体が欠失され、例えば、ＣＨ２ドメインの全部または部分が欠失される。
他のある実施形態において、抗カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン抗体は、異なる抗体アイソタイプに由来する定常領域（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の２つ以上からの定常領域）を含む。他の実施形態において、抗カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン抗体は、キメラのヒンジ（すなわち、異なる抗体アイソタイプのヒンジドメインに由来するヒンジ部分を含むヒンジ、例えば、ＩｇＧ４分子からの上部ヒンジドメインおよびＩｇＧ１中央ヒンジドメイン）を含む。一実施形態において、抗カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン抗体は、ヒトＩｇＧ４分子からＦｃ領域またはその部分、および分子のコアヒンジ領域におけるＳｅｒ２２８Ｐｒｏ変異（ＥＵ番号付け）を含む。
ある種の抗カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン抗体において、Ｆｃ部分は、当技術分野において知られている技術を用いて、エフェクター機能を増大または低減するように変異されていてよい。例えば、定常領域ドメインの欠失または不活性化（点変異もしくは他の手段による）により、循環性の修飾されている抗体のＦｃ受容体結合が低減し、それにより腫瘍の局在化を増大し得る。他の場合では、本発明に一致する定常領域の修飾は補体の結合を加減し、ゆえに血清半減期およびコンジュゲートした細胞毒の非特異的な会合を低減し得る。定常領域のさらに他の修飾を用いて、抗原の特異性または柔軟性の増大により局在化を増強させる、ジスルフィド連結またはオリゴ糖部分を修飾してもよい。腫瘍の局在化、体内分布、および血清半減期など、得られた物理学的プロファイル、バイオアベイラビリティ、および修飾の他の生化学的効果は、過度の実験をせずに良く知られている免疫学的技術を用いて、容易に測定し、定量することができる。
ある実施形態において、本発明の抗体において用いられるＦｃドメインはＦｃバリアントである。本明細書で用いられる、「Ｆｃバリアント」の語は、前記Ｆｃドメインが由来する野生型Ｆｃドメインに対して少なくとも１つのアミノ酸置換を有するＦｃドメインを意味する。例えば、ＦｃドメインがヒトＩｇＧ抗体に由来する場合、前記ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのＦｃバリアントは、前記Ｆｃドメインに対して少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでいる。
Ｆｃバリアントのアミノ酸置換は、Ｆｃドメイン内のあらゆる位置（すなわち、ＥＵ規則のあらゆるアミノ酸位置）に位置していてよい。一実施形態において、Ｆｃバリアントは、ヒンジドメインまたはその部分に位置するアミノ酸位置での置換を含む。別の一実施形態において、Ｆｃバリアントは、ＣＨ２ドメインまたはその部分に位置するアミノ酸位置での置換を含む。別の一実施形態において、Ｆｃバリアントは、ＣＨ３ドメインまたはその部分に位置するアミノ酸位置での置換を含む。別の一実施形態において、Ｆｃバリアントは、ＣＨ４ドメインまたはその部分に位置するアミノ酸位置での置換を含む。
本発明の抗体は、エフェクター機能および／またはＦｃＲ結合において改善（例えば、低減または増強）をもたらすことが知られている、技術分野で認められているあらゆるＦｃバリアントを用いることができる。前記Ｆｃバリアントは、例えば、その各々を参照によって本明細書に組み入れる、国際ＰＣＴ公開ＷＯ８８／０７０８９Ａ１、ＷＯ９６／１４３３９Ａ１、ＷＯ９８／０５７８７Ａ１、ＷＯ９８／２３２８９Ａ１、ＷＯ９９／５１６４２Ａ１、ＷＯ９９／５８５７２Ａ１、ＷＯ００／０９５６０Ａ２、ＷＯ００／３２７６７Ａ１、ＷＯ００／４２０７２Ａ２、ＷＯ０２／４４２１５Ａ２、ＷＯ０２／０６０９１９Ａ２、ＷＯ０３／０７４５６９Ａ２、ＷＯ０４／０１６７５０Ａ２、ＷＯ０４／０２９２０７Ａ２、ＷＯ０４／０３５７５２Ａ２、ＷＯ０４／０６３３５１Ａ２、ＷＯ０４／０７４４５５Ａ２、ＷＯ０４／０９９２４９Ａ２、ＷＯ０５／０４０２１７Ａ２、ＷＯ０５／０７０９６３Ａ１、ＷＯ０５／０７７９８１Ａ２、ＷＯ０５／０９２９２５Ａ２、ＷＯ０５／１２３７８０Ａ２、ＷＯ０６／０１９４４７Ａ１、ＷＯ０６／０４７３５０Ａ２、およびＷＯ０６／０８５９６７Ａ２、または米国特許第５，６４８，２６０号、第５，７３９，２７７号、第５，８３４，２５０号、第５，８６９，０４６号、第６，０９６，８７１号、第６，１２１，０２２号、第６，１９４，５５１号、第６，２４２，１９５号、第６，２７７，３７５号、第６，５２８，６２４号、第６，５３８，１２４号、第６，７３７，０５６号、第６，８２１，５０５号、第６，９９８，２５３号、および第７，０８３，７８４号に開示されているあらゆる１つのアミノ酸置換を含むことができる。例示の一実施形態において、本発明の抗体は、ＥＵ２６８位にアミノ酸置換（例えば、Ｈ２６８ＤまたはＨ２６８Ｅ）を含むＦｃバリアントを含むことができる。別の例示の一実施形態において、本発明の抗体は、ＥＵ２３９位（例えば、Ｓ２３９ＤもしくはＳ２３９Ｅ）および／またはＥＵ３３２位（例えば、Ｉ３３２ＤもしくはＩ３３２Ｑ）にアミノ酸置換を含むＦｃバリアントを含むことができる。
ある実施形態において、本発明の抗体は、抗体の抗原非依存的エフェクター機能、特に抗体の循環半減期を改変するアミノ酸置換を含むＦｃバリアントを含むことができる。このような抗体は、これら置換のない抗体と比べた場合、ＦｃＲｎに対する結合の増大または低減のいずれかを表し、ゆえに血清における半減期のそれぞれ増大または低減を有する。ＦｃＲｎに対して改善された親和性を有するＦｃバリアントは血清半減期がより長いことが予想され、このような分子は、慢性疾患または障害の処置など、投与した抗体の半減期が長いことが望ましい場合の哺乳動物の処置の方法において有用な適用がある。これとは対照的に、ＦｃＲｎ結合親和性の低減したＦｃバリアントは半減期がより短いことが予想され、このような分子は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏの画像診断において、または長期間循環中に存在する場合に出発抗体に毒性の副作用がある場合においてなど、循環時間の短縮が有利であり得る場合に哺乳動物に投与するのに有用である。ＦｃＲｎ結合親和性の低下したＦｃバリアントはまた、胎盤を通過する可能性が低く、したがって妊婦における疾患または障害を処置するのにも有用である。さらに、低減したＦｃＲｎ結合親和性が望ましいことがある他の適用には、脳、腎臓、および／または肝臓の局在化が望ましい適用が含まれる。例示の一実施形態において、本発明の改変された抗体は、脈管構造から腎糸球体の上皮を越えた輸送の低下を示す。別の一実施形態において、本発明の改変された抗体は、脳から血液脳関門（ＢＢＢ）を超え、血管の間隙中への輸送の低下を示す。一実施形態において、ＦｃＲｎ結合の改変された抗体は、Ｆｃドメインの「ＦｃＲｎ結合性ループ」内に１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有するＦｃドメインを含む。ＦｃＲｎ結合性ループは、２８０〜２９９のアミノ酸残基（ＥＵ番号付けによる）からなる。ＦｃＲｎ結合活性を改変した例示のアミノ酸置換は、参照によって本明細書に組み入れる、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ０５／０４７３２７に開示されている。ある種の例示の実施形態において、本発明の抗体またはそのフラグメントは、以下の置換を１つまたはそれ以上有するＦｃドメインを含む：Ｖ２８４Ｅ、Ｈ２８５Ｅ、Ｎ２８６Ｄ、Ｋ２９０Ｅ、およびＳ３０４Ｄ（ＥＵ番号付け）。
他の実施形態において、本明細書に記載する診断および処置方法において用いるための抗体は、グリコシル化を低減または排除するように改変されている、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４重鎖定常領域などの定常領域を有する。例えば、本発明の抗体は、抗体のグリコシル化を改変するアミノ酸置換を含むＦｃバリアントを含むこともできる。例えば、前記Ｆｃバリアントは、低減したグリコシル化（例えば、Ｎ連結またはＯ連結したグリコシル化）を有することができる。例示の実施形態において、Ｆｃバリアントは、アミノ酸の２９７位（ＥＵ番号付け）に通常見出されるＮ連結したグリカンのグリコシル化の低減を含む。別の一実施形態において、抗体は、グリコシル化モチーフの付近またはグリコシル化モチーフ内、例えば、アミノ酸配列ＮＸＴまたはＮＸＳを含んでいるＮ連結したグリコシル化モチーフ内のアミノ酸置換を有する。特定の一実施形態において、抗体は、アミノ酸の２２８位または２９９位（ＥＵ番号付け）にアミノ酸置換を有するＦｃバリアントを含む。より詳しい実施形態において、抗体は、Ｓ２２８ＰおよびＴ２９９Ａ変異（ＥＵ番号付け）を含むＩｇＧ１またはＩｇＧ４の定常領域を含む。
グリコシル化の低減または改変を付与する例示のアミノ酸置換は、参照によって本明細書に組み入れる、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ０５／０１８５７２に開示されている。好ましい実施形態において、本発明の抗体またはそのフラグメントは、グリコシル化を排除するように修飾される。このような抗体またはそのフラグメントは、「アグリ（ａｇｌｙ）」抗体またはそのフラグメント（例えば、「アグリ」抗体）と呼ばれることがある。理論によって拘泥しようとするものではないが、「アグリ」抗体またはそのフラグメントは、ｉｎ ｖｉｖｏで安全性および安定性の改善されたプロファイルを有し得る。例示のアグリ抗体またはそのフラグメントは、Ｆｃエフェクター機能を欠くＩｇＧ４抗体のアグリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）Ｆｃ領域を含み、それによりカリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンを発現する正常の重要な器官に対するＦｃ媒介性毒性に対する潜在性を排除する。さらに他の実施形態において、本発明の抗体またはそのフラグメントは、改変されたグリカンを含む。例えば、抗体は、Ｆｃ領域のＡｓｎ２９７のＮグリカン上に少数のフコース残基を有することができ、すなわち、アフコシル化されている（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）。別の一実施形態において、抗体は、Ｆｃ領域のＡｓｎ２９７のＮグリカン上に改変された数のシアル酸残基を有することができる。
ｉｉｉ）共有結合性の付着
共有結合性の付着が、抗体がその同族のエピトープに特異的に結合するのを妨げないように、本発明の抗カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン抗体を、抗体に対する分子の共有結合性の付着などにより修飾してもよい。例えば、限定的なものではないが、本発明の抗体またはそのフラグメントを、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、知られている保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク分解性の切断、細胞のリガンドまたは他のタンパク質に対する連結などにより修飾してもよい。あらゆる多数の化学的修飾を、それだけには限定されないが、特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化などを含めた知られている技術により行ってもよい。さらに、誘導体は、１つまたはそれ以上の非古典的なアミノ酸を含むことができる。
本発明の抗体またはそのフラグメントは、Ｎ末端もしくはＣ末端で異種性のポリペプチドにさらに組換え的に融合していてもよく、またはポリペプチドもしくは他の組成物に対して化学的にコンジュゲートしていてもよい（共有結合性および非共有結合性のコンジュゲートを含む）。例えば、抗カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン抗体は、検出アッセイにおける標識として有用な分子、および異種性のポリペプチド、薬物、放射性核種、または毒素などのエフェクター分子に組換え的に融合またはコンジュゲートしていてもよい。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０８４９５、ＷＯ９１／１４４３８、ＷＯ８９／１２６２４、米国特許第５，３１４，９９５号、およびＥＰ３９６，３８７を参照されたい。
抗カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏの半減期を増大するために、または当技術分野において知られている方法を用いた免疫アッセイにおいて用いるために、異種性のポリペプチドに融合していてもよい。例えば、一実施形態において、ＰＥＧが本発明の抗カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン抗体にコンジュゲートして、ｉｎ ｖｉｖｏの半減期を増大することができる。Ｌｅｏｎｇ，Ｓ．Ｒ．ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、１６巻、１０６頁（２００１年）；Ａｄｖ．ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．、５４巻、５３１頁（２００２年）；またはＷｅｉｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ、３０巻、５１２頁（２００２年）。
さらに、本発明の抗カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン抗体は、ペプチドなどのマーカー配列に融合して、精製または検出を促進してもよい。好ましい実施形態において、マーカーのアミノ酸配列は、多くが市販されている数ある中で、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ、Ｉｎｃ．、９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、Ｃａｌｉｆ．、９１３１１）において提供されるタグなどのヘキサヒスチジンペプチドである。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６巻、８２１〜８２４頁（１９８９年）において記載されている通り、ヘキサヒスチジンは融合タンパク質の簡便な精製をもたらす。精製に有用な他のペプチドタグには、それだけには限定されないが、インフルエンザのヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応する「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ、３７巻、７６７頁（１９８４年））および「フラグ」タグが含まれる。
本発明の抗カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン抗体は、例えば、分子の治療上の性質を改善するために、標的の検出を促進するために、または患者の画像作成もしくは治療のために、非コンジュゲート形態において用いてもよく、または様々な分子の少なくとも１つにコンジュゲートしていてもよい。本発明の抗カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン抗体は、精製を行う場合は精製の前または後のいずれかに、標識化またはコンジュゲートすることができる。特に、本発明の抗カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン抗体は、治療薬、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的応答調節剤、医薬品、またはＰＥＧにコンジュゲートしていてもよい。
本発明は、診断薬または治療薬にコンジュゲートしている、本発明の抗カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン抗体をさらに包含する。抗カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン抗体を診断的に用いて、例えば、臨床検査手順の部分として免疫細胞障害（例えば、ＣＬＬ）の発症または進行をモニタリングして、所与の処置および／または防止のレジメンの有効性などを決定することができる。検出は、抗カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン抗体の、検出可能な物質に対するカップリングにより促進され得る。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性材料、様々なポジトロン放出断層撮影を用いたポジトロン放射性金属、および非放射性の常磁性金属イオンが含まれる。例えば、本発明による診断として用いるために抗体にコンジュゲートすることができる金属イオンについて、米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。適切な酵素の例には、セイヨウワサビのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれ；適切な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが含まれ；適切な蛍光材料の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリスリンが含まれ；発光材料の例にはルミノールが含まれ；生物発光材料の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが含まれ；適切な放射性材料の例には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、または９９Ｔｃが含まれる。
本明細書に開示する診断および処置方法において用いるための抗カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン抗体は、細胞毒（例えば、放射性同位元素、細胞毒性薬物、もしくは毒素）、治療薬、細胞分裂阻害剤、生物学的毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的応答調節剤、医薬品、免疫学的に活性なリガンド（例えば、得られる分子が新生物細胞およびＴ細胞などのエフェクター細胞の両方に結合する、リンホカインもしくは他の抗体）またはＰＥＧにコンジュゲートしていてもよい。
別の一実施形態において、本明細書に開示する診断方法および処置方法において用いるための抗カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン抗体は、腫瘍細胞の増殖を低減する分子にコンジュゲートしていてもよい。他の実施形態において、開示する組成物は、薬物またはプロドラッグにカップリングしている抗体またはそのフラグメントを含み得る。本発明のなお他の実施形態は、リシン、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素など、特定の生体毒素またはこれらの細胞毒性フラグメントにコンジュゲートしている、抗体またはそのフラグメントの使用を含む。どのコンジュゲートの抗体または非コンジュゲートの抗体を用いるかの選択は、癌のタイプおよびステージ、補助的処置の使用（例えば、化学療法または外部放射）、および患者の状態に依存する。当業者であれば、本明細書の教示に鑑みてこのような選択を容易に行うことができることが理解されよう。
以前の研究において、同位元素で標識されている抗腫瘍抗体は、動物モデルにおいて、ある場合にはヒトにおいて、腫瘍細胞を破壊するのに上首尾に用いられていることが理解されよう。例示の放射性同位元素には、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１０５Ｒｈ、１５３Ｓｍ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、および１８８Ｒｅが含まれる。放射性核種は、核のＤＮＡにおける多数の鎖切断を引き起こす電離放射線を生成し、細胞死をもたらすことによって作用する。治療用コンジュゲートを生成するのに用いられる同位元素は、路程の短い、高エネルギーアルファ粒子またはベータ粒子を生成するのが典型的である。このような放射性核種は、それに対してコンジュゲートが付着し、または侵入する、新生物細胞など、これらが極めて近接する細胞を死滅させる。これらは、非局在性細胞に対して効果が殆どまたは全くない。放射性核種は本質的に非免疫原性である。
ＩＶ．抗カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン抗体、またはそれらの抗原結合性フラグメントの発現
上記に記載した本発明の抗カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン抗体を提供するための単離された遺伝物質をマニピュレーションした後は、遺伝子を、所望の量の請求する抗体またはそのフラグメントを生成するのに用いることができる宿主細胞中に導入するための発現ベクター中に挿入するのが典型的である。
「ベクター」または「発現ベクター」の語は、明細書および特許請求の範囲の目的で本明細書において用いられて、細胞中の所望の遺伝子中に導入し、所望の遺伝子を発現するためのビヒクルとして本発明に従って用いられるベクターを意味する。当業者には知られている通り、このようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルス、およびレトロウイルスからなる群から容易に選択することができる。一般的に、本発明に適合性であるベクターは、選択マーカー、所望の遺伝子のクローニングを促進するのに適切な制限部位、および真核細胞もしくは原核細胞に侵入し、および／または真核細胞もしくは原核細胞において複製する能力を含む。
多数の発現ベクター系を、本発明の目的に用いることができる。例えば、１クラスのベクターは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶ、もしくはＭＯＭＬＶ）、またはＳＶ４０ウイルスなどの動物ウイルスに由来するＤＮＡエレメントを利用する。その他は、内部リボソーム結合部位を有するポリシストロニック系の使用を伴う。さらに、トランスフェクションされた宿主細胞の選択を可能にするマーカーを１つまたはそれ以上導入することにより、ＤＮＡをその染色体中に組み込んでいる細胞を選択することができる。マーカーは、原栄養性を、栄養要求性の宿主に、殺生物剤（例えば、抗生物質）抵抗性または銅などの重金属に対する抵抗性を提供し得る。選択マーカー遺伝子は、発現させようとするＤＮＡ配列に直接連結されるか、または同時形質転換により同じ細胞中に導入されるかのいずれかであり得る。さらなるエレメントが、ｍＲＮＡの最適合成にやはり必要とされ得る。これらのエレメントは、シグナル配列、スプライスシグナル、ならびに転写プロモーター、エンハンサー、および終止シグナルを含み得る。特に好ましい実施形態において、上記で論じた通り、クローニングされた可変領域遺伝子が、発現ベクター中に、重鎖および軽鎖の合成された定常領域遺伝子（好ましくはヒト）と一緒に挿入される。
他の好ましい実施形態において、本発明の抗カリジンもしくはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン抗体またはこれらのフラグメントは、ポリシストロニック構築物を用いて発現され得る。このような発現系において、抗体の重鎖および軽鎖など、多数の対象の遺伝子生成物を、単一のポリシストロニック構築物から生成することができる。これらの系は、真核生物の宿主細胞において本発明のポリペプチドを比較的高レベルで提供するのに、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を用いるのが有利である。適合性のＩＲＥＳ配列が、本明細書に参照によって組み入れる、米国特許第６，１９３，９８０号に開示されている。当業者であれば、このような発現系を用いて、本出願に開示される全範囲のポリペプチドを効果的に生成することができる。
より一般的には、抗体またはそのフラグメントをコードするベクターまたはＤＮＡ配列を調製した後、発現ベクターを適切な宿主細胞中に導入してもよい。すなわち、宿主細胞を形質転換してもよい。プラスミドの宿主細胞中への導入は、当業者にはよく知られている様々な技術によって遂行することができる。これらには、それだけには限定されないが、トランスフェクション（電気泳動および電気穿孔を含む）、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈降、被覆されたＤＮＡでの細胞融合、マイクロインジェクション、およびインタクトなウイルスへの感染が含まれる。Ｒｉｄｇｗａｙ，Ａ．Ａ．Ｇ．、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ」、チャプター２４．２、４７０〜４７２頁、Ｖｅｃｔｏｒｓ、ＲｏｄｒｉｇｕｅｚおよびＤｅｎｈａｒｄｔ編集（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．、１９８８年）を参照されたい。プラスミドの宿主中への導入が、電気穿孔によるのが最も好ましい。形質転換した細胞を、軽鎖および重鎖の生成に適切な条件下で増殖させ、重鎖および／または軽鎖のタンパク質合成に対してアッセイする。例示のアッセイ技術には、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または蛍光標示式細胞分取器分析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学などが含まれる。
本明細書で用いられる「形質転換」の語は、広範な意味において用いられて、遺伝子型を変更し、引き続きレシピエント細胞における変化をもたらす、レシピエント宿主細胞中へのＤＮＡの導入を意味する。
これらの同じ系統に沿って、「宿主細胞」は、組換えＤＮＡ技術を用いて構築され、少なくとも１つの異種性の遺伝子をコードするベクターで形質転換されている細胞を意味する。組換え宿主からポリペプチドを単離するためのプロセスの記載において、「細胞」および「細胞培養物」の語は交換可能に用いられて、明らかに別の方法で特定されなければ、抗体の起源を意味する。換言すれば、「細胞」からのポリペプチドの回収は、回転させて落とした全細胞から、または培地および懸濁した細胞の両方を含む細胞培養物からのいずれかを意味し得る。
一実施形態において、抗体の発現に用いる宿主細胞系は哺乳動物由来のものであり、当業者であれば、その中で発現させようとする所望の遺伝子生成物に最も適する特定の宿主細胞系を決定することができる。例示の宿主細胞系には、それだけには限定されないが、ＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣系、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頚癌）、ＣＶＩ（サル腎臓系）、ＣＯＳ（ＣＶＩのＳＶ４０ Ｔ抗原での誘導体）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞） ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓系）、ＳＰ２／Ｏ（マウスミエローマ）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）、２９３（ヒト腎臓）が含まれる。一実施形態において、細胞系は、それから発現される抗体のアフコシル化など、改変されたグリコシル化を提供する（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６．ＲＴＭ．（Ｃｒｕｃｅｌｌ）またはＦＵＴ８−ノックアウトＣＨＯ細胞系（Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ．ＲＴＭ．細胞）（Ｂｉｏｗａ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．））。一実施形態において、ＮＳ０細胞を用いることができる。ＣＨＯ細胞が特に好ましい。宿主細胞系は典型的に、商業的サービスである、米国組織培養コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）または出版されている文献から入手できる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ生成により、大量の所望のポリペプチドを産出するためのスケールアップが可能になる。組織培養条件下で哺乳動物細胞を培養するための技術は当技術分野において知られており、均質懸濁（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）培養（例えば、エアリフトリアクター中もしくは連続的スターラーリアクター中）、または固定化もしくは捕捉された細胞培養（例えば、ホローファイバー中、マイクロカプセル中、アガロースマイクロビーズ上、もしくはセラミックカートリッジ上）が含まれる。必要であれば、および／または所望により、ポリペプチドの溶液は、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロース上のクロマトグラフィー、および／または（免疫）アフィニティクロマトグラフィーなど、通例のクロマトグラフィー方法によって精製することができる。
本発明の抗カリジンもしくはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン抗体またはこれらのフラグメントをコードする遺伝子は、細菌または酵母菌または植物細胞などの非哺乳動物細胞で発現させることもできる。これに関して、様々な非哺乳動物の単細胞微生物（例えば、細菌）、すなわち、培養物または発酵において増殖させることができるものも、形質転換することができることが理解されよう。細菌は形質転換を受けやすく、腸内細菌科のメンバー、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）またはサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）；バシラス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）；連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、およびインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の系統が含まれる。細菌中で発現させる場合、ポリペプチドが封入体の一部になり得ることがさらに理解されよう。ポリペプチドを、単離し、精製し、次いで機能性分子に構築しなければならない。
原核生物の他に、真核微生物も用いることができる。出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、すなわち通常のパン酵母が、真核微生物の中で最も一般的に用いられるが、数々の他の系統が一般的に利用できる。出芽酵母における発現には、例えば、プラスミドＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ、２８２巻、３９頁（１９７９年）；Ｋｉｎｇｓｍａｎら、Ｇｅｎｅ、７巻、１４１頁（１９７９年）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら、Ｇｅｎｅ、１０巻、１５７頁（１９８０年））が一般的に用いられる。このプラスミドはすでに、ＡＴＣＣ Ｎｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、８５巻、１２頁（１９７７年））など、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母菌の変異株に対する選択マーカーを提供するＴＲＰ１遺伝子を含んでいる。酵母菌宿主細胞のゲノムに特徴的であるｔｒｐＩの破壊（ｌｅｓｉｏｎ）の存在により、次いで、トリプトファンの非存在下の増殖によって形質転換を検出するための効果的な環境がもたらされる。
Ｖ．医薬製剤、および抗カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン抗体の投与方法
別の一態様において、本発明は、抗カリジンもしくはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン抗体またはこれらのフラグメントを含む医薬組成物を提供する。
本発明の抗体またはそのフラグメントを調製し、対象に投与する方法は、よく知られており、または当業者によって容易に決定される。本発明の抗体またはそのフラグメントの投与経路は、経口、非経口、吸入による、または局所的であってよい。本明細書で用いられる非経口の語は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸、または膣投与を含む。静脈内、動脈内、皮下、および筋肉内の形態の非経口投与が一般的に好ましい。これらの形態の投与は全て本発明の範囲内であることが明らかに企図されるが、投与のための形態は、注射用、特に、静脈内または動脈内の注射用または点滴用の溶液である。通常、注射に適する医薬組成物はバッファー（例えば、酢酸バッファー、リン酸バッファー、またはクエン酸バッファー）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、場合により安定化剤（例えば、ヒトアルブミン）などを含むことができる。しかしながら、本明細書の教示に適合性である他の方法において、ポリペプチドを、有害な細胞の集団の部位で直接誘導体化し、それにより罹患組織の治療薬に対する暴露を増大してもよい。
非経口投与のための調製物には、無菌の水溶液剤、または非水性溶液剤、懸濁剤、および乳剤が含まれる。非水性溶媒の例には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルがある。水性担体は、水、アルコール／水性溶液、エマルジョン、または懸濁液を含み、食塩水および緩衝媒体が含まれる。本発明において、薬学的に許容される担体には、それだけには限定されないが、０．０１Ｍ〜０．１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍのリン酸バッファー、または０．８％食塩水が含まれる。他の通常の非経口用ビヒクルには、リン酸ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル、または不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルには、液体および栄養の補充剤、電解質補充剤、例えば、リンゲルのデキストロースをベースにしたものなどが含まれる。保存剤および他の添加剤、例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート化剤、および不活性ガスなども、存在することができる。より具体的には、注射用使用に適する医薬組成物には、無菌の水溶液（水溶性の場合）、または無菌の注射用溶液もしくは分散液を即席で調製するための分散剤および無菌の粉末が含まれる。このような場合、組成物は無菌でなければならず、容易なシリンジ操作性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に液体でなければならない。組成物は製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染性の作用に対抗して保存されるのが好ましい。担体は、水、エタノール、多価アルコール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）を含む溶媒または分散媒体、ならびにこれらの適切な混合物であってよい。例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散物の場合は必要とされる粒子サイズの維持により、界面活性剤の使用により、適当な流動性を維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって実現することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムが組成物中に含まれるのが好ましい。注射用組成物の長時間の吸収は、組成物中に、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによりもたらすことができる。
いずれにしても、無菌の注射用溶液剤は、必要とされる量の有効化合物（例えば、単独の、または他の有効薬剤と組み合わせた抗体）を、所望により、本明細書に列挙した成分の１つまたは組合せと一緒に適切な溶媒中に組み入れ、その後濾過滅菌することにより調製することができる。一般的に、分散剤は、有効化合物を無菌のビヒクル中に組み入れることにより調製され、無菌のビヒクルは、塩基性の分散媒体、および上記に列挙したものの中から必要とされる他の成分を含んでいる。無菌の注射用溶液を調製するための無菌の粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、凍結乾燥により、あらかじめ滅菌濾過したその溶液から、有効成分プラスあらゆるさらなる所望の成分の粉末が産生される。注射用の調製物を、当技術分野において知られている方法に従って無菌条件下で、処理加工し、アンプル、バッグ、ボトル、シリンジ、またはバイアルなどの容器中に充填し、密閉する。さらに、調製物を包装し、各々参照によって本明細書に組み入れる、同時係属中の米国出願番号第０９／２５９，３３７号および米国出願番号第０９／２５９，３３８号に記載されているものなどのキットの形態で販売してもよい。このような製品は、関連する組成物は、自己免疫障害または新生物障害に罹患し、またはかかりやすい対象を処置するのに有用であることを示すラベルまたは添付文書を有するのが好ましい。
本発明の安定化した抗体またはそのフラグメントの、上記に記載した状態を処置するのに有効な投与量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか、または動物であるか、投与する他の薬物療法、および処置が予防的であるか、または治療的であるかを含めた多くの様々な因子に応じて変化する。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含めた非ヒトの哺乳動物も処置することができる。処置の投与量は、安全性および有効性を最適化するために、当業者に知られているルーチンの方法を用いて滴定することができる。
本発明の抗体での受動免疫に対して、投与量は、例えば、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重（宿主の）、より通常的に０．０１ｍｇ／ｋｇ体重から５ｍｇ／ｋｇ体重（例えば、０．０２ｍｇ／ｋｇ体重、０．２５ｍｇ／ｋｇ体重、０．５ｍｇ／ｋｇ体重、０．７５ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、２ｍｇ／ｋｇ体重など）の範囲であってよい。例えば、投与量は、１ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重、または１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内、好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｋｇ体重であってよい。上記の範囲における投与量の中間値も、本発明の範囲内であることが意図される。
対象に、このような投与量を毎日、１日おき、毎週、または経験的な分析によって決定されるあらゆる他のスケジュールに従って投与することができる。例示的な処置は、長期間、例えば、少なくとも６か月にわたる、複数投与量の投与を伴う。さらなる例示的な処置レジメンは、２週間ごとに１回、または１か月に１回、または３か月から６か月ごとに１回の投与を伴う。例示的な投与量スケジュールは、連日１〜１０ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇ、１日おきに３０ｍｇ／ｋｇ、または毎週６０ｍｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態において、結合特異性の異なる２つ以上のモノクローナル抗体を同時に投与するが、この場合、投与する各抗体の投与量は指摘する範囲内であり得る。
本発明の抗体またはそのフラグメントは、複数の機会に投与することができる。単回投与量の間の間隔は、例えば、毎日、毎週、毎月、または毎年であってよい。間隔はまた、患者におけるポリペプチドまたは標的分子の血中レベルを測定することによって指摘される通り、不規則であってもよい。いくつかの方法では、投与量は、１〜１０００ｕｇ／ｍｌまたは２５〜３００ｕｇ／ｍｌなど、抗体または毒素の血漿中のある濃度を実現するように調節される。あるいは、抗体またはそのフラグメントを徐放製剤として投与することができ、この場合、より頻度の少ない投与が必要とされる。投与量および頻度は、患者中の抗体の半減期に応じて変化する。一般的に、ヒト化抗体が最も長い半減期を示し、キメラ抗体および非ヒト抗体がその後に続く。一実施形態において、本発明の抗体またはそのフラグメントは、非コンジュゲート形態において投与することができる。別の一実施形態において、本発明の抗体は、コンジュゲート形態において複数回投与することができる。さらに別の一実施形態において、本発明の抗体またはそのフラグメントは、非コンジュゲート形態において、次いでコンジュゲート形態において、またはその反対で投与することができる。
投与量および投与の頻度は、処置が予防的であるかまたは治療的であるかに応じて変化し得る。予防的適用では、本発明の抗体を含む組成物またはそのカクテルを、まだ疾患状態にはない患者に、患者の抵抗性を増強するために投与する。このような量を「予防的有効投与量」と規定する。この使用において、正確な量は、さらに患者の健康状態および全身の免疫に依存するが、一般的に１投与量当たり０．１ｍｇから２５ｍｇ、特に１投与量当たり０．５ｍｇから２．５ｍｇの範囲である。比較的低い投与量を、長期間にわたって比較的まばらな間隔で投与する。患者の中には、生涯の残りの間処置を継続して受けるものもある。
治療的適用では、疾患の進行が低減または終結するまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的または完全な回復を示すまで、比較的短い間隔の比較的高い投与量（例えば、１投与量あたり抗体約１ｍｇ／ｋｇから４００ｍｇ／ｋｇ、ラジオイムノコンジュゲートに対して５ｍｇから２５ｍｇの投与量が、細胞毒−薬物コンジュゲート分子に対してより高投与量がより通常用いられる）が時として必要とされる。その後、患者に予防的レジメンを投与してもよい。
一実施形態において、対象を、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子（例えば、ベクター中）で処置してもよい。ポリペプチドをコードする核酸に対する投与量は、患者１人あたりＤＮＡ約１０ｎｇから１ｇ、１００ｎｇから１００ｍｇ、１ｕｇから１０ｍｇ、または３０〜３００ｕｇの範囲である。感染性のウイルスベクターに対する投与量は、１投与量あたりビリオン１０〜１００個から、またはそれを超えて変化する。
治療薬は、予防的処置および／または治療的処置に対して、非経口、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、腹腔内、経鼻、または筋肉内の手段によって投与することができる。筋肉内注射または静脈内注入が、本発明の抗体の投与に好ましい。いくつかの方法において、治療用抗体またはそのフラグメントを、頭蓋中に直接注射する。いくつかの方法において、抗体またはそのフラグメントを、徐放用組成物または装置として、例えば、Ｍｅｄｉｐａｔ（商標）装置として投与する。
本発明の薬剤は、処置（例えば、予防的もしくは治療的）を必要とする障害または状態を処置する上で有効である他の薬剤と組み合わせて、場合により投与することができる。好ましいさらなる薬剤は、当技術分野で認められており、特定の障害に標準的に投与される薬剤である。
本発明の９０Ｙ標識化抗体の有効な単回処置線量（すなわち、治療有効量）は、約５ｍＣｉと約７５ｍＣｉの間、より好ましくは約１０ｍＣｉと約４０ｍＣｉの間の範囲である。１３１Ｉ標識化抗体の有効な単回処置非骨髄切除（ｎｏｎ−ｍａｒｒｏｗ ａｂｌａｔｉｖｅ）線量は、約５ｍＣｉと約７０ｍＣｉの間、より好ましくは約５ｍＣｉと約４０ｍＣｉの間の範囲である。１３１Ｉ標識化抗体の有効な単回処置切除（ａｂｌａｔｉｖｅ）線量（すなわち、骨髄自家移植を必要とし得る）は、約３０ｍＣｉと約６００ｍＣｉの間、より好ましくは約５０ｍＣｉと５００ｍＣｉ未満の間の範囲である。キメラ修飾した抗体と組み合わせると、マウス抗体と相対して循環半減期がより長いため、ヨウ素１３１標識化キメラ抗体の有効な単回処置非骨髄切除（ｎｏｎ−ｍａｒｒｏｗ ａｂｌａｔｉｖｅ）線量は、約５ｍＣｉと約４０ｍＣｉの間の範囲、より好ましくは約３０ｍＣｉ未満である。１１１Ｉｎ標識などに対する画像法の判断基準は、約５ｍＣｉ未満であるのが典型的である。
１３１Ｉおよび９０Ｙで大量の臨床実験を獲得したが、他の放射標識が当技術分野で知られており、同様の目的で用いられている。さらに他の放射性同位元素が画像法に用いられている。例えば、本発明の範囲に適合性であるさらなる放射性同位元素には、それだけには限定されないが、１２３Ｉ、１２５Ｉ、３２Ｐ、５７Ｃｏ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、７７Ｂｒ、８１Ｒｂ、８１Ｋｒ、８７Ｓｒ、１１３Ｉｎ、１２７Ｃｓ、１２９Ｃｓ、１３２Ｉ、１９７Ｈｇ、２０３Ｐｂ、２０６Ｂｉ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、４７Ｓｃ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１５３Ｓｍ、１８８Ｒｅ、１９９Ａｕ、２２５Ａｃ、２１１Ａ ２１３Ｂｉが含まれる。この点で、アルファ、ガンマ、およびベータ放射体は全て、本発明の範囲内で適合性である。さらに、本開示に鑑みて、当業者であれば、過度の実験をせずに、どの放射性核種が選択された経過の処置に適合性であるかを容易に決定することができることが提案される。この目的で、臨床上の診断においてすでに用いられているさらなる放射性核種には、１２５Ｉ、１２３Ｉ、９９Ｔｃ、４３Ｋ、５２Ｆｅ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、および１１１Ｉｎが含まれる。抗体は、標的化免疫療法において潜在的に用いるために様々な放射性核種でやはり標識化されている（Ｐｅｉｒｅｒｓｚら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、６５巻、１１１〜１２５頁（１９８７年））。これらの放射性核種には、１８８Ｒｅおよび１８６Ｒｅ、ならびにより低い度合いで１９９Ａｕおよび６７Ｃｕが含まれる。米国特許第５，４６０，７８５号は、このような放射性同位元素に関するさらなるデータを提供するものであり、参照によって本明細書に組み入れる。
先に論じた通り、本発明の抗体またはそのフラグメントは、哺乳動物の障害をｉｎ ｖｉｖｏ処置するのに薬学的に有効な量において投与することができる。この点で、本開示の抗体またはそのフラグメントは、有効薬剤の投与を促進し、安定性を促進するように調合されることが理解されよう。本発明による医薬組成物が、薬学的に許容される、非毒性の、無菌の担体、例えば、生理食塩水、非毒性のバッファー、保存剤などを含むのが好ましい。本出願の目的では、治療薬にコンジュゲートしている、または非コンジュゲートの、本発明の抗体の薬学的に有効な量は、標的に対する効果的な結合を実現し、利益を実現するのに、例えば、疾患もしくは障害の症状を回復し、または物質もしくは細胞を検出するのに、十分な量を意味するよう持ちこたえられる。腫瘍細胞の場合、ポリペプチドは、好ましくは、新生物細胞または免疫反応性細胞上の選択された免疫反応性の抗原と相互作用することができ、これらの細胞の死滅の増大をもたらす。もちろん、本発明の医薬組成物は、薬学的に有効な量のポリペプチドを提供するために単回投与量または複数回投与量において投与することができる。
本開示の範囲に沿って、本発明の抗体は、治療効果または予防効果を生成するのに十分な量において、前述の処置方法に従ってヒトまたは他の動物に投与することができる。本発明のポリペプチドは、知られている技術に従って、本発明の抗体を従来の薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせることによって調製される従来の剤形において、このようなヒトまたは他の動物に投与することができる。当業者であれば、薬学的に許容される担体または希釈剤の形態および特徴は、それと一緒に組み合わせようとする有効成分の量、投与経路、および他のよく知られている変数によって指示されることを認識されよう。当業者であれば、本発明によるポリペプチドの１つまたはそれ以上の種を含むカクテルは、特に効果的であることが判明し得ることをさらに理解されよう。
ＶＩ．カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン関連の疾患または障害を処置する方法
本発明の抗カリジンもしくはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン抗体またはこれらのフラグメントは、カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンの活性に拮抗するのに有用である。したがって、別の一態様において、本発明は、本発明の抗カリジンもしくはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン抗体またはこれらの抗原結合性フラグメントを１つまたはそれ以上含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することにより、カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン関連の疾患または障害を処置するための方法を提供する。
処置を受け入れることができるカリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン関連の疾患または障害には、制限なく、炎症、外傷、火傷、ショック、アレルギー、急性または慢性の疼痛、および腎線維症などの線維症などの病態生理学的状態が含まれる。ある例示の実施形態において、本発明の抗体は、末期腎不全の主な原因である、腎線維症および関連する急性腎損傷、ならびに慢性腎疾患を処置するために支給することができる。
当業者であれば、ルーチンの実験により、カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン関連の疾患または障害を処置する目的で、有効な、非毒性量の抗体（またはさらなる治療薬）が何であるかを決定することができよう。例えば、ポリペプチドの治療有効量は、疾患のステージ（例えば、ステージＩ対ステージＩＶ）、年齢、性別、医学上の合併症（例えば、免疫抑制性の状態または疾患）、および対象の体重、ならびに抗体が対象における所望の反応を誘発する能力などの因子に従って変動し得る。投与量レジメンは、最適の治療反応をもたらすように調節することができる。例えば、いくつかの分割された投与量を毎日投与してもよく、または投与量は、治療状況の緊急事態によって指摘される通り、比例的に低減してもよい。しかしながら、一般的には、有効投与量は、１日あたり体重１キログラムあたり約０．０５ミリグラムから１００ミリグラム、より好ましくは１日あたり体重１キログラムあたり約０．５ミリグラムから１０ミリグラムの範囲であると予想される。
ＶＩＩ．実施例
本発明を以下の実施例によりさらに説明するが、実施例をさらなる限定と解釈してはならない。配列表、図、および全ての参照、本出願を通して引用する、特許および公開されている特許出願の内容は、参照によって本明細書に明確に組み入れる。
さらに、本発明に従って、当業者の範囲内で従来の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術を用いることができる。このような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９年）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（本明細書における「Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年」）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編集、１９８５年）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編集、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ［Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編集（１９８５年）］；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ［Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編集（１９８４年）］；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編集（１９８６年）］；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ［ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６年）］；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４年）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編集）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４年）を参照されたい。
〔実施例１〕
ハイブリドーマの生成：ＫＬＨに対するカリジンペプチドコンジュゲートでのマウスの免疫化およびヒトＢＫＲ１リガンドに対する抗体産生
目的は、カリジン（ＫＤ；配列番号１）およびｄｅｓ−ａｒｇ−カリジン（ＤＡＫＤ；配列番号２）のヒトＢＫＲ１に対する結合を阻害する、これらのリガンド（カリジンおよびｄｅｓ−ａｒｇ−カリジン）に対する交差反応性抗体を開発することであった。一般的に、ペプチドのＣ末端上またはＮ末端上いずれかのさらなるシステインによってＫＤにコンジュゲートしているＫＬＨでのマウスの免疫化を用いて、ハイブリドーマを生成するための融合パートナーとしてマウスミエローマ細胞系と融合させるためのマウス脾細胞を得た。
簡潔に述べると、免疫化のプロトコールは以下の通りであった：ＢＡＬＢ／ｃマウス（８〜２０週齢の未処置のメス）を、抗原としてリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中ＫＬＨ−ＫＤおよびＫＤ−ＫＬＨ等量の混合物をマウス１匹あたり合計１００ｕｇ、マウス１匹あたり全体積２００μｌ中Ｓｉｇｍａアジュバント系（Ｓｉｇｍａカタログ番号６３２２）を１：１の比で混合して、腹腔内免疫化した（０日目）。２１日目、マウスを、抗原としてＰＢＳ中ＫＬＨ−ＫＤおよびＫＤ−ＫＬＨ等量の混合物をマウス１匹あたり合計５０ｕｇ、マウス１匹あたり全体積２００μｌ中Ｓｉｇｍａアジュバント系（Ｓｉｇｍａカタログ番号６３２２）を１：１の比で混合して、追加免疫した。３０日目、血液試料を、ＫＤ特異的抗体の力価を評価するために収集した。５１日目、マウスを、抗原としてＰＢＳ中ＫＬＨ−ＫＤおよびＫＤ−ＫＬＨ等量の混合物をマウス１匹あたり合計５０ｕｇ、マウス１匹あたり全体積２００μｌ中Ｓｉｇｍａアジュバント系（Ｓｉｇｍａカタログ番号６３２２）を１：１の比で混合して、融合のために追加免疫した。５５日目、マウスをＣＯ２チャンバーによって屠殺し、心穿刺によって血液を回収し、脾臓をハイブリドーマ生成用に収集した。
アデノシンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）が欠損しているマウスミエローマ細胞を、特異的な抗原で免疫化したマウスからの脾臓細胞と融合することにより、ハイブリドーマを作成した。ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アザセリン、およびチミジン）培地を用いた選択系により、ＡＰＲＴ＋である融合細胞の他は全て排除される。上首尾なハイブリドーマはまた、免疫グロブリン（Ｉｇｈ）重鎖、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座の１つを保持し、機能的な抗体を分泌しなければならない。
ハイブリドーマ生成培地（ＩＭＤＭ）を、以下のものを合わせることにより作成した：Ｉｓｃｏｖｅのダルベッコ変法イーグル培地（ＨｙＣｌｏｎｅ ＳＨ３０２５９．０１）５００ｍｌ、ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ ＳＨ３００７０．０３）５０ｍｌ、Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号２５０３０）５ｍｌ、非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１１１４００５０）５ｍｌ、ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１１３６００７０）５ｍｌ、０．１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１５１４０１４８）５ｍｌ。培地を使用前に濾過した。増殖培地を、以下のものを合わせることにより作成した：無血清培地（Ｇｉｂｃｏ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＳＦＭ＃１２０４５）１０００ｍｌ、１０％ＨｙＣｌｏｎｅ ＳｕｐｅｒＬｏｗ ＩｇＧ Ｄｅｆｉｎｅｄ ＦＢＳ＃ＳＨ３０８９８．０３ １００ｍｌ、およびペニシリン／ストレプトマイシン１０ｍｌ。凍結培地は、濾過滅菌した、熱不活性化したＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ ＳＨ３００７０．０３）４５ｍｌおよびＤＭＳＯ５ｍｌであった。含まれた他の材料は以下の通りである：ＨＡＴ（５０×）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（＃ＨＯ２６２）から入手した；ハイブリドーマ融合およびクローニングサプリメント（５０×）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ １１ ３６３ ７３５ ００１）、トリパンブルー染色０．４％（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１５２５０−０６１またはＴ１０２８２）；７５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ５０ｗ／ｖ％中ＰＥＧ１５００（Ｒｏｃｈｅカタログ番号７８３６４１（１０７８３６４１００１）。ＨＡＴ、ならびにハイブリドーマ融合およびクローニングサプリメント以外の試薬は全て、３７℃で用いた。
Figure 2015513903
簡潔に述べると、融合３日前または４日前、マウスを対象の抗原で、腹腔内または静脈内のいずれかで追加免疫した。融合の日、マウスをＣＯ２チャンバー中で屠殺し、心穿刺により血液を採取し、脾臓を取り出し、ペトリ皿中無血清ＩＭＤＭ１０ｍｌ中に配置した。融合パートナー細胞ミエローマ：ＦＯ（ＡＴＣＣ ｒｅｆ ＣＲＬ−１６４６）／×６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ ｒｅｆ ＣＲＬ１５８０）を対数期に増殖させ、次いで融合１日前に分割し（１：２および１：５）、２０ｍｌ遠心管中に採取し、回転させ、ペレットをＩＭＤＭ１０ｍｌ中に再懸濁した。ペレットを、無血清ＩＭＤＭ培地で２回洗浄した。遠心は全て１５７０ｒｐｍで５分間行った。最終の再懸濁は無血清ＩＭＤＭ１０ｍｌ中であった。結合組織を脾臓から切り離した。脾臓を、３７℃に予め加温した無血清ＩＭＤＭ１ｍｌと一緒に、１ｍｌシリンジおよび２５ゲージニードルによって注射した。脾細胞を、ピンセットにより弾性線維性外膜から絞り出し、無血清ＩＭＤＭ１０ｍｌで２回洗浄し（最初の回転を含む）、無血清ＩＭＤＭ１０ｍｌ中に再懸濁した。細胞を、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ自動セルカウンターで計数した。
融合パートナー細胞および脾細胞を、１：２から１：１０（細胞数による）の比で、５０ｍｌチューブ１本中で合わせ、９７０ｒｐｍで１０分間（遅い回転）回転させて落として、ルーズなペレットを形成させた。「遅い」回転の後、ペレットを乱さないよう、しかしＰＥＧ１５００を薄めないために細胞の上の液体の量を最小限にするよう注意しながら上清を取り出した。最後に残った培地を保存し、ＰＥＧを加えた後に戻し加えた（下記）。予め加温したＰＥＧ１５００（３７℃、全量１ｍｌ）を１分の期間にわたって細胞ペレットに滴下することにより滴下添加し、ＰＥＧを全滴加えた後、細胞を混合した。ペレットをＰＥＧと一緒にさらに１分間インキュベートし、その後、１０ｍｌのうち最初の１ｍｌを３０秒かけて加えるよう、無血清ＩＭＤＭ培地１０ｍｌを１分間にかけて加えた。９７０ｒｐｍで１０分間、遅く回転させた細胞および上清をデカントした。（２）の１００ｍｌトラフ中に以下のものを加えた：１０％ＦＢＳを含むＩＭＤＭ７０ｍｌ、ＨＡＴ２ｍｌ、ならびにハイブリドーマおよび融合クローニングサプリメント２ｍｌ。細胞を、１０％ＦＢＳを含むＩＭＤＭ１０ｍｌ中に再懸濁し、（２）の５０ｍｌチューブ（チューブ１本あたり５ｍｌ細胞）に分割し、１０％ＦＢＳを含むＩＭＤＭ２５ｍｌを加えた。得られた３０ｍｌを、ＨＢＳＳ／ＨＡＴ／クローニングサプリメント７０ｍｌを含むトラフに移し、２００ｕｌ細胞／ウエルを（１０）の９６ウエルプレート中にピペッティングした。約１０日から１４日後、またはウエル中の培地が黄色に変わったら、ＥＬＩＳＡ（５０ｕｌ）によるスクリーニングに融合を準備した。第１のスクリーニング後、ポジティブのクローンを選択し、番号付けし、１０％ＦＢＳＨＩを含むＩＭＤＭの１ウエルあたり５００ｕｌにおいて、２４ウエルプレートに移した。ハイブリドーマ上清を、Ｎ末端およびＣ末端ビオチン化ペプチドでコーティングしたストレプトアビジンプレート上でのＥＬＩＳＡによってスクリーニングした（下記を参照されたい）。
〔実施例２〕
ヒトＢＫＲ１リガンドに対する抗体を発現するハイブリドーマのキャラクタリゼーションおよび選択
ハイブリドーマの上清を、Ｎ末端およびＣ末端ビオチン化ペプチドでコーティングしたストレプトアビジンプレート上でのＥＬＩＳＡによってスクリーニングし（例えば、表２に記載したものを参照されたい）、次いで抗体結合の動力学を、確認されたポジティブハイブリドーマクローンに対して決定した。
ハイブリドーマ上清中の抗体がＢＫＲ１リガンドペプチドに結合する能力を、ＥＬＩＳＡアッセイで評価した。ＤＡＫＤ−ビオチンまたはＫＤ−ビオチンペプチドを、室温で１時間、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）バッファー中９６ウエルＳＡプレート上にコーティングし、非特異的な結合部位を、ＰＢＳバッファー中１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックした。このプレートを用いて、粗製ハイブリドーマ上清の１次および２次スクリーニングを行った。ハイブリドーマ上清を、コーティングしたＫＤまたはＤＡＫＤペプチドに対して結合させるために、プレートに加えた。１時間インキュベート後、プレートを洗浄し、結合した抗体を、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート２次抗体（ＨＲＰ−ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）：Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ＃１１５−０３５−１６６）を用いて検出し、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）基質（Ｒｏｃｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ＃１１ ２０４ ５２１ ００１）を用いて展開した。エクセルを用いてデータを分析した。ポジティブのシグナル（１：１００００血清希釈ＥＬＩＳＡシグナルより２倍高い）を示す抗体を選択し、確認のため２回ずつ再スクリーニングした。確認されたポジティブのハイブリドーマクローンを選択し、Ｂｉａｃｏｒｅによる結合解離速度ランキングを受けさせた。
抗体結合の動力学に対して、用いた機器は、リアルタリムにおける生体分子の相互作用分析（ＢＩＡ）用にデザインされた、ＢＩＡＣＯＲＥ２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ３０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）であった。用いたセンサーチップは、カルボキシメチル化デキストランマトリックス上にストレプトアビジンが共有結合性に固定化されているＳＡチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）であった。各センサーチップは平行な４つのフローセル（Ｆｃ）を有する。ビオチン化したあらゆるＢＫＲ１またはＢＫＲ２リガンドペプチドを、結合解離速度のスクリーニングおよび選択的スクリーニング用に、ＳＡチップにおけるフローセル２から４（Ｆｃ２からＦｃ４）の１つに固定化した。フローセル１（Ｆｃ１）を確保し、試験するリガンドペプチドに比べて等しい、または近いペプチド長を陰性対照として、ランダムペプチド（一終端をビオチン化したもの）で固定化した。スクリーニングアッセイにおいて、一過性に発現されたヒト化バリアントの一次スクリーニングによって選択されたハイブリドーマクローンの細胞培養物上清を、固定化したペプチド上に注射した。ハイブリドーマ細胞培養培地をブランクとしてチップの表面上にやはり注射してベースラインを確立した。Ｆｃ１およびブランクバッファーの作動のシグナルを差し引いた後、各ペプチドに対する上清からの抗体の解離速度を分析し、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウエアを用いて格付けした。上位の（Ｋｄ＜１０−４１／ｓ）結合解離速度を実証した抗体クローンだけを、サブクローニングおよびさらなるキャラクタリゼーションに選択した。動力学分析において、試験抗体に対するスクリーニングにおいて同定された対応するビオチン−ペプチドをＦｃ２からＦｃ４において固定化し、ランダムペプチドを有するＦｃ１を基準の細胞として用いた。スクリーニングから選択した精製した各抗体を、０．１ｎＭから１０ｎＭの間のランニングバッファー（１×ＨＢＳ−ＥＰバッファー、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中２倍の段階希釈中に作成した。結合の会合速度、解離速度、および全体の親和性を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎにおいて算出した。各抗体に対する抗体結合動力学を、Ｂｉａｃｏｒｅを用いて３回ずつのアッセイにおいて常に確認した。
合計８匹のマウスを、ＫＬＨ−ＫＤ／ＫＤ−ＫＬＨおよびＫＬＨ−ＤＡＫＤ／ＤＡＫＤ−ＫＬＨの混合で免疫化し、上記のプロトコールを用いて脾臓を融合した。ＤＡＫＤ−ビオチンおよびＫＤ−ビオチンとのＥＬＩＳＡにおける約７６８０個のハイブリドーマクローンの一次スクリーニング後、クローン７６個だけがポジティブと確認され、ストレプトアビジン（ＳＡ）チップ上に固定化したＤＡＫＤ−ビオチンおよびＫＤ−ビオチンにわたるＢｉａｃｏｒｅ３０００／２０００における結合解離速度順位付けに選択した。これらのうち、結合解離速度が＜＝１０−４であるハイブリドーマクローン８個をサブクローニングし、配列決定し、精製し、さらなるキャラクタリゼーションをした（表３を参照されたい）。
Figure 2015513903
Figure 2015513903
表３に見られる結果に基づいて、独特の配列を有するクローン５個を動力学試験に選択した。これらの抗体は、ＤＡＫＤ−ビオチン、ＫＤ−ビオチン、ＤＡＫＬＰ−ビオチン、およびＫＬＰ−ビオチンの結合に高度に選択性であった（表４を参照されたい）。これらは、他のキニンペプチドに、またはＮ末端がビオチン化されているペプチドに結合しない。
Figure 2015513903
齧歯動物のＢＫＲ１リガンド、ＤＡＢＫおよびＤＡＫＤをブロックする抗体、ならびにキニンファミリーのペプチドの異なるメンバーに対して他の結合特異性を有する抗体を産生するための１アレイの免疫原（ペプチドのリストを参照されたい、表２）で、さらなる免疫化を行った。表５は、産生された抗体の重鎖および軽鎖の配列を列挙するものである。
Figure 2015513903
Figure 2015513903
〔実施例３〕
マウス動物試験のためのサロゲート抗体の産生
マウス動物試験において用いるサロゲート抗体は、齧歯動物のＢＫＲ１リガンド、ＤＡＢＫ、およびＤＡＫＬＰ（ＤＡＫＤのマウス同等物）に結合し、中和することができることが必要とされた。必要とされるサロゲート抗体を産生するために、マウスを最初に、ＤＡＢＫおよび／またはＤＡＫＤで免疫化し、ＫＬＨをペプチドのＮ末端に直接コンジュゲートした。ＥＬＩＳＡスクリーニングからビオチン−ＤＡＢＫ／ビオチン−ＤＡＫＤ（ペプチドのＮ末端上の直接的なビオチン化）ポジティブのハイブリドーマクローンを、スケールアップおよび精製に選択した。ビオチン−ＤＡＢＫ、ビオチン−ＤＡＫＬＰ、およびビオチン−ＤＡＫＤに対して高い結合親和性が実証された、ファミリー７に列挙する抗体（表１２を参照されたい）を、Ｂｉａｃｏｒｅ直接結合アッセイに基づいて選択した（表１０）。しかしながら、これらのファミリー７の抗体は、競合ＥＬＩＳＡにおいて、天然の、非修飾のＤＡＢＫおよびＤＡＫＤペプチドに対して結合を示さず、機能的薬物スクリーニングシステム（ＦＤＳＳ）（浜松ホトニクスＫ．Ｋ．、日本）でのカルシウム流入アッセイにおいて中和機能を欠いていた。さらに、ビオチン−ＤＡＢＫおよびビオチン−ＤＡＫＤは、天然の、非修飾のＤＡＢＫおよびＤＡＫＤペプチドに比べて、ＦＤＳＳアッセイにおける生理活性を完全に失っていた（データは示さず）。
ＫＬＨおよびビオチンの直接的なＮ末端コンジュゲートは、ＤＡＢＫおよびＤＡＫＤの天然のコンフォメーションの形成を妨げると仮定した。ＫＬＨコンジュゲートおよびビオチンコンジュゲートしたペプチドの天然のコンフォメーションを回復する目的で、リンカーをデザインし、ペプチドのコンフォメーション上のＫＬＨ／ビオチンコンジュゲート効果を「クッション」にしようと、ＤＡＢＫおよび／またはＤＡＫＤのＮ末端に付加した。モデリング結果に基づき、ポリグリシンリンカーが、単純で、非極性で、中性の性質であるという理由で最初に試みられ、試験された。ＦＤＳＳアッセイの結果は、ＫＬＨならびにビオチンがコンジュゲートしたＤＡＢＫおよびＤＡＫＤペプチドの生理活性を回復する能力に従って、ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ（３Ｇ）リンカーが最善であったことを指摘していた（データは示さず）。それゆえ、マウスを免疫化するのにＫＬＨ−３Ｇ−ＤＡＢＫを選択した。また、ビオチン−３Ｇ−ＤＡＢＫおよびビオチン−３Ｇ−ＫＤを、結合ベースのスクリーニングアッセイ（ＥＬＩＳＡおよびＢｉａｃｏｒｅ）に用いた。ＤＡＢＫ／ＤＡＫＤ特異的抗体（ファミリー３、表１３を参照されたい）をいくつか、この新たなラウンドのサロゲート抗体ハイブリドーマ選択において同定した。上位の結合親和性、および天然のＤＡＢＫ／ＤＡＫＤに対する中和活性、および他のペプチドに対する交差反応性がないことに基づいて、ＥＥ１を主要なサロゲート抗体として選択した（表６〜１２を参照されたい）。
表１３に列挙する異なる免疫原を用いて、特異性の異なる抗体が産生された。ファミリー４の抗体はＢＫＲ２受容体リガンド、ＢＫ、およびＫＤに特異的であった。ファミリー５の抗体は、ＢＫおよびＤＡＢＫのＣ末端に特異的に結合する。ファミリー６の抗体は、ＢＫ、ＤＡＢＫ、およびＤＡＫＤに結合するが、ＫＤに結合しない。
より長いポリグリシンリンカー、ポリアラニンリンカー、ならびにポリエチレングリコール（ＰＥＧ２）リンカーおよびアミノヘキサン酸（Ａｈｘ）リンカー（６−炭素の不活性なリンカー）などの既存のリンカーを含めたさらなるリンカーを、サロゲートＥＥ１抗体に対する結合に対して、ＥＥ１におけるＤＡＢＫ／ＤＡＫＤ結合ポケット中に適合するリンカーの能力について評価した。リンカーペプチドは全て、Ａｂｇｅｎｔ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって受注合成されたものであった。試験した、リンカーを有するビオチン化ペプチド（ビオチン−リンカー−ＤＡＢＫ／ＤＡＫＤ）は全てＥＥ１に良好に結合し、あらゆる不活性のＮ末端リンカーは、ビオチンおよび他の分子とコンジュゲートすると、ＤＡＢＫおよびＤＡＫＤペプチドが天然の生理活性のコンフォメーションを保持するのを助けることが指摘された。これとは対照的に、Ｎ末端に直接的なビオチンコンジュゲートを有するビオチン−ＤＡＢＫおよびビオチン−ＤＡＫＤペプチドでは、ＥＥ１に対して結合せず、または不良な結合が観察された（図１を参照されたい）。
産生された抗体の結合の動力学を表５〜１１に概要する。次いで、産生された抗体を全てファミリーに分別し、これらの結合特異性を以下の表１２に概要する。表１３は、その結合特異性に基づいてファミリー１およびファミリー２中に配置された抗体の、重鎖および軽鎖の配列を提供するものである（表１２を参照されたい）。
Figure 2015513903
Figure 2015513903
Figure 2015513903
Figure 2015513903
Figure 2015513903
Figure 2015513903
Figure 2015513903
Figure 2015513903
〔実施例４〕
カルシウム動員を用いたｄｅｓ−ａｒｇ−キニンリガンド枯渇のキャラクタリゼーション
機能アッセイを用いて、産生された抗体の７つのファミリーをさらにキャラクタリゼーションした。ブラジキニンＢ１受容体シグナリングはＧｑが連結しており、それゆえ受容体の活性化は、ＧｑのＩＰ３活性化および下流のカルシウム動員を用いてモニタリングすることができる。ＨＥＫ ｍＢＫＲ１（組換えマウスブラジキニンＢ１受容体）細胞またはＭＲＣ５（ブラジキニンＢ２受容体の内因性の発現（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１７１））を用いてカルシウム動員を測定した。
簡潔に述べると、マウスＢｄｋｒｂ１遺伝子（配列を以下に提供する）を、マウス肺ｃＤＮＡ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ、カタログ番号Ｃ１３３４１５２）から、ＰＣＲプライマー８０４＿ｃＧＷＹ＿Ｆ：５’−ＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＡＧＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＣＣＣＡＧＧＣＣＴＣＧＣＴＧ−３’（配列番号１０７）および８０４＿ｃＧＷＹ＿Ｒ：５’−ＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＡＡＡＧＴＴＣＣＣＡＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣ−３’（配列番号１０８）、ならびにＰｆｕポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号６００２６４）を用いて増幅し、ｐＤＯＮＲ２０１中に、ＢＰクロナーゼ酵素ミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１７８９−０２０）を用いてクローニングした。並行して、ｐＥＡＫ８発現ベクター（ＥＤＧＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、Ｎ末端ＨＡタグ（ＧＣＡＴＡＣＣＣＡＴＡＣＧＡＣＧＴＣＣＣＡＧＡＣＴＡＣＧＣＴ、ＧｅｎＢａｎｋ配列番号１０９ＣＹ１００４４３）を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（ベクターｐＥＡＫ８−ｎＨＡ）で直線化したｐＥＡＫ８中に挿入することにより修飾し、引き続きＧａｔｅｗａｙカセットＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１８２８−０２９）を、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化し、クレノーポリメラーゼ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０２１０Ｓ）で平滑末端化したｐＥＡＫ８＿ｎＨＡ中に挿入し、ベクターｐＥＡＫ８＿ｎＨＡ＿ＤＥＳＴを得た。次に、マウスＢｄｋｒｂ１を、ＬＲクロナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１７９１−１００）を用いて、ｐＥＡＫ８＿ｎＨＡ＿ＤＥＳＴ中にサブクローニングした。次いで、２９３−ＰＳＣ細胞に、Ｆｕｇｅｎｅ６トランスフェクション試薬を用いて、ｐＥＡＫ８−Ｂｄｋｒｂ１プラスミドをトランスフェクションした。細胞を、トランスフェクション２４時間後、抗生物質（ピューロマイシン）選択下に置き、選択を維持して安定な細胞系を産生した。得られた安定な細胞系におけるＢｄｋｒｂ１遺伝子の存在を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用い、アガロースゲル電気泳動により確認した。ブラジキニンＢ１受容体の細胞表面発現を、ＦＡＣＳ機器上、ブラジキニンＢ１Ｒ上のＮ末端−ＨＡ−タグ（Ｃｏｖａｎｃｅ、カタログ番号ＭＭＳ−１０１Ｐ）に対する抗体を用いて行った。ブラジキニンＢ１受容体の機能活性が、選択的アゴニストでのカルシウム動員アッセイにおいて実証された。
細胞中にサブクローニングしたＢｄｋｒｂ１遺伝子：
ATGGCGTCCCAGGCCTCGCTGAAGCTACAGCCTTCTAACCAAAGCCAGCAGGCCCCTCCCAACATCACCTCCTGCGAGGGCGCCCCGGAAGCCTGGGATCTGCTGTGTCGGGTGCTGCCAGGGTTTGTCATCACTGTCTGTTTCTTTGGCCTCCTGGGGAACCTTTTAGTCCTGTCCTTCTTCCTTTTGCCTTGGCGACGATGGTGGCAGCAGCGGCGGCAGCGCCTAACCATAGCAGAAATCTACCTGGCTAACTTGGCAGCTTCTGATCTGGTGTTTGTGCTGGGCCTGCCCTTCTGGGCAGAGAACGTTGGGAACCGTTTCAACTGGCCCTTTGGAAGTGACCTCTGCCGGGTGGTCAGCGGGGTCATCAAGGCCAACCTGTTCATCAGCATCTTCCTGGTGGTGGCCATCAGTCAGGACCGCTACAGGTTGCTGGTATACCCCATGACCAGCTGGGGGAACCGGCGGCGACGGCAAGCCCAAGTGACCTGCCTGCTCATCTGGGTAGCTGGGGGCCTCTTGAGCACCCCCACGTTCCTTCTGCGTTCCGTCAAAGTCGTCCCTGATCTGAACATCTCTGCCTGCATCCTGCTTTTCCCCCACGAAGCTTGGCACTTTGTAAGGATGGTGGAGTTGAACGTTTTGGGTTTCCTCCTCCCATTGGCTGCCATCCTCTACTTCAACTTTCACATCCTGGCCTCCCTGAGAGGACAGAAGGAGGCCAGCAGAACCCGGTGTGGGGGACCCAAGGACAGCAAGACAATGGGGCTGATCCTCACACTGGTAGCCTCCTTCCTGGTCTGCTGGGCCCCTTACCACTTCTTTGCCTTCCTGGATTTCCTGGTCCAGGTGAGAGTGATCCAGGACTGCTTCTGGAAGGAGCTCACAGACCTGGGCCTGCAGCTGGCCAACTTCTTTGCTTTTGTCAACAGCTGCCTGAACCCACTGATTTATGTCTTTGCAGGCCGGCTCTTTAAGACCAGGGTTCTGGGAACTTTATAA (GenBank NM_007539; 配列番号110)
ＨＥＫ ｍＢＫＲ１またはＭＲＣ５細胞を、増殖培地中、３８４ウエル透明底プレート中にプレーティングし、一夜付着させた。増殖培地を除去し、細胞をアッセイバッファー（ＨＢＳＳ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２．５ｍＭプロベネシド）中で洗浄し、次いで０．０４％プルロニック酸を含む０．５ｕＭ Ｆｌｕｏ−４ＡＭ細胞透過性カルシウム感知色素で、３７Ｃで１時間、色素添加した。ＡＭエステルを切断し、カルシウム色素を細胞質中に保持した。１時間後、細胞を洗浄して過剰の色素を除去し、残余のバッファー２０ｕｌが細胞上に残存した。浜松からの機能的薬物スクリーニングシステム（ＦＤＳＳ）上、２×溶液として処置を加え、カルシウム動員を、少なくとも４分間動力学的にモニタリングした。Ｂ１ＲまたはＢ２Ｒ受容体の活性化により、Ｇａｌｐｈａ ｑ媒介性ホスホリパーゼＣの活性化およびＩＰ３媒介性カルシウム動員がもたらされる。Ｆｌｕｏ−４色素は放出されたカルシウムをキレート化し、蛍光における頑強な変化が観察される。結果を、プレートにわたる細胞密度または色素添加間の差に対して標準化するための、最大−最小相対的蛍光単位としてエクスポートした。
リガンドの力価を、各日、リガンドの濃度反応曲線を作動させることにより決定し、リガンドのＥＣ７０〜８０のおよその濃度を抗体とのインキュベートに選択した。検出曲線の直線範囲上にあり、アンタゴニストまたはリガンド枯渇性の抗体での低減を見るのに十分なウインドウが存在したことから、あるＥＣ８０濃度を選択した。抗体の用量反応曲線により、あるＥＣ８０濃度のリガンドに結合することが可能になり、リガンド枯渇の度合いを、蛍光における変化を用いてモニタリングした。結果をバッファーおよびＥＣ８０リガンド反応に対して標準化し、リガンド枯渇に対するＥＣ５０を算出した。次いで、結果をモル比として報告したが、モル比は、用いたリガンド濃度によって除したリガンド反応の５０％の枯渇を低減する抗体濃度（すなわち、ＡｂのＥＣ５０）に相当する。１単位の抗体は２単位のリガンドを枯渇させることができなければならないため、理論的な最大値は０．５でなければならないが、本発明者らは実際にもっと低い値を見ており、この値は、抗体に対する化学量論的制約というよりむしろ、低いリガンド濃度に対する検出方法の非感受性を反映するものであり得る。これらの実験の結果を表１４〜１６に示す。
ファミリー１およびファミリー２の抗体（表１３を参照されたい）はＢｉａｃｏｒｅによるより優れた結合の動力学（表１３）ならびに、ＤＡＫＤおよびＫＤペプチドに対するカルシウム動員により測定した中和活性（表１４および表１５）を実証するものである。抗体をその熱安定性およびヒト化に対する配列適合性に対してさらに分析した。Ｆ１５１は熱安定性であり、ＣＤＲ領域に問題のある残基が存在せず、マウスリガンドＫＬＰおよびＤＡＫＬＰに対して交差反応性であったため、Ｆ１５１はヒト化に関して進歩していた。
Figure 2015513903
Figure 2015513903
〔実施例５〕
Ｆ１５１の操作：不必要な配列モチーフのヒト化、安定化、および変異
１．ヒト化
用いたヒト化プロトコールは、その全文を参照によって本明細書に組み入れる、ＰＣＴ／ＵＳ０８／７４３８１（ＵＳ２０１１００２７２６６）に記載されている。マウスＦ１５１の可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）配列を用いて、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ（ＭＯＥ；ｖ．２００９．１０；Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ）における抗−ＤＡＫＤ／ＫＤ Ｆ１５１ ＬＣおよびＨＣのホモロジーモデルを構築した。以下のテンプレートを用いた：軽鎖フレームワーク−１ＳＢＳ（フレームワーク領域における同一性９３％）、重鎖フレームワーク−２ＶＸＴ（フレームワーク領域における同一性８４％）、Ｌ１−１ＬＶＥ（同一性９３％）、Ｌ２−１ＥＥＵ（同一性１００％）、Ｌ３−２Ｒ５６（同一性９３％）、Ｈ１−１ＮＪ９（同一性９５％）、Ｈ２−２ＶＸＵ（同一性７６％）、およびＨ３−１ＨＩＬ（同一性４９％）。テンプレートは、Ｒｕｔｇｅｒｓおよびカリフォルニア大学サンディエゴ校によって管理されているウェブサイトである、ｒｃｓｂ．ｏｒｇのワールドワイドウェブ上に見出されるＲＣＳＢタンパク質データバンク（ＲＣＳＢ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ）で入手できる（Ｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ｍ、ＷｅｓｔｂｒｏｏｋＪ．、Ｆｅｎｇ．Ｚ．、Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ，Ｇ．、Ｂｈａｔ，Ｔ．Ｎ．、Ｗｅｉｓｓｉｇ，Ｈ．、Ｓｈｉｎｄｙａｌｏｖ，Ｉ．Ｎ．、Ｂｏｕｒｎｅ，Ｐ．Ｅ．、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０００年、２８巻、２３５〜２４２頁）。ホモロジーモデルは引き続き、ＭＯＥにおいて実行される標準的手段を用いてエネルギー最小化した。マウスＦ１５１の最小化３Ｄホモロジーモデルの分子動力学（ＭＤ）シミュレーションを、Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ Ｂｏｒｎで暗溶媒中１．１ナノ秒（ｎｓ）間、温度５００Ｋのタンパク質バックボーン上の束縛で引き続き行った。１０個の多様なコンフォメーションを、最後の１ｎｓ間、この最初のＭＤ作動から１００ピコ秒（ｐｓ）ごとに抽出した。これらの多様なコンフォメーションを、次いで、各々ＭＤシミュレーションにかけ、２．３ｎｓ間、タンパク質バックボーン上、３００Ｋの温度で束縛はなかった。１０ＭＤの各作動に対して、ＭＤ軌道から１ｐｓごとに１つの、最終の２，０００のスナップショットを次に用いて、各マウスのＦ１５１アミノ酸に対して、基準のメドイド位置（ｍｅｄｏｉｄ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）と比較して二乗平均偏差（ｒｍｓｄ）を算出した。所与のアミノ酸の１０回の別々のＭＤ作動に対する平均ｒｍｓｄを、全てのＦ１５１マウスのアミノ酸の全体の平均ｒｍｓｄと比べることにより、アミノ酸が十分に柔軟性であれば、ＭＤの間に見られる通り、Ｔ細胞受容体と相互作用する可能性があり、免疫反応の活性化に反応性であると考えられることが決定される。６２個のアミノ酸が、ＣＤＲおよび５Åのすぐ近傍を除いて、マウスＦ１５１抗体において柔軟性であると同定された。
２０ｎｓ（１０×２ｎｓ）間、最も柔軟なマウスＦ１５１アミノ酸２８個の動きを、次いで、ヒト生殖系列相動性モデル４９個の対応する柔軟なアミノ酸の動きと比較し、この各々に対して１０×２ｎｓＭＤシミュレーションを作動した。４９個のヒト生殖系列モデルを、７個の最も一般的なヒト生殖系列軽鎖（ｖｋ１、ｖｋ２、ｖｋ３、ｖｋ４、ｖラムダ１、ｖラムダ２、ｖラムダ３）、および７個の最も一般的なヒト生殖系列重鎖（ｖｈ１ａ、ｖｈ１ｂ、ｖｈ２、ｖｈ３、ｖｈ４、ｖｈ５、ｖｈ６）を組織的に合わせることにより構築した。ｖｋ１−ｖｈ１ｂヒト生殖系列抗体の柔軟なアミノ酸は、マウスＦ１５１抗体の柔軟なアミノ酸に比べて、０．８０の４Ｄ類似性を示し、そこで、柔軟なアミノ酸に着目してｖｋ１−ｖｈ１ｂ生殖系列抗体を用いてＦ１５１アミノ酸をヒト化した。マウスＦ１５１のｖｋ１−ｖｈ１ｂアミノ酸間の対でのアミノ酸会合に対して、２つの対応するホモロジーモデルのアルファ炭素の最適な３Ｄの重ね合わせに基づいて、２つの配列をアラインした（ｖｋ１およびｖｈ１ｂそれぞれとのＦ１５１ ＬＣおよびＦ１５１ ＨＣのアラインメントに対して図１５を参照されたい）。
２．安定化
２つのアプローチを用いて抗体の安定性を改善した。
ａ）知識ベースのアプローチ
出現度数の低い軽鎖および重鎖のアミノ酸対これらそれぞれの正準（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）配列は、ＣＤＲを除いて、最も頻繁に見出されるアミノ酸に変異することが提唱されていた（ΔΔＧｔｈ＞０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ；Ｅ．Ｍｏｎｓｅｌｌｉｅｒ、Ｈ．Ｂｅｄｏｕｅｌｌｅ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３６２巻、２００６年、５８０〜５９３頁）。軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）に対するコンセンサス変異のこの最初のリストを、最も近いヒト生殖系列（ｖｋ１−ｖｈ１ｂ）において見出されるアミノ酸に制限した。ＣＤＲの最も近傍において示唆される変化（５オングストロームの「バーニア」ゾーン、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２４巻、１９９２年、４８７〜４９９頁）を考慮から除外した。これにより、ＬＣにおける５つの安定化変異（表１９を参照されたい）およびＨＣにおける４つの安定化変異（表２０を参照されたい）がもたらされた。他の判断基準を考慮に入れて、抗ＤＡＫＤ／ＫＤ Ｆ１５１抗体を潜在的に安定化するためのこれらの変異を考慮した。これらの判断基準は、表面のハイドロパシーの好ましい変化、または分子メカニクスベースの予想される変異体の安定化であった。文献において成功であることが報告されたさらなる安定化変異（Ｅ．ＭｏｎｓｅｌｌｉｅｒおよびＨ．Ｂｅｄｏｕｅｌｌｅ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３６２巻、２００６年、５８０〜５９３頁；Ｂ．Ｊ．Ｓｔｅｉｐｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、１９９４年、２４０巻、１８８〜１９２頁）も考慮した（表１６〜２２を参照されたい）。これらの変化の１つは、以下のＨＣ２ａ、ＨＣ２ｂ、およびＨＣ２ｃ配列における安定化変異（Ｄ８９Ｅ）として組み入れられた。別の示唆される変化（Ｑ６２Ｅ）がバリアントＨＣ２ｂに組み入れられた。
ｂ）３ＤおよびＭＤベースのアプローチ
３ＤおよびＭＤベースのアプローチは、以前に報告されている（Ｓｅｃｏ Ｊ、Ｌｕｑｕｅ ＦＪ、Ｂａｒｒｉｌ Ｘ．、Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．、２００９年４月２３日、５２巻（８）、２３６３〜７１頁；Ｍａｌｉｎ Ｊｏｎｓｓｏｎら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ、２００３年、１０７巻、５５１１〜５５１８頁）。二成分の溶媒（水中２０％イソプロパノール、２０ｎｓ生成シミュレーション）中でＦａｂの分子動力学的シミュレーションを分析することにより、抗体の疎水性領域を明確に同定した。次いで、凝集を防ごうと、リジン変異をこれらの領域の近傍に導入した。シュレディンガーのマエストロソフトウエア（ｖ．８．５．２０７）内の疎水性表面マップを用いたさらなる分析が完了した。これら２つの技術の組合せを用いて、重鎖において１つ、軽鎖において１つの、２つのＬｙｓ変異が示唆される。
３．グラフト化によるヒト化
グラフト化技術を用いたヒト化は以前に報告されている（Ｐｅｔｅｒ Ｔ．Ｊｏｎｅｓ、Ｐａｕｌ Ｈ．Ｄｅａｒ、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ Ｆｏｏｔｅ、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓ．Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、およびＧｒｅｇ Ｗｉｎｔｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、１９８６年、３２１巻、５２２〜５２５頁）。用いられたヒト化プロセスは、抗−ＤＡＫＤ／ＫＤ軽鎖および重鎖に最も近いヒト生殖系列を同定することによって始まった。これは、系統的に列挙された全てのヒト生殖系列（カッパおよびラムダ鎖に対するＶおよびＪドメインの全ての可能な組合せ；重鎖に対してＶ、Ｄ、およびＪドメイン）に対して、ＢＬＡＳＴ検索を行うことにより行われる。
以下の最も近いヒト生殖系列がそれぞれ、抗−ＤＡＫＤ／ＫＤ Ｆ１５１軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）に８３％および６２％の配列同一性と同定された（図１６を参照されたい）。内部ＶＢＡＳＥ生殖系列を用いて、軽鎖はＶ ＩＶ−Ｂ３（同一性約８３％）遺伝子座に近く、重鎖はＶＨ１サブファミリーの１〜０８および１〜１８（同一性約６２％）遺伝子座に近いことが見出される。ＣＤＲ領域（ＭＯＥによって規定される）およびバーニア領域（ＦｏｏｔｅおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９２年、２２４巻、４８７〜４９９頁において規定される）を太字体で示す。下線を付したヒト化変異は、上記で規定したＣＤＲおよびバーニアゾーンの残基を除外して、アラインした２つの配列の対での比較を行うことにより得た。ヒト化の別のバリアントでは、ＣＤＲだけを比較において除外した。
４．不要な配列モチーフの変異
以下の配列のモチーフを考慮した：Ａｓｐ−Ｐｒｏ（酸に不安定な結合）、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（グリコシル化、Ｘ＝Ｐｒｏ以外のあらゆるアミノ酸）、Ａｓｐ−Ｇｌｙ／Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（柔軟性の領域におけるスクシンイミド／ｉｓｏ−ａｓｐ形成）、Ａｓｎ−Ｇｌｙ／Ｈｉｓ／Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ｃｙｓ（暴露された脱アミド部位）、およびＭｅｔ（暴露された領域における酸化）。マウスＦ１５１には暴露された不要な配列モチーフがないが、これらはいくつかのヒト化バリアントにおいて導入されるため、他の判断基準の中で、マウスＦ１５１のＶＬおよびＶＨドメインが他のマウス抗体から選択された。
ＬＣ３ａ、ＬＣ３ｂ、ＨＣ３ａ、およびＨＣ３ｂは各々、同定された、潜在的に問題の多いスクシンイミド部位を有する。これらの部位は、関与する残基が潜在的にＨ−結合ネットワークに関与するので、提唱された配列において修飾されなかった（ホモロジーモデルの目視検査）。これらの位置は、数々の他の抗体構造にも見出される。さらに、ＨＣ３ａおよびＨＣ３ｂの両方において、グラフト化による厳密なヒト化は、Ｓｅｒ１１５のＭｅｔへの置換を含む。このメチオニンが暴露される。ロイシンは多くの近いヒト生殖系列配列間で一般的な残基であるので、この位置のロイシンへの置換は、ヒト化変異として示唆される。
得られたヒト化された配列を配列類似性に対して、国際エピトープデータベース（ＩＥＤＢ）データベース（ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｃｏｍのワールドワイドウェブ上に見出される；バージョン２００９年６月；Ｖｉｔａ Ｒ、Ｚａｒｅｂｓｋｉ Ｌ、Ｇｒｅｅｎｂａｕｍ ＪＡ、Ｅｍａｍｉ Ｈ、Ｈｏｏｆ Ｉ、Ｓａｌｉｍｉ Ｎ、Ｄａｍｌｅ Ｒ、Ｓｅｔｔｅ Ａ、Ｐｅｔｅｒｓ Ｂ．、Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｅｐｉｔｏｐｅ ｄａｔａｂａｓｅ ２．０．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０１０年１月；３８（データベース発行）：Ｄ８５４〜６２．Ｅｐｕｂ ２００９年１１月１１日）に対してＢＬＡＳＴ検索して、配列のどれもあらゆる知られているヒトＢ細胞またはＴ細胞のエピトープを含まないことが確実になった（７０％の配列同一性をＢＬＡＳＴ検索によって、ヒト種からの結果のみを考慮して、得られた結果に対するカットオフとして用いた）。
５．マウスＦ１５１可変ドメインのオリジナル配列
ＣＤＲを太字体で強調し、バーニア領域（ＦｏｏｔｅおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９２年、２２４巻、４８７〜４９９頁）に下線を付す。
軽鎖（配列番号２６）
Figure 2015513903
 ジャーミナリティ（ｇｅｒｍｉｎａｌｉｔｙ）インデックス＝Ｚ４６６１５＿１＿Ｖ＿Ｘ６７８５８＿１＿Ｊ［Ｖ ＩＶ−Ｂ３］と８３％
重鎖（配列番号１９）：
Figure 2015513903
 ジャーミナリティインデックス＝Ｚ１２３１６＿１＿ＶＸ９７０５１＿４＿Ｄ＿Ｘ９７０５１＿５＿Ｊ［ＶＨ１ １−１８］と６２％
６．操作した配列
ａ）背景
軽鎖に対して５バージョン（ＬＣ１、ＬＣ２ａ、ＬＣ２ｂ、ＬＣ３ａ、およびＬＣ３ｂ）、および重鎖５バージョン（ＨＣ１、ＨＣ２ａ、ＨＣ２ｂ、ＨＣ３ａ、およびＨＣ３ｂ）が提唱された。
ＬＣ１は、４Ｄヒト化プロトコールを用いて同定されたヒト化変異５個を含む。ＬＣ２ａは、さらなる５個の安定化変異を導入した。ＬＣ２ｂは、凝集を防ぐのを助けるため、リジン変異１個を付加した。ＬＣ３ａは、最も近いヒト生殖系列配列に対するグラフト化に由来し、マウスＣＤＲおよびバーニアゾーン残基を保持する変異を１５個含む。ＬＣ３ｃは、さらなるヒト化変異１個とともにＣＤＲグラフト化に由来する変異を１６個含んでいた。
ＨＣ１は、社内のプロトコールによって同定されるヒト化変異を６個有する。ＨＣ２ａはさらなる安定化変異５個を導入し、ＨＣ２ｂはＨＣ１に比べてさらなる安定化変異６個を含んでいる。ＨＣ２ｃは、凝集を防ぐのを助けるため、ＨＣ２ａの安定化変異の他にＬｙｓ変異を１個含む。ＨＣ３ａは、最も近いヒト生殖系列配列に対するグラフト化に由来し、マウスＣＤＲおよびバーニアゾーン残基を保持する変異を１９個含む。ＨＣ３ｂは、ＣＤＲグラフト化に由来する変異を２５個含む。
合計６個の組合せが提唱された（表１６に概要する）：
ＬＣ１×ＨＣ１（ヒト化のみに対処する変異）
ＬＣ２ａ×ＨＣ２ａ（ヒト化および安定化に対処する変異）
ＬＣ２ａ×ＨＣ２ｂ（ヒト化および安定化に対処する変異）
ＬＣ２ｂ×ＨＣ２ｃ（ヒト化、安定化、および「抗凝集」に対処する変異）
ＬＣ３ａ×ＨＣ３ａ（グラフト化＋バーニアにより殆どヒト化に対処する変異）
ＬＣ３ｂ×ＨＣ３ｂ（グラフト化によりヒト化に対処する変異）
Figure 2015513903
Figure 2015513903
Figure 2015513903
ａ）操作した軽鎖の配列
潜在的に問題のある、知られているＴ細胞またはＢ細胞のエピトープは、提唱された全てのバリアントにおいて見出されなかった。
ＬＣ１（配列番号２７）、ヒト化変異に下線を付し、ＣＤＲおよびバーニアゾーンを太字体とする：
Figure 2015513903
ＬＣ２ａ（配列番号２８）、ヒト化変異に下線を付し、ＣＤＲおよびバーニアゾーンを太字体とし、安定化変異をイタリック体とする（以下に示す、５位のＴ、１２位のＳ、２１位のＩ、６９位のＳ、９１位のＴ）：
Figure 2015513903
ＬＣ２ｂ（配列番号２９）、ヒト化変異に下線を付し、ＣＤＲおよびバーニアゾーンを太字体とし、安定化変異をイタリック体とし（以下に示す、５位のＴ、１２位のＳ、２１位のＩ、６９位のＳ、９１位のＴ）、抗凝集変異は８９位のＫである：
Figure 2015513903
ＬＣ３ａ（配列番号３０）、グラフト化変異に下線を付して示し、ＣＤＲおよびバーニアゾーンを太字体で示す：
Figure 2015513903
ＬＣ３ｂ（配列番号３１）、グラフト化変異に下線を付して示し、ＣＤＲおよびバーニアゾーンを太字体で示す：
Figure 2015513903
 ５２位のＬは、ヒトに変異されるバーニア残基であることに留意されたい。
ｃ）操作した重鎖配列
ＨＣ１（配列番号２０）、ヒト化変異に下線を付し、ＣＤＲおよびバーニアゾーンを太字体とする：
Figure 2015513903
ＨＣ２ａ（配列番号２１）、ヒト化変異に下線を付し、ＣＤＲおよびバーニアゾーンを太字体とし、安定化変異をイタリック体とする（以下に示す、１位のＱ、９位のＡ、４４位のＧ、８０位のＹ、および９０位のＥ）：
Figure 2015513903
ＨＣ２ｂ（配列番号２２）、ヒト化変異に下線を付し、ＣＤＲおよびバーニアゾーンを太字体とし、安定化変異をイタリック体とする（以下に示す、１位のＱ、９位のＡ、４４位のＧ、６２位のＥ、８０位のＹ、および９０位のＥ）：
Figure 2015513903
ＩＥＤＢデータベースにおいて、ヒトエピトープは配列ＨＣ２ｂに対して同定されなかった。
ＨＣ２ｃ（配列番号２３）、ヒト化変異に下線を付し、ＣＤＲおよびバーニアゾーンを太字体とし、安定化変異をイタリック体とし（以下に示す、１位のＱ、９位のＡ、４４位のＧ、８０位のＹ、および９０位のＥ）、抗凝集変異は８６位のＫである：
Figure 2015513903
ＨＣ３ａ（配列番号２４）、グラフト化変異に下線を付して示し、ＣＤＲおよびバーニアゾーンを太字体で示す：
Figure 2015513903
ＬＣ３ｂ（配列番号２５）、グラフト化変異に下線を付して示し、ＣＤＲおよびバーニアゾーンを太字体で示す：
Figure 2015513903
以下のバーニア残基は、ヒトに変異されることに留意されたい：２位のＶ、４８位のＭ、６８位のＶ、７０位のＭ、および７４位のＴ。
ＩＥＤ８データベースにおいて、ヒトエピトープは、配列ＨＣ３ｂに対して同定されなかった。
ＨＣ３ｂジャーミナリティインデックス＝Ｚ１２３１６＿１＿Ｖ＿Ｊ００２３５＿１＿Ｄ＿Ｕ４２５９０＿１＿Ｊ［１−１８／ＤＰ−１４］と８３％
Figure 2015513903
Figure 2015513903
Figure 2015513903
Figure 2015513903
〔実施例６〕
ヒト化バリアントのキャラクタリゼーション
表１６に表すインシリコモデリングに基づき、ヒト化Ｆ１５１の軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）の可変領域のＤＮＡを、ＨＥＫ２９３発現に対してコドン最適化し、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの子会社）によって遺伝子合成した。合成したＤＮＡフラグメントを、それぞれＡｐａＬＩ／ＢｓｉＷＩ部位で軽鎖（ＣＬ）をコードするベクターであるｐＦＦ０３６２（Ａ．ヒトカッパＬＣベクター）の定常領域中に、およびＡｐａＬＩ／ＡｐａＩ部位で重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）をコードするベクターであるｐＦＦ０３６３（Ｂ．ヒトＩｇＧ１ ＨＣベクター）の定常領域中にクローニングした。得られた、全長のＬＣを含むプラスミドｐＦＦ０６４０、およびヒト化Ｆ１５１バリアントの全長のＨＣを含むｐＦＦ０４６６を、コトランスフェクションし、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｋ９０００−０１）において一過性に発現させた。
表１６に示す６つのヒト化バリアントを、結合の動力学（上記で論じた）、ならびに化学的性質および物理的性質、例えば、当技術分野においてルーチン的に用いられている熱安定性などの様々なパラメータによってキャラクタリゼーションした。
キャラクタリゼーションは２段において行った。Ｉ段には、表２４および図２に示す示差走査熱量（ＤＳＣ）が含まれた。簡潔に述べると、ＤＳＣ実験に対して、抗体を、リン酸緩衝食塩水溶液に対して透析した。抗体濃度をＵＶ吸収によって測定した。抗体を、ＰＢＳを用いて１ｍｇ／ｍＬに希釈した。スキャンを、基準細胞中ＰＢＳで、０．３２６８ｍＬキャピラリーセルを用いて、Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｎ−ＤＳＣ ＩＩ装置を用いて行った。スキャン速度は２℃／分であり、試料を２０℃から１００℃までスキャンした。
ＨＣ３ｂ／ＬＣ３ｂを除いて全てのバリアントが、親の抗体に対して匹敵する結合親和性を示した。バリアントＨＣ３ａ／ＬＣ３ａが、ＳＥＣデータ、安定性、および凝集の欠如などの他の物理化学的性質に基づいて他のバリアントを凌いで選択された（表２３〜２５を参照されたい）。
Figure 2015513903
Figure 2015513903
Figure 2015513903
Figure 2015513903
親のＦ１５１の軽鎖および重鎖の、ヒト化Ｆ１５１バリアント（ＨＣ３ａ／ＬＣ３ａ）に対するアラインメントについて、図３を参照されたい。
〔実施例７〕
ＢＲＫ１リガンドカリジンおよびｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンに対するヒト化抗体Ｆ１
５１の結晶構造
カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンに結合するヒト化Ｆ１５１（ＨＣ３ａ／ＬＣ３ａ）Ｆａｂの結晶構造を決定し、分子相互作用を分析した。
カリジン粉末はＰｈｏｅｎｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（カタログ番号００９−３７）から購入した。Ｆａｂタンパク質の産生に対して、ヒト化Ｆ１５１ ＨＣ３ａから重鎖（ＨＣ）ＶＨ領域のＤＮＡを、６×Ｈｉｓタグを付したＣＨ１ベクターｐＦＦ０３６６中にクローニングした。ここで用いた軽鎖（ＬＣ）プラスミドは、Ｆ１５１ヒト化において用いたオリジナルのＦ１５１ ＬＣ３ａのプラスミドと同じであった（実施例５を参照されたい）。２つのプラスミドを、Ｆａｂ発現用にフリースタイルＨＥＫ２９３細胞中にコトランスフェクションした。Ｆａｂタンパク質を、コバルトレジンを用いて精製し、バッファーを５０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６．０、５０ｍＭ ＮａＣｌに交換した後、約９ｍｇ／ｍＬに濃縮した。精製したＦ１５１ Ｆａｂタンパク質を、カリジンとモル比１：２で混合し、結晶化スクリーニング用に設定した。結晶化スクリーニングを、広範囲の条件で行った。Ｈａｍｐｔｏｎ ＲｅｓｅａｒｃｈスクリーニングキットＰＥＧ／ＩＯＮ ＨＴのＢ１０、Ｂ１２、およびＧ１０条件下で、最善の結晶が観察された。結晶を、ウエルバッファー中２０％グリセロールで凍結保護し、回折データ収集用に凍結した。両方の複合体に対するＸ線回折データを、Ｃａｎａｄｉａｎ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ、ビームラインＣＭＣＦ−０８ＩＤで収集した。Ｆ１５１−ＫＤ複合体に対するＲｍｅｒｇｅは８．９％であり、Ｉ／ｓ（Ｉ）＝２０．２であり、Ｆ１５１−ＤＡＫＤに対してそれぞれ７．７％および１８．５である。Ｆ１５１−ＫＤ構造をＰｈａｓｅｒにおける分子置換によって、ＶＬ−ＶＨおよびＣＬ−ＣＨ１ドメインを独立の単位として処理して、ＰＤＢエントリー３ＱＯＳからのＦａｂ配位を用いて解析した。構造を、Ｒｆａｃｔｏｒ０．２０５およびＲｆｒｅｅ０．２２８に対する空間群Ｐ２１２１２１における解像度２．０７ÅのａｕｔｏＢｕｓｔｅｒによって練り上げた。Ｆ１５１−ＤＡＫＤ構造を、Ｆ１５１−ＫＤ配位を用いて解析した。構造をＲｆａｃｔｏｒ０．２３２およびＲｆｒｅｅ０．２３８に対する空間群Ｐ２１２１２１における解像度１．８６ÅのａｕｔｏＢｕｓｔｅｒにおいて練り上げた。
図４および図５に示す電子密度マップは、カリジン（ＫＤ）およびＤｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン（ＤＡＫＤ）のＦ１５１ Ｆａｂに対する結合を示し、各アミノ酸の位置を明確に決定するものである。カリジンに関して、Ｃ最末端残基のＡｒｇ１０に対する電子密度は存在しない。これはＣ末端残基のアルギニンがないＤＡＫＤ（以下の表２７に示す）が、Ｆ１５１に対してＫＤと等しく良好に結合するという観察に一致する。ＫＤおよびＤＡＫＤに対する中和ＦＤＳＳ細胞アッセイにおけるＦ１５１のＩＣ５０値はそれぞれ、０．１２ｎＭおよび０．０９ｎＭである。両方の場合とも、電子密度は、ペプチドのＣ末端に向かって弱くなる。ＫＤにおけるＰｈｅ９は、ＤＡＫＤにおけるＰｈｅ９よりもわずかに良好な電子密度を有するので、Ｆ１５１に結合する場合は、ＫＤのＣ末端にさらなるアルギニンが存在することで、このペプチドのＣ末端が安定する可能性があるが、このアルギニンはそれ自体、Ｘ線によって観察されるほど十分に安定ではない。２つの構造は本質的に同一であるので（ＫＤとＤＡＫＤとの間のｒｍｓは、Ｃ原子に対して０．１３９であり、全ての原子に対して０．３２８である）、以下の議論は全てＦ１５１−ＫＤ構造をベースとする。
Figure 2015513903
ＫＤは、図６に示す通り、軽鎖と重鎖とのＦｖサブユニット間の界面に埋もれているそのＮ末端と結合する。軽鎖と重鎖との間の界面には、Ｔｙｒ−Ｌ４２、Ｔｙｒ−Ｌ９３、Ｔｙｒ−Ｌ１００、Ｔｒｐ＿Ｌ１０２、Ｐｈｅ−Ｌ１０４およびＴｙｒ−Ｈ３５、Ｔｒｐ−Ｈ４７、Ｔｙｒ−Ｈ５０、Ｔｙｒ−Ｈ９９、Ｔｒｐ−Ｈ１１０を含む芳香族アミノ酸が充填されており、スタッキングおよび疎水性相互作用により相互に安定化している。ＣＤＲの軽鎖および重鎖各々からの残基が結合に寄与する。ＣＤＲ上でマッピングされたＫＤとの相互作用に関与する軽鎖および重鎖に沿った残基を、図７および図８に示す。重鎖のＣＤＲ Ｈ３は最長のループであり、ＫＤとの相互作用で最も頻繁に用いられており、ＫＤに対するサイドカバーを形成する。ループは、主に、他の２つのＣＤＲ、重鎖のＨ１およびＨ２、すなわち、Ａｓｐ−Ｈ１０１とＡｒｇ−Ｈ５２との間の塩橋（Ｈ１およびＨ３を安定化）、Ｔｙｒ−Ｈ１０２とＴｙｒ−Ｈ５４との間のアレーン−Ｈ相互作用（Ｈ２およびＨ３を安定化）、Ａｓｐ−Ｈ１０８とＴｙｒ−Ｈ３５との間のＨ−結合、ならびにＨｉｓ−Ｈ１０５とＴｙｒ−Ｌ５５との間のＨ−結合（Ｈ３およびＬ２を安定化）との相互作用により安定化された。
産生される抗体間のＫＤ相互作用性の残基を比較すると、抗体間に類似性が存在し、他者よりもＫＤ相互作用に対して特定のアミノ酸の使用により関係するものがあったことが分かる。例えば、軽鎖において、Ｆ１５１、Ｃ６３、およびＩ２２は、それらのＣＤＲにおいてより類似するアミノ酸を用いてＫＤに結合するが、Ｂ２１およびＩ５４はさらに類似していた。重鎖において、Ｆ１５１およびＣ６３は相互に、ならびにＢ２１、Ｉ２２、およびＩ５４から驚くほど独特であった。後３者は、類似性における群を形成すると思われる。Ｃ６３はその重鎖において特に興味深く、Ｈ２およびＨ３におけるループ長が他者全てとさらに異なる。Ｆａｂを全体的に考慮すると、Ｂ２１およびＩ５４が最も緊密に関連していた。
結晶構造において、ＫＤは、Ｆａｂとの系統的な水素結合および疎水的相互作用に関与することを、本発明者らは見出した。ＫＤのＮ末端はＦａｂ中に埋もれており、より集中的な相互作用を抱え持つが、Ｃ末端は本質的に溶媒に暴露されている。最初の４残基（Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）を除いて、ＫＤの他の残基はバルク溶媒中に徐々に伸長する。Ｌｙｓ１側鎖のアミジニウム（ａｍｉｄｉｎｉｕｍ）基は、Ｇｌｕ−Ｌ６１（Ｌ：軽鎖）によって塩橋により繋留され、アミノ末端のアミノ基Ｌｙｓ１はＡｓｐ−Ｈ１０８（Ｈ：重鎖）と塩橋を形成する。Ｌｙｓ１側鎖のアミジニウム基も、Ｔｙｒ−Ｌ５５の芳香環上にぶら下がり、陽イオン相互作用に関与する。Ｌｙｓ１に関与するこのような強力な相互作用は、ＦａｂにおけるＫＤのアミノ末端を密接に繋留する。これは、ＫＤのＦ１５１に対する結合におけるＬｙｓ１の重要性の説明にもなる。これ（すなわち、ブラジキニン）がなければ、ｈＦ１５１またはＦ１５１に対する検出可能な結合を測定することができない。Ｌｙｓ１同様、Ａｒｇ２は、塩橋によりＦａｂと相互作用する。Ａｒｇ２のグアニジウム（ｇｕａｎｉｄｉｕｍ）基はＡｓｐ−Ｈ１０４の側鎖と相互作用する。Ａｒｇ２の側鎖はまた、Ａｒｇ−Ｈ１０１の主鎖カルボニル酸素とＨ−結合している。また、Ｐｒｏ８の主鎖酸素は、Ａｒｇ−Ｈ１０１の側鎖にＨ−結合している。Ｔｙｒ−Ｈ１０２はＰｈｅ８およびＰｒｏ９に半分インターカレートし、ＫＤとの疎水性相互作用に関与する。直接的相互作用の他に、多くの水媒介性Ｈ−結合も、ＫＤとＦａｂとの間に見られる。チロシン残基が、他のアミノ酸に比べて相互作用において最も頻繁に用いられており、図７および図８においてアステリスクで印を付けた１６残基中９残基がチロシンであるのに注目するのも興味深い。ＫＤを取り囲むＦ１５１における全ての残基が、Ａｓｎ−Ｈ３３を除いて、リガンド結合において役割を果たしていると思われ、Ａｓｎ−Ｈ３３はＰｈｅ６側鎖に近いが、極性において不適合性であり、他の重要な相互作用がない。ＴｒｐまたはＴｙｒなどの芳香族／疎水性残基での、Ｐｈｅ８との相互作用に対する置換は、アフィニティ成熟を考慮する場合に手っ取り早い選択であると思われる。これら２つの芳香族アミノ酸は、実際、他の抗体に見られる（Ｃ６３におけるＴｒｐ、およびＢ２１、Ｉ２２、Ｉ５４におけるＴｙｒ）。下記の表２８は、図７および図８において印を付けた１６個のＫＤ相互作用性アミノ酸残基の詳しい分析を提供するものであり、抗原結合を攪乱してはならないＣＤＲ領域において行うことができる機能的置換を記載するものである。
Figure 2015513903
Figure 2015513903
カリジン（ＫＤ）またはｄｅｓＡｒｇ１０−カリジン（ＤＡＫＤ）のコンフォメーションのエピトープの分析により、これが「Ｐｒｏ４キンク」コンフォメーションを取ることが明らかになった。図１７に示す通り、「Ｐｒｏ４キンク」コンフォメーションの特徴は、プロリン４でのＫＤまたはＤＡＫＤの主鎖ポリペプチドバックボーンにおけるＩＩ型タイトターンである（参照によって本明細書に組み入れる、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ＪＳ．、「Ｔｈｅ ａｎａｔｏｍｙ ａｎｄ ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．」、Ａｄｖ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．、１９８１年、３４巻、１６７〜３３９頁を参照されたい）。「Ｐｒｏ４キンク」コンフォメーションは、ＫＤ（１〜２および６〜９）またはＤＡＫＤの全てまたは実質的に全ての残存するアミノ酸が、空間的に積み重なって疎水性側鎖とアラインするＳ字形リピートを取ることによってさらに規定され得る。
〔実施例８〕
疼痛モデルにおける抗ＢＫＲ１−リガンド抗体のｉｎ ｖｉｖｏ薬理
本発明の本実施例は、（ａ）Ｓａｄｄｉ ＧＭ ａｎｄ Ａｂｂｏｔｔ ＦＶ．、Ｐａｉｎ、２０００年、８９巻、５３〜６３頁；（ｂ）Ｃｈｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｉｎ、２０１０年、２巻、６〜１３頁および（ｃ）Ｂｅｎｎｅｔｔ ＧＪ ａｎｄ Ｘｉｅ ＹＫ．、Ｐａｉｎ、１９８８年、３３巻、８７〜１０７頁に記載されている修飾された手順による急性および慢性の疼痛の、様々な前臨床のモデルにおける、抗ＢＫＲ１受容体−リガンド抗体のｉｎ ｖｉｖｏの有効性を説明するものである。
動物
ホルマリン実験には成年オスＯＦ１マウス（２０〜３０グラム）を、ＣＦＡおよびＣＣＩ試験の両方には成年オスＣ５７ＢＩ／６Ｊマウス（２５〜３０グラム）を用いて実験を行った。マウスを、１２時間の明暗周期下、温度制御した部屋において維持した。食事および水を自由に摂取させた。全ての実験に対して、マウスを実験室に少なくとも２時間気候順化させた後、試験を行った。試験に対して無作為化は行わなかった。行動試験を行う実験者は処置に対してブラインドではなかったが、試験の仮説について知らされなかった。手順は全て、サノフィ−アベンティス研究開発部の「動物ケアおよび使用委員会（Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）」によって認可されたものであり、欧州指針（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ）８６／６０９／ＥＥＣ実施のフランス制定法（省令第８７〜８４８ １９８７年１０月１９日、決定１９８８年４月１９日）に従って行った。
Ａ．ホルマリン誘発性急性炎症性疼痛
ホルマリン試験を用いて、侵害受容性疼痛および炎症性疼痛を測定した。実際に、ホルマリンを足蹠内（ｉｎｔｒａｐｌａｎｔａｒ）注射すると、初期の急性侵害受容性行動反応（０〜１２分）が誘発され、脊髄興奮性に起因する第２の炎症媒介性反応（１５〜４５分）が続く。
ホルムアルデヒド（３７％、Ｓｉｇｍａ）を食塩水で希釈（ｖ／ｖ）して、ホルムアルデヒド濃度２．５％を得た（すなわち、ホルマリン濃度およそ６．２５％）。マウスを優しく押さえ、この溶液２０μＬを、後足の一本の背部中に皮下注射した。行動反応を、ホルマリン注射の直後に、次いで４５分にわたり３分間隔で、以下の通りスコア付けした：（０）注射した足の通常の体重負荷、（１）注射した足を床に軽く休める、（２）注射した足を持ち上げる（ｌｉｆｔｉｎｇ−ｅｌｅｖａｔｉｏｎ）、（３）注射した足を舐め、または噛む。群の大きさは、オスＯＦ１マウス１１〜１２匹であった。
スコアを時間に対してプロットし、曲線下面積（ＡＵＣ）を、初期相（０〜１２分）および後期相（１５〜４５分）の両方に対して平均スコア（±ＳＥＭ）から算出した。疼痛様行動の逆転を、ＡＵＣの％における変化として表した。
ＥＥ１抗体は、オスＯＦ１マウスにおけるホルマリン試験の後期相における疼痛様行動を阻害した。ＥＥ１抗体は、ホルマリンを足蹠内注射する４８時間前に静脈内投与した場合、後期相のみにおいて疼痛様行動の投与量依存性の逆転を示し、図９に示す通り、最小有効量（ＭＥＤ）＝２．５ｍｇ／ｋｇであった。実際に、２．５、１０、および３０ｍｇ／ｋｇを投与した場合、表２９に示す通り、ＥＥ１は後期相を、それぞれ３５±５％、３３±５％、および４５±７％逆転した。
これとは対照的に、Ｆ１５１は、ホルマリンを足蹠内注射する４８時間前に投与した場合、ホルマリン試験の後期相における疼痛様行動を弱く阻害する。実際に、表２９に示す通り、２．５および１０ｍｇ／ｋｇを投与した場合、Ｆ１５１は後期相を、それぞれ１５±７％および２１±５％逆転した。
Figure 2015513903
Ｂ．ＣＦＡ（フロイント完全アジュバント）誘発性慢性炎症性疼痛
鉱油およびマンナイド（ｍａｎｎｉｄｅ）モノオレエート（Ｓｉｇｍａ）中加熱殺菌結核菌１μｇ／μＬを含むフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）２５μＬを、短時間麻酔下（イソフルラン、３％）で、足蹠内投与することにより、慢性炎症を誘発した。群の大きさは、オスＣ５７Ｂ／６マウス８匹だった。
２．５ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇのＣＦＡを足蹠内注射して２２時間後にＥＥ１抗体を静脈内投与し、機械的過敏症および熱的過敏症を、ＣＦＡ足蹠内投与後１日目（Ｄ１）、４日目（Ｄ４）および７日目（Ｄ７）に評価した。
Ｂ１．機械的過敏症
機械的過敏症を、注射した足の足蹠表面上にＶｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント（Ｂｉｏｓｅｂ、フランス）０．６ｇを１０回適用した後の離脱反応の頻度（Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ）（ＦＲ、％における）を測定することにより評価した。疼痛様行動に対するＥＥ１抗体の効力を調査するために、本発明者らは機械的過敏症の逆転（％における）を、以下の通り算出した：
逆転のパーセントを各マウスに対して、（平均ＦＲ−アイソタイプ−対照投与後−ＦＲ−Ｉｐｓｉ投与後）／（平均ＦＲ−アイソタイプ−対照投与後−平均ＦＲ−ｓｈａｍ投与後
）として算出した。
ＣＦＡを足蹠内注射した後、Ｄ１、Ｄ４、およびＤ７に、無処置群に比べてアイソタイプ−対照１Ｂ７．１１−処置群においてＦＲのＶｏｎ Ｆｒｅｙフィラメントに対する有意な増大が観察され、機械的過敏症の発生が実証された。ＥＥ１抗体を、足蹠内ＣＦＡの２２時間後に静脈内投与した場合、アイソタイプ−対照１Ｂ７．１１−処置群において得られたものと比べて、試験した様々な時間で、このＦＲを有意に低減することができた（図１０）。
機械的過敏症の逆転は、ＥＥ１抗体２．５ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇの静脈内投与に対してそれぞれ、Ｄ１に４１±８％および２２±８％、Ｄ４に３６±９％および３２±９％、ならびにＤ７に２７±１０％および５０±９％であった（表３０）。
Figure 2015513903
Ｂ２．熱的過敏症
熱的過敏症に対して、足蹠装置（ＩＩＴＣ、Ｗｏｏｄｌａｎｄ Ｈｉｌｌｓ、ＵＳＡ）を用いて放射熱に反応した足引っ込め潜伏時間（Ｐａｗ Ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ Ｌａｔｅｎｃｉｅｓ）（ＰＷＬ、秒における）の測定を評価した。
疼痛様行動に対するＥＥ１抗体の効力を調査するために、本発明者らは熱的過敏症の逆転（％における）を、以下の通り算出した：
逆転のパーセントを各マウスに対して、（ＰＷＬ投与後−平均アイソタイプ−対照投与後）／（平均アイソタイプ−対照投与前−平均アイソタイプ−対照投与後）として算出した。
熱的過敏症は、ベースライン時、ＣＦＡを足蹠内注射する前、全群間で差がなかった（データは示さず）。
ＣＦＡを足蹠内注射した後、Ｄ１、Ｄ４、およびＤ７に、アイソタイプ−対照１Ｂ７．１１−処置群のマウスにおいて注射した足の足引っ込め潜伏時間における有意な低減が観察され、ＣＦＡは熱的過敏症を誘発したことが実証された（データは示さず）。ＥＥ１抗体を、足蹠内ＣＦＡ注射の２２時間後に静脈内投与し（すなわち、足蹠内ＣＦＡ注射後１日目）、ＥＥ１抗体は、試験した投与量を問わず、Ｄ１の足引っ込め潜伏時間を増大することができなかった（図１１）。しかしながら、ＥＥ１は、Ｄ４の足引っ込め潜伏時間を有意に増大し、この効果はＤ７にも存在した（図１１）。
熱的過敏症の逆転は、ＥＥ１の２．５ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇ静脈内投与に対してそれぞれ、Ｄ４に４１±１５％および５８±２１％、ならびにＤ７に４６±１０％および５２±１７％であった（表３１）。
Figure 2015513903
Ｃ．ＣＣＩ（慢性絞扼損傷）誘発性神経障害様疼痛（Ｂｅｎｎｅｔｔのモデル）
ＣＣＩモデルを末梢神経損傷のモデルとして用いた。簡潔に述べると、マウスをイソフルラン（３％）で麻酔し、小さく切開することにより右坐骨神経を大腿中央（ｍｉｄ ｔｈｉｇｈ）レベルで暴露した。１ｍｍのスペースで６．０クロムガット（Ｅｔｈｉｃｏｎ）の緩い結紮を３つ、坐骨神経周辺に配置した。筋肉および皮膚を閉じることにより、外科手術の手順を完了した。ＣＣＩ外科手術の日を０日目とした。群の大きさは、オスＣ５７ＢＩ／６マウス６〜１０匹であった。
外科手術後１１日目に、ＥＥ１抗体２．５および３０ｍｇ／ｋｇを静脈内投与し、機械的過敏症および熱的過敏症を、外科手術後１２日目（Ｄ１２）、１４日目（Ｄ１４）、および１８日目（Ｄ１８）に評価し、これらは処置後１日目（Ｄ１）、３日目（Ｄ３）、および７日目（Ｄ７）に相当するものであった。
Ｃ１．機械的過敏症
スチール製のロッドをマウスの後ろ足に適用し力を増大する（１０秒で５グラム）、Ｄｙｎａｍｉｃ Ｐｌａｎｔａｒ Ａｅｓｔｈｅｓｉｏｍｅｔｅｒ（Ｕｇｏ−Ｂａｓｉｌｅ、イタリア）を用いて、圧迫（ｇにおける）刺激の増大に対する後ろ足引っ込め閾値（損傷［すなわちＩｐｓｉ］および非損傷［すなわちＣｏｎｔｒａ］両方の足に対する）を測定することにより、機械的過敏症を評価した。
ＥＥ１抗体の疼痛様行動に対する効果を調査するために、本発明者らは、機械的過敏症の逆転を以下の通り決定した：逆転のパーセントを各マウスに対して、（Ｉｐｓｉ投与後−Ｉｐｓｉ投与前）／（Ｃｏｎｔｒａ投与前−Ｉｐｓｉ投与前）として算出した。
外科手術後、手術したマウスは、損傷した足に対する機械的刺激に対して頑強な鋭敏化を発症したが、非損傷の足には影響がなかった。１１日目、損傷した足に対する機械的鋭敏化はプラトーに到達した（データは示さず）。
ＥＥ１抗体を１１日目に静脈内投与すると、Ｄ１２、Ｄ１４、およびＤ１８に、ＣＣＩ誘発性機械的過敏症の逆転に対するわずかな傾向を実証し、２．５および３０ｍｇ／ｋｇそれぞれ、Ｄ１２に１５．２±４．９％および１５．２±５．７％、Ｄ１４に２６．８±５．７％および２５．７±４．５％、ならびにＤ１８に３０．３±７．１％および２０．８±５．９％であった（図１２および表３２）。
Figure 2015513903
Ｃ２．熱的過敏症
熱的過敏症に対して、足蹠装置（ＩＩＴＣ、Ｗｏｏｄｌａｎｄ Ｈｉｌｌｓ、ＵＳＡ）を用いて放射熱に反応した足引っ込め潜伏時間（秒における）の測定を、注射した後ろ足に対して評価した。
疼痛様行動に対するＥＥ１抗体の効力を調査するために、本発明者らは熱的過敏症の逆転（％における）を、以下の通り算出した：
逆転のパーセントを各マウスに対して、（Ｉｐｓｉ投与後−平均アイソタイプ−対照投与後）／（平均無処置投与後−平均アイソタイプ−対照投与後）として算出した。
外科手術後、手術したマウスは、損傷した足に対する熱的刺激に対して頑強な鋭敏化を発症したが、非損傷の足には影響がなかった。１１日目、損傷した足に対する熱的鋭敏化はプラトーに到達した（データは示さず）。
ＥＥ１抗体を１１日目に静脈内投与すると、Ｄ１２に、傾向が観察されたとしても、ＥＥ１抗体は損傷した足の足引っ込め潜伏時間を有意に増大しなかった。しかしながら、Ｄ１４から、ＥＥ１抗体は後ろ足引っ込めを有意に増大した（図１３）。熱的過敏症の逆転は、ＥＥ１抗体２．５ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇ静脈投与に対してそれぞれ、Ｄ１２に４１±１６％および５６±２４％、ならびにＤ１４に５１±１６％および９８±４８％、ならびにＤ１８に７８±１９％および８４±２２％であった（表３３）。
Figure 2015513903

Claims (41)

  1. ａ）カリジンもしくはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンに特異的に結合するが、ブラジキニンもしくはｄｅｓ−Ａｒｇ９−ブラジキニンには特異的に結合しない；
    ｂ）カリジンもしくはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンに、１×１０−１０Ｍ未満のＫＤで特異的に結合する；
    ｃ）カリジンもしくはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンに、１×１０４ｓ−１未満のＫｏｆｆで特異的に結合する；
    および／または
    ｄ）カリジンもしくはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンに特異的に結合し、ブラジキニンＢ１受容体への結合を阻害する
    単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  2. カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンのＮ末端のリジン残基に結合する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  3. カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンのブラジキニン−１受容体への結合を阻害する、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  4. マウスのカリジン様ペプチド（ＫＬＰ）に特異的に結合する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  5. ａ）配列番号７［Ｘ１ＹＸ２Ｘ３ＤＸ４ＨＡＭＸ５Ｙ］、
    式中、
    Ｘ１は、Ｙ、Ｆ、またはＨであり、
    Ｘ２は、Ｒ、Ｄ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、またはＷであり、
    Ｘ３は、Ｙ、Ｆ、Ｗ、またはＨであり、
    Ｘ４は、Ｄ、Ｅ、またはＹであり、
    Ｘ５は、ＤまたはＥである、
    ｂ）配列番号６３［Ｘ１ＥＹＤＧＸ２ＹＸ３Ｘ４ＬＤＸ５］、
    式中、
    Ｘ１は、ＷまたはＦであり、
    Ｘ２は、Ｎであり、またはアミノ酸はなく、
    Ｘ３は、ＹまたはＳであり、
    Ｘ４は、ＤまたはＰであり、
    Ｘ５は、ＦまたはＹである、
    ｃ）配列番号１３、
    ｄ）配列番号３２、
    ｅ）配列番号４０、
    ｆ）配列番号４７、および
    ｇ）配列番号５５
    からなる群から選択されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  6. ａ）配列番号８［ＹＦＸ１ＰＸ２ＮＧＮＴＧＹＮＱＫＦＲＧ］、
    式中、
    Ｘ１は、Ｄ、Ｒ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、またはＷであり、
    Ｘ２は、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、またはＱである、
    ｂ）配列番号６４［ＷＸ１ＤＰＥＮＧＤＸ２Ｘ３ＹＡＰＫＦＱＧ］、
    式中、
    Ｘ１は、ＩまたはＶであり、
    Ｘ２は、ＴまたはＳであり、
    Ｘ３は、ＧまたはＤである、
    ｃ）配列番号１４、
    ｄ）配列番号３３、
    ｅ）配列番号４１、
    ｆ）配列番号４８、および
    ｇ）配列番号５６
    からなる群から選択されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  7. ａ）配列番号９［ＧＹＳＦＴＤＹＸ１ＩＹ］、
    式中、
    Ｘ１は、Ｎ、Ｗ、またはＹである、
    ｂ）配列番号６５［ＧＦＮＩＫＤＹＹＸ１Ｈ］、
    式中、
    Ｘ１は、ＬまたはＭである、
    ｃ）配列番号１５、
    ｄ）配列番号３４、
    ｅ）配列番号４２、
    ｆ）配列番号４９、および
    ｇ）配列番号５７
    からなる群から選択されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  8. ａ）配列番号１０［ＱＱＸ１Ｘ２ＳＸ３ＰＸ４Ｔ］、
    式中、
    Ｘ１は、Ｙ、Ｆ、またはＨであり、
    Ｘ２は、Ｙ、Ｆ、Ｈ、またはＷであり、
    Ｘ３は、Ｙ、Ｆ、Ｔ、またはＨであり、
    Ｘ４は、Ｗ、Ｙ、Ｆ、Ｈ、またはＬである、
    ｂ）配列番号６６［ＱＸ１Ｘ２Ｘ３ＳＸ４ＰＸ５Ｔ］、
    式中、
    Ｘ１は、ＱまたはＮであり、
    Ｘ２は、Ｙ、Ｆ、Ｄ、またはＨであり、
    Ｘ３は、Ｙ、Ｆ、Ｈ、またはＷであり、
    Ｘ４は、Ｙ、Ｆ、Ｔ、またはＨであり、
    Ｘ５は、Ｗ、Ｙ、Ｆ、Ｈ、またはＬである、
    ｃ）配列番号６９［Ｘ１ＱＧＴＨＦＰＹＴ］、
    式中、
    Ｘ１は、ＬまたはＭである、
    ｄ）配列番号１６、
    ｅ）配列番号３５、
    ｆ）配列番号４３、
    ｇ）配列番号５０、および
    ｈ）配列番号５８、
    からなる群から選択されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインをさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  9. ａ）配列番号１１［ＷＡＳＴＲＸ１］、
    式中、
    Ｘ１は、Ｅ、Ｄ、Ｑ、またはＮである、
    ｂ）配列番号６７［Ｘ２ＡＳＴＲＸ２］、
    式中、
    Ｘ１は、ＷまたはＧであり、
    Ｘ２は、Ｅ、Ｄ、Ｑ、またはＮである、
    ｃ）配列番号１７、
    ｄ）配列番号３６、
    ｅ）配列番号５１、
    ｆ）配列番号５９
    からなる群から選択されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列をさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  10. ａ）配列番号１２［ＫＳＳＱＳＬＬＸ１ＳＳＮＱＫＮＸ２ＬＡ］、
    式中、
    Ｘ１は、Ｗ、Ｈ、Ｙ、またはＦであり、
    Ｘ２は、ＨまたはＹである、
    ｂ）配列番号６８［ＫＳＳＱＳＬＬＸ１Ｘ２ＳＸ３ＱＸ４ＮＸ５ＬＡ］、
    式中、
    Ｘ１は、Ｗ、Ｈ、Ｙ、またはＦであり、
    Ｘ２は、ＳまたはＧであり、
    Ｘ３は、ＮまたはＤであり、
    Ｘ４は、ＫまたはＲであり、
    Ｘ５は、ＨまたはＹである、
    ｃ）配列番号７０［ＫＳＳＱＳＬＬＹＳＮＧＸ１ＴＹＬＮ］、
    式中、
    Ｘ１は、ＫまたはＥであり、
    ｂ）配列番号１８、
    ｃ）配列番号３７、
    ｄ）配列番号４４、
    ｅ）配列番号５２、および
    ｆ）配列番号６０
    からなる群から選択されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  11. ａ）配列番号１０［ＱＱＸ１Ｘ２ＳＸ３ＰＸ４Ｔ］、
    式中、
    Ｘ１は、Ｙ、Ｆ、またはＨであり、
    Ｘ２は、Ｙ、Ｆ、Ｈ、またはＷであり、
    Ｘ３は、Ｙ、Ｆ、Ｔ、またはＨであり、
    Ｘ４は、Ｗ、Ｙ、Ｆ、Ｈ、またはＬである、
    ｂ）配列番号６６［ＱＸ１Ｘ２Ｘ３ＳＸ４ＰＸ５Ｔ］、
    式中、
    Ｘ１は、ＱまたはＮであり、
    Ｘ２は、Ｙ、Ｆ、Ｄ、またはＨであり、
    Ｘ３は、Ｙ、Ｆ、Ｈ、またはＷであり、
    Ｘ４は、Ｙ、Ｆ、Ｔ、またはＨであり、
    Ｘ５は、Ｗ、Ｙ、Ｆ、Ｈ、またはＬである、
    ｃ）配列番号６９［Ｘ１ＱＧＴＨＦＰＹＴ］、
    式中、
    Ｘ１は、ＬまたはＭである、
    ｄ）配列番号１６、
    ｅ）配列番号３５、
    ｆ）配列番号４３、
    ｇ）配列番号５０、および
    ｈ）配列番号５８
    からなる群から選択されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  12. ａ）配列番号１１［ＷＡＳＴＲＸ１］、
    式中、
    Ｘ１は、Ｅ、Ｄ、Ｑ、またはＮである、
    ｂ）配列番号６７［Ｘ２ＡＳＴＲＸ２］、
    式中、
    Ｘ１は、ＷまたはＧであり、
    Ｘ２は、Ｅ、Ｄ、Ｑ、またはＮである、
    ｃ）配列番号１７、
    ｄ）配列番号３６、
    ｅ）配列番号５１、および
    ｆ）配列番号５９
    からなる群から選択されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列をさらに含む、請求項１１に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  13. ａ）配列番号１２［ＫＳＳＱＳＬＬＸ１ＳＳＮＱＫＮＸ２ＬＡ］、
    式中、
    Ｘ１は、Ｗ、Ｈ、Ｙ、またはＦであり、
    Ｘ２は、ＨまたはＹである、
    ｂ）配列番号６８［ＫＳＳＱＳＬＬＸ１Ｘ２ＳＸ３ＱＸ４ＮＸ５ＬＡ］、
    式中、
    Ｘ１は、Ｗ、Ｈ、Ｙ、またはＦであり、
    Ｘ２は、ＳまたはＧであり、
    Ｘ３は、ＮまたはＤであり、
    Ｘ４は、ＫまたはＲであり、
    Ｘ５は、ＨまたはＹである、
    ｃ）配列番号７０［ＫＳＳＱＳＬＬＹＳＮＧＸ１ＴＹＬＮ］、
    式中、
    Ｘ１は、ＫまたはＥであり、
    ｂ）配列番号１８、
    ｃ）配列番号３７、
    ｄ）配列番号４４、
    ｅ）配列番号５２、および
    ｆ）配列番号６０
    からなる群から選択されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列をさらに含む、請求項１２に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  14. 配列番号１３、１４、および１５にそれぞれ記載のＨＣＤＲ３、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ１領域のアミノ配列を含む重鎖可変領域、ならびにＫａｂａｔによるＨ１、Ｈ５、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１６、Ｈ３８、Ｈ４０、Ｈ４１、Ｈ４３、Ｈ４４、Ｈ６６、Ｈ７５、Ｈ７９、Ｈ８１、Ｈ８２Ａ、Ｈ８３、Ｈ８７、およびＨ１０８からなる群から選択される位置の１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  15. 配列番号１６、１７、および１８にそれぞれ記載のＬＣＤＲ３、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ１領域のアミノ配列を含む軽鎖可変領域、ならびにＫａｂａｔによるＬ５、Ｌ９、Ｌ１５、Ｌ１８、Ｌ１９、Ｌ２１、Ｌ２２、Ｌ４３、Ｌ６３、Ｌ７８、Ｌ７９、Ｌ８３、Ｌ８５、Ｌ１００、およびＬ１０４からなる群から選択される位置の１つまたはそれ以上のアミノ酸置換をさらに含む、請求項１４に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  16. 配列番号１６、１７、および１８にそれぞれ記載のＬＣＤＲ３、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ１領域のアミノ配列を含む軽鎖可変領域、ならびにＫａｂａｔによるＬ５、Ｌ９、Ｌ１５、Ｌ１８、Ｌ１９、Ｌ２１、Ｌ２２、Ｌ４３、Ｌ６３、Ｌ７８、Ｌ７９、Ｌ８３、Ｌ８５、Ｌ１００、およびＬ１０４からなる群から選択される位置の１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  17. 配列番号１９、２０、２１、２２、２４、２５、３８、４５、５３、および６１からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  18. 配列番号２６、２７、２８、２９、２９、３０、３１、３９、４６、５４、および６２からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメインアミノ酸配列をさらに含む、請求項１７に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  19. 配列番号２６、２７、２８、２９、２９、３０、３１、３９、４６、５４、および６２からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  20. 配列番号１９、２０、２１、２２、２４、２５、３８、４５、５３、および６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  21. 配列番号２６、２７、２８、２９、２９、３０、３１、３９、４６、５４、および６２からなる群から選択される軽鎖可変ドメインアミノ酸配列をさらに含む、請求項２０に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  22. 配列番号２６、２７、２８、２９、２９、３０、３１、３９、４６、５４、および６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  23. 配列番号１９および２６、配列番号２０および２７、配列番号２１および２８、配列番号２２および２８、配列番号２３および２９、配列番号２４および３０、配列番号２５および３１、配列番号３８および３９、配列番号４５および４６、配列番号５３および５４、または配列番号６１および６２に記載の、それぞれ重鎖および軽鎖の可変領域アミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  24. カリジンおよびｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンに対する結合を、配列番号１９および２６、配列番号３８および３９、配列番号４５および４６、配列番号５３および５４、または配列番号６１および６２に記載の、それぞれ重鎖および軽鎖の可変領域アミノ酸配列を含む抗体と競合する、カリジンおよびｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  25. カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンに対する結合を、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の抗体と競合し、ブラジキニンまたはｄｅｓＡｒｇ９−ブラジキニンに結合しない、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  26. ＫＤまたはＤＡＫＤのプロリン４のＩＩ型タイトターンを含むＰｒｏ４キンクコンフォメーションを取る、カリジン（ＫＤ）またはｄｅｓＡｒｇ１０−カリジン（ＤＡＫＤ）のコンフォメーションエピトープに特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  27. ＫＤまたはＤＡＫＤのＰｒｏ４キンクコンフォメーションは、アミノ酸の疎水性側鎖と空間的に積み重なってアラインしているＳ字形のアミノ酸リピートをさらに含む、請求項２６に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  28. （ａ）カリジンもしくはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンに特異的に結合するが、ブラジキニンもしくはｄｅｓ−Ａｒｇ９−ブラジキニンには特異的に結合しない；
    ｂ）カリジンもしくはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンに１×１０−１０Ｍ未満のＫＤで特異的に結合する；
    ｃ）カリジンもしくはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンに１×１０４ｓ−１未満のＫｏｆｆで特異的に結合する；
    および／または
    ｄ）カリジンもしくはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンに特異的に結合し、ブラジキニンＢ１受容体への結合を阻害する；
    請求項２６または２７に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  29. 診断薬または治療薬にコンジュゲートしている、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の抗体。
  30. 請求項１〜２９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメントのアミノ酸配列をコードする、単離された核酸。
  31. 請求項３０に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
  32. 請求項３１に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞。
  33. 請求項３２に記載の宿主細胞を、カリジンおよびｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンに特異的に結合する抗体が宿主細胞によって生成される条件下で培養することを含む、カリジンおよびｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジンに特異的に結合する抗体を生成する方法。
  34. 請求項１〜２８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント、および１つまたはそれ以上の薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
  35. 請求項３４に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、カリジンまたはｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン関連の疾患または障害を処置するための方法。
  36. 疾患または障害は慢性疼痛である、請求項３５に記載の方法。
  37. ペプチドは配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなり、ｄｅｓ−Ａｒｇ９−ブラジキニン、ｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン、およびｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン様ペプチドに特異的に結合する抗体が動物の免疫系によって生成されるように、ペプチドのアミノ末端のアルギニンはリンカー部分によって担体部分に間接的にカップリングしている、ペプチドを含む免疫原で動物を免疫化することを含む、ｄｅｓ−Ａｒｇ９−ブラジキニンおよびｄｅｓ−Ａｒｇ１０−カリジン様ペプチドに特異的に結合する抗体を産生する方法。
  38. 動物から、抗体、抗体をコードする核単離（ｎｕｃｌｅｉｃ ｉｓｏｌａｔｉｎｇ）、または抗体を発現する免疫細胞を単離することをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
  39. 担体部分はタンパク質である、請求項３７に記載の方法。
  40. タンパク質はキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）である、請求項３９に記載の方法。
  41. リンカー部分は［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ］ｎを含み、ｎは少なくとも１である、請求項４０に記載の方法。
JP2015503318A 2012-03-28 2013-03-15 ブラジキニンｂ１受容体リガンドに対する抗体 Active JP6779012B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018218861A JP6912441B2 (ja) 2012-03-28 2018-11-22 ブラジキニンｂ１受容体リガンドに対する抗体

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261616845P 2012-03-28 2012-03-28
US61/616,845 2012-03-28
FR1350953 2013-02-04
FR1350953 2013-02-04
PCT/US2013/031836 WO2013148296A1 (en) 2012-03-28 2013-03-15 Antibodies to bradykinin b1 receptor ligands

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2018218861A Division JP6912441B2 (ja) 2012-03-28 2018-11-22 ブラジキニンｂ１受容体リガンドに対する抗体

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2015513903A true JP2015513903A (ja) 2015-05-18
JP2015513903A5 JP2015513903A5 (ja) 2016-04-07
JP6779012B2 JP6779012B2 (ja) 2020-11-04

Family

ID=49261064

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2015503318A Active JP6779012B2 (ja) 2012-03-28 2013-03-15 ブラジキニンｂ１受容体リガンドに対する抗体
JP2018218861A Active JP6912441B2 (ja) 2012-03-28 2018-11-22 ブラジキニンｂ１受容体リガンドに対する抗体
JP2021112483A Active JP7411609B2 (ja) 2012-03-28 2021-07-07 ブラジキニンｂ１受容体リガンドに対する抗体
JP2023216462A Pending JP2024038036A (ja) 2012-03-28 2023-12-22 ブラジキニンｂ１受容体リガンドに対する抗体

Family Applications After (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2018218861A Active JP6912441B2 (ja) 2012-03-28 2018-11-22 ブラジキニンｂ１受容体リガンドに対する抗体
JP2021112483A Active JP7411609B2 (ja) 2012-03-28 2021-07-07 ブラジキニンｂ１受容体リガンドに対する抗体
JP2023216462A Pending JP2024038036A (ja) 2012-03-28 2023-12-22 ブラジキニンｂ１受容体リガンドに対する抗体

Country Status (39)

Country Link
US (5) US9376494B2 (ja)
EP (2) EP3246339B1 (ja)
JP (4) JP6779012B2 (ja)
KR (4) KR20220031728A (ja)
CN (2) CN104334578B (ja)
AR (1) AR090352A1 (ja)
AU (2) AU2013240242B2 (ja)
BR (1) BR112014024282A2 (ja)
CA (1) CA2868353C (ja)
CL (2) CL2014002590A1 (ja)
CO (1) CO7111293A2 (ja)
CR (1) CR20140440A (ja)
CY (1) CY1121466T1 (ja)
DK (2) DK2831113T3 (ja)
DO (1) DOP2014000199A (ja)
EA (1) EA201491784A1 (ja)
ES (1) ES2673869T3 (ja)
GT (1) GT201400192A (ja)
HK (1) HK1206754A1 (ja)
HR (1) HRP20180928T1 (ja)
HU (1) HUE037720T2 (ja)
IL (1) IL234830B (ja)
LT (1) LT2831113T (ja)
MA (1) MA37407B1 (ja)
MX (2) MX361874B (ja)
MY (2) MY166157A (ja)
NZ (1) NZ631543A (ja)
PE (1) PE20142170A1 (ja)
PH (1) PH12014501970A1 (ja)
PL (1) PL2831113T3 (ja)
PT (1) PT2831113T (ja)
RS (1) RS57413B1 (ja)
SG (2) SG11201405162YA (ja)
SI (1) SI2831113T1 (ja)
TR (1) TR201808486T4 (ja)
TW (1) TWI605060B (ja)
UA (1) UA117097C2 (ja)
UY (1) UY34682A (ja)
WO (1) WO2013148296A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019050822A (ja) * 2012-03-28 2019-04-04 サノフイＳａｎｏｆｉ ブラジキニンｂ１受容体リガンドに対する抗体

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA035943B1 (ru) 2013-03-13 2020-09-03 Протена Биосайенсес Лимитед Антитело, связывающееся с тау-белком человека
CN105504049B (zh) * 2014-09-26 2019-07-05 艾托金生物医药（苏州）有限公司 宫颈癌相关的hpv e7蛋白单克隆抗体及其应用
CO2018007216A2 (es) 2015-12-15 2018-09-20 Dyax Corp Ensayo de cuantificacion de peptido para diferenciar quininogeno de alto peso molecular (hmwk) de longitud completa y hmwk escindido
US11299751B2 (en) 2016-04-29 2022-04-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
WO2017189959A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
CN109415432B (zh) 2016-05-02 2022-07-08 普罗塞纳生物科学有限公司 Tau免疫疗法
EA201892417A1 (ru) 2016-05-02 2019-05-31 Протена Биосайенсис Лимитед Антитела, распознающие тау
EP3452509A1 (en) 2016-05-02 2019-03-13 Prothena Biosciences Limited Antibodies recognizing tau
JOP20190100A1 (ar) 2016-11-19 2019-05-01 Potenza Therapeutics Inc بروتينات ربط مولد ضد مضاد لـ gitr وطرق استخدامها
JP7442790B2 (ja) * 2017-05-02 2024-03-05 プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド タウ認識抗体
MX2019013184A (es) * 2017-05-08 2020-02-07 Adimab Llc Dominios de union a anti-cd3 y anticuerpos que los comprenden, y metodos para su generacion y uso.
WO2019148186A1 (en) * 2018-01-29 2019-08-01 Silarus Therapeutics, Inc. Antibodies binding erfe and methods of use
WO2020180819A1 (en) 2019-03-03 2020-09-10 Prothena Biosciences Limited Antibodies recognizing tau

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008543810A (ja) * 2005-06-14 2008-12-04 サイトス バイオテクノロジー アーゲー 抗原コンジュゲート及びその使用

Family Cites Families (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4741900A (en) 1982-11-16 1988-05-03 Cytogen Corporation Antibody-metal ion complexes
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2, Inc., Danville, Calif. Geänderte antikörper.
EP0428534B1 (en) 1988-06-14 1995-03-29 Cetus Oncology Corporation Coupling agents and sterically hindered disulfide linked conjugates prepared therefrom
US6780613B1 (en) 1988-10-28 2004-08-24 Genentech, Inc. Growth hormone variants
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
ZA902949B (en) 1989-05-05 1992-02-26 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
US5460785A (en) 1989-08-09 1995-10-24 Rhomed Incorporated Direct labeling of antibodies and other protein with metal ions
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
DE69127749T2 (de) 1990-03-20 1998-04-16 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York, New York, N.Y. Chimäre antikörper mit rezeptor-bindenden liganden anstelle ihrer konstanten region
DK0574395T3 (da) 1990-11-09 2002-10-07 Stephen D Gillies Cytokin-immunkonjugater
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
GB9422383D0 (en) 1994-11-05 1995-01-04 Wellcome Found Antibodies
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
GB9524973D0 (en) 1995-12-06 1996-02-07 Lynxvale Ltd Viral vectors
JP2001506967A (ja) 1996-08-02 2001-05-29 ブリストル―マイヤーズ・スクイブ・カンパニー 治療およびインビボ診断における免疫グロブリンの使用の結果としての免疫グロブリン誘発毒性の抑制方法
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
ES2258817T3 (es) 1997-05-21 2006-09-01 Biovation Limited Metodo para la produccion de proteinas no inmunogenas.
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6242195B1 (en) 1998-04-02 2001-06-05 Genentech, Inc. Methods for determining binding of an analyte to a receptor
PT1068241E (pt) 1998-04-02 2007-11-19 Genentech Inc Variantes de anticorpos e respectivos fragmentos
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
EP1105427A2 (en) 1998-08-17 2001-06-13 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
EP1006183A1 (en) 1998-12-03 2000-06-07 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Recombinant soluble Fc receptors
DE69934967T2 (de) 1998-12-08 2007-12-06 Biovation Ltd. Verfahren zur verminderung der immunogenität von proteinen
WO2000042072A2 (en) 1999-01-15 2000-07-20 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
GB0029407D0 (en) 2000-12-01 2001-01-17 Affitech As Product
JP4336498B2 (ja) 2000-12-12 2009-09-30 メディミューン，エルエルシー 延長した半減期を有する分子ならびにその組成物および用途
US20040002587A1 (en) 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
KR20040088572A (ko) 2002-03-01 2004-10-16 이뮤노메딕스, 인코오포레이티드 제거율 증강을 위한 양특이성 항체 점 돌연변이들
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
WO2004016750A2 (en) 2002-08-14 2004-02-26 Macrogenics, Inc. FcϜRIIB-SPECIFIC ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF
DK2364996T3 (en) 2002-09-27 2017-02-06 Xencor Inc Optimized Fc variants and methods for their formation
AU2003286467B2 (en) 2002-10-15 2009-10-01 Abbvie Biotherapeutics Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
EP1587540B1 (en) 2003-01-09 2021-09-15 MacroGenics, Inc. IDENTIFICATION AND ENGINEERING OF ANTIBODIES WITH VARIANT Fc REGIONS AND METHODS OF USING SAME
CN1871259A (zh) 2003-08-22 2006-11-29 比奥根艾迪克Ma公司 具有改变的效应物功能的经改进的抗体和制备它的方法
GB0324368D0 (en) 2003-10-17 2003-11-19 Univ Cambridge Tech Polypeptides including modified constant regions
EP2385069A3 (en) 2003-11-12 2012-05-30 Biogen Idec MA Inc. Neonatal Fc rReceptor (FcRn)- binding polypeptide variants, dimeric Fc binding proteins and methods related thereto
US20050249723A1 (en) 2003-12-22 2005-11-10 Xencor, Inc. Fc polypeptides with novel Fc ligand binding sites
PT1706424E (pt) 2004-01-12 2009-10-01 Applied Molecular Evolution Variantes da região fc
EP2053062A1 (en) 2004-03-24 2009-04-29 Xencor, Inc. Immunoglobin variants outside the Fc region
WO2005123780A2 (en) 2004-04-09 2005-12-29 Protein Design Labs, Inc. Alteration of fcrn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
WO2006085967A2 (en) 2004-07-09 2006-08-17 Xencor, Inc. OPTIMIZED ANTI-CD20 MONOCONAL ANTIBODIES HAVING Fc VARIANTS
JP2008505174A (ja) 2004-07-15 2008-02-21 ゼンコー・インコーポレイテッド 最適化Ｆｃ変異体
WO2006047350A2 (en) 2004-10-21 2006-05-04 Xencor, Inc. IgG IMMUNOGLOBULIN VARIANTS WITH OPTIMIZED EFFECTOR FUNCTION
US8460364B2 (en) 2006-07-20 2013-06-11 Orbusneich Medical, Inc. Bioabsorbable polymeric medical device
AR063840A1 (es) * 2006-11-15 2009-02-25 Medarex Inc Anticuerpos humanos monoclonales para btla y metodos de uso
US20110022149A1 (en) 2007-06-04 2011-01-27 Cox Brian J Methods and devices for treatment of vascular defects
EP2574345A1 (en) * 2007-06-12 2013-04-03 AC Immune S.A. Humanized antibodies to amyloid beta
CN111909273B (zh) 2007-08-29 2024-03-26 塞诺菲-安万特股份有限公司 人源化的抗-cxcr5抗体、其衍生物及它们的应用
JP5701606B2 (ja) * 2007-11-07 2015-04-15 セルデックス セラピューティクス インコーポレイテッド ヒト樹状細胞および上皮細胞２０５（ｄｅｃ−２０５）に結合する抗体
EP2420245A1 (en) * 2010-08-18 2012-02-22 Max-Delbrück-Centrum Für Molekulare Medizin Therapeutic use of agonists or antagonists of bradykinin receptor 1 or 2, for modulation collateral blood vessel growth
CN104334578B (zh) * 2012-03-28 2021-10-08 赛诺菲 缓激肽b1受体配体的抗体

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008543810A (ja) * 2005-06-14 2008-12-04 サイトス バイオテクノロジー アーゲー 抗原コンジュゲート及びその使用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BEDI,G.S. ET AL.: ""Monoclonal antibodies to bradykinin inhibit smooth muscle contractile avtion of bradykinin."", BIOCHIM. BIOPHYS. ACTA, vol. 842, JPN6016048995, 1985, pages 90 - 99, ISSN: 0003465617 *
DUNCAN, A.M. ET AL.: ""Kinins in humans."", AM. J. PHYSIOL. REGULATORY INTEGRATIVE COMP. PHYSIOL., vol. 278, JPN6016048997, 2000, pages 897 - 904, ISSN: 0003465618 *
GEPPETTI, P. ET AL.: ""Kallidin applied to the human nasal mucosa produces algesic response not blocked by capsaicin desen", REGULATORY PEPTIDES, vol. 33, JPN6016048998, 1991, pages 321 - 329, XP025208931, ISSN: 0003465619, DOI: 10.1016/0167-0115(91)90234-8 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019050822A (ja) * 2012-03-28 2019-04-04 サノフイＳａｎｏｆｉ ブラジキニンｂ１受容体リガンドに対する抗体

Also Published As

Publication number Publication date
MX2018015914A (es) 2021-12-08
US20180222967A1 (en) 2018-08-09
EP2831113B1 (en) 2018-03-14
CN104334578B (zh) 2021-10-08
AU2013240242B2 (en) 2018-02-08
CL2014002590A1 (es) 2015-01-16
BR112014024282A2 (pt) 2017-08-08
TWI605060B (zh) 2017-11-11
HRP20180928T1 (hr) 2018-07-27
DK3246339T3 (da) 2020-01-27
EP2831113A1 (en) 2015-02-04
US20200115441A1 (en) 2020-04-16
PL2831113T3 (pl) 2018-08-31
US20160368976A1 (en) 2016-12-22
DK2831113T3 (en) 2018-06-25
EP3246339B1 (en) 2019-10-09
CA2868353C (en) 2023-10-31
HK1206754A1 (en) 2016-01-15
KR102035882B1 (ko) 2019-10-24
AU2018203081A1 (en) 2018-05-24
UY34682A (es) 2013-10-31
JP7411609B2 (ja) 2024-01-11
JP6779012B2 (ja) 2020-11-04
US20150050270A1 (en) 2015-02-19
HUE037720T2 (hu) 2018-09-28
PE20142170A1 (es) 2015-01-07
KR20190121861A (ko) 2019-10-28
AR090352A1 (es) 2014-11-05
MX361874B (es) 2018-12-18
KR20220031728A (ko) 2022-03-11
LT2831113T (lt) 2018-06-25
MX2014011688A (es) 2015-01-22
IL234830B (en) 2018-11-29
KR20150002679A (ko) 2015-01-07
SG11201405162YA (en) 2014-09-26
DOP2014000199A (es) 2014-10-31
CO7111293A2 (es) 2014-11-10
TR201808486T4 (tr) 2018-07-23
CN104334578A (zh) 2015-02-04
NZ631543A (en) 2017-03-31
AU2013240242A1 (en) 2014-10-02
CN113773385A (zh) 2021-12-10
SG10201702396QA (en) 2017-04-27
GT201400192A (es) 2015-07-29
US9879079B2 (en) 2018-01-30
JP6912441B2 (ja) 2021-08-04
KR102166083B1 (ko) 2020-10-16
CA2868353A1 (en) 2013-10-03
MA37407A1 (fr) 2016-05-31
MA37407B1 (fr) 2018-03-30
US10465002B2 (en) 2019-11-05
WO2013148296A1 (en) 2013-10-03
US9376494B2 (en) 2016-06-28
EP3246339A1 (en) 2017-11-22
UA117097C2 (uk) 2018-06-25
MY184037A (en) 2021-03-17
PT2831113T (pt) 2018-06-20
ES2673869T3 (es) 2018-06-26
MY166157A (en) 2018-06-06
CR20140440A (es) 2014-11-17
EA201491784A1 (ru) 2015-02-27
KR20200121370A (ko) 2020-10-23
PH12014501970A1 (en) 2014-11-17
CY1121466T1 (el) 2020-05-29
SI2831113T1 (en) 2018-08-31
CL2017003039A1 (es) 2018-03-16
TW201343671A (zh) 2013-11-01
KR102367723B1 (ko) 2022-02-28
JP2024038036A (ja) 2024-03-19
JP2019050822A (ja) 2019-04-04
RS57413B1 (sr) 2018-09-28
JP2021166538A (ja) 2021-10-21
US20230399388A1 (en) 2023-12-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7411609B2 (ja) ブラジキニンｂ１受容体リガンドに対する抗体
CN104105708A (zh) PDGF受体β结合多肽
AU2014306649A1 (en) Antibodies to Plasminogen Activator inhibitor-1 (PAI-1) and uses thereof
US11851460B2 (en) PD1 binding agents
BR112014029219B1 (pt) Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, uso dos mesmos e composição farmacêutica
AU2017292752A1 (en) Antibodies with low immunogenicity and uses thereof
Li et al. Antibodies to kallidin and des-Arg 9-kallidin
TW202413426A (zh) 抗ｃｃｒ８抗體及使用方法
OA17139A (en) Antibodies to bradykinin B1 receptor ligands

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20160215

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20160215

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20161214

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20161220

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20170321

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20170324

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20170808

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20171108

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20180202

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20180724

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20181122

C60 Trial request (containing other claim documents, opposition documents)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60

Effective date: 20181122

C11 Written invitation by the commissioner to file amendments

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C11

Effective date: 20181211

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20181219

C21 Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C21

Effective date: 20190108

A912 Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912

Effective date: 20190208

C211 Notice of termination of reconsideration by examiners before appeal proceedings

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C211

Effective date: 20190219

C22 Notice of designation (change) of administrative judge

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C22

Effective date: 20190716

C13 Notice of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C13

Effective date: 20191105

C302 Record of communication

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C302

Effective date: 20191107

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20200205

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20200214

C13 Notice of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C13

Effective date: 20200317

C22 Notice of designation (change) of administrative judge

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C22

Effective date: 20200407

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20200609

C22 Notice of designation (change) of administrative judge

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C22

Effective date: 20200714

C23 Notice of termination of proceedings

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C23

Effective date: 20200811

C03 Trial/appeal decision taken

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C03

Effective date: 20200915

C30A Notification sent

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C3012

Effective date: 20200915

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20201013

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6779012

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

S531 Written request for registration of change of domicile

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250