JP2015073523A - 核酸の検出方法、検出プローブ、マイクロアレイ、核酸検出キット、核酸‐検出プローブ‐捕捉プローブ複合体、核酸固定化担体、及び流体デバイス - Google Patents
核酸の検出方法、検出プローブ、マイクロアレイ、核酸検出キット、核酸‐検出プローブ‐捕捉プローブ複合体、核酸固定化担体、及び流体デバイス Download PDFInfo
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Abstract
【課題】酵素を用いずに、標的核酸が核酸プローブからの解離を防ぐことが可能であり、高精度に核酸を検出することができる核酸の検出方法を提供する。
【解決手段】（ａ）第１の部分及び第２の部分からなる核酸を含有する核酸試料と、ステムループ構造を形成し、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、５’突出末端又は３’突出末端を有し、標識物質により標識されている検出プローブと、前記第１の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、該配列中に第１の光反応性塩基誘導体を含む捕捉プローブと、を接触させる工程と、（ｂ）核酸−検出プローブ‐捕捉プローブ複合体を形成させる工程と、（ｃ）第一の波長帯域の光によって、前記第１の光反応性塩基誘導体と前記核酸とを架橋させる工程と、（ｄ）前記核酸−検出プローブ‐捕捉プローブ複合体中の標識物質を検出する工程と、を有する核酸の検出方法。
【選択図】なし
【解決手段】（ａ）第１の部分及び第２の部分からなる核酸を含有する核酸試料と、ステムループ構造を形成し、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、５’突出末端又は３’突出末端を有し、標識物質により標識されている検出プローブと、前記第１の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、該配列中に第１の光反応性塩基誘導体を含む捕捉プローブと、を接触させる工程と、（ｂ）核酸−検出プローブ‐捕捉プローブ複合体を形成させる工程と、（ｃ）第一の波長帯域の光によって、前記第１の光反応性塩基誘導体と前記核酸とを架橋させる工程と、（ｄ）前記核酸−検出プローブ‐捕捉プローブ複合体中の標識物質を検出する工程と、を有する核酸の検出方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、核酸の検出方法、検出プローブ、マイクロアレイ、核酸検出キット、核酸‐検出プローブ‐捕捉プローブ複合体、核酸固定化担体、及び流体デバイスに関する。
従来、細胞内の遺伝子発現量を測定する手段としてｍＲＮＡをターゲットとしたＤＮＡマイクロアレイが広く用いられている。２１世紀に入って、短鎖の非コードＲＮＡであるｍｉＲＮＡが、生体内の遺伝子発現の制御をしていることが報告され、ｍｉＲＮＡの異常発現とがんを初めとした様々な疾患との関係が明らかになりつつある。このような知見に基づき、ｍｉＲＮＡをターゲットとしたＤＮＡマイクロアレイの開発競争が繰り広げられている。
更に、２００８年にｍｉＲＮＡが血液中を循環していることが発見されたことにより（非特許文献１参照）、血液検査するだけでがんの診断ができる可能性が示され、ｍｉＲＮＡをターゲットとしたＤＮＡマイクロアレイ市場が近い将来急拡大するものと見込まれている。
一方、ｃＤＮＡへの逆転写反応を利用した定量ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）法もｍｉＲＮＡを定量する技術として広く実用化されている。定量ＰＣＲ法は、逆転写酵素を用いてｍｉＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、該ｃＤＮＡを増幅することにより、鋳型となったｍｉＲＮＡ量を見積もる方法である。定量ＰＣＲ法は、ＰＣＲ反応を用いて一定量まで増幅したｃＤＮＡ量を測定する方法であるため、ＤＮＡマイクロアレイに比べて定量性が高い一方で、複数のサンプルや多種のｍｉＲＮＡに対する並列処理が難しいという問題点がある。
ｍｉＲＮＡをターゲットとした既存のＤＮＡマイクロアレイ（以下、ｍｉＲＮＡ標的ＤＮＡマイクロアレイという。）は、目的となるｍｉＲＮＡに相補的にハイブリダイズする遺伝子配列を持つ核酸プローブを透明基板上に並べたものである。
ｍｉＲＮＡ標的ＤＮＡマイクロアレイを用いたｍｉＲＮＡの定量方法としては、例えば、以下の方法が挙げられる。先ず、生体サンプルからｍｉＲＮＡを抽出し、該ｍｉＲＮＡを蛍光標識した後に、ｍｉＲＮＡ標的ＤＮＡマイクロアレイに添加し、基板上の核酸プローブにハイブリダイズさせる。次いで、基板に非特異的に吸着したｍｉＲＮＡを洗浄した後、蛍光強度を指標にｍｉＲＮＡ量を見積もる。
生体サンプルからｍｉＲＮＡを調製する際には、生体サンプルから全ＲＮＡを抽出・精製し、ｍｉＲＮＡを含む全ＲＮＡを蛍光標識した後に、蛍光標識ｍｉＲＮＡを含む蛍光標識全ＲＮＡを、ｍｉＲＮＡ標的ＤＮＡマイクロアレイに接触させる。
ｍｉＲＮＡ標的ＤＮＡマイクロアレイを用いたｍｉＲＮＡの定量方法としては、例えば、以下の方法が挙げられる。先ず、生体サンプルからｍｉＲＮＡを抽出し、該ｍｉＲＮＡを蛍光標識した後に、ｍｉＲＮＡ標的ＤＮＡマイクロアレイに添加し、基板上の核酸プローブにハイブリダイズさせる。次いで、基板に非特異的に吸着したｍｉＲＮＡを洗浄した後、蛍光強度を指標にｍｉＲＮＡ量を見積もる。
生体サンプルからｍｉＲＮＡを調製する際には、生体サンプルから全ＲＮＡを抽出・精製し、ｍｉＲＮＡを含む全ＲＮＡを蛍光標識した後に、蛍光標識ｍｉＲＮＡを含む蛍光標識全ＲＮＡを、ｍｉＲＮＡ標的ＤＮＡマイクロアレイに接触させる。
しかし、生体内、特に血液中のｍｉＲＮＡ量は、全ＲＮＡ中、０．０１質量％と極めて少ないため、このような前処理の過程が複雑な場合、ｍｉＲＮＡは、ピペット操作の途中で吸着や分解の影響を受けやすい。さらに、測定ごとの蛍光標識率の変動が測定結果の再現性を低くしてしまうという問題点も持ち合わせている。
また、このような手作業による前処理は、研究者や臨床検査技師の技術差によって影響を受けるため、将来的にはμ−ＴＡＳ（Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ)を用いて、全ての前処理工程をチップ上で行えるように全自動化されることが望まれている。ここで、μ−ＴＡＳとは、ＭＥＭＳ（Ｍｉｃｒｏ Ｅｌｅｃｔｒｏ
Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）技術を用いて、チップ上に微小な流路や反応室、混合室を設け、一つのチップ上で核酸を分析するマイクロ流体デバイスを意味する。
しかしながら、以下のように蛍光標識法がボトルネックとなり、全自動化への組み込みが進んでいない。
Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）技術を用いて、チップ上に微小な流路や反応室、混合室を設け、一つのチップ上で核酸を分析するマイクロ流体デバイスを意味する。
しかしながら、以下のように蛍光標識法がボトルネックとなり、全自動化への組み込みが進んでいない。
ｍｉＲＮＡの主な蛍光標識法として、ｍｉＲＮＡの塩基部分に直接蛍光標識する方法や、Ｔ４ＤＮＡリガーゼなどの酵素を用いてｍｉＲＮＡの３’末端に蛍光標識したヌクレオチドを付加する方法が挙げられる。
しかし、これらの方法では全ての核酸が非特異的に蛍光標識されるため、基板上の核酸プローブにハイブリダイゼーションさせる前に、予め蛍光標識された標的ｍｉＲＮＡから未反応の蛍光試薬等を取り除く必要がある。これらの分離にはゲルろ過クロマトグラフィーを用いるのが一般的であり、約２２塩基と短いｍｉＲＮＡを、未反応の蛍光試薬から精度良く分離する必要がある。例えば、μ−ＴＡＳを用いて分離する場合には、生体サンプルを、樹脂の詰まった領域を長距離移動させる工程が必要であり、スペースの限られたチップ内でかかる工程を行うのは極めて難しい。また、例え可能であっても、連続して実験を繰り返すためには、未反応の蛍光試薬を洗い流すために長時間の洗浄が必要であり、現実的ではない。
しかし、これらの方法では全ての核酸が非特異的に蛍光標識されるため、基板上の核酸プローブにハイブリダイゼーションさせる前に、予め蛍光標識された標的ｍｉＲＮＡから未反応の蛍光試薬等を取り除く必要がある。これらの分離にはゲルろ過クロマトグラフィーを用いるのが一般的であり、約２２塩基と短いｍｉＲＮＡを、未反応の蛍光試薬から精度良く分離する必要がある。例えば、μ−ＴＡＳを用いて分離する場合には、生体サンプルを、樹脂の詰まった領域を長距離移動させる工程が必要であり、スペースの限られたチップ内でかかる工程を行うのは極めて難しい。また、例え可能であっても、連続して実験を繰り返すためには、未反応の蛍光試薬を洗い流すために長時間の洗浄が必要であり、現実的ではない。
上記の問題点に対し、未反応の蛍光色素の分離過程を省いてｍｉＲＮＡを検出できるサンドイッチ型マイクロアレイ法が考案されている（特許文献１参照。）。
係るサンドイッチ型マイクロアレイ法の第１の方法として、具体的には、以下の工程が挙げられる。先ず、第１の部分３００及び第２の部分３０１からなる各ｍｉＲＮＡ３０３に相補的な配列を有する核酸プローブを二分割し、捕捉プローブ３０４（Ｃａｐｔｕｒｅ
ｐｒｏｂｅ）と検出プローブ３０５（Ｄｅｔｅｃｔ ｐｒｏｂｅ）とする。そして、各ｍｉＲＮＡ３０３の第１の部分３００に相補的な配列を有する捕捉プローブ３０４群を基板３０６上に配列させてマイクロアレイを作製する（図１８参照）。
次いで、各ｍｉＲＮＡ３０３を、作製したマイクロアレイ基板（基板３０６）に接触させた後、各ｍｉＲＮＡ３０３の第２の部分３０１に相補的な配列を有する検出プローブ３０５群を含む溶液をマイクロアレイ基板（基板３０６）に接触させることで、ｍｉＲＮＡ３０３、捕捉プローブ３０４、検出プローブ３０５の３者をハイブリダイゼーションさせる（図１８参照）。検出プローブ３０５は、ｍｉＲＮＡ３０３の第２の部分３０１を認識して結合するため、捕捉プローブ３０４への非特異的な結合は起こらず、未反応の検出プローブ３０４をクロマトクラフィーなどで分離する必要がない。
係るサンドイッチ型マイクロアレイ法の第１の方法として、具体的には、以下の工程が挙げられる。先ず、第１の部分３００及び第２の部分３０１からなる各ｍｉＲＮＡ３０３に相補的な配列を有する核酸プローブを二分割し、捕捉プローブ３０４（Ｃａｐｔｕｒｅ
ｐｒｏｂｅ）と検出プローブ３０５（Ｄｅｔｅｃｔ ｐｒｏｂｅ）とする。そして、各ｍｉＲＮＡ３０３の第１の部分３００に相補的な配列を有する捕捉プローブ３０４群を基板３０６上に配列させてマイクロアレイを作製する（図１８参照）。
次いで、各ｍｉＲＮＡ３０３を、作製したマイクロアレイ基板（基板３０６）に接触させた後、各ｍｉＲＮＡ３０３の第２の部分３０１に相補的な配列を有する検出プローブ３０５群を含む溶液をマイクロアレイ基板（基板３０６）に接触させることで、ｍｉＲＮＡ３０３、捕捉プローブ３０４、検出プローブ３０５の３者をハイブリダイゼーションさせる（図１８参照）。検出プローブ３０５は、ｍｉＲＮＡ３０３の第２の部分３０１を認識して結合するため、捕捉プローブ３０４への非特異的な結合は起こらず、未反応の検出プローブ３０４をクロマトクラフィーなどで分離する必要がない。
しかしながら、特許文献１に記載の第１の方法では、ｍｉＲＮＡ３０３に相補的な配列を有する核酸プローブを２つに分割することにより、１つのプローブ上のｍｉＲＮＡ３０３に相補的な配列はそれぞれ１０塩基程度となる。その結果、ｍｉＲＮＡ３０３と核酸プローブとの親和性が減少し、血液中に極微量しか存在しないｍｉＲＮＡ３０３を正確に定量することが難しい。
また、生体サンプル中には約７０塩基のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡの前駆体）が含まれている。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは約２２塩基のｍｉＲＮＡの配列を含んでいるため、特許文献１の第１の方法では両者を区別できず、遺伝子発現制御機能を有するｍｉＲＮＡのみを正確に定量できないという根本的な問題を抱えている。
また、生体サンプル中には約７０塩基のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡの前駆体）が含まれている。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは約２２塩基のｍｉＲＮＡの配列を含んでいるため、特許文献１の第１の方法では両者を区別できず、遺伝子発現制御機能を有するｍｉＲＮＡのみを正確に定量できないという根本的な問題を抱えている。
この解決策として特許文献１に記載の第２の方法では、更に、リガーゼを用いてｍｉＲＮＡ３０３と核酸プローブを共有結合させる方法が提案されている（図１９参照）。しかしながら、図１８に示される第１の方法において、リガーゼを用いた場合、ｍｉＲＮＡ３０３とハイブリダイズした検出プローブ３０５と捕捉プローブ３０４が共有結合した後、ｍｉＲＮＡ３０３が解離して他の捕捉プローブ３０４に結合することにより、同一分子のｍｉＲＮＡ３０３が複数回に亘って検出される危険がある。
一方、図１９に示される第２の方法においては、さらに２種類の橋渡し用プローブ３０７，３０８（ｃ−ｂｒｉｄｇｅ３０７, ｄ−ｂｒｉｄｇｅ３０８）を使用することで、捕捉プローブ３０４とｍｉＲＮＡ３０３と検出プローブ３０９とをライゲーションにより共有結合させ、基板３０６上に捕捉されたｍｉＲＮＡ３０３が基板３０６から解離することを防いでいる。
Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、第１０５巻、第１０５１３〜１０５１８頁、２００８年
しかしながら、例えば、特許文献１に記載の第２の方法では、ｍｉＲＮＡ３０３と４種類のプローブが全て衝突して５種類の分子が複合体を形成した場合のみシグナルが検出されるため、定量性が悪くなるという問題を抱えており、操作も煩雑で時間を要する。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、リガーゼ等の酵素を用いずとも標的核酸が核酸プローブから解離することを防ぐことが可能であり、簡便で、高精度かつ高感度に、核酸を検出することができる核酸の検出方法、並びに、該核酸の検出方法に用いられる検出プローブ、マイクロアレイ、核酸検出キット、核酸‐検出プローブ‐捕捉プローブ複合体、核酸固定化担体、及び流体デバイスを提供することを目的とする。
本発明者らは上記の課題を解決するため、鋭意研究を行った結果、光反応性塩基誘導体を有する核酸プローブを用いることにより課題を解決できることを見出した。本発明の一実施態様は、下記（１）〜（７）を提供するものである。
（１）本発明の一実施態様における核酸の検出方法は、
（ａ）第１の部分及び第２の部分からなる核酸を含有する核酸試料と、
ステムループ構造を形成し、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、５’突出末端又は３’突出末端を有し、標識物質により標識されている検出プローブと、
前記第１の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、該配列中に第１の光反応性塩基誘導体を含む捕捉プローブと、を接触させる工程と、
（ｂ）前記第２の部分を前記検出プローブにハイブリダイズさせ、前記第１の部分を前記捕捉プローブにハイブリダイズさせ、核酸−検出プローブ‐捕捉プローブ複合体を形成させる工程と、
（ｃ）前記第１の部分を前記捕捉プローブにハイブリダイズさせ、第一の波長帯域の光によって、前記第１の光反応性塩基誘導体と前記核酸とを架橋させる工程と、
（ｄ）前記核酸−検出プローブ‐捕捉プローブ複合体中の標識物質を検出する工程と、を有することを特徴とする。
（２）本発明の一実施態様における検出プローブは、
核酸試料中の第１の部分及び第２の部分からなる核酸を検出するために用いられる検出プローブであって、
相補鎖を形成する２つのステム部と、
前記２つのステム部間の領域であり、標識物質により標識されているループ部と、
前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列からなり、該第２の部分とハイブリダイズし得る配列中に光反応性塩基誘導体を含み、５’突出末端又は３’突出末端と、を備えることを特徴とする。
（３）本発明の一実施態様におけるマイクロアレイは、
核酸と検出プローブと複合体を形成可能で、配列中に光反応性塩基誘導体を含む捕捉プローブが基板に固定されており、
前記核酸は、前記捕捉プローブとハイブリダイズし得る第１の部分と、前記検出プローブとハイブリダイズし得る第２の部分とを含み、
前記検出プローブは、ステムループ構造を形成し、５’突出末端又は３’突出末端を有し、標識物質により標識されていることを特徴とする。
（４）本発明の一実施態様における核酸検出キットは、
捕捉プローブおよび検出プローブを備えた核酸検出キットであって、
前記捕捉プローブは、標的核酸を第一の部分と第二の部分に分割した場合に、前記第一の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、該配列中に光反応性塩基誘導体を含み、
前記検出プローブは、ステムループ構造を形成し、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、５’突出末端又は３’突出末端を有し、標識物質により標識されていることを特徴とする。
（５）本発明の一実施態様における核酸‐検出プローブ‐捕捉プローブ複合体は、
第１の部分及び第２の部分からなる核酸を介して、
ステムループ構造を形成し、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、５’突出末端又は３’突出末端を有し、標識物質により標識されている検出プローブと、
前記第１の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、該配列中に光反応性塩基誘導体を含む捕捉プローブとが、連結されてなることを特徴とする。
（６）本発明の一実施態様における核酸固定化担体は、
先に記載の核酸‐検出プローブ‐捕捉プローブ複合体が基板に固定化されてなることを特徴とする。
（７）本発明の一実施態様における流体デバイスは、
捕捉プローブが固定されてなる基板と、検出プローブ導入用インレットと、を有する核酸検出部を備えた流体デバイスであって、
前記捕捉プローブは、標的核酸を第一の部分と第二の部分に分割した場合に、前記第一の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、該配列中に光反応性塩基誘導体を含み、
前記検出プローブは、ステムループ構造を形成し、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、５’突出末端又は３’突出末端を有し、標識物質により標識されていることを特徴とする。
（１）本発明の一実施態様における核酸の検出方法は、
（ａ）第１の部分及び第２の部分からなる核酸を含有する核酸試料と、
ステムループ構造を形成し、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、５’突出末端又は３’突出末端を有し、標識物質により標識されている検出プローブと、
前記第１の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、該配列中に第１の光反応性塩基誘導体を含む捕捉プローブと、を接触させる工程と、
（ｂ）前記第２の部分を前記検出プローブにハイブリダイズさせ、前記第１の部分を前記捕捉プローブにハイブリダイズさせ、核酸−検出プローブ‐捕捉プローブ複合体を形成させる工程と、
（ｃ）前記第１の部分を前記捕捉プローブにハイブリダイズさせ、第一の波長帯域の光によって、前記第１の光反応性塩基誘導体と前記核酸とを架橋させる工程と、
（ｄ）前記核酸−検出プローブ‐捕捉プローブ複合体中の標識物質を検出する工程と、を有することを特徴とする。
（２）本発明の一実施態様における検出プローブは、
核酸試料中の第１の部分及び第２の部分からなる核酸を検出するために用いられる検出プローブであって、
相補鎖を形成する２つのステム部と、
前記２つのステム部間の領域であり、標識物質により標識されているループ部と、
前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列からなり、該第２の部分とハイブリダイズし得る配列中に光反応性塩基誘導体を含み、５’突出末端又は３’突出末端と、を備えることを特徴とする。
（３）本発明の一実施態様におけるマイクロアレイは、
核酸と検出プローブと複合体を形成可能で、配列中に光反応性塩基誘導体を含む捕捉プローブが基板に固定されており、
前記核酸は、前記捕捉プローブとハイブリダイズし得る第１の部分と、前記検出プローブとハイブリダイズし得る第２の部分とを含み、
前記検出プローブは、ステムループ構造を形成し、５’突出末端又は３’突出末端を有し、標識物質により標識されていることを特徴とする。
（４）本発明の一実施態様における核酸検出キットは、
捕捉プローブおよび検出プローブを備えた核酸検出キットであって、
前記捕捉プローブは、標的核酸を第一の部分と第二の部分に分割した場合に、前記第一の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、該配列中に光反応性塩基誘導体を含み、
前記検出プローブは、ステムループ構造を形成し、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、５’突出末端又は３’突出末端を有し、標識物質により標識されていることを特徴とする。
（５）本発明の一実施態様における核酸‐検出プローブ‐捕捉プローブ複合体は、
第１の部分及び第２の部分からなる核酸を介して、
ステムループ構造を形成し、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、５’突出末端又は３’突出末端を有し、標識物質により標識されている検出プローブと、
前記第１の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、該配列中に光反応性塩基誘導体を含む捕捉プローブとが、連結されてなることを特徴とする。
（６）本発明の一実施態様における核酸固定化担体は、
先に記載の核酸‐検出プローブ‐捕捉プローブ複合体が基板に固定化されてなることを特徴とする。
（７）本発明の一実施態様における流体デバイスは、
捕捉プローブが固定されてなる基板と、検出プローブ導入用インレットと、を有する核酸検出部を備えた流体デバイスであって、
前記捕捉プローブは、標的核酸を第一の部分と第二の部分に分割した場合に、前記第一の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、該配列中に光反応性塩基誘導体を含み、
前記検出プローブは、ステムループ構造を形成し、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、５’突出末端又は３’突出末端を有し、標識物質により標識されていることを特徴とする。
本発明によれば、標的核酸と核酸プローブとの酵素による連結を行わずに、高精度に、核酸を検出することができる。
≪核酸の検出方法≫
［第一実施形態］
本実施形態の核酸の検出方法は、
（ａ）第１の部分及び第２の部分からなる核酸を含有する核酸試料と、
ステムループ構造を形成し、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、５’突出末端又は３’突出末端を有し、標識物質により標識されている検出プローブと、
前記第１の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、該配列中に第１の光反応性塩基誘導体を含む捕捉プローブと、を接触させる工程と、
（ｂ）前記第２の部分を前記検出プローブにハイブリダイズさせ、前記第１の部分を前記捕捉プローブにハイブリダイズさせ、核酸−検出プローブ‐捕捉プローブ複合体を形成させる工程と、
（ｃ）前記第１の部分を前記捕捉プローブにハイブリダイズさせ、第一の波長帯域の光によって、前記第１の光反応性塩基誘導体と前記核酸とを架橋させる工程と、
（ｄ）前記核酸−検出プローブ‐捕捉プローブ複合体中の標識物質を検出する工程と、を有する。
本実施形態において、前記捕捉プローブは基板に固定されている。
光反応性塩基誘導体が捕捉プローブに含まれることにより、捕捉プローブと核酸との間が架橋され得るため、高精度な核酸の検出が実現される。
［第一実施形態］
本実施形態の核酸の検出方法は、
（ａ）第１の部分及び第２の部分からなる核酸を含有する核酸試料と、
ステムループ構造を形成し、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、５’突出末端又は３’突出末端を有し、標識物質により標識されている検出プローブと、
前記第１の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、該配列中に第１の光反応性塩基誘導体を含む捕捉プローブと、を接触させる工程と、
（ｂ）前記第２の部分を前記検出プローブにハイブリダイズさせ、前記第１の部分を前記捕捉プローブにハイブリダイズさせ、核酸−検出プローブ‐捕捉プローブ複合体を形成させる工程と、
（ｃ）前記第１の部分を前記捕捉プローブにハイブリダイズさせ、第一の波長帯域の光によって、前記第１の光反応性塩基誘導体と前記核酸とを架橋させる工程と、
（ｄ）前記核酸−検出プローブ‐捕捉プローブ複合体中の標識物質を検出する工程と、を有する。
本実施形態において、前記捕捉プローブは基板に固定されている。
光反応性塩基誘導体が捕捉プローブに含まれることにより、捕捉プローブと核酸との間が架橋され得るため、高精度な核酸の検出が実現される。
また、本実施形態の核酸の検出方法では、さらに、前記検出プローブが、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列中に第２の光反応性塩基誘導体を含み、前記工程（ｃ）において、さらに、前記第２の部分を前記検出プローブにハイブリダイズさせ、第２の波長帯域光によって前記第２の光反応性塩基誘導体と前記核酸とを架橋させるものであることが好ましい。
光反応性塩基誘導体が捕捉プローブに加えて、検出プローブに含まれることにより、検出プローブと核酸との間にも架橋がされ得るため、より高精度に核酸の検出が実現される。
光反応性塩基誘導体が捕捉プローブに加えて、検出プローブに含まれることにより、検出プローブと核酸との間にも架橋がされ得るため、より高精度に核酸の検出が実現される。
前記核酸試料に含有される検出対象の核酸としては、特に限定されないが、一例としてｍｉＲＮＡや転写が途中で止まった短鎖ｍＲＮＡ等の短鎖ＲＮＡである。例えば、生体内に多種類存在し、遺伝子発現の制御に関与しているｍｉＲＮＡである。
なお、本実施形態では、捕捉プローブは固相、たとえば基板に固定されていてもよい。固相としては、基板の他に、担体を好ましいものとして例示できる。固相担体としては、たとえば、磁気ビーズ、金ナノ粒子、アガロースビーズ、プラスチックビーズ等が挙げられる。固相基板としては、たとえば、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、金属基板等が挙げられる。
なお、本実施形態では、捕捉プローブは固相、たとえば基板に固定されていてもよい。固相としては、基板の他に、担体を好ましいものとして例示できる。固相担体としては、たとえば、磁気ビーズ、金ナノ粒子、アガロースビーズ、プラスチックビーズ等が挙げられる。固相基板としては、たとえば、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、金属基板等が挙げられる。
以下、図１を参照しながら、本実施形態における各工程について説明する。
工程（ａ）は、
第１の部分１及び第２の部分２からなるｍｉＲＮＡ３を含有する核酸試料と、ステムループ構造を形成し、前記第２の部分２とハイブリダイズし得る配列５ｂを含み、５’突出末端又は３’突出末端を有し、標識物質５ａにより標識されている検出プローブ５と、
前記第１の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、該配列中に第１の光反応性塩基誘導体７ａを含む捕捉プローブ４と、を接触させる工程であり、捕捉プローブ４は基板６に固定されている。
図１に示すように、検出対象のｍｉＲＮＡ３を、第１の部分１及び第２の部分２に二分割する。即ち、ｍｉＲＮＡ３は、第１の部分及び第２の部分からなる。
捕捉プローブ４及び検出プローブ５は、それぞれ、ｍｉＲＮＡ３の第１の部分１及び第２の部分２にハイブリダイズし得るものである。そのため、第１の部分１及び第２の部分２の長さは、５〜１７塩基が好ましく、約２２塩基からなるｍｉＲＮＡを２分割した塩基数という観点から、７〜１５塩基がより好ましい。
これら第１の部分１及び第２の部分２の長さは、配列特異性が保たれることが担保されていれば上記塩基数に限定されない。上記点は、第１の部分１及び第２の部分２のＧＣ含有量や標的ｍｉＲＮＡに類似の核酸の存在などによって影響される。
本実施形態においては、ｍｉＲＮＡ３の５’側の部分を第１の部分１とし、ｍｉＲＮＡ３の３’側の部分を第２の部分２とする。
第１の部分１及び第２の部分２からなるｍｉＲＮＡ３を含有する核酸試料と、ステムループ構造を形成し、前記第２の部分２とハイブリダイズし得る配列５ｂを含み、５’突出末端又は３’突出末端を有し、標識物質５ａにより標識されている検出プローブ５と、
前記第１の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、該配列中に第１の光反応性塩基誘導体７ａを含む捕捉プローブ４と、を接触させる工程であり、捕捉プローブ４は基板６に固定されている。
図１に示すように、検出対象のｍｉＲＮＡ３を、第１の部分１及び第２の部分２に二分割する。即ち、ｍｉＲＮＡ３は、第１の部分及び第２の部分からなる。
捕捉プローブ４及び検出プローブ５は、それぞれ、ｍｉＲＮＡ３の第１の部分１及び第２の部分２にハイブリダイズし得るものである。そのため、第１の部分１及び第２の部分２の長さは、５〜１７塩基が好ましく、約２２塩基からなるｍｉＲＮＡを２分割した塩基数という観点から、７〜１５塩基がより好ましい。
これら第１の部分１及び第２の部分２の長さは、配列特異性が保たれることが担保されていれば上記塩基数に限定されない。上記点は、第１の部分１及び第２の部分２のＧＣ含有量や標的ｍｉＲＮＡに類似の核酸の存在などによって影響される。
本実施形態においては、ｍｉＲＮＡ３の５’側の部分を第１の部分１とし、ｍｉＲＮＡ３の３’側の部分を第２の部分２とする。
尚、本発明及び本願明細書において「ハイブリダイズし得る」とは、本発明に用いられる捕捉プローブあるいは検出プローブの少なくとも一部が標的核酸（標的ｍｉＲＮＡ）にハイブリダイズし、相補的に複合体を形成することを含む。「ストリンジェントな条件」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＴＨＩＲＤ ＥＤＩＴＩＯＮ（Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載の条件が挙げられる。
本実施形態の核酸の検出方法は、検出プローブが、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列中に第２の光反応性塩基誘導体７ｂを含んでもよい。
図１に示される態様では、捕捉プローブ４は、前記第１の部分とハイブリダイズし得る配列中に第１の光反応性塩基誘導体７ａを含み、検出プローブ５は、ｍｉＲＮＡ３の第２の部分２とハイブリダイズし得る配列５ｂ中に第２の光反応性塩基誘導体７ｂを含む。
図１に示される態様では、捕捉プローブ４は、前記第１の部分とハイブリダイズし得る配列中に第１の光反応性塩基誘導体７ａを含み、検出プローブ５は、ｍｉＲＮＡ３の第２の部分２とハイブリダイズし得る配列５ｂ中に第２の光反応性塩基誘導体７ｂを含む。
核酸試料は、核酸を含有する試料であれば、特に限定されないが、例えば、本実施形態の核酸の検出方法をがんの診断に用いる場合には、がんの発症が確認されている者、若しくはがんの発症が疑われている者、又はがん治療を受けている患者等の被験者の血液、リンパ液、髄液、精液、唾液、尿等のサンプルから核酸を抽出することにより得られるものであることが好ましい。これらのサンプルからの核酸抽出は、トリゾルを用いる等、定法により行うことができるが、短鎖ＲＮＡを抽出する方法を利用することが好ましい。
上述したように、血液中のｍｉＲＮＡ量は、全ＲＮＡ中、０．０１質量％と極めて少ない。核酸試料には、サンプルから抽出された全ＲＮＡから分画により濃縮したｍｉＲＮＡを用いてもよい。本実施形態においては、検出対象のｍｉＲＮＡ自体を標識物質で標識する必要が無いため、核酸試料には分画操作をしていないものを用いてもよい。
捕捉プローブ４は、５’末端領域に、ｍｉＲＮＡ３の第１の部分１とハイブリダイズし得る配列を含む。
ｍｉＲＮＡ３を高精度に定量する観点から、捕捉プローブ４は、ｍｉＲＮＡ３の第２の部分２とハイブリダイズしないように、ｍｉＲＮＡ３の第２の部分２に相補的な配列を含まないことが好ましい。
基板６に固定された捕捉プローブ４が、ｍｉＲＮＡ３とハイブリダイゼーションするためには、分子的な自由度が必要であることから、捕捉プローブ４は、基板６と結合する３’末端にスペーサー４ａを有していることが好ましい。スペーサー４ａの長さとしては、特に限定されないが、３〜５０塩基が好ましく、５〜２５塩基がより好ましい。ただし、スペーサーに用いられる塩基は、同程度の長さと柔らかさを持ったＰＥＧ等のリンカーで代替可能である。係る場合には、スペーサー４ａに用いられる塩基数は０塩基でもよい。
捕捉プローブ４の長さは、プローブとして機能するために必要な長さであれば特に限定されないが、第１の部分１及びスペーサー４ａの塩基数を勘案し、３〜５０塩基が好ましく、５〜４０塩基がより好ましい。
ｍｉＲＮＡ３を高精度に定量する観点から、捕捉プローブ４は、ｍｉＲＮＡ３の第２の部分２とハイブリダイズしないように、ｍｉＲＮＡ３の第２の部分２に相補的な配列を含まないことが好ましい。
基板６に固定された捕捉プローブ４が、ｍｉＲＮＡ３とハイブリダイゼーションするためには、分子的な自由度が必要であることから、捕捉プローブ４は、基板６と結合する３’末端にスペーサー４ａを有していることが好ましい。スペーサー４ａの長さとしては、特に限定されないが、３〜５０塩基が好ましく、５〜２５塩基がより好ましい。ただし、スペーサーに用いられる塩基は、同程度の長さと柔らかさを持ったＰＥＧ等のリンカーで代替可能である。係る場合には、スペーサー４ａに用いられる塩基数は０塩基でもよい。
捕捉プローブ４の長さは、プローブとして機能するために必要な長さであれば特に限定されないが、第１の部分１及びスペーサー４ａの塩基数を勘案し、３〜５０塩基が好ましく、５〜４０塩基がより好ましい。
捕捉プローブ４は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、ＤＮＡやＲＮＡと同様の機能を有するものであれば、天然、非天然に限られず、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等の人工核酸を含むものであってもよい。ＤＮＡやＲＮＡと比較して、標的ｍｉＲＮＡ３との親和性が高く、ＤＮＡ分解酵素やＲＮＡ分解酵素に認識されにくいとの観点から、捕捉プローブ４は、ＬＮＡ又はＢＮＡを含むことが好ましい。
また、工程（ｄ）において、基板６上に形成されたｍｉＲＮＡ３―検出プローブ５−捕捉プローブ４複合体を検出するに際し、捕捉プローブ４は、検出プローブ５を標識する標識物質とは異なる種類の標識物質で標識されていることが好ましい。捕捉プローブ４を標識する標識物質としては、後述する検出プローブ５の標識に用いられるものと同様のものが挙げられる。
捕捉プローブ４を固定するために用いられる基板６としては、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、金属基板等が挙げられる。捕捉プローブ４を基板６上に固定する方法としては、光リソグラフ技術を利用して、基板上に高密度でプローブを固定する方法やガラス基板等にスポッティングによりプローブを固定する方法が挙げられる。
光リソグラフ技術を利用する場合には、基板６上で捕捉プローブ４を合成してもよい。
スポッティングにより捕捉プローブ４を固定する場合には、捕捉プローブ４に固相結合部位を設け、基板６に固相結合部位認識部位を設けておくことが好ましい。
このような固相結合部位／固相結合部位認識部位の組み合わせとしては、捕捉プローブ４をアミノ基、ホルミル基、ＳＨ基、スクシミジルエステル基等の官能基で修飾して設けられた固相結合部位と、基板６をアミノ基、ホルミル基、エポキシ基、マレイミド基等を有するシランカップリング剤で表面処理して設けられた固相結合部位認識部位との組合わせや、金-チオール結合を利用した組合せが挙げられる。
また、スポッティングにより捕捉プローブを固定する他の方法として、シアノール基を有する捕捉プローブを、ガラス基板に吐出し、配列させ、シランカップリング反応により共有結合させる方法も挙げられる。
光リソグラフ技術を利用する場合には、基板６上で捕捉プローブ４を合成してもよい。
スポッティングにより捕捉プローブ４を固定する場合には、捕捉プローブ４に固相結合部位を設け、基板６に固相結合部位認識部位を設けておくことが好ましい。
このような固相結合部位／固相結合部位認識部位の組み合わせとしては、捕捉プローブ４をアミノ基、ホルミル基、ＳＨ基、スクシミジルエステル基等の官能基で修飾して設けられた固相結合部位と、基板６をアミノ基、ホルミル基、エポキシ基、マレイミド基等を有するシランカップリング剤で表面処理して設けられた固相結合部位認識部位との組合わせや、金-チオール結合を利用した組合せが挙げられる。
また、スポッティングにより捕捉プローブを固定する他の方法として、シアノール基を有する捕捉プローブを、ガラス基板に吐出し、配列させ、シランカップリング反応により共有結合させる方法も挙げられる。
本実施形態において、検出プローブ５は、３’末端領域に、ｍｉＲＮＡ３の第２の部分２とハイブリダイズし得る配列５ｂを含む。
ｍｉＲＮＡ３を高精度に定量する観点から、検出プローブ５は、ｍｉＲＮＡ３の第１の部分１とハイブリダイズしないように、ｍｉＲＮＡ３の第１の部分１に相補的な配列を含まないことが好ましい。
ｍｉＲＮＡ３を高精度に定量する観点から、検出プローブ５は、ｍｉＲＮＡ３の第１の部分１とハイブリダイズしないように、ｍｉＲＮＡ３の第１の部分１に相補的な配列を含まないことが好ましい。
検出プローブ５は、ステムループ構造を形成する。ステムループ構造とは、一本鎖核酸において、分子内で離れた２箇所の領域に相補的な配列がある場合、核酸の塩基対間の相互作用によって相補鎖（ステム構造）を形成するとともに、その２箇所の領域に狭まれた配列がループ構造を形成するものをいう。ステムループ構造は、ヘアピンループ構造とも称される。
本実施形態において、検出プローブ５は、５’末端側から、相補鎖を形成する２つのステム部５ｃ，５ｄと、該２つのステム部５ｃ，５ｄ間の領域であるループ部５ｅと、第２の部分２とハイブリダイズし得る配列５ｂとからなる。即ち、検出プローブ５は、３’突出末端を有している。検出プローブは、突出末端を有しており、検出プローブが有する突出末端が、５’突出末端であるか３’突出末端であるかは、捕捉プローブと基板とが捕捉プローブの５’末端を介して結合しているか３’末端を介して結合しているかによる。
本実施形態において、検出プローブ５は、５’末端側から、相補鎖を形成する２つのステム部５ｃ，５ｄと、該２つのステム部５ｃ，５ｄ間の領域であるループ部５ｅと、第２の部分２とハイブリダイズし得る配列５ｂとからなる。即ち、検出プローブ５は、３’突出末端を有している。検出プローブは、突出末端を有しており、検出プローブが有する突出末端が、５’突出末端であるか３’突出末端であるかは、捕捉プローブと基板とが捕捉プローブの５’末端を介して結合しているか３’末端を介して結合しているかによる。
仮に、捕捉プローブが、ｍｉＲＮＡと同じ塩基配列領域を含むｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡの前駆体）と複合体を形成したとしても、検出プローブが突出末端を有するため、立体障害が生じ、検出プローブ−ｍｉＲＮＡ−捕捉プローブ複合体が形成されない。従って、本実施形態によれば、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは認識されず、標的ｍｉＲＮＡのみを認識するため、高精度に標的ｍｉＲＮＡを検出することができる。
検出プローブ５におけるステム部の長さは、ループ部の長さとの兼ね合いによって決まる。検出プローブ５におけるステム部の長さは、検出プローブ５が安定してステムループ構造を形成できる長さであれば特に限定されないが、たとえば、３〜５０塩基が好ましく、５〜２０塩基がより好ましい。
検出プローブ５におけるループ部の長さは、ステム部の長さとの兼ね合いによって決まる。検出プローブ５におけるループ部の長さは、検出プローブ５が安定してステムループ構造を形成できる長さであれば特に限定されないが、たとえば、３〜２００塩基が好ましく、５〜１００塩基がより好ましい。
検出プローブ５の長さは、ステムループ構造を形成でき、プローブとして機能するために必要な長さであれば特に限定されないが、第２の部分２の塩基数及びステムループ構造形成に必要な塩基数を勘案し、１４〜２００塩基が好ましく、２４〜１５０塩基がより好ましい。
検出プローブ５におけるループ部の長さは、ステム部の長さとの兼ね合いによって決まる。検出プローブ５におけるループ部の長さは、検出プローブ５が安定してステムループ構造を形成できる長さであれば特に限定されないが、たとえば、３〜２００塩基が好ましく、５〜１００塩基がより好ましい。
検出プローブ５の長さは、ステムループ構造を形成でき、プローブとして機能するために必要な長さであれば特に限定されないが、第２の部分２の塩基数及びステムループ構造形成に必要な塩基数を勘案し、１４〜２００塩基が好ましく、２４〜１５０塩基がより好ましい。
検出プローブ５は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、ＤＮＡやＲＮＡと同様の機能を有するものであれば、天然、非天然に限られず、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等の人工核酸を含むものであってもよい。ＤＮＡやＲＮＡと比較して、標的ｍｉＲＮＡとの親和性が高く、ＤＮＡ分解酵素やＲＮＡ分解酵素に認識されにくい観点から、検出プローブ５は、ＬＮＡ又はＢＮＡを含むことが好ましい。
捕捉プローブ４及び検出プローブ５の少なくともいずれか一方が、ＬＮＡ又はＢＮＡを含むことが好ましく、捕捉プローブ４及び検出プローブ５の両方が、ＬＮＡ又はＢＮＡを含むことがより好ましい。
捕捉プローブ４及び検出プローブ５の少なくともいずれか一方が、ＬＮＡ又はＢＮＡを含むことが好ましく、捕捉プローブ４及び検出プローブ５の両方が、ＬＮＡ又はＢＮＡを含むことがより好ましい。
検出プローブ５は、標識物質５ａにより標識されている。後述するｍｉＲＮＡ３―検出プローブ５−捕捉プローブ４複合体を形成する際の立体障害の観点から、標識物質５ａは、ループ部５ｅに結合していることが好ましい。
標識物質としては、例えば、蛍光色素、蛍光ビーズ、量子ドット、金ナノ粒子、ビオチン、抗体、抗原、エネルギー吸収性物質、ラジオアイソトープ、化学発光体、酵素等が挙げられる。
蛍光色素としては、ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’,５’−ジクロロ２’ ,７’−ジメトキシフルオレセイン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＴＥＴ（テトラクロロフルオレセイン）、ＨＥＸ（５'−ヘキサクロロ−フルオレセイン−ＣＥホスホロアミダイト）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ５６８、Ａｌｅｘａ６４７等が挙げられる。
全ＲＮＡ中、ｍｉＲＮＡはごく微量しか存在しないため、分画せずにｍｉＲＮＡを高効率に標識することは困難である。一方、本実施形態においては、予め標識した検出プローブを用いるため、高効率に、ｍｉＲＮＡを定量することができる。
標識物質としては、例えば、蛍光色素、蛍光ビーズ、量子ドット、金ナノ粒子、ビオチン、抗体、抗原、エネルギー吸収性物質、ラジオアイソトープ、化学発光体、酵素等が挙げられる。
蛍光色素としては、ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’,５’−ジクロロ２’ ,７’−ジメトキシフルオレセイン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＴＥＴ（テトラクロロフルオレセイン）、ＨＥＸ（５'−ヘキサクロロ−フルオレセイン−ＣＥホスホロアミダイト）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ５６８、Ａｌｅｘａ６４７等が挙げられる。
全ＲＮＡ中、ｍｉＲＮＡはごく微量しか存在しないため、分画せずにｍｉＲＮＡを高効率に標識することは困難である。一方、本実施形態においては、予め標識した検出プローブを用いるため、高効率に、ｍｉＲＮＡを定量することができる。
捕捉プローブ４が標識物質により標識されている場合、捕捉プローブ４を標識する標識物質と検出プローブ５を標識する標識物質との組合せは、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動；Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ）が起こり得ない組合せであっても、ＦＲＥＴが起こり得る組合せでもあってもよい。
標的ｍｉＲＮＡの有する配列や長さによって、ＦＲＥＴ効率が異なるという観点からは、ＦＲＥＴが起こり得ない組合せが好ましい。ＦＲＥＴが起こり得る標識物質の組合せを用いる場合であっても、例えば、捕捉プローブの基板に近い末端をＦＡＭで標識し、検出プローブの基板から最も遠いループ部分をＡｌｅｘａ６４７で標識する等、両者間でＦＲＥＴが起きないように設計することもできる。
また、検出プローブが捕捉プローブに連結された場合と基板に吸着した場合とを区別することができるという観点からは、ＦＲＥＴが起こり得る組合せが好ましい。
ＦＲＥＴが起こりうる標識物質の組合せとしては、励起波長が４９０ｎｍ付近の蛍光色素（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミングリーン、Ａｌｅｘａ（登録商標）ｆｌｕｏｒ ４８８、Ｂｏｄｉｐｙ ＦＬ等）と励起波長が５４０ｎｍ付近の蛍光色素（例えば、ＴＡＭＲＡ、テトラメチルローダミン、Ｃｙ３）、または、励起波長が５４０ｎｍ付近の蛍光色素と励起波長が６３０ｎｍ付近の蛍光色素（例えば、Ｃｙ５等）の組み合わせが好ましい。
標的ｍｉＲＮＡの有する配列や長さによって、ＦＲＥＴ効率が異なるという観点からは、ＦＲＥＴが起こり得ない組合せが好ましい。ＦＲＥＴが起こり得る標識物質の組合せを用いる場合であっても、例えば、捕捉プローブの基板に近い末端をＦＡＭで標識し、検出プローブの基板から最も遠いループ部分をＡｌｅｘａ６４７で標識する等、両者間でＦＲＥＴが起きないように設計することもできる。
また、検出プローブが捕捉プローブに連結された場合と基板に吸着した場合とを区別することができるという観点からは、ＦＲＥＴが起こり得る組合せが好ましい。
ＦＲＥＴが起こりうる標識物質の組合せとしては、励起波長が４９０ｎｍ付近の蛍光色素（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミングリーン、Ａｌｅｘａ（登録商標）ｆｌｕｏｒ ４８８、Ｂｏｄｉｐｙ ＦＬ等）と励起波長が５４０ｎｍ付近の蛍光色素（例えば、ＴＡＭＲＡ、テトラメチルローダミン、Ｃｙ３）、または、励起波長が５４０ｎｍ付近の蛍光色素と励起波長が６３０ｎｍ付近の蛍光色素（例えば、Ｃｙ５等）の組み合わせが好ましい。
また、本実施形態においては、捕捉プローブ及び検出プローブの２つのプローブが、標的ｍｉＲＮＡの第１の部分及び第２の部分をそれぞれ認識する。例えば、ｍｉＲＮＡが、ｌｅｔ−７ａ（５’−ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＡＵＡＧＵＵ−３’）である場合、ｌｅｔ−７ａの第１の部分を５’−ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧ−３’とし、第２の部分を５’− ＧＵＵＧＵＡＵＡＧＵＵ−３’とし、それぞれにハイブリダイズし得る配列を含む捕捉プローブ及び検出プローブを作製する。
ここで、検出プローブにおいて、ｌｅｔ−７ａの第２の部分とハイブリダイズし得る配列を、５’−ＡＡＣＴＡＴＡＣＡＡＣ−３’とし、ｌｅｔ−７ａの第２の部分の１塩基目のグアニンがアデニンに代わったｌｅｔ−７ｆ（５’−ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＡＵＵＧＵＡＵＡＧＵＵ−３’）の第２の部分とハイブリダイズし得る配列を、５’−ＡＡＣＴＡＴＡＣＡＡＴ−３’とし、これら２種類のｍｉＲＮＡと２種類の検出プローブが共存する条件下で、それぞれのｍｉＲＮＡを並列的に定量しようとした場合、ｌｅｔ−７ａとｌｅｔ−７ｆの第１の部分の配列が全く同じであるため、両者はマイクロアレイ上の同一の捕捉プローブ４にハイブリダイズし、それぞれがｍｉＲＮＡ３―検出プローブ５−捕捉プローブ４複合体を形成する。
従って、当該領域では両ｍｉＲＮＡが合算されたシグナルが検出され、誤った結果を導く場合がある。これは、例えば特許文献１において、致命的な問題である。
本発明者らは、以下の２点によりこの問題を解決できることを見出した。
従って、当該領域では両ｍｉＲＮＡが合算されたシグナルが検出され、誤った結果を導く場合がある。これは、例えば特許文献１において、致命的な問題である。
本発明者らは、以下の２点によりこの問題を解決できることを見出した。
第１に、前記工程（ａ）において、前記溶液は、異なる種類の標識物質により標識されている複数種類の検出プローブを含むことが好ましい。
これは、ｌｅｔ−７ａとｌｅｔ−７ｆの第２の部分とそれぞれハイブリダイズする検出プローブ（ｌｅｔ−７ａ）と検出プローブ（ｌｅｔ−７ｆ）を異なる標識物質により標識し、それぞれのシグナルを個別に定量する方法である。標識物質として、例えば波長の異なる蛍光物質であるＡｌｅｘａ５３２又はＡｌｅｘａ６４７を用いて、両検出プローブを標識する方法が挙げられる。
これは、ｌｅｔ−７ａとｌｅｔ−７ｆの第２の部分とそれぞれハイブリダイズする検出プローブ（ｌｅｔ−７ａ）と検出プローブ（ｌｅｔ−７ｆ）を異なる標識物質により標識し、それぞれのシグナルを個別に定量する方法である。標識物質として、例えば波長の異なる蛍光物質であるＡｌｅｘａ５３２又はＡｌｅｘａ６４７を用いて、両検出プローブを標識する方法が挙げられる。
第２に、前記工程（ａ）において、前記核酸試料は、検出対象の複数種類のｍｉＲＮＡを含有し、前記複数種類のｍｉＲＮＡの第１の部分がそれぞれ重複しないように、前記捕捉プローブの５’末端と３’末端のうち、どちら側が基板に固定されるかを選択されることが好ましい。
これは、類似ｍｉＲＮＡのうち、配列の異なる部分にハイブリダイズするプローブを捕捉プローブとして用いる方法である。ｌｅｔ−７ａおよびｌｅｔ−７ｆを例にすると、配列の異なる３’末端側の５’−ＧＵＵＧＵＡＵＡＧＵＵ−３’及び５’−ＡＵＵＧＵＡＵＡＧＵＵ−３’を第１の部分とし、共通の配列である５’末端側の５’−ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧ−３’を第２の部分とする。図１に記載の５’末端と３’末端の配置を反転させることで、補足プローブ４の５’末端側を基板上に固定した捕捉プローブ４−検出プローブ５−ｍｉＲＮＡ３複合体を形成させることが可能になる。この場合、ｌｅｔ−７ａ及びｌｅｔ−７ｂに対する検出プローブ５は同一の配列であり、標識される標識物質も同一となる。
これは、類似ｍｉＲＮＡのうち、配列の異なる部分にハイブリダイズするプローブを捕捉プローブとして用いる方法である。ｌｅｔ−７ａおよびｌｅｔ−７ｆを例にすると、配列の異なる３’末端側の５’−ＧＵＵＧＵＡＵＡＧＵＵ−３’及び５’−ＡＵＵＧＵＡＵＡＧＵＵ−３’を第１の部分とし、共通の配列である５’末端側の５’−ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧ−３’を第２の部分とする。図１に記載の５’末端と３’末端の配置を反転させることで、補足プローブ４の５’末端側を基板上に固定した捕捉プローブ４−検出プローブ５−ｍｉＲＮＡ３複合体を形成させることが可能になる。この場合、ｌｅｔ−７ａ及びｌｅｔ−７ｂに対する検出プローブ５は同一の配列であり、標識される標識物質も同一となる。
このように、本実施形態によれば、類似ｍｉＲＮＡを厳密に区別し、高精度に標的ｍｉＲＮＡを定量することができる。
ｍｉＲＮＡ３を含有する核酸試料と、検出プローブ５と、を含む溶液に用いられる液体としては、通常のハイブリダイゼーションに用いられる緩衝液等が挙げられる。
工程（ｂ）は、第２の部分２を検出プローブ５にハイブリダイズさせ、第１の部分１を捕捉プローブ４にハイブリダイズさせ、基板６上にｍｉＲＮＡ３―検出プローブ５−捕捉プローブ４複合体を形成させる工程である。
工程（ｂ）において、ｍｉＲＮＡは立体構造を形成しやすいため、９５℃で５分間程度インキュベーションして、ｍｉＲＮＡを熱変性させ、プローブとハイブリダイズしやすい状態にしておくことが好ましい。
ハイブリダイゼーションは、特に限定されるものではなく、各プローブのＴｍ値等を考慮した上で、温度、ｐＨ、塩濃度、緩衝液等の通常の条件下で行うことができる。高精度にｍｉＲＮＡを定量する観点から、ハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件で行うことが好ましい。
ストリンジェントな条件とは、例えば、３０℃程度の温度条件（プローブの配列のＴｍより５℃〜１０℃程高い温度条件）、１Ｍ未満の塩濃度条件等が挙げられる。
ハイブリダイゼーションは、特に限定されるものではなく、各プローブのＴｍ値等を考慮した上で、温度、ｐＨ、塩濃度、緩衝液等の通常の条件下で行うことができる。高精度にｍｉＲＮＡを定量する観点から、ハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件で行うことが好ましい。
ストリンジェントな条件とは、例えば、３０℃程度の温度条件（プローブの配列のＴｍより５℃〜１０℃程高い温度条件）、１Ｍ未満の塩濃度条件等が挙げられる。
工程（ｃ）は、前記第１の部分を前記捕捉プローブにハイブリダイズさせ、前記第２の部分を前記検出プローブにハイブリダイズさせ、第一の波長帯域の光によって、前記第１の光反応性塩基誘導体と前記核酸とを架橋させ、第２の波長帯域光によって前記第２の光反応性塩基誘導体と前記核酸とを架橋させる工程である。
光反応性塩基誘導体とは、所定の波長の光が照射されることにより、反応性が活性化され、任意の標的核酸と検出プローブ、及び任意の標的核酸と捕捉プローブとを架橋可能な塩基誘導体を意味する。光反応性塩基誘導体の一例として、ソラーレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）を付加した塩基、３−Ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ（以下、ＣＮＶＫともいう。）、4-チオチミジン、アデニン反応性基のケージド物 （Kobori ら、Bioorganic & Medicinal Chemistry, 20：5071-5076 (2012)）、３−ｃａｒｂｏｎｙｌｖｉｎｙｌ ｐｈｅｎｏｌ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ （ＣＶＰ） (Yoshimuraら、 Nucleic Acids Symposium Series , 48:81-82 (2004))、ｐ‐ｃａｒｂａｍｏｙｌｖｉｎｙｌ ｐｈｅｎｏｌ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ （ｐ−ＣＶＰ） （Amiら、Org. Biomol. Chem., 5: 2583-2586（2007）））、５‐ｃａｒｂｏｘｙｖｉｎｙｌｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ （ＣＶＵ） (Ogasawaraら、Chem Bio Chem, 6：1756-1760 (2005))、ｃａｒｂａｚｏｌｅ‐ｔｅｔｈｅｒｅｄ ５‐ｃａｒｂｏｘｙｖｉｎｙｌ‐２'‐ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ （ＹＣＶＵ）(Fujimotoら、Organic Letters, 10: 397-400 (2008))、５-ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌ‐１’‐α‐２’- ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ （α‐ＣＵ）, β‐ＣＵ（Oginoら、Angew. Chem. Int. Ed. 45：7223-7226（2006））、５‐ｖｉｎｙｌ‐２’‐ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ （ＶＵ）, ５‐ｈｅｐｔｅｎｙｌ‐２’―ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ （ＨＵ）, ５‐ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｖｉｎｙｌ‐２’‐ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ （ＨＶＵ）, ５‐ｔ‐ｂｕｔｙｌｖｉｎｙｌ‐２’‐ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ （ＢｕＶＵ）（Oginoら、Org. Biomol. Chem., 7：3163-3167 (2009)）、 ＢＴＶＵ， ＰＴＶＵ， ＭＰＴＶＵ， ＮＴＶＵ （Amiら、ChemBioChem 9, 2071-2074 (2008)）、Ｎ３‐ｍｅｔｈｙｌ−５−ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌ‐２’‐ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ （ＭＣＶＵ）（Fujimotoら、Chem. Commun., 3177-3179 （2005））、７‐ｄｅａｚａ‐２’‐ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ （ＶＺＡ） (Saitoら、Tetrahedron Letters 46：97-99 (2005))などが挙げられる。
光反応性塩基誘導体とは、所定の波長の光が照射されることにより、反応性が活性化され、任意の標的核酸と検出プローブ、及び任意の標的核酸と捕捉プローブとを架橋可能な塩基誘導体を意味する。光反応性塩基誘導体の一例として、ソラーレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）を付加した塩基、３−Ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ（以下、ＣＮＶＫともいう。）、4-チオチミジン、アデニン反応性基のケージド物 （Kobori ら、Bioorganic & Medicinal Chemistry, 20：5071-5076 (2012)）、３−ｃａｒｂｏｎｙｌｖｉｎｙｌ ｐｈｅｎｏｌ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ （ＣＶＰ） (Yoshimuraら、 Nucleic Acids Symposium Series , 48:81-82 (2004))、ｐ‐ｃａｒｂａｍｏｙｌｖｉｎｙｌ ｐｈｅｎｏｌ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ （ｐ−ＣＶＰ） （Amiら、Org. Biomol. Chem., 5: 2583-2586（2007）））、５‐ｃａｒｂｏｘｙｖｉｎｙｌｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ （ＣＶＵ） (Ogasawaraら、Chem Bio Chem, 6：1756-1760 (2005))、ｃａｒｂａｚｏｌｅ‐ｔｅｔｈｅｒｅｄ ５‐ｃａｒｂｏｘｙｖｉｎｙｌ‐２'‐ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ （ＹＣＶＵ）(Fujimotoら、Organic Letters, 10: 397-400 (2008))、５-ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌ‐１’‐α‐２’- ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ （α‐ＣＵ）, β‐ＣＵ（Oginoら、Angew. Chem. Int. Ed. 45：7223-7226（2006））、５‐ｖｉｎｙｌ‐２’‐ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ （ＶＵ）, ５‐ｈｅｐｔｅｎｙｌ‐２’―ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ （ＨＵ）, ５‐ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｖｉｎｙｌ‐２’‐ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ （ＨＶＵ）, ５‐ｔ‐ｂｕｔｙｌｖｉｎｙｌ‐２’‐ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ （ＢｕＶＵ）（Oginoら、Org. Biomol. Chem., 7：3163-3167 (2009)）、 ＢＴＶＵ， ＰＴＶＵ， ＭＰＴＶＵ， ＮＴＶＵ （Amiら、ChemBioChem 9, 2071-2074 (2008)）、Ｎ３‐ｍｅｔｈｙｌ−５−ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌ‐２’‐ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ （ＭＣＶＵ）（Fujimotoら、Chem. Commun., 3177-3179 （2005））、７‐ｄｅａｚａ‐２’‐ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ （ＶＺＡ） (Saitoら、Tetrahedron Letters 46：97-99 (2005))などが挙げられる。
前記第１の波長帯域光および前記第２の波長帯域光は、任意の標的核酸と検出プローブ、及び任意の標的核酸と捕捉プローブとを架橋可能な波長帯域光であれば特に制限されず、前記第１の波長帯域光と前記第２の波長帯域光とは、同じ波長帯域であってもよい。
検出プローブが含む第１の光反応性塩基誘導体と、捕捉プローブが含む第２の光反応性塩基誘導体とは、同一の化合物であってもよく、互いに異なる化合物であってもよい。すなわち、第１の光反応性塩基誘導体と第２の光反応性塩基誘導体とが同一の化合物の場合を、前記第１の波長帯域光と前記第２の波長帯域光が同じ波長帯域であって、任意の標的核酸と検出プローブ、及び任意の標的核酸と捕捉プローブとを架橋可能な場合として例示できる。
検出プローブが含む第１の光反応性塩基誘導体と、捕捉プローブが含む第２の光反応性塩基誘導体とは、同一の化合物であってもよく、互いに異なる化合物であってもよい。すなわち、第１の光反応性塩基誘導体と第２の光反応性塩基誘導体とが同一の化合物の場合を、前記第１の波長帯域光と前記第２の波長帯域光が同じ波長帯域であって、任意の標的核酸と検出プローブ、及び任意の標的核酸と捕捉プローブとを架橋可能な場合として例示できる。
図１（ｂ）は、前記第１の部分１を捕捉プローブ４にハイブリダイズさせ、前記第２の部分２を前記検出プローブにハイブリダイズさせた状態を示している。捕捉プローブ４は前記第１の部分とハイブリダイズし得る配列中に光反応性塩基誘導体７ａを含み、検出プローブ５は、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列５ｂ中に光反応性塩基誘導体７ｂを含んでいる。このとき、前記第１の波長帯域光及び/又は前記第２の波長帯域光を当該複合体へと照射し、第１の光反応性塩基誘導体７ａとｍｉＲＮＡ３、及び第２の光反応性塩基誘導体７ｂとｍｉＲＮＡ３をそれぞれ架橋させる。図１中７ａ及び７ｂはｍｉＲＮＡ３と架橋されていない状態の光反応性塩基誘導体を表し、７ａ’及び７ｂ’はｍｉＲＮＡ３と架橋された状態の光反応性塩基誘導体を表す。
核酸と検出プローブ、又は核酸と捕捉プローブとの連結にリガーゼ等の酵素を用いる方法では、酵素が機能する条件で連結の反応を行う。
一方、本実施形態の核酸検出方法では、核酸と検出プローブ、又は核酸と捕捉プローブとの連結に光反応性塩基誘導体を用いることにより、酵素が機能しない条件で、又は酵素を失活させる条件を経ていても、核酸の検出を行うことができる。当該条件の一例としては、上述の、ｍｉＲＮＡは立体構造を解くための９５℃で５分間程度インキュベーションがある。また、別の例として、プローブと核酸とのハイブリダイズを行う際に、溶液中に界面活性剤が含有された場合が挙げられる。溶液中に界面活性剤を含有させることにより、核酸の検出をより高精度に行うことができる。このように、本実施形態の核酸検出方法では、酵素を用いる代わりに光反応性塩基誘導体を用いるので、核酸の検出を高精度に行うための種々の条件を幅広く選択することができる。また、連結の反応の前に酵素が失活することを避けるために、本実施形態で用いる一連の試薬類の保管等を厳密に行う必要性を低減することができ、製品の品質管理がより容易となる。
本実施形態の核酸検出方法では、酵素を用いる代わりに光反応性塩基誘導体を用いて核酸の連結を行うので、酵素反応では制御困難である連結反応時間の厳密な制御、および微細な範囲ごとの連結反応の制御を行うことが可能である。微細な範囲ごとの連結反応の制御とは、たとえば、光照射時に、光反射効率に勾配を有するようコーティングが施されたフィルターを用い、極狭い面積ごとに光照射ドース条件を変化させることが挙げられる。
一方、本実施形態の核酸検出方法では、核酸と検出プローブ、又は核酸と捕捉プローブとの連結に光反応性塩基誘導体を用いることにより、酵素が機能しない条件で、又は酵素を失活させる条件を経ていても、核酸の検出を行うことができる。当該条件の一例としては、上述の、ｍｉＲＮＡは立体構造を解くための９５℃で５分間程度インキュベーションがある。また、別の例として、プローブと核酸とのハイブリダイズを行う際に、溶液中に界面活性剤が含有された場合が挙げられる。溶液中に界面活性剤を含有させることにより、核酸の検出をより高精度に行うことができる。このように、本実施形態の核酸検出方法では、酵素を用いる代わりに光反応性塩基誘導体を用いるので、核酸の検出を高精度に行うための種々の条件を幅広く選択することができる。また、連結の反応の前に酵素が失活することを避けるために、本実施形態で用いる一連の試薬類の保管等を厳密に行う必要性を低減することができ、製品の品質管理がより容易となる。
本実施形態の核酸検出方法では、酵素を用いる代わりに光反応性塩基誘導体を用いて核酸の連結を行うので、酵素反応では制御困難である連結反応時間の厳密な制御、および微細な範囲ごとの連結反応の制御を行うことが可能である。微細な範囲ごとの連結反応の制御とは、たとえば、光照射時に、光反射効率に勾配を有するようコーティングが施されたフィルターを用い、極狭い面積ごとに光照射ドース条件を変化させることが挙げられる。
なお、工程（ｂ）及び工程（ｃ）は、同時に行われてもよい。即ち、ハイブリダイゼーション及び架橋が、同時に行われてもよい。
プローブを、捕捉プローブ４と検出プローブ５の２つに分割することにより、各プローブと標的ｍｉＲＮＡ３との親和性が若干減少するが、上述した、（１）基板６と捕捉プローブ４とをスペーサー４ａを介して結合させ、捕捉プローブ４に分子的な自由度を付与すること（２）捕捉プローブ４及び／又は検出プローブ５がＬＮＡ又はＢＮＡを含むことで、各プローブとｍｉＲＮＡ３との親和性を高めること、により各プローブと標的ｍｉＲＮＡ３との親和性を高めることができる。
ハイブリダイゼーション反応終了後、非特異的にハイブリダイズしたものを除去するために、基板６を洗浄することが好ましい。洗浄方法についても通常の条件下で行うことができる。高精度にｍｉＲＮＡを定量する観点から、洗浄はストリンジェントな条件で行うことが好ましく、例えば、基板６を塩濃度の低い溶液中を振とうさせて数回洗浄する方法が挙げられる。
工程（ｄ）は基板６上に形成されたｍｉＲＮＡ３―検出プローブ５−捕捉プローブ４複合体中の標識物質５ａを検出し、検出結果から核酸試料中のｍｉＲＮＡ３を検出する工程である。ここで、「検出する」とは、定量的に検出すること、定量すること、分析すること等も含まれる。
上記の様に、検出プローブ５は標識物質５ａで標識されているため、ｍｉＲＮＡ３―検出プローブ５−捕捉プローブ４複合体中の標識物質５ａを定量的に検出する。その際、段階希釈した既知量のｍｉＲＮＡを用いて、標準曲線を作製し、該標準曲線を利用することが好ましい。かかる検出結果を用いて核酸試料中のｍｉＲＮＡ３を定量することができる。
工程（ｄ）における、標識物質の検出方法は、特に限定されるものではなく、例えば、核酸マイクロアレイ自動検出装置を用いて、複合体の蛍光強度を測定する等、核酸を検出する場合に通常行われる方法を用いて行うことができる。
上記の様に、検出プローブ５は標識物質５ａで標識されているため、ｍｉＲＮＡ３―検出プローブ５−捕捉プローブ４複合体中の標識物質５ａを定量的に検出する。その際、段階希釈した既知量のｍｉＲＮＡを用いて、標準曲線を作製し、該標準曲線を利用することが好ましい。かかる検出結果を用いて核酸試料中のｍｉＲＮＡ３を定量することができる。
工程（ｄ）における、標識物質の検出方法は、特に限定されるものではなく、例えば、核酸マイクロアレイ自動検出装置を用いて、複合体の蛍光強度を測定する等、核酸を検出する場合に通常行われる方法を用いて行うことができる。
本実施形態のｍｉＲＮＡの検出方法によれば、従来必要であった橋渡し用プローブが不必要なため、操作が簡便化され、更に、ｍｉＲＮＡ自体を標識物質で標識する必要が無いため、高感度に標的ｍｉＲＮＡを定量することができる。
また、本実施形態のｍｉＲＮＡの検出方法によれば、ステムループ構造を形成する検出プローブを用いるため、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを認識することなく、高精度に標的ｍｉＲＮＡを定量することができる。
また、本実施形態のｍｉＲＮＡの検出方法によれば、ステムループ構造を形成する検出プローブを用いるため、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを認識することなく、高精度に標的ｍｉＲＮＡを定量することができる。
［第二実施形態］
本実施形態の核酸の検出方法は、
（ａ）第１の部分及び第２の部分からなる核酸を含有する核酸試料と、
ステムループ構造を形成し、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、５’突出末端又は３’突出末端を有し、標識物質により標識されている検出プローブと、
前記第１の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、該配列中に第１の光反応性塩基誘導体を含む捕捉プローブと、を接触させる工程と、
（ｂ）前記第２の部分を前記検出プローブにハイブリダイズさせ、前記第１の部分を前記捕捉プローブにハイブリダイズさせ、核酸−検出プローブ‐捕捉プローブ複合体を形成させる工程と、
（ｃ）前記第１の部分を前記捕捉プローブにハイブリダイズさせ、第一の波長帯域の光によって、前記第１の光反応性塩基誘導体と前記核酸とを架橋させる工程と、
（ｄ）前記核酸−検出プローブ‐捕捉プローブ複合体中の標識物質を検出する工程と、を有し、
前記検出プローブが、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列中に第２の光反応性塩基誘導体を含み、前記工程（ｃ）において、さらに、前記第２の部分を前記検出プローブにハイブリダイズさせ、第２の波長帯域光によって前記第２の光反応性塩基誘導体と前記核酸とを架橋させるものである。
すなわち、本実施形態の核酸の検出方法では、先に記載の第一実施形態で固相に固定されていた捕捉プローブが、固相に固定されていなくともよい。そのため、捕捉プローブを基板に固定させる工程を実施せずともよく、捕捉プローブが固定された基板を用いずとも実施可能であり、検出対象の核酸種類が少ない場合など、より手軽に核酸の検出を行うことができるという利点がある。
本実施形態の核酸の検出方法は、
（ａ）第１の部分及び第２の部分からなる核酸を含有する核酸試料と、
ステムループ構造を形成し、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、５’突出末端又は３’突出末端を有し、標識物質により標識されている検出プローブと、
前記第１の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、該配列中に第１の光反応性塩基誘導体を含む捕捉プローブと、を接触させる工程と、
（ｂ）前記第２の部分を前記検出プローブにハイブリダイズさせ、前記第１の部分を前記捕捉プローブにハイブリダイズさせ、核酸−検出プローブ‐捕捉プローブ複合体を形成させる工程と、
（ｃ）前記第１の部分を前記捕捉プローブにハイブリダイズさせ、第一の波長帯域の光によって、前記第１の光反応性塩基誘導体と前記核酸とを架橋させる工程と、
（ｄ）前記核酸−検出プローブ‐捕捉プローブ複合体中の標識物質を検出する工程と、を有し、
前記検出プローブが、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列中に第２の光反応性塩基誘導体を含み、前記工程（ｃ）において、さらに、前記第２の部分を前記検出プローブにハイブリダイズさせ、第２の波長帯域光によって前記第２の光反応性塩基誘導体と前記核酸とを架橋させるものである。
すなわち、本実施形態の核酸の検出方法では、先に記載の第一実施形態で固相に固定されていた捕捉プローブが、固相に固定されていなくともよい。そのため、捕捉プローブを基板に固定させる工程を実施せずともよく、捕捉プローブが固定された基板を用いずとも実施可能であり、検出対象の核酸種類が少ない場合など、より手軽に核酸の検出を行うことができるという利点がある。
本実施形態における核酸の検出は、例えば、反応溶液内の核酸‐補足プローブ‐検出プローブの三者複合体の形成を検出することで行われる。そのため、捕捉プローブを標識する標識物質と検出プローブを標識する標識物質との組合せは、ＦＲＥＴが起こり得る組合せであることが好ましい。
［第三実施形態］
本実施形態の核酸の検出方法は、先に記載の第二実施形態の核酸の検出方法において、さらに、第３の部分を有する複合体捕捉プローブが固定化されてなる基板を用いる核酸の検出方法であって、検出プローブがさらに、前記第３の部分とハイブリダイズし得る配列を有し、
（ｃ−２）前記第３の部分を検出プローブにハイブリダイズさせる工程
を有する核酸の検出方法である。
本実施形態の核酸の検出方法は、先に記載の第二実施形態の核酸の検出方法において、さらに、第３の部分を有する複合体捕捉プローブが固定化されてなる基板を用いる核酸の検出方法であって、検出プローブがさらに、前記第３の部分とハイブリダイズし得る配列を有し、
（ｃ−２）前記第３の部分を検出プローブにハイブリダイズさせる工程
を有する核酸の検出方法である。
本実施形態の核酸の検出方法を、図２を参照して説明する。
まず、ｍｉＲＮＡ３と検出プローブ５と捕捉プローブ４’とを液相中で接触させる（図２（ａ））。次いで、第２の部分２を前記検出プローブ５にハイブリダイズさせ、第１の部分１を捕捉プローブ４’にハイブリダイズさせ、核酸−検出プローブ‐捕捉プローブ複合体を形成させ、第１の波長帯域光及び/又は前記第２の波長帯域光を当該複合体へと照射し、第１の光反応性塩基誘導体７ａとｍｉＲＮＡ３、及び第２の光反応性塩基誘導体７ｂとｍｉＲＮＡ３をそれぞれ架橋させる。（図２（ｂ））。そして基板６’に固定化された複合体捕捉プローブ８が有する第三の部分８ｂに捕捉プローブ４’をハイブリダイズさせ、核酸−検出プローブ‐捕捉プローブ複合体中の標識物質を検出し、検出結果からｍｉＲＮＡ３を検出する（図２（ｃ）、図２（ｄ））。
まず、ｍｉＲＮＡ３と検出プローブ５と捕捉プローブ４’とを液相中で接触させる（図２（ａ））。次いで、第２の部分２を前記検出プローブ５にハイブリダイズさせ、第１の部分１を捕捉プローブ４’にハイブリダイズさせ、核酸−検出プローブ‐捕捉プローブ複合体を形成させ、第１の波長帯域光及び/又は前記第２の波長帯域光を当該複合体へと照射し、第１の光反応性塩基誘導体７ａとｍｉＲＮＡ３、及び第２の光反応性塩基誘導体７ｂとｍｉＲＮＡ３をそれぞれ架橋させる。（図２（ｂ））。そして基板６’に固定化された複合体捕捉プローブ８が有する第三の部分８ｂに捕捉プローブ４’をハイブリダイズさせ、核酸−検出プローブ‐捕捉プローブ複合体中の標識物質を検出し、検出結果からｍｉＲＮＡ３を検出する（図２（ｃ）、図２（ｄ））。
基板に固定されていないプローブと、基板に固定されているプローブとでは、基板に固定されていないプローブの方が核酸とのハイブリダイズの効率がより高い傾向にある。したがって、本実施形態で示されるように、基板上に固定されていない捕捉プローブを用いて核酸−検出プローブ‐捕捉プローブ複合体を形成させた後に、当該複合体を基板上に捕捉することで、核酸の検出効率を高めることが可能である。複合体捕捉プローブ８が有する第三の部分８ｂは、親和性を高めるためにｍｉＲＮＡ３の第一の部分１より長く、例えば１５〜４０塩基が好ましく、各捕捉プローブを特異的に結合させるという観点から、１８〜２５塩基がより好ましい。
［第四実施形態］
本実施形態の核酸の検出方法は、先に記載の第一実施形態における工程（ｃ）において、該工程が前記基板の一部領域に選択的に前記第一の波長帯域の光を照射し、前記光反応性塩基誘導体と前記核酸とを架橋させる工程を含む。
本実施形態の核酸の検出方法の一例を図３〜図４を参照して説明する。図３は、本実施形態の核酸の検出方法に用いられる流体デバイスの一例を表す模式図である。流体デバイス２０１は、核酸精製部２０３と、前記捕捉プローブが固定化されてなる基板２０４と、核酸精製部２０３と基板２０４とをつなぐ流路２０６と、流路２０６上のバルブ２０４ｆとを備える。図４に示されるように、核酸精製部２０３、２０３’、２０３’’にはそれぞれ異なる検体１〜３が配置されている。また、基板２０４は３つの領域Ａ〜領域Ｃに分けられている。当該検体には、検出対象のｍｉＲＮＡが含有され、基板２０４は、検出プローブを含有する溶液と接触しているものとする。まず、バルブ２０４ｆを開き、検体１を基板２０４へと送液する（図４（ａ））。そして、領域Ａのみに光を照射し、光反応性塩基誘導体とｍｉＲＮＡとを架橋させ、核酸−検出プローブ‐捕捉プローブ複合体を形成させる（図４（ｂ））。次に、バルブ２０４ｆ’を開き、検体２を基板２０４へと送液する。そして、領域Ｂのみに光を照射し、光反応性塩基誘導体とｍｉＲＮＡとを架橋させ、核酸−検出プローブ‐捕捉プローブ複合体を形成させる（図４（ｃ））。
本実施形態の核酸の検出方法は、先に記載の第一実施形態における工程（ｃ）において、該工程が前記基板の一部領域に選択的に前記第一の波長帯域の光を照射し、前記光反応性塩基誘導体と前記核酸とを架橋させる工程を含む。
本実施形態の核酸の検出方法の一例を図３〜図４を参照して説明する。図３は、本実施形態の核酸の検出方法に用いられる流体デバイスの一例を表す模式図である。流体デバイス２０１は、核酸精製部２０３と、前記捕捉プローブが固定化されてなる基板２０４と、核酸精製部２０３と基板２０４とをつなぐ流路２０６と、流路２０６上のバルブ２０４ｆとを備える。図４に示されるように、核酸精製部２０３、２０３’、２０３’’にはそれぞれ異なる検体１〜３が配置されている。また、基板２０４は３つの領域Ａ〜領域Ｃに分けられている。当該検体には、検出対象のｍｉＲＮＡが含有され、基板２０４は、検出プローブを含有する溶液と接触しているものとする。まず、バルブ２０４ｆを開き、検体１を基板２０４へと送液する（図４（ａ））。そして、領域Ａのみに光を照射し、光反応性塩基誘導体とｍｉＲＮＡとを架橋させ、核酸−検出プローブ‐捕捉プローブ複合体を形成させる（図４（ｂ））。次に、バルブ２０４ｆ’を開き、検体２を基板２０４へと送液する。そして、領域Ｂのみに光を照射し、光反応性塩基誘導体とｍｉＲＮＡとを架橋させ、核酸−検出プローブ‐捕捉プローブ複合体を形成させる（図４（ｃ））。
このように、基板の一部領域のみに光を照射することで、光照射した基板の領域のみで、光反応性塩基誘導体と核酸とを架橋させることができる。したがって、光照射をされていない基板の領域にある捕捉プローブを、核酸の検出に利用可能な状態のまま維持することができる。検出対象の核酸を含んだ複数種類のサンプル検査を、基板の交換を伴わずに、基板の一部領域を順々に利用して行うことが可能であり、１検査あたりの基板利用コストを低減させることができる。
他の例としては、１検査において基板への光照射のタイミングを基板の一部領域ごとに変えることが挙げられる。本実施形態の核酸の検出方法の一例を、図５を参照して説明する。図５には、上記流体デバイスの２０１を示す。核酸精製部２０３、２０３’、２０３’’には同一の検体１が配置されている。
まず、バルブ２０４ｆを開き、検体１を基板２０４へと送液する（図５（ａ））。そして、領域Ａのみに光を照射し、光反応性塩基誘導体とｍｉＲＮＡとを架橋させ、核酸−検出プローブ‐捕捉プローブ複合体を形成させる（図５（ｂ））。そして、領域Ｂのみに光を照射し、光反応性塩基誘導体とｍｉＲＮＡとを架橋させ、核酸−検出プローブ‐捕捉プローブ複合体を形成させる（図５（ｃ））。このとき、バルブ２０４ｆ’を開き、再度検体１を基板２０４へと送液してもよい。
まず、バルブ２０４ｆを開き、検体１を基板２０４へと送液する（図５（ａ））。そして、領域Ａのみに光を照射し、光反応性塩基誘導体とｍｉＲＮＡとを架橋させ、核酸−検出プローブ‐捕捉プローブ複合体を形成させる（図５（ｂ））。そして、領域Ｂのみに光を照射し、光反応性塩基誘導体とｍｉＲＮＡとを架橋させ、核酸−検出プローブ‐捕捉プローブ複合体を形成させる（図５（ｃ））。このとき、バルブ２０４ｆ’を開き、再度検体１を基板２０４へと送液してもよい。
サンプル中含まれる複数の標的核酸量が核酸ごとに異なっている場合、含有量の多い標的核酸では捕捉プローブ又は検出プローブとの複合体の形成が早くに完了し、逆に含有量の少ない標的核酸では捕捉部ローブ又は検出プローブとの複合体の形成完了が遅くなる傾向にある。そのため、含有量に差がある標的核酸の定量的な検出を同時に行うことは困難となる。対して、本実施形態の一例では、基板への光照射に時間差を設けることにより、基板の領域で標的核酸と捕捉プローブ又は検出プローブとの含有量や親和性に応じた反応時間でハイブリダイゼーションを行うことが可能であり、１基板あたりで検出可能な標的核酸種の範囲を拡張することができる。
基板の一部領域に選択的に光を照射する方法は、公知のパターン露光の方法を用いればよく、基板と露光装置の間へのマスクの配置、縮小投影型露光装置の使用等を行うことが例示できる。
基板の一部領域に選択的に光を照射する方法は、公知のパターン露光の方法を用いればよく、基板と露光装置の間へのマスクの配置、縮小投影型露光装置の使用等を行うことが例示できる。
［第五実施形態］
本実施形態の核酸の検出方法は、先に記載の第一実施形態の核酸検出方法において、さらに、第３の波長帯域光によって前記捕捉プローブと前記核酸との架橋を開裂させる工程（ｅ）と、
前記捕捉プローブとの架橋を開裂させた前記核酸を回収する工程（ｆ）と、
を有するものである。
本実施形態の核酸の検出方法は、先に記載の第一実施形態の核酸検出方法において、さらに、第３の波長帯域光によって前記捕捉プローブと前記核酸との架橋を開裂させる工程（ｅ）と、
前記捕捉プローブとの架橋を開裂させた前記核酸を回収する工程（ｆ）と、
を有するものである。
本実施形態において、光反応性塩基誘導体は、可逆的光連結性塩基を用いることが好ましい。可逆的光連結性塩基は、核酸との光連結及び光解離とを可逆的に生じさせることが可能な光連結性塩基であり、可逆的光連結性塩基は、例えば、光連結に用いた波長帯域光とは異なる波長帯域光が照射されることによって、ｍｉＲＮＡ３と検出プローブ５及び／又は捕捉プローブ４とを可逆的に光連結及び光開裂する塩基を含む。第３の波長帯域光は、前記捕捉プローブと前記核酸との架橋を開裂させることが可能な波長帯域光である。可逆的光連結性塩基誘導体は、一例として、ソラーレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）を付加した塩基、ＣＮＶＫ、ＣＶＵ、ＹＣＶＵ、α‐ＣＵ、β‐ＣＵ、ＶＵ、ＨＵ、ＨＶＵ、ＢｕＶＵ、ＶＺＡ等が挙げられる。
なお、可逆的光連結性塩基の一例として、ＣＮＶＫを用いる場合、短時間で効率よく架橋できる。
光反応性塩基誘導体７としてＣＮＶＫを用いる場合、ｍｉＲＮＡ３と捕捉プローブ４との複合体に、光連結する第一の波長帯域の光及び又は第二の波長帯域の光と、光開裂する第三の波長帯域の光とを照射することで可逆的な架橋反応が可能である。ＣＮＶＫを用いる場合、第一及び／又は第二の波長帯域は３４０ｎｍ以上の光である。一例として、３４０〜３８０ｎｍの波長帯域の光を照射することにより、ＣＮＶＫの５’側 に隣接するプリン塩基と塩基対を形成しているｍＲＮＡ３中のピリミジン塩基を構成する原子とＣＮＶＫを構成する原子とが架橋構造を形成する。第三の波長帯域は３５０ｎｍ未満の光である。一例として、２８０〜３４５ｎｍの波長帯域の光を照射することにより、架橋は解除される。第一及び／又は第二の波長帯域と第三の波長帯域は、波長帯域の一部が互いに重複していてもよいとする。
ＣＮＶＫを用いることで、所定の波長帯域の光を短時間（例えば３０秒）照射することで高い架橋効率が得られ、照射対象の核酸を損傷するおそれがない。また、ＣＮＶＫは、効率のよい可逆的な架橋反応が可能であるという点において優れている。
なお、可逆的光連結性塩基の一例として、ＣＮＶＫを用いる場合、短時間で効率よく架橋できる。
光反応性塩基誘導体７としてＣＮＶＫを用いる場合、ｍｉＲＮＡ３と捕捉プローブ４との複合体に、光連結する第一の波長帯域の光及び又は第二の波長帯域の光と、光開裂する第三の波長帯域の光とを照射することで可逆的な架橋反応が可能である。ＣＮＶＫを用いる場合、第一及び／又は第二の波長帯域は３４０ｎｍ以上の光である。一例として、３４０〜３８０ｎｍの波長帯域の光を照射することにより、ＣＮＶＫの５’側 に隣接するプリン塩基と塩基対を形成しているｍＲＮＡ３中のピリミジン塩基を構成する原子とＣＮＶＫを構成する原子とが架橋構造を形成する。第三の波長帯域は３５０ｎｍ未満の光である。一例として、２８０〜３４５ｎｍの波長帯域の光を照射することにより、架橋は解除される。第一及び／又は第二の波長帯域と第三の波長帯域は、波長帯域の一部が互いに重複していてもよいとする。
ＣＮＶＫを用いることで、所定の波長帯域の光を短時間（例えば３０秒）照射することで高い架橋効率が得られ、照射対象の核酸を損傷するおそれがない。また、ＣＮＶＫは、効率のよい可逆的な架橋反応が可能であるという点において優れている。
工程（ｅ）において、捕捉プローブと核酸との架橋を開裂させることで、基板上に捕捉プローブのみを残留させることができ、捕捉プローブが固定された基板の再利用が可能となる。また、工程（ｆ）において捕捉プローブとの架橋を開裂させることで、基板上から解離した核酸を回収することができる。回収された核酸は再度解析されてもよく、再解析を行うことで、より信頼性の高い核酸の検出を行うことができる。
核酸の回収にあたっては、工程（ｅ）において、第３の波長帯域光によって、さらに前記検出プローブと前記核酸との架橋も開裂されることが好ましい。また、第３の波長帯域光を前記基板の一部領域に選択的に照射し、基板上から目的の核酸を選択的に回収することができる。
≪検出プローブ、捕捉プローブ、マイクロアレイ、核酸検出キット、核酸‐検出プローブ‐捕捉プローブ複合体、および核酸固定化担体≫
本実施形態の検出プローブは、核酸試料中の第１の部分及び第２の部分からなる核酸を検出するために用いられる検出プローブであって、相補鎖を形成する２つのステム部と、前記２つのステム部間の領域であり、標識物質により標識されているループ部と、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列からなり、該第２の部分とハイブリダイズし得る配列中に光反応性塩基誘導体を含み、５’突出末端又は３’突出末端と、を備えるものであり、上述した検出プローブ５に代表されるものである。
他の実施形態として、標的核酸を個別に検出するとの観点から、検出プローブは、前記ループ部の標識は、前記第２の部分の塩基配列と対応づけられていてもよい。検出プローブが含む前記光反応性塩基誘導体は異なる波長帯域で光連結と光開裂することが好ましい。また、前記核酸は、ｍｉＲＮＡであることが好ましい。
本実施形態の検出プローブは、核酸試料中の第１の部分及び第２の部分からなる核酸を検出するために用いられる検出プローブであって、相補鎖を形成する２つのステム部と、前記２つのステム部間の領域であり、標識物質により標識されているループ部と、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列からなり、該第２の部分とハイブリダイズし得る配列中に光反応性塩基誘導体を含み、５’突出末端又は３’突出末端と、を備えるものであり、上述した検出プローブ５に代表されるものである。
他の実施形態として、標的核酸を個別に検出するとの観点から、検出プローブは、前記ループ部の標識は、前記第２の部分の塩基配列と対応づけられていてもよい。検出プローブが含む前記光反応性塩基誘導体は異なる波長帯域で光連結と光開裂することが好ましい。また、前記核酸は、ｍｉＲＮＡであることが好ましい。
本実施形態の捕捉プローブは、核酸試料中の第１の部分及び第２の部分からなる核酸を検出するために用いられる捕捉プローブであって、前記第１の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、該配列中に光反応性塩基誘導体を含むものであり、上述した捕捉プローブ４に代表されるものである。捕捉プローブが含む前記光反応性塩基誘導体は異なる波長帯域で光連結と光開裂することが好ましい。また、前記核酸は、ｍｉＲＮＡであることが好ましい。
本実施形態のマイクロアレイは、核酸と検出プローブと複合体を形成可能で、配列中に光反応性塩基誘導体を含む捕捉プローブが基板に固定されており、
前記核酸は、前記捕捉プローブとハイブリダイズし得る第１の部分と、前記検出プローブとハイブリダイズし得る第２の部分とを含み、
前記検出プローブは、ステムループ構造を形成し、５’突出末端又は３’突出末端を有し、標識物質により標識されている。検出プローブは、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列中に光反応性塩基誘導体を含んでもよい。
検出プローブは、上述した検出プローブ５に代表されるものであり、捕捉プローブは上述した捕捉プローブ４に代表されるものである。捕捉プローブが基板に固定されたものとしては、上記≪核酸の検出方法≫において説明したものが例示できる。
前記核酸は、前記捕捉プローブとハイブリダイズし得る第１の部分と、前記検出プローブとハイブリダイズし得る第２の部分とを含み、
前記検出プローブは、ステムループ構造を形成し、５’突出末端又は３’突出末端を有し、標識物質により標識されている。検出プローブは、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列中に光反応性塩基誘導体を含んでもよい。
検出プローブは、上述した検出プローブ５に代表されるものであり、捕捉プローブは上述した捕捉プローブ４に代表されるものである。捕捉プローブが基板に固定されたものとしては、上記≪核酸の検出方法≫において説明したものが例示できる。
本実施形態の核酸検出キットは、捕捉プローブおよび検出プローブを備えたものである。検出プローブは、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列中に光反応性塩基誘導体を含んでもよい。捕捉プローブおよび検出プローブとしては、上述した捕捉プローブ４及び検出プローブ５にそれぞれ代表される。
本実施形態の核酸‐検出プローブ‐捕捉プローブ複合体は、第１の部分及び第２の部分からなる核酸を介して、
ステムループ構造を形成し、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、５’突出末端又は３’突出末端を有し、標識物質により標識されている検出プローブと、
前記第１の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、該配列中に光反応性塩基誘導体を含む捕捉プローブとが、連結され、前記検出プローブが、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列中に光反応性塩基誘導体を含むものである。当該複合体としては、先に記載の≪核酸の検出方法≫の工程（ｂ）において形成された複合体を例示できるが、係る工程に限定されない。
ステムループ構造を形成し、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、５’突出末端又は３’突出末端を有し、標識物質により標識されている検出プローブと、
前記第１の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、該配列中に光反応性塩基誘導体を含む捕捉プローブとが、連結され、前記検出プローブが、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列中に光反応性塩基誘導体を含むものである。当該複合体としては、先に記載の≪核酸の検出方法≫の工程（ｂ）において形成された複合体を例示できるが、係る工程に限定されない。
また、本実施形態の核酸固定化担体は、先に記載の核酸‐検出プローブ‐捕捉プローブ複合体が基板に固定化されてなるものであり、先に記載の≪核酸の検出方法≫の第一実施形態に記載の工程（ｂ）又は工程（ｃ）において形成された核酸‐検出プローブ‐捕捉プローブ複合体が基板に固定化されたものを例示できる。
≪流体デバイス≫
［第一実施形態］
本実施形態の流体デバイス（たとえばマイクロ流体デバイス（マイクロＴＡＳ）、ミリ流体デバイス（ミリＴＡＳ）など）は、捕捉プローブが固定化されてなる基板と、検出プローブ導入用インレットと、を有する核酸検出部を備えた流体デバイスであって、
前記捕捉プローブは、標的核酸を第一の部分と第二の部分に分割した場合に、前記第一の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、該配列中に光反応性塩基誘導体を含み、
前記検出プローブは、ステムループ構造を形成し、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、５’突出末端又は３’突出末端を有し、標識物質により標識されているものである。また、本実施形態の流体デバイスは、前記検出プローブが、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列中に光反応性塩基誘導体を含むことが好ましい。
捕捉プローブが固定化されてなる基板としては、先に記載のマイクロアレイを例示することができる。
図６に本実施形態の流体デバイスの構成を模式的に示す。流体デバイス１１は、捕捉プローブが固定化されてなる基板１０４ｃと、検出プローブ導入用インレット１０４ａと、を有する核酸検出部１０４を備えている。核酸検出部１０４は、核酸試料を導入するためのサンプル導入用インレット１０２ｂをさらに備えていてもよい。
［第一実施形態］
本実施形態の流体デバイス（たとえばマイクロ流体デバイス（マイクロＴＡＳ）、ミリ流体デバイス（ミリＴＡＳ）など）は、捕捉プローブが固定化されてなる基板と、検出プローブ導入用インレットと、を有する核酸検出部を備えた流体デバイスであって、
前記捕捉プローブは、標的核酸を第一の部分と第二の部分に分割した場合に、前記第一の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、該配列中に光反応性塩基誘導体を含み、
前記検出プローブは、ステムループ構造を形成し、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、５’突出末端又は３’突出末端を有し、標識物質により標識されているものである。また、本実施形態の流体デバイスは、前記検出プローブが、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列中に光反応性塩基誘導体を含むことが好ましい。
捕捉プローブが固定化されてなる基板としては、先に記載のマイクロアレイを例示することができる。
図６に本実施形態の流体デバイスの構成を模式的に示す。流体デバイス１１は、捕捉プローブが固定化されてなる基板１０４ｃと、検出プローブ導入用インレット１０４ａと、を有する核酸検出部１０４を備えている。核酸検出部１０４は、核酸試料を導入するためのサンプル導入用インレット１０２ｂをさらに備えていてもよい。
本実施形態によれば、捕捉プローブに光反応性塩基誘導体が含まれるので、より高精度に核酸を定量できる。
また、本実施形態によれば、酵素を用いる代わりに光反応性塩基誘導体を用いて核酸の連結を行うので、酵素反応では制御困難である核酸の連結反応時間の厳密な制御、および微細な範囲ごとの連結反応の制御を行うことが可能である。このように本実施形態によれば、核酸の連結反応に温度による制御が必要とされず、また連結反応の厳密な制御が容易であるので、連結反応が行われる部位の流体デバイス中における配置の自由度を高めることができる。また連結反応の厳密な制御に必要な流体デバイスの構成も簡略化され得る。
また、本実施形態によれば、酵素を用いる代わりに光反応性塩基誘導体を用いて核酸の連結を行うので、酵素反応では制御困難である核酸の連結反応時間の厳密な制御、および微細な範囲ごとの連結反応の制御を行うことが可能である。このように本実施形態によれば、核酸の連結反応に温度による制御が必要とされず、また連結反応の厳密な制御が容易であるので、連結反応が行われる部位の流体デバイス中における配置の自由度を高めることができる。また連結反応の厳密な制御に必要な流体デバイスの構成も簡略化され得る。
［第二実施形態］
本実施形態の流体デバイスは、一例としてサンプル中のエキソソームが内包する核酸を検出するデバイスであって、図７に示すように、流体デバイス１０１は、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有するエキソソーム精製部１０２と、核酸精製部１０３と、核酸検出部１０４とを備える。
本実施形態の流体デバイスは、一例としてサンプル中のエキソソームが内包する核酸を検出するデバイスであって、図７に示すように、流体デバイス１０１は、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有するエキソソーム精製部１０２と、核酸精製部１０３と、核酸検出部１０４とを備える。
がん細胞等の異常細胞は、細胞膜の内部に特有のタンパク質や核酸、ｍｉＲＮＡなどを発現している。そして、体液中に分泌されるエキソソームも、分泌元の細胞由来のｍｉＲＮＡなどを発現している。そのため、体液中のエキソソームの膜内部に存在する核酸を分析することで、バイオプシー検査をしなくとも、生体内の異常を調べることができる技術の確立が期待されている。なお、バイオプシー検査とは、病変部位の組織を採取し顕微鏡で病変部位を観察することによって、病気の診断等を調べる臨床検査をいう。
したがって、本実施形態の流体デバイスは、一例として、図７に示されるように、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有するエキソソーム精製部１０２と、エキソソーム精製部１０２と核酸精製部１０３を繋ぐ第一の流路１０５と、核酸精製部１０３と核酸検出部１０４を繋ぐ第二の流路１０６と、を備えたものである。
したがって、本実施形態の流体デバイスは、一例として、図７に示されるように、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有するエキソソーム精製部１０２と、エキソソーム精製部１０２と核酸精製部１０３を繋ぐ第一の流路１０５と、核酸精製部１０３と核酸検出部１０４を繋ぐ第二の流路１０６と、を備えたものである。
なお、分析に用いるサンプルによる二次感染を防止する観点から、本実施形態の流体デバイス１０１は、一例として図７に示すように廃液槽１０７，１０８，１０９を備える。
尚、図７においては三つの廃液槽を示しているが一つ又は二つの廃液槽にまとめたものであってもよい。
尚、図７においては三つの廃液槽を示しているが一つ又は二つの廃液槽にまとめたものであってもよい。
エキソソーム精製部１０２は、インレットと、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有するエキソソーム固定部１０２ｄを備えることが好ましい。図７に示すように、エキソソーム精製部１０２はサンプル導入用インレット１０２ｂと破砕液導入用インレット１０２ｃ（図示略）を備えることが好ましく、更に洗浄液導入用インレット１０２ａを備えることがより好ましい。
図７に示すように、エキソソームの分析において、まず上述したエキソソーム精製部において、サンプル導入用インレット１０２ｂにサンプルを注入し、流路１０２ｉのバルブ１０２ｆを開き、吸引によりサンプルをエキソソーム固定部１０２ｄに導入する。
図７に示すように、エキソソームの分析において、まず上述したエキソソーム精製部において、サンプル導入用インレット１０２ｂにサンプルを注入し、流路１０２ｉのバルブ１０２ｆを開き、吸引によりサンプルをエキソソーム固定部１０２ｄに導入する。
サンプルとしては、検出対象の細胞をとりまく環境から得られるものであって、該細胞が分泌したエキソソームを含有するものであれば特に限定されず、血液、尿、母乳、気管支肺胞洗浄液、羊水、悪性滲出液、唾液等が挙げられる。中でも、エキソソームを検出しやすい血液又は尿が好ましい。更に、血液においては、エキソソームの検出のしやすさから、血漿が好ましい。また、係るサンプルには、培養細胞が分泌したエキソソームを含有する細胞培養液も含まれる。
エキソソーム固定部２ｄに導入されたサンプル中のエキソソームは、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物によって捕捉される。
次いで、エキソソーム固定部１０２ｄに固定されたエキソソームを破砕する。図７に示すように、図示略の流路１０２ｊ上のバルブ１０２ｇを開き、破砕液導入用インレット１０２ｃに破砕液を注入し、吸引により破砕液をエキソソーム固定部１０２ｄへ導入する。破砕液としては、例えば細胞溶解に用いられる従来公知のものが挙げられる。
破砕液がエキソソーム固定部１０２ｄを通ることにより、エキソソーム固定部１０２ｄ上に捕捉されたエキソソームが破砕され、エキソソームに内包される核酸が放出される。エキソソームから放出された核酸は、バルブ１０５ａを介して第一の流路１０５を通り核酸精製部１０３へ送られる。
エキソソーム固定部２ｄに導入されたサンプル中のエキソソームは、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物によって捕捉される。
次いで、エキソソーム固定部１０２ｄに固定されたエキソソームを破砕する。図７に示すように、図示略の流路１０２ｊ上のバルブ１０２ｇを開き、破砕液導入用インレット１０２ｃに破砕液を注入し、吸引により破砕液をエキソソーム固定部１０２ｄへ導入する。破砕液としては、例えば細胞溶解に用いられる従来公知のものが挙げられる。
破砕液がエキソソーム固定部１０２ｄを通ることにより、エキソソーム固定部１０２ｄ上に捕捉されたエキソソームが破砕され、エキソソームに内包される核酸が放出される。エキソソームから放出された核酸は、バルブ１０５ａを介して第一の流路１０５を通り核酸精製部１０３へ送られる。
図７に示すように、核酸精製部１０３は、核酸回収液導入用インレット１０３ｂと、核酸固定部１０３ｃとを備えることが好ましく、更に核酸洗浄液導入用インレット１０３ａ（図示略）を備えることがより好ましい。
核酸固定部１０３ｃは、核酸を固定可能なものであれば特に限定されないが、一例として核酸を固定するシリカメンブレンが挙げられる。
核酸固定部１０３ｃは、核酸を固定可能なものであれば特に限定されないが、一例として核酸を固定するシリカメンブレンが挙げられる。
エキソソームは、分泌元の細胞に由来するタンパク質や核酸を保持している。核酸としては、ｍｉＲＮＡが挙げられる。本実施形態において、核酸固定部１０３ｃが固定する核酸はｍｉＲＮＡであることが好ましい。
核酸固定部１０３ｃをエキソソーム破砕液が通過することにより、核酸固定部１０３ｃ上に核酸が捕捉される。
次いで、核酸固定部１０３ｃに固定された核酸を溶出させる。図７に示すように、流路１０３ｇのバルブ１０３ｆを開け、核酸回収液導入用インレット１０３ｂに核酸回収液を注入し、核酸回収液を核酸固定部１０３ｃに導入する。次いで、核酸固定部１０３ｃから核酸を回収する。核酸は第二の流路１０６を通り、核酸検出部１０４へ送られる。
核酸固定部１０３ｃをエキソソーム破砕液が通過することにより、核酸固定部１０３ｃ上に核酸が捕捉される。
次いで、核酸固定部１０３ｃに固定された核酸を溶出させる。図７に示すように、流路１０３ｇのバルブ１０３ｆを開け、核酸回収液導入用インレット１０３ｂに核酸回収液を注入し、核酸回収液を核酸固定部１０３ｃに導入する。次いで、核酸固定部１０３ｃから核酸を回収する。核酸は第二の流路１０６を通り、核酸検出部１０４へ送られる。
したがって、図６を参照して説明したように、サンプル導入用インレット１０２ｂから導入された核酸試料は、そのまま核酸検出部１０４へと導入されてもよく、別の例として、図７を参照して説明したように、サンプル導入用インレット１０２ｂから導入された核酸試料は、エキソソーム精製部においてエキソソームから抽出され、核酸精製部において精製されてから、核酸検出部１０４へと導入されてもよい。
前記核酸検出部１０４は図８に示されるようにバルブ４ｇ、４ｈを備えた流路上に基板４ｃを備えたものでもよい。このように核酸検出部４の流路内にバルブを設けることで、核酸検出部４自体を流路内の溶液を定量可能な溶液混合器として用いることができる。
核酸の溶液混合器１０４への送液は、図８中のバルブ１０４ｇ、１０４ｈを閉じて行うことが好ましい。こうすることで、溶液混合器の流路内で、核酸を含む溶液が定量される。
核酸の溶液混合器１０４への送液は、図８中のバルブ１０４ｇ、１０４ｈを閉じて行うことが好ましい。こうすることで、溶液混合器の流路内で、核酸を含む溶液が定量される。
核酸が溶液混合器１０４へ送られた後、バルブ１０４ｄを開け、検出プローブ導入用インレット１０４ａに検出プローブ溶解液を注入し、検出プローブ溶解液を溶液混合器１０４へと送液する。検出プローブ溶解液の溶液混合器１０４への送液は、図８中のバルブ１０４ｇ、１０４ｈを閉じて行う。こうすることで、溶液混合器の流路内で、検出プローブ溶解液が定量される。
次いで、バルブ１０４ｄ、１０４ｅ、１０４ｆ、１１２ａを閉じ、バルブ１０４ｇ、１０４ｈを開けて、核酸と検出プローブ溶解液を溶液混合器内で循環させ、混合する。一例として図示略のポンプバルブの開閉を１０分間程度継続させる。液を循環させることにより短時間で効率よく複合体（ｍｉＲＮＡ３―検出プローブ５−捕捉プローブ４複合体）が基板上に形成される。そして、複合体が形成された基板４ｃへと光を照射し、光反応性塩基誘導体とｍｉＲＮＡとを架橋させる。
次いで、捕捉プローブが固定されてなる基板を洗浄し、該基板上の非特異的吸着物を取り除くことが好ましい。洗浄により、光反応性塩基誘導体と架橋された標的ｍｉＲＮＡおよび検出プローブをより高純度で基板４ｃ上に配置させることが可能となる。したがって、溶液混合器１０４は、更に図示略の洗浄液導入用インレット１０４ｂを備えていることが好ましい。図示略のバルブ１０４ｅを開け、洗浄液導入用インレット１０４ｂに洗浄液を注入し、基板に導入する。
次いで、基板上に形成された複合体の標識物質の強度を測定する。標識物質の強度は、核酸の存在量を反映するため、本実施形態によれば、サンプル中に含まれる核酸の量を定量することができる。
標識物質の強度の測定は、一例として、図示略の顕微鏡、光源、パソコンなどの制御部により行われる。
標識物質の強度の測定は、一例として、図示略の顕微鏡、光源、パソコンなどの制御部により行われる。
本実施形態によれば、検出プローブおよび捕捉プローブに光反応性塩基誘導体が含まれるので、より高精度に核酸を定量できる。
更には、本実施形態によれば、従来は１日以上要したエキソソームの分析をわずか一時間程度で迅速に行うことができる。
更には、本実施形態によれば、従来は１日以上要したエキソソームの分析をわずか一時間程度で迅速に行うことができる。
［第三実施形態］
本実施形態の流体デバイスを図９において模式的に示す。流体デバイス１０１’は先に記載の流体デバイス１０１の変形例である。流体デバイス１０１’は先の≪核酸の検出方法≫の第二実施形態の核酸の検出方法に好適に用いることができる。当該方法では、捕捉プローブは固相に固定されていなくともよいため、検出プローブ及び捕捉プローブ導入用インレット１０４ａ’に検出プローブ５および捕捉プローブ４を注入し、核酸固定部１０３ｃへと導入し、ｍｉＲＮＡ３―検出プローブ５−捕捉プローブ４複合体を形成させる。核酸固定部１０３ｃへと光を照射し、光反応性塩基誘導体とｍｉＲＮＡとを架橋させる。
本実施形態の流体デバイスを図９において模式的に示す。流体デバイス１０１’は先に記載の流体デバイス１０１の変形例である。流体デバイス１０１’は先の≪核酸の検出方法≫の第二実施形態の核酸の検出方法に好適に用いることができる。当該方法では、捕捉プローブは固相に固定されていなくともよいため、検出プローブ及び捕捉プローブ導入用インレット１０４ａ’に検出プローブ５および捕捉プローブ４を注入し、核酸固定部１０３ｃへと導入し、ｍｉＲＮＡ３―検出プローブ５−捕捉プローブ４複合体を形成させる。核酸固定部１０３ｃへと光を照射し、光反応性塩基誘導体とｍｉＲＮＡとを架橋させる。
［第四実施形態］
本実施形態の流体デバイスを図１０において模式的に示す。流体デバイス１０１’’は先に記載の流体デバイス１０１’の変形例である。流体デバイス１０１’は先の≪核酸の検出方法≫の第三実施形態の核酸の検出方法に好適に用いることができる。当該方法では、基板上に固定されていない捕捉プローブを用いて核酸−検出プローブ‐捕捉プローブ複合体を形成させた後に、当該複合体を基板上に捕捉する。したがって、流体デバイス１０１’’は、複合体捕捉プローブ８が固定化されてなる基板１０４ｃ’を備える。検出プローブ及び捕捉プローブ導入用インレット１０４ａ’に検出プローブ５および捕捉プローブ４’を注入し、核酸固定部１０３ｃへと導入し、ｍｉＲＮＡ３―検出プローブ５−捕捉プローブ４’複合体を形成させる。核酸固定部１０３ｃへと光を照射し、光反応性塩基誘導体とｍｉＲＮＡとを架橋させる。その後、ｍｉＲＮＡ３―検出プローブ５−捕捉プローブ４’複合体を基板１０４ｃ’へと送液し、複合体中の標識物質を検出し、検出結果からｍｉＲＮＡ３を検出することができる。
本実施形態の流体デバイスを図１０において模式的に示す。流体デバイス１０１’’は先に記載の流体デバイス１０１’の変形例である。流体デバイス１０１’は先の≪核酸の検出方法≫の第三実施形態の核酸の検出方法に好適に用いることができる。当該方法では、基板上に固定されていない捕捉プローブを用いて核酸−検出プローブ‐捕捉プローブ複合体を形成させた後に、当該複合体を基板上に捕捉する。したがって、流体デバイス１０１’’は、複合体捕捉プローブ８が固定化されてなる基板１０４ｃ’を備える。検出プローブ及び捕捉プローブ導入用インレット１０４ａ’に検出プローブ５および捕捉プローブ４’を注入し、核酸固定部１０３ｃへと導入し、ｍｉＲＮＡ３―検出プローブ５−捕捉プローブ４’複合体を形成させる。核酸固定部１０３ｃへと光を照射し、光反応性塩基誘導体とｍｉＲＮＡとを架橋させる。その後、ｍｉＲＮＡ３―検出プローブ５−捕捉プローブ４’複合体を基板１０４ｃ’へと送液し、複合体中の標識物質を検出し、検出結果からｍｉＲＮＡ３を検出することができる。
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［液相でのｍｉＲＮＡ検出］
検出対象の標的ｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ−１４１及びｍｉＲ−２００ａを選定した。両者の配列はほぼ同一であるが２塩基の差異がある。以下に示す材料をつくばオリゴサービス株式会社に委託し、自動核酸合成装置を使用して、ホスホロアミダイト法に従って合成した。
（実施例１）
標的ｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ−１４１の配列を有するＲＮＡを合成した。また、これに相補的な配列を有する捕捉プローブと検出プローブの２種の核酸プローブを設計・合成した。
用いた標的ｍｉＲＮＡ、捕捉プローブ、及び検出プローブの配列を以下に示す。
（１）標的ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ−１４１［配列：５’−ＵＡＡＣＡＣＵＧＵＣＵＧＧＵＡＡＡＧＡＵＧＧ−３’］ （配列番号１：２２ｍｅｒ）
検出対象の標的ｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ−１４１及びｍｉＲ−２００ａを選定した。両者の配列はほぼ同一であるが２塩基の差異がある。以下に示す材料をつくばオリゴサービス株式会社に委託し、自動核酸合成装置を使用して、ホスホロアミダイト法に従って合成した。
（実施例１）
標的ｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ−１４１の配列を有するＲＮＡを合成した。また、これに相補的な配列を有する捕捉プローブと検出プローブの２種の核酸プローブを設計・合成した。
用いた標的ｍｉＲＮＡ、捕捉プローブ、及び検出プローブの配列を以下に示す。
（１）標的ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ−１４１［配列：５’−ＵＡＡＣＡＣＵＧＵＣＵＧＧＵＡＡＡＧＡＵＧＧ−３’］ （配列番号１：２２ｍｅｒ）
（２）捕捉プローブ−１４１／２００ａ（Ｃａｐｔｕｒｅ ｐｒｏｂｅ−１４１／２００ａ）［配列：５’−Ｘ１−ＣＮＶＫ−Ｘ２−ｆＳ−３’］ Ｘ１、Ｘ２は以下の配列を表し、Ｓはチオール基を表し、ｆは６−ＦＡＭ（６−カルボキシフルオロセイン）を表す。
Ｘ１：ＡＣＣＡＧＡＣＡ（８ｍｅｒ）
Ｘ２：ＴＧＴＴＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡ（配列番号２：２６ｍｅｒ）
Ｘ１：ＡＣＣＡＧＡＣＡ（８ｍｅｒ）
Ｘ２：ＴＧＴＴＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡ（配列番号２：２６ｍｅｒ）
（３）検出プローブ‐１４１（Ｄｅｔｅｃｔ ｐｒｏｂｅ‐１４１）［配列：５’−Ｘ３−Ｃｙ５−Ｘ４−ＣＮＶＫ−Ｘ５−３’］
Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５は以下の配列を表す。
Ｘ３：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号３：１７ｍｅｒ）
Ｘ４：ＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＣＣＡ（配列番号４：２１ｍｅｒ）
Ｘ５：ＣＴＴＴ（４ｍｅｒ）
表１に示す組成で標的ｍｉＲＮＡ、補足プローブ、検出プローブを含有するハイブリダイゼーション反応溶液を調整した。
Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５は以下の配列を表す。
Ｘ３：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号３：１７ｍｅｒ）
Ｘ４：ＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＣＣＡ（配列番号４：２１ｍｅｒ）
Ｘ５：ＣＴＴＴ（４ｍｅｒ）
表１に示す組成で標的ｍｉＲＮＡ、補足プローブ、検出プローブを含有するハイブリダイゼーション反応溶液を調整した。
上述したハイブリダイゼーション反応溶液をシェーカー上で１０００ｒｐｍの速さで振とうさせながら室温で１時間ハイブリダイゼーションさせた後、当該反応溶液に３６５ｎｍの紫外線（８ ｍＷ/ｃｍ２）を６０分間照射し、標的ｍｉＲＮＡとＣＮＶＫとを共有結合させた。
（実施例２）
標的ｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ−２００ａの配列を有するＲＮＡを合成した。また、これに相補的な配列を有する捕捉プローブと検出プローブの２種の核酸プローブを設計・合成した。
用いた標的ｍｉＲＮＡ、捕捉プローブ、及び検出プローブの配列を以下に示す。なお、検出プローブ‐１４１と検出プローブ‐２００aでは、両者の塩基配列は２塩基異なっており、蛍光標識の種類が異なる。
（１）標的ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ−２００ａ［配列：５’−ＵＡＡＣＡＣＵＧＵＣＵＧＧＵＡＡＣＧＡＵＧＵ−３’］ （配列番号５：２２ｍｅｒ）
（２）捕捉プローブ−１４１／２００ａ（Ｃａｐｔｕｒｅ ｐｒｏｂｅ−１４１／２００ａ）［配列：５’−Ｘ１−ＣＮＶＫ−Ｘ２−ｆＳ−３’］
Ｘ１、Ｘ２は以下の配列を表し、Ｓはチオール基を表し、ｆは６−ＦＡＭ（６−カルボキシフルオロセイン）を表す。
Ｘ１：ＡＣＣＡＧＡＣＡ（８ｍｅｒ）
Ｘ２：ＴＧＴＴＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡ（配列番号２：２６ｍｅｒ）
標的ｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ−２００ａの配列を有するＲＮＡを合成した。また、これに相補的な配列を有する捕捉プローブと検出プローブの２種の核酸プローブを設計・合成した。
用いた標的ｍｉＲＮＡ、捕捉プローブ、及び検出プローブの配列を以下に示す。なお、検出プローブ‐１４１と検出プローブ‐２００aでは、両者の塩基配列は２塩基異なっており、蛍光標識の種類が異なる。
（１）標的ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ−２００ａ［配列：５’−ＵＡＡＣＡＣＵＧＵＣＵＧＧＵＡＡＣＧＡＵＧＵ−３’］ （配列番号５：２２ｍｅｒ）
（２）捕捉プローブ−１４１／２００ａ（Ｃａｐｔｕｒｅ ｐｒｏｂｅ−１４１／２００ａ）［配列：５’−Ｘ１−ＣＮＶＫ−Ｘ２−ｆＳ−３’］
Ｘ１、Ｘ２は以下の配列を表し、Ｓはチオール基を表し、ｆは６−ＦＡＭ（６−カルボキシフルオロセイン）を表す。
Ｘ１：ＡＣＣＡＧＡＣＡ（８ｍｅｒ）
Ｘ２：ＴＧＴＴＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡ（配列番号２：２６ｍｅｒ）
（３）検出プローブ‐２００ａ（Ｄｅｔｅｃｔ ｐｒｏｂｅ‐２００ａ）［配列：５’−Ｘ６−Ｃｙ３−Ｘ７−ＣＮＶＫ−Ｘ８−３’］
Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８は以下の配列を表す。
Ｘ６：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号６：１７ｍｅｒ）
Ｘ７：ＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＡＣＡ（配列番号７：２１ｍｅｒ）
Ｘ８：ＣＧＴＴ（４ｍｅｒ）
これらの標的ｍｉＲＮＡ、補足プローブ、検出プローブを用いて、実施例１と同様にハイブリダイゼーション汎用溶液を調整し、ハイブリダイゼーション操作、及び紫外線照射を行った。
Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８は以下の配列を表す。
Ｘ６：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号６：１７ｍｅｒ）
Ｘ７：ＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＡＣＡ（配列番号７：２１ｍｅｒ）
Ｘ８：ＣＧＴＴ（４ｍｅｒ）
これらの標的ｍｉＲＮＡ、補足プローブ、検出プローブを用いて、実施例１と同様にハイブリダイゼーション汎用溶液を調整し、ハイブリダイゼーション操作、及び紫外線照射を行った。
実施例１および実施例２で用いた標的ｍｉＲＮＡの配列と、それに対応する検出プローブおよび捕捉プローブの配列を図１１に示す。
（比較例１）
標的ｍｉＲＮＡとしてｍｉＲ−２００ａを、検出プローブとして検出プローブ‐１４１を用いた以外は、実施例１と同様の方法で、ハイブリダイゼーション及び紫外線照射を行った。
（比較例２）
標的ｍｉＲＮＡとしてｍｉＲ−１４１を、検出プローブとして検出プローブ‐２００ａを用いた以外は、実施例１と同様の方法で、ハイブリダイゼーション及び紫外線照射を行った。
（比較例３）
ハイブリダイゼーション後に紫外線照射を行わなかった以外は、実施例１と同様の方法で、ハイブリダイゼーションを行った。
（比較例４）
ハイブリダイゼーション後に紫外線照射を行わなかった以外は、実施例２と同様の方法で、ハイブリダイゼーションを行った。
標的ｍｉＲＮＡとしてｍｉＲ−２００ａを、検出プローブとして検出プローブ‐１４１を用いた以外は、実施例１と同様の方法で、ハイブリダイゼーション及び紫外線照射を行った。
（比較例２）
標的ｍｉＲＮＡとしてｍｉＲ−１４１を、検出プローブとして検出プローブ‐２００ａを用いた以外は、実施例１と同様の方法で、ハイブリダイゼーション及び紫外線照射を行った。
（比較例３）
ハイブリダイゼーション後に紫外線照射を行わなかった以外は、実施例１と同様の方法で、ハイブリダイゼーションを行った。
（比較例４）
ハイブリダイゼーション後に紫外線照射を行わなかった以外は、実施例２と同様の方法で、ハイブリダイゼーションを行った。
（ｍｉＲＮＡ−Ｃ−ｐｒｏｂｅ−Ｄ−ｐｒｏｂｅ複合体の形成率の測定）
実施例１〜２、比較例１〜４で得られたサンプルを、尿素を含む変性アクリルアミドゲル上で電気泳動し、蛍光像のバンドの濃淡からｍｉＲＮＡ−Ｃ−ｐｒｏｂｅ−Ｄ−ｐｒｏｂｅ複合体（Ｔｅｒｔｉａｒｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）の形成率を調べた。変性ＰＡＧＥ ゲル上での６‐ＦＡＭおよびＣｙ５の蛍光像を合成した写真を図１２に示す。蛍光像は、蛍光イメージャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ ＦＸ、ＢｉｏＲａｄ社）で観察し、励起波長および蛍光フィルターはそれぞれＣｙ３：５３２ｎｍ，５５５ｎｍ ＬＰ、Ｃｙ５：６３５ｎｍ，６９０ｎｍ ＢＰ、６ＦＡＭ：４８８ｎｍ，５３０ｎｍ ＢＰを用いた。なお、Ｃｙ３標識の検出プローブ‐２００ａを用いた実施例２、比較例２、比較例４のレーンでＴｅｒｔｉａｒｙ ｃｏｍｐｌｅｘやＤ−ｐｒｏｂｅのバンドがわずかに検出されたのは、Ｃｙ３−Ｄ−ｐｒｏｂｅの蛍光がわずかに６‐ＦＡＭフィルターに漏れてきているためと考えられる。
実施例１〜２、比較例１〜４で得られたサンプルを、尿素を含む変性アクリルアミドゲル上で電気泳動し、蛍光像のバンドの濃淡からｍｉＲＮＡ−Ｃ−ｐｒｏｂｅ−Ｄ−ｐｒｏｂｅ複合体（Ｔｅｒｔｉａｒｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）の形成率を調べた。変性ＰＡＧＥ ゲル上での６‐ＦＡＭおよびＣｙ５の蛍光像を合成した写真を図１２に示す。蛍光像は、蛍光イメージャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ ＦＸ、ＢｉｏＲａｄ社）で観察し、励起波長および蛍光フィルターはそれぞれＣｙ３：５３２ｎｍ，５５５ｎｍ ＬＰ、Ｃｙ５：６３５ｎｍ，６９０ｎｍ ＢＰ、６ＦＡＭ：４８８ｎｍ，５３０ｎｍ ＢＰを用いた。なお、Ｃｙ３標識の検出プローブ‐２００ａを用いた実施例２、比較例２、比較例４のレーンでＴｅｒｔｉａｒｙ ｃｏｍｐｌｅｘやＤ−ｐｒｏｂｅのバンドがわずかに検出されたのは、Ｃｙ３−Ｄ−ｐｒｏｂｅの蛍光がわずかに６‐ＦＡＭフィルターに漏れてきているためと考えられる。
電気泳動後の上記の変性ＰＡＧＥ ゲルをＣｙ５フィルターで観察した蛍光像を図１３に示す。ｍｉＲＮＡ−Ｃ−ｐｒｏｂｅの上方のバンドよりわずかに上側に、ｍｉＲＮＡ−Ｄ−ｐｒｏｂｅと思われるバンドが見られた。
続いて、６‐ＦＡＭおよびＣｙ３の蛍光像を合成した写真を図１４に示す。なお、Ｃｙ５標識の検出プローブ‐１４１を用いた実施例１、比較例１、比較例３のレーンでＤ−ｐｒｏｂｅのバンドが検出されたのは、Ｃｙ５−Ｄ−ｐｒｏｂｅの蛍光がわずかにＣｙ３フィルターに漏れてきているためと考えられる。
また、Ｃｙ３フィルターで観察した蛍光像を図１５に示す。
図１５のｍｉＲＮＡ−Ｃ−ｐｒｏｂｅ複合体のバンドは６‐ＦＡＭ−Ｃ−ｐｒｏｂｅの蛍光が漏れたものである。実施例２のレーンでは、そのわずかに上方にｍｉＲＮＡ−Ｄ−ｐｒｏｂｅ複合体のバンドがみられた。
図１５のｍｉＲＮＡ−Ｃ−ｐｒｏｂｅ複合体のバンドは６‐ＦＡＭ−Ｃ−ｐｒｏｂｅの蛍光が漏れたものである。実施例２のレーンでは、そのわずかに上方にｍｉＲＮＡ−Ｄ−ｐｒｏｂｅ複合体のバンドがみられた。
上記の各バンドの濃度から、複合体の形成率を求めた。結果を表２に示す。中段（●）はＤ−ｐｒｏｂｅの蛍光を指標に、下段（＊）はＣ−ｐｒｏｂｅの蛍光を指標に算出した。表中の％はハイブリダイゼーション反応溶液中の標的ｍｉＲＮＡ、補足プローブ、検出プローブ量に対するモル％である。
実施例１〜２及び比較例１〜２との比較から、ｍｉＲＮＡとＤ−ｐｒｏｂｅの配列が完全に相補的な場合のみ、Ｃ−ｐｒｏｂｅ−Ｄ−ｐｒｏｂｅ−ｍｉＲＮＡの３者複合体が形成されることが示された。６０分照射での３者複合体形成率は、ｍｉＲ−１４１で７．０％、ｍｉＲ−２００ａで５．３％であった。ｍｉＲＮＡとＤ−ｐｒｏｂｅの配列が２塩基異なる場合は、３者複合体が全く形成されなかった（３者複合体形成率は、検出限界の０．２％以下）。したがって、ＣＮＶＫを有する補足プローブおよび検出プローブは、配列特異性を有することが明らかであり、ＣＮＶＫを有する補足プローブおよび検出プローブを用いることで、酵素による標的核酸と核酸プローブとの連結を行わずに、２塩基の差異を検出可能なほど高精度に核酸を定量できることが示された。
実施例１〜２及び比較例３〜４との比較から、紫外線を当てない場合（比較例３〜４）では、ｍｉＲＮＡとＤ−ｐｒｏｂｅの配列が完全に相補的でも、変性ＰＡＧＥゲル上では全く３者複合体が形成されておらず、３者複合体の形成が紫外線照射に依存していることが証明された。
（実施例３）
ハイブリダイゼーション後に紫外線照射を１０分間で行った以外は、実施例１と同様の方法で、ハイブリダイゼーションを行った。Ｃ−ｐｒｏｂｅ−Ｄ−ｐｒｏｂｅ−ｍｉＲＮＡの３者複合体の形成率は２．７％であった。
（実施例４）
ハイブリダイゼーション後に紫外線照射を１０分間で行った以外は、実施例２と同様の方法で、ハイブリダイゼーションを行った。Ｃ−ｐｒｏｂｅ−Ｄ−ｐｒｏｂｅ−ｍｉＲＮＡの３者複合体の形成率は２．５％であった。
ハイブリダイゼーション後に紫外線照射を１０分間で行った以外は、実施例１と同様の方法で、ハイブリダイゼーションを行った。Ｃ−ｐｒｏｂｅ−Ｄ−ｐｒｏｂｅ−ｍｉＲＮＡの３者複合体の形成率は２．７％であった。
（実施例４）
ハイブリダイゼーション後に紫外線照射を１０分間で行った以外は、実施例２と同様の方法で、ハイブリダイゼーションを行った。Ｃ−ｐｒｏｂｅ−Ｄ−ｐｒｏｂｅ−ｍｉＲＮＡの３者複合体の形成率は２．５％であった。
［固相でのｍｉＲＮＡ検出］
＜マイクロアレイの作製＞
まず、以下の表３に示す組成で、前記捕捉プローブ−１４１／２００ａを溶解した。
＜マイクロアレイの作製＞
まず、以下の表３に示す組成で、前記捕捉プローブ−１４１／２００ａを溶解した。
室温で1時間静置した後、ＮＡＰ−５カラムを用いてＤＴＴを取り除き、３×ＳＳＣ bufferに平衡化させ、溶出物の吸光度から蛍光標識のラベル率を求めた。Ｃａｐｔｕｒｅ ｐｒｏｂｅ−１４１／２００ａのラベル率は８７％であった。
上記の３×ＳＳＣ bufferに平衡化させて得られた捕捉プローブ−１４１／２００ａ溶液をＳｉｌａｎｅ−ＰＥＧ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ (Ｍ．Ｗ． ５０００、ＮＡＮＯＣＳ社製）と混合し、室温で１時間静置した後、最終濃度１０ｍＭとなるようＤＴＴを加え、さらに１時間静置して、ｐｒｏｂｅ−ＰＥＧ液を得た。ｐｒｏｂｅ−ＰＥＧ液の組成を以下に示す。
以下の表５に示す組成で、捕捉プローブを含有する溶液を調整し、インクジェット装置（ＭｉｃｒｏＪｅｔ社製ＬａｂｏＪｅｔ−５００Ｂｉｏ）を用いて、ガラス基板上に、表５に示す捕捉プローブ−１４１／２００ａを含む溶液を吐出した。
得られた基板を２５℃、高湿条件（１５μｌ、５０℃の水を配したチャンバー内）にて２時間保温し、捕捉プローブ−１４１／２００ａをガラス基板のシラノール基と反応させた後、基板上に１００％アセトンをゆっくりと滴下し１分間置いた後超純水で洗浄し、２ｘ ＳＳＣ， ０．１％ ＳＤＳに１０分間浸してさらに洗浄し、再度後超純水で洗浄して、風乾させ、ガラス基板に捕捉プローブ−１４１／２００ａが固定化されたマイクロアレイを得た。基板上の６−ＦＡＭの蛍光強度から算出した捕捉プローブの固定密度は２９２０±３５９ｃｏｐｙ/μｍ２であった。
＜ｍｉＲＮＡのハイブリダイゼーション＞
（実施例５）
前記検出プローブ‐１４１を含有する１．５ｘ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを下記の表６に示す組成で調整した。
（実施例５）
前記検出プローブ‐１４１を含有する１．５ｘ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを下記の表６に示す組成で調整した。
次いで、以下の表７に示す組成で、標的ｍｉＲＮＡ及び前記１．５ｘ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを混合し、標的ｍｉＲＮＡを含有するハイブリダイゼーションバッファーの混合液を調整した。
得られた、標的ｍｉＲＮＡ及び検出プローブを含有する混合液を９５℃で５分間保温した後、３００μｌずつをＰＤＭＳチャンバーの穴へと分注して、前記マイクロアレイで覆い、当該混合液をマイクロアレイ基盤に接触させ、シェーカー上で１０００ｒｐｍの速さで振とうさせながら室温で１５分間インキュベーションさせた。この際、１５分間の３６５ｎｍの紫外線（３０ｍＷ/ｃｍ２）の基板への照射も同時に行った。次いで、当該基板を２ｘ ＳＳＣ, ０．１％ ＳＤＳ、２５℃の溶液に１０分間浸し、さらに０．２ｘ ＳＳＣ、２５℃の溶液に１０分間浸し、再度０．２ｘ ＳＳＣ、２５℃の溶液に１０分間浸して洗浄した。
（比較例５）
前記標的ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１４１）の代わりに前記標的ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−２００ａ）を用いた以外は、実施例５と同様の方法でハイブリダイゼーションを行った。
前記標的ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１４１）の代わりに前記標的ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−２００ａ）を用いた以外は、実施例５と同様の方法でハイブリダイゼーションを行った。
（ｍｉＲＮＡ−Ｃ−ｐｒｏｂｅ−Ｄ−ｐｒｏｂｅ複合体の形成率の測定）
実施例５及び比較例５のハイブリダイゼーション後の基盤を乾燥させ、蛍光顕微鏡で観察した。観察結果を図１６に示す。図１６に示された画像のＣｙ５の蛍光強度から算出したＤ−ｐｒｏｂｅの結合密度は、ｍｉＲ−１４１存在下で１．５±０．２５ ｃｏｐｙ／μｍ２、ｍｉＲ−２００ａ存在下で０．０６４±０．０９７ ｃｏｐｙ／μｍ２（検出感度以下）となり、少なくとも２４倍の差があった。このことから、ＣＮＶＫを有する核酸プローブは、配列特異性が保たれていることが示された。以上のように、ＣＮＶＫを有する検出プローブ及び基板に固定化されＣＮＶＫを有する補足プローブを用いることで、酵素による標的核酸と核酸プローブとの連結を行わずに、２塩基の差異を検出可能なほど高精度に核酸を定量できることが示された。
実施例５及び比較例５のハイブリダイゼーション後の基盤を乾燥させ、蛍光顕微鏡で観察した。観察結果を図１６に示す。図１６に示された画像のＣｙ５の蛍光強度から算出したＤ−ｐｒｏｂｅの結合密度は、ｍｉＲ−１４１存在下で１．５±０．２５ ｃｏｐｙ／μｍ２、ｍｉＲ−２００ａ存在下で０．０６４±０．０９７ ｃｏｐｙ／μｍ２（検出感度以下）となり、少なくとも２４倍の差があった。このことから、ＣＮＶＫを有する核酸プローブは、配列特異性が保たれていることが示された。以上のように、ＣＮＶＫを有する検出プローブ及び基板に固定化されＣＮＶＫを有する補足プローブを用いることで、酵素による標的核酸と核酸プローブとの連結を行わずに、２塩基の差異を検出可能なほど高精度に核酸を定量できることが示された。
［マイクロアレイ基板上でのＤ−ｐｒｏｂｅの解離］
（実施例６）
ＣＮＶＫの利点として、３１２ｎｍ紫外線によりＣＮＶＫと塩基との間の架橋を開裂可能であることが挙げられる。上記実施例５において標的ｍｉＲＮＡおよび検出プローブのハイブリダイゼーションを行った後のマイクロアレイ基板に、紫外線照射装置（ＡＴＴＯ製）を用い、装置のガラス面の上方１ｃｍにマイクロアレイ基盤を置き、基板に３１２ｎｍ紫外線を５分間照射した。この際、紫外線照射によりＣＮＶＫが開裂した後、Ｃ−ｐｒｏｂｅからＤ−ｐｒｏｂｅが解離しやすいように８Ｍ 尿素水溶液存在下で照射を行った。マイクロアレイ基板を超純水で洗浄後、蛍光顕微鏡で観察した。３１２ｎｍ紫外線照射前後の補足プローブおよび検出プロ―ブの蛍光像を図１７に示す。照射前に結合していた検出プローブは、照射後全く観察されなかった。
一方、ガラス基板に固定した捕捉プローブは、付加されている蛍光色素６−ＦＡＭが３１２ｎｍの光を若干吸収し、一部退色するために、紫外線照射前より暗くは見えていたが、蛍光像が観察され、捕捉プローブのみが基板上に残っている様子が確認された。しがたって、標的ｍｉＲＮＡの定量後に標的ｍｉＲＮＡおよび検出プローブを解離させ、捕捉プローブが固定されたＤＮＡマイクロアレイを再利用可能であることを確認できた。
（実施例６）
ＣＮＶＫの利点として、３１２ｎｍ紫外線によりＣＮＶＫと塩基との間の架橋を開裂可能であることが挙げられる。上記実施例５において標的ｍｉＲＮＡおよび検出プローブのハイブリダイゼーションを行った後のマイクロアレイ基板に、紫外線照射装置（ＡＴＴＯ製）を用い、装置のガラス面の上方１ｃｍにマイクロアレイ基盤を置き、基板に３１２ｎｍ紫外線を５分間照射した。この際、紫外線照射によりＣＮＶＫが開裂した後、Ｃ−ｐｒｏｂｅからＤ−ｐｒｏｂｅが解離しやすいように８Ｍ 尿素水溶液存在下で照射を行った。マイクロアレイ基板を超純水で洗浄後、蛍光顕微鏡で観察した。３１２ｎｍ紫外線照射前後の補足プローブおよび検出プロ―ブの蛍光像を図１７に示す。照射前に結合していた検出プローブは、照射後全く観察されなかった。
一方、ガラス基板に固定した捕捉プローブは、付加されている蛍光色素６−ＦＡＭが３１２ｎｍの光を若干吸収し、一部退色するために、紫外線照射前より暗くは見えていたが、蛍光像が観察され、捕捉プローブのみが基板上に残っている様子が確認された。しがたって、標的ｍｉＲＮＡの定量後に標的ｍｉＲＮＡおよび検出プローブを解離させ、捕捉プローブが固定されたＤＮＡマイクロアレイを再利用可能であることを確認できた。
以上の結果から、本実施形態によれば、検出プローブおよび捕捉プローブに光反応性塩基誘導体が含まれるので、より高精度に核酸を定量できる。
１…第１の部分、２…第２の部分、３…ｍｉＲＮＡ、４…捕捉プローブ、４ａ…スペーサー、５…検出プローブ、５ａ…捕捉プローブ、５ｂ…配列、５ｃ，５ｄ…ステム部、５ｅ…ループ部、６，６’…基板、７ａ，７ａ’…第１の光反応性塩基誘導体、７ｂ，７ｂ’…第２の光反応性塩基誘導体、８…複合体捕捉プローブ、８ｂ…第３の部分、
１１，１０１’，１０１’，１０１’’…流体デバイス、１０２…エキソソーム精製部、１０２ａ…洗浄液導入用インレット、１０２ｂ…サンプル導入用インレット、１０２ｃ…破砕液導入用インレット、１０２ｄ…エキソソーム固定部、１０２ｅ，１０２ｆ，１０３ｆ，１０４ｄ，１０４ｆ，１０５ａ，１１０ａ，１１１ａ，１１２ａ…バルブ、１０２ｈ，１０２ｉ，１０３ｇ，１１０，１１１，１１２…流路、１０３、２０３…核酸精製部、１０３ｂ…核酸回収液導入用インレット、１０３ｃ…核酸固定部、１０４，…核酸検出部，溶液混合器、１０４ａ…検出プローブ導入用インレット、１０４ｃ…基板、１０５…第一の流路、１０６…第二の流路、１０７…第一の廃液槽、１０８…第二の廃液槽、１０９…第三の廃液槽、１１０…第三の流路、１１１…第四の流路、１１２…第五の流路、
２０１…流体デバイス、２０３，２０３’、２０３’’…核酸精製部、２０４…基板、２０４ｆ，２０４ｆ’，２０４ｆ’’…バルブ、２０６…流路
１１，１０１’，１０１’，１０１’’…流体デバイス、１０２…エキソソーム精製部、１０２ａ…洗浄液導入用インレット、１０２ｂ…サンプル導入用インレット、１０２ｃ…破砕液導入用インレット、１０２ｄ…エキソソーム固定部、１０２ｅ，１０２ｆ，１０３ｆ，１０４ｄ，１０４ｆ，１０５ａ，１１０ａ，１１１ａ，１１２ａ…バルブ、１０２ｈ，１０２ｉ，１０３ｇ，１１０，１１１，１１２…流路、１０３、２０３…核酸精製部、１０３ｂ…核酸回収液導入用インレット、１０３ｃ…核酸固定部、１０４，…核酸検出部，溶液混合器、１０４ａ…検出プローブ導入用インレット、１０４ｃ…基板、１０５…第一の流路、１０６…第二の流路、１０７…第一の廃液槽、１０８…第二の廃液槽、１０９…第三の廃液槽、１１０…第三の流路、１１１…第四の流路、１１２…第五の流路、
２０１…流体デバイス、２０３，２０３’、２０３’’…核酸精製部、２０４…基板、２０４ｆ，２０４ｆ’，２０４ｆ’’…バルブ、２０６…流路
Claims (23)
- （ａ）第１の部分及び第２の部分からなる核酸を含有する核酸試料と、
ステムループ構造を形成し、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、５’突出末端又は３’突出末端を有し、標識物質により標識されている検出プローブと、
前記第１の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、該配列中に第１の光反応性塩基誘導体を含む捕捉プローブと、を接触させる工程と、
（ｂ）前記第２の部分を前記検出プローブにハイブリダイズさせ、前記第１の部分を前記捕捉プローブにハイブリダイズさせ、核酸−検出プローブ‐捕捉プローブ複合体を形成させる工程と、
（ｃ）前記第１の部分を前記捕捉プローブにハイブリダイズさせ、第一の波長帯域の光によって、前記第１の光反応性塩基誘導体と前記核酸とを架橋させる工程と、
（ｄ）前記核酸−検出プローブ‐捕捉プローブ複合体中の標識物質を検出する工程と、
を有することを特徴とする核酸の検出方法。 - 前記検出プローブが、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列中に第２の光反応性塩基誘導体を含み、前記工程（ｃ）において、さらに、前記第２の部分を前記検出プローブにハイブリダイズさせ、第２の波長帯域光によって前記第２の光反応性塩基誘導体と前記核酸とを架橋させる請求項１に記載の核酸の検出方法。
- 前記捕捉プローブは基板に固定されていることを特徴とする、請求項１又は２に記載の核酸の検出方法。
- 前記工程（ａ）において、前記溶液は、異なる種類の標識物質により標識されている複数種類の検出プローブを含む請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
- 前記工程（ａ）において、前記核酸試料は、検出対象の複数種類の核酸を含有し、前記複数種類の核酸の第１の部分がそれぞれ重複しないように、前記捕捉プローブの５’末端と３’末端のうち、どちら側が基板に固定されるかを選択される請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
- 前記工程（ｃ）は、前記基板の一部領域に選択的に前記第一の波長帯域の光を照射し、前記光反応性塩基誘導体と前記核酸とを架橋させる工程である請求項１〜５のいずれか一項に核酸の検出方法。
- 前記第１の波長帯域光と前記第２の波長帯域光とは、同じ波長帯域である請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
- 前記第１の光反応性塩基誘導体及び／又は前記第２の光反応性塩基誘導体は可逆的光連結性塩基である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
- 第３の波長帯域光によって前記捕捉プローブと前記核酸との架橋を開裂させる工程（ｅ）と、
前記捕捉プローブとの架橋を開裂させた前記核酸を回収する工程（ｆ）と、
を有する請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。 - 前記第１の光反応性塩基誘導体及び／又は前記第２の光反応性塩基誘導体は異なる波長帯域で光連結と光開裂する請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
- 前記第１の光反応性塩基誘導体及び／又は前記第２の光反応性塩基誘導体が３−Ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅである請求項１〜１０のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
- 前記核酸は、ｍｉＲＮＡである請求項１〜１１のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
- 前記捕捉プローブ及び／又は前記検出プローブはＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）又はＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）を含む請求項１〜１２のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
- 核酸試料中の第１の部分及び第２の部分からなる核酸を検出するために用いられる検出プローブであって、
相補鎖を形成する２つのステム部と、
前記２つのステム部間の領域であり、標識物質により標識されているループ部と、
前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列からなり、該第２の部分とハイブリダイズし得る配列中に光反応性塩基誘導体を含み、５’突出末端又は３’突出末端と、を備えることを特徴とする検出プローブ。 - 前記ループ部の標識は、前記第２の部分の塩基配列と対応づけられている請求項１４に記載の検出プローブ。
- 前記光反応性塩基誘導体は異なる波長帯域で光連結と光開裂する請求項１４又は１５に記載の検出プローブ。
- 前記核酸は、ｍｉＲＮＡである請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の検出プローブ。
- 核酸と検出プローブと複合体を形成可能で、配列中に光反応性塩基誘導体を含む捕捉プローブが基板に固定されており、
前記核酸は、前記捕捉プローブとハイブリダイズし得る第１の部分と、前記検出プローブとハイブリダイズし得る第２の部分とを含み、
前記検出プローブは、ステムループ構造を形成し、５’突出末端又は３’突出末端を有し、標識物質により標識されていることを特徴とするマイクロアレイ。 - 捕捉プローブおよび検出プローブを備えた核酸検出キットであって、
前記捕捉プローブは、標的核酸を第一の部分と第二の部分に分割した場合に、前記第一の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、該配列中に光反応性塩基誘導体を含み、
前記検出プローブは、ステムループ構造を形成し、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、５’突出末端又は３’突出末端を有し、標識物質により標識されていることを特徴とする核酸検出キット。 - 第１の部分及び第２の部分からなる核酸を介して、
ステムループ構造を形成し、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、５’突出末端又は３’突出末端を有し、標識物質により標識されている検出プローブと、
前記第１の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、該配列中に光反応性塩基誘導体を含む捕捉プローブとが、連結されてなることを特徴とする核酸‐検出プローブ‐捕捉プローブ複合体。 - 請求項２０に記載の核酸‐検出プローブ‐捕捉プローブ複合体が基板に固定化されてなることを特徴とする核酸固定化担体。
- 捕捉プローブが固定化されてなる基板と、検出プローブ導入用インレットと、を有する核酸検出部を備えた流体デバイスであって、
前記捕捉プローブは、標的核酸を第一の部分と第二の部分に分割した場合に、前記第一の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、該配列中に光反応性塩基誘導体を含み、
前記検出プローブは、ステムループ構造を形成し、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、５’突出末端又は３’突出末端を有し、標識物質により標識されていることを特徴とする流体デバイス。 - 前記核酸はサンプル中のエキソソームが内包する核酸である請求項２２に記載の流体デバイス。
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|---|---|
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Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107119124A (zh) * | 2017-05-10 | 2017-09-01 | 清华大学 | 一种检测待测样本中目标miRNA的含量的方法 |
| CN108384831A (zh) * | 2018-02-13 | 2018-08-10 | 塔里木大学 | 具有4至10个核苷酸单体的寡聚核苷酸的检测方法 |
| KR20200029581A (ko) * | 2017-07-24 | 2020-03-18 | 퀀텀-에스아이 인코포레이티드 | 고강도 표지된 반응물 조성물 및 서열분석 방법 |
| WO2021114040A1 (zh) * | 2019-12-09 | 2021-06-17 | 彩科(苏州)生物科技有限公司 | 一种无扩增的核酸分子检测试剂盒及其使用方法 |
| JP2021523388A (ja) * | 2018-08-28 | 2021-09-02 | ジェイエル メディラブズ、インコーポレイテッド | ターゲット物質の検出方法及びキット |
| JPWO2021215428A1 (ja) * | 2020-04-22 | 2021-10-28 | ||
| US11613772B2 (en) | 2019-01-23 | 2023-03-28 | Quantum-Si Incorporated | High intensity labeled reactant compositions and methods for sequencing |
| WO2024117156A1 (ja) * | 2022-11-30 | 2024-06-06 | 積水メディカル株式会社 | 核酸測定方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008086296A (ja) * | 2006-10-05 | 2008-04-17 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 新規蛍光標識核酸 |
| WO2009066447A1 (ja) * | 2007-11-19 | 2009-05-28 | Japan Advanced Institute Of Science And Technology | 光クロスリンク能を有する光応答性人工ヌクレオチド |
| EP2272856A1 (en) * | 2008-04-16 | 2011-01-12 | Japan Advanced Institute of Science and Technology | Sequence-specific nucleic acid purification method manner |
| WO2012033190A1 (ja) * | 2010-09-10 | 2012-03-15 | 三菱化学メディエンス株式会社 | 光を用いた核酸の増幅抑制方法および高感度な選択的核酸増幅方法 |
| JP2012147704A (ja) * | 2011-01-18 | 2012-08-09 | Olympus Corp | 標的核酸分子の検出方法 |
-
2013
- 2013-10-11 JP JP2013214107A patent/JP2015073523A/ja active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008086296A (ja) * | 2006-10-05 | 2008-04-17 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 新規蛍光標識核酸 |
| WO2009066447A1 (ja) * | 2007-11-19 | 2009-05-28 | Japan Advanced Institute Of Science And Technology | 光クロスリンク能を有する光応答性人工ヌクレオチド |
| EP2272856A1 (en) * | 2008-04-16 | 2011-01-12 | Japan Advanced Institute of Science and Technology | Sequence-specific nucleic acid purification method manner |
| WO2012033190A1 (ja) * | 2010-09-10 | 2012-03-15 | 三菱化学メディエンス株式会社 | 光を用いた核酸の増幅抑制方法および高感度な選択的核酸増幅方法 |
| JP2012147704A (ja) * | 2011-01-18 | 2012-08-09 | Olympus Corp | 標的核酸分子の検出方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 現代化学３月号, JPN6013026545, March 2013 (2013-03-01), pages 42 - 45, ISSN: 0003828933 * |
| 第２５回バイオメディカル分析科学シンポジウム講演要旨集, JPN6013026543, 8 August 2012 (2012-08-08), pages 116 - 117, ISSN: 0003828932 * |
Cited By (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107119124A (zh) * | 2017-05-10 | 2017-09-01 | 清华大学 | 一种检测待测样本中目标miRNA的含量的方法 |
| US11655504B2 (en) | 2017-07-24 | 2023-05-23 | Quantum-Si Incorporated | High intensity labeled reactant compositions and methods for sequencing |
| TWI829642B (zh) * | 2017-07-24 | 2024-01-21 | 美商寬騰矽公司 | 高強度經標記之反應物組合物及用於定序之方法 |
| KR20200029581A (ko) * | 2017-07-24 | 2020-03-18 | 퀀텀-에스아이 인코포레이티드 | 고강도 표지된 반응물 조성물 및 서열분석 방법 |
| JP2020530988A (ja) * | 2017-07-24 | 2020-11-05 | クアンタム−エスアイ インコーポレイテッドＱｕａｎｔｕｍ−Ｓｉ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ | 高強度標識反応物組成物および配列決定のための方法 |
| KR102626317B1 (ko) | 2017-07-24 | 2024-01-18 | 퀀텀-에스아이 인코포레이티드 | 고강도 표지된 반응물 조성물 및 서열분석 방법 |
| JP7287942B2 (ja) | 2017-07-24 | 2023-06-06 | クアンタム－エスアイ インコーポレイテッド | 高強度標識反応物組成物および配列決定のための方法 |
| CN108384831B (zh) * | 2018-02-13 | 2020-12-22 | 塔里木大学 | 长度为4至10个核苷酸单体的寡聚核苷酸的检测方法 |
| CN108384831A (zh) * | 2018-02-13 | 2018-08-10 | 塔里木大学 | 具有4至10个核苷酸单体的寡聚核苷酸的检测方法 |
| JP7168155B2 (ja) | 2018-08-28 | 2022-11-09 | ジェイエル メディラブズ、インコーポレイテッド | ターゲット物質の検出方法及びキット |
| JP2021523388A (ja) * | 2018-08-28 | 2021-09-02 | ジェイエル メディラブズ、インコーポレイテッド | ターゲット物質の検出方法及びキット |
| US11613772B2 (en) | 2019-01-23 | 2023-03-28 | Quantum-Si Incorporated | High intensity labeled reactant compositions and methods for sequencing |
| WO2021114040A1 (zh) * | 2019-12-09 | 2021-06-17 | 彩科(苏州)生物科技有限公司 | 一种无扩增的核酸分子检测试剂盒及其使用方法 |
| WO2021215428A1 (ja) * | 2020-04-22 | 2021-10-28 | 日華化学株式会社 | 核酸の検出方法及びオリゴヌクレオチドプローブ |
| JPWO2021215428A1 (ja) * | 2020-04-22 | 2021-10-28 | ||
| EP4141115A4 (en) * | 2020-04-22 | 2024-09-11 | Nicca Chemical Co | NUCLEIC ACID DETECTION METHODS AND OLIGONUCLEOTIDE PROBE |
| WO2024117156A1 (ja) * | 2022-11-30 | 2024-06-06 | 積水メディカル株式会社 | 核酸測定方法 |
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