JP2013534141A - 予備消化された栄養フォーミュラ - Google Patents

Abstract

本発明は、予備消化された栄養フォーミュラの調製のための方法ならびにその予備消化された液体栄養フォーミュラおよび予備消化された栄養フォーミュラの調製のためのキットに関する。当該予備消化された栄養フォーミュラは、消化酵素と、炭水化物、脂質、タンパク質および水の混合物を含む液体栄養組成物とを含む。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１０年８月６日に出願された米国仮特許出願第６１／３７１，６０８号および２０１１年３月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／４７０，０９４号の優先権を主張しており、これらの仮特許出願の各々は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に援用される。

本発明は、予備消化された栄養フォーミュラに関する。本発明はまた、予備消化された栄養フォーミュラの調製のための方法において、その予備消化された栄養フォーミュラを形成するために、消化酵素と、炭水化物、脂質、タンパク質および水の混合物を含む液体栄養組成物とを混合するステップを含む方法に関する。

患者に適した薬物投薬は、医療分野における重要な課題である。特に幼児、より小さい子供、および老人患者については、さらに時には成人層についても、薬物の投与および投薬方法が、しばしば実質的な問題を呈する。当該技術分野においてよく知られているように、薬物は、多くの形態（例えば、液体、固体、および液体中固体の組み合わせ）で提供され、多くのやり方で（例えば、経口により、注入により、経皮により）患者に投与される。

米国食品医薬品局（Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ：ＦＤＡ）により２００，０００人を超える米国人が患っていると推定されている膵外分泌機能不全（ｅｘｏｃｒｉｎｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ：ＥＰＩ）の場合、患者は、膵臓により生成される消化酵素の不足により食物を適切に消化することができない。消化酵素のそうした減少は、栄養素の消化不良および吸収不良などの障害に繋がり、これらは、栄養失調およびそれと関連する他の結果として生じる望ましくない生理学的状態に繋がる。これらの障害は、嚢胞性線維症（ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ：ＣＦ）および膵臓の外分泌機能に欠陥を生じさせる他の状態（例えば、膵癌、膵切除、および膵炎）を患う人々に共通している。この栄養失調は、未処置のままにされると、特に幼児およびＣＦ患者の場合には、生命を脅かし得、これらの障害は、小児の成長障害、免疫応答障害（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）、および平均余命の短縮に繋がる。

消化酵素（例えば、パンクレリパーゼおよび他の膵酵素製品（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ ｐｒｏｄｕｃｔｓ：ＰＥＰｓ）は、ＥＰＩを少なくとも部分的に治療するために投与され得る。消化酵素サプリメントの投与は、患者がより効果的に食物を消化することを可能にする。

消化酵素（例えば、パンクレリパーゼ（Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）、Ｃｒｅｏｎ（登録商標）およびＰａｎｃｒｅａｚｅ（登録商標））を含有するカプセルが、経口投与用に開発されている。しかしながら、患者がそうしたカプセルを嚥下できない場合は、それぞれのカプセルが開けられ、その内容物が、少量の食物、通常は、柔らかい酸性の食物（例えば、市販のアップルソース）に振り掛けられ、患者にスプーンで経口投与され得る。あるいは、幼児および小児には、そのような薬物は、その内容物をシリンジデバイスでの投与に適した媒体中に懸濁させて含有するシリンジデバイスを用いて経口投与され得る。

小児および成人のＥＰＩ患者を含む一部の患者には、胃造瘻チューブおよびより小さい口径の経腸栄養チューブ（例えば、経鼻胃および経空腸栄養チューブ）を介した経腸栄養が必要であることも認識されている。したがって、消化酵素を経口により摂取することができないそのような患者への消化酵素（例えば、パンクレリパーゼ）の投与に対する明らかな必要性がある。さらに、消化酵素が微粒子形態でありかつ投与のために栄養フォーミュラ中に加えられる場合において、問題点としては、どのようにして確実に消化酵素が栄養フォーミュラ中のその消化酵素に感受性がある成分に対してそれらの酵素活性を効果的に発揮するようにするか、およびどのようにしてその微粒子による経腸栄養の潜在的な妨害を未然に防ぐかが挙げられる。

ＥＰＩを処置するために使用されるパンクレリパーゼは、主として、３つの酵素クラス、すなわち、リパーゼ、プロテアーゼおよびアミラーゼの組み合わせを、それらの種々の補因子および補酵素と一緒にしたものである。これらの酵素は、膵臓で自然に産生され、脂肪、タンパク質および炭水化物の消化において重要である。パンクレリパーゼは、典型的にはブタの膵腺から調製されるが、他の供給源、例えば、それぞれあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第６，０５１，２２０号明細書、米国特許出願公開第２００４／００５７９４４号明細書、米国特許出願公開第２００１／００４６４９３号明細書、および国際公開第２００６／０４４５２９号パンフレットに記載されているものもまた使用され得る。これらの酵素は、グリセロールおよび脂肪酸への脂肪の加水分解、デキストリンおよび糖へのデンプンの加水分解、ならびにアミノ酸および誘導物質へのタンパク質の加水分解を触媒する。

膵酵素は、ほぼ中性の条件および僅かにアルカリ性の条件下で最適な活性を示す。胃条件下において、膵酵素は不活性化され得、結果として生物学的活性を失うことになる。したがって、外因的に投与される酵素は、一般的に、胃不活性化から保護され、それらが胃を通って十二指腸へ移行する間、元のままの状態を保つ。したがって、膵酵素をコーティングすることが望ましい。膵リパーゼは、胃不活性化に対して最も感受性が高く、かつ吸収不良の処置における重要な酵素である。リパーゼを含有する酵素組成物の安定性を決定するために、典型的に、リパーゼ活性がモニタリングされる。Ｏｒｔｅｎｚｉらに対して発行された米国特許第７，６５８，９１８号明細書の全内容が、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に明示的に援用されるのであるが、これは、安定な消化酵素組成物について記述するものであり、経口投与される特定の微粒子薬物を、患者の胃を通過しその後腸内で放出するように設計することを説明している。患者、特に幼児および小児への、そのよう微粒子薬物の適切な投薬量の投与は、可能な限り正確であるべきである。

前述のことに鑑みて、予備消化された栄養配合物、特には、経腸栄養チューブの閉塞の何らのまたは限られた可能性（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）もなしに経腸投与が可能であるような、効果的に消化された栄養配合物を調製するための、実用的で、安価で、簡単で、かつ効果的な方法に対する必要性がある。

本発明は、予備消化された栄養配合物を調製する方法において、そのようなものから利益を得ることになるような患者へのその経腸投与に先立つ液体栄養組成物の予備消化を達成するために、消化酵素と液体栄養組成物とを混合するステップを含むことを特徴とする方法に関する。本発明はまた、予備消化された栄養配合物に関する。上述の一般的な説明および以下の詳細な説明は、どちらも本発明を限定するものではなく例示するものであることが理解されるべきである。

本発明は、添付の以下の図と関連して読まれる場合に、以下の発明を実施するための形態から最も良く理解される。

図１は、ブレンディング前の、液体食＋パンクレリパーゼＭＣＴ。 図２は、１６，５００ｒｐｍでの１分間のブレンディング後の、液体食＋パンクレリパーゼＭＴＣ。 図３は、液体食＋パンクレリパーゼＭＣＴのホモジネート（１６，５００ｒｐｍでの１分間のブレンディング）の濾過後のガラスフィルターるつぼ上の残渣。 図４は、１５，５００ｒｐｍでの１分間のブレンディング後の、液体食＋パンクレリパーゼＭＴＣ。 図５は、液体食（Ｅｎｓｕｒｅ Ｐｌｕｓ（登録商標））＋パンクレリパーゼＭＴＣのホモジネート（１５，５００ｒｐｍでの１分間のブレンディング）の濾過後のガラスフィルターるつぼ上の残渣。 図６は、１５，５００ｒｐｍでの２分間のブレンディング後の、液体食＋パンクレリパーゼＭＴＣ。 図７は、液体食（Ｅｎｓｕｒｅ Ｐｌｕｓ（登録商標））＋パンクレリパーゼＭＴＣのホモジネート（１５，５００ｒｐｍでの２分間のブレンディング）の濾過後のガラスフィルターるつぼ上の残渣。 図８は、液体食中でのリパーゼの放出および安定性のグラフ。 図９は、脂肪分解の間のｐＨおよび温度の動態。 図１０は、実験３における各脂肪分解生成物の濃度のプロット。 図１１は、実験３におけるＴＡＧ動態。 図１２は、脂肪分解は、パンクレリパーゼＭＴＣについてのレベル１（Ｌ１）およびレベル（Ｌ２）である。 図１３は、室温における５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム中のパンクレリパーゼマイクロ錠剤（約５，０００リパーゼＵＰＳ単位）−時間０。 図１４は、室温における５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム中のパンクレリパーゼマイクロ錠剤（約５，０００リパーゼＵＰＳ単位）−１０分。 図１５は、室温における５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム中のパンクレリパーゼマイクロ錠剤（約５，０００リパーゼＵＰＳ単位）−２０分。 図１６は、室温における５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム中のパンクレリパーゼマイクロ錠剤（約５，０００リパーゼＵＰＳ単位）−３５分。 図１７は、室温における５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム中のパンクレリパーゼマイクロ錠剤（約５，０００リパーゼＵＰＳ単位）−４５分。 図１８は、室温における５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム中のパンクレリパーゼマイクロ錠剤（約５，０００リパーゼＵＰＳ単位）−５５分。 図１９は、室温における５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム中のパンクレリパーゼマイクロ錠剤（約５，０００リパーゼＵＰＳ単位）−時間０。 図２０は、室温における５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム中のパンクレリパーゼマイクロ錠剤（約５，０００リパーゼＵＰＳ単位）−１０分。 図２１は、室温における５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム中のパンクレリパーゼマイクロ錠剤（約５，０００リパーゼＵＰＳ単位）−２０分。 図２２は、室温における５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム中のパンクレリパーゼマイクロ錠剤（約５，０００リパーゼＵＰＳ単位）−２０分間の浸漬時間後に撹拌した溶液。 図２３は、室温における５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム中のパンクレリパーゼミニ錠剤（約５，０００リパーゼＵＰＳ単位）−時間０。 図２４は、室温における５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム中のパンクレリパーゼミニ錠剤（約５，０００リパーゼＵＰＳ単位）−１０分。 図２５は、室温における５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム中のパンクレリパーゼミニ錠剤（約５，０００リパーゼＵＰＳ単位）−２０分。 図２６は、室温における５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム中のパンクレリパーゼミニ錠剤（約５，０００リパーゼＵＳＰ単位）−２０分間の浸漬時間後に撹拌した溶液。 図２７は、室温における５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム中のパンクレリパーゼミニ錠剤（約５，０００リパーゼＵＰＳ単位）−３０分。 図２８は、室温における５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム中のパンクレリパーゼミニ錠剤（約５，０００リパーゼＵＰＳ単位）−３０分間の浸漬時間の終わりに撹拌した溶液。 図２９は、室温における５ｍＬの１３％重炭酸ナトリウム中のパンクレリパーゼマイクロ錠剤（約５，０００リパーゼＵＰＳ単位）−時間０。 図３０は、室温における５ｍＬの１３％重炭酸ナトリウム中のパンクレリパーゼマイクロ錠剤（約５，０００リパーゼＵＰＳ単位）−１０分。 図３１は、室温における５ｍＬの１３％重炭酸ナトリウム中のパンクレリパーゼマイクロ錠剤（約５，０００リパーゼＵＰＳ単位）−２０分。 図３２は、室温における５ｍＬの０．６５％重炭酸ナトリウム中のパンクレリパーゼマイクロ錠剤（約５，０００リパーゼＵＰＳ単位）−時間０。 図３３は、室温における５ｍＬの０．６５％重炭酸ナトリウム中のパンクレリパーゼマイクロ錠剤（約５，０００リパーゼＵＰＳ単位）−３５分。 図３４は、室温における５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム中のパンクレリパーゼマイクロ錠剤（約４０，０００リパーゼＵＰＳ単位Ｕ）−時間０。 図３５は、室温における５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム中のパンクレリパーゼマイクロ錠剤（約４０，０００リパーゼＵＰＳ単位）−２０分。 図３６は、室温における５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム中のパンクレリパーゼマイクロ錠剤（約４０，０００リパーゼＵＰＳ単位）−４５分。 図３７は、４℃における５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム中のパンクレリパーゼマイクロ錠剤（約４０，０００リパーゼＵＰＳ単位）−時間０。 図３８は、４℃における５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム中のパンクレリパーゼマイクロ錠剤（約４０，０００リパーゼＵＰＳ単位）−４５分。 図３９は、室温における５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム中のパンクレリパーゼマイクロ錠剤（約４０，０００リパーゼＵＰＳ単位）−２０分。 図４０は、室温における１５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム中のパンクレリパーゼマイクロ錠剤（約４０，０００リパーゼＵＳＰ単位）−２０分。 図４１は、室温における２５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム中のパンクレリパーゼマイクロ錠剤（約４０，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ）−２０分。 図４２は、室温における２５ｍＬの８．４％重炭酸塩溶液中のパンクレリパーゼペレット（約４０，０００リパーゼＵＳＰ単位）−時間０。 図４３は、室温における２５ｍＬの８．４％重炭酸塩溶液中のパンクレリパーゼペレット（約４０，０００リパーゼＵＳＰ単位）−２０分。 図４４は、室温における２５ｍＬの８．４％重炭酸塩溶液中のパンクレリパーゼペレット（約４０，０００リパーゼＵＳＰ単位）−９０分。 図４５は、室温における２５ｍＬの８．４％重炭酸塩溶液中のパンクレリパーゼペレット（約４０，０００リパーゼＵＳＰ単位）−１２０分。 図４６は、室温／４℃で貯蔵された２５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム溶液中の、４０，０００リパーゼＵＰＳ単位のパンクレリパーゼマイクロ錠剤とパンクレリパーゼ粉末との、残存リパーゼ活性の比較。

本発明は、予備消化された栄養フォーミュラの調製のための方法において、予備消化された栄養フォーミュラを形成するために、消化酵素またはその酵素溶液と、炭水化物、脂質、タンパク質および水の混合物を含む液体栄養組成物とを混合するステップを含むことを特徴とする方法に関する。

本発明の１つの実施形態において、液体栄養組成物への消化酵素またはその酵素溶液の添加のステップが、混合ステップに先立って行われる。

本発明の別の実施形態において、液体栄養組成物への消化酵素の添加のステップが、混合ステップに先立って行われる。

本発明の別の実施形態において、液体栄養組成物への消化酵素溶液の添加のステップが、混合ステップに先立って行われる。

本発明の別の実施形態において、消化酵素は、パンクレリパーゼビーズの形態である。

本発明の別の実施形態において、消化酵素は、腸溶コーティングされたパンクレリパーゼビーズの形態である。

本発明の別の実施形態において、消化酵素は、腸溶コーティングされたパンクレリパーゼビーズの形態であり、混合ステップは、機械的ブレンディングによって行われる。

本発明の別の実施形態において、混合ステップは、パンクレリパーゼビーズおよび液体栄養組成物の機械的ブレンディングによって、その混合物がホモジナイズされるまで行われる。

本発明の別の実施形態において、消化酵素は、薬学的に受容可能な弱塩基性溶液中に懸濁されてその酵素溶液を形成する、腸溶コーティングされたパンクレリパーゼビーズの形態である。

本発明の予備消化された栄養フォーミュラは、消化酵素を含有する任意の好適な経口剤形から出発して調製され得る。好適な剤形の非限定的な例としては、錠剤、カプセル剤、またはサシェ剤（ｓａｃｈｅｔ）が挙げられる。特定の実施形態において、剤形は、カプセル剤である。それぞれの剤形は、薬物の消化酵素ビーズを含有する。本発明において、消化酵素ビーズは、そこに含有されている活性酵素を放出するために、薬学的に受容可能な弱塩基性溶液との機械的混合または混合を行い得る任意の種類の微粒子である。用語「ビーズ」は、顆粒、錠剤、球体、ミニ錠剤、マイクロ錠剤、微粒子、微小球、マイクロカプセル、マイクロペレット、および約５ｍｍまでの直径を有する粒子を包含し、当該ビーズは、任意の好適な粒径または形状であり得る。例えば、ビーズは、約５０〜５，０００μｍの粒径範囲を有する「マイクロペレット」の形態であり得る、または約２〜５ｍｍの範囲内の公称（例えば、平均）粒子直径を有する「ミニ錠剤」の形態であり得る。この微粒子は、約２ｍｍ未満（例えば、約１〜２ｍｍ）の公称（例えば、平均）粒子直径を有する「マイクロ錠剤」であり得る。１．１５ｍｍの最小メジアン粒径を有する「ミニ微小球」または２．６３ｍｍに最大メジアン粒子を有する「マイクロ錠剤」もまた、本方法に好適である。粒子は、約８００μｍ未満、好ましくは５００μｍ未満、好ましくは約４００μｍ〜約６００μｍまたは約２５０μｍ〜約５００μｍの平均粒径を有する「マイクロカプセル」の形態であり得る。これらのビーズはまた、４００μｍ以上の体積径（ｄ（ｖ，０．１）（体積分布の１０％がこの値よりも低く、かつ９０％がこの値よりも高くなるところの直径として定義される）および９００μｍ以下の体積径ｄ（ｖ，０．９）（体積分布の９０％がこの値よりも低く、かつ１０％がこの値よりも高くなるところの直径として定義される）を有する「マイクロペレット」であり得る。比表面（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｕｒｆａｃｅ）は、８．７ｃｍ^２／ｇ〜１９．８ｃｍ^２／ｇの間の範囲にあり得る。

予備消化された栄養フォーミュラの調製に好適な全ての消化酵素ビーズ、特にパンクレリパーゼ酵素ビーズは、腸溶コーティングによってコーティングされ得る。

語句「腸溶性ポリマー」とは、消化酵素を胃内容物から保護するポリマー、例えば、酸性ｐＨでは安定であるがより高いｐＨでは急速に分解または溶解し得るポリマー、または、胃腸管の残部と対照的に、消化酵素が胃の中にある間は確実に胃内容物と消化酵素との接触が比較的少なくなるようにするのに十分に水和または浸食の速度が遅いポリマーを意味する。腸溶性ポリマーは、可塑剤およびさらなる賦形剤をさらに含み得る腸溶コーティングの成分である。腸溶性ポリマーの非限定的な例としては、当該技術分野において知られているもの、例えば、変性または未変性の天然ポリマー（例えば、酢酸フタル酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、およびシェラック）；または合成ポリマー（例えば、アクリルポリマーまたはコポリマー、メタクリル酸ポリマーおよびコポリマー、メタクリル酸メチルコポリマー、ならびにメタクリル酸／メタクリル酸メチルコポリマー）が挙げられる。腸溶コーティングにより、パンクレリパーゼの遅延放出ビーズからなるコアが封入される。こうしたコーティングは、胃の酸性環境から薬物を保護するバリヤーとして機能し、薬物が小腸に到達する前の薬物の放出を実質的に妨げる。コーティングされた安定化された消化酵素粒子は、次いで、カプセル剤に製剤化され得る。安定化された消化酵素粒子の特定剤形の一つは、腸溶コーティングされたパンクレリパーゼ酵素ビーズが充填されたカプセル剤である。

本明細書で使用される用語「消化酵素」とは、食物の成分が生物によって摂取または吸収され得るようにそれらの成分を分解する消化管中の酵素を意味する。消化酵素の非限定的な例としては、パンクレリパーゼ（パンクレアチンとも呼ばれる）、リパーゼ、補リパーゼ、トリプリン、キモトリプシン、キモトリプシンＢ、膵ペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ、グリセロールエステルヒドロラーゼ、ホスホリパーゼ、ステロールエステルヒドロラーゼ、エラスターゼ、キニノゲナーゼ、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、α−アミラーゼ、パパイン、キモパパイン、グルテナーゼ（ｇｌｕｔｅｎａｓｅ）、ブロメライン、フィシン、β−アミラーゼ、セルラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ラクターゼ、スクラーゼ、イソマルターゼ、およびそれらの混合物が含まれる。

本明細書で使用される場合、用語「膵酵素」とは、膵臓分泌物中に存在する酵素種類（例えば、アミラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、またはそれらの混合物）のうちのいずれか１つまたは酵素活性を有する膵臓起源の任意の抽出物（例えば、パンクレアチン）をいう。

用語「パンクレリパーゼ」または「パンクレリパーゼ酵素」または「パンクレアチン」とは、数種類の酵素（アミラーゼ、リパーゼ、およびプロテアーゼ酵素を含む）の混合物を意味する。パンクレリパーゼは、例えば、Ｎｏｒｄｍａｒｋ Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ ＧｍｂＨ社、またはＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＬＬＣ社から市販されている。

用語「リパーゼ」とは、グリセロールおよび単純な脂肪酸への脂質の加水分解を触媒する酵素を意味する。本発明に好適なリパーゼの例としては、動物リパーゼ（例えば、ブタリパーゼ）、細菌リパーゼ（例えば、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）リパーゼおよび／またはバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）リパーゼ）、真菌リパーゼ、植物リパーゼ、組換えリパーゼ（例えば、組換えＤＮＡ技術により、培養下の細菌、酵母、真菌、植物、昆虫または哺乳動物の宿主細胞のいずれか１つから選択される、好適な宿主細胞によって産生されたもの、すなわち、天然に存在する配列と相同または実質的に同一であるアミノ酸配列を含む組換えリパーゼ、天然に存在するリパーゼコード核酸と相同または実質的に同一である核酸によってコードされるリパーゼなど）、合成リパーゼ、化学的に変性されたリパーゼ、およびそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。用語「脂質」は、脂肪、蝋、ステロール、脂溶性ビタミン（例えば、ビタミンＡ、Ｄ、ＥおよびＫ）、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質などを含む、天然に存在する分子を広く包含する。

用語「アミラーゼ」とは、デンプンを分解するグリコシドヒドロラーゼ酵素（例えば、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、γ−アミラーゼ、酸性α−グルコシダーゼ、唾液アミラーゼ（例えば、プチアリン）など）をいう。本発明における使用に適したアミラーゼとしては、動物アミラーゼ、細菌アミラーゼ、真菌アミラーゼ（例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）アミラーゼ、例えば、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）アミラーゼ）、植物アミラーゼ、組換えアミラーゼ（例えば、組換えＤＮＡ技術により、培養下の細菌、酵母、真菌、植物、昆虫または哺乳動物の宿主細胞のいずれか１つから選択される、好適な宿主細胞によって産生されたもの、すなわち、天然に存在する配列と相同または実質的に同一であるアミノ酸配列を含む組換えアミラーゼ、天然に存在するアミラーゼコード核酸と相同または実質的に同一である核酸によってコードされるアミラーゼなど）、化学的に変性されたアミラーゼ、およびそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。

用語「プロテアーゼ」とは、一般的に、タンパク質のアミノ酸間のペプチド結合を破壊する酵素（例えば、プロテイナーゼ、ペプチダーゼ、またはタンパク質分解酵素）をいう。プロテアーゼは、一般的に、それらの触媒型（例えば、アスパラギン酸ペプチダーゼ、システイン（チオール）ペプチダーゼ、メタロペプチダーゼ、セリンペプチダーゼ、トレオニンペプチダーゼ）、アルカリもしくはセミアルカリプロテアーゼ、中性ペプチダーゼ、および未知の触媒機構のペプチダーゼによって特定される。本発明における使用に適したプロテアーゼの非限定的な例としては、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ（例えば、プラスメプシン（ｐｌａｓｍｅｐｓｉｎ））メタロプロテアーゼおよびグルタミン酸プロテアーゼが含まれる。また、本発明における使用に好適なプロテアーゼとしては、動物プロテアーゼ、細菌プロテアーゼ、真菌プロテアーゼ（例えば、アスペルギルス・メレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓ）プロテアーゼ）、植物プロテアーゼ、組換えプロテアーゼ（例えば、組換えＤＮＡ技術により、培養下の細菌、酵母、真菌、植物、昆虫または哺乳動物の宿主細胞のいずれか１つから選択される、好適な宿主細胞によって産生されたもの、すなわち、天然に存在する配列と相同または実質的に同一であるアミノ酸配列を含む組換えプロテアーゼ、天然に存在するプロテアーゼコード核酸と相同または実質的に同一である核酸によってコードされるプロテアーゼなど）、化学的に変性されたプロテアーゼ、およびそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。

本発明のパンクレリパーゼ酵素は、１種以上のリパーゼ（すなわち、１種のリパーゼ、または２種以上のリパーゼ）、１種以上のアミラーゼ（すなわち、１種のアミラーゼ、または２種以上のアミラーゼ）、１種以上のプロテアーゼ（すなわち、１種のプロテアーゼ、２種以上のプロテアーゼ）、ならびにこれらの酵素の異なる組み合わせおよび比での混合物を含み得る。

本発明に有用な組成物中のリパーゼ活性は、約６５０〜約４５，０００ＩＵ（ＵＳＰ法）、約６７５〜約８２５ＩＵ、約２，５００〜約２８，０００ＩＵ（ＵＳＰ法）、約２，７００〜約３，３００ＩＵ、約４，５００〜約５，５００ＩＵ、約９，０００〜約１１，０００ＩＵ、約１３，５００〜約１６，５００ＩＵ、および約１８，０００〜約２２，０００ＩＵ、約２２，５００〜約２７，５００ＩＵ、約３６，０００〜約４４，０００ＩＵ、ならびにそれらの間の全ての範囲および部分範囲であり得る。当該組成物中のアミラーゼ活性は、約１，６００〜約６，５７５ＩＵ（ＵＳＰ）、約６，０００〜約２２５，０００ＩＵ、例えば、約６，４００〜約２６，３００ＩＵ、約１０，７００〜約４３，８００ＩＵ、約２１，５００〜約８７，５００ＩＵ、約３２，１００〜約１３１，３００ＩＵ、約４２，９００〜約１７５，０００ＩＵ、約５３，６００〜約２１８，７００ＩＵ、ならびにそれらの間の全ての範囲および部分範囲であり得る。当該組成物中のプロテアーゼ活性は、約１，２５０〜約３，８５０ＩＵ（ＵＳＰ）、約５，０００〜約１３０，０００ＩＵ、例えば、約５，０００〜約１５，４００ＩＵ、約８，４００〜約２５，７００ＩＵ、約１６，８００〜約５１，３００ＩＵ、約２５，０００〜約７７，０００ＩＵ、約３３，５００〜約１０２，８００ＩＵ、約４１，８００ＩＵ〜約１２８，３００ＩＵならびにそれらの間の全ての範囲および部分範囲であり得る。リパーゼ活性は約６７５〜約８２５ＩＵの範囲にあり、アミラーゼ活性は約１，６００〜約６，５７５ＩＵの範囲にあり、かつプロテアーゼ活性は約１，２５０〜約３，８５０ＩＵ（ＵＳＰ）の範囲にあり得る。リパーゼ活性は約２，７００〜約３，３００ＩＵの範囲にあり、アミラーゼ活性は約６，４００〜約２６，３００ＩＵの範囲にあり、かつプロテアーゼ活性は約５，０００〜約１５，４００ＩＵ（ＵＳＰ）の範囲にあり得る。あるいは、リパーゼ活性は約４，５００〜約５，５００ＩＵの範囲にあり、アミラーゼ活性は約１０，７００〜約４３，８００ＩＵの範囲にあり、かつプロテアーゼ活性は約８，４００〜約２５，７００ＩＵ（ＵＳＰ）の範囲にあり得る。あるいは、リパーゼ活性は約９，０００〜約１１，０００ＩＵの範囲にあり、アミラーゼ活性は約２１，５００〜約８７．５００ＩＵの範囲にあり、かつプロテアーゼ活性は約１６，８００〜約５１，３００ＩＵ（ＵＳＰ）の範囲にあり得る。あるいは、リパーゼ活性は約１３，５００〜約１６，５００ＩＵの範囲にあり、アミラーゼ活性は約３２，１００〜約１３１，３００ＩＵの範囲にあり、かつプロテアーゼ活性は約２５，０００〜約７７，０００ＩＵ（ＵＳＰ）の範囲にあり得る。リパーゼ活性は、約１８，０００〜約２２，０００ＩＵの範囲にあり、アミラーゼ活性は約４２，９００〜約１７５，０００ＩＵの範囲にあり、かつプロテアーゼ活性は約３３，５００〜約１０２，６００ＩＵ（ＵＳＰ）の範囲にあり得る。リパーゼ活性は、約２２，０００〜約２７，５００ＩＵの範囲にあり、アミラーゼ活性は約５３，６００〜約２１８，７００ＩＵの範囲にあり、かつプロテアーゼ活性は約４１，８００ＩＵ〜約１２８，３００ＩＵ（ＵＳＰ）の範囲にあり得る。また、リパーゼ活性は、約５，０００ＰｈＥｕｒリパーゼ単位〜約３０，０００ＰｈＥｕｒリパーゼ単位の範囲にあり得、これは、約５，０００または約１０，０００または約１５，０００または約２０，０００または約３０，０００または約４０，０００ＰｈＥｕｒリパーゼ単位であってよい。

本発明の１つの実施形態においては、さらに、上に列挙したアミラーゼ活性の一部を含有する単一単位もまた、本方法について分析され得る。

特定の実施形態において、当該組成物中のアミラーゼ／リパーゼ活性の比は、約１〜約１０（例えば、約２．３８〜約８．７５）の範囲にあり得る（酵素アッセイはＵＳＰに準じて行われる）。さらに別の実施形態において、プロテアーゼ／リパーゼの比は、約１〜約８（例えば、約１．８６〜約５．１３）の範囲にあり得る（酵素アッセイはＵＳＰに準じて行われる）。さらに他の実施形態において、アミラーゼ／リパーゼ活性の比は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０である。

Ａｐｔａｌｉｓ Ｐｈａｒｍａは、本発明において使用され得る腸溶コーティングされたパンクレリパーゼ酵素ビーズ薬物の少なくとも一部を販売している。例えば、Ａｐｔａｌｉｓ Ｐｈａｒｍａは、ＥＵＲ−１００８という名称およびＺｅｎｐｅｐ（登録商標）という登録商標で、患者における膵外分泌機能不全（ＥＰＩ）の処置のための遅延放出カプセル剤を販売している。経口投与用Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）カプセルは、それぞれ、腸溶コーティングされたビーズ（７５０、３，０００、５，０００ＵＳＰ単位のリパーゼについては１．８〜１．９ｍｍ、１０，０００、１５，０００、２０，０００および４０，０００ＵＳＰ単位のリパーゼについては２．２〜２．５ｍｍ）を含有する。

Ａｐｔａｌｉｓ Ｐｈａｒｍａの製剤は、失われた酵素の代わりを補い、消化および吸収を改善し、かつ米国薬局方の基準を満たす。腸溶コーティングされたパンクレリパーゼ酵素を含有するＺｅｎｐｅｐ（登録商標）カプセルは、ヒドロキシプロピル−メチルセルロースからなっており、約６％以下、好ましくは約２％以下の含水率を有している。この製品の不活性成分は、クロスカルメロースナトリウム、水素添加ヒマシ油、コロイド状二酸化ケイ素、微結晶性セルロース、ステアリン酸マグネシウム、ヒプロメロースフタル酸エステル、タルク、およびクエン酸トリエチルを含む。Ａｐｔａｌｉｓ Ｐｈａｒｍａの製剤は、極めて安定な配合物であるため、その各用量は、一貫した量の主要膵酵素リパーゼ、プロテアーゼ、およびアミラーゼを、患者および医師に提供する。カプセル剤は開けられ、その内容物を分割して、用量を個別に滴定し得る。これらの特徴は、ヘルスケア専門家が、処置レジメンを微調整して、改善された投薬精度で最適な症状制御を達成することを可能にする。

本発明の特定の実施形態において、パンクレリパーゼ酵素は、経腸栄養用栄養フォーミュラに導入される。この手順は、炭水化物、脂質、タンパク質、微量養分、微量元素、繊維および水の混合物を含む液体栄養組成物の一部の、ブレードのあらゆる部分を覆うのに十分な量でのブレンダーへの注入のステップを含む。これに続いて、ブレンダー中に消化酵素ビーズの用量の全量が加えられ、ホモジネートが得られるまで好適な条件下でこの混合物が混合される。次いで、液体栄養組成物の残りの部分で、その得られた酵素栄養フォーミュラの最終体積が調整される。この混合は、例えば、標準的な家庭用ブレンダーを用いて行われる。家庭用ブレンダーにおけるブレードサイズ、形状および回転速度のばらつきのため、ビーズの完全な分解を酵素活性の減少なしに達成するための最適ブレンディング条件には、室温における１２，５００〜１８，０００ｒｐｍの間の混合速度での１〜２分間にわたる連続混合が必要である。これらの条件下において、得られたホモジネートは、元のままの錠剤または認知できる大きさの断片を含有しない。ブレンディングの間に発生するフォーミュラの発泡は、経時的に解決する。

あるいは、腸溶コーティングされたパンクレリパーゼ酵素ビーズは、それらを薬学的に受容可能な弱塩基性溶液中に懸濁させることによって、活性酵素のアベイラビリティを確保するために分解され得、次いで、この溶液が、炭水化物、脂質、タンパク質および水の混合物を含む液体栄養組成物に添加され、最後に、結果として生じる混合物が混合されて、パンクレリパーゼにより予備消化された栄養フォーミュラを形成する。この方法において、塩基性溶液中のビーズの混合物は、液体栄養組成物との混合まで約２０分〜約１２０分間にわたり保持される。この混合物は、それを栄養フォーミュラに注入するまで、好ましくは約２０分〜約４５分間置いておかれ、かつそれは撹拌され得る。この混合物は、５℃より低い温度を含む室温より低い温度で（例えば、４℃で）保持され得る。

弱塩基性溶液は、アルカリ性物質、アミノ酸またはそれらの混合物を含む。アルカリ性物質は、アルカリおよびアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩、硫酸塩、リン酸塩および酸化物、トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（ＴＨＡＭ）ならびにそれらの混合物からなる群から選択され得る。前記アルカリ性物質は、ナトリウム、カリウム、カルシウムまたはマグネシウムの炭酸塩、重炭酸塩、硫酸塩、リン酸塩およびそれらの混合物から選択され得る。一部の実施形態において、アルカリ性物質は、重炭酸ナトリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、三塩基性リン酸ナトリウム、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、および酸化マグネシウム、ならびにそれらの混合物からなる群から選択される。特定の実施形態において、アルカリ性物質は、重炭酸ナトリウムである。重炭酸ナトリウムが使用される場合は、その濃度は、約０．６５〜約１３％重量／体積（例えば、約８．４％重量／体積）の範囲にある。他の実施形態において、重炭酸ナトリウム濃度は、約０．６５％、約０．７０％、約０．７５％、約０．８０％、約０．８５％、約０．９０％、約０．９５％、約１．０％、約１．５％、約２．０％、約２．５％、約３．０％、約３．５％、約４．０％、約４．５％、約５．０％、約５．５％、約６．０％、約６．５％、約７．０％、約７．５％、約８．０％、約８．４％、約８．５％、約９．０％、約１０．０％、約１０．５％、約１１．０％、約１１．５％、約１２．０％、約１２．５％、または約１３．０％重量／体積であり、それらの間の全ての範囲および部分範囲を含む。弱塩基性溶液は、適切な体積の水性媒体に適切な量のアルカリ性物質を溶解させることによって調製される。この溶液のｐＨは、約７．５〜約８．５（例えば、約８．１〜約８．２）である。

薬学的に受容可能な弱塩基性溶液中の腸溶コーティングされたパンクレリパーゼビーズの混合物は、短時間のうちに調製され、腸溶コーティングされたパンクレリパーゼ酵素の効果的な分解をもたらすために必要とされる弱塩基性溶液の体積は、加えられるべきリパーゼＵＳＰ単位に応じて約５ｍＬ〜約２５ｍＬ（例えば、約５、約１２、約１５、約１７、約２０、約２２、または約２５ｍＬ）である。この混合物は、パンクレリパーゼ粉末から出発して調製される対応する混合物よりもはるかに高いリパーゼ安定性を有している。

異なる液体栄養組成物が、本発明において使用され得、それらは、本明細書に記載されているように調製され、全カロリーの約２８〜約９０％の量の炭水化物、約１〜約５５％の量の脂肪、約４〜約３２％の量のタンパク質を含み、微量養分は、ビタミンおよびミネラルについてのＲＤＡを１００％満たす。市販の液体栄養組成物（例えば、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社からのＰｅｄｉａＳｕｒｅ（登録商標）もしくはＥｎｓｕｒｅ（登録商標）もしくはＰｕｌｍｏｃａｒｅ（登録商標）またはＦｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂ社からのＦｒｅｓｕｂｉｎ（登録商標）であるが、これらに限定されない）または他の同様の製品もまた、使用され得る。

パンクレリパーゼ酵素は、液体栄養組成物中に適量に分けて（ｄｏｓｅ）入れられるべきである。用量は、臨床症状、脂肪便の程度および食事の脂肪含有量に基づいて、個々の患者に適合するようにされ得る。脂肪１ｇ当たり約２，０００〜約４，０００リパーゼ単位の用量が、投与に先立って液体栄養組成物と混合される際の出発用量として推奨される。パンクレリパーゼ酵素を含む剤形（例えば、カプセル剤）は、開けられ、その内容物は、そのままの状態でまたは弱塩基性溶液との混合物の形態で、ヘルスケア提供者によって処方されたとおりに、単一または複数用量で、液体栄養組成物中に加えられることが出来る。

本発明の方法を用いれば、パンクレリパーゼにより予備消化された栄養フォーミュラは、液体栄養組成物に加えられたリパーゼ活性の単位に対する割合として算出される、高いリパーゼ活性を有し、そのリパーゼ活性は、約８５％より高い（例えば、約９０％または約９５％である）。ほぼ室温での約３６０分間の貯蔵時間後の、液体栄養組成物に加えられたリパーゼの単位に対する割合としての平均リパーゼ活性は、約９５％より高い。

上述の記載および実験の部分から、本発明がいくつもの重要な利点を提供するものであることが分かる。本発明は、ビーズ化された（ｂｅａｄｅｄ）薬物から出発する、経腸フォーミュラの調製に好適な、簡単かつ迅速な方法を提供する。液体栄養組成物への添加後、リパーゼ活性は維持されており、得られる予備消化された栄養フォーミュラは粒子（例えば、元のままの錠剤またはその断片）を含有せず、リパーゼは、６時間より長い間にわたり、液体食中で安定なままであり、脂肪分解が効果的に達成される。

予備消化された栄養フォーミュラは、投薬を注意深く制御しながらかつ注意深く薬物が投与されるのを可能にし、ＥＰＩを患う幼児患者、高齢患者、またはその他の患者用に好適である。

本発明はまた、好適なシール容器に含有された液体栄養組成物（炭水化物、脂質、タンパク質の水性混合物）と、腸溶コーティングされたパンクレリパーゼ酵素組成物の形態の酵素剤形（例えば、カプセル１００）とを組み合わせたキットを提供する。このキットは、薬学的に受容可能な弱塩基性溶液または薬学的に受容可能な弱塩基性溶液の調製における使用のためのアルカリ性物質をさらに含み得る。

特定数のカプセルなどの剤形を含有するガラス瓶が、好適である。あるいは、本発明の組成物または剤形は、「ブリスターパック」に単位剤形として包装され得る。当該組成物または剤形の安定性を改善するために、それらは、シールされた、防水パッケージで貯蔵されるべきである。好適な防水パッケージの非限定的な例としては、ガラスジャー、防湿樹脂またはコーティングを含むプラスチックジャー、アルミニウム蒸着プラスチック（例えば、Ｍｙｌａｒ）包装などが挙げられる。語句「防水」とは、容器容積１立法センチメートル（ｃｍ^３）当たり年間約０．５ｍｇ未満の水という透水性を有するパッケージをいう。当該組成物または剤形が貯蔵される容器（例えば、ボトル）は、任意の適切なクロージャー、特に、貯蔵の間の水分の進入を最小限に抑えるクロージャーで閉じられ得る。液体栄養組成物と共に投与されるべき剤形を含有するパッケージはまた、パッケージ内の湿気を減少させることが可能な乾燥剤（すなわち、水を吸収する、水と反応する、または水を吸着する物質）、例えば、パッケージ内に閉じ込められた大気から水分を「取り除く」ことが可能な乾燥剤カプセル（例えば、分子篩、粘土、シリカゲル、活性炭、およびそれらの混合物）も含有し得る。また、経口薬学的単位用量を包装する場合に、セルロース系材料（例えば、綿）の「詰め物」を容器の上部に加えて容器の上部にある空間を埋め、それにより内容物の移動を最小限に抑えることは、常套手段である。

２つのキット成分（液体栄養組成物、腸溶コーティングされたパンクレリパーゼビーズを含む剤形および必要に応じてアルカリ性物質）は、１つの単一のパックに一緒に包装され得る。

このキットは、製品の安定性を確保する任意の好適なパッケージで貯蔵され得る。パッケージは、輸送および／または貯蔵の間の水分の進入を最小限に抑えるべきである。例えば、パッケージは、ねじ込みクロージャーまたはプレス嵌めクロージャーを有するガラスジャーまたはプラスチックジャーであり得る。

本発明はまた、小児患者または成人患者への本発明の方法を用いて得られた予備消化された栄養フォーミュラの投与方法において、ａ）予備消化された栄養フォーミュラを投与バッグに移すステップと、ｂ）予備消化された栄養フォーミュラを、バッグから経腸チューブを介して患者に投与するステップと、を含むことを特徴とする方法も包含する。予備消化された栄養フォーミュラは、その投与前に緩やかに撹拌され得る。この方法は、腸溶コーティングされたパンクレリパーゼ酵素から出発する、予備消化された栄養フォーミュラの、容易かつ正確な、短時間の調製を可能にする。

実験２．２および４．１１を除く全ての実験を、腸溶性ポリマーのヒプロメロースフタル酸エステル（ＨＰ５５）でコーティングされた、パンクレリパーゼ原料と賦形剤（例えば、クロスカルメロースナトリウム、水素添加ヒマシ油、コロイド状二酸化ケイ素、微結晶性セルロース、およびステアリン酸マグネシウム）とのブレンドである、パンクレリパーゼミニ錠剤（ＭＴ）またはマイクロ錠剤（ＭＣＴ）のいずれかの、腸溶コーティングされたパンクレリパーゼビーズを用いて行い、これらのＭＴおよびＭＣＴは、６％未満の含水率を有するＨＰＭＣカプセルに含有されており、それらは、Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）の名で市販されている。当業者であれば、代替の腸溶性ポリマーおよび賦形剤が、腸溶コーティングされたパンクレリパーゼビーズにおいて使用され得ることを認識するであろう。

以下の実験において使用される液体栄養組成物（または液体食）は、タンパク質：６．２５ｇ／１００ｍＬ、脂肪：４．９２ｇ／１００ｍＬ、炭水化物：２０．２ｇ／１００ｍＬ（１．５ｃａｌ／ｍｌ）の含有量を有する（Ｅｎｓｕｒｅ Ｐｌｕｓ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ社、２００ｍＬボトル、香味：イチゴ）。代替の配合物が、患者の個人の必要に応じて使用され得る。

１）脂肪分解活性の測定は、使用される基質（オリーブ油）中のエステル化された脂肪酸の加水分解から形成される遊離脂肪酸のｐＨスタット法による滴定に基づく、パンクレリパーゼＵＳＰモノグラフに記載されているリパーゼアッセイの概要手順に準じて行われる。これは、以下の原理に基づくものである：リパーゼは、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の形成に繋がるトリグリセリドの加水分解を触媒する。時間に基づく形成されたＦＦＡの滴定は、リパーゼの酵素活性の測定を与え、その酵素活性は、１Ｕ＝毎分１マイクロモルのＦＦＡの形成という単位で表され得る。反応は、ｐＨ値が固定値と比較して変化した場合に水酸化ナトリウム（滴定剤）の添加を与える実験系によって一定のｐＨ値を維持することによって起こる（ｐＨスタット法）。時間に基づく添加された滴定剤の量は、トリグリセリドに対するリパーゼ作用によって形成されたＦＦＡの量に対応する。適切な量の基質を用い、かつ酵素が安定である実験条件下で作業すれば、時間に基づくＦＦＡ形成についての線形動態が得られ得る。曲線の傾斜｛添加された滴定剤＝ｆ（時間，分）｝により、リパーゼ酵素活性が与えられる。

２）タンパク質分解活性の測定は、パンクレリパーゼＵＳＰモノグラフに記載されている概要手順に準じて行われる。

３）デンプン分解活性の測定は、パンクレリパーゼＵＳＰモノグラフに記載されている概要手順に準じて行われる。

実験１．液体食中のパンクレリパーゼマイクロ錠剤の機械的分解
実験１．１．
液体食（タンパク質：６．２５ｇ／１００ｍＬ、脂肪：４．９２ｇ／１００ｍＬ、炭水化物：２０．２ｇ／１００ｍＬ、Ｅｎｓｕｒｅ Ｐｌｕｓ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ社：）を含有するボトルを振盪し、次いで開け、２００ｍＬの内容物を、５００ｍＬプラスチック容器およびステンレス鋼の非対称ブレードを備えたＳｔｅｒｉｌｍｉｘｅｒ １２ Ｌａｂホモジナイザー（混合速度範囲：１２，５００〜１８，０００ｒｐｍ）（ＰＢＩ）に注入する。４０，０００リパーゼＵＳＰ単位に相当するパンクレリパーゼＭＣＴ（Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）、６１リパーゼＵＳＰ単位／ｍｇ）の量（製品約６００ｍｇ≒マイクロ錠剤４０個、Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）５０００カプセル８個）液体食に含有されている脂肪１ｇ当たり約４，０００リパーゼＵＳＰ単位）を添加し、ブレンダーを閉じ、ブレンダーのポジション９＝１６，５００ｒｐｍの混合速度で装置を１分間始動させる。

ブレンディング後に、以下のやり方でマイクロ錠剤の分解を確認する。

ａ）ブレンダーの内容物の半分を、円錐ゴムシールを有する濾過フラスコ中のフィルターるつぼ（３０ｍＬのフィルターるつぼ、焼結ガラスディスク多孔度０）に通して濾過して、液体食の均質性および元のままのマイクロ錠剤の不在を評価する。フィルターディスクを調べる：元のままの錠剤も認知できる大きさの断片も検出されず、したがって、この製品は分解されたと見なされ、さらに、濾液は、未処理の液体食と比べて均質である。

ｂ）ブレンダーの未濾過の内容物の残りの部分を、２００ｍＬビーカーに移し入れ、このビーカーを覆い、そのホモジネートを室温にて３０分間放置しておき、次いで、底部を目視により確認し、均質であることが分かる。その結果を表１にまとめる。

実験１．２
１分間および２分間にわたりより低い混合速度率（ｍｉｘｉｎｇ ｓｐｅｅｄ ｒａｔｅ）（装置のポジション７に対応する１５，５００ｒｐｍ）を用いて実験１．１の全手順を繰り返し、マイクロ錠剤の分解を実験１の同じやり方で確認する。結果を表１に報告する。

回転式ブレンダーを用いての１〜２分のブレンディング時間は、マイクロ錠剤中に存在する膵酵素を液体食中に均質に分散させる有効な手段である。このインビトロ実験は、液体食中のマイクロ錠剤の完全な分解が、１５，０００ｒｐｍ（家庭用ブレンダーにおいて利用可能な速度）での１分間にわたるブレンディングによって達成されることを示している。

実験２．パンクレリパーゼビーズを用いて調製された酵素−栄養フォーミュラ（酵素−栄養フォーミュラ／パンクレリパーゼビーズ）中および液体栄養組成物とパンクレリパーゼ粉末との混合物（液体栄養組成物／パンクレリパーゼ粉末）中のリパーゼの安定性および放出の測定
実験１．１および１．２に記載したように、４０，０００リパーゼＵＳＰ単位に相当する量（Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）５０００カプセル８個）のマイクロ錠剤を２００ｍＬの液体食に添加して、約４０００リパーゼＵＳＰ単位／ｇ脂肪を得、１５，５００ｒｐｍの混合速度で１分間にわたりブレンドする。その酵素−栄養フォーミュラ／パンクレリパーゼビーズにおいて、室温での３６０分間の貯蔵の間、リパーゼ活性を測定する。

もう１つの試料を、パンクレリパーゼ粉末（８８リパーゼＵＳＰ単位／ｍｇ；パンクレリパーゼマイクロ錠剤Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）に含有されている同じパンクレリパーゼバッチ）を同じ用量で液体栄養組成物に添加し、１分間手振盪して調製する。この粉末との比較を、ブレンディング手順の結果としてのパンクレリパーゼマイクロ錠剤中のリパーゼ活性のあらゆる減少を検出するために行う。

実験２．１．酵素−栄養フォーミュラ／パンクレリパーゼ中のリパーゼ活性
液体食のボトルを振盪し、開け、２００ｍＬの内容物を、５００ｍＬプラスチック容器およびステンレス鋼の非対称的ブレードを備えたＳｔｅｒｉｌｍｉｘｅｒ １２ Ｌａｂブレンダーに注入する。４０，０００リパーゼＵＳＰ単位（液体食に含有されている脂肪１ｇ当たり約４，０００リパーゼＵＳＰ単位）に相当する量のマイクロ錠剤をブレンダーに添加し、ブレンダーを閉じ、１５，５００ｒｐｍに対応するブレンダーのポジション７の混合速度で装置を１分間動作させる。マイクロ錠剤の完全な分解を、目視検査により確認する。ブレンディングの直後に、ホモジネートの３ｍＬアリコートを、５０ｍＬ容量フラスコに移し入れ、冷精製水で容量まで希釈し、その溶液（理論リパーゼ濃度は１２ＵＳＰ単位／ｍｌである）を、短時間振盪する。これがＴ０試料である。リパーゼ活性を測定するために、１ｍＬのＴ０試料を、リパーゼアッセイ（Ｌｉｐａｓｅ Ａｓｓａｙ）パンクレリパーゼＵＳＰモノグラフに従って直ちに滴定する。液体食に導入された理論総リパーゼ活性に対するリパーゼ活性の割合を求める。

容器を閉じ、撹拌せずに室温でホモジネートを放置しておき、各アリコートを採取する前に、ホモジネートを短時間振盪する。１０、２０、３０、４０、６０、１２０、２４０、３６０分後に、室温で貯蔵されたホモジネートの新たな３ｍＬアリコートを各時点で採取し、Ｔ０試料について記載した希釈および分析に従うことによって、同じ手順を繰り返す。

全実験を、２つの異なる日に２回繰り返す（反復試験１および２）。結果を表２に示す。図８も参照されたい。

実験２．２．液体栄養組成物／パンクレリパーゼ粉末中のリパーゼ活性
液体食のボトルを振盪し、開け、次いで２００ｍＬの内容物を、５００ｍＬプラスチック容器（ブレンダーに使用された同じ種類）に注入する。４０，０００リパーゼＵＳＰ単位、液体食に含有されている脂肪１ｇ当たり約４，０００リパーゼＵＳＰ単位）に相当する量のパンクレリパーゼ粉末（実験２．１に使用されたＭＣＴに含有されている同じロットの原料）を添加し、容器を閉じ、１分間にわたり十分に手振盪する。液体栄養組成物／パンクレリパーゼ粉末の３ｍＬアリコートを、５０ｍＬ容量フラスコに移し入れ、冷精製水で容量まで希釈し、その溶液（理論リパーゼ濃度＝１２ＵＳＰ単位／ｍＬ）を短時間振盪して、それをホモジナイズする。これがＴ０試料である。リパーゼ活性を測定するために、１ｍＬのＴ０試料を、リパーゼアッセイ（Ｌｉｐａｓｅ Ａｓｓａｙ）パンクレリパーゼＵＳＰモノグラフに従って直ちに滴定する。液体食に導入された理論総リパーゼ活性に対するリパーゼ活性の割合を求める。

１０、２０、３０、４０、６０、１２０、２４０、および３６０分後に、室温で貯蔵された液体栄養組成物／パンクレリパーゼ粉末の新たな３ｍＬアリコートを各時点で採取し、Ｔ０試料について記載した希釈および分析に従うことによって、同じ手順を繰り返す。

全実験を、２つの異なる日に２回繰り返す（反復試験１および２）。結果を表３に示す。図８も参照されたい。

上記の実験から、酵素−栄養組成物／パンクレリパーゼＭＣＴにおいてはリパーゼ活性が常に理論値（すなわち、マイクロ錠剤として液体食に添加されたリパーゼの単位）通りであることが明らかである。これは、酵素の放出がブレンディングステップの直後に完結し、リパーゼが少なくとも６時間にわたり液体食中で安定なままであることを実証している。さらに、これらの結果は、ブレンディングステップの間に生じた酵素の劣化はなく、分解したマイクロ錠剤からの酵素の放出は完全であることを裏付けている。

実験３．パンクレリパーゼＭＣＴ（ブレンディングにより分解）により予備消化された液体食フォーミュラ中のリパーゼ活性の有効性
液体栄養組成物とＭＣＴとのブレンディング後に得られる予備消化された食物におけるリパーゼ活性の有効性を、液体食フォーミュラに含有されているエステル化脂肪酸（ＴＡＧ＝トリグリセリド；ＤＡＧ＝ジグリセリド；ＭＡＧ＝モノグリセリド）の遊離脂肪酸（ＦＦＡ）への脂肪分解の動態を測定することによって実施する。この実験は、下記の一般方針に従った。

ａ）液体食フォーミュラ中のリパーゼの量は、最大一日投与量に基づき、２８００ＵＳＰ Ｕ／ｇ脂肪である。

ｂ）上に記載したとおりの組成を有する液体食フォーミュラを使用し、最初におよび時間の関数としてｐＨ測定を行う（ｐＨ電極を備えた５０ｍＬの恒温容器（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｔｅｄ ｖｅｓｓｅｌ）中で２５℃にて行われる実験）。

ｃ）実験１および２の同じバッチのパンクレリパーゼマイクロ錠剤を使用する。

ｄ）８時間にわたる、０（マイクロ錠剤の添加前）、５、１０、１５、３０、６０、１２０、１８０、２４０、３００、３６０、４２０、および４８０分の時点での、脂肪分解生成物の動態プロファイルの測定。脂質抽出およびＴＡＧ、ＤＡＧ、ＭＡＧおよびＦＦＡの分析を、ＴＬＣ−ＦＩＤ分析法により行う。

ｅ）パンクレリパーゼＵＳＰモノグラフに記載されているアッセイを用いての、脂肪分解動態について選択された同じ期間の間の同じ時点での膵リパーゼ活性のアッセイによる、リパーゼ安定性プロファイルの測定。

実験３．１ 脂肪分解反応動態（Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｌｉｐｏｌｙｓｉｓ ｒｅａｃｔｉｏｎ）
液体食のボトルを振盪し、２００ｍＬの内容物をブレンダー（Ｗａｒｉｎｇ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｂｌｅｎｄｅｒ ８０１０Ｅ ３８ＢＬ４０型）に注入する。２８，０００リパーゼＵＳＰ単位に相当する量のパンクレリパーゼマイクロ錠剤（６１リパーゼＵＳＰ単位／ｍｇ）を添加する＝液体食に含有されている脂肪１グラム当たり約２，８００リパーゼＵＳＰ単位。１分間のブレンディング（混合速度：１８，０００ｒｐｍ）後、マイクロ錠剤の完全な分解を、目視検査により確認する。５０ｍＬのその混合物を、ｐＨ電極を備えた５０ｍＬの恒温容器に移し入れる。脂肪分解反応を、撹拌なしの条件下で４８０分間にわたり２５℃で維持し、各サンプリング時点において、反応のｐＨおよび温度を測定する。液体食中に存在する脂質の初期量（総脂質抽出およびＴＬＣ−ＦＩＤ分析）は、マイクロ錠剤を添加する前に「そのままの状態で」測定する（時間０試料）。

実験３．２．サンプリングおよび脂質抽出
実験の各時点（５、１０、１５、３０、６０、１２０、１８０、２４０、３００、３６０、４２０、４８０分）において、脂肪分解生成物を定量的に回収するために、１ｍＬの反応混合物を抜き取る。各サンプリングの前に、反応混合物を、機械的撹拌器で短時間ホモジナイズする。抽出は、Ｆｏｌｃｈの手順に準じて行う。

実験３．３．脂肪分解生成物の定量分析
ＴＡＧ、ＤＡＧ、ＭＡＧおよびＦＦＡの定量分析を、検体検出のためのフレームイオン化検出器と結合された薄層クロマトグラフィー技術によって行う。各脂肪分解生成物についての標準化合物（ＴＡＧについてはトリオレイン；ＤＡＧについては１，２−ジオレイン；ＭＡＧについては１−モノオレイン；ＦＦＡについてはオレイン酸）を、検量線の作成のために使用する。抽出された有機層における適切な内部標準の回収率を対応する検量線を用いることによって求めることにより、全体的な抽出収率を評価する。全ての分析を、二重反復試験で行う。

実験３．４．脂肪分解レベルの計算
加水分解の時に、ＴＡＧ１分子は、最大３分子のＦＦＡを放出し得る。加水分解（または脂肪分解）レベルは、通常、食物トリグリセリド（ＴＡＧ０）から放出されるアシル鎖に対する割合として定義される。
Ｌ％＝１００×ＦＦＡ／３×ＴＡＧ_０

脂肪の完全な吸収には、ＴＡＧ１分子からの２つのＦＦＡの放出に相当する、食物ＴＡＧからＭＡＧへの転化、すなわち、６６．６％の上記の定義に従う脂肪分解レベルしか必要とされない。本明細書では、酵素加水分解過程の間の脂肪吸収能力を直接反映する脂肪分解レベルの定義が使用される。脂肪分解レベルは、本明細書において、「腸管吸収性の」アシル鎖、すなわちＦＦＡおよびＭＡＧに転化された全食物ＴＡＧアシル鎖の割合として表される。これは、以下の式によって定義され、式中、ＴＡＧ、ＤＡＧ、ＭＡＧおよびＦＦＡは、加水分解過程の間の所与の時間に回収された残留トリグリセリドおよび脂肪分解生成物のミリモルの単位での量である。
Ｌ％＝１００×（ＦＦＡ＋ＭＡＧ）／３×ＴＡＧ_０＝１００×（ＦＦＡ＋ＭＡＧ）／３ＴＡＧ＋２ＤＡＧ＋ＭＡＧ＋ＦＦＡ

この定義によれば、１００％脂肪分解は、ＴＡＧ１分子からＭＡＧ１分子およびＦＦＡ２分子への転化に相当する。この脂肪分解レベルの定義は、ＭＡＧの加水分解の可能性を考慮しておらず、後者の過程は、脂肪吸収に不可欠ではない。分析の結果を、以下の表４〜７および図１０〜１２に報告する。

上記のデータから、パンクレリパーゼマイクロ錠剤（ブレンディングにより分解）で予備消化された液体食中の（リパーゼの脂肪分解活性の結果としての）ＴＡＧレベルの顕著な低下が観察されることが明らかである。ＴＡＧの濃度は、最初の１時間で初期値の約４５％まで下がり、次いで、実験の残りの部分でより少ない程度に低下し続け、８時間後には約７０％の低下に達した。さらに、脂肪分解について、これらの結果は、本発明の方法を用いて得られる液体栄養組成物が、１時間後には約１６％および８時間後には約２８％というトリグリセリドから放出されたアシル鎖の割合を有することを示しており、遊離脂肪酸アシル鎖およびモノグリセリドアシル鎖に転化されたトリグリセリドアシル鎖の割合は、１時間後には約２８％および８時間後には約３６％である。

実験４．重炭酸ナトリウム溶液中のパンクレリパーゼビーズ（マイクロ錠剤およびミニ錠剤）の分解
重炭酸ナトリウム溶液の調製
溶液Ａ）１３％重量／体積の重炭酸ナトリウム溶液：１３．０ｇの重炭酸ナトリウムを、容量フラスコ中の１００ｍＬの水に添加し、振盪する；この塩は、完全には溶解しない（飽和溶液）。

溶液Ｂ）８．４％重量／体積の重炭酸ナトリウム溶液：８．４ｇの重炭酸ナトリウムを、容量フラスコ中の１００ｍＬの水に添加し、溶解するまで振盪する。

溶液Ｃ）０．６５％重量／体積の重炭酸ナトリウム溶液：０．６５ｇの重炭酸ナトリウムを、容量フラスコ中の１００ｍＬの水に添加し、溶解するまで振盪する。

実験４．室温における５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム溶液中での５，０００リパーゼＵＳＰ単位／カプセルの腸溶コーティングされたパンクレリパーゼ酵素マイクロ錠剤（Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）マイクロ錠剤５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／ｃｐｓ）の単一用量単位の分解時間
カプセル１個の内容物を、１５ｍＬビーカー中の５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウムに、撹拌せずに添加する。この試料を、室温にて、卓上条件（ｂｅｎｃｈ ｔｏｐ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）で、撹拌せずに貯蔵する。製品の分解（すなわち、製品のいずれの残留物も、容易に知覚できる堅いコアを有さない柔らかい塊である）が観察されるまで、一定時間ごとに目視観測を行い、浸漬されているマイクロ錠剤の外観を記録する。このマイクロ錠剤は、上記の条件における２０分間の貯蔵後に分解されるようである。いずれの残っている残留物も、約５５分後に完全に溶解する。図１３〜１８は、８．４％重炭酸塩溶液に浸漬させたマイクロ錠剤の、撹拌なしでの０、１０、２０、３５、４５、および５５分後の写真である。

実験４．２．室温における５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム溶液中での２０分間の貯蔵後の５，０００リパーゼＵＳＰ単位／カプセルのパンクレリパーゼ酵素マイクロ錠剤（Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）マイクロ錠剤５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／ｃｐｓ）の単一用量単位の分解
１用量単位の分解効果を、室温における５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム溶液中での２０分間の貯蔵後に、製品の残っている残留物の穏やかな撹拌後に評価する：少しの断片のみが観察される。図１９〜２１は、撹拌せずに８．４％重炭酸塩溶液に浸漬させたマイクロ錠剤の０、１０、２０分後の写真である。図２２は、２０分間の浸漬の終わりにおける穏やかな撹拌後の残っている残留物である。

実験４．３．室温における５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム溶液中での２０分間の貯蔵後の５，０００リパーゼＵＳＰ単位に相当する量のパンクレリパーゼミニ錠剤の分解
実験４．２を、５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕに相当するパンクレリパーゼミニ錠剤を用いて繰り返す。この場合の方が、８．４％重炭酸ナトリウム溶液への２０分間の浸漬後に撹拌した試料中に、より多くの断片が観察される。

図２３〜２５は、撹拌せずに８．４％重炭酸塩溶液に浸漬させたミニ錠剤の０、１０、および２０分後の写真である。図２６は、２０分間の浸漬の終わりにおける穏やかな撹拌後の残っている残留物のものである。

実験４．４．室温における５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム溶液中での３０分間の貯蔵後の５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕに相当する量のパンクレリパーゼミニ錠剤の分解
この実験において、重炭酸ナトリウム溶液中のミニ錠剤は、撹拌なしでのより長い滞留時間（３０分）を有する。終了点において、穏やかな撹拌後に、残っている柔らかい塊は完全に消失した（図２７〜２８）。

実験４．５．５，０００リパーゼＵＳＰ単位／カプセルのパンクレリパーゼマイクロ錠剤（Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）マイクロ錠剤５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／ｃｐｓ）を添加した８．４％重炭酸ナトリウム溶液のｐＨ測定［^＊分解段階＝０〜２４０分］
室温における５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム溶液のｐＨを、「そのままの状態で」および単一用量単位の内容物の添加から５、１０、１５、２０、３０、８０、１２０、１８０、および２４０分後に測定する。ｐＨの著しい変化は認められない。表９にその得られたｐＨ値を示す。

実験４．６．室温における５ｍＬの１３％重炭酸ナトリウム溶液中での５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／カプセルのパンクレリパーゼ酵素マイクロ錠剤（Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）マイクロ錠剤５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／ｃｐｓ）の単一用量単位の分解
カプセル１個の内容物を、１５ｍＬビーカー中の５ｍＬの１３％重炭酸ナトリウムに、撹拌せずに添加する。この試料を、室温にて、卓上条件で、撹拌せずに貯蔵する。製品の分解が観察されるまで、一定時間ごとに目視観測を行い、浸漬されているマイクロ錠剤の外観を記録する。このマイクロ錠剤は、上記の条件における２０分間の貯蔵後に完全に溶解する。図２９〜３１は、１３％重炭酸塩溶液中に浸漬させたマイクロ錠剤の、撹拌なしでの０、１０、および２０分後の写真である。

実験４．７．室温における５ｍＬの０．６５％重炭酸ナトリウム溶液中での５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／カプセルのパンクレリパーゼ酵素マイクロ錠剤（Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）マイクロ錠剤５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／ｃｐｓ）の単一用量単位の分解
カプセル１個の内容物を、１５ｍＬビーカー中の５ｍＬの０．６５％重炭酸ナトリウムに、撹拌せずに添加する。この試料を、室温にて、卓上条件で、撹拌せずに貯蔵する。製品の分解が観察されるまで、一定時間ごとに目視観測を行い、浸漬されているマイクロ錠剤の外観を記録する。上記の条件下での２０分後、全てのマイクロ錠剤は、完全には分解されていない（小さい堅いコアが依然として見える）。３５分後は、少しの柔らかい塊のみが観察される。図３２〜３３は、０．６５％重炭酸塩溶液中に浸漬させたマイクロ錠剤の、撹拌なしでの０および３５分後の写真である。

実験４．８．室温における５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム溶液中での５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／カプセルのパンクレリパーゼ酵素マイクロ錠剤（Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）マイクロ錠剤５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／ｃｐｓ）の８単位（５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／カプセル＝４０，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ）のプールされた試料の分解
４０，０００リパーゼＵＳＰ単位に相当する５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／ｃｐｓのカプセル８個の内容物を、３０ｍＬビーカー中の５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウムに、撹拌せずに添加する。この試料を、室温にて、卓上条件で、撹拌せずに貯蔵する。製品の分解が観察されるまで、一定時間ごとに目視観測を行い、浸漬されているマイクロ錠剤の外観を記録する。上記の条件での２０分後、全てのマイクロ錠剤は、完全には分解されていない（小さい堅いコアが依然として見える）。約４０〜４５分後は、柔らかい塊のみが観察される。図３４〜３６は、８．４％重炭酸塩溶液中に浸漬させたマイクロ錠剤の、撹拌なしでの０、２０、および４５分後の写真である。

実験４．９．４℃における５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム溶液中での５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／カプセルのパンクレリパーゼ酵素マイクロ錠剤（Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）マイクロ錠剤５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／ｃｐｓ）の８単位（５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／カプセル＝４０，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ）のプールされた試料の分解
約４０，０００リパーゼＵＳＰ単位に相当する８個のカプセルの内容物を、３０ｍＬビーカー中の５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウムに、撹拌せずに添加する。この試料を、４℃にて、撹拌せずに貯蔵する。製品の分解が観察されるまで、一定時間ごとに目視観測を行い、浸漬されているマイクロ錠剤の外観を記録する。上記の条件での２０分後、マイクロ錠剤のほとんどが依然として元のままであり、約４５分後は、少数の柔らかい塊しか観察されない。図３７〜３８は、４℃において８．４％重炭酸塩溶液中に浸漬させたマイクロ錠剤の、撹拌なしでの０および４５分後の写真である。

実験４．１０．５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／カプセルのパンクレリパーゼ酵素マイクロ錠剤（Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）マイクロ錠剤５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／ｃｐｓ）の８単位（５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／カプセル＝４０，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ）のプールされた試料の分解時間に対する８．４％重炭酸ナトリウム溶液の体積の影響
パンクレリパーゼマイクロ錠剤（４０，０００リパーゼＵＳＰ単位）分解時間に対する８．４％重炭酸ナトリウム溶液の体積の影響を、５、１０、１５、２０、および２５ｍＬの媒体中に懸濁させたマイクロ錠剤について、室温において、撹拌せずに評価する。一定時間ごとに目視観測を行い、浸漬されているマイクロ錠剤の外観を記録する。重炭酸ナトリウム溶液の体積増加に伴うマイクロ錠剤分解時間の漸減が観察される。体積を５ｍＬから１０ｍＬに増加することにより、分解時間が約１０分短縮し（４５分に対して３５分）、１５ｍＬの試料は、２０分後にマイクロ錠剤のほとんどが依然として元のままであることを示すが、２０および２５ｍＬの試料においては、２０分（５ｍＬの８．４％重炭酸塩溶液中での５，０００Ｕの個々の用量単位の分解に必要とされる同じ時間）後に柔らかい塊しか観察されない。「そのままの状態で」のおよびマイクロ錠剤の２０分間の分解段階後の２５ｍＬの重炭酸ナトリウム溶液のｐＨは、それぞれ８．１１６および７．９７９である。図３９〜４１は、撹拌なしでの２０分後に、室温において漸増体積（５、１５、および２５ｍＬ）の８．４％重炭酸塩溶液に浸漬させたマイクロ錠剤のものである。

実験４．１１．室温における２５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム溶液中での４０，０００リパーゼＵＳＰ単位に相当するパンクレリパーゼ酵素ペレット（Ｃｒｅｏｎ（登録商標）遅延放出カプセル、２４，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／ｃｐｓ、市販製品、使用期限０２７２０１２）のプールされた試料の分解時間
約４０，０００リパーゼＵＳＰ単位に相当するいくつかのカプセルの内容物を、５０ｍＬビーカー中の２５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウムに、撹拌せずに添加する。この試料を、室温にて、撹拌せずに貯蔵する。製品の分解が観察されるまで、一定時間ごとに目視観測を行い、浸漬されているマイクロ錠剤の外観を記録する。上記の条件での２０分後、全ての顆粒が、時間０と比較して何らの著しい外観の変化なしに、依然として元のままであり、短時間の撹拌後、顆粒の固まった塊（ｐａｃｋｅｄ ｍａｓｓ）が形成される。６０分後も、堅いコアを有する変わらない量の顆粒が依然として存在し、これは、別の短時間の撹拌ステップ後も分解しない。さらなる制御において、９０分では少数の顆粒が依然として観察され、完全な分解は１２０分後に起こる。図４２〜４５は、室温において８．４％重炭酸塩溶液中に浸漬させた腸溶コーティングされた球体（Ｃｒｅｏｎ（登録商標））の０、２０、９０、および１２０分後の写真を示している。

実験５．８．４％重炭酸ナトリウム溶液中でのパンクレリパーゼ酵素活性の測定
室温および４℃で貯蔵した、重炭酸ナトリウム溶液に溶解させたパンクレリパーゼ酵素マイクロ錠剤に含有されている３つの主要酵素の活性を、５，０００リパーゼＵＳＰ単位の単一用量単位について、および４０，０００リパーゼＵＳＰ単位のより高い用量について評価する。上に記載した方法を用いて活性を確認する。

実験５．１．５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム溶液に溶解させた^＊５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／カプセルのパンクレリパーゼ酵素マイクロ錠剤（Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）マイクロ錠剤５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／ｃｐｓ）の単一用量単位のリパーゼ活性（室温と４℃との比較）［^＊分解段階＝室温で２０分］
カプセル１個の内容物を、１５ｍＬビーカー中の５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウムに、撹拌せずに添加する。この試料を、室温にて、卓上条件で、撹拌せずに貯蔵する。２つの独立した試料を調製する（１Ａおよび１Ｂ）。２０分後に、そのパンクレリパーゼ／重炭酸塩試料を撹拌し、１２０μｌアリコートを１０ｍＬの水に希釈し、１ｍＬのこの溶液について、リパーゼ活性を、パンクレリパーゼＵＳＰモノグラフに記載されているリパーゼアッセイに従って測定する（時間０）。ｔ０サンプリングの直後に、試料１Ａを室温で貯蔵し、一方試料１Ｂを４℃で保持する。ｔ０から１５、３０、４５、６０、９０、１５０、および２４０分後に、さらなる１２０μｌアリコートを試料１Ａおよび１Ｂの両方から取り出し、希釈し、直ちにリパーゼ活性についてアッセイする。パンクレリパーゼ／重炭酸ナトリウム混合物中のリパーゼの活性は、同じ試験において求められたバッチリパーゼアッセイ結果（ａｓｓａｙ）から計算される総リパーゼ活性に対する％として表される。２つの試験からの結果を、表１０ａ（室温における活性）、表１０ｂ（４℃における活性）および表１０ｃ（平均データ）にまとめる。

室温で貯蔵された混合物よりも４℃で貯蔵された混合物の方が高いリパーゼ安定性（４時間後に約２０％に対して約６０％の残留リパーゼ活性）を示す。特に、室温で貯蔵された試料については、最初の１時間で（初期リパーゼ活性の５０％未満を残しての）リパーゼ活性のほぼ垂直の降下が観察される。

実験５．２．５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム溶液に溶解させた^＊５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／カプセルのパンクレリパーゼ酵素マイクロ錠剤（Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）マイクロ錠剤５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／ｃｐｓ）の８単位（５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／カプセル＝４０，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ）のプールされた試料のリパーゼ活性［^＊分解段階＝室温で２０分］
カプセル８個の内容物を、１５ｍＬビーカー中の５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウムに、撹拌せずに添加する。この試料を、室温にて、卓上条件で、撹拌せずに貯蔵する。２つの独立した試料を調製する（２Ａおよび２Ｂ）。２０分後に、そのパンクレリパーゼ／重炭酸塩混合物を撹拌し、１５０μｌアリコートを１００ｍＬの水に希釈し、１ｍＬのこの溶液について、リパーゼ活性を、パンクレリパーゼＵＳＰモノグラフのリパーゼアッセイに従って測定する（時間０）。ｔ０サンプリングの直後に、試料２Ａを室温で貯蔵し、一方試料２Ｂを４℃で保持する。ｔ０から１５、３０、４５、６０、１２０、および２４０分後に、さらなる１５０μｌアリコートを試料２Ａおよび２Ｂの両方から取り出し、直ちにリパーゼ活性についてアッセイする。パンクレリパーゼ／重炭酸ナトリウム混合物中のリパーゼの活性は、同じ試験において求められたバッチリパーゼアッセイ結果から算出される総リパーゼ活性に対する％として表される。その結果を表１１にまとめる。

ｔ０で観測される低い初期値は、２０分間の分解段階におけるマイクロ錠剤の全量の不完全な溶解によって説明され得る。試験された貯蔵条件の両方において、測定された残留リパーゼ活性は、単一の用量単位について行われた先の実験と比べてより高い。

実験５．３．５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム溶液に溶解させた^＊５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／カプセルのパンクレリパーゼ酵素マイクロ錠剤（Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）マイクロ錠剤５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／ｃｐｓ）の単一用量単位のリパーゼ活性（室温と４℃との比較）［^＊室温での４０分間の分解段階後］
この実験における分解段階の時間は、実験２．１に比べて２倍にされる。その結果を表１２にまとめる。

分解時間を延長する場合、重炭酸塩媒体中でのさらなる滞留時間に起因して、リパーゼ安定性は、僅かに劣化する。

実験５．４．５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム溶液に溶解させた^＊５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／カプセルのパンクレリパーゼ酵素マイクロ錠剤（Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）マイクロ錠剤５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／ｃｐｓ）の８単位（５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／カプセル＝４０，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ）のプールされた試料のリパーゼ活性［^＊室温での４０分間の分解段階後］
この実験は、量の多い方のマイクロ錠剤の完全な分解を確実にするために分解段階の時間が２倍にされる以外は、実験２．２の同じ手順に従う。その結果を表１３にまとめる。

先の試験で既に観察されたように、良好なリパーゼ安定性が、４℃で貯蔵された試料懸濁液において観察される（４時間の貯蔵後に約７４％の残留活性）。２０分段階においてマイクロ錠剤の一部が完全には分解されていないので、４０，０００リパーゼＵＳＰ単位のプールされた試料については２０分から４０分に分解時間を増やすことによるリパーゼ安定性における著しい差異は認められない。

実験５．５．５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム溶液に溶解させた^＊５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／カプセルのパンクレリパーゼ酵素マイクロ錠剤（Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）マイクロ錠剤５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／ｃｐｓ）の８単位（５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／カプセル＝４０，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ）のプールされた試料のプロテアーゼ活性［^＊室温での４０分間の分解段階後］
約４０，０００リパーゼＵＳＰ単位に相当する８個のカプセルの内容物を、１５ｍＬビーカー中の５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウムに、撹拌せずに添加する。この試料を、室温にて、卓上条件で、撹拌せずに貯蔵する。２つの独立した試料を調製する（２Ａおよび２Ｂ）。４０分後に、そのパンクレリパーゼ／重炭酸塩混合物を撹拌し、１４０μｌアリコートを１００ｍＬの冷ｐＨ７．５緩衝液に希釈する。１ｍＬのこの溶液を、冷ｐＨ７．５緩衝液で２０ｍＬにさらに希釈する。プロテアーゼ活性を、パンクレリパーゼＵＳＰモノグラフに記載されている概要手順に準じて測定する（時間０）。ｔ０アリコートを採取した直後に、試料２Ａを室温で貯蔵し、一方試料２Ｂを４℃で保持する。ｔ０から３０、６０、１２０、２４０分後に、さらなる１４０μｌアリコートを試料２Ａおよび２Ｂの両方から取り出し、直ちにプロテアーゼ活性についてアッセイする。パンクレリパーゼ／重炭酸ナトリウム混合物中のプロテアーゼの活性は、バッチプロテアーゼアッセイ結果（１７７ＵＳＰ Ｕ／ｍｇ）から計算される総プロテアーゼ活性に対する％として表される。その結果を表１４にまとめる。

両方の貯蔵条件において、プロテアーゼは、４時間の間、残留活性が、室温で貯蔵された試料溶液については７５．７〜８８．７％の間、４℃で貯蔵された試料溶液については８１．９〜１０９％の間であり、良好な安定性を示す。

実験５．６．５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム溶液に溶解させた^＊５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／カプセルのパンクレリパーゼ酵素マイクロ錠剤（Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）マイクロ錠剤５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／ｃｐｓ）の８単位（５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／カプセル＝４０，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ）のプールされた試料のアミラーゼ活性［^＊室温での４０分間の分解段階後］
約４０，０００リパーゼＵＳＰ単位に相当する８個のカプセルの内容物を、１５ｍＬビーカー中の５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウムに、撹拌せずに添加する。この試料を、室温にて、卓上条件で、撹拌せずに貯蔵する。２つの独立した試料を調製する（２Ａおよび２Ｂ）。４０分後に、そのパンクレリパーゼ／重炭酸塩混合物を撹拌し、２７０μｌアリコートを５ｍＬの冷ｐＨ６．８アミラーゼ緩衝液に希釈する。１ｍＬのこの溶液を、冷ｐＨ６．８アミラーゼ緩衝液で２０ｍＬにさらに希釈する。アミラーゼ活性を、パンクレリパーゼＵＳＰモノグラフに記載されている概要手順に準じて測定する（時間０）。ｔ０アリコートを採取した直後に、試料２Ａを室温で貯蔵し、一方試料２Ｂを４℃で保持する。ｔ０から６０および１２０分後に、さらなる２７０μｌアリコートを試料２Ａおよび２Ｂの両方から取り出し、直ちにアミラーゼ活性についてアッセイする。パンクレリパーゼ／重炭酸ナトリウム混合物中のアミラーゼの安定性は、バッチアミラーゼアッセイ結果（２３８ＵＳＰ Ｕ／ｍｇ）から計算される総アミラーゼ活性に対する％として表される。結果を表１５にまとめる。

アミラーゼ活性は、室温で貯蔵された試料溶液と比較して、４℃で貯蔵された試料溶液において改善される（試験期間を通して理論酵素活性の７５〜８０％の間）。

実験５．７．５ｍＬの１３％重炭酸ナトリウム飽和溶液に溶解させた^＊５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／カプセルのパンクレリパーゼ酵素マイクロ錠剤（Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）マイクロ錠剤５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／ｃｐｓ）の単一用量単位のリパーゼ活性（室温と４℃との比較）［^＊室温での２０分間の分解段階後］
この実験は、実験２．１に記載した同じ手順に従い、唯一の違いは、利用される重炭酸ナトリウム溶液の濃度（１３％）である。パンクレリパーゼ／重炭酸ナトリウム混合物中のリパーゼの安定性は、同じ試験において求められたバッチリパーゼアッセイ結果から算出される総リパーゼ活性に対する％として表される。その結果を表１６にまとめる。

２つの貯蔵条件において観察されるリパーゼ安定性プロファイルは、８．４％重炭酸ナトリウム溶液を用いて得られたリパーゼ安定性プロファイルとほぼ完全に重ね合わせ得る。このことは、アルカリ性物質の濃度上昇がこの酵素の安定性に影響を及ぼさないということを意味している。

実験５．８．５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム溶液に溶解させた^＊５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／カプセルのパンクレリパーゼ酵素マイクロ錠剤（Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）マイクロ錠剤５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／ｃｐｓ）の８単位（５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／カプセル＝４０，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ）のプールされた試料のリパーゼ活性［^＊４℃での４５分間の分解段階後］
この実験は、実験２．２に記載した同じ手順に従い、唯一の違いは、４℃で４５分間にわたり行われる分解段階である。パンクレリパーゼ／重炭酸ナトリウム混合物中のリパーゼの安定性は、同じ試験において求められたバッチリパーゼアッセイ結果から算出される総リパーゼ活性に対する％として表される。その結果を表１７にまとめる。

観察されたリパーゼ安定性プロファイルは、室温での４０分間の分解段階を用いて得られたリパーゼ安定性プロファイルと同等である。４０，０００リパーゼＵＳＰ単位のプールされた試料については、室温での４０分間の分解段階は、この酵素の安定性に影響を及ぼさない。

実験５．９．２５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム溶液に溶解させた^＊５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／カプセルのパンクレリパーゼ酵素マイクロ錠剤（Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）マイクロ錠剤５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／ｃｐｓ）の８単位（５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／カプセル＝４０，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ）のプールされた試料のリパーゼ活性［^＊室温での２０分間の分解段階後］
約４０，０００リパーゼＵＳＰ単位に相当する８個のカプセルの内容物を、５０ｍＬビーカー中の２５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウムに、撹拌せずに添加する。この試料を、室温にて、卓上条件で貯蔵する。２つの独立した試料を調製する（２Ａおよび２Ｂ）。２０分後に、そのパンクレリパーゼ／重炭酸塩混合物を撹拌し、１５０μｌアリコートを水で２０ｍＬに希釈し、この混合物を撹拌し、１５０μｌアリコートを２０ｍＬの水に希釈し、１ｍＬのこの溶液について、リパーゼ活性を、Ｐａｎｃｒｅｌｉｐａｓｅ ＵＳＰモノグラフにおける概要手順に準じて測定する（時間０）。ｔ０アリコートを採取した直後に、試料２Ａを室温で貯蔵し、一方試料２Ｂを４℃で保持する。ｔ０から１５、３０、４５、６０、１２０、および２４０分後に、さらなる１５０μｌアリコートを溶液２Ａおよび２Ｂの両方から取り出し、直ちにリパーゼ活性についてアッセイする。パンクレリパーゼ／重炭酸ナトリウム混合物中のリパーゼの安定性は、同じ試験において求められたバッチリパーゼアッセイ結果から算出される総リパーゼ活性に対する％として表される。その結果を表１８にまとめる。

４℃で貯蔵された２５ｍＬの試料溶液のリパーゼ安定性は、５ｍＬの重炭酸塩媒体中で分解させた同じ量のマイクロ錠剤について同じ貯蔵条件において観察された同じプロファイルを示すのに対し、室温で貯蔵された２５ｍＬの試料溶液は、より小さい体積での対応する試料と比較して、改善された安定性（４時間後に、約２３％に対して約４０％の残留酵素活性）を示す。

実験５．１０．２５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム溶液に溶解させたパンクレリパーゼ粉末（４０，０００リパーゼＵＳＰ単位）のリパーゼ安定性
約４０，０００リパーゼＵＳＰ単位に相当する量のパンクレリパーゼ粉末を、５０ｍＬビーカー中の２５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウムに添加し、短時間（２分）撹拌して均質な混合物を得る。２つの独立した試料を調製する（２Ａおよび２Ｂ）。１５０μｌアリコートを２０ｍＬの水に希釈し、１ｍＬのこの溶液について、リパーゼ活性を、パンクレリパーゼＵＳＰモノグラフの概要手順を用いて測定する（時間０）。ｔ０アリコートを採取した直後に、試料２Ａを室温で貯蔵し、一方試料２Ｂを４℃で保持する。ｔ０から１５、４５、６０、１２０、および２４０分後に、さらなる１５０μｌアリコートを試料２Ａおよび２Ｂの両方から取り出し、直ちにリパーゼ活性についてアッセイする。パンクレアチン粉末／重炭酸ナトリウム混合物中のリパーゼの安定性は、同じ試験において求められたバッチリパーゼアッセイ結果（１１９ＵＳＰ Ｕ／ｍｇ）から算出される総リパーゼ活性に対する％として表される。その結果を表１９にまとめる。

他の実験で使用したパンクレリパーゼマイクロ錠剤に含有されている同じロットのパンクレリパーゼ粉末のリパーゼ安定性プロファイルは、腸溶コーティングされたパンクレリパーゼマイクロ錠剤について観察されたリパーゼ安定性プロファイルよりも顕著に低い（両方の貯蔵条件において２４０分の終了点において残留リパーゼ活性が１４〜１６％低い）。図４６に、２５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム溶液中の、分解マイクロ錠剤とパンクレリパーゼ粉末との、リパーゼ安定性プロファイルの比較を示す。

実験６．パンクレリパーゼ酵素ビーズ／重炭酸塩溶液（弱塩基性溶液中で分解させたビーズ）を添加した液体栄養組成物中のリパーゼ活性の測定
実験６．１．５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム溶液に溶解させた^＊５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／カプセルのパンクレリパーゼ酵素マイクロ錠剤（Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）マイクロ錠剤５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／ｃｐｓ）の８単位（５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／カプセル＝４０，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ）のプールされた試料の液体栄養組成物中でのリパーゼ活性［^＊分解段階＝室温で２０分］
４０，０００リパーゼＵＳＰ単位に相当する８個のカプセルの内容物を、３０ｍＬビーカー中の５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウムに、撹拌せずに添加する。２０分後に、そのパンクレリパーゼ／重炭酸塩混合物を撹拌し、２０００ｍＬの液体栄養組成物（上記の組成を参照）を含有するボトルに注入し；（「そのままの状態で」の液体栄養組成物のｐＨ＝６．４２３；液体栄養組成物＋溶解したマイクロ錠剤を含有する５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム溶液のｐＨ＝６．７２４）；容器を閉じ、短時間振盪する。結果として生じる混合物の３ｍＬアリコートを、５０ｍＬ容量フラスコに注入し、冷水で容量まで希釈し、その溶液を短時間振盪する（理論リパーゼ濃度＝１２ＵＳＰ単位／ｍｌ）。これがＴ０試料である。リパーゼ活性を測定するために、１ｍＬのＴ０試料を、パンクレリパーゼＵＳＰモノグラフのリパーゼアッセイに従って直ちにアッセイする。容器を閉じ、撹拌せずに室温で貯蔵し、各アリコートを採取する前に、その混合物を短時間振盪する。この手順を、１５、３０、６０、１２０、２４０、および３６０分後に、いずれの時点においても、室温で貯蔵した混合物の３ｍＬアリコートをサンプリングし、Ｔ０試料について記載した希釈および分析に従うことによって繰り返す。パンクレリパーゼ／重炭酸ナトリウム混合物を添加した液体栄養組成物（２００ｍｌ）中のリパーゼの安定性は、実験２．１〜２．４、２．７〜２．９で得られたバッチリパーゼアッセイ結果の平均値（７５．１リパーゼＵＳＰ Ｕ／ｍｇ）から算出される総リパーゼ活性に対する％として表される。その結果を表２０にまとめる。

リパーゼ活性は、考慮された時間範囲において安定なままであった。最初の時点（ｔ０〜３０分）において観察された僅かな減少は、２０分間の分解段階におけるマイクロ錠剤の全量の不完全な溶解によって説明され得、しかしながら、残っている残留物は全て、液体食中での最初の１時間後には完全に溶解するものと思われる。試験される液体栄養組成物にパンクレリパーゼ酵素／重炭酸塩混合物を注入した後は、リパーゼの劣化は何ら観察されない。リパーゼは、調製後少なくとも６時間は安定したままである。

実験６．２．５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム溶液中に溶解させた^＊パンクレリパーゼマイクロ錠剤（約４０，０００リパーゼＵＳＰ単位）の液体栄養組成物中のリパーゼ安定性［^＊４℃での４５分間の分解段階後］
約４０，０００リパーゼＵＳＰ単位に相当する８個のカプセルの内容物を、３０ｍＬビーカー中の５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウムに、撹拌せずに添加し、４℃で貯蔵する。４５分後に、そのパンクレリパーゼ／重炭酸塩混合物を撹拌し、液体栄養組成物のボトルに注入し、容器を閉じ、短時間振盪する。結果として生じる混合物の３ｍＬアリコートを５０ｍＬ容量フラスコに注入し、冷水で容量まで希釈し、その溶液を短時間振盪する。これがＴ０試料である。リパーゼ活性を測定するために、１ｍＬのＴ０試料を、パンクレリパーゼＵＳＰモノグラフにおける概要手順を用いて直ちにアッセイする。容器を閉じ、撹拌せずに室温で貯蔵し、各アリコートを採取する前に、その混合物を短時間振盪する。同じ手順を、１５、３０、６０、１２０、および２４０分後に、いずれの時点においても、室温で貯蔵した混合物の３ｍＬアリコートをサンプリングし、Ｔ０試料について記載した希釈および分析に従うことによって繰り返す。パンクレリパーゼ／重炭酸ナトリウム溶液を添加した試験液体栄養組成物中のリパーゼの安定性は、先の実験２．１〜２．４、２．７〜２．９で得られたバッチリパーゼアッセイ結果値の平均（７５．１リパーゼＵＳＰ Ｕ／ｍｇ）から算出される総リパーゼ活性に対する％として表される。その結果を表２１にまとめる。

リパーゼ活性は、４時間の間、試験された液体栄養組成物中で安定なままであった。この実験の間中、酵素活性の漸増が観察される。これは、液体食の成分によって誘導される（活性増大に関係する）酵素形態変化に起因し得る。より高いリパーゼ活性が測定される以外は、この実験の安定性プロファイルは、先の実験（５ｍＬの８．４％重炭酸塩溶液中により短い分解時間後に溶解させた同じ量のマイクロ錠剤を添加した液体栄養組成物）と同様である。

実験６．３．５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム溶液に溶解させた^＊５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／カプセルのパンクレリパーゼ酵素マイクロ錠剤（Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）マイクロ錠剤５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／ｃｐｓ）の８単位（５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／カプセル＝４０，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ）のプールされた試料の液体栄養組成物中のプロテアーゼ活性［^＊分解段階＝４℃で４５分］
約４０，０００リパーゼＵＳＰ単位に相当する８個のカプセルの内容物を、３０ｍＬビーカー中の５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウムに、撹拌せずに添加し、４℃で貯蔵する。４５分後に、そのパンクレリパーゼ／重炭酸塩混合物を撹拌し、液体栄養組成物のボトルに注入し、容器を閉じ、短時間振盪する。結果として生じる混合物の２．８ｍＬアリコートを２０ｍＬ容量フラスコに注入し、冷ｐＨ７．５緩衝液で容量まで希釈する。１ｍＬのこの溶液を、冷ｐＨ７．５緩衝液で５０ｍＬにさらに希釈する。プロテアーゼ活性を、パンクレリパーゼＵＳＰモノグラフの概要手順を用いて測定する（時間０）。容器を閉じ、撹拌せずに室温で貯蔵し、各アリコートを採取する前に、その混合物を短時間振盪する。同じ手順を、３０、６０、１２０、および２４０分後に、いずれの時点においても、室温で貯蔵した混合物の２．８ｍＬアリコートをサンプリングし、Ｔ０試料について記載した希釈および分析に従うことによって繰り返す。パンクレリパーゼ／重炭酸ナトリウム混合物を添加した試験される液体食中のプロテアーゼの安定性は、バッチプロテアーゼアッセイ結果（１７７ＵＳＰ Ｕ／ｍｇ）から算出される総プロテアーゼ活性に対する％として表される。その結果を表２２にまとめる。

４時間より長い間にわたり、プロテアーゼ残留活性は、理論総酵素含有量の１００％に極めて近い（またはそれよりも僅かに大きい）。

実験６．４．５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム溶液に溶解させた^＊５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／カプセルのパンクレリパーゼ酵素マイクロ錠剤（Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）マイクロ錠剤５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／ｃｐｓ）の８単位（５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／カプセル＝４０，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ）のプールされた試料の液体栄養食中のアミラーゼ活性［^＊４℃での４５分間の分解段階後］
４０，０００リパーゼＵＳＰ単位に相当する８個のカプセルの内容物を、３０ｍＬビーカー中の５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウムに、撹拌せずに添加し、４℃で貯蔵する。４５分後に、そのパンクレリパーゼ／重炭酸塩混合物を撹拌し、液体食のボトルに注入し、容器を閉じ、短時間振盪する。結果として生じる混合物の２．２ｍＬアリコートを２０ｍＬ容量フラスコに注入し、冷ｐＨ６．８アミラーゼ緩衝液で容量まで希釈し、振盪する。アミラーゼ活性を、パンクレリパーゼＵＳＰモノグラフの概要手順を用いて測定する（時間０）。容器を閉じ、撹拌せずに室温で貯蔵し、各アリコートを採取する前に、その混合物を短時間振盪する。同じ手順を、６０および１２０分後に、いずれの時点においても、室温で貯蔵した混合物の２．２ｍＬアリコートをサンプリングし、Ｔ０試料について記載した希釈および分析に従うことによって繰り返す。パンクレリパーゼ／重炭酸ナトリウム混合物を添加した試験される食物中のアミラーゼの安定性は、バッチアミラーゼアッセイ結果（２３８ＵＳＰ Ｕ／ｍｇ）から算出される総アミラーゼ活性に対する％として表される。その結果を表２３にまとめる。

アミラーゼ活性は、試験された液体食中での２時間の間中（理論総酵素含有量の８８％から７５％への）漸減を示し、したがって、減少は、重炭酸ナトリウム溶液中ほど著しくはない。

実験６．５．２５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウム溶液に溶解させた^＊５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／カプセルのパンクレリパーゼ酵素マイクロ錠剤（Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）マイクロ錠剤５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／ｃｐｓ）の８単位（５，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ／カプセル＝４０，０００リパーゼＵＳＰ Ｕ）のプールされた試料を加えた液体栄養食中のリパーゼ安定性［^＊室温での２０分間の分解段階後］
４０，０００リパーゼＵＳＰ単位に相当する８個のカプセルの内容物を、好適なビーカー中の２５ｍＬの８．４％重炭酸ナトリウムに、撹拌せずに添加する。２０分後に、そのパンクレリパーゼ／重炭酸塩混合物を撹拌し、液体食のボトルに注入し、容器を閉じ、短時間振盪する。結果として生じる混合物の３．５ｍＬアリコートを５０ｍＬ容量フラスコに注入し、冷水で容量まで希釈し、その溶液を短時間振盪する。これがＴ０試料である。リパーゼ活性を測定するために、１ｍＬのＴ０試料を、パンクレリパーゼＵＳＰモノグラフの概要手順を用いて直ちにアッセイする。容器を閉じ、撹拌せずに室温で貯蔵し、各アリコートを採取する前に、その混合物を短時間振盪する。同じ手順を、１５、３０、６０、１２０、２４０、および３６０分後に、いずれの時点においても、室温で貯蔵した混合物の３．５ｍＬアリコートをサンプリングし、Ｔ０試料について記載した希釈および分析に従うことによって繰り返す。パンクレリパーゼ／重炭酸ナトリウム混合物を添加した試験される液体栄養組成物中のリパーゼの安定性は、実験２．１〜２．４、２．７〜２．９で得られたバッチリパーゼアッセイ結果値の平均（７５．１リパーゼＵＳＰ Ｕ／ｍｇ）から算出される総リパーゼ活性に対する％として表される。その結果を表２４にまとめる。

ｔ０を除いて、リパーゼ安定性プロファイルは、より少ない体積（５ｍＬ）の８．４％重炭酸ナトリウム溶液に溶解させた製品を添加した同じ液体食において得られたリパーゼ安定性プロファイルとほぼ完全に重ね合わせ得る。このことは、重炭酸塩媒体の体積の増加がこの酵素の安定性に影響を及ぼさないということを意味している。

特定の具体的な実施形態および実施例を参照して上に例示され、説明されてはいるが、本発明は、しかしながら、その示された詳細に限定されることは意図されていない。むしろ、様々な変更を、特許請求の範囲およびその均等物の範囲内において、本発明の精神から逸脱することなく、それらの詳細について行い得る。例えば、本文書において広く記載される範囲は全て、そのより広い範囲内に入るあらゆるより狭い範囲をその範囲内に包含することが、明示的に意図される。

Claims (43)

1. 予備消化された栄養フォーミュラの調製のための方法において、前記予備消化された栄養フォーミュラを形成するために、消化酵素またはその酵素溶液と、炭水化物、脂質、タンパク質および水の混合物を含む液体栄養組成物とを混合するステップを含むことを特徴とする方法。
2. 請求項１に記載の方法において、前記液体栄養組成物に前記消化酵素またはその酵素溶液を添加するステップが、前記混合ステップに先立って行われることを特徴とする方法。
3. 請求項２に記載の方法において、前記液体栄養組成物に消化酵素を添加するステップが、前記混合ステップに先立って行われることを特徴とする方法。
4. 請求項２に記載の方法において、前記液体栄養組成物に消化酵素溶液を添加するステップが、前記混合ステップに先立って行われることを特徴とする方法。
5. 請求項１、２、３または４に記載の方法において、前記消化酵素が、パンクレリパーゼビーズの形態であることを特徴とする方法。
6. 請求項１、２、３または４に記載の方法において、前記消化酵素が、腸溶コーティングされたパンクレリパーゼビーズの形態であることを特徴とする方法。
7. 請求項１、２、３または４に記載の方法において、前記消化酵素が、腸溶コーティングされたパンクレリパーゼビーズの形態であり、前記混合ステップが、機械的ブレンディングによって行われることを特徴とする方法。
8. 請求項１、２、３または４に記載の方法において、前記混合ステップが、前記パンクレリパーゼビーズおよび液体栄養組成物の機械的ブレンディングによって、その混合物がホモジナイズされるまで行われることを特徴とする方法。
9. 請求項１、２、３または４に記載の方法において、前記その酵素溶液が、薬学的に受容可能な弱塩基性溶液中に腸溶コーティングされたパンクレリパーゼビーズを懸濁させることによって調製されることを特徴とする方法。
10. 請求項１、２、３、４、５、６、７または８に記載の方法において、混合ステップが、ほぼ室温において約１〜約２分間にわたり約１２，５００〜約１８，０００ｒｐｍの間の混合速度で連続的に行われることを特徴とする方法。
11. 請求項９または１０に記載の方法において、前記混合ステップの結果として生じる混合物が、次いで、前記液体栄養組成物のさらなる部分と合わされることを特徴とする方法。
12. 請求項１０に記載の方法において、前記混合ステップが、約１５，０００〜約１６，５００ｒｐｍの間で行われることを特徴とする方法。
13. 請求項１０に記載の方法において、前記混合ステップが、混合ブレードを有するブレンディング装置で行われ、混合されるべき前記混合物が、前記ブレードを覆うのに十分な量であることを特徴とする方法。
14. 請求項９に記載の方法において、弱塩基性溶液中のパンクレリパーゼビーズの混合物が、それが前記液体栄養組成物に添加されるまで約２０分〜約１２０分間にわたり保持されることを特徴とする方法。
15. 請求項９または１４に記載の方法において、前記薬学的に受容可能な弱塩基性溶液が、少なくとも１種のアルカリ性物質、１種のアミノ酸、またはそれらの混合物を含むことを特徴とする方法。
16. 請求項１５に記載の方法において、前記アルカリ性物質が、アルカリおよびアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩、硫酸塩、リン酸塩、酸化物、ならびにトリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（ＴＨＡＭ）、ならびにそれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする方法。
17. 請求項１６に記載の方法において、前記アルカリ性物質が、重炭酸ナトリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、三塩基性リン酸ナトリウム、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、および酸化マグネシウム、ならびにそれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする方法。
18. 請求項１７に記載の方法において、前記アルカリ性物質が、重炭酸ナトリウムであり、前記重炭酸ナトリウムの濃度が、約０．６５〜約１３％重量／体積の範囲にあることを特徴とする方法。
19. 請求項９、１４、１５、１６、１７、または１８に記載の方法において、前記薬学的に受容可能な弱塩基性溶液のｐＨが、約７．５〜約８．５の範囲にあることを特徴とする方法。
20. 請求項９、１４、１５、１６、１７、１８または１９に記載の方法において、弱塩基性溶液中のパンクレリパーゼビーズの混合物が、それが前記液体栄養組成物に添加されるまで、室温より低い温度で保持されることを特徴とする方法。
21. 請求項５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０に記載の方法において、前記パンクレリパーゼビーズが、前記液体栄養組成物の脂肪１ｇ当たり約２，０００〜約４，０００リパーゼＵＳＰ単位のほぼ間に相当する量であることを特徴とする方法。
22. 請求項１乃至２１の何れか１項に記載の方法において、前記液体栄養組成物のカロリー含有量が、全体の約２８〜９０％を炭水化物、約１〜５５％を脂肪、そして約４〜３２％をタンパク質が構成するものであることを特徴とする方法。
23. 請求項１乃至２２の何れか１項に記載の方法において、使用される前記酵素が、顆粒、錠剤、球体、ミニ錠剤、マイクロ錠剤、微粒子、微小球、マイクロカプセルまたはマイクロペレットの形態であることを特徴とする方法。
24. 請求項１乃至１６の何れか１項に記載の方法において、前記酵素が、合計で約３，０００、約４，２００、約５，０００、約６，０００、約１０，０００、約１０，５００、約１５，０００、約１６，８００、約２０，０００、約２１，０００、約２４，０００、または２５，０００ＵＳＰリパーゼ単位もしくはその倍数、または約５，０００もしくは約３０，０００ＰｈＥｕｒリパーゼ単位もしくはその倍数を有することを特徴とする方法。
25. 請求項１乃至２４の何れか１項に記載の方法において、治療有効量の酵素が添加されることを特徴とする方法。
26. 請求項１乃至２５の何れか１項に記載の方法によって得ることができる予備消化された栄養フォーミュラにおいて、前記酵素が、前記液体栄養組成物に加えられたリパーゼ活性の単位に対する割合として約８５％より高いリパーゼ活性を有することを特徴とする予備消化された栄養フォーミュラ。
27. 請求項２６に記載の予備消化された栄養フォーミュラにおいて、前記酵素が、前記液体栄養組成物に加えられたリパーゼ活性の単位に対する割合として約９０％より高いリパーゼ活性を有することを特徴とする予備消化された栄養フォーミュラ。
28. 請求項２６に記載の予備消化された栄養フォーミュラにおいて、前記酵素が、前記液体栄養組成物に加えられたリパーゼ活性の単位に対する割合として約９５％より高いリパーゼ活性を有することを特徴とする予備消化された栄養フォーミュラ。
29. 請求項２６に記載の予備消化された栄養フォーミュラにおいて、前記酵素は、ほぼ室温での約３６０分間の貯蔵時間後に、前記液体栄養組成物に加えられたリパーゼ活性の単位に対する割合として約９５％より高い平均リパーゼ活性を有することを特徴とする予備消化された栄養フォーミュラ。
30. 請求項２６に記載の予備消化された栄養フォーミュラにおいて、前記酵素が、室温での３６０分間の貯蔵時間後に、前記液体栄養組成物に加えられたリパーゼ活性の単位の割合として約１００％の平均リパーゼ活性を有することを特徴とする予備消化された栄養フォーミュラ。
31. 請求項２６乃至３０の何れか１項に記載の予備消化された栄養フォーミュラにおいて、前記脂質がトリグリセリドを含み、前記トリグリセリドの量が、約１時間後に、初期値の約４５％であることを特徴とする予備消化された栄養フォーミュラ。
32. 請求項２６乃至３０の何れか１項に記載の予備消化された栄養フォーミュラにおいて、前記脂質がトリグリセリドを含み、前記トリグリセリドの量が、約８時間後に、初期値の約３０％であることを特徴とする予備消化された栄養フォーミュラ。
33. 請求項２６乃至３０の何れか１項に記載のパンクレリパーゼにより予備消化された栄養フォーミュラにおいて、前記脂質がトリグリセリドを含み、前記トリグリセリドから放出されるアシル鎖の割合が、約１時間後に、約１６％であることを特徴とするパンクレリパーゼにより予備消化された栄養フォーミュラ。
34. 請求項３１または３３に記載の予備消化された栄養フォーミュラにおいて、前記脂質がトリグリセリドを含み、遊離脂肪酸アシル鎖およびモノグリセリドアシル鎖に転化されるトリグリセリドアシル鎖の割合が、約１時間後に、約２８％であることを特徴とする予備消化された栄養フォーミュラ。
35. 請求項２６乃至３０の何れか１項に記載の予備消化された栄養フォーミュラにおいて、前記脂質がトリグリセリドを含み、前記トリグリセリドから放出されるアシル鎖の割合が、約８時間後に、約２８％であることを特徴とする予備消化された栄養フォーミュラ。
36. 請求項３２または３５に記載の予備消化された栄養フォーミュラにおいて、前記脂質がトリグリセリドを含み、遊離脂肪酸アシル鎖およびモノグリセリドアシル鎖に転化されるトリグリセリドアシル鎖の割合が、約８時間後に、約３６％であることを特徴とする予備消化された栄養フォーミュラ。
37. 予備消化された栄養フォーミュラの投与を必要とする患者への投与方法において、
    ａ）請求項２６乃至３６の何れか１項に記載の前記予備消化された栄養フォーミュラを投与バッグに移すステップと、
    ｂ）前記パンクレリパーゼにより予備消化された栄養フォーミュラを、前記バッグから経腸チューブ、ゲージ（ｇａｕｇｅ）胃造瘻チューブ、経鼻胃チューブまたは経空腸チューブを介して前記患者に投与するステップと、
    を含むことを特徴とする方法。
38. 請求項３７に記載の方法において、前記予備消化された栄養フォーミュラが、それの投与前に緩やかに撹拌されることを特徴とする方法。
39. 小児患者または成人患者への予備消化された栄養フォーミュラの投与方法において、
    ａ．炭水化物、脂質、タンパク質および水の混合物を含む液体栄養組成物の一部をブレンダーに注入するステップと、
    ｂ．パンクレリパーゼビーズの用量の総量を前記ブレンダーに加え、前記ブレンダーを閉じるステップと、
    ｃ．結果として生じる混合物を、ほぼ室温において約１〜２分間にわたり約１５，０００〜約１６，５００ｒｐｍの間の混合速度で連続的に混合するステップと、
    ｄ．ステップｃ）において得られたブレンドを前記液体栄養組成物の別の部分と合わせて、全予備消化された栄養フォーミュラの最終体積を達成するステップと、
    ｅ．ステップｄ）の前記予備消化された栄養フォーミュラを投与バッグに移すステップと、
    ｆ．栄養供給を開始する前に緩やかに前記バッグを振盪するステップと、
    ｇ．経腸チューブを介して前記栄養供給を開始するステップと、
    を含むことを特徴とする方法。
40. パンクレリパーゼビーズの使用において、小児患者または成人患者の経腸栄養のための予備消化された栄養フォーミュラの調製のための使用であることを特徴とする使用。
41. 経腸栄養のための予備消化された栄養フォーミュラの調製のためのキットにおいて、
    ａ．炭水化物、脂質、タンパク質および水の混合物を含む液体栄養組成物と、
    ｂ．パンクレリパーゼビーズと、
    を含むことを特徴とするキット。
42. 請求項４１に記載のキットにおいて、薬学的に受容可能な弱塩基性溶液をさらに含むことを特徴とするキット。
43. 請求項４１に記載のキットにおいて、薬学的に受容可能な弱塩基性溶液を調製するためのアルカリ性物質をさらに含むことを特徴とするキット。

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