JP2013125005A - Latex agglutination immunoreagent for ck-mb measurement and measuring method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ＣＫ−ＭＢ測定用ラテックス凝集免疫試薬及び測定方法に関する。 The present invention relates to a latex agglutination immunoreagent for CK-MB measurement and a measurement method.
クレアチンキナーゼ（以下、ＣＫ）は、クレアチンリン酸とＡＤＰとをクレアチンとＡＴＰに触媒する酵素で、生体内では脳や心筋、平滑筋、神経系などに存在し、骨格筋に最も多く存在する。ＣＫは２つのサブユニット構造からなり、骨格筋型のＣＫ−ＭＭ、心筋由来型のＣＫ−ＭＢ、脳や平滑筋型のＣＫ−ＢＢの３種のアイソザイムが存在する。その他、ミトコンドリア由来のＣＫや免疫グロブリン結合型のＣＫが存在する。特にＣＫ−ＭＢは心筋由来のアイソザイムで、心筋逸脱マーカーとして酵素活性やタンパク質量を測定し、心筋梗塞の診断や、発症時のモニタリングに頻用される。前記アイソザイムは、通常、それぞれ２量体で存在する。 Creatine kinase (hereinafter referred to as CK) is an enzyme that catalyzes creatine phosphate and ADP to creatine and ATP, and is present in vivo in the brain, myocardium, smooth muscle, nervous system, and the like, and is most abundant in skeletal muscle. CK is composed of two subunit structures, and there are three types of isozymes, skeletal muscle type CK-MM, myocardial origin type CK-MB, and brain and smooth muscle type CK-BB. In addition, there are mitochondrial CK and immunoglobulin-binding CK. In particular, CK-MB is an isozyme derived from the myocardium, and is frequently used for diagnosis of myocardial infarction and monitoring at the time of onset by measuring enzyme activity and protein amount as a myocardial deviation marker. The isozymes are usually present as dimers, respectively.
ＣＫ−ＭＢの測定法としては、その酵素活性を測定する方法や、抗原抗体反応によりＣＫ−ＭＢのタンパク質濃度を測定する方法が頻用されている。酵素活性測定法としては、免疫阻害法と組み合わせたＣＫ−ＭＢ活性測定法が多用されている。測定原理は、ＣＫ−Ｍサブユニットに特異的に結合し酵素活性を阻害する抗ＣＫ−Ｍ抗体を用い、ＣＫ−ＭＭ及びＣＫ−ＭＢの酵素活性を阻害し、残存するＣＫ活性から、ＣＫ−ＭＢ活性を求める方法である。なお、残存ＣＫ活性は以下の反応式に基づき、ＮＡＤＰＨの増加量から導かれる。 As a method for measuring CK-MB, a method of measuring the enzyme activity and a method of measuring the protein concentration of CK-MB by an antigen-antibody reaction are frequently used. As an enzyme activity measurement method, a CK-MB activity measurement method combined with an immune inhibition method is frequently used. The measurement principle uses an anti-CK-M antibody that specifically binds to the CK-M subunit and inhibits the enzyme activity, inhibits the enzyme activity of CK-MM and CK-MB, and from the remaining CK activity, This is a method for determining MB activity. The residual CK activity is derived from the increase in NADPH based on the following reaction formula.
一方、抗原抗体反応によりＣＫ−ＭＢのタンパク質濃度を測定する方法としては、化学発光酵素免疫測定法（以下、ＣＬＩＡ法）、酵素免疫測定法（以下、ＥＩＡ法）による技術が開示され、またラテックス凝集反応による方法も開示されている（特許文献１）。特にラテックス凝集反応による測定法はＢ／Ｆ分離が不要で、その簡便さや汎用装置への対応が容易な点から臨床検査薬としての適用が期待されている。 On the other hand, as a method for measuring the protein concentration of CK-MB by an antigen-antibody reaction, techniques based on a chemiluminescent enzyme immunoassay (hereinafter referred to as CLIA) and an enzyme immunoassay (hereinafter referred to as EIA) are disclosed. A method using an agglutination reaction is also disclosed (Patent Document 1). In particular, the latex agglutination reaction measurement method does not require B / F separation, and is expected to be applied as a clinical test agent because of its simplicity and easy compatibility with general-purpose devices.
ラテックス凝集法の測定原理は、測定対象の抗原に結合する抗体をラテックス粒子に担持させ、抗原の存在下で抗原抗体反応させるものである。ラテックス粒子の凝集を光学的に検出することで、その凝集の程度から測定対象の抗原量を測定する方法である。 The measurement principle of the latex agglutination method is such that an antibody that binds to an antigen to be measured is supported on latex particles, and an antigen-antibody reaction is carried out in the presence of the antigen. In this method, the amount of antigen to be measured is measured from the degree of aggregation by optically detecting the aggregation of latex particles.
ＣＫ−ＭＢは、ＣＫ−ＭサブユニットとＣＫ−Ｂサブユニットとから成る。ＣＫ−ＭＢを測定可能な抗体は、（１）ＣＫ−Ｍサブユニットに特異的に結合する抗体、（２）ＣＫ−Ｂサブユニットに特異的に結合する抗体、そして、（３）ＣＫ−ＭサブユニットやＣＫ−Ｂサブユニットには結合しないがＣＫ−ＭＢに特異的に結合する抗体に分類できる（特許文献１）。ＣＫ−ＭＢ測定用ラテックス凝集試薬を構築する場合は、これらの抗体群から好適な２種以上を選択することが考えられる。例えば、ＣＫ−Ｂサブユニットに特異的な抗体のみでは、ＣＫ−ＭＢがサンドイッチされず測定系が成立しない場合が多いからである。 CK-MB consists of a CK-M subunit and a CK-B subunit. Antibodies capable of measuring CK-MB are (1) an antibody that specifically binds to the CK-M subunit, (2) an antibody that specifically binds to the CK-B subunit, and (3) CK-M The antibody can be classified into an antibody that does not bind to a subunit or CK-B subunit but specifically binds to CK-MB (Patent Document 1). When constructing a latex agglutination reagent for CK-MB measurement, it is conceivable to select two or more suitable antibodies from these antibody groups. For example, only with an antibody specific for the CK-B subunit, CK-MB is not sandwiched and the measurement system is often not established.
具体的には、２種の抗体によるＣＫ−ＭＢのサンドイッチが成立する組合せ例として、ＣＫ−Ｂサブユニットに特異的に結合する抗体と、ＣＫ−Ｍサブユニットに特異的に結合する抗体とを、それぞれ、別のラテックス粒子に担持させる場合が考えられる。しかし、ＣＫ−Ｂサブユニットに特異的に結合する抗体は、ＣＫ−ＭＢの他、ＣＫ−ＢＢへも結合する。同様に、ＣＫ−Ｍサブユニットに特異的に結合する抗体は、ＣＫ−ＭＢの他、ＣＫ−ＭＭへも結合する。従って、当該抗体の組合せの場合、共存するＣＫ−ＢＢやＣＫ−ＭＭも検出することから、ＣＫ−ＭＢの正確な測定ができない。 Specifically, as a combination example in which a sandwich of CK-MB by two kinds of antibodies is established, an antibody that specifically binds to the CK-B subunit and an antibody that specifically binds to the CK-M subunit In this case, it is conceivable that the particles are supported on different latex particles. However, an antibody that specifically binds to the CK-B subunit binds to CK-BB as well as CK-MB. Similarly, an antibody that specifically binds to the CK-M subunit binds to CK-MM as well as CK-MB. Therefore, in the case of the antibody combination, since CK-BB and CK-MM coexisting are also detected, CK-MB cannot be measured accurately.
しかし、Ｂ／Ｆ分離のステップを含む測定系、例えばＣＬＩＡ法やＥＩＡ法であれば、当該抗体の組み合わせであっても上記のようなＣＫ−ＢＢやＣＫ−ＭＭの干渉の影響は受けにくい。すなわち、試料を第一の抗体担持担体と接触させる工程と、引き続く第二の抗体担持担体を接触させる工程とが、Ｂ／Ｆ分離前後で分離されるため、ＣＫ−ＭＭやＣＫ−ＢＢがサンドイッチされないためである。
一方、しかしながら、ラテックス凝集法においての測定工程は簡素でＢ／Ｆ分離のステップを必要としないことが特徴である。そのため、ＣＬＩＡ法等のように共存物を排除することができない為、それらの干渉の影響を受けやすい。
However, in the case of a measurement system including a B / F separation step, for example, the CLIA method or the EIA method, even the combination of the antibodies is not easily affected by the above-described interference with CK-BB or CK-MM. That is, the step of bringing the sample into contact with the first antibody-carrying carrier and the subsequent step of bringing into contact with the second antibody-carrying carrier are separated before and after the B / F separation, so that CK-MM and CK-BB are sandwiched. Because it is not done.
On the other hand, however, the measurement process in the latex agglutination method is simple and does not require a B / F separation step. Therefore, coexisting substances cannot be excluded as in the CLIA method and the like, so that they are easily affected by such interference.
ラテックス凝集法での当該課題を解決するために、特許文献１ではＭサブユニットやＢサブユニットには結合せずＣＫ−ＭＢに特異的に結合する抗体を使用した技術を開示されている。当該文献では、ＣＫ−ＢＢ又はＣＫ−ＭＭへの交差性のある抗体を使用するとＣＫ−ＢＢ又はＣＫ−ＭＭの干渉を受けることから、ＣＫ−ＭＢにのみ特異的な抗体であれば、干渉反応を回避できるとして干渉の影響を解決している。これまでのＣＫ−ＭＢのサンドイッチアッセイに関するいずれの記載も、干渉の影響が主として抗体の特異性に依存するため、課題を解決する為には抗体の反応性やそれらの組合せを工夫することに主眼をおくものばかりである。 In order to solve the problem in the latex agglutination method, Patent Document 1 discloses a technique using an antibody that specifically binds to CK-MB without binding to M subunit or B subunit. In this document, if an antibody having a cross-reactivity to CK-BB or CK-MM is used, it will be interfered by CK-BB or CK-MM. The influence of interference is solved as it can be avoided. Since all the descriptions related to the sandwich assay of CK-MB so far depend on the specificity of the antibody, the influence of interference mainly focuses on devising the reactivity of the antibody and the combination thereof to solve the problem. It ’s all about putting
例えば、特許文献２および特許文献３では、ＣＫ−ＭＢに特異的に結合し他のアイソザイムに結合しない抗体を見出し、ＣＫ−ＭＭやＣＫ−ＢＢの干渉を回避する技術を提示している。
非特許文献１では、ＣＫ−ＭＢに特異的な抗体を使用し試料からＣＫ−ＭＢを回収し、ＣＫ−ＭＢの酵素活性を測定することでＣＫ−ＭＢを測定し、ＣＫ−ＭＭやＣＫ−ＢＢの干渉を回避する手法を開示している。
非特許文献２〜４では、サンドイッチイムノアッセイで２種類のＣＫ−ＭＢ特異抗体を使用することで、ＣＫ−ＭＭやＣＫ−ＢＢの干渉を回避する手法を開示している。
しかし、このような特異的な反応性を有する抗体を取得することは難しく、簡便且つ正確なＣＫ−ＭＢ測定用のラテックス凝集試薬が望まれている。
For example, Patent Document 2 and Patent Document 3 find an antibody that specifically binds to CK-MB and does not bind to other isozymes, and presents a technique for avoiding interference of CK-MM and CK-BB.
In Non-Patent Document 1, CK-MB is collected from a sample using an antibody specific for CK-MB, and CK-MB is measured by measuring the enzyme activity of CK-MB. A technique for avoiding BB interference is disclosed.
Non-Patent Documents 2 to 4 disclose a technique for avoiding interference of CK-MM and CK-BB by using two kinds of CK-MB specific antibodies in sandwich immunoassay.
However, it is difficult to obtain an antibody having such specific reactivity, and a simple and accurate latex agglutination reagent for CK-MB measurement is desired.
従って、本発明の課題は、上記問題点を解決することのできる、生体成分中のＣＫ−ＭＢ測定用ラテックス凝集免疫測定試薬及び測定方法であって、ＣＫ−ＭＭやＣＫ−ＢＢなどの共存物の干渉を回避し、簡便且つ正確なＣＫ−ＭＢ測定用ラテックス凝集免疫測定試薬及び測定方法を提供することである。 Accordingly, an object of the present invention is a latex agglutination immunoassay reagent for measuring CK-MB in biological components and a measuring method that can solve the above-mentioned problems, and a coexistent such as CK-MM and CK-BB. It is an object to provide a latex agglutination immunoassay reagent for CK-MB measurement and a measurement method that are simple and accurate.
本発明者らは、鋭意検討した結果、ＣＫ−ＭＢ測定用ラテックス凝集免疫測定方法において、ＣＫ−ＭＢやＣＫ−ＢＢに特異的な抗体であっても、組み合わせによっては、それらの分子（例えばＣＫ−ＢＢ）への干渉影響が生じる場合があること、更に、そのような交差性を有する抗体を使用する場合であっても、ラテックス粒子の平均粒子径が特定の範囲内にあることにより、意外にもＣＫ−ＢＢに対する反応性を低減できることを見出し、より正確にＣＫ−ＭＢを測定する技術を創出した。 As a result of intensive studies, the present inventors have determined that even in the latex agglutination immunoassay method for CK-MB measurement, antibodies specific for CK-MB and CK-BB may be used depending on their combination (for example, CK-MB). -BB) may cause interference effects, and even when using antibodies having such crossover properties, the average particle diameter of latex particles is within a specific range, which is surprising. In addition, it was found that the reactivity to CK-BB can be reduced, and a technique for measuring CK-MB more accurately was created.
すなわち、本発明は、
［１］ＣＫ−ＭＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を固相したラテックス粒子、ＣＫ−ＢＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を固相したラテックス粒子を含み、これらの粒子の平均粒子径が０．２３μｍ〜０．３２μｍである、ＣＫ−ＭＢ測定用ラテックス凝集免疫試薬、
［２］前記ＣＫ−ＢＢに特異的に結合するモノクローナル抗体が、該ＣＫ−ＢＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を固相したラテックス粒子単独では、ＣＫ−ＢＢとのラテックス凝集を生じない抗体である、［１］のラテックス凝集免疫試薬、
［３］前記ＣＫ−ＭＢに特異的に結合するモノクローナル抗体が、該ＣＫ−ＭＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を固相したラテックス粒子単独では、ＣＫ−ＭＢとのラテックス凝集を生じない抗体である、［２］のラテックス凝集免疫試薬、
［４］検体と、ＣＫ−ＭＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を固相したラテックス粒子及びＣＫ−ＢＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を固相したラテックス粒子とを反応させ、ラテックス粒子の凝集を光学的に検出する工程を含み、これらの粒子の平均粒子径が０．２３μｍ〜０．３２μｍである、ＣＫ−ＭＢのラテックス凝集免疫測定方法、
［５］前記ＣＫ−ＢＢに特異的に結合するモノクローナル抗体が、該ＣＫ−ＢＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を固相したラテックス粒子単独では、ＣＫ−ＢＢとのラテックス凝集を生じない抗体である、［４］のラテックス凝集免疫測定方法、
［６］前記ＣＫ−ＭＢに特異的に結合するモノクローナル抗体が、該ＣＫ−ＭＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を固相したラテックス粒子単独では、ＣＫ−ＭＢとのラテックス凝集を生じない抗体である、［５］のラテックス凝集免疫測定方法
に関する。
That is, the present invention
[1] Including latex particles solid-phased with a monoclonal antibody that specifically binds to CK-MB and latex particles solid-phased with a monoclonal antibody that specifically binds to CK-BB, the average particle size of these particles being 0 A latex agglutination immunoreagent for CK-MB measurement, which is 23 μm to 0.32 μm,
[2] The monoclonal antibody that specifically binds to CK-BB is an antibody that does not cause latex aggregation with CK-BB when the latex antibody alone that solidifies the monoclonal antibody that specifically binds to CK-BB is used. A latex agglutination immunoreagent according to [1],
[3] The monoclonal antibody that specifically binds to CK-MB is an antibody that does not cause latex aggregation with CK-MB when it is a latex particle alone having a monoclonal antibody that specifically binds to CK-MB as a solid phase. A latex agglutination immunoreagent according to [2],
[4] Aggregation of latex particles by reacting a specimen with latex particles solid-phased with a monoclonal antibody that specifically binds to CK-MB and latex particles solid-phased with a monoclonal antibody that specifically binds to CK-BB A latex agglutination immunoassay method for CK-MB, wherein the average particle size of these particles is 0.23 μm to 0.32 μm,
[5] The monoclonal antibody that specifically binds to CK-BB is an antibody that does not cause latex aggregation with CK-BB when it is a latex particle alone with a solid phase of the monoclonal antibody that specifically binds to CK-BB. [4] latex agglutination immunoassay method,
[6] The monoclonal antibody that specifically binds to CK-MB is an antibody that does not cause latex aggregation with CK-MB when it is a latex particle alone on which a monoclonal antibody that specifically binds to CK-MB is solid-phased. The present invention relates to a latex agglutination immunoassay method [5].
本発明によれば、簡便に、生体成分中で共存するＣＫ−ＭＢ以外のアイソザイムであるＣＫ−ＭＭやＣＫ−ＢＢ等の夾雑物質からの干渉反応を軽減し、ＣＫ−ＭＢをより正確に測定できる、ラテックス凝集免疫試薬及び測定法を提供することができる。 According to the present invention, interference reaction from contaminants such as CK-MM and CK-BB, which are isozymes other than CK-MB coexisting in biological components, can be easily reduced, and CK-MB can be measured more accurately. A latex agglutination immunoreagent and assay can be provided.
本発明の試薬は、生体成分中のＣＫ−ＭＢを測定するラテックス凝集法による免疫測定試薬であって、用手法によっても測定可能であるが、ラテックス凝集法が測定可能な自動分析機に搭載される試薬として特に好適に用いられる。 The reagent of the present invention is an immunoassay reagent by latex agglutination method that measures CK-MB in biological components, and can be measured by the method used, but is mounted on an automatic analyzer capable of measuring latex agglutination method. It is particularly preferably used as a reagent.
本発明の試薬は、ラテックス凝集反応において、生体成分中のＣＫ−ＭＢの存在によりラテックス凝集が生じる２種以上の抗体の組み合わせを含めばよいが、具体的には、ＣＫ−ＭＢに特異的に結合するモノクローナル抗体と、ＣＫ−ＢＢに特異的に結合するモノクローナル抗体との組み合わせが挙げられる。本明細書において、ＣＫ−ＭＢに特異的に結合するとは、ＥＩＡ法やＣＬＩＡ法等のＢ／Ｆ分離工程を含むサンドイッチ法によるアッセイで、ＣＫ−ＭＢ以外のアイソザイムや他のタンパク質などに反応せず、ＣＫ−ＭＢに強い反応を示すことを意味する。また、ＣＫ−ＢＢに特異的に結合するとは、同アッセイでＣＫ−ＢＢ以外のアイソザイムや他のタンパク質などに反応せず、ＣＫ−ＢＢに強い反応を示すことを意味する。 The reagent of the present invention may contain a combination of two or more antibodies that cause latex aggregation due to the presence of CK-MB in a biological component in the latex agglutination reaction. The combination of the monoclonal antibody couple | bonded and the monoclonal antibody couple | bonded specifically with CK-BB is mentioned. In the present specification, specifically binding to CK-MB is a sandwich method including a B / F separation step such as EIA or CLIA, and reacts with isozymes other than CK-MB or other proteins. It means that it shows a strong response to CK-MB. In addition, specifically binding to CK-BB means that it does not react with isozymes other than CK-BB or other proteins in the same assay and shows a strong reaction with CK-BB.
ＣＫ−ＭＢ又はＣＫ−ＢＢは、生体内あるいは溶液中では２量体を形成していることが知られている。よって、ＣＫ−ＭＢ又はＣＫ−ＢＢに特異的な抗体（特に、ＣＫ−ＢＢに特異的な抗体）は、１種類であってもラテックス凝集を起こす場合がある。しかし、本発明では、それぞれ１種類の抗体では、ＣＫ−ＭＢ又はＣＫ−ＢＢの存在に応じてラテックス凝集を生じない抗体を組み合わせることが好ましい。すなわち、ＣＫ−ＭＢに特異的な抗体としては、その抗体１種類のみを固相化したラテックス粒子を単独で用いた場合に、ＣＫ−ＭＢとのラテックス凝集を起こさない抗体であることが好ましい。また、ＣＫ−ＢＢに特異的な抗体としては、その抗体１種類のみを固相化したラテックス粒子を単独で用いた場合に、ＣＫ−ＢＢとのラテックス凝集を起こさない抗体であることが好ましい。
更に、後述する実施例にも示すように、ＣＫ−ＭＢに特異的に結合するモノクローナル抗体とＣＫ−ＢＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を組み合わせることにより、ラテックス凝集反応を起こすことから、前記ＣＫ−ＢＢ抗体は、ＣＫ−ＭＢのＣＫ−Ｂサブユニットに反応することが推測される。このことから、本発明のＣＫ−ＢＢに特異的に結合する抗体は、少なくともラテックス凝集反応時に、ＣＫ−ＭＢのＣＫ−Ｂサブユニットに反応することが好ましい。
CK-MB or CK-BB is known to form a dimer in vivo or in solution. Therefore, even when one type of antibody specific to CK-MB or CK-BB (in particular, an antibody specific to CK-BB) is used, latex aggregation may occur. However, in the present invention, it is preferable to combine an antibody that does not cause latex aggregation depending on the presence of CK-MB or CK-BB, with each one type of antibody. That is, the antibody specific to CK-MB is preferably an antibody that does not cause latex aggregation with CK-MB when latex particles obtained by immobilizing only one type of antibody are used alone. In addition, the antibody specific for CK-BB is preferably an antibody that does not cause latex aggregation with CK-BB when latex particles obtained by immobilizing only one type of antibody are used alone.
Furthermore, as shown in the Examples described later, the latex agglutination reaction is caused by combining a monoclonal antibody that specifically binds to CK-MB and a monoclonal antibody that specifically binds to CK-BB. It is speculated that the -BB antibody reacts with the CK-B subunit of CK-MB. Therefore, it is preferable that the antibody that specifically binds to CK-BB of the present invention reacts with the CK-B subunit of CK-MB at least during the latex agglutination reaction.
本発明で使用するＣＫ−ＭＢに特異的に結合するモノクローナル抗体と、ＣＫ−ＢＢに特異的に結合するモノクローナル抗体の作製は、例えば、公知の細胞融合法で作製されたハイブリドーマによるモノクローナル抗体産生法により得ることができる。抗体産生細胞としては、ヒトを除く動物、例えば、マウス・ラット・モルモット等から選択することができる。すなわち、ＣＫ−ＭＢやＣＫ−ＢＢを抗原として使用し、次いで、該ＣＫ−ＭＢや該ＣＫ−ＢＢを用いてスクリーニングを実施することによって、本発明で使用できるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを調製することができ、そのハイブリドーマから目的のモノクローナル抗体を調製することができる。ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体の調製は、定法、例えば、続生化学実験講座（日本生化学会編）又は免疫生化学研究法（日本生化学会編）に記載の方法に従って行うことができる。また、ＣＫ−ＭＢ特異的に結合する抗体やＣＫ−ＢＢ特異的に結合する抗体は、ハイブリドーマから得られた血清や抗体を、ＥＩＡ法やＣＬＩＡ法等で他のアイソザイムや他のタンパク質などに反応せず、それぞれＣＫ−ＭＢあるいはＣＫ−ＢＢに強い反応を示すことを指標としてスクリーニングすることで得ることができる。 Production of a monoclonal antibody that specifically binds to CK-MB and a monoclonal antibody that specifically binds to CK-BB used in the present invention is, for example, a method for producing a monoclonal antibody using a hybridoma produced by a known cell fusion method. Can be obtained. The antibody-producing cells can be selected from animals other than humans, such as mice, rats, guinea pigs and the like. That is, a hybridoma that produces a monoclonal antibody that can be used in the present invention is prepared by using CK-MB or CK-BB as an antigen and then performing screening using the CK-MB or CK-BB. The target monoclonal antibody can be prepared from the hybridoma. The hybridoma and the monoclonal antibody can be prepared according to a conventional method, for example, a method described in a follow-up biochemistry experiment course (edited by the Japanese Biochemical Society) or an immunobiochemical research method (edited by the Japanese Biochemical Society). In addition, an antibody that specifically binds to CK-MB or an antibody that specifically binds to CK-BB reacts with serum or antibody obtained from a hybridoma to other isozymes or other proteins by the EIA method or CLIA method. Without screening, it can be obtained by screening using as an index the strong reaction to CK-MB or CK-BB, respectively.
本発明で使用可能なモノクローナル抗体には、抗体フラグメントが含まれる。前記抗体フラグメントは、所望のモノクローナル抗体のフラグメントであって、しかも、もとのモノクローナル抗体と同じ反応性を有する抗体フラグメントである。本発明で用いることのできる抗体フラグメントには、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖ等が含まれる。これらのフラグメントは、例えば、モノクローナル抗体を常法によりタンパク質分解酵素によって消化し、続いて、タンパク質の分離・精製の常法に従って得ることができる。これらは、そのままラテックス粒子に固相して使用することができるが、Ｆａｂ’フラグメントやＦ（ａｂ’）２フラグメントに調製したものをラテックス粒子に固相することができる。抗体のＦｃフラグメントに対する非特異反応を回避する観点から、Ｆａｂ’やＦ（ａｂ’）２がより好ましい。 Monoclonal antibodies that can be used in the present invention include antibody fragments. The antibody fragment is a fragment of a desired monoclonal antibody and has the same reactivity as the original monoclonal antibody. Antibody fragments that can be used in the present invention include, for example, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , or Fv. These fragments can be obtained, for example, by digesting a monoclonal antibody with a proteolytic enzyme according to a conventional method, and subsequently following a conventional method for protein separation and purification. These can be used as they are solid-phased on latex particles, but those prepared as Fab ′ fragments and F (ab ′) 2 fragments can be solid-phased on latex particles. Fab ′ and F (ab ′) 2 are more preferable from the viewpoint of avoiding a nonspecific reaction of the antibody against the Fc fragment.
また、本発明で使用するＣＫ−ＭＢに特異的に結合する抗体は、Ｒｏｃｈｅ社やＢｉｏｐａｃｉｆｉｃ社、Ｆｉｚｇｅｒａｌｄ社、Ｍｅｒｉｄｉａｎ社、Ｍｅｄｉｘ社、Ｔｒｉｎａ社、Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ社などから購入することができ、ＣＫ−ＢＢに特異的に結合するモノクローナル抗体も、Ｂｉｏｐａｃｉｆｉｃ社、Ｆｉｚｇｅｒａｌｄ社、Ｍｅｒｉｄｉａｎ社、Ｄａｋｏ社などから購入することができる。当業者であれば、本発明で用いることのできるモノクローナル抗体に関する上述の説明に従って、あるいは、後述の実施例に記載の具体的手順に従って、これらの抗体が、本発明に利用可能か容易に決定することができる。 Further, an antibody that specifically binds to CK-MB used in the present invention can be purchased from Roche, Biopacific, Fizzgerald, Meridian, Medix, Trina, Biodesign, etc., and CK-BB Monoclonal antibodies that specifically bind to can also be purchased from Biopacific, Fizzgerald, Meridian, Dako, and the like. A person skilled in the art can easily determine whether these antibodies can be used in the present invention according to the above-described explanation regarding the monoclonal antibodies that can be used in the present invention, or according to the specific procedures described in the Examples below. be able to.
本発明に使用するラテックス粒子は、平均粒子径が０．２３μｍ〜０．３２μｍであればよく、１種類のラテックス粒子のみを使用してもよいし、複数のラテックス粒子を使用してもよい。例えば、粒子径の異なるラテックス粒子を組み合わせて使用することができる。ラテックス粒子は単一粒径で製造することは実質的に困難であることから、粒子全体の平均粒子径として規定される。従って、本発明では平均粒子径を０．２３μｍ〜０．３２μｍと特定するが、当該範囲に含まれないラテックス粒子を含む場合であっても、本発明に該当する場合がある。例えば、平均粒子径が０．２３μｍ〜０．３２μｍのラテックス粒子が、重量パーセント換算で８５％以上含まれていれば良い。なお、この平均粒子径は、公知の方法で測定することが可能であり、例えば、透過型電子顕微鏡装置を用いた画像解析によりより算出される。 The latex particles used in the present invention may have an average particle diameter of 0.23 μm to 0.32 μm, and only one type of latex particle or a plurality of latex particles may be used. For example, latex particles having different particle diameters can be used in combination. Since latex particles are substantially difficult to produce with a single particle size, they are defined as the average particle size of the entire particle. Therefore, although the average particle diameter is specified as 0.23 μm to 0.32 μm in the present invention, even when latex particles not included in the range are included, the present invention may fall under the present invention. For example, 85% or more of latex particles having an average particle diameter of 0.23 μm to 0.32 μm may be included in terms of weight percent. The average particle diameter can be measured by a known method, and is calculated by, for example, image analysis using a transmission electron microscope apparatus.
また、本発明に使用するラテックス粒子の平均粒子系の下限は０．２３μｍ、上限は０．３２μｍである。当該範囲内であれば、ＣＫ−ＭＭやＣＫ−ＢＢによる干渉を軽減してＣＫ−ＭＢを検出することが可能となる。なお、平均粒子径が０．２３μｍ未満では、ＣＫ−ＭＢによる特異的な凝集を示すシグナルが小さく、検出感度が悪化することがあり、ＣＫ−ＭＢの高感度な測定を達成できない場合がある。一方、０．３２μｍを超えると、共存するＣＫ−ＢＢの影響が生じやすい。 Further, the lower limit of the average particle system of latex particles used in the present invention is 0.23 μm, and the upper limit is 0.32 μm. Within this range, it is possible to detect CK-MB while reducing interference caused by CK-MM and CK-BB. When the average particle size is less than 0.23 μm, the signal indicating specific aggregation by CK-MB is small and the detection sensitivity may be deteriorated, and high-sensitivity measurement of CK-MB may not be achieved. On the other hand, when it exceeds 0.32 μm, the coexistence of CK-BB tends to occur.
本発明に係るラテックス粒子としては、通常この分野で用いられているものであれば特に限定はされないが、例えば、スチレン、塩化ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル等のビニル系モノマーを重合させてなる単一重合体（例えば、ポリスチレン、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体等）からなる粒子、ブタジエン系共重合体（例えば、スチレン−ブタジエン共重合体、メチルメタクリレート−ブタジエン共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン共重合体等）からなる粒子、それ以外の共重合体（例えば、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸エステル共重合体、アクリル酸エステル共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体等）からなる粒子を挙げられる。官能基としてカルボキシル基、１級アミノ基、カルバモイル基（−ＣＯＮＨ２）、水酸基、アルデヒド基等を有し、かつ、基体が上記有機系微粒子からなる粒子を挙げられる。 The latex particles according to the present invention are not particularly limited as long as they are usually used in this field. For example, vinyl particles such as styrene, vinyl chloride, acrylonitrile, vinyl acetate, acrylic acid ester, and methacrylic acid ester are used. Particles consisting of a single polymer obtained by polymerizing monomers (eg, polystyrene, methacrylic acid polymer, acrylic acid polymer, etc.), butadiene copolymers (eg, styrene-butadiene copolymer, methyl methacrylate-butadiene copolymer) Particles made of polymer, acrylonitrile-butadiene copolymer, etc., and other copolymers (for example, styrene-styrene sulfonate copolymer, methacrylate ester copolymer, acrylate ester copolymer, vinyl chloride- Acrylic ester copolymer etc.) That. Examples thereof include particles having a carboxyl group, a primary amino group, a carbamoyl group (—CONH 2 ), a hydroxyl group, an aldehyde group, etc. as a functional group, and a substrate composed of the organic fine particles.
本発明におけるラテックス粒子への抗体固相の第１の態様としては、抗体の種類ごとに固相ラテックス液を調製し、次いで複数の前記固相ラテックス液を混合して試薬を調製することが挙げられる。ラテックス液の混合比は、特に限定しない。
また、本発明におけるラテックス粒子への抗体固相の第２の態様としては、ラテックス粒子に対して、２種以上の抗体を同時に感作して試薬を調製することが挙げられる。ラテックス液の混合比は、特に限定しない。
好適な試薬の調製が行いやすいこと等から、第１の態様のように、ＣＫ−ＭＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を固相した第１のラテックス粒子、ＣＫ−ＢＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を固相した第２のラテックス粒子として、抗体の種類ごとに固相ラテックス液を調製する方が好ましい。
In the first aspect of the antibody solid phase to latex particles in the present invention, a solid phase latex solution is prepared for each type of antibody, and then a plurality of the solid phase latex solutions are mixed to prepare a reagent. It is done. The mixing ratio of the latex liquid is not particularly limited.
In addition, as a second embodiment of the antibody solid phase to latex particles in the present invention, it is possible to prepare a reagent by simultaneously sensitizing two or more kinds of antibodies to latex particles. The mixing ratio of the latex liquid is not particularly limited.
Since it is easy to prepare a suitable reagent, etc., as in the first embodiment, it specifically binds to the first latex particle, CK-BB, on which a monoclonal antibody that specifically binds to CK-MB is solid-phased. It is preferable to prepare a solid-phase latex solution for each type of antibody as the second latex particles on which the monoclonal antibody is solid-phased.
ラテックス粒子に抗体を固相する方法としては、公知の方法に準じて行えばよく、例えば、抗体とラテックス粒子とを緩衝液中で懸濁させ、２５℃で１時間反応させた後、遠心分離、ブロッキング処理等、通常この分野で行われる処理により得ることができる。また、抗体とラテックスとを化学結合により固相する方法や、ビオチン−アビジン反応により抗体を固相する方法も選択できる。 The antibody may be solid-phased on the latex particles in accordance with a known method. For example, the antibody and latex particles are suspended in a buffer, reacted at 25 ° C. for 1 hour, and then centrifuged. It can be obtained by a process usually performed in this field, such as a blocking process. In addition, a method in which the antibody and latex are solid-phased by a chemical bond and a method in which the antibody is solid-phased by a biotin-avidin reaction can be selected.
本発明の試薬は、１試薬系であってもよいし、２試薬系であってもよい。本発明の試薬が１試薬系である場合は、検体に前記抗体を固相したラテックス粒子懸濁液を添加し、抗原抗体反応を生じさせることにより、検体中のＣＫ−ＭＢを測定することができる。本発明の試薬が２試薬系である場合には、緩衝液成分を主体とした第１試薬を検体に添加した後、更に前記抗体を固相したラテックス粒子を含む第２試薬を添加することで、抗原抗体反応を生じさせ、検体中のＣＫ−ＭＢを測定することができる。 The reagent of the present invention may be a one-reagent system or a two-reagent system. When the reagent of the present invention is a one-reagent system, a latex particle suspension in which the antibody is solid-phased is added to a specimen, and an antigen-antibody reaction is caused to measure CK-MB in the specimen. it can. When the reagent of the present invention is a two-reagent system, a first reagent mainly composed of a buffer component is added to a sample, and then a second reagent containing latex particles having the antibody as a solid phase is further added. Then, an antigen-antibody reaction can be caused and CK-MB in the sample can be measured.
ラテックスの凝集の度合いは、例えば吸光度を用いて測定し、予め求めておいた標準品の検量線からその濃度を求めることにより、検体中のＣＫ−ＭＢ濃度を定量することができる。なお、吸光度の測定波長は、通常は３４０ｎｍ〜１０００ｎｍ、好ましくは５００ｎｍ〜９００ｎｍで測定すればよい。ラテックス凝集反応を測光する時間は、ラテックス凝集反応が生じている時間を時間当たりの変化速度、あるいは一定時間の変化量によって測光することができる。例えば、吸光度を測定する場合、ラテックス凝集反応が始まってから３０秒後から５分後の時間当たりの吸光度変化速度、あるいは一定時間の吸光度変化量によって測光することができる。反応温度は１０〜５０℃であることが好ましく、２０〜４０℃であることがより好ましい。反応時間は適宜決定することができ、例えば汎用自動分析機では１０〜１５分間の反応時間で測定することができる。なお、当業者であれば、光学機器あるいは汎用自動分析機を用いた分析において、公知の方法に従って、反応温度、反応時間、測定波長、測定時間、試薬構成、ラテックス濃度、ラテックス固定化するモノクローナル抗体濃度、各種添加剤濃度を適宜決定することができる。 The degree of latex aggregation can be quantified by measuring the concentration of latex using, for example, absorbance and determining the concentration from a calibration curve of a standard product obtained in advance. The absorbance measurement wavelength is usually 340 nm to 1000 nm, preferably 500 nm to 900 nm. The time during which the latex agglutination reaction is measured can be measured by the rate of change per hour or the amount of change over a certain period of time. For example, when measuring the absorbance, it can be measured by the absorbance change rate per hour from 30 seconds to 5 minutes after the start of the latex agglutination reaction, or the absorbance change amount for a certain time. The reaction temperature is preferably 10 to 50 ° C, more preferably 20 to 40 ° C. The reaction time can be appropriately determined. For example, in a general-purpose automatic analyzer, the reaction time can be measured with a reaction time of 10 to 15 minutes. A person skilled in the art can determine the reaction temperature, reaction time, measurement wavelength, measurement time, reagent configuration, latex concentration, and latex antibody immobilized monoclonal antibody according to a known method in analysis using an optical instrument or a general-purpose automatic analyzer. The concentration and various additive concentrations can be determined as appropriate.
本発明に用いられるラテックス粒子の濃度は、ラテックス凝集法による免疫学的測定試薬に適用できる濃度であれば特に限定されるものではないが、ＣＫ−ＭＢを測定するために必要な反応時のラテックスの濃度は０．００５ｗ／ｖ％〜０．２ｗ／ｖ％が好ましく、０．０１ｗ／ｖ％〜０．１ｗ／ｖ％であることがより好ましい。 The concentration of latex particles used in the present invention is not particularly limited as long as it is a concentration that can be applied to an immunological measurement reagent by latex agglutination method, but latex at the time of reaction necessary for measuring CK-MB The concentration of is preferably 0.005 w / v% to 0.2 w / v%, and more preferably 0.01 w / v% to 0.1 w / v%.
本発明の試薬に適用することのできる被検試料は、ＣＫ−ＭＢを含有する可能性のある被検試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、生体試料、より具体的には、血清、血漿、尿、又は体液などを挙げることができる。好ましくは、血清、血漿が使用できる。 The test sample that can be applied to the reagent of the present invention is not particularly limited as long as it is a test sample that may contain CK-MB. For example, a biological sample, more specifically, , Serum, plasma, urine, or body fluid. Preferably, serum and plasma can be used.
本発明の試薬は、モノクローナル抗体を固定化したラテックス粒子以外にも、ラテックス凝集法による免疫学的測定試薬に添加可能な添加剤、例えば、緩衝液、凝集促進剤、非特異反応抑制剤などを更に含有することができる。 The reagent of the present invention includes additives that can be added to an immunological measurement reagent by latex agglutination method, such as a buffer solution, an aggregation accelerator, a nonspecific reaction inhibitor, in addition to latex particles to which a monoclonal antibody is immobilized. Furthermore, it can contain.
前記緩衝液としては、ｐＨ５．５〜８．５に緩衝能を有する緩衝液が好ましく、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、又はグッド緩衝液などが好適に使用され、反応時の緩衝液濃度は１０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、２０〜２００ｍｍｏｌ／Ｌであることがより好まししい。緩衝液濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である場合、ラテックス粒子が自己凝集を起こしたり、非特異的な反応を起こしやすい。また、緩衝液濃度が５００ｍｍｏｌ／Ｌ以上の場合、ラテックス凝集生じにくい。反応時の緩衝液のｐＨは５．５〜８．５であることが好ましい。ｐＨがこの範囲外であると、ラテックス粒子が自己凝集を起こしたり、ラテックス凝集反応を起こしづらかったり、非特異的な反応を起こしやすい。 As the buffer solution, a buffer solution having a buffer capacity of pH 5.5 to 8.5 is preferable, Tris buffer solution, phosphate buffer solution, Good buffer solution or the like is preferably used, and the buffer solution concentration at the time of reaction is It is preferably 10 to 500 mmol / L, and more preferably 20 to 200 mmol / L. When the buffer solution concentration is 10 mmol / L or less, latex particles tend to cause self-aggregation or nonspecific reaction. Further, when the buffer solution concentration is 500 mmol / L or more, latex aggregation hardly occurs. The pH of the buffer during the reaction is preferably 5.5 to 8.5. When the pH is outside this range, the latex particles easily self-aggregate, it is difficult to cause latex agglutination reaction, or non-specific reaction tends to occur.
本発明の試薬に添加可能な凝集促進剤としては、水溶性高分子やタンパク質が好適に用いられる。例えば、デキストランやデキストラン硫酸、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドンなどの水溶性高分子や、ウシ血清アルブミンなどのアルブミン類、γ−グロブリンなどのグロブリン類が挙げられる。 As aggregation promoters that can be added to the reagent of the present invention, water-soluble polymers and proteins are preferably used. Examples include water-soluble polymers such as dextran, dextran sulfate, polyvinyl alcohol, polyethylene glycol, and polyvinylpyrrolidone, albumins such as bovine serum albumin, and globulins such as γ-globulin.
本発明の試薬に添加可能な非特異反応抑制剤としては、非特異反応の原因物質に対する抗体やレセプター、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液又はグッド緩衝液などの緩衝液類、ＥＤＴＡ、ＣｙＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＥＧＴＡ、ＮＴＡ、ＮＴＰなどのキレート剤、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムなどの塩類、脂肪酸ジエタノールアミド、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、脂肪酸ソルビタンエステル、アルキルポリグルコシド、アルキルモノグリセリルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド、アルキルグリコシドなどの非イオン性界面活性剤が挙げられる。 Nonspecific reaction inhibitors that can be added to the reagent of the present invention include antibodies and receptors for substances causing nonspecific reactions, Tris buffer, phosphate buffer, glycine buffer, borate buffer, citrate buffer, Buffers such as acetate buffer or Good buffer, chelating agents such as EDTA, CyDTA, DTPA, EGTA, NTA, NTP, sodium chloride, potassium chloride, sodium sulfate, calcium sulfate, magnesium sulfate, calcium carbonate, sodium carbonate, etc. Salts, fatty acid diethanolamide, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene alkyl phenyl ether, fatty acid sorbitan ester, alkyl polyglucoside, alkyl monoglyceryl ether, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, fatty acid alkanolamide, Nonionic surfactants such as Rukirugurikoshido the like.
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples, but these do not limit the scope of the present invention.
《実施例１〜３及び比較例１〜２》
ＣＫ−ＭＢ測定試薬は、緩衝液成分を主体とした第１試薬と、ラテックス粒子を主体とした第２試薬とからなる２試薬系として構成し、自動分析機による評価を実施した。
<< Examples 1-3 and Comparative Examples 1-2 >>
The CK-MB measurement reagent was configured as a two-reagent system consisting of a first reagent mainly composed of a buffer component and a second reagent mainly composed of latex particles, and evaluation was performed by an automatic analyzer.
（検体）
ＣＫ−ＭＢ、ＣＫ−ＢＢ、ＣＫ−ＭＭは、ヒトリコンビナントタンパク質としてオリエンタル酵母社から購入し、検体希釈液〔１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）、２ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ２Ｎａ、２ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、１７５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ〕にて、それぞれ、最終濃度１０Ｕ／Ｌ、１００Ｕ／Ｌ、１０００Ｕ／Ｌに調製した。
(Sample)
CK-MB, CK-BB, and CK-MM were purchased from Oriental Yeast Co. as human recombinant proteins, and diluted with a sample diluent [10 mmol / L Tris (pH 7.0), 2 mmol / L EDTA 2 Na, 2 mmol / L DTT ( Dithiothreitol) and 175 mmol / L NaCl] were prepared at final concentrations of 10 U / L, 100 U / L, and 1000 U / L, respectively.
（第１試薬の調製）
２５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．５）に、０．３ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、０．２４％非イオン性界面活性剤、０．１％アルブミンを溶解させた水溶液を調製し、第１試薬とした。
(Preparation of the first reagent)
Prepare an aqueous solution in which 0.3 mol / L sodium chloride, 5 mmol / L EDTA, 0.24% nonionic surfactant and 0.1% albumin are dissolved in 25 mmol / L Tris buffer (pH 7.5). The first reagent was used.
（第２試薬の調製）
平均粒子径０．２０μｍのラテックス粒子を使用した系を比較例１、平均粒子径０．２３μｍのラテックス粒子を使用した系を実施例１、平均粒子径０．３０μｍのラテックス粒子を使用した系を実施例２、平均粒子径０．３２μｍのラテックス粒子を使用した系を実施例３、平均粒子径０．４３μｍのラテックス粒子を使用した系を比較例２とした。なお、いずれのラテックス粒子も、表面にカルボキシル基が導入されたポリスチレンラテックス粒子（ＪＳＲ株式会社製）である。
(Preparation of second reagent)
A system using latex particles having an average particle diameter of 0.20 μm is Comparative Example 1, a system using latex particles having an average particle diameter of 0.23 μm is Example 1, and a system using latex particles having an average particle diameter of 0.30 μm is used. Example 2 is a system using latex particles having an average particle diameter of 0.32 μm, and Example 3 is a system using latex particles having an average particle diameter of 0.43 μm. Each latex particle is a polystyrene latex particle (manufactured by JSR Corporation) having a carboxyl group introduced on its surface.
抗ＣＫ−ＭＢ抗体としては、ヒト由来ＣＫ−ＭＢアイソザイムをマウスに免疫し、定法に従って作製され、ヒト由来ＣＫ−ＭＢを抗原として用いるＥＩＡ法により、ＣＫ−ＢＢアイソザイム及びＣＫ−ＭＭアイソザイムとは反応しないＣＫ−ＭＢ特異的な抗体であることが確認されたものを使用した。前記の各ポリスチレンラテックス粒子（実施例１〜３及び比較例１〜２）を、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．１）に０．１ｗ／ｖ％となるように分散させ、塩酸−１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを添加し、２５℃条件下で３分間反応させた後、ペプシン消化でＦ（ａｂ’）２フラグメント化した前記抗ＣＫ−ＭＢ抗体を添加し、更に１時間反応させた。１９０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を廃棄した後、ラテックス固形分を０．０５％アジ化ナトリウム溶液にて分散させ、抗ＣＫ−ＭＢ抗体結合ラテックス液１とした。 As an anti-CK-MB antibody, a mouse-derived CK-MB isozyme is immunized to a mouse, prepared according to a conventional method, and reacted with CK-BB and CK-MM isozymes by EIA method using human-derived CK-MB as an antigen. What was confirmed to be an antibody specific to CK-MB was not used. Each of the polystyrene latex particles (Examples 1 to 3 and Comparative Examples 1 to 2) was dispersed in a 10 mmol / L MOPS buffer (pH 7.1) so as to be 0.1 w / v%, and hydrochloric acid-1- Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide was added and reacted at 25 ° C. for 3 minutes, and then the anti-CK-MB antibody that had been F (ab ′) 2 fragmented by pepsin digestion was added. The reaction was further continued for 1 hour. After centrifugation at 19000 rpm for 20 minutes and discarding the supernatant, the latex solids were dispersed in 0.05% sodium azide solution to obtain anti-CK-MB antibody-bound latex solution 1.
一方、抗ＣＫ−ＢＢ抗体としては、ヒト由来ＣＫ−ＢＢアイソザイムをマウスに免疫し、定法に従って作製され、ヒト由来ＣＫ−ＢＢを抗原として用いるＥＩＡ法により、ＣＫ−ＭＢアイソザイム及びＣＫ−ＭＭアイソザイムとは反応しないＣＫ−ＢＢ特異的な抗体であることが確認されたものを使用した。同様に、前記の各ポリスチレンラテックス（実施例１〜３及び比較例１〜２）を、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．１）に０．１ｗ／ｖ％となるように分散させ、塩酸−１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを添加し、２５℃条件下で３分間反応させた後、ペプシン消化したＦ（ａｂ’）２フラグメント化した前記抗ＣＫ−ＢＢ抗体を添加し、更に１時間反応させた。１９０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を廃棄した後、ラテックス固形分を０．０５％アジ化ナトリウム水溶液にて分散させ、抗ＣＫ−ＢＢ抗体結合ラテックス液２とした。 On the other hand, as an anti-CK-BB antibody, a mouse-derived CK-BB isozyme is immunized to a mouse, and prepared according to a conventional method. Used was confirmed to be a non-reactive CK-BB-specific antibody. Similarly, each of the polystyrene latexes (Examples 1 to 3 and Comparative Examples 1 and 2) was dispersed in a 10 mmol / L MOPS buffer (pH 7.1) so that the concentration was 0.1 w / v%. 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide was added and reacted at 25 ° C. for 3 minutes, and then the anti-CK-BB antibody fragmented with pepsin-digested F (ab ′) 2 was added. And further reacted for 1 hour. After centrifugation at 19000 rpm for 20 minutes and discarding the supernatant, the latex solid was dispersed in 0.05% aqueous sodium azide solution to obtain anti-CK-BB antibody-bound latex solution 2.
前記ラテックス液１及び２において、抗体感作時の各成分の濃度は、０．１ｗ／ｖ％ ポリスチレンラテックス１ｍＬ当たり、塩酸−１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド１１．２μｇ、抗ＣＫ−ＭＢ抗体または抗ＣＫ−ＢＢ抗体１０μｇとした。
抗ＣＫ−ＭＢ抗体結合ラテックス液１と、抗ＣＫ−ＢＢ抗体結合ラテックス液２とを等量で混合し、第２試薬とした。
In the latex solutions 1 and 2, the concentration of each component during antibody sensitization was 11.2 μg of hydrochloric acid-1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide per 1 mL of 0.1 w / v% polystyrene latex, Anti-CK-MB antibody or anti-CK-BB antibody was 10 μg.
Anti-CK-MB antibody-bound latex solution 1 and anti-CK-BB antibody-bound latex solution 2 were mixed in equal amounts to obtain a second reagent.
（自動分析機による測定）
汎用自動分析機 日立７１７０Ｓ形日立自動分析装置（日立ハイテクノロジーズ製）を用いてＣＫ−ＭＢ測定試薬の評価を行った。測定条件は、検体１１μＬに第１試薬９０μＬを添加混合させ、３７℃で５分間保持した後、第２試薬９０μＬを添加混合させ、更に５分間保持した。第２試薬添加後３０秒後から５分後の５７０ｎｍにおける吸光度変化量を求めた。実施例１〜３及び比較例１〜２を用いた測定結果（各検体の吸光度変化量）を表１に示す。
(Measurement by automatic analyzer)
The CK-MB measurement reagent was evaluated using a general-purpose automatic analyzer Hitachi 7170S type Hitachi automatic analyzer (manufactured by Hitachi High-Technologies). As measurement conditions, 90 μL of the first reagent was added to and mixed with 11 μL of the sample and held at 37 ° C. for 5 minutes, and then 90 μL of the second reagent was added and mixed, and then held for 5 minutes. The amount of change in absorbance at 570 nm after 5 seconds after the addition of the second reagent was determined. Table 1 shows measurement results (absorbance change amount of each specimen) using Examples 1 to 3 and Comparative Examples 1 and 2.
表１に示すように、ＣＫ−ＢＢ検体は、ラテックス粒子の平均粒子径が大きい系で凝集反応が生じた。平均粒子径が小さいとＣＫ−ＢＢによる凝集の程度は低かった。特に、実施例１においては、ＣＫ−ＢＢに対する凝集反応が低く良好であった。また、実施例１は、比較例１と比較して、ＣＫ−ＭＢとの反応性も高い点で良好である。ＣＫ−ＭＢは、生体成分中に１０Ｕ／Ｌ以上あると臨床意義が高いことが知られている。実施例１でのＣＫ−ＢＢ １００Ｕ／Ｌ検体の数値は、ＣＫ−ＭＢ １０Ｕ／Ｌ検体での数値より低値であり、ＣＫ−ＢＢによる干渉の影響を回避した試薬組成であると考えられる。 As shown in Table 1, the CK-BB specimen caused an aggregation reaction in a system in which the average particle diameter of latex particles was large. When the average particle size was small, the degree of aggregation by CK-BB was low. In particular, in Example 1, the aggregation reaction to CK-BB was low and good. Moreover, Example 1 is favorable in that the reactivity with CK-MB is higher than that of Comparative Example 1. It is known that CK-MB has high clinical significance when it is 10 U / L or more in a biological component. The numerical value of the CK-BB 100 U / L sample in Example 1 is lower than the numerical value of the CK-MB 10 U / L sample, and is considered to be a reagent composition that avoids the influence of interference by CK-BB.
また、実施例２、実施例３でのＣＫ−ＢＢ １００Ｕ／Ｌ検体の反応性は、実施例１より若干高いものの、ＣＫ−ＭＢ １０Ｕ／Ｌ、ＣＫ−ＭＢ １００Ｕ／Ｌ、ＣＫ−ＭＢ １０００Ｕ／Ｌ共に高い反応性が得られた。比較例２ではＣＫ−ＢＢ １００Ｕ／Ｌが干渉反応を示し、ＣＫ−ＭＢ １０００Ｕ／Ｌでも高い反応が得られなかった。
一方、ＣＫ−ＭＭについては、ＣＫ−ＭＢ抗体とＣＫ−ＢＢ抗体との組み合わせである本実施例では、どの条件でも干渉反応を認めないことを確認した。
以上より、実施例１〜３においては、ＣＫ−ＢＢ及びＣＫ−ＭＭによる干渉反応が低減され、ＣＫ−ＭＢの高い反応性が得られる条件であることが明らかとなった。
Moreover, although the reactivity of the CK-BB 100U / L sample in Example 2 and Example 3 is slightly higher than Example 1, CK-MB 10U / L, CK-MB 100U / L, CK-MB 1000U / High reactivity was obtained for both L. In Comparative Example 2, CK-BB 100 U / L showed an interference reaction, and even CK-MB 1000 U / L did not give a high reaction.
On the other hand, for CK-MM, in this example, which is a combination of CK-MB antibody and CK-BB antibody, it was confirmed that no interference reaction was observed under any conditions.
As mentioned above, in Examples 1-3, it became clear that the interference reaction by CK-BB and CK-MM is reduced, and it is the conditions from which the high reactivity of CK-MB is obtained.
《比較例３及び４》
（１種類のモノクローナル抗体（抗ＣＫ−ＭＢ抗体又は抗ＣＫ−ＢＢ抗体）を使用したラテックス凝集反応の検討）
以下の点を除き、先述と同様な２試薬系として構成し、評価を実施した。すなわち、表面にカルボキシル基が導入された平均粒子径０．３２μｍのポリスチレンラテックス粒子（ＪＳＲ株式会社製）を使用し、抗ＣＫ−ＭＢ抗体結合ラテックス液１と、抗ＣＫ−ＢＢ抗体結合ラテックス液２とを作製した。抗ＣＫ−ＭＢ抗体結合ラテックス液１のみで調製した第２試薬を用いた系を比較例３、抗ＣＫ−ＢＢ抗体結合ラテックス液２のみで調製した第２試薬を用いた系を比較例４とした。
比較例３〜４を用いた測定結果（各検体の吸光度変化量）を表２に示す。
<< Comparative Examples 3 and 4 >>
(Examination of latex agglutination using one type of monoclonal antibody (anti-CK-MB antibody or anti-CK-BB antibody))
Except for the following points, a two-reagent system similar to the above was configured and evaluated. That is, polystyrene latex particles (manufactured by JSR Corporation) having an average particle diameter of 0.32 μm having a carboxyl group introduced on the surface are used, and anti-CK-MB antibody-binding latex solution 1 and anti-CK-BB antibody-binding latex solution 2 And made. A system using the second reagent prepared only with the anti-CK-MB antibody-binding latex solution 1 is Comparative Example 3, and a system using the second reagent prepared only with the anti-CK-BB antibody-binding latex solution 2 is Comparative Example 4 and did.
Table 2 shows the measurement results using Comparative Examples 3 to 4 (absorbance change amount of each specimen).
表２に示すように、ＣＫ−ＭＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を結合させたラテックス粒子単独（比較例３）や、ＣＫ−ＢＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を結合させたラテックス粒子単独（比較例４）でも、ＣＫ−ＭＢだけではなく、ＣＫ−ＢＢ、ＣＫ−ＭＭ共に反応性を示さなかった。特に、ＣＫ−ＭＢ及びＣＫ−ＢＢは、生体内あるいは液体中で２量体を形成することが知られている。よって、ＣＫ−ＭＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を結合させたラテックス粒子単独や、ＣＫ−ＢＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を結合させたラテックス粒子単独でも、ラテックス凝集を生じる可能性があった。本検討により、ＣＫ−ＭＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を結合させたラテックス粒子単独や、ＣＫ−ＢＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を結合させたラテックス粒子単独では、ラテックス凝集を生じない抗体を使用し、それぞれの抗体を平均粒子径が０．２３μｍ〜０．３２μｍのラテックス粒子に固相したラテックス粒子を含む試薬構成により、簡便且つ正確に、生体成分中のＣＫ−ＭＢを測定するラテックス凝集免疫試薬及び測定方法を提供できることが示された。 As shown in Table 2, latex particles alone (comparative example 3) to which a monoclonal antibody specifically binding to CK-MB was bound, or latex particles alone to which a monoclonal antibody specifically bound to CK-BB was bound Even in (Comparative Example 4), not only CK-MB but also CK-BB and CK-MM showed no reactivity. In particular, CK-MB and CK-BB are known to form dimers in vivo or in liquid. Therefore, latex particles alone with a monoclonal antibody that specifically binds to CK-MB or latex particles alone with a monoclonal antibody that specifically binds to CK-BB may cause latex aggregation. It was. As a result of this study, an antibody that does not cause latex aggregation with a latex particle alone bound with a monoclonal antibody that specifically binds CK-MB, or with a latex particle alone bound with a monoclonal antibody that specifically binds CK-BB. Latex for measuring CK-MB in biological components easily and accurately by using a reagent composition comprising latex particles in which each antibody is solid-phased on latex particles having an average particle size of 0.23 μm to 0.32 μm It has been shown that an aggregated immunoreagent and measurement method can be provided.
本発明は、臨床検査、特には心筋逸脱マーカーとして心筋梗塞の診断等に有用なＣＫ−ＭＢの測定に利用することができる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can be used for the measurement of CK-MB, which is useful for clinical examinations, particularly for diagnosis of myocardial infarction as a myocardial deviation marker.
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