JP2013542224A - デングウイルス組換えサブユニットスワクチン - Google Patents

Abstract

本発明は、ヒト被験者への投与用のデングウイルスワクチンおよび免疫原性組成物を提供する。本発明のワクチン組成物は、組換え的に産生された切断型デングウイルスエンベロープ糖タンパク質の単量体および／または二量体形を含み、アジュバントおよび薬学的に許容可能な担体と共に製剤化されるとき、平衡のとれた４価の免疫応答を誘導する。本明細書に記載の組成物の好ましい実施態様において、ＤＥＮ４タンパク質成分はＤＥＮ４の二量体形である。組成物は、免疫抑制、易感染性および免疫老化の個体群を含む一般の個体群における使用に許容できるように設計される。また本明細書では、本明細書で記載の組成物を患者に投与することによって、ヒト患者個体群において防御免疫応答を誘導する方法をも提供する。

Description

（関連出願の相互参照）
本特許出願は、２０１０年１０月２９日出願の米国仮特許出願第６１／４０８，３１０号の利益を主張し、その開示内容は内容全体が本明細書において参照され援用される。
（米国政府援助研究に関する陳述）
本発明は一部分、番号５ＵＯ１ＡＩ０５６４１０−０３および１ＵＣ１ＡＩ０６２４８１（ＮＩＨ）、ならびにＷ８１ＸＷＨ−０６−２−００３５（ＤＯＤ）の下、米国政府の援助を受けた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。

本発明は、ヒト被験者におけるデングウイルス感染ならびにその臨床症状の防御および／または治療にとって有用な、デングウイルス感染に対する免疫応答を誘発する組成物に関する。

フラビウイルス科は、タイプ種の黄熱病ウイルス（ＹＦ）、デングウイルスの４の血清型（ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３およびＤＥＮ−４）、日本脳炎ウイルス（ＪＥ）、ダニ媒介脳炎（ＴＢＥ）、西ナイルウイルス（ＷＮ）、セントルイス脳炎ウイルス（ＳＬＥ）および約７０の他の病気を引き起こすウイルスを含む。フラビウイルスは、一本鎖のプラス鎖ＲＮＡゲノムを含む小型のエンベロープウイルスである。１０個の遺伝子産物が単一のオープンリーディングフレームにコードされており、カプシド（Ｃ）、「プレ膜」（ｐｒＭ、細胞からビリオンが放出する直前に「膜」（Ｍ）になる）、「エンベロープ」（Ｅ）、に続いて非構造（ＮＳ）タンパク質ＮＳ１、ＮＳ２ａ、ＮＳ２ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂおよびＮＳ５の順に組織化されポリタンパク質として翻訳される（総説としては、Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｔ．Ｊ．ら，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９０） ４４：６４９−６８８；Ｈｅｎｃｈａｌ，Ｅ．Ａ．およびＰｕｔｎａｋ，Ｊ．Ｒ．，Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．（１９９０） ３：３７６−３９６）。個々のフラビウイルスタンパク質は、次にウイルスにコードされたプロテアーゼと同様に宿主によっても媒介される精確なプロセシングによって産生される。

フラビウイルスのエンベロープは宿主細胞膜に由来し、ウイルスにコードされた膜で係留された膜（Ｍ）およびエンベロープ（Ｅ）糖タンパク質を含む。Ｅ糖タンパク質は、最大のウイルス構造タンパク質であり、細胞表面接着および内部エンドゾーム融合活性に対し責任のある機能ドメインを含む。またそれは、防御免疫に関連する、ウイルス中和抗体の産生を誘導する宿主免疫系の最大の標的でもある。

デングウイルスはヤブカ属の蚊、主にネッタイシマカおよびヒトスジシマカによって人に伝染する。デングウイルスによる感染は、不顕性または軽度の熱病から、高熱、頭痛、関節痛と筋肉痛、発疹、リンパ節症および白血球減少症によって特徴づけられる典型的なデング熱（ＤＦ）を経由して（Ｇｉｂｂｏｎｓ，Ｒ．Ｖ．およびＤ．Ｗ．Ｖａｕｇｈｎ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ（２００２） ３２４：１５６３−１５６６）、点状出血や斑状出血の存在から治療しなければ死をもたらす特発性出血および深いショックにまで及ぶ血管透過性および／または重篤な出血症状によって特徴付けられる、子供にありふれたより重篤な感染形態であるデング出血熱／デングショック症候群（ＤＨＦ／ＤＳＳ）に至る範囲の種々の臨床像をもたらす。診断および迅速な医療介入がなければ、ＤＨＦ／ＤＳＳの突然の発病と急速な進行は死に至る可能がある。

デングウイルスは、ＤＨＦ／ＤＳＳの２５０、０００ないし５００、０００の症例を含む毎年発生するデング熱の１億の症例が見積もられる地球規模の疾患率と死亡率の観点から（Ｇｕｂｌｅｒ，Ｄ．Ｊ．，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（１９８８） １１：４８０−４９６；Ｇｉｂｂｏｎｓ，前掲書）、節足動物媒介性ウイルスの最も重要なグループである。地球規模の人口増加、特に熱帯の至る所での住民の都市化、および持続する蚊防除方法の欠如により、デングウイルスのベクターである蚊は熱帯、亜熱帯およびいくつかの温帯地域中に分布を拡げ、デング感染のリスクを世界人口の半分以上にもたらした。現代のジェット機旅行および人間の移住がデングウイルス血清型の地球規模の分布を助長した結果、今やデングウイルスの複数の血清型が多数の地域において風土病となっている。過去２０年以上にわたり、デング熱流行の頻度およびＤＨＦ／ＤＳＳの発生率が増加した。例えば東南アジアにおいてＤＨＦ／ＤＳＳは、子供の入院および死亡の主因である（Ｇｕｂｌｅｒ，前掲書；Ｇｉｂｂｏｎｓ ａｎｄ Ｖａｕｇｈｎ，前掲書）。

現在までフラビウイルスワクチンの開発は、入り混じった成功を経験してきた。フラビウイルス誘発性疾患に対する防御ワクチン候補を生み出すための取り組みにおいて手段を与えてきた４の基本的な方法、すなわち弱毒化生、不活化全ウイルス、組換えサブユニットタンパク質およびＤＮＡワクチンがある。黄熱病ウイルス用の弱毒化生ワクチンは何十年も利用されてきた。不活化全ウイルスワクチンの使用は、ＴＢＥおよびＪＥウイルスに対して実証されてきた。

上で強調したＹＥ、ＪＥおよびＴＢＥワクチンの成功にも関わらず、デングウイルス用ワクチンを開発するための弱毒化生ウイルスおよび不活化ウイルス法の使用は、重大な難題に突き当たった。デングウイルスには４の血清型（ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３およびＤＥＮ４）があり、各々の血清型のウイルス株は世界のデング熱風土病地域の至る所で広まっていることが認められている。自然感染は、感染した血清型に対する長く持続する免疫を与えるが他のデング血清型には与えない。デングウイルスの１の血清型による感染が他の血清型による二次感染を伴うとき、重篤な疾患の形態（ＤＨＦ／ＤＳＳ）がデング二次感染後に最もよく生じる。ＤＨＦおよびＤＳＳとデング二次感染との高頻度の関連は、１のウイルス型による感染によって誘導された二次デングウイルス型の感染性を亢進する、非中和抗体のためであると仮定された（抗体依存性感染状況‐ＡＤＥ）。このコンセプトは、効果的なデングワクチンは全ての４のデング血清型に対する平衡のとれた特異的中和抗体および特異的免疫記憶細胞を同時に誘導しなければならないので（ＨａｌｓｔｅｄおよびＤｅｅｎ，２００２）、ワクチン開発にとって重要な意味を有する。これはデングワクチン開発における主要な課題であると判明した。

今日まで、臨床的に試験されたワクチンの大多数は弱毒化生ワクチンであり、それらは健康な被験者に与えられた全ての生ウイルスワクチンに共通する安全性への懸念を引き起こす。ウイルスの不十分な弱毒化はウイルスに関連した有害事象をもたらし得、一方過剰な弱毒化はワクチンの効果を抑制し得る。また野生型への復帰または病原性増加（または効果の減少）への突然変異も起こり得る。さらに、適切に弱毒化されたとしても、生ウイルスワクチンは、妊婦、幼児または高齢者個体群等の正常な個体群の特別なセグメントと同様に、例えば免疫不全または免疫抑制患者等の特定の患者の個体群にとって禁忌となる。

デングウイルスに対する弱毒化生ウイルス法に関するさらなる課題点は、４価ワクチンの中で独立して複製する４のウイルスの組み合せに関連する難題を含む。干渉に関する課題点は、今日まで試験された全ての４価の製剤を苦しませ、平衡のとれない４価の免疫および広い間隔（例えば０、６、１２月）で投与される複数回投与の必要性を生じていた。これは決して理想的ではなく、部分的に免疫化され野生型ウイルスに暴露された個体に対する、これらの個体が重症型の疾患（例えばデング出血熱）の高いリスクにさらされるかもしれないので、安全性の課題を提示することができるだろう。

Ｉｖｙら（米国特許第６，４３２，４１１号）は、ＤＥＮ１−４の８０％Ｅ（ＤＥＮ−２エンベロープポリペプチドのアミノ酸１−３９５と等価）タンパク質を含む４価のサブユニットワクチンを開示する。Ｉｖｙら（前掲書）は、またＤＥＮ１−４の８０％ＥおよびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバントを含む組成物も報告する。しかしながら、全ての４のデング血清型に対する平衡のとれた免疫応答を誘発することができる安定な４価ワクチンに対する要求が現存する。

ＭｃＤｏｎｅｌｌら，米国特許第６，４１６，７６３号

Ａｎｇｓｕｂｈａｋｏｒｎ，Ｓ．ら，（１９９４）Ｓｏｕｔｈｅａｓｔ Ａｓｉａｎ Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ ２５：５５４−５９ Ａｚｚａｒｉ，Ｃ．ら，（１９８７）Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｉｒ． ９：３９１−６ Ｂａｌｌａｓ，Ｚ．Ｊ．ら，（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：４８７８−８６ Ｂａｎｃｒｏｆｔ，Ｗ．Ｈ．ら，（１９８４）Ｖａｃｃｉｎｅ１４９：１００５−１０ Ｂａｋｏｎｙｉら，（２００５）Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１１：２２５ Ｂａｎｚｈｏｆｆら，（２００３）Ｇｅｒｅｎｔｏｌｏｇｙ ４９：１７７−８４ ＢａｒｒおよびＭｉｔｃｈｅｌｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７４：８−２５（１９９６） Ｂｅａｓｌｅｙ，Ｄ．およびＢａｒｒｅｔｔ Ａ．，（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７６：１３０９７−１３１００ Ｂｅａｓｌｅｙ，Ｄ．ら，（２００４）Ｖａｃｃｉｎｅ ２２：３７２２−２６ Ｂｅｎ−Ｎａｔｈａｎら，（２００３）Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１８８：５−１２ Ｂｅｎ−Ｙｅｈｕｄａら，（２００３）Ｖａｃｃｉｎｅ ２１：３１６９−７８ Ｂｈａｍａｒａｐｒａｖａｔｉ，Ｎ．ら，（１９８７）Ｂｕｌｌ．Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎ． ６５：１８９−９５ Ｂｈａｍａｒａｐｒａｖａｔｉ，Ｎ．およびＳｕｔｅｅ，Ｙ．（２０００）Ｖａｃｃｉｎｅ Ｓｕｐｐｌ ２：４４−４７ Ｂｒａｎｄｔ，Ｅ．Ｅ．（１９９０）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ． １６２：５７７−８３ Ｂｒａｙ，Ｍ．ら，（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７０：４１６２−６６ Ｂｒａｙ，Ｍ．およびＬａｉ，Ｃ．Ｊ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０３４２−４６ Ｂｒｕｎｇｅｒ，Ａ．ら，（１９９８）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． ５４：９０５−２１ Ｃａｎｅ，Ｐ．Ａ．ら，（１９８８）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：１２４１−４６ Ｂｕｎｇｅｎｅｒら，（２００５）Ｖａｃｃｉｎｅ ２３：１２３２−４１ Ｃａｒｄｏｓａ，Ｍ．Ｊ．（１９９８）Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ． ５４：３９５−４０５ Ｃｅｒｑｕｅｔｔｉ，Ｍ．Ｃ．ら，（１９８３）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ． ４１：１０１７ Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｔ．Ｊ．ら，（１９９０）Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４４：６４９−８８ Ｃｈａｎｇら，（２００１）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ９５１：２７２−８５ Ｃｈｅｎ，Ｗ．ら，（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６９：５１８６−９０ Ｃｈｏｗｅｒｓら，（２００１）Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．７：６７５−７８ Ｃｈｕ，Ｒ．Ｓ．ら，（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １８６：１６２３ Ｃｌｅｍｅｎｔｓら，（２０１０）Ｖａｃｃｉｎｅ ２８：２７０５ Ｃｏｍｍｅｎｔ，（２００４）Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒ．Ｍｅｄ．１４１：１５３ Ｃｏｘ，Ｊ．Ｃ．およびＣｏｕｌｔｅｒ，Ａ．Ｒ．（１９９７）Ｖａｃｃｉｎｅ １５：２４８−５６ Ｃｒｉｌｌ，Ｗ．およびＲｏｅｈｒｉｇＪ．（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７５：７７６９−７３ Ｃｕｌｐ，Ｊ．Ｓ．ら，（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１７３−７ Ｃｕｚｚｕｂｂｏら，（２００１）Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ８：１１５０−５５ Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉら，（２０１０）Ｓｃｉｅｎｃｅ３２８：７４５−７４８ Ｄｈａｒａｋｕｌ，Ｔ．ら，（１９９４）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ． １７０：２７−３３ Ｅｃｋｅｌｓ，Ｋ．Ｈ．ら、（１９８４）Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ． ３３：６８４−８９ Ｅｄｅｌｍａｎ，Ｒ．ら，（１９９４）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ． １７０：１４４８−５５ Ｅｌｉａｓら，（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７１：３６９７−３７０４ Ｅｎｎｉｓ，Ｆ．ら，（１９９９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２５９：２５６−６１ Ｆａｌｇｏｕｔ，Ｂ．ら，（１９９０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６４：４３５６−６３ Ｆｌｅｅｔｏｎ，Ｍ．Ｎ．ら，（１９９０）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ． ８０：１１８９−９８ Ｆｒｅｃｈら，（２００５）Ｖａｃｃｉｎｅ ２３：９４６−５０ Ｇｉｂｂｏｎｓ，Ｒ．Ｖ．およびＶａｕｇｈｎ，Ｄ．Ｗ．（２００２）Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ３２４：１５６３−６６ Ｇｌｕｃｋ，Ｒ．およびＭｅｔｃａｌｆ，（２００２）Ｖａｃｃｉｎｅ ２０：Ｂ１０−６ Ｇｕｅｂｒｅ−Ｘａｂｉｅｒら，（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：７６１０−１８ Ｇｕｂｌｅｒ，Ｄ．Ｊ．（１９９８）Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ． １１：４８０−９６ Ｇｕｐｔａ，Ｒ．Ｋ．およびＧ．Ｒ．Ｓｉｂｅｒ，（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２６３−７６ Ｈａｌｌ，Ｒ．Ａ．ら，（１９９６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７７：１２８７−９４ Ｈａｌｓｔｅａｄ，Ｓ．Ｂ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４７６−８１ Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ｇ．およびＫｒｉｅｇ，Ａ．（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６４：９４４−５２ Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ｇら，（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１６４：１６１７−２４ Ｈｅｉｎｚ，Ｆ．Ｘ．ら，（１９８３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １３０：４８５−５０１ Ｈｅｎｃｈａｌ，Ｅ．Ａ．ら，（１９８５）Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ． ３４：１６２−６９ Ｈｅｎｃｈａｌ，Ｅ．Ａ．およびＰｕｔｎａｋＪ．Ｒ．（１９９９０）Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ． ３：３７６−９６ Ｈｏｋｅ，Ｃ．Ｈ．Ｊｒ．ら，（１９９０）Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ． ４３：２１９−２６ Ｉｖｅｙ−Ｈｏｙｌｅ，Ｍ．（１９９１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２：７０４−７ Ｊａｃｏｂｓ，Ｓ．Ｃ．ら，（１９９４）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ． ７５：２３９９−２４０２ Ｊａｎ，Ｌ．ら，（１９９３）Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ． ４８：４１２−２３ Ｊｏｈａｎｓｅｎ，Ｈ．ら、（１９８９）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：８８２−８９ Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．Ａ．およびＫｊｅｌｄｇａａｒｄ，Ｍ．（１９９８）Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｏ，ｓｏｆｔｗａｒｅ ｍａｎｕａｌ，Ｕｐｐｓａｌａ Ｋａｎｅｓａ−ｔｈａｓａｎ，Ｎ．ら，（２００１）Ｖａｃｃｉｎｅ １９：３１７９−８８ Ｋａｔｚ，Ｊ．ら，（２００４）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ． ２９：１１３−２４ Ｋｅｎｓｉｌ，Ｃ．Ｒ．ら，（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：４３１−３７ Ｋｉｍｕｒａ−Ｋｉｒｏｄａ，Ｊ．およびＫ．Ｙａｓｕｉ，（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４１：３６０６−１０ Ｋｌｅｅら，（２００４）ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ． １０：１４０５−１１ Ｋｒｅｉｌら，（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７２：３０７６−３０８１ Ｋｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．ら，（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７４：５４６ Ｌａｉ，Ｃ．Ｊ．ら，（１９９８）Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｖｉｒｏｌ． １０：１７３−７９ Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ，Ｒ．ら，（１９９３）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ． ２６：２８３−９１ Ｌａｗｒｅｎｃｅら，（２００３）Ｃｏｍｍｕｎ．Ｄｉｓ．Ｉｎｔｅｌｌ． ２７：３０７−２３ Ｌｅｄｅｒら，（２００１）Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．３３：１５５３−６６ Ｌｅｓｅｒｍａｎ，Ｌ．（２００４）Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ． １４：１７５−８９ Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｍ．およびＦｒａｎｋ，Ｗ．Ｊ．（１９８８）Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ． ４４：２４２ ＬｉｎおよびＷｕ，（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７７：２６００−６ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，Ｐ．Ｇ．ら，（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５４：１２８７−９５ Ｌｕｓｔｉｇら，（２０００）Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：４０１−１０ Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ，Ｊ．Ｍ．ら，（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２０：２３２−４０ Ｍａｎｄｌ，Ｃ．Ｗ．（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６：５６４−５７１ Ｍａｒｋｏｆｆ，Ｌ．（２０００）Ｖａｃｃｉｎｅ １８：２６−３２ Ｍａｓｏｎ，Ｐ．Ｗ．（１９８９）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２０３７−４８ Ｍａｔｈｅｗ，Ａ．ら，（１９９６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． ９８：１６８４−９２ ＭｃＥｌｈａｎｅｙ，（２００３）Ｃｏｎｎ．Ｍｅｄ． ６７：４６９−７４ ＭｃＫｅｅ，Ｋ．Ｔ．ら，（１９８７）Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ． ３６：４３５−４２ Ｍｅｎ，Ｒ．ら，（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６５：１４００−１４０７ Ｍｉｓｈｔｏ，ら，（２００３）Ａｇｅｉｎｇ Ｒｅｓ．Ｒｅｖ． ２：４１９−３２ Ｍｏｄｉｓ，Ｙ．ら，（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：６９８６−９１ Ｍｏｄｉｓ，Ｙ．ら，（２００４）Ｎａｔｕｒｅ ４２７：３１３−９ Ｍｏｉｎｇｅｏｎ，Ｐ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９８：１８９−９８ Ｍｏｎａｔｈ，Ｔ．ら，（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｏｒｄ． １：３７−５０ Ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ ａｎｄ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ Ｗｅｅｋｌｙ Ｒｅｐｏｒｔ（ＭＭＷＲ）（２００３）ｖｏｌ．５２ Ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ ａｎｄ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ Ｗｅｅｋｌｙ Ｒｅｐｏｒｔ（ＭＭＷＲ）（２００４）ｖｏｌ．５３，Ｎｏｖ１９，２００４ Ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ ａｎｄ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ Ｗｅｅｋｌｙ Ｒｅｐｏｒｔ（ＭＭＷＲ）（２００２）ｖｏｌ．５１：１−１０ Ｍｕｒｐｈｙら，（１９８６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２４：１９７−２０２ Ｎｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｊ．ら，（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２３５７−６２ Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ，Ｚ．（１９９７）Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ Ｘ−ｒａｙ Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ Ｄａｔａ Ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｉｎ Ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ Ｍｏｄｅ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．Ｖｏｌｕｍｅ２７６．ｐｐ３０７−２６ Ｏｘｅｎｉｕｓ，Ａ．ら，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７３：４１２０ Ｐａｗｅｌｅｃ（２００３）Ｂｉｏｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ４：１６７−７０ Ｐａｗｅｌｅｃら，（２００２）Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．７：ｄ１ ０５６−１８３ Ｐｌａｔｏｎｏｖら，（２００１）Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ． ７：１２８−３２ Ｐｌｅｔｎｅｖら，（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：３０３６−４１ ＰｏｄｄａおよびＤｅｌＧｉｕｄｉｃｅ（２００３）Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ ２：１９７−２０３ Ｐｒｅｓｃｒｉｒｅ Ｉｎｔ．（２００４） １３：２０６−８ Ｑｉａｏら，（２００４）Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ． １９０：２１０４−８ Ｒａｍｏｎ．Ｇ．（１９２５）Ｂｕｌｌ．Ｓｏｃ．Ｃｅｎｔｒ．Ｍｅｄ．Ｖｅｔ． １０１：２２７−３４ ＲｅｙＦ．Ａ．，ら，（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７５：２９１−９８ Ｒｏｄｅｎｈｕｉｓ−Ｚｙｂｅｒｔら，（２０１０）ＰＬｏｓ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ６：１−９ Ｒｕｆら，（２００４）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ３２：１９１−９８ Ｒｅｖｉｅｗ（２００３）Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ． ６９Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ：１−６０ Ｓａｂｃｈａｒｅｏｎ，Ａ．ら，（２００２）Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ． ６６：２６４−７２ Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｊ．ら，（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３５：２８０５−９ Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｊ．ら，（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６０：１１５３−５５ Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｊ．ら，（１９８７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ． ６８：８５３−５７ Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｊ．ら，（１９９０）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ． ７１：５９３−９９ Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｊ．ら，（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９２：１３２ Ｓｍｉｔｈｂｕｒｎら，（１９４０）Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ． ２０：４７１−９２ Ｓｍｕｃｎｙ，Ｊ．ら，（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ． ５３：４３２−７ Ｔｅｓｈ，Ｒ．Ｂ．ら，（２００２）Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ． ８：２４５−５１ Ｔｅｓｈ，Ｒ．Ｂ．ら，（２００２）Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ． ８：１３９２−７ Ｔｒｉｒａｗａｔａｎａｐｏｎｇ，Ｔ．ら，（１９９２）Ｇｅｎｅ １１６：１３９−１５０ Ｔｓａｉら，（１９９８）Ｌａｎｃｅｔ ３５２：７６７−７１ Ｖａｕｇｈｎ，Ｄ．Ｗ．ら，（１９９６）Ｖａｃｃｉｎｅ１４：３２９−３６ ＶｅｒｔｈｅｌｙｉおよびＫｌｉｎｍａｎ（２００３）Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０９：６４−７１ Ｘｉａｏ，Ｓ−Ｙ．ら，（２００１）Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ． ７：７１４−２１ Ｗａｎｇら，（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６７：５２７３−７７ Ｗａｎｇ，Ｓ．ら，（２００３）Ｖａｃｃｉｎｅ ２１：４２９７−４３０６ Ｗｅｅｒａｔｎａ，Ｒ．Ｄ．ら，（２０００）Ｖａｃｃｉｎｅ １８：１７５５−６２ Ｗｉｎｄｏｎら，（２００１）Ｖａｃｃｉｎｅ ２０：４９０−９７

本発明は、デングウイルス感染と関連する疾患の防御および／または治療用のヒト患者個体群における使用のためのワクチンおよび免疫原性組成物を提供する。ワクチンは、デングウイルスエンベロープタンパク質由来の組換えサブユニットタンパク質とアジュバントを組み合わせて形成する。本発明のデングウイルスワクチンは、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３およびＤＥＮ４に対する平衡のとれた防御的な４価の免疫応答を誘導するように設計されており、一方では許容可能な安全性プロファイルを提供する。

ユニークなワクチン製剤は、ワクチン製剤を作製するためにアジュバントと組み合された、新規で、適切に折り畳まれた組換えエンベロープサブユニットタンパク質（「デング８０Ｅ」または「ＤＥＮ−８０Ｅ」または「ＤＥＮ１−８０Ｅ」または「ＤＥＮ２−８０Ｅ」または「ＤＥＮ３−８０Ｅ」または「ＤＥＮ４−８０Ｅ」または「ＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐ」）に依存する。製剤の組換えエンベロープタンパク質の単量体および／または二量体形の比率を変えるというユニークな組み合せは、具体的には平衡のとれた４価の応答に対する要求を処理するために設計される。ワクチンは、健康なヒトボランティアにおけるウイルス中和抗体等の適切な、平衡のとれた４価の防御免疫応答を誘導するように、ならびに健康な個体および易感染性の個体に対する投与に関し許容可能な安全性プロファイルを維持するように設計される。本明細書に記載のワクチン組成物のさらなる優位性は、それらが顕著な量のプレ膜（ｐｒＭ）タンパク質を含まないことであり、そのことが最近抗‐ｐｒＭ抗体と関連づけられたＡＤＥのリスクを潜在的に最小化する（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２８：７４５−７４８（２０１０）；Ｒｏｄｅｎｈｕｉｓ−Ｚｙｂｅｒｔら，ＰＬｏｓ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ６：１−９（２０１０））。８０Ｅタンパク質は、ｐｒＭと同時翻訳で発現されるが、しかしポリタンパク質はそれが分泌経路を移行するときにｐｒＭ−Ｅ接合部で、純化のために８０Ｅ成分を培養培地中に放出するように宿主細胞のシグナラーゼによって切断される（Ｃｌｅｍｅｎｔｓら，２０１０，Ｖａｃｃｉｎｅ ２８：２７０５）。

本発明の他の態様は、デングウイルス感染が誘発する疾患に対する免疫予防としての許容可能な担体中での治療的有効量のワクチンの使用、および医薬組成物としての許容可能な担体中での治療的有効量のワクチンの使用を含む。

明細書を通しておよび添付の特許請求の範囲において使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上の明らかな指示が無い限り複数への言及を含む。

明細書を通しておよび添付の特許請求の範囲において使用するとき、以下の定義および略語が適用される。

用語「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、治療的処置および予防または防御法の両方を称する。治療を必要とする個体群は、デング熱に感染するリスクにある個体群、例えばデング感染および／またはその臨床症状発現が防御されることが期待される被験者／患者の個体群と同様に、任意の臨床症状が顕在化しているか否かに関わらず、既にデング熱に感染した個体群を含む。本発明のデングワクチンによる患者の治療は、以下の１または複数を含む：患者におけるデング熱に対する免疫応答の誘導／増加、デング熱に感染した患者におけるデング熱の臨床症状発現の可能性の防御、回復、抑制または低減、デング熱、ＤＨＦまたはＤＳＳおよび／または他の疾患またはデング感染と関連する合併症を発症する可能性の防御または低減、デング感染および／または他の疾患またはデング熱と関連する合併症の臨床症状の重篤度または持続期間の低減、ならびにデング感染の可能性の防御または低減。

用語「治療的有効量」とは、十分なワクチン組成物が、これに限定されるものではないが：患者におけるデング熱に対する免疫応答の誘導／増加、デング感染またはデング熱回帰感染の可能性の防御または低減、デング熱に感染した患者におけるデング感染の臨床症状発現の防御、回復または抑制、デング熱、ＤＨＦおよび／またはＤＳＳの防御、デング熱と関連する疾患の重篤度または持続期間の低減、を含む所期の効果を産生するために患者に導入されることを意味する。当業者はこのレベルが変動し得ることを認識している。

用語「免疫応答」とは、細胞性（Ｔ細胞）免疫応答および／または抗体（Ｂ細胞）応答を称する。

用語「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」とは、免疫応答性および易感染性の個体群の両方を含む、本明細書に記載のデングワクチン／免疫原性組成物を受容する予定の任意の人間を称する。本明細書に定義の通り「患者」は、自然感染かまたはワクチン接種かによって既にデング熱に感染した個体群または今後暴露されるかもしれない個体群を含む。

「ＭＡＡ」は、Ｍｅｒｃｋアルミニウムアジュバントを意味する。ＭＡＡはアモルファス・アルミニウムヒドロキシホスファートアジュバントである。用語「ＭＡＡ」は、本明細書において用語「アモルファス・アルミニウムヒドロキシホスファート」または「ＡＡＨＳ」と互換的に用いられる。

「ＩＳＣＯＭ型アジュバント」は、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）を含むアジュバントであり、サポニン、コレステロールおよびリン脂質から構成され、それらは共に、その機能に寄与するユニークな球形のケージ型構造を有する、特徴的なケージ型粒子を形成する（総説としては、ＢａｒｒおよびＭｉｔｃｈｅｌｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７４：８−２５（１９９６）を参照されたい）。この用語は、抗原により産生されＩＳＣＯＭ粒子の内部に抗原を含むＩＳＣＯＭアジュバント、および抗原無添加で産生される中空型のＩＳＣＯＭ型アジュバントであるＩＳＣＯＭマトリックスアジュバントの両方を含む。本明細書で提供する組成物および方法の好ましい実施態様において、ＩＳＣＯＭ型アジュバントは、抗原無添加で製造されるＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）等のＩＳＣＯＭマトリックス粒子アジュバントである（ＩＳＣＯＭ（登録商標）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）はＣＳＬ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａの登録商標である）。

ｃＧＭＰグレードに精製されたＤＥＮ１−８０Ｅ、ＤＥＮ２−８０Ｅ、ＤＥＮ３−８０ＥおよびＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐ（各試料１μｇ）の銀染色したドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ゲル（パネルＡ）およびウェスタンブロット（パネルＢ）を示す。全試料は１０％ゲル上、非還元条件下で泳動した。ウェスタンブロットは全てのデングウイルスを認識するマウスモノクローナル抗体（４Ｇ２）を使用して染色した。分子量マーカーのサイズ（ｋＤ単位）はゲルおよびブロットの左側に示した。 ｃＧＭＰグレードに精製されたＤＥＮ１−８０Ｅ、ＤＥＮ２−８０Ｅ、ＤＥＮ３−８０ＥおよびＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐ（各試料１μｇ）の銀染色したドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ゲル（パネルＡ）およびウェスタンブロット（パネルＢ）を示す。全試料は１０％ゲル上、非還元条件下で泳動した。ウェスタンブロットは全てのデングウイルスを認識するマウスモノクローナル抗体（４Ｇ２）を使用して染色した。分子量マーカーのサイズ（ｋＤ単位）はゲルおよびブロットの左側に示した。 アカゲザルへの４価のデングウイルスによる攻撃感染の研究結果：実施例６に記載の通り、ベロ細胞でのサル血清の直接プラークアッセイによる攻撃感染後の定量的ウイルス血症評価を示す。

上記の通り、ヒト用のデングワクチンの開発においていくつかの試みがなされてきたが、しかしこれまでのところこれらの試みは安全性および／または効果に関する課題によって苦しめられてきた。そのために本発明は、ヒト被験者におけるデングウイルス感染、および／またはその臨床症状の防御および／または治療に有用である組成物を提供する。

多くの従来の取り組みは、安全性と十分な免疫原性（例えば、免疫化された個体群における平衡のとれた４価の応答の誘導可能性）の両方を有するヒトデングワクチンの開発に向けられてきた。これらの取り組みにも関わらず、これらの条件を十分に満たす人間用のデングワクチンは、今日まで樹立されなかった。従って本発明によって解決すべき技術的課題は、２の主要な条件；すなわち（１）ワクチン接種を受けた個体群（ヒト被験者）において平衡のとれた４価防御免疫応答を誘導するための能力、および（２）幼児、高齢者および免疫不全状態患者を含むヒト被験者におけるすぐれた安全性プロファイルを維持するための能力、を満たすデングウイルスワクチンを発見することである。これはデングウイルスワクチン開発における重要な難題を示しており、今日までこの技術的課題の全ての態様を適切に処理するワクチン製剤は提示されていない。デングウイルス感染の流行が増加しているため、解決のための高度で、未だ対処されていない増大する要求がある。

全てのフラビウイルスのエンベロープタンパク質は著しい相同性を共有する。エンベロープタンパク質の全て３の外部ドメイン内に含まれるエピトープに対して作られた抗体は、ウイルスの中和、すなわちインビトロでの感受性細胞のウイルス感染の阻害をすることができる。ウイルス中和抗体の力価が高いことは、一般にインビボでのフラビウイルス感染に対する防御およびフラビウイルス誘発性疾患の防御と、インビトロで最良の相関関係にあると認められている（Ｍａｒｋｏｆｆ，Ｖａｃｃｉｎｅ（２０００） １８：２６−３２；Ｂｅｎ−Ｎａｔｈａｎら，Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓｅａｓｅｓ（２００３） １８８：５−１２；Ｋｒｅｉｌら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８８） ７２：３０７６−３０８１；Ｂｅａｓｌｅｙら，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００４） ２２：３７２２−２６）。従って高力価のデングウイルス中和応答を誘導するワクチンは、デングウイルスによって誘発される疾患に対しワクチン接種受容患者を防御するだろう。

ＤＨＦおよびＤＳＳの二次デング感染との関連頻度の高さは、一次感染の結果生じた交差反応性の非中和性の抗体の存在によるものと仮定され、その抗体はＦｃ受容体介在経路により単球／マクロファージ等のＦｃ受容体保有細胞の感染を促進することによって、二次感染する血清型の複製の発現を増加させる（ＡＤＥ；Ｈａｌｓｔｅａｄ １９８８；Ｈａｌｓｔｅａｄ １９８９）。あるいは最近の仮説は、「抗原原罪」の現象によって初期の免疫応答が一次感染の血清型に対して主に向けられ、そのことがより特異的な免疫応答が開始され得る前に、二次感染の血清型が複製し優位性を得ることを可能にする、と考えている（Ｍｏｎｇｋｏｌｓａｐａｙａら，２００３）。効果的なデングワクチンは、全ての４のデング血清型に対する平衡のとれた特異的中和抗体および特異的記憶細胞を同時に誘導しなければならないので、機構に関わらずこの二次感染増強という現象は、ワクチン開発に対し重要で密接な関係にある（ＨａｌｓｔｅａｄおよびＤｅｅｎ，２００２）。これはデングワクチン開発における主要な課題であることが判明した。

この課題がデングワクチン開発においてどのような問題を起こしたかを説明するために、現在まで行われた取り組みを再検討することが有用である。候補の弱毒化生デングワクチン株を開発するために相当量の取り組みが行われたが、しかし試験されたウイルス株の多くは不十分であることが判明し、ならびにウイルスの血清型間の干渉が非常に厳しいことが判明した。典型的に弱毒化したウイルスを使用した２の開発プログラムが第ＩＩ相臨床試験に進んだが、しかし干渉および／または生産性の課題のために第ＩＩ相で留まるかまたは停止された。

フラビウイルスワクチンを開発するための伝統的な弱毒化生ウイルス法に代えて、組換えキメラ法が利用された。この方法は基剤として周知の弱毒化ウイルス株を利用し、基剤ウイルスの等価の遺伝子の代わりに対象の関連するウイルス由来の適当な遺伝子（フラビウイルスに関してはｐｒＭおよびＥ）を置換する。ＷＮおよびデングワクチン開発のために使用された一方法は、弱毒化ＤＥＮ−４株を基剤にした内部型キメラの使用である（Ｂｒａｙ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６） ７０：４１６２−４１６６；Ｃｈｅｎ，Ｗ，ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９５） ６９：５１８６−５１９０；Ｂｒａｙ，Ｍ．およびＬａｉ，Ｃ．−Ｊ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１） ８８：１０３４２−１０３４６；Ｌａｉ，Ｃ．Ｊ．ら，Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８） １０：１７３−１７９）。もう一つの方法は、ＪＥウイルス、ＤＥＮウイルスおよびＷＮウイルス用の組換えキメラワクチンを開発するための、基剤としての弱毒化ＹＦ１７Ｄウイルス株の使用だった。（Ｇｕｙ，Ｂ．ら，Ｖａｃｃｉｎｅ（２０１１），ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｖａｃｃｉｎｅ．２０１１．０６．０９４；Ｌａｉ，Ｃ．Ｊ．およびＭｏｎａｔｈ Ｔ．Ｐ．Ａｄｖ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ（２００３） ６１：４６９−５０９；Ｍｏｎａｔｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００６） １０３：６６９４）。弱毒化生キメラ法の使用は伝統的な弱毒化生ウイルス法よりも有利であるとは言え、キメラ法は適当に弱毒化したウイルス株の開発およびデングウイルスに対する平衡のとれた４価の応答の達成に直面する困難さに未だに苦しまされている。

現在、不活化全ウイルス法を使用するＪＥおよびＴＢＥ用に生産された市販のワクチンが入手できる。弱毒化生ウイルス法と同様に、一定のフラビウイルスに対する不活化ウイルス法の使用は、他のフラビウイルスに関する成功を保証しなかった。例えば不活化ＤＥＮワクチンを開発するための取り組みは、限られた成功しか得られなかった。第一にこれらの方法は、細胞培養系から十分なウイルス収量を得ることができないことによって制限された。Ｃ６／３６等の昆虫細胞からのウイルス収量は、一般的に１０^４ないし１０^５ｐｆｕ／ｍｌの範囲であり、費用効果がある不活化ウイルスワクチンを産生するために必要なレベルよりかなり低い。ＬＬＣ−ＭＫ２およびベロ細胞を含む哺乳動物細胞からの収量はかなり高いが、しかしユニークなベロ細胞系からの最高の収量、約１０^６ｐｆｕ／ｍｌでも本当に費用効果があるワクチン生産を達成するために必要なよりもまだ低い。低収量は、平衡のとれた４価応答を誘導する能力にさらに悪い影響を与え得る。

また裸ＤＮＡ法の使用は、ＤＥＮ、ＪＥ、ＴＢＥおよびＷＮ用の非複製型フラビウイルスワクチンを開発するための取り組みにおいても評価された（Ｐｏｒｔｅｒら，１９９８；Ｒａｖｉｐｒａｋａｓｈら，２０００；Ｋｏｎｉｓｈｉら，１９９８；Ｃｈａｎｇら，２０００；Ｓｃｈｍａｌｊｏｈｎら，１９９７；Ａｂｅｒｌｅら，１９９９；Ｄａｖｉｓら，２００１）。ＤＮＡ法は、インビボでの抗原の発現のため、生産の容易さ、一定の配列の使用、液性免疫および細胞性免疫の両方を誘発する潜在能力において優位性を与える。これらの優位性にも関わらず、一貫した活発な免疫応答を誘導する能力がこの方法にとっての主要な障害であり続けている。動物モデルにおいて適切な防御免疫応答を誘導するいくつかの成功があったとは言え（Ｄａｖｉｓら，２００１）、ヒトにおけるこれらの応答を誘導する能力は未だ確立されていない。さらにＤＮＡワクチンは、宿主ゲノム中でのプラスミド配列の組込みおよび二重らせんＤＮＡに対する自己抗体を産生する潜在能力に関する懸念のために、追加の法規制の調査に直面している。

フラビウイルスワクチン開発のための組換えサブユニットタンパク質の使用は、非複製型ウイルス法のもう一つの例である。この方法は、詳細に明らかにされた産物の生産および特異的な免疫応答を誘導する潜在能力において優位性を与える。適切で活発な免疫応答を引き起こす能力が存在するとは言え、組換えサブユニットの使用に関連する難題がある。これはタンパク質の特性（未変性様の構造）および所期の免疫応答誘導でのアジュバントの必要性の両方のためである。組換えサブユニットワクチンは、組換えサブユニットＢ型肝炎ワクチン（例えば、ＲＥＣＯＭＢＩＶＡＸ ＨＢ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ．，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ，ＮＪ）およびＥＮＧＥＲＩＸ Ｂ（登録商標）（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ＳＡ Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｌｇｉｕｍ））によって、およびかなり最近ではヒトパピローマウイルスワクチン（例えば、ＧＡＲＤＡＳＩＬ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ．）およびＣＥＲＶＡＲＩＸ（登録商標）（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ＳＡ Ｃｏｒｐ．））によって最も効果的に例証された、安全性および防御効率に関する長い歴史を有している。生産のどの時点においても複製型ウイルスが存在しないという事実は、予防的な設定での健康なまたは免疫不全状態の個体群へのサブユニットワクチンの投与に関連して、非常に限られたリスクしか存在しないことを保証するのを助長する。さらにＢ型肝炎ワクチンおよびヒトパピローマウイルスワクチンは、高度に免疫原性であり有効であることが示されてきた。

組換えフラビウイルスタンパク質の発現は、構造タンパク質Ｃ、ｐｒＭおよびＥならびに非構造タンパク質ＮＳＩに重点がおかれてきた。Ｅタンパク質は、本タンパク質がウイルスの表面に曝され、ウイルスの重要な生物学的側面に関わっており、感染宿主における中和抗体の標的であるために、最も取り組まれてきた実験材料だった（Ｃｈａｍｂｅｒｓ，前掲書；Ｍａｓｏｎ，Ｐ．Ｗ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ（１９８９）７０：２０３７−２０４８）。さらに精製フラビウイルスＥタンパク質に対して作製されたモノクローナル抗体は、インビトロで中和され、そのいくつかはインビボで受動感染防御を与えることが示された（Ｈｅｎｃｈａｌ，Ｅ．Ａ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．（１９８５） ３４：１６２−１６９；Ｈｅｉｎｚ，Ｆ．Ｘ．ら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８３） １３０：４８５−５０１；Ｋｉｍｕｒａ−Ｋｉｒｏｄａ，Ｊ．およびＹａｓｕｉ，Ｋ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８８） １４１：３６０６−３６１０；Ｔｒｉｒａｗａｔａｎａｐｏｎｇ，Ｔ．ら，Ｇｅｎｅ（１９９２） １１６：１３９−１５０）。
ワクチンでの使用のための組換えフラビウイルスタンパク質を生産するという目標に向けて、大腸菌、酵母およびバキュロウイルス等の種々の発現系が利用されてきた。これらの試みは、低収量、フラビウイルスタンパク質の不適当なプロセッシングおよび中程度ないし乏しい免疫原性によって苦しまされてきた（ＥｃｋｅｌｓおよびＰｕｔｎａｋ，２００３）。組換えタンパク質が強力な免疫原として役に立つためには、Ｅタンパク質の未変性様構造を維持する必要がある。未変性様構造を有する組換えＥタンパク質を産生する能力は、利用される発現系に高度に依存する。米国特許第６，１６５，４７７号は、酵母細胞におけるＤＥＮのＥタンパク質サブユニットの発現プロセスを開示する。酵母細胞で発現されたＥタンパク質は細菌系より改善された構造を示したが、しかしなおハイパーグリコシル化および収量の課題に直面した。

かなり最近の研究において、Ｅタンパク質の切断型を発現するために安定して形質転換された昆虫細胞の使用が、Ｘ線結晶解析法によって決定された通り、未変性様構造を維持する産物をもたらすと確立された（Ｍｏｄｉｓら，２００３；Ｍｏｄｉｓら，２００５；およびＺｈａｎｇら，２００４）。安定して形質転換された昆虫細胞系の使用が、ＤＥＮの血清型１−４、ＪＥ、ＴＢＥおよびＷＮ等の切断型組換えフラビウイルスＥタンパク質の発現の成功をもたらした。米国特許第６，１３６，５６１号は、安定して形質転換された昆虫細胞系におけるＤＥＮ、ＪＥ、ＴＢＥおよびＹＦのＥサブユニットタンパク質の発現プロセスを開示する。Ｉｖｙら（米国特許６，４３２，４１１号）は、ＩＳＣＯＭ型構造を有するサポニンと組み合されたとき、安定して形質転換された昆虫細胞において発現されたフラビウイルスＥサブユニットタンパク質（ＤＥＮ−２エンベロープポリペプチドのアミノ酸１−３９５と等価）の候補ワクチンとしての有用性を開示する。Ｉｖｙらは、ＤＥＮ１−４の８０％ＥおよびＩＳＣＯＭＡＴＩＲＸ（登録商標）アジュバントを含む組成物と同様に、全ての４のＤＥＮ型（ＤＥＮ１−４）由来の８０％Ｅタンパク質を含む４価サブユニットワクチンをさらに報告する。サルにおけるこの４価ワクチンの免疫原性および防御効率を解析する小規模な予備実験が実施された（Ｃｌｅｍｅｎｔｓら，Ｖａｃｃｉｎｅ ２８：２７０５−１５（２０１０）；Ｃｏｌｌｅｒら，Ｖａｃｃｉｎｅ ２９：７２６７−７５（２０１１））。該ワクチンは、２以上のデング型に対する中和抗体および防御免疫を誘導すると言われた。米国特許第６，７４９，８５７号は、本出願に記載のＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐ等の切断型デングエンベロープタンパク質の二量体形の発現を開示する。米国特許第６，４１６，７６３号は、組換えＥに基づくワクチン製剤において安定して形質転換された昆虫細胞系によって産生された非構造タンパク質１（ＮＳ１）を含むことの利益を記載する。これらの特許は、動物モデルにおいてＩＳＣＯＭ型構造を含むサポニンと組み合されるとき、安定して形質転換された昆虫細胞から発現されたフラビウイルスサブユニットの有用性を示している。しかしこれらの特許は、ヒト被験者における免疫原性を実証されたアジュバントと製剤化されたＥだけを基剤とするワクチン製剤を取り扱わず又は予想しない。多くのワクチン候補は動物モデルにおいて有望な効果が実証されたが、人間の使用への移行に成功せずに終わった。

一般的に、不活化ウイルス、組換えサブユニットタンパク質およびＤＮＡ等の非複製型ウイルスワクチン法の使用は、弱毒化生ウイルスワクチン法にまさるいくつかの優位性を有する。これらの長所は、生ウイルスが被験者に送達されないので、主として安全性に関連する。他の優位性は、弱毒化生ウイルスと比較して投与計画の時期を早める能力、ならびに投与量およびアジュバント量を調整することによって免疫応答を調節し平衡する能力を含む。

ヒト用のフラビウイルスワクチンの開発において、動物モデルにおける前臨床データに基づいてヒト被験者における候補ワクチンの安全性および免疫原性を予想することは困難だった。これは、ヒト臨床治験に進んだ弱毒化生ウイルスワクチン候補の多くにとって難題であることが判明した。最も酷い完全な失敗例は、非ヒト霊長目においては非常に魅力的な安全性プロファイルを示したが、香港のワクチン受容者においてデング熱を誘発した、クローン化デングウイルス３型単離株によって示された安全プロファイルだった（Ｓａｎｃｈｅｚら，ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００６） ２４：４９１４−２６）。この困難さは、ワクチン効力を達成するために、複製型ウイルスワクチンと同レベルのウイルス／宿主の相互作用を必要としない、非複製型ウイルスワクチンの使用によって低減されるかもしれない。しかし、前臨床モデルにおいて良好な安全性および防御効率を示しながら、ヒトにおける安全かつ効果的なワクチンとして機能しそこなった、おびただしい数の非複製型ウイルスワクチン候補が存在する（例えば、不活化ＲＳＶワクチン；Ｍｕｒｐｈｙら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８６） ２４：１９７−２０２）。このように、フラビウイルス用の安全かつ効果的なワクチンの開発に関連して複数の難題が存在し得て、開発はしばしば長年にわたる試行錯誤を要求する。さらに動物モデルに基づく前臨床試験は、ヒト被験者におけるワクチンの成績に関し予測的でないかもしれず、従ってヒトでの成績が候補ワクチンの能力の証明において決定的である。

おびただしい数の治験のデングウイルスワクチンが前臨床試験および開発の種々のステージにあるとはいえ、たった６のワクチン候補だけがヒト臨床治験に進んだ。臨床試験で試験された６のワクチンは：（１）弱毒化生デング血清型４キメラ（例えば、Ｄｕｒｂｉｎら，２００６，Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ２：１６７；Ｂｌａｎｅｙら，２００５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７９：５５１６）；（２）弱毒化生黄熱‐デングキメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｖａｘ；例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，２０１０，Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ． ２０１：３７０）；（３）ウォーターリード陸軍研究所によって典型的に弱毒化されたウイルスワクチン（例えば、Ｓｕｎら，２００９，Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ５：３３）；（４）弱毒化生デング血清型２キメラ（例えば、Ｈｕａｎｇら，２００３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７７：１１４３６）；（５）ｐｒＭ−Ｅ発現性ＤＮＡワクチン（Ｒａｖｉｐｒａｋａｓｈら，２００６，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３５３：１６６）；および（６）マヒドン大学によって開発された典型的に弱毒化されたウイルスワクチン（例えば、Ｂｈａｍａｒａｐｒａｖａｔｉら，１９８７）、である。しかし、候補ワクチン各々に関連して固有の難点および潜在的な弱点が存在する。

デングに対する弱毒化生ウイルス法に関するさらなる課題は、４価ワクチンにおける４の独立して複製するウイルスの組み合せに関連する難題を含む。干渉に関する課題は、今日まで試験された全ての４価製剤を苦しませ、平衡のとれない４価免疫および長い間隔（例えば、０、６、１２月）での３回投与の必要性をもたらした。これは決して理想的とはいえず、部分的に免疫化されたのちに野生型ウイルスに暴露される個体群、これらの個体群は重度の疾患（例えば、デング出血熱）の高いリスクにあり得るので、に対する安全性の課題を提示するだろう。
臨床治験で試験された最後のデングワクチンはＤＮＡワクチンである。裸ＤＮＡワクチンは、現在のところどのような感染症に対しても証明さておらず、長期にわたるＤＮＡに対する自己免疫反応の誘発による潜在的な免疫病理学的な課題は未解決である。潜在的な効力が欠如していることを示唆するが、ウイルス中和抗体は、試験したワクチン製剤によって全くまたは僅かしか誘発されなかった。

本明細書に記載の発明の１態様は、組換え発現系を使用して産生および分泌され、次にワクチン製剤（例えば、ＨＢＶ−００１ Ｄ１）においてアジュバントと組み合される、サブユニットデングウイルスエンベロープ糖タンパク質（例えば、ＤＥＮ１−８０Ｅ、ＤＥＮ２−８０Ｅ、ＤＥＮ３−８０Ｅ、ＤＥＮ４−８０ＥまたはＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐ）を提供する。開示されたワクチンは、ヒトボランティにおける相同デングウイルスに対するウイルス中和抗体応答の誘導化に有効であり、かつ健康なおよび危険にあるヒト被験者に対する許容可能な安全プロファイルを有する。

目的に向けて、本発明の１態様は、血清型ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３およびＤＥＮ−４の有効量の精製デングウイルスエンベロープ（「Ｅ」）タンパク質、薬学的に許容可能な賦形剤および有効量のアジュバントを含む免疫原性組成物を提供し；ここでＥタンパク質は、宿主細胞で組換え的に発現されたときに前記のＥタンパク質が増殖培地の中に分泌可能であるように、各々、そのＮ末端のアミノン酸残基１から出発して野生型Ｅの長さの約８０％を構成し；ここでＤＥＮ−４Ｅタンパク質は二量体であり（「ＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐ」）；ならびにこおで組成物はヒト被験者における中和抗体の産生を誘導する。本発明のこの態様の好ましい実施態様において、上記の組成物中のＥタンパク質は、昆虫宿主細胞の中で組換え的に産生され発現される。より好ましい実施態様においてＥタンパク質は、下記の通りＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ２（Ｓ２）の宿主細胞で組換え的に産生され発現される。

本発明の組換えサブユニットデングウイルスＥタンパク質は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ２（Ｓ２）細胞を使用する細胞培養発現系の方法によって産生される。この系は、未変性様構造を維持するデング組換えエンベロープを産生することが証明されている（Ｃｕｚｚｕｂｂｏら，Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００１） ８：１１５０−５５；Ｍｏｄｉｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２００３） １００：６９８６−９１；Ｍｏｄｉｓら，Ｎａｔｕｒｅ（２００４） ４２７：３１３−９；Ｚｈａｎｇら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（２００４） １２（９）：１６０７−１８）。この発現系は、また西ナイル、日本脳炎、Ｃ型肝炎およびダニ媒介脳炎ウイルス等の他のフラビウイルス由来の他の組換えエンベロープタンパク質を発現することも示された。組換えエンベロープタンパク質は、典型的には未変性エンベロープタンパク質の８０％を残してＣ末端で切断される（「８０Ｅ」）。従って８０Ｅは、そのＮ末端のアミノ酸１から出発して、Ｅタンパク質の連続したアミノ酸のおよそ最初の８０％と定義される。

本発明で使用される切断型８０Ｅタンパク質の範囲は、タンパク質の膜アンカー部分（Ｅカルボキシ末端のおよそ最後の１０％）を削除しているので、換言すれば、そのＮ末端のアミノ酸１から出発してＥの連続するアミノ酸の最初の９０％までであるので、それを細胞外の培地に分泌することを可能とし、回収を容易にする。切断は、Ｅタンパク質の８０Ｅタンパク質部分を膜アンカー部分と連結する「基部」部分をも削除している；基部部分は、注目すべき抗原エピトープを含まず、従って好ましい抗原であるＤＥＮ１−８０Ｅ、ＤＥＮ２−８０Ｅ、ＤＥＮ３−８０Ｅ、ＤＥＮ４−８０ＥまたはＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐ中には含まれない。Ｅタンパク質の少なくとも９０％から１００％未満は、クローン化し分泌することが可能であり、すなわちタンパク質は９０％＋の長さでカルボキシ末端を切断されることが可能であり、切断型Ｅタンパク質が分泌可能である限り膜貫通ドメインの部分を含むことが可能である。「分泌可能（Ｓｅｃｒｅｔａｂｌｅ）」とは分泌され得ることを意味し、典型的には発現系における形質転換細胞から分泌される。従って当業者であれば、タンパク質が分泌可能であるかぎり、本発明の組成物および方法に有用であるデングＥタンパク質が、明細書で例示した８０％から変動し得ることを理解するだろう。本発明の各々の態様の好ましい実施態様において、ＤＥＮのＥタンパク質は、Ｎ末端アミノ酸から出発してエンベロープタンパク質の長さの約８０％であり、かつアミノ酸残基番号３９５ないし４０１の範囲のアミノ酸、例えばデングウイルス２型のアミン酸１ないしアミノ酸３９５で終わる。本発明の各々の態様の他の実施態様において、デングＥタンパク質は、そのＮ末端のアミノ酸１で出発してＥの連続するアミノ酸の約７５％、約８５％、約９０％、約９５％または約９８％であり得る。本明細書の本発明の態様の代表的な実施態様において、ＤＥＮのＥタンパク質は、配列番号６に示さるＤＥＮ１−８０Ｅ、配列番号７に示されるＤＥＮ２−８０Ｅ、配列番号８に示されるＤＥＮ３−８０Ｅ、配列番号８に示されるＤＥＮ−８０Ｅおよび配列番号９に示されるＤＥＮ４−８０Ｅ等の様に、そのＮ末端のアミノン酸１で出発してＥタンパク質の連続するアミノ酸の約８０％である。

分泌されるＥタンパク質は、組換えタンパク質の免疫原性がより増強されるように、例えばＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐタンパク質中のように二量体化を促進するドメインをさらに含んでもよい。代表的なＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐタンパク質は、配列番号１０に示されるようなアミノ酸配列を含む。４のデングウイルス由来の組換えＥタンパク質の二量体と単量体形を組み合わせることによって、免疫応答は平衡のとれた４価の応答が誘導されるように調節し得る。組換えデングウイルス８０Ｅサブユニットタンパク質がヒト使用のために適切に調剤されると、それらはヒト被験者における強力なウイルス中和抗体を誘導し得る。従って、本発明は、重要な技術的課題に対する新規な解答、つまりヒト被験者における高レベルの安全性および平衡のとれた４価の免疫原性の両方を示すデングウイルスワクチンの産生を提供する。
アジュバント
本発明のワクチン製剤／免疫原性組成物は、ヒトの使用に適した少なくとも１のアジュバントを含む。好ましい実施態様において、デング８０Ｅ組換えサブユニットタンパク質は、サポニンに基づく（「ＩＳＣＯＭ型」）アジュバント（例えば、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバント）および／またはアルミニウムに基づくアジュバント（一括して「アラム」または「アラムに基づくアジュバント」）と製剤化される。

アルミニウムは、主としてＴ_Ｈ２応答を刺激することによって、同時投与された抗原に対する免疫応答を刺激することが長く示されてきており、アルミニウムに基づくアジュバントは米国において人間の使用のために登録された最初のアジュバントである。本明細書に記載のデング８０Ｅ抗原に加えて、本発明のこの態様の組成物は、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたはその混合物等のアルミニウムアジュバントに吸着される。本明細者で提供される組成物のアルミニウムアジュバントは、アルミニウムの沈降物形態でないことが好ましい。アルミニウム沈降ワクチンは標的抗原に対する応答を増加させるかもしれないが、しかし高度に不均一な製剤であることが示され、不整合な結果が得られた（Ｌｉｎｄｂｌａｄ Ｅ．Ｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８２：４９７−５０５（２００４）を参照されたい）。対照的にアルミニウム吸着形態ワクチンは、それはヒトへの投与用のワクチン製剤の本質的特質であるが、標準法で実施し得る。さらに、おそらく一部は注射部位からの緩徐な排除を可能とすることによって、または抗原提示細胞による抗原のより効率的な取り込を可能とすることによって、所期の抗原のアルミニウムアジュバント上への物理吸着がアジュバント機能において重要な役割を担っていると考えられている。

アラムに基づくアジュバントは、少なくとも一部はデポメカニズム（抗原を保持する機構）および未変性様構造を有する組換えデング８０Ｅ抗原との組合せにより機能すると信じられており、アラムのアジュバント機能は、免疫不全個体群の患者を含むワクチン接種を受けた個体群において、強力な免疫応答を誘導するために十分である。

本発明のアルミニウムアジュバントは、水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）_３）、リン酸アルミニウム（ＡｌＰＯ_４）、アルミニウムヒドロキシホスファート、アモルファス・アルミニウムヒドロキシホスファートスルファート（ＡＡＨＳ）またはいわゆる「アラム」（ＫＡｌ（ＳＯ_４）・１２Ｈ_２Ｏ）の形態であってよい（Ｋｌｅｉｎら，Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｌｕｍｉｎｕｍ ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｂｙ（２７）Ａｌ ＭＡＳ ＮＭＲ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ． ８９（３）：３１１−２１（２０００）を参照されたい）。本明細書で提供する本発明の代表的な実施態様において、アルミニウムアジュバントは水酸化アルミニウムである。
本発明のいくつかの実施態様において、アルミニウムアジュバントはＡＡＨＳの形態である（本明細書において互換的にＭｅｒｃｋアルミニウムアジュバント（ＭＡＡ）と称する）。ＭＡＡは中性ｐＨで電荷を保有せず、一方ＡｌＯＨは正の実効電荷を保有し、ＡＬＰＯ_４は典型的には中性ｐＨで負の実効電荷を保有する。潜在的に抗原結合能に影響するアルミニウムアジュバントの実効電荷のために、ＭＡＡはＡｌＯＨよりもいくつかの抗原に対する高い結合能を有する。本明細書に記載の本発明のさらに他の代表的な実施態様において、アルミニウムアジュバントはアルハイドロゲルである。

当業者であれば、安全でかつワクチン組成物の標的デング８０Ｅ抗原に対する免疫応答を増強するうえで有効であるアルミニウムアジュバントの最適用量を決定し得るだろう。ＦＤＡ認可ワクチンに含まれるアルミニウム含量と同様に、アルミニウムの安全性プロファイルに関する議論に関してはＢａｙｌｏｒら，Ｖａｃｃｉｎｅ ２０：Ｓ１８−Ｓ２３（２００）を参照されたい。一般的にアルミニウムアジュバントの有効かつ安全な用量は、２００ないし１２００μｇ／ｍＬの濃度で変動する。本発明の特定の実施態様においてワクチンは、１．０と３．５ｍｇ／ｍＬの間のアルミニウムアジュバントを含む（アルミニウム元素として１．２５ｍｇまで）。本発明の製剤および組成物の他の実施態様において、ワクチンの１用量当たり約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００μｇのアルミニウムアジュバントが存在する。

アルミニウムに基づくアジュバントを有する製剤は、それによってデング８０Ｅ抗原がアルミニウムアジュバントに結合することを可能とする混合剤を含み、例えばアルハイドロゲルは、その結果、抗原の≧７５％が水酸化アルミニウムに結合する。臨床開発を支援するためのｃＧＭＰ下でのＤＥＮ１−８０Ｅ＋アルハイドロゲルワクチン（ＨＢＶ−００１ Ｄ１）の製剤化および充填は、実施例３に記載する。

上記の通り、本発明の１態様は、アジュバントと組み合わせたデング８０Ｅ抗原を含むワクチンおよび組成物を提供する。好ましいアジュバントはＩＳＣＯＭアジュバントである。本明細書で提供される製剤および方法において、ＩＳＣＯＭアジュバントは、サポニン、コレステロールおよびリン脂質を含み、免疫刺激複合体すなわちＩＳＣＯＭを形成する。一般的にはキラヤ・サポナリア樹木の樹皮から単離されるサポニンの強力な活性は、８０年以上前に初めて実証された。（総説としては、ＢａｒｒおよびＭｉｔｃｈｅｌｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７４：８−２５（１９９６）；ならびにＳｋｅｎｅおよびＳｕｔｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ４０：５３−５９（２００６）を参照されたい）。アルミニウムアジュバントと比較してＩＳＣＯＭ型アジュバントまたはＩＳＣＯＭは、Ｔ細胞および抗体応答の両方を含む同時投与された抗原に対するより広範な免疫応答を誘発しうる。しかし毒性および溶血活性に関する潜在能力が見出され、当時のヒトまたは動物への使用に対するサポニンの将来性を制限した。

その後、サポニンは、コレステロールおよびリン脂質と組み合わせると、２０以上のサブユニットから構成されるケージ型構造を有する特徴的な粒子を形成することが発見された。このユニークな構造は、ＩＳＣＯＭのアジュバント活性に寄与する。加えて、サポニンをコレステロールおよびリン脂質と共にＩＳＣＯＭ内へ取り込むと、サポニンの溶血活性が排除されることが示された。また、ＩＳＣＯＭがアジュバントとして使用されるとき、免疫応答を誘導するために遊離サポニンと比較して、より少量のアジュバントしか必要としないことも示された（ＳｋｅｎｅおよびＳｕｔｔｏｎ，前掲書を参照されたい）。これらの理由により、ＩＳＣＯＭは可能性のあるワクチンアジュバントとして精力的に研究されてきた。

上記の目的を達成するために、本発明は、デング８０Ｅ抗原、ＩＳＣＯＭアジュバントおよび薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物に関し、ここで前記ＩＳＣＯＭアジュバントはサポニン、コレステロールおよびリン脂質を含み、ここで前記デング８０Ｅ抗原は、前記Ｅタンパク質が宿主細胞中で組換え的に発現されたときに増殖培地の中へ分泌され得るように、そのＮ末端のアミノ酸残基１から出発して野生型Ｅの長さの約８０％を構成する。上記の組成物はアルミニウム塩のアジュバントをさらに含んでもよい。

本発明のこの態様の好ましい実施態様において、組成物に含まれるＤＥＮ１、ＤＥＮ２およびＤＥＮ３の８０Ｅ抗原は単量体であり、かつＤＥＮ４の８０Ｅ抗原は二量体である。単量体形のＤＥＮ１、ＤＥＮ２およびＤＥＮ３の８０Ｅタンパク質サブユニットおよび二量体形のＤＥＮ４（ＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐ）を含む４価組成物は、アカゲザルにおいて平衡のとれた４価の免疫応答を誘導し得ること、ならびにウイルス攻撃に対する防御を提供し得ることが本明細書で示された（実施例６を参照されたい）。上記の組成物はアルミニウム塩アジュバントをさらに含んでもよい。

本発明のこの態様の他の実施態様において、組成物中のＤＥＮ１−８０Ｅ、ＤＥＮ２−８０Ｅ、ＤＥＮ３−ＥおよびＤＥＮ４−８０Ｅタンパク質は単量体である。このような実施態様において、ＤＥＮ４成分は、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２およびＤＥＮ３タンパク質の個々の量の約１．５ないし約３倍の量で、好ましくはＤＥＮ１、ＤＥＮ２およびＤＥＮ３成分（タンパク質）の量の約２倍で存在する。

本発明のこの態様の代表的な実施態様において、ＩＳＣＯＭアジュバントは、サポニンに基づくアジュバント、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバントである。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバントを有する製剤は、８０Ｅ抗原がアジュバントと共に送達される混合剤を含む。

本発明の他の実施態様においてワクチン成分は、アルミニウムに基づくアジュバントおよびＩＳＣＯＭまたはサポニンに基づくアジュバントの両方と共に製剤化される。
デングウイルスエンベロープンパク質サブユニット
単量体形のＤＥＮ１−８０Ｅ、ＤＥＮ２−８０ＥおよびＤＥＮ３−８０Ｅタンパク質サブユニットおよび二量体形のＤＥＮ４（ＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐ）を含む４価組成物は、アカゲザルにおいて平衡のとれた４価の免疫応答を誘導し得ること、およびウイルス攻撃感染に対する防御を提供し得ることが本明細書で示された（実施例６を参照されたい）。従って本発明のこの態様のいくつかの好ましい実施態様において、組成物に含まれるＤＥＮ１、ＤＥＮ２およびＤＥＮ３の８０Ｅ抗原は単量体であり、かつＤＥＮ４の８０Ｅ抗原は二量体である。デング８０Ｅタンパク質の二量体の形成は以下に記載する。

また全ての４のデング型に対する高度に平衡のとれた免疫応答は、組成物中に存在するＤＥＮ４抗原成分（ＤＥＮ４−８０ＥかまたはＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐ）の量がＤＥＮ１−８０Ｅ、ＤＥＮ２−８０ＥまたはＤＥＮ３−８０Ｅ抗原の量の約２倍であるように、ＤＥＮ４−８０Ｅ成分の抗原含量を調節することによって達成し得ることも本明細書で示された（実施例７を参照されたい）。従って本発明は、血清型ＤＥＮ１−８０Ｅ、ＤＥＮ２−８０Ｅ、ＤＥＮ３−８０ＥおよびＤＥＮ４−８０Ｅの有効量の精製デングウイルスエンベロープ（「Ｅ」）タンパク質、薬学的に許容可能な賦形剤および有効量のアジュバントを含む免疫原性組成物を提供し；ここでＥタンパク質は、前記のＥタンパク質が宿主細胞で組換え的に発現されたときに増殖培地の中に分泌可能であるように、各々、そのＮ末端のアミノン酸残基１から出発して野生型Ｅの長さの約８０％を構成し；およびここで組成物はヒト被験者における中和抗体の産生を誘導し；ここでＤＥＮ４成分の抗原含量はＤＥＮ１、ＤＥＮ２またはＤＥＮ３成分の個々の抗原含量の約１．５ないし約３倍である。本発明のこの態様の好ましい実施態様において、組成物中のＤＥＮ１：ＤＥＮ２：ＤＥＮ３：ＤＥＮ４抗原の比率は約１：１：１：２である。

本発明のこの態様のいくつかの実施態様において、ＤＥＮ４成分はＤＥＮ４−８０Ｅである。従って組成物は、ＤＥＮ１−８０Ｅ、ＤＥＮ２−８０Ｅ、ＤＥＮ３−８０ＥおよびＤＥＮ４−８０Ｅの単量体を含む。本発明のこの態様の他の実施態様において、ＤＥＮ４成分はＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐである。このような他の実施態様において、組成物は、ＤＥＮ１−８０Ｅ、ＤＥＮ２−８０ＥおよびＤＥＮ３−８０Ｅおよび二量体のＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐを含む。

本発明の好ましい実施態様において、本明細書に記載のデングウイルスワクチン製剤（ＤＥＮ１−８０Ｅ、ＤＥＮ２−８０Ｅ、ＤＥＮ３−８０Ｅ、ＤＥＮ４−８０および／またはＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐ）の組換えタンパク質成分は、真核細胞の細胞培養発現系、特にＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ Ｓ２細胞系によって産生される（Ｊｏｈａｎｓｅｎ．Ｈ．ら，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．（１９８９） ３：８８２−８８９；Ｉｖｅｙ−Ｈｏｙｌｅ，Ｍ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１） ２：７０４−７０７；Ｃｕｌｐ，Ｊ．Ｓ．ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）（１９９１） ９：１７３−１７７）。この発現法は、デング血清型１−４、ＪＥ、ＴＢＥおよびＷＮ等のフラビウイルス由来の切断型組換えエンベロープタンパク質を成功裡に産生する。これらのタンパク質は、未変性エンベロープタンパク質の約８０％を残してＣ末端で切断される（８０Ｅ）。切断はタンパク質の膜アンカーを削除し、従ってタンパク質が細胞外の培地中に分泌されることを可能とし、回収を容易にし；また切断は、免疫原性の効果をほとんど有さない基部部分も削除する。さらに発現したタンパク質は、適切にグリコシル化され、ならびに立体構造的に感受性のモノクローナル抗体４Ｇ２との反応性によって決定された通り、未変性の立体構造を維持することが示された。

既述の通り（Ｉｖｙら，米国特許第６，１３６，５６１号；Ｉｖｙら，米国特許第６，１６５，４７７号；ＭｃＤｏｎｅｌｌら，米国特許第６，４１６，７６３号；Ｉｖｙら，米国特許第６，４３２，４１１号；およびＰｅｔｅｒｓら，米国特許第６，７４９，８５７号）および本明細書で用いられる通り、ＤＥＮ１−８０Ｅ、ＤＥＮ２−８０Ｅ、ＤＥＮ３−８０Ｅ、ＤＥＮ４−８０ＥおよびＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐは、デングエンベロープタンパク質にまたがるタンパク質、好ましくは、エンベロープタンパク質のＮ末端アミノン酸から出発してかつアミノ酸残基番号３９５ないし４０１の範囲のアミノ酸で終わる、例えば８０Ｅがデングウイルス２型のアミノ酸１ないし３９５を含むタンパク質であり得るようなタンパク質、を称する。Ｐｅｔｅｒｓら，米国特許第６，７４９，８５７に記載の通り、組換え８０Ｅタンパク質は、フロッピーリンカーによって８０Ｅタンパク質に結合された二量体化ドメインを含んでもよい（例、ＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐ）。二量体形のタンパク質の包含は、選択された成分に対する免疫応答を調節するために使用され、平衡のとれた４価応答の誘導をもたらす。ＤＥＮ−８０Ｅタンパク質の発現は実施例１に記載する。本発明の好ましい実施態様において、ＤＥＮ４タンパク質成分が二量体である４価の成分が提供される（例、ＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐ）。

二量体の８０Ｅタンパク質サブユニット、例えばＤＥＮ４の８０Ｅ二量体は当該技術分野で周知の方法によって産生し得る（例えば、Ｐｅｔｅｒｓら，米国特許第６，７４９，８５７ Ｂ１を参照されたい）。簡潔に説明すると、基本的な３方法が、二量体の８０％Ｅ分子を構築するためにＰｅｔｅｒｓらによって前掲書に記載されている。第一の方法は、可動性リンカーによって共有結合的に相互に付着した８０％Ｅのタンデムコピーを使用することを含む。ＤＥＮ２の８０％Ｅの２のコピーを共有結合的に連結するアミノ酸のストレッチは、２の８０％Ｅ分子が未変性のヘッドトゥテールの二量体の配向で関連することを可能とし、一方では相互の共有結合を維持する、可動性テザーとして役立つように設計されている。当業者にとって、同様に他のリンカー配列を選択することは容易に明らかである。本発明は、開示された特定のリンカーに限定されるものではないが、しかし２の８０％Ｅ分子が未変性のヘッドトゥテールの二量体の配向で関連することを可能とし、一方では相互の共有結合を維持する任意のアミノ酸配列に限定される。

第二の方法は、２の８０％Ｅ−ロイシンジッパー分子間の二量体化を増強するための、単量体８０％Ｅ分子へのカルボキシ末端ロイシンジッパードメインの付加を含む。この方法の２のバージョンを採用し得る。一方のバージョンは、ロイシンジッパードメインを連結して結果として共有結合した二量体産物を生じるジスルフィド結合を含み、一方、他方はロイシンジッパードメインの非共有結合的会合に基づいている。ロイシンジッパードメインは、もう一つの８０％Ｅのジッパー分子由来の同一の配列と二量体化するように設計されている。非共有結合的に連結したロイシンジッパーの形成は、８０％Ｅ分子の二量体化を増強し得るし、それは８０％Ｅ分子をロイシンジッパードメインに結合する可動性リンカーにより未変性のヘッドトゥーテールの立体構造に関連し得る。ロイシンジッパードメインは、もう一つの８０％Ｅのジッパー分子由来の同一の配列と二量体化するように設計されている。いったんロイシンジッパーが二量体化すると、両者の末端間でジスルフィド結合が形成され結果として共有結合した二量体産物が生じる。共有結合的に連結したロイシンジッパーの形成は、８０％Ｅ分子の二量体化を増強し得るし、それは８０％Ｅ分子をロイシンジッパードメインに結合する可動性リンカーにより未変性のヘッドトゥーテールの立体構造に関連し得る。

８０％Ｅの二量体化を増強するために使用される最後の方法は、８０％Ｅのカルボキシ末端へのへリックス・ターン・へリックスドメインの付加である。一方の修飾された８０％Ｅ分子由来のへリックス・ターン・へリックスドメインは、二量体の４へリックスバンドルドメインを形成するために、他方の当該物と会合するであろう。非共有結合的に会合した４へリックスバンドルドメインの形成は、８０％Ｅ分子の二量体化を増強するであろうし、８０％Ｅをヘリックスバンドルに結合する可動性リンカーにより未変性のヘッドトゥーテールの立体構造に関連し得る。
本発明の他の実施態様において、ＤＥＮ−８０Ｅは、Ｃｙｓ１−Ｃｙｓ２、Ｃｙｓ３−Ｃｙｓ８、Ｃｙｓ４−Ｃｙｓ６、Ｃｙｓ５−Ｃｙｓ７、Ｃｙｓ９−Ｃｙｓ１０およびＣｙｓ１１−Ｃｙｓ１２の６のジスルフィド架橋を含むデングウイルスエンベロープタンパク質サブユニットとしてより広く定義され；ここで該タンパク質は、Ｄｒｏｓｏｈｉｌａ細胞から組換えタンパク質として分泌され；ならびにここで該タンパク質は、ヒト被験者に投与されたときに相同性のフラビウイルスに対する中和抗体応答を発生させる。

より好ましい実施態様において、組換えデングウイルスエンベロープタンパク質サブユニットは、既述のジスルフィド型、および未変性のデングウイルスエンベロープタンパク質のＮ末端の最初のアミノ酸から出発してエンベロープタンパク質の相同な８０％の部分（８０Ｅ）の親水性プロファイル特性をさらに含む。換言すればアミノン酸は、組換えサブユニットタンパク質が未変性様構造および適当な免疫原性（ウイルス中和抗体誘発能）を保持するのを保証するためにジスルフィドおよび親水性プロファイルが維持される限り、デングウイルス８０Ｅを含む配列の中で置換され得る。

好ましくは、デングウイルス８０Ｅサブユニットは、マスターセルバンクを使用して無血清培地中で発現され、既述の通りクロマトグラフィーによって精製される（Ｉｖｙら，米国特許第６，４３２，４１１号）。臨床試験を支援するためのｃＧＭＰ下でのＤＥＮ１−８０Ｅのバッチ製造は、実施例２に記載する。

動物で試験したデングウイルス製剤中の非構造タンパク質１（ＮＳ１）等の非構造タンパク質の包含に関し記載された追加された利点（ＭｃＤｏｎｅｌｌら，米国特許６，４１６，７６３号）と対照的に、本発明のＤＥＮ−８０Ｅタンパク質は、ＮＳ１を包含しなくてもヒト被験者における強力で、免疫原性のワクチンとして役に立つ。

投与および使用
本発明は、デングウイルス感染が誘発する疾患を防御または軽減するための方法を提供する。本明細書で使用するときワクチンとは、仮に個体へのワクチンの投与が、疾患に対する完全もしくは部分的な個体の免疫かまたは疾患に関連する兆候もしくは症状の完全もしくは部分的な軽減（例、抑制）かを結果として生じるならば、疾患を防御または軽減することを言う。

従って本発明は、ヒト患者における防御免疫応答を増強するための方法であって、本明細書のいずれかに記載の治療的有効量の免疫原性組成物を患者に投与することを含む方法に関する。

本発明の治療用組成物は、非経口的に皮下、筋肉内または皮内注射によって投与され得るが、しかし他の全身モードの投与が採用されてもよい。本発明の好ましい投与法は、筋肉内経路である。従って、本発明の方法のいくつかの実施態様において組成物は、筋肉内経路で患者に投与される。他の実施態様において、皮内または皮下送達が考慮される。

また本明細書では、本発明の有効量の組成物を患者に投与することを含む、デングウイルス誘発性疾患に対するヒトにおける免疫防御を供給する方法も提供し、それによってデング疾患からの防御を提供する。本発明のこの態様において、好ましい投与経路は、筋肉内、皮下および皮内から成る群から選択される。

また本発明は、ヒト患者における防御免疫応答を増強するための方法にも関連し、該方法は、精製デングウイルスエンベロープ（「Ｅ」）タンパク質および薬学的に許容可能な賦形剤、ここでＥタンパク質は、前記のＥタンパク質が宿主細胞で組換え的に発現されたときに増殖培地の中に分泌可能であるように、そのＮ末端のアミノン酸残基１から出発して野生型Ｅの長さの約８０％を構成し；および有効量のアジュバントを含む治療的有効量の免疫原性組成物を投与することを含み、ここでワクチンはヒト被験者における中和抗体の産生を誘導する。

本発明の他の態様は、血清型ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３およびＤＥＮ−４の有効量の精製デングウイルスエンベロープ（「Ｅ」）タンパク質、薬学的に許容可能な賦形剤および有効量のアジュバントを含む、デング熱および／またはデング感染の防御または治療用の免疫原性組成物を提供し；ここでＥタンパク質は、前記のＥタンパク質が宿主細胞で組換え的に発現されたときに増殖培地の中に分泌可能であるように、各々、そのＮ末端のアミノン酸残基１から出発して野生型Ｅの長さの約８０％を構成し；ならびにここでＤＥＮ−４Ｅタンパク質は二量体であってもよい。本発明のいくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、免疫不全個体群に投与されることが予定される。さらなる態様において、該組成物は小児科の個体群に投与されることが予定される。

本発明のこの態様のいくつかの実施態様において、組成物のＤＥＮ４成分はＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐである。他の実施態様において、ＤＥＮ４成分は、ＤＥＮ４−８０ＥまたはＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐであり、ならびにＤＥＮ４タンパク質の量は、ＤＥＮ１−８０Ｅ、ＤＥＮ２−８０ＥまたはＤＥＮ３−８０Ｅ成分の量の約１．５ないし３倍である。

また本発明の他の態様は、デング感染またはそれが誘発する疾患の治療または防御用薬品の製造のための、上記または明細書に記載の組成物の使用をも記載する。

本明細書に記載の組成物の活性医療成分（デング８０Ｅおよび／または８０Ｅｚｉｐ）は、「治療的有効量」で、換言すれば「発明の概要」に記載の通り生理的に意味のある量で、患者に送達される。仮に患者への組成物の投与が受容者である患者の生理機能において検出可能な変化を生じるならば、本発明の組成物の活性成分は生理学的に意味ある量で存在する。本発明において、受容者である患者における検出可能な変化は、相同性のデングウイルスに対する中和抗体の誘導である。

本発明の活性なワクチンは、単独でまたは利用可能な範囲において他の活性なサブユニットを含むような他の活性なワクチンと併用して使用し得る。１種または数種のウイルスまたは血清型由来の一致するまたは異なるサブユニットが特定の製剤に含まれてよい。本発明の活性なワクチンは、薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含んでもよい。

複数回投与計画が利用されるきは、ワクチン接種の時機に関して多くの異なる技術が存在する。免疫化された被験者によって発現される免疫グロブリンのレパートリーの発現のレベルおよび多様性を増強するためには、本発明の組成物を複数回使用することが好ましい。仮に複数回の接種がされるのであれば、典型的には１ないし２月の間隔で接種し得る。本発明の好ましい接種計画は、被験者を０、１および２月で接種することである。また他の接種計画も利用し得る。例えば、０、１および３月、または０、１および６月等の他の接種計画が利用し得るであろう。

デングウイルス誘発疾患に対し被験者を免疫化するために、例えば、サブユニットを含むワクチンは、ワクチンの複数回投与を通常含む伝統的なワクチン接種プロトコルで被験者に投与される。投与は典型的には注射、典型的には筋肉内注射または皮下注射によるが、しかしまた他の全身モードの投与法が採用されてもよい。

免疫原性組成物
上記の通り本発明の１態様は、血清型ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３およびＤＥＮ−４の有効量の精製デングウイルスエンベロープ（「Ｅ」）タンパク質、薬学的に許容可能な賦形剤および有効量のアジュバントを含む免疫原性組成物であり；ここでＥタンパク質は、各々、そのＮ末端のアミノン酸残基１から出発して野生型Ｅの長さの約８０％を構成し；ここでＤＥＮ４−Ｅタンパク質は二量体であり；ならびにここで組成物はヒト被験者における中和抗体の産生を誘導する。

本発明のこの態様の実施態様において、各々の血清型に対するデングＥタンパク質の量は、約１μｇないし約１５０μｇ、約１μｇないし約１０μｇ、約１μｇ ないし約５μｇ、約２μｇないし約４μｇ、約３μｇないし約６μｇ、約５μｇないし約２５μｇ、約１０μｇないし約２０μｇ、約５μｇないし約１０μｇ、 約２０μｇないし約２５μｇ、約４０μｇないし約６０μｇ、約７５μｇないし約１２５μｇ、または約９０μｇないし約１１０μｇである。他の実施態様において、各々のデングタンパク質量は、約１μｇ、約２μｇ、約３μｇ、約４μｇ、約５μｇ、約６μｇ、約７μｇ、約８μｇ、約９μｇ、約１０μｇ、約１５μｇ、約２０μｇ、約２５μｇ、約３０μｇ、約３５μｇ、約４０μｇ、約４５μｇ、約５０μｇ、約５５μｇ、約６０μｇ、約６５μｇ、約７０μｇ、約７５μｇ、約８０μｇ 約８５μｇ、約９０μｇ、約９５μｇ、約１００μｇ、約１１０μｇ、約１２０μｇ、約１３０μｇ、約１４０μｇまたは約１５０μｇである。本発明の好ましい実施態様において、各々のデングＥタンパク質の量は、約３μｇ、約６μｇ、約１０μｇ、約２０μｇ、約５０μｇ、約１００μｇ、３μｇ、６μｇ、１０μｇ、２０ｇ、５０μｇまたは１００μｇである。

また血清型ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３およびＤＥＮ−４の有効量の精製デングウイルスエンベロープ（「Ｅ」）タンパク質、薬学的に許容可能な賦形剤、および有効量のアジュバントを含む免疫原性組成物も提供され；ここでＥタンパク質は、各々、そのＮ末端のアミノン酸残基１から出発して野生型Ｅの長さの約８０％を構成し；ここでＤＥＮ４のタンパク質の量はＤＥＮ１、ＤＥＮ２およびＤＥＮ３のタンパク質の個々の量の約１．５ないし約３倍であり、ならびにここで該組成物はヒト被験者における中和抗体の産生を誘導する。本発明のこの態様において、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３およびＤＥＮ４Ｅタンパク質は単量体（例、ＤＥＮ−８０Ｅ）であるか、またはＤＥＮ１、ＤＥＮ２およびＤＥＮ３Ｅタンパク質は単量体でありかつＤＥＮ４タンパク質は二量体である。

本発明のこの態様において、ＤＥＮ４Ｅタンパク質が単量体か二量体かに関わらず、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２およびＤＥＮ３Ｅタンパク質の個々の量の約１．５ないし３倍の量で存在するという条件付きで、組成物中のデングＥタンパク質は上記の量で存在する。従って、単なる例であるが、仮にＤＥＮ１、ＤＥＮ２およびＤＥＮ３Ｅタンパク質が組成物中に約３μｇの量で存在するとすれば、ＤＥＮ４Ｅタンパク質は組成物中に約４．５μｇないし約９μｇ、好ましくは約６μｇ存在する。さらなる例として、仮にＤＥＮ１、ＤＥＮ２およびＤＥＮ３Ｅタンパク質が組成物中に約１０μｇの量で存在するとすれば、ＤＥＮ４Ｅタンパク質は組成物中に約１５μｇないし約３０μｇ、好ましくは約２０μｇ存在する。さらに他の例において、仮にＤＥＮ１、ＤＥＮ２およびＤＥＮ３Ｅタンパク質が組成物中に約５０μｇの量で存在するとすれば、ＤＥＮ４Ｅタンパク質は組成物中に約７５μｇないし約１５０μｇ、好ましくは約１００μｇ存在する。当業者であれば、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２およびＤＥＮ３Ｅタンパク質の量がほぼ等しいとしても、量は変動し得て正確に１：１：１の比率で存在しなければならないのではないことを理解するであろう。当業者であれば、安全でかつＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３およびＤＥＮ４に対する平衡のとれた４価の免疫応答を誘導する各々のＤＥＮのＥタンパク質の最適用量を決めることができるであろう。

本発明の好ましい実施態様において、免疫原性組成物は、約３μｇのＤＥＮ１、ＤＥＮ２およびＤＥＮ３Ｅタンパク質および約６μｇのＤＥＮ４Ｅタンパク質（ＤＥＮ４−８０ＥまたはＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐ）を含む。より好ましい実施態様において、免疫原性組成物は、約１０μｇのＤＥＮ１、ＤＥＮ２およびＤＥＮ３Ｅタンパク質および約２０μｇのＤＥＮ４Ｅタンパク質（ＤＥＮ４−８０ＥまたはＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐ）を含む。より好ましい実施態様において、免疫原性組成物は、約５０μｇのＤＥＮ１、ＤＥＮ２およびＤＥＮ３Ｅタンパク質および約１００μｇのＤＥＮ４Ｅタンパク質（ＤＥＮ４−８０ＥまたはＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐ）を含む。

本発明の組成物において有用な薬学的に許容可能な担体は、採用される投与量および濃度で患者に対し無毒性である任意の共存性の試剤、例えば水、生理的食塩水、ブドウ糖、グリセリン、エタノール、緩衝剤およびそれに類するもの、およびその組み合せを含む。また担体は、安定剤、可溶化剤、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ_２またはＣａＣｌ_２等の浸透圧調節剤、界面活性剤およびその混合物、等の追加の成分をさらに含んでもよい。

本記載の発明によれば、治療組成物の「有効量」とは、所期の生物学的効果を達成するために十分な量である。一般的に、有効量の組成物を提供するために必要とされる投与量は、被験者の年齢、容態、性別、病気の程度等の要因、もしあれば、および他の可変要素、それは当業者によって調節され得るが、に依存して変動し得る。本発明の抗原調製剤は、有効量の単回投与かまたは複数回投与かによって投与され得る。本発明の組成物の有効量は、製品の１用量当たり０．０１ないし５００μｇ、より好ましくは製品の１用量当たり１ないし１００μｇ、最も好ましくは製品の１用量当たり５ないし５０μｇで変動し得る。本発明の組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含んでもよい。

本発明に従って、ヒト被験者への投与を支援するための、ＤＥＮ１−８０Ｅ、ＤＥＮ２−８０Ｅ、ＤＥＮ３−８０ＥおよびＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐ活性成分およびＨＢＶ−００１ Ｄ１および４価デングワクチンの、ｃＧＭＰ下の大規模での生産を示す（実施例１ないし４）。非ヒト霊長目および健康な成人ボランティアにおける、本発明のワクチンの安全性および免疫原性（効力）の定量について記載する（実施例５ないし８）。本発明のデングワクチンの実施態様は二つの重要な態様を組み合わせる。第一の態様において、アジュバントと組み合された組換えサブユニットタンパク質の固有安全性は、健康な個体群および易感染性の個体群におる疾患の防御に対する最適の方法を提供する。第二の態様において、立体構造的に適切な組換えＤＥＮ１−８０Ｅ、ＤＥＮ２−８０Ｅ、ＤＥＮ３−８０Ｅ、ＤＥＮ４−８０ＥおよびＤＥＮ４−８０ＥＸｉｐ抗原の、実際の使用に十分な量の現行の適正製造基準（ｃＧＭＰ）下での生産は、非ヒト霊長目およびヒト被験者における平衡のとれた４価ウイルス中和抗体を誘導し、疾患に対する防御機構を提供する、ワクチンを結果としてもたらす。単量体および二量体８０Ｅタンパク質および種々の比率のユニークな組み合せが、ＤＨＦ等の重症疾患のリスクを最小化するために重要である４価の平衡を保証するために利用される。これらの新規な態様の組み合せが、ヒト被験者における安全でかつ効果的なデングウイルスワクチンの新規発明をもたらす。これらのワクチン製剤は、非構造タンパク質ＮＳ１の包含は、効果的な免疫原性および防御にとって要求されないという予期しない発見によってさらに特徴づけられる。さらに、開示されたデングワクチンは、幼児、高齢者および易感染性の個体群を含む特に重篤な疾患の高度のリスクにある個体群に対する許容可能な安全性プロファイルを維持する一方で、ワクチン接種された個体群における適切な防御免疫応答を誘導するという技術課題に取り組む。

本明細書に記載の全ての刊行物は、本発明と関連して使用し得る方法論および材料を記載しおよび開示する目的で参照により援用される。明細書のいかなるものも、本発明が先行発明の当該開示より前である権利を有さないと認めるものと解釈されるものではない。

添付図面を参照して本発明の好ましい実施態様を記載するが、本発明は当該実施態様そのものに限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲において定められる本発明の範囲または精神から逸脱することなく、当業者によって種々の変更および修飾が本発明にもたらされ得ると理解されるべきである。
以下の実施例は本発明を例示するものであり限定するものではない。

Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２系におけるデング８０Ｅタンパク質の発現および精製
発現プラスミドｐＭｔｔｂｎｓ（ｐＭｔｔＰＡ由来）は、以下のエレメント：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒメタロチオネインプロモーター、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子分泌リーダー（ｔＰＡＬ）およびＳＶ４０初期ポリアデニル化信号、を含む。１４塩基対のＢａｍＨＩ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｆａｃｉｅｎｃｅ由来の制限酵素）断片が、現存するＢｇｌＩＩ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｌｏｂｉｇｉｉ由来の制限酵素）のユニークサイトに加えてＸｈｏＩ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｈｏｌｉｃｉｃｏｌａ由来の制限酵素）のユニークサイトを含むｐＭｔｔΔＸｈｏを産生するためにｐＭｔｔｂｎｓベクターから切除された。この発現ベクターは、発現タンパク質の細胞培養液への分泌を促進する。デング配列は、これらのＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩのユニークサイトを使用してｐＭｔｔΔＸｈｏベクターに導入された。本明細書に記載の研究に使用されたデング配列は、以下の配列番号１ないし５：（１）配列番号１；ＤＥＮ１ｐｒＭ−８０Ｅ；（２）配列番号２；ＤＥＮ２ｐｒＭ−８０Ｅ；（３）配列番号３；ＤＥＮ３ｐｒＭ−８０Ｅ；（４）配列番号４；ＤＥＮ４ｐｒＭ−８０Ｅ；および（５）配列番号５；ＤＥＮ４ｐｒＭ−８０ＥＺｐ、によって表される。カルボキシ切断デングエンベロープタンパク質の発現のために、適切な遺伝子断片がウイルスのＲＮＡまたはｃＤＮＡクローンから増幅された。合成ｐｒＭ８０Ｅ（プレ膜タンパク質‐８０％糖タンパク質Ｅ）遺伝子断片は、デングコドンの直後に２の停止コドンを含んでいた。

Ｓ２細胞は、発現プラスミドおよび（ｉ）リン酸カルシウム共沈法または（ｉｉ）生産者の推奨に従ってＣｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｋｉｔｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用してハイグロマイシン耐性をコードするｐＣｏＨｙｇｒｏ選択プラスミドの両者により同時形質転換した。細胞は、発現プラスミド対選択プラスミドの比率が２０：１の全ＤＮＡ２０μｇにより同時形質転換した。形質転換体は、３００μｇ/ｍｌのハイグロマイシンＢ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）により選択した。選択後、細胞は無血清培地Ｅｘｃｅｌ ４２０（ＪＲＨ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ）での増殖に順応させた。発現研究のために細胞は、ハイグロマイシン３００μｇ／ｍｌを含むＥｘｃｅｌ ４２０で増殖し、２００μＭのＣｕＳＯ_４で誘導した。細胞は２Ｘ１０^６細胞数／ｍｌの密度で播種し、６ないし７日間増殖させた。最適条件下で、６ないし７日間の増殖後に１．５ないし２Ｘ１０^７細胞数／ｍｌの細胞密度が達成された。培養上清は、発現されたタンパク質に関しＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによって調べた。

ウェスタンブロット上でのＤＥＮ−８０Ｅの検出のために、抗ウサギＩｇＧアルカリホスファターゼ二次抗体複合体を伴う、精製不活化デングウイルスに対し開発したウサギポリクローナル抗デングウイルス抗体を使用した。ブロットは、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）固相アルカリ性ホスファターゼ基質により発色させた。

ＤＥＮ１−８０Ｅ、ＤＥＮ２−８０Ｅ、ＤＥＮ３−８０Ｅ、ＤＥＮ４−８０ＥまたはＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐタンパク質の精製は、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）４Ｇ２を使用する免疫アフィニティークロマトグラフィー（ＩＡＣ）によって行った。簡潔に説明すると、手順は発現後培養液の清澄化を含む。次に未精製の物質は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド反応により共有結合した固定化ＭＡｂを含むＩＡＣカラムに負荷する。試料を負荷した後にマトリクスは、Ｔｗｅｅｎ−２０を０．０５％（ｖ／ｖ）含むｐＨ７．２の１０ｍＭリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ＰＢＳＴ、１４０ｍＭのＮａＣｌ）で洗浄する。結合したタンパク質は、ｐＨ２．５の２０ｍＭグリシン緩衝液によりＩＡＣカラムから溶出する。溶出液は中和し、次に緩衝液をＰＢＳに交換する。精製産物は、それぞれ純度、同一性、含量および生物活性を検討するために、常法通りクーマシーまたは銀染色を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット、紫外線吸収、および酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＳＡ）により分析する。さらに試料は、Ｎ末端アミノン酸配列分析およびアミノン酸分析によって分析した。これらの分析は、精製産物の同一性および含量に関する確証を提供した。

図１は精製ＤＥＮ−８０Ｅタンパク質の代表的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ（パネルＡ）およびウェスタンブロット（パネルＢ）のプロファイルを提供する。分析の間、試料は非還元条件下で泳動した。ＤＥＮ１−８０Ｅ、ＤＥＮ２−８０ＥおよびＤＥＮ３−８０Ｅ分子は、アミノ酸組成から決定された分子量と一致する相対分子量（すなわち４５ｋＤ）を有する単一バンドとして泳動する。ＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐタンパク質は、非還元条件下で主として見かけの分子量約９０ｋＤを有する二量体として泳動する。

ＤＥＮ１−８０Ｅ、ＤＥＮ２−８０Ｅ、ＤＥＮ３−８０ＥまたはＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐのｃＧＭＰロットの生産
マスターセルバンク（ＭＣＢ）は、ｃＧＭＰ条件下でＳ２細胞系の各々から調製した。ｃＧＭＰ製造工程は、Ｓ２ＭＣ細胞系の撹拌タンク型バイオリアクターへの拡大、およびその後の分泌タンパク質を含む培養液の回収を含む。細胞は、デプスフィルターを利用する濾過によって培養液から分離する。ＤＥＮ１−８０Ｅ、ＤＥＮ２−８０Ｅ、ＤＥＮ３−８０ＥまたはＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐは次に、生じた澄明化した上清から、４Ｇ２モノクローナル抗体を使用する免疫アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。免疫アフィニティー精製産物については、その後、低ｐＨのウイルス不活性化ステップ、および２０ｎｍ粒子を除去可能な孔径を有する膜を使用するウイルス濾過ステップを実施した。組換えサブユニットワクチン成分を用いて、低ｐＨウイルス不活化およびウイルス濾過ステップが実施できる能力は、これが可能でない弱毒化生ワクチンに優る優位性である。これらのウイルス排除ステップは偶発性媒介物試験を著しく簡略化して、製品に対するさらなるレベルの安全性を提供する。ＤＥＮ−８０Ｅタンパク質の最終処理は、緩衝液交換および０．２μｍのフィルターによる最終濾過を伴う限外濾過による濃縮を含んだ。

ｃＧＭＰ下でのＤＥＮ１−８０Ｅ、ＤＥＮ２−８０Ｅ、ＤＥＮ３−８０ＥまたはＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐのロットの製造は下記の通りに行った。各々のＭＣＢのバイアルを解凍し、各々の解凍したバイアルの内容物を、１０ｍＬ容のＥＸ−ＣＥＬＬ培地中２６℃で５日間培養した。各々の培養液は、５００ｍＬのディスポーザブル振盪フラスコに拡大した。培養液は、１．５Ｘ１０^７／ｍＬの細胞密度に達するまで増殖させた。フラスコはプールして、ディスポーザブル振盪フラスコ中のより多量の培地を接種するために使用し、次にそれを３ないし４日間培養した。培養液は、２Ｘ１０^７細胞数／ｍＬの細胞密度に達するまで培養した。培養液は、次にディスポーザブル振盪フラスコの複数の培養液に拡大した。これらの培養液は、１．６Ｘ１０^７細胞数／ｍＬの平均細胞密度に達するまで培養した。フラスコの細胞はプールして、２０Ｌのステンレス鋼製バイオリアクターに接種するために使用した。培養液は、１．２Ｘ１０^７細胞数／ｍＬの細胞密度に達するまで培養した。２０Ｌバイオリアクターからの適当な量の細胞を、２Ｘ１０^６細胞数／ｍＬの初期細胞密度となるように、１００Ｌのステンレス鋼製バイオリアクターへ移植した。培養液は、＞４．０Ｘ１０^６細胞数／ｍＬの細胞密度に達するまで培養した。培養液は、次に硫酸銅を０．２ｍＭの終濃度となるように硫酸銅を培養液に添加することによって誘導した。培養液は、その後５日間培養した。各々の１００Ｌの培養液は、０．２μｍフィルターカートリッジを伴う０．４５μｍフィルターカートリッジを使用するデプス濾過によって採取した。濾液は、１０Ｌ容のシングルユースバッグに収集し、−２０℃で貯蔵した。

ＤＥＮ１−８０Ｅ、ＤＥＮ２−８０Ｅ、ＤＥＮ３−８０ＥまたはＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐのバルクハーベストは、雰囲気温度下（１５ないし２５℃）約２４時間で解凍した。微粒子は、その後、孔径５μｍのフィルターに物質を通して除去した。濾過したバルクハーベストは、４Ｇ２−セファロースカラムに直接負荷した。負荷後カラムは、Ｔｗｅｅｎ−２０を０．０５％含むｐＨ７．１の１１ｍＭのＰＢＳ（ＰＢＳＴ）により洗浄し、次に保持された８０Ｅは、グリシン緩衝液によりｐＨを下げて溶出した。サブバッチはプールし、次に最終ｐＨ３．８までｐＨを下げてウイルスを不活性化し、次に物質を雰囲気温度（１５ないし２５℃）で１６ないし２４時間インキュベートし、その後ｐＨを７．０±０．５に調整した。物質は、小さな粒子を除去するために０．２μｍのプレフィルターに通し、次に２０ｎｍ孔径の膜を使用して限外ろ過した（ｖｉｒａｌ ｆｉｌｔｅｒｅｄ）。次に物質は濃縮し、次に限外濾過膜によって緩衝液を交換し、次に０．２μｍのフィルターを通して直接滅菌バッグの中へ最終の濾過滅菌を行った。精製８０Ｅ生物物質は、ワクチン製品の製剤化に放出する前に、広範な安全性、同一性、耐久力および純度の評価を受けた。

臨床試験使用のためのＨＢＶ−００１ Ｄ１ワクチンの製剤化
１価のＤＥＮ１−８０Ｅアラム吸着（ＨＢＶ−００１ Ｄ１）ワクチンの製剤化は、ｃＧＭＰ下で行った。簡潔に説明すると、実施例２に記載の精製生物物質であるＤＥＮ１−８０Ｅを解凍し、次にクラス１００のラミナーフローエリアに移動した。ＤＥＮ１−８０Ｅは、０．２０ｍｇ／ｍｌのタンパク質標的終濃度になるように、滅菌ダルベッコ・リン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で希釈し、次に希釈８０Ｅ溶液は濾過滅菌した。ＤＰＢＳおよびアルハイドロゲル「８５」を２．５０ｍｇ／ｍＬの最終アルミニウム濃度となるまで、希釈ＤＥＮ１−８０Ｅ溶液に容量的に添加した。溶液は２ないし８℃で一晩穏やかに混合した。

一晩吸着後、吸着されなかったＤＥＮ１−８０Ｅタンパク質の量を測定した。ＨＢＶ−００１ Ｄ１ワクチンの充填へ進むには最小限７５％の吸着が必要とされた。適当な量のＨＢＶ−００１ワクチンを準備した滅菌バイアルに移した。充填したバイアルは栓をし、密封し次に圧着した。ワクチンを充填したバイアルは２ないし８℃で貯蔵した。臨床試験でワクチンを使用する前に、広範な安全性、耐久力、同一性、有効性および純度の試験を行った。

臨床試験使用のための４価デング抗原の製剤化
４価ＤＥＮ−８０Ｅワクチンの製剤化はｃＧＭＰ下で行った。簡潔に説明すると、実施例２に記載の精製生物物質であるＤＥＮ１−８０Ｅ、ＤＥＮ２−８０Ｅ、ＤＥＮ３−８０ＥおよびＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐを解凍し、クラス１００のラミナーフローエリアに移動した。解凍した抗原は濾過滅菌し、次に濾過後のタンパク質濃度を測定した。ＤＥＮ−８０Ｅ抗原は、０．５０ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質標的濃度に達するまで、滅菌ダルベッコ・リン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）により各々独立して希釈した。４のタンパク質溶液は、次にＤＥＮ１−８０Ｅを０．１ｍｇ／ｍＬ、ＤＥＮ２−８０Ｅを０．１ｍｇ／ｍＬ、ＤＥＮ３−８０Ｅを０．１ｍｇ／ｍＬおよびＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐを０．２ｍｇ／ｍＬ含む４価の溶液を産生するために、ＤＥＮ１−８０Ｅ：ＤＥＮ２−８０Ｅ：ＤＥＮ３−８０Ｅ：ＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐに関し１：１：１：２の比率で容量的に混合した。４価ワクチン混合液の適当量を用意した滅菌バイアルに移した。充填したバイアルは栓をし、密封し次に圧着した。ワクチンを充填したバイアルは、２ないし８℃で貯蔵した。またＤＥＮ１−８０Ｅ、ＤＥＮ２−８０Ｅ、ＤＥＮ３−８０ＥおよびＤＥＮ４−８０Ｅを含む類似の製剤も臨床試験を支援するために調製した。臨床試験でワクチンを使用する前に、広範な安全性、耐久力、同一性、有効性および純度の試験を行った。４価抗原は、単独またはヒト被験者への投与前に医薬品の臨床試験実施基準に従って滅菌し充填したアジュバントと混合して投与する。

ＨＢＶ−００１ Ｄ１デング１型組換えサブユニットワクチンの臨床試験
実施例３に記載の通り、ｃＧＭＰ下で製造されたＨＢＶ−００１ワクチンを臨床治験で試験した。健康な成人ボランティアでの生物学的製剤であるＨＢＶ−００１ Ｄ１を評価するために、単一医療センター、二重盲検、無作為化の第Ｉ相試験により、同量のアルハイドロゲル「８５」アジュバントを有するワクチンの活性成分（ＤＥＮ１−８０Ｅ）の２の異なる用量レベルを評価した。被験者は、試験ワクチンの単回の筋肉内注射を０、４および８週に受けた。試験計画を以下の表１に要約する。

安全性および忍容性は、対象身体的検査、通常の実験室内試験（血液学、臨床化学および検尿）および試験ボランティアにおける生命徴候および有害事象の記録による試験を通して評価した。さらに被験者は、特定の有害事象と同様に反応源性および忍容性データを記録するために、各々のワクチン接種の２日前から１４日後の間ダイアリーカードを使用した。この研究の有効性評価は、≧１：１０のＰＲＮＴ_５０（プラーク減少中和試験）アッセイによって測定される、ウイルス中和抗体力価の量および範囲（すなわち免疫原性）の測定を含んだ。試験において、ワクチンがヒト被験者にとって安全であると示唆する安全なシグナルは確認されなかった。

免疫化した個体からの免疫原性データを表２に要約する。低用量コホートの６人のワクチン受容者のうち、全ての被験者は０、２および４週で中和抗体力価が陰性だった。被験者の大部分（４／６）は、３回目のワクチン投与後２週の１０週で中和抗体を発生した。どの被験者も３４周では検出可能な抗体を示さなかった。１の被験者（００７）は、初期の６週に（２回目のワクチン投与後２週）陽性の結果を示し、それは１０週にも存在したが、３４周では（投与３後２６週）検出不能だった。

高用量コホートの６人のワクチン受容者のうち、全ての被験者は０、２および４週で中和抗体力価が陰性だった。１の被験者は、初期の６週に（２回目のワクチン投与後２週）陽性の結果を示した。２の被験者は８週（３回目のワクチン投与日）に中和抗体を示し、被験者の大部分（５／６）は、１０週では中和抗体を発生した。２の被験者は３４週で検出可能な抗体力価を示し続けた。これは、ヒト被験者におけるデング用の非複製型ワクチンのウイルス中和抗体誘導に関する最初の証明であることを意味している。全ての４人のプラセボ受容者は、全ての測定時点において検出不能な抗体力価しか有さなかった。

結果は、ＨＢＶ−００１ Ｄ１ワクチンがヒト患者において安全でありかつＤＥＮ１に対する免疫応答を誘導することができることを証明する。さらに、この適切な防御免疫応答は、強力な防御のためにＮＳ１に対する必要性が予想されたにも関わらず（ＭｃＤｏｎｅｌｌら，米国特許６，４１６，７６３号）、製剤中にＮＳ１を包含せずにワクチン接種を受けた個体群において誘導された。

アカゲザルにおける４価デング８０Ｅ組換えサブユニットワクチン（ｗ／ＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐ）の試験
単量体ＤＥＮ１−８０Ｅ、単量体ＤＥＮ２−８０Ｅ、単量体ＤＥＮ３−８０Ｅおよび二量体ＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐのユニークな組み合せを含む４価製剤は、各々のＤＥＮ−８０Ｅの１μｇおよびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバントの４７ＩＳＣＯ単位の用量をアカゲザルに送達するために、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバントとの混合剤として調製した（群１）。第二の混合剤を調製したが、それは同じ４価組成物を含んだがまた０．１μｇのＤＥＮ２由来のＮＳ１タンパク質の０．１μｇの投与量をも含んだ（群２）。１２匹のサルから成る群は各々、混合剤かまたはＩＳＣＯＭＴＲＩＸ（登録商標）単独（群３）の３用量を２月の間隔で投与した。免疫原性は、ワクチンの３回投与後の３０日（１５０試験日）に評価した。ＮＳ１を含まない４価製剤により免疫した個々の動物の抗体力価を表３に示す。明らかな通り、単量体および二量体抗原のユニークな組み合せは、結果として動物における高力価で、平衡のとれた４価のウイルス中和応答をもたらす。

プラーク減少中和試験において５０％減少のカットオフ値で定量したウイルス中和抗体力価
最後のワクチン投与を受けた後の５月に、動物を野生型デングウイルスで攻撃感染した。攻撃感染のために、各々１２匹のサルから成る各群は、４のデングウイルス型の１型による攻撃感染のために無作為に各々３匹のサルから成る４群に細区画した。各々のサルを、野生型のデングウイルスの約１０^５プラーク形成単位により皮下経路によって攻撃感染した。動物から次の１１日間、毎日血液試料を採取した。血液試料は、ベロ細胞上への直接プレーティングまたは蚊Ｃ６／３６細胞上での増幅に続くベロ細胞へのプレーティングによって、ウイルスの存在（ウイルス血症）の評価を行った。野生型デングウイルスに感染するとき、アカゲザルは病徴を発症しないが一方、それらはウイルス血症を発生するために、ウイルス血症の防御が防御効力を代用する物と考えられる。攻撃感染データを表２に示す。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバントだけを受容した１２匹の対照動物の中の１１匹が攻撃感染後にウイルス血症を発生した一方、ＮＳ１を含まない４価ワクチン製剤を受容した全ての動物（群１）は検出可能なウイルス血症から完全に防御された。またＮＳ１を含んだ４価ワクチン製剤を受容した１２匹の動物（群２）の中の１１匹もウイルス血症から防御されたが、しかし驚くべきことにＮＳ１を含む製剤を受容した１匹のサルが１日だけウイルス血症を発症した。従って、ＮＳ１を含まない単量体および二量体のタンパク質から成るユニークな組み合せを含む４価ワクチン製剤は、平衡のとれた４価免疫およびウイルス攻撃感染からの完全な防御を示したが、しかも驚くべきことにはＮＳ１を含む製剤と比較してよりすぐれた防御を示したように見える。

アカゲザルにおける４価デング８０Ｅ組換えサブユニットワクチンの試験
このＧＬＰに無い（ｎｏｎ−ＧＬＰ）アカゲザル試験の目的は、１）ＤＥＮ４−８０ＥとＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐの免疫原性および防御効果を比較すること、および２）他の単量体ＤＥＮ−８０Ｅ組換えサブユニット（ＤＥＮ１−８０Ｅ、ＤＥＮ２−８０ＥおよびＤＥＮ３−８０Ｅ）を有する４価製剤中のＤＥＮ４−８０Ｅの免疫原性および防御効果を評価することだった。ＤＥＮ４−８０ＥおよびＤＥＮ４−８０Ｅｚｉｐは、低、中および高用量（６、２０および１００μｇ／用量）で評価した。同様に４価製剤は、低（それぞれ３、３，３，６μｇのＤＥＮ１−８０Ｅ、ＤＥＮ２−８０Ｅ、ＤＥＮ３−８０ＥおよびＤＥＮ４−８０Ｅ）、中（１０、１０、１０、２０μｇ）および高（５０、５０、１００μｇ）用量で評価した。試験製剤の大部分は、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバントを用量当たり９０ＩＳＣＯ単位で含んだ。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバントだけを用量当たり９０ＩＳＣＯ単位受容した負の対照群を含めた。試験には、比較の目的で追加の２群を含めた。２２５μｇのアルハイドロゲルと製剤化した中用量のＤＥＮ４−８０Ｅ（２０μｇ）を受容した一群、および３７．６ＩＳＣＯ単位と製剤化した中用量の４価ワクチンを受容した一群を含めた。各々のワクチンまたは対照製剤は、ＥＬＩＳＡアッセイでフラビウイルス（ＤＥＮ１、２、３及び４ならびにＷＮ）抗体陰性だった、健康な大人で、雌雄の体重３ｋｇ以上アカゲザルに投与した。単価ＤＥＮ４ワクチンを評価するときは群当たり３匹のサルを使用し、４価製剤またはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）の負の対照群を評価するために群当たり１２匹のサルを使用した。

上記の候補ワクチン製剤は、全量０．５ｍＬで筋肉内接種によって投与した。ワクチンの３用量を４週の間隔で投与した。ウイルス中和活性は、マイクロ中和試験に基づくＬｉＣｏｒを使用して４週毎（Ｔ＝０、４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２）に測定する。１２週（投与３後４週）に対するＬｉＣｏｒ結果を以下の表４に要約する。１２週の結果からの重要な結論の一つは、ＤＥＮ４−８０ＥとＤＥＮ４−８０Ｅｚｉｐの免疫原性が、評価された用量にわたり極めて同等であることに帰着する。ＤＥＮ４−８０Ｅに対する低、中及び高用量の幾何平均中和力価は、それぞれ５０８、５０８及び３２０だったが、一方ＤＥＮ４−８０Ｅｚｉｐに対する力価は６４０、１０１６及び３２０だった。またＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）によりアジュバント化された中用量のＤＥＮ４−８０Ｅを受容した群は、アルハイドロゲルを受容した群（３２）よりも実質的に高い幾何平均中和力価（５０８）を有することも認められた。また４価ワクチン製剤を受容した群において、全てのデング型にわたり高度に平衡のとれた応答が達成されることもわかった。明らかな用量反応は、単一成分ワクチン（ＤＥＮ４−８０ＥまたはＤＥＮ４−ｚｉｐ）にも４価ワクチンにも認められなかった。

４価デング８０Ｅ組換えサブユニットワクチンの臨床治験
ｃＧＭＰ下で製造した４価デングウイルス８０Ｅワクチンを臨床治験における試験用に調製する。治験は４価デング８０Ｅワクチンの第Ｉ相試験からなり得るだろう。治験は、無作為、二重盲検、プラセボ対照、投与量増加の試験であり得て、それは健康なフラビウイルスにナイーブな１８ないし４５才の成人における４価（ＤＥＮ１−８０Ｅ、ＤＥＮ２−８０Ｅ、ＤＥＮ３−８０ＥおよびＤＥＮ４−８０Ｅ）デングワクチンの異なる製剤の安全性、忍容性及び免疫原性を評価し得るだろう。免疫原性データは、３回接種後の６月および１年と同様に各々のワクチン接種後の１月に収集し得るだろう。

全部で９０人の被験者が、０、４及び８週で投与される活性ワクチンかまたはプラセボの３回の筋肉内注射を受けるために、治験に登録され得るだろう。表５に示す通り、デング１、デング２、デング３およびデング４−８０Ｅ抗原の３用量レベル：すなわち低用量（それぞれ３、３、３および６μｇ）、中用量（それぞれ１０、１０、１０および２０μｇ）および高用量（それぞれ５０、５０、５０および１００μｇ）の製剤が評価され得るだろう。各々の用量レベル内で、試験される特定のワクチンは、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）でアジュバント化した（３０または６０ＩＳＣＯ単位含有）、アルハイドロゲル（登録商標）でアジュバント化した製剤、またはアジュバントを含まない製剤を含み得るだろう。

Claims (20)

1. 血清型ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３およびＤＥＮ−４の有効量の精製デングウイルスエンベロープ（「Ｅ」）タンパク質、薬学的に許容可能な賦形剤ならびに有効量のアジュバントを含む免疫原性組成物であって、Ｅタンパク質は、各々、そのＮ末端のアミノ酸残基１から出発して野生型Ｅの長さの約８０％を構成し、ＤＥＮ−４Ｅタンパク質は二量体であり、ならびに該組成物はヒト被験者における中和抗体の産生を誘導する、前記免疫原性組成物。
2. Ｅタンパク質が昆虫宿主細胞中で組換え的に産生されかつ発現される請求項１に記載の組成物。
3. Ｅタンパク質がＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ２（Ｓ２）宿主細胞中で組換え的に産生されかつ発現される請求項１に記載の組成物。
4. アジュバントがアルミニウム塩アジュバントである前記請求項のいずれかに記載の組成物。
5. アジュバントがＩＳＣＯＭ型アジュバントである前記請求項のいずれかに記載の組成物。
6. アジュバントがＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸである請求項５に記載の組成物。
7. ＤＥＮ４タンパク質の量がＤＥＮ１、ＤＥＮ２およびＤＥＮ３タンパク質の個々の量の約１．５ないし約３倍である請求項５に記載の組成物。
8. ＤＥＮ４タンパク質の量がＤＥＮ１、ＤＥＮ２およびＤＥＮ３タンパク質の個々の量の約２倍である請求項７に記載の組成物。
9. 血清型ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３およびＤＥＮ−４の有効量の精製デングウイルスエンベロープ（「Ｅ」）タンパク質単量体、薬学的に許容可能な賦形剤および有効量のアジュバントを含む免疫原性組成物であって、Ｅタンパク質は、宿主細胞において組換え的に発現されるとき、前記Ｅタンパク質が増殖培地中に分泌可能であるように、各々、そのＮ末端のアミノ酸残基１から出発して野生型Ｅの長さの約８０％を構成し、ＤＥＮ４Ｅタンパク質の量はＤＥＮ１、ＤＥＮ２およびＤＥＮ３Ｅタンパク質の個々の量の約１．５ないし約３倍であり、ならびに該組成物はヒト被験者における中和抗体の産生を誘導する、前記免疫原性組成物。
10. ＤＥＮ４Ｅタンパク質の量がＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３Ｅタンパク質の個々の量の約２倍である請求項９に記載の組成物。
11. ＤＥＮのＥタンパク質の量が：（ａ）ＤＥＮ１−８０Ｅ約３μｇ、ＤＥＮ２−８０Ｅ約３μｇ、ＤＥＮ３−８０Ｅ約３μｇおよびＤＥＮ４−８０Ｅ約６μｇ；（ｂ）ＤＥＮ１−８０Ｅ約１０μｇ、ＤＥＮ２−８０Ｅ約１０μｇ、ＤＥＮ３−８０Ｅ約１０μｇおよびＤＥＮ４−８０Ｅ約２０μｇ；（ｃ）ＤＥＮ１−８０Ｅ約５０μｇ、ＤＥＮ２−８０Ｅ約５０μｇ、ＤＥＮ３−８０Ｅ約５０μｇおよびＤＥＮ４−８０Ｅ約１００μｇ；（ｄ）ＤＥＮ１−８０Ｅ約３μｇ、ＤＥＮ２−８０Ｅ約３μｇ、ＤＥＮ３−８０Ｅ約３μｇおよびＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐ約６μｇ；（ｅ）ＤＥＮ１−８０Ｅ約１０μｇ、ＤＥＮ２−８０Ｅ約１０μｇ、ＤＥＮ３−８０Ｅ約１０μｇおよびＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐ約２０μｇ；ならびに（ｆ）ＤＥＮ１−８０Ｅ約５０μｇ、ＤＥＮ２−８０Ｅ約５０μｇ、ＤＥＮ３−８０Ｅ約５０μｇおよびＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐ約１００μｇ、から成る群から選択される請求項１０に記載の組成物。
12. ヒト患者における防御免疫応答を増強するための方法であって、前記請求項のいずれかに記載の治療的有効量の免疫原性組成物を患者に投与することを含む、該方法。
13. 請求項１〜１１のいずれかに記載の有効量の組成物を投与すること、それによってデング熱（ｄｅｎｇｕｅ ｄｉｓｅａｓｅ）からの防御を提供することを含むデングウイルス誘発性疾患に対するヒトにおける免疫防御を提供する方法。
14. ヒト患者において防御免疫応答を増強する方法であって、該増強方法は、精製デングウイルスエンベロープ（「Ｅ」）タンパク質および薬学的に許容可能な賦形剤（ここでＥタンパク質は、そのＮ末端のアミノ酸残基１から出発して野生型Ｅの長さの約８０％を構成する）、および有効量のアジュバントを含む治療的有効量の免疫原性組成物を投与することを含み、ワクチンがヒト被験者における中和抗体の産生を誘導する前記の増強方法。
15. 免疫原性組成物が血清型ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３およびＤＥＮ４のデングウイルスＥタンパク質を含み、ここでＤＥＮ４タンパク質が二量体である、請求項１４に記載の方法。
16. 組成物中のＤＥＮ４タンパク質の量がＤＥＮ１、ＤＥＮ２およびＤＥＮ３タンパク質の個々の量の約２倍である請求項１４または請求項１５に記載の方法。
17. 組成物が筋肉内、皮下または皮内投与経路により投与される請求項１３〜１６のいずれかに記載の方法。
18. 血清型ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３およびＤＥＮ−４の有効量の精製デングウイルスエンベロープ（「Ｅ」）タンパク質、薬学的に許容可能な賦形剤および有効量のアジュバントを含み、Ｅタンパク質は、各々、そのＮ末端のアミノ酸残基１から出発して野生型Ｅの長さの約８０％を構成し、ならびにＤＥＮ−４Ｅタンパク質は二量体である、デング熱（ｄｅｎｇｕｅ ｄｉｓｅａｓｅ）の防御または治療用の免疫原性組成物。
19. 免疫不全患者に投与することが予定される請求項１６に記載の組成物。
20. デング感染またはデング熱（ｄｅｎｇｕｅ ｄｉｓｅａｓｅ）の治療または防御用の医薬品製造のための請求項１〜１１のいずれかに記載の組成物の使用。

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