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JP2013543499A - 血球凝集素ポリペプチド、ならびにそれに関連する試薬および方法 - Google Patents

血球凝集素ポリペプチド、ならびにそれに関連する試薬および方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、グリカンとそれらに結合する相互作用パートナーとの相互作用を解析するためのシステムを提供する。本発明はまた、アンブレラトポロジーグリカンに結合するＨＡポリペプチド、ならびにこれらに関連する試薬および方法も提供する。基準のＨ５ ＨＡポリペプチド配列のアミノ酸配列と、残基１３０、１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、２２８、およびこれらの組合せからなる群から選択される残基のうちの１またはそれより多くで異なるアミノ酸配列を有するＨ５ ＨＡポリペプチドを含む結合剤を含む医薬組成物。

Description

関連出願の引用
本出願は、１０１０年１０月４日に出願した米国仮出願第６１／３８９，６３９号の利益を主張する。米国仮出願第６１／３８９，６３９号の内容全体は、本明細書中に参考として援用される。
政府援助
本発明は、米国国立衛生研究所により与えられた助成第ＧＭ５７０７３号および同第Ｕ５４ ＧＭ６２１１６号下の政府援助により行った。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
背景
インフルエンザは、大流行、流行、再流行、および大発生の長い歴史を有する。Ｈ５Ｎ１株を含めたトリインフルエンザは、高度に接触伝染性であり潜在的に致死性の病原体であるが、現在のところ、ヒトに感染する能力は限定されたものであるにとどまる。しかし、トリインフルエンザウイルスは歴史的に、その宿主特異性を変化させ、それが容易にヒトに感染することを可能とする、突然変異を累積させることが観察されている。実際、前世紀におけるインフルエンザの主要な大流行のうちの２つは、それらの遺伝子組成を変化させてヒトへの感染を可能とした、トリインフルエンザウイルスに由来していた。
概要
最新型のＨ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ９Ｎ２、およびＨ２Ｎ２のトリインフルエンザ株は、その宿主特異性を変化させ、それが容易にヒトに感染することを可能とする、突然変異を累積させうることが強く憂慮されている。したがって、これらの株におけるＨＡタンパク質が実際に、容易にヒトに感染しうる形態へと転換されうるかどうかを評価することが必要とされており、このような能力を伴うＨＡ変異体（ｖａｒｉａｎｔ）を同定することもさらに必要とされている。異なる被験体、特に、ヒトの感染を可能とするかまたは妨害するＨＡタンパク質の特徴を一般に理解することもさらに必要とされている。また、インフルエンザウイルスにより引き起こされる疾患を有効に処置するか、またはその発症を遅延させるためのワクチンおよび治療戦略も必要とされている。
本発明は、特定のグリカン結合特徴を伴う結合剤を提供する。特に、本発明は、アンブレラ様トポロジーを有するシアル化グリカンに結合する結合剤を提供する。一部の実施形態では、本発明による結合剤が、高度な親和性および／または特異性でアンブレラトポロジーグリカンに結合する。一部の実施形態では、本発明による結合剤が、コーントポロジーグリカンと比較して、アンブレラトポロジーグリカンに対する結合優先性を示す。一部の実施形態では、本発明による結合剤が、血球凝集素受容体におけるグリカンへの結合について血球凝集素と競合する。一部の実施形態では、本発明による結合剤が、アンブレラトポロジーグリカンへの結合について血球凝集素と競合する。
本発明はまた、ワクチンを含め、提供される結合剤と関連する診断用試薬および診断法ならびに治療用試薬および治療法も提供する。
本発明は特に、グリコシル化を変化させたＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、またはＨ１６のＨＡポリペプチド変異体）が、基準のＨＡポリペプチドと比較してヒトＨＡ受容体への結合の増大（または減少）を示しうることの認識を包含する。一部の実施形態では、基準のポリペプチドを、以下のうちのいずれかのＨＡポリペプチドとする：
本発明はまた特に、ＨＡのループ領域を変化させたＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、またはＨ１６のＨＡポリペプチド変異体）が、基準のＨＡポリペプチド（例えば、配列番号４３〜５２のうちのいずれかのＨＡポリペプチドを含めた）と比較してヒトＨＡ受容体への結合の増大（または減少）を示しうることの認識も包含する。
一部の実施形態では、本発明が、グリコシル化を変化させたＨ５ ＨＡポリペプチド変異体が、基準のＨＡポリペプチドと比較してヒトＨＡ受容体への結合の増大（または減少）を示しうることの認識を包含する。一部の実施形態では、基準のポリペプチドを、以下のうちのいずれかのＨＡポリペプチドとする：
本発明はまた特に、ＨＡのループ領域を変化させたＨ５ ＨＡポリペプチド変異体が、基準のＨＡポリペプチド（例えば、配列番号５０、５１、および５３〜５５のうちのいずれかのＨＡポリペプチドを含めた）と比較してヒトＨＡ受容体への結合の増大（または減少）を示しうることの認識も包含する。
図１Ａ〜１Ｃは、野生型のＨＡの例示的な配列アライメントを示す図である。配列は、ＮＣＢＩによるインフルエンザウイルスの配列データベースから得た。

図１Ａ〜１Ｃは、野生型のＨＡの例示的な配列アライメントを示す図である。配列は、ＮＣＢＩによるインフルエンザウイルスの配列データベースから得た。

図１Ａ〜１Ｃは、野生型のＨＡの例示的な配列アライメントを示す図である。配列は、ＮＣＢＩによるインフルエンザウイルスの配列データベースから得た。

図２Ａ〜Ｂは、ＨＡグリカン結合ドメインの配列アライメントを示す図である。グレー：シアル酸への結合に関与している保存的アミノ酸。赤色：Ｎｅｕ５Ａｃα２−３／６Ｇａｌモチーフへの結合に関与している特定のアミノ酸。黄色：Ｑ２２６（１３７、１３８）およびＥ１９０（１８６、２２８）の配置に影響を及ぼすアミノ酸。緑色：Ｎｅｕ５Ａｃα２−３／６Ｇａｌモチーフに結合した他の単糖（または修飾）への結合に関与しているアミノ酸。ＡＳＩ３０、ＡＰＲ３４、ＡＤＵ６３、ＡＤＳ９７、およびＶｉｅｔ０４の配列は、それらの各々の結晶構造から得た。他の配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｕｓ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）から得た。略号：

図２Ａ〜Ｂは、ＨＡグリカン結合ドメインの配列アライメントを示す図である。グレー：シアル酸への結合に関与している保存的アミノ酸。赤色：Ｎｅｕ５Ａｃα２−３／６Ｇａｌモチーフへの結合に関与している特定のアミノ酸。黄色：Ｑ２２６（１３７、１３８）およびＥ１９０（１８６、２２８）の配置に影響を及ぼすアミノ酸。緑色：Ｎｅｕ５Ａｃα２−３／６Ｇａｌモチーフに結合した他の単糖（または修飾）への結合に関与しているアミノ酸。ＡＳＩ３０、ＡＰＲ３４、ＡＤＵ６３、ＡＤＳ９７、およびＶｉｅｔ０４の配列は、それらの各々の結晶構造から得た。他の配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｕｓ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）から得た。略号：

図３は、Ｈ１ ＨＡの保存的部分配列の特徴を例示する配列アライメントを示す図である。図３Ａは、図３Ａがさらなる保存的部分配列の存在を示すことを除き、図１Ａに提示された同じアライメントを示す図である。図３Ｂは、図３Ａがさらなる保存的部分配列の存在を示すことを除き、図１Ｃに提示された同じアライメントを示す図である。 図３は、Ｈ１ ＨＡの保存的部分配列の特徴を例示する配列アライメントを示す図である。図３Ａは、図３Ａがさらなる保存的部分配列の存在を示すことを除き、図１Ａに提示された同じアライメントを示す図である。図３Ｂは、図３Ａがさらなる保存的部分配列の存在を示すことを除き、図１Ｃに提示された同じアライメントを示す図である。 図４は、Ｈ３ ＨＡの保存的部分配列の特徴を例示する配列アライメントを示す図である。図４Ａは、図４Ａがさらなる保存的部分配列の存在を示すことを除き、図１Ａに提示された同じアライメントを示す図である。図４Ｂは、図４Ａがさらなる保存的部分配列の存在を示すことを除き、図１Ｃに提示された同じアライメントを示す図である。 図４は、Ｈ３ ＨＡの保存的部分配列の特徴を例示する配列アライメントを示す図である。図４Ａは、図４Ａがさらなる保存的部分配列の存在を示すことを除き、図１Ａに提示された同じアライメントを示す図である。図４Ｂは、図４Ｂがさらなる保存的部分配列の存在を示すことを除き、図１Ｃに提示された同じアライメントを示す図である。 図５Ａ−１は、Ｈ５ ＨＡの保存的部分配列の特徴を例示する配列アライメントを示す図である。図５Ａ−１は、図５Ａ−１がさらなる保存的部分配列の存在を示すことを除き、図１Ａに提示された同じアライメントを示す図である。 図５Ａ−２は、図５Ａ−２がさらなる保存的部分配列の存在を示すことを除き、図１Ｃに提示された同じアライメントを示す図である。 図５Ｂ１〜Ｂ５は、さらなるＨ５ ＨＡの配列アライメントを示す図である。

図５Ｂ１〜Ｂ５は、さらなるＨ５ ＨＡの配列アライメントを示す図である。

図５Ｂ１〜Ｂ５は、さらなるＨ５ ＨＡの配列アライメントを示す図である。

図５Ｂ１〜Ｂ５は、さらなるＨ５ ＨＡの配列アライメントを示す図である。

図５Ｂ１〜Ｂ５は、さらなるＨ５ ＨＡの配列アライメントを示す図である。

図５Ｂ−６は、さらなるトリ４型（ＨＡ）Ｈ５Ｎ１ウイルス株を示す図である。 図６は、グリカン受容体の特異性を理解するための枠組みを示す図である。α２−３結合グリカンおよび／またはα２−６結合グリカンは、異なるトポロジーを取ることが可能である。本発明によれば、ＨＡポリペプチドがこれらのトポロジーのうちの特定のトポロジーに結合する能力により、このＨＡポリペプチドに異なる宿主、例えば、ヒトの感染を媒介する能力が付与される。この図のパネルＡで例示される通り、本発明は、２つの特に関連するトポロジーである「コーン」トポロジーおよび「アンブレラ」トポロジーを規定する。コーントポロジーは、α２−３結合グリカンおよび／またはα２−６結合グリカンが取りうるトポロジーであり、コアに結合した短鎖オリゴ糖または分枝状オリゴ糖に典型的である（特定の長鎖オリゴ糖もこのトポロジーを取りうるが）。アンブレラトポロジーは、α２−６結合グリカンだけが取りうるトポロジーであり（おそらく、α２−６結合において存在するさらなるＣ５−Ｃ６間結合により付与される、立体配座的な複数性が増大するために）、特にモチーフＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃ−を含有する、長鎖オリゴ糖または長鎖オリゴ糖分枝を伴う分枝状グリカンが主に取るトポロジーである。本明細書で記載される、ＨＡポリペプチドがアンブレラグリカントポロジーに結合する能力により、ヒト受容体への結合および／またはヒトの感染を媒介する能力が付与される。この図のパネルＢは、三糖モチーフ（それぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃおよびＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）のグリコシドのねじれ角により統御されるα２−３トポロジーおよびα２−６トポロジーを特異的に示す図である。パラメータ（θ）（これらの三糖モチーフにおけるＮｅｕ５ＡｃのＣ２原子と後続のＧａｌ糖およびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角）を、トポロジーを特徴付けるものとして規定した。θの外形と、α２−３モチーフおよびα２−６モチーフの立体配座マップとを重ね合わせることにより、α２−３モチーフは１００％のコーン様トポロジーを取り、α２−６モチーフはコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングすることが示される（パネルＣ）。α２−３およびα２−６によりサンプリングされるコーン様トポロジーでは、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖が、コーンを張り渡す領域に沿って配置される。ＨＡのコーン様トポロジーとの相互作用は主に、番号付けされた位置（Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づく）におけるアミノ酸の、Ｎｅｕ５Ａｃ糖およびＧａｌ糖との接触を伴う。他方、α２−６に固有のアンブレラ様トポロジーでは、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖が、ＨＡとの結合部位（ＨＡ−α２−６共結晶構造において観察される）の方へと屈曲する。糖内のファンデルワールス力によるＧｌｃＮＡｃのアセチル基とＮｅｕ５Ａｃのアセチル基との間の接触を介して安定化するので、長鎖のα２−６オリゴ糖（例えば、少なくとも四糖）には、この立体配座が好適であろう。ＨＡのアンブレラ様トポロジーとの相互作用は、番号付けされた位置（Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づく）におけるアミノ酸の、Ｎｅｕ５Ａｃ糖およびＧａｌ糖との接触に加えて、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖との接触も伴う。この図のパネルＣは、α２−３およびα２−６によるコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの立体配座サンプリングを示す図である。断面（Ａ）〜（Ｄ）はそれぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ結合、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ結合、およびＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ結合の立体配座（φ，ψ）マップを示す。ＧｌｙｃｏＭａｐｓ ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ／ｍｏｄｅｌｉｎｇ／ｇｌｙｃｏｍａｐｓｄｂ／）から得られるこれらのマップは、ＭＭ３の力の場を用いるアブイニシオのＭＤシミュレーションを用いて発生させた。エネルギー分布は、暗色（最高のエネルギーを表す）〜最低のエネルギーを表す明色にわたる色彩でコードする。丸で囲われた領域１〜５は、ＨＡ−グリカン共結晶構造におけるα２−３オリゴ糖およびα２−６オリゴ糖について観察される（φ，ψ）値を表す。ＨＡ結合ポケットでは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌのトランス立体配座（丸で囲われた領域１）が、この立体配座をゴーシュ配座（丸で囲われた領域２）とする、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８ Ｈ３Ｎ２ ＨＡの、α２−３との共結晶構造を例外として、優勢である。他方、ＨＡ結合ポケットでは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌのシス立体配座（丸で囲われた領域３）が優勢である。コーン様トポロジーは、丸で囲われた領域１および２によりサンプリングされ、アンブレラ様トポロジーは、丸で囲われた領域３によりサンプリングされる。断面（Ｅ）〜（Ｆ）は、それぞれ、α２−３モチーフおよびα２−６モチーフによる、コーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーのサンプリングを示す。立体配座マップにおける暗色領域は、所与の（φ，ψ）値のセットについてθパラメータ（Ｎｅｕ５ＡｃのＣ２原子と後続のＧａｌ糖およびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角）を計算するための外側境界として用いた。エネルギーカットオフに基づき、θ＞１１０°の値を用いてコーン様トポロジーを特徴付け、θ＜１００°の値を用いてアンブレラ様トポロジーを特徴付けた。θの外形を立体配座エネルギーマップと重ね合わせることにより、α２−３モチーフは、アンブレラ様トポロジーを取るにはエネルギー的に好適ではないので、１００％コーン様トポロジーを取ることが示された。他方、α２−６モチーフは、コーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングし、このサンプリングを、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合のω角（Ｏ−Ｃ６−Ｃ５−Ｈ５）に基づいて分類した。 図６は、グリカン受容体の特異性を理解するための枠組みを示す図である。α２−３結合グリカンおよび／またはα２−６結合グリカンは、異なるトポロジーを取ることが可能である。本発明によれば、ＨＡポリペプチドがこれらのトポロジーのうちの特定のトポロジーに結合する能力により、このＨＡポリペプチドに異なる宿主、例えば、ヒトの感染を媒介する能力が付与される。この図のパネルＡで例示される通り、本発明は、２つの特に関連するトポロジーである「コーン」トポロジーおよび「アンブレラ」トポロジーを規定する。コーントポロジーは、α２−３結合グリカンおよび／またはα２−６結合グリカンが取りうるトポロジーであり、コアに結合した短鎖オリゴ糖または分枝状オリゴ糖に典型的である（特定の長鎖オリゴ糖もこのトポロジーを取りうるが）。アンブレラトポロジーは、α２−６結合グリカンだけが取りうるトポロジーであり（おそらく、α２−６結合において存在するさらなるＣ５−Ｃ６間結合により付与される、立体配座的な複数性が増大するために）、特にモチーフＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃ−を含有する、長鎖オリゴ糖または長鎖オリゴ糖分枝を伴う分枝状グリカンが主に取るトポロジーである。本明細書で記載される、ＨＡポリペプチドがアンブレラグリカントポロジーに結合する能力により、ヒト受容体への結合および／またはヒトの感染を媒介する能力が付与される。この図のパネルＢは、三糖モチーフ（それぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃおよびＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）のグリコシドのねじれ角により統御されるα２−３トポロジーおよびα２−６トポロジーを特異的に示す図である。パラメータ（θ）（これらの三糖モチーフにおけるＮｅｕ５ＡｃのＣ２原子と後続のＧａｌ糖およびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角）を、トポロジーを特徴付けるものとして規定した。θの外形と、α２−３モチーフおよびα２−６モチーフの立体配座マップとを重ね合わせることにより、α２−３モチーフは１００％のコーン様トポロジーを取り、α２−６モチーフはコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングすることが示される（パネルＣ）。α２−３およびα２−６によりサンプリングされるコーン様トポロジーでは、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖が、コーンを張り渡す領域に沿って配置される。ＨＡのコーン様トポロジーとの相互作用は主に、番号付けされた位置（Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づく）におけるアミノ酸の、Ｎｅｕ５Ａｃ糖およびＧａｌ糖との接触を伴う。他方、α２−６に固有のアンブレラ様トポロジーでは、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖が、ＨＡとの結合部位（ＨＡ−α２−６共結晶構造において観察される）の方へと屈曲する。糖内のファンデルワールス力によるＧｌｃＮＡｃのアセチル基とＮｅｕ５Ａｃのアセチル基との間の接触を介して安定化するので、長鎖のα２−６オリゴ糖（例えば、少なくとも四糖）には、この立体配座が好適であろう。ＨＡのアンブレラ様トポロジーとの相互作用は、番号付けされた位置（Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づく）におけるアミノ酸の、Ｎｅｕ５Ａｃ糖およびＧａｌ糖との接触に加えて、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖との接触も伴う。この図のパネルＣは、α２−３およびα２−６によるコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの立体配座サンプリングを示す図である。断面（Ａ）〜（Ｄ）はそれぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ結合、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ結合、およびＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ結合の立体配座（φ，ψ）マップを示す。ＧｌｙｃｏＭａｐｓ ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ／ｍｏｄｅｌｉｎｇ／ｇｌｙｃｏｍａｐｓｄｂ／）から得られるこれらのマップは、ＭＭ３の力の場を用いるアブイニシオのＭＤシミュレーションを用いて発生させた。エネルギー分布は、暗色（最高のエネルギーを表す）〜最低のエネルギーを表す明色にわたる色彩でコードする。丸で囲われた領域１〜５は、ＨＡ−グリカン共結晶構造におけるα２−３オリゴ糖およびα２−６オリゴ糖について観察される（φ，ψ）値を表す。ＨＡ結合ポケットでは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌのトランス立体配座（丸で囲われた領域１）が、この立体配座をゴーシュ配座（丸で囲われた領域２）とする、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８ Ｈ３Ｎ２ ＨＡの、α２−３との共結晶構造を例外として、優勢である。他方、ＨＡ結合ポケットでは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌのシス立体配座（丸で囲われた領域３）が優勢である。コーン様トポロジーは、丸で囲われた領域１および２によりサンプリングされ、アンブレラ様トポロジーは、丸で囲われた領域３によりサンプリングされる。断面（Ｅ）〜（Ｆ）は、それぞれ、α２−３モチーフおよびα２−６モチーフによる、コーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーのサンプリングを示す。立体配座マップにおける暗色領域は、所与の（φ，ψ）値のセットについてθパラメータ（Ｎｅｕ５ＡｃのＣ２原子と後続のＧａｌ糖およびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角）を計算するための外側境界として用いた。エネルギーカットオフに基づき、θ＞１１０°の値を用いてコーン様トポロジーを特徴付け、θ＜１００°の値を用いてアンブレラ様トポロジーを特徴付けた。θの外形を立体配座エネルギーマップと重ね合わせることにより、α２−３モチーフは、アンブレラ様トポロジーを取るにはエネルギー的に好適ではないので、１００％コーン様トポロジーを取ることが示された。他方、α２−６モチーフは、コーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングし、このサンプリングを、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合のω角（Ｏ−Ｃ６−Ｃ５−Ｈ５）に基づいて分類した。 図６は、グリカン受容体の特異性を理解するための枠組みを示す図である。α２−３結合グリカンおよび／またはα２−６結合グリカンは、異なるトポロジーを取ることが可能である。本発明によれば、ＨＡポリペプチドがこれらのトポロジーのうちの特定のトポロジーに結合する能力により、このＨＡポリペプチドに異なる宿主、例えば、ヒトの感染を媒介する能力が付与される。この図のパネルＡで例示される通り、本発明は、２つの特に関連するトポロジーである「コーン」トポロジーおよび「アンブレラ」トポロジーを規定する。コーントポロジーは、α２−３結合グリカンおよび／またはα２−６結合グリカンが取りうるトポロジーであり、コアに結合した短鎖オリゴ糖または分枝状オリゴ糖に典型的である（特定の長鎖オリゴ糖もこのトポロジーを取りうるが）。アンブレラトポロジーは、α２−６結合グリカンだけが取りうるトポロジーであり（おそらく、α２−６結合において存在するさらなるＣ５−Ｃ６間結合により付与される、立体配座的な複数性が増大するために）、特にモチーフＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃ−を含有する、長鎖オリゴ糖または長鎖オリゴ糖分枝を伴う分枝状グリカンが主に取るトポロジーである。本明細書で記載される、ＨＡポリペプチドがアンブレラグリカントポロジーに結合する能力により、ヒト受容体への結合および／またはヒトの感染を媒介する能力が付与される。この図のパネルＢは、三糖モチーフ（それぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃおよびＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）のグリコシドのねじれ角により統御されるα２−３トポロジーおよびα２−６トポロジーを特異的に示す図である。パラメータ（θ）（これらの三糖モチーフにおけるＮｅｕ５ＡｃのＣ２原子と後続のＧａｌ糖およびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角）を、トポロジーを特徴付けるものとして規定した。θの外形と、α２−３モチーフおよびα２−６モチーフの立体配座マップとを重ね合わせることにより、α２−３モチーフは１００％のコーン様トポロジーを取り、α２−６モチーフはコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングすることが示される（パネルＣ）。α２−３およびα２−６によりサンプリングされるコーン様トポロジーでは、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖が、コーンを張り渡す領域に沿って配置される。ＨＡのコーン様トポロジーとの相互作用は主に、番号付けされた位置（Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づく）におけるアミノ酸の、Ｎｅｕ５Ａｃ糖およびＧａｌ糖との接触を伴う。他方、α２−６に固有のアンブレラ様トポロジーでは、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖が、ＨＡとの結合部位（ＨＡ−α２−６共結晶構造において観察される）の方へと屈曲する。糖内のファンデルワールス力によるＧｌｃＮＡｃのアセチル基とＮｅｕ５Ａｃのアセチル基との間の接触を介して安定化するので、長鎖のα２−６オリゴ糖（例えば、少なくとも四糖）には、この立体配座が好適であろう。ＨＡのアンブレラ様トポロジーとの相互作用は、番号付けされた位置（Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づく）におけるアミノ酸の、Ｎｅｕ５Ａｃ糖およびＧａｌ糖との接触に加えて、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖との接触も伴う。この図のパネルＣは、α２−３およびα２−６によるコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの立体配座サンプリングを示す図である。断面（Ａ）〜（Ｄ）はそれぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ結合、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ結合、およびＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ結合の立体配座（φ，ψ）マップを示す。ＧｌｙｃｏＭａｐｓ ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ／ｍｏｄｅｌｉｎｇ／ｇｌｙｃｏｍａｐｓｄｂ／）から得られるこれらのマップは、ＭＭ３の力の場を用いるアブイニシオのＭＤシミュレーションを用いて発生させた。エネルギー分布は、暗色（最高のエネルギーを表す）〜最低のエネルギーを表す明色にわたる色彩でコードする。丸で囲われた領域１〜５は、ＨＡ−グリカン共結晶構造におけるα２−３オリゴ糖およびα２−６オリゴ糖について観察される（φ，ψ）値を表す。ＨＡ結合ポケットでは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌのトランス立体配座（丸で囲われた領域１）が、この立体配座をゴーシュ配座（丸で囲われた領域２）とする、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８ Ｈ３Ｎ２ ＨＡの、α２−３との共結晶構造を例外として、優勢である。他方、ＨＡ結合ポケットでは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌのシス立体配座（丸で囲われた領域３）が優勢である。コーン様トポロジーは、丸で囲われた領域１および２によりサンプリングされ、アンブレラ様トポロジーは、丸で囲われた領域３によりサンプリングされる。断面（Ｅ）〜（Ｆ）は、それぞれ、α２−３モチーフおよびα２−６モチーフによる、コーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーのサンプリングを示す。立体配座マップにおける暗色領域は、所与の（φ，ψ）値のセットについてθパラメータ（Ｎｅｕ５ＡｃのＣ２原子と後続のＧａｌ糖およびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角）を計算するための外側境界として用いた。エネルギーカットオフに基づき、θ＞１１０°の値を用いてコーン様トポロジーを特徴付け、θ＜１００°の値を用いてアンブレラ様トポロジーを特徴付けた。θの外形を立体配座エネルギーマップと重ね合わせることにより、α２−３モチーフは、アンブレラ様トポロジーを取るにはエネルギー的に好適ではないので、１００％コーン様トポロジーを取ることが示された。他方、α２−６モチーフは、コーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングし、このサンプリングを、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合のω角（Ｏ−Ｃ６−Ｃ５−Ｈ５）に基づいて分類した。 図６は、グリカン受容体の特異性を理解するための枠組みを示す図である。α２−３結合グリカンおよび／またはα２−６結合グリカンは、異なるトポロジーを取ることが可能である。本発明によれば、ＨＡポリペプチドがこれらのトポロジーのうちの特定のトポロジーに結合する能力により、このＨＡポリペプチドに異なる宿主、例えば、ヒトの感染を媒介する能力が付与される。この図のパネルＡで例示される通り、本発明は、２つの特に関連するトポロジーである「コーン」トポロジーおよび「アンブレラ」トポロジーを規定する。コーントポロジーは、α２−３結合グリカンおよび／またはα２−６結合グリカンが取りうるトポロジーであり、コアに結合した短鎖オリゴ糖または分枝状オリゴ糖に典型的である（特定の長鎖オリゴ糖もこのトポロジーを取りうるが）。アンブレラトポロジーは、α２−６結合グリカンだけが取りうるトポロジーであり（おそらく、α２−６結合において存在するさらなるＣ５−Ｃ６間結合により付与される、立体配座的な複数性が増大するために）、特にモチーフＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃ−を含有する、長鎖オリゴ糖または長鎖オリゴ糖分枝を伴う分枝状グリカンが主に取るトポロジーである。本明細書で記載される、ＨＡポリペプチドがアンブレラグリカントポロジーに結合する能力により、ヒト受容体への結合および／またはヒトの感染を媒介する能力が付与される。この図のパネルＢは、三糖モチーフ（それぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃおよびＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）のグリコシドのねじれ角により統御されるα２−３トポロジーおよびα２−６トポロジーを特異的に示す図である。パラメータ（θ）（これらの三糖モチーフにおけるＮｅｕ５ＡｃのＣ２原子と後続のＧａｌ糖およびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角）を、トポロジーを特徴付けるものとして規定した。θの外形と、α２−３モチーフおよびα２−６モチーフの立体配座マップとを重ね合わせることにより、α２−３モチーフは１００％のコーン様トポロジーを取り、α２−６モチーフはコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングすることが示される（パネルＣ）。α２−３およびα２−６によりサンプリングされるコーン様トポロジーでは、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖が、コーンを張り渡す領域に沿って配置される。ＨＡのコーン様トポロジーとの相互作用は主に、番号付けされた位置（Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づく）におけるアミノ酸の、Ｎｅｕ５Ａｃ糖およびＧａｌ糖との接触を伴う。他方、α２−６に固有のアンブレラ様トポロジーでは、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖が、ＨＡとの結合部位（ＨＡ−α２−６共結晶構造において観察される）の方へと屈曲する。糖内のファンデルワールス力によるＧｌｃＮＡｃのアセチル基とＮｅｕ５Ａｃのアセチル基との間の接触を介して安定化するので、長鎖のα２−６オリゴ糖（例えば、少なくとも四糖）には、この立体配座が好適であろう。ＨＡのアンブレラ様トポロジーとの相互作用は、番号付けされた位置（Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づく）におけるアミノ酸の、Ｎｅｕ５Ａｃ糖およびＧａｌ糖との接触に加えて、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖との接触も伴う。この図のパネルＣは、α２−３およびα２−６によるコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの立体配座サンプリングを示す図である。断面（Ａ）〜（Ｄ）はそれぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ結合、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ結合、およびＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ結合の立体配座（φ，ψ）マップを示す。ＧｌｙｃｏＭａｐｓ ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ／ｍｏｄｅｌｉｎｇ／ｇｌｙｃｏｍａｐｓｄｂ／）から得られるこれらのマップは、ＭＭ３の力の場を用いるアブイニシオのＭＤシミュレーションを用いて発生させた。エネルギー分布は、暗色（最高のエネルギーを表す）〜最低のエネルギーを表す明色にわたる色彩でコードする。丸で囲われた領域１〜５は、ＨＡ−グリカン共結晶構造におけるα２−３オリゴ糖およびα２−６オリゴ糖について観察される（φ，ψ）値を表す。ＨＡ結合ポケットでは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌのトランス立体配座（丸で囲われた領域１）が、この立体配座をゴーシュ配座（丸で囲われた領域２）とする、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８ Ｈ３Ｎ２ ＨＡの、α２−３との共結晶構造を例外として、優勢である。他方、ＨＡ結合ポケットでは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌのシス立体配座（丸で囲われた領域３）が優勢である。コーン様トポロジーは、丸で囲われた領域１および２によりサンプリングされ、アンブレラ様トポロジーは、丸で囲われた領域３によりサンプリングされる。断面（Ｅ）〜（Ｆ）は、それぞれ、α２−３モチーフおよびα２−６モチーフによる、コーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーのサンプリングを示す。立体配座マップにおける暗色領域は、所与の（φ，ψ）値のセットについてθパラメータ（Ｎｅｕ５ＡｃのＣ２原子と後続のＧａｌ糖およびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角）を計算するための外側境界として用いた。エネルギーカットオフに基づき、θ＞１１０°の値を用いてコーン様トポロジーを特徴付け、θ＜１００°の値を用いてアンブレラ様トポロジーを特徴付けた。θの外形を立体配座エネルギーマップと重ね合わせることにより、α２−３モチーフは、アンブレラ様トポロジーを取るにはエネルギー的に好適ではないので、１００％コーン様トポロジーを取ることが示された。他方、α２−６モチーフは、コーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングし、このサンプリングを、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合のω角（Ｏ−Ｃ６−Ｃ５−Ｈ５）に基づいて分類した。 図６は、グリカン受容体の特異性を理解するための枠組みを示す図である。α２−３結合グリカンおよび／またはα２−６結合グリカンは、異なるトポロジーを取ることが可能である。本発明によれば、ＨＡポリペプチドがこれらのトポロジーのうちの特定のトポロジーに結合する能力により、このＨＡポリペプチドに異なる宿主、例えば、ヒトの感染を媒介する能力が付与される。この図のパネルＡで例示される通り、本発明は、２つの特に関連するトポロジーである「コーン」トポロジーおよび「アンブレラ」トポロジーを規定する。コーントポロジーは、α２−３結合グリカンおよび／またはα２−６結合グリカンが取りうるトポロジーであり、コアに結合した短鎖オリゴ糖または分枝状オリゴ糖に典型的である（特定の長鎖オリゴ糖もこのトポロジーを取りうるが）。アンブレラトポロジーは、α２−６結合グリカンだけが取りうるトポロジーであり（おそらく、α２−６結合において存在するさらなるＣ５−Ｃ６間結合により付与される、立体配座的な複数性が増大するために）、特にモチーフＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃ−を含有する、長鎖オリゴ糖または長鎖オリゴ糖分枝を伴う分枝状グリカンが主に取るトポロジーである。本明細書で記載される、ＨＡポリペプチドがアンブレラグリカントポロジーに結合する能力により、ヒト受容体への結合および／またはヒトの感染を媒介する能力が付与される。この図のパネルＢは、三糖モチーフ（それぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃおよびＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）のグリコシドのねじれ角により統御されるα２−３トポロジーおよびα２−６トポロジーを特異的に示す図である。パラメータ（θ）（これらの三糖モチーフにおけるＮｅｕ５ＡｃのＣ２原子と後続のＧａｌ糖およびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角）を、トポロジーを特徴付けるものとして規定した。θの外形と、α２−３モチーフおよびα２−６モチーフの立体配座マップとを重ね合わせることにより、α２−３モチーフは１００％のコーン様トポロジーを取り、α２−６モチーフはコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングすることが示される（パネルＣ）。α２−３およびα２−６によりサンプリングされるコーン様トポロジーでは、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖が、コーンを張り渡す領域に沿って配置される。ＨＡのコーン様トポロジーとの相互作用は主に、番号付けされた位置（Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づく）におけるアミノ酸の、Ｎｅｕ５Ａｃ糖およびＧａｌ糖との接触を伴う。他方、α２−６に固有のアンブレラ様トポロジーでは、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖が、ＨＡとの結合部位（ＨＡ−α２−６共結晶構造において観察される）の方へと屈曲する。糖内のファンデルワールス力によるＧｌｃＮＡｃのアセチル基とＮｅｕ５Ａｃのアセチル基との間の接触を介して安定化するので、長鎖のα２−６オリゴ糖（例えば、少なくとも四糖）には、この立体配座が好適であろう。ＨＡのアンブレラ様トポロジーとの相互作用は、番号付けされた位置（Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づく）におけるアミノ酸の、Ｎｅｕ５Ａｃ糖およびＧａｌ糖との接触に加えて、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖との接触も伴う。この図のパネルＣは、α２−３およびα２−６によるコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの立体配座サンプリングを示す図である。断面（Ａ）〜（Ｄ）はそれぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ結合、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ結合、およびＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ結合の立体配座（φ，ψ）マップを示す。ＧｌｙｃｏＭａｐｓ ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ／ｍｏｄｅｌｉｎｇ／ｇｌｙｃｏｍａｐｓｄｂ／）から得られるこれらのマップは、ＭＭ３の力の場を用いるアブイニシオのＭＤシミュレーションを用いて発生させた。エネルギー分布は、暗色（最高のエネルギーを表す）〜最低のエネルギーを表す明色にわたる色彩でコードする。丸で囲われた領域１〜５は、ＨＡ−グリカン共結晶構造におけるα２−３オリゴ糖およびα２−６オリゴ糖について観察される（φ，ψ）値を表す。ＨＡ結合ポケットでは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌのトランス立体配座（丸で囲われた領域１）が、この立体配座をゴーシュ配座（丸で囲われた領域２）とする、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８ Ｈ３Ｎ２ ＨＡの、α２−３との共結晶構造を例外として、優勢である。他方、ＨＡ結合ポケットでは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌのシス立体配座（丸で囲われた領域３）が優勢である。コーン様トポロジーは、丸で囲われた領域１および２によりサンプリングされ、アンブレラ様トポロジーは、丸で囲われた領域３によりサンプリングされる。断面（Ｅ）〜（Ｆ）は、それぞれ、α２−３モチーフおよびα２−６モチーフによる、コーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーのサンプリングを示す。立体配座マップにおける暗色領域は、所与の（φ，ψ）値のセットについてθパラメータ（Ｎｅｕ５ＡｃのＣ２原子と後続のＧａｌ糖およびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角）を計算するための外側境界として用いた。エネルギーカットオフに基づき、θ＞１１０°の値を用いてコーン様トポロジーを特徴付け、θ＜１００°の値を用いてアンブレラ様トポロジーを特徴付けた。θの外形を立体配座エネルギーマップと重ね合わせることにより、α２−３モチーフは、アンブレラ様トポロジーを取るにはエネルギー的に好適ではないので、１００％コーン様トポロジーを取ることが示された。他方、α２−６モチーフは、コーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングし、このサンプリングを、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合のω角（Ｏ−Ｃ６−Ｃ５−Ｈ５）に基づいて分類した。 図６は、グリカン受容体の特異性を理解するための枠組みを示す図である。α２−３結合グリカンおよび／またはα２−６結合グリカンは、異なるトポロジーを取ることが可能である。本発明によれば、ＨＡポリペプチドがこれらのトポロジーのうちの特定のトポロジーに結合する能力により、このＨＡポリペプチドに異なる宿主、例えば、ヒトの感染を媒介する能力が付与される。この図のパネルＡで例示される通り、本発明は、２つの特に関連するトポロジーである「コーン」トポロジーおよび「アンブレラ」トポロジーを規定する。コーントポロジーは、α２−３結合グリカンおよび／またはα２−６結合グリカンが取りうるトポロジーであり、コアに結合した短鎖オリゴ糖または分枝状オリゴ糖に典型的である（特定の長鎖オリゴ糖もこのトポロジーを取りうるが）。アンブレラトポロジーは、α２−６結合グリカンだけが取りうるトポロジーであり（おそらく、α２−６結合において存在するさらなるＣ５−Ｃ６間結合により付与される、立体配座的な複数性が増大するために）、特にモチーフＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃ−を含有する、長鎖オリゴ糖または長鎖オリゴ糖分枝を伴う分枝状グリカンが主に取るトポロジーである。本明細書で記載される、ＨＡポリペプチドがアンブレラグリカントポロジーに結合する能力により、ヒト受容体への結合および／またはヒトの感染を媒介する能力が付与される。この図のパネルＢは、三糖モチーフ（それぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃおよびＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）のグリコシドのねじれ角により統御されるα２−３トポロジーおよびα２−６トポロジーを特異的に示す図である。パラメータ（θ）（これらの三糖モチーフにおけるＮｅｕ５ＡｃのＣ２原子と後続のＧａｌ糖およびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角）を、トポロジーを特徴付けるものとして規定した。θの外形と、α２−３モチーフおよびα２−６モチーフの立体配座マップとを重ね合わせることにより、α２−３モチーフは１００％のコーン様トポロジーを取り、α２−６モチーフはコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングすることが示される（パネルＣ）。α２−３およびα２−６によりサンプリングされるコーン様トポロジーでは、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖が、コーンを張り渡す領域に沿って配置される。ＨＡのコーン様トポロジーとの相互作用は主に、番号付けされた位置（Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づく）におけるアミノ酸の、Ｎｅｕ５Ａｃ糖およびＧａｌ糖との接触を伴う。他方、α２−６に固有のアンブレラ様トポロジーでは、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖が、ＨＡとの結合部位（ＨＡ−α２−６共結晶構造において観察される）の方へと屈曲する。糖内のファンデルワールス力によるＧｌｃＮＡｃのアセチル基とＮｅｕ５Ａｃのアセチル基との間の接触を介して安定化するので、長鎖のα２−６オリゴ糖（例えば、少なくとも四糖）には、この立体配座が好適であろう。ＨＡのアンブレラ様トポロジーとの相互作用は、番号付けされた位置（Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づく）におけるアミノ酸の、Ｎｅｕ５Ａｃ糖およびＧａｌ糖との接触に加えて、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖との接触も伴う。この図のパネルＣは、α２−３およびα２−６によるコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの立体配座サンプリングを示す図である。断面（Ａ）〜（Ｄ）はそれぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ結合、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ結合、およびＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ結合の立体配座（φ，ψ）マップを示す。ＧｌｙｃｏＭａｐｓ ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ／ｍｏｄｅｌｉｎｇ／ｇｌｙｃｏｍａｐｓｄｂ／）から得られるこれらのマップは、ＭＭ３の力の場を用いるアブイニシオのＭＤシミュレーションを用いて発生させた。エネルギー分布は、暗色（最高のエネルギーを表す）〜最低のエネルギーを表す明色にわたる色彩でコードする。丸で囲われた領域１〜５は、ＨＡ−グリカン共結晶構造におけるα２−３オリゴ糖およびα２−６オリゴ糖について観察される（φ，ψ）値を表す。ＨＡ結合ポケットでは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌのトランス立体配座（丸で囲われた領域１）が、この立体配座をゴーシュ配座（丸で囲われた領域２）とする、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８ Ｈ３Ｎ２ ＨＡの、α２−３との共結晶構造を例外として、優勢である。他方、ＨＡ結合ポケットでは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌのシス立体配座（丸で囲われた領域３）が優勢である。コーン様トポロジーは、丸で囲われた領域１および２によりサンプリングされ、アンブレラ様トポロジーは、丸で囲われた領域３によりサンプリングされる。断面（Ｅ）〜（Ｆ）は、それぞれ、α２−３モチーフおよびα２−６モチーフによる、コーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーのサンプリングを示す。立体配座マップにおける暗色領域は、所与の（φ，ψ）値のセットについてθパラメータ（Ｎｅｕ５ＡｃのＣ２原子と後続のＧａｌ糖およびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角）を計算するための外側境界として用いた。エネルギーカットオフに基づき、θ＞１１０°の値を用いてコーン様トポロジーを特徴付け、θ＜１００°の値を用いてアンブレラ様トポロジーを特徴付けた。θの外形を立体配座エネルギーマップと重ね合わせることにより、α２−３モチーフは、アンブレラ様トポロジーを取るにはエネルギー的に好適ではないので、１００％コーン様トポロジーを取ることが示された。他方、α２−６モチーフは、コーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングし、このサンプリングを、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合のω角（Ｏ−Ｃ６−Ｃ５−Ｈ５）に基づいて分類した。 図６は、グリカン受容体の特異性を理解するための枠組みを示す図である。α２−３結合グリカンおよび／またはα２−６結合グリカンは、異なるトポロジーを取ることが可能である。本発明によれば、ＨＡポリペプチドがこれらのトポロジーのうちの特定のトポロジーに結合する能力により、このＨＡポリペプチドに異なる宿主、例えば、ヒトの感染を媒介する能力が付与される。この図のパネルＡで例示される通り、本発明は、２つの特に関連するトポロジーである「コーン」トポロジーおよび「アンブレラ」トポロジーを規定する。コーントポロジーは、α２−３結合グリカンおよび／またはα２−６結合グリカンが取りうるトポロジーであり、コアに結合した短鎖オリゴ糖または分枝状オリゴ糖に典型的である（特定の長鎖オリゴ糖もこのトポロジーを取りうるが）。アンブレラトポロジーは、α２−６結合グリカンだけが取りうるトポロジーであり（おそらく、α２−６結合において存在するさらなるＣ５−Ｃ６間結合により付与される、立体配座的な複数性が増大するために）、特にモチーフＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃ−を含有する、長鎖オリゴ糖または長鎖オリゴ糖分枝を伴う分枝状グリカンが主に取るトポロジーである。本明細書で記載される、ＨＡポリペプチドがアンブレラグリカントポロジーに結合する能力により、ヒト受容体への結合および／またはヒトの感染を媒介する能力が付与される。この図のパネルＢは、三糖モチーフ（それぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃおよびＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）のグリコシドのねじれ角により統御されるα２−３トポロジーおよびα２−６トポロジーを特異的に示す図である。パラメータ（θ）（これらの三糖モチーフにおけるＮｅｕ５ＡｃのＣ２原子と後続のＧａｌ糖およびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角）を、トポロジーを特徴付けるものとして規定した。θの外形と、α２−３モチーフおよびα２−６モチーフの立体配座マップとを重ね合わせることにより、α２−３モチーフは１００％のコーン様トポロジーを取り、α２−６モチーフはコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングすることが示される（パネルＣ）。α２−３およびα２−６によりサンプリングされるコーン様トポロジーでは、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖が、コーンを張り渡す領域に沿って配置される。ＨＡのコーン様トポロジーとの相互作用は主に、番号付けされた位置（Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づく）におけるアミノ酸の、Ｎｅｕ５Ａｃ糖およびＧａｌ糖との接触を伴う。他方、α２−６に固有のアンブレラ様トポロジーでは、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖が、ＨＡとの結合部位（ＨＡ−α２−６共結晶構造において観察される）の方へと屈曲する。糖内のファンデルワールス力によるＧｌｃＮＡｃのアセチル基とＮｅｕ５Ａｃのアセチル基との間の接触を介して安定化するので、長鎖のα２−６オリゴ糖（例えば、少なくとも四糖）には、この立体配座が好適であろう。ＨＡのアンブレラ様トポロジーとの相互作用は、番号付けされた位置（Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づく）におけるアミノ酸の、Ｎｅｕ５Ａｃ糖およびＧａｌ糖との接触に加えて、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖との接触も伴う。この図のパネルＣは、α２−３およびα２−６によるコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの立体配座サンプリングを示す図である。断面（Ａ）〜（Ｄ）はそれぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ結合、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ結合、およびＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ結合の立体配座（φ，ψ）マップを示す。ＧｌｙｃｏＭａｐｓ ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ／ｍｏｄｅｌｉｎｇ／ｇｌｙｃｏｍａｐｓｄｂ／）から得られるこれらのマップは、ＭＭ３の力の場を用いるアブイニシオのＭＤシミュレーションを用いて発生させた。エネルギー分布は、暗色（最高のエネルギーを表す）〜最低のエネルギーを表す明色にわたる色彩でコードする。丸で囲われた領域１〜５は、ＨＡ−グリカン共結晶構造におけるα２−３オリゴ糖およびα２−６オリゴ糖について観察される（φ，ψ）値を表す。ＨＡ結合ポケットでは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌのトランス立体配座（丸で囲われた領域１）が、この立体配座をゴーシュ配座（丸で囲われた領域２）とする、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８ Ｈ３Ｎ２ ＨＡの、α２−３との共結晶構造を例外として、優勢である。他方、ＨＡ結合ポケットでは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌのシス立体配座（丸で囲われた領域３）が優勢である。コーン様トポロジーは、丸で囲われた領域１および２によりサンプリングされ、アンブレラ様トポロジーは、丸で囲われた領域３によりサンプリングされる。断面（Ｅ）〜（Ｆ）は、それぞれ、α２−３モチーフおよびα２−６モチーフによる、コーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーのサンプリングを示す。立体配座マップにおける暗色領域は、所与の（φ，ψ）値のセットについてθパラメータ（Ｎｅｕ５ＡｃのＣ２原子と後続のＧａｌ糖およびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角）を計算するための外側境界として用いた。エネルギーカットオフに基づき、θ＞１１０°の値を用いてコーン様トポロジーを特徴付け、θ＜１００°の値を用いてアンブレラ様トポロジーを特徴付けた。θの外形を立体配座エネルギーマップと重ね合わせることにより、α２−３モチーフは、アンブレラ様トポロジーを取るにはエネルギー的に好適ではないので、１００％コーン様トポロジーを取ることが示された。他方、α２−６モチーフは、コーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングし、このサンプリングを、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合のω角（Ｏ−Ｃ６−Ｃ５−Ｈ５）に基づいて分類した。 図６は、グリカン受容体の特異性を理解するための枠組みを示す図である。α２−３結合グリカンおよび／またはα２−６結合グリカンは、異なるトポロジーを取ることが可能である。本発明によれば、ＨＡポリペプチドがこれらのトポロジーのうちの特定のトポロジーに結合する能力により、このＨＡポリペプチドに異なる宿主、例えば、ヒトの感染を媒介する能力が付与される。この図のパネルＡで例示される通り、本発明は、２つの特に関連するトポロジーである「コーン」トポロジーおよび「アンブレラ」トポロジーを規定する。コーントポロジーは、α２−３結合グリカンおよび／またはα２−６結合グリカンが取りうるトポロジーであり、コアに結合した短鎖オリゴ糖または分枝状オリゴ糖に典型的である（特定の長鎖オリゴ糖もこのトポロジーを取りうるが）。アンブレラトポロジーは、α２−６結合グリカンだけが取りうるトポロジーであり（おそらく、α２−６結合において存在するさらなるＣ５−Ｃ６間結合により付与される、立体配座的な複数性が増大するために）、特にモチーフＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃ−を含有する、長鎖オリゴ糖または長鎖オリゴ糖分枝を伴う分枝状グリカンが主に取るトポロジーである。本明細書で記載される、ＨＡポリペプチドがアンブレラグリカントポロジーに結合する能力により、ヒト受容体への結合および／またはヒトの感染を媒介する能力が付与される。この図のパネルＢは、三糖モチーフ（それぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃおよびＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）のグリコシドのねじれ角により統御されるα２−３トポロジーおよびα２−６トポロジーを特異的に示す図である。パラメータ（θ）（これらの三糖モチーフにおけるＮｅｕ５ＡｃのＣ２原子と後続のＧａｌ糖およびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角）を、トポロジーを特徴付けるものとして規定した。θの外形と、α２−３モチーフおよびα２−６モチーフの立体配座マップとを重ね合わせることにより、α２−３モチーフは１００％のコーン様トポロジーを取り、α２−６モチーフはコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングすることが示される（パネルＣ）。α２−３およびα２−６によりサンプリングされるコーン様トポロジーでは、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖が、コーンを張り渡す領域に沿って配置される。ＨＡのコーン様トポロジーとの相互作用は主に、番号付けされた位置（Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づく）におけるアミノ酸の、Ｎｅｕ５Ａｃ糖およびＧａｌ糖との接触を伴う。他方、α２−６に固有のアンブレラ様トポロジーでは、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖が、ＨＡとの結合部位（ＨＡ−α２−６共結晶構造において観察される）の方へと屈曲する。糖内のファンデルワールス力によるＧｌｃＮＡｃのアセチル基とＮｅｕ５Ａｃのアセチル基との間の接触を介して安定化するので、長鎖のα２−６オリゴ糖（例えば、少なくとも四糖）には、この立体配座が好適であろう。ＨＡのアンブレラ様トポロジーとの相互作用は、番号付けされた位置（Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づく）におけるアミノ酸の、Ｎｅｕ５Ａｃ糖およびＧａｌ糖との接触に加えて、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖との接触も伴う。この図のパネルＣは、α２−３およびα２−６によるコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの立体配座サンプリングを示す図である。断面（Ａ）〜（Ｄ）はそれぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ結合、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ結合、およびＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ結合の立体配座（φ，ψ）マップを示す。ＧｌｙｃｏＭａｐｓ ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ／ｍｏｄｅｌｉｎｇ／ｇｌｙｃｏｍａｐｓｄｂ／）から得られるこれらのマップは、ＭＭ３の力の場を用いるアブイニシオのＭＤシミュレーションを用いて発生させた。エネルギー分布は、暗色（最高のエネルギーを表す）〜最低のエネルギーを表す明色にわたる色彩でコードする。丸で囲われた領域１〜５は、ＨＡ−グリカン共結晶構造におけるα２−３オリゴ糖およびα２−６オリゴ糖について観察される（φ，ψ）値を表す。ＨＡ結合ポケットでは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌのトランス立体配座（丸で囲われた領域１）が、この立体配座をゴーシュ配座（丸で囲われた領域２）とする、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８ Ｈ３Ｎ２ ＨＡの、α２−３との共結晶構造を例外として、優勢である。他方、ＨＡ結合ポケットでは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌのシス立体配座（丸で囲われた領域３）が優勢である。コーン様トポロジーは、丸で囲われた領域１および２によりサンプリングされ、アンブレラ様トポロジーは、丸で囲われた領域３によりサンプリングされる。断面（Ｅ）〜（Ｆ）は、それぞれ、α２−３モチーフおよびα２−６モチーフによる、コーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーのサンプリングを示す。立体配座マップにおける暗色領域は、所与の（φ，ψ）値のセットについてθパラメータ（Ｎｅｕ５ＡｃのＣ２原子と後続のＧａｌ糖およびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角）を計算するための外側境界として用いた。エネルギーカットオフに基づき、θ＞１１０°の値を用いてコーン様トポロジーを特徴付け、θ＜１００°の値を用いてアンブレラ様トポロジーを特徴付けた。θの外形を立体配座エネルギーマップと重ね合わせることにより、α２−３モチーフは、アンブレラ様トポロジーを取るにはエネルギー的に好適ではないので、１００％コーン様トポロジーを取ることが示された。他方、α２−６モチーフは、コーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングし、このサンプリングを、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合のω角（Ｏ−Ｃ６−Ｃ５−Ｈ５）に基づいて分類した。 図６は、グリカン受容体の特異性を理解するための枠組みを示す図である。α２−３結合グリカンおよび／またはα２−６結合グリカンは、異なるトポロジーを取ることが可能である。本発明によれば、ＨＡポリペプチドがこれらのトポロジーのうちの特定のトポロジーに結合する能力により、このＨＡポリペプチドに異なる宿主、例えば、ヒトの感染を媒介する能力が付与される。この図のパネルＡで例示される通り、本発明は、２つの特に関連するトポロジーである「コーン」トポロジーおよび「アンブレラ」トポロジーを規定する。コーントポロジーは、α２−３結合グリカンおよび／またはα２−６結合グリカンが取りうるトポロジーであり、コアに結合した短鎖オリゴ糖または分枝状オリゴ糖に典型的である（特定の長鎖オリゴ糖もこのトポロジーを取りうるが）。アンブレラトポロジーは、α２−６結合グリカンだけが取りうるトポロジーであり（おそらく、α２−６結合において存在するさらなるＣ５−Ｃ６間結合により付与される、立体配座的な複数性が増大するために）、特にモチーフＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃ−を含有する、長鎖オリゴ糖または長鎖オリゴ糖分枝を伴う分枝状グリカンが主に取るトポロジーである。本明細書で記載される、ＨＡポリペプチドがアンブレラグリカントポロジーに結合する能力により、ヒト受容体への結合および／またはヒトの感染を媒介する能力が付与される。この図のパネルＢは、三糖モチーフ（それぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃおよびＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）のグリコシドのねじれ角により統御されるα２−３トポロジーおよびα２−６トポロジーを特異的に示す図である。パラメータ（θ）（これらの三糖モチーフにおけるＮｅｕ５ＡｃのＣ２原子と後続のＧａｌ糖およびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角）を、トポロジーを特徴付けるものとして規定した。θの外形と、α２−３モチーフおよびα２−６モチーフの立体配座マップとを重ね合わせることにより、α２−３モチーフは１００％のコーン様トポロジーを取り、α２−６モチーフはコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングすることが示される（パネルＣ）。α２−３およびα２−６によりサンプリングされるコーン様トポロジーでは、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖が、コーンを張り渡す領域に沿って配置される。ＨＡのコーン様トポロジーとの相互作用は主に、番号付けされた位置（Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づく）におけるアミノ酸の、Ｎｅｕ５Ａｃ糖およびＧａｌ糖との接触を伴う。他方、α２−６に固有のアンブレラ様トポロジーでは、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖が、ＨＡとの結合部位（ＨＡ−α２−６共結晶構造において観察される）の方へと屈曲する。糖内のファンデルワールス力によるＧｌｃＮＡｃのアセチル基とＮｅｕ５Ａｃのアセチル基との間の接触を介して安定化するので、長鎖のα２−６オリゴ糖（例えば、少なくとも四糖）には、この立体配座が好適であろう。ＨＡのアンブレラ様トポロジーとの相互作用は、番号付けされた位置（Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づく）におけるアミノ酸の、Ｎｅｕ５Ａｃ糖およびＧａｌ糖との接触に加えて、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖との接触も伴う。この図のパネルＣは、α２−３およびα２−６によるコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの立体配座サンプリングを示す図である。断面（Ａ）〜（Ｄ）はそれぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ結合、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ結合、およびＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ結合の立体配座（φ，ψ）マップを示す。ＧｌｙｃｏＭａｐｓ ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ／ｍｏｄｅｌｉｎｇ／ｇｌｙｃｏｍａｐｓｄｂ／）から得られるこれらのマップは、ＭＭ３の力の場を用いるアブイニシオのＭＤシミュレーションを用いて発生させた。エネルギー分布は、暗色（最高のエネルギーを表す）〜最低のエネルギーを表す明色にわたる色彩でコードする。丸で囲われた領域１〜５は、ＨＡ−グリカン共結晶構造におけるα２−３オリゴ糖およびα２−６オリゴ糖について観察される（φ，ψ）値を表す。ＨＡ結合ポケットでは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌのトランス立体配座（丸で囲われた領域１）が、この立体配座をゴーシュ配座（丸で囲われた領域２）とする、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８ Ｈ３Ｎ２ ＨＡの、α２−３との共結晶構造を例外として、優勢である。他方、ＨＡ結合ポケットでは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌのシス立体配座（丸で囲われた領域３）が優勢である。コーン様トポロジーは、丸で囲われた領域１および２によりサンプリングされ、アンブレラ様トポロジーは、丸で囲われた領域３によりサンプリングされる。断面（Ｅ）〜（Ｆ）は、それぞれ、α２−３モチーフおよびα２−６モチーフによる、コーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーのサンプリングを示す。立体配座マップにおける暗色領域は、所与の（φ，ψ）値のセットについてθパラメータ（Ｎｅｕ５ＡｃのＣ２原子と後続のＧａｌ糖およびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角）を計算するための外側境界として用いた。エネルギーカットオフに基づき、θ＞１１０°の値を用いてコーン様トポロジーを特徴付け、θ＜１００°の値を用いてアンブレラ様トポロジーを特徴付けた。θの外形を立体配座エネルギーマップと重ね合わせることにより、α２−３モチーフは、アンブレラ様トポロジーを取るにはエネルギー的に好適ではないので、１００％コーン様トポロジーを取ることが示された。他方、α２−６モチーフは、コーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングし、このサンプリングを、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合のω角（Ｏ−Ｃ６−Ｃ５−Ｈ５）に基づいて分類した。 図７は、ＨＡ残基のコーングリカントポロジーとの相互作用を、ＨＡ残基のアンブレラグリカントポロジーとの相互作用と対比して示す図である。ＨＡ−グリカン共結晶を解析することにより、Ｎｅｕ５ＡｃのＨＡとの結合部位に対する位置がほとんど不変であることが明らかとなる。Ｎｅｕ５Ａｃとの接触は、Ｆ９８、Ｓ／Ｔ１３６、Ｗ１５３、Ｈ１８３、およびＬ／Ｉ１９４など、高度に保存された残基を伴う。他の糖との接触は、糖の結合がα２−３結合であるかまたはα２−６結合であるか、およびグリカントポロジーがコーントポロジーであるかまたはアンブレラトポロジーであるかに応じて異なる残基を伴う。例えば、コーントポロジーでは、主要な接触が、Ｎｅｕ５Ａｃとの接触およびＧａｌ糖との接触である。Ｅ１９０およびＱ２２６は、この結合において特に重要な役割を果たす。この図はまた、コーン構造への結合に関与しうる他の位置（例えば、１３７位、１４５位、１８６位、１８７位、１９３位、２２２位）も例示する。場合によっては、異なる残基により、異なるグリカン構造との異なる接触がもたらされうる。これらの位置におけるアミノ酸の種類は、ＨＡポリペプチドがグリカン構造の修飾パターンおよび／または分枝パターンが異なる受容体に結合する能力に影響を及ぼしうる。アンブレラトポロジーでは、Ｎｅｕ５ＡｃおよびＧａｌを越えた糖との接触がもたらされる。この図は、アンブレラ構造への結合に関与しうる残基（例えば、１３７、１４５、１５６、１５９、１８６、１８７、１８９、１９０、１９２、１９３、１９６、２２２、２２５、２２６）を例示する。場合によっては、異なる残基により、異なるグリカン構造との異なる接触がもたらされうる。これらの位置におけるアミノ酸の種類は、ＨＡポリペプチドがグリカン構造の修飾パターンおよび／または分枝パターンが異なる受容体に結合する能力に影響を及ぼしうる。一部の実施形態では、１９０位におけるＤ残基および／または２２５位におけるＤ残基が、アンブレラトポロジーへの結合に寄与する。 図８は、例示的なコーントポロジーを示す図である。この図は、コーントポロジーを取る特定の例示的な（網羅的ではないが）グリカン構造を例示する。 図９は、例示的なアンブレラトポロジーを示す図である。（Ａ）アンブレラトポロジーを取りうる、特定の例示的な（網羅的ではないが）Ｎ結合型グリカン構造およびＯ結合型グリカン構造。（Ｂ）アンブレラトポロジーを取りうる、特定の例示的な（網羅的ではないが）Ｏ結合型グリカン構造。 図９は、例示的なアンブレラトポロジーを示す図である。（Ａ）アンブレラトポロジーを取りうる、特定の例示的な（網羅的ではないが）Ｎ結合型グリカン構造およびＯ結合型グリカン構造。（Ｂ）アンブレラトポロジーを取りうる、特定の例示的な（網羅的ではないが）Ｏ結合型グリカン構造。 図９は、例示的なアンブレラトポロジーを示す図である。（Ａ）アンブレラトポロジーを取りうる、特定の例示的な（網羅的ではないが）Ｎ結合型グリカン構造およびＯ結合型グリカン構造。（Ｂ）アンブレラトポロジーを取りうる、特定の例示的な（網羅的ではないが）Ｏ結合型グリカン構造。 図９は、例示的なアンブレラトポロジーを示す図である。（Ａ）アンブレラトポロジーを取りうる、特定の例示的な（網羅的ではないが）Ｎ結合型グリカン構造およびＯ結合型グリカン構造。（Ｂ）アンブレラトポロジーを取りうる、特定の例示的な（網羅的ではないが）Ｏ結合型グリカン構造。 図９は、例示的なアンブレラトポロジーを示す図である。（Ａ）アンブレラトポロジーを取りうる、特定の例示的な（網羅的ではないが）Ｎ結合型グリカン構造およびＯ結合型グリカン構造。（Ｂ）アンブレラトポロジーを取りうる、特定の例示的な（網羅的ではないが）Ｏ結合型グリカン構造。 図９は、例示的なアンブレラトポロジーを示す図である。（Ａ）アンブレラトポロジーを取りうる、特定の例示的な（網羅的ではないが）Ｎ結合型グリカン構造およびＯ結合型グリカン構造。（Ｂ）アンブレラトポロジーを取りうる、特定の例示的な（網羅的ではないが）Ｏ結合型グリカン構造。 図９は、例示的なアンブレラトポロジーを示す図である。（Ａ）アンブレラトポロジーを取りうる、特定の例示的な（網羅的ではないが）Ｎ結合型グリカン構造およびＯ結合型グリカン構造。（Ｂ）アンブレラトポロジーを取りうる、特定の例示的な（網羅的ではないが）Ｏ結合型グリカン構造。 図９は、例示的なアンブレラトポロジーを示す図である。（Ａ）アンブレラトポロジーを取りうる、特定の例示的な（網羅的ではないが）Ｎ結合型グリカン構造およびＯ結合型グリカン構造。（Ｂ）アンブレラトポロジーを取りうる、特定の例示的な（網羅的ではないが）Ｏ結合型グリカン構造。 図１０Ａ〜Ｂは、ヒト気管支上皮細胞およびヒト結腸上皮細胞のグリカンプロファイルを示す図である。上気道組織におけるグリカンの多様性をさらに探索するため、Ｎ結合型グリカンをＨＢＥ（代表的な上気道細胞系）から単離し、ＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いて解析した。ＨＢＥではα２−６の発現が優勢であることは、試料をシアリダーゼＳ（α２−３特異的）およびシアリダーゼＡ（切断酵素：ＳＡ）で前処理することにより確認された。長鎖の分枝状トポロジーを伴うグリカンの発現が優勢であることは、ＴＯＦ−ＴＯＦによる代表的な質量ピークのフラグメント化解析を介して裏付けられる。上気道組織におけるグリカンの多様性の基準を与えるため、ヒト結腸上皮細胞（ＨＴ２９細胞；代表的な消化管細胞系）のＮ結合型グリカンプロファイルを得た。最新型のＨ５Ｎ１ウイルスは、消化管細胞に感染することが示されているため、この細胞系を選択した。シアリダーゼＡおよびＳで前処理された対照により、ＨＴ−２９細胞では、α２−３グリカンの発現が優勢であることが示された。さらに、長鎖の分枝状グリカントポロジーは、ＨＢＥについて観察されるほど広くは見られない。したがって、Ｈ５Ｎ１ ＨＡのヒトへの適応は、ヒト上気道組織において発現する多様なグリカン（例えば、アンブレラグリカン）に高親和性で結合することを可能とする、ＨＡの突然変異を伴うであろう。 図１０Ａ〜Ｂは、ヒト気管支上皮細胞およびヒト結腸上皮細胞のグリカンプロファイルを示す図である。上気道組織におけるグリカンの多様性をさらに探索するため、Ｎ結合型グリカンをＨＢＥ（代表的な上気道細胞系）から単離し、ＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いて解析した。ＨＢＥではα２−６の発現が優勢であることは、試料をシアリダーゼＳ（α２−３特異的）およびシアリダーゼＡ（切断酵素：ＳＡ）で前処理することにより確認された。長鎖の分枝状トポロジーを伴うグリカンの発現が優勢であることは、ＴＯＦ−ＴＯＦによる代表的な質量ピークのフラグメント化解析を介して裏付けられる。上気道組織におけるグリカンの多様性の基準を与えるため、ヒト結腸上皮細胞（ＨＴ２９細胞；代表的な消化管細胞系）のＮ結合型グリカンプロファイルを得た。最新型のＨ５Ｎ１ウイルスは、消化管細胞に感染することが示されているため、この細胞系を選択した。シアリダーゼＡおよびＳで前処理された対照により、ＨＴ−２９細胞では、α２−３グリカンの発現が優勢であることが示された。さらに、長鎖の分枝状グリカントポロジーは、ＨＢＥについて観察されるほど広くは見られない。したがって、Ｈ５Ｎ１ ＨＡのヒトへの適応は、ヒト上気道組織において発現する多様なグリカン（例えば、アンブレラグリカン）に高親和性で結合することを可能とする、ＨＡの突然変異を伴うであろう。 図１１は、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３ＧａｌおよびＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌモチーフの立体配座マップおよび溶媒露出度を示す図である。パネルＡは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ結合の立体配座マップを示す図である。丸で囲われた領域２は、ＡＰＲ３４＿Ｈ１＿２３、ＡＤＵ６３＿Ｈ３＿２３、およびＡＤＳ９７＿Ｈ５＿２３による共結晶構造において観察されるトランス立体配座である。丸で囲われた領域１は、ＡＡＩ６８＿Ｈ３＿２３共結晶構造において観察される立体配座である。パネルＢは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌの立体配座マップであって、シス立体配座（丸で囲われた領域３）が、全てのＨＡ−α２−６シアル化グリカン共結晶構造において観察される立体配座マップを示す図である。パネルＣは、それぞれのＨＡ−グリカン共結晶構造のα２−３シアル化オリゴ糖におけるＮｅｕ５Ａｃの溶媒露出表面積（ＳＡＳＡ）と、α２−６シアル化オリゴ糖におけるＮｅｕ５ＡｃのＳＡＳＡとの差違を示す図である。赤色バーおよびシアンバーは、それぞれ、α２−６シアル化グリカンにおけるＮｅｕ５Ａｃ（正の値）、またはα２−３シアル化グリカンにおけるＮｅｕ５Ａｃ（負の値）が、グリカン結合部位との接触を増大させることを示す。パネルＤは、ブタおよびヒトのＨ１に結合したα２−３シアル化グリカン（Ｈ１α２−３）、トリおよびヒトのＨ３に結合したα２−３シアル化グリカン（Ｈ３α２−３）におけるＮｅｕＡｃのＳＡＳＡと、ブタおよびヒトのＨ１に結合したα２−６シアル化グリカン（Ｈ１α２−６）におけるＮｅｕＡｃのＳＡＳＡとの差違を示す図である。Ｈ３α２−３についての負のバーは、ヒトＨ３ ＨＡのＮｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌとの接触が、トリＨ３のＮｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌとの接触と比較して低度であることを示す。ねじれ角−φ：Ｃ２−Ｃ１−Ｏ−Ｃ３結合（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３／６結合の場合）；ψ：Ｃ１−Ｏ−Ｃ３−Ｈ３結合（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ結合の場合）またはＣ１−Ｏ−Ｃ６−Ｃ５結合（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合の場合）；ω：Ｏ−Ｃ６−Ｃ５−Ｈ５結合（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合の場合）。φ、ψマップは、Ｍａｒｔｉｎ Ｆｒａｎｋ博士およびＣｌａｕｓ−Ｗｉｌｈｅｌｍ ｖｏｎ ｄｅｒ Ｌｉｅｔｈ博士（Ｇｅｒｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により開発されたＧｌｙｃｏＭａｐｓ ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ／ｍｏｄｅｌｉｎｇ／ｇｌｙｃｏｍａｐｓｄｂ／）から得た。高エネルギー〜低エネルギーにわたる色分けのスキームは、それぞれ、明るい赤色〜明るい緑色とする。 図１１は、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３ＧａｌおよびＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌモチーフの立体配座マップおよび溶媒露出度を示す図である。パネルＡは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ結合の立体配座マップを示す図である。丸で囲われた領域２は、ＡＰＲ３４＿Ｈ１＿２３、ＡＤＵ６３＿Ｈ３＿２３、およびＡＤＳ９７＿Ｈ５＿２３による共結晶構造において観察されるトランス立体配座である。丸で囲われた領域１は、ＡＡＩ６８＿Ｈ３＿２３共結晶構造において観察される立体配座である。パネルＢは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌの立体配座マップであって、シス立体配座（丸で囲われた領域３）が、全てのＨＡ−α２−６シアル化グリカン共結晶構造において観察される立体配座マップを示す図である。パネルＣは、それぞれのＨＡ−グリカン共結晶構造のα２−３シアル化オリゴ糖におけるＮｅｕ５Ａｃの溶媒露出表面積（ＳＡＳＡ）と、α２−６シアル化オリゴ糖におけるＮｅｕ５ＡｃのＳＡＳＡとの差違を示す図である。赤色バーおよびシアンバーは、それぞれ、α２−６シアル化グリカンにおけるＮｅｕ５Ａｃ（正の値）、またはα２−３シアル化グリカンにおけるＮｅｕ５Ａｃ（負の値）が、グリカン結合部位との接触を増大させることを示す。パネルＤは、ブタおよびヒトのＨ１に結合したα２−３シアル化グリカン（Ｈ１α２−３）、トリおよびヒトのＨ３に結合したα２−３シアル化グリカン（Ｈ３α２−３）におけるＮｅｕＡｃのＳＡＳＡと、ブタおよびヒトのＨ１に結合したα２−６シアル化グリカン（Ｈ１α２−６）におけるＮｅｕＡｃのＳＡＳＡとの差違を示す図である。Ｈ３α２−３についての負のバーは、ヒトＨ３ ＨＡのＮｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌとの接触が、トリＨ３のＮｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌとの接触と比較して低度であることを示す。ねじれ角−φ：Ｃ２−Ｃ１−Ｏ−Ｃ３結合（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３／６結合の場合）；ψ：Ｃ１−Ｏ−Ｃ３−Ｈ３結合（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ結合の場合）またはＣ１−Ｏ−Ｃ６−Ｃ５結合（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合の場合）；ω：Ｏ−Ｃ６−Ｃ５−Ｈ５結合（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合の場合）。φ、ψマップは、Ｍａｒｔｉｎ Ｆｒａｎｋ博士およびＣｌａｕｓ−Ｗｉｌｈｅｌｍ ｖｏｎ ｄｅｒ Ｌｉｅｔｈ博士（Ｇｅｒｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により開発されたＧｌｙｃｏＭａｐｓ ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ／ｍｏｄｅｌｉｎｇ／ｇｌｙｃｏｍａｐｓｄｂ／）から得た。高エネルギー〜低エネルギーにわたる色分けのスキームは、それぞれ、明るい赤色〜明るい緑色とする。 図１１は、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３ＧａｌおよびＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌモチーフの立体配座マップおよび溶媒露出度を示す図である。パネルＡは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ結合の立体配座マップを示す図である。丸で囲われた領域２は、ＡＰＲ３４＿Ｈ１＿２３、ＡＤＵ６３＿Ｈ３＿２３、およびＡＤＳ９７＿Ｈ５＿２３による共結晶構造において観察されるトランス立体配座である。丸で囲われた領域１は、ＡＡＩ６８＿Ｈ３＿２３共結晶構造において観察される立体配座である。パネルＢは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌの立体配座マップであって、シス立体配座（丸で囲われた領域３）が、全てのＨＡ−α２−６シアル化グリカン共結晶構造において観察される立体配座マップを示す図である。パネルＣは、それぞれのＨＡ−グリカン共結晶構造のα２−３シアル化オリゴ糖におけるＮｅｕ５Ａｃの溶媒露出表面積（ＳＡＳＡ）と、α２−６シアル化オリゴ糖におけるＮｅｕ５ＡｃのＳＡＳＡとの差違を示す図である。赤色バーおよびシアンバーは、それぞれ、α２−６シアル化グリカンにおけるＮｅｕ５Ａｃ（正の値）、またはα２−３シアル化グリカンにおけるＮｅｕ５Ａｃ（負の値）が、グリカン結合部位との接触を増大させることを示す。パネルＤは、ブタおよびヒトのＨ１に結合したα２−３シアル化グリカン（Ｈ１α２−３）、トリおよびヒトのＨ３に結合したα２−３シアル化グリカン（Ｈ３α２−３）におけるＮｅｕＡｃのＳＡＳＡと、ブタおよびヒトのＨ１に結合したα２−６シアル化グリカン（Ｈ１α２−６）におけるＮｅｕＡｃのＳＡＳＡとの差違を示す図である。Ｈ３α２−３についての負のバーは、ヒトＨ３ ＨＡのＮｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌとの接触が、トリＨ３のＮｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌとの接触と比較して低度であることを示す。ねじれ角−φ：Ｃ２−Ｃ１−Ｏ−Ｃ３結合（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３／６結合の場合）；ψ：Ｃ１−Ｏ−Ｃ３−Ｈ３結合（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ結合の場合）またはＣ１−Ｏ−Ｃ６−Ｃ５結合（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合の場合）；ω：Ｏ−Ｃ６−Ｃ５−Ｈ５結合（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合の場合）。φ、ψマップは、Ｍａｒｔｉｎ Ｆｒａｎｋ博士およびＣｌａｕｓ−Ｗｉｌｈｅｌｍ ｖｏｎ ｄｅｒ Ｌｉｅｔｈ博士（Ｇｅｒｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により開発されたＧｌｙｃｏＭａｐｓ ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ／ｍｏｄｅｌｉｎｇ／ｇｌｙｃｏｍａｐｓｄｂ／）から得た。高エネルギー〜低エネルギーにわたる色分けのスキームは、それぞれ、明るい赤色〜明るい緑色とする。 図１１は、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３ＧａｌおよびＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌモチーフの立体配座マップおよび溶媒露出度を示す図である。パネルＡは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ結合の立体配座マップを示す図である。丸で囲われた領域２は、ＡＰＲ３４＿Ｈ１＿２３、ＡＤＵ６３＿Ｈ３＿２３、およびＡＤＳ９７＿Ｈ５＿２３による共結晶構造において観察されるトランス立体配座である。丸で囲われた領域１は、ＡＡＩ６８＿Ｈ３＿２３共結晶構造において観察される立体配座である。パネルＢは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌの立体配座マップであって、シス立体配座（丸で囲われた領域３）が、全てのＨＡ−α２−６シアル化グリカン共結晶構造において観察される立体配座マップを示す図である。パネルＣは、それぞれのＨＡ−グリカン共結晶構造のα２−３シアル化オリゴ糖におけるＮｅｕ５Ａｃの溶媒露出表面積（ＳＡＳＡ）と、α２−６シアル化オリゴ糖におけるＮｅｕ５ＡｃのＳＡＳＡとの差違を示す図である。赤色バーおよびシアンバーは、それぞれ、α２−６シアル化グリカンにおけるＮｅｕ５Ａｃ（正の値）、またはα２−３シアル化グリカンにおけるＮｅｕ５Ａｃ（負の値）が、グリカン結合部位との接触を増大させることを示す。パネルＤは、ブタおよびヒトのＨ１に結合したα２−３シアル化グリカン（Ｈ１α２−３）、トリおよびヒトのＨ３に結合したα２−３シアル化グリカン（Ｈ３α２−３）におけるＮｅｕＡｃのＳＡＳＡと、ブタおよびヒトのＨ１に結合したα２−６シアル化グリカン（Ｈ１α２−６）におけるＮｅｕＡｃのＳＡＳＡとの差違を示す図である。Ｈ３α２−３についての負のバーは、ヒトＨ３ ＨＡのＮｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌとの接触が、トリＨ３のＮｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌとの接触と比較して低度であることを示す。ねじれ角−φ：Ｃ２−Ｃ１−Ｏ−Ｃ３結合（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３／６結合の場合）；ψ：Ｃ１−Ｏ−Ｃ３−Ｈ３結合（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ結合の場合）またはＣ１−Ｏ−Ｃ６−Ｃ５結合（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合の場合）；ω：Ｏ−Ｃ６−Ｃ５−Ｈ５結合（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合の場合）。φ、ψマップは、Ｍａｒｔｉｎ Ｆｒａｎｋ博士およびＣｌａｕｓ−Ｗｉｌｈｅｌｍ ｖｏｎ ｄｅｒ Ｌｉｅｔｈ博士（Ｇｅｒｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により開発されたＧｌｙｃｏＭａｐｓ ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ／ｍｏｄｅｌｉｎｇ／ｇｌｙｃｏｍａｐｓｄｂ／）から得た。高エネルギー〜低エネルギーにわたる色分けのスキームは、それぞれ、明るい赤色〜明るい緑色とする。 図１２Ａ〜Ｂは、上気道組織切片のレクチン染色を示す図である。Ｊａｃａｌｉｎ（明色）およびＣｏｎＡ（暗色）で気管組織を共染色することにより、Ｊａｃａｌｉｎ（Ｏ結合型グリカンに特異的に結合する）の気管尖枝表面における杯細胞への優先的な結合、およびＣｏｎＡ（Ｎ結合型グリカンに特異的に結合する）の気管上皮絨毛細胞への優先的な結合が明らかになる。特定のいかなる理論により拘束されることも望まないが、本発明者らは、この知見により、杯細胞が主にＯ結合型グリカンを発現させるのに対し、上皮絨毛細胞は主にＮ結合型グリカンを発現させることが示唆されることに注目する。ＪａｃａｌｉｎおよびＳＮＡ（暗色；α２−６に特異的に結合する）で気管を共染色することにより、ＳＮＡの杯細胞および絨毛細胞の両方への結合が示される。他方、Ｊａｃａｌｉｎ（明色）およびα２−３シアル化グリカンに特異的に結合するＭＡＬ（暗色）による共染色は、ＭＡＬの気管の多列上皮への結合は微弱な最小の結合〜結合なしであるが、気管組織の基底領域への結合は広範であることを示す。併せて、レクチン染色データにより、気管上皮の先端側の絨毛細胞および杯細胞のそれぞれにおけるＮ結合型およびＯ結合型グリカンの両方の一部として、α２−６シアル化グリカンの発現が優勢であり分布が広範であることが示された。 図１２Ａ〜Ｂは、上気道組織切片のレクチン染色を示す図である。Ｊａｃａｌｉｎ（明色）およびＣｏｎＡ（暗色）で気管組織を共染色することにより、Ｊａｃａｌｉｎ（Ｏ結合型グリカンに特異的に結合する）の気管尖枝表面における杯細胞への優先的な結合、およびＣｏｎＡ（Ｎ結合型グリカンに特異的に結合する）の気管上皮絨毛細胞への優先的な結合が明らかになる。特定のいかなる理論により拘束されることも望まないが、本発明者らは、この知見により、杯細胞が主にＯ結合型グリカンを発現させるのに対し、上皮絨毛細胞は主にＮ結合型グリカンを発現させることが示唆されることに注目する。ＪａｃａｌｉｎおよびＳＮＡ（暗色；α２−６に特異的に結合する）で気管を共染色することにより、ＳＮＡの杯細胞および絨毛細胞の両方への結合が示される。他方、Ｊａｃａｌｉｎ（明色）およびα２−３シアル化グリカンに特異的に結合するＭＡＬ（暗色）による共染色は、ＭＡＬの気管の多列上皮への結合は微弱な最小の結合〜結合なしであるが、気管組織の基底領域への結合は広範であることを示す。併せて、レクチン染色データにより、気管上皮の先端側の絨毛細胞および杯細胞のそれぞれにおけるＮ結合型およびＯ結合型グリカンの両方の一部として、α２−６シアル化グリカンの発現が優勢であり分布が広範であることが示された。 図１３は、異なる遺伝的クレードにわたるＨ５Ｎ１ ＨＡのＲＢＳについての比較を示す図である。

図１４は、Ｓｔｅｖｅｎｓら、２００８年、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、３８１巻：１３８２〜９４頁を出典とする図である。Ｖｉｅｔ０３０４：Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４。Ｉｎｄ５０５：Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５。ＬＳ：ＨＡのＲＢＳにおけるＱ２２６Ｌ突然変異およびＧ２２８Ｓ突然変異。 図１５は、Ｖｉｅｔ０３０４−ＬＳ ＨＡおよびＶｉｅｔ０３０４−ＲＬＳ（Ｉｎｄ５０５−ＬＳと同等の突然変異体）ＨＡを、代表的なトリ受容体およびヒト受容体を含む本発明者らのグリカンアレイ上で用量依存的な形で解析したことを示す図である。いずれの突然変異体によっても、ヒト適応型ＨＡにより共有される高親和性によるα２−６結合と対照的な最小のα２−６結合（結合シグナルが観察されるのはＨＡ濃度が高いときに限られる）が示された。 図１６は、ＬＳ突然変異の文脈でＮ１５８におけるグリコシル化を欠くＨ５Ｎ１ ＨＡについての用量依存的な解析を示す図である。ＬＳ突然変異の文脈でＮ１５８におけるグリコシル化を除去したところ、ヒト受容体への結合親和性が、ヒト適応型Ｈ１Ｎ１ ＨＡおよびＨ２Ｎ２ ＨＡについて観察される範囲と同じ範囲（Ｋｄ’約２０ｐＭ）まで増大した。Ｈ５ ＨＡ鋳型のＮ１５８におけるグリコシル化をＱ２２６Ｌ突然変異だけ（すなわち、ＬＳ突然変異のうちのＧ２２８Ｓを伴わない）で除去したところ、ヒト受容体への優先性が改善される（トリ受容体への優先性を上回る）が、ヒト受容体への結合親和性は、Ｎ１５８において脱グリコシル化されたＬＳ突然変異体と比較して実質的に低下することが示された。 図１７は、ヒト適応型Ｈ２Ｎ２ ＨＡ（Ａｌｂ６＿５８）と、ヒト適応型Ｈ５Ｎ１（Ｖｉｅｔ１２０３＿０４）ＨＡとの間のＲＢＳの顕著な特徴の比較を示す図である。Ｈ２Ｎ２ ＨＡをＨ５Ｎ１ ＨＡと比較したときの４つの差違は、（１）欠失を包含するＨ２Ｎ２ ＨＡにおける１３０ループの組成物、（２）Ｈ２Ｎ２ ＨＡの１５８位におけるグリコシル化の欠如、（３）１３７位、２２１位、２２６位、および２２８位を伴うＲＢＳ底部のアミノ酸組成物、ならびに（４）１８８位、１９２位、および１９３位を伴うＲＢＳ上部のアミノ酸組成物を包含する。 図１８は、Ｈ５ ＨＡ突然変異体のＲＢＳの、Ｈ２Ｎ２ ＨＡのＲＢＳとの比較を示す図である。Ａ１ｂ６＿５８＿Ｈ２Ｎ２（配列番号８９）：Ａ／Ａｌｂａｎｙ／６／５８ Ｈ２Ｎ２ ＨＡ；Ｖｉｅｔ１２０３＿０４＿Ｄ（配列番号９０）：Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４ ＨＡの修飾形；Ｖｉｅｔ１２０３＿０４＿Ｄ＿Ｈ２ＲＢＳ（配列番号９１）：１３０位における欠失および１３カ所のアミノ酸置換を伴う、Ｖｉｅｔ１２０３＿０４＿Ｄの突然変異体；Ｖｉｅｔ１２０３＿０４＿Ｄ＿Ｈ２ＲＢＳｍｉｎ（配列番号９２）：１３０位における欠失および７カ所の置換を伴う、Ｖｉｅｔ１２０３＿０４＿Ｄの突然変異体；ｃｋＥｇｙ＿０７（配列番号９３）：１３０位における欠失を既に有するＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｅｇｙｐｔ／Ｒ２／２００７ Ｈ５Ｎ１ ＨＡ；ｃｋＥｇｙ＿０７＿Ｈ２ＲＢＳ（配列番号９４）：８カ所の置換を伴うｃｋＥｇｙ＿０７の突然変異体；ｃｋＶｉｅｔ＿０８（配列番号９５）：１９２位および１９３位における電荷のスイッチを既に有するＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｖｉｅｔｎａｍ／ＮＣＶＤ−０９３／２００８ Ｈ５Ｎ１ ＨＡ；ｃｋＶｉｅｔ＿０８＿Ｈ２ＲＢＳ（配列番号９６）：１３０位における欠失および６カ所の置換を伴うｃｋＶｉｅｔ＿０８の突然変異体；ｃｋＶｉｅｔ＿０８Ｈ２ＲＢＳｍｉｎ（配列番号９７）：１３０位における欠失および６カ所の置換を伴うｃｋＶｉｅｔ＿０８の突然変異体；ｃｋＶｉｅｔ＿０８＿Ｈ２ＲＢＳｍｉｎ（配列番号９８）：１３０位における欠失および４カ所の置換を伴うｃｋＶｉｅｔ＿０８の突然変異体。置換された残基の位置は、太字とし、かつ、強調する。１３０ループにおける欠失は、太字で強調して示す。１５８位におけるグリコシル化も強調する。 図１９は、そのＲＢＳの分子組成が、ヒト適応型Ｈ２Ｎ２ ＨＡの分子組成を模倣するように、デザインされたＨ５Ｎ１ ＨＡ（Ｖｉｅｔ１２０３＿０４＿Ｄ＿Ｈ２ＲＢＳ）の突然変異体についての用量依存的な解析を示す図である。この突然変異体は、他のヒト適応型ＨＡの特徴である高度に特異的な高親和性によるヒト受容体への結合を示す。この突然変異体のヒト受容体（６’ＳＬＮ−ＬＮ）に対する結合親和性は、ヒト適応型Ｈ１Ｎ１ ＨＡおよびヒト適応型Ｈ２Ｎ２ ＨＡのＫｄ’と同じ範囲にあるＫｄ’約３ｐＭで定量化される。 図２０は、流行性ＨＡに特徴的なグリカン−受容体間結合の特性を示す図である。原型的なヒト適応型で流行性の１９１８年型Ｈ１Ｎ１（Ｓ１）株および１９５８年型Ｈ２Ｎ２（Ｓ２）株および２００９年型Ｈ１Ｎ１（Ｓ３）株に由来するＨＡは、ヒト受容体（６’ＳＬＮ−ＬＮ）に対しては、特異的な高親和性による結合を示すが、トリ受容体（３’ＳＬＮ−ＬＮ）に対しては、最小〜実質的に低度の親和性による結合（ヒト受容体への親和性と比べて）を示す。他方、顕著な特徴であるＬＳ突然変異をＶｉｅｔ１２０３＿０４ Ｈ５Ｎ１ ＨＡの配列に導入しても、その受容体への優先性が、流行性ＨＡについて認められるヒト受容体への結合へとスイッチされることはない。 図２１は、ＨＡ亜型に由来する代表的な配列の系統樹を示す図である。クレード１およびクレード２のＨＡをもたらす分枝を標識し、それぞれ、赤色および青色で着色する。類縁の緊密な亜型は、互いに近接する分枝に配置する。 図２２は、Ｈ５ ＨＡのＲＢＳ内で重要な構造的特徴を示す図である。図では、これらのＨＡの間で異なるアミノ酸の側鎖を伴う、Ａｌｂ６＿５８ ＨＡ（グレー）およびＶｉｅｔ０３０４（緑色）のＲＢＳの模式図が示される。本文で記載されるＨ２のＲＢＳとＨ５のＲＢＳとを識別する４つの特徴を赤色点線の円で強調する。 図２３は、代表的なＨ２ ＨＡおよびＨ５ ＨＡのＲＢＳの配列アライメントを示す図である。流行性のＨ２Ｎ２株（Ａ／Ａｌｂａｎｙ／６／５８またはＡｌｂ５８）、１９９７年〜２００６年型株（Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８６／９７またはＨＫ＿４８６＿９７、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／２１３／０３またはＨＫ＿２１３＿０３、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４またはＶｉｅｔ１２０３＿０４、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５またはＩｎｄ＿５＿０５、Ａ／Ｅｇｙｐｔ／２７８６−ＮＡＭＲＵ３またはＥｇｙ＿２７８６−Ｎ３＿０６）に由来する代表的なヒト単離物に由来するＨＡ配列を、ＬＳ突然変異（ｃｋＥｇｙ＿０７ｍｕｔｖ５．３）を導入するのに選択されたＨ５ ＨＡ鋳型（Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｅｇｙｐｔ／Ｒ２／０７またはｃｋＥｇｙ＿０７）と共に配列決定する。 図２４は、ＬＳアミノ酸変化を保有するｃｋＥｇｙ＿０７およびｃｋＥｇｙ＿０７のグリカン受容体結合特性を示す図である。ＨＡの用量依存的な直接的グリカン結合は、代表的なヒト受容体およびトリ受容体を含むグリカンアレイプラットフォームにおいて実施した。パネルＡでは、野生型のｃｋＥｇｙ＿０７ ＨＡにより、他の野生型のＨ５Ｎ１ ＨＡに典型的な特異的でかつ高親和性によるトリ受容体への結合特徴が示される。パネルＢは、ＬＳ突然変異をこのＨＡに導入することにより、その特異性がヒト受容体（６’ＳＬＮ−ＬＮ）へと定量的にシフトされ、そのトリ受容体への結合が最小レベルへと実質的に低減されることを示す図である。パネルＣは、ｃｋＥｇｙ＿０７ ＬＳ突然変異体の、主にヒト気管組織切片の尖枝表面において発現する生理学的なヒト受容体への結合を示す図である。用量依存的な結合プロファイルに由来する、ヒト受容体に対する特異性および親和性は、突然変異体ＨＡによるヒト気管組織の染色と併せると、要求される他の変化（ＰＢ２の変化など）の文脈で、この突然変異体ＨＡを保有するＨ５Ｎ１ウイルスのエアロゾル伝染をもたらすのに十分でありうる程度の特異性および親和性である。 図２４は、ＬＳアミノ酸変化を保有するｃｋＥｇｙ＿０７およびｃｋＥｇｙ＿０７のグリカン受容体結合特性を示す図である。ＨＡの用量依存的な直接的グリカン結合は、代表的なヒト受容体およびトリ受容体を含むグリカンアレイプラットフォームにおいて実施した。パネルＡでは、野生型のｃｋＥｇｙ＿０７ ＨＡにより、他の野生型のＨ５Ｎ１ ＨＡに典型的な特異的でかつ高親和性によるトリ受容体への結合特徴が示される。パネルＢは、ＬＳ突然変異をこのＨＡに導入することにより、その特異性がヒト受容体（６’ＳＬＮ−ＬＮ）へと定量的にシフトされ、そのトリ受容体への結合が最小レベルへと実質的に低減されることを示す図である。パネルＣは、ｃｋＥｇｙ＿０７ ＬＳ突然変異体の、主にヒト気管組織切片の尖枝表面において発現する生理学的なヒト受容体への結合を示す図である。用量依存的な結合プロファイルに由来する、ヒト受容体に対する特異性および親和性は、突然変異体ＨＡによるヒト気管組織の染色と併せると、要求される他の変化（ＰＢ２の変化など）の文脈で、この突然変異体ＨＡを保有するＨ５Ｎ１ウイルスのエアロゾル伝染をもたらすのに十分でありうる程度の特異性および親和性である。 図２４は、ＬＳアミノ酸変化を保有するｃｋＥｇｙ＿０７およびｃｋＥｇｙ＿０７のグリカン受容体結合特性を示す図である。ＨＡの用量依存的な直接的グリカン結合は、代表的なヒト受容体およびトリ受容体を含むグリカンアレイプラットフォームにおいて実施した。パネルＡでは、野生型のｃｋＥｇｙ＿０７ ＨＡにより、他の野生型のＨ５Ｎ１ ＨＡに典型的な特異的でかつ高親和性によるトリ受容体への結合特徴が示される。パネルＢは、ＬＳ突然変異をこのＨＡに導入することにより、その特異性がヒト受容体（６’ＳＬＮ−ＬＮ）へと定量的にシフトされ、そのトリ受容体への結合が最小レベルへと実質的に低減されることを示す図である。パネルＣは、ｃｋＥｇｙ＿０７ ＬＳ突然変異体の、主にヒト気管組織切片の尖枝表面において発現する生理学的なヒト受容体への結合を示す図である。用量依存的な結合プロファイルに由来する、ヒト受容体に対する特異性および親和性は、突然変異体ＨＡによるヒト気管組織の染色と併せると、要求される他の変化（ＰＢ２の変化など）の文脈で、この突然変異体ＨＡを保有するＨ５Ｎ１ウイルスのエアロゾル伝染をもたらすのに十分でありうる程度の特異性および親和性である。 図２５は、ＬＳ突然変異の文脈で、１５８位におけるグリコシル化の喪失の、Ｈ５ ＨＡのグリカン受容体への結合に対する効果についての解析を示す図である。パネルＡでは、ｃｋＥｇｙ＿０７＿ＬＳ突然変異体が、他の流行性ＨＡに類似させるヒト受容体の定量的なスイッチを示す。パネルＢは、比較のための、先行研究を出典とするＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９ Ｈ１Ｎ１ ＨＡ（Ｓ３）株の結合曲線を示す。パネルＣは、Ｖｉｅｔ０３＿０４＿ＡＬＳ突然変異体におけるＴ１６０Ａ突然変異により、この位置におけるグリコシル化の喪失をもたらす、Ｎ１５８におけるグリコシル化のシークォン配列が除去されることを示す図である。この突然変異体は、ヒト受容体への結合の劇的な改善を示すが、流行性ＨＡおよびｃｋＥｇｙ＿０７＿ＬＳ突然変異体（上パネルに示す）に特徴的ではない、そのトリ受容体への結合の大半は保持する。パネルＤでは、天然で１５８位におけるグリコシル化を欠くＥｇｙ＿０６ＨＡ配列に導入されたＬＳアミノ酸突然変異がまた、Ｖｉｅｔ０３＿０４＿ＡＬＳ突然変異体と同じ結合プロファイルも示す。 図２５は、ＬＳ突然変異の文脈で、１５８位におけるグリコシル化の喪失の、Ｈ５ ＨＡのグリカン受容体への結合に対する効果についての解析を示す図である。パネルＡでは、ｃｋＥｇｙ＿０７＿ＬＳ突然変異体が、他の流行性ＨＡに類似させるヒト受容体の定量的なスイッチを示す。パネルＢは、比較のための、先行研究を出典とするＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９ Ｈ１Ｎ１ ＨＡ（Ｓ３）株の結合曲線を示す。パネルＣは、Ｖｉｅｔ０３＿０４＿ＡＬＳ突然変異体におけるＴ１６０Ａ突然変異により、この位置におけるグリコシル化の喪失をもたらす、Ｎ１５８におけるグリコシル化のシークォン配列が除去されることを示す図である。この突然変異体は、ヒト受容体への結合の劇的な改善を示すが、流行性ＨＡおよびｃｋＥｇｙ＿０７＿ＬＳ突然変異体（上パネルに示す）に特徴的ではない、そのトリ受容体への結合の大半は保持する。パネルＤでは、天然で１５８位におけるグリコシル化を欠くＥｇｙ＿０６ＨＡ配列に導入されたＬＳアミノ酸突然変異がまた、Ｖｉｅｔ０３＿０４＿ＡＬＳ突然変異体と同じ結合プロファイルも示す。 図２５は、ＬＳ突然変異の文脈で、１５８位におけるグリコシル化の喪失の、Ｈ５ ＨＡのグリカン受容体への結合に対する効果についての解析を示す図である。パネルＡでは、ｃｋＥｇｙ＿０７＿ＬＳ突然変異体が、他の流行性ＨＡに類似させるヒト受容体の定量的なスイッチを示す。パネルＢは、比較のための、先行研究を出典とするＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９ Ｈ１Ｎ１ ＨＡ（Ｓ３）株の結合曲線を示す。パネルＣは、Ｖｉｅｔ０３＿０４＿ＡＬＳ突然変異体におけるＴ１６０Ａ突然変異により、この位置におけるグリコシル化の喪失をもたらす、Ｎ１５８におけるグリコシル化のシークォン配列が除去されることを示す図である。この突然変異体は、ヒト受容体への結合の劇的な改善を示すが、流行性ＨＡおよびｃｋＥｇｙ＿０７＿ＬＳ突然変異体（上パネルに示す）に特徴的ではない、そのトリ受容体への結合の大半は保持する。パネルＤでは、天然で１５８位におけるグリコシル化を欠くＥｇｙ＿０６ＨＡ配列に導入されたＬＳアミノ酸突然変異がまた、Ｖｉｅｔ０３＿０４＿ＡＬＳ突然変異体と同じ結合プロファイルも示す。 図２５は、ＬＳ突然変異の文脈で、１５８位におけるグリコシル化の喪失の、Ｈ５ ＨＡのグリカン受容体への結合に対する効果についての解析を示す図である。パネルＡでは、ｃｋＥｇｙ＿０７＿ＬＳ突然変異体が、他の流行性ＨＡに類似させるヒト受容体の定量的なスイッチを示す。パネルＢは、比較のための、先行研究を出典とするＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９ Ｈ１Ｎ１ ＨＡ（Ｓ３）株の結合曲線を示す。パネルＣは、Ｖｉｅｔ０３＿０４＿ＡＬＳ突然変異体におけるＴ１６０Ａ突然変異により、この位置におけるグリコシル化の喪失をもたらす、Ｎ１５８におけるグリコシル化のシークォン配列が除去されることを示す図である。この突然変異体は、ヒト受容体への結合の劇的な改善を示すが、流行性ＨＡおよびｃｋＥｇｙ＿０７＿ＬＳ突然変異体（上パネルに示す）に特徴的ではない、そのトリ受容体への結合の大半は保持する。パネルＤでは、天然で１５８位におけるグリコシル化を欠くＥｇｙ＿０６ＨＡ配列に導入されたＬＳアミノ酸突然変異がまた、Ｖｉｅｔ０３＿０４＿ＡＬＳ突然変異体と同じ結合プロファイルも示す。 図２６は、天然で特徴２を獲得した、Ｈ５Ｎ１ ＨＡ配列におけるヒト適応型のアミノ酸変化を示す図である。Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｖｉｅｔｎａｍ／ＮＣＶＤ−０９３／２００８トリＨ５Ｎ１ ＨＡが、１９０螺旋において、典型的にＴｈｒを含む１９２位をＬｙｓへと突然変異させ、典型的にＬｙｓ／Ａｒｇを含む１９３位をＭｅｔへと突然変異させるアミノ酸変化を既に獲得している。６カ所のアミノ酸変化および欠失を導入して、特徴１（１３０ループにおける欠失＋Ａ１３０Ｔ）および特徴３（Ｓ１３７Ｒ／Ｓ２２１Ｐ／Ｑ２２６Ｌ／Ｓ２２７Ｇ／Ｇ２２８Ｓ）に合致させたところ、結果として、１５８位におけるグリコシル化の存在下であってもその優先性をヒト受容体へと定量的にスイッチする突然変異体のＨＡが得られた。しかし、ＬＳ突然変異を伴うが、１３０ループにおける欠失は伴わずに、Ｔ１６０Ａのグリコシル化の喪失の変化を導入したところ、結果として、ヒト受容体およびトリ受容体への結合の劇的な低減がもたらされた（データは示さない）。したがって、これらのＨ５Ｎ１ ＨＡの場合、ＬＳ突然変異の文脈では、１３０ループにおける欠失が、グリコシル化の喪失よりはるかに重要な変化である。 図２７は、近年のトリＨ５単離物およびヒトＨ５Ｎ１単離物における重要な特徴の出現を示す図である。パネルＡでは、それらのＨＡがＨ２ ＨＡ ＲＢＳの特徴１および４に合致するアミノ酸変化を獲得したトリＨ５Ｎ１単離物およびヒトＨ５Ｎ１単離物の百分率を、株が単離された年の関数としてプロットする。２００７年におけるそれらの最初の出現以来、これらの重要な特徴を有する単離物の百分率が劇的に増大している。これらの単離物の配列についての系統解析により、それらがクレード２．２．１に属することが示された。パネルＢは、それらのＨＡがＨ２ ＨＡ ＲＢＳの特徴２に合致するアミノ酸変化を獲得したトリ単離物およびヒト単離物の百分率を示す図である。この特徴を獲得したのは、Ｈ５Ｎ１単離物のうちのわずかな部分であるに過ぎない。ＮＣＢＩ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅに由来する全長の非冗長ＨＡ配列を配列決定し、所与の年における特徴の各々の発生数を計算し、百分率として表した。全長２２７７の非冗長Ｈ５Ｎ１配列を解析に用いた。 図２７は、近年のトリＨ５単離物およびヒトＨ５Ｎ１単離物における重要な特徴の出現を示す図である。パネルＡでは、それらのＨＡがＨ２ ＨＡ ＲＢＳの特徴１および４に合致するアミノ酸変化を獲得したトリＨ５Ｎ１単離物およびヒトＨ５Ｎ１単離物の百分率を、株が単離された年の関数としてプロットする。２００７年におけるそれらの最初の出現以来、これらの重要な特徴を有する単離物の百分率が劇的に増大している。これらの単離物の配列についての系統解析により、それらがクレード２．２．１に属することが示された。パネルＢは、それらのＨＡがＨ２ ＨＡ ＲＢＳの特徴２に合致するアミノ酸変化を獲得したトリ単離物およびヒト単離物の百分率を示す図である。この特徴を獲得したのは、Ｈ５Ｎ１単離物のうちのわずかな部分であるに過ぎない。ＮＣＢＩ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅに由来する全長の非冗長ＨＡ配列を配列決定し、所与の年における特徴の各々の発生数を計算し、百分率として表した。全長２２７７の非冗長Ｈ５Ｎ１配列を解析に用いた。 図２８は、グリカンアレイで用いられるグリカンの拡張命名法を示す図である。Ｎｅｕ５Ａｃ：Ｎ−アセチルＤ−ノイラミン酸、Ｇａｌ：Ｄ−ガラクトース、ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ−アセチルＤ−グルコサミン。α／β：ピラノース糖のアノマー配置。全ての糖は、スペーサーを介してビオチンに結合する（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｌｙｃｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ／ｓｔａｔｉｃ／ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｃｏｒｅｄ５．ｓｈｔｍｌにおいて記載されている−Ｓｐ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン）。
ＨＡ配列エレメントについての説明
ＨＡ配列エレメント１
ＨＡ配列エレメント１とは、天然のインフルエンザウイルス単離物中に見出される多くのＨＡタンパク質の残基９７〜１８５（ここでは、基準としてのＨ３ ＨＡを用いて残基の位置を割り当てる）にほぼ対応する配列エレメントである。この配列エレメントは、基本構造：
Ｃ（Ｙ／Ｆ）ＰＸ１ＣＸ２ＷＸ３ＷＸ４ＨＨＰ：
［配列中、
Ｘ１を約３０〜４５アミノ酸長とし、
Ｘ２を約５〜２０アミノ酸長とし、
Ｘ３を約２５〜３０アミノ酸長とし、
Ｘ４を約２アミノ酸長とする］
を有する。
一部の実施形態では、Ｘ１を約３５〜４５アミノ酸長、または約３５〜４３アミノ酸長、または約３５、３６、３７、３８、３８、４０、４１、４２、もしくは４３アミノ酸長とする。一部の実施形態では、Ｘ２を約９〜１５アミノ酸長、または約９〜１４アミノ酸長、または約９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４アミノ酸長とする。一部の実施形態では、Ｘ３を約２６〜２８アミノ酸長、または約２６、２７、もしくは２８アミノ酸長とする。一部の実施形態では、Ｘ４が、配列（Ｇ／Ａ）（Ｉ／Ｖ）を有する。一部の実施形態では、Ｘ４が、配列ＧＩを有し、一部の実施形態では、Ｘ４が、配列ＧＶを有し、一部の実施形態では、Ｘ４が、配列ＡＩを有し、一部の実施形態では、Ｘ４が、配列ＡＶを有する。一部の実施形態では、ＨＡ配列エレメント１が、ジスルフィド結合を含む。一部の実施形態では、このジスルフィド結合が、９７位および１３９位（本明細書で用いられるカノニカルのＨ３番号付けシステムに基づく）に対応する残基を架橋する。
一部の実施形態では、および特にＨ１ポリペプチドでは、Ｘ１を約４３アミノ酸長とし、かつ／またはＸ２を約１３アミノ酸長とし、かつ／またはＸ３を約２６アミノ酸長とする。一部の実施形態では、および特にＨ１ポリペプチドでは、ＨＡ配列エレメント１が、構造：
［配列中、
Ｘ１Ａを約２７〜４２アミノ酸長、または約３２〜４２アミノ酸長、または約３２〜４０アミノ酸長、または約２６〜４１アミノ酸長、または約３１〜４１アミノ酸長、または約３１〜３９アミノ酸長、または約３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０アミノ酸長とし、Ｘ２〜Ｘ４を上記の通りとする］
を有する。
一部の実施形態では、および特にＨ１ポリペプチドでは、ＨＡ配列エレメント１が、構造：
［配列中、
Ｘ１Ａを約２７〜４２アミノ酸長、または約３２〜４２アミノ酸長、または約３２〜４０アミノ酸長、または約３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０アミノ酸長とし、
Ｘ３Ａを約２３〜２８アミノ酸長、または約２４〜２６アミノ酸長、または約２４、２５、もしくは２６アミノ酸長とし、Ｘ２およびＸ４を上記の通りとする］
を有する。
一部の実施形態では、および特にＨ１ポリペプチドでは、ＨＡ配列エレメント１が、典型的にはＸ１内（Ｘ１Ａ内を含めた）にあり、とりわけ、Ｘ１の残基１２の近傍で始まる（例えば、図１〜３において例示される）配列：
を包含する。
一部の実施形態では、および特にＨ３ポリペプチドでは、Ｘ１を約３９アミノ酸長とし、かつ／またはＸ２を約１３アミノ酸長とし、かつ／またはＸ３を、約２６アミノ酸長とする。
一部の実施形態では、および特にＨ３ポリペプチドでは、ＨＡ配列エレメント１が、構造：
［配列中、
Ｘ１Ａを約２７〜４２アミノ酸長、または約３２〜４２アミノ酸長、または約３２〜４０アミノ酸長、または約２３〜３８アミノ酸長、または約２８〜３８アミノ酸長、または約２８〜３６アミノ酸長、または約２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０アミノ酸長とし、Ｘ２〜Ｘ４を上記の通りとする］
を有する。
一部の実施形態では、および特にＨ３ポリペプチドでは、ＨＡ配列エレメント１が、構造：
［配列中、
Ｘ１Ａを約２７〜４２アミノ酸長、または約３２〜４２アミノ酸長、または約３２〜４０アミノ酸長、または約３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０アミノ酸長とし、
Ｘ３Ａを約２３〜２８アミノ酸長、または約２４〜２６アミノ酸長、または約２４、２５、もしくは２６アミノ酸長とし、Ｘ２およびＸ４を上記の通りとする］
を有する。
一部の実施形態では、および特にＨ３ポリペプチドでは、ＨＡ配列エレメント１が、典型的にはＸ１内（Ｘ１Ａ内を含めた）にあり、とりわけ、Ｘ１の残基１２の近傍で始まる（例えば、図１、２、および４において例示される）配列：
を包含する。
一部の実施形態では、および特にＨ５ポリペプチドでは、Ｘ１を約４２アミノ酸長とし、かつ／またはＸ２を約１３アミノ酸長とし、かつ／またはＸ３を約２６アミノ酸長とする。
一部の実施形態では、および特にＨ５ポリペプチドでは、ＨＡ配列エレメント１が、構造：
［配列中、
Ｘ１Ａを約２７〜４２アミノ酸長、または約３２〜４２アミノ酸長、または約３２〜４０アミノ酸長、または約２３〜３８アミノ酸長、または約２８〜３８アミノ酸長、または約２８〜３６アミノ酸長、または約２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０アミノ酸長とし、Ｘ２〜Ｘ４を上記の通りとする］
を有する。
一部の実施形態では、および特にＨ５ポリペプチドでは、ＨＡ配列エレメント１が、構造：
［配列中、
Ｘ１Ａを約２７〜４２アミノ酸長、または約３２〜４２アミノ酸長、または約３２〜４０アミノ酸長、または約３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０アミノ酸長とし、
Ｘ３Ａを約２３〜２８アミノ酸長、または約２４〜２６アミノ酸長、または約２４、２５、もしくは２６アミノ酸長とし、Ｘ２およびＸ４を上記の通りとする］
を有する。
一部の実施形態では、および特にＨ５ポリペプチドでは、ＨＡ配列エレメント１を、配列：
により伸長させる（すなわち、残基１８６〜１９３に対応する位置において）。
一部の実施形態では、および特にＨ５ポリペプチドでは、ＨＡ配列エレメント１が、典型的にはＸ１内にあり、とりわけ、Ｘ１の残基６の近傍で始まる（例えば、図１、２、および５において例示される）配列：

を包含する。
ＨＡ配列エレメント２
ＨＡ配列エレメント２とは、天然のインフルエンザウイルス単離物中に見出される多くのＨＡタンパク質の残基３２４〜３４０（ここでもまた、Ｈ３ ＨＡに基づく番号付けシステムを用いる）にほぼ対応する配列エレメントである。この配列エレメントは、基本構造：
を有する。一部の実施形態では、ＨＡ配列エレメント２が配列：
［配列中、
Ｘ１を約４〜１４アミノ酸長、または約８〜１２アミノ酸長、または約１２、１１、１０、９、もしくは８アミノ酸長とする］
を有する。一部の実施形態では、この配列エレメントが、ＨＡ１およびＨＡ２の生成を可能とするＨＡ０の切断部位をもたらす。
一部の実施形態では、および特にＨ１ポリペプチドでは、ＨＡ配列エレメント２が、構造：
［配列中、
Ｘ１Ａを約３アミノ酸長とし、一部の実施形態では、Ｘ１ＡをＧ（Ｌ／Ｉ）Ｆとする］
を有する。
一部の実施形態では、および特にＨ３ポリペプチドでは、ＨＡ配列エレメント２が、構造：
［配列中、
Ｘ１Ａを約３アミノ酸長とし、一部の実施形態では、Ｘ１ＡをＧ（Ｌ／Ｉ）Ｆとする］
を有する。
一部の実施形態では、および特にＨ５ポリペプチドでは、ＨＡ配列エレメント２が、構造：
［配列中、
Ｘ１Ａを約３アミノ酸長とし、一部の実施形態では、Ｘ１ＡをＧ（Ｌ／Ｉ）Ｆとする］
を有する。
定義
親和性：当技術分野で公知の「親和性」とは、特定のリガンド（例えば、ＨＡポリペプチド）がそのパートナー（例えば、ＨＡ受容体）に結合する緊密さの尺度である。親和性は、異なる方法で測定することができる。
結合：本明細書で用いられる「結合」という用語とは典型的に、薬剤間（ｂｅｔｗｅｅｎまたはａｍｏｎｇ）における非共有結合的会合を指すことが理解されるであろう。本明細書の多くの実施形態では、結合が、特定のグリカン（例えば、アンブレラトポロジーグリカンまたはコーントポロジーグリカン）との関係で提起される。当業者は、このような結合を多様な文脈のうちのいずれにおいても評価しうることを理解するであろう。一部の実施形態では、結合を、遊離グリカンとの関係で評価する。一部の実施形態では、結合を、担体に結合した（例えば、これに共有結合的に連結された）グリカンとの関係で評価する。一部のこのような実施形態では、担体がポリペプチドである。一部の実施形態では、結合を、ＨＡ受容体に結合したグリカンとの関係で評価する。このような実施形態では、受容体への結合について言及する場合もあり、グリカンへの結合について言及する場合もある。
結合剤：本明細書では一般に、「結合剤」という用語を用いて、本明細書で記載される、グリカンに結合する（例えば、アンブレラトポロジーグリカンに結合する）任意の実体を指す。結合剤は、任意の化学的種類としうる。一部の実施形態では、結合剤をポリペプチド（例えば、抗体または抗体断片を含めた）とし、一部のこのような実施形態では、結合剤を、ＨＡポリペプチドおよび／またはそれらの変異体および／またはそれらの特徴的部分とし、一部の実施形態では、結合剤を、それらのアミノ酸配列をＨＡに特徴的な配列を包含しないポリペプチド（すなわち、「非ＨＡポリペプチド」）とする。一部の実施形態では、結合剤を低分子とする。一部の実施形態では、結合剤を核酸とする。一部の実施形態では、結合剤をアプタマーとする。一部の実施形態では、結合剤をポリマーとし、一部の実施形態では、結合剤を非ポリマー性とする。一部の実施形態では、結合剤を炭水化物とする。一部の実施形態では、結合剤をレクチンとする。一部の実施形態では、本明細書で記載される結合剤が、アンブレラ様トポロジーを有するシアル化グリカンに結合する。一部の実施形態では、結合剤が、高度な親和性および／または特異性でアンブレラトポロジーグリカンに結合する。一部の実施形態では、結合剤が、コーントポロジーグリカンと比較して、アンブレラトポロジーグリカンに対する結合優先性を示す。一部の実施形態では、結合剤が、血球凝集素受容体におけるグリカンへの結合について血球凝集素と競合する。一部の実施形態では、結合剤が、アンブレラトポロジーグリカンへの結合について血球凝集素と競合する。一部の実施形態では、本明細書で提供される結合剤を、アンブレラトポロジーの遮断剤とする。一部の実施形態では、本明細書で提供される結合剤を、アンブレラトポロジーの特異的遮断剤とする。一部の実施形態では、結合剤が、アンブレラトポロジーグリカンの模倣体に結合する。
生物学的に活性：本明細書で用いられる「生物学的に活性」という語句は、生体系において、特に、生物において活性を有する任意の薬剤の特徴を指す。例えば、生物に投与すると、その生物に対して生物学的効果を及ぼす薬剤を、生物学的に活性であると考える。一部の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドが生物学的に活性である場合、タンパク質またはポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を共有するそのタンパク質またはポリペプチドの部分を、典型的に「生物学的活性」部分と称する。
特徴的部分：本明細書で用いられる、タンパク質またはポリペプチドの「特徴的部分」という語句は、併せてタンパク質またはポリペプチドの特徴となるアミノ酸の連続的な連なり、またはアミノ酸の連続的な連なりの集合を含有する部分である。このような連続的な連なりの各々は一般に、少なくとも２アミノ酸を含有する。さらに、当業者は、典型的に、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０以上のアミノ酸が、タンパク質の特徴となるように要求されることを理解するであろう。一般に、特徴的部分とは、上記で指定した配列同一性に加えて、少なくとも１つの機能的特徴を関連するインタクトタンパク質と共有する部分である。
特徴的配列：「特徴的配列」とは、ポリペプチドまたは核酸の全てのファミリーメンバー中に見出され、したがって、当業者がそのファミリーのメンバーを規定するのに用いうる配列である。
コーントポロジー：本明細書では、「コーントポロジー」という語句を用いて、特定のグリカン、特にＨＡ受容体におけるグリカンが取る３次元的配置を指す。図６に例示される通り、コーントポロジーは、α２−３シアル化グリカンが取る場合もあり、α２−６シアル化グリカンが取る場合もあり、短鎖オリゴ糖に典型的であるが、また、一部の長鎖オリゴ糖もこの立体配座を取る場合がある。コーントポロジーは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌグリコシド結合のねじれ角であって、立体配座のエネルギーを最小とする３つの領域（図１１）をサンプリングし、約−６０、約６０、または約１８０のφ（Ｃ１−Ｃ２−Ｏ−Ｃ３／Ｃ６）値ならびに−６０〜６０のψ（Ｃ２−Ｏ−Ｃ３／Ｃ６−Ｈ３／Ｃ５）によって与えられるねじれ角を特徴とする。図８は、コーントポロジーを取るグリカンの特定の代表的な（網羅的ではないが）例を示す。
〜に対応する：本明細書で用いられる「〜に対応する」という用語は、ＨＡポリペプチド中のアミノ酸残基の位置／同一性を指示するのに用いられることが多い。当業者は、本明細書では簡潔さの目的で、例えば、１９０位の残基「に対応する」アミノ酸が、実際に特定のアミノ酸鎖の１９０番目のアミノ酸である必要はなく、むしろ、野生型のＨ３ ＨＡの１９０位に見出される残基に対応するように、カノニカルの番号付けシステム（野生型のＨ３ ＨＡに基づく）を用いる（例えば、図１〜５で例示される）ことを理解するであろう。対応するアミノ酸をどのようにして同定するかは、当業者が容易に理解する。
分離度〜次で隔てられた：本明細書で用いられる「分離度〜次で隔てられた」アミノ酸とは、グリカン結合に対して間接的な効果を及ぼすＨＡのアミノ酸である。例えば、分離度１次で隔てられたアミノ酸は、（１）直接的に結合するアミノ酸と相互作用する場合もあり、かつ／または（２）直接的に結合するアミノ酸が宿主細胞のＨＡ受容体と会合するグリカンと相互作用する能力に他の形で影響を及ぼす場合もあり、このような分離度１次で隔てられたアミノ酸は、グリカン自体に直接結合する場合もあり、結合しない場合もある。分離度２次で隔てられたアミノ酸は、（１）分離度１次で隔てられたアミノ酸と相互作用し、かつ／または（２）分離度１次で隔てられたアミノ酸が直接的に結合するアミノ酸などと相互作用する能力に他の形で影響を及ぼす。
直接的に結合するアミノ酸：本明細書で用いられる「直接的に結合するアミノ酸」という語句は、宿主細胞のＨＡ受容体と会合する１またはそれより多くのグリカンと直接的に相互作用する、ＨＡポリペプチドのアミノ酸を指す。
操作された：本明細書で用いられる「操作された」という用語は、それらのアミノ酸配列が人間により選択されているポリペプチドについて記載する。例えば、操作されたＨＡポリペプチドのアミノ酸配列は、天然のインフルエンザウイルス単離物中に見出されるＨＡポリペプチドのアミノ酸配列と異なる。一部の実施形態では、操作されたＨＡポリペプチドのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベース中に包含されるＨＡポリペプチドのアミノ酸配列と異なる。
Ｈ１ポリペプチド：本明細書で用いられる「Ｈ１ポリペプチド」という用語は、それらのアミノ酸配列が、Ｈ１の特徴であり、Ｈ１を他のＨＡ亜型から識別する少なくとも１つの配列エレメントを包含するＨＡポリペプチドである。このような代表的な配列エレメントは、例えば、図１〜３で例示されるアライメントなどのアライメントにより決定することができ、これらには例えば、ＨＡ配列エレメントのＨ１特異的な実施形態との関係において本明細書で記載されるものが含まれる。
Ｈ３ポリペプチド：本明細書で用いられる用語「Ｈ３ポリペプチド」とは、それらのアミノ酸配列が、Ｈ３の特徴であり、Ｈ３を他のＨＡ亜型から識別する少なくとも１つの配列エレメントを包含するＨＡポリペプチドである。このような代表的な配列エレメントは、例えば、図１、２、および４で例示されるアライメントなどのアライメントにより決定することができ、これらには例えば、ＨＡ配列エレメントのＨ３特異的な実施形態との関係において本明細書で記載されるものが含まれる。
Ｈ５ポリペプチド：本明細書で用いられる用語「Ｈ５ポリペプチド」とは、それらのアミノ酸配列が、Ｈ５の特徴であり、Ｈ５を他のＨＡ亜型から識別する少なくとも１つの配列エレメントを包含するＨＡポリペプチドである。このような代表的な配列エレメントは、例えば、図１、２、および５で例示されるアライメントなどのアライメントにより決定することができ、これらには例えば、ＨＡ配列エレメントのＨ５特異的な実施形態との関係において本明細書で記載されるものが含まれる。
ＨＸポリペプチド：本明細書で用いられる用語「ＨＸポリペプチド」とは、それらのアミノ酸配列が、ＨＸの特徴であり、ＨＸを他のＨＡ亜型から識別する少なくとも１つの配列エレメントを包含するＨＡポリペプチドであり、この場合、「Ｘ」とは、ＨＡ亜型の番号付け（例えば、「Ｘ」＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６とすると、それぞれ、「ＨＸ」＝Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、またはＨ１６となる）を指す。
血球凝集素（ＨＡ）ポリペプチド：本明細書で用いられる「血球凝集素ポリペプチド」（または「ＨＡポリペプチド」）という用語は、それらのアミノ酸配列が、ＨＡの少なくとも１つの特徴的配列を包含するポリペプチドを指す。当技術分野では、インフルエンザウイルス単離物に由来する多種多様なＨＡ配列が公知であり、実際、米国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）は、本出願の出願時現在で９７９６のＨＡ配列を包含するデータベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＦＬＵ／ｆｌｕ．ｈｔｍｌ）を維持している。当業者は、このデータベースを参照することにより、一般にＨＡポリペプチドの特徴である配列を容易に同定することもでき、かつ／もしくは特定のＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、またはＨ１６のポリペプチド）の特徴である配列を容易に同定することもでき、特定の宿主、例えば、トリ、ラクダ、イヌ、ネコ、ジャコウネコ、環境、ウマ、ヒト、ヒョウ、ミンク、マウス、アザラシ、ムナジロテン、ブタ、トラ、クジラなどの感染を媒介するＨＡの特徴である配列を容易に同定することもできる。例えば、一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドが、インフルエンザウイルスの天然の単離物中に見出されるＨＡタンパク質の残基９７の近傍と１８５の近傍との間、３２４の近傍と３４０の近傍との間、９６の近傍と１００の近傍との間、および／または１３０の近傍と２３０の近傍との間で見出される１またはそれより多くの特徴的配列エレメントを包含する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドが、本明細書で規定されるＨＡ配列エレメント１および２のうちの少なくとも１つを含むアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドが、ＨＡ配列エレメント１および２を含み、一部の実施形態では、互いに約１００〜約２００、または約１２５〜約１７５、または約１２５〜約１６０、または約１２５〜約１５０、または約１２９〜約１３９、または約１２９、約１３０、約１３１、約１３２、約１３３、約１３４、約１３５、約１３６、約１３７、約１３８、もしくは約１３９アミノ酸隔てられたアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドが、グリカン結合に関与する領域９６〜１００および／または１３０〜２３０内の位置にある残基を包含するアミノ酸配列を有する。例えば、多くのＨＡポリペプチドは、以下の残基：Ｔｙｒ９８、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ１３６、Ｔｒｐ１５３、Ｈｉｓ１８３、およびＬｅｕ／Ｉｌｅ１９４のうちの１またはそれより多くを包含する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドが、これらの残基のうちの少なくとも２つ、３つ、４つ、または５つ全てを包含する。
単離された：本明細書で用いられる「単離された」という用語は、（ｉ）当初生成した（天然でまたは実験環境において）ときに会合していた成分のうちの少なくとも一部から分離されているか、または（ｉｉ）人工的に生成させた薬剤または実体を指す。単離された薬剤または実体は、それらが当初会合していた他の成分のうちの少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％以上から分離することができる。一部の実施形態では、単離された薬剤が、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を超えて純粋である。
結合特異的遮断剤（ＬＳＢＡ）：本明細書で用いられる「結合特異的遮断剤」という用語は、α２−６シアル化グリカンを有するＨＡ受容体に結合する薬剤を指す。一部の実施形態では、ＬＳＢＡが、α２−６シアル化グリカンを有するＨＡ受容体に、α２−３シアル化グリカンを有するＨＡ受容体に対する親和性の少なくとも約４０、５０、または７５％の親和性で選択的に結合する。一部の実施形態では、ＬＳＢＡが、α２−６シアル化グリカンを有するＨＡ受容体に、α２−３シアル化グリカンを有するＨＡ受容体に対する親和性の少なくとも約２、４、５、または１０倍の親和性で選択的に結合する。一部の実施形態では、ＬＳＢＡのα２−６シアル化グリカンに対する親和性が、α２−３シアル化グリカンに対するその親和性の少なくとも５０、１００、１５０、または２００％である。一部の実施形態では、ＬＳＢＡが、ＨＡ受容体への結合について血球凝集素と競合しうる。例えば、ＬＳＢＡは、結合特徴（例えば、α２−６シアル化グリカンまたはα２−３シアル化グリカン）に基づき、インフルエンザウイルス粒子（例えば、ヒトインフルエンザウイルスまたはトリインフルエンザウイルス）のＨＡ受容体への結合を選択的に阻害しうる。一部の実施形態では、ＬＳＢＡをポリペプチドとする。一部のこのような実施形態では、ＬＳＢＡポリペプチドが、天然のポリペプチドのアミノ酸配列と実質的に同一であるかまたは実質的に相同であるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＬＳＢＡポリペプチドをＨＡポリペプチドとする。一部の実施形態では、ＬＳＢＡポリペプチドを、天然のＨＡポリペプチドまたはその断片とする。一部の実施形態では、ＬＳＢＡポリペプチドが、ＨＡポリペプチドのアミノ酸配列とは類縁でないアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＬＳＢＡポリペプチドを、抗体またはその断片とする。一部の実施形態では、ＬＳＢＡポリペプチドを、レクチン（例えば、ＳＮＡ−１）とする。一部の実施形態では、ＬＳＢＡをポリペプチドでないとする。一部の実施形態では、ＬＳＢＡを低分子とする。一部の実施形態では、ＬＳＢＡを核酸とする。
長鎖オリゴ糖：本開示の目的では、それが少なくとも４つの糖残基を有する少なくとも１つの直鎖を包含する場合に典型的に、オリゴ糖を「長鎖」であると考える。
非天然アミノ酸：「非天然アミノ酸」という語句は、アミノ酸の化学構造（すなわち：
であり、したがって、少なくとも２つのペプチド結合に関与することが可能であるが、天然で見出されるＲ基と異なるＲ基を有する）を有する実体を指す。一部の実施形態では、非天然アミノ酸はまた、水素ではなく、第２のＲ基も有する場合もあり、かつ／またはアミノ酸部分またはカルボン酸部分において１またはそれより多くの他の置換を有する場合もある。
ポリペプチド：一般的に述べると、「ポリペプチド」とは、ペプチド結合を介して互いに結合した少なくとも２アミノ酸の連なりである。一部の実施形態では、ポリペプチドが、それらの各々が少なくとも１つのペプチド結合を介して他のアミノ酸に結合した、少なくとも３〜５アミノ酸を包含しうる。当業者は、ポリペプチドが場合によって、「非天然」アミノ酸または他の実体であるにもかかわらず、場合によってポリペプチド鎖へと組み込まれることが可能な「非天然」アミノ酸または他の実体も包含することを理解するであろう。
純粋な：本明細書で用いられる薬剤または実体は、それが実質的に他の成分を含まない場合に「純粋」である。例えば、特定の薬剤または実体を約９０％超含有する調製物を、典型的に純粋な調製物であると考える。一部の実施形態では、薬剤または実体が、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％純粋である。
短鎖オリゴ糖：本開示の目的では、任意の直鎖においてそれが有する残基が４未満、または確実に３未満である場合に典型的に、オリゴ糖を「短鎖」であると考える。
特異性：当技術分野において公知の「特異性」とは、特定のリガンド（例えば、ＨＡポリペプチド）が、その結合パートナー（例えば、ヒトＨＡ受容体、特にヒト上気道ＨＡ受容体）を、他の潜在的な結合パートナー（例えば、トリＨＡ受容体）から識別する能力の尺度である。
実質的な相同性：本明細書では、「実質的な相同性」という語句を用いて、アミノ酸配列または核酸配列の間の比較を指す。当業者が理解する通り、一般に、それらが対応する位置において相同な残基を含有する場合に２つの配列を「実質的に相同」であると考える。相同な残基は、同一な残基の場合がある。代替的に、相同な残基は、適切な形で同様の構造的特徴および／または機能的特徴を有する同一でない残基でもありうる。例えば、当業者に周知である通り、特定のアミノ酸は、「疎水性」アミノ酸もしくは「親水性」アミノ酸として、かつ／または「極性」側鎖もしくは「非極性」側鎖を有するものとして典型的に分類される。１つのアミノ酸の別の同じ種類のアミノ酸への置換は、「相同」置換と考えうることが多い。典型的なアミノ酸の類別を以下にまとめる。
当技術分野において周知である通り、アミノ酸配列または核酸配列は、ヌクレオチド配列用のＢＬＡＳＴＮ、ならびにアミノ酸配列用のＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなど、市販のコンピュータプログラムにおいて使用可能なアルゴリズムを含めた各種のアルゴリズムのうちのいずれかを用いて比較することができる。例示的なこのようなプログラムは、これらの後出の全てが参照により本明細書に組み込まれる、
において記載されている。相同な配列を同定するステップに加えて、上述のプログラムは典型的に、相同性の程度の指標ももたらす。一部の実施形態では、それらの対応する残基のうちの少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％以上が関連する残基の連なりにわたり相同である場合に、２つの配列を実質的に相同であると考える。一部の実施形態では、関連する連なりを、完全な配列とする。一部の実施形態では、関連する連なりを、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２２５、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００、少なくとも３２５、少なくとも３５０、少なくとも３７５、少なくとも４００、少なくとも４２５、少なくとも４５０、少なくとも４７５、少なくとも５００以上の残基とする。
実質的同一性：本明細書では、「実質的同一性」という語句を用いて、アミノ酸配列または核酸配列の間の比較を指す。当業者が理解する通り、一般に、それらが対応する位置において同一な残基を含有する場合に、２つの配列を「実質的に同一」であると考える。当技術分野において周知である通り、アミノ酸配列または核酸配列は、ヌクレオチド配列用のＢＬＡＳＴＮ、ならびにアミノ酸配列用のＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなど、市販のコンピュータプログラムにおいて使用可能なアルゴリズムを含めた各種のアルゴリズムのうちのいずれかを用いて比較することができる。例示的なこのようなプログラムは、これらの後出の全てが参照により本明細書に組み込まれる、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、「Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ」、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２１５巻（３号）：４０３〜４１０頁、１９９０年；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、「Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ： ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５巻：３３８９〜３４０２頁、１９９７年；Ｂａｘｅｖａｎｉｓら、「Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｗｉｌｅｙ、１９９８年；およびＭｉｓｅｎｅｒら（編）、「Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、１３２巻）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、１９９９年において記載されている。同一な配列を同定するステップに加えて、上述のプログラムは典型的に、同一性の程度の指標ももたらす。一部の実施形態では、それらの対応する残基のうちの少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％以上が関連する残基の連なりにわたり同一である場合に、２つの配列を実質的に同一であると考える。一部の実施形態では、関連する連なりを、完全な配列とする。一部の実施形態では、関連する連なりを、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２２５、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００、少なくとも３２５、少なくとも３５０、少なくとも３７５、少なくとも４００、少なくとも４２５、少なくとも４５０、少なくとも４７５、少なくとも５００以上の残基とする。
治療剤：本明細書で用いられる「治療剤」という語句は、所望の生物学的または薬理学的効果を誘発する任意の薬剤を指す。
処置：本明細書で用いられる「処置」という用語は、疾患、障害、または状態の１またはそれより多くの症状または様相を緩和するか、これらの発症を遅延させるか、これらの重症度もしくは発症率の低減またはこれらの予防をもたらすのに用いられる任意の方法を指す。本発明の目的では、症状の発症前に処置を行うこともでき、症状の発症時に処置を行うこともでき、かつ／または症状の発症後に処置を行うこともできる。
アンブレラトポロジー：本明細書では、「アンブレラトポロジー」という語句を用いて、特定のグリカン、特にＨＡ受容体におけるグリカンが取る３次元的配置を指す。本発明は、アンブレラトポロジーグリカンへの結合が、ヒト宿主の感染を媒介するＨＡタンパク質の特徴であることの認識を包含する。図６で例示する通り、アンブレラトポロジーを典型的に取るのは、α２−６シアル化グリカンだけであり、長鎖（例えば、四糖より長い）オリゴ糖に典型的である。一部の実施形態では、アンブレラトポロジーグリカンが、図６（右パネル）に提示される構造と実質的に同様の３次元構造を呈示するグリカンである。一部の実施形態では、アンブレラトポロジーグリカンが、図６（右パネル）に示されるアミノ酸残基を介してＨＡポリペプチドに接触するグリカンである。一部の実施形態では、アンブレラトポロジーグリカンが、図６（右パネル）に示されるアミノ酸結合ポケットに接触し、かつ／または特異的に結合することが可能なグリカンである。一部の実施形態では、グリカンの構造的トポロジーを、ＳｉａのＣ２、ＧａｌのＣ１、およびＧｌｃＮＡｃのＣ１の間の角として定義されるパラメータであるθに基づいて分類する。θ＜１００°の値は、α２−３グリカンおよび短鎖α２−６グリカンが取るコーン様トポロジーを表す。θ＞１１０°の値は、長鎖α２−６グリカンが取るトポロジーなどのアンブレラ様トポロジーを表す（図６）。アンブレラトポロジーの例は、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合の角φ約−６０によって与えられる（例えば、図１１を参照されたい）。図９は、アンブレラトポロジーを取りうるグリカンの特定の代表的な（網羅的ではないが）例を示す。図９に提示される長鎖α２−６モチーフは、非還元末端において生物学的なＮ結合型グリカン、Ｏ結合型グリカン、および糖脂質の一部として見出される長鎖（例えば、少なくとも三糖である）に結合するＮｅｕ５Ａｃα２−６を包含する。枠囲いした挿入図は、高親和性でＨＡに結合する生物学的グリカンの一部として見出されるアンブレラトポロジーの長鎖α２−６グリカン部分の例を示す。一部の実施形態では、アンブレラトポロジーグリカン（例えば、１つの部位における）が、短鎖α２−６（例えば、単一のラクトサミン）分枝より大きな比率で長鎖（例えば、複数のラクトサミン単位）α２−６オリゴ糖分枝を含む。一部の実施形態では、アンブレラトポロジーグリカン（例えば、１つの部位における）が、短鎖α２−６（例えば、単一のラクトサミン）分枝の約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、または約５０倍を超える長鎖α２−６オリゴ糖分枝を含む。一部の実施形態では、ＨＡのアンブレラトポロジーグリカンおよび／またはグリカンデコイとの相互作用の固有の特徴を、ＨＡの非還元末端においてシアル酸（ＳＡ）および／またはＳＡ類似体を含むグリカンとの接触とする。一部の実施形態では、オリゴ糖の鎖長を、少なくとも三糖（ＳＡまたはＳＡ類似体を除く）とする。一部の実施形態では、図６の右側パネルに示される番号付けされた残基の組合せが、アンブレラ様トポロジーとの接触に関与している。一部の実施形態では、アンブレラトポロジーグリカンを、以下の形態：
Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｓｕｇ１−Ｓｕｇ２−Ｓｕｇ３
［配列中、
（ａ）Ｎｅｕ５Ａｃα２−６が、典型的に（本質的にではないが）非還元末端にあり、
（ｂ）Ｓｕｇ１を、
（ｉ）α配置もしくはβ配置（Ｎ結合型伸長鎖およびＯ結合型伸長鎖ではβ配置とすることが多く、糖タンパク質にＯ結合するＧａｌＮＡｃα配置の場合はα配置とする）のヘキソース（ＧａｌまたはＧｌｃとすることが多い）もしくはヘキソサミン（ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ）とし、
（ｉｉ）Ｎｅｕ５Ａｃα２−６以外の糖が、Ｓｕｇ１（Ｓｕｇ１を、糖タンパク質にＯ結合したＧａｌＮＡｃα配置とする場合を除く）の非還元位置のうちのいずれにも結合しないとし、かつ／または
（ｉｉｉ）硫酸、リン酸、グアニジウム、アミン、Ｎ−アセチルなどの非糖部分を、Ｓｕｇ１（例えば、ＨＡとの接触を改善するために）の非還元位置（典型的には６位）に結合させることができ、
（ｃ）Ｓｕｇ２および／またはＳｕｇ３を、
（ｉ）α配置もしくはβ配置（β配置とすることが多い）のヘキソース（ＧａｌまたはＧｌｃとすることが多い）もしくはヘキソサミン（ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ）とし、かつ／または
（ｉｉ）糖（Ｆｕｃなど）もしくは硫酸、リン酸、グアニジウム、アミン、Ｎ−アセチルなどの非糖部分を、Ｓｕｇ２、Ｓｕｇ３、および／もしくはＳｕｇ４の非還元位置に結合させることができ、
（ｄ）Ｎｅｕ５Ａｃα２−６結合とは別に、オリゴ糖における任意の２つの糖の間の結合を、１−２結合、１−３結合、１−４結合、および／または１−６結合（典型的に１−３結合または１−４結合）とすることができ、かつ／または
（ｅ）Ｎｅｕ５Ａｃα２−６が、糖タンパク質にＯ結合したＧａｌＮＡｃαに結合し、さらなる糖がＧａｌＮＡｃαの非還元末端に結合する構造、例えば
を取る］
のオリゴ糖とする。
アンブレラトポロジー遮断剤（ＵＴＢＡ）：本明細書で用いられる「アンブレラトポロジー遮断剤」という用語は、アンブレラトポロジーグリカンを有するＨＡ受容体に結合する薬剤を指す。一部の実施形態では、ＵＴＢＡが、ヒト上気道中に見出されるアンブレラトポロジーグリカンを有するＨＡ受容体に結合する。ＵＢＴＡが、アンブレラトポロジーグリカンに結合する場合もあり、かつ／またはコーントポロジーグリカンに結合する場合もある。一部の実施形態では、ＵＴＢＡが、アンブレラトポロジーグリカンに、コーントポロジーグリカンに対するその親和性の５０、１００、１５０、または２００％の親和性で選択的に結合する。一部の実施形態では、ＵＴＢＡが、アンブレラトポロジーグリカンに、コーントポロジーグリカンに対するその親和性の５０〜１５０％の親和性で選択的に結合する。一部の実施形態では、ＵＴＢＡが、アンブレラトポロジーグリカンに、コーントポロジーグリカンに対するその親和性とほぼ同じ親和性で結合する。例えば、一部の実施形態では、ＵＴＢＡが、アンブレラトポロジーグリカン（例えば、６’ＳＬＮ−ＬＮ）に、それがコーントポロジーグリカン（例えば、３’ＳＬＮ−ＬＮ）に結合するときの親和性の約５０〜２００％、５０〜１５０％、またはほぼ同じ親和性で結合する。一部の実施形態では、ＵＴＢＡが、インフルエンザウイルス粒子（例えば、ヒトインフルエンザウイルスまたはトリインフルエンザウイルス）のＨＡ受容体への結合を、受容体のグリカントポロジー（例えば、アンブレラトポロジーまたはコーントポロジー）に基づいて選択的に阻害する。一部の実施形態では、ＵＴＢＡをポリペプチドとする。一部のこのような実施形態では、ＵＴＢＡポリペプチドが、天然のポリペプチドのアミノ酸配列と実質的に同一であるかまたは実質的に相同であるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＵＴＢＡポリペプチドをＨＡポリペプチドとする。一部の実施形態では、ＵＴＢＡポリペプチドを、天然のＨＡポリペプチドまたはその断片とする。一部の実施形態では、ＵＴＢＡポリペプチドが、ＨＡポリペプチドのアミノ酸配列とは類縁でないアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＵＴＢＡポリペプチドを、抗体またはその断片とする。一部の実施形態では、ＵＴＢＡポリペプチドを、レクチン（例えば、ＳＮＡ−１）とする。一部の実施形態では、ＵＴＢＡをポリペプチドでないとする。一部の実施形態では、ＵＴＢＡを低分子とする。一部の実施形態では、ＵＴＢＡを核酸とする。
アンブレラトポロジーグリカンの模倣体：「アンブレラトポロジーグリカンの模倣体」とは、本明細書で記載される結合剤に結合する、アンブレラトポロジーグリカン以外の薬剤である。一部の実施形態では、アンブレラトポロジーグリカンの模倣体が、ＨＡポリペプチドに結合する薬剤である。一部のこのような実施形態では、アンブレラトポロジーグリカンの模倣体が、残基９５、９８、１２８、１３０、１３１、１３２、１３３、１３５、１３６、１３７、１３８、１４５、１５３、１５５、１５６、１５８、１５９、１６０、１８３、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、２１９、２２１、２２２、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、およびこれらの組合せからなる群から選択されるＨＡポリペプチド残基と相互作用する薬剤である。一部のこのような実施形態では、アンブレラトポロジーグリカンの模倣体が、残基１３０、１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、２２８、およびこれらの組合せからなる群から選択されるＨＡポリペプチド残基と相互作用する薬剤である。一部のこのような実施形態では、アンブレラトポロジーグリカンの模倣体が、残基１６０、１９２、１９３、およびこれらの組合せからなる群から選択されるＨＡポリペプチド残基と相互作用する薬剤である。上記で言及したアミノ酸位置は、Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づくことに注意されたい。一部の実施形態では、ＨＡトポロジーグリカンの模倣体が、ＨＡポリペプチドとの相互作用についてアンブレラトポロジーグリカンと競合する薬剤である。
アンブレラトポロジー特異的遮断剤（ＵＴＳＢＡ）：本明細書で用いられる「アンブレラトポロジー特異的遮断剤」という用語は、ヒト上気道中に見出されるアンブレラトポロジーグリカンを有するＨＡ受容体に結合する薬剤を指す。ＵＴＳＢＡは、アンブレラトポロジーグリカンＨＡに選択的に結合する。例えば、ＵＴＳＢＡは、アンブレラトポロジーグリカン（例えば、６’ＳＬＮ−ＬＮ）に、それがコーントポロジーグリカン（例えば、３’ＳＬＮ−ＬＮ）に結合するときの親和性のほぼ少なくとも２、少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも１０倍の親和性で結合する。典型的に、ＵＴＳＢＡのアンブレラトポロジーグリカンに対する親和性は、１ｎＭより大きい。典型的に、ＵＴＳＢＡのコーントポロジーグリカンに対する親和性は、アンブレラトポロジーグリカンの、ＳＣ１８、Ｍｏｓ９９、Ｔｘ９１などのヒト適応型ＨＡ、およびＳＮＡ−Ｉなどのα２−６結合する植物レクチンに対する結合親和性の少なくとも２〜３桁の範囲内である。用量依存的な直接的結合アッセイにより測定されるＵＴＳＢＡの結合親和性（図１９および２０）は、典型的に、少なくとも１ｎＭとなるであろう。典型的に、ＵＴＳＢＡのコーントポロジーグリカンに対する親和性は、最大でも、コーントポロジーグリカンの、Ｖｉｅｔ０４０５株、Ａｖ１８株などのトリＨＡに対する結合親和性より１〜３桁小さい。一部の実施形態では、ＵＴＳＢＡが、インフルエンザウイルス粒子（例えば、ヒトインフルエンザウイルスまたはトリインフルエンザウイルス）のＨＡ受容体（例えば、Ｈ１、Ｈ２、もしくはＨ３、またはヒト適応型のＨ５、Ｈ７、もしくはＨ９）への結合を、グリカントポロジー（例えば、アンブレラトポロジーまたはコーントポロジー）に基づいて選択的に阻害する。一部の実施形態では、ＵＴＳＢＡをポリペプチドとする。一部のこのような実施形態では、ＵＴＳＢＡポリペプチドが、天然のポリペプチドのアミノ酸配列と実質的に同一であるかまたは実質的に相同であるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＵＴＳＢＡポリペプチドをＨＡポリペプチドとする。一部の実施形態では、ＵＴＳＢＡポリペプチドを、天然のＨＡポリペプチドまたはその断片とする。一部の実施形態では、ＵＴＳＢＡポリペプチドが、ＨＡポリペプチドのアミノ酸配列とは類縁でないアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＵＴＳＢＡポリペプチドを、抗体またはその断片とする。一部の実施形態では、ＵＴＳＢＡポリペプチドを、レクチン（例えば、ＳＮＡ−１）とする。一部の実施形態では、ＵＴＳＢＡをポリペプチドでないとする。一部の実施形態では、ＵＴＳＢＡを低分子とする。一部の実施形態では、ＵＴＳＢＡを核酸とする。
ワクチン接種：本明細書で用いられる「ワクチン接種」という用語は、例えば、病原作用物質に対する免疫反応を発生させることを意図する組成物の投与を指す。本発明の目的では、ワクチン接種を、病原作用物質への曝露前、曝露時、および／または曝露後に、ならびに、一部の実施形態では、この病原作用物質への曝露前、曝露時、および／または曝露直後に実施することができる。一部の実施形態では、ワクチン接種が、適切な形で時間間隔を置いた、ワクチン接種用組成物の複数回の投与を包含する。
変異体：本明細書で用いられる「変異体」という用語は、特定の対象のポリペプチド（例えば、ＨＡポリペプチド）と、その配列を比較する「親」ポリペプチドとの間の関係について記載する、関係についての用語である。対象のポリペプチドが、特定の位置における少数の配列変化を除き、親ポリペプチドのアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列を有する場合に、対象のポリペプチドを親ポリペプチドの「変異体」であると考える。典型的には、変異体中の残基のうち、親ポリペプチドと比較して置換されている残基が、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％より少ない。一部の実施形態では、変異体の残基が、親ポリペプチドと比較して１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１カ所置換されている。変異体の機能的残基（すなわち、特定の生物学的活性に関与する残基）の置換は、きわめて少数（例えば、５、４、３、２、または１カ所より少ない）であることが多い。さらに、変異体は、典型的に、親ポリペプチドと比較した付加または欠失が５、４、３、２、または１カ所以下であり、付加または欠失を有さないことが多い。さらに、いかなる付加または欠失も、典型的に約２５、約２０、約１９、約１８、約１７、約１６、約１５、約１４、約１３、約１０、約９、約８、約７、約６残基より少なく、一般に約５、約４、約３、または約２残基より少ない。一部の実施形態では、親ポリペプチドを、天然で見出されるポリペプチドとする。例えば、親ＨＡポリペプチドを、天然の（例えば、野生型の）インフルエンザウイルスの単離物中に見出されるポリペプチド（例えば、野生型のＨＡポリペプチド）とすることができる。
ベクター：本明細書で用いられる「ベクター」とは、それを連結した別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。一部の実施形態では、ベクターが、真核細胞または原核細胞などの宿主細胞において、それらを連結した核酸の染色体外における複製および／または発現を可能とする。本明細書では、作動可能に連結された遺伝子の発現を方向付けることが可能なベクターを、「発現ベクター」と称する。
野生型の：当技術分野で理解される通り、「野生型の」という語句は一般に、タンパク質または核酸の、天然で見出される通常の形態を指す。例えば、野生型のＨＡポリペプチドは、インフルエンザウイルスの天然の単離物中で見出される。異なる多様な野生型のＨＡ配列は、ＮＣＢＩによるインフルエンザウイルスの配列データベースである、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＦＬＵ／ＦＬＵ．ｈｔｍｌ中に見出すことができる。
特定の実施形態についての詳細な説明
本発明は、アンブレラトポロジーグリカンに結合する結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド、ＨＡポリペプチド変異体、ＬＳＢＡ、ＵＴＢＡ、ＵＴＳＢＡなど）を提供する。一部の実施形態では、本発明が、特定の標的種のＨＡ受容体において見出されるアンブレラトポロジーグリカンに結合する結合剤を提供する。例えば、一部の実施形態では、本発明が、ヒトＨＡ受容体、例えば、ヒト上皮細胞において見出されるＨＡ受容体において見出されるアンブレラトポロジーグリカンに結合する結合剤、特に上気道のヒトＨＡ受容体において見出されるアンブレラトポロジーグリカンに結合する結合剤を提供する。
本発明は、ヒト上気道の細胞において見出されるＨＡ受容体に結合する結合剤を提供し、特に、このような受容体に、指定された親和性および／または特異性で結合する（および／またはそれらのグリカンに結合する、特に、それらのアンブレラグリカンに結合する）結合剤を提供する。
一部の実施形態では、本発明による結合剤をＨＡポリペプチド配列とするか、または本発明による結合剤がＨＡポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本発明による結合剤が、天然の親ＨＡポリペプチド配列と、残基１３０、１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、２２８、およびこれらの組合せからなる群から選択される残基のうちの１またはそれより多くで異なるＨＡポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、本発明による結合剤が、天然の親ＨＡポリペプチド配列と、残基１６０、１９２、１９３、およびこれらの組合せからなる群から選択される残基のうちの１またはそれより多くで異なるＨＡポリペプチド配列を含む。
本発明は、アンブレラトポロジーグリカン（例えば、長鎖α２−６シアル化グリカン）に結合する能力、特に高親和性で結合する能力を獲得することにより、ＨＡポリペプチド変異体にヒトに感染する能力を付与しうる（その親ＨＡポリペプチドが感染可能でない場合に）ことの認識を包含する。特定のいかなる理論により拘束されることも望まないが、本発明者らは、アンブレラトポロジーグリカンへの結合が決定的な場合があり、特に、他のグリカン型への結合の喪失は要求されない場合があることを提起する。
本発明は、例えば、それらを同定するためのシステム、それらを調製する戦略、それらに結合する抗体、およびそれらに関連する多様な診断法および治療法を含めた、本発明による結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド、ＨＡポリペプチド変異体、ＵＴＢＡ、ＵＴＳＢＡなど）と関連する多様な試薬および方法をさらに提供する。本発明のこれらの態様の特定の実施形態および他の実施形態についてのさらなる説明を以下に示す。
血球凝集素（ＨＡ）
インフルエンザウイルスは、特定のウイルスの膜に埋め込まれた２つの糖タンパク質である、血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含有する脂質膜エンベロープを特徴とするＲＮＡウイルスである。１６のＨＡ亜型および９つのＮＡ亜型が公知であり、異なるインフルエンザ株は、株のＨＡ亜型およびＮＡ亜型の番号に基づいて命名されている。アミノ酸配列の同一性および結晶構造の比較に基づき、ＨＡ亜型は、２つの主要な群および４つの小クレードに分けられている。異なるＨＡ亜型は必ずしも高度のアミノ酸配列の同一性を共有するわけでないが、異なるＨＡ亜型の全体的な３Ｄ構造は、分類目的に用いうる複数の微細な差違を伴いながらも、互いと類似している。例えば、膜遠位側のサブドメインの、中央のα螺旋に対する特定の配向性は、ＨＡ亜型を決定するのに一般に用いられる１つの構造的特徴である（参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｕｓｓｅｌｌら、２００４年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３２５巻：２８７頁）。
ＨＡは、１６の亜型のうちの１つによるホモ三量体として膜内にて存在し、Ｈ１〜Ｈ１６と称する。これまでのところ、ヒト感染に適応しているのは、これらの亜型のうちの３つ（Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３）だけである。ヒトに感染するように適応したＨＡの報告された１つの特徴（例えば、流行性Ｈ１Ｎ１（１９１８年型）インフルエンザ亜型およびＨ３Ｎ２（１９６７〜６８年型）インフルエンザ亜型に由来するＨＡの特徴）は、それらが、α２−３シアル化グリカンに優先的に結合するそれらのトリ前駆体と比較して、α２−６シアル化グリカンに優先的に結合する能力である（それらの全てが参照により本明細書に組み込まれる、
しかし、本発明は、ヒト宿主に感染する能力は、特定の結合のグリカンへの結合との相関は小さいが、特定のトポロジーのグリカンへの結合との相関は大きいことの認識を包含する。したがって、本発明は、ヒトの感染を媒介するＨＡが、アンブレラトポロジーグリカンに結合し、コーントポロジーグリカンに対する優先性を上回るアンブレラトポロジーグリカンに対する優先性が示されることが多い（コーントポロジーグリカンがα２−６シアル化グリカンの場合でも）ことを裏付ける。
シアル化オリゴ糖（α２−３結合およびα２−６結合の両方の）に結合したＨ１（ヒトおよびブタ）亜型、Ｈ３（トリ）亜型、およびＨ５（トリ）亜型に由来するＨＡの複数の結晶構造が入手可能であり、これらにより、ＨＡのこれらのグリカンとの異なる相互作用に関与している特定のアミノ酸への分子的洞察がもたらされる（それらの全てが参照により本明細書に組み込まれる、
例えば、単独であるかまたはα２−３シアル化オリゴ糖またはα２−６シアル化オリゴ糖に結合したＨ５（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／３／９７）の結晶構造により、特定の結合したグリカンと直接相互作用するアミノ酸が同定され、また、分離度１次または複数次で隔てられたアミノ酸も同定される（参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｔｅｖｅｎｓら、２００１年、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９８巻：１１１８１頁）。場合によっては、これらの残基の立体配座が、非結合状態と対比した結合状態において異なる。例えば、Ｇｌｕ１９０、Ｌｙｓ１９３、およびＧｌｎ２２６の全ては、直接的な結合相互作用に関与し、立体配座が非結合状態と対比した結合状態において異なる。また、Ｇｌｕ１９０に近位であるＡｓｎ１８６の立体配座も、非結合状態と対比した結合状態において著明に異なる。
結合剤
上記で言及した通り、本発明は、アンブレラトポロジーグリカンへの結合が、例えば、ヒトを含めた特定の宿主の感染を媒介する能力と相関することの知見を包含する。したがって、本発明は、アンブレラグリカンに結合する（および／またはアンブレラトポロジーグリカンの模倣体に結合する）結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド、ＨＡポリペプチド変異体、ＬＳＢＡ、ＵＴＢＡ、ＵＴＳＢＡなど）を提供する。一部の実施形態では、本発明による結合剤が、アンブレラグリカンに高親和性で結合する（および／またはアンブレラトポロジーグリカンの模倣体に高親和性で結合する）。一部の実施形態では、本発明による結合剤が、複数の異なるアンブレラトポロジーグリカンに、高度な親和性および／または特異性で結合することが多い。
一部の実施形態では、本発明による結合剤が、アンブレラトポロジーグリカン（例えば、長鎖α２−６シアル化グリカン、例えば、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−など）に、高親和性で結合する。例えば、一部の実施形態では、本発明による結合剤が、ヒトの感染を媒介する野生型のＨＡ（例えば、Ｈ１Ｎ１ ＨＡまたはＨ３Ｎ２ ＨＡ）について観察される親和性と同等な親和性でアンブレラトポロジーグリカンに結合する。一部の実施形態では、本発明による結合剤が、アンブレラグリカンに、同等の条件下でヒトの感染を媒介する野生型のＨＡについて観察される親和性の少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の親和性で結合する。一部の実施形態では、本発明による結合剤が、アンブレラグリカンに、ヒトの感染を媒介する野生型のＨＡについて同等の条件下で観察される親和性より大きな親和性で結合する。
一部の実施形態では、本発明による結合剤の結合親和性を、ある濃度範囲にわたり評価する。特に、多価結合アッセイでは、このような戦略により、単一濃度の解析より著明に多くの情報がもたらされる。一部の実施形態では、例えば、本発明による結合剤の結合親和性を、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０倍以上の範囲の濃度にわたり評価する。
一部の実施形態では、それらが本明細書で記載されるアッセイなどの多価グリカンアレイ結合アッセイにおいて飽和シグナルを示す場合に、本発明による結合剤が高親和性を示す。一部の実施形態では、それらがこのような研究において約４０００００以上を上回る（例えば、約５０００００、約６０００００、約７０００００、約８０００００などを上回る）シグナルを示す場合に、本発明による結合剤が高親和性を示す。一部の実施形態では、本明細書で記載される結合剤が、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍以上の濃度範囲にわたりアンブレラグリカンに対する飽和結合を示し、一部の実施形態では、１０倍以上に及ぶ濃度範囲にわたりアンブレラグリカンに対する飽和結合を示す。
さらに、一部の実施形態では、本発明による結合剤が、コーントポロジーグリカンに結合するより強力にアンブレラトポロジーグリカン（および／またはアンブレラトポロジーグリカンの模倣体）に結合する。一部の実施形態では、本発明による結合剤が、アンブレラグリカンに対して、コーングリカンと対比して約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、または約２の相対的親和性を示す。
一部の実施形態では、本発明による結合剤が、α２−６シアル化グリカンに結合し、一部の実施形態では、本発明による結合剤が、α２−６シアル化グリカンに優先的に結合する。一部の実施形態では、本発明による結合剤が、複数の異なるα２−６シアル化グリカンに結合する。一部の実施形態では、本発明による結合剤が、α２−３シアル化グリカンに結合することが可能ではないが、一部の実施形態では、本発明による結合剤が、α２−３シアル化グリカンに結合することが可能である。
一部の実施形態では、本発明による結合剤が、ヒト上気道上皮細胞において見出される受容体に結合する。一部の実施形態では、本発明による結合剤が、気管支および／または気管のＨＡ受容体に結合する。一部の実施形態では、本発明による結合剤が、肺深部の受容体に結合することが可能ではないが、一部の実施形態では、本発明による結合剤が、肺深部の受容体に結合することが可能である。
一部の実施形態では、本発明による結合剤が、ヒト上気道組織（例えば、上皮細胞）のＨＡ受容体において見出されるグリカンのうちの少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％以上に結合する。
一部の実施形態では、本発明による結合剤が、図９で例示されるグリカンのうちの１またはそれより多くに結合する。一部の実施形態では、本発明による結合剤が、図９で例示される複数のグリカンに結合する。一部の実施形態では、本発明による結合剤が、図９で例示されるグリカンに、高度な親和性および／または特異性で結合する。一部の実施形態では、本発明による結合剤が、図９で例示されるグリカンに、図８で例示されるグリカンに対するそれらの結合と比較して優先的に結合する。一部の実施形態では、本発明による結合剤が、以下の形態：
Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｓｕｇ１−Ｓｕｇ２−Ｓｕｇ３
［配列中、
１．Ｎｅｕ５Ａｃα２−６が、常にまたはほとんど常に非還元末端にあり、
２．Ｓｕｇ１を、
ａ．α配置もしくはβ配置（Ｎ結合型伸長鎖およびＯ結合型伸長鎖ではβ配置とすることが多く、糖タンパク質にＯ結合するＧａｌＮＡｃα配置の場合はα配置とする）のヘキソース（ＧａｌまたはＧｌｃとすることが多い）もしくはヘキソサミン（ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ）とし、
ｂ．Ｎｅｕ５Ａｃα２−６以外の糖が、Ｓｕｇ１（Ｓｕｇ１を糖タンパク質にＯ結合したＧａｌＮＡｃα配置とする場合を除く）の非還元位置のうちのいずれにも結合しないものとし、かつ／または
ｃ．硫酸、リン酸、グアニジウム、アミン、Ｎ−アセチルなどの非糖部分を、ＨＡとの接触を改善するために、Ｓｕｇ１の非還元位置（典型的には６位）に結合させることができ、
３．Ｓｕｇ２および／またはＳｕｇ３を、
ａ．α配置もしくはβ配置（β配置とすることが多い）のヘキソース（ＧａｌまたはＧｌｃとすることが多い）もしくはヘキソサミン（ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ）とし、かつ／または
ｂ．糖（Ｆｕｃなど）もしくは硫酸、リン酸、グアニジウム、アミン、Ｎ−アセチルなどの非糖部分を、Ｓｕｇ２、Ｓｕｇ３、および／もしくはＳｕｇ４の非還元位置に結合させることができ、
４．Ｎｅｕ５Ａｃα２−６結合とは別に、オリゴ糖における任意の２つの糖の間の結合を、１−２結合、１−３結合、１−４結合、および／または１−６結合（典型的に１−３結合または１−４結合）とすることができ、かつ／または
５．Ｎｅｕ５Ａｃα２−６が、糖タンパク質にＯ結合したＧａｌＮＡｃαに結合し、さらなる糖がＧａｌＮＡｃαの非還元末端に結合する構造、例えば、
を取る］
のオリゴ糖に結合する。
本発明は、結合特異性が指定された結合剤を提供し、また、結合特徴がアンブレラグリカンとの関係で指定された結合剤も提供する。
本発明が提供する特定の具体的な結合剤については、以下でより詳細に説明する。
ＨＡポリペプチド
一部の実施形態では、本発明による結合剤をＨＡポリペプチドとする。例えば、本発明は、結合特異性が指定された、単離されたＨＡポリペプチドを提供し、また、結合特徴がアンブレラグリカンとの関係で指定された、操作されたＨＡポリペプチドも提供する。
一部の実施形態では、提供される結合特徴が指定されたＨＡポリペプチドを、Ｈ１ポリペプチドとする。一部の実施形態では、結合特徴が指定された本発明によるＨＡポリペプチドを、Ｈ２ポリペプチドとする。一部の実施形態では、結合特徴が指定された本発明によるＨＡポリペプチドを、Ｈ３ポリペプチドとする。一部の実施形態では、結合特徴が指定された本発明によるＨＡポリペプチドを、Ｈ４ポリペプチドとする。一部の実施形態では、結合特徴が指定された本発明によるＨＡポリペプチドを、Ｈ５ポリペプチドとする。一部の実施形態では、結合特徴が指定された本発明によるＨＡポリペプチドを、Ｈ６ポリペプチドとする。一部の実施形態では、結合特徴が指定された本発明によるＨＡポリペプチドを、Ｈ７ポリペプチドとする。一部の実施形態では、結合特徴が指定された本発明によるＨＡポリペプチドを、Ｈ８ポリペプチドとする。一部の実施形態では、結合特徴が指定された本発明によるＨＡポリペプチドを、Ｈ９ポリペプチドとする。一部の実施形態では、結合特徴が指定された本発明によるＨＡポリペプチドを、Ｈ１０ポリペプチドとする。一部の実施形態では、結合特徴が指定された本発明によるＨＡポリペプチドを、Ｈ１１ポリペプチドとする。一部の実施形態では、結合特徴が指定された本発明によるＨＡポリペプチドを、Ｈ１２ポリペプチドとする。一部の実施形態では、結合特徴が指定された本発明によるＨＡポリペプチドを、Ｈ１３ポリペプチドとする。一部の実施形態では、結合特徴が指定された本発明によるＨＡポリペプチドを、Ｈ１４ポリペプチドとする。一部の実施形態では、結合特徴が指定された本発明によるＨＡポリペプチドを、Ｈ１５ポリペプチドとする。一部の実施形態では、結合特徴が指定された本発明によるＨＡポリペプチドを、Ｈ１６ポリペプチドとする。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチドが、株：Ａ／Ｓｏｕｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ／１／１９１８；Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４；Ａ／Ｔａｉｗａｎ／１／１９８６；Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／１９９１；Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／１９９５；Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／９２／１９９６；Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９；Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６のうちのいずれに由来するＨ１タンパク質も包含しない。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチドが、１９５７〜５８年のアジアにおけるインフルエンザの流行時の株のうちのいずれに由来するＨ２タンパク質でもない。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチドが、株：Ａ／Ｊａｐａｎ／３０５＋／１９５７；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／１９５７；Ａ／Ｔａｉｗａｎ／１／１９６４；Ａ／Ｔａｉｗａｎ／１／１９６７のうちのいずれに由来するＨ２タンパク質も包含しない。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチドが、株：Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８；Ａ／Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｓ／２／１９８２；Ａ／Ｍｉｓｓｉｓｓｉｐｐｉ／１／１９８５；Ａ／Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ／３６０／１９８６；Ａ／Ｓｉｃｈｕａｎ／２／１９８７；Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／１１／１９８７；Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３５３／１９８９；Ａ／Ｓｈａｎｄｏｎｇ／９／１９９３；Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／３３／１９９４；Ａ／Ｎａｎｃｈａｎｇ／８１３／１９９５；Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／１９９７；Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／１９９９；Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／１９９９；Ａ／Ｗｙｏｍｉｎｇ／３／２００３；Ａ／Ｏｋｌａｈｏｍａ／３２３／２００３；Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００４；Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６５／２００５のうちのいずれに由来するＨ３タンパク質も包含しない。
変異体のＨＡポリペプチド
一部の実施形態では、そのアミノ酸配列が少数の特定の配列変化を除き親ＨＡポリペプチドのアミノ酸配列と同一である点において、提供されるＨＡポリペプチドを、親ＨＡの変異体とする。一部の実施形態では、親ＨＡを、インフルエンザウイルスの天然の単離物中に見出されるＨＡポリペプチド（例えば、野生型のＨＡポリペプチド）とする。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド変異体のグリカン結合特徴が、それらの対応する親ＨＡポリペプチドと異なる。一部の実施形態では、本発明によるＨＡ変異体ポリペプチドのアンブレラグリカンに対する親和性および／または特異性（例えば、コーングリカンに対する親和性および／または特異性と比較した）が、それらのコグネイトの親ＨＡポリペプチドより大きい。一部の実施形態では、このようなＨＡポリペプチド変異体を、操作された変異体とする。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡ変異体ポリペプチドのアンブレラグリカンに対する親和性および／または特異性が、それらのコグネイトの親ＨＡポリペプチドと比較して大きい。一部の実施形態では、本発明によるＨＡ変異体ポリペプチドのコーントポロジーグリカンに対する親和性および／または特異性が、それらのコグネイトの親ＨＡポリペプチドと比較して低減される。一部の実施形態では、本発明によるＨＡ変異体ポリペプチドのアンブレラグリカンに対する親和性および／または特異性が、それらのコグネイトの親ＨＡポリペプチドと比較して大きく、コーントポロジーグリカンに対する親和性および／または特異性が低減される。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡ変異体ポリペプチドのα２−６グリカンに対する親和性および／または特異性が、それらのコグネイトの親ＨＡポリペプチドと比較して大きい。一部の実施形態では、本発明によるＨＡ変異体ポリペプチドのα２−３グリカンに対する親和性および／または特異性が、それらのコグネイトの親ＨＡポリペプチドと比較して低減される。一部の実施形態では、本発明によるＨＡ変異体ポリペプチドのα２−６グリカンおよびα２−３グリカンに対する親和性および／または特異性が、それらのコグネイトの親ＨＡポリペプチドと比較して大きい。一部の実施形態では、本発明によるＨＡ変異体ポリペプチドのα２−６グリカンに対する親和性および／または特異性が、それらのコグネイトの親ＨＡポリペプチドと比較して大きく、α２−３グリカンに対する親和性および／または特異性が低減される。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡ変異体ポリペプチドのアンブレラトポロジーグリカンおよびα２−３グリカンに対する親和性および／または特異性が、それらのコグネイトの親ＨＡポリペプチドと比較して大きい。一部の実施形態では、本発明によるＨＡ変異体ポリペプチドのアンブレラトポロジーグリカンに対する親和性および／または特異性が、それらのコグネイトの親ＨＡポリペプチドと比較して大きく、α２−３グリカンに対する親和性および／または特異性が低減される。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡ変異体ポリペプチドのα２−６グリカンおよびコーントポロジーグリカンに対する親和性および／または特異性が、それらのコグネイトの親ＨＡポリペプチドと比較して大きい。一部の実施形態では、本発明によるＨＡ変異体ポリペプチドのα２−６グリカンに対する親和性および／または特異性が、それらのコグネイトの親ＨＡポリペプチドと比較して大きく、コーントポロジーグリカンに対する親和性および／または特異性が低減される。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド変異体が、異なるＨＡ亜型中に見出されるＨＡ配列と符合する１またはそれより多くの配列変化を含有する。具体的な一例を挙げると、一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体が、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体をＨ２ ＨＡポリペプチドに酷似させる１またはそれより多くの配列変化を含有する。別の具体例を挙げると、一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体が、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体をＨ１ ＨＡポリペプチドに酷似させる１またはそれより多くの配列変化を含有する。
本発明は特に、グリコシル化を変化させたＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、またはＨ１６のＨＡポリペプチド変異体）が、基準のＨＡポリペプチドと比較して２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍以上の親和性をヒトＨＡ受容体に対して示しうることの認識を包含する。本発明はまた特に、ＨＡのループ領域を変化させたＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、またはＨ１６のＨＡポリペプチド変異体）が、基準のＨＡポリペプチド（例えば、配列番号４３〜５５のうちのいずれかのＨＡポリペプチド）と比較して２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍以上の親和性をヒトＨＡ受容体に対して示しうることの認識も包含する。
本発明は特に、グリコシル化を変化させたＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、またはＨ１６のＨＡポリペプチド変異体）が、基準のＨＡポリペプチドと比較して２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍以上の特異性をヒトＨＡ受容体に対して示しうることの認識を包含する。本発明はまた特に、ＨＡのループ領域を変化させたＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、またはＨ１６のＨＡポリペプチド変異体）が、基準のＨＡポリペプチド（例えば、配列番号４３〜５５のうちのいずれかのＨＡポリペプチド）と比較して２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍以上の特異性をヒトＨＡ受容体に対して示しうることの認識も包含する。
一部の実施形態では、基準のＨＡポリペプチドを、Ａ／Ｓｏｕｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ／１／１８（Ｈ１Ｎ１）（配列番号４３）に由来するＨＡとする。一部の実施形態では、基準のＨＡポリペプチドを、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７（配列番号４４）に由来するＨＡとする。一部の実施形態では、基準のＨＡポリペプチドを、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／０９（配列番号４５）に由来するＨＡとする。一部の実施形態では、基準のＨＡポリペプチドを、Ａ／Ａｌｂａｎｙ／６／５８（Ｈ２Ｎ２）（配列番号４６）に由来するＨＡとする。一部の実施形態では、基準のＨＡポリペプチドを、Ａ／Ａｉｃｈｉ／１／６８（配列番号４７）に由来するＨＡとする。一部の実施形態では、基準のＨＡポリペプチドを、Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／９９（配列番号４８）に由来するＨＡとする。一部の実施形態では、基準のＨＡポリペプチドを、Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／０９（配列番号４９）に由来するＨＡとする。一部の実施形態では、基準のＨＡポリペプチドを、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（配列番号５０）に由来するＨＡとする。一部の実施形態では、基準のＨＡポリペプチドを、Ａ／Ｅｇｙｐｔ／２７８６−ＮＡＭＲＵ３／０６（配列番号５１）に由来するＨＡとする。一部の実施形態では、基準のＨＡポリペプチドを、Ａ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ／１０７／０３（配列番号５２）に由来するＨＡとする。一部の実施形態では、基準のＨＡポリペプチドを、Ａ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／４８６／９７（配列番号５３）に由来するＨＡとする。一部の実施形態では、基準のＨＡポリペプチドを、Ａ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／２１３／０３（配列番号５４）に由来するＨＡとする。一部の実施形態では、基準のＨＡポリペプチドを、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５（配列番号５５）に由来するＨＡとする。
一部の実施形態では、グリカン結合特徴を変化させたＨＡポリペプチド変異体が、グリカン結合部位内の残基またはグリカン結合部位に影響を及ぼす残基において、１またはそれより多くの配列変化を有する。一部の実施形態では、このような置換を、結合したグリカンと直接相互作用するアミノ酸の置換とし、一部の実施形態では、分離度１次で隔てられたアミノ酸は、（１）直接的に結合するアミノ酸と相互作用するか、（２）直接的に結合するアミノ酸がグリカンと相互作用する能力に他の形で影響を及ぼすが、グリカン自体とは直接相互作用しないか、または（３）直接的に結合するアミノ酸がグリカンと相互作用する能力に他の形で影響を及ぼし、また、グリカン自体とも直接相互作用するので、このような置換を、結合したグリカンと相互作用するアミノ酸から分離度１次で隔てられたアミノ酸の置換とする。本発明によるＨＡポリペプチド変異体は、１もしくは複数の直接的に結合するアミノ酸、１もしくは複数の分離度１次のアミノ酸、１もしくは複数の分離度２次のアミノ酸、またはこれらの任意の組合せの置換を含有する。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド変異体が、１またはそれより多くの分離度がなおより高次なアミノ酸の置換を含有しうる。
一部の実施形態では、グリカン結合特徴を変化させたＨＡポリペプチド変異体が、Ｎｅｕ５ＡｃおよびＧａｌの向こう側の糖と接触する残基において配列変化を有する（例えば、図７を参照されたい）。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体が、野生型の親ＨＡと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド変異体が、コグネイトの野生型の親ＨＡと比較して少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ以上のアミノ酸置換を有し、一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド変異体が、２つ、３つ、または４つのアミノ酸置換を有する。一部の実施形態では、このようなアミノ酸置換の全てを、グリカン結合部位内に配置する。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド変異体が、米国特許公開第２００９／０２６９３４２号および同第２０１０／０００４１９５号のうちのいずれか、ならびに２０１０年７月２日に出願され、「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＤＩＡＧＮＯＳＩＮＧ ＡＮＤ／ＯＲ ＴＲＥＡＴＩＮＧ ＩＮＦＬＵＥＮＺＡ ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ」と題する、米国特許出願第１２／８２９９３１号（これらの全てが参照により本明細書に組み込まれる）において記載されている１またはそれより多くのアミノ酸置換を含有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体が、残基９５、９８、１２８、１３０、１３１、１３２、１３３、１３５、１３６、１３７、１３８、１４５、１５３、１５５、１５６、１５８、１５９、１６０、１８３、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、２１９、２２１、２２２、２２４、２２５、２２６、２２７、および２２８のうちの１またはそれより多くに対応する位置において配列の置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体、特に、Ｈ５ポリペプチド変異体が、残基９５、９８、１２８、１３０、１３１、１３２、１３３、１３５、１３６、１３７、１３８、１４５、１５３、１５５、１５６、１５８、１５９、１６０、１８３、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、２１９、２２１、２２２、２２４、２２５、２２６、２２７、および２２８からなる群から選択される残基において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５）と比べて１またはそれより多くのアミノ酸置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体、特に、Ｈ５ポリペプチド変異体が、残基９５、９８、１２８、１３０、１３１、１３２、１３３、１３５、１３６、１３７、１３８、１４５、１５３、１５５、１５６、１５８、１５９、１６０、１８３、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、２１９、２２１、２２２、２２４、２２５、２２６、２２７、および２２８からなる群から選択される任意の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、または３７残基において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５）と比べて１またはそれより多くのアミノ酸置換を有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、アミノ酸１５８位に対応する部位におけるグリコシル化を低減または消失させる配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、アミノ酸１５８位に対応する部位に結合したグリカンの同一性および／または構造に影響を及ぼし、かつ／またはこれを変化させる配列置換を有する。一部の実施形態では、このような配列置換は、１５８位に対応する部位における突然変異、例えば、Ａｓｎ１５８Ｘａａ［ＸａａはＡｓｎ以外の任意のアミノ酸である］である。一部の実施形態では、このような配列置換は、１６０位に対応する部位における突然変異、例えば、Ｔｈｒ１６０Ｘａａ［ＸａａはＡｓｎ以外の任意のアミノ酸である］である。一部の実施形態では、このような配列置換が、突然変異Ｔｈｒ１６０Ａｌａを含む。一部の実施形態では、アミノ酸１５８位に対応する部位におけるグリコシル化を低減するか、消失させるか、これに影響を及ぼすか、またはこれを変化させる配列置換により、非Ｈ２ ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）を、Ｈ２ ＨＡポリペプチドに酷似させる（例えば、構造的にも機能的にも酷似させる）ことができる。一部の実施形態では、１６０位に対応する部位における突然変異（例えば、Ｔｈｒ１６０ＡｌａなどのＴｈｒ１６０Ｘａａ）により、非Ｈ２ ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）を、Ｈ２ ＨＡポリペプチドに酷似させる（例えば、構造的にも機能的にも酷似させる）ことができる。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基２２６、２２８、および１６０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基２２６、２２８、および１６０に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基２２６および１６０に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基２２８および１６０に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基２２６および２２８に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基２２６、２２８、および１５８のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基２２６、２２８、および１５８に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基２２６および１５８に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基２２８および１５８に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基２２６および２２８に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、ＨＡポリペプチドのループ領域のうちの１またはそれより多くにおいて欠失を包含する配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、ＨＡポリペプチドの１２８〜１３７のループ領域に対応する部位において欠失を包含する配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、ＨＡポリペプチドの残基１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、および／または１３７に対応するアミノ酸位置のうちの１またはそれより多くにおいて欠失を包含する配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、ＨＡポリペプチドの１２８〜１３４のループ領域に対応する部位において欠失を包含する配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、ＨＡポリペプチドの残基１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、および／または１３４に対応するアミノ酸位置のうちの１またはそれより多くにおいて欠失を包含する配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３０に対応するアミノ酸の欠失を包含する配列置換を有する。一部の実施形態では、このようなループ領域の置換により、非Ｈ２ ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）を、Ｈ２ ＨＡポリペプチドに酷似させる（例えば、構造的にも機能的にも酷似させる）ことができる。一部の実施形態では、残基１３０に対応するアミノ酸の欠失により、非Ｈ２ ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）を、Ｈ２ ＨＡポリペプチドに酷似させる（例えば、構造的にも機能的にも酷似させる）ことができる。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、２２８、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、２２８、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、または１４個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、および２２８のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、および２２８のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、または１３個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３１、１３２、１３５、１８８、１９２、２２１、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３１、１３２、１３５、１８８、１９２、２２１、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、または７個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３１、１３２、１３５、１８８、１９２、および２２１のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３１、１３２、１３５、１８８、１９２、および２２１のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、または６個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３３、１３７、１５５、１９３、２２６、２２７、２２８、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３３、１３７、１５５、１９３、２２６、２２７、２２８、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、または８個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３３、１３７、１５５、１９３、２２６、２２７、および２２８のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３３、１３７、１５５、１９３、２２６、２２７、および２２８のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、または７個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３０、１９２、および１９３のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３０、１９２、１９３のうちの任意の１個、２個、または３個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１９２および１９３のうちの一方または両方に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、２２８、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、２２８、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、または１６個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、および２２８のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、および２２８のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、または１５個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、または７個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、および２２８のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、および２２８のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、または６個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、２２８、１３１、１３２、１３３、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、２２８、１３１、１３２、１３３、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、または１１個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、２２８、１３１、１３２、および１３３のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、２２８、１３１、１３２、および１３３のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基２２７、１３１、１３２、１３３、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基２２７、１３１、１３２、１３３、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、または５個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基２２７、１３１、１３２、および１３３のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基２２７、１３１、１３２、および１３３のうちの任意の１個、２個、３個、または４個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３１、１３３、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、２２８、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３１、１３３、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、２２８、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、または１１個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３１、１３３、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、および２２８のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３１、１３３、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、および２２８のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３１、１３３、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３１、１３３、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３１、１３３、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２６、および２２８のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３１、１３３、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２６、および２２８のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、または９個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３１、１３３、１３７、１５５、１５９、１６０、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、２２８、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３１、１３３、１３７、１５５、１５９、１６０、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、２２８、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、または１３個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３１、１３３、１３７、１５５、１５９、１６０、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、および２２８のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３１、１３３、１３７、１５５、１５９、１６０、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、および２２８のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、または１２個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３１、１３３、１３７、１５５、１５９、１６０、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３１、１３３、１３７、１５５、１５９、１６０、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、または１２個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３１、１３３、１３７、１５５、１５９、１６０、１８８、１９２、１９３、２２６、および２２８のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３１、１３３、１３７、１５５、１５９、１６０、１８８、１９２、１９３、２２６、および２２８のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、または１１個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、１３１、１３２、１３３、２２１、２２７、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、１３１、１３２、１３３、２２１、２２７、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、または１２個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、１３１、１３２、１３３、２２１および２２７のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、１３１、１３２、１３３、２２１、および２２７のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、または１１個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３１、１３２、１３３、２２１、２２７、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３１、１３２、１３３、２２１、２２７、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、または６個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３１、１３２、１３３、２２１、および２２７のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３１、１３２、１３３、２２１、および２２７のうちの任意の１個、２個、３個、４個、または５個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体、特にＨ５ポリペプチド変異体が、残基９８、１３６、１５３、１５５、１８３、および１９４が含まれるがこれらに限定されない、グリカンに直接結合する受容体の領域に位置するアミノ酸から選択される残基において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くのアミノ酸置換を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド変異体、特にＨ５ポリペプチド変異体が、（ａ）残基９８および１９５、（ｂ）残基９８、１３８、１８６、１８７、１９５、および２２８、または（ｃ）残基１３８、１８６、１８７、および２２８が含まれるがこれらに限定されない、グリカンに直接結合する受容体の領域に隣接して位置するアミノ酸から選択される残基において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くのアミノ酸置換を有する。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド変異体、特にＨ５変異体が、以下のアミノ酸置換のうちの１またはそれより多くを有する：
（アミノ酸置換中、Ｘａａ＝Ａｓｎ以外の任意のアミノ酸）、
一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１９２に対応する位置においてその位置において電荷をスイッチするアミノ酸置換を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１９３に対応する位置においてその位置において電荷をスイッチするアミノ酸置換を有する。例えば、一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基１９２に対応する位置においてＴｈｒまたは疎水性残基（例えば、ＶａｌまたはＩｌｅ）を有し、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）（例えば、ヒト適応型変異体）が、残基１９２に対応する位置において親水性残基を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）（例えば、ヒト適応型変異体）が、残基１９２に対応する位置において親水性残基を有する。別の例を挙げれば、一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基１９２に対応する位置においてＴｈｒまたは疎水性残基（例えば、ＶａｌまたはＩｌｅ）を有し、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）（例えば、ヒト適応型変異体）が、残基１９２に対応する位置において塩基性残基（例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇ）を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）（例えば、ヒト適応型変異体）が、残基１９２に対応する位置において塩基性残基（例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇ）を有する。さらに別の例を挙げれば、一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基１９３に対応する位置において塩基性残基（例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇ）を有し、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）（例えば、ヒト適応型変異体）が、残基１９３に対応する位置において中性残基または酸性残基を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）（例えば、ヒト適応型変異体）が、残基１９３に対応する位置において中性残基または酸性残基を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）（例えば、ヒト適応型変異体）が、残基１９３に対応する位置においてＴｈｒ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、またはＶａｌを有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）のヒト適応化が、１８８位における残基の特性（複数可）と関連する。Ｈ５ ＨＡでは、残基１８８が、残基１９２においてＴｈｒまたは疎水性残基と接触するＡｌａであることが多い。これに対し、Ｈ２ ＨＡでは、残基１８８が、残基１９２においてＡｒｇまたはＬｙｓと接触するＧｌｕまたはＡｓｐであることが多い。よって、一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、１８８位においてＧｌｕを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、１８８位においてＡｓｐを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、Ａｌａ１８８Ｇｌｕ置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、Ａｌａ１８８Ａｓｐ置換を有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基１８８に対応する位置においてＡｌａを有し、残基１９２に対応する位置においてＴｈｒを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基１８８に対応する位置においてＡｌａを有し、残基１９２に対応する位置において疎水性残基を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１８８に対応する位置においてＧｌｕを有し、残基１９２に対応する位置においてＡｒｇを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１８８に対応する位置においてＡｓｐを有し、残基１９２に対応する位置においてＡｒｇを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１８８に対応する位置においてＧｌｕを有し、残基１９２に対応する位置においてＬｙｓを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１８８に対応する位置においてＡｓｐを有し、残基１９２に対応する位置においてＬｙｓを有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基１８８に対応する位置においてＡｌａを有し、残基１９２に対応する位置においてＴｈｒを有し、残基１９３に対応する位置においてＬｙｓを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基１８８に対応する位置においてＡｌａを有し、残基１９２に対応する位置において疎水性残基を有し、残基１９３に対応する位置においてＬｙｓを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基１８８に対応する位置においてＡｌａを有し、残基１９２に対応する位置においてＴｈｒを有し、残基１９３に対応する位置においてＡｒｇを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基１８８に対応する位置においてＡｌａを有し、残基１９２に対応する位置において疎水性残基を有し、残基１９３に対応する位置においてＡｒｇを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１８８に対応する位置においてＧｌｕを有し、残基１９２に対応する位置においてＡｒｇを有し、残基１９３に対応する位置においてＴｈｒを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１８８に対応する位置においてＡｓｐを有し、残基１９２に対応する位置においてＡｒｇを有し、残基１９３に対応する位置においてＴｈｒを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１８８に対応する位置においてＧｌｕを有し、残基１９２に対応する位置においてＬｙｓを有し、残基１９３に対応する位置においてＴｈｒを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１８８に対応する位置においてＡｓｐを有し、残基１９２に対応する位置においてＬｙｓを有し、残基１９３に対応する位置においてＴｈｒを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１８８に対応する位置においてＧｌｕを有し、残基１９２に対応する位置においてＡｒｇを有し、残基１９３に対応する位置においてＴｈｒ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、またはＶａｌを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１８８に対応する位置においてＡｓｐを有し、残基１９２に対応する位置においてＡｒｇを有し、残基１９３に対応する位置においてＴｈｒ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、またはＶａｌを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１８８に対応する位置においてＧｌｕを有し、残基１９２に対応する位置においてＬｙｓを有し、残基１９３に対応する位置においてＴｈｒ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、またはＶａｌを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１８８に対応する位置においてＡｓｐを有し、残基１９２に対応する位置においてＬｙｓを有し、残基１９３に対応する位置においてＴｈｒ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、またはＶａｌを有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基１３１に対応する位置においてＡｌａを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３１に対応する位置においてＴｈｒを有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基１３２に対応する位置においてＳｅｒを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３２に対応する位置においてＴｈｒを有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基１３３に対応する位置においてＳｅｒを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３３に対応する位置においてＴｈｒを有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基１３１、１３２、および／または１３３に対応する任意の位置においてＡｌａ、Ｔｈｒ、および／またはＳｅｒを包含する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３１、１３２、および／または１３３に対応する任意の位置においてＡｌａ、Ｔｈｒ、および／またはＳｅｒを包含する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、１３１、１３２、および１３３に対応する位置の全てにおいてＴｈｒを包含する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基１３５に対応する位置においてＶａｌを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３５に対応する位置においてＶａｌ以外の任意のアミノ酸を有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基１３７に対応する位置においてＳｅｒを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３７に対応する位置においてＡｒｇを有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基１５５に対応する位置においてＩｌｅを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１５５に対応する位置においてＴｈｒを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基１５５に対応する位置においてＴｈｒを包含する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１５５に対応する位置においてＴｈｒを包含する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基２２１に対応する位置においてＳｅｒを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基２２１に対応する位置においてＰｒｏを有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基２２１に対応する位置においてＳｅｒを包含する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基２２１に対応する位置においてＰｒｏを包含する。特定のいかなる一つの理論により拘束されることも望まないが、Ｐｒｏ２２１は、Ｈ２ ＨＡのＲＢＳと関与する２２０ループの立体配座に影響を及ぼしうるであろう。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基２２６に対応する位置においてＧｌｎを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基２２６に対応する位置においてＬｅｕを有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基２２７に対応する位置においてＳｅｒを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基２２７に対応する位置においてＧｌｙを有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基２２８に対応する位置においてＧｌｙを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基２２８に対応する位置においてＳｅｒを有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基２２６、２２７、および２２８に対応する位置において、それぞれ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、およびＧｌｙ残基を包含する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基２２６、２２７、および２２８に対応する位置において、それぞれ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、およびＳｅｒを包含する。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド変異体、特にＨ５変異体が、表示される位置（これらの位置の番号付けは、Ｈ３ ＨＡの番号付けに対応する）において以下のアミノ酸：
・Δ１３０（「Δ１３０」とは、１３０位に対応するアミノ酸における欠失を示す）＋残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋残基１３１、１３２、１３５、１８８、１９２、および２２１に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋残基１３３、１３７、１５５、１９３、２２６、２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋残基１３１、１３３、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋残基１３１、１３３、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２６、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋残基１３１、１３３、１３７、１５５、１５９、１６０、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋残基１３１、１３３、１３７、１５５、１５９、１６０、１８８、１９２、１９３、２２６、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、１３１、１３２、１３３、２２１、および２２７に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋残基１３１、１３２、１３３、２２１、および２２７に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、２２８、１３１、１３２、および１３３に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋残基２２７、１３１、１３２、および１３３に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
（Ｘａａ＝任意のアミノ酸）
・Δ１３０、Ｘａａ１３１Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、Ｘａａ１３２Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、Ｘａａ１３３Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ２２１Ｐｒｏ、Ｓｅｒ２２７Ｇｌｙ（Ｘａａ＝任意のアミノ酸）
・Δ１３０、Ｘａａ１９２Ｘａａ’（Ｘａａ＝任意の疎水性アミノ酸、およびＸａａ’＝任意の親水性アミノ酸）
・Δ１３０、Ｘａａ１９２Ｌｙｓ／Ａｒｇ（Ｘａａ＝任意の疎水性残基）
・Δ１３０、Ｘａａ１９３Ｘａａ’（Ｘａａ＝塩基性残基、例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇ、およびＸａａ’＝中性残基または酸性残基）
・Δ１３０、Ｌｙｓ／Ａｒｇ１９３Ｔｈｒ／Ａｌａ／Ｍｅｔ／Ｖａｌ
・Δ１３０、Ｘａａ１９２Ｘａａ’（Ｘａａ＝任意の疎水性アミノ酸、およびＸａａ’＝任意の親水性アミノ酸）、Ｘａａ１９３Ｘａａ’（Ｘａａ＝塩基性残基、例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇ、およびＸａａ’＝中性残基または酸性残基）
・Δ１３０、Ｘａａ１９２Ｌｙｓ／Ａｒｇ（Ｘａａ＝任意の疎水性残基）、Ｘａａ１９３Ｘａａ’（Ｘａａ＝塩基性残基、例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇ、およびＸａａ’＝中性残基または酸性残基）
・Δ１３０、Ｘａａ１９２Ｘａａ’（Ｘａａ＝任意の疎水性アミノ酸、およびＸａａ’＝任意の親水性アミノ酸）、Ｌｙｓ／Ａｒｇ１９３Ｔｈｒ／Ａｌａ／Ｍｅｔ／Ｖａｌ
・Δ１３０、Ｘａａ１９２Ｌｙｓ／Ａｒｇ（Ｘａａ＝任意の疎水性残基）、Ｌｙｓ／Ａｒｇ１９３Ｔｈｒ／Ａｌａ／Ｍｅｔ／Ｖａｌ
・Δ１３０、Ａｌａ１８８Ｇｌｕ
・Δ１３０、Ａｌａ１８８Ａｓｐ
・Δ１３０、Ｘａａ１９２Ｘａａ’（Ｘａａ＝任意の疎水性アミノ酸、およびＸａａ’＝任意の親水性アミノ酸）、Ａｌａ１８８Ｇｌｕ
・Δ１３０、Ｘａａ１９２Ｌｙｓ／Ａｒｇ（Ｘａａ＝任意の疎水性残基）、Ａｌａ１８８Ｇｌｕ
・Δ１３０、Ｘａａ１９３Ｘａａ’（Ｘａａ＝塩基性残基、例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇ、およびＸａａ’＝中性残基または酸性残基）、Ａｌａ１８８Ｇｌｕ
・Δ１３０、Ｌｙｓ／Ａｒｇ１９３Ｔｈｒ／Ａｌａ／Ｍｅｔ／Ｖａｌ、Ａｌａ１８８Ｇｌｕ
・Δ１３０、Ｘａａ１９２Ｘａａ’（Ｘａａ＝任意の疎水性アミノ酸、およびＸａａ’＝任意の親水性アミノ酸）、Ａｌａ１８８Ａｓｐ
・Δ１３０、Ｘａａ１９２Ｌｙｓ／Ａｒｇ（Ｘａａ＝任意の疎水性残基）、Ａｌａ１８８Ａｓｐ
・Δ１３０、Ｘａａ１９３Ｘａａ’（Ｘａａ＝塩基性残基、例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇ、およびＸａａ’＝中性残基または酸性残基）、Ａｌａ１８８Ａｓｐ
・Δ１３０、Ｌｙｓ／Ａｒｇ１９３Ｔｈｒ／Ａｌａ／Ｍｅｔ／Ｖａｌ、Ａｌａ１８８Ａｓｐ
・Δ１３０、Ｘａａ１９２Ｘａａ’（Ｘａａ＝任意の疎水性アミノ酸、およびＸａａ’＝任意の親水性アミノ酸）、Ｘａａ１９３Ｘａａ’（Ｘａａ＝塩基性残基、例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇ、およびＸａａ’＝中性残基または酸性残基）、Ａｌａ１８８Ｇｌｕ
・Δ１３０、Ｘａａ１９２Ｌｙｓ／Ａｒｇ（Ｘａａ＝任意の疎水性残基）、Ｘａａ１９３Ｘａａ’（Ｘａａ＝塩基性残基、例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇ、およびＸａａ’＝中性残基または酸性残基）、Ａｌａ１８８Ｇｌｕ
・Δ１３０、Ｘａａ１９２Ｘａａ’（Ｘａａ＝任意の疎水性アミノ酸、およびＸａａ’＝任意の親水性アミノ酸）、Ｌｙｓ／Ａｒｇ１９３Ｔｈｒ／Ａｌａ／Ｍｅｔ／Ｖａｌ、Ａｌａ１８８Ｇｌｕ
・Δ１３０、Ｘａａ１９２Ｌｙｓ／Ａｒｇ（Ｘａａ＝任意の疎水性残基）、Ｌｙｓ／Ａｒｇ１９３Ｔｈｒ／Ａｌａ／Ｍｅｔ／Ｖａｌ、Ａｌａ１８８Ｇｌｕ
・Δ１３０、Ｘａａ１９２Ｘａａ’（Ｘａａ＝任意の疎水性アミノ酸、およびＸａａ’＝任意の親水性アミノ酸）、Ｘａａ１９３Ｘａａ’（Ｘａａ＝塩基性残基、例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇ、およびＸａａ’＝中性残基または酸性残基）、Ａｌａ１８８Ａｓｐ
・Δ１３０、Ｘａａ１９２Ｌｙｓ／Ａｒｇ（Ｘａａ＝任意の疎水性残基）、Ｘａａ１９３Ｘａａ’（Ｘａａ＝塩基性残基、例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇ、およびＸａａ’＝中性残基または酸性残基）、Ａｌａ１８８Ａｓｐ
・Δ１３０、Ｘａａ１９２Ｘａａ’（Ｘａａ＝任意の疎水性アミノ酸、およびＸａａ’＝任意の親水性アミノ酸）、Ｌｙｓ／Ａｒｇ１９３Ｔｈｒ／Ａｌａ／Ｍｅｔ／Ｖａｌ、Ａｌａ１８８Ａｓｐ
・Δ１３０、Ｘａａ１９２Ｌｙｓ／Ａｒｇ（Ｘａａ＝任意の疎水性残基）、Ｌｙｓ／Ａｒｇ１９３Ｔｈｒ／Ａｌａ／Ｍｅｔ／Ｖａｌ、Ａｌａ１８８Ａｓｐ
のうちの１またはそれより多くを有する。
一部の実施形態では、本発明が、それらのアミノ酸配列が、以下に示されるエレメント：
・Ｘ１３０＋Ｘ１３１、Ｘ１３２、Ｘ１３３、Ｘ１３５、Ｘ１３７、Ｘ１５５、Ｘ１８８、Ｘ１９２、Ｘ１９３、Ｘ２２１、Ｘ２２６、Ｘ２２７、およびＸ２２８のうちの任意の可能な組合せ
・Ｘ１３０＋Ｘ１３１、Ｘ１３２、Ｘ１３５、Ｘ１８８、Ｘ１９２、およびＸ２２１のうちの任意の可能な組合せ
・Ｘ１３０＋Ｘ１３３、Ｘ１３７、Ｘ１５５、Ｘ１９３、Ｘ２２６、Ｘ２２７、およびＸ２２８のうちの任意の可能な組合せ
・Ｘ１３０＋Ｘ１３１、Ｘ１３２、Ｘ１３３、Ｘ１３５、Ｘ１３７、Ｘ１５５、Ｘａａ１５８（Ｘａａ＝Ａｓｎ以外の任意のアミノ酸）、Ｘ１６０、Ｘ１８８、Ｘ１９２、Ｘ１９３、Ｘ２２１、Ｘ２２６、Ｘ２２７、およびＸ２２８のうちの任意の可能な組合せ
・Ｘ１３０＋Ｘ１３１、Ｘ１３３、Ｘ１３７、Ｘ１５５、Ｘ１８８、Ｘ１９２、Ｘ１９３、Ｘ２２６、Ｘ２２７、およびＸ２２８のうちの任意の可能な組合せ
・Ｘ１３０＋Ｘ１３１、Ｘ１３３、Ｘ１３７、Ｘ１５５、Ｘ１８８、Ｘ１９２、Ｘ１９３、Ｘ２２６、およびＸ２２８のうちの任意の可能な組合せ
・Ｘ１３０＋Ｘ１３１、Ｘ１３３、Ｘ１３７、Ｘ１５５、Ｘ１５９、Ｘ１６０、Ｘ１８８、Ｘ１９２、Ｘ１９３、Ｘ２２６、Ｘ２２７、およびＸ２２８のうちの任意の可能な組合せ
・Ｘ１３０＋Ｘ１３１、Ｘ１３３、Ｘ１３７、Ｘ１５５、Ｘ１５９、Ｘ１６０、Ｘ１８８、Ｘ１９２、Ｘ１９３、Ｘ２２６、およびＸ２２８のうちの任意の可能な組合せ
・Ｘ１３０＋Ｘ１３７、Ｘ１８８、Ｘ１９２、Ｘ１９３、Ｘ２２６、Ｘ２２８、Ｘ１３１、Ｘ１３２、Ｘ１３３、Ｘ２２１、およびＸ２２７のうちの任意の可能な組合せ
・Ｘ１３０＋Ｘ１３１、Ｘ１３２、Ｘ１３３、Ｘ２２１、およびＸ２２７のうちの任意の可能な組合せ
・Ｘ１３０＋Ｘ１３７、Ｘ１８８、Ｘ１９２、Ｘ１９３、Ｘ２２６、およびＸ２２８のうちの任意の可能な組合せ
・Ｘ１３０＋Ｘ１３７、Ｘ１８８、Ｘ１９２、Ｘ１９３、Ｘ２２６、Ｘ２２７、Ｘ２２８、Ｘ１３１、Ｘ１３２、およびＸ１３３のうちの任意の可能な組合せ
・Ｘ１３０＋Ｘ２２７、Ｘ１３１、Ｘ１３２、およびＸ１３３のうちの任意の可能な組合せ
［ここで、Ｘ＝任意のアミノ酸（上記で別段に指定しない限り）、および／またはＸ＝欠失アミノ酸］（これらの位置の番号付けは、Ｈ３ ＨＡの番号付けに対応する）
を包含する、ＨＡポリペプチド（例えば、ＨＡポリペプチド変異体、操作されたＨＡポリペプチド、および／または操作されたＨＡポリペプチド変異体）を提供する。
一部の実施形態では、Ｘ１３０が、１３０位における欠失である。一部の実施形態では、Ｘ１６０がＡｌａである。一部の実施形態では、Ｘ１５８が、Ａｓｎ以外の任意のアミノ酸である。
一部のこのような実施形態では、変異体のアンブレラグリカンに対する親和性および／または特異性が増大するように、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、野生型のＨ５ ＨＡポリペプチドと比較して少なくとも１つのさらなる置換を有する。
一部のこのような実施形態では、変異体のアンブレラグリカンに対する親和性および／または特異性が増大するように、ＨＡポリペプチドが、野生型のＨＡポリペプチドと比較して少なくとも１つのさらなる置換を有する。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Ｌ２２６、Ｓ２２８、およびＡ１６０を包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Ｌ２２６およびＡ１６０を包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Ｓ２２８およびＡ１６０を包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Ａ１６０を包含する配列を有する。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Ｌ２２６、Ｓ２２８、およびＸ１５８（Ｘ＝Ａｓｎ以外の任意のアミノ酸）を包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Ｌ２２６およびＸ１５８を包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Ｓ２２８およびＸ１５８を包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Ｘ１５８を包含する配列を有する。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、ならびに残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｌ２２６、Ｓ２２８、Ａ１６０、ならびに残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１８８、１９２、１９３、２２１、および２２７に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｌ２２６、Ａ１６０、ならびに残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１８８、１９２、１９３、２２１、２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｓ２２８、Ａ１６０、ならびに残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１８８、１９２、１９３、２２１、および２２７に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｌ２２６、Ｓ２２８、ならびに残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、および２２７に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ａ１６０、ならびに残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｌ２２６、ならびに残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、および２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｓ２２８、ならびに残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、および２２７に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｌ２２６、Ｓ２２８、Ｘ１５８（Ｘ＝Ａｓｎ以外の任意のアミノ酸）、ならびに残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、および２２７に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｌ２２６、Ｘ１５８、ならびに残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｓ２２８、Ｘ１５８、ならびに残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、および２２７に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｌ２２６、Ｓ２２８、ならびに残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、および２２７に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｘ１５８（Ｘ＝Ａｓｎ以外の任意のアミノ酸）、ならびに残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。
一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、親ＨＡと比較して、特に野生型の親ＨＡと比較して開放性の結合部位を有する。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、アンブレラトポロジーグリカンに結合する。一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチドが、図９に示されるグリカン（例えば、α２−６シアル化グリカン）のうちの少なくとも一部に結合する。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、図９に示される複数のグリカンに結合する。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、ヒト上気道組織（例えば、上皮細胞）内のＨＡ受容体において見出されるグリカンのうちの少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％以上に結合する。
一態様では、本発明が、高親和性によるアンブレラトポロジーグリカンへの結合だけでは、ヒトに対する効果的な伝染／感染性を付与するのに十分ではありえないことの具体的な認識を提供する。本発明は、また、コーントポロジーグリカンへの結合の低減も重要でありうることの洞察を提供する。一部の実施形態では、高親和性によるアンブレラトポロジーグリカンへの結合およびコーントポロジーグリカンへの結合親和性の低減が、ヒトに対する効果的な伝染／感染性を付与することに関与している可能性がある。一部の実施形態では、高親和性によるアンブレラトポロジーグリカンへの結合は、ヒトに対する効果的な伝染／感染性を付与するのに十分である。一部の実施形態では、コーントポロジーグリカンへの結合親和性を低減しない（例えば、変化させない、増大させるなど）場合であっても、高親和性によるアンブレラトポロジーグリカンへの結合は、ヒトに対する効果的な伝染／感染性を付与するのに十分である。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）のアンブレラトポロジーグリカンへの結合親和性および／または結合特異性の増大ならびにコーントポロジーグリカンへの結合親和性および／または結合特異性の低減が、ヒトに対する伝染／感染性を、基準のポリペプチド（例えば、ＨＡポリペプチド変異体のコグネイトである親ＨＡポリペプチド）と比べて増大させるかまたは増強することに関与している可能性がある。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）のアンブレラトポロジーグリカンへの結合親和性および／または結合特異性の増大は、ヒトに対する伝染／感染性を基準のポリペプチド（例えば、ＨＡポリペプチド変異体のコグネイトである親ＨＡポリペプチド）と比べて増大させるかまたは増強するのに十分である。一部の実施形態では、コーントポロジーグリカンへの結合親和性および／または結合特異性を低減しない（例えば、変化させない、増大させるなど）場合であっても、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）のアンブレラトポロジーグリカンへの結合親和性および／または結合特異性の増大は、ヒトに対する伝染／感染性を基準のポリペプチド（例えば、ＨＡポリペプチド変異体のコグネイトである親ＨＡポリペプチド）と比べて増大させるかまたは増強するのに十分である。一部の実施形態では、コーントポロジーグリカンへの結合親和性および／または結合特異性が、アンブレラトポロジーグリカンへの結合親和性および／または結合特異性と同等であり、かつ／またはこれより大きい場合であっても、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）のアンブレラトポロジーグリカンへの結合親和性および／または結合特異性の増大は、ヒトに対する伝染／感染性を基準のポリペプチド（例えば、ＨＡポリペプチド変異体のコグネイトである親ＨＡポリペプチド）と比べて増大させる かまたは増強するのに十分である。
ＨＡポリペプチドの部分または断片
本発明は、本発明によるＨＡポリペプチドの特徴的部分（これらは結合剤の場合もあり、結合剤でない場合もある）およびそれらをコードする核酸をさらに提供する。一般に、特徴的部分とは、それらが併せてＨＡポリペプチドの特徴となる、アミノ酸の連続的な連なりまたはアミノ酸の連続的な連なりの集合を含有する部分である。このような連続的連なりの各々は一般に、少なくとも２つのアミノ酸を含有する。さらに当業者は、典型的に少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０以上のアミノ酸が、Ｈ５ ＨＡポリペプチドの特徴となるように要求されることを理解するであろう。一般に、特徴的部分とは、上記で指定した配列同一性に加えて、関連するインタクトＨＡポリペプチドと少なくとも１つの機能的特徴を共有する部分である。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチドの特徴的部分が、関連する全長ＨＡポリペプチドとグリカン結合特徴を共有する。
非ＨＡポリペプチド
一部の実施形態では、本発明により提供される結合剤が、それらのアミノ酸配列が特徴的なＨＡ配列を包含しないポリペプチドである。本明細書では、このようなポリペプチドを「非ＨＡポリペプチド」と称する。一部の実施形態では、非ＨＡポリペプチドが、あらかじめ（例えば、例えば、基準配列と比較した戦略的なアミノ酸変化［例えば、付加、欠失、および／または置換］の導入を含めた合理的なデザインを介して）選択されるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、非ＨＡポリペプチドが、化学量論的に決定され、例えば、本明細書で規定される所望の結合特徴に基づいて同定されるアミノ酸配列を有する。
抗体
一部の実施形態では、本発明により提供される結合剤を、抗体（例えば、アンブレラトポロジーグリカンおよび／またはアンブレラトポロジーグリカンの模倣体に結合する抗体）とする。本発明に適する抗体は、任意のアンブレラトポロジーグリカンのエピトープに免疫特異的に結合する抗体または抗体断片を包含する。本明細書で用いられる「抗体」という用語は、指定されたタンパク質またはペプチド、またはその断片に対して特異的に反応性である免疫グロブリンおよびこれらの断片を包含することを意図する。適切な抗体には、ヒト抗体、霊長動物化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、コンジュゲート抗体（すなわち、他のタンパク質、放射性標識、細胞毒素にコンジュゲートするかまたは融合させた抗体）、Ｓｍａｌｌ Ｍｏｄｕｌａｒ ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（「ＳＭＩＰ（商標）」）、単鎖抗体、ラクダ抗体、および抗体断片が含まれるがこれらに限定されない。本明細書で用いられる「抗体」という用語にはまた、インタクトモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一ドメイン抗体（例えば、サメの単一ドメイン抗体（例えば、ＩｇＮＡＲまたはその断片））、少なくとも２つのインタクト抗体から形成される多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、およびそれらが所望の生物学的活性を呈示する限りにおける抗体断片も含まれる。本明細書で用いられる抗体ポリペプチドは、任意の種類（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）でありうる。
本明細書で用いられる「抗体断片」は、例えば、抗体の抗原結合領域または可変領域など、インタクト抗体の部分を包含する。抗体断片の例は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、およびＦｖ断片；トリアボティー；テトラボディー；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；および抗体断片から形成される多重特異性抗体を包含する。「抗体断片」という用語はまた、特定の抗原に結合して複合体を形成することにより抗体と同様に作用する、任意の合成タンパク質または遺伝子操作されたタンパク質も包含する。例えば、抗体断片は、重鎖および軽鎖の可変領域からなる単離された断片である「Ｆｖ」断片、軽鎖可変領域および重鎖可変領域がペプチドリンカーで連結されている組換え単鎖ポリペプチド分子（「ＳｃＦｖタンパク質」）、および超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小の認識単位を包含する。
抗体は、当技術分野で周知の方法を用いて発生させることができる。例えば、抗体を生成させるためのプロトコールは、参照により本明細書に組み込まれる、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８年、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」により記載されている。典型的に、抗体は、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ラクダ、ラマ、サメ、または他の適切な宿主において発生させることができる。代替的に、抗体は、ＩｇＹ分子を生成させるニワトリにおいても作製することができる（参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｃｈａｄｅら、１９９６年、ＡＬＴＥＸ、１３巻（５号）：８０〜８５頁）。一部の実施形態では、本発明に適する抗体を、類人霊長動物抗体とする。例えば、ヒヒにおいて治療的に有用な抗体を作製する一般的な技法は、例えば、これらのいずれもが参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇら、国際特許公開第ＷＯ９１／１１４６５号、１９９１年；およびＬｏｓｍａｎら、１９９０年、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ、４６巻：３１０頁において見出すことができる。一部の実施形態では、モノクローナル抗体を、ハイブリドーマ法を用いて調製することができる（参照により本明細書に組み込まれる、ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、１９８３年、Ｎａｔｕｒｅ、３０５巻（５９３４号）：５３７〜４０頁）。一部の実施形態ではまた、モノクローナル抗体を、組換え法を介して作製することもできる（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，１６６，４５２号、１９７９年）。
一部の実施形態では、本発明に適する抗体が、ヒト化抗体またはヒト抗体を包含しうる。非ヒト抗体のヒト化形態とは、非ヒトＩｇに由来する最小限の配列を含有する、キメラＩｇ、Ｉｇ鎖、またはＩｇ断片（Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、またはＡｂの他の抗原に結合する部分配列など）である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト供給源から導入された１またはそれより多くのアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「インポート」可変ドメインから取り込まれることが典型的である「インポート」残基と称することが多い。ヒト化は、齧歯動物の相補性決定領域（ＣＤＲ）またはＣＤＲ配列を、ヒト抗体の対応する配列で置換することにより達成する（これらのいずれもが参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８年、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻（６１６２号）：３２３〜７頁；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻（４８４７号）：１５３４〜６頁）。このような「ヒト化」抗体とは、非ヒト種に由来する対応する配列で置換されたインタクトヒト可変ドメインが実質的に少ないキメラＡｂである（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，８１６，５６７号、１９８９年）。一部の実施形態では、ヒト化抗体を、一部のＣＤＲ残基、および、おそらくは、一部のＦＲ残基が、齧歯動物Ａｂにおける類似の部位に由来する残基で置換されているヒト抗体とすることが典型的である。ヒト化抗体は、レシピエントのＣＤＲに由来する残基が、所望の特異性、親和性、および効能を有する、マウス、ラット、またはウサギなど、非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲに由来する残基で置換されているヒトＩｇ（レシピエント抗体）を包含する。場合によっては、対応する非ヒト残基を、ヒトＩｇのＦｖフレームワーク残基により置換する。ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、インポートされたＣＤＲ配列またはフレームワーク配列にも見出されない残基を含みうる。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトＩｇのＣＤＲ領域に対応するＣＤＲ領域のうちの全てではないにせよこれらの大半、およびＦＲ領域のうちの全てではないにせよこれらの大半を、ヒトＩｇコンセンサス配列の領域とする、少なくとも１つの、および典型的には２つの可変ドメインのうちの実質的に全てを含む。ヒト化抗体はまた、Ｉｇ定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒトＩｇのＦｃの少なくとも一部も含むことが最適である（これらのいずれもが参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８年、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻（６１６２号）：３２３〜７頁；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ．、２３９巻（４８４７号）：１５３４〜６頁）。
ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーを含めた多様な技法（これらのいずれもが参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９１年、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２８巻（９号）：１０２７〜３７頁；Ｍａｒｋｓら、１９９１年、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．、２２２巻（３号）：５８１〜９７頁）、およびヒトモノクローナル抗体の調製（参照により本明細書に組み込まれる、ＲｅｉｓｆｅｌｄおよびＳｅｌｌ、１９８５年、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖ．、４巻（１号）：２７１〜９０頁）を用いて生成させることもできる。同様に、ヒトＩｇ遺伝子の、内因性のＩｇ遺伝子を部分的または完全に不活化させたトランスジェニック動物への導入も、ヒト抗体を合成するのに利用することができる。感作すると、遺伝子の再構成、アセンブリー、および抗体レパートリーを含めた全ての点においてヒトにおいて見られるヒト抗体の生成に酷似するヒト抗体の生成が観察される（それらの全てが参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、１９９６年、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１４巻（７号）：８４５〜５１頁；Ｌｏｎｂｅｒｇら、１９９４年、Ｎａｔｕｒｅ、３６８巻（６４７４号）：８５６〜９頁；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、１９９５年、Ｉｎｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３巻（１号）：６５〜９３頁；Ｍａｒｋｓら、１９９２年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ Ｙ）、１０巻（７号）：７７９〜８３頁）。
レクチン
一部の実施形態では、本発明により提供される結合剤を、レクチンとする。レクチンとは、可溶性の炭水化物、または糖コンジュゲート（例えば、糖ペプチドまたは糖脂質）の一部である炭水化物部分に結合しうる糖結合タンパク質である。レクチンは典型的に、特定の動物細胞を凝集させ、かつ／または特定の糖部分を認識することにより、糖コンジュゲートを沈殿させる。例えば、ＳＮＡ−１とは、α２−６シアル酸に対する親和性が高いレクチンである。さらに別の例として述べると、Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ ｓｑｕａｍｏｓｕｓのレクチン（ＰＳＬ１ａおよびＰＳＬ１ｂ）は、アスパラギン結合型糖タンパク質の三糖配列であるＮｅｕ５Ａｃα２，６Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ／ＧｌｃＮＡｃを含有するシアル化糖コンジュゲートに結合するときの親和性が高い。結合剤として作用しうる非限定的な例示的レクチンには、ＳＮＡ−１、ＳＮＡ−１’、ＰＳＬ１ａ、ＰＳＬ１ｂ、およびこれらに由来するポリペプチドが含まれる。
例示的なレクチンのアミノ酸配列を以下に示す。
Ｓａｍｂｕｃｕｓ Ｎｉｇｒａのレクチン１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号第Ｕ２７１２２号）：
Ｓａｍｂｕｃｕｓ Ｎｉｇｒａのレクチン１’（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号第Ｕ６６１９１号）：
Ｐｏｌｙｐｏｒｏｕｓ ｓｑｕａｍｏｓｕｓのレクチン１ａ（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ７５ＷＴ９）
Ｐｏｌｙｐｏｒｏｕｓ ｓｑｕａｍｏｓｕｓのレクチン１ｂ（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ７５ＷＴ８）
アプタマー
一部の実施形態では、本発明により提供される結合剤をアプタマーとする。アプタマーとは、特定の分子標的（例えば、アンブレラトポロジーグリカン）に緊密に結合する核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）からなる高分子である。特定のアプタマーは、直鎖状のヌクレオチド配列を介して記載することができ、典型的には長さが約１５〜約６０ヌクレオチドである。いかなる理論により拘束されることも望まないが、アプタマー中のヌクレオチド鎖が、この分子を複雑な３次元的形状へとフォールディングする分子内相互作用を形成し、この３次元的形状により、アプタマーがその標的分子の表面に緊密に結合することが可能となることが目論まれる。全ての可能なヌクレオチド配列の母集団内に存在する分子的形状の並外れた多様性を踏まえるなら、タンパク質および低分子を含めた多彩な分子標的についてもアプタマーを得ることができる。高度な特異性に加えて、それらの標的に対するアプタマーの親和性は極めて高い（例えば、タンパク質に対して、ピコモル〜低濃度のナノモル範囲の親和性）。アプタマーは化学的に安定であり、活性を喪失させることなく煮沸することもでき、凍結させることもできる。アプタマーは合成分子であるため、それらの機能を特定の適用に最適化しうる各種の修飾を施しやすい。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏの適用において用いるために、アプタマーを修飾して、それらの血中の酵素による分解に対する感受性を劇的に低減することができる。加えて、アプタマーを修飾して、それらの生体内分布または血漿中貯留時間を変化させることもできる。
アンブレラトポロジーグリカン（および／またはアンブレラトポロジーグリカンの模倣体）に結合しうるアプタマーの選択は、当技術分野で公知の方法を介して達成することができる。例えば、アプタマーは、ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法を用いて選択することができる（参照により本明細書に組み込まれる、ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ、１９９０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９巻：５０５〜５１０頁）。ＳＥＬＥＸ法では、核酸分子の大規模なライブラリー（例えば、１０１５の異なる分子）を、標的分子（例えば、アンブレラトポロジーグリカンのエピトープを有するアンブレラトポロジーグリカン）と共に生成させ、かつ／またはスクリーニングする。標的分子は、ある時間にわたりヌクレオチド配列のライブラリーと共にインキュベートすることが可能である。次いで、当技術分野で公知の複数の方法を用いて、アプタマーの標的分子を、混合物中の結合していない分子（これらは廃棄することができる）から物理的に分離することができる。次いで、標的分子に対する親和性が最も高いアプタマーを、標的分子から精製し、酵素的に増幅して、標的分子に結合しうるアプタマーについて実質的に濃縮された新たな分子ライブラリーを生成させることができる。次いで、濃縮されたライブラリーを用いて、選択、分配、および増幅の新たなサイクルを開始することができる。５〜１５サイクルにわたるこの反復的な選択工程、分配工程、および増幅工程の後、ライブラリーを、標的分子に緊密に結合する少数のアプタマーへと縮減する。次いで、混合物中の個別の分子を単離し、それらのヌクレオチド配列を決定し、結合親和性および特異性との関係におけるそれらの特性を測定および比較することができる。次いで、単離されたアプタマーをさらに洗練して、標的への結合および／またはアプタマー構造に寄与しない任意のヌクレオチドを消失させ、これにより、それらのコア結合ドメインへと切断されたアプタマーを生成させることができる。アプタマー法の総説については、その教示の全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｊａｙａｓｅｎａ、１９９９年、Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ．、４５巻：１６２８〜５０頁を参照されたい。
ポリペプチドの生成
本発明によるポリペプチド（例えば、ＨＡポリペプチドおよび／または非ＨＡポリペプチド）、および／もしくはそれらの特徴的部分、またはそれらをコードする核酸は、任意の利用可能な手段を介して生成させることができる。
本発明によるポリペプチド（またはそれらの特徴的部分）は、例えば、本発明によるポリペプチドをコードする核酸を発現させるように操作された宿主細胞系を用いることにより生成させることができる。
鶏卵、バキュロウイルス、植物、酵母、メイティン−ダービーイヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、またはＶｅｒｏ（アフリカミドリザル腎臓）細胞など、任意の系を用いてポリペプチド（または特徴的部分）を生成させることができる。代替的にまたは加えて、ポリペプチド（または特徴的部分）は、発現ベクターの使用を介するなどの組換え法を用いて細胞内で発現させることができる（参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）。
代替的にまたは加えて、本発明によるポリペプチド（またはそれらの特徴的部分）は、合成的手段を介して生成させることもできる。
代替的にまたは加えて、本発明によるポリペプチド（またはそれらの特徴的部分）、特にＨＡポリペプチドは、その他野生型であるか、弱毒化されているか、死滅しているかどうかなど、インタクトなウイルスの文脈で生成させることができる。また、本発明によるポリペプチド（例えば、ＨＡポリペプチド）、またはそれらの特徴的部分は、ウイルス様粒子の文脈でも生成させることができる。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（またはそれらの特徴的部分）を、インフルエンザウイルスから単離および／または精製することができる。例えば、ウイルスは、孵化鶏卵などの卵内で増殖させることができるが、この場合、採取される物質は典型的に、尿膜腔液である。代替的にまたは加えて、インフルエンザウイルスは、組織培養物を用いてウイルスを増殖させる任意の方法に由来しうる。ウイルスを増殖させるのに適する細胞基質には、例えば、ＭＤＣＫ細胞またはＭＤＣＫ細胞、ＭＤＣＫ様細胞のクローンに由来する細胞などのイヌ腎臓細胞、Ｖｅｒｏ細胞を含めたＡＧＭＫ細胞などのサル腎臓細胞、連続継代細胞系として培養された上皮細胞、２９３Ｔ細胞、ＢＫ−２１細胞、ＣＶ−１細胞、または市販供給源（例えば、ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から容易に入手可能な、ワクチンを目的としてインフルエンザウイルスを生成させるのに適する他の任意の哺乳動物細胞型が含まれる。また、適切な細胞基質は、ＭＲＣ−５細胞などのヒト細胞も包含する。適切な細胞基質は、細胞系に限定されず、例えばまた、ニワトリ胚線維芽細胞などの初代細胞も包含される。
当業者はまた、ポリペプチド、特に本明細書で記載される変異体のＨＡポリペプチドは、アンブレラトポロジーグリカンに結合することが可能なポリペプチドの容易なスクリーニングおよび／または選択を可能とする条件下で、ポリペプチドを生成させる（単独であれ、ウイルス粒子またはウイルスの一部としての生成を含めた、複合体の一部としてであれ）細胞または生物を培養することにより、発生させる場合もあり、同定する場合もあり、単離する場合もあり、かつ／または生成させる場合もあることも理解するであろう。一例を挙げるに過ぎないが、一部の実施形態では、ポリペプチド（例えば、ＨＡ変異体ポリペプチド）のコレクションを、アンブレラトポロジーグリカンに結合する（例えば、特定の特異性および／または親和性で）変異体を明らかにし、かつ／またはこれらに好適な条件下で生成させ、かつ／または研究することが有用でありうる。一部の実施形態では、このようなポリペプチド（例えば、ＨＡ変異体ポリペプチド）のコレクションが、天然における進化の結果として得られる。一部の実施形態では、このようなポリペプチド（例えば、ＨＡ変異体ポリペプチド）のコレクションが、操作の結果として得られる。一部の実施形態では、このようなポリペプチド（例えば、ＨＡ変異体ポリペプチド）のコレクションが、操作および天然の進化の組合せの結果として得られる。
ＨＡ受容体
ＨＡは、糖タンパク質受容体に結合することにより、細胞表面と相互作用する。ＨＡのＨＡ受容体への結合は主に、ＨＡ受容体におけるＮ結合型グリカンを介する。とりわけ、インフルエンザウイルス粒子の表面におけるＨＡは、細胞宿主の表面におけるＨＡ受容体と会合するシアル化したグリカンを認識する。認識および結合の後、宿主細胞がウイルス細胞を取り込むと、ウイルスは近傍の細胞に分布するさらに多くのウイルス粒子を複製し、これらを生成させることが可能となる。例示的なＨＡ−グリカン間相互作用の一部の結晶構造が同定されており、これらを表１に提示する：
ＨＡ−α２−６シアル化グリカン複合体は、ＡＤＵ６３＿Ｈ３およびＡＤＳ９７＿Ｈ５およびＶｉｅｔ０４＿Ｈ５のＨＡ１サブユニットのＣＡトレースを、ＡＳＩ３０＿Ｈ１＿２６およびＡＰＲ３４＿Ｈ１＿２６（Ｈ１）へと重ね合わせることにより発生させた。ヒトＡ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（Ｈ３Ｎ２）のα２−６シアル化グリカンとの構造的複合体は公表されている（参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｉｓｅｎら、１９９７年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２３２巻：１９頁）が、それらの座標は、タンパク質データバンクにおいて使用可能ではなかった。ＳＡＲＦ２（ｈｔｔｐ：／／１２３ｄ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ／ｓａｒｆ２．ｈｔｍｌ）プログラムを用いて、重ね合せのための異なるＨＡ１サブユニットの構造アライメントを得た。
ＨＡ受容体は、受容体のＨＡ結合部位近傍のα２−３シアル化グリカンまたはα２−６シアル化グリカンにより修飾されており、受容体に結合したグリカンの結合の種類は、受容体のＨＡ結合部位の立体配座に影響を及ぼす可能性があり、したがって、受容体の異なるＨＡに対する特異性に影響を及ぼす可能性がある。
例えば、トリＨＡのグリカン結合ポケットは、狭小である。本発明によれば、このポケットは、α２−３シアル化グリカンのトランス立体配座および／またはα２−３結合であれ、α２−６結合であれ、コーントポロジーグリカンに結合する。
トリ組織におけるＨＡ受容体、およびまた、ヒト肺深部およびヒト消化（ＧＩ）管組織におけるＨＡ受容体もα２−３シアル化グリカン結合を特徴とし、さらに（本発明によれば）、主にコーントポロジーを取る、α２−３シアル化グリカンおよび／またはα２−６シアル化グリカンを含めたグリカンも特徴とする。本明細書では、このようなコーントポロジーグリカンを有するＨＡ受容体をＣＴＨＡｒと称することができる。
これに対して、上気道の気管支および気管におけるヒトＨＡ受容体は、α２−６シアル化グリカンで修飾されている。α２−３モチーフとは異なり、α２−６モチーフは、Ｃ６−Ｃ５結合のために立体配座的自由度を増大させる（参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｕｓｓｅｌｌら、２００６年、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ、２３巻：８５頁）。このようなα２−６シアル化グリカンは、この立体配座的自由度から生じる構造の多様性に対応する開放性の大きな結合ポケットを有するＨＡに結合する。さらに、本発明によれば、ヒト上気道組織の感染を効果的に媒介するために、ＨＡは、アンブレラトポロジーにあるグリカン（例えば、α２−６シアル化グリカン）に結合することを必要とする可能性があり、特に、高度の親和性および／または特異性を伴うこのようなアンブレラトポロジーグリカンに結合することを必要とする可能性がある。本明細書では、アンブレラトポロジーグリカンを有するＨＡ受容体をＵＴＨＡｒと称することができる。
これらの空間的に制約されたグリコシル化プロファイルの結果として、ヒトは通常、多くの野生型のトリＨＡ（例えば、トリＨ５）を含有するウイルスに感染しない。とりわけ、ウイルスに遭遇する可能性が極めて高いヒト気道の部分（すなわち、気管および気管支）は、コーングリカン（例えば、α２−３シアル化グリカンおよび／または短鎖グリカン）を伴う受容体を欠き、野生型のトリＨＡは、コーングリカン（例えば、α２−３シアル化グリカンおよび／または短鎖グリカン）と会合する受容体に主にまたはもっぱら結合することが典型的であるため、ヒトは、トリウイルスに感染することがまれである。ウイルスがアンブレラグリカン（例えば、長鎖α２−６シアル化グリカン）を有する肺深部および／または消化管の受容体に接近しうる程度にウイルスとの接触が十分に緊密である場合に限り、ヒトは感染する。
グリカンアレイ
公知の特定のグリカン間結合タンパク質（ＧＢＰ）相互作用についての最新の知識を迅速に拡張するため、国際的な研究協力イニシアチブであるＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ（ＣＦＧ； ｗｗｗ．ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｌｙｃｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ）は、新規のグリカンリガンド特異性についてＧＢＰをハイスループットでスクリーニングすることを可能とした複数のグリカン構造を含むグリカンアレイを開発した。グリカンアレイは、一価および多価のグリカンモチーフ（すなわち、ポリアクリルアミド骨格に結合した）の両方を含み、各アレイは、低濃度（１０μＭ）および高濃度（１００μＭ）の２６４のグリカンおよび各濃度に応じた６カ所のスポットを含む（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｌｙｃｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ／ｓｔａｔｉｃ／ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｃｏｒｅｈ５．ｓｈｔｍｌを参照されたい）。
アレイは主に、Ｎ結合型グリカンおよびＯ結合型グリカンの生理学的多様性を捕捉する合成グリカンを含む。アレイでは、合成グリカンに加えてまた、異なる哺乳動物の糖タンパク質に由来するＮ結合型グリカンの混合物も表出される。
本明細書で用いられる、グリカン「アレイ」とは、場合によって固体支持体に固定化された１またはそれより多くのグリカンのセットを指す。一部の実施形態では、「アレイ」を、空間内で物理的に隔てられた２カ所以上の位置において構成された配置またはパターンとして存在するグリカンのコレクションとする。典型的には、グリカンアレイが、少なくとも４カ所、少なくとも８カ所、少なくとも１６カ所、少なくとも２４カ所、少なくとも４８カ所、少なくとも９６カ所、または数百カ所もしくは数千カ所の異なる位置を有する。一般に、本発明によるグリカンアレイは、各種のフォーマットのうちのいずれかを有しうる。当技術分野では、生体分子に適用可能な、多様で異なるアレイフォーマットが公知である。例えば、膨大な数のタンパク質アレイおよび／または核酸アレイが周知である。当業者は、本発明のグリカンアレイに適する標準的なアレイフォーマットを速やかに理解するであろう。
一部の実施形態では、本発明によるグリカンアレイが、「マイクロアレイ」フォーマットで存在する。マイクロアレイは典型的に、試料位置を約５０μ〜約２００μ以下の距離だけ隔てている場合があり、試料をナノモル〜マイクロモルの範囲内またはナノグラム〜ピコグラムの範囲内に固定化している場合がある。当技術分野で公知のアレイフォーマットは、例えば、異なる試料位置の各々のスケールが、例えば、１０μであるフォーマットを包含する。
一部の実施形態では、本発明によるグリカンアレイが、支持体上に空間的に固定化された複数のグリカンを含む。本発明は、支持体上に配列されたグリカン分子を提供する。本明細書で用いられる「支持体」とは、グリカン分子を配列するのに用いるのに適する任意の物質を指す。当業者が理解する通り、多種多様な材料のうちのいずれを用いることもできる。少数の例を挙げるに過ぎないが、本発明において用いうる支持体材料には、疎水性膜、例えば、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜、またはナイロン膜が含まれる。当技術分野では、このような膜が周知であり、例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｍｅｌ Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ、ＵＫから得ることができる。
一部の実施形態では、グリカンを配列する支持体が、金属酸化物を含みうる。適切な金属酸化物には、酸化チタン、酸化タンタル、および酸化アルミニウムが含まれるがこれらに限定されない。このような材料の例は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌｔｄ、Ｆａｎｃｙ Ｒｏａｄ、Ｐｏｏｌｅ、Ｄｏｒｓｅｔ．ＢＨ１２ ４ＱＨ ＵＫから得ることができる。
一部の実施形態では、このような支持体を金属酸化物ゲルとするか、またはこのような支持体が金属酸化物ゲルを含む。金属酸化物ゲルは、所与の肉眼的領域内に大表面積をもたらして、炭水化物含有分子の固定化の一助となると考えられる。
本発明により用いうるさらなるまたは代替的な支持体材料には、ゲル、例えば、シリカゲルまたは酸化アルミニウムゲルが含まれる。このような材料の例は、例えば、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙから得ることができる。
一部の実施形態では、グリカンアレイを、通常の使用時にはサイズまたは形状の変化に耐性でありうる支持体上に固定化する。例えば、支持体を、グリカンを配列するのに用いるのに適する材料成分でコーティングしたスライドガラスとすることができる。また、一部の複合材料も、支持体に所望の固体性をもたらしうる。
本明細書で裏付けられる通り、本発明によるアレイは、異なるＨＡポリペプチドおよびそれらの結合特徴の同定および／または特徴付けに有用である。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチドをこのようなアレイ上で調べて、それらがアンブレラトポロジーグリカン（例えば、α２−６シアル化グリカン、特にアンブレラトポロジーに配置された長鎖α２−６シアル化グリカン）に結合する能力を評価する。
実際、本発明は、ＨＡポリペプチドの結合能を特徴付けるのに用いうるα２−６シアル化グリカンのアレイ、および、場合によって、α２−３シアル化グリカンのアレイ、ならびに／または、例えば、ヒトに結合するＨＡポリペプチドを検出するための診断法として用いうるα２−６シアル化グリカンのアレイ、および、場合によって、α２−３シアル化グリカンのアレイを提供する。一部の実施形態では、本発明によるアレイが、アンブレラトポロジーにあるグリカン（例えば、α２−６シアル化グリカン、特に長鎖α２−６シアル化グリカン）を含有する。当業者に明らかである通り、このようなアレイは、例えば、研究者によりデザインおよび／または調製されるＨＡポリペプチドに加えて、天然のインフルエンザウイルス単離物中に見出されるＨＡポリペプチドを含めた任意のＨＡポリペプチドを特徴付けるまたはこれを検出するのに有用である。
一部の実施形態では、このようなアレイが、ヒトＨＡ受容体、特にヒト上気道ＨＡ受容体において見出されるグリカン（例えば、α２−６シアル化グリカン、特に、長鎖α２−６シアル化グリカンであることが多いアンブレラグリカン）のうちの約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％以上を代表するグリカンを包含する。一部の実施形態では、本発明によるアレイが、図１０に示されるグリカン構造のうちの一部または全部を包含する。一部の実施形態では、アレイが、示されるこれらのグリカンのうちの少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％以上を包含する。
本発明は、グリカンアレイを用いてＨＡタンパク質を同定するかまたはこれを特徴付ける方法を提供する。一部の実施形態では、例えば、このような方法が、（１）ＨＡポリペプチドを含有する試料を供給するステップと、（２）試料をグリカンアレイと接触させるステップと、（３）ＨＡポリペプチドのアレイ上の１またはそれより多くのグリカンへの結合を検出するステップとを含む。
本発明によるグリカンアレイと接触させる、ＨＡポリペプチドを含有する試料に適する供給源には、血液、血清／血漿、末梢血単核細胞／末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ／ＰＢＬ）、痰、尿、糞便、咽頭スワブ、皮膚病変スワブ、脳脊髄液、頸管スミア、膿試料、食物マトリックス、ならびに脳、脾臓、および肝臓など、体内の多様な部分に由来する組織などの病理学的試料が含まれるがこれらに限定されない。代替的にまたは加えて、ＨＡポリペプチドを含有する試料に適する他の供給源には、土壌、水、および微生物叢などの環境試料が含まれるがこれらに限定されない。さらに他の試料には、実験用試料、例えば、研究者によりデザインされ、かつ／または調製される、操作されたＨＡポリペプチドの試料が含まれる。また、列挙されていない他の試料も適用可能でありうる。
当技術分野では、ＨＡポリペプチドの本発明によるグリカンアレイへの結合についてアッセイするのに適する多種多様な検出システムが公知である。例えば、ＨＡポリペプチドは、アレイと接触させる前に、またはアレイと接触させた後に検出可能に標識する（直接的にまたは間接的に）ことができる。次いで、局在化された標識を検出することにより、結合を検出することができる。一部の実施形態では、走査デバイスを用いてアレイ上の特定の位置を検証することができる。
代替的にまたは加えて、配列されたグリカンへの結合は、例えば、熱量測定による検出システム、蛍光による検出システム、または放射線による検出システム、もしくは他の標識方法、または標識化を要求しない他の方法を用いて測定することができる。一般に、蛍光による検出は典型的に、蛍光分子を伴うアレイを直接プローブするステップと、蛍光シグナルをモニタリングするステップとを伴う。代替的にまたは加えて、アレイは、間接的に蛍光を検出する（この場合は、蛍光標識したストレプトアビジンの結合について調べることを介する）ためにタグづけされた（例えば、ビオチンでタグ付けされた）分子によりプローブすることもできる。代替的にまたは加えて、配列されたグリカンを蛍光標識し、被験分子（異なるフルオロフォアで標識する場合もあり、標識しない場合もある）でプローブする、蛍光消光法も用いることができる。このような実施形態では、アレイへの結合が、配列されたグリカンから発光する蛍光を抑止するように作用し、したがって、蛍光発光の喪失を介して結合を検出する。代替的にまたは加えて、配列されたグリカンは、放射性標識したプローブをもたらす、放射性物質の存在下で増殖させた生組織試料によりプローブすることもできる。このような実施形態における結合は、放射性発光を測定することにより検出することができる。
このような方法は、ＨＡポリペプチドによる本発明によるグリカンアレイへの結合の事実および／または結合の程度を決定するのに有用である。一部の実施形態では、このような方法をグリカン−ＨＡポリペプチド相互作用に干渉するかまたは他の形でこれを変化させる薬剤を同定するおよび／または特徴付けるのにさらに用いることもできる。
以下で記載される方法は、例えば、炭水化物と相互作用することが可能であると考えられる分子が、実際に相互作用しうるかどうかを確認するか、またはある分子が、炭水化物と相互作用する能力を予測されない形で有するかどうかを確認するのに特に用いることができる。
本発明はまた、本発明によるアレイを用いて、例えば、被験試料中の特定の薬剤を検出する方法も提供する。例えば、このような方法は、（１）グリカンアレイを被験試料と（例えば、ＨＡポリペプチドを含有すると考えられる試料と）接触させるステップと、（２）被験試料中の任意の薬剤のアレイへの結合を検出するステップとを含みうる。
なおさらに、本発明によるアレイへの結合は、例えば、結合剤とグリカンとの間の相互作用の反応速度を決定するのにも用いることができる。例えば、本発明による相互作用の反応速度を決定する方法は、（１）グリカンアレイを被験分子と接触させるステップと、（２）結合剤と配列されたグリカン（複数可）との間の相互作用の反応速度を測定するステップとを包含しうる。
結合剤の、本発明によるアレイ中のグリカンのうちのいずれかとの相互作用の反応速度は、上記で詳述した、例えば、熱量測定シグナルまたは蛍光シグナルのリアルタイムにおける変化を介して測定することができる。このような方法は、例えば、特定の結合剤が、同じ炭水化物と相互作用する異なる結合剤より高度の結合で特定の炭水化物と相互作用することが可能であるかどうかを決定するのに特に用いることができる。
当然ながら、本発明によるＨＡポリペプチドによるグリカン結合を、アレイフォーマット自体では存在しないグリカン試料または供給源において評価しうることが理解されるであろう。例えば、本発明によるＨＡポリペプチドを、組織試料および／または細胞系に結合させて、それらのグリカン結合特徴を評価することができる。適切な細胞系は、例えば、各種の哺乳動物細胞系、特に、アンブレラトポロジーグリカン（例えば、これらのうちの少なくとも一部は、α２−６シアル化グリカン、特に長鎖α２−６シアル化グリカンでありうる）を含有するＨＡ受容体を発現させる哺乳動物細胞系のうちのいずれかを包含する。一部の実施形態では、用いられる細胞系が、アンブレラトポロジーを伴う個別のグリカンを発現させる。一部の実施形態では、用いられる細胞系が、多様なグリカンを発現させる。一部の実施形態では、細胞系を、臨床単離物から得、場合によっては、所望のグリカン分布および／またはグリカン保有率を有するようにそれらを維持または操作する。一部の実施形態では、組織試料および／または細胞系が、哺乳動物の上気道上皮細胞に特徴的なグリカンを発現させる。
核酸
一部の実施形態では、本発明が、ＨＡポリペプチド、またはＨＡポリペプチドの特徴的部分もしくは生物学的に活性な部分をコードする核酸を提供する。一部の実施形態では、本発明が、ＨＡポリペプチド、またはＨＡポリペプチドの特徴的部分もしくは生物学的に活性な部分をコードする核酸と相補的な核酸を提供する。
一部の実施形態では、本発明が、ＨＡポリペプチド、またはＨＡポリペプチドの特徴的部分もしくは生物学的に活性な部分をコードする核酸とハイブリダイズする核酸分子を提供する。このような核酸は、例えば、プライマーとして用いることもでき、プローブとして用いることもできる。少数の例を挙げるに過ぎないが、このような核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるプライマーとして用いることもでき、ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含めた）のためのプローブとして用いることもでき、かつ／または逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）のためのプライマーとして用いることもできる。
一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡの場合もあり、ＲＮＡの場合もあり、一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もある。一部の実施形態では、本発明による核酸が、１またはそれより多くの非天然ヌクレオチドを包含する場合があり、一部の実施形態では、本発明による核酸が、天然のヌクレオチドだけを包含する。
ポリペプチドに対する抗体
本発明は、本発明による結合剤ポリペプチド（例えば、ＨＡポリペプチド）に対する抗体を提供する。これらは、モノクローナル抗体の場合もあり、ポリクローナル抗体の場合もあり、当業者に公知の各種の技法のうちのいずれかを介して調製することができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８年、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照されたい）。例えば、抗体は、モノクローナル抗体の生成を含めた細胞培養法を介して生成させることもでき、組換え抗体の生成を可能とするために、抗体遺伝子の、適切な細菌細胞宿主または哺乳動物細胞宿主へのトランスフェクションを介して生成させることもできる。
動物モデルにおける結合剤の試験
本発明は、本発明による結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド、ＬＳＢＡ、ＵＳＢＡ、ＵＴＳＢＡなど）を動物宿主において調べる方法を提供する。本明細書で用いられる「動物宿主」は、インフルエンザの研究に適する任意の動物モデルを包含する。例えば、本発明に適する動物宿主は、霊長動物、フェレット、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、マウス、ハムスター、ウサギ、およびラットなどの齧歯動物を含めた任意の哺乳動物宿主でありうる。一部の実施形態では、本発明に用いられる動物宿主を、フェレットとする。特に、一部の実施形態では、本発明による結合剤（場合によって、本発明による組成物中の）を投与する前に、動物宿主を、ウイルス曝露または感染に対してナイーブとする。一部の実施形態では、本発明による結合剤の投与前に、または投与と共時的に、動物宿主にウイルスを接種するか、動物宿主をウイルスに感染させるか、または動物宿主を他の形でウイルスに曝露する。当技術分野で公知の任意の方法を介して、本発明を実施するのに用いられる動物宿主にウイルスを接種するか、動物宿主をウイルスに感染させるか、または動物宿主を他の形でウイルスに曝露することができる。一部の実施形態では、動物宿主にウイルスを鼻腔内接種するか、動物宿主をウイルスに鼻腔内感染させるか、または動物宿主をウイルスに鼻腔内曝露することができる。
一部の実施形態では、適切な動物宿主のコーントポロジーグリカンと対比したアンブレラトポロジーグリカンの分布、および／またはα２−３グリカンと対比したα２−６グリカンの分布が、ヒト気道内で見出される分布と類似しうる。例えば、ヒトにおけるインフルエンザウイルスにより引き起こされる疾患のモデルとして用いられる場合、動物宿主としてのフェレットは、マウスより代表的でありうることが目論まれる（参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｕｍｐｅｙら、２００７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１５巻；６５５〜５９頁）。いかなる理論に拘束されることも望まないが、本発明は、フェレットの気道におけるグリカン分布が、ヒト気道におけるグリカン分布と類似する程度は、マウスがヒトに対して示す類似より大きい場合があるという考えを包含する。ナイーブの動物および／または接種した動物を、各種の研究のうちのいずれかに用いることができる。当技術分野で公知である通り、例えば、このような動物モデルは、ウイルス伝染研究に用いることができる。ウイルス伝染研究におけるフェレットの使用が、ヒトにおけるウイルス伝染についての信頼できる予測モデルとして提供されうることが目論まれる。当技術分野で、例えば、ウイルス性インフルエンザの、接種された動物（例えば、フェレット）からナイーブ動物への空気伝染が公知である（参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｕｍｐｅｙら、２００７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１５巻；６５５〜５９頁）。ウイルス伝染研究を用いて、本発明による結合剤ポリペプチド（例えば、ＨＡポリペプチド）を調べることができる。例えば、動物宿主におけるウイルスの結合および／または感染性を遮断する前記結合剤の有効性を決定するために、本発明による結合剤を適切な動物宿主に、ウイルス伝染研究の前に投与することもでき、ウイルス伝染研究時に投与することもでき、ウイルス伝染研究の後に投与することもできる。動物宿主におけるウイルス伝染研究から集められた情報を用いて、ヒト宿主におけるウイルスの結合および／または感染性を遮断する結合剤の有効性を予測することができる。
医薬組成物
一部の実施形態では、本発明が、本発明による結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド、ＬＳＢＡ、ＵＴＢＡ、ＵＴＢＳＡなど）および／または類縁の実体を包含する医薬組成物を提供する。例えば、一部の実施形態では、本発明による医薬組成物中に、結合剤ポリペプチド（複数可）（例えば、ＨＡポリペプチド）、このようなポリペプチドをコードする核酸、このようなポリペプチドまたは核酸の特徴的な断片または生物学的に活性な断片、このようなポリペプチドまたは断片に結合し、かつ／またはこれと競合する抗体、このようなポリペプチドまたはそれらに結合するグリカンなどと相互作用するかまたはこれと競合する低分子などが包含される。
本発明は、本発明によるこのような医薬組成物の投与を介するインフルエンザ感染の処置を包含する。一部の実施形態では、本発明による医薬組成物を、インフルエンザ感染を患っているまたはインフルエンザ感染に対して感受性である被験体に投与する。一部の実施形態では、被験体におけるインフルエンザ感染を患っていると考えられる被験体が、一般にインフルエンザ感染と関連する１またはそれより多くの症状を示している。一部の実施形態では、被験体が、インフルエンザウイルスに曝露されていることが公知であるか、またはインフルエンザウイルスに曝露されていると考えられる。一部の実施形態では、被験体が、インフルエンザウイルスに曝露されていることが公知であるか、またはインフルエンザウイルスに曝露されていると考えられる場合、その被験体を、インフルエンザ感染に対して感受性であると考える。一部の実施形態では、被験体が、インフルエンザウイルスに感染していることが公知であるかもしくは疑われる他の個体と接触している場合、および／または被験体が、インフルエンザ感染が蔓延していることが公知であるかもしくは蔓延していると考えられる場所に存在しているかもしくは存在していた場合、その被験体を、インフルエンザウイルスに曝露されていることが公知であるか、またはインフルエンザウイルスに曝露されていると考える。
一部の実施形態では、インフルエンザ感染を患っているまたはインフルエンザ感染に対して感受性である被験体を、本発明による結合剤に対する抗体について、本発明による医薬組成物の投与前、投与時、または投与後に調べる。一部の実施形態では、このような抗体を有する被験体に、本発明による結合剤を含む医薬組成物を投与しない。一部の実施形態では、このような抗体の検出（またはその欠如）に基づき、適量の医薬組成物および／または結合剤を選択する。
一部の実施形態では、処置される特定の被験体の選択、投与される特定の結合剤または組成物、および／または投与される特定の用量またはレジメンを、例えば、書面形態、印字形態、または電子的保存形態で記録する。
本発明による組成物は、インフルエンザ感染の１またはそれより多くの症状の発生前に投与することもでき、発生後に投与することもできる。
本発明は、本明細書で記載される化合物の投与を介するインフルエンザ感染の処置を包含する。一部の実施形態では、本発明によるインフルエンザ感染の処置を、ワクチンの投与を介して達成する。現在のところ、インフルエンザワクチンの開発では著明な達成がなされているが、さらなる改善の余地が認められる。本発明は、本発明による結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド、ＬＳＢＡ、ＵＴＢＡ、ＵＴＢＳＡなど）を含むワクチン、特にアンブレラグリカン（例えば、長鎖α２−６シアル化グリカンなど、例えば、α２−６結合アンブレラグリカン）に結合する結合剤を含むワクチンを提供する。
一例を挙げるに過ぎないが、ヒトにおけるＨ５Ｎ１株に特異的なワクチンを生成させる試みは一般に、少なくとも部分的にはＨ５ ＨＡの免疫原性が低いために成功していない。一研究では、Ｈ５Ｎ１株を指向するワクチンが、感染からの防御を保証するのに十分な高さの力価ではない１：４０の抗体力価をもたらすことが示された。さらに、１：４０という穏当な抗体力価（９０μｇずつ２回にわたる精製ワクチンの投与により、ウイルスまたは抗原が死滅する）を発生させるのに要求される用量であっても、通常の季節性インフルエンザウイルスワクチンの場合に通常用いられる力価の１２倍であった（参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｒｅａｎｏｒら、２００６年、Ｎ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ、３５４巻：１３４３頁）。他の研究も、現行のＨ５ワクチンの免疫原性は高くないことを同様に示している（参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｒｅｓｓｏｎら、２００６年、Ｌａｎｃｅｔ、３６７巻：１６５７頁）。一部の実施形態では、本発明によるワクチンを、低用量のＨ５ ＨＡタンパク質の使用、および／または高度な免疫原性の達成を可能とすることを意図する１またはそれより多くの戦略（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｎｓｅｒｉｎｋ、２００５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０９巻：９９６頁を参照されたい）を用いて調合する。例えば、一部の実施形態では、多価性を改善し（例えば、デンドリマーの使用を介して）、一部の実施形態では、１またはそれより多くのアジュバントを用いるなどである。
一部の実施形態では、本発明が、ワクチンおよびこれらのワクチンのヒト被験体への投与を提供する。一部の実施形態では、ワクチンを、以下：（１）不活化ウイルス、（２）弱毒化されたインフルエンザ生ウイルス、例えば、複製欠損ウイルス、（３）本発明による結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド、ＬＳＢＡ、ＵＴＢＡ、ＵＴＢＳＡなど）、（４）結合剤ポリペプチド（例えば、ＨＡポリペプチド）またはその特徴的部分もしくは生物学的に活性な部分をコードする核酸、（５）本発明による結合剤ポリペプチド（例えば、ＨＡポリペプチド）またはその特徴的部分もしくは生物学的に活性な部分をコードするＤＮＡベクター、および／または（６）発現系、例えば、抗原として用いられる１またはそれより多くのインフルエンザタンパク質を発現させる細胞のうちの１またはそれより多くを含む組成物とする。
したがって、一部の実施形態では、本発明が、不活化インフルエンザウイルスワクチンを提供する。一部の実施形態では、不活化インフルエンザウイルスワクチンが、３種類の抗原調製物：不活化全粒子ウイルス、精製されたウイルス粒子を洗浄剤または他の試薬で破壊して、脂質エンベロープを可溶化させたサブビリオン（「スプリット」ワクチン）、または精製されたＨＡポリペプチド（「サブユニット」ワクチン）のうちの１つを含む。一部の実施形態では、ウイルスを、ホルムアルデヒド、ベータ−プロピオラクトン、エーテル、洗浄剤（ＴＷＥＥＮ−８０（登録商標）など）を伴うエーテル、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）およびＴｒｉｔｏｎ Ｎ１０１、デオキシコール酸ナトリウムおよびトリ（ｎ−ブチル）リン酸による処置を介して不活化させることができる。不活化は、尿膜腔液（鶏卵内で生成させたウイルスに由来する）を清明化させた後に生じさせることもでき、清明化させる前に生じさせることもでき、ビリオンは、遠心分離を介して単離および精製することができる（参照により本明細書に組み込まれる、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら編、１９９８年、「Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ」、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｌｄｅｎ、ＭＡ）。ワクチンの効力を評価するためには、一元放射免疫拡散（ＳＲＤ）検査を用いることができる（これらのいずれもが参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｃｈｉｌｄら、１９７５年、Ｂｕｌｌ． Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎ．、５２巻：４３〜５０および２２３〜３１頁；Ｍｏｓｔｏｗら、１９７５年、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２巻：５３１頁）。
本発明はまた、弱毒化されたインフルエンザ生ワクチン、および当技術分野で周知である弱毒化のための方法も提供する。一部の実施形態では、弱毒化を、部位指向性突然変異誘発などの逆遺伝学の使用を介して達成する。
一部の実施形態では、ワクチンにおいて用いられるインフルエンザウイルスを、卵内、例えば、孵化鶏卵内で増殖させるが、この場合、採取される物質は、尿膜腔液である。代替的にまたは加えて、インフルエンザウイルスは、組織培養物を用いてウイルスを増殖させる任意の方法に由来しうる。ウイルスを増殖させるのに適する細胞基質には、例えば、ＭＤＣＫ細胞またはＭＤＣＫ細胞、ＭＤＣＫ様細胞のクローンに由来する細胞などのイヌ腎臓細胞、Ｖｅｒｏ細胞を含めたＡＧＭＫ細胞などのサル腎臓細胞、連続継代細胞系として培養された上皮細胞、２９３Ｔ細胞、ＢＫ−２１細胞、ＣＶ−１細胞、または市販供給源（例えば、ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．）から容易に入手可能な、ワクチンを目的としてインフルエンザウイルスを生成させるのに適する他の任意の哺乳動物細胞型（上気道上皮細胞を含めた）が含まれる。また、適切な細胞基質は、ＭＲＣ−５細胞などのヒト細胞も包含する。適切な細胞基質は、細胞系に限定されず、例えばまた、ニワトリ胚線維芽細胞などの初代細胞も包含される。
一部の実施形態では、本発明によるワクチンが、１またはそれより多くのアジュバントをさらに含む。例えば、アルミニウム塩（参照により本明細書に組み込まれる、Ｂａｙｌｏｒら、２００２年、Ｖａｃｃｉｎｅ、２０巻：Ｓ１８頁）およびモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ；参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｉｂｉら、１９８６年、「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ」、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌ． Ｃｏｒｐ．、ＮＹ、４０７頁）は、ヒト用ワクチンにおけるアジュバントとして用いることができる。代替的にまたは加えて、ＭＦ５９（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｉｒｏｎ．ｃｏｍ／ｉｎｖｅｓｔｏｒｓ／ｐｒｅｓｓｒｅｌｅａｓｅｓ／２００５／０５１０２８．ｈｔｍｌ）、ＣＰＧ ７９０９（参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｏｏｐｅｒら、２００４年、Ｖａｃｃｉｎｅ、２２巻：３１３６頁）、およびＱＳ２１などのサポニン（参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｈｏｃｈｉｋｙａｎら、２００６年、Ｖａｃｃｉｎｅ、２４巻：２２７５頁）などの新たな化合物も、現在、ヒト用ワクチンにおけるアジュバントとして調べられている。
加えて、当技術分野では、ポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン］（ＰＣＣＰ；参照により本明細書に組み込まれる、Ｐａｙｎｅら、１９９８年、Ｖａｃｃｉｎｅ、１６巻：９２頁）、インターフェロンγ（参照により本明細書に組み込まれる、Ｃａｏら、１９９２年、Ｖａｃｃｉｎｅ、１０巻：２３８頁）、ブロックコポリマーＰ１２０５（ＣＲＬ１００５；参照により本明細書に組み込まれる、Ｋａｔｚら、２０００年、Ｖａｃｃｉｎｅ、１８巻：２１７７頁）、インターロイキン２（ＩＬ−２；参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｂｗｕｉｋｅら、１９９０年、Ｖａｃｃｉｎｅ、８巻：３４７頁）、およびメタクリル酸ポリメチル（ＰＭＭＡ；参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｒｅｕｔｅｒら、１９８１年、Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．、７０巻：３６７頁）など、一部のアジュバントがインフルエンザワクチンの免疫原性を増強することが公知である。
一部の実施形態では、本発明による組成物、例えば、結合剤の組成物がアジュバントを包含しない（例えば、提供される組成物は、アジュバントを本質的に含まない）。一部の実施形態では、本発明による組成物がアラムアジュバントを包含しない（例えば、提供される組成物がアラムを本質的に含まない）。
ワクチンに加えて、本発明は、ウイルス感染の処置に有用な他の治療用組成物も提供する。一部の実施形態では、処置を、ＨＡポリペプチドの発現または活性に干渉する薬剤の投与を介して達成する。
一部の実施形態では、本発明が、抗体または提供されるポリペプチドと類縁の他の薬剤を含む医薬組成物を提供する。例えば、本発明は、特定のＨＡポリペプチド（例えば、アンブレラグリカンに結合するＨＡポリペプチド）、核酸（ＲＮＡｉに用いうる、ＨＡ配列と相補的な核酸配列など）、ＨＡ受容体への結合について競合するグリカン、グリカン−ＨＡポリペプチド相互作用と競合する低分子もしくは糖模倣体、またはこれらの任意の組合せを含有するウイルス粒子を認識する抗体を含有する組成物を提供する。一部の実施形態では、多様な構造を有する異なる薬剤のコレクションを用いる。一部の実施形態では、治療用組成物が、１またはそれより多くの多価薬剤を含む。一部の実施形態では、処置が、曝露または曝露の疑いの直後における応急投与を含む。
一部の実施形態では、本明細書で記載されるワクチンのうちのいずれかにより、異なる多様なインフルエンザウイルスに対する広範な交差防御がもたらされる。例えば、一部の実施形態では、本明細書で記載されるワクチンにより、トリ適応型Ｈ５ウイルスおよびヒト適応型Ｈ５ウイルスの両方に対する交差防御がもたらされる。一部の実施形態では、本明細書で記載されるワクチンのうちのいずれかにより、任意のＨ５インフルエンザウイルス株またはＨ５インフルエンザウイルス変異体に対する交差防御がもたらされる。一部の実施形態では、本明細書で記載されるワクチンのうちのいずれかにより、任意のＨ２インフルエンザウイルス株またはＨ２インフルエンザウイルス変異体に対する交差防御がもたらされる。一部の実施形態では、本明細書で記載されるワクチンのうちのいずれかにより、任意のＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、またはＨ１６のインフルエンザウイルス株またはインフルエンザウイルス変異体に対する交差防御がもたらされる。
一般に、医薬組成物は、滅菌水、生理食塩液、緩衝生理食塩液、またはデキストロース液が含まれるがこれらに限定されない生体適合性の滅菌担体など、１またはそれより多くの不活性薬剤に加えて、治療剤を包含する。代替的にまたは加えて、組成物は、安定化剤、緩衝剤、賦形剤（例えば、糖、アミノ酸など）、または防腐剤などの各種の添加剤のうちのいずれかも含有しうる。
一部の実施形態では、本発明による医薬組成物中に存在する治療剤が、本明細書で記載される１またはそれより多くの結合剤からなる。一部の実施形態では、本発明による医薬組成物が、アンブレラトポロジーグリカンに結合する（および／またはアンブレラトポロジーグリカンの模倣体に結合する）結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド、ＬＳＢＡ、ＵＴＢＡ、ＵＴＳＢＡなど）を含有する。一部のこのような実施形態では、本発明による組成物が、アンブレラトポロジーグリカンに結合しない類縁の薬剤（例えば、他のＨＡポリペプチドなど）を実質的に含まない。一部のこのような実施形態では、本発明による医薬組成物が、アンブレラトポロジーグリカン以外のＨＡ受容体グリカンに結合する薬剤のうちの５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、または１％以下を含有する。
一部の実施形態では、医薬組成物が、脂質小胞、バイオアベイラビリティーを有しかつ／もしくは生体適合性でありかつ／もしくは生体分解性であるマトリックス、または他の微粒子内に封入され、閉じ込められ、または結合した治療剤を包含する。
一部の実施形態では、提供される医薬組成物が、凝集していない結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド、ＬＳＢＡ、ＵＴＢＡ、ＵＴＳＢＡなど）を包含する。例えば、一部の実施形態では、結合剤のうちで凝集物中に存在する結合剤が、乾燥重量または数で１％、２％、５％、１０％、２０％、または３０％未満である。
一部の実施形態では、提供される医薬組成物が、変性していない結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド、ＬＳＢＡ、ＵＴＢＡ、ＵＴＳＢＡなど）を包含する。例えば、一部の実施形態では、投与されるＵＴＳＢＡのうちで変性しているＵＴＳＢＡが、乾燥重量または数で１％、２％、５％、１０％、２０％、または３０％未満である。
一部の実施形態では、提供される医薬組成物が、不活性でない結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド、ＬＳＢＡ、ＵＴＢＡ、ＵＴＳＢＡなど）を包含する。例えば、一部の実施形態では、投与されるＵＴＳＢＡのうちで不活性なＵＴＳＢＡが、乾燥重量または数で１％、２％、５％、１０％、２０％、または３０％未満である。
一部の実施形態では、本発明による医薬組成物を、提供される結合剤の免疫原性を低減するように調合する。例えば、一部の実施形態では、提供される結合剤が、その免疫原性を遮蔽するポリエチレングリコールおよび／またはカルボキシメチルセルロースなどの薬剤と会合する（例えば、これに結合する）。一部の実施形態では、提供される結合剤が、免疫原性を低減するさらなるグリコシル化を有する。
本発明の医薬組成物は、単独で投与することもでき、ワクチンおよび／または抗体が含まれるがこれらに限定されない１またはそれより多くの他の治療剤と組み合わせて投与することもできる。「〜と組み合わせて」とは、薬剤を、同時に投与するかまたは送達のために併せて調合しなければならないことを含意することを意図しないが、これらの送達法は、本発明の範囲にある。一般に、各薬剤は、その薬剤について決定される用量および時間スケジュールで投与する。加えて、本発明は、それらのバイオアベイラビリティーを改善する場合もあり、それらの代謝を低減または修飾する場合もあり、それらの分泌を阻害する場合もあり、それらの体内における分布を修飾する場合もある薬剤と組み合わせた、本発明による医薬組成物の送達を包含する。本発明の医薬組成物は、それを必要とする任意の被験体（例えば、任意の動物）の処置に用いうるが、それらは、ヒトの処置において用いることが最も好ましい。一部の実施形態では、本発明による医薬組成物および／または結合剤を、抗ウイルス剤（例えば、オセルタミビル［ＴＡＭＩＦＬＵ（登録商標）］、ザナマビル［ＲＥＬＥＺＡ（登録商標）］など）および／またはシアリダーゼのうちの１またはそれより多くと組み合わせて投与する。
本発明の医薬組成物は、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、動脈内経路、皮下経路、脳室内経路、経皮経路、皮内経路、直腸内経路、膣内経路、腹腔内経路、局所経路（粉末、軟膏、クリーム、または液滴を介するなど）、経粘膜経路、鼻腔内経路、口腔内経路、腸内経路、舌下経路を含めた各種の経路を介して投与することもでき、気管内点滴、気管支内点滴、および／もしくは吸入を介して投与することもでき、かつ／または経口スプレー、鼻腔内スプレー、および／もしくはエアロゾルとして投与することもできる。一般に最も適切な投与経路は、薬剤の性質（例えば、消化管環境におけるその安定性）、患者の状態（例えば、患者が経口投与を認容しうるかどうか）などを含めた各種の因子に依存する。
現在のところ、経口経路または鼻腔内スプレー経路またはエアロゾル経路（例えば、吸入を介する経路）が、治療剤を肺および呼吸系へと直接送達するのに最も一般に用いられている。しかし、本発明は、薬物送達科学において起こりうる進歩を考慮して、任意の適切な経路を介する本発明による医薬組成物の送達を包含する。
一部の実施形態では、吸入送達またはエアロゾル送達のための調製物が、複数の粒子を含む。一部の実施形態では、このような調製物の平均粒子サイズが、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、または約１３ミクロンである。一部の実施形態では、吸入送達またはエアロゾル送達のための調製物を、乾燥粉末として調合する。一部の実施形態では、吸入送達またはエアロゾル送達のための調製物を、例えば、保湿剤の組入れを介して、湿潤粉末として調合する。一部の実施形態では、保湿剤を、水、生理食塩液、または生理学的ｐＨの他の液体からなる群から選択する。
一部の実施形態では、本発明による組成物を、鼻腔または口腔への液滴として投与する。一部の実施形態では、用量が、複数の液滴（例えば、１〜１００滴、１〜５０滴、１〜２０滴、１〜１０滴、１〜５滴など）を含みうる。
一部の実施形態では、本発明による組成物を、計量された用量の組成物（例えば、結合剤の組成物）を送達するデバイスを用いて投与する。
本明細書で記載される医薬組成物を皮内送達するときに用いるのに適するデバイスには、米国特許第４，８８６，４９９号、米国特許第５，１９０，５２１号、米国特許第５，３２８，４８３号、米国特許第５，５２７，２８８号、米国特許第４，２７０，５３７号、米国特許第５，０１５，２３５号、米国特許第５，１４１，４９６号、米国特許第５，４１７，６６２号（これらの全てが参照により本明細書に組み込まれる）において記載されるデバイスなどの短い注射針デバイスが含まれる。皮内組成物はまた、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ９９／３４８５０において記載されるデバイスおよびこれらの機能的同等物など、注射針の皮膚への有効穿通長を限定するデバイスを介して投与することもできる。また、液体のワクチンを、液体用ジェット注射器を介して、または角質層を穿刺する注射針を介して、真皮へと送達し、真皮に到達するジェットを生成させる、ジェット注射デバイスも適切である。例えば、ジェット注射デバイスは、米国特許第５，４８０，３８１号、米国特許第５，５９９，３０２号、米国特許第５，３３４，１４４号、米国特許第５，９９３，４１２号、米国特許第５，６４９，９１２号、米国特許第５，５６９，１８９号、米国特許第５，７０４，９１１号、米国特許第５，３８３，８５１号、米国特許第５，８９３，３９７号、米国特許第５，４６６，２２０号、米国特許第５，３３９，１６３号、米国特許第５，３１２，３３５号、米国特許第５，５０３，６２７号、米国特許第５，０６４，４１３号、米国特許第５，５２０，６３９号、米国特許第４，５９６，５５６号、米国特許第４，７９０，８２４号、米国特許第４，９４１，８８０号、米国特許第４，９４０，４６０号、ＷＯ９７／３７７０５、およびＷＯ９７／１３５３７（これらの全てが参照により本明細書に組み込まれる）において記載されている。また、圧縮ガスを用いて、粉末形態のワクチンを、皮膚の外層を介して真皮へと加速化させる粉末／粒子送達用バリスティックデバイスも適切である。加えて、従来のシリンジを、皮内投与の古典的なＭａｎｔｏｕｘ法において用いることもできる。
医薬の調合および製造における一般的な検討項目は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、１９版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９５年において見出すことができる。
本発明による医薬組成物は、所望の結果を達成するのに適する任意の用量で投与することができる。一部の実施形態では、所望の結果を、インフルエンザ感染の１またはそれより多くの症状の強度、重症度、および／もしくは頻度の低減、ならびに／またはこれらの発症の遅延とする。
一部の実施形態では、本発明による医薬組成物を、アンブレラトポロジーグリカンへの結合についてインフルエンザＨＡと競合するのに有効な用量の結合剤を投与するように調合する。一部の実施形態では、インフルエンザＨＡによるこのような結合が、１回または複数回にわたる本発明による組成物の投与後に、このような投与の不在におけるそのレベルと比較して低減される。一部の実施形態では、本発明による医薬組成物を、組成物を施される被験体に（例えば、被験体の気道に）存在するＨＡ結合部位（例えば、アンブレラトポロジーグリカンを含有するＨＡ結合部位）のうちの少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％以上を飽和させるのに有効な用量の結合剤を投与するように調合する。
一部の実施形態では、本発明による医薬組成物を、０．０００１〜１０００ｍｇ／ｋｇの範囲内にある単位用量の結合剤を送達するように調合する。
一部の実施形態では、本発明による医薬組成物を、複数回にわたり投与する。一部の実施形態では、本発明による医薬組成物を、複数回／日にわたり投与する。一部の実施形態では、被験体が、治療的投与期間の間に挿入される治療的投与未満の投与期間を経ないように、本発明による医薬組成物を、連続投与レジメンに従い投与する。一部の実施形態では、被験体が、２つの治療的投与期間の間に挿入される少なくとも１つの治療的投与未満の投与期間を経るように、本発明による医薬組成物を、間欠投与レジメンに従い投与する。
診断剤／キット
本発明は、血液、血清／血漿、末梢血単核細胞／末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ／ＰＢＬ）、痰、尿、糞便、咽頭スワブ、皮膚病変スワブ、脳脊髄液、頸管スミア、膿試料、食物マトリックス、ならびに脳、脾臓、および肝臓など、体内の多様な部分に由来する組織が含まれるがこれらに限定されない病理学的試料中に、結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド、ＬＳＢＡ、ＵＴＢＡ、ＵＴＳＢＡなど）を検出するため、および特に特定のグリカン結合特徴（例えば、アンブレラグリカン、α２−６シアル化グリカン、長鎖α２−６シアル化グリカンなどへの結合特徴）を伴う結合剤を検出するためのキットを提供する。本発明はまた、土壌、水、および微生物叢が含まれるがこれらに限定されない環境試料中に被験体の結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド、ＬＳＢＡ、ＵＴＢＡ、ＵＴＳＢＡなど）を検出するためのキットも提供する。また、列挙されていない他の試料も適用可能でありうる。
一部の実施形態では、本発明が、このようなポリペプチドを結合剤とする場合であれそうでない場合であれ、本明細書で記載されるＨＡポリペプチドを検出するためのキットを提供する。
一部の実施形態では、本発明によるキットが、特定のグリカン結合特徴を伴う結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド、ＬＳＢＡ、ＵＴＢＡ、ＵＴＳＢＡなど）を特異的に検出する１またはそれより多くの薬剤を包含しうる。このような検出剤は、例えば、特定の結合剤（例えば、アンブレラグリカン、および／またはα２−６シアル化グリカン、および／または長鎖α２−６シアル化グリカンに結合する結合剤）を特異的に認識する抗体を包含することが可能であり、これらは、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光法、および／または免疫ブロット法を介してこのような結合剤を特異的に検出するのに用いることができる。
ＨＡポリペプチドに結合する抗体はまた、試料を対象のＨＡポリペプチドに対して特異的な抗体で処理し、その試料が培養された細胞に感染する能力を、処理されていない試料と比べて調べる、ウイルス中和試験においても用いることができる。その試料中のウイルスがこのようなＨＡポリペプチドを含有する場合、抗体はウイルスを中和し、ウイルスが培養された細胞に感染することを防止する。代替的にまたは加えて、このような抗体はまた、ＨＡタンパク質を所与の試料から単離し、特定のＨＡポリペプチドまたはＨＡポリペプチドのセットに対して特異的な抗体で処置し、その試料が赤血球を凝集させる能力を、処理されていない試料と比べて調べる、ＨＡ阻害試験においても用いることができる。試料中のウイルスがこのようなＨＡポリペプチドを含有する場合、抗体はＨＡポリペプチドの活性を中和し、ＨＡポリペプチドが赤血球を凝集させることを防止する（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８年、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ； ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｃｓｒ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｉｎｆｌｕｅｎｚａ／ＷＨＯ＿ＣＤＳ＿ＣＳＲ＿ＮＣＳ＿２００２＿５／ｅｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ； ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｃｓｒ／ｄｉｓｅａｓｅ／ａｖｉａｎ＿ｉｎｆｌｕｅｎｚａ／ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ／ｌａｂｔｅｓｔｓ／ｅｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。一部の実施形態では、このような薬剤が、特定のＨＡポリペプチドをコードするヌクレオチドに特異的に結合する核酸を包含することが可能であり、これらは、ＲＴ−ＰＣＲまたはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを介してこのようなＨＡポリペプチドを特異的に検出するのに用いることができる（ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｃｓｒ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｉｎｆｌｕｅｎｚａ／ＷＨＯ＿ＣＤＳ＿ＣＳＲ＿ＮＣＳ＿２００２＿５／ｅｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ； ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｃｓｒ／ｄｉｓｅａｓｅ／ａｖｉａｎ＿ｉｎｆｌｕｅｎｚａ／ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ／ｌａｂｔｅｓｔｓ／ｅｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。一部の実施形態では、試料から単離された核酸を、検出前に増幅する。一部の実施形態では、診断用試薬を、検出可能に標識することができる。
本発明はまた、インフルエンザウイルスおよびワクチンを生成させるための本発明による試薬を含有するキットも提供する。キットの内容物には、対象のＨＡポリペプチド（または特徴的部分もしくは生物学的に活性な部分）をコードするＨＡヌクレオチド（または特徴的部分もしくは生物学的に活性な部分）を含有する発現プラスミドが含まれるがこれらに限定されない。代替的にまたは加えて、キットは、対象のＨＡポリペプチド（または特徴的部分もしくは生物学的に活性な部分）を発現させる発現プラスミドも含有しうる。また、使用者が任意の対象のインフルエンザウイルスに由来するＨＡヌクレオチドを組み込むことが可能であるように、ウイルス遺伝子を含有しない発現プラスミドも包含されうる。また、Ｖｅｒｏ細胞系およびＭＤＣＫ細胞系が含まれるがこれらに限定されない哺乳動物細胞系も、キットと共に包含されうる。一部の実施形態では、診断用試薬を、検出可能に標識することができる。
一部の実施形態では、本発明により用いられるキットが、基準試料、試料を処理するための指示書、試験の実施、結果を解釈するための指示書、緩衝液、および／または試験を実施するのに必要な他の試薬を包含しうる。一部の実施形態では、キットが、抗体パネルを含みうる。
本発明の一部の実施形態では、上記で論じたグリカンアレイを、診断剤および／またはキットとして用いることができる。
一部の実施形態では、本発明によるグリカンアレイおよび／またはキットを用いて、ＨＡポリペプチドのアンブレラグリカンへの結合を複数の用量（例えば、本明細書で記載される）で評価する用量反応関係研究を実施する。このような研究は、特に、被験ＨＡポリペプチドの結合特徴に対する貴重な洞察をもたらし、特に、特定の結合を評価するのに有用である。この種の結合についての用量反応関係の研究は、有用に適用されることが多い。一例を挙げるに過ぎないが、それらは、その連鎖が天然の進化を介して発生したものであれ、意図的な操作を介して発生したものであれ、これらの２つの組合せを介して発生したものであれ、類縁のＨＡポリペプチド変異体の連鎖における結合特徴の進化を追跡する一助となりうる。
一部の実施形態では、本発明によるグリカンアレイおよび／またはキットを用いて、所望の結合特徴を有する結合剤（例えば、ＨＡポリペプチドおよび／またはＨＡポリペプチドの変異体）を誘導、同定、および／または選択する。例えば、一部の実施形態では、本発明によるグリカンアレイおよび／またはキットを用いて、ポリペプチド結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド）の集団に対して進化（例えば、スクリーニングおよび／または選択）圧力を及ぼす。
本発明は、本発明による医薬組成物を投与するためのキットを提供する。例えば、一部の実施形態では、本発明が、少なくとも１回分の用量の結合剤を含むキットを提供する。一部の実施形態では、本発明が、初回の単位用量および後続の単位用量の結合剤を含むキットを提供する。一部のこのような実施形態では、初回の単位用量が後続の単位用量より大きいか、または２つの用量は同等である。
一部の実施形態では、本発明によるキット（特に、本発明による医薬組成物を投与するためのキット）が、送達デバイス、例えば、吸入器の少なくとも１つの構成要素を含む。一部のこのような実施形態では、本発明が、送達デバイスの少なくとも１つの構成要素、例えば、吸入器およびある用量の結合剤を含むキットを提供する。
一部の実施形態では、提供されるキットが、使用のための指示書を含む。
（実施例１）
広範なスペクトルにわたるヒト結合型ＨＡポリペプチドの分子的決定因子の同定
序説
Ｈ５Ｎ１トリインフルエンザウイルス（「鳥類インフルエンザ」または「トリインフルエンザ」）とは、感染性および致死性が高い病原体である。１９９６年以来、３つの大陸にわたり複数のＨ５Ｎ１の大発生が起こり、数百万羽の家禽を死滅させている。その出現以来、このウイルスはまた、ヒトに感染する潜在的可能性も示しており、死亡率は６０％を超えている。ヒトは事実上、Ｈ５Ｎ１ウイルスに対する免疫を有さないが、このウイルスはいまだ、ヒトの間で効率的に感染および伝染することが可能となるようにヒト宿主に適応してはいない。このウイルスは、ヒト集団内に足場を得ることを可能とする突然変異を獲得するであろう。
Ａ型インフルエンザウイルスの表面糖タンパク質である血球凝集素（ＨＡ）は、ウイルスの宿主細胞への侵入を誘発する一因となる。ＨＡは、シアル化グリカン受容体（α２→３結合型シアル酸またはα２→６結合型シアル酸を末端とするグリカン複合体）に結合する。Ｈ５Ｎ１ ＨＡは、α２→３結合型シアル酸を末端とするグリカン受容体に優先的に結合する。本発明者らは、ヒト宿主におけるヒト適応型Ａ型インフルエンザウイルスに対するグリカン受容体が、ＨＡのグリカン受容体結合部位（ＲＢＳ）において特徴的なアンブレラ様トポロジーを取るα２→６シアル化グリカン（以下では、ヒト受容体と称する）であることを裏付けた（参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋｈａｒａｎら、２００８年、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ、２６巻：１０７頁）。本発明者らはまた、高親和性によるこれらのヒトグリカン受容体への結合が、ヒト適応型ＨＡの特徴であり、ヒト適応型のＨ１Ｎ１ウイルスおよびＨ３Ｎ２ウイルスの効率的な空気伝染性と相関することも示した（これらのいずれもが参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋｈａｒａｎら、２００８年、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ、２６巻：１０７頁；Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎら、２００８年、ＰＮＡＳ、１０５巻：２８００頁）。本研究において、本発明者らは、Ｈ５Ｎ１ウイルスであって、このウイルスが高親和性でヒト受容体に結合することを可能とするＲＢＳにおける配列置換をＨＡが有するＨ５Ｎ１ウイルスを提示した。
実験デザイン
インフルエンザＨＡは、単量体が５５２アミノ酸を含有するホモ三量体のタンパク質である。単量体の各々は、２つのジスルフィド結合した部分である、ＨＡ１およびＨＡ２からなる。ＨＡ１がグリカン受容体結合部位（ＲＢＳ）を含むのに対し、ＨＡ２はウイルスと細胞膜との融合に関与している。ＲＢＳポケットは、ＨＡの９５、１３１、１３３、１３６、１３７、１３８、１４５、１５３、１５５、１５６、１５８、１５９、１８３、１８６、１８７、１８９、１９０、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、２１９、２２２、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８位（Ｈ３の番号付けを用いる）を伴う。
本発明者らは、Ｈ５Ｎ１と代表的なヒト受容体との間の分子的接触を詳細に解析し、これらの接触を、ヒト適応型流行性のＨ１Ｎ１ ＨＡ、Ｈ２Ｎ２ ＨＡ、およびＨ３Ｎ２ ＨＡとヒト受容体との間の接触と比較した。この手法を介して、本発明者らは、Ｈ５Ｎ１ ＨＡの突然変異体形態を発生させるための戦略を規定した。突然変異Ｑ２２６ＬおよびＧ２２８Ｓ（またはＬＳ突然変異）を、Ｈ５Ｎ１ ＨＡの複数の遺伝的クレードにわたり導入した。これらの突然変異は、それらのヒトへの適応をもたらした、それぞれ、Ｈ２Ｎ２ ＨＡおよびＨ３Ｎ２ ＨＡの２２６位および２２８位における特徴的なアミノ酸置換に基づく。
これらの突然変異は、Ｈ５Ｎ１ ＨＡの異なる遺伝的クレードのＲＢＳの文脈で導入した（図１３）。先行研究（例えば、これらのいずれもが参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｔｅｖｅｎｓら、２００８年、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、３８１巻：１３８２〜９４頁；およびＳｔｅｖｅｎｓら、２００６年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１２巻：４０４頁）では、グリカンアレイプラットフォームの異なるＨ５Ｎ１株においてＬＳ突然変異を含む組換えＨＡおよび全ウイルスのいずれもが解析されており、これらの株の一部が、α２→６シアル化グリカンへの結合を獲得したことが示されている（図１４）。しかし、これらの研究の目標は、高タンパク質濃度または高ウイルス力価における結合についてスクリーニングし、どのくらい多くのα２→３グリカンまたはα２→６グリカンが結合シグナルを示すのかを決定することであった。
これに対し、本発明者らは、複数のＨ５Ｎ１株に由来するＲＢＳ中にＬＳ突然変異を保有する組換えＨＡについての用量依存的な解析を実施した（図１５）。本データは、これらの突然変異体のうちのいずれもが、ヒト適応型ＨＡにより共有されている、ヒト受容体への特徴的な高結合親和性を示さなかったことを裏付ける。本結果はまた、ＲＢＳ中にＬＳ突然変異だけを保有するＨ５Ｎ１ウイルスの非効率的な伝染とも相関した。しかし、これらの突然変異体のうちのいずれもが高親和性によるヒト受容体への結合を示さなかった。したがって、Ｈ５Ｎ１ ＨＡの突然変異体形態を規定するには、さらなる戦略が必要とされた。
グリコシル化を失効化させる突然変異
したがって、そのＲＢＳを、より近年の遺伝的クレード（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５などの株を包含する）のＲＢＳと類似させるために、本発明者らは、１２８、１３３、１４５、１５９、１９３（以下の太字および下線を付した残基）における５カ所のアミノ酸置換を、Ｖｉｅｔ＿１２０３＿０４＿ｃ１（クレード１株であるＡ／Ｖｉｅｔ Ｎａｍ／１２０３／０４）ＨＡへと導入した。
本発明者らは、アミノ酸位置Ｎ１５８におけるグリコシル化であれば、Ｈ５Ｎ１ ＨＡのＲＢＳにおけるヒト受容体のアンブレラ様トポロジーに干渉しうることを認識した。したがって、本発明者らの最初の戦略は、Ｑ２２８Ｌ置換および／またはＧ２２８Ｓ置換、ならびにＮ１５８におけるグリコシル化を失効化させる、さらなるＴ１６０Ａ突然変異を含有するＨ５Ｎ１ ＨＡの突然変異体形態を発生させることを伴った。
このグリコシル化部位は、全ての遺伝的クレードにわたって保存的であるわけではない。Ｎ１５８にグリコシル化が存在しないことにより、ヒト受容体の、ＬＳ突然変異を伴うＨ５Ｎ１ ＨＡへの結合が改善される場合は、天然でこのグリコシル化部位を欠く遺伝的クレード（ｃ２．２、ｃ２．２．１など；図１３を参照されたい）に属するウイルスのヒトへの適応を達成するのに、ＬＳ突然変異だけで十分でありうるであろう。これらのクレードの鋳型配列を、Ｅｇｙｐｔ＿２８７６−Ｎ３＿０６＿ｃ２．２（クレード２．２に属するＡ／Ｅｇｙｐｔ／２７８６−Ｎ３／０６）として選択した。本発明者らはまた、ヒト受容体への結合親和性の改善度を点検するために、Ｈ２ ＨＡではＱ２２６Ｌ突然変異が親和性を実質的に改善するのに十分であることを踏まえ、Ｑ２２６Ｌ突然変異だけを保有する突然変異体形態（１５８位における脱グリコシル化の文脈で）も規定した。
上記の突然変異体についての用量依存的な解析（図１６）は、ＬＳ突然変異の文脈でＴｈｒ−１６０をＡｌａへと突然変異させることを介してＡｓｎ−１５８におけるグリコシル化を除去することにより、ヒト受容体への結合が実質的に改善されることを示した。これは、Ｖｉｅｔ１２０３＿０４＿ＤにおけるＴ１６０Ａ／Ｑ２２６Ｌ／Ｇ２２８Ｓ突然変異体、ならびにＥｇｙｐｔ＿２８７６−Ｎ３＿０６＿ｃ２．２ ＨＡにおけるＬＳ突然変異のいずれについても観察された。本発明者らはさらに、Ｑ２２６Ｌ突然変異だけ（Ｇ２２８Ｓを伴わない）では、Ｎ１５８においてグリコシル化を除去する文脈で高度なヒト受容体への結合親和性をもたらすのに十分でないことも裏付けた。しかし、本発明は、Ｑ２２６（例えば、Ｑ２２６Ｌ）における突然変異だけでも、一部の特定のウイルス株の文脈にあるＮ１５８におけるグリコシル化を除去する文脈で高度なヒト受容体への結合親和性をもたらすのに十分でありうることの認識を包含する。本発明はまた、Ｇ２２８（例えば、Ｇ２２８Ｓ）における突然変異だけでも、一部の特定のウイルス株の文脈にあるＮ１５８におけるグリコシル化を除去する文脈で高度なヒト受容体への結合親和性をもたらすのに十分でありうることの認識も包含する。本発明はまた、Ｑ２２６およびＧ２２８の両方における突然変異（例えば、Ｑ２２６ＬおよびＧ２２８Ｓ）が、一部の特定のウイルス株の文脈にあるＮ１５８におけるグリコシル化を除去する文脈で高度なヒト受容体への結合親和性をもたらすのに要求されうることの認識も包含する。
加えて、本発明者らはまた、上記の突然変異体のトリ受容体への（特に、３’ＳＬＮ−ＬＮ−ＬＮおよび３’ＳＬＮ−ＬＮへの）結合が極めて高度であり、ヒト適応型ＨＡには典型的でないことも発見した。例えば、ヒト受容体への結合およびトリ受容体への結合の両方を示す原型的な流行性Ｈ２Ｎ２ ＨＡ（Ａ／Ａｌｂａｎｙ／６／５８）の場合であっても、ヒト受容体への結合親和性は、トリ受容体への結合親和性より何桁も高度であった。
ループ領域におけるアミノ酸欠失
本発明者らは、Ｈ５Ｎ１ ＨＡの突然変異体形態を、そのＲＢＳとヒト受容体との間の分子的な接触が、ヒト適応型Ｈ２Ｎ２ ＨＡとヒト受容体との間の接触を緊密に模倣するように、デザインした。Ｈ２Ｎ２ ＨＡのＲＢＳの分子組成、およびそれがいかにしてグリカン受容体の特異性を統御するのかについて理解しようとする本発明者らのかつての研究に基づき、本発明者らは、まず、Ｈ５Ｎ１ ＨＡのＲＢＳの、１９５７年〜５８年型の流行株（Ａ／Ａｌｂａｎｙ／６／／５８またはＡｌｂ６＿５８）に由来する原型的なヒト適応型Ｈ２Ｎ２ ＨＡのＲＢＳとの詳細な分子的比較を実施した（図１７）。Ｈ５ ＨＡとＡｌｂ６＿５８ ＨＡとの間のＲＢＳの分子組成の差違を最小化するために、本発明者らは、Ｖｉｅｔ１２０３＿０４＿Ｄ鋳型（「Ｖｉｅｔ１２０３＿０４＿Ｄ＿Ｈ２ＲＢＳ」；配列番号６１）において、１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、および２２８位における１３カ所のアミノ酸置換、ならびに１３０位における欠失を含む突然変異体を発生させた。Ｈ２ ＨＡとＨ５ ＨＡとの間の包括的な比較に基づき、欠失および置換の組合せを表す、Ｈ５Ｎ１ ＨＡのＲＢＳにおける突然変異のデザインおよび試験に焦点を絞るのは、本研究が全く初めてである。欠失は、１３０位において行った。Ｈ２Ｎ２ ＨＡは、１５８位におけるグリコシル化は欠くが、突然変異体ＨＡにおけるＮ１５８のグリコシル化部位（Ｖｉｅｔ１２０３＿０４＿Ｄのグリコシル化部位）は保持した。したがって、本発明は、前述の突然変異に、１５８位におけるグリコシル化を失効化させる突然変異が加われば、ヒトへの結合がなおさらに増強されうることの認識を包含する。本発明者らはまた、保存的置換に基づくより少数の突然変異により、この突然変異体の別の変化形（「Ｖｉｅｔ１２０３＿０４＿Ｄ＿Ｈ２ＲＢＳｍｉｎ」；配列番号６３）もデザインした。
本発明者らはまた、ＲＢＳの分子組成に関して、天然でＡｌｂ６＿５８のＨ２Ｎ２ ＨＡと近縁でありうる他のＨ５Ｎ１株に由来するＨＡ配列も探索した。本発明者らは、例示的な鋳型の２つのセット：（１）１９２位および１９３位の電荷特性のスイッチを伴う鋳型のセット（Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｖｉｅｔｎａｍ／ＮＣＶＤ−０９３／２００８またはｃｋＶｉｅｔ＿０８）、および（２）１３０ループにおける欠失を伴う鋳型のセット（Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｅｇｙｐｔ／Ｒ２／２００７またはｃｋＥｇｙ＿０７）を同定した。これらの新たなＨ５Ｎ１ ＨＡ鋳型の上述の位置においてより少数の突然変異を伴うさらなる突然変異体形態をデザインして、Ｈ５Ｎ１ ＨＡのＲＢＳに、ヒト適応型Ｈ２Ｎ２ ＨＡのＲＢＳを模倣させた。
用量依存的なグリカンアレイを用いて、突然変異体のヒト受容体への結合親和性を調べた。Ｖｉｅｔ１２０３＿０４＿Ｄ＿Ｈ２ＲＢＳの突然変異体により、ヒト適応型Ｈ１Ｎ１ ＨＡおよびヒト適応型Ｈ２Ｎ２ ＨＡの特徴である高度に特異的な高親和性によるヒト受容体への結合が示された（図１９）。本発明は、さらなる突然変異をデザインして、（１）１３０ループの組成および欠失、（２）１９２位および１９３位における荷電残基のスイッチ、（３）１５８位におけるグリコシル化の関係、ならびにこの関係がいかにして突然変異体のＨ５Ｎ１ ＨＡのヒト受容体への結合親和性を統御するのかを理解しうることの認識を包含する。
用いられるＨ５Ｎ１鋳型ならびに上記の原理および実施例２に示される原理に従いデザインされる例示的な突然変異体ポリペプチドの例示的な配列
例示的なＨ５Ｎ１鋳型ならびに上記の原理および実施例２に示される原理に従いデザインされる例示的な突然変異体Ｈ５ ＨＡポリペプチドのアライメントを、図１８および以下に提示する。
Ｖｉｅｔ１２０３＿０４＿Ｄ：太字の残基、下線を付した残基は、置換部位を示す。
以下の配列において、斜字体および強調は、突然変異を生じさせる領域を示し、太字体および下線は、突然変異した残基を示す。
Ｖｉｅｔ１２０３＿０４＿Ｄ＿Ｈ２ＲＢＳ：
Ｖｉｅｔ１２０３＿０４＿Ｄ＿Ｈ２ＲＢＳ＿Ｎ１５８ｄｅｇｌｙｃ
Ｖｉｅｔ１２０３＿０４＿Ｄ＿Ｈ２ＲＢＳｍｉｎ）：欠失＋７カ所の突然変異
Ｖｉｅｔ１２０３＿０４＿Ｄ（Ｔ１６０Ａ／Ｑ２２６Ｌ／Ｇ２２８Ｓ）突然変異体：
Ｅｇｙｐｔ＿２８７６−Ｎ３＿０６＿ｃ２．２：１５８位におけるグリコシル化の欠如は大型のフォントで示す。
ＬＳ突然変異を伴うＥｇｙｐｔ＿２８７６−Ｎ３＿０６＿ｃ２．２ＨＡ：１５８位におけるグリコシル化の欠如は大型のフォントで示す。
単一のＱ２２６Ｌ突然変異を伴うＥｇｙｐｔ＿２８７６−Ｎ３＿０６＿ｃ２．２ＨＡ：１５８位におけるグリコシル化の欠如は大型のフォントで示す。
Ｔ１６０Ａ／Ｑ２２６Ｌの二重突然変異を伴うＶｉｅｔ１２０３＿０４＿Ｄ：
ｃｋＶｉｅｔ＿０８：Ｈ２Ｎ２において観察されるＬｙｓ１９２およびＭｅｔ１９３の電荷の組合せ（大型のフォントで示す）を既に保有するＷＴ ＨＡ
ｃｋＶｉｅｔ＿０８＿Ｈ２ＲＢＳ：欠失＋６カ所の突然変異
ｃｋＶｉｅｔ＿０８＿Ｈ２ＲＢＳ：欠失＋５カ所の突然変異
ｃｋＶｉｅｔ＿０８＿Ｈ２ＲＢＳｍｉｎ：欠失＋４カ所の突然変異
ｃｋＥｇｙ＿０７：１３０ループにおける欠失を既に保有する
ｃｋＥｇｙ＿０７＿ＬＳ：ｃｋＥｇｙ＿０７におけるＬＳ突然変異
ｃｋＥｇｙ＿０７＿Ｈ２ＲＢＳ：８カ所の突然変異
考察
複数の実験的研究が、Ｈ５ ＨＡのヒト受容体特異性の決定因子を同定することを試みている。しかし、これらの研究は、近傍の位置の影響を考慮せずに、ＲＢＳ部位におけるアミノ酸の置換に直接焦点を当てている。さらに、宿主特異性の可能な決定因子としての挿入または欠失について考慮した先行研究さえ見られない。構造ベースの探索はまた、主に、欠失の構造的効果を、コンピュータによる解析を用いて正確に評価することができないため、Ｈ５ ＨＡの重要な決定因子を同定することにも満たない。これに対し、新規の特性を伴うタンパク質を操作することの重要性を認識し、これに配列アライメント法を用いたのは、本発明者らが初めてである。本発明は、近年においてヒトに感染する潜在的可能性を示してきた他のＨＡ亜型（Ｈ７、Ｈ９など）の宿主特異性の決定因子を同定するのに同様の手法を用いうることの認識を包含する。
材料および方法
野生型のＨＡポリペプチドの異なるトポロジーのグリカンへの直接的結合の用量反応関係
直接的結合アッセイは、規定されるグリカン構造（例えば、一価構造または多価構造）が、ポリマー骨格を用いることが多い支持体（例えば、スライドガラスまたはウェルプレート）上に提示されるグリカンアレイを典型的に用いる。いわゆる「シーケンシャル」アッセイでは、三量体のＨＡポリペプチドを、アレイに結合させ、次いで、例えば、標識した（例えば、ＦＩＴＣまたは西洋ワサビペルオキシダーゼで）一次抗体および二次抗体を用いて検出する。「多価」アッセイでは、三量体のＨＡを、まず、あらかじめ複合体化させたＨＡ１つ当たり１２ずつのグリカン結合部位が存在するように、一次抗体および二次抗体と複合体化させ（典型的には、ＨＡ：一次抗体：二次抗体の比を４：２：１として）、次いで、アレイと接触させる。アレイにおける異なるグリカンについての相対的親和性について情報が得られるように、結合アッセイは、典型的に、あるＨＡ濃度の範囲にわたり実施する。
例えば、直接的結合研究は、３’ＳＬＮ、６’ＳＬＮ、３’ＳＬＮ−ＬＮ、６’ＳＬＮ−ＬＮ、および３’ＳＬＮ−ＬＮ−ＬＮ（ＬＮは、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃを表し、３’は、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３を表し、６’は、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６を表す）などの異なるグリカンを有するアレイにより実施した。とりわけ、ビオチニル化グリカン（１２０ピコモル／ｍｌのビオチニル化グリカン５０μｌ）を、ＰＢＳであらかじめ３回にわたりすすいだ、ストレプトアビジンでコーティングした高結合能の３８４ウェルプレートと共に、一晩にわたり（ＰＢＳ中、４℃で）インキュベートした。次いで、プレートを、ＰＢＳで３回にわたり洗浄して過剰なグリカンを除去し、さらなる処理なしに用いた。
適量のＨｉｓタグづけしたＨＡタンパク質、一次抗体（マウス抗６×Ｈｉｓタグ抗体）、および二次抗体（ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ）を、ＨＡ：一次抗体：二次抗体の比を４：２：１として、氷上で１５分間にわたりインキュベートした。次いで、混合物（すなわち、あらかじめ複合体化させたＨＡ）を、ＰＢＳ中に１％のＢＳＡを伴う２５０μｌの最終容量へと構成した。次いで、５０μｌのあらかじめ複合体化させたＨＡを、３８４ウェルプレート内のグリカンでコーティングしたウェルへと添加し、室温で２時間にわたりインキュベートした。その後、ウェルを、０．０５％のＴＷＥＥＮ−２０を含有するＰＢＳで３回にわたり洗浄し、次いで、ＰＢＳで３回にわたり洗浄した。製造元による指示書に従い、Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）を用いて、ＨＲＰ活性を推定した。ＨＡプレ複合体の系列希釈液について研究した。適切な陰性対照（非シアル化グリカン）およびバックグラウンド対照（グリカンなしまたはＨＡなし）を包含し、全てのアッセイを３連で実施した。
（実施例２）
例示的なヒト結合Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドをＨ５ポリペプチドとする。一部のこのような実施形態では、本発明によるＨ５ポリペプチドが、アンブレラグリカンへの結合（例えば、高度な親和性および／または高度な特異的結合）を示す。一部のこのような実施形態では、本発明によるＨ５ポリペプチドが、同等な（アンブレラトポロジーへの結合と）高親和性によるコーントポロジーグリカンへの結合またはコーントポロジーグリカンへの結合の低減（例えば、アンブレラトポロジーグリカンと比べた低親和性および／または低特異性）を示す。
一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチドが、ヒト上気道上皮細胞において見出される受容体に結合する。さらに、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチドは、複数の異なるα２−６シアル化グリカンにも結合する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、アンブレラグリカンに結合する。
一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチドが、気管支および／または気管のＨＡ受容体に結合する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、肺深部の受容体に結合することが可能でなく、一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、肺深部の受容体に結合することが可能である。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、α２−３シアル化グリカンに結合することが可能でなく、一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、α２−３シアル化グリカンに結合することが可能である。
一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチドを、親Ｈ５ ＨＡポリペプチド（例えば、天然のインフルエンザ単離物中に見出されるＨ５ ＨＡポリペプチド）の変異体とする。例えば、一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチドが、野生型のＨ５ ＨＡポリペプチドと比較して、グリカン結合部位内に少なくとも１つのアミノ酸置換を有するか、またはグリカン結合部位に影響を及ぼす少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。一部の実施形態では、このような置換を、結合したグリカンと直接相互作用するアミノ酸の置換とし、一部の実施形態では、分離度１次で隔てられたアミノ酸は、（１）直接的に結合するアミノ酸と相互作用するか、（２）直接的に結合するアミノ酸がグリカンと相互作用する能力に他の形で影響を及ぼすが、グリカン自体とは直接相互作用しないか、または（３）直接的に結合するアミノ酸がグリカンと相互作用する能力に他の形で影響を及ぼし、また、グリカン自体とも直接相互作用するので、このような置換を、結合したグリカンと相互作用するアミノ酸から分離度１次で隔てられたアミノ酸の置換とする。本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチドは、１もしくは複数の直接的に結合するアミノ酸、１もしくは複数の分離度１次のアミノ酸、１もしくは複数の分離度２次のアミノ酸、またはこれらの任意の組合せの置換を含有する。一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチドが、１またはそれより多くの分離度がなおより高次なアミノ酸の置換を含有しうる。
一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体が、野生型のＨ５ ＨＡポリペプチドと比較して少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ以上のアミノ酸置換を有し、一部の実施形態では本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体が、２つ、３つ、または４つのアミノ酸置換を有する。一部の実施形態では、このようなアミノ酸置換の全てを、グリカン結合部位内に配置する。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド変異体が、米国特許公開第２００９／０２６９３４２号および同第２０１０／０００４１９５号のうちのいずれか、ならびに２０１０年７月２日に出願され、「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＤＩＡＧＮＯＳＩＮＧ ＡＮＤ／ＯＲ ＴＲＥＡＴＩＮＧ ＩＮＦＬＵＥＮＺＡ ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ」と題する、米国特許出願第１２／８２９９３１号（これらの全てが参照により本明細書に組み込まれる）において記載されている１またはそれより多くのアミノ酸置換を含有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基９５、９８、１２８、１３０、１３１、１３２、１３３、１３５、１３６、１３７、１３８、１４５、１５３、１５５、１５６、１５８、１５９、１６０、１８３、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、２１９、２２１、２２２、２２４、２２５、２２６、２２７、および２２８のうちの１またはそれより多くに対応する位置において配列の置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基９５、９８、１２８、１３０、１３１、１３２、１３３、１３５、１３６、１３７、１３８、１４５、１５３、１５５、１５６、１５８、１５９、１６０、１８３、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、２１９、２２１、２２２、２２４、２２５、２２６、２２７、および２２８からなる群から選択される残基において、野生型の親Ｈ５ ＨＡと比べて１またはそれより多くのアミノ酸置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基９５、９８、１２８、１３０、１３１、１３２、１３３、１３５、１３６、１３７、１３８、１４５、１５３、１５５、１５６、１５８、１５９、１６０、１８３、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、２１９、２２１、２２２、２２４、２２５、２２６、２２７、および２２８からなる群から選択される任意の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、または３７残基において、野生型の親Ｈ５ ＨＡと比べて１またはそれより多くのアミノ酸置換を有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、１５８位に対応する部位におけるグリコシル化を低減または消失させる配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、１５８位に対応する部位に結合したグリカンの同一性および／または構造に影響を及ぼし、かつ／またはこれを変化させる配列置換を有する。一部の実施形態では、このような配列置換は、１５８位に対応する部位における突然変異、例えば、Ａｓｎ１５８Ｘａａ［ＸａａはＡｓｎ以外の任意のアミノ酸である］である。一部の実施形態では、このような配列置換は、１６０位に対応する部位における突然変異、例えば、Ｔｈｒ１６０Ｘａａ［ＸａａはＡｓｎ以外の任意のアミノ酸である］である。一部の実施形態では、このような配列置換が、突然変異Ｔｈｒ１６０Ａｌａを含む。一部の実施形態では、１５８位に対応する部位におけるグリコシル化を低減するか、消失させるか、これに影響を及ぼすか、またはこれを変化させる配列置換により、Ｈ５ ＨＡポリペプチドを、Ｈ２ ＨＡポリペプチドに酷似させる（例えば、構造的にも機能的にも酷似させる）ことができる。一部の実施形態では、１６０位に対応する部位における突然変異（例えば、Ｔｈｒ１６０ＡｌａなどのＴｈｒ１６０Ｘａａ）により、Ｈ５ ＨＡポリペプチドを、Ｈ２ ＨＡポリペプチドに酷似させる（例えば、構造的にも機能的にも酷似させる）ことができる。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基２２６、２２８、および１６０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親Ｈ５ ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基２２６、２２８、および１６０に対応する位置において、野生型の親Ｈ５ ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基２２６および１６０に対応する位置において、野生型の親Ｈ５ ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基２２８および１６０に対応する位置において、野生型の親Ｈ５ ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基２２６および２２８に対応する位置において、野生型の親Ｈ５ ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基２２６、２２８、および１５８のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親Ｈ５ ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基２２６、２２８、および１５８に対応する位置において、野生型の親Ｈ５ ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基２２６および１５８に対応する位置において、野生型の親Ｈ５ ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基２２８および１５８に対応する位置において、野生型の親Ｈ５ ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基２２６および２２８に対応する位置において、野生型の親Ｈ５ ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、ＨＡポリペプチドのループ領域のうちの１またはそれより多くにおいて欠失を包含する１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、ＨＡポリペプチドの１２８〜１３７のループ領域に対応する部位において欠失を包含する１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、ＨＡポリペプチドの残基１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、および／または１３７に対応するアミノ酸位置のうちの１またはそれより多くにおいて欠失を包含する１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、ＨＡポリペプチドの１２８〜１３４のループ領域に対応する部位において欠失を包含する１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、ＨＡポリペプチドの残基１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、および／または１３４に対応するアミノ酸位置のうちの１またはそれより多くにおいて欠失を包含する１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３０に対応するアミノ酸の欠失を包含する１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、このようなループ領域の置換により、Ｈ５ ＨＡポリペプチドを、Ｈ２ ＨＡポリペプチドに酷似させる（例えば、構造的にも機能的にも酷似させる）ことができる。一部の実施形態では、残基１３０に対応するアミノ酸を欠失させることにより、Ｈ５ ＨＡポリペプチドを、Ｈ２ ＨＡポリペプチドに酷似させる（例えば、構造的にも機能的にも酷似させる）ことができる。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、２２８、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、２２８、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、または１４個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、および２２８のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、および２２８のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、または１３個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３１、１３２、１３５、１８８、１９２、２２１、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３１、１３２、１３５、１８８、１９２、２２１、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、または７個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３１、１３２、１３５、１８８、１９２、および２２１のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３１、１３２、１３５、１８８、１９２、および２２１のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、または６個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３３、１３７、１５５、１９３、２２６、２２７、２２８、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３３、１３７、１５５、１９３、２２６、２２７、２２８、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、またはに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３３、１３７、１５５、１９３、２２６、２２７、および２２８のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３３、１３７、１５５、１９３、２２６、２２７、および２２８のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、または７個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３０、１９２、および１９３のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３０、１９２、１９３のうちの任意の１個、２個、または３個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１９２および１９３のうちの一方または両方に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、２２８、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、２２８、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、または１６個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、および２２８のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、および２２８のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、または１５個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、または７個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、および２２８のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、および２２８のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、または６個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、２２８、１３１、１３２、１３３、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、２２８、１３１、１３２、１３３、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、または１１個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、２２８、１３１、１３２、および１３３のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、２２８、１３１、１３２、および１３３のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基２２７、１３１、１３２、１３３、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基２２７、１３１、１３２、１３３、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、または５個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基２２７、１３１、１３２、および１３３のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基２２７、１３１、１３２、および１３３のうちの任意の１個、２個、３個、または４個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３１、１３３、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、２２８、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３１、１３３、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、２２８、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、または１１個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３１、１３３、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、および２２８のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３１、１３３、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、および２２８のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３１、１３３、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３１、１３３、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３１、１３３、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２６、および２２８のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３１、１３３、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２６、および２２８のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、または９個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３１、１３３、１３７、１５５、１５９、１６０、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、２２８、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３１、１３３、１３７、１５５、１５９、１６０、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、２２８、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、または１３個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３１、１３３、１３７、１５５、１５９、１６０、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、および２２８のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３１、１３３、１３７、１５５、１５９、１６０、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、および２２８のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、または１２個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３１、１３３、１３７、１５５、１５９、１６０、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３１、１３３、１３７、１５５、１５９、１６０、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、または１２個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３１、１３３、１３７、１５５、１５９、１６０、１８８、１９２、１９３、２２６、および２２８のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３１、１３３、１３７、１５５、１５９、１６０、１８８、１９２、１９３、２２６、および２２８のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、または１１個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、１３１、１３２、１３３、２２１、２２７、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、１３１、１３２、１３３、２２１、２２７、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、または１２個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、１３１、１３２、１３３、２２１、および２２７のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、１３１、１３２、１３３、２２１、および２２７のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、または１１個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３１、１３２、１３３、２２１、２２７、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３１、１３２、１３３、２２１、２２７、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、または６個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３１、１３２、１３３、２２１、および２２７のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３１、１３２、１３３、２２１、および２２７のうちの任意の１個、２個、３個、４個、または５個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて配列置換を有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基９８、１３６、１５３、１５５、１８３、および１９４が含まれるがこれらに限定されない、グリカンに直接結合する受容体の領域に位置するアミノ酸から選択される残基において、野生型の親Ｈ５ ＨＡと比べて１またはそれより多くのアミノ酸置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（ａ）残基９８および１９５、（ｂ）残基９８、１３８、１８６、１８７、１９５、および２２８、または（ｃ）残基１３８、１８６、１８７、および２２８が含まれるがこれらに限定されない、グリカンに直接結合する受容体の領域に隣接して位置するアミノ酸から選択される残基において、野生型の親Ｈ５ ＨＡと比べて１またはそれより多くのアミノ酸置換を有する。
一部の実施形態では、分離度１次で隔てられたアミノ酸が、（１）直接的に結合するアミノ酸と相互作用するか、（２）直接的に結合するアミノ酸がグリカンと相互作用する能力に他の形で影響を及ぼすが、グリカン自体とは直接相互作用しないか、または（３）直接的に結合するアミノ酸がグリカンと相互作用する能力に他の形で影響を及ぼし、また、グリカン自体とも直接相互作用するという点で、ＨＡポリペプチド変異体、特にＨ５ポリペプチド変異体は、残基９８、１３８、１８６、１８７、１９５および２２８を含むがこれらに限定されない、結合したグリカンと相互作用するアミノ酸から分離度１次で隔てられたアミノ酸から選択される残基において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くのアミノ酸置換を有する。
一部の実施形態では、分離度１次で隔てられたアミノ酸が、（１）直接的に結合するアミノ酸と相互作用するか、（２）直接的に結合するアミノ酸がグリカンと相互作用する能力に他の形で影響を及ぼすが、グリカン自体とは直接相互作用しないか、または（３）直接的に結合するアミノ酸がグリカンと相互作用する能力に他の形で影響を及ぼし、また、グリカン自体とも直接相互作用するという点で、ＨＡポリペプチド変異体、特にＨ５ポリペプチド変異体は、残基１３８、１８６、１８７、および２２８を含むがこれらに限定されない、結合したグリカンと相互作用するアミノ酸から分離度１次で隔てられたアミノ酸から選択される残基において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くのアミノ酸置換を有する。
一部の実施形態では、分離度１次で隔てられたアミノ酸が、（１）直接的に結合するアミノ酸と相互作用するか、（２）直接的に結合するアミノ酸がグリカンと相互作用する能力に他の形で影響を及ぼすが、グリカン自体とは直接相互作用しないか、または（３）直接的に結合するアミノ酸がグリカンと相互作用する能力に他の形で影響を及ぼし、また、グリカン自体とも直接相互作用するという点で、ＨＡポリペプチド変異体、特にＨ５ポリペプチド変異体は、残基９８および１９５を含むがこれらに限定されない、結合したグリカンと相互作用するアミノ酸から分離度１次で隔てられたアミノ酸から選択される残基において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くのアミノ酸置換を有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体、特にＨ５ポリペプチド変異体が、残基１５９において、野生型の親ＨＡと比べてアミノ酸置換を有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体、特にＨ５ポリペプチド変異体が、１９０、１９３、２２５、および２２６から選択される残基において、野生型の親ＨＡポリペプチドと比べて１またはそれより多くのアミノ酸置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体、特にＨ５ポリペプチド変異体が、１９０、１９３、２２６、および２２８から選択される残基において、野生型の親ＨＡポリペプチドと比べて１またはそれより多くのアミノ酸置換を有する。
一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体が、以下のアミノ酸置換：Ｓｅｒ１３２Ｔｈｒ、Ａｌａ１３３Ｔｈｒ、Ｓｅｒ１３３Ｔｈｒ、Ｓｅｒ１３７Ａｌａ、Ｓｅｒ１３７Ａｒｇ、Ｉｌｅ１５５Ｔｈｒ、Ｌｙｓ１５６Ｇｌｕ、Ａｓｎ１５８Ｘａａ（ここで、Ｘａａ＝Ａｓｎ以外の任意のアミノ酸）、Ｔｈｒ１６０Ａｌａ、Ａｓｎ１８６Ｐｒｏ、Ａｓｐ１８７Ｓｅｒ、Ａｓｐ１８７Ｔｈｒ、Ａｌａ１８８Ｇｌｕ、Ａｌａ１８８Ａｓｐ、Ａｌａ１８９Ｇｌｎ、Ａｌａ１８９Ｌｙｓ、Ａｌａ１８９Ｔｈｒ、Ｇｌｕ１９０Ａｓｐ、Ｇｌｕ１９０Ｔｈｒ、Ｔｈｒ１９２Ａｒｇ／Ｌｙｓ、Ｌｙｓ１９３Ａｒｇ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｌｙｓ１９３Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ１９３Ｔｈｒ／Ａｌａ／Ｍｅｔ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ２２１Ｐｒｏ、Ｇｌｙ２２５Ａｓｐ、Ｇｌｎ２２６Ｉｌｅ、Ｇｌｎ２２６Ｌｅｕ、Ｇｌｎ２２６Ｖａｌ、Ｓｅｒ２２７Ａｌａ、Ｇｌｙ２２８Ｓｅｒのうちの１またはそれより多くを有する。
一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１９２に対応する位置においてその位置において電荷をスイッチするアミノ酸置換を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１９３に対応する位置においてその位置において電荷をスイッチするアミノ酸置換を有する。例えば、一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチドが、残基１９２に対応する位置においてＴｈｒまたは疎水性残基（例えば、ＶａｌまたはＩｌｅ）を有し、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体（例えば、ヒト適応型変異体）が、残基１９２に対応する位置において親水性残基を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体（例えば、ヒト適応型変異体）が、残基１９２に対応する位置において親水性残基を有する。別の例を挙げれば、一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチドが、残基１９２に対応する位置においてＴｈｒまたは疎水性残基（例えば、ＶａｌまたはＩｌｅ）を有し、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体（例えば、ヒト適応型変異体）が、残基１９２に対応する位置において塩基性残基（例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇ）を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体（例えば、ヒト適応型変異体）が、残基１９２に対応する位置において塩基性残基（例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇ）を有する。さらに別の例を挙げれば、一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチドが、残基１９３に対応する位置において塩基性残基（例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇ）を有し、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体（例えば、ヒト適応型変異体）が、残基１９３に対応する位置において中性残基または酸性残基を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体（例えば、ヒト適応型変異体）が、残基１９３に対応する位置において中性残基または酸性残基を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体（例えば、ヒト適応型変異体）が、残基１９３に対応する位置においてＴｈｒ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、またはＶａｌを有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドのヒト適応化が、１８８位における残基の特性（複数可）と関連する。Ｈ５ ＨＡでは、残基１８８が、残基１９２においてＴｈｒまたは疎水性残基と接触するＡｌａであることが多い。これに対し、Ｈ２ ＨＡでは、残基１８８が、残基１９２においてＡｒｇまたはＬｙｓと接触するＧｌｕまたはＡｓｐであることが多い。よって、一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、１８８位においてＧｌｕを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、１８８位においてＡｓｐを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、Ａｌａ１８８Ｇｌｕ置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、Ａｌａ１８８Ａｓｐ置換を有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、残基１８８に対応する位置においてＡｌａを有し、残基１９２に対応する位置においてＴｈｒを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、残基１８８に対応する位置においてＡｌａを有し、残基１９２に対応する位置において疎水性残基を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１８８に対応する位置においてＧｌｕを有し、残基１９２に対応する位置においてＡｒｇを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１８８に対応する位置においてＡｓｐを有し、残基１９２に対応する位置においてＡｒｇを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１８８に対応する位置においてＧｌｕを有し、残基１９２に対応する位置においてＬｙｓを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１８８に対応する位置においてＡｓｐを有し、残基１９２に対応する位置においてＬｙｓを有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、残基１８８に対応する位置においてＡｌａを有し、残基１９２に対応する位置においてＴｈｒを有し、残基１９３に対応する位置においてＬｙｓを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、残基１８８に対応する位置においてＡｌａを有し、残基１９２に対応する位置において疎水性残基を有し、残基１９３に対応する位置においてＬｙｓを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、残基１８８に対応する位置においてＡｌａを有し、残基１９２に対応する位置においてＴｈｒを有し、残基１９３に対応する位置においてＡｒｇを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、残基１８８に対応する位置においてＡｌａを有し、残基１９２に対応する位置において疎水性残基を有し、残基１９３に対応する位置においてＡｒｇを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１８８に対応する位置においてＧｌｕを有し、残基１９２に対応する位置においてＡｒｇを有し、残基１９３に対応する位置においてＴｈｒを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１８８に対応する位置においてＡｓｐを有し、残基１９２に対応する位置においてＡｒｇを有し、残基１９３に対応する位置においてＴｈｒを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１８８に対応する位置においてＧｌｕを有し、残基１９２に対応する位置においてＬｙｓを有し、残基１９３に対応する位置においてＴｈｒを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１８８に対応する位置においてＡｓｐを有し、残基１９２に対応する位置においてＬｙｓを有し、残基１９３に対応する位置においてＴｈｒを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１８８に対応する位置においてＧｌｕを有し、残基１９２に対応する位置においてＡｒｇを有し、残基１９３に対応する位置においてＴｈｒ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、またはＶａｌを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１８８に対応する位置においてＡｓｐを有し、残基１９２に対応する位置においてＡｒｇを有し、残基１９３に対応する位置においてＴｈｒ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、またはＶａｌを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１８８に対応する位置においてＧｌｕを有し、残基１９２に対応する位置においてＬｙｓを有し、残基１９３に対応する位置においてＴｈｒ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、またはＶａｌを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１８８に対応する位置においてＡｓｐを有し、残基１９２に対応する位置においてＬｙｓを有し、残基１９３に対応する位置においてＴｈｒ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、またはＶａｌを有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、残基１３１に対応する位置においてＡｌａを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３１に対応する位置においてＴｈｒを有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、残基１３２に対応する位置においてＳｅｒを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３２に対応する位置においてＴｈｒを有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、残基１３３に対応する位置においてＳｅｒを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３３に対応する位置においてＴｈｒを有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、残基１３１、１３２、および／または１３３に対応する任意の位置においてＡｌａ、Ｔｈｒ、および／またはＳｅｒを包含する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３１、１３２、および／または１３３に対応する任意の位置においてＡｌａ、Ｔｈｒ、および／またはＳｅｒを包含する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３１、１３２、および１３３に対応する位置の全てにおいてＴｈｒを包含する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、残基１３５に対応する位置においてＶａｌを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３５に対応する位置においてＶａｌ以外の任意のアミノ酸を有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、残基１３７に対応する位置においてＳｅｒを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３７に対応する位置においてＡｒｇを有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、残基１５５に対応する位置においてＩｌｅを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１５５に対応する位置においてＴｈｒを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、残基１５５に対応する位置においてＴｈｒを包含する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１５５に対応する位置においてＴｈｒを包含する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、残基２２１に対応する位置においてＳｅｒを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基２２１に対応する位置においてＰｒｏを有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、残基２２１に対応する位置においてＳｅｒを包含する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基２２１に対応する位置においてＰｒｏを包含する。特定のいかなる一つの理論により拘束されることも望まないが、Ｐｒｏ２２１は、Ｈ２ ＨＡのＲＢＳと関与する２２０ループの立体配座に影響を及ぼしうるであろう。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、残基２２６に対応する位置においてＧｌｎを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基２２６に対応する位置においてＬｅｕを有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、残基２２７に対応する位置においてＳｅｒを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基２２７に対応する位置においてＧｌｙを有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、残基２２８に対応する位置においてＧｌｙを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基２２８に対応する位置においてＳｅｒを有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、２２６位、２２７位、および２２８位において、それぞれ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、およびＧｌｙ残基を包含する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、２２６位、２２７位、および２２８位において、それぞれ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、およびＳｅｒを包含する。
一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体が、表示される位置において以下のアミノ酸変化：
・Δ１３０（「Δ１３０」とは、１３０位に対応するアミノ酸における欠失を示す）＋１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋１３１、１３２、１３５、１８８、１９２、および２２１に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋１３３、１３７、１５５、１９３、２２６、２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋１３１、１３３、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋１３１、１３３、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２６、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋１３１、１３３、１３７、１５５、１５９、１６０、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋１３１、１３３、１３７、１５５、１５９、１６０、１８８、１９２、１９３、２２６、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、１３１、１３２、１３３、２２１、および２２７に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋１３１、１３２、１３３、２２１、および２２７に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、２２８、１３１、１３２、および１３３に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋２２７、１３１、１３２、および１３３に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
のうちの１またはそれより多くを有する。
一部の実施形態では、本発明が、それらのアミノ酸配列が以下：
［配列中、
Ｘ＝任意のアミノ酸（上記で別段に指定しない限り）とし、かつ／またはＸ＝欠失アミノ酸である。これらの位置の番号付けは、Ｈ３ ＨＡの番号付けに対応する］
に示されるエレメント（これらの位置の番号付けは、Ｈ３ ＨＡの番号付けに対応する）を包含する、Ｈ５ ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体、操作されたＨ５ ＨＡポリペプチド、および／または操作されたＨ５ ＨＡポリペプチド変異体）を提供する。
一部の実施形態では、Ｘ１３０を、１３０位に対応する部位における欠失とする。一部の実施形態では、Ｘ１６０がＡｌａである。一部の実施形態では、Ｘ１５８が、Ａｓｎ以外の任意のアミノ酸である。
一部のこのような実施形態では、変異体のアンブレラグリカンに対する親和性および／または特異性が増大するように、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、野生型のＨ５ ＨＡと比較して少なくとも１つのさらなる置換を有する。
一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Ｌ２２６、Ｓ２２８、およびＡ１６０を包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Ｌ２２６およびＡ１６０を包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Ｓ２２８およびＡ１６０を包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Ａ１６０を包含する配列を有する。
一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Ｌ２２６、Ｓ２２８、およびＸ１５８（Ｘ＝Ａｓｎ以外の任意のアミノ酸）を包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Ｌ２２６およびＸ１５８を包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Ｓ２２８およびＸ１５８を包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Ｘ１５８を包含する配列を有する。
一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、ならびに１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。
一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｌ２２６、Ｓ２２８、Ａ１６０、ならびに１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１８８、１９２、１９３、２２１、および２２７に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｌ２２６、Ａ１６０、ならびに１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１８８、１９２、１９３、２２１、２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｓ２２８、Ａ１６０、ならびに１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１８８、１９２、１９３、２２１、および２２７に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｌ２２６、Ｓ２２８、ならびに１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、および２２７に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。
一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ａ１６０、ならびに１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｌ２２６、ならびに１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、および２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｓ２２８、ならびに１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、および２２７に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。
一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｌ２２６、Ｓ２２８、Ｘ１５８（Ｘ＝Ａｓｎ以外の任意のアミノ酸）、ならびに１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、および２２７に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｌ２２６、Ｘ１５８、ならびに１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｓ２２８、Ｘ１５８、ならびに１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、および２２７に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｌ２２６、Ｓ２２８、ならびに１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、および２２７に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。
一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｘ１５８（Ｘ＝Ａｓｎ以外の任意のアミノ酸）、ならびに１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。
一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体が、親Ｈ５ ＨＡと比較して、特に野生型の親Ｈ５ ＨＡと比較して開放性の結合部位を有する。
一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチドが、アンブレラトポロジーグリカンに結合する。一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチドが、図９に示されるグリカン（例えば、α２−６シアル化グリカン）のうちの少なくとも一部に結合する。一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチドが、図９に示される複数のグリカンに結合する。
一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチドが、ヒト上気道組織（例えば、上皮細胞）内のＨＡ受容体において見出されるグリカンのうちの少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％以上に結合する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）を、配列番号５０、５１、５３〜５５、および６０〜７５に示されるポリペプチドのうちのいずれかとする。
一態様では、本発明が、高親和性によるアンブレラトポロジーグリカンへの結合だけでは、ヒトに対する効果的な伝染／感染性を付与するのに十分ではありえないことの具体的な認識を提供する。本発明は、また、コーントポロジーグリカンへの結合の低減も重要でありうることの洞察を提供する。一部の実施形態では、高親和性によるアンブレラトポロジーグリカンへの結合およびコーントポロジーグリカンへの結合親和性の低減が、ヒトに対する効果的な伝染／感染性を付与することに関与している可能性がある。一部の実施形態では、高親和性によるアンブレラトポロジーグリカンへの結合は、ヒトに対する効果的な伝染／感染性を付与するのに十分である。一部の実施形態では、コーントポロジーグリカンへの結合親和性を低減しない（例えば、変化させない、増大させるなど）場合であっても、高親和性によるアンブレラトポロジーグリカンへの結合は、ヒトに対する効果的な伝染／感染性を付与するのに十分である。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体のアンブレラトポロジーグリカンへの結合親和性および／または結合特異性の増大ならびにコーントポロジーグリカンへの結合親和性および／または結合特異性の低減が、ヒトに対する伝染／感染性を、基準のポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体のコグネイトである親ＨＡポリペプチド）と比べて増大させるかまたは増強することに関与している可能性がある。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体のアンブレラトポロジーグリカンへの結合親和性および／または結合特異性の増大は、ヒトに対する伝染／感染性を基準のポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体のコグネイトである親ＨＡポリペプチド）と比べて増大させるかまたは増強するのに十分である。一部の実施形態では、コーントポロジーグリカンへの結合親和性および／または結合特異性を低減しない（例えば、変化させない、増大させるなど）場合であっても、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体のアンブレラトポロジーグリカンへの結合親和性および／または結合特異性の増大は、ヒトに対する伝染／感染性を基準のポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体のコグネイトである親ＨＡポリペプチド）と比べて増大させるかまたは増強するのに十分である。一部の実施形態では、コーントポロジーグリカンへの結合親和性および／または結合特異性が、アンブレラトポロジーグリカンへの結合親和性および／または結合特異性と同等であり、かつ／またはこれより大きい場合であっても、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体のアンブレラトポロジーグリカンへの結合親和性および／または結合特異性の増大は、ヒトに対する伝染／感染性を基準のポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体のコグネイトである親ＨＡポリペプチド）と比べて増大させるかまたは増強するのに十分である。
（実施例３）
ヒト上気道組織におけるグリカンの多様性
レクチン結合研究により、上気道組織におけるα２−３グリカンおよびα２−６グリカンの分布の多様性が示された。染色研究により、気管上皮の先端側におけるＮ結合型グリカン（絨毛細胞）およびＯ結合型グリカン（杯細胞における）の両方の一部としてのα２−６シアル化グリカンの分布が優勢であることが示される（図１２）。他方、気管組織の内部領域は主に、Ｎ結合型グリカンにおいて分布するα２−３グリカンを含む。
ＭＡＬＤＩ−ＭＳグリカンプロファイリング解析により、ヒト上気道における実質的な多様性（図１０）ならびにα２−６シアル化グリカンの発現が優勢であることが示された。ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＴＯＦを用いる代表的な質量ピークのフラグメント化により、複数のラクトサミン反復配列を伴う長鎖オリゴ糖分枝が、短鎖オリゴ糖分枝と比較して広範に分布するグリカントポロジーが裏付けられる（図１０）。上気道におけるグリカンの分布およびトポロジーの多様性についての基準をもたらすために、ヒト結腸上皮細胞（ＨＴ２９細胞）に由来するＮ結合型グリカンについてＭＡＬＤＩ−ＭＳ解析を実施した。近年のＨ５Ｎ１ウイルスは主に消化管に感染しているため、これらの細胞を代表的な消化管細胞として選択した。ＨＴ２９細胞のグリカンプロファイルは、α２−３グリカンの分布が優勢であり、長鎖オリゴ糖分枝のグリカントポロジーは観察されないＨＢＥのグリカンプロファイルと著明に異なる（図１０）。
図１２のデータは、以下の方法を介して作成した。ホルマリンで固定し、パラフィンで包埋したヒト気管組織切片は、ＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入した。組織切片を脱パラフィン化し、再水和させた後、内因性ビオチンは、ストレプトアビジン／ビオチンブロッキングキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）を用いてブロッキングした。次いで、切片を、ＦＩＴＣで標識したＪａｃａｌｉｎ（Ｏ結合型グリカンに特異的）、ビオチニル化したＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ（Ｎ結合型グリカンを構成するコアオリゴ糖構造の一部であるα結合型マンノース残基に特異的なＣｏｎ Ａ）、ビオチニル化したＭａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓのレクチン（ＭＡＬ、ＳＡα２，３−ｇａｌに特異的）、およびビオチニル化したＳａｍｂｕｃｃｕｓ ｎｉｇｒａのアグルチニン（ＳＮＡ、ＳＡα２，６−ｇａｌに特異的）（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｓ；０．５％のＴｗｅｅｎ−２０を伴うＰＢＳ中に１０μｇ／ｍｌ）と共に、３時間にわたりインキュベートした。ＴＢＳＴ（１％のＴｗｅｅｎ−２０を伴うトリス緩衝生理食塩液）による洗浄の後、切片を、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ５４６ストレプトアビジン（０．５％のＴｗｅｅｎ−２０を伴うＰＢＳ中に２μｇ／ｍｌ）と共に、１時間にわたりインキュベートした。スライドをＴＢＳＴで洗浄し、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０レーザー走査共焦点顕微鏡）下で観察した。全てのインキュベーションは、室温（ＲＴ）で実施した。
図１０のデータは、以下の方法を用いて作成した。細胞（約７０×１０６個）は、１００ｍＭのクエン酸緩衝生理食塩液と共に＞９０％をコンフルエントとして採取し、プロテアーゼ阻害剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）による処理およびホモジナイゼーションの後で細胞膜を単離した。細胞膜画分をＰＮＧａｓｅＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で処置し、反応混合物を３７℃で一晩にわたりインキュベートした。反応混合物を１０分間にわたり煮沸して酵素を失活させ、Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８ ＳＰＥカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて、脱グリコシル化されたペプチドおよびタンパク質を除去した。グリカンは、さらに脱塩し、グラファイト化炭素製の固相抽出カラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ）を用いて中性（２５％のアセトニトリル画分）画分および酸性（０．０５％のトリフルオロ酢酸を含有する５０％のアセトニトリル）画分へと精製した。酸性画分は、それぞれ、ソフトイオン化条件（加速化電圧を２２ｋＶ、グリッド電圧を９３％、ガイドワイヤーを０．３％、および抽出遅延時間を１５０ナノ秒とする）を伴う陽イオンモードおよび陰イオンモードのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを介して解析した。ピークは、非ナトリウム化分子種として較正した。α２−６シアル化グリカンの発現が優勢であることは、シアリダーゼＡおよびＳを用いて試料を前処理することにより確認した。単離されたグリカンは、その後最終容量を１００ｍＬとする５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０中に０．１ＵのＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓのシアリダーゼ（シアリダーゼＡ、非特異的）またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのシアリダーゼ（シアリダーゼＳ、α２−３シアル化グリカンに特異的）と共に３７℃で２４時間にわたりインキュベートした。中性画分および酸性画分は、それぞれ、陽イオンモードおよび陰イオンモードのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを介して解析した。
（実施例４）
Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体のヒト肺組織への結合
ホルマリンで固定し、パラフィンで包埋したヒト肺組織切片およびヒト気管組織切片（それぞれ、例えば、ＵＳ Ｂｉｏｍａｘ，Ｉｎｃ．およびＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入した）への結合が提示される。組織切片は、脱パラフィン化し、再水和させ、ＰＢＳ中に１％のＢＳＡと共に３０分間にわたりインキュベートして、非特異的結合を防止した。Ｈ５ ＨＡポリペプチドは、それぞれ４：２：１の比で、一次抗体（マウス抗６×Ｈｉｓタグ抗体）および二次抗体（Ａｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗マウス抗体）と共に、氷上で２０分間にわたりあらかじめ複合体化させた。形成された複合体は、１％のＢＳＡ−ＰＢＳにより４０、２０または１０μｇ／ｍｌの最終ＨＡ濃度へと希釈する。次いで、組織切片を、ＨＡ−抗体複合体と共にＲＴで３時間にわたりインキュベートする。切片は、ヨウ化プロピジウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＴＢＳＴ中に１：１００）で対比染色し、十分に洗浄し、次いで、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０レーザー走査共焦点顕微鏡）下で観察する。
あらかじめ複合体化させたＨ５ ＨＡポリペプチドはまた、Ｊａｃａｌｉｎ（杯細胞など、非絨毛性の粘液性細胞のマーカー）など他のレクチンと共に組織切片を共染色して、ＨＡにより組織上皮における絨毛細胞および／または非絨毛細胞が染色されるかどうかについてのさらなる情報を得るのにも用いる。
（実施例５）
動物宿主におけるＨ５ ＨＡポリペプチドの試験
本明細書で記載する通り、本発明は、ウイルスの伝染について研究するために動物宿主（例えば、フェレット）を用いることにより、ヒトへのウイルス伝染について信頼できる指標がもたらされうることの認識を包含する。同様に、本発明は、ウイルスの伝染について研究するために本発明による結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド）により処置される動物宿主（例えば、フェレット）を用いることにより、ヒト宿主におけるウイルスの防止または処置のための本発明によるこのような結合剤の有効性について信頼できる指標がもたらされうることの認識も包含する。
ウイルス伝染アッセイ
ウイルス伝染アッセイを、本発明による結合剤の存在下または非存在下において用いて、適切な動物モデルにおけるウイルス伝染を決定する。例えば、動物宿主、例えば、フェレットを、動物間の直接的および間接的な接触を防止する、隣接するケージ内で飼育する。しかし、これらの飼育条件は、空気を介するインフルエンザウイルスの拡散を可能とする。動物のうちの第１の部分に、当技術分野で公知の方法（例えば、鼻腔内投与、筋肉内投与、または本明細書で記載される投与方式のうちのいずれか）を介して有効量のウイルスを接種する（「接種された動物」）。次いで、１、２、３日以上後で、ナイーブの動物を、接種された動物と隣接するケージに導入することができる。
研究で用いられる動物は、接種または伝染の１、２、３日以上後の任意の時点で、解析のために死滅させることができる。ウイルス伝染研究に適する解析には、感染性ウイルスの力価（例えば、鼻腔内洗浄を介する）の決定、動物における身体症状（例えば、嗜眠、食欲不振、鼻漏、くしゃみ、高熱、および／または死）の観察、とりわけ、呼吸器組織の免疫組織化学的解析が含まれうるがこれらに限定されない。
上記のウイルス伝染アッセイはまた、ウイルスの接種または伝染の前、間、または後における、動物宿主の、本明細書で記載される本発明に従う結合剤による処置も組み込みうる。次いで、本明細書で記載される解析法を用いて、動物宿主のウイルスによる伝染および／または感染の遮断における結合剤（複数可）の有効性を決定する。
血清学的研究
結合剤および／または結合剤を含むワクチン組成物をフェレットに０日目に筋肉内投与した後、２１日目に追加投与を実施する。各動物に由来する血液を、０、１４、２１、および３５日目に回収する。回収された血清を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、それがウイルスの凝集を阻害し、ウイルス感染を中和する能力について検討した。
血球凝集反応阻害（ＨＡＩ）アッセイ
ＨＡＩの滴定は、９６−ウェルのｖ型底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）内で実施する。血清を２倍に系列希釈し、２００μｌの全容量中に血球凝集用量の４倍のＡ型インフルエンザウイルスへと添加する。次に、２％の（ｖｏｌ／ｖｏｌ）赤血球溶液２５μｌを添加する。血清、ウイルス、および赤血球を静かに混合し、３０分間にわたりインキュベートした後にアッセイを読み取る。血球凝集用量の４倍のウイルスを阻害する最大の抗体希釈率の逆数としての力価を記録する。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける中和アッセイ
血清の系列希釈液を、ウイルスと混合し、室温で３０分間にわたりインキュベートし、次いで、ＭＤＣＫ細胞と共に３７℃で１時間にわたりインキュベートする。次いで、細胞を無血清培地で２回にわたり洗浄し、次いで、トリプシンを伴うかまたは伴わない新鮮な培地を添加する。ウイルスの増殖は、細胞変性効果を介して評価する。データは、中和を引き起こす血清の最大の希釈率の逆数として作成する。
ウイルス感作アッセイ
ワクチン接種されたフェレットを、同種および異種の野生型および突然変異体のＨ５Ｎ１株で鼻腔内感作する。感作後１、３、および５日目に、フェレットから鼻腔内洗浄液を採取する。ＭＤＣＫ細胞におけるウイルスを滴定して、気道内に放出されるウイルスを決定する。
（実施例５）
Ｈ５Ｎ１血球凝集素の近年の単離物における２カ所のアミノ酸変化は、そのヒト受容体への優先性をスイッチするのに十分である
序説
高度に病原性のＨ５Ｎ１は、２００３年以来、ヒトにおける複数の局在化された大発生を開始して、地球規模の憂慮をもたらしている（これらのいずれもが参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｅｕｍａｎｎら、２０１０年、Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ、２０巻：５１頁；Ｇｕａｎら、２００９年、Ｒｅｖ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈ、２８巻：３９頁）。既存のＨ５Ｎ１株はエアロゾル伝染が不可能であり、むしろ、主に感染した動物との直接的な接触を介して伝染する。しかし、感染と関連する罹患率および死亡率の高さ（約６０％）、ならびに公知のインフルエンザ亜型（Ｈ５Ｎ１を含めた）が突然変異または遺伝子再集合を介して表現型形質を獲得する能力により、Ｈ５Ｎ１株もエアロゾル伝染性を獲得しうることが示唆される（参照により本明細書に組み込まれる、Ｙｅｎら、２００９年、Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ、３３３巻：３頁）。このようなウイルスが重度の感染を引き起こす潜在的可能性と共に、ヒト集団がＨ５Ｎ１に対して事前に免疫を有さないという事実により、このような株が発生すれば、将来において流行または大流行が生じうることが示唆される（参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｕｂｂａｒａｏら、２００７年、ＰＬｏＳ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、３巻：ｅ４０頁）。
逆遺伝学システムの使用により、１１の遺伝子産物のうち、血球凝集素（ＨＡ）およびポリメラーゼ（ＰＢ２）における特定のアミノ酸変化の獲得が、ヒトへのエアロゾル伝染に極めて重要であることが示されている（参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｏｅｖｅｎら、２００９年、Ｐｒｏ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１０６巻：３３６６頁）。したがって、これらのタンパク質における遺伝子変化の機能的効果について対処することは、表現型の変化に対する潜在的可能性を同定するのにとりわけ重要である。ＰＢ２の場合、６２７位におけるリシンからグルタミン酸への極めて重要な変化が、エアロゾル伝染性を獲得するのに重要である（参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｏｅｖｅｎら、２００９年、Ｐｒｏ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１０６巻：３３６６頁）。しかし、ＨＡの生物学的役割、すなわち、ビリオンの融合および感染をもたらすグリカン受容体への結合を踏まえるなら、ヒトへの適応をもたらす特異的な突然変異は、亜型特異的および株特異的であると考えられる（これらのいずれもが参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｔｅｖｅｎｓら、２００６年、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、４巻：８５７頁；Ｒｕｓｓｅｌｌら、２００６年、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ、２３巻：８５頁）。
先行研究により、ＨＡの受容体は、特定のグリカン構造（例えば、「アンブレラトポロジー」または「コーントポロジー」であるα２→３結合型シアル酸またはα２→６結合型シアル酸）を末端とするグリカンであることが同定されている。トリ適応型Ｈ５Ｎ１ ＨＡは、コーントポロジーグリカンを末端とするグリカン受容体に優先的に結合し、これらの多くが、α２→３結合型シアル酸（トリ受容体）を有する（これらのいずれもが参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｔｅｖｅｎｓら、２００６年、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、３５５巻：１１４３頁；Ｇａｍｂａｒｙａｎら、２００６年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３４４巻：４３２頁）。ヒト適応型Ｈ１Ｎ１株、ヒト適応型Ｈ２Ｎ２株、およびヒト適応型Ｈ３Ｎ２株のＨＡにより、コーントポロジー（例えば、多くがα２→３シアル化グリカン）からアンブレラトポロジー（例えば、多くがα２→６シアル化グリカン）（ヒト受容体）への結合優先性のスイッチ、およびこれらのヒト適応型ウイルスの空気伝染性と相関することが示されている、特徴的な高親和性によるヒト受容体への結合が裏付けられている（これらのいずれもが参照により本明細書に組み込まれる、Ｐａｐｐａｓら、２０１０年、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、５巻：ｅ１１１５８頁；Ｔｕｍｐｅｙら、２００７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１５巻：６５５頁）。この枠組みを用いて、近年の研究は、現在広く生じているＨ２Ｎ２株、Ｈ７Ｎ７株、およびＨ９Ｎ２株のヒトへの適応をもたらす突然変異のセットを同定している（それらの全てが参照により本明細書に組み込まれる、Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎら、２０１０年、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、５巻：ｅ１３７６８頁；Ｂｅｌｓｅｒら、２００８年、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１０５巻：７５５８頁；Ｓｏｒｒｅｌｌら、２００９年、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１０６巻：７５６５頁）。これらの研究は、転換に要求される突然変異が、研究された亜型およびなお特定の株に基づいて異なりうることを裏付けている。突然変異したＨ５Ｎ１株が、Ｈ２／Ｈ３（Ｑ２２６ＬおよびＧ２２８ＳまたはＬＳ）突然変異および／またはＨ１（Ｅ１９０Ｄ、Ｇ２２５ＤまたはＤＤ）突然変異の顕著な特徴である変化を包含するとする先行研究（それらの全てが参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｉｎｅｓら、２０１１年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、４１３巻：１３９頁；Ｓｔｅｖｅｎｓら、２００８年、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、３８１巻：１３８２頁；Ｓｔｅｖｅｎｓら、２００６年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１２巻：４０４頁）により、これらの突然変異体のうちのいずれもが、ヒト適応型の「流行性」株のＨＡに特徴的な、ヒト受容体への特異性および親和性へと定量的に「スイッチ」するわけではないことが示されている（図２０）。Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（Ｖｉｅｔ０３＿０４）配列における顕著な特徴であるＬＳ残基を導入しようとする試みは、スイッチをもたらしていない。本発明者らは、顕著な特徴であるＬＳ残基に適切に対応するのに必要とされる重要な構造的特徴を確立した。本発明者らはまた、いかなる構造的特徴が、高親和性によるヒト受容体への結合を可能とするような受容体の特異性のスイッチを促進するのに要求されるのかも決定した。
実験デザイン
インフルエンザＨＡは、単量体が５５２アミノ酸を含有するホモ三量体のタンパク質である。単量体の各々は、２つのジスルフィド結合した部分である、ＨＡ１およびＨＡ２からなる。ＨＡ１がグリカン受容体結合部位（ＲＢＳ）を含むのに対し、ＨＡ２はウイルスと細胞膜との融合に関与している。ＲＢＳポケットは、ＨＡの９５、１３１、１３３、１３６、１３７、１３８、１４５、１５３、１５５、１５６、１５８、１５９、１８３、１８６、１８７、１８９、１９０、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、２１９、２２２、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８位（Ｈ３の番号付けを用いる）を伴う。
Ｈ５ ＨＡは、系統的にＨ２ ＨＡに最も近縁である（図２１）ので、ＬＳ残基に対応する構造的特徴および適正なＨ５ ＨＡ配列を決定するために、本発明者らは、Ｈ２ ＨＡのＲＢＳとＨ５ ＨＡのＲＢＳの詳細な構造的比較を実施した。この研究のために、原型的な流行性Ｈ２（Ａ／Ａｌｂａｎｙ／６／５８またはＡｌｂ６＿５８）ＨＡを、初期のヒト単離物（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４またはＶｉｅｔ０３＿０４）に由来する代表的なＨ５Ｎ１ ＨＡと共に選択した。比較解析を行うことにより、本研究では、Ｈ５ ＨＡのＲＢＳをＨ２ ＨＡのＲＢＳから識別する４つの異なる特徴を同定した（図２２）。第１に、Ｈ２ ＨＡの１３０ループの組成は、Ｈ５ ＨＡの１３０位（Ｈ３の番号付け）において欠失を包含するＨ５ ＨＡとは異なる。第２に、ヒト受容体末端のＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌモチーフの向こう側の糖残基と相互作用する、ＲＢＳの「上部」または「１９０螺旋」におけるアミノ酸組成（１８８位、１９２位、および１９３位などにおけるアミノ酸組成）には差違が認められる。第３に、ヒト受容体のＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌモチーフと相互作用する、ＲＢＳの「底部」におけるアミノ酸組成（１３７位、２２１位、２２６位、および２２８位などにおける、ＬＳ変化を包含するアミノ酸組成）には差違が認められる。第４に、Ｈ２ ＨＡでは、Ｈ５ ＨＡの１５８位におけるグリコシル化部位が不在である。この部位におけるグリコシル化であれば、ＲＢＳに結合したヒト受容体末端のＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌモチーフの向こう側の糖残基に干渉する潜在的可能性がありうるであろう（これらのいずれもが参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｔｅｖｅｎｓら、２００８年、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、３８１巻：１３８２頁；Ｗａｎｇら、２０１０年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、８４巻：６５７０頁）。本発明の知見は、Ｈ２ ＨＡのＲＢＳとＨ５ ＨＡのＲＢＳとのこの詳細な比較を包含し、これにより、既に観察されたより特徴的なＬＳ変化の埒外にある特定のアミノ酸の差違が示唆される。本発明者らは、ＬＳ突然変異の文脈でＨ２ ＨＡのＲＢＳの構造的特徴への合致を促進する適切なＨ５ ＨＡ配列を同定しようと努めた。
全ての現在に至るまでのＨ５Ｎ１配列（トリ単離物およびヒト単離物の両方）についての解析により、本発明者らは、３つのさらなる観察：１）近年のトリ単離物およびヒト単離物（２００７年以後）の多くに由来するＨ５ ＨＡポリペプチドが既に、第１の特徴に合致する、１３０ループにおける欠失を獲得していることの観察、２）特徴２に合致する、「１９０螺旋」における重要なアミノ酸変化が既に観察されていることの観察、および３）また多くのＨ５ ＨＡ配列において、１５８位におけるグリコシル化の喪失（特徴４）も観察されていることの観察を行うことが可能となった。ＨＡ ＲＢＳの重要な構造的特徴の文脈で、本発明者らは、１３０ループにおける欠失が、同じＨＡにおいてグリコシル化の喪失を共時的に伴うこと（特徴１および４）が、Ｈ５ ＨＡの進化において極めて重要であることを決定した。しかし、本発明は、グリコシル化の喪失が１３０ループにおける残基の欠失に付随的であっても、その逆は成り立たないことの認識を包含する。本発明は、特定の最新型のＨ５ ＨＡ株が、旧型のヒト単離物（Ｖｉｅｔ０３＿０４など）から大幅に分岐しているが、また、流行性のＨ２ ＨＡ ＲＢＳに合致するのに必要な、重要な構造的特徴も獲得していることの観察を包含する。
したがって本発明者らは、特徴１および４を有する株であれば、顕著な特徴であるＬＳ残基に適切に対応する適正なＨ５ ＨＡ配列となるかどうかを評価した。この実験のために、株Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｅｇｙｐｔ／Ｒ２／２００７（またはｃｋＥｇｙ＿０７）を、天然で特徴１および４を獲得した代表的なＨ５ ＨＡとして選択した（図２３）。このＨ５ ＨＡ配列にＬＳ突然変異だけを導入すること（ｃｋＥｇｙ＿０７＿ＬＳ）により、ヒト受容体へのスイッチおよび高親和性によるヒト受容体への結合（およびトリ受容体に対する比較的低度な親和性）が示され、これにより、ヒト適応型「流行性」ＨＡのグリカン結合特徴への類似が示された（図２４Ａ、Ｂ、および図２５）。さらなる知見により、流行性ＨＡによるこの組織の染色に類似する、ヒト気管上皮の尖枝表面におけるこの突然変異体のＨ５ ＨＡのヒト受容体への結合（図２４Ｃ）が裏付けられる（これらのいずれもが参照により本明細書に組み込まれる、Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎら、２０１０年、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、５巻：ｅ１３７６８頁；Ｍａｉｎｅｓら、２００９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２５巻：４８４頁）。
他の研究者らによる、Ｖｉｅｔ０３＿０４など旧型のヒト単離物にＬＳ変化だけを導入する初期の努力は、スイッチをもたらさず、ＬＳ突然変異に対応しうるＨ５ ＨＡ ＲＢＳの構造的特徴を理解する必要を過小評価した。ｃｋＥｇｙ＿０７＿ＬＳもまた、天然で特徴４を獲得したことを踏まえ、本発明者らは、この特徴だけ、すなわち、ＬＳと併せたグリコシル化の喪失（Ｔ１６０Ａ突然変異を介して達成される）により、Ｖｉｅｔ０３＿０４のグリカン受容体への結合優先性がスイッチされるかどうかを評価した（図２５）。野生型のＨＡであるＶｉｅｔ０３＿０４と比較して、この突然変異体株の用量依存的な直接的グリカン結合は、ヒト受容体への結合を示したが、また、流行性ヒト適応型ＨＡには非特徴的な、その高親和性によるトリ受容体への結合も保持した（図２５）。天然で特徴４を獲得した別の株（Ａ／Ｅｇｙｐｔ／２７８６−ＮＡＭＲＵ３／０６またはＥｇｙ＿０６）にＬＳ変化だけを導入したところ、この観察が確証された。最後に、天然で特徴２を獲得した、代表的なＨ５ ＨＡ（Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｖｉｅｔｎａｍ／ＮＣＶＤ−０９３／０８またはｃｋＶｉｅｔ＿０８）（図２２Ｃ）における突然変異により、ヒト受容体への結合親和性が付与されたが、また、高親和性によるトリ受容体への結合も保持された（図２６）ことは、この構造的枠組みと符合する。
考察
顕著な特徴であるＬＳ残基に適切に対応するのに必要とされる特定の構造的特徴を規定したのは、本発明者らが初めてである。加えて、本発明者らは、現在広く生じている特定のＨ５ ＨＡポリペプチドが、Ｈ５ ＨＡのヒト受容体への優先性をスイッチし、これにより、それらのヒトへの適応をもたらすのに、２カ所のアミノ酸変化、顕著な特徴であるＬＳを要求するのみであることの洞察も提示する。本発明に由来する情報を用いて、本発明者らは、ＬＳ変化だけを組み込むことにより受容体の特異性のスイッチ切換えを施しやすい、適切なＨ５ ＨＡ配列（全Ｈ５Ｎ１ ＨＡのうちの小規模な代表的プールに由来する配列ではあるが）を合理的に選択した。これらの最新型のＨ５ ＨＡポリペプチドの１つの特徴的特性は、それらが、特徴１、２、および４（図２７）を獲得するように天然で進化したことである。特徴１および４を獲得した配列は、ＮＣＢＩデータベースにおける２２７７の非冗長Ｈ５Ｎ１ ＨＡ配列のうちの６％に過ぎないが、しかし、これが、２００９年および２０１０年に単離されたＨ５Ｎ１株のうちの約４５％を表す。Ｈ５Ｎ１ ＨＡについてのさらなる系統解析により、天然で獲得した特徴１および４は、クレード２．２．１に属することが明らかとなる。これまでのところ、特徴１の発生は、クレード２．２．１に限られると考えられるが、しかし、特徴４の存在がクレード２．２．１に制約されるわけではない。クレード２．２．１株は、既に旧型のヒト単離物（Ｖｉｅｔ０３＿０４など）から大幅に分岐しており、これらの旧来の株よりヒトに対して緊密に適応していることが極めて重要である。クレード２．２．１に属する、報告されたヒトＨ５Ｎ１単離物の全ては、エジプトおよびイスラエルに由来する。したがって、クレード２．２．１株の進化をモニタリングすることが重要である。
１２９位における正に荷電した残基（特徴２）を伴う例示的なＨ５Ｎ１株
全てがクレード２．２．１に属する同じＨＡの１３０位における欠失（および１５８位におけるグリコシル化の喪失）（特徴１）を伴う例示的なＨ５Ｎ１株。これらには、以下が含まれるがこれらに限定されない。
材料および方法
ＨＡのクローニング、バキュロウイルスによる合成、発現、および精製
ＷＴのＨ５ ＨＡ配列および突然変異体のＨ５ ＨＡ配列を、昆虫細胞による発現のためにコドン最適化し、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）により合成した。次いで、合成された遺伝子を、ｐＡｃＧＰ６７Ａプラスミドへとサブクローニングし、製造元による指示書に従い、Ｂａｃｕｌｏｇｏｌｄシステム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて、バキュロウイルスを創出した。次いで、ＢＤ Ｂａｃｕｌｏｇｏｌｄ Ｍａｘ−ＸＰ ＳＦＭ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）により培養したＳｆ９細胞の懸濁液培養物に感染させるのに、組換えバキュロウイルスを用いた。感染をモニタリングし、感染の３〜４日後に条件付け培地を採取した。ニッケル親和性クロマトグラフィー（ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて、採取した条件付け培地から可溶性のＨＡを精製した。ＨＡを含有する溶出画分をプールし、１００Ｋ ＭＷＣＯスピンカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて、ｐＨ８．０の１倍濃度ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）へと濃縮および緩衝液交換した。精製されたタンパク質は、ＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて定量化した。
組換えＨＡのヒト気管組織切片への結合
パラフィン包埋したヒト気管（ＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）組織切片を、ＰＢＳ中に１％のＢＳＡで３０分間にわたり脱パラフィン化し、再水和し、インキュベートして、非特異的結合を防止した。ＨＡを、氷上で２０分間にわたり、一次抗体（マウス抗６×Ｈｉｓタグ、Ａｂｃａｍ）および二次抗体（Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗マウス抗体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、それぞれ、４：２：１のモル比であらかじめ複合体化させた。１％のＢＳＡ−ＰＢＳ中であらかじめ複合体化させたＨＡを希釈することにより、異なるＨＡ濃度にわたり組織への結合を実施した。次いで、組織切片を、ＲＴで３時間にわたり、ＨＡ−抗体複合体と共にインキュベートした。組織切片は、ヨウ化プロピジウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＴＢＳＴ中で１：１００）で対比染色した。組織切片をマウントし、次いで共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０レーザー走査共焦点顕微鏡）を用いて造影した。
ＷＴのＨＡおよび突然変異体のＨＡの用量依存的な直接的結合
多価ＨＡ−グリカン間相互作用を探索するため、ビオチニル化した代表的なα２→３シアル化グリカンおよびα２→６シアル化グリカンを含むストレプトアビジンプレートアレイを、既に記載した通りに用いた。３’ＳＬＮ、３’ＳＬＮ−ＬＮ、３’ＳＬＮ−ＬＮ−ＬＮは、代表的なトリ受容体である。６’ＳＬＮおよび６’ＳＬＮ−ＬＮは、代表的なヒト受容体である。ＬＮは、ラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）に対応し、３’ＳＬＮおよび６’ＳＬＮは、それぞれ、ＬＮに結合したＮｅｕ５Ａｃα２−３およびＮｅｕ５Ａｃα２−６に対応する（図２８）。ビオチニル化グリカンは、それらのリソースリクエストプログラムを介して、Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓから得た。ストレプトアビジンでコーティングした高結合能の３８４ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ）で、ウェルを２．４μＭのビオチニル化グリカン５０μｌと共に、４℃で一晩にわたりインキュベートすることにより、各ウェルの容量いっぱいまで投入した。過剰なグリカンは、ＰＢＳによる十分な洗浄を介して除去した。三量体のＨＡ単位は、３つのＨＡ単量体（および、したがって、各単量体につき１つずつである３つのＲＢＳ）を含む。ストレプトアビジンプレートアレイのウェル内のビオチニル化グリカンの空間的配置が好適なのは、三量体のＨＡ単位中の３つのＨＡ単量体のうちのただ１つへの結合である。したがって、ＨＡ−グリカン間相互作用における多価性を特異的に増強するために、組換えＨＡタンパク質を、４：２：１（ＨＡ：一次抗体：二次抗体）のモル比で一次抗体および二次抗体とあらかじめ複合体化させた。プレ複合体中で４つの三量体のＨＡ単位が全てのＨＡについて同一な配置により、それらのグリカン結合親和性の間の比較が可能となる。適量のヒスチジンタグづけしたＨＡタンパク質、一次抗体（Ａｂｃａｍ製のマウス抗６×ＨｉｓタグＩｇＧ）、および二次抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製のＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ）を、４：２：１の比で含有する原液を、氷上で２０分間にわたりインキュベートした。適量のあらかじめ複合体化させたＨＡ原液を、ＰＢＳ中に１％のＢＳＡで２５０μｌへと希釈した。この５０μｌのあらかじめ複合体化させたＨＡを、グリカンでコーティングしたウェルの各々へと添加し、室温で３時間にわたりインキュベートした後、ＰＢＳおよびＰＢＳＴ（１倍濃度のＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）による洗浄ステップを実施した。製造元による指示書に従い、Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ａｓｓａｙキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）を用いて、ＨＲＰ活性に基づき、結合シグナルを決定した。
同等物
当業者は、日常的な実験だけを用いて、本明細書で記載される本発明の実施形態との多くの同等物を認識するかまたはこれらを確認することが可能である。本発明の範囲は、上記の「説明」に限定されることを意図するものではなく、以下の特許請求の範囲に示される通りである。
関連出願の引用
本出願は、１０１０年１０月４日に出願した米国仮出願第６１／３８９，６３９号の利益を主張する。米国仮出願第６１／３８９，６３９号の内容全体は、本明細書中に参考として援用される。
政府援助
本発明は、米国国立衛生研究所により与えられた助成第ＧＭ５７０７３号および同第Ｕ５４ ＧＭ６２１１６号下の政府援助により行った。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
背景
インフルエンザは、大流行、流行、再流行、および大発生の長い歴史を有する。Ｈ５Ｎ１株を含めたトリインフルエンザは、高度に接触伝染性であり潜在的に致死性の病原体であるが、現在のところ、ヒトに感染する能力は限定されたものであるにとどまる。しかし、トリインフルエンザウイルスは歴史的に、その宿主特異性を変化させ、それが容易にヒトに感染することを可能とする、突然変異を累積させることが観察されている。実際、前世紀におけるインフルエンザの主要な大流行のうちの２つは、それらの遺伝子組成を変化させてヒトへの感染を可能とした、トリインフルエンザウイルスに由来していた。
概要
最新型のＨ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ９Ｎ２、およびＨ２Ｎ２のトリインフルエンザ株は、その宿主特異性を変化させ、それが容易にヒトに感染することを可能とする、突然変異を累積させうることが強く憂慮されている。したがって、これらの株におけるＨＡタンパク質が実際に、容易にヒトに感染しうる形態へと転換されうるかどうかを評価することが必要とされており、このような能力を伴うＨＡ変異体（ｖａｒｉａｎｔ）を同定することもさらに必要とされている。異なる被験体、特に、ヒトの感染を可能とするかまたは妨害するＨＡタンパク質の特徴を一般に理解することもさらに必要とされている。また、インフルエンザウイルスにより引き起こされる疾患を有効に処置するか、またはその発症を遅延させるためのワクチンおよび治療戦略も必要とされている。
本発明は、特定のグリカン結合特徴を伴う結合剤を提供する。特に、本発明は、アンブレラ様トポロジーを有するシアル化グリカンに結合する結合剤を提供する。一部の実施形態では、本発明による結合剤が、高度な親和性および／または特異性でアンブレラトポロジーグリカンに結合する。一部の実施形態では、本発明による結合剤が、コーントポロジーグリカンと比較して、アンブレラトポロジーグリカンに対する結合優先性を示す。一部の実施形態では、本発明による結合剤が、血球凝集素受容体におけるグリカンへの結合について血球凝集素と競合する。一部の実施形態では、本発明による結合剤が、アンブレラトポロジーグリカンへの結合について血球凝集素と競合する。
本発明はまた、ワクチンを含め、提供される結合剤と関連する診断用試薬および診断法ならびに治療用試薬および治療法も提供する。
本発明は特に、グリコシル化を変化させたＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、またはＨ１６のＨＡポリペプチド変異体）が、基準のＨＡポリペプチドと比較してヒトＨＡ受容体への結合の増大（または減少）を示しうることの認識を包含する。一部の実施形態では、基準のポリペプチドを、以下のうちのいずれかのＨＡポリペプチドとする：
本発明はまた特に、ＨＡのループ領域を変化させたＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、またはＨ１６のＨＡポリペプチド変異体）が、基準のＨＡポリペプチド（例えば、配列番号４３〜５２のうちのいずれかのＨＡポリペプチドを含めた）と比較してヒトＨＡ受容体への結合の増大（または減少）を示しうることの認識も包含する。
一部の実施形態では、本発明が、グリコシル化を変化させたＨ５ ＨＡポリペプチド変異体が、基準のＨＡポリペプチドと比較してヒトＨＡ受容体への結合の増大（または減少）を示しうることの認識を包含する。一部の実施形態では、基準のポリペプチドを、以下のうちのいずれかのＨＡポリペプチドとする：
本発明はまた特に、ＨＡのループ領域を変化させたＨ５ ＨＡポリペプチド変異体が、基準のＨＡポリペプチド（例えば、配列番号５０、５１、および５３〜５５のうちのいずれかのＨＡポリペプチドを含めた）と比較してヒトＨＡ受容体への結合の増大（または減少）を示しうることの認識も包含する。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
基準のＨ５ ＨＡポリペプチド配列のアミノ酸配列と、残基１３０、１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、２２８、およびこれらの組合せからなる群から選択される残基のうちの１またはそれより多くで異なるアミノ酸配列を有するＨ５ ＨＡポリペプチドを含む結合剤
を含む医薬組成物。
（項目２）
前記結合剤が、アンブレラトポロジーグリカンとＨＡポリペプチドとの間でのグリカン−ＨＡポリペプチド相互作用と競合する、項目１に記載の医薬組成物。
（項目３）
前記Ｈ５ ＨＡポリペプチドの長さが１９〜５５アミノ酸の範囲にある、項目１に記載の医薬組成物。
（項目４）
前記Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、長さが少なくとも１９アミノ酸である部分を包含するアミノ酸配列を有し、配列番号５０、５１、５３、５４、または５５からなる群から選択されるＨ５ ＨＡポリペプチドの対応する部分と少なくとも９５％の配列全体の同一性を示す、項目１に記載の医薬組成物。
（項目５）
前記Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、アミノ酸１〜５５に対応する領域にわたり、配列番号５０、５１、５３、５４、または５５からなる群から選択される基準のＨ５ ＨＡと少なくとも９５％の同一性を示すアミノ酸配列を有するが、前記基準のＨＡのアミノ酸配列と、残基１３０、１９２、１９３、およびこれらの組合せからなる群から選択される１またはそれより多くの残基が異なる、項目１に記載の医薬組成物。
（項目６）
前記Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、アミノ酸１〜５５に対応する領域にわたり、配列番号５０、５１、５３、５４、または５５からなる群から選択される基準のＨ５ ＨＡと少なくとも９５％の同一性を示すアミノ酸配列を有するが、前記基準のＨＡのアミノ酸配列と、残基１２８〜１３７、およびこれらの組合せからなる群から選択される１またはそれより多くの残基が異なる、項目１に記載の医薬組成物。
（項目７）
前記Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、アミノ酸１〜５５に対応する領域にわたり、配列番号５０、５１、５３、５４、または５５からなる群から選択される基準のＨ５ ＨＡと少なくとも９５％の同一性を示すアミノ酸配列を有するが、前記基準のＨＡのアミノ酸配列と、アミノ酸残基１３０の欠失が存在することにより異なる、項目１に記載の医薬組成物。
（項目８）
前記Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、アミノ酸１〜５５に対応する領域にわたり、配列番号５０、５１、５３、５４、または５５からなる群から選択される基準のＨ５ ＨＡと少なくとも９５％の同一性を示すアミノ酸配列を有するが、前記基準のＨＡのアミノ酸配列と、残基１６０、２２６、２２８、およびこれらの組合せからなる群から選択される１またはそれより多くの残基が異なる、項目１に記載の医薬組成物。
（項目９）
前記Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、アミノ酸１〜５５に対応する領域にわたり、配列番号５０、５１、５３、５４、または５５からなる群から選択される基準のＨ５ ＨＡと少なくとも９５％の同一性を示すアミノ酸配列を有するが、前記基準のＨＡのアミノ酸配列と、残基１５８、２２６、２２８、およびこれらの組合せからなる群から選択される１またはそれより多くの残基が異なる、項目１に記載の医薬組成物。
（項目１０）
前記アンブレラトポロジーグリカンが、長鎖α２−６シアル化グリカンを含む、項目２に記載の医薬組成物。
（項目１１）
前記長鎖α２−６シアル化グリカンが、


からなる群から選択される、項目１０に記載の医薬組成物。
（項目１２）
前記結合剤が、アンブレラトポロジーグリカンに、同等の条件下でヒトの感染を媒介する野生型のＨＡについて観察される親和性の少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の親和性で結合する、項目２に記載の医薬組成物。
（項目１３）
前記結合剤が、アンブレラトポロジーグリカンに、コーントポロジーグリカンに結合するより強力に結合する、項目２に記載の医薬組成物。
（項目１４）
前記結合剤が、アンブレラトポロジーグリカン対コーントポロジーグリカンについて少なくとも２の相対的親和性を示す、項目２に記載の医薬組成物。
（項目１５）
前記結合剤が、アンブレラトポロジーグリカン対コーントポロジーグリカンについて少なくとも５の相対的親和性を示す、項目２に記載の医薬組成物。
（項目１６）
前記結合剤が、アンブレラトポロジーグリカン対コーントポロジーグリカンについて少なくとも１０の相対的親和性を示す、項目２に記載の医薬組成物。
（項目１７）
前記相互作用が、前記ＨＡポリペプチドと、ヒト上気道上皮細胞、気管支、気管、または肺深部において見出される受容体との間で生じる、項目２に記載の医薬組成物。
（項目１８）
アンブレラトポロジーグリカンとＨＡポリペプチドとの間のグリカン−ＨＡポリペプチド相互作用と競合する結合剤
を含むワクチン組成物であって、
前記ワクチンが、任意のＨ５インフルエンザウイルスに対して広く防御的であるワクチン組成物。
（項目１９）
前記Ｈ５インフルエンザウイルスが、ヒト適応型Ｈ５ウイルスまたはトリ適応型Ｈ５ウイルスである、項目１８に記載のワクチン組成物。
（項目２０）
前記適応型Ｈ５ウイルスが、基準のＨ５ ＨＡポリペプチド配列と、残基１３０、１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、２２８、およびこれらの組合せからなる群から選択される残基のうちの１またはそれより多くで異なるＨ５ ＨＡポリペプチド配列を含む、項目１９に記載のワクチン組成物。
（項目２１）
被験体においてＨ５インフルエンザウイルスのアンブレラトポロジーを有する血球凝集素受容体への結合を阻害するか、アンブレラトポロジーを有する血球凝集素受容体に結合するインフルエンザウイルスによる被験体の感染の危険性を最小化するか、または被験体を処置する方法であって、
インフルエンザウイルスによる感染に対して感受性であるかまたはこれを患っている被験体を同定するステップと、
アンブレラトポロジーグリカンとＨＡポリペプチドとのグリカン−ＨＡポリペプチド間相互作用と競合する結合剤を選択するステップと、
前記ウイルスによるアンブレラトポロジーグリカンを有する血球凝集素受容体への結合を低減するか、前記危険性を最小化するか、または前記患者を処置するように、有効量の前記結合剤を投与するステップと
を含む方法。
（項目２２）
前記結合剤が、基準のＨ５ ＨＡポリペプチド配列と、残基１３０、１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、２２８、およびこれらの組合せからなる群から選択される残基のうちの１またはそれより多くでＨ５ ＨＡポリペプチド配列を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記選択するステップが、結合剤を、前記結合剤がアンブレラトポロジーグリカンを有する血球凝集素受容体に結合することが可能であることに基づいて選択することを包含する、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
前記結合剤がＬＳＢＡである、項目２１に記載の方法。
（項目２５）
前記結合剤がＵＴＢＡである、項目２１に記載の方法。
（項目２６）
前記結合剤がＵＴＳＢＡである、項目２１に記載の方法。
（項目２７）
前記ＵＴＳＢＡを、前記ウイルスへの曝露前に前記被験体に投与する、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記ＵＴＳＢＡを、前記ウイルスへの曝露後に前記被験体に投与する、項目２６に記載の方法。
（項目２９）
投与する量が、前記被験体のアンブレラトポロジーグリカンを含有するＨＡ受容体を飽和させるのに十分である、項目２１に記載の方法。
（項目３０）
前記ＵＴＳＢＡを、吸入により投与する、項目２６に記載の方法。
（項目３１）
前記ＵＴＳＢＡが、抗体、レクチン、アプタマー、および非ＨＡポリペプチドからなる群から選択される、項目２６に記載の方法。
（項目３２）
前記ＵＴＳＢＡを、第２の治療剤の投与と組み合わせて投与する、項目２６に記載の方法。
（項目３３）
前記第２の治療剤が抗ウイルス剤である、項目３２に記載の方法。
図１Ａ〜１Ｃは、野生型のＨＡの例示的な配列アライメントを示す図である。配列は、ＮＣＢＩによるインフルエンザウイルスの配列データベースから得た。

図１Ａ〜１Ｃは、野生型のＨＡの例示的な配列アライメントを示す図である。配列は、ＮＣＢＩによるインフルエンザウイルスの配列データベースから得た。

図１Ａ〜１Ｃは、野生型のＨＡの例示的な配列アライメントを示す図である。配列は、ＮＣＢＩによるインフルエンザウイルスの配列データベースから得た。

図２Ａ〜Ｂは、ＨＡグリカン結合ドメインの配列アライメントを示す図である。グレー：シアル酸への結合に関与している保存的アミノ酸。赤色：Ｎｅｕ５Ａｃα２−３／６Ｇａｌモチーフへの結合に関与している特定のアミノ酸。黄色：Ｑ２２６（１３７、１３８）およびＥ１９０（１８６、２２８）の配置に影響を及ぼすアミノ酸。緑色：Ｎｅｕ５Ａｃα２−３／６Ｇａｌモチーフに結合した他の単糖（または修飾）への結合に関与しているアミノ酸。ＡＳＩ３０、ＡＰＲ３４、ＡＤＵ６３、ＡＤＳ９７、およびＶｉｅｔ０４の配列は、それらの各々の結晶構造から得た。他の配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｕｓ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）から得た。略号：

図２Ａ〜Ｂは、ＨＡグリカン結合ドメインの配列アライメントを示す図である。グレー：シアル酸への結合に関与している保存的アミノ酸。赤色：Ｎｅｕ５Ａｃα２−３／６Ｇａｌモチーフへの結合に関与している特定のアミノ酸。黄色：Ｑ２２６（１３７、１３８）およびＥ１９０（１８６、２２８）の配置に影響を及ぼすアミノ酸。緑色：Ｎｅｕ５Ａｃα２−３／６Ｇａｌモチーフに結合した他の単糖（または修飾）への結合に関与しているアミノ酸。ＡＳＩ３０、ＡＰＲ３４、ＡＤＵ６３、ＡＤＳ９７、およびＶｉｅｔ０４の配列は、それらの各々の結晶構造から得た。他の配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｕｓ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）から得た。略号：

図３は、Ｈ１ ＨＡの保存的部分配列の特徴を例示する配列アライメントを示す図である。図３Ａは、図３Ａがさらなる保存的部分配列の存在を示すことを除き、図１Ａに提示された同じアライメントを示す図である。図３Ｂは、図３Ａがさらなる保存的部分配列の存在を示すことを除き、図１Ｃに提示された同じアライメントを示す図である。 図３は、Ｈ１ ＨＡの保存的部分配列の特徴を例示する配列アライメントを示す図である。図３Ａは、図３Ａがさらなる保存的部分配列の存在を示すことを除き、図１Ａに提示された同じアライメントを示す図である。図３Ｂは、図３Ａがさらなる保存的部分配列の存在を示すことを除き、図１Ｃに提示された同じアライメントを示す図である。 図４は、Ｈ３ ＨＡの保存的部分配列の特徴を例示する配列アライメントを示す図である。図４Ａは、図４Ａがさらなる保存的部分配列の存在を示すことを除き、図１Ａに提示された同じアライメントを示す図である。図４Ｂは、図４Ａがさらなる保存的部分配列の存在を示すことを除き、図１Ｃに提示された同じアライメントを示す図である。 図４は、Ｈ３ ＨＡの保存的部分配列の特徴を例示する配列アライメントを示す図である。図４Ａは、図４Ａがさらなる保存的部分配列の存在を示すことを除き、図１Ａに提示された同じアライメントを示す図である。図４Ｂは、図４Ｂがさらなる保存的部分配列の存在を示すことを除き、図１Ｃに提示された同じアライメントを示す図である。 図５Ａ−１は、Ｈ５ ＨＡの保存的部分配列の特徴を例示する配列アライメントを示す図である。図５Ａ−１は、図５Ａ−１がさらなる保存的部分配列の存在を示すことを除き、図１Ａに提示された同じアライメントを示す図である。 図５Ａ−２は、図５Ａ−２がさらなる保存的部分配列の存在を示すことを除き、図１Ｃに提示された同じアライメントを示す図である。 図５Ｂ１〜Ｂ５は、さらなるＨ５ ＨＡの配列アライメントを示す図である。

図５Ｂ１〜Ｂ５は、さらなるＨ５ ＨＡの配列アライメントを示す図である。

図５Ｂ１〜Ｂ５は、さらなるＨ５ ＨＡの配列アライメントを示す図である。

図５Ｂ１〜Ｂ５は、さらなるＨ５ ＨＡの配列アライメントを示す図である。

図５Ｂ１〜Ｂ５は、さらなるＨ５ ＨＡの配列アライメントを示す図である。

図５Ｂ−６は、さらなるトリ４型（ＨＡ）Ｈ５Ｎ１ウイルス株を示す図である。 図６は、グリカン受容体の特異性を理解するための枠組みを示す図である。α２−３結合グリカンおよび／またはα２−６結合グリカンは、異なるトポロジーを取ることが可能である。本発明によれば、ＨＡポリペプチドがこれらのトポロジーのうちの特定のトポロジーに結合する能力により、このＨＡポリペプチドに異なる宿主、例えば、ヒトの感染を媒介する能力が付与される。この図のパネルＡで例示される通り、本発明は、２つの特に関連するトポロジーである「コーン」トポロジーおよび「アンブレラ」トポロジーを規定する。コーントポロジーは、α２−３結合グリカンおよび／またはα２−６結合グリカンが取りうるトポロジーであり、コアに結合した短鎖オリゴ糖または分枝状オリゴ糖に典型的である（特定の長鎖オリゴ糖もこのトポロジーを取りうるが）。アンブレラトポロジーは、α２−６結合グリカンだけが取りうるトポロジーであり（おそらく、α２−６結合において存在するさらなるＣ５−Ｃ６間結合により付与される、立体配座的な複数性が増大するために）、特にモチーフＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃ−を含有する、長鎖オリゴ糖または長鎖オリゴ糖分枝を伴う分枝状グリカンが主に取るトポロジーである。本明細書で記載される、ＨＡポリペプチドがアンブレラグリカントポロジーに結合する能力により、ヒト受容体への結合および／またはヒトの感染を媒介する能力が付与される。この図のパネルＢは、三糖モチーフ（それぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃおよびＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）のグリコシドのねじれ角により統御されるα２−３トポロジーおよびα２−６トポロジーを特異的に示す図である。パラメータ（θ）（これらの三糖モチーフにおけるＮｅｕ５ＡｃのＣ２原子と後続のＧａｌ糖およびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角）を、トポロジーを特徴付けるものとして規定した。θの外形と、α２−３モチーフおよびα２−６モチーフの立体配座マップとを重ね合わせることにより、α２−３モチーフは１００％のコーン様トポロジーを取り、α２−６モチーフはコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングすることが示される（パネルＣ）。α２−３およびα２−６によりサンプリングされるコーン様トポロジーでは、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖が、コーンを張り渡す領域に沿って配置される。ＨＡのコーン様トポロジーとの相互作用は主に、番号付けされた位置（Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づく）におけるアミノ酸の、Ｎｅｕ５Ａｃ糖およびＧａｌ糖との接触を伴う。他方、α２−６に固有のアンブレラ様トポロジーでは、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖が、ＨＡとの結合部位（ＨＡ−α２−６共結晶構造において観察される）の方へと屈曲する。糖内のファンデルワールス力によるＧｌｃＮＡｃのアセチル基とＮｅｕ５Ａｃのアセチル基との間の接触を介して安定化するので、長鎖のα２−６オリゴ糖（例えば、少なくとも四糖）には、この立体配座が好適であろう。ＨＡのアンブレラ様トポロジーとの相互作用は、番号付けされた位置（Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づく）におけるアミノ酸の、Ｎｅｕ５Ａｃ糖およびＧａｌ糖との接触に加えて、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖との接触も伴う。この図のパネルＣは、α２−３およびα２−６によるコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの立体配座サンプリングを示す図である。断面（Ａ）〜（Ｄ）はそれぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ結合、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ結合、およびＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ結合の立体配座（φ，ψ）マップを示す。ＧｌｙｃｏＭａｐｓ ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ／ｍｏｄｅｌｉｎｇ／ｇｌｙｃｏｍａｐｓｄｂ／）から得られるこれらのマップは、ＭＭ３の力の場を用いるアブイニシオのＭＤシミュレーションを用いて発生させた。エネルギー分布は、暗色（最高のエネルギーを表す）〜最低のエネルギーを表す明色にわたる色彩でコードする。丸で囲われた領域１〜５は、ＨＡ−グリカン共結晶構造におけるα２−３オリゴ糖およびα２−６オリゴ糖について観察される（φ，ψ）値を表す。ＨＡ結合ポケットでは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌのトランス立体配座（丸で囲われた領域１）が、この立体配座をゴーシュ配座（丸で囲われた領域２）とする、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８ Ｈ３Ｎ２ ＨＡの、α２−３との共結晶構造を例外として、優勢である。他方、ＨＡ結合ポケットでは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌのシス立体配座（丸で囲われた領域３）が優勢である。コーン様トポロジーは、丸で囲われた領域１および２によりサンプリングされ、アンブレラ様トポロジーは、丸で囲われた領域３によりサンプリングされる。断面（Ｅ）〜（Ｆ）は、それぞれ、α２−３モチーフおよびα２−６モチーフによる、コーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーのサンプリングを示す。立体配座マップにおける暗色領域は、所与の（φ，ψ）値のセットについてθパラメータ（Ｎｅｕ５ＡｃのＣ２原子と後続のＧａｌ糖およびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角）を計算するための外側境界として用いた。エネルギーカットオフに基づき、θ＞１１０°の値を用いてコーン様トポロジーを特徴付け、θ＜１００°の値を用いてアンブレラ様トポロジーを特徴付けた。θの外形を立体配座エネルギーマップと重ね合わせることにより、α２−３モチーフは、アンブレラ様トポロジーを取るにはエネルギー的に好適ではないので、１００％コーン様トポロジーを取ることが示された。他方、α２−６モチーフは、コーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングし、このサンプリングを、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合のω角（Ｏ−Ｃ６−Ｃ５−Ｈ５）に基づいて分類した。 図６は、グリカン受容体の特異性を理解するための枠組みを示す図である。α２−３結合グリカンおよび／またはα２−６結合グリカンは、異なるトポロジーを取ることが可能である。本発明によれば、ＨＡポリペプチドがこれらのトポロジーのうちの特定のトポロジーに結合する能力により、このＨＡポリペプチドに異なる宿主、例えば、ヒトの感染を媒介する能力が付与される。この図のパネルＡで例示される通り、本発明は、２つの特に関連するトポロジーである「コーン」トポロジーおよび「アンブレラ」トポロジーを規定する。コーントポロジーは、α２−３結合グリカンおよび／またはα２−６結合グリカンが取りうるトポロジーであり、コアに結合した短鎖オリゴ糖または分枝状オリゴ糖に典型的である（特定の長鎖オリゴ糖もこのトポロジーを取りうるが）。アンブレラトポロジーは、α２−６結合グリカンだけが取りうるトポロジーであり（おそらく、α２−６結合において存在するさらなるＣ５−Ｃ６間結合により付与される、立体配座的な複数性が増大するために）、特にモチーフＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃ−を含有する、長鎖オリゴ糖または長鎖オリゴ糖分枝を伴う分枝状グリカンが主に取るトポロジーである。本明細書で記載される、ＨＡポリペプチドがアンブレラグリカントポロジーに結合する能力により、ヒト受容体への結合および／またはヒトの感染を媒介する能力が付与される。この図のパネルＢは、三糖モチーフ（それぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃおよびＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）のグリコシドのねじれ角により統御されるα２−３トポロジーおよびα２−６トポロジーを特異的に示す図である。パラメータ（θ）（これらの三糖モチーフにおけるＮｅｕ５ＡｃのＣ２原子と後続のＧａｌ糖およびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角）を、トポロジーを特徴付けるものとして規定した。θの外形と、α２−３モチーフおよびα２−６モチーフの立体配座マップとを重ね合わせることにより、α２−３モチーフは１００％のコーン様トポロジーを取り、α２−６モチーフはコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングすることが示される（パネルＣ）。α２−３およびα２−６によりサンプリングされるコーン様トポロジーでは、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖が、コーンを張り渡す領域に沿って配置される。ＨＡのコーン様トポロジーとの相互作用は主に、番号付けされた位置（Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づく）におけるアミノ酸の、Ｎｅｕ５Ａｃ糖およびＧａｌ糖との接触を伴う。他方、α２−６に固有のアンブレラ様トポロジーでは、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖が、ＨＡとの結合部位（ＨＡ−α２−６共結晶構造において観察される）の方へと屈曲する。糖内のファンデルワールス力によるＧｌｃＮＡｃのアセチル基とＮｅｕ５Ａｃのアセチル基との間の接触を介して安定化するので、長鎖のα２−６オリゴ糖（例えば、少なくとも四糖）には、この立体配座が好適であろう。ＨＡのアンブレラ様トポロジーとの相互作用は、番号付けされた位置（Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づく）におけるアミノ酸の、Ｎｅｕ５Ａｃ糖およびＧａｌ糖との接触に加えて、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖との接触も伴う。この図のパネルＣは、α２−３およびα２−６によるコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの立体配座サンプリングを示す図である。断面（Ａ）〜（Ｄ）はそれぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ結合、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ結合、およびＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ結合の立体配座（φ，ψ）マップを示す。ＧｌｙｃｏＭａｐｓ ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ／ｍｏｄｅｌｉｎｇ／ｇｌｙｃｏｍａｐｓｄｂ／）から得られるこれらのマップは、ＭＭ３の力の場を用いるアブイニシオのＭＤシミュレーションを用いて発生させた。エネルギー分布は、暗色（最高のエネルギーを表す）〜最低のエネルギーを表す明色にわたる色彩でコードする。丸で囲われた領域１〜５は、ＨＡ−グリカン共結晶構造におけるα２−３オリゴ糖およびα２−６オリゴ糖について観察される（φ，ψ）値を表す。ＨＡ結合ポケットでは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌのトランス立体配座（丸で囲われた領域１）が、この立体配座をゴーシュ配座（丸で囲われた領域２）とする、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８ Ｈ３Ｎ２ ＨＡの、α２−３との共結晶構造を例外として、優勢である。他方、ＨＡ結合ポケットでは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌのシス立体配座（丸で囲われた領域３）が優勢である。コーン様トポロジーは、丸で囲われた領域１および２によりサンプリングされ、アンブレラ様トポロジーは、丸で囲われた領域３によりサンプリングされる。断面（Ｅ）〜（Ｆ）は、それぞれ、α２−３モチーフおよびα２−６モチーフによる、コーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーのサンプリングを示す。立体配座マップにおける暗色領域は、所与の（φ，ψ）値のセットについてθパラメータ（Ｎｅｕ５ＡｃのＣ２原子と後続のＧａｌ糖およびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角）を計算するための外側境界として用いた。エネルギーカットオフに基づき、θ＞１１０°の値を用いてコーン様トポロジーを特徴付け、θ＜１００°の値を用いてアンブレラ様トポロジーを特徴付けた。θの外形を立体配座エネルギーマップと重ね合わせることにより、α２−３モチーフは、アンブレラ様トポロジーを取るにはエネルギー的に好適ではないので、１００％コーン様トポロジーを取ることが示された。他方、α２−６モチーフは、コーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングし、このサンプリングを、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合のω角（Ｏ−Ｃ６−Ｃ５−Ｈ５）に基づいて分類した。 図６は、グリカン受容体の特異性を理解するための枠組みを示す図である。α２−３結合グリカンおよび／またはα２−６結合グリカンは、異なるトポロジーを取ることが可能である。本発明によれば、ＨＡポリペプチドがこれらのトポロジーのうちの特定のトポロジーに結合する能力により、このＨＡポリペプチドに異なる宿主、例えば、ヒトの感染を媒介する能力が付与される。この図のパネルＡで例示される通り、本発明は、２つの特に関連するトポロジーである「コーン」トポロジーおよび「アンブレラ」トポロジーを規定する。コーントポロジーは、α２−３結合グリカンおよび／またはα２−６結合グリカンが取りうるトポロジーであり、コアに結合した短鎖オリゴ糖または分枝状オリゴ糖に典型的である（特定の長鎖オリゴ糖もこのトポロジーを取りうるが）。アンブレラトポロジーは、α２−６結合グリカンだけが取りうるトポロジーであり（おそらく、α２−６結合において存在するさらなるＣ５−Ｃ６間結合により付与される、立体配座的な複数性が増大するために）、特にモチーフＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃ−を含有する、長鎖オリゴ糖または長鎖オリゴ糖分枝を伴う分枝状グリカンが主に取るトポロジーである。本明細書で記載される、ＨＡポリペプチドがアンブレラグリカントポロジーに結合する能力により、ヒト受容体への結合および／またはヒトの感染を媒介する能力が付与される。この図のパネルＢは、三糖モチーフ（それぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃおよびＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）のグリコシドのねじれ角により統御されるα２−３トポロジーおよびα２−６トポロジーを特異的に示す図である。パラメータ（θ）（これらの三糖モチーフにおけるＮｅｕ５ＡｃのＣ２原子と後続のＧａｌ糖およびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角）を、トポロジーを特徴付けるものとして規定した。θの外形と、α２−３モチーフおよびα２−６モチーフの立体配座マップとを重ね合わせることにより、α２−３モチーフは１００％のコーン様トポロジーを取り、α２−６モチーフはコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングすることが示される（パネルＣ）。α２−３およびα２−６によりサンプリングされるコーン様トポロジーでは、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖が、コーンを張り渡す領域に沿って配置される。ＨＡのコーン様トポロジーとの相互作用は主に、番号付けされた位置（Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づく）におけるアミノ酸の、Ｎｅｕ５Ａｃ糖およびＧａｌ糖との接触を伴う。他方、α２−６に固有のアンブレラ様トポロジーでは、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖が、ＨＡとの結合部位（ＨＡ−α２−６共結晶構造において観察される）の方へと屈曲する。糖内のファンデルワールス力によるＧｌｃＮＡｃのアセチル基とＮｅｕ５Ａｃのアセチル基との間の接触を介して安定化するので、長鎖のα２−６オリゴ糖（例えば、少なくとも四糖）には、この立体配座が好適であろう。ＨＡのアンブレラ様トポロジーとの相互作用は、番号付けされた位置（Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づく）におけるアミノ酸の、Ｎｅｕ５Ａｃ糖およびＧａｌ糖との接触に加えて、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖との接触も伴う。この図のパネルＣは、α２−３およびα２−６によるコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの立体配座サンプリングを示す図である。断面（Ａ）〜（Ｄ）はそれぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ結合、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ結合、およびＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ結合の立体配座（φ，ψ）マップを示す。ＧｌｙｃｏＭａｐｓ ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ／ｍｏｄｅｌｉｎｇ／ｇｌｙｃｏｍａｐｓｄｂ／）から得られるこれらのマップは、ＭＭ３の力の場を用いるアブイニシオのＭＤシミュレーションを用いて発生させた。エネルギー分布は、暗色（最高のエネルギーを表す）〜最低のエネルギーを表す明色にわたる色彩でコードする。丸で囲われた領域１〜５は、ＨＡ−グリカン共結晶構造におけるα２−３オリゴ糖およびα２−６オリゴ糖について観察される（φ，ψ）値を表す。ＨＡ結合ポケットでは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌのトランス立体配座（丸で囲われた領域１）が、この立体配座をゴーシュ配座（丸で囲われた領域２）とする、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８ Ｈ３Ｎ２ ＨＡの、α２−３との共結晶構造を例外として、優勢である。他方、ＨＡ結合ポケットでは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌのシス立体配座（丸で囲われた領域３）が優勢である。コーン様トポロジーは、丸で囲われた領域１および２によりサンプリングされ、アンブレラ様トポロジーは、丸で囲われた領域３によりサンプリングされる。断面（Ｅ）〜（Ｆ）は、それぞれ、α２−３モチーフおよびα２−６モチーフによる、コーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーのサンプリングを示す。立体配座マップにおける暗色領域は、所与の（φ，ψ）値のセットについてθパラメータ（Ｎｅｕ５ＡｃのＣ２原子と後続のＧａｌ糖およびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角）を計算するための外側境界として用いた。エネルギーカットオフに基づき、θ＞１１０°の値を用いてコーン様トポロジーを特徴付け、θ＜１００°の値を用いてアンブレラ様トポロジーを特徴付けた。θの外形を立体配座エネルギーマップと重ね合わせることにより、α２−３モチーフは、アンブレラ様トポロジーを取るにはエネルギー的に好適ではないので、１００％コーン様トポロジーを取ることが示された。他方、α２−６モチーフは、コーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングし、このサンプリングを、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合のω角（Ｏ−Ｃ６−Ｃ５−Ｈ５）に基づいて分類した。 図６は、グリカン受容体の特異性を理解するための枠組みを示す図である。α２−３結合グリカンおよび／またはα２−６結合グリカンは、異なるトポロジーを取ることが可能である。本発明によれば、ＨＡポリペプチドがこれらのトポロジーのうちの特定のトポロジーに結合する能力により、このＨＡポリペプチドに異なる宿主、例えば、ヒトの感染を媒介する能力が付与される。この図のパネルＡで例示される通り、本発明は、２つの特に関連するトポロジーである「コーン」トポロジーおよび「アンブレラ」トポロジーを規定する。コーントポロジーは、α２−３結合グリカンおよび／またはα２−６結合グリカンが取りうるトポロジーであり、コアに結合した短鎖オリゴ糖または分枝状オリゴ糖に典型的である（特定の長鎖オリゴ糖もこのトポロジーを取りうるが）。アンブレラトポロジーは、α２−６結合グリカンだけが取りうるトポロジーであり（おそらく、α２−６結合において存在するさらなるＣ５−Ｃ６間結合により付与される、立体配座的な複数性が増大するために）、特にモチーフＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃ−を含有する、長鎖オリゴ糖または長鎖オリゴ糖分枝を伴う分枝状グリカンが主に取るトポロジーである。本明細書で記載される、ＨＡポリペプチドがアンブレラグリカントポロジーに結合する能力により、ヒト受容体への結合および／またはヒトの感染を媒介する能力が付与される。この図のパネルＢは、三糖モチーフ（それぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃおよびＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）のグリコシドのねじれ角により統御されるα２−３トポロジーおよびα２−６トポロジーを特異的に示す図である。パラメータ（θ）（これらの三糖モチーフにおけるＮｅｕ５ＡｃのＣ２原子と後続のＧａｌ糖およびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角）を、トポロジーを特徴付けるものとして規定した。θの外形と、α２−３モチーフおよびα２−６モチーフの立体配座マップとを重ね合わせることにより、α２−３モチーフは１００％のコーン様トポロジーを取り、α２−６モチーフはコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングすることが示される（パネルＣ）。α２−３およびα２−６によりサンプリングされるコーン様トポロジーでは、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖が、コーンを張り渡す領域に沿って配置される。ＨＡのコーン様トポロジーとの相互作用は主に、番号付けされた位置（Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づく）におけるアミノ酸の、Ｎｅｕ５Ａｃ糖およびＧａｌ糖との接触を伴う。他方、α２−６に固有のアンブレラ様トポロジーでは、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖が、ＨＡとの結合部位（ＨＡ−α２−６共結晶構造において観察される）の方へと屈曲する。糖内のファンデルワールス力によるＧｌｃＮＡｃのアセチル基とＮｅｕ５Ａｃのアセチル基との間の接触を介して安定化するので、長鎖のα２−６オリゴ糖（例えば、少なくとも四糖）には、この立体配座が好適であろう。ＨＡのアンブレラ様トポロジーとの相互作用は、番号付けされた位置（Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づく）におけるアミノ酸の、Ｎｅｕ５Ａｃ糖およびＧａｌ糖との接触に加えて、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖との接触も伴う。この図のパネルＣは、α２−３およびα２−６によるコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの立体配座サンプリングを示す図である。断面（Ａ）〜（Ｄ）はそれぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ結合、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ結合、およびＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ結合の立体配座（φ，ψ）マップを示す。ＧｌｙｃｏＭａｐｓ ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ／ｍｏｄｅｌｉｎｇ／ｇｌｙｃｏｍａｐｓｄｂ／）から得られるこれらのマップは、ＭＭ３の力の場を用いるアブイニシオのＭＤシミュレーションを用いて発生させた。エネルギー分布は、暗色（最高のエネルギーを表す）〜最低のエネルギーを表す明色にわたる色彩でコードする。丸で囲われた領域１〜５は、ＨＡ−グリカン共結晶構造におけるα２−３オリゴ糖およびα２−６オリゴ糖について観察される（φ，ψ）値を表す。ＨＡ結合ポケットでは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌのトランス立体配座（丸で囲われた領域１）が、この立体配座をゴーシュ配座（丸で囲われた領域２）とする、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８ Ｈ３Ｎ２ ＨＡの、α２−３との共結晶構造を例外として、優勢である。他方、ＨＡ結合ポケットでは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌのシス立体配座（丸で囲われた領域３）が優勢である。コーン様トポロジーは、丸で囲われた領域１および２によりサンプリングされ、アンブレラ様トポロジーは、丸で囲われた領域３によりサンプリングされる。断面（Ｅ）〜（Ｆ）は、それぞれ、α２−３モチーフおよびα２−６モチーフによる、コーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーのサンプリングを示す。立体配座マップにおける暗色領域は、所与の（φ，ψ）値のセットについてθパラメータ（Ｎｅｕ５ＡｃのＣ２原子と後続のＧａｌ糖およびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角）を計算するための外側境界として用いた。エネルギーカットオフに基づき、θ＞１１０°の値を用いてコーン様トポロジーを特徴付け、θ＜１００°の値を用いてアンブレラ様トポロジーを特徴付けた。θの外形を立体配座エネルギーマップと重ね合わせることにより、α２−３モチーフは、アンブレラ様トポロジーを取るにはエネルギー的に好適ではないので、１００％コーン様トポロジーを取ることが示された。他方、α２−６モチーフは、コーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングし、このサンプリングを、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合のω角（Ｏ−Ｃ６−Ｃ５−Ｈ５）に基づいて分類した。 図６は、グリカン受容体の特異性を理解するための枠組みを示す図である。α２−３結合グリカンおよび／またはα２−６結合グリカンは、異なるトポロジーを取ることが可能である。本発明によれば、ＨＡポリペプチドがこれらのトポロジーのうちの特定のトポロジーに結合する能力により、このＨＡポリペプチドに異なる宿主、例えば、ヒトの感染を媒介する能力が付与される。この図のパネルＡで例示される通り、本発明は、２つの特に関連するトポロジーである「コーン」トポロジーおよび「アンブレラ」トポロジーを規定する。コーントポロジーは、α２−３結合グリカンおよび／またはα２−６結合グリカンが取りうるトポロジーであり、コアに結合した短鎖オリゴ糖または分枝状オリゴ糖に典型的である（特定の長鎖オリゴ糖もこのトポロジーを取りうるが）。アンブレラトポロジーは、α２−６結合グリカンだけが取りうるトポロジーであり（おそらく、α２−６結合において存在するさらなるＣ５−Ｃ６間結合により付与される、立体配座的な複数性が増大するために）、特にモチーフＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃ−を含有する、長鎖オリゴ糖または長鎖オリゴ糖分枝を伴う分枝状グリカンが主に取るトポロジーである。本明細書で記載される、ＨＡポリペプチドがアンブレラグリカントポロジーに結合する能力により、ヒト受容体への結合および／またはヒトの感染を媒介する能力が付与される。この図のパネルＢは、三糖モチーフ（それぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃおよびＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）のグリコシドのねじれ角により統御されるα２−３トポロジーおよびα２−６トポロジーを特異的に示す図である。パラメータ（θ）（これらの三糖モチーフにおけるＮｅｕ５ＡｃのＣ２原子と後続のＧａｌ糖およびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角）を、トポロジーを特徴付けるものとして規定した。θの外形と、α２−３モチーフおよびα２−６モチーフの立体配座マップとを重ね合わせることにより、α２−３モチーフは１００％のコーン様トポロジーを取り、α２−６モチーフはコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングすることが示される（パネルＣ）。α２−３およびα２−６によりサンプリングされるコーン様トポロジーでは、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖が、コーンを張り渡す領域に沿って配置される。ＨＡのコーン様トポロジーとの相互作用は主に、番号付けされた位置（Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づく）におけるアミノ酸の、Ｎｅｕ５Ａｃ糖およびＧａｌ糖との接触を伴う。他方、α２−６に固有のアンブレラ様トポロジーでは、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖が、ＨＡとの結合部位（ＨＡ−α２−６共結晶構造において観察される）の方へと屈曲する。糖内のファンデルワールス力によるＧｌｃＮＡｃのアセチル基とＮｅｕ５Ａｃのアセチル基との間の接触を介して安定化するので、長鎖のα２−６オリゴ糖（例えば、少なくとも四糖）には、この立体配座が好適であろう。ＨＡのアンブレラ様トポロジーとの相互作用は、番号付けされた位置（Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づく）におけるアミノ酸の、Ｎｅｕ５Ａｃ糖およびＧａｌ糖との接触に加えて、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖との接触も伴う。この図のパネルＣは、α２−３およびα２−６によるコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの立体配座サンプリングを示す図である。断面（Ａ）〜（Ｄ）はそれぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ結合、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ結合、およびＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ結合の立体配座（φ，ψ）マップを示す。ＧｌｙｃｏＭａｐｓ ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ／ｍｏｄｅｌｉｎｇ／ｇｌｙｃｏｍａｐｓｄｂ／）から得られるこれらのマップは、ＭＭ３の力の場を用いるアブイニシオのＭＤシミュレーションを用いて発生させた。エネルギー分布は、暗色（最高のエネルギーを表す）〜最低のエネルギーを表す明色にわたる色彩でコードする。丸で囲われた領域１〜５は、ＨＡ−グリカン共結晶構造におけるα２−３オリゴ糖およびα２−６オリゴ糖について観察される（φ，ψ）値を表す。ＨＡ結合ポケットでは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌのトランス立体配座（丸で囲われた領域１）が、この立体配座をゴーシュ配座（丸で囲われた領域２）とする、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８ Ｈ３Ｎ２ ＨＡの、α２−３との共結晶構造を例外として、優勢である。他方、ＨＡ結合ポケットでは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌのシス立体配座（丸で囲われた領域３）が優勢である。コーン様トポロジーは、丸で囲われた領域１および２によりサンプリングされ、アンブレラ様トポロジーは、丸で囲われた領域３によりサンプリングされる。断面（Ｅ）〜（Ｆ）は、それぞれ、α２−３モチーフおよびα２−６モチーフによる、コーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーのサンプリングを示す。立体配座マップにおける暗色領域は、所与の（φ，ψ）値のセットについてθパラメータ（Ｎｅｕ５ＡｃのＣ２原子と後続のＧａｌ糖およびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角）を計算するための外側境界として用いた。エネルギーカットオフに基づき、θ＞１１０°の値を用いてコーン様トポロジーを特徴付け、θ＜１００°の値を用いてアンブレラ様トポロジーを特徴付けた。θの外形を立体配座エネルギーマップと重ね合わせることにより、α２−３モチーフは、アンブレラ様トポロジーを取るにはエネルギー的に好適ではないので、１００％コーン様トポロジーを取ることが示された。他方、α２−６モチーフは、コーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングし、このサンプリングを、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合のω角（Ｏ−Ｃ６−Ｃ５−Ｈ５）に基づいて分類した。 図６は、グリカン受容体の特異性を理解するための枠組みを示す図である。α２−３結合グリカンおよび／またはα２−６結合グリカンは、異なるトポロジーを取ることが可能である。本発明によれば、ＨＡポリペプチドがこれらのトポロジーのうちの特定のトポロジーに結合する能力により、このＨＡポリペプチドに異なる宿主、例えば、ヒトの感染を媒介する能力が付与される。この図のパネルＡで例示される通り、本発明は、２つの特に関連するトポロジーである「コーン」トポロジーおよび「アンブレラ」トポロジーを規定する。コーントポロジーは、α２−３結合グリカンおよび／またはα２−６結合グリカンが取りうるトポロジーであり、コアに結合した短鎖オリゴ糖または分枝状オリゴ糖に典型的である（特定の長鎖オリゴ糖もこのトポロジーを取りうるが）。アンブレラトポロジーは、α２−６結合グリカンだけが取りうるトポロジーであり（おそらく、α２−６結合において存在するさらなるＣ５−Ｃ６間結合により付与される、立体配座的な複数性が増大するために）、特にモチーフＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃ−を含有する、長鎖オリゴ糖または長鎖オリゴ糖分枝を伴う分枝状グリカンが主に取るトポロジーである。本明細書で記載される、ＨＡポリペプチドがアンブレラグリカントポロジーに結合する能力により、ヒト受容体への結合および／またはヒトの感染を媒介する能力が付与される。この図のパネルＢは、三糖モチーフ（それぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃおよびＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）のグリコシドのねじれ角により統御されるα２−３トポロジーおよびα２−６トポロジーを特異的に示す図である。パラメータ（θ）（これらの三糖モチーフにおけるＮｅｕ５ＡｃのＣ２原子と後続のＧａｌ糖およびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角）を、トポロジーを特徴付けるものとして規定した。θの外形と、α２−３モチーフおよびα２−６モチーフの立体配座マップとを重ね合わせることにより、α２−３モチーフは１００％のコーン様トポロジーを取り、α２−６モチーフはコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングすることが示される（パネルＣ）。α２−３およびα２−６によりサンプリングされるコーン様トポロジーでは、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖が、コーンを張り渡す領域に沿って配置される。ＨＡのコーン様トポロジーとの相互作用は主に、番号付けされた位置（Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づく）におけるアミノ酸の、Ｎｅｕ５Ａｃ糖およびＧａｌ糖との接触を伴う。他方、α２−６に固有のアンブレラ様トポロジーでは、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖が、ＨＡとの結合部位（ＨＡ−α２−６共結晶構造において観察される）の方へと屈曲する。糖内のファンデルワールス力によるＧｌｃＮＡｃのアセチル基とＮｅｕ５Ａｃのアセチル基との間の接触を介して安定化するので、長鎖のα２−６オリゴ糖（例えば、少なくとも四糖）には、この立体配座が好適であろう。ＨＡのアンブレラ様トポロジーとの相互作用は、番号付けされた位置（Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づく）におけるアミノ酸の、Ｎｅｕ５Ａｃ糖およびＧａｌ糖との接触に加えて、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖との接触も伴う。この図のパネルＣは、α２−３およびα２−６によるコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの立体配座サンプリングを示す図である。断面（Ａ）〜（Ｄ）はそれぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ結合、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ結合、およびＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ結合の立体配座（φ，ψ）マップを示す。ＧｌｙｃｏＭａｐｓ ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ／ｍｏｄｅｌｉｎｇ／ｇｌｙｃｏｍａｐｓｄｂ／）から得られるこれらのマップは、ＭＭ３の力の場を用いるアブイニシオのＭＤシミュレーションを用いて発生させた。エネルギー分布は、暗色（最高のエネルギーを表す）〜最低のエネルギーを表す明色にわたる色彩でコードする。丸で囲われた領域１〜５は、ＨＡ−グリカン共結晶構造におけるα２−３オリゴ糖およびα２−６オリゴ糖について観察される（φ，ψ）値を表す。ＨＡ結合ポケットでは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌのトランス立体配座（丸で囲われた領域１）が、この立体配座をゴーシュ配座（丸で囲われた領域２）とする、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８ Ｈ３Ｎ２ ＨＡの、α２−３との共結晶構造を例外として、優勢である。他方、ＨＡ結合ポケットでは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌのシス立体配座（丸で囲われた領域３）が優勢である。コーン様トポロジーは、丸で囲われた領域１および２によりサンプリングされ、アンブレラ様トポロジーは、丸で囲われた領域３によりサンプリングされる。断面（Ｅ）〜（Ｆ）は、それぞれ、α２−３モチーフおよびα２−６モチーフによる、コーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーのサンプリングを示す。立体配座マップにおける暗色領域は、所与の（φ，ψ）値のセットについてθパラメータ（Ｎｅｕ５ＡｃのＣ２原子と後続のＧａｌ糖およびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角）を計算するための外側境界として用いた。エネルギーカットオフに基づき、θ＞１１０°の値を用いてコーン様トポロジーを特徴付け、θ＜１００°の値を用いてアンブレラ様トポロジーを特徴付けた。θの外形を立体配座エネルギーマップと重ね合わせることにより、α２−３モチーフは、アンブレラ様トポロジーを取るにはエネルギー的に好適ではないので、１００％コーン様トポロジーを取ることが示された。他方、α２−６モチーフは、コーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングし、このサンプリングを、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合のω角（Ｏ−Ｃ６−Ｃ５−Ｈ５）に基づいて分類した。 図６は、グリカン受容体の特異性を理解するための枠組みを示す図である。α２−３結合グリカンおよび／またはα２−６結合グリカンは、異なるトポロジーを取ることが可能である。本発明によれば、ＨＡポリペプチドがこれらのトポロジーのうちの特定のトポロジーに結合する能力により、このＨＡポリペプチドに異なる宿主、例えば、ヒトの感染を媒介する能力が付与される。この図のパネルＡで例示される通り、本発明は、２つの特に関連するトポロジーである「コーン」トポロジーおよび「アンブレラ」トポロジーを規定する。コーントポロジーは、α２−３結合グリカンおよび／またはα２−６結合グリカンが取りうるトポロジーであり、コアに結合した短鎖オリゴ糖または分枝状オリゴ糖に典型的である（特定の長鎖オリゴ糖もこのトポロジーを取りうるが）。アンブレラトポロジーは、α２−６結合グリカンだけが取りうるトポロジーであり（おそらく、α２−６結合において存在するさらなるＣ５−Ｃ６間結合により付与される、立体配座的な複数性が増大するために）、特にモチーフＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃ−を含有する、長鎖オリゴ糖または長鎖オリゴ糖分枝を伴う分枝状グリカンが主に取るトポロジーである。本明細書で記載される、ＨＡポリペプチドがアンブレラグリカントポロジーに結合する能力により、ヒト受容体への結合および／またはヒトの感染を媒介する能力が付与される。この図のパネルＢは、三糖モチーフ（それぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃおよびＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）のグリコシドのねじれ角により統御されるα２−３トポロジーおよびα２−６トポロジーを特異的に示す図である。パラメータ（θ）（これらの三糖モチーフにおけるＮｅｕ５ＡｃのＣ２原子と後続のＧａｌ糖およびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角）を、トポロジーを特徴付けるものとして規定した。θの外形と、α２−３モチーフおよびα２−６モチーフの立体配座マップとを重ね合わせることにより、α２−３モチーフは１００％のコーン様トポロジーを取り、α２−６モチーフはコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングすることが示される（パネルＣ）。α２−３およびα２−６によりサンプリングされるコーン様トポロジーでは、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖が、コーンを張り渡す領域に沿って配置される。ＨＡのコーン様トポロジーとの相互作用は主に、番号付けされた位置（Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づく）におけるアミノ酸の、Ｎｅｕ５Ａｃ糖およびＧａｌ糖との接触を伴う。他方、α２−６に固有のアンブレラ様トポロジーでは、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖が、ＨＡとの結合部位（ＨＡ−α２−６共結晶構造において観察される）の方へと屈曲する。糖内のファンデルワールス力によるＧｌｃＮＡｃのアセチル基とＮｅｕ５Ａｃのアセチル基との間の接触を介して安定化するので、長鎖のα２−６オリゴ糖（例えば、少なくとも四糖）には、この立体配座が好適であろう。ＨＡのアンブレラ様トポロジーとの相互作用は、番号付けされた位置（Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づく）におけるアミノ酸の、Ｎｅｕ５Ａｃ糖およびＧａｌ糖との接触に加えて、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖との接触も伴う。この図のパネルＣは、α２−３およびα２−６によるコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの立体配座サンプリングを示す図である。断面（Ａ）〜（Ｄ）はそれぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ結合、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ結合、およびＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ結合の立体配座（φ，ψ）マップを示す。ＧｌｙｃｏＭａｐｓ ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ／ｍｏｄｅｌｉｎｇ／ｇｌｙｃｏｍａｐｓｄｂ／）から得られるこれらのマップは、ＭＭ３の力の場を用いるアブイニシオのＭＤシミュレーションを用いて発生させた。エネルギー分布は、暗色（最高のエネルギーを表す）〜最低のエネルギーを表す明色にわたる色彩でコードする。丸で囲われた領域１〜５は、ＨＡ−グリカン共結晶構造におけるα２−３オリゴ糖およびα２−６オリゴ糖について観察される（φ，ψ）値を表す。ＨＡ結合ポケットでは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌのトランス立体配座（丸で囲われた領域１）が、この立体配座をゴーシュ配座（丸で囲われた領域２）とする、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８ Ｈ３Ｎ２ ＨＡの、α２−３との共結晶構造を例外として、優勢である。他方、ＨＡ結合ポケットでは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌのシス立体配座（丸で囲われた領域３）が優勢である。コーン様トポロジーは、丸で囲われた領域１および２によりサンプリングされ、アンブレラ様トポロジーは、丸で囲われた領域３によりサンプリングされる。断面（Ｅ）〜（Ｆ）は、それぞれ、α２−３モチーフおよびα２−６モチーフによる、コーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーのサンプリングを示す。立体配座マップにおける暗色領域は、所与の（φ，ψ）値のセットについてθパラメータ（Ｎｅｕ５ＡｃのＣ２原子と後続のＧａｌ糖およびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角）を計算するための外側境界として用いた。エネルギーカットオフに基づき、θ＞１１０°の値を用いてコーン様トポロジーを特徴付け、θ＜１００°の値を用いてアンブレラ様トポロジーを特徴付けた。θの外形を立体配座エネルギーマップと重ね合わせることにより、α２−３モチーフは、アンブレラ様トポロジーを取るにはエネルギー的に好適ではないので、１００％コーン様トポロジーを取ることが示された。他方、α２−６モチーフは、コーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングし、このサンプリングを、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合のω角（Ｏ−Ｃ６−Ｃ５−Ｈ５）に基づいて分類した。 図６は、グリカン受容体の特異性を理解するための枠組みを示す図である。α２−３結合グリカンおよび／またはα２−６結合グリカンは、異なるトポロジーを取ることが可能である。本発明によれば、ＨＡポリペプチドがこれらのトポロジーのうちの特定のトポロジーに結合する能力により、このＨＡポリペプチドに異なる宿主、例えば、ヒトの感染を媒介する能力が付与される。この図のパネルＡで例示される通り、本発明は、２つの特に関連するトポロジーである「コーン」トポロジーおよび「アンブレラ」トポロジーを規定する。コーントポロジーは、α２−３結合グリカンおよび／またはα２−６結合グリカンが取りうるトポロジーであり、コアに結合した短鎖オリゴ糖または分枝状オリゴ糖に典型的である（特定の長鎖オリゴ糖もこのトポロジーを取りうるが）。アンブレラトポロジーは、α２−６結合グリカンだけが取りうるトポロジーであり（おそらく、α２−６結合において存在するさらなるＣ５−Ｃ６間結合により付与される、立体配座的な複数性が増大するために）、特にモチーフＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃ−を含有する、長鎖オリゴ糖または長鎖オリゴ糖分枝を伴う分枝状グリカンが主に取るトポロジーである。本明細書で記載される、ＨＡポリペプチドがアンブレラグリカントポロジーに結合する能力により、ヒト受容体への結合および／またはヒトの感染を媒介する能力が付与される。この図のパネルＢは、三糖モチーフ（それぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃおよびＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）のグリコシドのねじれ角により統御されるα２−３トポロジーおよびα２−６トポロジーを特異的に示す図である。パラメータ（θ）（これらの三糖モチーフにおけるＮｅｕ５ＡｃのＣ２原子と後続のＧａｌ糖およびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角）を、トポロジーを特徴付けるものとして規定した。θの外形と、α２−３モチーフおよびα２−６モチーフの立体配座マップとを重ね合わせることにより、α２−３モチーフは１００％のコーン様トポロジーを取り、α２−６モチーフはコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングすることが示される（パネルＣ）。α２−３およびα２−６によりサンプリングされるコーン様トポロジーでは、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖が、コーンを張り渡す領域に沿って配置される。ＨＡのコーン様トポロジーとの相互作用は主に、番号付けされた位置（Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づく）におけるアミノ酸の、Ｎｅｕ５Ａｃ糖およびＧａｌ糖との接触を伴う。他方、α２−６に固有のアンブレラ様トポロジーでは、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖が、ＨＡとの結合部位（ＨＡ−α２−６共結晶構造において観察される）の方へと屈曲する。糖内のファンデルワールス力によるＧｌｃＮＡｃのアセチル基とＮｅｕ５Ａｃのアセチル基との間の接触を介して安定化するので、長鎖のα２−６オリゴ糖（例えば、少なくとも四糖）には、この立体配座が好適であろう。ＨＡのアンブレラ様トポロジーとの相互作用は、番号付けされた位置（Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づく）におけるアミノ酸の、Ｎｅｕ５Ａｃ糖およびＧａｌ糖との接触に加えて、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖との接触も伴う。この図のパネルＣは、α２−３およびα２−６によるコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの立体配座サンプリングを示す図である。断面（Ａ）〜（Ｄ）はそれぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ結合、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ結合、およびＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ結合の立体配座（φ，ψ）マップを示す。ＧｌｙｃｏＭａｐｓ ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ／ｍｏｄｅｌｉｎｇ／ｇｌｙｃｏｍａｐｓｄｂ／）から得られるこれらのマップは、ＭＭ３の力の場を用いるアブイニシオのＭＤシミュレーションを用いて発生させた。エネルギー分布は、暗色（最高のエネルギーを表す）〜最低のエネルギーを表す明色にわたる色彩でコードする。丸で囲われた領域１〜５は、ＨＡ−グリカン共結晶構造におけるα２−３オリゴ糖およびα２−６オリゴ糖について観察される（φ，ψ）値を表す。ＨＡ結合ポケットでは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌのトランス立体配座（丸で囲われた領域１）が、この立体配座をゴーシュ配座（丸で囲われた領域２）とする、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８ Ｈ３Ｎ２ ＨＡの、α２−３との共結晶構造を例外として、優勢である。他方、ＨＡ結合ポケットでは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌのシス立体配座（丸で囲われた領域３）が優勢である。コーン様トポロジーは、丸で囲われた領域１および２によりサンプリングされ、アンブレラ様トポロジーは、丸で囲われた領域３によりサンプリングされる。断面（Ｅ）〜（Ｆ）は、それぞれ、α２−３モチーフおよびα２−６モチーフによる、コーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーのサンプリングを示す。立体配座マップにおける暗色領域は、所与の（φ，ψ）値のセットについてθパラメータ（Ｎｅｕ５ＡｃのＣ２原子と後続のＧａｌ糖およびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角）を計算するための外側境界として用いた。エネルギーカットオフに基づき、θ＞１１０°の値を用いてコーン様トポロジーを特徴付け、θ＜１００°の値を用いてアンブレラ様トポロジーを特徴付けた。θの外形を立体配座エネルギーマップと重ね合わせることにより、α２−３モチーフは、アンブレラ様トポロジーを取るにはエネルギー的に好適ではないので、１００％コーン様トポロジーを取ることが示された。他方、α２−６モチーフは、コーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングし、このサンプリングを、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合のω角（Ｏ−Ｃ６−Ｃ５−Ｈ５）に基づいて分類した。 図６は、グリカン受容体の特異性を理解するための枠組みを示す図である。α２−３結合グリカンおよび／またはα２−６結合グリカンは、異なるトポロジーを取ることが可能である。本発明によれば、ＨＡポリペプチドがこれらのトポロジーのうちの特定のトポロジーに結合する能力により、このＨＡポリペプチドに異なる宿主、例えば、ヒトの感染を媒介する能力が付与される。この図のパネルＡで例示される通り、本発明は、２つの特に関連するトポロジーである「コーン」トポロジーおよび「アンブレラ」トポロジーを規定する。コーントポロジーは、α２−３結合グリカンおよび／またはα２−６結合グリカンが取りうるトポロジーであり、コアに結合した短鎖オリゴ糖または分枝状オリゴ糖に典型的である（特定の長鎖オリゴ糖もこのトポロジーを取りうるが）。アンブレラトポロジーは、α２−６結合グリカンだけが取りうるトポロジーであり（おそらく、α２−６結合において存在するさらなるＣ５−Ｃ６間結合により付与される、立体配座的な複数性が増大するために）、特にモチーフＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃ−を含有する、長鎖オリゴ糖または長鎖オリゴ糖分枝を伴う分枝状グリカンが主に取るトポロジーである。本明細書で記載される、ＨＡポリペプチドがアンブレラグリカントポロジーに結合する能力により、ヒト受容体への結合および／またはヒトの感染を媒介する能力が付与される。この図のパネルＢは、三糖モチーフ（それぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃおよびＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）のグリコシドのねじれ角により統御されるα２−３トポロジーおよびα２−６トポロジーを特異的に示す図である。パラメータ（θ）（これらの三糖モチーフにおけるＮｅｕ５ＡｃのＣ２原子と後続のＧａｌ糖およびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角）を、トポロジーを特徴付けるものとして規定した。θの外形と、α２−３モチーフおよびα２−６モチーフの立体配座マップとを重ね合わせることにより、α２−３モチーフは１００％のコーン様トポロジーを取り、α２−６モチーフはコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングすることが示される（パネルＣ）。α２−３およびα２−６によりサンプリングされるコーン様トポロジーでは、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖が、コーンを張り渡す領域に沿って配置される。ＨＡのコーン様トポロジーとの相互作用は主に、番号付けされた位置（Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づく）におけるアミノ酸の、Ｎｅｕ５Ａｃ糖およびＧａｌ糖との接触を伴う。他方、α２−６に固有のアンブレラ様トポロジーでは、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖が、ＨＡとの結合部位（ＨＡ−α２−６共結晶構造において観察される）の方へと屈曲する。糖内のファンデルワールス力によるＧｌｃＮＡｃのアセチル基とＮｅｕ５Ａｃのアセチル基との間の接触を介して安定化するので、長鎖のα２−６オリゴ糖（例えば、少なくとも四糖）には、この立体配座が好適であろう。ＨＡのアンブレラ様トポロジーとの相互作用は、番号付けされた位置（Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づく）におけるアミノ酸の、Ｎｅｕ５Ａｃ糖およびＧａｌ糖との接触に加えて、ＧｌｃＮＡｃおよび後続の糖との接触も伴う。この図のパネルＣは、α２−３およびα２−６によるコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの立体配座サンプリングを示す図である。断面（Ａ）〜（Ｄ）はそれぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ結合、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ結合、およびＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ結合の立体配座（φ，ψ）マップを示す。ＧｌｙｃｏＭａｐｓ ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ／ｍｏｄｅｌｉｎｇ／ｇｌｙｃｏｍａｐｓｄｂ／）から得られるこれらのマップは、ＭＭ３の力の場を用いるアブイニシオのＭＤシミュレーションを用いて発生させた。エネルギー分布は、暗色（最高のエネルギーを表す）〜最低のエネルギーを表す明色にわたる色彩でコードする。丸で囲われた領域１〜５は、ＨＡ−グリカン共結晶構造におけるα２−３オリゴ糖およびα２−６オリゴ糖について観察される（φ，ψ）値を表す。ＨＡ結合ポケットでは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌのトランス立体配座（丸で囲われた領域１）が、この立体配座をゴーシュ配座（丸で囲われた領域２）とする、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８ Ｈ３Ｎ２ ＨＡの、α２−３との共結晶構造を例外として、優勢である。他方、ＨＡ結合ポケットでは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌのシス立体配座（丸で囲われた領域３）が優勢である。コーン様トポロジーは、丸で囲われた領域１および２によりサンプリングされ、アンブレラ様トポロジーは、丸で囲われた領域３によりサンプリングされる。断面（Ｅ）〜（Ｆ）は、それぞれ、α２−３モチーフおよびα２−６モチーフによる、コーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーのサンプリングを示す。立体配座マップにおける暗色領域は、所与の（φ，ψ）値のセットについてθパラメータ（Ｎｅｕ５ＡｃのＣ２原子と後続のＧａｌ糖およびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角）を計算するための外側境界として用いた。エネルギーカットオフに基づき、θ＞１１０°の値を用いてコーン様トポロジーを特徴付け、θ＜１００°の値を用いてアンブレラ様トポロジーを特徴付けた。θの外形を立体配座エネルギーマップと重ね合わせることにより、α２−３モチーフは、アンブレラ様トポロジーを取るにはエネルギー的に好適ではないので、１００％コーン様トポロジーを取ることが示された。他方、α２−６モチーフは、コーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングし、このサンプリングを、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合のω角（Ｏ−Ｃ６−Ｃ５−Ｈ５）に基づいて分類した。 図７は、ＨＡ残基のコーングリカントポロジーとの相互作用を、ＨＡ残基のアンブレラグリカントポロジーとの相互作用と対比して示す図である。ＨＡ−グリカン共結晶を解析することにより、Ｎｅｕ５ＡｃのＨＡとの結合部位に対する位置がほとんど不変であることが明らかとなる。Ｎｅｕ５Ａｃとの接触は、Ｆ９８、Ｓ／Ｔ１３６、Ｗ１５３、Ｈ１８３、およびＬ／Ｉ１９４など、高度に保存された残基を伴う。他の糖との接触は、糖の結合がα２−３結合であるかまたはα２−６結合であるか、およびグリカントポロジーがコーントポロジーであるかまたはアンブレラトポロジーであるかに応じて異なる残基を伴う。例えば、コーントポロジーでは、主要な接触が、Ｎｅｕ５Ａｃとの接触およびＧａｌ糖との接触である。Ｅ１９０およびＱ２２６は、この結合において特に重要な役割を果たす。この図はまた、コーン構造への結合に関与しうる他の位置（例えば、１３７位、１４５位、１８６位、１８７位、１９３位、２２２位）も例示する。場合によっては、異なる残基により、異なるグリカン構造との異なる接触がもたらされうる。これらの位置におけるアミノ酸の種類は、ＨＡポリペプチドがグリカン構造の修飾パターンおよび／または分枝パターンが異なる受容体に結合する能力に影響を及ぼしうる。アンブレラトポロジーでは、Ｎｅｕ５ＡｃおよびＧａｌを越えた糖との接触がもたらされる。この図は、アンブレラ構造への結合に関与しうる残基（例えば、１３７、１４５、１５６、１５９、１８６、１８７、１８９、１９０、１９２、１９３、１９６、２２２、２２５、２２６）を例示する。場合によっては、異なる残基により、異なるグリカン構造との異なる接触がもたらされうる。これらの位置におけるアミノ酸の種類は、ＨＡポリペプチドがグリカン構造の修飾パターンおよび／または分枝パターンが異なる受容体に結合する能力に影響を及ぼしうる。一部の実施形態では、１９０位におけるＤ残基および／または２２５位におけるＤ残基が、アンブレラトポロジーへの結合に寄与する。 図８は、例示的なコーントポロジーを示す図である。この図は、コーントポロジーを取る特定の例示的な（網羅的ではないが）グリカン構造を例示する。 図９は、例示的なアンブレラトポロジーを示す図である。（Ａ）アンブレラトポロジーを取りうる、特定の例示的な（網羅的ではないが）Ｎ結合型グリカン構造およびＯ結合型グリカン構造。（Ｂ）アンブレラトポロジーを取りうる、特定の例示的な（網羅的ではないが）Ｏ結合型グリカン構造。 図９は、例示的なアンブレラトポロジーを示す図である。（Ａ）アンブレラトポロジーを取りうる、特定の例示的な（網羅的ではないが）Ｎ結合型グリカン構造およびＯ結合型グリカン構造。（Ｂ）アンブレラトポロジーを取りうる、特定の例示的な（網羅的ではないが）Ｏ結合型グリカン構造。 図９は、例示的なアンブレラトポロジーを示す図である。（Ａ）アンブレラトポロジーを取りうる、特定の例示的な（網羅的ではないが）Ｎ結合型グリカン構造およびＯ結合型グリカン構造。（Ｂ）アンブレラトポロジーを取りうる、特定の例示的な（網羅的ではないが）Ｏ結合型グリカン構造。 図９は、例示的なアンブレラトポロジーを示す図である。（Ａ）アンブレラトポロジーを取りうる、特定の例示的な（網羅的ではないが）Ｎ結合型グリカン構造およびＯ結合型グリカン構造。（Ｂ）アンブレラトポロジーを取りうる、特定の例示的な（網羅的ではないが）Ｏ結合型グリカン構造。 図９は、例示的なアンブレラトポロジーを示す図である。（Ａ）アンブレラトポロジーを取りうる、特定の例示的な（網羅的ではないが）Ｎ結合型グリカン構造およびＯ結合型グリカン構造。（Ｂ）アンブレラトポロジーを取りうる、特定の例示的な（網羅的ではないが）Ｏ結合型グリカン構造。 図９は、例示的なアンブレラトポロジーを示す図である。（Ａ）アンブレラトポロジーを取りうる、特定の例示的な（網羅的ではないが）Ｎ結合型グリカン構造およびＯ結合型グリカン構造。（Ｂ）アンブレラトポロジーを取りうる、特定の例示的な（網羅的ではないが）Ｏ結合型グリカン構造。 図９は、例示的なアンブレラトポロジーを示す図である。（Ａ）アンブレラトポロジーを取りうる、特定の例示的な（網羅的ではないが）Ｎ結合型グリカン構造およびＯ結合型グリカン構造。（Ｂ）アンブレラトポロジーを取りうる、特定の例示的な（網羅的ではないが）Ｏ結合型グリカン構造。 図９は、例示的なアンブレラトポロジーを示す図である。（Ａ）アンブレラトポロジーを取りうる、特定の例示的な（網羅的ではないが）Ｎ結合型グリカン構造およびＯ結合型グリカン構造。（Ｂ）アンブレラトポロジーを取りうる、特定の例示的な（網羅的ではないが）Ｏ結合型グリカン構造。 図１０Ａ〜Ｂは、ヒト気管支上皮細胞およびヒト結腸上皮細胞のグリカンプロファイルを示す図である。上気道組織におけるグリカンの多様性をさらに探索するため、Ｎ結合型グリカンをＨＢＥ（代表的な上気道細胞系）から単離し、ＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いて解析した。ＨＢＥではα２−６の発現が優勢であることは、試料をシアリダーゼＳ（α２−３特異的）およびシアリダーゼＡ（切断酵素：ＳＡ）で前処理することにより確認された。長鎖の分枝状トポロジーを伴うグリカンの発現が優勢であることは、ＴＯＦ−ＴＯＦによる代表的な質量ピークのフラグメント化解析を介して裏付けられる。上気道組織におけるグリカンの多様性の基準を与えるため、ヒト結腸上皮細胞（ＨＴ２９細胞；代表的な消化管細胞系）のＮ結合型グリカンプロファイルを得た。最新型のＨ５Ｎ１ウイルスは、消化管細胞に感染することが示されているため、この細胞系を選択した。シアリダーゼＡおよびＳで前処理された対照により、ＨＴ−２９細胞では、α２−３グリカンの発現が優勢であることが示された。さらに、長鎖の分枝状グリカントポロジーは、ＨＢＥについて観察されるほど広くは見られない。したがって、Ｈ５Ｎ１ ＨＡのヒトへの適応は、ヒト上気道組織において発現する多様なグリカン（例えば、アンブレラグリカン）に高親和性で結合することを可能とする、ＨＡの突然変異を伴うであろう。 図１０Ａ〜Ｂは、ヒト気管支上皮細胞およびヒト結腸上皮細胞のグリカンプロファイルを示す図である。上気道組織におけるグリカンの多様性をさらに探索するため、Ｎ結合型グリカンをＨＢＥ（代表的な上気道細胞系）から単離し、ＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いて解析した。ＨＢＥではα２−６の発現が優勢であることは、試料をシアリダーゼＳ（α２−３特異的）およびシアリダーゼＡ（切断酵素：ＳＡ）で前処理することにより確認された。長鎖の分枝状トポロジーを伴うグリカンの発現が優勢であることは、ＴＯＦ−ＴＯＦによる代表的な質量ピークのフラグメント化解析を介して裏付けられる。上気道組織におけるグリカンの多様性の基準を与えるため、ヒト結腸上皮細胞（ＨＴ２９細胞；代表的な消化管細胞系）のＮ結合型グリカンプロファイルを得た。最新型のＨ５Ｎ１ウイルスは、消化管細胞に感染することが示されているため、この細胞系を選択した。シアリダーゼＡおよびＳで前処理された対照により、ＨＴ−２９細胞では、α２−３グリカンの発現が優勢であることが示された。さらに、長鎖の分枝状グリカントポロジーは、ＨＢＥについて観察されるほど広くは見られない。したがって、Ｈ５Ｎ１ ＨＡのヒトへの適応は、ヒト上気道組織において発現する多様なグリカン（例えば、アンブレラグリカン）に高親和性で結合することを可能とする、ＨＡの突然変異を伴うであろう。 図１１は、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３ＧａｌおよびＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌモチーフの立体配座マップおよび溶媒露出度を示す図である。パネルＡは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ結合の立体配座マップを示す図である。丸で囲われた領域２は、ＡＰＲ３４＿Ｈ１＿２３、ＡＤＵ６３＿Ｈ３＿２３、およびＡＤＳ９７＿Ｈ５＿２３による共結晶構造において観察されるトランス立体配座である。丸で囲われた領域１は、ＡＡＩ６８＿Ｈ３＿２３共結晶構造において観察される立体配座である。パネルＢは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌの立体配座マップであって、シス立体配座（丸で囲われた領域３）が、全てのＨＡ−α２−６シアル化グリカン共結晶構造において観察される立体配座マップを示す図である。パネルＣは、それぞれのＨＡ−グリカン共結晶構造のα２−３シアル化オリゴ糖におけるＮｅｕ５Ａｃの溶媒露出表面積（ＳＡＳＡ）と、α２−６シアル化オリゴ糖におけるＮｅｕ５ＡｃのＳＡＳＡとの差違を示す図である。赤色バーおよびシアンバーは、それぞれ、α２−６シアル化グリカンにおけるＮｅｕ５Ａｃ（正の値）、またはα２−３シアル化グリカンにおけるＮｅｕ５Ａｃ（負の値）が、グリカン結合部位との接触を増大させることを示す。パネルＤは、ブタおよびヒトのＨ１に結合したα２−３シアル化グリカン（Ｈ１α２−３）、トリおよびヒトのＨ３に結合したα２−３シアル化グリカン（Ｈ３α２−３）におけるＮｅｕＡｃのＳＡＳＡと、ブタおよびヒトのＨ１に結合したα２−６シアル化グリカン（Ｈ１α２−６）におけるＮｅｕＡｃのＳＡＳＡとの差違を示す図である。Ｈ３α２−３についての負のバーは、ヒトＨ３ ＨＡのＮｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌとの接触が、トリＨ３のＮｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌとの接触と比較して低度であることを示す。ねじれ角−φ：Ｃ２−Ｃ１−Ｏ−Ｃ３結合（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３／６結合の場合）；ψ：Ｃ１−Ｏ−Ｃ３−Ｈ３結合（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ結合の場合）またはＣ１−Ｏ−Ｃ６−Ｃ５結合（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合の場合）；ω：Ｏ−Ｃ６−Ｃ５−Ｈ５結合（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合の場合）。φ、ψマップは、Ｍａｒｔｉｎ Ｆｒａｎｋ博士およびＣｌａｕｓ−Ｗｉｌｈｅｌｍ ｖｏｎ ｄｅｒ Ｌｉｅｔｈ博士（Ｇｅｒｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により開発されたＧｌｙｃｏＭａｐｓ ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ／ｍｏｄｅｌｉｎｇ／ｇｌｙｃｏｍａｐｓｄｂ／）から得た。高エネルギー〜低エネルギーにわたる色分けのスキームは、それぞれ、明るい赤色〜明るい緑色とする。 図１１は、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３ＧａｌおよびＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌモチーフの立体配座マップおよび溶媒露出度を示す図である。パネルＡは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ結合の立体配座マップを示す図である。丸で囲われた領域２は、ＡＰＲ３４＿Ｈ１＿２３、ＡＤＵ６３＿Ｈ３＿２３、およびＡＤＳ９７＿Ｈ５＿２３による共結晶構造において観察されるトランス立体配座である。丸で囲われた領域１は、ＡＡＩ６８＿Ｈ３＿２３共結晶構造において観察される立体配座である。パネルＢは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌの立体配座マップであって、シス立体配座（丸で囲われた領域３）が、全てのＨＡ−α２−６シアル化グリカン共結晶構造において観察される立体配座マップを示す図である。パネルＣは、それぞれのＨＡ−グリカン共結晶構造のα２−３シアル化オリゴ糖におけるＮｅｕ５Ａｃの溶媒露出表面積（ＳＡＳＡ）と、α２−６シアル化オリゴ糖におけるＮｅｕ５ＡｃのＳＡＳＡとの差違を示す図である。赤色バーおよびシアンバーは、それぞれ、α２−６シアル化グリカンにおけるＮｅｕ５Ａｃ（正の値）、またはα２−３シアル化グリカンにおけるＮｅｕ５Ａｃ（負の値）が、グリカン結合部位との接触を増大させることを示す。パネルＤは、ブタおよびヒトのＨ１に結合したα２−３シアル化グリカン（Ｈ１α２−３）、トリおよびヒトのＨ３に結合したα２−３シアル化グリカン（Ｈ３α２−３）におけるＮｅｕＡｃのＳＡＳＡと、ブタおよびヒトのＨ１に結合したα２−６シアル化グリカン（Ｈ１α２−６）におけるＮｅｕＡｃのＳＡＳＡとの差違を示す図である。Ｈ３α２−３についての負のバーは、ヒトＨ３ ＨＡのＮｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌとの接触が、トリＨ３のＮｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌとの接触と比較して低度であることを示す。ねじれ角−φ：Ｃ２−Ｃ１−Ｏ−Ｃ３結合（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３／６結合の場合）；ψ：Ｃ１−Ｏ−Ｃ３−Ｈ３結合（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ結合の場合）またはＣ１−Ｏ−Ｃ６−Ｃ５結合（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合の場合）；ω：Ｏ−Ｃ６−Ｃ５−Ｈ５結合（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合の場合）。φ、ψマップは、Ｍａｒｔｉｎ Ｆｒａｎｋ博士およびＣｌａｕｓ−Ｗｉｌｈｅｌｍ ｖｏｎ ｄｅｒ Ｌｉｅｔｈ博士（Ｇｅｒｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により開発されたＧｌｙｃｏＭａｐｓ ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ／ｍｏｄｅｌｉｎｇ／ｇｌｙｃｏｍａｐｓｄｂ／）から得た。高エネルギー〜低エネルギーにわたる色分けのスキームは、それぞれ、明るい赤色〜明るい緑色とする。 図１１は、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３ＧａｌおよびＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌモチーフの立体配座マップおよび溶媒露出度を示す図である。パネルＡは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ結合の立体配座マップを示す図である。丸で囲われた領域２は、ＡＰＲ３４＿Ｈ１＿２３、ＡＤＵ６３＿Ｈ３＿２３、およびＡＤＳ９７＿Ｈ５＿２３による共結晶構造において観察されるトランス立体配座である。丸で囲われた領域１は、ＡＡＩ６８＿Ｈ３＿２３共結晶構造において観察される立体配座である。パネルＢは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌの立体配座マップであって、シス立体配座（丸で囲われた領域３）が、全てのＨＡ−α２−６シアル化グリカン共結晶構造において観察される立体配座マップを示す図である。パネルＣは、それぞれのＨＡ−グリカン共結晶構造のα２−３シアル化オリゴ糖におけるＮｅｕ５Ａｃの溶媒露出表面積（ＳＡＳＡ）と、α２−６シアル化オリゴ糖におけるＮｅｕ５ＡｃのＳＡＳＡとの差違を示す図である。赤色バーおよびシアンバーは、それぞれ、α２−６シアル化グリカンにおけるＮｅｕ５Ａｃ（正の値）、またはα２−３シアル化グリカンにおけるＮｅｕ５Ａｃ（負の値）が、グリカン結合部位との接触を増大させることを示す。パネルＤは、ブタおよびヒトのＨ１に結合したα２−３シアル化グリカン（Ｈ１α２−３）、トリおよびヒトのＨ３に結合したα２−３シアル化グリカン（Ｈ３α２−３）におけるＮｅｕＡｃのＳＡＳＡと、ブタおよびヒトのＨ１に結合したα２−６シアル化グリカン（Ｈ１α２−６）におけるＮｅｕＡｃのＳＡＳＡとの差違を示す図である。Ｈ３α２−３についての負のバーは、ヒトＨ３ ＨＡのＮｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌとの接触が、トリＨ３のＮｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌとの接触と比較して低度であることを示す。ねじれ角−φ：Ｃ２−Ｃ１−Ｏ−Ｃ３結合（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３／６結合の場合）；ψ：Ｃ１−Ｏ−Ｃ３−Ｈ３結合（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ結合の場合）またはＣ１−Ｏ−Ｃ６−Ｃ５結合（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合の場合）；ω：Ｏ−Ｃ６−Ｃ５−Ｈ５結合（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合の場合）。φ、ψマップは、Ｍａｒｔｉｎ Ｆｒａｎｋ博士およびＣｌａｕｓ−Ｗｉｌｈｅｌｍ ｖｏｎ ｄｅｒ Ｌｉｅｔｈ博士（Ｇｅｒｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により開発されたＧｌｙｃｏＭａｐｓ ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ／ｍｏｄｅｌｉｎｇ／ｇｌｙｃｏｍａｐｓｄｂ／）から得た。高エネルギー〜低エネルギーにわたる色分けのスキームは、それぞれ、明るい赤色〜明るい緑色とする。 図１１は、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３ＧａｌおよびＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌモチーフの立体配座マップおよび溶媒露出度を示す図である。パネルＡは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ結合の立体配座マップを示す図である。丸で囲われた領域２は、ＡＰＲ３４＿Ｈ１＿２３、ＡＤＵ６３＿Ｈ３＿２３、およびＡＤＳ９７＿Ｈ５＿２３による共結晶構造において観察されるトランス立体配座である。丸で囲われた領域１は、ＡＡＩ６８＿Ｈ３＿２３共結晶構造において観察される立体配座である。パネルＢは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌの立体配座マップであって、シス立体配座（丸で囲われた領域３）が、全てのＨＡ−α２−６シアル化グリカン共結晶構造において観察される立体配座マップを示す図である。パネルＣは、それぞれのＨＡ−グリカン共結晶構造のα２−３シアル化オリゴ糖におけるＮｅｕ５Ａｃの溶媒露出表面積（ＳＡＳＡ）と、α２−６シアル化オリゴ糖におけるＮｅｕ５ＡｃのＳＡＳＡとの差違を示す図である。赤色バーおよびシアンバーは、それぞれ、α２−６シアル化グリカンにおけるＮｅｕ５Ａｃ（正の値）、またはα２−３シアル化グリカンにおけるＮｅｕ５Ａｃ（負の値）が、グリカン結合部位との接触を増大させることを示す。パネルＤは、ブタおよびヒトのＨ１に結合したα２−３シアル化グリカン（Ｈ１α２−３）、トリおよびヒトのＨ３に結合したα２−３シアル化グリカン（Ｈ３α２−３）におけるＮｅｕＡｃのＳＡＳＡと、ブタおよびヒトのＨ１に結合したα２−６シアル化グリカン（Ｈ１α２−６）におけるＮｅｕＡｃのＳＡＳＡとの差違を示す図である。Ｈ３α２−３についての負のバーは、ヒトＨ３ ＨＡのＮｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌとの接触が、トリＨ３のＮｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌとの接触と比較して低度であることを示す。ねじれ角−φ：Ｃ２−Ｃ１−Ｏ−Ｃ３結合（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３／６結合の場合）；ψ：Ｃ１−Ｏ−Ｃ３−Ｈ３結合（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ結合の場合）またはＣ１−Ｏ−Ｃ６−Ｃ５結合（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合の場合）；ω：Ｏ−Ｃ６−Ｃ５−Ｈ５結合（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合の場合）。φ、ψマップは、Ｍａｒｔｉｎ Ｆｒａｎｋ博士およびＣｌａｕｓ−Ｗｉｌｈｅｌｍ ｖｏｎ ｄｅｒ Ｌｉｅｔｈ博士（Ｇｅｒｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により開発されたＧｌｙｃｏＭａｐｓ ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ／ｍｏｄｅｌｉｎｇ／ｇｌｙｃｏｍａｐｓｄｂ／）から得た。高エネルギー〜低エネルギーにわたる色分けのスキームは、それぞれ、明るい赤色〜明るい緑色とする。 図１２Ａ〜Ｂは、上気道組織切片のレクチン染色を示す図である。Ｊａｃａｌｉｎ（明色）およびＣｏｎＡ（暗色）で気管組織を共染色することにより、Ｊａｃａｌｉｎ（Ｏ結合型グリカンに特異的に結合する）の気管尖枝表面における杯細胞への優先的な結合、およびＣｏｎＡ（Ｎ結合型グリカンに特異的に結合する）の気管上皮絨毛細胞への優先的な結合が明らかになる。特定のいかなる理論により拘束されることも望まないが、本発明者らは、この知見により、杯細胞が主にＯ結合型グリカンを発現させるのに対し、上皮絨毛細胞は主にＮ結合型グリカンを発現させることが示唆されることに注目する。ＪａｃａｌｉｎおよびＳＮＡ（暗色；α２−６に特異的に結合する）で気管を共染色することにより、ＳＮＡの杯細胞および絨毛細胞の両方への結合が示される。他方、Ｊａｃａｌｉｎ（明色）およびα２−３シアル化グリカンに特異的に結合するＭＡＬ（暗色）による共染色は、ＭＡＬの気管の多列上皮への結合は微弱な最小の結合〜結合なしであるが、気管組織の基底領域への結合は広範であることを示す。併せて、レクチン染色データにより、気管上皮の先端側の絨毛細胞および杯細胞のそれぞれにおけるＮ結合型およびＯ結合型グリカンの両方の一部として、α２−６シアル化グリカンの発現が優勢であり分布が広範であることが示された。 図１２Ａ〜Ｂは、上気道組織切片のレクチン染色を示す図である。Ｊａｃａｌｉｎ（明色）およびＣｏｎＡ（暗色）で気管組織を共染色することにより、Ｊａｃａｌｉｎ（Ｏ結合型グリカンに特異的に結合する）の気管尖枝表面における杯細胞への優先的な結合、およびＣｏｎＡ（Ｎ結合型グリカンに特異的に結合する）の気管上皮絨毛細胞への優先的な結合が明らかになる。特定のいかなる理論により拘束されることも望まないが、本発明者らは、この知見により、杯細胞が主にＯ結合型グリカンを発現させるのに対し、上皮絨毛細胞は主にＮ結合型グリカンを発現させることが示唆されることに注目する。ＪａｃａｌｉｎおよびＳＮＡ（暗色；α２−６に特異的に結合する）で気管を共染色することにより、ＳＮＡの杯細胞および絨毛細胞の両方への結合が示される。他方、Ｊａｃａｌｉｎ（明色）およびα２−３シアル化グリカンに特異的に結合するＭＡＬ（暗色）による共染色は、ＭＡＬの気管の多列上皮への結合は微弱な最小の結合〜結合なしであるが、気管組織の基底領域への結合は広範であることを示す。併せて、レクチン染色データにより、気管上皮の先端側の絨毛細胞および杯細胞のそれぞれにおけるＮ結合型およびＯ結合型グリカンの両方の一部として、α２−６シアル化グリカンの発現が優勢であり分布が広範であることが示された。 図１３は、異なる遺伝的クレードにわたるＨ５Ｎ１ ＨＡのＲＢＳについての比較を示す図である。

図１４は、Ｓｔｅｖｅｎｓら、２００８年、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、３８１巻：１３８２〜９４頁を出典とする図である。Ｖｉｅｔ０３０４：Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４。Ｉｎｄ５０５：Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５。ＬＳ：ＨＡのＲＢＳにおけるＱ２２６Ｌ突然変異およびＧ２２８Ｓ突然変異。 図１５は、Ｖｉｅｔ０３０４−ＬＳ ＨＡおよびＶｉｅｔ０３０４−ＲＬＳ（Ｉｎｄ５０５−ＬＳと同等の突然変異体）ＨＡを、代表的なトリ受容体およびヒト受容体を含む本発明者らのグリカンアレイ上で用量依存的な形で解析したことを示す図である。いずれの突然変異体によっても、ヒト適応型ＨＡにより共有される高親和性によるα２−６結合と対照的な最小のα２−６結合（結合シグナルが観察されるのはＨＡ濃度が高いときに限られる）が示された。 図１６は、ＬＳ突然変異の文脈でＮ１５８におけるグリコシル化を欠くＨ５Ｎ１ ＨＡについての用量依存的な解析を示す図である。ＬＳ突然変異の文脈でＮ１５８におけるグリコシル化を除去したところ、ヒト受容体への結合親和性が、ヒト適応型Ｈ１Ｎ１ ＨＡおよびＨ２Ｎ２ ＨＡについて観察される範囲と同じ範囲（Ｋｄ’約２０ｐＭ）まで増大した。Ｈ５ ＨＡ鋳型のＮ１５８におけるグリコシル化をＱ２２６Ｌ突然変異だけ（すなわち、ＬＳ突然変異のうちのＧ２２８Ｓを伴わない）で除去したところ、ヒト受容体への優先性が改善される（トリ受容体への優先性を上回る）が、ヒト受容体への結合親和性は、Ｎ１５８において脱グリコシル化されたＬＳ突然変異体と比較して実質的に低下することが示された。 図１７は、ヒト適応型Ｈ２Ｎ２ ＨＡ（Ａｌｂ６＿５８）と、ヒト適応型Ｈ５Ｎ１（Ｖｉｅｔ１２０３＿０４）ＨＡとの間のＲＢＳの顕著な特徴の比較を示す図である。Ｈ２Ｎ２ ＨＡをＨ５Ｎ１ ＨＡと比較したときの４つの差違は、（１）欠失を包含するＨ２Ｎ２ ＨＡにおける１３０ループの組成物、（２）Ｈ２Ｎ２ ＨＡの１５８位におけるグリコシル化の欠如、（３）１３７位、２２１位、２２６位、および２２８位を伴うＲＢＳ底部のアミノ酸組成物、ならびに（４）１８８位、１９２位、および１９３位を伴うＲＢＳ上部のアミノ酸組成物を包含する。 図１８は、Ｈ５ ＨＡ突然変異体のＲＢＳの、Ｈ２Ｎ２ ＨＡのＲＢＳとの比較を示す図である。Ａ１ｂ６＿５８＿Ｈ２Ｎ２（配列番号８９）：Ａ／Ａｌｂａｎｙ／６／５８ Ｈ２Ｎ２ ＨＡ；Ｖｉｅｔ１２０３＿０４＿Ｄ（配列番号９０）：Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４ ＨＡの修飾形；Ｖｉｅｔ１２０３＿０４＿Ｄ＿Ｈ２ＲＢＳ（配列番号９１）：１３０位における欠失および１３カ所のアミノ酸置換を伴う、Ｖｉｅｔ１２０３＿０４＿Ｄの突然変異体；Ｖｉｅｔ１２０３＿０４＿Ｄ＿Ｈ２ＲＢＳｍｉｎ（配列番号９２）：１３０位における欠失および７カ所の置換を伴う、Ｖｉｅｔ１２０３＿０４＿Ｄの突然変異体；ｃｋＥｇｙ＿０７（配列番号９３）：１３０位における欠失を既に有するＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｅｇｙｐｔ／Ｒ２／２００７ Ｈ５Ｎ１ ＨＡ；ｃｋＥｇｙ＿０７＿Ｈ２ＲＢＳ（配列番号９４）：８カ所の置換を伴うｃｋＥｇｙ＿０７の突然変異体；ｃｋＶｉｅｔ＿０８（配列番号９５）：１９２位および１９３位における電荷のスイッチを既に有するＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｖｉｅｔｎａｍ／ＮＣＶＤ−０９３／２００８ Ｈ５Ｎ１ ＨＡ；ｃｋＶｉｅｔ＿０８＿Ｈ２ＲＢＳ（配列番号９６）：１３０位における欠失および６カ所の置換を伴うｃｋＶｉｅｔ＿０８の突然変異体；ｃｋＶｉｅｔ＿０８Ｈ２ＲＢＳｍｉｎ（配列番号９７）：１３０位における欠失および６カ所の置換を伴うｃｋＶｉｅｔ＿０８の突然変異体；ｃｋＶｉｅｔ＿０８＿Ｈ２ＲＢＳｍｉｎ（配列番号９８）：１３０位における欠失および４カ所の置換を伴うｃｋＶｉｅｔ＿０８の突然変異体。置換された残基の位置は、太字とし、かつ、強調する。１３０ループにおける欠失は、太字で強調して示す。１５８位におけるグリコシル化も強調する。 図１９は、そのＲＢＳの分子組成が、ヒト適応型Ｈ２Ｎ２ ＨＡの分子組成を模倣するように、デザインされたＨ５Ｎ１ ＨＡ（Ｖｉｅｔ１２０３＿０４＿Ｄ＿Ｈ２ＲＢＳ）の突然変異体についての用量依存的な解析を示す図である。この突然変異体は、他のヒト適応型ＨＡの特徴である高度に特異的な高親和性によるヒト受容体への結合を示す。この突然変異体のヒト受容体（６’ＳＬＮ−ＬＮ）に対する結合親和性は、ヒト適応型Ｈ１Ｎ１ ＨＡおよびヒト適応型Ｈ２Ｎ２ ＨＡのＫｄ’と同じ範囲にあるＫｄ’約３ｐＭで定量化される。 図２０は、流行性ＨＡに特徴的なグリカン−受容体間結合の特性を示す図である。原型的なヒト適応型で流行性の１９１８年型Ｈ１Ｎ１（Ｓ１）株および１９５８年型Ｈ２Ｎ２（Ｓ２）株および２００９年型Ｈ１Ｎ１（Ｓ３）株に由来するＨＡは、ヒト受容体（６’ＳＬＮ−ＬＮ）に対しては、特異的な高親和性による結合を示すが、トリ受容体（３’ＳＬＮ−ＬＮ）に対しては、最小〜実質的に低度の親和性による結合（ヒト受容体への親和性と比べて）を示す。他方、顕著な特徴であるＬＳ突然変異をＶｉｅｔ１２０３＿０４ Ｈ５Ｎ１ ＨＡの配列に導入しても、その受容体への優先性が、流行性ＨＡについて認められるヒト受容体への結合へとスイッチされることはない。 図２１は、ＨＡ亜型に由来する代表的な配列の系統樹を示す図である。クレード１およびクレード２のＨＡをもたらす分枝を標識し、それぞれ、赤色および青色で着色する。類縁の緊密な亜型は、互いに近接する分枝に配置する。 図２２は、Ｈ５ ＨＡのＲＢＳ内で重要な構造的特徴を示す図である。図では、これらのＨＡの間で異なるアミノ酸の側鎖を伴う、Ａｌｂ６＿５８ ＨＡ（グレー）およびＶｉｅｔ０３０４（緑色）のＲＢＳの模式図が示される。本文で記載されるＨ２のＲＢＳとＨ５のＲＢＳとを識別する４つの特徴を赤色点線の円で強調する。 図２３は、代表的なＨ２ ＨＡおよびＨ５ ＨＡのＲＢＳの配列アライメントを示す図である。流行性のＨ２Ｎ２株（Ａ／Ａｌｂａｎｙ／６／５８またはＡｌｂ５８（配列番号９８））、１９９７年〜２００６年型株（Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８６／９７またはＨＫ＿４８６＿９７（配列番号１０５）、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／２１３／０３またはＨＫ＿２１３＿０３（配列番号１０４）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４またはＶｉｅｔ１２０３＿０４（配列番号１０３）、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５またはＩｎｄ＿５＿０５（配列番号１０２）、Ａ／Ｅｇｙｐｔ／２７８６−ＮＡＭＲＵ３またはＥｇｙ＿２７８６−Ｎ３＿０６（配列番号１０１））に由来する代表的なヒト単離物に由来するＨＡ配列を、ＬＳ突然変異（ｃｋＥｇｙ＿０７ｍｕｔｖ５．３（配列番号９９））を導入するのに選択されたＨ５ ＨＡ鋳型（Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｅｇｙｐｔ／Ｒ２／０７またはｃｋＥｇｙ＿０７（配列番号１００））と共に配列決定する。 図２４は、ＬＳアミノ酸変化を保有するｃｋＥｇｙ＿０７およびｃｋＥｇｙ＿０７のグリカン受容体結合特性を示す図である。ＨＡの用量依存的な直接的グリカン結合は、代表的なヒト受容体およびトリ受容体を含むグリカンアレイプラットフォームにおいて実施した。パネルＡでは、野生型のｃｋＥｇｙ＿０７ ＨＡにより、他の野生型のＨ５Ｎ１ ＨＡに典型的な特異的でかつ高親和性によるトリ受容体への結合特徴が示される。パネルＢは、ＬＳ突然変異をこのＨＡに導入することにより、その特異性がヒト受容体（６’ＳＬＮ−ＬＮ）へと定量的にシフトされ、そのトリ受容体への結合が最小レベルへと実質的に低減されることを示す図である。パネルＣは、ｃｋＥｇｙ＿０７ ＬＳ突然変異体の、主にヒト気管組織切片の尖枝表面において発現する生理学的なヒト受容体への結合を示す図である。用量依存的な結合プロファイルに由来する、ヒト受容体に対する特異性および親和性は、突然変異体ＨＡによるヒト気管組織の染色と併せると、要求される他の変化（ＰＢ２の変化など）の文脈で、この突然変異体ＨＡを保有するＨ５Ｎ１ウイルスのエアロゾル伝染をもたらすのに十分でありうる程度の特異性および親和性である。 図２４は、ＬＳアミノ酸変化を保有するｃｋＥｇｙ＿０７およびｃｋＥｇｙ＿０７のグリカン受容体結合特性を示す図である。ＨＡの用量依存的な直接的グリカン結合は、代表的なヒト受容体およびトリ受容体を含むグリカンアレイプラットフォームにおいて実施した。パネルＡでは、野生型のｃｋＥｇｙ＿０７ ＨＡにより、他の野生型のＨ５Ｎ１ ＨＡに典型的な特異的でかつ高親和性によるトリ受容体への結合特徴が示される。パネルＢは、ＬＳ突然変異をこのＨＡに導入することにより、その特異性がヒト受容体（６’ＳＬＮ−ＬＮ）へと定量的にシフトされ、そのトリ受容体への結合が最小レベルへと実質的に低減されることを示す図である。パネルＣは、ｃｋＥｇｙ＿０７ ＬＳ突然変異体の、主にヒト気管組織切片の尖枝表面において発現する生理学的なヒト受容体への結合を示す図である。用量依存的な結合プロファイルに由来する、ヒト受容体に対する特異性および親和性は、突然変異体ＨＡによるヒト気管組織の染色と併せると、要求される他の変化（ＰＢ２の変化など）の文脈で、この突然変異体ＨＡを保有するＨ５Ｎ１ウイルスのエアロゾル伝染をもたらすのに十分でありうる程度の特異性および親和性である。 図２４は、ＬＳアミノ酸変化を保有するｃｋＥｇｙ＿０７およびｃｋＥｇｙ＿０７のグリカン受容体結合特性を示す図である。ＨＡの用量依存的な直接的グリカン結合は、代表的なヒト受容体およびトリ受容体を含むグリカンアレイプラットフォームにおいて実施した。パネルＡでは、野生型のｃｋＥｇｙ＿０７ ＨＡにより、他の野生型のＨ５Ｎ１ ＨＡに典型的な特異的でかつ高親和性によるトリ受容体への結合特徴が示される。パネルＢは、ＬＳ突然変異をこのＨＡに導入することにより、その特異性がヒト受容体（６’ＳＬＮ−ＬＮ）へと定量的にシフトされ、そのトリ受容体への結合が最小レベルへと実質的に低減されることを示す図である。パネルＣは、ｃｋＥｇｙ＿０７ ＬＳ突然変異体の、主にヒト気管組織切片の尖枝表面において発現する生理学的なヒト受容体への結合を示す図である。用量依存的な結合プロファイルに由来する、ヒト受容体に対する特異性および親和性は、突然変異体ＨＡによるヒト気管組織の染色と併せると、要求される他の変化（ＰＢ２の変化など）の文脈で、この突然変異体ＨＡを保有するＨ５Ｎ１ウイルスのエアロゾル伝染をもたらすのに十分でありうる程度の特異性および親和性である。 図２５は、ＬＳ突然変異の文脈で、１５８位におけるグリコシル化の喪失の、Ｈ５ ＨＡのグリカン受容体への結合に対する効果についての解析を示す図である。パネルＡでは、ｃｋＥｇｙ＿０７＿ＬＳ突然変異体が、他の流行性ＨＡに類似させるヒト受容体の定量的なスイッチを示す。パネルＢは、比較のための、先行研究を出典とするＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９ Ｈ１Ｎ１ ＨＡ（Ｓ３）株の結合曲線を示す。パネルＣは、Ｖｉｅｔ０３＿０４＿ＡＬＳ突然変異体におけるＴ１６０Ａ突然変異により、この位置におけるグリコシル化の喪失をもたらす、Ｎ１５８におけるグリコシル化のシークォン配列が除去されることを示す図である。この突然変異体は、ヒト受容体への結合の劇的な改善を示すが、流行性ＨＡおよびｃｋＥｇｙ＿０７＿ＬＳ突然変異体（上パネルに示す）に特徴的ではない、そのトリ受容体への結合の大半は保持する。パネルＤでは、天然で１５８位におけるグリコシル化を欠くＥｇｙ＿０６ＨＡ配列に導入されたＬＳアミノ酸突然変異がまた、Ｖｉｅｔ０３＿０４＿ＡＬＳ突然変異体と同じ結合プロファイルも示す。 図２５は、ＬＳ突然変異の文脈で、１５８位におけるグリコシル化の喪失の、Ｈ５ ＨＡのグリカン受容体への結合に対する効果についての解析を示す図である。パネルＡでは、ｃｋＥｇｙ＿０７＿ＬＳ突然変異体が、他の流行性ＨＡに類似させるヒト受容体の定量的なスイッチを示す。パネルＢは、比較のための、先行研究を出典とするＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９ Ｈ１Ｎ１ ＨＡ（Ｓ３）株の結合曲線を示す。パネルＣは、Ｖｉｅｔ０３＿０４＿ＡＬＳ突然変異体におけるＴ１６０Ａ突然変異により、この位置におけるグリコシル化の喪失をもたらす、Ｎ１５８におけるグリコシル化のシークォン配列が除去されることを示す図である。この突然変異体は、ヒト受容体への結合の劇的な改善を示すが、流行性ＨＡおよびｃｋＥｇｙ＿０７＿ＬＳ突然変異体（上パネルに示す）に特徴的ではない、そのトリ受容体への結合の大半は保持する。パネルＤでは、天然で１５８位におけるグリコシル化を欠くＥｇｙ＿０６ＨＡ配列に導入されたＬＳアミノ酸突然変異がまた、Ｖｉｅｔ０３＿０４＿ＡＬＳ突然変異体と同じ結合プロファイルも示す。 図２５は、ＬＳ突然変異の文脈で、１５８位におけるグリコシル化の喪失の、Ｈ５ ＨＡのグリカン受容体への結合に対する効果についての解析を示す図である。パネルＡでは、ｃｋＥｇｙ＿０７＿ＬＳ突然変異体が、他の流行性ＨＡに類似させるヒト受容体の定量的なスイッチを示す。パネルＢは、比較のための、先行研究を出典とするＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９ Ｈ１Ｎ１ ＨＡ（Ｓ３）株の結合曲線を示す。パネルＣは、Ｖｉｅｔ０３＿０４＿ＡＬＳ突然変異体におけるＴ１６０Ａ突然変異により、この位置におけるグリコシル化の喪失をもたらす、Ｎ１５８におけるグリコシル化のシークォン配列が除去されることを示す図である。この突然変異体は、ヒト受容体への結合の劇的な改善を示すが、流行性ＨＡおよびｃｋＥｇｙ＿０７＿ＬＳ突然変異体（上パネルに示す）に特徴的ではない、そのトリ受容体への結合の大半は保持する。パネルＤでは、天然で１５８位におけるグリコシル化を欠くＥｇｙ＿０６ＨＡ配列に導入されたＬＳアミノ酸突然変異がまた、Ｖｉｅｔ０３＿０４＿ＡＬＳ突然変異体と同じ結合プロファイルも示す。 図２５は、ＬＳ突然変異の文脈で、１５８位におけるグリコシル化の喪失の、Ｈ５ ＨＡのグリカン受容体への結合に対する効果についての解析を示す図である。パネルＡでは、ｃｋＥｇｙ＿０７＿ＬＳ突然変異体が、他の流行性ＨＡに類似させるヒト受容体の定量的なスイッチを示す。パネルＢは、比較のための、先行研究を出典とするＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９ Ｈ１Ｎ１ ＨＡ（Ｓ３）株の結合曲線を示す。パネルＣは、Ｖｉｅｔ０３＿０４＿ＡＬＳ突然変異体におけるＴ１６０Ａ突然変異により、この位置におけるグリコシル化の喪失をもたらす、Ｎ１５８におけるグリコシル化のシークォン配列が除去されることを示す図である。この突然変異体は、ヒト受容体への結合の劇的な改善を示すが、流行性ＨＡおよびｃｋＥｇｙ＿０７＿ＬＳ突然変異体（上パネルに示す）に特徴的ではない、そのトリ受容体への結合の大半は保持する。パネルＤでは、天然で１５８位におけるグリコシル化を欠くＥｇｙ＿０６ＨＡ配列に導入されたＬＳアミノ酸突然変異がまた、Ｖｉｅｔ０３＿０４＿ＡＬＳ突然変異体と同じ結合プロファイルも示す。 図２６は、天然で特徴２を獲得した、Ｈ５Ｎ１ ＨＡ配列におけるヒト適応型のアミノ酸変化を示す図である。Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｖｉｅｔｎａｍ／ＮＣＶＤ−０９３／２００８トリＨ５Ｎ１ ＨＡが、１９０螺旋において、典型的にＴｈｒを含む１９２位をＬｙｓへと突然変異させ、典型的にＬｙｓ／Ａｒｇを含む１９３位をＭｅｔへと突然変異させるアミノ酸変化を既に獲得している。６カ所のアミノ酸変化および欠失を導入して、特徴１（１３０ループにおける欠失＋Ａ１３０Ｔ）および特徴３（Ｓ１３７Ｒ／Ｓ２２１Ｐ／Ｑ２２６Ｌ／Ｓ２２７Ｇ／Ｇ２２８Ｓ）に合致させたところ、結果として、１５８位におけるグリコシル化の存在下であってもその優先性をヒト受容体へと定量的にスイッチする突然変異体のＨＡが得られた。しかし、ＬＳ突然変異を伴うが、１３０ループにおける欠失は伴わずに、Ｔ１６０Ａのグリコシル化の喪失の変化を導入したところ、結果として、ヒト受容体およびトリ受容体への結合の劇的な低減がもたらされた（データは示さない）。したがって、これらのＨ５Ｎ１ ＨＡの場合、ＬＳ突然変異の文脈では、１３０ループにおける欠失が、グリコシル化の喪失よりはるかに重要な変化である。 図２７は、近年のトリＨ５単離物およびヒトＨ５Ｎ１単離物における重要な特徴の出現を示す図である。パネルＡでは、それらのＨＡがＨ２ ＨＡ ＲＢＳの特徴１および４に合致するアミノ酸変化を獲得したトリＨ５Ｎ１単離物およびヒトＨ５Ｎ１単離物の百分率を、株が単離された年の関数としてプロットする。２００７年におけるそれらの最初の出現以来、これらの重要な特徴を有する単離物の百分率が劇的に増大している。これらの単離物の配列についての系統解析により、それらがクレード２．２．１に属することが示された。パネルＢは、それらのＨＡがＨ２ ＨＡ ＲＢＳの特徴２に合致するアミノ酸変化を獲得したトリ単離物およびヒト単離物の百分率を示す図である。この特徴を獲得したのは、Ｈ５Ｎ１単離物のうちのわずかな部分であるに過ぎない。ＮＣＢＩ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅに由来する全長の非冗長ＨＡ配列を配列決定し、所与の年における特徴の各々の発生数を計算し、百分率として表した。全長２２７７の非冗長Ｈ５Ｎ１配列を解析に用いた。 図２７は、近年のトリＨ５単離物およびヒトＨ５Ｎ１単離物における重要な特徴の出現を示す図である。パネルＡでは、それらのＨＡがＨ２ ＨＡ ＲＢＳの特徴１および４に合致するアミノ酸変化を獲得したトリＨ５Ｎ１単離物およびヒトＨ５Ｎ１単離物の百分率を、株が単離された年の関数としてプロットする。２００７年におけるそれらの最初の出現以来、これらの重要な特徴を有する単離物の百分率が劇的に増大している。これらの単離物の配列についての系統解析により、それらがクレード２．２．１に属することが示された。パネルＢは、それらのＨＡがＨ２ ＨＡ ＲＢＳの特徴２に合致するアミノ酸変化を獲得したトリ単離物およびヒト単離物の百分率を示す図である。この特徴を獲得したのは、Ｈ５Ｎ１単離物のうちのわずかな部分であるに過ぎない。ＮＣＢＩ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅに由来する全長の非冗長ＨＡ配列を配列決定し、所与の年における特徴の各々の発生数を計算し、百分率として表した。全長２２７７の非冗長Ｈ５Ｎ１配列を解析に用いた。 図２８は、グリカンアレイで用いられるグリカンの拡張命名法を示す図である。Ｎｅｕ５Ａｃ：Ｎ−アセチルＤ−ノイラミン酸、Ｇａｌ：Ｄ−ガラクトース、ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ−アセチルＤ−グルコサミン。α／β：ピラノース糖のアノマー配置。全ての糖は、スペーサーを介してビオチンに結合する（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｌｙｃｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ／ｓｔａｔｉｃ／ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｃｏｒｅｄ５．ｓｈｔｍｌにおいて記載されている−Ｓｐ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン）。
ＨＡ配列エレメントについての説明
ＨＡ配列エレメント１
ＨＡ配列エレメント１とは、天然のインフルエンザウイルス単離物中に見出される多くのＨＡタンパク質の残基９７〜１８５（ここでは、基準としてのＨ３ ＨＡを用いて残基の位置を割り当てる）にほぼ対応する配列エレメントである。この配列エレメントは、基本構造：
Ｃ（Ｙ／Ｆ）ＰＸ１ＣＸ２ＷＸ３ＷＸ４ＨＨＰ（配列番号１０６）：
［配列中、
Ｘ１を約３０〜４５アミノ酸長とし、
Ｘ２を約５〜２０アミノ酸長とし、
Ｘ３を約２５〜３０アミノ酸長とし、
Ｘ４を約２アミノ酸長とする］
を有する。
一部の実施形態では、Ｘ１を約３５〜４５アミノ酸長、または約３５〜４３アミノ酸長、または約３５、３６、３７、３８、３８、４０、４１、４２、もしくは４３アミノ酸長とする。一部の実施形態では、Ｘ２を約９〜１５アミノ酸長、または約９〜１４アミノ酸長、または約９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４アミノ酸長とする。一部の実施形態では、Ｘ３を約２６〜２８アミノ酸長、または約２６、２７、もしくは２８アミノ酸長とする。一部の実施形態では、Ｘ４が、配列（Ｇ／Ａ）（Ｉ／Ｖ）を有する。一部の実施形態では、Ｘ４が、配列ＧＩを有し、一部の実施形態では、Ｘ４が、配列ＧＶを有し、一部の実施形態では、Ｘ４が、配列ＡＩを有し、一部の実施形態では、Ｘ４が、配列ＡＶを有する。一部の実施形態では、ＨＡ配列エレメント１が、ジスルフィド結合を含む。一部の実施形態では、このジスルフィド結合が、９７位および１３９位（本明細書で用いられるカノニカルのＨ３番号付けシステムに基づく）に対応する残基を架橋する。
一部の実施形態では、および特にＨ１ポリペプチドでは、Ｘ１を約４３アミノ酸長とし、かつ／またはＸ２を約１３アミノ酸長とし、かつ／またはＸ３を約２６アミノ酸長とする。一部の実施形態では、および特にＨ１ポリペプチドでは、ＨＡ配列エレメント１が、構造：
［配列中、
Ｘ１Ａを約２７〜４２アミノ酸長、または約３２〜４２アミノ酸長、または約３２〜４０アミノ酸長、または約２６〜４１アミノ酸長、または約３１〜４１アミノ酸長、または約３１〜３９アミノ酸長、または約３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０アミノ酸長とし、Ｘ２〜Ｘ４を上記の通りとする］
を有する。
一部の実施形態では、および特にＨ１ポリペプチドでは、ＨＡ配列エレメント１が、構造：
［配列中、
Ｘ１Ａを約２７〜４２アミノ酸長、または約３２〜４２アミノ酸長、または約３２〜４０アミノ酸長、または約３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０アミノ酸長とし、
Ｘ３Ａを約２３〜２８アミノ酸長、または約２４〜２６アミノ酸長、または約２４、２５、もしくは２６アミノ酸長とし、Ｘ２およびＸ４を上記の通りとする］
を有する。
一部の実施形態では、および特にＨ１ポリペプチドでは、ＨＡ配列エレメント１が、典型的にはＸ１内（Ｘ１Ａ内を含めた）にあり、とりわけ、Ｘ１の残基１２の近傍で始まる（例えば、図１〜３において例示される）配列：
を包含する。
一部の実施形態では、および特にＨ３ポリペプチドでは、Ｘ１を約３９アミノ酸長とし、かつ／またはＸ２を約１３アミノ酸長とし、かつ／またはＸ３を、約２６アミノ酸長とする。
一部の実施形態では、および特にＨ３ポリペプチドでは、ＨＡ配列エレメント１が、構造：
［配列中、
Ｘ１Ａを約２７〜４２アミノ酸長、または約３２〜４２アミノ酸長、または約３２〜４０アミノ酸長、または約２３〜３８アミノ酸長、または約２８〜３８アミノ酸長、または約２８〜３６アミノ酸長、または約２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０アミノ酸長とし、Ｘ２〜Ｘ４を上記の通りとする］
を有する。
一部の実施形態では、および特にＨ３ポリペプチドでは、ＨＡ配列エレメント１が、構造：
［配列中、
Ｘ１Ａを約２７〜４２アミノ酸長、または約３２〜４２アミノ酸長、または約３２〜４０アミノ酸長、または約３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０アミノ酸長とし、
Ｘ３Ａを約２３〜２８アミノ酸長、または約２４〜２６アミノ酸長、または約２４、２５、もしくは２６アミノ酸長とし、Ｘ２およびＸ４を上記の通りとする］
を有する。
一部の実施形態では、および特にＨ３ポリペプチドでは、ＨＡ配列エレメント１が、典型的にはＸ１内（Ｘ１Ａ内を含めた）にあり、とりわけ、Ｘ１の残基１２の近傍で始まる（例えば、図１、２、および４において例示される）配列：
を包含する。
一部の実施形態では、および特にＨ５ポリペプチドでは、Ｘ１を約４２アミノ酸長とし、かつ／またはＸ２を約１３アミノ酸長とし、かつ／またはＸ３を約２６アミノ酸長とする。
一部の実施形態では、および特にＨ５ポリペプチドでは、ＨＡ配列エレメント１が、構造：
［配列中、
Ｘ１Ａを約２７〜４２アミノ酸長、または約３２〜４２アミノ酸長、または約３２〜４０アミノ酸長、または約２３〜３８アミノ酸長、または約２８〜３８アミノ酸長、または約２８〜３６アミノ酸長、または約２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０アミノ酸長とし、Ｘ２〜Ｘ４を上記の通りとする］
を有する。
一部の実施形態では、および特にＨ５ポリペプチドでは、ＨＡ配列エレメント１が、構造：
［配列中、
Ｘ１Ａを約２７〜４２アミノ酸長、または約３２〜４２アミノ酸長、または約３２〜４０アミノ酸長、または約３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０アミノ酸長とし、
Ｘ３Ａを約２３〜２８アミノ酸長、または約２４〜２６アミノ酸長、または約２４、２５、もしくは２６アミノ酸長とし、Ｘ２およびＸ４を上記の通りとする］
を有する。
一部の実施形態では、および特にＨ５ポリペプチドでは、ＨＡ配列エレメント１を、配列：
により伸長させる（すなわち、残基１８６〜１９３に対応する位置において）。
一部の実施形態では、および特にＨ５ポリペプチドでは、ＨＡ配列エレメント１が、典型的にはＸ１内にあり、とりわけ、Ｘ１の残基６の近傍で始まる（例えば、図１、２、および５において例示される）配列：
を包含する。
ＨＡ配列エレメント２
ＨＡ配列エレメント２とは、天然のインフルエンザウイルス単離物中に見出される多くのＨＡタンパク質の残基３２４〜３４０（ここでもまた、Ｈ３ ＨＡに基づく番号付けシステムを用いる）にほぼ対応する配列エレメントである。この配列エレメントは、基本構造：
を有する。一部の実施形態では、ＨＡ配列エレメント２が配列：
［配列中、
Ｘ１を約４〜１４アミノ酸長、または約８〜１２アミノ酸長、または約１２、１１、１０、９、もしくは８アミノ酸長とする］
を有する。一部の実施形態では、この配列エレメントが、ＨＡ１およびＨＡ２の生成を可能とするＨＡ０の切断部位をもたらす。
一部の実施形態では、および特にＨ１ポリペプチドでは、ＨＡ配列エレメント２が、構造：
［配列中、
Ｘ１Ａを約３アミノ酸長とし、一部の実施形態では、Ｘ１ＡをＧ（Ｌ／Ｉ）Ｆとする］を有する。
一部の実施形態では、および特にＨ３ポリペプチドでは、ＨＡ配列エレメント２が、構造：
［配列中、
Ｘ１Ａを約３アミノ酸長とし、一部の実施形態では、Ｘ１ＡをＧ（Ｌ／Ｉ）Ｆとする］を有する。
一部の実施形態では、および特にＨ５ポリペプチドでは、ＨＡ配列エレメント２が、構造：
［配列中、
Ｘ１Ａを約３アミノ酸長とし、一部の実施形態では、Ｘ１ＡをＧ（Ｌ／Ｉ）Ｆとする］を有する。
定義
親和性：当技術分野で公知の「親和性」とは、特定のリガンド（例えば、ＨＡポリペプチド）がそのパートナー（例えば、ＨＡ受容体）に結合する緊密さの尺度である。親和性は、異なる方法で測定することができる。
結合：本明細書で用いられる「結合」という用語とは典型的に、薬剤間（ｂｅｔｗｅｅｎまたはａｍｏｎｇ）における非共有結合的会合を指すことが理解されるであろう。本明細書の多くの実施形態では、結合が、特定のグリカン（例えば、アンブレラトポロジーグリカンまたはコーントポロジーグリカン）との関係で提起される。当業者は、このような結合を多様な文脈のうちのいずれにおいても評価しうることを理解するであろう。一部の実施形態では、結合を、遊離グリカンとの関係で評価する。一部の実施形態では、結合を、担体に結合した（例えば、これに共有結合的に連結された）グリカンとの関係で評価する。一部のこのような実施形態では、担体がポリペプチドである。一部の実施形態では、結合を、ＨＡ受容体に結合したグリカンとの関係で評価する。このような実施形態では、受容体への結合について言及する場合もあり、グリカンへの結合について言及する場合もある。
結合剤：本明細書では一般に、「結合剤」という用語を用いて、本明細書で記載される、グリカンに結合する（例えば、アンブレラトポロジーグリカンに結合する）任意の実体を指す。結合剤は、任意の化学的種類としうる。一部の実施形態では、結合剤をポリペプチド（例えば、抗体または抗体断片を含めた）とし、一部のこのような実施形態では、結合剤を、ＨＡポリペプチドおよび／またはそれらの変異体および／またはそれらの特徴的部分とし、一部の実施形態では、結合剤を、それらのアミノ酸配列をＨＡに特徴的な配列を包含しないポリペプチド（すなわち、「非ＨＡポリペプチド」）とする。一部の実施形態では、結合剤を低分子とする。一部の実施形態では、結合剤を核酸とする。一部の実施形態では、結合剤をアプタマーとする。一部の実施形態では、結合剤をポリマーとし、一部の実施形態では、結合剤を非ポリマー性とする。一部の実施形態では、結合剤を炭水化物とする。一部の実施形態では、結合剤をレクチンとする。一部の実施形態では、本明細書で記載される結合剤が、アンブレラ様トポロジーを有するシアル化グリカンに結合する。一部の実施形態では、結合剤が、高度な親和性および／または特異性でアンブレラトポロジーグリカンに結合する。一部の実施形態では、結合剤が、コーントポロジーグリカンと比較して、アンブレラトポロジーグリカンに対する結合優先性を示す。一部の実施形態では、結合剤が、血球凝集素受容体におけるグリカンへの結合について血球凝集素と競合する。一部の実施形態では、結合剤が、アンブレラトポロジーグリカンへの結合について血球凝集素と競合する。一部の実施形態では、本明細書で提供される結合剤を、アンブレラトポロジーの遮断剤とする。一部の実施形態では、本明細書で提供される結合剤を、アンブレラトポロジーの特異的遮断剤とする。一部の実施形態では、結合剤が、アンブレラトポロジーグリカンの模倣体に結合する。
生物学的に活性：本明細書で用いられる「生物学的に活性」という語句は、生体系において、特に、生物において活性を有する任意の薬剤の特徴を指す。例えば、生物に投与すると、その生物に対して生物学的効果を及ぼす薬剤を、生物学的に活性であると考える。一部の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドが生物学的に活性である場合、タンパク質またはポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を共有するそのタンパク質またはポリペプチドの部分を、典型的に「生物学的活性」部分と称する。
特徴的部分：本明細書で用いられる、タンパク質またはポリペプチドの「特徴的部分」という語句は、併せてタンパク質またはポリペプチドの特徴となるアミノ酸の連続的な連なり、またはアミノ酸の連続的な連なりの集合を含有する部分である。このような連続的な連なりの各々は一般に、少なくとも２アミノ酸を含有する。さらに、当業者は、典型的に、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０以上のアミノ酸が、タンパク質の特徴となるように要求されることを理解するであろう。一般に、特徴的部分とは、上記で指定した配列同一性に加えて、少なくとも１つの機能的特徴を関連するインタクトタンパク質と共有する部分である。
特徴的配列：「特徴的配列」とは、ポリペプチドまたは核酸の全てのファミリーメンバー中に見出され、したがって、当業者がそのファミリーのメンバーを規定するのに用いうる配列である。
コーントポロジー：本明細書では、「コーントポロジー」という語句を用いて、特定のグリカン、特にＨＡ受容体におけるグリカンが取る３次元的配置を指す。図６に例示される通り、コーントポロジーは、α２−３シアル化グリカンが取る場合もあり、α２−６シアル化グリカンが取る場合もあり、短鎖オリゴ糖に典型的であるが、また、一部の長鎖オリゴ糖もこの立体配座を取る場合がある。コーントポロジーは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌグリコシド結合のねじれ角であって、立体配座のエネルギーを最小とする３つの領域（図１１）をサンプリングし、約−６０、約６０、または約１８０のφ（Ｃ１−Ｃ２−Ｏ−Ｃ３／Ｃ６）値ならびに−６０〜６０のψ（Ｃ２−Ｏ−Ｃ３／Ｃ６−Ｈ３／Ｃ５）によって与えられるねじれ角を特徴とする。図８は、コーントポロジーを取るグリカンの特定の代表的な（網羅的ではないが）例を示す。
〜に対応する：本明細書で用いられる「〜に対応する」という用語は、ＨＡポリペプチド中のアミノ酸残基の位置／同一性を指示するのに用いられることが多い。当業者は、本明細書では簡潔さの目的で、例えば、１９０位の残基「に対応する」アミノ酸が、実際に特定のアミノ酸鎖の１９０番目のアミノ酸である必要はなく、むしろ、野生型のＨ３ ＨＡの１９０位に見出される残基に対応するように、カノニカルの番号付けシステム（野生型のＨ３ ＨＡに基づく）を用いる（例えば、図１〜５で例示される）ことを理解するであろう。対応するアミノ酸をどのようにして同定するかは、当業者が容易に理解する。
分離度〜次で隔てられた：本明細書で用いられる「分離度〜次で隔てられた」アミノ酸とは、グリカン結合に対して間接的な効果を及ぼすＨＡのアミノ酸である。例えば、分離度１次で隔てられたアミノ酸は、（１）直接的に結合するアミノ酸と相互作用する場合もあり、かつ／または（２）直接的に結合するアミノ酸が宿主細胞のＨＡ受容体と会合するグリカンと相互作用する能力に他の形で影響を及ぼす場合もあり、このような分離度１次で隔てられたアミノ酸は、グリカン自体に直接結合する場合もあり、結合しない場合もある。分離度２次で隔てられたアミノ酸は、（１）分離度１次で隔てられたアミノ酸と相互作用し、かつ／または（２）分離度１次で隔てられたアミノ酸が直接的に結合するアミノ酸などと相互作用する能力に他の形で影響を及ぼす。
直接的に結合するアミノ酸：本明細書で用いられる「直接的に結合するアミノ酸」という語句は、宿主細胞のＨＡ受容体と会合する１またはそれより多くのグリカンと直接的に相互作用する、ＨＡポリペプチドのアミノ酸を指す。
操作された：本明細書で用いられる「操作された」という用語は、それらのアミノ酸配列が人間により選択されているポリペプチドについて記載する。例えば、操作されたＨＡポリペプチドのアミノ酸配列は、天然のインフルエンザウイルス単離物中に見出されるＨＡポリペプチドのアミノ酸配列と異なる。一部の実施形態では、操作されたＨＡポリペプチドのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベース中に包含されるＨＡポリペプチドのアミノ酸配列と異なる。
Ｈ１ポリペプチド：本明細書で用いられる「Ｈ１ポリペプチド」という用語は、それらのアミノ酸配列が、Ｈ１の特徴であり、Ｈ１を他のＨＡ亜型から識別する少なくとも１つの配列エレメントを包含するＨＡポリペプチドである。このような代表的な配列エレメントは、例えば、図１〜３で例示されるアライメントなどのアライメントにより決定することができ、これらには例えば、ＨＡ配列エレメントのＨ１特異的な実施形態との関係において本明細書で記載されるものが含まれる。
Ｈ３ポリペプチド：本明細書で用いられる用語「Ｈ３ポリペプチド」とは、それらのアミノ酸配列が、Ｈ３の特徴であり、Ｈ３を他のＨＡ亜型から識別する少なくとも１つの配列エレメントを包含するＨＡポリペプチドである。このような代表的な配列エレメントは、例えば、図１、２、および４で例示されるアライメントなどのアライメントにより決定することができ、これらには例えば、ＨＡ配列エレメントのＨ３特異的な実施形態との関係において本明細書で記載されるものが含まれる。
Ｈ５ポリペプチド：本明細書で用いられる用語「Ｈ５ポリペプチド」とは、それらのアミノ酸配列が、Ｈ５の特徴であり、Ｈ５を他のＨＡ亜型から識別する少なくとも１つの配列エレメントを包含するＨＡポリペプチドである。このような代表的な配列エレメントは、例えば、図１、２、および５で例示されるアライメントなどのアライメントにより決定することができ、これらには例えば、ＨＡ配列エレメントのＨ５特異的な実施形態との関係において本明細書で記載されるものが含まれる。
ＨＸポリペプチド：本明細書で用いられる用語「ＨＸポリペプチド」とは、それらのアミノ酸配列が、ＨＸの特徴であり、ＨＸを他のＨＡ亜型から識別する少なくとも１つの配列エレメントを包含するＨＡポリペプチドであり、この場合、「Ｘ」とは、ＨＡ亜型の番号付け（例えば、「Ｘ」＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６とすると、それぞれ、「ＨＸ」＝Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、またはＨ１６となる）を指す。
血球凝集素（ＨＡ）ポリペプチド：本明細書で用いられる「血球凝集素ポリペプチド」（または「ＨＡポリペプチド」）という用語は、それらのアミノ酸配列が、ＨＡの少なくとも１つの特徴的配列を包含するポリペプチドを指す。当技術分野では、インフルエンザウイルス単離物に由来する多種多様なＨＡ配列が公知であり、実際、米国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）は、本出願の出願時現在で９７９６のＨＡ配列を包含するデータベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＦＬＵ／ｆｌｕ．ｈｔｍｌ）を維持している。当業者は、このデータベースを参照することにより、一般にＨＡポリペプチドの特徴である配列を容易に同定することもでき、かつ／もしくは特定のＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、またはＨ１６のポリペプチド）の特徴である配列を容易に同定することもでき、特定の宿主、例えば、トリ、ラクダ、イヌ、ネコ、ジャコウネコ、環境、ウマ、ヒト、ヒョウ、ミンク、マウス、アザラシ、ムナジロテン、ブタ、トラ、クジラなどの感染を媒介するＨＡの特徴である配列を容易に同定することもできる。例えば、一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドが、インフルエンザウイルスの天然の単離物中に見出されるＨＡタンパク質の残基９７の近傍と１８５の近傍との間、３２４の近傍と３４０の近傍との間、９６の近傍と１００の近傍との間、および／または１３０の近傍と２３０の近傍との間で見出される１またはそれより多くの特徴的配列エレメントを包含する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドが、本明細書で規定されるＨＡ配列エレメント１および２のうちの少なくとも１つを含むアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドが、ＨＡ配列エレメント１および２を含み、一部の実施形態では、互いに約１００〜約２００、または約１２５〜約１７５、または約１２５〜約１６０、または約１２５〜約１５０、または約１２９〜約１３９、または約１２９、約１３０、約１３１、約１３２、約１３３、約１３４、約１３５、約１３６、約１３７、約１３８、もしくは約１３９アミノ酸隔てられたアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドが、グリカン結合に関与する領域９６〜１００および／または１３０〜２３０内の位置にある残基を包含するアミノ酸配列を有する。例えば、多くのＨＡポリペプチドは、以下の残基：Ｔｙｒ９８、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ１３６、Ｔｒｐ１５３、Ｈｉｓ１８３、およびＬｅｕ／Ｉｌｅ１９４のうちの１またはそれより多くを包含する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドが、これらの残基のうちの少なくとも２つ、３つ、４つ、または５つ全てを包含する。
単離された：本明細書で用いられる「単離された」という用語は、（ｉ）当初生成した（天然でまたは実験環境において）ときに会合していた成分のうちの少なくとも一部から分離されているか、または（ｉｉ）人工的に生成させた薬剤または実体を指す。単離された薬剤または実体は、それらが当初会合していた他の成分のうちの少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％以上から分離することができる。一部の実施形態では、単離された薬剤が、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を超えて純粋である。
結合特異的遮断剤（ＬＳＢＡ）：本明細書で用いられる「結合特異的遮断剤」という用語は、α２−６シアル化グリカンを有するＨＡ受容体に結合する薬剤を指す。一部の実施形態では、ＬＳＢＡが、α２−６シアル化グリカンを有するＨＡ受容体に、α２−３シアル化グリカンを有するＨＡ受容体に対する親和性の少なくとも約４０、５０、または７５％の親和性で選択的に結合する。一部の実施形態では、ＬＳＢＡが、α２−６シアル化グリカンを有するＨＡ受容体に、α２−３シアル化グリカンを有するＨＡ受容体に対する親和性の少なくとも約２、４、５、または１０倍の親和性で選択的に結合する。一部の実施形態では、ＬＳＢＡのα２−６シアル化グリカンに対する親和性が、α２−３シアル化グリカンに対するその親和性の少なくとも５０、１００、１５０、または２００％である。一部の実施形態では、ＬＳＢＡが、ＨＡ受容体への結合について血球凝集素と競合しうる。例えば、ＬＳＢＡは、結合特徴（例えば、α２−６シアル化グリカンまたはα２−３シアル化グリカン）に基づき、インフルエンザウイルス粒子（例えば、ヒトインフルエンザウイルスまたはトリインフルエンザウイルス）のＨＡ受容体への結合を選択的に阻害しうる。一部の実施形態では、ＬＳＢＡをポリペプチドとする。一部のこのような実施形態では、ＬＳＢＡポリペプチドが、天然のポリペプチドのアミノ酸配列と実質的に同一であるかまたは実質的に相同であるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＬＳＢＡポリペプチドをＨＡポリペプチドとする。一部の実施形態では、ＬＳＢＡポリペプチドを、天然のＨＡポリペプチドまたはその断片とする。一部の実施形態では、ＬＳＢＡポリペプチドが、ＨＡポリペプチドのアミノ酸配列とは類縁でないアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＬＳＢＡポリペプチドを、抗体またはその断片とする。一部の実施形態では、ＬＳＢＡポリペプチドを、レクチン（例えば、ＳＮＡ−１）とする。一部の実施形態では、ＬＳＢＡをポリペプチドでないとする。一部の実施形態では、ＬＳＢＡを低分子とする。一部の実施形態では、ＬＳＢＡを核酸とする。
長鎖オリゴ糖：本開示の目的では、それが少なくとも４つの糖残基を有する少なくとも１つの直鎖を包含する場合に典型的に、オリゴ糖を「長鎖」であると考える。
非天然アミノ酸：「非天然アミノ酸」という語句は、アミノ酸の化学構造（すなわち：
であり、したがって、少なくとも２つのペプチド結合に関与することが可能であるが、天然で見出されるＲ基と異なるＲ基を有する）を有する実体を指す。一部の実施形態では、非天然アミノ酸はまた、水素ではなく、第２のＲ基も有する場合もあり、かつ／またはアミノ酸部分またはカルボン酸部分において１またはそれより多くの他の置換を有する場合もある。
ポリペプチド：一般的に述べると、「ポリペプチド」とは、ペプチド結合を介して互いに結合した少なくとも２アミノ酸の連なりである。一部の実施形態では、ポリペプチドが、それらの各々が少なくとも１つのペプチド結合を介して他のアミノ酸に結合した、少なくとも３〜５アミノ酸を包含しうる。当業者は、ポリペプチドが場合によって、「非天然」アミノ酸または他の実体であるにもかかわらず、場合によってポリペプチド鎖へと組み込まれることが可能な「非天然」アミノ酸または他の実体も包含することを理解するであろう。
純粋な：本明細書で用いられる薬剤または実体は、それが実質的に他の成分を含まない場合に「純粋」である。例えば、特定の薬剤または実体を約９０％超含有する調製物を、典型的に純粋な調製物であると考える。一部の実施形態では、薬剤または実体が、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％純粋である。
短鎖オリゴ糖：本開示の目的では、任意の直鎖においてそれが有する残基が４未満、または確実に３未満である場合に典型的に、オリゴ糖を「短鎖」であると考える。
特異性：当技術分野において公知の「特異性」とは、特定のリガンド（例えば、ＨＡポリペプチド）が、その結合パートナー（例えば、ヒトＨＡ受容体、特にヒト上気道ＨＡ受容体）を、他の潜在的な結合パートナー（例えば、トリＨＡ受容体）から識別する能力の尺度である。
実質的な相同性：本明細書では、「実質的な相同性」という語句を用いて、アミノ酸配列または核酸配列の間の比較を指す。当業者が理解する通り、一般に、それらが対応する位置において相同な残基を含有する場合に２つの配列を「実質的に相同」であると考える。相同な残基は、同一な残基の場合がある。代替的に、相同な残基は、適切な形で同様の構造的特徴および／または機能的特徴を有する同一でない残基でもありうる。例えば、当業者に周知である通り、特定のアミノ酸は、「疎水性」アミノ酸もしくは「親水性」アミノ酸として、かつ／または「極性」側鎖もしくは「非極性」側鎖を有するものとして典型的に分類される。１つのアミノ酸の別の同じ種類のアミノ酸への置換は、「相同」置換と考えうることが多い。典型的なアミノ酸の類別を以下にまとめる。
当技術分野において周知である通り、アミノ酸配列または核酸配列は、ヌクレオチド配列用のＢＬＡＳＴＮ、ならびにアミノ酸配列用のＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなど、市販のコンピュータプログラムにおいて使用可能なアルゴリズムを含めた各種のアルゴリズムのうちのいずれかを用いて比較することができる。例示的なこのようなプログラムは、これらの後出の全てが参照により本明細書に組み込まれる、
において記載されている。相同な配列を同定するステップに加えて、上述のプログラムは典型的に、相同性の程度の指標ももたらす。一部の実施形態では、それらの対応する残基のうちの少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％以上が関連する残基の連なりにわたり相同である場合に、２つの配列を実質的に相同であると考える。一部の実施形態では、関連する連なりを、完全な配列とする。一部の実施形態では、関連する連なりを、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２２５、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００、少なくとも３２５、少なくとも３５０、少なくとも３７５、少なくとも４００、少なくとも４２５、少なくとも４５０、少なくとも４７５、少なくとも５００以上の残基とする。
実質的同一性：本明細書では、「実質的同一性」という語句を用いて、アミノ酸配列または核酸配列の間の比較を指す。当業者が理解する通り、一般に、それらが対応する位置において同一な残基を含有する場合に、２つの配列を「実質的に同一」であると考える。当技術分野において周知である通り、アミノ酸配列または核酸配列は、ヌクレオチド配列用のＢＬＡＳＴＮ、ならびにアミノ酸配列用のＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなど、市販のコンピュータプログラムにおいて使用可能なアルゴリズムを含めた各種のアルゴリズムのうちのいずれかを用いて比較することができる。例示的なこのようなプログラムは、これらの後出の全てが参照により本明細書に組み込まれる、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、「Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ」、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２１５巻（３号）：４０３〜４１０頁、１９９０年；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、「Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：
ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５巻：３３８９〜３４０２頁、１９９７年；Ｂａｘｅｖａｎｉｓら、「Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ
Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｗｉｌｅｙ、１９９８年；およびＭｉｓｅｎｅｒら（編）、「Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、１３２巻）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、１９９９年において記載されている。同一な配列を同定するステップに加えて、上述のプログラムは典型的に、同一性の程度の指標ももたらす。一部の実施形態では、それらの対応する残基のうちの少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％以上が関連する残基の連なりにわたり同一である場合に、２つの配列を実質的に同一であると考える。一部の実施形態では、関連する連なりを、完全な配列とする。一部の実施形態では、関連する連なりを、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２２５、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００、少なくとも３２５、少なくとも３５０、少なくとも３７５、少なくとも４００、少なくとも４２５、少なくとも４５０、少なくとも４７５、少なくとも５００以上の残基とする。
治療剤：本明細書で用いられる「治療剤」という語句は、所望の生物学的または薬理学的効果を誘発する任意の薬剤を指す。
処置：本明細書で用いられる「処置」という用語は、疾患、障害、または状態の１またはそれより多くの症状または様相を緩和するか、これらの発症を遅延させるか、これらの重症度もしくは発症率の低減またはこれらの予防をもたらすのに用いられる任意の方法を指す。本発明の目的では、症状の発症前に処置を行うこともでき、症状の発症時に処置を行うこともでき、かつ／または症状の発症後に処置を行うこともできる。
アンブレラトポロジー：本明細書では、「アンブレラトポロジー」という語句を用いて、特定のグリカン、特にＨＡ受容体におけるグリカンが取る３次元的配置を指す。本発明は、アンブレラトポロジーグリカンへの結合が、ヒト宿主の感染を媒介するＨＡタンパク質の特徴であることの認識を包含する。図６で例示する通り、アンブレラトポロジーを典型的に取るのは、α２−６シアル化グリカンだけであり、長鎖（例えば、四糖より長い）オリゴ糖に典型的である。一部の実施形態では、アンブレラトポロジーグリカンが、図６（右パネル）に提示される構造と実質的に同様の３次元構造を呈示するグリカンである。一部の実施形態では、アンブレラトポロジーグリカンが、図６（右パネル）に示されるアミノ酸残基を介してＨＡポリペプチドに接触するグリカンである。一部の実施形態では、アンブレラトポロジーグリカンが、図６（右パネル）に示されるアミノ酸結合ポケットに接触し、かつ／または特異的に結合することが可能なグリカンである。一部の実施形態では、グリカンの構造的トポロジーを、ＳｉａのＣ２、ＧａｌのＣ１、およびＧｌｃＮＡｃのＣ１の間の角として定義されるパラメータであるθに基づいて分類する。θ＜１００°の値は、α２−３グリカンおよび短鎖α２−６グリカンが取るコーン様トポロジーを表す。θ＞１１０°の値は、長鎖α２−６グリカンが取るトポロジーなどのアンブレラ様トポロジーを表す（図６）。アンブレラトポロジーの例は、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合の角φ約−６０によって与えられる（例えば、図１１を参照されたい）。図９は、アンブレラトポロジーを取りうるグリカンの特定の代表的な（網羅的ではないが）例を示す。図９に提示される長鎖α２−６モチーフは、非還元末端において生物学的なＮ結合型グリカン、Ｏ結合型グリカン、および糖脂質の一部として見出される長鎖（例えば、少なくとも三糖である）に結合するＮｅｕ５Ａｃα２−６を包含する。枠囲いした挿入図は、高親和性でＨＡに結合する生物学的グリカンの一部として見出されるアンブレラトポロジーの長鎖α２−６グリカン部分の例を示す。一部の実施形態では、アンブレラトポロジーグリカン（例えば、１つの部位における）が、短鎖α２−６（例えば、単一のラクトサミン）分枝より大きな比率で長鎖（例えば、複数のラクトサミン単位）α２−６オリゴ糖分枝を含む。一部の実施形態では、アンブレラトポロジーグリカン（例えば、１つの部位における）が、短鎖α２−６（例えば、単一のラクトサミン）分枝の約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、または約５０倍を超える長鎖α２−６オリゴ糖分枝を含む。一部の実施形態では、ＨＡのアンブレラトポロジーグリカンおよび／またはグリカンデコイとの相互作用の固有の特徴を、ＨＡの非還元末端においてシアル酸（ＳＡ）および／またはＳＡ類似体を含むグリカンとの接触とする。一部の実施形態では、オリゴ糖の鎖長を、少なくとも三糖（ＳＡまたはＳＡ類似体を除く）とする。一部の実施形態では、図６の右側パネルに示される番号付けされた残基の組合せが、アンブレラ様トポロジーとの接触に関与している。一部の実施形態では、アンブレラトポロジーグリカンを、以下の形態：
Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｓｕｇ１−Ｓｕｇ２−Ｓｕｇ３
［配列中、
（ａ）Ｎｅｕ５Ａｃα２−６が、典型的に（本質的にではないが）非還元末端にあり、
（ｂ）Ｓｕｇ１を、
（ｉ）α配置もしくはβ配置（Ｎ結合型伸長鎖およびＯ結合型伸長鎖ではβ配置とすることが多く、糖タンパク質にＯ結合するＧａｌＮＡｃα配置の場合はα配置とする）のヘキソース（ＧａｌまたはＧｌｃとすることが多い）もしくはヘキソサミン（ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ）とし、
（ｉｉ）Ｎｅｕ５Ａｃα２−６以外の糖が、Ｓｕｇ１（Ｓｕｇ１を、糖タンパク質にＯ結合したＧａｌＮＡｃα配置とする場合を除く）の非還元位置のうちのいずれにも結合しないとし、かつ／または
（ｉｉｉ）硫酸、リン酸、グアニジウム、アミン、Ｎ−アセチルなどの非糖部分を、Ｓｕｇ１（例えば、ＨＡとの接触を改善するために）の非還元位置（典型的には６位）に結合させることができ、
（ｃ）Ｓｕｇ２および／またはＳｕｇ３を、
（ｉ）α配置もしくはβ配置（β配置とすることが多い）のヘキソース（ＧａｌまたはＧｌｃとすることが多い）もしくはヘキソサミン（ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ）とし、かつ／または
（ｉｉ）糖（Ｆｕｃなど）もしくは硫酸、リン酸、グアニジウム、アミン、Ｎ−アセチルなどの非糖部分を、Ｓｕｇ２、Ｓｕｇ３、および／もしくはＳｕｇ４の非還元位置に結合させることができ、
（ｄ）Ｎｅｕ５Ａｃα２−６結合とは別に、オリゴ糖における任意の２つの糖の間の結合を、１−２結合、１−３結合、１−４結合、および／または１−６結合（典型的に１−３結合または１−４結合）とすることができ、かつ／または
（ｅ）Ｎｅｕ５Ａｃα２−６が、糖タンパク質にＯ結合したＧａｌＮＡｃαに結合し、さらなる糖がＧａｌＮＡｃαの非還元末端に結合する構造、例えば
を取る］
のオリゴ糖とする。
アンブレラトポロジー遮断剤（ＵＴＢＡ）：本明細書で用いられる「アンブレラトポロジー遮断剤」という用語は、アンブレラトポロジーグリカンを有するＨＡ受容体に結合する薬剤を指す。一部の実施形態では、ＵＴＢＡが、ヒト上気道中に見出されるアンブレラトポロジーグリカンを有するＨＡ受容体に結合する。ＵＢＴＡが、アンブレラトポロジーグリカンに結合する場合もあり、かつ／またはコーントポロジーグリカンに結合する場合もある。一部の実施形態では、ＵＴＢＡが、アンブレラトポロジーグリカンに、コーントポロジーグリカンに対するその親和性の５０、１００、１５０、または２００％の親和性で選択的に結合する。一部の実施形態では、ＵＴＢＡが、アンブレラトポロジーグリカンに、コーントポロジーグリカンに対するその親和性の５０〜１５０％の親和性で選択的に結合する。一部の実施形態では、ＵＴＢＡが、アンブレラトポロジーグリカンに、コーントポロジーグリカンに対するその親和性とほぼ同じ親和性で結合する。例えば、一部の実施形態では、ＵＴＢＡが、アンブレラトポロジーグリカン（例えば、６’ＳＬＮ−ＬＮ）に、それがコーントポロジーグリカン（例えば、３’ＳＬＮ−ＬＮ）に結合するときの親和性の約５０〜２００％、５０〜１５０％、またはほぼ同じ親和性で結合する。一部の実施形態では、ＵＴＢＡが、インフルエンザウイルス粒子（例えば、ヒトインフルエンザウイルスまたはトリインフルエンザウイルス）のＨＡ受容体への結合を、受容体のグリカントポロジー（例えば、アンブレラトポロジーまたはコーントポロジー）に基づいて選択的に阻害する。一部の実施形態では、ＵＴＢＡをポリペプチドとする。一部のこのような実施形態では、ＵＴＢＡポリペプチドが、天然のポリペプチドのアミノ酸配列と実質的に同一であるかまたは実質的に相同であるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＵＴＢＡポリペプチドをＨＡポリペプチドとする。一部の実施形態では、ＵＴＢＡポリペプチドを、天然のＨＡポリペプチドまたはその断片とする。一部の実施形態では、ＵＴＢＡポリペプチドが、ＨＡポリペプチドのアミノ酸配列とは類縁でないアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＵＴＢＡポリペプチドを、抗体またはその断片とする。一部の実施形態では、ＵＴＢＡポリペプチドを、レクチン（例えば、ＳＮＡ−１）とする。一部の実施形態では、ＵＴＢＡをポリペプチドでないとする。一部の実施形態では、ＵＴＢＡを低分子とする。一部の実施形態では、ＵＴＢＡを核酸とする。
アンブレラトポロジーグリカンの模倣体：「アンブレラトポロジーグリカンの模倣体」とは、本明細書で記載される結合剤に結合する、アンブレラトポロジーグリカン以外の薬剤である。一部の実施形態では、アンブレラトポロジーグリカンの模倣体が、ＨＡポリペプチドに結合する薬剤である。一部のこのような実施形態では、アンブレラトポロジーグリカンの模倣体が、残基９５、９８、１２８、１３０、１３１、１３２、１３３、１３５、１３６、１３７、１３８、１４５、１５３、１５５、１５６、１５８、１５９、１６０、１８３、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、２１９、２２１、２２２、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、およびこれらの組合せからなる群から選択されるＨＡポリペプチド残基と相互作用する薬剤である。一部のこのような実施形態では、アンブレラトポロジーグリカンの模倣体が、残基１３０、１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、２２８、およびこれらの組合せからなる群から選択されるＨＡポリペプチド残基と相互作用する薬剤である。一部のこのような実施形態では、アンブレラトポロジーグリカンの模倣体が、残基１６０、１９２、１９３、およびこれらの組合せからなる群から選択されるＨＡポリペプチド残基と相互作用する薬剤である。上記で言及したアミノ酸位置は、Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づくことに注意されたい。一部の実施形態では、ＨＡトポロジーグリカンの模倣体が、ＨＡポリペプチドとの相互作用についてアンブレラトポロジーグリカンと競合する薬剤である。
アンブレラトポロジー特異的遮断剤（ＵＴＳＢＡ）：本明細書で用いられる「アンブレラトポロジー特異的遮断剤」という用語は、ヒト上気道中に見出されるアンブレラトポロジーグリカンを有するＨＡ受容体に結合する薬剤を指す。ＵＴＳＢＡは、アンブレラトポロジーグリカンＨＡに選択的に結合する。例えば、ＵＴＳＢＡは、アンブレラトポロジーグリカン（例えば、６’ＳＬＮ−ＬＮ）に、それがコーントポロジーグリカン（例えば、３’ＳＬＮ−ＬＮ）に結合するときの親和性のほぼ少なくとも２、少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも１０倍の親和性で結合する。典型的に、ＵＴＳＢＡのアンブレラトポロジーグリカンに対する親和性は、１ｎＭより大きい。典型的に、ＵＴＳＢＡのコーントポロジーグリカンに対する親和性は、アンブレラトポロジーグリカンの、ＳＣ１８、Ｍｏｓ９９、Ｔｘ９１などのヒト適応型ＨＡ、およびＳＮＡ−Ｉなどのα２−６結合する植物レクチンに対する結合親和性の少なくとも２〜３桁の範囲内である。用量依存的な直接的結合アッセイにより測定されるＵＴＳＢＡの結合親和性（図１９および２０）は、典型的に、少なくとも１ｎＭとなるであろう。典型的に、ＵＴＳＢＡのコーントポロジーグリカンに対する親和性は、最大でも、コーントポロジーグリカンの、Ｖｉｅｔ０４０５株、Ａｖ１８株などのトリＨＡに対する結合親和性より１〜３桁小さい。一部の実施形態では、ＵＴＳＢＡが、インフルエンザウイルス粒子（例えば、ヒトインフルエンザウイルスまたはトリインフルエンザウイルス）のＨＡ受容体（例えば、Ｈ１、Ｈ２、もしくはＨ３、またはヒト適応型のＨ５、Ｈ７、もしくはＨ９）への結合を、グリカントポロジー（例えば、アンブレラトポロジーまたはコーントポロジー）に基づいて選択的に阻害する。一部の実施形態では、ＵＴＳＢＡをポリペプチドとする。一部のこのような実施形態では、ＵＴＳＢＡポリペプチドが、天然のポリペプチドのアミノ酸配列と実質的に同一であるかまたは実質的に相同であるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＵＴＳＢＡポリペプチドをＨＡポリペプチドとする。一部の実施形態では、ＵＴＳＢＡポリペプチドを、天然のＨＡポリペプチドまたはその断片とする。一部の実施形態では、ＵＴＳＢＡポリペプチドが、ＨＡポリペプチドのアミノ酸配列とは類縁でないアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＵＴＳＢＡポリペプチドを、抗体またはその断片とする。一部の実施形態では、ＵＴＳＢＡポリペプチドを、レクチン（例えば、ＳＮＡ−１）とする。一部の実施形態では、ＵＴＳＢＡをポリペプチドでないとする。一部の実施形態では、ＵＴＳＢＡを低分子とする。一部の実施形態では、ＵＴＳＢＡを核酸とする。
ワクチン接種：本明細書で用いられる「ワクチン接種」という用語は、例えば、病原作用物質に対する免疫反応を発生させることを意図する組成物の投与を指す。本発明の目的では、ワクチン接種を、病原作用物質への曝露前、曝露時、および／または曝露後に、ならびに、一部の実施形態では、この病原作用物質への曝露前、曝露時、および／または曝露直後に実施することができる。一部の実施形態では、ワクチン接種が、適切な形で時間間隔を置いた、ワクチン接種用組成物の複数回の投与を包含する。
変異体：本明細書で用いられる「変異体」という用語は、特定の対象のポリペプチド（例えば、ＨＡポリペプチド）と、その配列を比較する「親」ポリペプチドとの間の関係について記載する、関係についての用語である。対象のポリペプチドが、特定の位置における少数の配列変化を除き、親ポリペプチドのアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列を有する場合に、対象のポリペプチドを親ポリペプチドの「変異体」であると考える。典型的には、変異体中の残基のうち、親ポリペプチドと比較して置換されている残基が、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％より少ない。一部の実施形態では、変異体の残基が、親ポリペプチドと比較して１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１カ所置換されている。変異体の機能的残基（すなわち、特定の生物学的活性に関与する残基）の置換は、きわめて少数（例えば、５、４、３、２、または１カ所より少ない）であることが多い。さらに、変異体は、典型的に、親ポリペプチドと比較した付加または欠失が５、４、３、２、または１カ所以下であり、付加または欠失を有さないことが多い。さらに、いかなる付加または欠失も、典型的に約２５、約２０、約１９、約１８、約１７、約１６、約１５、約１４、約１３、約１０、約９、約８、約７、約６残基より少なく、一般に約５、約４、約３、または約２残基より少ない。一部の実施形態では、親ポリペプチドを、天然で見出されるポリペプチドとする。例えば、親ＨＡポリペプチドを、天然の（例えば、野生型の）インフルエンザウイルスの単離物中に見出されるポリペプチド（例えば、野生型のＨＡポリペプチド）とすることができる。
ベクター：本明細書で用いられる「ベクター」とは、それを連結した別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。一部の実施形態では、ベクターが、真核細胞または原核細胞などの宿主細胞において、それらを連結した核酸の染色体外における複製および／または発現を可能とする。本明細書では、作動可能に連結された遺伝子の発現を方向付けることが可能なベクターを、「発現ベクター」と称する。
野生型の：当技術分野で理解される通り、「野生型の」という語句は一般に、タンパク質または核酸の、天然で見出される通常の形態を指す。例えば、野生型のＨＡポリペプチドは、インフルエンザウイルスの天然の単離物中で見出される。異なる多様な野生型のＨＡ配列は、ＮＣＢＩによるインフルエンザウイルスの配列データベースである、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＦＬＵ／ＦＬＵ．ｈｔｍｌ中に見出すことができる。
特定の実施形態についての詳細な説明
本発明は、アンブレラトポロジーグリカンに結合する結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド、ＨＡポリペプチド変異体、ＬＳＢＡ、ＵＴＢＡ、ＵＴＳＢＡなど）を提供する。一部の実施形態では、本発明が、特定の標的種のＨＡ受容体において見出されるアンブレラトポロジーグリカンに結合する結合剤を提供する。例えば、一部の実施形態では、本発明が、ヒトＨＡ受容体、例えば、ヒト上皮細胞において見出されるＨＡ受容体において見出されるアンブレラトポロジーグリカンに結合する結合剤、特に上気道のヒトＨＡ受容体において見出されるアンブレラトポロジーグリカンに結合する結合剤を提供する。
本発明は、ヒト上気道の細胞において見出されるＨＡ受容体に結合する結合剤を提供し、特に、このような受容体に、指定された親和性および／または特異性で結合する（および／またはそれらのグリカンに結合する、特に、それらのアンブレラグリカンに結合する）結合剤を提供する。
一部の実施形態では、本発明による結合剤をＨＡポリペプチド配列とするか、または本発明による結合剤がＨＡポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本発明による結合剤が、天然の親ＨＡポリペプチド配列と、残基１３０、１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、２２８、およびこれらの組合せからなる群から選択される残基のうちの１またはそれより多くで異なるＨＡポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、本発明による結合剤が、天然の親ＨＡポリペプチド配列と、残基１６０、１９２、１９３、およびこれらの組合せからなる群から選択される残基のうちの１またはそれより多くで異なるＨＡポリペプチド配列を含む。
本発明は、アンブレラトポロジーグリカン（例えば、長鎖α２−６シアル化グリカン）に結合する能力、特に高親和性で結合する能力を獲得することにより、ＨＡポリペプチド変異体にヒトに感染する能力を付与しうる（その親ＨＡポリペプチドが感染可能でない場合に）ことの認識を包含する。特定のいかなる理論により拘束されることも望まないが、本発明者らは、アンブレラトポロジーグリカンへの結合が決定的な場合があり、特に、他のグリカン型への結合の喪失は要求されない場合があることを提起する。
本発明は、例えば、それらを同定するためのシステム、それらを調製する戦略、それらに結合する抗体、およびそれらに関連する多様な診断法および治療法を含めた、本発明による結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド、ＨＡポリペプチド変異体、ＵＴＢＡ、ＵＴＳＢＡなど）と関連する多様な試薬および方法をさらに提供する。本発明のこれらの態様の特定の実施形態および他の実施形態についてのさらなる説明を以下に示す。
血球凝集素（ＨＡ）
インフルエンザウイルスは、特定のウイルスの膜に埋め込まれた２つの糖タンパク質である、血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含有する脂質膜エンベロープを特徴とするＲＮＡウイルスである。１６のＨＡ亜型および９つのＮＡ亜型が公知であり、異なるインフルエンザ株は、株のＨＡ亜型およびＮＡ亜型の番号に基づいて命名されている。アミノ酸配列の同一性および結晶構造の比較に基づき、ＨＡ亜型は、２つの主要な群および４つの小クレードに分けられている。異なるＨＡ亜型は必ずしも高度のアミノ酸配列の同一性を共有するわけでないが、異なるＨＡ亜型の全体的な３Ｄ構造は、分類目的に用いうる複数の微細な差違を伴いながらも、互いと類似している。例えば、膜遠位側のサブドメインの、中央のα螺旋に対する特定の配向性は、ＨＡ亜型を決定するのに一般に用いられる１つの構造的特徴である（参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｕｓｓｅｌｌら、２００４年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３２５巻：２８７頁）。
ＨＡは、１６の亜型のうちの１つによるホモ三量体として膜内にて存在し、Ｈ１〜Ｈ１６と称する。これまでのところ、ヒト感染に適応しているのは、これらの亜型のうちの３つ（Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３）だけである。ヒトに感染するように適応したＨＡの報告された１つの特徴（例えば、流行性Ｈ１Ｎ１（１９１８年型）インフルエンザ亜型およびＨ３Ｎ２（１９６７〜６８年型）インフルエンザ亜型に由来するＨＡの特徴）は、それらが、α２−３シアル化グリカンに優先的に結合するそれらのトリ前駆体と比較して、α２−６シアル化グリカンに優先的に結合する能力である（それらの全てが参照により本明細書に組み込まれる、
しかし、本発明は、ヒト宿主に感染する能力は、特定の結合のグリカンへの結合との相関は小さいが、特定のトポロジーのグリカンへの結合との相関は大きいことの認識を包含する。したがって、本発明は、ヒトの感染を媒介するＨＡが、アンブレラトポロジーグリカンに結合し、コーントポロジーグリカンに対する優先性を上回るアンブレラトポロジーグリカンに対する優先性が示されることが多い（コーントポロジーグリカンがα２−６シアル化グリカンの場合でも）ことを裏付ける。
シアル化オリゴ糖（α２−３結合およびα２−６結合の両方の）に結合したＨ１（ヒトおよびブタ）亜型、Ｈ３（トリ）亜型、およびＨ５（トリ）亜型に由来するＨＡの複数の結晶構造が入手可能であり、これらにより、ＨＡのこれらのグリカンとの異なる相互作用に関与している特定のアミノ酸への分子的洞察がもたらされる（それらの全てが参照により本明細書に組み込まれる、
例えば、単独であるかまたはα２−３シアル化オリゴ糖またはα２−６シアル化オリゴ糖に結合したＨ５（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／３／９７）の結晶構造により、特定の結合したグリカンと直接相互作用するアミノ酸が同定され、また、分離度１次または複数次で隔てられたアミノ酸も同定される（参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｔｅｖｅｎｓら、２００１年、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９８巻：１１１８１頁）。場合によっては、これらの残基の立体配座が、非結合状態と対比した結合状態において異なる。例えば、Ｇｌｕ１９０、Ｌｙｓ１９３、およびＧｌｎ２２６の全ては、直接的な結合相互作用に関与し、立体配座が非結合状態と対比した結合状態において異なる。また、Ｇｌｕ１９０に近位であるＡｓｎ１８６の立体配座も、非結合状態と対比した結合状態において著明に異なる。
結合剤
上記で言及した通り、本発明は、アンブレラトポロジーグリカンへの結合が、例えば、ヒトを含めた特定の宿主の感染を媒介する能力と相関することの知見を包含する。したがって、本発明は、アンブレラグリカンに結合する（および／またはアンブレラトポロジーグリカンの模倣体に結合する）結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド、ＨＡポリペプチド変異体、ＬＳＢＡ、ＵＴＢＡ、ＵＴＳＢＡなど）を提供する。一部の実施形態では、本発明による結合剤が、アンブレラグリカンに高親和性で結合する（および／またはアンブレラトポロジーグリカンの模倣体に高親和性で結合する）。一部の実施形態では、本発明による結合剤が、複数の異なるアンブレラトポロジーグリカンに、高度な親和性および／または特異性で結合することが多い。
一部の実施形態では、本発明による結合剤が、アンブレラトポロジーグリカン（例えば、長鎖α２−６シアル化グリカン、例えば、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−など）に、高親和性で結合する。例えば、一部の実施形態では、本発明による結合剤が、ヒトの感染を媒介する野生型のＨＡ（例えば、Ｈ１Ｎ１ ＨＡまたはＨ３Ｎ２ ＨＡ）について観察される親和性と同等な親和性でアンブレラトポロジーグリカンに結合する。一部の実施形態では、本発明による結合剤が、アンブレラグリカンに、同等の条件下でヒトの感染を媒介する野生型のＨＡについて観察される親和性の少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の親和性で結合する。一部の実施形態では、本発明による結合剤が、アンブレラグリカンに、ヒトの感染を媒介する野生型のＨＡについて同等の条件下で観察される親和性より大きな親和性で結合する。
一部の実施形態では、本発明による結合剤の結合親和性を、ある濃度範囲にわたり評価する。特に、多価結合アッセイでは、このような戦略により、単一濃度の解析より著明に多くの情報がもたらされる。一部の実施形態では、例えば、本発明による結合剤の結合親和性を、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０倍以上の範囲の濃度にわたり評価する。
一部の実施形態では、それらが本明細書で記載されるアッセイなどの多価グリカンアレイ結合アッセイにおいて飽和シグナルを示す場合に、本発明による結合剤が高親和性を示す。一部の実施形態では、それらがこのような研究において約４０００００以上を上回る（例えば、約５０００００、約６０００００、約７０００００、約８０００００などを上回る）シグナルを示す場合に、本発明による結合剤が高親和性を示す。一部の実施形態では、本明細書で記載される結合剤が、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍以上の濃度範囲にわたりアンブレラグリカンに対する飽和結合を示し、一部の実施形態では、１０倍以上に及ぶ濃度範囲にわたりアンブレラグリカンに対する飽和結合を示す。
さらに、一部の実施形態では、本発明による結合剤が、コーントポロジーグリカンに結合するより強力にアンブレラトポロジーグリカン（および／またはアンブレラトポロジーグリカンの模倣体）に結合する。一部の実施形態では、本発明による結合剤が、アンブレラグリカンに対して、コーングリカンと対比して約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、または約２の相対的親和性を示す。
一部の実施形態では、本発明による結合剤が、α２−６シアル化グリカンに結合し、一部の実施形態では、本発明による結合剤が、α２−６シアル化グリカンに優先的に結合する。一部の実施形態では、本発明による結合剤が、複数の異なるα２−６シアル化グリカンに結合する。一部の実施形態では、本発明による結合剤が、α２−３シアル化グリカンに結合することが可能ではないが、一部の実施形態では、本発明による結合剤が、α２−３シアル化グリカンに結合することが可能である。
一部の実施形態では、本発明による結合剤が、ヒト上気道上皮細胞において見出される受容体に結合する。一部の実施形態では、本発明による結合剤が、気管支および／または気管のＨＡ受容体に結合する。一部の実施形態では、本発明による結合剤が、肺深部の受容体に結合することが可能ではないが、一部の実施形態では、本発明による結合剤が、肺深部の受容体に結合することが可能である。
一部の実施形態では、本発明による結合剤が、ヒト上気道組織（例えば、上皮細胞）のＨＡ受容体において見出されるグリカンのうちの少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％以上に結合する。
一部の実施形態では、本発明による結合剤が、図９で例示されるグリカンのうちの１またはそれより多くに結合する。一部の実施形態では、本発明による結合剤が、図９で例示される複数のグリカンに結合する。一部の実施形態では、本発明による結合剤が、図９で例示されるグリカンに、高度な親和性および／または特異性で結合する。一部の実施形態では、本発明による結合剤が、図９で例示されるグリカンに、図８で例示されるグリカンに対するそれらの結合と比較して優先的に結合する。一部の実施形態では、本発明による結合剤が、以下の形態：
Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｓｕｇ１−Ｓｕｇ２−Ｓｕｇ３
［配列中、
１．Ｎｅｕ５Ａｃα２−６が、常にまたはほとんど常に非還元末端にあり、
２．Ｓｕｇ１を、
ａ．α配置もしくはβ配置（Ｎ結合型伸長鎖およびＯ結合型伸長鎖ではβ配置とすることが多く、糖タンパク質にＯ結合するＧａｌＮＡｃα配置の場合はα配置とする）のヘキソース（ＧａｌまたはＧｌｃとすることが多い）もしくはヘキソサミン（ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ）とし、
ｂ．Ｎｅｕ５Ａｃα２−６以外の糖が、Ｓｕｇ１（Ｓｕｇ１を糖タンパク質にＯ結合したＧａｌＮＡｃα配置とする場合を除く）の非還元位置のうちのいずれにも結合しないものとし、かつ／または
ｃ．硫酸、リン酸、グアニジウム、アミン、Ｎ−アセチルなどの非糖部分を、ＨＡとの接触を改善するために、Ｓｕｇ１の非還元位置（典型的には６位）に結合させることができ、
３．Ｓｕｇ２および／またはＳｕｇ３を、
ａ．α配置もしくはβ配置（β配置とすることが多い）のヘキソース（ＧａｌまたはＧｌｃとすることが多い）もしくはヘキソサミン（ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ）とし、かつ／または
ｂ．糖（Ｆｕｃなど）もしくは硫酸、リン酸、グアニジウム、アミン、Ｎ−アセチルなどの非糖部分を、Ｓｕｇ２、Ｓｕｇ３、および／もしくはＳｕｇ４の非還元位置に結合させることができ、
４．Ｎｅｕ５Ａｃα２−６結合とは別に、オリゴ糖における任意の２つの糖の間の結合を、１−２結合、１−３結合、１−４結合、および／または１−６結合（典型的に１−３結合または１−４結合）とすることができ、かつ／または
５．Ｎｅｕ５Ａｃα２−６が、糖タンパク質にＯ結合したＧａｌＮＡｃαに結合し、さらなる糖がＧａｌＮＡｃαの非還元末端に結合する構造、例えば、
を取る］
のオリゴ糖に結合する。
本発明は、結合特異性が指定された結合剤を提供し、また、結合特徴がアンブレラグリカンとの関係で指定された結合剤も提供する。
本発明が提供する特定の具体的な結合剤については、以下でより詳細に説明する。
ＨＡポリペプチド
一部の実施形態では、本発明による結合剤をＨＡポリペプチドとする。例えば、本発明は、結合特異性が指定された、単離されたＨＡポリペプチドを提供し、また、結合特徴がアンブレラグリカンとの関係で指定された、操作されたＨＡポリペプチドも提供する。
一部の実施形態では、提供される結合特徴が指定されたＨＡポリペプチドを、Ｈ１ポリペプチドとする。一部の実施形態では、結合特徴が指定された本発明によるＨＡポリペプチドを、Ｈ２ポリペプチドとする。一部の実施形態では、結合特徴が指定された本発明によるＨＡポリペプチドを、Ｈ３ポリペプチドとする。一部の実施形態では、結合特徴が指定された本発明によるＨＡポリペプチドを、Ｈ４ポリペプチドとする。一部の実施形態では、結合特徴が指定された本発明によるＨＡポリペプチドを、Ｈ５ポリペプチドとする。一部の実施形態では、結合特徴が指定された本発明によるＨＡポリペプチドを、Ｈ６ポリペプチドとする。一部の実施形態では、結合特徴が指定された本発明によるＨＡポリペプチドを、Ｈ７ポリペプチドとする。一部の実施形態では、結合特徴が指定された本発明によるＨＡポリペプチドを、Ｈ８ポリペプチドとする。一部の実施形態では、結合特徴が指定された本発明によるＨＡポリペプチドを、Ｈ９ポリペプチドとする。一部の実施形態では、結合特徴が指定された本発明によるＨＡポリペプチドを、Ｈ１０ポリペプチドとする。一部の実施形態では、結合特徴が指定された本発明によるＨＡポリペプチドを、Ｈ１１ポリペプチドとする。一部の実施形態では、結合特徴が指定された本発明によるＨＡポリペプチドを、Ｈ１２ポリペプチドとする。一部の実施形態では、結合特徴が指定された本発明によるＨＡポリペプチドを、Ｈ１３ポリペプチドとする。一部の実施形態では、結合特徴が指定された本発明によるＨＡポリペプチドを、Ｈ１４ポリペプチドとする。一部の実施形態では、結合特徴が指定された本発明によるＨＡポリペプチドを、Ｈ１５ポリペプチドとする。一部の実施形態では、結合特徴が指定された本発明によるＨＡポリペプチドを、Ｈ１６ポリペプチドとする。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチドが、株：Ａ／Ｓｏｕｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ／１／１９１８；Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４；Ａ／Ｔａｉｗａｎ／１／１９８６；Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／１９９１；Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／１９９５；Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／９２／１９９６；Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９；Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６のうちのいずれに由来するＨ１タンパク質も包含しない。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチドが、１９５７〜５８年のアジアにおけるインフルエンザの流行時の株のうちのいずれに由来するＨ２タンパク質でもない。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチドが、株：Ａ／Ｊａｐａｎ／３０５＋／１９５７；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／１９５７；Ａ／Ｔａｉｗａｎ／１／１９６４；Ａ／Ｔａｉｗａｎ／１／１９６７のうちのいずれに由来するＨ２タンパク質も包含しない。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチドが、株：Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８；Ａ／Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｓ／２／１９８２；Ａ／Ｍｉｓｓｉｓｓｉｐｐｉ／１／１９８５；Ａ／Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ／３６０／１９８６；Ａ／Ｓｉｃｈｕａｎ／２／１９８７；Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／１１／１９８７；Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３５３／１９８９；Ａ／Ｓｈａｎｄｏｎｇ／９／１９９３；Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／３３／１９９４；Ａ／Ｎａｎｃｈａｎｇ／８１３／１９９５；Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／１９９７；Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／１９９９；Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／１９９９；Ａ／Ｗｙｏｍｉｎｇ／３／２００３；Ａ／Ｏｋｌａｈｏｍａ／３２３／２００３；Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００４；Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６５／２００５のうちのいずれに由来するＨ３タンパク質も包含しない。
変異体のＨＡポリペプチド
一部の実施形態では、そのアミノ酸配列が少数の特定の配列変化を除き親ＨＡポリペプチドのアミノ酸配列と同一である点において、提供されるＨＡポリペプチドを、親ＨＡの変異体とする。一部の実施形態では、親ＨＡを、インフルエンザウイルスの天然の単離物中に見出されるＨＡポリペプチド（例えば、野生型のＨＡポリペプチド）とする。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド変異体のグリカン結合特徴が、それらの対応する親ＨＡポリペプチドと異なる。一部の実施形態では、本発明によるＨＡ変異体ポリペプチドのアンブレラグリカンに対する親和性および／または特異性（例えば、コーングリカンに対する親和性および／または特異性と比較した）が、それらのコグネイトの親ＨＡポリペプチドより大きい。一部の実施形態では、このようなＨＡポリペプチド変異体を、操作された変異体とする。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡ変異体ポリペプチドのアンブレラグリカンに対する親和性および／または特異性が、それらのコグネイトの親ＨＡポリペプチドと比較して大きい。一部の実施形態では、本発明によるＨＡ変異体ポリペプチドのコーントポロジーグリカンに対する親和性および／または特異性が、それらのコグネイトの親ＨＡポリペプチドと比較して低減される。一部の実施形態では、本発明によるＨＡ変異体ポリペプチドのアンブレラグリカンに対する親和性および／または特異性が、それらのコグネイトの親ＨＡポリペプチドと比較して大きく、コーントポロジーグリカンに対する親和性および／または特異性が低減される。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡ変異体ポリペプチドのα２−６グリカンに対する親和性および／または特異性が、それらのコグネイトの親ＨＡポリペプチドと比較して大きい。一部の実施形態では、本発明によるＨＡ変異体ポリペプチドのα２−３グリカンに対する親和性および／または特異性が、それらのコグネイトの親ＨＡポリペプチドと比較して低減される。一部の実施形態では、本発明によるＨＡ変異体ポリペプチドのα２−６グリカンおよびα２−３グリカンに対する親和性および／または特異性が、それらのコグネイトの親ＨＡポリペプチドと比較して大きい。一部の実施形態では、本発明によるＨＡ変異体ポリペプチドのα２−６グリカンに対する親和性および／または特異性が、それらのコグネイトの親ＨＡポリペプチドと比較して大きく、α２−３グリカンに対する親和性および／または特異性が低減される。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡ変異体ポリペプチドのアンブレラトポロジーグリカンおよびα２−３グリカンに対する親和性および／または特異性が、それらのコグネイトの親ＨＡポリペプチドと比較して大きい。一部の実施形態では、本発明によるＨＡ変異体ポリペプチドのアンブレラトポロジーグリカンに対する親和性および／または特異性が、それらのコグネイトの親ＨＡポリペプチドと比較して大きく、α２−３グリカンに対する親和性および／または特異性が低減される。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡ変異体ポリペプチドのα２−６グリカンおよびコーントポロジーグリカンに対する親和性および／または特異性が、それらのコグネイトの親ＨＡポリペプチドと比較して大きい。一部の実施形態では、本発明によるＨＡ変異体ポリペプチドのα２−６グリカンに対する親和性および／または特異性が、それらのコグネイトの親ＨＡポリペプチドと比較して大きく、コーントポロジーグリカンに対する親和性および／または特異性が低減される。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド変異体が、異なるＨＡ亜型中に見出されるＨＡ配列と符合する１またはそれより多くの配列変化を含有する。具体的な一例を挙げると、一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体が、Ｈ５
ＨＡポリペプチド変異体をＨ２ ＨＡポリペプチドに酷似させる１またはそれより多くの配列変化を含有する。別の具体例を挙げると、一部の実施形態では、本発明によるＨ５
ＨＡポリペプチド変異体が、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体をＨ１ ＨＡポリペプチドに酷似させる１またはそれより多くの配列変化を含有する。
本発明は特に、グリコシル化を変化させたＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、またはＨ１６のＨＡポリペプチド変異体）が、基準のＨＡポリペプチドと比較して２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍以上の親和性をヒトＨＡ受容体に対して示しうることの認識を包含する。本発明はまた特に、ＨＡのループ領域を変化させたＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、またはＨ１６のＨＡポリペプチド変異体）が、基準のＨＡポリペプチド（例えば、配列番号４３〜５５のうちのいずれかのＨＡポリペプチド）と比較して２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍以上の親和性をヒトＨＡ受容体に対して示しうることの認識も包含する。
本発明は特に、グリコシル化を変化させたＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、またはＨ１６のＨＡポリペプチド変異体）が、基準のＨＡポリペプチドと比較して２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍以上の特異性をヒトＨＡ受容体に対して示しうることの認識を包含する。本発明はまた特に、ＨＡのループ領域を変化させたＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、またはＨ１６のＨＡポリペプチド変異体）が、基準のＨＡポリペプチド（例えば、配列番号４３〜５５のうちのいずれかのＨＡポリペプチド）と比較して２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍以上の特異性をヒトＨＡ受容体に対して示しうることの認識も包含する。
一部の実施形態では、基準のＨＡポリペプチドを、Ａ／Ｓｏｕｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ／１／１８（Ｈ１Ｎ１）（配列番号４３）に由来するＨＡとする。一部の実施形態では、基準のＨＡポリペプチドを、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７（配列番号４４）に由来するＨＡとする。一部の実施形態では、基準のＨＡポリペプチドを、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／０９（配列番号４５）に由来するＨＡとする。一部の実施形態では、基準のＨＡポリペプチドを、Ａ／Ａｌｂａｎｙ／６／５８（Ｈ２Ｎ２）（配列番号４６）に由来するＨＡとする。一部の実施形態では、基準のＨＡポリペプチドを、Ａ／Ａｉｃｈｉ／１／６８（配列番号４７）に由来するＨＡとする。一部の実施形態では、基準のＨＡポリペプチドを、Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／９９（配列番号４８）に由来するＨＡとする。一部の実施形態では、基準のＨＡポリペプチドを、Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／０９（配列番号４９）に由来するＨＡとする。一部の実施形態では、基準のＨＡポリペプチドを、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（配列番号５０）に由来するＨＡとする。一部の実施形態では、基準のＨＡポリペプチドを、Ａ／Ｅｇｙｐｔ／２７８６−ＮＡＭＲＵ３／０６（配列番号５１）に由来するＨＡとする。一部の実施形態では、基準のＨＡポリペプチドを、Ａ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ／１０７／０３（配列番号５２）に由来するＨＡとする。一部の実施形態では、基準のＨＡポリペプチドを、Ａ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／４８６／９７（配列番号５３）に由来するＨＡとする。一部の実施形態では、基準のＨＡポリペプチドを、Ａ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／２１３／０３（配列番号５４）に由来するＨＡとする。一部の実施形態では、基準のＨＡポリペプチドを、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５（配列番号５５）に由来するＨＡとする。
一部の実施形態では、グリカン結合特徴を変化させたＨＡポリペプチド変異体が、グリカン結合部位内の残基またはグリカン結合部位に影響を及ぼす残基において、１またはそれより多くの配列変化を有する。一部の実施形態では、このような置換を、結合したグリカンと直接相互作用するアミノ酸の置換とし、一部の実施形態では、分離度１次で隔てられたアミノ酸は、（１）直接的に結合するアミノ酸と相互作用するか、（２）直接的に結合するアミノ酸がグリカンと相互作用する能力に他の形で影響を及ぼすが、グリカン自体とは直接相互作用しないか、または（３）直接的に結合するアミノ酸がグリカンと相互作用する能力に他の形で影響を及ぼし、また、グリカン自体とも直接相互作用するので、このような置換を、結合したグリカンと相互作用するアミノ酸から分離度１次で隔てられたアミノ酸の置換とする。本発明によるＨＡポリペプチド変異体は、１もしくは複数の直接的に結合するアミノ酸、１もしくは複数の分離度１次のアミノ酸、１もしくは複数の分離度２次のアミノ酸、またはこれらの任意の組合せの置換を含有する。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド変異体が、１またはそれより多くの分離度がなおより高次なアミノ酸の置換を含有しうる。
一部の実施形態では、グリカン結合特徴を変化させたＨＡポリペプチド変異体が、Ｎｅｕ５ＡｃおよびＧａｌの向こう側の糖と接触する残基において配列変化を有する（例えば、図７を参照されたい）。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体が、野生型の親ＨＡと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド変異体が、コグネイトの野生型の親ＨＡと比較して少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ以上のアミノ酸置換を有し、一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド変異体が、２つ、３つ、または４つのアミノ酸置換を有する。一部の実施形態では、このようなアミノ酸置換の全てを、グリカン結合部位内に配置する。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド変異体が、米国特許公開第２００９／０２６９３４２号および同第２０１０／０００４１９５号のうちのいずれか、ならびに２０１０年７月２日に出願され、「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＤＩＡＧＮＯＳＩＮＧ ＡＮＤ／ＯＲ ＴＲＥＡＴＩＮＧ ＩＮＦＬＵＥＮＺＡ ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ」と題する、米国特許出願第１２／８２９９３１号（これらの全てが参照により本明細書に組み込まれる）において記載されている１またはそれより多くのアミノ酸置換を含有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体が、残基９５、９８、１２８、１３０、１３１、１３２、１３３、１３５、１３６、１３７、１３８、１４５、１５３、１５５、１５６、１５８、１５９、１６０、１８３、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、２１９、２２１、２２２、２２４、２２５、２２６、２２７、および２２８のうちの１またはそれより多くに対応する位置において配列の置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体、特に、Ｈ５ポリペプチド変異体が、残基９５、９８、１２８、１３０、１３１、１３２、１３３、１３５、１３６、１３７、１３８、１４５、１５３、１５５、１５６、１５８、１５９、１６０、１８３、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、２１９、２２１、２２２、２２４、２２５、２２６、２２７、および２２８からなる群から選択される残基において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５）と比べて１またはそれより多くのアミノ酸置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体、特に、Ｈ５ポリペプチド変異体が、残基９５、９８、１２８、１３０、１３１、１３２、１３３、１３５、１３６、１３７、１３８、１４５、１５３、１５５、１５６、１５８、１５９、１６０、１８３、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、２１９、２２１、２２２、２２４、２２５、２２６、２２７、および２２８からなる群から選択される任意の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、または３７残基において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５）と比べて１またはそれより多くのアミノ酸置換を有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、アミノ酸１５８位に対応する部位におけるグリコシル化を低減または消失させる配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、アミノ酸１５８位に対応する部位に結合したグリカンの同一性および／または構造に影響を及ぼし、かつ／またはこれを変化させる配列置換を有する。一部の実施形態では、このような配列置換は、１５８位に対応する部位における突然変異、例えば、Ａｓｎ１５８Ｘａａ［ＸａａはＡｓｎ以外の任意のアミノ酸である］である。一部の実施形態では、このような配列置換は、１６０位に対応する部位における突然変異、例えば、Ｔｈｒ１６０Ｘａａ［ＸａａはＡｓｎ以外の任意のアミノ酸である］である。一部の実施形態では、このような配列置換が、突然変異Ｔｈｒ１６０Ａｌａを含む。一部の実施形態では、アミノ酸１５８位に対応する部位におけるグリコシル化を低減するか、消失させるか、これに影響を及ぼすか、またはこれを変化させる配列置換により、非Ｈ２
ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）を、Ｈ２ ＨＡポリペプチドに酷似させる（例えば、構造的にも機能的にも酷似させる）ことができる。一部の実施形態では、１６０位に対応する部位における突然変異（例えば、Ｔｈｒ１６０ＡｌａなどのＴｈｒ１６０Ｘａａ）により、非Ｈ２ ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）を、Ｈ２ ＨＡポリペプチドに酷似させる（例えば、構造的にも機能的にも酷似させる）ことができる。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基２２６、２２８、および１６０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基２２６、２２８、および１６０に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基２２６および１６０に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基２２８および１６０に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基２２６および２２８に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基２２６、２２８、および１５８のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基２２６、２２８、および１５８に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基２２６および１５８に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基２２８および１５８に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基２２６および２２８に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、ＨＡポリペプチドのループ領域のうちの１またはそれより多くにおいて欠失を包含する配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５
ＨＡポリペプチド変異体）が、ＨＡポリペプチドの１２８〜１３７のループ領域に対応する部位において欠失を包含する配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、ＨＡポリペプチドの残基１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、および／または１３７に対応するアミノ酸位置のうちの１またはそれより多くにおいて欠失を包含する配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、ＨＡポリペプチドの１２８〜１３４のループ領域に対応する部位において欠失を包含する配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、ＨＡポリペプチドの残基１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、および／または１３４に対応するアミノ酸位置のうちの１またはそれより多くにおいて欠失を包含する配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３０に対応するアミノ酸の欠失を包含する配列置換を有する。一部の実施形態では、このようなループ領域の置換により、非Ｈ２ ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）を、Ｈ２ ＨＡポリペプチドに酷似させる（例えば、構造的にも機能的にも酷似させる）ことができる。一部の実施形態では、残基１３０に対応するアミノ酸の欠失により、非Ｈ２ ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）を、Ｈ２ ＨＡポリペプチドに酷似させる（例えば、構造的にも機能的にも酷似させる）ことができる。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、２２８、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、２２８、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、または１４個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、および２２８のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、および２２８のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、または１３個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３１、１３２、１３５、１８８、１９２、２２１、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３１、１３２、１３５、１８８、１９２、２２１、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、または７個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３１、１３２、１３５、１８８、１９２、および２２１のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３１、１３２、１３５、１８８、１９２、および２２１のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、または６個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３３、１３７、１５５、１９３、２２６、２２７、２２８、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５
ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３３、１３７、１５５、１９３、２２６、２２７、２２８、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、または８個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５
ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３３、１３７、１５５、１９３、２２６、２２７、および２２８のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３３、１３７、１５５、１９３、２２６、２２７、および２２８のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、または７個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３０、１９２、および１９３のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３０、１９２、１９３のうちの任意の１個、２個、または３個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１９２および１９３のうちの一方または両方に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、２２８、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、２２８、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、または１６個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、および２２８のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、および２２８のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、または１５個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、または７個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、および２２８のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、および２２８のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、または６個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、２２８、１３１、１３２、１３３、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、２２８、１３１、１３２、１３３、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、または１１個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、２２８、１３１、１３２、および１３３のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、２２８、１３１、１３２、および１３３のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基２２７、１３１、１３２、１３３、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基２２７、１３１、１３２、１３３、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、または５個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基２２７、１３１、１３２、および１３３のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基２２７、１３１、１３２、および１３３のうちの任意の１個、２個、３個、または４個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３１、１３３、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、２２８、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３１、１３３、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、２２８、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、または１１個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３１、１３３、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、および２２８のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３１、１３３、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、および２２８のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３１、１３３、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３１、１３３、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３１、１３３、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２６、および２２８のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３１、１３３、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２６、および２２８のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、または９個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３１、１３３、１３７、１５５、１５９、１６０、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、２２８、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３１、１３３、１３７、１５５、１５９、１６０、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、２２８、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、または１３個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３１、１３３、１３７、１５５、１５９、１６０、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、および２２８のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３１、１３３、１３７、１５５、１５９、１６０、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、および２２８のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、または１２個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３１、１３３、１３７、１５５、１５９、１６０、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３１、１３３、１３７、１５５、１５９、１６０、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、または１２個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３１、１３３、１３７、１５５、１５９、１６０、１８８、１９２、１９３、２２６、および２２８のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３１、１３３、１３７、１５５、１５９、１６０、１８８、１９２、１９３、２２６、および２２８のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、または１１個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、１３１、１３２、１３３、２２１、２２７、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、１３１、１３２、１３３、２２１、２２７、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、または１２個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、１３１、１３２、１３３、２２１および２２７のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、１３１、１３２、１３３、２２１、および２２７のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、または１１個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３１、１３２、１３３、２２１、２２７、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３１、１３２、１３３、２２１、２２７、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、または６個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３１、１３２、１３３、２２１、および２２７のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３１、１３２、１３３、２２１、および２２７のうちの任意の１個、２個、３個、４個、または５個に対応する位置において、野生型の親ＨＡ（例えば、Ｈ５ ＨＡ）と比べて配列置換を有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体、特にＨ５ポリペプチド変異体が、残基９８、１３６、１５３、１５５、１８３、および１９４が含まれるがこれらに限定されない、グリカンに直接結合する受容体の領域に位置するアミノ酸から選択される残基において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くのアミノ酸置換を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド変異体、特にＨ５ポリペプチド変異体が、（ａ）残基９８および１９５、（ｂ）残基９８、１３８、１８６、１８７、１９５、および２２８、または（ｃ）残基１３８、１８６、１８７、および２２８が含まれるがこれらに限定されない、グリカンに直接結合する受容体の領域に隣接して位置するアミノ酸から選択される残基において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くのアミノ酸置換を有する。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド変異体、特にＨ５変異体が、以下のアミノ酸置換のうちの１またはそれより多くを有する：
（アミノ酸置換中、Ｘａａ＝Ａｓｎ以外の任意のアミノ酸）、
一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１９２に対応する位置においてその位置において電荷をスイッチするアミノ酸置換を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１９３に対応する位置においてその位置において電荷をスイッチするアミノ酸置換を有する。例えば、一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基１９２に対応する位置においてＴｈｒまたは疎水性残基（例えば、ＶａｌまたはＩｌｅ）を有し、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）（例えば、ヒト適応型変異体）が、残基１９２に対応する位置において親水性残基を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）（例えば、ヒト適応型変異体）が、残基１９２に対応する位置において親水性残基を有する。別の例を挙げれば、一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基１９２に対応する位置においてＴｈｒまたは疎水性残基（例えば、ＶａｌまたはＩｌｅ）を有し、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）（例えば、ヒト適応型変異体）が、残基１９２に対応する位置において塩基性残基（例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇ）を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）（例えば、ヒト適応型変異体）が、残基１９２に対応する位置において塩基性残基（例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇ）を有する。さらに別の例を挙げれば、一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基１９３に対応する位置において塩基性残基（例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇ）を有し、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）（例えば、ヒト適応型変異体）が、残基１９３に対応する位置において中性残基または酸性残基を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）（例えば、ヒト適応型変異体）が、残基１９３に対応する位置において中性残基または酸性残基を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）（例えば、ヒト適応型変異体）が、残基１９３に対応する位置においてＴｈｒ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、またはＶａｌを有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）のヒト適応化が、１８８位における残基の特性（複数可）と関連する。Ｈ５ ＨＡでは、残基１８８が、残基１９２においてＴｈｒまたは疎水性残基と接触するＡｌａであることが多い。これに対し、Ｈ２ ＨＡでは、残基１８８が、残基１９２においてＡｒｇまたはＬｙｓと接触するＧｌｕまたはＡｓｐであることが多い。よって、一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、１８８位においてＧｌｕを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、１８８位においてＡｓｐを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、Ａｌａ１８８Ｇｌｕ置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、Ａｌａ１８８Ａｓｐ置換を有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基１８８に対応する位置においてＡｌａを有し、残基１９２に対応する位置においてＴｈｒを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基１８８に対応する位置においてＡｌａを有し、残基１９２に対応する位置において疎水性残基を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１８８に対応する位置においてＧｌｕを有し、残基１９２に対応する位置においてＡｒｇを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１８８に対応する位置においてＡｓｐを有し、残基１９２に対応する位置においてＡｒｇを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１８８に対応する位置においてＧｌｕを有し、残基１９２に対応する位置においてＬｙｓを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１８８に対応する位置においてＡｓｐを有し、残基１９２に対応する位置においてＬｙｓを有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基１８８に対応する位置においてＡｌａを有し、残基１９２に対応する位置においてＴｈｒを有し、残基１９３に対応する位置においてＬｙｓを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基１８８に対応する位置においてＡｌａを有し、残基１９２に対応する位置において疎水性残基を有し、残基１９３に対応する位置においてＬｙｓを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基１８８に対応する位置においてＡｌａを有し、残基１９２に対応する位置においてＴｈｒを有し、残基１９３に対応する位置においてＡｒｇを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基１８８に対応する位置においてＡｌａを有し、残基１９２に対応する位置において疎水性残基を有し、残基１９３に対応する位置においてＡｒｇを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１８８に対応する位置においてＧｌｕを有し、残基１９２に対応する位置においてＡｒｇを有し、残基１９３に対応する位置においてＴｈｒを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１８８に対応する位置においてＡｓｐを有し、残基１９２に対応する位置においてＡｒｇを有し、残基１９３に対応する位置においてＴｈｒを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１８８に対応する位置においてＧｌｕを有し、残基１９２に対応する位置においてＬｙｓを有し、残基１９３に対応する位置においてＴｈｒを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５
ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１８８に対応する位置においてＡｓｐを有し、残基１９２に対応する位置においてＬｙｓを有し、残基１９３に対応する位置においてＴｈｒを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１８８に対応する位置においてＧｌｕを有し、残基１９２に対応する位置においてＡｒｇを有し、残基１９３に対応する位置においてＴｈｒ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、またはＶａｌを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１８８に対応する位置においてＡｓｐを有し、残基１９２に対応する位置においてＡｒｇを有し、残基１９３に対応する位置においてＴｈｒ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、またはＶａｌを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１８８に対応する位置においてＧｌｕを有し、残基１９２に対応する位置においてＬｙｓを有し、残基１９３に対応する位置においてＴｈｒ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、またはＶａｌを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１８８に対応する位置においてＡｓｐを有し、残基１９２に対応する位置においてＬｙｓを有し、残基１９３に対応する位置においてＴｈｒ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、またはＶａｌを有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基１３１に対応する位置においてＡｌａを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３１に対応する位置においてＴｈｒを有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基１３２に対応する位置においてＳｅｒを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３２に対応する位置においてＴｈｒを有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基１３３に対応する位置においてＳｅｒを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３３に対応する位置においてＴｈｒを有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基１３１、１３２、および／または１３３に対応する任意の位置においてＡｌａ、Ｔｈｒ、および／またはＳｅｒを包含する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３１、１３２、および／または１３３に対応する任意の位置においてＡｌａ、Ｔｈｒ、および／またはＳｅｒを包含する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、１３１、１３２、および１３３に対応する位置の全てにおいてＴｈｒを包含する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基１３５に対応する位置においてＶａｌを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３５に対応する位置においてＶａｌ以外の任意のアミノ酸を有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基１３７に対応する位置においてＳｅｒを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１３７に対応する位置においてＡｒｇを有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基１５５に対応する位置においてＩｌｅを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１５５に対応する位置においてＴｈｒを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基１５５に対応する位置においてＴｈｒを包含する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基１５５に対応する位置においてＴｈｒを包含する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基２２１に対応する位置においてＳｅｒを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基２２１に対応する位置においてＰｒｏを有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基２２１に対応する位置においてＳｅｒを包含する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基２２１に対応する位置においてＰｒｏを包含する。特定のいかなる一つの理論により拘束されることも望まないが、Ｐｒｏ２２１は、Ｈ２ ＨＡのＲＢＳと関与する２２０ループの立体配座に影響を及ぼしうるであろう。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基２２６に対応する位置においてＧｌｎを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基２２６に対応する位置においてＬｅｕを有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基２２７に対応する位置においてＳｅｒを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基２２７に対応する位置においてＧｌｙを有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基２２８に対応する位置においてＧｌｙを有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基２２８に対応する位置においてＳｅｒを有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、残基２２６、２２７、および２２８に対応する位置において、それぞれ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、およびＧｌｙ残基を包含する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、残基２２６、２２７、および２２８に対応する位置において、それぞれ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、およびＳｅｒを包含する。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド変異体、特にＨ５変異体が、表示される位置（これらの位置の番号付けは、Ｈ３ ＨＡの番号付けに対応する）において以下のアミノ酸：
・Δ１３０（「Δ１３０」とは、１３０位に対応するアミノ酸における欠失を示す）＋残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋残基１３１、１３２、１３５、１８８、１９２、および２２１に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋残基１３３、１３７、１５５、１９３、２２６、２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋残基１３１、１３３、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋残基１３１、１３３、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２６、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋残基１３１、１３３、１３７、１５５、１５９、１６０、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋残基１３１、１３３、１３７、１５５、１５９、１６０、１８８、１９２、１９３、２２６、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、１３１、１３２、１３３、２２１、および２２７に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋残基１３１、１３２、１３３、２２１、および２２７に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、２２８、１３１、１３２、および１３３に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋残基２２７、１３１、１３２、および１３３に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
（Ｘａａ＝任意のアミノ酸）
・Δ１３０、Ｘａａ１３１Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、Ｘａａ１３２Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、Ｘａａ１３３Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ２２１Ｐｒｏ、Ｓｅｒ２２７Ｇｌｙ（Ｘａａ＝任意のアミノ酸）
・Δ１３０、Ｘａａ１９２Ｘａａ’（Ｘａａ＝任意の疎水性アミノ酸、およびＸａａ’＝任意の親水性アミノ酸）
・Δ１３０、Ｘａａ１９２Ｌｙｓ／Ａｒｇ（Ｘａａ＝任意の疎水性残基）
・Δ１３０、Ｘａａ１９３Ｘａａ’（Ｘａａ＝塩基性残基、例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇ、およびＸａａ’＝中性残基または酸性残基）
・Δ１３０、Ｌｙｓ／Ａｒｇ１９３Ｔｈｒ／Ａｌａ／Ｍｅｔ／Ｖａｌ
・Δ１３０、Ｘａａ１９２Ｘａａ’（Ｘａａ＝任意の疎水性アミノ酸、およびＸａａ’＝任意の親水性アミノ酸）、Ｘａａ１９３Ｘａａ’（Ｘａａ＝塩基性残基、例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇ、およびＸａａ’＝中性残基または酸性残基）
・Δ１３０、Ｘａａ１９２Ｌｙｓ／Ａｒｇ（Ｘａａ＝任意の疎水性残基）、Ｘａａ１９３Ｘａａ’（Ｘａａ＝塩基性残基、例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇ、およびＸａａ’＝中性残基または酸性残基）
・Δ１３０、Ｘａａ１９２Ｘａａ’（Ｘａａ＝任意の疎水性アミノ酸、およびＸａａ’＝任意の親水性アミノ酸）、Ｌｙｓ／Ａｒｇ１９３Ｔｈｒ／Ａｌａ／Ｍｅｔ／Ｖａｌ
・Δ１３０、Ｘａａ１９２Ｌｙｓ／Ａｒｇ（Ｘａａ＝任意の疎水性残基）、Ｌｙｓ／Ａｒｇ１９３Ｔｈｒ／Ａｌａ／Ｍｅｔ／Ｖａｌ
・Δ１３０、Ａｌａ１８８Ｇｌｕ
・Δ１３０、Ａｌａ１８８Ａｓｐ
・Δ１３０、Ｘａａ１９２Ｘａａ’（Ｘａａ＝任意の疎水性アミノ酸、およびＸａａ’＝任意の親水性アミノ酸）、Ａｌａ１８８Ｇｌｕ
・Δ１３０、Ｘａａ１９２Ｌｙｓ／Ａｒｇ（Ｘａａ＝任意の疎水性残基）、Ａｌａ１８８Ｇｌｕ
・Δ１３０、Ｘａａ１９３Ｘａａ’（Ｘａａ＝塩基性残基、例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇ、およびＸａａ’＝中性残基または酸性残基）、Ａｌａ１８８Ｇｌｕ
・Δ１３０、Ｌｙｓ／Ａｒｇ１９３Ｔｈｒ／Ａｌａ／Ｍｅｔ／Ｖａｌ、Ａｌａ１８８Ｇｌｕ
・Δ１３０、Ｘａａ１９２Ｘａａ’（Ｘａａ＝任意の疎水性アミノ酸、およびＸａａ’＝任意の親水性アミノ酸）、Ａｌａ１８８Ａｓｐ
・Δ１３０、Ｘａａ１９２Ｌｙｓ／Ａｒｇ（Ｘａａ＝任意の疎水性残基）、Ａｌａ１８８Ａｓｐ
・Δ１３０、Ｘａａ１９３Ｘａａ’（Ｘａａ＝塩基性残基、例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇ、およびＸａａ’＝中性残基または酸性残基）、Ａｌａ１８８Ａｓｐ
・Δ１３０、Ｌｙｓ／Ａｒｇ１９３Ｔｈｒ／Ａｌａ／Ｍｅｔ／Ｖａｌ、Ａｌａ１８８Ａｓｐ
・Δ１３０、Ｘａａ１９２Ｘａａ’（Ｘａａ＝任意の疎水性アミノ酸、およびＸａａ’＝任意の親水性アミノ酸）、Ｘａａ１９３Ｘａａ’（Ｘａａ＝塩基性残基、例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇ、およびＸａａ’＝中性残基または酸性残基）、Ａｌａ１８８Ｇｌｕ
・Δ１３０、Ｘａａ１９２Ｌｙｓ／Ａｒｇ（Ｘａａ＝任意の疎水性残基）、Ｘａａ１９３Ｘａａ’（Ｘａａ＝塩基性残基、例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇ、およびＸａａ’＝中性残基または酸性残基）、Ａｌａ１８８Ｇｌｕ
・Δ１３０、Ｘａａ１９２Ｘａａ’（Ｘａａ＝任意の疎水性アミノ酸、およびＸａａ’＝任意の親水性アミノ酸）、Ｌｙｓ／Ａｒｇ１９３Ｔｈｒ／Ａｌａ／Ｍｅｔ／Ｖａｌ、Ａｌａ１８８Ｇｌｕ
・Δ１３０、Ｘａａ１９２Ｌｙｓ／Ａｒｇ（Ｘａａ＝任意の疎水性残基）、Ｌｙｓ／Ａｒｇ１９３Ｔｈｒ／Ａｌａ／Ｍｅｔ／Ｖａｌ、Ａｌａ１８８Ｇｌｕ
・Δ１３０、Ｘａａ１９２Ｘａａ’（Ｘａａ＝任意の疎水性アミノ酸、およびＸａａ’＝任意の親水性アミノ酸）、Ｘａａ１９３Ｘａａ’（Ｘａａ＝塩基性残基、例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇ、およびＸａａ’＝中性残基または酸性残基）、Ａｌａ１８８Ａｓｐ
・Δ１３０、Ｘａａ１９２Ｌｙｓ／Ａｒｇ（Ｘａａ＝任意の疎水性残基）、Ｘａａ１９３Ｘａａ’（Ｘａａ＝塩基性残基、例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇ、およびＸａａ’＝中性残基または酸性残基）、Ａｌａ１８８Ａｓｐ
・Δ１３０、Ｘａａ１９２Ｘａａ’（Ｘａａ＝任意の疎水性アミノ酸、およびＸａａ’＝任意の親水性アミノ酸）、Ｌｙｓ／Ａｒｇ１９３Ｔｈｒ／Ａｌａ／Ｍｅｔ／Ｖａｌ、Ａｌａ１８８Ａｓｐ
・Δ１３０、Ｘａａ１９２Ｌｙｓ／Ａｒｇ（Ｘａａ＝任意の疎水性残基）、Ｌｙｓ／Ａｒｇ１９３Ｔｈｒ／Ａｌａ／Ｍｅｔ／Ｖａｌ、Ａｌａ１８８Ａｓｐ
のうちの１またはそれより多くを有する。
一部の実施形態では、本発明が、それらのアミノ酸配列が、以下に示されるエレメント：
・Ｘ１３０＋Ｘ１３１、Ｘ１３２、Ｘ１３３、Ｘ１３５、Ｘ１３７、Ｘ１５５、Ｘ１８８、Ｘ１９２、Ｘ１９３、Ｘ２２１、Ｘ２２６、Ｘ２２７、およびＸ２２８のうちの任意の可能な組合せ
・Ｘ１３０＋Ｘ１３１、Ｘ１３２、Ｘ１３５、Ｘ１８８、Ｘ１９２、およびＸ２２１のうちの任意の可能な組合せ
・Ｘ１３０＋Ｘ１３３、Ｘ１３７、Ｘ１５５、Ｘ１９３、Ｘ２２６、Ｘ２２７、およびＸ２２８のうちの任意の可能な組合せ
・Ｘ１３０＋Ｘ１３１、Ｘ１３２、Ｘ１３３、Ｘ１３５、Ｘ１３７、Ｘ１５５、Ｘａａ１５８（Ｘａａ＝Ａｓｎ以外の任意のアミノ酸）、Ｘ１６０、Ｘ１８８、Ｘ１９２、Ｘ１９３、Ｘ２２１、Ｘ２２６、Ｘ２２７、およびＸ２２８のうちの任意の可能な組合せ
・Ｘ１３０＋Ｘ１３１、Ｘ１３３、Ｘ１３７、Ｘ１５５、Ｘ１８８、Ｘ１９２、Ｘ１９３、Ｘ２２６、Ｘ２２７、およびＸ２２８のうちの任意の可能な組合せ
・Ｘ１３０＋Ｘ１３１、Ｘ１３３、Ｘ１３７、Ｘ１５５、Ｘ１８８、Ｘ１９２、Ｘ１９３、Ｘ２２６、およびＸ２２８のうちの任意の可能な組合せ
・Ｘ１３０＋Ｘ１３１、Ｘ１３３、Ｘ１３７、Ｘ１５５、Ｘ１５９、Ｘ１６０、Ｘ１８８、Ｘ１９２、Ｘ１９３、Ｘ２２６、Ｘ２２７、およびＸ２２８のうちの任意の可能な組合せ
・Ｘ１３０＋Ｘ１３１、Ｘ１３３、Ｘ１３７、Ｘ１５５、Ｘ１５９、Ｘ１６０、Ｘ１８８、Ｘ１９２、Ｘ１９３、Ｘ２２６、およびＸ２２８のうちの任意の可能な組合せ
・Ｘ１３０＋Ｘ１３７、Ｘ１８８、Ｘ１９２、Ｘ１９３、Ｘ２２６、Ｘ２２８、Ｘ１３１、Ｘ１３２、Ｘ１３３、Ｘ２２１、およびＸ２２７のうちの任意の可能な組合せ
・Ｘ１３０＋Ｘ１３１、Ｘ１３２、Ｘ１３３、Ｘ２２１、およびＸ２２７のうちの任意の可能な組合せ
・Ｘ１３０＋Ｘ１３７、Ｘ１８８、Ｘ１９２、Ｘ１９３、Ｘ２２６、およびＸ２２８のうちの任意の可能な組合せ
・Ｘ１３０＋Ｘ１３７、Ｘ１８８、Ｘ１９２、Ｘ１９３、Ｘ２２６、Ｘ２２７、Ｘ２２８、Ｘ１３１、Ｘ１３２、およびＸ１３３のうちの任意の可能な組合せ
・Ｘ１３０＋Ｘ２２７、Ｘ１３１、Ｘ１３２、およびＸ１３３のうちの任意の可能な組合せ
［ここで、Ｘ＝任意のアミノ酸（上記で別段に指定しない限り）、および／またはＸ＝欠失アミノ酸］（これらの位置の番号付けは、Ｈ３ ＨＡの番号付けに対応する）
を包含する、ＨＡポリペプチド（例えば、ＨＡポリペプチド変異体、操作されたＨＡポリペプチド、および／または操作されたＨＡポリペプチド変異体）を提供する。
一部の実施形態では、Ｘ１３０が、１３０位における欠失である。一部の実施形態では、Ｘ１６０がＡｌａである。一部の実施形態では、Ｘ１５８が、Ａｓｎ以外の任意のアミノ酸である。
一部のこのような実施形態では、変異体のアンブレラグリカンに対する親和性および／または特異性が増大するように、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、野生型のＨ５ ＨＡポリペプチドと比較して少なくとも１つのさらなる置換を有する。
一部のこのような実施形態では、変異体のアンブレラグリカンに対する親和性および／または特異性が増大するように、ＨＡポリペプチドが、野生型のＨＡポリペプチドと比較して少なくとも１つのさらなる置換を有する。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Ｌ２２６、Ｓ２２８、およびＡ１６０を包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Ｌ２２６およびＡ１６０を包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Ｓ２２８およびＡ１６０を包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Ａ１６０を包含する配列を有する。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Ｌ２２６、Ｓ２２８、およびＸ１５８（Ｘ＝Ａｓｎ以外の任意のアミノ酸）を包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（Ｈ５
ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Ｌ２２６およびＸ１５８を包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Ｓ２２８およびＸ１５８を包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Ｘ１５８を包含する配列を有する。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、ならびに残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｌ２２６、Ｓ２２８、Ａ１６０、ならびに残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１８８、１９２、１９３、２２１、および２２７に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｌ２２６、Ａ１６０、ならびに残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１８８、１９２、１９３、２２１、２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｓ２２８、Ａ１６０、ならびに残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１８８、１９２、１９３、２２１、および２２７に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｌ２２６、Ｓ２２８、ならびに残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、および２２７に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ａ１６０、ならびに残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｌ２２６、ならびに残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、および２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｓ２２８、ならびに残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、および２２７に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｌ２２６、Ｓ２２８、Ｘ１５８（Ｘ＝Ａｓｎ以外の任意のアミノ酸）、ならびに残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、および２２７に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｌ２２６、Ｘ１５８、ならびに残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｓ２２８、Ｘ１５８、ならびに残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、および２２７に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｌ２２６、Ｓ２２８、ならびに残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、および２２７に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｘ１５８（Ｘ＝Ａｓｎ以外の任意のアミノ酸）、ならびに残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。
一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、親ＨＡと比較して、特に野生型の親ＨＡと比較して開放性の結合部位を有する。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、アンブレラトポロジーグリカンに結合する。一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチドが、図９に示されるグリカン（例えば、α２−６シアル化グリカン）のうちの少なくとも一部に結合する。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、図９に示される複数のグリカンに結合する。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド）が、ヒト上気道組織（例えば、上皮細胞）内のＨＡ受容体において見出されるグリカンのうちの少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％以上に結合する。
一態様では、本発明が、高親和性によるアンブレラトポロジーグリカンへの結合だけでは、ヒトに対する効果的な伝染／感染性を付与するのに十分ではありえないことの具体的な認識を提供する。本発明は、また、コーントポロジーグリカンへの結合の低減も重要でありうることの洞察を提供する。一部の実施形態では、高親和性によるアンブレラトポロジーグリカンへの結合およびコーントポロジーグリカンへの結合親和性の低減が、ヒトに対する効果的な伝染／感染性を付与することに関与している可能性がある。一部の実施形態では、高親和性によるアンブレラトポロジーグリカンへの結合は、ヒトに対する効果的な伝染／感染性を付与するのに十分である。一部の実施形態では、コーントポロジーグリカンへの結合親和性を低減しない（例えば、変化させない、増大させるなど）場合であっても、高親和性によるアンブレラトポロジーグリカンへの結合は、ヒトに対する効果的な伝染／感染性を付与するのに十分である。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）のアンブレラトポロジーグリカンへの結合親和性および／または結合特異性の増大ならびにコーントポロジーグリカンへの結合親和性および／または結合特異性の低減が、ヒトに対する伝染／感染性を、基準のポリペプチド（例えば、ＨＡポリペプチド変異体のコグネイトである親ＨＡポリペプチド）と比べて増大させるかまたは増強することに関与している可能性がある。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）のアンブレラトポロジーグリカンへの結合親和性および／または結合特異性の増大は、ヒトに対する伝染／感染性を基準のポリペプチド（例えば、ＨＡポリペプチド変異体のコグネイトである親ＨＡポリペプチド）と比べて増大させるかまたは増強するのに十分である。一部の実施形態では、コーントポロジーグリカンへの結合親和性および／または結合特異性を低減しない（例えば、変化させない、増大させるなど）場合であっても、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）のアンブレラトポロジーグリカンへの結合親和性および／または結合特異性の増大は、ヒトに対する伝染／感染性を基準のポリペプチド（例えば、ＨＡポリペプチド変異体のコグネイトである親ＨＡポリペプチド）と比べて増大させるかまたは増強するのに十分である。一部の実施形態では、コーントポロジーグリカンへの結合親和性および／または結合特異性が、アンブレラトポロジーグリカンへの結合親和性および／または結合特異性と同等であり、かつ／またはこれより大きい場合であっても、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）のアンブレラトポロジーグリカンへの結合親和性および／または結合特異性の増大は、ヒトに対する伝染／感染性を基準のポリペプチド（例えば、ＨＡポリペプチド変異体のコグネイトである親ＨＡポリペプチド）と比べて増大させる かまたは増強するのに十分である。
ＨＡポリペプチドの部分または断片
本発明は、本発明によるＨＡポリペプチドの特徴的部分（これらは結合剤の場合もあり、結合剤でない場合もある）およびそれらをコードする核酸をさらに提供する。一般に、特徴的部分とは、それらが併せてＨＡポリペプチドの特徴となる、アミノ酸の連続的な連なりまたはアミノ酸の連続的な連なりの集合を含有する部分である。このような連続的連なりの各々は一般に、少なくとも２つのアミノ酸を含有する。さらに当業者は、典型的に少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０以上のアミノ酸が、Ｈ５ ＨＡポリペプチドの特徴となるように要求されることを理解するであろう。一般に、特徴的部分とは、上記で指定した配列同一性に加えて、関連するインタクトＨＡポリペプチドと少なくとも１つの機能的特徴を共有する部分である。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチドの特徴的部分が、関連する全長ＨＡポリペプチドとグリカン結合特徴を共有する。
非ＨＡポリペプチド
一部の実施形態では、本発明により提供される結合剤が、それらのアミノ酸配列が特徴的なＨＡ配列を包含しないポリペプチドである。本明細書では、このようなポリペプチドを「非ＨＡポリペプチド」と称する。一部の実施形態では、非ＨＡポリペプチドが、あらかじめ（例えば、例えば、基準配列と比較した戦略的なアミノ酸変化［例えば、付加、欠失、および／または置換］の導入を含めた合理的なデザインを介して）選択されるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、非ＨＡポリペプチドが、化学量論的に決定され、例えば、本明細書で規定される所望の結合特徴に基づいて同定されるアミノ酸配列を有する。
抗体
一部の実施形態では、本発明により提供される結合剤を、抗体（例えば、アンブレラトポロジーグリカンおよび／またはアンブレラトポロジーグリカンの模倣体に結合する抗体）とする。本発明に適する抗体は、任意のアンブレラトポロジーグリカンのエピトープに免疫特異的に結合する抗体または抗体断片を包含する。本明細書で用いられる「抗体」という用語は、指定されたタンパク質またはペプチド、またはその断片に対して特異的に反応性である免疫グロブリンおよびこれらの断片を包含することを意図する。適切な抗体には、ヒト抗体、霊長動物化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、コンジュゲート抗体（すなわち、他のタンパク質、放射性標識、細胞毒素にコンジュゲートするかまたは融合させた抗体）、Ｓｍａｌｌ Ｍｏｄｕｌａｒ ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（「ＳＭＩＰ（商標）」）、単鎖抗体、ラクダ抗体、および抗体断片が含まれるがこれらに限定されない。本明細書で用いられる「抗体」という用語にはまた、インタクトモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一ドメイン抗体（例えば、サメの単一ドメイン抗体（例えば、ＩｇＮＡＲまたはその断片））、少なくとも２つのインタクト抗体から形成される多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、およびそれらが所望の生物学的活性を呈示する限りにおける抗体断片も含まれる。本明細書で用いられる抗体ポリペプチドは、任意の種類（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）でありうる。
本明細書で用いられる「抗体断片」は、例えば、抗体の抗原結合領域または可変領域など、インタクト抗体の部分を包含する。抗体断片の例は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、およびＦｖ断片；トリアボティー；テトラボディー；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；および抗体断片から形成される多重特異性抗体を包含する。「抗体断片」という用語はまた、特定の抗原に結合して複合体を形成することにより抗体と同様に作用する、任意の合成タンパク質または遺伝子操作されたタンパク質も包含する。例えば、抗体断片は、重鎖および軽鎖の可変領域からなる単離された断片である「Ｆｖ」断片、軽鎖可変領域および重鎖可変領域がペプチドリンカーで連結されている組換え単鎖ポリペプチド分子（「ＳｃＦｖタンパク質」）、および超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小の認識単位を包含する。
抗体は、当技術分野で周知の方法を用いて発生させることができる。例えば、抗体を生成させるためのプロトコールは、参照により本明細書に組み込まれる、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８年、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」により記載されている。典型的に、抗体は、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ラクダ、ラマ、サメ、または他の適切な宿主において発生させることができる。代替的に、抗体は、ＩｇＹ分子を生成させるニワトリにおいても作製することができる（参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｃｈａｄｅら、１９９６年、ＡＬＴＥＸ、１３巻（５号）：８０〜８５頁）。一部の実施形態では、本発明に適する抗体を、類人霊長動物抗体とする。例えば、ヒヒにおいて治療的に有用な抗体を作製する一般的な技法は、例えば、これらのいずれもが参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇら、国際特許公開第ＷＯ９１／１１４６５号、１９９１年；およびＬｏｓｍａｎら、１９９０年、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ、４６巻：３１０頁において見出すことができる。一部の実施形態では、モノクローナル抗体を、ハイブリドーマ法を用いて調製することができる（参照により本明細書に組み込まれる、ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、１９８３年、Ｎａｔｕｒｅ、３０５巻（５９３４号）：５３７〜４０頁）。一部の実施形態ではまた、モノクローナル抗体を、組換え法を介して作製することもできる（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，１６６，４５２号、１９７９年）。
一部の実施形態では、本発明に適する抗体が、ヒト化抗体またはヒト抗体を包含しうる。非ヒト抗体のヒト化形態とは、非ヒトＩｇに由来する最小限の配列を含有する、キメラＩｇ、Ｉｇ鎖、またはＩｇ断片（Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、またはＡｂの他の抗原に結合する部分配列など）である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト供給源から導入された１またはそれより多くのアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「インポート」可変ドメインから取り込まれることが典型的である「インポート」残基と称することが多い。ヒト化は、齧歯動物の相補性決定領域（ＣＤＲ）またはＣＤＲ配列を、ヒト抗体の対応する配列で置換することにより達成する（これらのいずれもが参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８年、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻（６１６２号）：３２３〜７頁；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻（４８４７号）：１５３４〜６頁）。このような「ヒト化」抗体とは、非ヒト種に由来する対応する配列で置換されたインタクトヒト可変ドメインが実質的に少ないキメラＡｂである（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，８１６，５６７号、１９８９年）。一部の実施形態では、ヒト化抗体を、一部のＣＤＲ残基、および、おそらくは、一部のＦＲ残基が、齧歯動物Ａｂにおける類似の部位に由来する残基で置換されているヒト抗体とすることが典型的である。ヒト化抗体は、レシピエントのＣＤＲに由来する残基が、所望の特異性、親和性、および効能を有する、マウス、ラット、またはウサギなど、非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲに由来する残基で置換されているヒトＩｇ（レシピエント抗体）を包含する。場合によっては、対応する非ヒト残基を、ヒトＩｇのＦｖフレームワーク残基により置換する。ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、インポートされたＣＤＲ配列またはフレームワーク配列にも見出されない残基を含みうる。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトＩｇのＣＤＲ領域に対応するＣＤＲ領域のうちの全てではないにせよこれらの大半、およびＦＲ領域のうちの全てではないにせよこれらの大半を、ヒトＩｇコンセンサス配列の領域とする、少なくとも１つの、および典型的には２つの可変ドメインのうちの実質的に全てを含む。ヒト化抗体はまた、Ｉｇ定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒトＩｇのＦｃの少なくとも一部も含むことが最適である（これらのいずれもが参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８年、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻（６１６２号）：３２３〜７頁；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ．、２３９巻（４８４７号）：１５３４〜６頁）。
ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーを含めた多様な技法（これらのいずれもが参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９１年、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２８巻（９号）：１０２７〜３７頁；Ｍａｒｋｓら、１９９１年、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．、２２２巻（３号）：５８１〜９７頁）、およびヒトモノクローナル抗体の調製（参照により本明細書に組み込まれる、ＲｅｉｓｆｅｌｄおよびＳｅｌｌ、１９８５年、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖ．、４巻（１号）：２７１〜９０頁）を用いて生成させることもできる。同様に、ヒトＩｇ遺伝子の、内因性のＩｇ遺伝子を部分的または完全に不活化させたトランスジェニック動物への導入も、ヒト抗体を合成するのに利用することができる。感作すると、遺伝子の再構成、アセンブリー、および抗体レパートリーを含めた全ての点においてヒトにおいて見られるヒト抗体の生成に酷似するヒト抗体の生成が観察される（それらの全てが参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、１９９６年、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１４巻（７号）：８４５〜５１頁；Ｌｏｎｂｅｒｇら、１９９４年、Ｎａｔｕｒｅ、３６８巻（６４７４号）：８５６〜９頁；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、１９９５年、Ｉｎｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３巻（１号）：６５〜９３頁；Ｍａｒｋｓら、１９９２年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ Ｙ）、１０巻（７号）：７７９〜８３頁）。
レクチン
一部の実施形態では、本発明により提供される結合剤を、レクチンとする。レクチンとは、可溶性の炭水化物、または糖コンジュゲート（例えば、糖ペプチドまたは糖脂質）の一部である炭水化物部分に結合しうる糖結合タンパク質である。レクチンは典型的に、特定の動物細胞を凝集させ、かつ／または特定の糖部分を認識することにより、糖コンジュゲートを沈殿させる。例えば、ＳＮＡ−１とは、α２−６シアル酸に対する親和性が高いレクチンである。さらに別の例として述べると、Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ ｓｑｕａｍｏｓｕｓのレクチン（ＰＳＬ１ａおよびＰＳＬ１ｂ）は、アスパラギン結合型糖タンパク質の三糖配列であるＮｅｕ５Ａｃα２，６Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ／ＧｌｃＮＡｃを含有するシアル化糖コンジュゲートに結合するときの親和性が高い。結合剤として作用しうる非限定的な例示的レクチンには、ＳＮＡ−１、ＳＮＡ−１’、ＰＳＬ１ａ、ＰＳＬ１ｂ、およびこれらに由来するポリペプチドが含まれる。
例示的なレクチンのアミノ酸配列を以下に示す。
Ｓａｍｂｕｃｕｓ Ｎｉｇｒａのレクチン１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号第Ｕ２７１２２号）：
Ｓａｍｂｕｃｕｓ Ｎｉｇｒａのレクチン１’（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号第Ｕ６６１９１号）：
Ｐｏｌｙｐｏｒｏｕｓ ｓｑｕａｍｏｓｕｓのレクチン１ａ（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ７５ＷＴ９）
Ｐｏｌｙｐｏｒｏｕｓ ｓｑｕａｍｏｓｕｓのレクチン１ｂ（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ７５ＷＴ８）
アプタマー
一部の実施形態では、本発明により提供される結合剤をアプタマーとする。アプタマーとは、特定の分子標的（例えば、アンブレラトポロジーグリカン）に緊密に結合する核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）からなる高分子である。特定のアプタマーは、直鎖状のヌクレオチド配列を介して記載することができ、典型的には長さが約１５〜約６０ヌクレオチドである。いかなる理論により拘束されることも望まないが、アプタマー中のヌクレオチド鎖が、この分子を複雑な３次元的形状へとフォールディングする分子内相互作用を形成し、この３次元的形状により、アプタマーがその標的分子の表面に緊密に結合することが可能となることが目論まれる。全ての可能なヌクレオチド配列の母集団内に存在する分子的形状の並外れた多様性を踏まえるなら、タンパク質および低分子を含めた多彩な分子標的についてもアプタマーを得ることができる。高度な特異性に加えて、それらの標的に対するアプタマーの親和性は極めて高い（例えば、タンパク質に対して、ピコモル〜低濃度のナノモル範囲の親和性）。アプタマーは化学的に安定であり、活性を喪失させることなく煮沸することもでき、凍結させることもできる。アプタマーは合成分子であるため、それらの機能を特定の適用に最適化しうる各種の修飾を施しやすい。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏの適用において用いるために、アプタマーを修飾して、それらの血中の酵素による分解に対する感受性を劇的に低減することができる。加えて、アプタマーを修飾して、それらの生体内分布または血漿中貯留時間を変化させることもできる。
アンブレラトポロジーグリカン（および／またはアンブレラトポロジーグリカンの模倣体）に結合しうるアプタマーの選択は、当技術分野で公知の方法を介して達成することができる。例えば、アプタマーは、ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法を用いて選択することができる（参照により本明細書に組み込まれる、ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ、１９９０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９巻：５０５〜５１０頁）。ＳＥＬＥＸ法では、核酸分子の大規模なライブラリー（例えば、１０１５の異なる分子）を、標的分子（例えば、アンブレラトポロジーグリカンのエピトープを有するアンブレラトポロジーグリカン）と共に生成させ、かつ／またはスクリーニングする。標的分子は、ある時間にわたりヌクレオチド配列のライブラリーと共にインキュベートすることが可能である。次いで、当技術分野で公知の複数の方法を用いて、アプタマーの標的分子を、混合物中の結合していない分子（これらは廃棄することができる）から物理的に分離することができる。次いで、標的分子に対する親和性が最も高いアプタマーを、標的分子から精製し、酵素的に増幅して、標的分子に結合しうるアプタマーについて実質的に濃縮された新たな分子ライブラリーを生成させることができる。次いで、濃縮されたライブラリーを用いて、選択、分配、および増幅の新たなサイクルを開始することができる。５〜１５サイクルにわたるこの反復的な選択工程、分配工程、および増幅工程の後、ライブラリーを、標的分子に緊密に結合する少数のアプタマーへと縮減する。次いで、混合物中の個別の分子を単離し、それらのヌクレオチド配列を決定し、結合親和性および特異性との関係におけるそれらの特性を測定および比較することができる。次いで、単離されたアプタマーをさらに洗練して、標的への結合および／またはアプタマー構造に寄与しない任意のヌクレオチドを消失させ、これにより、それらのコア結合ドメインへと切断されたアプタマーを生成させることができる。アプタマー法の総説については、その教示の全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｊａｙａｓｅｎａ、１９９９年、Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ．、４５巻：１６２８〜５０頁を参照されたい。
ポリペプチドの生成
本発明によるポリペプチド（例えば、ＨＡポリペプチドおよび／または非ＨＡポリペプチド）、および／もしくはそれらの特徴的部分、またはそれらをコードする核酸は、任意の利用可能な手段を介して生成させることができる。
本発明によるポリペプチド（またはそれらの特徴的部分）は、例えば、本発明によるポリペプチドをコードする核酸を発現させるように操作された宿主細胞系を用いることにより生成させることができる。
鶏卵、バキュロウイルス、植物、酵母、メイティン−ダービーイヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、またはＶｅｒｏ（アフリカミドリザル腎臓）細胞など、任意の系を用いてポリペプチド（または特徴的部分）を生成させることができる。代替的にまたは加えて、ポリペプチド（または特徴的部分）は、発現ベクターの使用を介するなどの組換え法を用いて細胞内で発現させることができる（参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）。
代替的にまたは加えて、本発明によるポリペプチド（またはそれらの特徴的部分）は、合成的手段を介して生成させることもできる。
代替的にまたは加えて、本発明によるポリペプチド（またはそれらの特徴的部分）、特にＨＡポリペプチドは、その他野生型であるか、弱毒化されているか、死滅しているかどうかなど、インタクトなウイルスの文脈で生成させることができる。また、本発明によるポリペプチド（例えば、ＨＡポリペプチド）、またはそれらの特徴的部分は、ウイルス様粒子の文脈でも生成させることができる。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド（またはそれらの特徴的部分）を、インフルエンザウイルスから単離および／または精製することができる。例えば、ウイルスは、孵化鶏卵などの卵内で増殖させることができるが、この場合、採取される物質は典型的に、尿膜腔液である。代替的にまたは加えて、インフルエンザウイルスは、組織培養物を用いてウイルスを増殖させる任意の方法に由来しうる。ウイルスを増殖させるのに適する細胞基質には、例えば、ＭＤＣＫ細胞またはＭＤＣＫ細胞、ＭＤＣＫ様細胞のクローンに由来する細胞などのイヌ腎臓細胞、Ｖｅｒｏ細胞を含めたＡＧＭＫ細胞などのサル腎臓細胞、連続継代細胞系として培養された上皮細胞、２９３Ｔ細胞、ＢＫ−２１細胞、ＣＶ−１細胞、または市販供給源（例えば、ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から容易に入手可能な、ワクチンを目的としてインフルエンザウイルスを生成させるのに適する他の任意の哺乳動物細胞型が含まれる。また、適切な細胞基質は、ＭＲＣ−５細胞などのヒト細胞も包含する。適切な細胞基質は、細胞系に限定されず、例えばまた、ニワトリ胚線維芽細胞などの初代細胞も包含される。
当業者はまた、ポリペプチド、特に本明細書で記載される変異体のＨＡポリペプチドは、アンブレラトポロジーグリカンに結合することが可能なポリペプチドの容易なスクリーニングおよび／または選択を可能とする条件下で、ポリペプチドを生成させる（単独であれ、ウイルス粒子またはウイルスの一部としての生成を含めた、複合体の一部としてであれ）細胞または生物を培養することにより、発生させる場合もあり、同定する場合もあり、単離する場合もあり、かつ／または生成させる場合もあることも理解するであろう。一例を挙げるに過ぎないが、一部の実施形態では、ポリペプチド（例えば、ＨＡ変異体ポリペプチド）のコレクションを、アンブレラトポロジーグリカンに結合する（例えば、特定の特異性および／または親和性で）変異体を明らかにし、かつ／またはこれらに好適な条件下で生成させ、かつ／または研究することが有用でありうる。一部の実施形態では、このようなポリペプチド（例えば、ＨＡ変異体ポリペプチド）のコレクションが、天然における進化の結果として得られる。一部の実施形態では、このようなポリペプチド（例えば、ＨＡ変異体ポリペプチド）のコレクションが、操作の結果として得られる。一部の実施形態では、このようなポリペプチド（例えば、ＨＡ変異体ポリペプチド）のコレクションが、操作および天然の進化の組合せの結果として得られる。
ＨＡ受容体
ＨＡは、糖タンパク質受容体に結合することにより、細胞表面と相互作用する。ＨＡのＨＡ受容体への結合は主に、ＨＡ受容体におけるＮ結合型グリカンを介する。とりわけ、インフルエンザウイルス粒子の表面におけるＨＡは、細胞宿主の表面におけるＨＡ受容体と会合するシアル化したグリカンを認識する。認識および結合の後、宿主細胞がウイルス細胞を取り込むと、ウイルスは近傍の細胞に分布するさらに多くのウイルス粒子を複製し、これらを生成させることが可能となる。例示的なＨＡ−グリカン間相互作用の一部の結晶構造が同定されており、これらを表１に提示する：
ＨＡ−α２−６シアル化グリカン複合体は、ＡＤＵ６３＿Ｈ３およびＡＤＳ９７＿Ｈ５およびＶｉｅｔ０４＿Ｈ５のＨＡ１サブユニットのＣＡトレースを、ＡＳＩ３０＿Ｈ１＿２６およびＡＰＲ３４＿Ｈ１＿２６（Ｈ１）へと重ね合わせることにより発生させた。ヒトＡ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（Ｈ３Ｎ２）のα２−６シアル化グリカンとの構造的複合体は公表されている（参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｉｓｅｎら、１９９７年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２３２巻：１９頁）が、それらの座標は、タンパク質データバンクにおいて使用可能ではなかった。ＳＡＲＦ２（ｈｔｔｐ：／／１２３ｄ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ／ｓａｒｆ２．ｈｔｍｌ）プログラムを用いて、重ね合せのための異なるＨＡ１サブユニットの構造アライメントを得た。
ＨＡ受容体は、受容体のＨＡ結合部位近傍のα２−３シアル化グリカンまたはα２−６シアル化グリカンにより修飾されており、受容体に結合したグリカンの結合の種類は、受容体のＨＡ結合部位の立体配座に影響を及ぼす可能性があり、したがって、受容体の異なるＨＡに対する特異性に影響を及ぼす可能性がある。
例えば、トリＨＡのグリカン結合ポケットは、狭小である。本発明によれば、このポケットは、α２−３シアル化グリカンのトランス立体配座および／またはα２−３結合であれ、α２−６結合であれ、コーントポロジーグリカンに結合する。
トリ組織におけるＨＡ受容体、およびまた、ヒト肺深部およびヒト消化（ＧＩ）管組織におけるＨＡ受容体もα２−３シアル化グリカン結合を特徴とし、さらに（本発明によれば）、主にコーントポロジーを取る、α２−３シアル化グリカンおよび／またはα２−６シアル化グリカンを含めたグリカンも特徴とする。本明細書では、このようなコーントポロジーグリカンを有するＨＡ受容体をＣＴＨＡｒと称することができる。
これに対して、上気道の気管支および気管におけるヒトＨＡ受容体は、α２−６シアル化グリカンで修飾されている。α２−３モチーフとは異なり、α２−６モチーフは、Ｃ６−Ｃ５結合のために立体配座的自由度を増大させる（参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｕｓｓｅｌｌら、２００６年、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ、２３巻：８５頁）。このようなα２−６シアル化グリカンは、この立体配座的自由度から生じる構造の多様性に対応する開放性の大きな結合ポケットを有するＨＡに結合する。さらに、本発明によれば、ヒト上気道組織の感染を効果的に媒介するために、ＨＡは、アンブレラトポロジーにあるグリカン（例えば、α２−６シアル化グリカン）に結合することを必要とする可能性があり、特に、高度の親和性および／または特異性を伴うこのようなアンブレラトポロジーグリカンに結合することを必要とする可能性がある。本明細書では、アンブレラトポロジーグリカンを有するＨＡ受容体をＵＴＨＡｒと称することができる。
これらの空間的に制約されたグリコシル化プロファイルの結果として、ヒトは通常、多くの野生型のトリＨＡ（例えば、トリＨ５）を含有するウイルスに感染しない。とりわけ、ウイルスに遭遇する可能性が極めて高いヒト気道の部分（すなわち、気管および気管支）は、コーングリカン（例えば、α２−３シアル化グリカンおよび／または短鎖グリカン）を伴う受容体を欠き、野生型のトリＨＡは、コーングリカン（例えば、α２−３シアル化グリカンおよび／または短鎖グリカン）と会合する受容体に主にまたはもっぱら結合することが典型的であるため、ヒトは、トリウイルスに感染することがまれである。ウイルスがアンブレラグリカン（例えば、長鎖α２−６シアル化グリカン）を有する肺深部および／または消化管の受容体に接近しうる程度にウイルスとの接触が十分に緊密である場合に限り、ヒトは感染する。
グリカンアレイ
公知の特定のグリカン間結合タンパク質（ＧＢＰ）相互作用についての最新の知識を迅速に拡張するため、国際的な研究協力イニシアチブであるＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｆｏｒ
Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ（ＣＦＧ； ｗｗｗ．ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｌｙｃｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ）は、新規のグリカンリガンド特異性についてＧＢＰをハイスループットでスクリーニングすることを可能とした複数のグリカン構造を含むグリカンアレイを開発した。グリカンアレイは、一価および多価のグリカンモチーフ（すなわち、ポリアクリルアミド骨格に結合した）の両方を含み、各アレイは、低濃度（１０μＭ）および高濃度（１００μＭ）の２６４のグリカンおよび各濃度に応じた６カ所のスポットを含む（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｌｙｃｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ／ｓｔａｔｉｃ／ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｃｏｒｅｈ５．ｓｈｔｍｌを参照されたい）。
アレイは主に、Ｎ結合型グリカンおよびＯ結合型グリカンの生理学的多様性を捕捉する合成グリカンを含む。アレイでは、合成グリカンに加えてまた、異なる哺乳動物の糖タンパク質に由来するＮ結合型グリカンの混合物も表出される。
本明細書で用いられる、グリカン「アレイ」とは、場合によって固体支持体に固定化された１またはそれより多くのグリカンのセットを指す。一部の実施形態では、「アレイ」を、空間内で物理的に隔てられた２カ所以上の位置において構成された配置またはパターンとして存在するグリカンのコレクションとする。典型的には、グリカンアレイが、少なくとも４カ所、少なくとも８カ所、少なくとも１６カ所、少なくとも２４カ所、少なくとも４８カ所、少なくとも９６カ所、または数百カ所もしくは数千カ所の異なる位置を有する。一般に、本発明によるグリカンアレイは、各種のフォーマットのうちのいずれかを有しうる。当技術分野では、生体分子に適用可能な、多様で異なるアレイフォーマットが公知である。例えば、膨大な数のタンパク質アレイおよび／または核酸アレイが周知である。当業者は、本発明のグリカンアレイに適する標準的なアレイフォーマットを速やかに理解するであろう。
一部の実施形態では、本発明によるグリカンアレイが、「マイクロアレイ」フォーマットで存在する。マイクロアレイは典型的に、試料位置を約５０μ〜約２００μ以下の距離だけ隔てている場合があり、試料をナノモル〜マイクロモルの範囲内またはナノグラム〜ピコグラムの範囲内に固定化している場合がある。当技術分野で公知のアレイフォーマットは、例えば、異なる試料位置の各々のスケールが、例えば、１０μであるフォーマットを包含する。
一部の実施形態では、本発明によるグリカンアレイが、支持体上に空間的に固定化された複数のグリカンを含む。本発明は、支持体上に配列されたグリカン分子を提供する。本明細書で用いられる「支持体」とは、グリカン分子を配列するのに用いるのに適する任意の物質を指す。当業者が理解する通り、多種多様な材料のうちのいずれを用いることもできる。少数の例を挙げるに過ぎないが、本発明において用いうる支持体材料には、疎水性膜、例えば、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜、またはナイロン膜が含まれる。当技術分野では、このような膜が周知であり、例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｍｅｌ Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ、ＵＫから得ることができる。
一部の実施形態では、グリカンを配列する支持体が、金属酸化物を含みうる。適切な金属酸化物には、酸化チタン、酸化タンタル、および酸化アルミニウムが含まれるがこれらに限定されない。このような材料の例は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙ
Ｌｔｄ、Ｆａｎｃｙ Ｒｏａｄ、Ｐｏｏｌｅ、Ｄｏｒｓｅｔ．ＢＨ１２ ４ＱＨ ＵＫから得ることができる。
一部の実施形態では、このような支持体を金属酸化物ゲルとするか、またはこのような支持体が金属酸化物ゲルを含む。金属酸化物ゲルは、所与の肉眼的領域内に大表面積をもたらして、炭水化物含有分子の固定化の一助となると考えられる。
本発明により用いうるさらなるまたは代替的な支持体材料には、ゲル、例えば、シリカゲルまたは酸化アルミニウムゲルが含まれる。このような材料の例は、例えば、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙから得ることができる。
一部の実施形態では、グリカンアレイを、通常の使用時にはサイズまたは形状の変化に耐性でありうる支持体上に固定化する。例えば、支持体を、グリカンを配列するのに用いるのに適する材料成分でコーティングしたスライドガラスとすることができる。また、一部の複合材料も、支持体に所望の固体性をもたらしうる。
本明細書で裏付けられる通り、本発明によるアレイは、異なるＨＡポリペプチドおよびそれらの結合特徴の同定および／または特徴付けに有用である。一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチドをこのようなアレイ上で調べて、それらがアンブレラトポロジーグリカン（例えば、α２−６シアル化グリカン、特にアンブレラトポロジーに配置された長鎖α２−６シアル化グリカン）に結合する能力を評価する。
実際、本発明は、ＨＡポリペプチドの結合能を特徴付けるのに用いうるα２−６シアル化グリカンのアレイ、および、場合によって、α２−３シアル化グリカンのアレイ、ならびに／または、例えば、ヒトに結合するＨＡポリペプチドを検出するための診断法として用いうるα２−６シアル化グリカンのアレイ、および、場合によって、α２−３シアル化グリカンのアレイを提供する。一部の実施形態では、本発明によるアレイが、アンブレラトポロジーにあるグリカン（例えば、α２−６シアル化グリカン、特に長鎖α２−６シアル化グリカン）を含有する。当業者に明らかである通り、このようなアレイは、例えば、研究者によりデザインおよび／または調製されるＨＡポリペプチドに加えて、天然のインフルエンザウイルス単離物中に見出されるＨＡポリペプチドを含めた任意のＨＡポリペプチドを特徴付けるまたはこれを検出するのに有用である。
一部の実施形態では、このようなアレイが、ヒトＨＡ受容体、特にヒト上気道ＨＡ受容体において見出されるグリカン（例えば、α２−６シアル化グリカン、特に、長鎖α２−６シアル化グリカンであることが多いアンブレラグリカン）のうちの約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％以上を代表するグリカンを包含する。一部の実施形態では、本発明によるアレイが、図１０に示されるグリカン構造のうちの一部または全部を包含する。一部の実施形態では、アレイが、示されるこれらのグリカンのうちの少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％以上を包含する。
本発明は、グリカンアレイを用いてＨＡタンパク質を同定するかまたはこれを特徴付ける方法を提供する。一部の実施形態では、例えば、このような方法が、（１）ＨＡポリペプチドを含有する試料を供給するステップと、（２）試料をグリカンアレイと接触させるステップと、（３）ＨＡポリペプチドのアレイ上の１またはそれより多くのグリカンへの結合を検出するステップとを含む。
本発明によるグリカンアレイと接触させる、ＨＡポリペプチドを含有する試料に適する供給源には、血液、血清／血漿、末梢血単核細胞／末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ／ＰＢＬ）、痰、尿、糞便、咽頭スワブ、皮膚病変スワブ、脳脊髄液、頸管スミア、膿試料、食物マトリックス、ならびに脳、脾臓、および肝臓など、体内の多様な部分に由来する組織などの病理学的試料が含まれるがこれらに限定されない。代替的にまたは加えて、ＨＡポリペプチドを含有する試料に適する他の供給源には、土壌、水、および微生物叢などの環境試料が含まれるがこれらに限定されない。さらに他の試料には、実験用試料、例えば、研究者によりデザインされ、かつ／または調製される、操作されたＨＡポリペプチドの試料が含まれる。また、列挙されていない他の試料も適用可能でありうる。
当技術分野では、ＨＡポリペプチドの本発明によるグリカンアレイへの結合についてアッセイするのに適する多種多様な検出システムが公知である。例えば、ＨＡポリペプチドは、アレイと接触させる前に、またはアレイと接触させた後に検出可能に標識する（直接的にまたは間接的に）ことができる。次いで、局在化された標識を検出することにより、結合を検出することができる。一部の実施形態では、走査デバイスを用いてアレイ上の特定の位置を検証することができる。
代替的にまたは加えて、配列されたグリカンへの結合は、例えば、熱量測定による検出システム、蛍光による検出システム、または放射線による検出システム、もしくは他の標識方法、または標識化を要求しない他の方法を用いて測定することができる。一般に、蛍光による検出は典型的に、蛍光分子を伴うアレイを直接プローブするステップと、蛍光シグナルをモニタリングするステップとを伴う。代替的にまたは加えて、アレイは、間接的に蛍光を検出する（この場合は、蛍光標識したストレプトアビジンの結合について調べることを介する）ためにタグづけされた（例えば、ビオチンでタグ付けされた）分子によりプローブすることもできる。代替的にまたは加えて、配列されたグリカンを蛍光標識し、被験分子（異なるフルオロフォアで標識する場合もあり、標識しない場合もある）でプローブする、蛍光消光法も用いることができる。このような実施形態では、アレイへの結合が、配列されたグリカンから発光する蛍光を抑止するように作用し、したがって、蛍光発光の喪失を介して結合を検出する。代替的にまたは加えて、配列されたグリカンは、放射性標識したプローブをもたらす、放射性物質の存在下で増殖させた生組織試料によりプローブすることもできる。このような実施形態における結合は、放射性発光を測定することにより検出することができる。
このような方法は、ＨＡポリペプチドによる本発明によるグリカンアレイへの結合の事実および／または結合の程度を決定するのに有用である。一部の実施形態では、このような方法をグリカン−ＨＡポリペプチド相互作用に干渉するかまたは他の形でこれを変化させる薬剤を同定するおよび／または特徴付けるのにさらに用いることもできる。
以下で記載される方法は、例えば、炭水化物と相互作用することが可能であると考えられる分子が、実際に相互作用しうるかどうかを確認するか、またはある分子が、炭水化物と相互作用する能力を予測されない形で有するかどうかを確認するのに特に用いることができる。
本発明はまた、本発明によるアレイを用いて、例えば、被験試料中の特定の薬剤を検出する方法も提供する。例えば、このような方法は、（１）グリカンアレイを被験試料と（例えば、ＨＡポリペプチドを含有すると考えられる試料と）接触させるステップと、（２）被験試料中の任意の薬剤のアレイへの結合を検出するステップとを含みうる。
なおさらに、本発明によるアレイへの結合は、例えば、結合剤とグリカンとの間の相互作用の反応速度を決定するのにも用いることができる。例えば、本発明による相互作用の反応速度を決定する方法は、（１）グリカンアレイを被験分子と接触させるステップと、（２）結合剤と配列されたグリカン（複数可）との間の相互作用の反応速度を測定するステップとを包含しうる。
結合剤の、本発明によるアレイ中のグリカンのうちのいずれかとの相互作用の反応速度は、上記で詳述した、例えば、熱量測定シグナルまたは蛍光シグナルのリアルタイムにおける変化を介して測定することができる。このような方法は、例えば、特定の結合剤が、同じ炭水化物と相互作用する異なる結合剤より高度の結合で特定の炭水化物と相互作用することが可能であるかどうかを決定するのに特に用いることができる。
当然ながら、本発明によるＨＡポリペプチドによるグリカン結合を、アレイフォーマット自体では存在しないグリカン試料または供給源において評価しうることが理解されるであろう。例えば、本発明によるＨＡポリペプチドを、組織試料および／または細胞系に結合させて、それらのグリカン結合特徴を評価することができる。適切な細胞系は、例えば、各種の哺乳動物細胞系、特に、アンブレラトポロジーグリカン（例えば、これらのうちの少なくとも一部は、α２−６シアル化グリカン、特に長鎖α２−６シアル化グリカンでありうる）を含有するＨＡ受容体を発現させる哺乳動物細胞系のうちのいずれかを包含する。一部の実施形態では、用いられる細胞系が、アンブレラトポロジーを伴う個別のグリカンを発現させる。一部の実施形態では、用いられる細胞系が、多様なグリカンを発現させる。一部の実施形態では、細胞系を、臨床単離物から得、場合によっては、所望のグリカン分布および／またはグリカン保有率を有するようにそれらを維持または操作する。一部の実施形態では、組織試料および／または細胞系が、哺乳動物の上気道上皮細胞に特徴的なグリカンを発現させる。
核酸
一部の実施形態では、本発明が、ＨＡポリペプチド、またはＨＡポリペプチドの特徴的部分もしくは生物学的に活性な部分をコードする核酸を提供する。一部の実施形態では、本発明が、ＨＡポリペプチド、またはＨＡポリペプチドの特徴的部分もしくは生物学的に活性な部分をコードする核酸と相補的な核酸を提供する。
一部の実施形態では、本発明が、ＨＡポリペプチド、またはＨＡポリペプチドの特徴的部分もしくは生物学的に活性な部分をコードする核酸とハイブリダイズする核酸分子を提供する。このような核酸は、例えば、プライマーとして用いることもでき、プローブとして用いることもできる。少数の例を挙げるに過ぎないが、このような核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるプライマーとして用いることもでき、ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含めた）のためのプローブとして用いることもでき、かつ／または逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）のためのプライマーとして用いることもできる。
一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡの場合もあり、ＲＮＡの場合もあり、一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もある。一部の実施形態では、本発明による核酸が、１またはそれより多くの非天然ヌクレオチドを包含する場合があり、一部の実施形態では、本発明による核酸が、天然のヌクレオチドだけを包含する。
ポリペプチドに対する抗体
本発明は、本発明による結合剤ポリペプチド（例えば、ＨＡポリペプチド）に対する抗体を提供する。これらは、モノクローナル抗体の場合もあり、ポリクローナル抗体の場合もあり、当業者に公知の各種の技法のうちのいずれかを介して調製することができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８年、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照されたい）。例えば、抗体は、モノクローナル抗体の生成を含めた細胞培養法を介して生成させることもでき、組換え抗体の生成を可能とするために、抗体遺伝子の、適切な細菌細胞宿主または哺乳動物細胞宿主へのトランスフェクションを介して生成させることもできる。
動物モデルにおける結合剤の試験
本発明は、本発明による結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド、ＬＳＢＡ、ＵＳＢＡ、ＵＴＳＢＡなど）を動物宿主において調べる方法を提供する。本明細書で用いられる「動物宿主」は、インフルエンザの研究に適する任意の動物モデルを包含する。例えば、本発明に適する動物宿主は、霊長動物、フェレット、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、マウス、ハムスター、ウサギ、およびラットなどの齧歯動物を含めた任意の哺乳動物宿主でありうる。一部の実施形態では、本発明に用いられる動物宿主を、フェレットとする。特に、一部の実施形態では、本発明による結合剤（場合によって、本発明による組成物中の）を投与する前に、動物宿主を、ウイルス曝露または感染に対してナイーブとする。一部の実施形態では、本発明による結合剤の投与前に、または投与と共時的に、動物宿主にウイルスを接種するか、動物宿主をウイルスに感染させるか、または動物宿主を他の形でウイルスに曝露する。当技術分野で公知の任意の方法を介して、本発明を実施するのに用いられる動物宿主にウイルスを接種するか、動物宿主をウイルスに感染させるか、または動物宿主を他の形でウイルスに曝露することができる。一部の実施形態では、動物宿主にウイルスを鼻腔内接種するか、動物宿主をウイルスに鼻腔内感染させるか、または動物宿主をウイルスに鼻腔内曝露することができる。
一部の実施形態では、適切な動物宿主のコーントポロジーグリカンと対比したアンブレラトポロジーグリカンの分布、および／またはα２−３グリカンと対比したα２−６グリカンの分布が、ヒト気道内で見出される分布と類似しうる。例えば、ヒトにおけるインフルエンザウイルスにより引き起こされる疾患のモデルとして用いられる場合、動物宿主としてのフェレットは、マウスより代表的でありうることが目論まれる（参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｕｍｐｅｙら、２００７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１５巻；６５５〜５９頁）。いかなる理論に拘束されることも望まないが、本発明は、フェレットの気道におけるグリカン分布が、ヒト気道におけるグリカン分布と類似する程度は、マウスがヒトに対して示す類似より大きい場合があるという考えを包含する。ナイーブの動物および／または接種した動物を、各種の研究のうちのいずれかに用いることができる。当技術分野で公知である通り、例えば、このような動物モデルは、ウイルス伝染研究に用いることができる。ウイルス伝染研究におけるフェレットの使用が、ヒトにおけるウイルス伝染についての信頼できる予測モデルとして提供されうることが目論まれる。当技術分野で、例えば、ウイルス性インフルエンザの、接種された動物（例えば、フェレット）からナイーブ動物への空気伝染が公知である（参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｕｍｐｅｙら、２００７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１５巻；６５５〜５９頁）。ウイルス伝染研究を用いて、本発明による結合剤ポリペプチド（例えば、ＨＡポリペプチド）を調べることができる。例えば、動物宿主におけるウイルスの結合および／または感染性を遮断する前記結合剤の有効性を決定するために、本発明による結合剤を適切な動物宿主に、ウイルス伝染研究の前に投与することもでき、ウイルス伝染研究時に投与することもでき、ウイルス伝染研究の後に投与することもできる。動物宿主におけるウイルス伝染研究から集められた情報を用いて、ヒト宿主におけるウイルスの結合および／または感染性を遮断する結合剤の有効性を予測することができる。
医薬組成物
一部の実施形態では、本発明が、本発明による結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド、ＬＳＢＡ、ＵＴＢＡ、ＵＴＢＳＡなど）および／または類縁の実体を包含する医薬組成物を提供する。例えば、一部の実施形態では、本発明による医薬組成物中に、結合剤ポリペプチド（複数可）（例えば、ＨＡポリペプチド）、このようなポリペプチドをコードする核酸、このようなポリペプチドまたは核酸の特徴的な断片または生物学的に活性な断片、このようなポリペプチドまたは断片に結合し、かつ／またはこれと競合する抗体、このようなポリペプチドまたはそれらに結合するグリカンなどと相互作用するかまたはこれと競合する低分子などが包含される。
本発明は、本発明によるこのような医薬組成物の投与を介するインフルエンザ感染の処置を包含する。一部の実施形態では、本発明による医薬組成物を、インフルエンザ感染を患っているまたはインフルエンザ感染に対して感受性である被験体に投与する。一部の実施形態では、被験体におけるインフルエンザ感染を患っていると考えられる被験体が、一般にインフルエンザ感染と関連する１またはそれより多くの症状を示している。一部の実施形態では、被験体が、インフルエンザウイルスに曝露されていることが公知であるか、またはインフルエンザウイルスに曝露されていると考えられる。一部の実施形態では、被験体が、インフルエンザウイルスに曝露されていることが公知であるか、またはインフルエンザウイルスに曝露されていると考えられる場合、その被験体を、インフルエンザ感染に対して感受性であると考える。一部の実施形態では、被験体が、インフルエンザウイルスに感染していることが公知であるかもしくは疑われる他の個体と接触している場合、および／または被験体が、インフルエンザ感染が蔓延していることが公知であるかもしくは蔓延していると考えられる場所に存在しているかもしくは存在していた場合、その被験体を、インフルエンザウイルスに曝露されていることが公知であるか、またはインフルエンザウイルスに曝露されていると考える。
一部の実施形態では、インフルエンザ感染を患っているまたはインフルエンザ感染に対して感受性である被験体を、本発明による結合剤に対する抗体について、本発明による医薬組成物の投与前、投与時、または投与後に調べる。一部の実施形態では、このような抗体を有する被験体に、本発明による結合剤を含む医薬組成物を投与しない。一部の実施形態では、このような抗体の検出（またはその欠如）に基づき、適量の医薬組成物および／または結合剤を選択する。
一部の実施形態では、処置される特定の被験体の選択、投与される特定の結合剤または組成物、および／または投与される特定の用量またはレジメンを、例えば、書面形態、印字形態、または電子的保存形態で記録する。
本発明による組成物は、インフルエンザ感染の１またはそれより多くの症状の発生前に投与することもでき、発生後に投与することもできる。
本発明は、本明細書で記載される化合物の投与を介するインフルエンザ感染の処置を包含する。一部の実施形態では、本発明によるインフルエンザ感染の処置を、ワクチンの投与を介して達成する。現在のところ、インフルエンザワクチンの開発では著明な達成がなされているが、さらなる改善の余地が認められる。本発明は、本発明による結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド、ＬＳＢＡ、ＵＴＢＡ、ＵＴＢＳＡなど）を含むワクチン、特にアンブレラグリカン（例えば、長鎖α２−６シアル化グリカンなど、例えば、α２−６結合アンブレラグリカン）に結合する結合剤を含むワクチンを提供する。
一例を挙げるに過ぎないが、ヒトにおけるＨ５Ｎ１株に特異的なワクチンを生成させる試みは一般に、少なくとも部分的にはＨ５ ＨＡの免疫原性が低いために成功していない。一研究では、Ｈ５Ｎ１株を指向するワクチンが、感染からの防御を保証するのに十分な高さの力価ではない１：４０の抗体力価をもたらすことが示された。さらに、１：４０という穏当な抗体力価（９０μｇずつ２回にわたる精製ワクチンの投与により、ウイルスまたは抗原が死滅する）を発生させるのに要求される用量であっても、通常の季節性インフルエンザウイルスワクチンの場合に通常用いられる力価の１２倍であった（参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｒｅａｎｏｒら、２００６年、Ｎ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ、３５４巻：１３４３頁）。他の研究も、現行のＨ５ワクチンの免疫原性は高くないことを同様に示している（参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｒｅｓｓｏｎら、２００６年、Ｌａｎｃｅｔ、３６７巻：１６５７頁）。一部の実施形態では、本発明によるワクチンを、低用量のＨ５ ＨＡタンパク質の使用、および／または高度な免疫原性の達成を可能とすることを意図する１またはそれより多くの戦略（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｎｓｅｒｉｎｋ、２００５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０９巻：９９６頁を参照されたい）を用いて調合する。例えば、一部の実施形態では、多価性を改善し（例えば、デンドリマーの使用を介して）、一部の実施形態では、１またはそれより多くのアジュバントを用いるなどである。
一部の実施形態では、本発明が、ワクチンおよびこれらのワクチンのヒト被験体への投与を提供する。一部の実施形態では、ワクチンを、以下：（１）不活化ウイルス、（２）弱毒化されたインフルエンザ生ウイルス、例えば、複製欠損ウイルス、（３）本発明による結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド、ＬＳＢＡ、ＵＴＢＡ、ＵＴＢＳＡなど）、（４）結合剤ポリペプチド（例えば、ＨＡポリペプチド）またはその特徴的部分もしくは生物学的に活性な部分をコードする核酸、（５）本発明による結合剤ポリペプチド（例えば、ＨＡポリペプチド）またはその特徴的部分もしくは生物学的に活性な部分をコードするＤＮＡベクター、および／または（６）発現系、例えば、抗原として用いられる１またはそれより多くのインフルエンザタンパク質を発現させる細胞のうちの１またはそれより多くを含む組成物とする。
したがって、一部の実施形態では、本発明が、不活化インフルエンザウイルスワクチンを提供する。一部の実施形態では、不活化インフルエンザウイルスワクチンが、３種類の抗原調製物：不活化全粒子ウイルス、精製されたウイルス粒子を洗浄剤または他の試薬で破壊して、脂質エンベロープを可溶化させたサブビリオン（「スプリット」ワクチン）、または精製されたＨＡポリペプチド（「サブユニット」ワクチン）のうちの１つを含む。一部の実施形態では、ウイルスを、ホルムアルデヒド、ベータ−プロピオラクトン、エーテル、洗浄剤（ＴＷＥＥＮ−８０（登録商標）など）を伴うエーテル、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）およびＴｒｉｔｏｎ Ｎ１０１、デオキシコール酸ナトリウムおよびトリ（ｎ−ブチル）リン酸による処置を介して不活化させることができる。不活化は、尿膜腔液（鶏卵内で生成させたウイルスに由来する）を清明化させた後に生じさせることもでき、清明化させる前に生じさせることもでき、ビリオンは、遠心分離を介して単離および精製することができる（参照により本明細書に組み込まれる、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら編、１９９８年、「Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ」、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｌｄｅｎ、ＭＡ）。ワクチンの効力を評価するためには、一元放射免疫拡散（ＳＲＤ）検査を用いることができる（これらのいずれもが参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｃｈｉｌｄら、１９７５年、Ｂｕｌｌ． Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎ．、５２巻：４３〜５０および２２３〜３１頁；Ｍｏｓｔｏｗら、１９７５年、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２巻：５３１頁）。
本発明はまた、弱毒化されたインフルエンザ生ワクチン、および当技術分野で周知である弱毒化のための方法も提供する。一部の実施形態では、弱毒化を、部位指向性突然変異誘発などの逆遺伝学の使用を介して達成する。
一部の実施形態では、ワクチンにおいて用いられるインフルエンザウイルスを、卵内、例えば、孵化鶏卵内で増殖させるが、この場合、採取される物質は、尿膜腔液である。代替的にまたは加えて、インフルエンザウイルスは、組織培養物を用いてウイルスを増殖させる任意の方法に由来しうる。ウイルスを増殖させるのに適する細胞基質には、例えば、ＭＤＣＫ細胞またはＭＤＣＫ細胞、ＭＤＣＫ様細胞のクローンに由来する細胞などのイヌ腎臓細胞、Ｖｅｒｏ細胞を含めたＡＧＭＫ細胞などのサル腎臓細胞、連続継代細胞系として培養された上皮細胞、２９３Ｔ細胞、ＢＫ−２１細胞、ＣＶ−１細胞、または市販供給源（例えば、ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．）から容易に入手可能な、ワクチンを目的としてインフルエンザウイルスを生成させるのに適する他の任意の哺乳動物細胞型（上気道上皮細胞を含めた）が含まれる。また、適切な細胞基質は、ＭＲＣ−５細胞などのヒト細胞も包含する。適切な細胞基質は、細胞系に限定されず、例えばまた、ニワトリ胚線維芽細胞などの初代細胞も包含される。
一部の実施形態では、本発明によるワクチンが、１またはそれより多くのアジュバントをさらに含む。例えば、アルミニウム塩（参照により本明細書に組み込まれる、Ｂａｙｌｏｒら、２００２年、Ｖａｃｃｉｎｅ、２０巻：Ｓ１８頁）およびモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ；参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｉｂｉら、１９８６年、「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ」、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌ． Ｃｏｒｐ．、ＮＹ、４０７頁）は、ヒト用ワクチンにおけるアジュバントとして用いることができる。代替的にまたは加えて、ＭＦ５９（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｉｒｏｎ．ｃｏｍ／ｉｎｖｅｓｔｏｒｓ／ｐｒｅｓｓｒｅｌｅａｓｅｓ／２００５／０５１０２８．ｈｔｍｌ）、ＣＰＧ ７９０９（参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｏｏｐｅｒら、２００４年、Ｖａｃｃｉｎｅ、２２巻：３１３６頁）、およびＱＳ２１などのサポニン（参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｈｏｃｈｉｋｙａｎら、２００６年、Ｖａｃｃｉｎｅ、２４巻：２２７５頁）などの新たな化合物も、現在、ヒト用ワクチンにおけるアジュバントとして調べられている。
加えて、当技術分野では、ポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン］（ＰＣＣＰ；参照により本明細書に組み込まれる、Ｐａｙｎｅら、１９９８年、Ｖａｃｃｉｎｅ、１６巻：９２頁）、インターフェロンγ（参照により本明細書に組み込まれる、Ｃａｏら、１９９２年、Ｖａｃｃｉｎｅ、１０巻：２３８頁）、ブロックコポリマーＰ１２０５（ＣＲＬ１００５；参照により本明細書に組み込まれる、Ｋａｔｚら、２０００年、Ｖａｃｃｉｎｅ、１８巻：２１７７頁）、インターロイキン２（ＩＬ−２；参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｂｗｕｉｋｅら、１９９０年、Ｖａｃｃｉｎｅ、８巻：３４７頁）、およびメタクリル酸ポリメチル（ＰＭＭＡ；参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｒｅｕｔｅｒら、１９８１年、Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．、７０巻：３６７頁）など、一部のアジュバントがインフルエンザワクチンの免疫原性を増強することが公知である。
一部の実施形態では、本発明による組成物、例えば、結合剤の組成物がアジュバントを包含しない（例えば、提供される組成物は、アジュバントを本質的に含まない）。一部の実施形態では、本発明による組成物がアラムアジュバントを包含しない（例えば、提供される組成物がアラムを本質的に含まない）。
ワクチンに加えて、本発明は、ウイルス感染の処置に有用な他の治療用組成物も提供する。一部の実施形態では、処置を、ＨＡポリペプチドの発現または活性に干渉する薬剤の投与を介して達成する。
一部の実施形態では、本発明が、抗体または提供されるポリペプチドと類縁の他の薬剤を含む医薬組成物を提供する。例えば、本発明は、特定のＨＡポリペプチド（例えば、アンブレラグリカンに結合するＨＡポリペプチド）、核酸（ＲＮＡｉに用いうる、ＨＡ配列と相補的な核酸配列など）、ＨＡ受容体への結合について競合するグリカン、グリカン−ＨＡポリペプチド相互作用と競合する低分子もしくは糖模倣体、またはこれらの任意の組合せを含有するウイルス粒子を認識する抗体を含有する組成物を提供する。一部の実施形態では、多様な構造を有する異なる薬剤のコレクションを用いる。一部の実施形態では、治療用組成物が、１またはそれより多くの多価薬剤を含む。一部の実施形態では、処置が、曝露または曝露の疑いの直後における応急投与を含む。
一部の実施形態では、本明細書で記載されるワクチンのうちのいずれかにより、異なる多様なインフルエンザウイルスに対する広範な交差防御がもたらされる。例えば、一部の実施形態では、本明細書で記載されるワクチンにより、トリ適応型Ｈ５ウイルスおよびヒト適応型Ｈ５ウイルスの両方に対する交差防御がもたらされる。一部の実施形態では、本明細書で記載されるワクチンのうちのいずれかにより、任意のＨ５インフルエンザウイルス株またはＨ５インフルエンザウイルス変異体に対する交差防御がもたらされる。一部の実施形態では、本明細書で記載されるワクチンのうちのいずれかにより、任意のＨ２インフルエンザウイルス株またはＨ２インフルエンザウイルス変異体に対する交差防御がもたらされる。一部の実施形態では、本明細書で記載されるワクチンのうちのいずれかにより、任意のＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、またはＨ１６のインフルエンザウイルス株またはインフルエンザウイルス変異体に対する交差防御がもたらされる。
一般に、医薬組成物は、滅菌水、生理食塩液、緩衝生理食塩液、またはデキストロース液が含まれるがこれらに限定されない生体適合性の滅菌担体など、１またはそれより多くの不活性薬剤に加えて、治療剤を包含する。代替的にまたは加えて、組成物は、安定化剤、緩衝剤、賦形剤（例えば、糖、アミノ酸など）、または防腐剤などの各種の添加剤のうちのいずれかも含有しうる。
一部の実施形態では、本発明による医薬組成物中に存在する治療剤が、本明細書で記載される１またはそれより多くの結合剤からなる。一部の実施形態では、本発明による医薬組成物が、アンブレラトポロジーグリカンに結合する（および／またはアンブレラトポロジーグリカンの模倣体に結合する）結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド、ＬＳＢＡ、ＵＴＢＡ、ＵＴＳＢＡなど）を含有する。一部のこのような実施形態では、本発明による組成物が、アンブレラトポロジーグリカンに結合しない類縁の薬剤（例えば、他のＨＡポリペプチドなど）を実質的に含まない。一部のこのような実施形態では、本発明による医薬組成物が、アンブレラトポロジーグリカン以外のＨＡ受容体グリカンに結合する薬剤のうちの５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、または１％以下を含有する。
一部の実施形態では、医薬組成物が、脂質小胞、バイオアベイラビリティーを有しかつ／もしくは生体適合性でありかつ／もしくは生体分解性であるマトリックス、または他の微粒子内に封入され、閉じ込められ、または結合した治療剤を包含する。
一部の実施形態では、提供される医薬組成物が、凝集していない結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド、ＬＳＢＡ、ＵＴＢＡ、ＵＴＳＢＡなど）を包含する。例えば、一部の実施形態では、結合剤のうちで凝集物中に存在する結合剤が、乾燥重量または数で１％、２％、５％、１０％、２０％、または３０％未満である。
一部の実施形態では、提供される医薬組成物が、変性していない結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド、ＬＳＢＡ、ＵＴＢＡ、ＵＴＳＢＡなど）を包含する。例えば、一部の実施形態では、投与されるＵＴＳＢＡのうちで変性しているＵＴＳＢＡが、乾燥重量または数で１％、２％、５％、１０％、２０％、または３０％未満である。
一部の実施形態では、提供される医薬組成物が、不活性でない結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド、ＬＳＢＡ、ＵＴＢＡ、ＵＴＳＢＡなど）を包含する。例えば、一部の実施形態では、投与されるＵＴＳＢＡのうちで不活性なＵＴＳＢＡが、乾燥重量または数で１％、２％、５％、１０％、２０％、または３０％未満である。
一部の実施形態では、本発明による医薬組成物を、提供される結合剤の免疫原性を低減するように調合する。例えば、一部の実施形態では、提供される結合剤が、その免疫原性を遮蔽するポリエチレングリコールおよび／またはカルボキシメチルセルロースなどの薬剤と会合する（例えば、これに結合する）。一部の実施形態では、提供される結合剤が、免疫原性を低減するさらなるグリコシル化を有する。
本発明の医薬組成物は、単独で投与することもでき、ワクチンおよび／または抗体が含まれるがこれらに限定されない１またはそれより多くの他の治療剤と組み合わせて投与することもできる。「〜と組み合わせて」とは、薬剤を、同時に投与するかまたは送達のために併せて調合しなければならないことを含意することを意図しないが、これらの送達法は、本発明の範囲にある。一般に、各薬剤は、その薬剤について決定される用量および時間スケジュールで投与する。加えて、本発明は、それらのバイオアベイラビリティーを改善する場合もあり、それらの代謝を低減または修飾する場合もあり、それらの分泌を阻害する場合もあり、それらの体内における分布を修飾する場合もある薬剤と組み合わせた、本発明による医薬組成物の送達を包含する。本発明の医薬組成物は、それを必要とする任意の被験体（例えば、任意の動物）の処置に用いうるが、それらは、ヒトの処置において用いることが最も好ましい。一部の実施形態では、本発明による医薬組成物および／または結合剤を、抗ウイルス剤（例えば、オセルタミビル［ＴＡＭＩＦＬＵ（登録商標）］、ザナマビル［ＲＥＬＥＺＡ（登録商標）］など）および／またはシアリダーゼのうちの１またはそれより多くと組み合わせて投与する。
本発明の医薬組成物は、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、動脈内経路、皮下経路、脳室内経路、経皮経路、皮内経路、直腸内経路、膣内経路、腹腔内経路、局所経路（粉末、軟膏、クリーム、または液滴を介するなど）、経粘膜経路、鼻腔内経路、口腔内経路、腸内経路、舌下経路を含めた各種の経路を介して投与することもでき、気管内点滴、気管支内点滴、および／もしくは吸入を介して投与することもでき、かつ／または経口スプレー、鼻腔内スプレー、および／もしくはエアロゾルとして投与することもできる。一般に最も適切な投与経路は、薬剤の性質（例えば、消化管環境におけるその安定性）、患者の状態（例えば、患者が経口投与を認容しうるかどうか）などを含めた各種の因子に依存する。
現在のところ、経口経路または鼻腔内スプレー経路またはエアロゾル経路（例えば、吸入を介する経路）が、治療剤を肺および呼吸系へと直接送達するのに最も一般に用いられている。しかし、本発明は、薬物送達科学において起こりうる進歩を考慮して、任意の適切な経路を介する本発明による医薬組成物の送達を包含する。
一部の実施形態では、吸入送達またはエアロゾル送達のための調製物が、複数の粒子を含む。一部の実施形態では、このような調製物の平均粒子サイズが、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、または約１３ミクロンである。一部の実施形態では、吸入送達またはエアロゾル送達のための調製物を、乾燥粉末として調合する。一部の実施形態では、吸入送達またはエアロゾル送達のための調製物を、例えば、保湿剤の組入れを介して、湿潤粉末として調合する。一部の実施形態では、保湿剤を、水、生理食塩液、または生理学的ｐＨの他の液体からなる群から選択する。
一部の実施形態では、本発明による組成物を、鼻腔または口腔への液滴として投与する。一部の実施形態では、用量が、複数の液滴（例えば、１〜１００滴、１〜５０滴、１〜２０滴、１〜１０滴、１〜５滴など）を含みうる。
一部の実施形態では、本発明による組成物を、計量された用量の組成物（例えば、結合剤の組成物）を送達するデバイスを用いて投与する。
本明細書で記載される医薬組成物を皮内送達するときに用いるのに適するデバイスには、米国特許第４，８８６，４９９号、米国特許第５，１９０，５２１号、米国特許第５，３２８，４８３号、米国特許第５，５２７，２８８号、米国特許第４，２７０，５３７号、米国特許第５，０１５，２３５号、米国特許第５，１４１，４９６号、米国特許第５，４１７，６６２号（これらの全てが参照により本明細書に組み込まれる）において記載されるデバイスなどの短い注射針デバイスが含まれる。皮内組成物はまた、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ９９／３４８５０において記載されるデバイスおよびこれらの機能的同等物など、注射針の皮膚への有効穿通長を限定するデバイスを介して投与することもできる。また、液体のワクチンを、液体用ジェット注射器を介して、または角質層を穿刺する注射針を介して、真皮へと送達し、真皮に到達するジェットを生成させる、ジェット注射デバイスも適切である。例えば、ジェット注射デバイスは、米国特許第５，４８０，３８１号、米国特許第５，５９９，３０２号、米国特許第５，３３４，１４４号、米国特許第５，９９３，４１２号、米国特許第５，６４９，９１２号、米国特許第５，５６９，１８９号、米国特許第５，７０４，９１１号、米国特許第５，３８３，８５１号、米国特許第５，８９３，３９７号、米国特許第５，４６６，２２０号、米国特許第５，３３９，１６３号、米国特許第５，３１２，３３５号、米国特許第５，５０３，６２７号、米国特許第５，０６４，４１３号、米国特許第５，５２０，６３９号、米国特許第４，５９６，５５６号、米国特許第４，７９０，８２４号、米国特許第４，９４１，８８０号、米国特許第４，９４０，４６０号、ＷＯ９７／３７７０５、およびＷＯ９７／１３５３７（これらの全てが参照により本明細書に組み込まれる）において記載されている。また、圧縮ガスを用いて、粉末形態のワクチンを、皮膚の外層を介して真皮へと加速化させる粉末／粒子送達用バリスティックデバイスも適切である。加えて、従来のシリンジを、皮内投与の古典的なＭａｎｔｏｕｘ法において用いることもできる。
医薬の調合および製造における一般的な検討項目は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、１９版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９５年において見出すことができる。
本発明による医薬組成物は、所望の結果を達成するのに適する任意の用量で投与することができる。一部の実施形態では、所望の結果を、インフルエンザ感染の１またはそれより多くの症状の強度、重症度、および／もしくは頻度の低減、ならびに／またはこれらの発症の遅延とする。
一部の実施形態では、本発明による医薬組成物を、アンブレラトポロジーグリカンへの結合についてインフルエンザＨＡと競合するのに有効な用量の結合剤を投与するように調合する。一部の実施形態では、インフルエンザＨＡによるこのような結合が、１回または複数回にわたる本発明による組成物の投与後に、このような投与の不在におけるそのレベルと比較して低減される。一部の実施形態では、本発明による医薬組成物を、組成物を施される被験体に（例えば、被験体の気道に）存在するＨＡ結合部位（例えば、アンブレラトポロジーグリカンを含有するＨＡ結合部位）のうちの少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％以上を飽和させるのに有効な用量の結合剤を投与するように調合する。
一部の実施形態では、本発明による医薬組成物を、０．０００１〜１０００ｍｇ／ｋｇの範囲内にある単位用量の結合剤を送達するように調合する。
一部の実施形態では、本発明による医薬組成物を、複数回にわたり投与する。一部の実施形態では、本発明による医薬組成物を、複数回／日にわたり投与する。一部の実施形態では、被験体が、治療的投与期間の間に挿入される治療的投与未満の投与期間を経ないように、本発明による医薬組成物を、連続投与レジメンに従い投与する。一部の実施形態では、被験体が、２つの治療的投与期間の間に挿入される少なくとも１つの治療的投与未満の投与期間を経るように、本発明による医薬組成物を、間欠投与レジメンに従い投与する。
診断剤／キット
本発明は、血液、血清／血漿、末梢血単核細胞／末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ／ＰＢＬ）、痰、尿、糞便、咽頭スワブ、皮膚病変スワブ、脳脊髄液、頸管スミア、膿試料、食物マトリックス、ならびに脳、脾臓、および肝臓など、体内の多様な部分に由来する組織が含まれるがこれらに限定されない病理学的試料中に、結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド、ＬＳＢＡ、ＵＴＢＡ、ＵＴＳＢＡなど）を検出するため、および特に特定のグリカン結合特徴（例えば、アンブレラグリカン、α２−６シアル化グリカン、長鎖α２−６シアル化グリカンなどへの結合特徴）を伴う結合剤を検出するためのキットを提供する。本発明はまた、土壌、水、および微生物叢が含まれるがこれらに限定されない環境試料中に被験体の結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド、ＬＳＢＡ、ＵＴＢＡ、ＵＴＳＢＡなど）を検出するためのキットも提供する。また、列挙されていない他の試料も適用可能でありうる。
一部の実施形態では、本発明が、このようなポリペプチドを結合剤とする場合であれそうでない場合であれ、本明細書で記載されるＨＡポリペプチドを検出するためのキットを提供する。
一部の実施形態では、本発明によるキットが、特定のグリカン結合特徴を伴う結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド、ＬＳＢＡ、ＵＴＢＡ、ＵＴＳＢＡなど）を特異的に検出する１またはそれより多くの薬剤を包含しうる。このような検出剤は、例えば、特定の結合剤（例えば、アンブレラグリカン、および／またはα２−６シアル化グリカン、および／または長鎖α２−６シアル化グリカンに結合する結合剤）を特異的に認識する抗体を包含することが可能であり、これらは、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光法、および／または免疫ブロット法を介してこのような結合剤を特異的に検出するのに用いることができる。
ＨＡポリペプチドに結合する抗体はまた、試料を対象のＨＡポリペプチドに対して特異的な抗体で処理し、その試料が培養された細胞に感染する能力を、処理されていない試料と比べて調べる、ウイルス中和試験においても用いることができる。その試料中のウイルスがこのようなＨＡポリペプチドを含有する場合、抗体はウイルスを中和し、ウイルスが培養された細胞に感染することを防止する。代替的にまたは加えて、このような抗体はまた、ＨＡタンパク質を所与の試料から単離し、特定のＨＡポリペプチドまたはＨＡポリペプチドのセットに対して特異的な抗体で処置し、その試料が赤血球を凝集させる能力を、処理されていない試料と比べて調べる、ＨＡ阻害試験においても用いることができる。試料中のウイルスがこのようなＨＡポリペプチドを含有する場合、抗体はＨＡポリペプチドの活性を中和し、ＨＡポリペプチドが赤血球を凝集させることを防止する（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８年、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ； ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｃｓｒ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｉｎｆｌｕｅｎｚａ／ＷＨＯ＿ＣＤＳ＿ＣＳＲ＿ＮＣＳ＿２００２＿５／ｅｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ； ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｃｓｒ／ｄｉｓｅａｓｅ／ａｖｉａｎ＿ｉｎｆｌｕｅｎｚａ／ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ／ｌａｂｔｅｓｔｓ／ｅｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。一部の実施形態では、このような薬剤が、特定のＨＡポリペプチドをコードするヌクレオチドに特異的に結合する核酸を包含することが可能であり、これらは、ＲＴ−ＰＣＲまたはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを介してこのようなＨＡポリペプチドを特異的に検出するのに用いることができる（ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｃｓｒ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｉｎｆｌｕｅｎｚａ／ＷＨＯ＿ＣＤＳ＿ＣＳＲ＿ＮＣＳ＿２００２＿５／ｅｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ； ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｃｓｒ／ｄｉｓｅａｓｅ／ａｖｉａｎ＿ｉｎｆｌｕｅｎｚａ／ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ／ｌａｂｔｅｓｔｓ／ｅｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。一部の実施形態では、試料から単離された核酸を、検出前に増幅する。一部の実施形態では、診断用試薬を、検出可能に標識することができる。
本発明はまた、インフルエンザウイルスおよびワクチンを生成させるための本発明による試薬を含有するキットも提供する。キットの内容物には、対象のＨＡポリペプチド（または特徴的部分もしくは生物学的に活性な部分）をコードするＨＡヌクレオチド（または特徴的部分もしくは生物学的に活性な部分）を含有する発現プラスミドが含まれるがこれらに限定されない。代替的にまたは加えて、キットは、対象のＨＡポリペプチド（または特徴的部分もしくは生物学的に活性な部分）を発現させる発現プラスミドも含有しうる。また、使用者が任意の対象のインフルエンザウイルスに由来するＨＡヌクレオチドを組み込むことが可能であるように、ウイルス遺伝子を含有しない発現プラスミドも包含されうる。また、Ｖｅｒｏ細胞系およびＭＤＣＫ細胞系が含まれるがこれらに限定されない哺乳動物細胞系も、キットと共に包含されうる。一部の実施形態では、診断用試薬を、検出可能に標識することができる。
一部の実施形態では、本発明により用いられるキットが、基準試料、試料を処理するための指示書、試験の実施、結果を解釈するための指示書、緩衝液、および／または試験を実施するのに必要な他の試薬を包含しうる。一部の実施形態では、キットが、抗体パネルを含みうる。
本発明の一部の実施形態では、上記で論じたグリカンアレイを、診断剤および／またはキットとして用いることができる。
一部の実施形態では、本発明によるグリカンアレイおよび／またはキットを用いて、ＨＡポリペプチドのアンブレラグリカンへの結合を複数の用量（例えば、本明細書で記載される）で評価する用量反応関係研究を実施する。このような研究は、特に、被験ＨＡポリペプチドの結合特徴に対する貴重な洞察をもたらし、特に、特定の結合を評価するのに有用である。この種の結合についての用量反応関係の研究は、有用に適用されることが多い。一例を挙げるに過ぎないが、それらは、その連鎖が天然の進化を介して発生したものであれ、意図的な操作を介して発生したものであれ、これらの２つの組合せを介して発生したものであれ、類縁のＨＡポリペプチド変異体の連鎖における結合特徴の進化を追跡する一助となりうる。
一部の実施形態では、本発明によるグリカンアレイおよび／またはキットを用いて、所望の結合特徴を有する結合剤（例えば、ＨＡポリペプチドおよび／またはＨＡポリペプチドの変異体）を誘導、同定、および／または選択する。例えば、一部の実施形態では、本発明によるグリカンアレイおよび／またはキットを用いて、ポリペプチド結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド）の集団に対して進化（例えば、スクリーニングおよび／または選択）圧力を及ぼす。
本発明は、本発明による医薬組成物を投与するためのキットを提供する。例えば、一部の実施形態では、本発明が、少なくとも１回分の用量の結合剤を含むキットを提供する。一部の実施形態では、本発明が、初回の単位用量および後続の単位用量の結合剤を含むキットを提供する。一部のこのような実施形態では、初回の単位用量が後続の単位用量より大きいか、または２つの用量は同等である。
一部の実施形態では、本発明によるキット（特に、本発明による医薬組成物を投与するためのキット）が、送達デバイス、例えば、吸入器の少なくとも１つの構成要素を含む。一部のこのような実施形態では、本発明が、送達デバイスの少なくとも１つの構成要素、例えば、吸入器およびある用量の結合剤を含むキットを提供する。
一部の実施形態では、提供されるキットが、使用のための指示書を含む。
（実施例１）
広範なスペクトルにわたるヒト結合型ＨＡポリペプチドの分子的決定因子の同定
序説
Ｈ５Ｎ１トリインフルエンザウイルス（「鳥類インフルエンザ」または「トリインフルエンザ」）とは、感染性および致死性が高い病原体である。１９９６年以来、３つの大陸にわたり複数のＨ５Ｎ１の大発生が起こり、数百万羽の家禽を死滅させている。その出現以来、このウイルスはまた、ヒトに感染する潜在的可能性も示しており、死亡率は６０％を超えている。ヒトは事実上、Ｈ５Ｎ１ウイルスに対する免疫を有さないが、このウイルスはいまだ、ヒトの間で効率的に感染および伝染することが可能となるようにヒト宿主に適応してはいない。このウイルスは、ヒト集団内に足場を得ることを可能とする突然変異を獲得するであろう。
Ａ型インフルエンザウイルスの表面糖タンパク質である血球凝集素（ＨＡ）は、ウイルスの宿主細胞への侵入を誘発する一因となる。ＨＡは、シアル化グリカン受容体（α２→３結合型シアル酸またはα２→６結合型シアル酸を末端とするグリカン複合体）に結合する。Ｈ５Ｎ１ ＨＡは、α２→３結合型シアル酸を末端とするグリカン受容体に優先的に結合する。本発明者らは、ヒト宿主におけるヒト適応型Ａ型インフルエンザウイルスに対するグリカン受容体が、ＨＡのグリカン受容体結合部位（ＲＢＳ）において特徴的なアンブレラ様トポロジーを取るα２→６シアル化グリカン（以下では、ヒト受容体と称する）であることを裏付けた（参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋｈａｒａｎら、２００８年、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ、２６巻：１０７頁）。本発明者らはまた、高親和性によるこれらのヒトグリカン受容体への結合が、ヒト適応型ＨＡの特徴であり、ヒト適応型のＨ１Ｎ１ウイルスおよびＨ３Ｎ２ウイルスの効率的な空気伝染性と相関することも示した（これらのいずれもが参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋｈａｒａｎら、２００８年、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ、２６巻：１０７頁；Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎら、２００８年、ＰＮＡＳ、１０５巻：２８００頁）。本研究において、本発明者らは、Ｈ５Ｎ１ウイルスであって、このウイルスが高親和性でヒト受容体に結合することを可能とするＲＢＳにおける配列置換をＨＡが有するＨ５Ｎ１ウイルスを提示した。
実験デザイン
インフルエンザＨＡは、単量体が５５２アミノ酸を含有するホモ三量体のタンパク質である。単量体の各々は、２つのジスルフィド結合した部分である、ＨＡ１およびＨＡ２からなる。ＨＡ１がグリカン受容体結合部位（ＲＢＳ）を含むのに対し、ＨＡ２はウイルスと細胞膜との融合に関与している。ＲＢＳポケットは、ＨＡの９５、１３１、１３３、１３６、１３７、１３８、１４５、１５３、１５５、１５６、１５８、１５９、１８３、１８６、１８７、１８９、１９０、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、２１９、２２２、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８位（Ｈ３の番号付けを用いる）を伴う。
本発明者らは、Ｈ５Ｎ１と代表的なヒト受容体との間の分子的接触を詳細に解析し、これらの接触を、ヒト適応型流行性のＨ１Ｎ１ ＨＡ、Ｈ２Ｎ２ ＨＡ、およびＨ３Ｎ２ ＨＡとヒト受容体との間の接触と比較した。この手法を介して、本発明者らは、Ｈ５Ｎ１
ＨＡの突然変異体形態を発生させるための戦略を規定した。突然変異Ｑ２２６ＬおよびＧ２２８Ｓ（またはＬＳ突然変異）を、Ｈ５Ｎ１ ＨＡの複数の遺伝的クレードにわたり導入した。これらの突然変異は、それらのヒトへの適応をもたらした、それぞれ、Ｈ２Ｎ２ ＨＡおよびＨ３Ｎ２ ＨＡの２２６位および２２８位における特徴的なアミノ酸置換に基づく。
これらの突然変異は、Ｈ５Ｎ１ ＨＡの異なる遺伝的クレードのＲＢＳの文脈で導入した（図１３）。先行研究（例えば、これらのいずれもが参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｔｅｖｅｎｓら、２００８年、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、３８１巻：１３８２〜９４頁；およびＳｔｅｖｅｎｓら、２００６年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１２巻：４０４頁）では、グリカンアレイプラットフォームの異なるＨ５Ｎ１株においてＬＳ突然変異を含む組換えＨＡおよび全ウイルスのいずれもが解析されており、これらの株の一部が、α２→６シアル化グリカンへの結合を獲得したことが示されている（図１４）。しかし、これらの研究の目標は、高タンパク質濃度または高ウイルス力価における結合についてスクリーニングし、どのくらい多くのα２→３グリカンまたはα２→６グリカンが結合シグナルを示すのかを決定することであった。
これに対し、本発明者らは、複数のＨ５Ｎ１株に由来するＲＢＳ中にＬＳ突然変異を保有する組換えＨＡについての用量依存的な解析を実施した（図１５）。本データは、これらの突然変異体のうちのいずれもが、ヒト適応型ＨＡにより共有されている、ヒト受容体への特徴的な高結合親和性を示さなかったことを裏付ける。本結果はまた、ＲＢＳ中にＬＳ突然変異だけを保有するＨ５Ｎ１ウイルスの非効率的な伝染とも相関した。しかし、これらの突然変異体のうちのいずれもが高親和性によるヒト受容体への結合を示さなかった。したがって、Ｈ５Ｎ１ ＨＡの突然変異体形態を規定するには、さらなる戦略が必要とされた。
グリコシル化を失効化させる突然変異
したがって、そのＲＢＳを、より近年の遺伝的クレード（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５などの株を包含する）のＲＢＳと類似させるために、本発明者らは、１２８、１３３、１４５、１５９、１９３（以下の太字および下線を付した残基）における５カ所のアミノ酸置換を、Ｖｉｅｔ＿１２０３＿０４＿ｃ１（クレード１株であるＡ／Ｖｉｅｔ Ｎａｍ／１２０３／０４）ＨＡへと導入した。
本発明者らは、アミノ酸位置Ｎ１５８におけるグリコシル化であれば、Ｈ５Ｎ１ ＨＡのＲＢＳにおけるヒト受容体のアンブレラ様トポロジーに干渉しうることを認識した。したがって、本発明者らの最初の戦略は、Ｑ２２８Ｌ置換および／またはＧ２２８Ｓ置換、ならびにＮ１５８におけるグリコシル化を失効化させる、さらなるＴ１６０Ａ突然変異を含有するＨ５Ｎ１ ＨＡの突然変異体形態を発生させることを伴った。
このグリコシル化部位は、全ての遺伝的クレードにわたって保存的であるわけではない。Ｎ１５８にグリコシル化が存在しないことにより、ヒト受容体の、ＬＳ突然変異を伴うＨ５Ｎ１ ＨＡへの結合が改善される場合は、天然でこのグリコシル化部位を欠く遺伝的クレード（ｃ２．２、ｃ２．２．１など；図１３を参照されたい）に属するウイルスのヒトへの適応を達成するのに、ＬＳ突然変異だけで十分でありうるであろう。これらのクレードの鋳型配列を、Ｅｇｙｐｔ＿２８７６−Ｎ３＿０６＿ｃ２．２（クレード２．２に属するＡ／Ｅｇｙｐｔ／２７８６−Ｎ３／０６）として選択した。本発明者らはまた、ヒト受容体への結合親和性の改善度を点検するために、Ｈ２ ＨＡではＱ２２６Ｌ突然変異が親和性を実質的に改善するのに十分であることを踏まえ、Ｑ２２６Ｌ突然変異だけを保有する突然変異体形態（１５８位における脱グリコシル化の文脈で）も規定した。
上記の突然変異体についての用量依存的な解析（図１６）は、ＬＳ突然変異の文脈でＴｈｒ−１６０をＡｌａへと突然変異させることを介してＡｓｎ−１５８におけるグリコシル化を除去することにより、ヒト受容体への結合が実質的に改善されることを示した。これは、Ｖｉｅｔ１２０３＿０４＿ＤにおけるＴ１６０Ａ／Ｑ２２６Ｌ／Ｇ２２８Ｓ突然変異体、ならびにＥｇｙｐｔ＿２８７６−Ｎ３＿０６＿ｃ２．２ ＨＡにおけるＬＳ突然変異のいずれについても観察された。本発明者らはさらに、Ｑ２２６Ｌ突然変異だけ（Ｇ２２８Ｓを伴わない）では、Ｎ１５８においてグリコシル化を除去する文脈で高度なヒト受容体への結合親和性をもたらすのに十分でないことも裏付けた。しかし、本発明は、Ｑ２２６（例えば、Ｑ２２６Ｌ）における突然変異だけでも、一部の特定のウイルス株の文脈にあるＮ１５８におけるグリコシル化を除去する文脈で高度なヒト受容体への結合親和性をもたらすのに十分でありうることの認識を包含する。本発明はまた、Ｇ２２８（例えば、Ｇ２２８Ｓ）における突然変異だけでも、一部の特定のウイルス株の文脈にあるＮ１５８におけるグリコシル化を除去する文脈で高度なヒト受容体への結合親和性をもたらすのに十分でありうることの認識も包含する。本発明はまた、Ｑ２２６およびＧ２２８の両方における突然変異（例えば、Ｑ２２６ＬおよびＧ２２８Ｓ）が、一部の特定のウイルス株の文脈にあるＮ１５８におけるグリコシル化を除去する文脈で高度なヒト受容体への結合親和性をもたらすのに要求されうることの認識も包含する。
加えて、本発明者らはまた、上記の突然変異体のトリ受容体への（特に、３’ＳＬＮ−ＬＮ−ＬＮおよび３’ＳＬＮ−ＬＮへの）結合が極めて高度であり、ヒト適応型ＨＡには典型的でないことも発見した。例えば、ヒト受容体への結合およびトリ受容体への結合の両方を示す原型的な流行性Ｈ２Ｎ２ ＨＡ（Ａ／Ａｌｂａｎｙ／６／５８）の場合であっても、ヒト受容体への結合親和性は、トリ受容体への結合親和性より何桁も高度であった。
ループ領域におけるアミノ酸欠失
本発明者らは、Ｈ５Ｎ１ ＨＡの突然変異体形態を、そのＲＢＳとヒト受容体との間の分子的な接触が、ヒト適応型Ｈ２Ｎ２ ＨＡとヒト受容体との間の接触を緊密に模倣するように、デザインした。Ｈ２Ｎ２ ＨＡのＲＢＳの分子組成、およびそれがいかにしてグリカン受容体の特異性を統御するのかについて理解しようとする本発明者らのかつての研究に基づき、本発明者らは、まず、Ｈ５Ｎ１ ＨＡのＲＢＳの、１９５７年〜５８年型の流行株（Ａ／Ａｌｂａｎｙ／６／／５８またはＡｌｂ６＿５８）に由来する原型的なヒト適応型Ｈ２Ｎ２ ＨＡのＲＢＳとの詳細な分子的比較を実施した（図１７）。Ｈ５ ＨＡとＡｌｂ６＿５８ ＨＡとの間のＲＢＳの分子組成の差違を最小化するために、本発明者らは、Ｖｉｅｔ１２０３＿０４＿Ｄ鋳型（「Ｖｉｅｔ１２０３＿０４＿Ｄ＿Ｈ２ＲＢＳ」；配列番号６１）において、１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、および２２８位における１３カ所のアミノ酸置換、ならびに１３０位における欠失を含む突然変異体を発生させた。Ｈ２ ＨＡとＨ５ ＨＡとの間の包括的な比較に基づき、欠失および置換の組合せを表す、Ｈ５Ｎ１ ＨＡのＲＢＳにおける突然変異のデザインおよび試験に焦点を絞るのは、本研究が全く初めてである。欠失は、１３０位において行った。Ｈ２Ｎ２ ＨＡは、１５８位におけるグリコシル化は欠くが、突然変異体ＨＡにおけるＮ１５８のグリコシル化部位（Ｖｉｅｔ１２０３＿０４＿Ｄのグリコシル化部位）は保持した。したがって、本発明は、前述の突然変異に、１５８位におけるグリコシル化を失効化させる突然変異が加われば、ヒトへの結合がなおさらに増強されうることの認識を包含する。本発明者らはまた、保存的置換に基づくより少数の突然変異により、この突然変異体の別の変化形（「Ｖｉｅｔ１２０３＿０４＿Ｄ＿Ｈ２ＲＢＳｍｉｎ」；配列番号６３）もデザインした。
本発明者らはまた、ＲＢＳの分子組成に関して、天然でＡｌｂ６＿５８のＨ２Ｎ２ ＨＡと近縁でありうる他のＨ５Ｎ１株に由来するＨＡ配列も探索した。本発明者らは、例示的な鋳型の２つのセット：（１）１９２位および１９３位の電荷特性のスイッチを伴う鋳型のセット（Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｖｉｅｔｎａｍ／ＮＣＶＤ−０９３／２００８またはｃｋＶｉｅｔ＿０８）、および（２）１３０ループにおける欠失を伴う鋳型のセット（Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｅｇｙｐｔ／Ｒ２／２００７またはｃｋＥｇｙ＿０７）を同定した。これらの新たなＨ５Ｎ１ ＨＡ鋳型の上述の位置においてより少数の突然変異を伴うさらなる突然変異体形態をデザインして、Ｈ５Ｎ１ ＨＡのＲＢＳに、ヒト適応型Ｈ２Ｎ２ ＨＡのＲＢＳを模倣させた。
用量依存的なグリカンアレイを用いて、突然変異体のヒト受容体への結合親和性を調べた。Ｖｉｅｔ１２０３＿０４＿Ｄ＿Ｈ２ＲＢＳの突然変異体により、ヒト適応型Ｈ１Ｎ１
ＨＡおよびヒト適応型Ｈ２Ｎ２ ＨＡの特徴である高度に特異的な高親和性によるヒト受容体への結合が示された（図１９）。本発明は、さらなる突然変異をデザインして、（１）１３０ループの組成および欠失、（２）１９２位および１９３位における荷電残基のスイッチ、（３）１５８位におけるグリコシル化の関係、ならびにこの関係がいかにして突然変異体のＨ５Ｎ１ ＨＡのヒト受容体への結合親和性を統御するのかを理解しうることの認識を包含する。
用いられるＨ５Ｎ１鋳型ならびに上記の原理および実施例２に示される原理に従いデザインされる例示的な突然変異体ポリペプチドの例示的な配列
例示的なＨ５Ｎ１鋳型ならびに上記の原理および実施例２に示される原理に従いデザインされる例示的な突然変異体Ｈ５ ＨＡポリペプチドのアライメントを、図１８および以下に提示する。
Ｖｉｅｔ１２０３＿０４＿Ｄ：太字の残基、下線を付した残基は、置換部位を示す。
以下の配列において、斜字体および強調は、突然変異を生じさせる領域を示し、太字体および下線は、突然変異した残基を示す。
Ｖｉｅｔ１２０３＿０４＿Ｄ＿Ｈ２ＲＢＳ：
Ｖｉｅｔ１２０３＿０４＿Ｄ＿Ｈ２ＲＢＳ＿Ｎ１５８ｄｅｇｌｙｃ
Ｖｉｅｔ１２０３＿０４＿Ｄ＿Ｈ２ＲＢＳｍｉｎ）：欠失＋７カ所の突然変異
Ｖｉｅｔ１２０３＿０４＿Ｄ（Ｔ１６０Ａ／Ｑ２２６Ｌ／Ｇ２２８Ｓ）突然変異体：
Ｅｇｙｐｔ＿２８７６−Ｎ３＿０６＿ｃ２．２：１５８位におけるグリコシル化の欠如は大型のフォントで示す。
ＬＳ突然変異を伴うＥｇｙｐｔ＿２８７６−Ｎ３＿０６＿ｃ２．２ＨＡ：１５８位におけるグリコシル化の欠如は大型のフォントで示す。
単一のＱ２２６Ｌ突然変異を伴うＥｇｙｐｔ＿２８７６−Ｎ３＿０６＿ｃ２．２ＨＡ：１５８位におけるグリコシル化の欠如は大型のフォントで示す。
Ｔ１６０Ａ／Ｑ２２６Ｌの二重突然変異を伴うＶｉｅｔ１２０３＿０４＿Ｄ：
ｃｋＶｉｅｔ＿０８：Ｈ２Ｎ２において観察されるＬｙｓ１９２およびＭｅｔ１９３の電荷の組合せ（大型のフォントで示す）を既に保有するＷＴ ＨＡ
ｃｋＶｉｅｔ＿０８＿Ｈ２ＲＢＳ：欠失＋６カ所の突然変異
ｃｋＶｉｅｔ＿０８＿Ｈ２ＲＢＳ：欠失＋５カ所の突然変異
ｃｋＶｉｅｔ＿０８＿Ｈ２ＲＢＳｍｉｎ：欠失＋４カ所の突然変異
ｃｋＥｇｙ＿０７：１３０ループにおける欠失を既に保有する
ｃｋＥｇｙ＿０７＿ＬＳ：ｃｋＥｇｙ＿０７におけるＬＳ突然変異
ｃｋＥｇｙ＿０７＿Ｈ２ＲＢＳ：８カ所の突然変異
考察
複数の実験的研究が、Ｈ５ ＨＡのヒト受容体特異性の決定因子を同定することを試みている。しかし、これらの研究は、近傍の位置の影響を考慮せずに、ＲＢＳ部位におけるアミノ酸の置換に直接焦点を当てている。さらに、宿主特異性の可能な決定因子としての挿入または欠失について考慮した先行研究さえ見られない。構造ベースの探索はまた、主に、欠失の構造的効果を、コンピュータによる解析を用いて正確に評価することができないため、Ｈ５ ＨＡの重要な決定因子を同定することにも満たない。これに対し、新規の特性を伴うタンパク質を操作することの重要性を認識し、これに配列アライメント法を用いたのは、本発明者らが初めてである。本発明は、近年においてヒトに感染する潜在的可能性を示してきた他のＨＡ亜型（Ｈ７、Ｈ９など）の宿主特異性の決定因子を同定するのに同様の手法を用いうることの認識を包含する。
材料および方法
野生型のＨＡポリペプチドの異なるトポロジーのグリカンへの直接的結合の用量反応関係
直接的結合アッセイは、規定されるグリカン構造（例えば、一価構造または多価構造）が、ポリマー骨格を用いることが多い支持体（例えば、スライドガラスまたはウェルプレート）上に提示されるグリカンアレイを典型的に用いる。いわゆる「シーケンシャル」アッセイでは、三量体のＨＡポリペプチドを、アレイに結合させ、次いで、例えば、標識した（例えば、ＦＩＴＣまたは西洋ワサビペルオキシダーゼで）一次抗体および二次抗体を用いて検出する。「多価」アッセイでは、三量体のＨＡを、まず、あらかじめ複合体化させたＨＡ１つ当たり１２ずつのグリカン結合部位が存在するように、一次抗体および二次抗体と複合体化させ（典型的には、ＨＡ：一次抗体：二次抗体の比を４：２：１として）、次いで、アレイと接触させる。アレイにおける異なるグリカンについての相対的親和性について情報が得られるように、結合アッセイは、典型的に、あるＨＡ濃度の範囲にわたり実施する。
例えば、直接的結合研究は、３’ＳＬＮ、６’ＳＬＮ、３’ＳＬＮ−ＬＮ、６’ＳＬＮ−ＬＮ、および３’ＳＬＮ−ＬＮ−ＬＮ（ＬＮは、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃを表し、３’は、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３を表し、６’は、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６を表す）などの異なるグリカンを有するアレイにより実施した。とりわけ、ビオチニル化グリカン（１２０ピコモル／ｍｌのビオチニル化グリカン５０μｌ）を、ＰＢＳであらかじめ３回にわたりすすいだ、ストレプトアビジンでコーティングした高結合能の３８４ウェルプレートと共に、一晩にわたり（ＰＢＳ中、４℃で）インキュベートした。次いで、プレートを、ＰＢＳで３回にわたり洗浄して過剰なグリカンを除去し、さらなる処理なしに用いた。
適量のＨｉｓタグづけしたＨＡタンパク質、一次抗体（マウス抗６×Ｈｉｓタグ抗体）、および二次抗体（ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ）を、ＨＡ：一次抗体：二次抗体の比を４：２：１として、氷上で１５分間にわたりインキュベートした。次いで、混合物（すなわち、あらかじめ複合体化させたＨＡ）を、ＰＢＳ中に１％のＢＳＡを伴う２５０μｌの最終容量へと構成した。次いで、５０μｌのあらかじめ複合体化させたＨＡを、３８４ウェルプレート内のグリカンでコーティングしたウェルへと添加し、室温で２時間にわたりインキュベートした。その後、ウェルを、０．０５％のＴＷＥＥＮ−２０を含有するＰＢＳで３回にわたり洗浄し、次いで、ＰＢＳで３回にわたり洗浄した。製造元による指示書に従い、Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）を用いて、ＨＲＰ活性を推定した。ＨＡプレ複合体の系列希釈液について研究した。適切な陰性対照（非シアル化グリカン）およびバックグラウンド対照（グリカンなしまたはＨＡなし）を包含し、全てのアッセイを３連で実施した。
（実施例２）
例示的なヒト結合Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドをＨ５ポリペプチドとする。一部のこのような実施形態では、本発明によるＨ５ポリペプチドが、アンブレラグリカンへの結合（例えば、高度な親和性および／または高度な特異的結合）を示す。一部のこのような実施形態では、本発明によるＨ５ポリペプチドが、同等な（アンブレラトポロジーへの結合と）高親和性によるコーントポロジーグリカンへの結合またはコーントポロジーグリカンへの結合の低減（例えば、アンブレラトポロジーグリカンと比べた低親和性および／または低特異性）を示す。
一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチドが、ヒト上気道上皮細胞において見出される受容体に結合する。さらに、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチドは、複数の異なるα２−６シアル化グリカンにも結合する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、アンブレラグリカンに結合する。
一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチドが、気管支および／または気管のＨＡ受容体に結合する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、肺深部の受容体に結合することが可能でなく、一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、肺深部の受容体に結合することが可能である。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、α２−３シアル化グリカンに結合することが可能でなく、一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、α２−３シアル化グリカンに結合することが可能である。
一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチドを、親Ｈ５ ＨＡポリペプチド（例えば、天然のインフルエンザ単離物中に見出されるＨ５ ＨＡポリペプチド）の変異体とする。例えば、一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチドが、野生型のＨ５ ＨＡポリペプチドと比較して、グリカン結合部位内に少なくとも１つのアミノ酸置換を有するか、またはグリカン結合部位に影響を及ぼす少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。一部の実施形態では、このような置換を、結合したグリカンと直接相互作用するアミノ酸の置換とし、一部の実施形態では、分離度１次で隔てられたアミノ酸は、（１）直接的に結合するアミノ酸と相互作用するか、（２）直接的に結合するアミノ酸がグリカンと相互作用する能力に他の形で影響を及ぼすが、グリカン自体とは直接相互作用しないか、または（３）直接的に結合するアミノ酸がグリカンと相互作用する能力に他の形で影響を及ぼし、また、グリカン自体とも直接相互作用するので、このような置換を、結合したグリカンと相互作用するアミノ酸から分離度１次で隔てられたアミノ酸の置換とする。本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチドは、１もしくは複数の直接的に結合するアミノ酸、１もしくは複数の分離度１次のアミノ酸、１もしくは複数の分離度２次のアミノ酸、またはこれらの任意の組合せの置換を含有する。一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチドが、１またはそれより多くの分離度がなおより高次なアミノ酸の置換を含有しうる。
一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体が、野生型のＨ５ ＨＡポリペプチドと比較して少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ以上のアミノ酸置換を有し、一部の実施形態では本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体が、２つ、３つ、または４つのアミノ酸置換を有する。一部の実施形態では、このようなアミノ酸置換の全てを、グリカン結合部位内に配置する。
一部の実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチド変異体が、米国特許公開第２００９／０２６９３４２号および同第２０１０／０００４１９５号のうちのいずれか、ならびに２０１０年７月２日に出願され、「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＤＩＡＧＮＯＳＩＮＧ ＡＮＤ／ＯＲ ＴＲＥＡＴＩＮＧ ＩＮＦＬＵＥＮＺＡ ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ」と題する、米国特許出願第１２／８２９９３１号（これらの全てが参照により本明細書に組み込まれる）において記載されている１またはそれより多くのアミノ酸置換を含有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基９５、９８、１２８、１３０、１３１、１３２、１３３、１３５、１３６、１３７、１３８、１４５、１５３、１５５、１５６、１５８、１５９、１６０、１８３、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、２１９、２２１、２２２、２２４、２２５、２２６、２２７、および２２８のうちの１またはそれより多くに対応する位置において配列の置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基９５、９８、１２８、１３０、１３１、１３２、１３３、１３５、１３６、１３７、１３８、１４５、１５３、１５５、１５６、１５８、１５９、１６０、１８３、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、２１９、２２１、２２２、２２４、２２５、２２６、２２７、および２２８からなる群から選択される残基において、野生型の親Ｈ５ ＨＡと比べて１またはそれより多くのアミノ酸置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基９５、９８、１２８、１３０、１３１、１３２、１３３、１３５、１３６、１３７、１３８、１４５、１５３、１５５、１５６、１５８、１５９、１６０、１８３、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、２１９、２２１、２２２、２２４、２２５、２２６、２２７、および２２８からなる群から選択される任意の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、または３７残基において、野生型の親Ｈ５ ＨＡと比べて１またはそれより多くのアミノ酸置換を有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、１５８位に対応する部位におけるグリコシル化を低減または消失させる配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５
ＨＡポリペプチド変異体が、１５８位に対応する部位に結合したグリカンの同一性および／または構造に影響を及ぼし、かつ／またはこれを変化させる配列置換を有する。一部の実施形態では、このような配列置換は、１５８位に対応する部位における突然変異、例えば、Ａｓｎ１５８Ｘａａ［ＸａａはＡｓｎ以外の任意のアミノ酸である］である。一部の実施形態では、このような配列置換は、１６０位に対応する部位における突然変異、例えば、Ｔｈｒ１６０Ｘａａ［ＸａａはＡｓｎ以外の任意のアミノ酸である］である。一部の実施形態では、このような配列置換が、突然変異Ｔｈｒ１６０Ａｌａを含む。一部の実施形態では、１５８位に対応する部位におけるグリコシル化を低減するか、消失させるか、これに影響を及ぼすか、またはこれを変化させる配列置換により、Ｈ５ ＨＡポリペプチドを、Ｈ２ ＨＡポリペプチドに酷似させる（例えば、構造的にも機能的にも酷似させる）ことができる。一部の実施形態では、１６０位に対応する部位における突然変異（例えば、Ｔｈｒ１６０ＡｌａなどのＴｈｒ１６０Ｘａａ）により、Ｈ５ ＨＡポリペプチドを、Ｈ２ ＨＡポリペプチドに酷似させる（例えば、構造的にも機能的にも酷似させる）ことができる。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基２２６、２２８、および１６０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親Ｈ５ ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基２２６、２２８、および１６０に対応する位置において、野生型の親Ｈ５ ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基２２６および１６０に対応する位置において、野生型の親Ｈ５ ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基２２８および１６０に対応する位置において、野生型の親Ｈ５ ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基２２６および２２８に対応する位置において、野生型の親Ｈ５ ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基２２６、２２８、および１５８のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親Ｈ５ ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基２２６、２２８、および１５８に対応する位置において、野生型の親Ｈ５ ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基２２６および１５８に対応する位置において、野生型の親Ｈ５ ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基２２８および１５８に対応する位置において、野生型の親Ｈ５ ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基２２６および２２８に対応する位置において、野生型の親Ｈ５ ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、ＨＡポリペプチドのループ領域のうちの１またはそれより多くにおいて欠失を包含する１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、ＨＡポリペプチドの１２８〜１３７のループ領域に対応する部位において欠失を包含する１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、ＨＡポリペプチドの残基１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、および／または１３７に対応するアミノ酸位置のうちの１またはそれより多くにおいて欠失を包含する１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、ＨＡポリペプチドの１２８〜１３４のループ領域に対応する部位において欠失を包含する１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、ＨＡポリペプチドの残基１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、および／または１３４に対応するアミノ酸位置のうちの１またはそれより多くにおいて欠失を包含する１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３０に対応するアミノ酸の欠失を包含する１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、このようなループ領域の置換により、Ｈ５ ＨＡポリペプチドを、Ｈ２ ＨＡポリペプチドに酷似させる（例えば、構造的にも機能的にも酷似させる）ことができる。一部の実施形態では、残基１３０に対応するアミノ酸を欠失させることにより、Ｈ５ ＨＡポリペプチドを、Ｈ２ ＨＡポリペプチドに酷似させる（例えば、構造的にも機能的にも酷似させる）ことができる。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、２２８、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、２２８、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、または１４個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、および２２８のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、および２２８のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、または１３個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３１、１３２、１３５、１８８、１９２、２２１、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３１、１３２、１３５、１８８、１９２、２２１、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、または７個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３１、１３２、１３５、１８８、１９２、および２２１のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３１、１３２、１３５、１８８、１９２、および２２１のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、または６個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３３、１３７、１５５、１９３、２２６、２２７、２２８、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３３、１３７、１５５、１９３、２２６、２２７、２２８、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、またはに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３３、１３７、１５５、１９３、２２６、２２７、および２２８のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３３、１３７、１５５、１９３、２２６、２２７、および２２８のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、または７個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３０、１９２、および１９３のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３０、１９２、１９３のうちの任意の１個、２個、または３個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１９２および１９３のうちの一方または両方に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、２２８、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、２２８、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、または１６個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、および２２８のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、および２２８のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、または１５個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、または７個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、および２２８のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、および２２８のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、または６個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、２２８、１３１、１３２、１３３、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、２２８、１３１、１３２、１３３、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、または１１個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、２２８、１３１、１３２、および１３３のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、２２８、１３１、１３２、および１３３のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基２２７、１３１、１３２、１３３、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５
ＨＡポリペプチド変異体が、残基２２７、１３１、１３２、１３３、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、または５個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基２２７、１３１、１３２、および１３３のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基２２７、１３１、１３２、および１３３のうちの任意の１個、２個、３個、または４個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３１、１３３、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、２２８、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３１、１３３、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、２２８、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、または１１個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３１、１３３、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、および２２８のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３１、１３３、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、および２２８のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３１、１３３、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３１、１３３、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３１、１３３、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２６、および２２８のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３１、１３３、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２６、および２２８のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、または９個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３１、１３３、１３７、１５５、１５９、１６０、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、２２８、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３１、１３３、１３７、１５５、１５９、１６０、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、２２８、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、または１３個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３１、１３３、１３７、１５５、１５９、１６０、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、および２２８のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３１、１３３、１３７、１５５、１５９、１６０、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、および２２８のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、または１２個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３１、１３３、１３７、１５５、１５９、１６０、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３１、１３３、１３７、１５５、１５９、１６０、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、または１２個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３１、１３３、１３７、１５５、１５９、１６０、１８８、１９２、１９３、２２６、および２２８のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３１、１３３、１３７、１５５、１５９、１６０、１８８、１９２、１９３、２２６、および２２８のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、または１１個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、１３１、１３２、１３３、２２１、２２７、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、１３１、１３２、１３３、２２１、２２７、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、または１２個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、１３１、１３２、１３３、２２１、および２２７のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、１３１、１３２、１３３、２２１、および２２７のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、または１１個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３１、１３２、１３３、２２１、２２７、および１３０のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３１、１３２、１３３、２２１、２２７、および１３０のうちの任意の１個、２個、３個、４個、５個、または６個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（１）１３０、および（２）残基１３１、１３２、１３３、２２１、および２２７のうちの１またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体）が、（１）１３０、ならびに（２）残基１３１、１３２、１３３、２２１、および２２７のうちの任意の１個、２個、３個、４個、または５個に対応する位置において、野生型の親ＨＡと比べて配列置換を有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基９８、１３６、１５３、１５５、１８３、および１９４が含まれるがこれらに限定されない、グリカンに直接結合する受容体の領域に位置するアミノ酸から選択される残基において、野生型の親Ｈ５ ＨＡと比べて１またはそれより多くのアミノ酸置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、（ａ）残基９８および１９５、（ｂ）残基９８、１３８、１８６、１８７、１９５、および２２８、または（ｃ）残基１３８、１８６、１８７、および２２８が含まれるがこれらに限定されない、グリカンに直接結合する受容体の領域に隣接して位置するアミノ酸から選択される残基において、野生型の親Ｈ５ ＨＡと比べて１またはそれより多くのアミノ酸置換を有する。
一部の実施形態では、分離度１次で隔てられたアミノ酸が、（１）直接的に結合するアミノ酸と相互作用するか、（２）直接的に結合するアミノ酸がグリカンと相互作用する能力に他の形で影響を及ぼすが、グリカン自体とは直接相互作用しないか、または（３）直接的に結合するアミノ酸がグリカンと相互作用する能力に他の形で影響を及ぼし、また、グリカン自体とも直接相互作用するという点で、ＨＡポリペプチド変異体、特にＨ５ポリペプチド変異体は、残基９８、１３８、１８６、１８７、１９５および２２８を含むがこれらに限定されない、結合したグリカンと相互作用するアミノ酸から分離度１次で隔てられたアミノ酸から選択される残基において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くのアミノ酸置換を有する。
一部の実施形態では、分離度１次で隔てられたアミノ酸が、（１）直接的に結合するアミノ酸と相互作用するか、（２）直接的に結合するアミノ酸がグリカンと相互作用する能力に他の形で影響を及ぼすが、グリカン自体とは直接相互作用しないか、または（３）直接的に結合するアミノ酸がグリカンと相互作用する能力に他の形で影響を及ぼし、また、グリカン自体とも直接相互作用するという点で、ＨＡポリペプチド変異体、特にＨ５ポリペプチド変異体は、残基１３８、１８６、１８７、および２２８を含むがこれらに限定されない、結合したグリカンと相互作用するアミノ酸から分離度１次で隔てられたアミノ酸から選択される残基において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くのアミノ酸置換を有する。
一部の実施形態では、分離度１次で隔てられたアミノ酸が、（１）直接的に結合するアミノ酸と相互作用するか、（２）直接的に結合するアミノ酸がグリカンと相互作用する能力に他の形で影響を及ぼすが、グリカン自体とは直接相互作用しないか、または（３）直接的に結合するアミノ酸がグリカンと相互作用する能力に他の形で影響を及ぼし、また、グリカン自体とも直接相互作用するという点で、ＨＡポリペプチド変異体、特にＨ５ポリペプチド変異体は、残基９８および１９５を含むがこれらに限定されない、結合したグリカンと相互作用するアミノ酸から分離度１次で隔てられたアミノ酸から選択される残基において、野生型の親ＨＡと比べて１またはそれより多くのアミノ酸置換を有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体、特にＨ５ポリペプチド変異体が、残基１５９において、野生型の親ＨＡと比べてアミノ酸置換を有する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体、特にＨ５ポリペプチド変異体が、１９０、１９３、２２５、および２２６から選択される残基において、野生型の親ＨＡポリペプチドと比べて１またはそれより多くのアミノ酸置換を有する。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチド変異体、特にＨ５ポリペプチド変異体が、１９０、１９３、２２６、および２２８から選択される残基において、野生型の親ＨＡポリペプチドと比べて１またはそれより多くのアミノ酸置換を有する。
一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体が、以下のアミノ酸置換：Ｓｅｒ１３２Ｔｈｒ、Ａｌａ１３３Ｔｈｒ、Ｓｅｒ１３３Ｔｈｒ、Ｓｅｒ１３７Ａｌａ、Ｓｅｒ１３７Ａｒｇ、Ｉｌｅ１５５Ｔｈｒ、Ｌｙｓ１５６Ｇｌｕ、Ａｓｎ１５８Ｘａａ（ここで、Ｘａａ＝Ａｓｎ以外の任意のアミノ酸）、Ｔｈｒ１６０Ａｌａ、Ａｓｎ１８６Ｐｒｏ、Ａｓｐ１８７Ｓｅｒ、Ａｓｐ１８７Ｔｈｒ、Ａｌａ１８８Ｇｌｕ、Ａｌａ１８８Ａｓｐ、Ａｌａ１８９Ｇｌｎ、Ａｌａ１８９Ｌｙｓ、Ａｌａ１８９Ｔｈｒ、Ｇｌｕ１９０Ａｓｐ、Ｇｌｕ１９０Ｔｈｒ、Ｔｈｒ１９２Ａｒｇ／Ｌｙｓ、Ｌｙｓ１９３Ａｒｇ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｌｙｓ１９３Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ１９３Ｔｈｒ／Ａｌａ／Ｍｅｔ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ２２１Ｐｒｏ、Ｇｌｙ２２５Ａｓｐ、Ｇｌｎ２２６Ｉｌｅ、Ｇｌｎ２２６Ｌｅｕ、Ｇｌｎ２２６Ｖａｌ、Ｓｅｒ２２７Ａｌａ、Ｇｌｙ２２８Ｓｅｒのうちの１またはそれより多くを有する。
一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１９２に対応する位置においてその位置において電荷をスイッチするアミノ酸置換を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１９３に対応する位置においてその位置において電荷をスイッチするアミノ酸置換を有する。例えば、一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチドが、残基１９２に対応する位置においてＴｈｒまたは疎水性残基（例えば、ＶａｌまたはＩｌｅ）を有し、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体（例えば、ヒト適応型変異体）が、残基１９２に対応する位置において親水性残基を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体（例えば、ヒト適応型変異体）が、残基１９２に対応する位置において親水性残基を有する。別の例を挙げれば、一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチドが、残基１９２に対応する位置においてＴｈｒまたは疎水性残基（例えば、ＶａｌまたはＩｌｅ）を有し、Ｈ５
ＨＡポリペプチド変異体（例えば、ヒト適応型変異体）が、残基１９２に対応する位置において塩基性残基（例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇ）を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体（例えば、ヒト適応型変異体）が、残基１９２に対応する位置において塩基性残基（例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇ）を有する。さらに別の例を挙げれば、一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチドが、残基１９３に対応する位置において塩基性残基（例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇ）を有し、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体（例えば、ヒト適応型変異体）が、残基１９３に対応する位置において中性残基または酸性残基を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体（例えば、ヒト適応型変異体）が、残基１９３に対応する位置において中性残基または酸性残基を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体（例えば、ヒト適応型変異体）が、残基１９３に対応する位置においてＴｈｒ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、またはＶａｌを有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドのヒト適応化が、１８８位における残基の特性（複数可）と関連する。Ｈ５ ＨＡでは、残基１８８が、残基１９２においてＴｈｒまたは疎水性残基と接触するＡｌａであることが多い。これに対し、Ｈ２ ＨＡでは、残基１８８が、残基１９２においてＡｒｇまたはＬｙｓと接触するＧｌｕまたはＡｓｐであることが多い。よって、一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、１８８位においてＧｌｕを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、１８８位においてＡｓｐを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、Ａｌａ１８８Ｇｌｕ置換を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、Ａｌａ１８８Ａｓｐ置換を有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、残基１８８に対応する位置においてＡｌａを有し、残基１９２に対応する位置においてＴｈｒを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、残基１８８に対応する位置においてＡｌａを有し、残基１９２に対応する位置において疎水性残基を有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１８８に対応する位置においてＧｌｕを有し、残基１９２に対応する位置においてＡｒｇを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１８８に対応する位置においてＡｓｐを有し、残基１９２に対応する位置においてＡｒｇを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１８８に対応する位置においてＧｌｕを有し、残基１９２に対応する位置においてＬｙｓを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１８８に対応する位置においてＡｓｐを有し、残基１９２に対応する位置においてＬｙｓを有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、残基１８８に対応する位置においてＡｌａを有し、残基１９２に対応する位置においてＴｈｒを有し、残基１９３に対応する位置においてＬｙｓを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、残基１８８に対応する位置においてＡｌａを有し、残基１９２に対応する位置において疎水性残基を有し、残基１９３に対応する位置においてＬｙｓを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、残基１８８に対応する位置においてＡｌａを有し、残基１９２に対応する位置においてＴｈｒを有し、残基１９３に対応する位置においてＡｒｇを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、残基１８８に対応する位置においてＡｌａを有し、残基１９２に対応する位置において疎水性残基を有し、残基１９３に対応する位置においてＡｒｇを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１８８に対応する位置においてＧｌｕを有し、残基１９２に対応する位置においてＡｒｇを有し、残基１９３に対応する位置においてＴｈｒを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１８８に対応する位置においてＡｓｐを有し、残基１９２に対応する位置においてＡｒｇを有し、残基１９３に対応する位置においてＴｈｒを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１８８に対応する位置においてＧｌｕを有し、残基１９２に対応する位置においてＬｙｓを有し、残基１９３に対応する位置においてＴｈｒを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１８８に対応する位置においてＡｓｐを有し、残基１９２に対応する位置においてＬｙｓを有し、残基１９３に対応する位置においてＴｈｒを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１８８に対応する位置においてＧｌｕを有し、残基１９２に対応する位置においてＡｒｇを有し、残基１９３に対応する位置においてＴｈｒ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、またはＶａｌを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１８８に対応する位置においてＡｓｐを有し、残基１９２に対応する位置においてＡｒｇを有し、残基１９３に対応する位置においてＴｈｒ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、またはＶａｌを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１８８に対応する位置においてＧｌｕを有し、残基１９２に対応する位置においてＬｙｓを有し、残基１９３に対応する位置においてＴｈｒ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、またはＶａｌを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１８８に対応する位置においてＡｓｐを有し、残基１９２に対応する位置においてＬｙｓを有し、残基１９３に対応する位置においてＴｈｒ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、またはＶａｌを有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、残基１３１に対応する位置においてＡｌａを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３１に対応する位置においてＴｈｒを有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、残基１３２に対応する位置においてＳｅｒを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３２に対応する位置においてＴｈｒを有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、残基１３３に対応する位置においてＳｅｒを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３３に対応する位置においてＴｈｒを有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、残基１３１、１３２、および／または１３３に対応する任意の位置においてＡｌａ、Ｔｈｒ、および／またはＳｅｒを包含する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３１、１３２、および／または１３３に対応する任意の位置においてＡｌａ、Ｔｈｒ、および／またはＳｅｒを包含する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３１、１３２、および１３３に対応する位置の全てにおいてＴｈｒを包含する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、残基１３５に対応する位置においてＶａｌを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３５に対応する位置においてＶａｌ以外の任意のアミノ酸を有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、残基１３７に対応する位置においてＳｅｒを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１３７に対応する位置においてＡｒｇを有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、残基１５５に対応する位置においてＩｌｅを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１５５に対応する位置においてＴｈｒを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、残基１５５に対応する位置においてＴｈｒを包含する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基１５５に対応する位置においてＴｈｒを包含する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、残基２２１に対応する位置においてＳｅｒを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基２２１に対応する位置においてＰｒｏを有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、残基２２１に対応する位置においてＳｅｒを包含する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基２２１に対応する位置においてＰｒｏを包含する。特定のいかなる一つの理論により拘束されることも望まないが、Ｐｒｏ２２１は、Ｈ２ ＨＡのＲＢＳと関与する２２０ループの立体配座に影響を及ぼしうるであろう。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、残基２２６に対応する位置においてＧｌｎを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基２２６に対応する位置においてＬｅｕを有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、残基２２７に対応する位置においてＳｅｒを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基２２７に対応する位置においてＧｌｙを有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、残基２２８に対応する位置においてＧｌｙを有する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、残基２２８に対応する位置においてＳｅｒを有する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、２２６位、２２７位、および２２８位において、それぞれ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、およびＧｌｙ残基を包含する。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、２２６位、２２７位、および２２８位において、それぞれ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、およびＳｅｒを包含する。
一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体が、表示される位置において以下のアミノ酸変化：
・Δ１３０（「Δ１３０」とは、１３０位に対応するアミノ酸における欠失を示す）＋１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋１３１、１３２、１３５、１８８、１９２、および２２１に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋１３３、１３７、１５５、１９３、２２６、２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋１３１、１３３、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋１３１、１３３、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２６、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋１３１、１３３、１３７、１５５、１５９、１６０、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋１３１、１３３、１３７、１５５、１５９、１６０、１８８、１９２、１９３、２２６、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２８、１３１、１３２、１３３、２２１、および２２７に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋１３１、１３２、１３３、２２１、および２２７に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋１３７、１８８、１９２、１９３、２２６、２２７、２２８、１３１、１３２、および１３３に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ１３０＋２２７、１３１、１３２、および１３３に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
のうちの１またはそれより多くを有する。
一部の実施形態では、本発明が、それらのアミノ酸配列が以下：
［配列中、
Ｘ＝任意のアミノ酸（上記で別段に指定しない限り）とし、かつ／またはＸ＝欠失アミノ酸である。これらの位置の番号付けは、Ｈ３ ＨＡの番号付けに対応する］
に示されるエレメント（これらの位置の番号付けは、Ｈ３ ＨＡの番号付けに対応する）を包含する、Ｈ５ ＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体、操作されたＨ５ ＨＡポリペプチド、および／または操作されたＨ５ ＨＡポリペプチド変異体）を提供する。
一部の実施形態では、Ｘ１３０を、１３０位に対応する部位における欠失とする。一部の実施形態では、Ｘ１６０がＡｌａである。一部の実施形態では、Ｘ１５８が、Ａｓｎ以外の任意のアミノ酸である。
一部のこのような実施形態では、変異体のアンブレラグリカンに対する親和性および／または特異性が増大するように、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体が、野生型のＨ５ ＨＡと比較して少なくとも１つのさらなる置換を有する。
一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Ｌ２２６、Ｓ２２８、およびＡ１６０を包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Ｌ２２６およびＡ１６０を包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Ｓ２２８およびＡ１６０を包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Ａ１６０を包含する配列を有する。
一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Ｌ２２６、Ｓ２２８、およびＸ１５８（Ｘ＝Ａｓｎ以外の任意のアミノ酸）を包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Ｌ２２６およびＸ１５８を包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Ｓ２２８およびＸ１５８を包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Ｘ１５８を包含する配列を有する。
一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、ならびに１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。
一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｌ２２６、Ｓ２２８、Ａ１６０、ならびに１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１８８、１９２、１９３、２２１、および２２７に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体（Ｈ５
ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｌ２２６、Ａ１６０、ならびに１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１８８、１９２、１９３、２２１、２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｓ２２８、Ａ１６０、ならびに１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１８８、１９２、１９３、２２１、および２２７に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｌ２２６、Ｓ２２８、ならびに１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、および２２７に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。
一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ａ１６０、ならびに１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｌ２２６、ならびに１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、および２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｓ２２８、ならびに１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、および２２７に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。
一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｌ２２６、Ｓ２２８、Ｘ１５８（Ｘ＝Ａｓｎ以外の任意のアミノ酸）、ならびに１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、および２２７に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｌ２２６、Ｘ１５８、ならびに１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｓ２２８、Ｘ１５８、ならびに１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、および２２７に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｌ２２６、Ｓ２２８、ならびに１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１５８、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、および２２７に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。
一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）が、Δ１３０、Ｘ１５８（Ｘ＝Ａｓｎ以外の任意のアミノ酸）、ならびに１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１６０、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、および２２８に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。
一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチド変異体が、親Ｈ５ ＨＡと比較して、特に野生型の親Ｈ５ ＨＡと比較して開放性の結合部位を有する。
一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチドが、アンブレラトポロジーグリカンに結合する。一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチドが、図９に示されるグリカン（例えば、α２−６シアル化グリカン）のうちの少なくとも一部に結合する。一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチドが、図９に示される複数のグリカンに結合する。
一部の実施形態では、本発明によるＨ５ ＨＡポリペプチドが、ヒト上気道組織（例えば、上皮細胞）内のＨＡ受容体において見出されるグリカンのうちの少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％以上に結合する。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド（Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体を含めた）を、配列番号５０、５１、５３〜５５、および６０〜７５に示されるポリペプチドのうちのいずれかとする。
一態様では、本発明が、高親和性によるアンブレラトポロジーグリカンへの結合だけでは、ヒトに対する効果的な伝染／感染性を付与するのに十分ではありえないことの具体的な認識を提供する。本発明は、また、コーントポロジーグリカンへの結合の低減も重要でありうることの洞察を提供する。一部の実施形態では、高親和性によるアンブレラトポロジーグリカンへの結合およびコーントポロジーグリカンへの結合親和性の低減が、ヒトに対する効果的な伝染／感染性を付与することに関与している可能性がある。一部の実施形態では、高親和性によるアンブレラトポロジーグリカンへの結合は、ヒトに対する効果的な伝染／感染性を付与するのに十分である。一部の実施形態では、コーントポロジーグリカンへの結合親和性を低減しない（例えば、変化させない、増大させるなど）場合であっても、高親和性によるアンブレラトポロジーグリカンへの結合は、ヒトに対する効果的な伝染／感染性を付与するのに十分である。
一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体のアンブレラトポロジーグリカンへの結合親和性および／または結合特異性の増大ならびにコーントポロジーグリカンへの結合親和性および／または結合特異性の低減が、ヒトに対する伝染／感染性を、基準のポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体のコグネイトである親ＨＡポリペプチド）と比べて増大させるかまたは増強することに関与している可能性がある。一部の実施形態では、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体のアンブレラトポロジーグリカンへの結合親和性および／または結合特異性の増大は、ヒトに対する伝染／感染性を基準のポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体のコグネイトである親ＨＡポリペプチド）と比べて増大させるかまたは増強するのに十分である。一部の実施形態では、コーントポロジーグリカンへの結合親和性および／または結合特異性を低減しない（例えば、変化させない、増大させるなど）場合であっても、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体のアンブレラトポロジーグリカンへの結合親和性および／または結合特異性の増大は、ヒトに対する伝染／感染性を基準のポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体のコグネイトである親ＨＡポリペプチド）と比べて増大させるかまたは増強するのに十分である。一部の実施形態では、コーントポロジーグリカンへの結合親和性および／または結合特異性が、アンブレラトポロジーグリカンへの結合親和性および／または結合特異性と同等であり、かつ／またはこれより大きい場合であっても、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体のアンブレラトポロジーグリカンへの結合親和性および／または結合特異性の増大は、ヒトに対する伝染／感染性を基準のポリペプチド（例えば、Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体のコグネイトである親ＨＡポリペプチド）と比べて増大させるかまたは増強するのに十分である。
（実施例３）
ヒト上気道組織におけるグリカンの多様性
レクチン結合研究により、上気道組織におけるα２−３グリカンおよびα２−６グリカンの分布の多様性が示された。染色研究により、気管上皮の先端側におけるＮ結合型グリカン（絨毛細胞）およびＯ結合型グリカン（杯細胞における）の両方の一部としてのα２−６シアル化グリカンの分布が優勢であることが示される（図１２）。他方、気管組織の内部領域は主に、Ｎ結合型グリカンにおいて分布するα２−３グリカンを含む。
ＭＡＬＤＩ−ＭＳグリカンプロファイリング解析により、ヒト上気道における実質的な多様性（図１０）ならびにα２−６シアル化グリカンの発現が優勢であることが示された。ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＴＯＦを用いる代表的な質量ピークのフラグメント化により、複数のラクトサミン反復配列を伴う長鎖オリゴ糖分枝が、短鎖オリゴ糖分枝と比較して広範に分布するグリカントポロジーが裏付けられる（図１０）。上気道におけるグリカンの分布およびトポロジーの多様性についての基準をもたらすために、ヒト結腸上皮細胞（ＨＴ２９細胞）に由来するＮ結合型グリカンについてＭＡＬＤＩ−ＭＳ解析を実施した。近年のＨ５Ｎ１ウイルスは主に消化管に感染しているため、これらの細胞を代表的な消化管細胞として選択した。ＨＴ２９細胞のグリカンプロファイルは、α２−３グリカンの分布が優勢であり、長鎖オリゴ糖分枝のグリカントポロジーは観察されないＨＢＥのグリカンプロファイルと著明に異なる（図１０）。
図１２のデータは、以下の方法を介して作成した。ホルマリンで固定し、パラフィンで包埋したヒト気管組織切片は、ＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入した。組織切片を脱パラフィン化し、再水和させた後、内因性ビオチンは、ストレプトアビジン／ビオチンブロッキングキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）を用いてブロッキングした。次いで、切片を、ＦＩＴＣで標識したＪａｃａｌｉｎ（Ｏ結合型グリカンに特異的）、ビオチニル化したＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ（Ｎ結合型グリカンを構成するコアオリゴ糖構造の一部であるα結合型マンノース残基に特異的なＣｏｎ Ａ）、ビオチニル化したＭａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓのレクチン（ＭＡＬ、ＳＡα２，３−ｇａｌに特異的）、およびビオチニル化したＳａｍｂｕｃｃｕｓ ｎｉｇｒａのアグルチニン（ＳＮＡ、ＳＡα２，６−ｇａｌに特異的）（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｓ；０．５％のＴｗｅｅｎ−２０を伴うＰＢＳ中に１０μｇ／ｍｌ）と共に、３時間にわたりインキュベートした。ＴＢＳＴ（１％のＴｗｅｅｎ−２０を伴うトリス緩衝生理食塩液）による洗浄の後、切片を、Ａｌｅｘａ
ｆｌｕｏｒ ５４６ストレプトアビジン（０．５％のＴｗｅｅｎ−２０を伴うＰＢＳ中に２μｇ／ｍｌ）と共に、１時間にわたりインキュベートした。スライドをＴＢＳＴで洗浄し、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０レーザー走査共焦点顕微鏡）下で観察した。全てのインキュベーションは、室温（ＲＴ）で実施した。
図１０のデータは、以下の方法を用いて作成した。細胞（約７０×１０６個）は、１００ｍＭのクエン酸緩衝生理食塩液と共に＞９０％をコンフルエントとして採取し、プロテアーゼ阻害剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）による処理およびホモジナイゼーションの後で細胞膜を単離した。細胞膜画分をＰＮＧａｓｅＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で処置し、反応混合物を３７℃で一晩にわたりインキュベートした。反応混合物を１０分間にわたり煮沸して酵素を失活させ、Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８ ＳＰＥカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて、脱グリコシル化されたペプチドおよびタンパク質を除去した。グリカンは、さらに脱塩し、グラファイト化炭素製の固相抽出カラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ）を用いて中性（２５％のアセトニトリル画分）画分および酸性（０．０５％のトリフルオロ酢酸を含有する５０％のアセトニトリル）画分へと精製した。酸性画分は、それぞれ、ソフトイオン化条件（加速化電圧を２２ｋＶ、グリッド電圧を９３％、ガイドワイヤーを０．３％、および抽出遅延時間を１５０ナノ秒とする）を伴う陽イオンモードおよび陰イオンモードのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを介して解析した。ピークは、非ナトリウム化分子種として較正した。α２−６シアル化グリカンの発現が優勢であることは、シアリダーゼＡおよびＳを用いて試料を前処理することにより確認した。単離されたグリカンは、その後最終容量を１００ｍＬとする５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０中に０．１ＵのＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓのシアリダーゼ（シアリダーゼＡ、非特異的）またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのシアリダーゼ（シアリダーゼＳ、α２−３シアル化グリカンに特異的）と共に３７℃で２４時間にわたりインキュベートした。中性画分および酸性画分は、それぞれ、陽イオンモードおよび陰イオンモードのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを介して解析した。
（実施例４）
Ｈ５ ＨＡポリペプチド変異体のヒト肺組織への結合
ホルマリンで固定し、パラフィンで包埋したヒト肺組織切片およびヒト気管組織切片（それぞれ、例えば、ＵＳ Ｂｉｏｍａｘ，Ｉｎｃ．およびＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入した）への結合が提示される。組織切片は、脱パラフィン化し、再水和させ、ＰＢＳ中に１％のＢＳＡと共に３０分間にわたりインキュベートして、非特異的結合を防止した。Ｈ５ ＨＡポリペプチドは、それぞれ４：２：１の比で、一次抗体（マウス抗６×Ｈｉｓタグ抗体）および二次抗体（Ａｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗マウス抗体）と共に、氷上で２０分間にわたりあらかじめ複合体化させた。形成された複合体は、１％のＢＳＡ−ＰＢＳにより４０、２０または１０μｇ／ｍｌの最終ＨＡ濃度へと希釈する。次いで、組織切片を、ＨＡ−抗体複合体と共にＲＴで３時間にわたりインキュベートする。切片は、ヨウ化プロピジウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＴＢＳＴ中に１：１００）で対比染色し、十分に洗浄し、次いで、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０レーザー走査共焦点顕微鏡）下で観察する。
あらかじめ複合体化させたＨ５ ＨＡポリペプチドはまた、Ｊａｃａｌｉｎ（杯細胞など、非絨毛性の粘液性細胞のマーカー）など他のレクチンと共に組織切片を共染色して、ＨＡにより組織上皮における絨毛細胞および／または非絨毛細胞が染色されるかどうかについてのさらなる情報を得るのにも用いる。
（実施例５）
動物宿主におけるＨ５ ＨＡポリペプチドの試験
本明細書で記載する通り、本発明は、ウイルスの伝染について研究するために動物宿主（例えば、フェレット）を用いることにより、ヒトへのウイルス伝染について信頼できる指標がもたらされうることの認識を包含する。同様に、本発明は、ウイルスの伝染について研究するために本発明による結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド）により処置される動物宿主（例えば、フェレット）を用いることにより、ヒト宿主におけるウイルスの防止または処置のための本発明によるこのような結合剤の有効性について信頼できる指標がもたらされうることの認識も包含する。
ウイルス伝染アッセイ
ウイルス伝染アッセイを、本発明による結合剤の存在下または非存在下において用いて、適切な動物モデルにおけるウイルス伝染を決定する。例えば、動物宿主、例えば、フェレットを、動物間の直接的および間接的な接触を防止する、隣接するケージ内で飼育する。しかし、これらの飼育条件は、空気を介するインフルエンザウイルスの拡散を可能とする。動物のうちの第１の部分に、当技術分野で公知の方法（例えば、鼻腔内投与、筋肉内投与、または本明細書で記載される投与方式のうちのいずれか）を介して有効量のウイルスを接種する（「接種された動物」）。次いで、１、２、３日以上後で、ナイーブの動物を、接種された動物と隣接するケージに導入することができる。
研究で用いられる動物は、接種または伝染の１、２、３日以上後の任意の時点で、解析のために死滅させることができる。ウイルス伝染研究に適する解析には、感染性ウイルスの力価（例えば、鼻腔内洗浄を介する）の決定、動物における身体症状（例えば、嗜眠、食欲不振、鼻漏、くしゃみ、高熱、および／または死）の観察、とりわけ、呼吸器組織の免疫組織化学的解析が含まれうるがこれらに限定されない。
上記のウイルス伝染アッセイはまた、ウイルスの接種または伝染の前、間、または後における、動物宿主の、本明細書で記載される本発明に従う結合剤による処置も組み込みうる。次いで、本明細書で記載される解析法を用いて、動物宿主のウイルスによる伝染および／または感染の遮断における結合剤（複数可）の有効性を決定する。
血清学的研究
結合剤および／または結合剤を含むワクチン組成物をフェレットに０日目に筋肉内投与した後、２１日目に追加投与を実施する。各動物に由来する血液を、０、１４、２１、および３５日目に回収する。回収された血清を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、それがウイルスの凝集を阻害し、ウイルス感染を中和する能力について検討した。
血球凝集反応阻害（ＨＡＩ）アッセイ
ＨＡＩの滴定は、９６−ウェルのｖ型底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）内で実施する。血清を２倍に系列希釈し、２００μｌの全容量中に血球凝集用量の４倍のＡ型インフルエンザウイルスへと添加する。次に、２％の（ｖｏｌ／ｖｏｌ）赤血球溶液２５μｌを添加する。血清、ウイルス、および赤血球を静かに混合し、３０分間にわたりインキュベートした後にアッセイを読み取る。血球凝集用量の４倍のウイルスを阻害する最大の抗体希釈率の逆数としての力価を記録する。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける中和アッセイ
血清の系列希釈液を、ウイルスと混合し、室温で３０分間にわたりインキュベートし、次いで、ＭＤＣＫ細胞と共に３７℃で１時間にわたりインキュベートする。次いで、細胞を無血清培地で２回にわたり洗浄し、次いで、トリプシンを伴うかまたは伴わない新鮮な培地を添加する。ウイルスの増殖は、細胞変性効果を介して評価する。データは、中和を引き起こす血清の最大の希釈率の逆数として作成する。
ウイルス感作アッセイ
ワクチン接種されたフェレットを、同種および異種の野生型および突然変異体のＨ５Ｎ１株で鼻腔内感作する。感作後１、３、および５日目に、フェレットから鼻腔内洗浄液を採取する。ＭＤＣＫ細胞におけるウイルスを滴定して、気道内に放出されるウイルスを決定する。
（実施例５）
Ｈ５Ｎ１血球凝集素の近年の単離物における２カ所のアミノ酸変化は、そのヒト受容体への優先性をスイッチするのに十分である
序説
高度に病原性のＨ５Ｎ１は、２００３年以来、ヒトにおける複数の局在化された大発生を開始して、地球規模の憂慮をもたらしている（これらのいずれもが参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｅｕｍａｎｎら、２０１０年、Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ、２０巻：５１頁；Ｇｕａｎら、２００９年、Ｒｅｖ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈ、２８巻：３９頁）。既存のＨ５Ｎ１株はエアロゾル伝染が不可能であり、むしろ、主に感染した動物との直接的な接触を介して伝染する。しかし、感染と関連する罹患率および死亡率の高さ（約６０％）、ならびに公知のインフルエンザ亜型（Ｈ５Ｎ１を含めた）が突然変異または遺伝子再集合を介して表現型形質を獲得する能力により、Ｈ５Ｎ１株もエアロゾル伝染性を獲得しうることが示唆される（参照により本明細書に組み込まれる、Ｙｅｎら、２００９年、Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ、３３３巻：３頁）。このようなウイルスが重度の感染を引き起こす潜在的可能性と共に、ヒト集団がＨ５Ｎ１に対して事前に免疫を有さないという事実により、このような株が発生すれば、将来において流行または大流行が生じうることが示唆される（参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｕｂｂａｒａｏら、２００７年、ＰＬｏＳ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、３巻：ｅ４０頁）。
逆遺伝学システムの使用により、１１の遺伝子産物のうち、血球凝集素（ＨＡ）およびポリメラーゼ（ＰＢ２）における特定のアミノ酸変化の獲得が、ヒトへのエアロゾル伝染に極めて重要であることが示されている（参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｏｅｖｅｎら、２００９年、Ｐｒｏ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１０６巻：３３６６頁）。したがって、これらのタンパク質における遺伝子変化の機能的効果について対処することは、表現型の変化に対する潜在的可能性を同定するのにとりわけ重要である。ＰＢ２の場合、６２７位におけるリシンからグルタミン酸への極めて重要な変化が、エアロゾル伝染性を獲得するのに重要である（参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｏｅｖｅｎら、２００９年、Ｐｒｏ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１０６巻：３３６６頁）。しかし、ＨＡの生物学的役割、すなわち、ビリオンの融合および感染をもたらすグリカン受容体への結合を踏まえるなら、ヒトへの適応をもたらす特異的な突然変異は、亜型特異的および株特異的であると考えられる（これらのいずれもが参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｔｅｖｅｎｓら、２００６年、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、４巻：８５７頁；Ｒｕｓｓｅｌｌら、２００６年、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ、２３巻：８５頁）。
先行研究により、ＨＡの受容体は、特定のグリカン構造（例えば、「アンブレラトポロジー」または「コーントポロジー」であるα２→３結合型シアル酸またはα２→６結合型シアル酸）を末端とするグリカンであることが同定されている。トリ適応型Ｈ５Ｎ１ ＨＡは、コーントポロジーグリカンを末端とするグリカン受容体に優先的に結合し、これらの多くが、α２→３結合型シアル酸（トリ受容体）を有する（これらのいずれもが参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｔｅｖｅｎｓら、２００６年、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、３５５巻：１１４３頁；Ｇａｍｂａｒｙａｎら、２００６年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３４４巻：４３２頁）。ヒト適応型Ｈ１Ｎ１株、ヒト適応型Ｈ２Ｎ２株、およびヒト適応型Ｈ３Ｎ２株のＨＡにより、コーントポロジー（例えば、多くがα２→３シアル化グリカン）からアンブレラトポロジー（例えば、多くがα２→６シアル化グリカン）（ヒト受容体）への結合優先性のスイッチ、およびこれらのヒト適応型ウイルスの空気伝染性と相関することが示されている、特徴的な高親和性によるヒト受容体への結合が裏付けられている（これらのいずれもが参照により本明細書に組み込まれる、Ｐａｐｐａｓら、２０１０年、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、５巻：ｅ１１１５８頁；Ｔｕｍｐｅｙら、２００７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１５巻：６５５頁）。この枠組みを用いて、近年の研究は、現在広く生じているＨ２Ｎ２株、Ｈ７Ｎ７株、およびＨ９Ｎ２株のヒトへの適応をもたらす突然変異のセットを同定している（それらの全てが参照により本明細書に組み込まれる、Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎら、２０１０年、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、５巻：ｅ１３７６８頁；Ｂｅｌｓｅｒら、２００８年、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１０５巻：７５５８頁；Ｓｏｒｒｅｌｌら、２００９年、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１０６巻：７５６５頁）。これらの研究は、転換に要求される突然変異が、研究された亜型およびなお特定の株に基づいて異なりうることを裏付けている。突然変異したＨ５Ｎ１株が、Ｈ２／Ｈ３（Ｑ２２６ＬおよびＧ２２８ＳまたはＬＳ）突然変異および／またはＨ１（Ｅ１９０Ｄ、Ｇ２２５ＤまたはＤＤ）突然変異の顕著な特徴である変化を包含するとする先行研究（それらの全てが参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｉｎｅｓら、２０１１年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、４１３巻：１３９頁；Ｓｔｅｖｅｎｓら、２００８年、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、３８１巻：１３８２頁；Ｓｔｅｖｅｎｓら、２００６年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１２巻：４０４頁）により、これらの突然変異体のうちのいずれもが、ヒト適応型の「流行性」株のＨＡに特徴的な、ヒト受容体への特異性および親和性へと定量的に「スイッチ」するわけではないことが示されている（図２０）。Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（Ｖｉｅｔ０３＿０４）配列における顕著な特徴であるＬＳ残基を導入しようとする試みは、スイッチをもたらしていない。本発明者らは、顕著な特徴であるＬＳ残基に適切に対応するのに必要とされる重要な構造的特徴を確立した。本発明者らはまた、いかなる構造的特徴が、高親和性によるヒト受容体への結合を可能とするような受容体の特異性のスイッチを促進するのに要求されるのかも決定した。
実験デザイン
インフルエンザＨＡは、単量体が５５２アミノ酸を含有するホモ三量体のタンパク質である。単量体の各々は、２つのジスルフィド結合した部分である、ＨＡ１およびＨＡ２からなる。ＨＡ１がグリカン受容体結合部位（ＲＢＳ）を含むのに対し、ＨＡ２はウイルスと細胞膜との融合に関与している。ＲＢＳポケットは、ＨＡの９５、１３１、１３３、１３６、１３７、１３８、１４５、１５３、１５５、１５６、１５８、１５９、１８３、１８６、１８７、１８９、１９０、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、２１９、２２２、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８位（Ｈ３の番号付けを用いる）を伴う。
Ｈ５ ＨＡは、系統的にＨ２ ＨＡに最も近縁である（図２１）ので、ＬＳ残基に対応する構造的特徴および適正なＨ５ ＨＡ配列を決定するために、本発明者らは、Ｈ２ ＨＡのＲＢＳとＨ５ ＨＡのＲＢＳの詳細な構造的比較を実施した。この研究のために、原型的な流行性Ｈ２（Ａ／Ａｌｂａｎｙ／６／５８またはＡｌｂ６＿５８）ＨＡを、初期のヒト単離物（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４またはＶｉｅｔ０３＿０４）に由来する代表的なＨ５Ｎ１ ＨＡと共に選択した。比較解析を行うことにより、本研究では、Ｈ５ ＨＡのＲＢＳをＨ２ ＨＡのＲＢＳから識別する４つの異なる特徴を同定した（図２２）。第１に、Ｈ２ ＨＡの１３０ループの組成は、Ｈ５ ＨＡの１３０位（Ｈ３の番号付け）において欠失を包含するＨ５ ＨＡとは異なる。第２に、ヒト受容体末端のＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌモチーフの向こう側の糖残基と相互作用する、ＲＢＳの「上部」または「１９０螺旋」におけるアミノ酸組成（１８８位、１９２位、および１９３位などにおけるアミノ酸組成）には差違が認められる。第３に、ヒト受容体のＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌモチーフと相互作用する、ＲＢＳの「底部」におけるアミノ酸組成（１３７位、２２１位、２２６位、および２２８位などにおける、ＬＳ変化を包含するアミノ酸組成）には差違が認められる。第４に、Ｈ２ ＨＡでは、Ｈ５ ＨＡの１５８位におけるグリコシル化部位が不在である。この部位におけるグリコシル化であれば、ＲＢＳに結合したヒト受容体末端のＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌモチーフの向こう側の糖残基に干渉する潜在的可能性がありうるであろう（これらのいずれもが参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｔｅｖｅｎｓら、２００８年、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、３８１巻：１３８２頁；Ｗａｎｇら、２０１０年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、８４巻：６５７０頁）。本発明の知見は、Ｈ２ ＨＡのＲＢＳとＨ５ ＨＡのＲＢＳとのこの詳細な比較を包含し、これにより、既に観察されたより特徴的なＬＳ変化の埒外にある特定のアミノ酸の差違が示唆される。本発明者らは、ＬＳ突然変異の文脈でＨ２ ＨＡのＲＢＳの構造的特徴への合致を促進する適切なＨ５ ＨＡ配列を同定しようと努めた。
全ての現在に至るまでのＨ５Ｎ１配列（トリ単離物およびヒト単離物の両方）についての解析により、本発明者らは、３つのさらなる観察：１）近年のトリ単離物およびヒト単離物（２００７年以後）の多くに由来するＨ５ ＨＡポリペプチドが既に、第１の特徴に合致する、１３０ループにおける欠失を獲得していることの観察、２）特徴２に合致する、「１９０螺旋」における重要なアミノ酸変化が既に観察されていることの観察、および３）また多くのＨ５ ＨＡ配列において、１５８位におけるグリコシル化の喪失（特徴４）も観察されていることの観察を行うことが可能となった。ＨＡ ＲＢＳの重要な構造的特徴の文脈で、本発明者らは、１３０ループにおける欠失が、同じＨＡにおいてグリコシル化の喪失を共時的に伴うこと（特徴１および４）が、Ｈ５ ＨＡの進化において極めて重要であることを決定した。しかし、本発明は、グリコシル化の喪失が１３０ループにおける残基の欠失に付随的であっても、その逆は成り立たないことの認識を包含する。本発明は、特定の最新型のＨ５ ＨＡ株が、旧型のヒト単離物（Ｖｉｅｔ０３＿０４など）から大幅に分岐しているが、また、流行性のＨ２ ＨＡ ＲＢＳに合致するのに必要な、重要な構造的特徴も獲得していることの観察を包含する。
したがって本発明者らは、特徴１および４を有する株であれば、顕著な特徴であるＬＳ残基に適切に対応する適正なＨ５ ＨＡ配列となるかどうかを評価した。この実験のために、株Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｅｇｙｐｔ／Ｒ２／２００７（またはｃｋＥｇｙ＿０７）を、天然で特徴１および４を獲得した代表的なＨ５ ＨＡとして選択した（図２３）。このＨ５ ＨＡ配列にＬＳ突然変異だけを導入すること（ｃｋＥｇｙ＿０７＿ＬＳ）により、ヒト受容体へのスイッチおよび高親和性によるヒト受容体への結合（およびトリ受容体に対する比較的低度な親和性）が示され、これにより、ヒト適応型「流行性」ＨＡのグリカン結合特徴への類似が示された（図２４Ａ、Ｂ、および図２５）。さらなる知見により、流行性ＨＡによるこの組織の染色に類似する、ヒト気管上皮の尖枝表面におけるこの突然変異体のＨ５ ＨＡのヒト受容体への結合（図２４Ｃ）が裏付けられる（これらのいずれもが参照により本明細書に組み込まれる、Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎら、２０１０年、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、５巻：ｅ１３７６８頁；Ｍａｉｎｅｓら、２００９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２５巻：４８４頁）。
他の研究者らによる、Ｖｉｅｔ０３＿０４など旧型のヒト単離物にＬＳ変化だけを導入する初期の努力は、スイッチをもたらさず、ＬＳ突然変異に対応しうるＨ５ ＨＡ ＲＢＳの構造的特徴を理解する必要を過小評価した。ｃｋＥｇｙ＿０７＿ＬＳもまた、天然で特徴４を獲得したことを踏まえ、本発明者らは、この特徴だけ、すなわち、ＬＳと併せたグリコシル化の喪失（Ｔ１６０Ａ突然変異を介して達成される）により、Ｖｉｅｔ０３＿０４のグリカン受容体への結合優先性がスイッチされるかどうかを評価した（図２５）。野生型のＨＡであるＶｉｅｔ０３＿０４と比較して、この突然変異体株の用量依存的な直接的グリカン結合は、ヒト受容体への結合を示したが、また、流行性ヒト適応型ＨＡには非特徴的な、その高親和性によるトリ受容体への結合も保持した（図２５）。天然で特徴４を獲得した別の株（Ａ／Ｅｇｙｐｔ／２７８６−ＮＡＭＲＵ３／０６またはＥｇｙ＿０６）にＬＳ変化だけを導入したところ、この観察が確証された。最後に、天然で特徴２を獲得した、代表的なＨ５ ＨＡ（Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｖｉｅｔｎａｍ／ＮＣＶＤ−０９３／０８またはｃｋＶｉｅｔ＿０８）（図２２Ｃ）における突然変異により、ヒト受容体への結合親和性が付与されたが、また、高親和性によるトリ受容体への結合も保持された（図２６）ことは、この構造的枠組みと符合する。
考察
顕著な特徴であるＬＳ残基に適切に対応するのに必要とされる特定の構造的特徴を規定したのは、本発明者らが初めてである。加えて、本発明者らは、現在広く生じている特定のＨ５ ＨＡポリペプチドが、Ｈ５ ＨＡのヒト受容体への優先性をスイッチし、これにより、それらのヒトへの適応をもたらすのに、２カ所のアミノ酸変化、顕著な特徴であるＬＳを要求するのみであることの洞察も提示する。本発明に由来する情報を用いて、本発明者らは、ＬＳ変化だけを組み込むことにより受容体の特異性のスイッチ切換えを施しやすい、適切なＨ５ ＨＡ配列（全Ｈ５Ｎ１ ＨＡのうちの小規模な代表的プールに由来する配列ではあるが）を合理的に選択した。これらの最新型のＨ５ ＨＡポリペプチドの１つの特徴的特性は、それらが、特徴１、２、および４（図２７）を獲得するように天然で進化したことである。特徴１および４を獲得した配列は、ＮＣＢＩデータベースにおける２２７７の非冗長Ｈ５Ｎ１ ＨＡ配列のうちの６％に過ぎないが、しかし、これが、２００９年および２０１０年に単離されたＨ５Ｎ１株のうちの約４５％を表す。Ｈ５Ｎ１ ＨＡについてのさらなる系統解析により、天然で獲得した特徴１および４は、クレード２．２．１に属することが明らかとなる。これまでのところ、特徴１の発生は、クレード２．２．１に限られると考えられるが、しかし、特徴４の存在がクレード２．２．１に制約されるわけではない。クレード２．２．１株は、既に旧型のヒト単離物（Ｖｉｅｔ０３＿０４など）から大幅に分岐しており、これらの旧来の株よりヒトに対して緊密に適応していることが極めて重要である。クレード２．２．１に属する、報告されたヒトＨ５Ｎ１単離物の全ては、エジプトおよびイスラエルに由来する。したがって、クレード２．２．１株の進化をモニタリングすることが重要である。
１２９位における正に荷電した残基（特徴２）を伴う例示的なＨ５Ｎ１株
全てがクレード２．２．１に属する同じＨＡの１３０位における欠失（および１５８位におけるグリコシル化の喪失）（特徴１）を伴う例示的なＨ５Ｎ１株。これらには、以下が含まれるがこれらに限定されない。
材料および方法
ＨＡのクローニング、バキュロウイルスによる合成、発現、および精製
ＷＴのＨ５ ＨＡ配列および突然変異体のＨ５ ＨＡ配列を、昆虫細胞による発現のためにコドン最適化し、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）により合成した。次いで、合成された遺伝子を、ｐＡｃＧＰ６７Ａプラスミドへとサブクローニングし、製造元による指示書に従い、Ｂａｃｕｌｏｇｏｌｄシステム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて、バキュロウイルスを創出した。次いで、ＢＤ Ｂａｃｕｌｏｇｏｌｄ Ｍａｘ−ＸＰ ＳＦＭ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）により培養したＳｆ９細胞の懸濁液培養物に感染させるのに、組換えバキュロウイルスを用いた。感染をモニタリングし、感染の３〜４日後に条件付け培地を採取した。ニッケル親和性クロマトグラフィー（ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて、採取した条件付け培地から可溶性のＨＡを精製した。ＨＡを含有する溶出画分をプールし、１００Ｋ ＭＷＣＯスピンカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて、ｐＨ８．０の１倍濃度ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）へと濃縮および緩衝液交換した。精製されたタンパク質は、ＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて定量化した。
組換えＨＡのヒト気管組織切片への結合
パラフィン包埋したヒト気管（ＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）組織切片を、ＰＢＳ中に１％のＢＳＡで３０分間にわたり脱パラフィン化し、再水和し、インキュベートして、非特異的結合を防止した。ＨＡを、氷上で２０分間にわたり、一次抗体（マウス抗６×Ｈｉｓタグ、Ａｂｃａｍ）および二次抗体（Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗マウス抗体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、それぞれ、４：２：１のモル比であらかじめ複合体化させた。１％のＢＳＡ−ＰＢＳ中であらかじめ複合体化させたＨＡを希釈することにより、異なるＨＡ濃度にわたり組織への結合を実施した。次いで、組織切片を、ＲＴで３時間にわたり、ＨＡ−抗体複合体と共にインキュベートした。組織切片は、ヨウ化プロピジウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＴＢＳＴ中で１：１００）で対比染色した。組織切片をマウントし、次いで共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０レーザー走査共焦点顕微鏡）を用いて造影した。
ＷＴのＨＡおよび突然変異体のＨＡの用量依存的な直接的結合
多価ＨＡ−グリカン間相互作用を探索するため、ビオチニル化した代表的なα２→３シアル化グリカンおよびα２→６シアル化グリカンを含むストレプトアビジンプレートアレイを、既に記載した通りに用いた。３’ＳＬＮ、３’ＳＬＮ−ＬＮ、３’ＳＬＮ−ＬＮ−ＬＮは、代表的なトリ受容体である。６’ＳＬＮおよび６’ＳＬＮ−ＬＮは、代表的なヒト受容体である。ＬＮは、ラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）に対応し、３’ＳＬＮおよび６’ＳＬＮは、それぞれ、ＬＮに結合したＮｅｕ５Ａｃα２−３およびＮｅｕ５Ａｃα２−６に対応する（図２８）。ビオチニル化グリカンは、それらのリソースリクエストプログラムを介して、Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓから得た。ストレプトアビジンでコーティングした高結合能の３８４ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ）で、ウェルを２．４μＭのビオチニル化グリカン５０μｌと共に、４℃で一晩にわたりインキュベートすることにより、各ウェルの容量いっぱいまで投入した。過剰なグリカンは、ＰＢＳによる十分な洗浄を介して除去した。三量体のＨＡ単位は、３つのＨＡ単量体（および、したがって、各単量体につき１つずつである３つのＲＢＳ）を含む。ストレプトアビジンプレートアレイのウェル内のビオチニル化グリカンの空間的配置が好適なのは、三量体のＨＡ単位中の３つのＨＡ単量体のうちのただ１つへの結合である。したがって、ＨＡ−グリカン間相互作用における多価性を特異的に増強するために、組換えＨＡタンパク質を、４：２：１（ＨＡ：一次抗体：二次抗体）のモル比で一次抗体および二次抗体とあらかじめ複合体化させた。プレ複合体中で４つの三量体のＨＡ単位が全てのＨＡについて同一な配置により、それらのグリカン結合親和性の間の比較が可能となる。適量のヒスチジンタグづけしたＨＡタンパク質、一次抗体（Ａｂｃａｍ製のマウス抗６×ＨｉｓタグＩｇＧ）、および二次抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製のＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ）を、４：２：１の比で含有する原液を、氷上で２０分間にわたりインキュベートした。適量のあらかじめ複合体化させたＨＡ原液を、ＰＢＳ中に１％のＢＳＡで２５０μｌへと希釈した。この５０μｌのあらかじめ複合体化させたＨＡを、グリカンでコーティングしたウェルの各々へと添加し、室温で３時間にわたりインキュベートした後、ＰＢＳおよびＰＢＳＴ（１倍濃度のＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）による洗浄ステップを実施した。製造元による指示書に従い、Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ａｓｓａｙキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）を用いて、ＨＲＰ活性に基づき、結合シグナルを決定した。
同等物
当業者は、日常的な実験だけを用いて、本明細書で記載される本発明の実施形態との多くの同等物を認識するかまたはこれらを確認することが可能である。本発明の範囲は、上記の「説明」に限定されることを意図するものではなく、以下の特許請求の範囲に示される通りである。

Claims (33)

  1. 基準のＨ５ ＨＡポリペプチド配列のアミノ酸配列と、残基１３０、１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、２２８、およびこれらの組合せからなる群から選択される残基のうちの１またはそれより多くで異なるアミノ酸配列を有するＨ５ ＨＡポリペプチドを含む結合剤
    を含む医薬組成物。
  2. 前記結合剤が、アンブレラトポロジーグリカンとＨＡポリペプチドとの間でのグリカン−ＨＡポリペプチド相互作用と競合する、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 前記Ｈ５ ＨＡポリペプチドの長さが１９〜５５アミノ酸の範囲にある、請求項１に記載の医薬組成物。
  4. 前記Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、長さが少なくとも１９アミノ酸である部分を包含するアミノ酸配列を有し、配列番号５０、５１、５３、５４、または５５からなる群から選択されるＨ５ ＨＡポリペプチドの対応する部分と少なくとも９５％の配列全体の同一性を示す、請求項１に記載の医薬組成物。
  5. 前記Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、アミノ酸１〜５５に対応する領域にわたり、配列番号５０、５１、５３、５４、または５５からなる群から選択される基準のＨ５ ＨＡと少なくとも９５％の同一性を示すアミノ酸配列を有するが、前記基準のＨＡのアミノ酸配列と、残基１３０、１９２、１９３、およびこれらの組合せからなる群から選択される１またはそれより多くの残基が異なる、請求項１に記載の医薬組成物。
  6. 前記Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、アミノ酸１〜５５に対応する領域にわたり、配列番号５０、５１、５３、５４、または５５からなる群から選択される基準のＨ５ ＨＡと少なくとも９５％の同一性を示すアミノ酸配列を有するが、前記基準のＨＡのアミノ酸配列と、残基１２８〜１３７、およびこれらの組合せからなる群から選択される１またはそれより多くの残基が異なる、請求項１に記載の医薬組成物。
  7. 前記Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、アミノ酸１〜５５に対応する領域にわたり、配列番号５０、５１、５３、５４、または５５からなる群から選択される基準のＨ５ ＨＡと少なくとも９５％の同一性を示すアミノ酸配列を有するが、前記基準のＨＡのアミノ酸配列と、アミノ酸残基１３０の欠失が存在することにより異なる、請求項１に記載の医薬組成物。
  8. 前記Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、アミノ酸１〜５５に対応する領域にわたり、配列番号５０、５１、５３、５４、または５５からなる群から選択される基準のＨ５ ＨＡと少なくとも９５％の同一性を示すアミノ酸配列を有するが、前記基準のＨＡのアミノ酸配列と、残基１６０、２２６、２２８、およびこれらの組合せからなる群から選択される１またはそれより多くの残基が異なる、請求項１に記載の医薬組成物。
  9. 前記Ｈ５ ＨＡポリペプチドが、アミノ酸１〜５５に対応する領域にわたり、配列番号５０、５１、５３、５４、または５５からなる群から選択される基準のＨ５ ＨＡと少なくとも９５％の同一性を示すアミノ酸配列を有するが、前記基準のＨＡのアミノ酸配列と、残基１５８、２２６、２２８、およびこれらの組合せからなる群から選択される１またはそれより多くの残基が異なる、請求項１に記載の医薬組成物。
  10. 前記アンブレラトポロジーグリカンが、長鎖α２−６シアル化グリカンを含む、請求項２に記載の医薬組成物。
  11. 前記長鎖α２−６シアル化グリカンが、

    からなる群から選択される、請求項１０に記載の医薬組成物。
  12. 前記結合剤が、アンブレラトポロジーグリカンに、同等の条件下でヒトの感染を媒介する野生型のＨＡについて観察される親和性の少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の親和性で結合する、請求項２に記載の医薬組成物。
  13. 前記結合剤が、アンブレラトポロジーグリカンに、コーントポロジーグリカンに結合するより強力に結合する、請求項２に記載の医薬組成物。
  14. 前記結合剤が、アンブレラトポロジーグリカン対コーントポロジーグリカンについて少なくとも２の相対的親和性を示す、請求項２に記載の医薬組成物。
  15. 前記結合剤が、アンブレラトポロジーグリカン対コーントポロジーグリカンについて少なくとも５の相対的親和性を示す、請求項２に記載の医薬組成物。
  16. 前記結合剤が、アンブレラトポロジーグリカン対コーントポロジーグリカンについて少なくとも１０の相対的親和性を示す、請求項２に記載の医薬組成物。
  17. 前記相互作用が、前記ＨＡポリペプチドと、ヒト上気道上皮細胞、気管支、気管、または肺深部において見出される受容体との間で生じる、請求項２に記載の医薬組成物。
  18. アンブレラトポロジーグリカンとＨＡポリペプチドとの間のグリカン−ＨＡポリペプチド相互作用と競合する結合剤
    を含むワクチン組成物であって、
    前記ワクチンが、任意のＨ５インフルエンザウイルスに対して広く防御的であるワクチン組成物。
  19. 前記Ｈ５インフルエンザウイルスが、ヒト適応型Ｈ５ウイルスまたはトリ適応型Ｈ５ウイルスである、請求項１８に記載のワクチン組成物。
  20. 前記適応型Ｈ５ウイルスが、基準のＨ５ ＨＡポリペプチド配列と、残基１３０、１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、２２８、およびこれらの組合せからなる群から選択される残基のうちの１またはそれより多くで異なるＨ５ ＨＡポリペプチド配列を含む、請求項１９に記載のワクチン組成物。
  21. 被験体においてＨ５インフルエンザウイルスのアンブレラトポロジーを有する血球凝集素受容体への結合を阻害するか、アンブレラトポロジーを有する血球凝集素受容体に結合するインフルエンザウイルスによる被験体の感染の危険性を最小化するか、または被験体を処置する方法であって、
    インフルエンザウイルスによる感染に対して感受性であるかまたはこれを患っている被験体を同定するステップと、
    アンブレラトポロジーグリカンとＨＡポリペプチドとのグリカン−ＨＡポリペプチド間相互作用と競合する結合剤を選択するステップと、
    前記ウイルスによるアンブレラトポロジーグリカンを有する血球凝集素受容体への結合を低減するか、前記危険性を最小化するか、または前記患者を処置するように、有効量の前記結合剤を投与するステップと
    を含む方法。
  22. 前記結合剤が、基準のＨ５ ＨＡポリペプチド配列と、残基１３０、１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、２２８、およびこれらの組合せからなる群から選択される残基のうちの１またはそれより多くでＨ５ ＨＡポリペプチド配列を含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記選択するステップが、結合剤を、前記結合剤がアンブレラトポロジーグリカンを有する血球凝集素受容体に結合することが可能であることに基づいて選択することを包含する、請求項２１に記載の方法。
  24. 前記結合剤がＬＳＢＡである、請求項２１に記載の方法。
  25. 前記結合剤がＵＴＢＡである、請求項２１に記載の方法。
  26. 前記結合剤がＵＴＳＢＡである、請求項２１に記載の方法。
  27. 前記ＵＴＳＢＡを、前記ウイルスへの曝露前に前記被験体に投与する、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記ＵＴＳＢＡを、前記ウイルスへの曝露後に前記被験体に投与する、請求項２６に記載の方法。
  29. 投与する量が、前記被験体のアンブレラトポロジーグリカンを含有するＨＡ受容体を飽和させるのに十分である、請求項２１に記載の方法。
  30. 前記ＵＴＳＢＡを、吸入により投与する、請求項２６に記載の方法。
  31. 前記ＵＴＳＢＡが、抗体、レクチン、アプタマー、および非ＨＡポリペプチドからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
  32. 前記ＵＴＳＢＡを、第２の治療剤の投与と組み合わせて投与する、請求項２６に記載の方法。
  33. 前記第２の治療剤が抗ウイルス剤である、請求項３２に記載の方法。
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