JP2015510397A - 抗体凝集物レベルを低下させるためのプロセスおよびそれによって産生される抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)約37℃および約pH7.0で、培養培地において、抗DLL4 mAbを発現する哺乳動物細胞株を培養するステップであって、
抗DLL4抗体が、それぞれ配列番号:1、配列番号:2、および配列番号:3において記載されるCDR1、CDR2、およびCDR3アミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびにそれぞれ配列番号:4、配列番号:5、および配列番号:6において記載されるCDR1、CDR2、およびCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含み、
培養培地が、約320mOsm/kg H2Oの出発重量オスモル濃度を有する上記ステップ、
(b)培養プロセスの間に細胞に材料供給するために、2つの部分に分かれた供給材料を使用するステップ、ならびに
(c)培養上清から、発現された抗体を回収するステップを含む方法も提供する。
(a)約36.5℃および約pH6.85で、培養培地において、抗DLL4 mAbを発現する哺乳動物細胞株を培養するステップであって、
抗DLL4抗体が、それぞれ配列番号:1、配列番号:2、および配列番号:3において記載されるCDR1、CDR2、およびCDR3アミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびにそれぞれ配列番号:4、配列番号:5、および配列番号:6において記載されるCDR1、CDR2、およびCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含み、
培養培地が、約320mOsm/kg H2Oの出発重量オスモル濃度を有する上記ステップ、
(b)培養プロセスの間に細胞に材料供給するために、2つの部分に分かれた供給材料を使用するステップ、ならびに
(c)培養上清から、発現された抗体を回収するステップを含む方法をも提供する。
他に定義されない限り、本明細書において使用される科学用語および技術用語は、当業者らによって一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によって他に必要とされない限り、単数の用語は、多数を含み、複数の用語は、単数を含むものとする。全般的に、本明細書において記載される細胞培養および組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質化学およびオリゴヌクレオチド化学またはポリヌクレオチド化学、ならびにハイブリダイゼーションに関して利用される命名法ならびにそれらの技術は、当技術分野においてよく知られており、また、一般に使用されるものである。
細胞培養パラメーターならびにプロテインA精製後の凝集物のレベルおよび組成の関係
mAb生産性プロファイルを減少させることなく、発酵プロセスにおける凝集のレベルを低下させる方法を開発した。発酵時により高い単量体純度のmAbを産生することは、下流の精製プロセスにとって有益であり、最終プロセスの収率の改善をもたらすであろう。
細胞培養維持:クローン31−121細胞は、50mLの無動物タンパク質培地(M18)を含有する250mL振盪フラスコ中で維持した。細胞は、グルタミンシンテターゼ阻害剤L−メチオニンスルホキシイミン(MSX)を補足した、インハウスの無動物タンパク質培地(M18)において3×105生細胞/mLの細胞播種で播種した。細胞培養物は、36.5℃の5%のCO2/95%空気の大気中で、140rpmで、継続的振盪下で維持し、3日ごとに継代した。
14日間の培養物の細胞培養上清を、遠心分離ならびに1.2μm、0.45μm、および0.2μmポアサイズ細胞膜フィルターによる濾過(filteriation)によって清澄した。清澄した培養物を、プロテインAアフィニティーカラムにかけた。
サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)は、医薬タンパク質凝集物の検出および定量化のための業界標準技術である(Gabrielson et al.,2005;Liu et al.,2009;Mahler et al.,2008)。SECは、UV280検出装置を装備したAgilent 1100に接続されたTSKgel 3000 SWXLカラム(7.8mm×30.0cm;TOSOH Bioscience、Stuttgart、Germany)およびSWXLガードカラム(6.0mm×4.0cm;TOSOH Bioscience、Stuttgart、Germany)を使用して実行した。溶出は、HPLCシステム上でのクロマトグラフィー分離のために、1.0mL/分の流速で、pH6.8の0.1Mリン酸ナトリウムおよび0.1M硫酸ナトリウムバッファーを使用して実行した。使用前に、カラムは、Bio−Rad laboratories(Hercules、CA、USA)のBioRadゲルろ過標準物質を使用して較正した。
最初の試験は、凝集物形成に対する影響についてスクリーニングした供給材料タイプ、最初の培地重量オスモル濃度、および播種細胞密度などのようなパラメーターを用いて、振盪フラスコ中で実行した(データ示さず)。温度、pH、および撹拌速度などのような他の因子は、これらのパラメーターを厳密にコントロールすることができるバイオリアクターシステムを必要とした。得られた結果に基づくと、培地の温度、pH、および出発重量オスモル濃度は、凝集物形成に対してかなりの影響を及ぼす主なプロセス細胞培養因子であった。振盪フラスコ実験の間に、使用される供給材料のタイプは、mAb凝集物形成に影響を与えることに関して、重要な役割を果たすようには見られなかった。しかしながら、2部に分かれた供給材料の使用は、mAb力価に関して有益な効果をもたらすように見られた。その結果、2部に分かれた供給材料を、すべてのさらなる実験のために使用した。
新しい発酵プロセスおよび高い凝集物レベルを生成した以前のプロセスの間の比較
DoEに基づいた研究の結果によって予測されるように、細胞は、最適化された条件下でバイオリアクター中で培養した。この新しいプロセスの実行を、この特定のクローンにより高レベルの凝集物を生成した以前の基本ケースのプロセスと比較した。凝集物組成および最終mAb力価に加えて、プロセスの間に達したピーク生細胞数(VCN)、投入したアルカリ溶液およびグルコース溶液の量、ならびに容器に散布したO2についての要求量を比較した(表3)。以前のプロセスは、M20aの単一の供給材料、培養温度について36.5℃、pH6.8、および320mOsm/kg H2Oの出発重量オスモル濃度を有する培地を利用した。新しい発酵プロセスは、2部に分かれた供給材料、培養温度について36.5℃または37℃、および6.85または7.0のpHならびに320mOsm/kg H2Oの出発重量オスモル濃度を有する培養培地を利用した。
実施形態1.抗デルタ様リガンド4(DLL4)モノクローナル抗体を産生するための方法であって、
約37℃の温度、約7.0のpH、および約320mOsm/kg H2Oの出発重量オスモル濃度で、抗体を発現する哺乳動物細胞を培養するステップであって、
抗体が、
a)配列番号:7において記載される重鎖可変(VH)ドメインおよび配列番号:8において記載される軽鎖可変(VL)ドメイン、または
b)配列番号:1において記載されるアミノ酸配列を含むVHドメイン相補性ドメイン領域(CDR)1、配列番号:2において記載されるアミノ酸配列を含むVHドメインCDR2、および配列番号:3において記載されるアミノ酸配列を含むVH CDR3ならびに配列番号:4において記載されるアミノ酸配列を含むVLドメインCDR1、配列番号:5において記載されるアミノ酸配列を含むVLドメインCDR2、および配列番号:6において記載されるアミノ酸配列を含むVLドメインCDR3を含む上記ステップ、ならびに
培養上清から、発現された抗DLL4抗体を回収するステップを含む上記方法。
約36.5℃の温度、約6.85のpH、および約320mOsm/kg H2Oの出発重量オスモル濃度で、抗体を発現する哺乳動物細胞を培養するステップであって、
抗体が、
a)配列番号:7において記載される重鎖可変(VH)ドメインおよび配列番号:8において記載される軽鎖可変(VL)ドメイン、または
b)配列番号:1において記載されるアミノ酸配列を含むVHドメイン相補性ドメイン領域(CDR)1、配列番号:2において記載されるアミノ酸配列を含むVHドメインCDR2、および配列番号:3において記載されるアミノ酸配列を含むVH CDR3ならびに配列番号:4において記載されるアミノ酸配列を含むVLドメインCDR1、配列番号:5において記載されるアミノ酸配列を含むVLドメインCDR2、および配列番号:6において記載されるアミノ酸配列を含むVLドメインCDR3を含む上記ステップ、ならびに
培養上清から、発現された抗DLL4抗体を回収するステップを含む方法。
a)約320mOsm/kg H2Oの出発重量オスモル濃度を有する培養培地において、約37℃の温度および約7.0のpHで、抗体を発現する哺乳動物細胞株を培養するステップであって、
細胞株が、配列番号:1のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号:2のアミノ酸配列を含むVH CDR2、配列番号:3のアミノ酸配列を含むVH CDR3、配列番号:4のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号:5のアミノ酸配列を含むVL CDR2、および配列番号:6のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む抗DLL4抗体を発現し、かつ
培養プロセスが、細胞に材料供給するために、2つの部分に分かれた供給材料を使用することを含む上記ステップ、
b)培養上清から、発現された抗体を回収するステップ、ならびに
c)アフィニティークロマトグラフィーを使用して、発現された抗体を精製するステップを含む上記方法。
a)約320mOsm/kg H2Oの出発重量オスモル濃度を有する培養培地において、約36.5℃の温度および約6.85のpHで、抗体を発現する哺乳動物細胞株を培養するステップであって、
細胞株が、配列番号:1のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号:2のアミノ酸配列を含むVH CDR2、配列番号:3のアミノ酸配列を含むVH CDR3、配列番号:4のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号:5のアミノ酸配列を含むVL CDR2、および配列番号:6のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む抗DLL4抗体を発現し、かつ
培養プロセスが、細胞に材料供給するために、2つの部分に分かれた供給材料を使用することを含む上記ステップ、
b)培養上清から、発現された抗体を回収するステップ、ならびに
c)アフィニティークロマトグラフィーを使用して、発現された抗体を精製するステップを含む上記方法。
抗DLL4抗体が、配列番号:1のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号:2のアミノ酸配列を含むVH CDR2、配列番号:3のアミノ酸配列を含むVH CDR3、配列番号:4のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号:5のアミノ酸配列を含むVL CDR2、および配列番号:6のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、上記方法。
a)pH7.0、温度34℃、および出発重量オスモル濃度400mOsm/kg H2Oまたは
b)pH6.85、温度35.5℃、および出発重量オスモル濃度360mOsm/kg H2Oまたは
c)pH6.7、温度37℃、および出発重量オスモル濃度400mOsm/kg H2Oまたは
d)pH6.7、温度34℃、および出発重量オスモル濃度320mOsm/kg H2Oまたは
e)pH7.0、温度37℃、および出発重量オスモル濃度320mOsm/kg H2Oまたは
f)pH7.0、温度37℃、および出発重量オスモル濃度400mOsm/kg H2Oまたは
g)pH6.85、温度35.5℃、および出発重量オスモル濃度360mOsm/kg H2Oまたは
h)pH7.0、温度34℃、および出発重量オスモル濃度320mOsm/kg H2Oまたは
i)pH6.7、温度37℃、および出発重量オスモル濃度320mOsm/kg H2Oまたは
j)pH6.85、温度36.5℃、および出発重量オスモル濃度320mOsm/kg H2O
のうちの1つを含む、実施形態28に記載の方法。
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Claims (32)
- 抗デルタ様リガンド4(DLL4)モノクローナル抗体を産生するための方法であって、
約37℃の温度、約7.0のpH、および約320mOsm/kg H2Oの出発重量オスモル濃度で、前記抗体を発現する哺乳動物細胞を培養するステップであって、
前記抗体が、
a)配列番号:7において記載される重鎖可変(VH)ドメインおよび配列番号:8において記載される軽鎖可変(VL)ドメイン、または
b)配列番号:1において記載されるアミノ酸配列を含むVHドメイン相補性ドメイン領域(CDR)1、配列番号:2において記載されるアミノ酸配列を含むVHドメインCDR2、および配列番号:3において記載されるアミノ酸配列を含むVH CDR3、ならびに配列番号:4において記載されるアミノ酸配列を含むVLドメインCDR1、配列番号:5において記載されるアミノ酸配列を含むVLドメインCDR2、および配列番号:6において記載されるアミノ酸配列を含むVLドメインCDR3を含む上記ステップ、ならびに
培養上清から、発現された前記抗DLL4抗体を回収するステップを含む上記方法。 - 抗デルタ様リガンド4(DLL4)モノクローナル抗体を産生するための方法であって、
約36.5℃の温度、約6.85のpH、および約320mOsm/kg H2Oの出発重量オスモル濃度で、前記抗体を発現する哺乳動物細胞を培養するステップであって、
前記抗体が、
a)配列番号:7において記載される重鎖可変(VH)ドメインおよび配列番号:8において記載される軽鎖可変(VL)ドメイン、または
b)配列番号:1において記載されるアミノ酸配列を含むVHドメイン相補性ドメイン領域(CDR)1、配列番号:2において記載されるアミノ酸配列を含むVHドメインCDR2、および配列番号:3において記載されるアミノ酸配列を含むVH CDR3、ならびに配列番号:4において記載されるアミノ酸配列を含むVLドメインCDR1、配列番号:5において記載されるアミノ酸配列を含むVLドメインCDR2、および配列番号:6において記載されるアミノ酸配列を含むVLドメインCDR3を含む上記ステップ、ならびに
培養上清から、発現された前記抗DLL4抗体を回収するステップを含む上記方法。 - 回収された前記抗DLL4抗体が、SEC−HPLCで決定される5%未満の凝集物を含む、請求項1または2に記載の方法。
- 回収された前記抗DLL4抗体が、SEC−HPLCで決定される2%未満の凝集物を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記培養の間に、2つの部分に分かれた供給材料により、前記細胞に材料供給するステップをさらに含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記哺乳動物細胞株が、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)、NSO、またはPER.C6細胞株から選ばれる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞株が、CHOである、請求項6に記載の方法。
- 前記抗DLL4抗体の回収が、前記抗体のアフィニティー精製を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アフィニティー精製が、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーを含む、請求項6に記載の方法。
- 前記培養上清における前記抗体の力価が、少なくとも3g/Lである、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記培養上清における前記抗体の力価が、少なくとも4g/Lである、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記培養上清における前記抗体の力価が、少なくとも5g/Lである、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記培養上清における前記抗体の力価が、少なくとも6g/Lである、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記培養上清における前記抗体の力価が、少なくとも7g/Lである、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗DLL4抗体が、配列番号:7において記載されるVHドメインおよび配列番号:8において記載されるVLドメインを含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗DLL4抗体が、配列番号:1において記載されるアミノ酸配列を含むVHドメインCDR1、配列番号:2において記載されるアミノ酸配列を含むVHドメインCDR2、および配列番号:3において記載されるアミノ酸配列を含むVH CDR3、ならびに配列番号:4において記載されるアミノ酸配列を含むVLドメインCDR1、配列番号:5において記載されるアミノ酸配列を含むVLドメインCDR2、および配列番号:6において記載されるアミノ酸配列を含むVLドメインCDR3を含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- プロテインA精製モノクローナル抗体産物中の凝集物含有量を約5%未満まで低下させるための方法であって、
a)約320mOsm/kg H2Oの出発重量オスモル濃度を有する培養培地において、約37℃の温度および約7.0のpHで、前記抗体を発現する哺乳動物細胞株を培養するステップであって、
前記細胞株が、配列番号:1のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号:2のアミノ酸配列を含むVH CDR2、配列番号:3のアミノ酸配列を含むVH CDR3、配列番号:4のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号:5のアミノ酸配列を含むVL CDR2、および配列番号:6のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む抗DLL4抗体を発現し、かつ
培養プロセスが、前記細胞に材料供給するために、2つの部分に分かれた供給材料を使用することを含む上記ステップ、
b)培養上清から、発現された前記抗体を回収するステップ、ならびに
c)アフィニティークロマトグラフィーを使用して、発現された前記抗体を精製するステップを含む上記方法。 - プロテインA精製モノクローナル抗体産物中の凝集物含有量を約5%未満まで低下させるための方法であって、
a)約320mOsm/kg H2Oの出発重量オスモル濃度を有する培養培地において、約36.5℃の温度および約6.85のpHで、前記抗体を発現する哺乳動物細胞株を培養するステップであって、
前記細胞株が、配列番号:1のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号:2のアミノ酸配列を含むVH CDR2、配列番号:3のアミノ酸配列を含むVH CDR3、配列番号:4のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号:5のアミノ酸配列を含むVL CDR2、および配列番号:6のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む抗DLL4抗体を発現し、かつ
培養プロセスが、前記細胞に材料供給するために、2つの部分に分かれた供給材料を使用することを含む上記ステップ、
b)培養上清から、発現された前記抗体を回収するステップ、ならびに
c)アフィニティークロマトグラフィーを使用して、発現された前記抗体を精製するステップを含む方法。 - 前記アフィニティークロマトグラフィーが、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーを含む、請求項17または18に記載の方法。
- 前記哺乳動物細胞が、CHO細胞である、請求項17〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体が、配列番号:7のアミノ酸配列を含むVHドメインおよび配列番号:8のアミノ酸配列を含むVLドメインを含む、請求項17〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 精製された前記抗DLL4抗体が、SEC−HPLCで決定される2%未満の凝集物を含む、請求項17〜21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記培養上清における前記抗体の力価が、少なくとも3g/Lである、請求項17〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記培養上清における前記抗体の力価が、少なくとも4g/Lである、請求項17〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記培養上清における前記抗体の力価が、少なくとも5g/Lである、請求項17〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記培養上清における前記抗体の力価が、少なくとも6g/Lである、請求項17〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記培養上清における前記抗体の力価が、少なくとも7g/Lである、請求項17〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 抗DLL4モノクローナル抗体(mAb)の凝集物を低下させるための方法であって、バイオリアクターにおいて、36.5℃の温度、6.8のpH、および320mOsm/kg H2Oの出発重量オスモル濃度を含む条件下での、同じmAb産生CHO細胞の培養よりも、少ない凝集物を産生する温度、pH、および重量オスモル濃度の条件下で、前記抗DLL4mAbを分泌するCHO細胞を培養するステップを含み、
前記抗DLL4抗体が、配列番号:1のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号:2のアミノ酸配列を含むVH CDR2、配列番号:3のアミノ酸配列を含むVH CDR3、配列番号:4のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号:5のアミノ酸配列を含むVL CDR2、および配列番号:6のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、上記方法。 - より少ない凝集物を産生する条件が、
a)pH7.0、温度34℃、および出発重量オスモル濃度400mOsm/kg H2Oまたは
b)pH6.85、温度35.5℃、および出発重量オスモル濃度360mOsm/kg H2Oまたは
c)pH6.7、温度37℃、および出発重量オスモル濃度400mOsm/kg H2Oまたは
d)pH6.7、温度34℃、および出発重量オスモル濃度320mOsm/kg H2Oまたは
e)pH7.0、温度37℃、および出発重量オスモル濃度320mOsm/kg H2Oまたは
f)pH7.0、温度37℃、および出発重量オスモル濃度400mOsm/kg H2Oまたは
g)pH6.85、温度35.5℃、および出発重量オスモル濃度360mOsm/kg H2Oまたは
h)pH7.0、温度34℃、および出発重量オスモル濃度320mOsm/kg H2Oまたは
i)pH6.7、温度37℃、および出発重量オスモル濃度320mOsm/kg H2Oまたは
j)pH6.85、温度36.5℃、および出発重量オスモル濃度320mOsm/kg H2Oのうちの1つを含む、請求項28に記載の方法。 - 前記培養が、2つの部分に分かれた供給材料により、前記細胞に材料供給するステップを含む、請求項28または29に記載の方法。
- 前記抗DLL4抗体が、配列番号:7に示されるアミノ酸配列を含むVHドメインおよび配列番号:8に示されるアミノ酸配列を含むVLドメインを含む、請求項28〜30のいずれか一項に記載の方法。
- SEC−HPLCで決定される約1.4%未満の凝集物を含む、請求項1〜31のいずれか1つによって産生される抗体組成物。
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