JP2013192526A - タンパク質溶液、このタンパク質溶液のプロテアーゼ活性の回復方法及びこのタンパク質溶液を含有する洗剤組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】貯蔵時のタンパク質溶液のプロテアーゼ活性が十分抑制でき、保存前と長期間保存後とを比較して、活性の低下が少ないタンパク質溶液、このタンパク質溶液のプロテアーゼ活性の回復方法及びこのタンパク質溶液を含有する洗剤組成物を提供することを目的とする。
【解決手段】プロテアーゼ（Ａ）、下記プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）及び溶剤（Ｃ）を含有するタンパク質溶液（Ｘ）。
プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）：クランＩＧに分類されるタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤であり、プロテアーゼ（Ａ）の活性の最適温度、最適ｐＨ及び最適基質濃度の条件下でＨｅｎｄｅｒｓｏｎプロットにより求めた（Ａ）に対する阻害定数Ｋｉが１ｐＭ〜１０μＭであるプロテアーゼ活性阻害剤。
【選択図】図４

Description

本発明は、タンパク質溶液、このタンパク質溶液のプロテアーゼ活性の回復方法及びこのタンパク質溶液を含有する洗剤組成物に関する。

プロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解を触媒する酵素群の総称で、微生物、動物及び植物中に広く存在が知られている。その応用分野としては、衣料用洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤、コンタクトレンズ用洗浄剤、浴用剤、角質除去用化粧料、食品の改質剤（製パン、肉の軟化、水産加工等）、ビールの清澄剤、皮革なめし剤、写真フィルムのゼラチン除去剤、消化助剤及び消炎剤等があり、多くの分野で盛んに利用されている。
しかしながら、プロテアーゼは、液体中ではプロテアーゼ自身や他の酵素を加水分解してしまう。このため、プロテアーゼを含むタンパク質溶液においては、プロテアーゼや他の酵素の活性が経時的に著しく低下するという問題が発生している。
そこで、プロテアーゼや他の酵素の加水分解を抑えるために、プロテアーゼ活性を阻害するプロテアーゼ活性阻害剤の研究が行われている。例えば、ボロニックアシッドがセリンプロテアーゼやズブチリシンの活性を阻害することが知られている（非特許文献１）。また、４−置換フェニルボロン酸がプロテアーゼの活性を阻害することが知られている（特許文献１）。
しかしながら、これらのプロテアーゼ活性阻害剤を含む溶液では、一定の効果はあるものの、貯蔵時のプロテアーゼ活性を十分阻害できるとは言えず、プロテアーゼ活性の低下が抑制できない問題がある。

特表平１１−５０７６８０号公報

Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５１，１９８３，ｐ５−ｐ３２

そこで、本発明は、貯蔵時のタンパク質溶液のプロテアーゼ活性が十分抑制でき、保存前と長期間保存後とを比較して、活性の低下が少ないタンパク質溶液、このタンパク質溶液のプロテアーゼ活性の回復方法及びこのタンパク質溶液を含有する洗剤組成物を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記の目的を達成するべく検討を行った結果、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明のタンパク質溶液（Ｘ）は、プロテアーゼ（Ａ）、下記プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）及び溶剤（Ｃ）を含有するタンパク質溶液である。
プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）：クランＩＧに分類されるタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤であり、基質（Ｐ）としてベンジルオキシカルボニルフェニルアラニルニトリアニリド、ベンゾイルアルギニンニトリアニリド、フリルアクリロイルグリシルロイシンアミド及びサクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリドのうちいずれか１つを用いて、プロテアーゼ（Ａ）の活性の最適温度、最適ｐＨ及び最適基質濃度の条件下でＨｅｎｄｅｒｓｏｎプロットにより求めた（Ａ）に対する阻害定数Ｋｉが１ｐＭ〜１０μＭであるプロテアーゼ活性阻害剤。
また、本発明のタンパク質溶液のプロテアーゼ活性回復方法は、タンパク質溶液（Ｘ）のプロテアーゼ活性回復方法であって、吸光度を利用した活性測定法による（Ｘ）のプロテアーゼ活性Ｘｉが、下記タンパク質溶液（Ｓ）の活性を基準として２０％以下であり、（Ｘ）に、（Ｘ）の重量を基準として１００〜１，０００，０００重量％の溶剤（Ｃ）をさらに添加するタンパク質溶液（Ｘ）のプロテアーゼ活性回復方法である。
タンパク質溶液（Ｓ）：タンパク質溶液（Ｘ）において、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）を（Ｂ）と同重量の（Ｃ）で置きかえたタンパク質溶液。
また、本発明の洗剤組成物は、タンパク質溶液（Ｘ）及び界面活性剤（Ｄ）を含有する洗剤組成物である。

本発明のタンパク質溶液は、長期的にプロテアーゼ活性を保つことができる。
また、本発明のプロテアーゼ活性回復方法は、阻害したプロテアーゼ活性を回復することができる。
さらに、本発明の洗剤組成物は、洗浄性の持続性が高い。
本発明において、「洗浄性の持続性」とは、長期保存前の洗浄性と長期間保存後の洗浄性とを比較して、洗浄性の低下が小さく、一定の洗浄性を保持することを意味する。

アルカラーゼに対する基質のミカエリス定数Ｋｍを求めるために作成したＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットであり、縦軸をそれぞれの基質濃度での酵素反応初速度の逆数（１／ｖ）、横軸を基質（Ｐ）の濃度［Ｓ］としてプロットしたグラフである。 アルカラーゼの活性の最適ｐＨを求めるために、縦軸をｐＨ４．５〜９．５における傾き係数ｋ、横軸をｐＨとしてプロットし、アルカラーゼの活性のｐＨ依存性を表したグラフである。 アルカラーゼの活性の最適温度を求めるために、縦軸を１０〜８０℃における傾き係数ｋ、横軸を温度としてプロットし、アルカラーゼの活性の温度依存性を表したグラフである。 プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）のアルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉを求めるために作成したＨｅｎｄｅｒｓｏｎプロットであり、アルカラーゼの残存活性をαとしたときに、縦軸を｛［プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）のモル濃度］／（１−α）｝、横軸を１／αとしてプロットしたグラフである。

本発明のタンパク質溶液（Ｘ）は、プロテアーゼ（Ａ）、下記プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）及び溶剤（Ｃ）を含有するタンパク質溶液である。
プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）：クランＩＧに分類されるタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤であり、基質（Ｐ）としてベンジルオキシカルボニルフェニルアラニルニトリアニリド、ベンゾイルアルギニンニトリアニリド、フリルアクリロイルグリシルロイシンアミド及びサクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリドのうちいずれか１つを用いて、プロテアーゼ（Ａ）の活性の最適温度、最適ｐＨ及び最適基質濃度の条件下でＨｅｎｄｅｒｓｏｎプロットにより求めた（Ａ）に対する阻害定数Ｋｉが１ｐＭ〜１０μＭであるプロテアーゼ活性阻害剤。

本発明においてプロテアーゼ（Ａ）とは、ペプチド又はタンパク質を基質として加水分解を触媒する酵素である。プロテアーゼ（Ａ）には、低温領域（０℃以上５０℃未満）にプロテアーゼ活性の至適温度を有する低温至適プロテアーゼと高温領域（５０℃以上）に至適温度を有する高温至適プロテアーゼが含まれる。（Ａ）としては、セリンプロテアーゼ（Ａ−１）、アスパラギン酸プロテアーゼ（Ａ−２）、システインプロテアーゼ（Ａ−３）及び金属プロテアーゼ（Ａ−４）が含まれる。

セリンプロテアーゼ（Ａ−１）は、触媒残基としてセリン残基をもつプロテアーゼであり、キモトリプシン、トリプシン、トロンビン、プラスミン、エラスターゼ、スブチリシン及びケキシン等が含まれる。具体的には、ブタすい臓由来トリプシン、バシラス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来のスブチリシン Ｎｏｖｏ、スブチリシン Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ、スブチリシン ３０９、スブチリシン １４７及びスブチリシン １６８等が挙げられる。
市販のセリンプロテアーゼ（Ａ−１）としては、ノボザイムス社製のもの（アルカラーゼ、サビナーゼ、エバラーゼ、カンナーゼ及びＰＴＮ等）並びにジェネンコア社製のもの（ピュラフェクト及びピュラフェクト ＯＸＰ等）等が挙げられる。

アスパラギン酸プロテアーゼ（Ａ−２）は、活性中心にアスパラギン酸の存在するプロテアーゼであり、ペプシン、カテプシンＤ、レニン及びキモシン等が含まれる。具体的には、ヒト胃由来のペプシン等が挙げられる。

システインプロテアーゼ（Ａ−３）は、チオール基が活性中心に存在するプロテアーゼであり、パパイン、ブロメライン、フィシン、アクチニジン、カテプシンＢ、カテプシンＨ、カテプシンＬ及びショウガプロテアーゼ等が含まれる。

金属プロテアーゼ（Ａ−４）は、活性中心に金属イオンを含むプロテアーゼであり、サーモライシン、マトリックスメタロプロテイナーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ及びコラゲナーゼ等が含まれる。

上記プロテアーゼ（Ａ）は、タンパク質溶液の使用用途によって適宜選択されるが、汎用性の観点から、セリンプロテアーゼ（Ａ−１）が好ましく、さらに好ましくはスブチリシンである。

本発明において、タンパク質溶液（Ｘ）中のプロテアーゼ（Ａ）の含有量は、タンパク質溶液の使用しやすさの観点から、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の合計重量を基準として、０．００００００１〜２０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．００００００１〜１０重量％、特に好ましくは０．００００００１〜０．５重量％である。
（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の合計重量を基準としたプロテアーゼ（Ａ）の含有量が０．００００００１重量％以上であることで、タンパク質溶液の使用量が抑えられる。また、２０重量％以下であることで、プロテアーゼの凝集を防ぐことができる。

本発明においてプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）は、クランＩＧに分類されるタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤であり、基質（Ｐ）としてベンジルオキシカルボニルフェニルアラニルニトリアニリド、ベンゾイルアルギニンニトリアニリド、フリルアクリロイルグリシルロイシンアミド及びサクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリドのうちいずれか１つを用いて、プロテアーゼ（Ａ）の活性の最適温度、最適ｐＨ及び最適基質濃度の条件下でＨｅｎｄｅｒｓｏｎプロットにより求めた（Ａ）に対する阻害定数Ｋｉが１ｐＭ〜１０μＭであるプロテアーゼ活性阻害剤である。

上記ベンジルオキシカルボニルフェニルアラニルニトリアニリドは、フェニルアラニンのアミノ基にオキシカルボキシベンジル基が結合し、カルボキシル基にニトロアニリンがペプチド結合したものであり、ＭＰ−バイオメディカル社（製品名：Ｎ−ｃｂｚ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ）から入手可能である。
上記ベンゾイルアルギニンニトリアニリドは、アルギニンのアミノ基にカルボキシベンジル基が結合し、アルギニンのカルボキシル基にニトロアニリンがペプチド結合したものであり、和光純薬工業（株）（製品名：Ｎα−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド塩酸塩）から入手可能である。
上記フリルアクリロイルグリシルロイシンアミドは、グリシルロイシンアミドのアミノ基にフリルアクリル酸がペプチド結合したものであり、シグマ社（製品名：Ｎ‐（３‐［２‐Ｆｕｒｙｌ］ａｃｒｙｌｏｙｌ）‐Ｇｌｙ‐Ｌｅｕ ａｍｉｄｅ）から入手可能である。
上記サクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリド（Ｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ）は、アラニルアラニルプロリルフェニルアラニンの末端アミノ基に無水コハク酸が結合し、末端カルボキシル基にニトロアニリンがペプチド結合したものであり、Ｂａｃｈｅｍ ＡＧ社（製品名：Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ）から入手可能である。

上記基質（Ｐ）のうち、Ｋｉを求める際にどの基質を用いるかは、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）が活性を阻害する（Ａ）の分類により適宜選択される。上記アスパラギン酸プロテアーゼ（Ａ−２）であればベンジルオキシカルボニルフェニルアラニルニトリアニリドを用いて、システインプロテアーゼ（Ａ−３）であればベンゾイルアルギニンニトリアニリドを用いて、金属プロテアーゼ（Ａ−４）であればフリルアクリロイルグリシルロイシンアミドを用いて、セリンプロテアーゼ（Ａ−１）であればサクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリドをを用いてＫｉを求める。
上記に（Ａ）として例示されていないプロテアーゼについては、参考文献１（Ｒａｗｌｉｎｇｓ， Ｎ．Ｄ． ＆ Ｂａｒｒｅｔｔ， Ａ．Ｊ．（１９９３） Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２９０， ｐ２０５−２１８）に、（Ａ−１）〜（Ａ−４）のいずれに分類されるかが記載されている。
また、上記にも、参考文献１にも記載されていないプロテアーゼが、（Ａ−１）〜（Ａ−４）のいずれに分類されるかは、参考文献２（Ｗｏｅｓｓｎｅｒ ＆ Ｂａｒｒｅｔｔ（１９９８）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）に示される方法を用いることで分類できる。

本発明においてプロテアーゼ（Ａ）の活性の最適基質濃度は、（Ａ）に対する基質（Ｐ）のミカエリス定数Ｋｍの３分の１倍〜２倍である。ミカエリス定数Ｋｍは酵素反応初速度の基質濃度依存性を求めることによって求められる。具体的には、下記のミカエリス定数Ｋｍ測定法によって求めたものである。
＜ミカエリス定数Ｋｍ測定法＞
一定量の基質（Ｐ）、プロテアーゼ（Ａ）、ｐＨ調整剤（Ｌ）及び水を含む一定の温度及びｐＨに調製した酵素反応溶液（Ｉ）を作成する。
酵素反応溶液（Ｉ）の温度は、１０〜８０℃の範囲内で、プロテアーゼ（Ａ）の活性が失活せず、活性があり、吸光度の測定ができる温度で、酵素反応溶液（Ｉ）作成時から測定終了までの間、一定温度に保つことができればいい。
酵素反応溶液（Ｉ）のｐＨは、ｐＨ３〜１２の範囲内であればいい。後述する最適ｐＨがわかっている場合は、最適ｐＨであることが好ましい。
酵素反応溶液（Ｉ）に用いるｐＨ調整剤（Ｌ）は、扱いやすさ及び安定性の観点から、ＨＥＰＥＳバッファー、ＭＥＳバッファーなどのＧｏｏｄバッファーが好ましい。酵素反応溶液（Ｉ）中の（Ｌ）の濃度（モル濃度）は、２５〜５００ｍＭである。
酵素反応溶液（Ｉ）中のプロテアーゼ（Ａ）の濃度（モル濃度）は、各プロテアーゼによって適宜選択されるが、後述する吸光度の変化ΔＡλを縦軸に、時間ｈを横軸にプロットした場合、プロットが直線となる濃度を選ぶ。
酵素反応溶液（Ｉ）中の基質（Ｐ）の濃度（モル濃度）は、経時的な吸光度変化を観測できる最小の基質濃度から最大の基質濃度の間で３点以上選べばよい。測定に使用する（Ａ）と類似のプロテアーゼのミカエリス定数Ｋｍが分かっている場合は、類似プロテアーゼのＫｍの１／５０倍〜１０倍の間で３点以上選べばよい。
酵素反応溶液（Ｉ）について、分光光度計を用いて、波長３００〜４５０ｎｍの範囲内で、酵素反応の生成物が極大吸収をもつ波長での吸光度Ａλを経時的に測定する。測定時の温度は、酵素反応溶液（Ｉ）を作成したときの温度と同温度である。測定時間は酵素の活性によって異なるが、吸光度が０．８を超えない範囲で０．１以上変化するのが見られれば良い。基質（Ｐ）及びプロテアーゼ（Ａ）を混合した直後の吸光度をＡλ₀、ｈ時間後の吸光度をＡλ_hとし、吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλ_h−Ａλ₀）と生成物の測定波長におけるモル吸光定数εを用いて下記数式（１）から酵素反応初速度ｖ（Ｍ／ｓ）を算出する。
ｖ＝ΔＡλ／（ε×ｈ×３６００） （１）
さらに、基質（Ｐ）の濃度が異なる酵素反応溶液（Ｉ）を用いて、同様に測定し、酵素反応初速度ｖを算出する。
ミカエリス定数Ｋｍは、算出した酵素反応初速度ｖを用いて、下記ミカエリスメンテン式（数式（２））から派生するＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットによって求められる。
ｖ＝Ｖｍａｘ［Ｓ］／（Ｋｍ＋［Ｓ］） （２）
上記数式（２）中、ｖは酵素反応初速度（Ｍ／ｓ）、Ｖｍａｘは最大速度（Ｍ／ｓ）、［Ｓ］は酵素反応溶液中での基質濃度（Ｍ）である。
Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットは、横軸（ｘ軸）にそれぞれの基質（Ｐ）の濃度［Ｓ］、縦軸（ｙ軸）にそれぞれの基質濃度［Ｓ］の酵素反応初速度ｖによる逆数（［Ｓ］／ｖ）をプロットしたものであり、プロットの近似直線とｘ軸との交点が−Ｋｍである。

プロテアーゼ（Ａ）の活性の最適ｐＨは、様々なｐＨで酵素反応溶液の吸光度を測定することによって決定できる。具体的には、下記の最適ｐＨ測定法によって求めたｐＨである。
＜最適ｐＨ測定法＞
一定量の基質（Ｐ）、プロテアーゼ（Ａ）、ｐＨ調整剤（Ｌ）及び水を含むｐＨを３〜１２に調製した酵素反応溶液（ＩＩ）を作成する。それぞれの溶液（ＩＩ）のｐＨ間隔は１程度とする（例えば、ｐＨ３．０、４．０及び５．０等）。
酵素反応溶液（ＩＩ）の温度は、１０〜８０℃の範囲内で、プロテアーゼ（Ａ）の活性が失活せず、活性があり、吸光度の測定ができる温度で、酵素反応溶液（ＩＩ）作成時から測定終了までの間、一定温度に保つことができればいい。
酵素反応溶液（ＩＩ）に用いるｐＨ調整剤（Ｌ）は、扱いやすさ及び安定性の観点から、ＨＥＰＥＳバッファー及びＭＥＳバッファー等のＧｏｏｄバッファーが好ましい。酵素反応溶液（ＩＩ）中のｐＨ調整剤（Ｌ）の濃度（モル濃度）は、２５〜５００ｍＭである。
酵素反応溶液（ＩＩ）中の基質（Ｐ）の濃度（モル濃度）は、上記プロテアーゼ（Ａ）の基質（Ｐ）に対するミカエリス定数Ｋｍの４〜６倍である。
酵素反応溶液（ＩＩ）中のプロテアーゼ（Ａ）の濃度（モル濃度）は、各プロテアーゼによって適宜選択され、後述する吸光度の変化ΔＡλを縦軸に、時間ｈを横軸にプロットした場合、プロットが直線となる濃度を選ぶ。
酵素反応溶液（ＩＩ）において、分光光度計を用いて、波長３００〜４５０ｎｍの範囲内で、酵素反応の生成物が極大吸収をもつ波長での吸光度Ａλを経時的に測定する。測定時の温度は、酵素反応溶液（ＩＩ）を作成したときの温度と同温度である。測定時間ｈは酵素の活性によって異なるが、吸光度が０．８を超えない範囲で、０．１以上変化すれば良い。基質（Ｐ）及びプロテアーゼ（Ａ）を混合した直後の吸光度をＡλ₀、ｈ時間後の吸光度をＡλ_hとし、吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλ_h−Ａλ₀）を縦軸に、時間ｈを横軸にプロットし、直線の傾き（係数ｋ）を求める。さらに、それぞれのｐＨ（３〜１２）の酵素反応溶液（ＩＩ）を用いて測定した係数ｋを用いて、縦軸を係数ｋ、横軸をｐＨとしてプロットし、係数ｋが極大値となるｐＨが最適ｐＨである。
ｐＨを調整する際に、バッファーの種類を変更する場合は、バッファーによってプロテアーゼ活性が異なるため、適宜これを補正する必要がある。補正する方法としては、バッファーの種類を変える境目のｐＨにおいて、両方のバッファーで活性を測定しておき、片方のバッファーで測定した値を基準として活性を補正する方法が挙げられる。

プロテアーゼ（Ａ）の活性の最適温度は、１０〜８０℃の範囲で酵素反応溶液の吸光度を測定することによって求められる。具体的には、下記の最適温度測定法によって求めた温度である。
＜最適温度測定法＞
一定量の基質（Ｐ）、プロテアーゼ（Ａ）、ｐＨ調整剤（Ｌ）及び水を含む最適ｐＨに調整した酵素反応溶液（ＩＩＩ）を作成する。
酵素反応溶液（ＩＩＩ）の温度は、１０〜８０℃の範囲で、温度が異なるもの（各温度の間隔がおよそ１０℃程度）を数種類作成する。
酵素反応溶液（ＩＩＩ）に用いるｐＨ調整剤（Ｌ）は、扱いやすさ及び安定性の観点から、ＨＥＰＥＳバッファー及びＭＥＳバッファー等のＧｏｏｄバッファーが好ましい。酵素反応溶液（ＩＩＩ）中の（Ｌ）の濃度（モル濃度）は、２５〜５００ｍＭである。
酵素反応溶液（ＩＩＩ）中の基質（Ｐ）の濃度（モル濃度）は、上記プロテアーゼ（Ａ）の基質（Ｐ）に対するミカエリス定数Ｋｍの４〜６倍である。
酵素反応溶液（ＩＩＩ）中のプロテアーゼ（Ａ）の濃度（モル濃度）は、各プロテアーゼによって適宜選択され、後述する吸光度の変化ΔＡλを縦軸に、時間ｈを横軸にプロットした場合、プロットが直線となる濃度を選ぶ。
酵素反応溶液（ＩＩＩ）について、分光光度計を用いて、波長３００〜４５０ｎｍの範囲内で、酵素反応の生成物が極大吸収をもつ波長での吸光度Ａλを経時的に測定する。測定時の温度は、酵素反応溶液（ＩＩＩ）を作成したときの温度と同温度である。測定時間ｈは酵素の活性によって異なるが、吸光度が０．８を超えない範囲で、０．１以上変化すれば良い。基質（Ｐ）及びプロテアーゼ（Ａ）を混合した直後の吸光度をＡλ₀、ｈ時間後の吸光度をＡλ_hとし、吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλ_h−Ａλ₀）を縦軸に、時間ｈを横軸にプロットして、直線の傾き（係数ｋ）を求める。１０〜８０℃の各温度で作成した酵素反応溶液（ＩＩＩ）において測定した係数ｋを用いて、縦軸を係数ｋ、横軸を温度としてプロットする。係数ｋが極大値となる温度がプロテアーゼ（Ａ）の活性の最適温度である。

＜阻害定数Ｋｉの測定方法＞
最適温度、最適ｐＨに調製した、一定量のプロテアーゼ（Ａ）、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）、ｐＨ調整剤（Ｌ）及び水を含むプロテアーゼ・プロテアーゼ活性阻害剤混合溶液（ｉ）を作成する。また、（Ｂ）の濃度が異なる（ｉ）を数種類作成する。作成した（ｉ）は、数十分〜数時間静置する。静置後のそれぞれの（ｉ）に、基質（Ｐ）を添加して酵素反応溶液（ＩＶ）を作成する。
（ｉ）及び（ＩＶ）に用いるｐＨ調整剤（Ｌ）は、扱いやすさ及び安定性の観点から、ＨＥＰＥＳバッファー、ＭＥＳバッファーなどのＧｏｏｄバッファーが好ましい。（ｉ）及び（ＩＶ）中の（Ｌ）の濃度（モル濃度）は、２５〜５００ｍＭであり、最適ｐＨに調整できればいい。
（ｉ）中のプロテアーゼ（Ａ）の濃度（モル濃度）は、前述のＫｍを求めた際の（Ａ）の濃度付近であり、且つ、後に（ｉ）に添加する基質（Ｐ）のモル濃度の１０００分の１倍〜１０分の１倍の濃度である。（ＩＶ）中の（Ａ）のモル濃度は、（ＩＶ）中の基質（Ｐ）のモル濃度の１０００分の１倍〜１０分の１倍の濃度である。
（ｉ）及び（ＩＶ）中のプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）の濃度（モル濃度）は、プロテアーゼ（Ａ）の濃度（モル濃度）の１０分の１倍〜１０００倍で４種類以上と（Ｂ）を含まないものを作成する。
酵素反応溶液（ＩＶ）中の基質（Ｐ）のモル濃度は、最適基質濃度（上記ミカエリス定数Ｋｍの３分の１倍〜２倍）である。
（ｉ）の静置時間は、（Ａ）と（Ｂ）が十分に結合し、プロテアーゼ（Ａ）の活性が一定になるまでの時間であり、あらかじめ実験して求めておく。
プロテアーゼ（Ａ）の活性が一定になるまでの時間は、後述する吸光度を利用した活性測定法により求めることができる。具体的には、プロテアーゼ・プロテアーゼ活性阻害剤混合溶液（ｉ）を作成してから、一定時間おきに、後述する吸光度を利用した活性測定法により、直線の傾き（係数ｋ）を求める。係数ｋが一定になるまでの時間が（Ａ）の活性が一定になるまでの時間である。
プロテアーゼ活性の最適温度及び最適ｐＨの条件下、酵素反応溶液（ＩＶ）を作成後、分光光度計を用いて、波長３００〜４５０ｎｍの範囲内で、生成物が極大吸収をもつ波長での吸光度Ａλを経時的に測定する。測定時間ｈは酵素の活性によって異なるが、吸光度が０．８を超えない範囲で０．１以上変化すれば良い。単位時間あたりの吸光度変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλ_h−Ａλ₀）と生成物の測定波長におけるモル吸光定数εから上記数式（１）を用いて酵素反応初速度ｖを算出する。また、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）の濃度が異なる（ｉ）を用いて作成した酵素反応溶液（ＩＶ）についても同様に測定し、酵素反応初速度ｖｉを算出する。（Ｂ）を含まない時の酵素反応初速度をｖｏとし、各（Ｂ）濃度での相対活性α（α＝ｖｉ／ｖｏ）を算出する。
横軸に１／αを、縦軸に｛［（Ｂ）のモル濃度］／（１−α）｝をプロットし、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎプロットを作成する。このプロットに近似直線を描いたときの傾きＫｉ（ａｐｐ）、測定時の基質濃度［Ｓ］及びミカエリス定数Ｋｍを、下記数式（３）に当てはめることによりＫｉを算出する。
Ｋｉ＝Ｋｉ（ａｐｐ）／（１＋［Ｓ］／Ｋｍ）（３）
上記Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎプロットは、具体的には、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１２７，１９７２，ｐ２１−３３３に記載されている方法を用いる。

本発明において、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）の阻害定数Ｋｉは、１ｐＭ〜１０μＭであり、適度なプロテアーゼ濃度範囲でプロテアーゼ活性を抑制及び回復する観点から、１ｎＭ〜１μＭが好ましい。
上記阻害定数Ｋｉが１ｐＭ未満では、プロテアーゼ（Ａ）とプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）の結合が強いため、（Ａ）の活性を回復させるには大量に希釈しなければならない。例えば、Ｋｉが０．１ｐＭの（Ｂ）を、（Ａ）と等モル量用いて（Ａ）の活性を２０％以下にした場合、タンパク質溶液中の（Ａ）が約１．０×１０^-10重量％の濃度になるように大希釈しなければ（Ａ）の活性を５０％以上に回復することができない。しかしながら、（Ａ）の濃度が１．０×１０^-10重量％以下では、タンパク質溶液（Ｘ）を用いて洗剤組成物を作成した場合、洗剤組成物中にタンパク質溶液（Ｘ）を添加することによる有用な効果が得られない。
一方、（Ｂ）の阻害定数Ｋｉが１０μＭより大きくなると、（Ａ）の活性を阻害するのが困難であり、タンパク質溶液（Ｘ）のプロテアーゼ活性の持続性が低い。
本発明において、プロテアーゼ活性の持続性とは、タンパク質溶液（Ｘ）を一定期間保存した後に回復させたプロテアーゼ活性と、保存する前に回復させたプロテアーゼ活性との差が小さく、プロテアーゼ活性の比（％）｛（一定期間保存した後に回復させたプロテアーゼ活性）／（保存する直前に回復させたプロテアーゼ活性）×１００｝が１００％に近くなり、一定のプロテアーゼ活性の回復性があることを意味する。

本発明において、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）の阻害定数Ｋｉが１ｐＭ〜１０μＭであることにより、少量の添加で適度にプロテアーゼ活性を阻害することができ、プロテアーゼや他のタンパク質の加水分解を抑えることができる。そのため、タンパク質溶液（Ｘ）において、（Ｂ）により阻害され、低下したプロテアーゼ（Ａ）の活性を、大量に希釈することなく、効率よく回復させることができる。また、タンパク質溶液（Ｘ）を長期間保存した後も、プロテアーゼ活性を効率よく回復することができ、プロテアーゼ活性の持続性が高い。

本発明において、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）はプロテアーゼ活性阻害の機能を保持するタンパク質であり、クランＩＧに分類されるプロテアーゼ活性阻害剤である。プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）の機能とは、プロテアーゼ（Ａ）と可逆的に結合し、プロテアーゼ（Ａ）の活性を阻害することである。クランＩＧに分類されるとは、参考文献３（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ，３７８，２００４，ｐ７０５−ｐ７１６）に記載される方法により分類されるタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤を意味する。クランＩＧに分類されるかどうかは、アミノ酸配列をＢＬＡＳＴＰプログラム（インターネット、２０１２年３月１２日検索、ＵＲＬ：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）で解析することによって確認することができる。
（Ｂ）として、具体的には、アズキ由来スブチリシン阻害剤（スブチリシンに対するＫｉが１００ｎＭ）、オオムギ由来キモトリプシンインヒビター１（キモトリプシンに対するＫｉが５ｎＭ）、トマト由来ペプチダーゼインヒビター１（トリプシンに対するＫｉが７０ｎＭ）、コメ由来スブチリシン／キモトリプシンインヒビター１（スブチリシンに対するＫｉが７ｎＭ）、コメ由来スブチリシン／キモトリプシンインヒビター２（スブチリシンに対するＫｉが０．２ｎＭ）、Ｈｉｒｕｄｏ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ由来エグリンｃ（キモトリプシンに対するＫｉが０．３７ｎＭ、アルカラーゼに対するＫｉが１．２ｐＭ、サビナーゼに対するＫｉが４．７ｐＭ）、ジャガイモ由来ポテトペプチダーゼインヒビターＩ（キモトリプシンに対するＫｉが４．１ｎＭ、アルカラーゼに対するＫｉが２．３μＭ、サビナーゼに対するＫｉが２．５μＭ）及びオオムギ由来キモトリプシンインヒビター２（スブチリシンに対するＫｉが０．５ｎＭ）等が挙げられる。また、これらのアミノ酸配列の一部を欠失、置換及び／又は付加したアミノ酸配列を有するタンパク質も、（Ｂ）として用いることができる。

クランＩＧに分類されるプロテアーゼ活性阻害剤は、分子量が数千程度の小分子のタンパク質であり、立体構造が安定しているものが多いため、耐熱性や耐薬品性が良好であり、タンパク質溶液のプロテアーゼ活性を長期的に保つことができる。

プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）として、プロテアーゼ活性阻害剤の安定性の観点から、Ｈｉｒｕｄｏ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ由来エグリンｃ及びジャガイモ由来ポテトペプチダーゼインヒビターＩが好ましく、さらに好ましくはＨｉｒｕｄｏ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ由来エグリンｃである。

（Ｂ）は、上記タンパク質を持つ動植物の組織から抽出して得ることが可能である。また、（Ｂ）のアミノ酸配列をコードする遺伝子を微生物等の宿主に導入し、宿主を培養液中で培養し、培養液中から採取及び精製することによって生産することもできる。
（Ｂ）のアミノ酸配列をコードする遺伝子は、公知の方法で得ることができる。さらに部位特異的突然変異誘発法等の公知の手法を利用して、一部を欠失、置換及び付加したアミノ酸配列をコードする遺伝子を得ることも可能である。欠失および置換されるアミノ酸の個数は、プロテアーゼ活性阻害剤の機能を保持する観点から、１〜１０個が好ましく、さらに好ましくは１〜５個である。また、付加には、アミノ酸配列の両末端への付加（酵素精製のためのタグ配列の付加等）と、両末端以外のアミノ酸配列中への付加が含まれる。アミノ酸配列に付加されるアミノ酸の個数は、付加がアミノ酸配列中の場合は、プロテアーゼ活性阻害剤の機能を保持する観点から、１〜１０個が好ましく、さらに好ましくは１〜５個である。また、アミノ酸配列の両末端への付加の場合は、プロテアーゼ活性阻害剤の機能を保持する観点から、１〜３０個が好ましく、さらに好ましくは１〜１０個である。

（Ｂ）を生産する際の宿主としては、動物細胞、微生物及び植物細胞等が挙げられる。
動物細胞としては、特に限定されないが、昆虫細胞、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞及びＣＨＯ細胞等が挙げられる。
昆虫細胞としては、特に限定されないが、Ｓｆ９細胞及びＳｆ２１細胞等が挙げられる。
微生物としては、特に限定されないが、細菌及び酵母等が挙げられる。
細菌としては、真正細菌及び古細菌が含まれる。
真正細菌には、グラム陰性菌及びグラム陽性菌が含まれる。グラム陰性細菌としては、エシェリチア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サーマス属菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、リゾビウム属菌（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シュードモナス属菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、シュワネラ属菌（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、ビブリオ属菌（Ｖｉｂｒｉｏ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属）、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属）等が挙げられる。グラム陽性菌としては、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ属）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ属）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属）、ブレビバチルス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ属）、ビフィドバクテリウム属 （Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属）、ラクトコッカス属 （Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属）、エンテロコッカス属 （Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属）、リューコノストック属 （Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属）等が挙げられる。
植物細胞としては、特に限定されないが、ＢＹ−２細胞等が挙げられる。

（Ｂ）を生産する際の宿主としては、クローニングの容易さの観点から、微生物が好ましく、さらに好ましくはエシェリチア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サーマス属菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、リゾビウム属菌（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シュードモナス属菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、シュワネラ属菌（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、ビブリオ属菌（Ｖｉｂｒｉｏ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属）及びシネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属）であり、特に好ましくはエシェリチア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュワネラ属菌（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ属）及びブレビバチルス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ属）である。

培養は微生物の資化可能な炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従って行えばよい。

培養液からプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）を精製及び採取する方法としては、常法に従って行うことができる。例えば、培養物から遠心分離又は濾過することで菌体を除き、得られた培養上清液から常法手段により目的酵素を濃縮することができる。このようにして得られた酵素液又は乾燥粉末はそのまま用いることもできるが、更に公知の方法により結晶化や造粒化してもいい。

本発明において、タンパク質溶液（Ｘ）中のプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）の含有量は、プロテアーゼ活性を長期間保つ観点から、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の合計重量を基準として、０．００００００１〜５０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．００００００１〜２０重量％、特に好ましくは０．００００００１〜１０重量％である。

本発明において、タンパク質溶液（Ｘ）中のプロテアーゼ（Ａ）及びプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）の含有量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて目的のバンドの濃さを定量することによって測定することができ、具体的には、同一のゲルにおいて電気泳動を行ったＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）との比較を行うことによって測定される。

本発明において、タンパク質溶液（Ｘ）中のプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）とプロテアーゼ（Ａ）の重量比（（Ｂ）の重量／（Ａ）の重量）は、０．０５〜３００が好ましく、さらに好ましくは０．０９〜２００、特に好ましくは０．１〜２０である。
（Ｂ）と（Ａ）との含有量の比が０．０５以上であることで、プロテアーゼ活性を十分抑制でき、長期間保存後もプロテアーゼ活性を保つことができるので好ましい。また、３００以下であることで、希釈したときにプロテアーゼ活性が効率よく戻るので好ましい。

タンパク質溶液（Ｘ）中のプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）とプロテアーゼ（Ａ）とのモル比｛（Ｂ）のモル数／（Ａ）のモル数｝は、０．０１〜３００が好ましく、さらに好ましくは０．１〜３００であり、次にさらに好ましくは１〜３００であり、特に好ましくは１〜１００であり、次に特に好ましくは１〜１０である。
プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）とプロテアーゼ（Ａ）とのモル比が０．０１以上であることで、プロテアーゼ活性を十分抑制でき、長期間保存後もプロテアーゼ活性を保つことができるので好ましい。また、３００以下であることで、希釈時にプロテアーゼ活性が効率よく戻るので好ましい。

本発明において、溶剤（Ｃ）としては、水、有機溶剤及びこれらの混合物等が含まれる。

水としては、特に限定されるものではなく、水道水、イオン交換水、蒸留水及び逆浸透水等が挙げられる。また、水中に、後述するｐＨ調整剤（Ｌ）を含むバッファー水溶液等が挙げられる。

有機溶剤としては、アルコール（炭素数１〜１８のアルコールが挙げられ、具体的には、メタノール、エタノール、ブタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール及びグリセリン等）、ケトン（アセトン及びメチルエチルケトン等）、エーテル（テトラヒドロフラン等の環状エーテル、ジエチルエーテル、エチレングリコールモノアルキルエーテル及びプロピレングリコールモノアルキルエーテル等）、スルホキシド（ジメチルスルホキシド等）、脂肪族又は脂環式炭化水素（ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ミネラルスピリット及びシクロヘキサン等）及びふっ素含有化合物（テトラフルオロエチレン等）等が挙げられる。これらの有機溶剤のうち、プロテアーゼ（Ａ）及びプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）の安定性の観点からスルホキシドが好ましい。

溶剤（Ｃ）としては、プロテアーゼ（Ａ）及びプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）の溶解性の観点から、スルホキシド及び水が好ましく、さらに好ましくは水であり、特に好ましくはｐＨ調整剤（Ｌ）を含むバッファー水溶液である。

本発明のタンパク質溶液（Ｘ）に含まれる溶剤（Ｃ）の含有量は、プロテアーゼおよびプロテアーゼ活性阻害剤の安定性の観点から、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の合計重量を基準として、３０〜９９．９９９９９９８重量％が好ましく、さらに好ましくは７０〜９９．９９９９９９８重量％、特に好ましくは８９．５〜９９．９９９９９９８重量％である。

本発明におけるタンパク質溶液（Ｘ）には、上記のプロテアーゼ（Ａ）、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）及び溶剤（Ｃ）以外に、界面活性剤（Ｄ）、無機塩（Ｅ）、糖（Ｆ）、アミノ酸（Ｇ）、脂肪酸（Ｉ）、油脂（Ｊ）、その他の低分子有機化合物（Ｈ）、プロテアーゼ以外の酵素（Ｋ）及びｐＨ調整剤（Ｌ）を含有することができる。

界面活性剤（Ｄ）としては、後述する本発明の洗剤組成物における界面活性剤（Ｄ）と同様であり、（Ｄ）として好ましいものも同様である。

無機塩（Ｅ）として、塩化ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、ギ酸ナトリウム、硫酸マグネシウム及び硫酸アンモニウム等が挙げられる。

糖（Ｆ）として、トレハロース、スクロース、デキストリン、シクロデキストリン、マルトース、フルクトース、ヒアルロン酸及びコンドロイチン硫酸等が挙げられる。

アミノ酸（Ｇ）として、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ロイシン、リシン、ヒスチジン、システイン、グルタミン、グルタミン酸、イソロイシン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、アルギニン、バリン及びそれらの塩等が挙げられる。

脂肪酸（Ｉ）として、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ドコサヘキサエン酸及びエイコサペンタエン酸等が挙げられる。

油脂（Ｊ）としては、上記脂肪酸（Ｉ）のモノ、ジ、トリグリセリド等が挙げられる。

その他の低分子有機化合物（Ｈ）としては、酢酸ベンジル、メチルサリチル酸、ベンジルサリチル酸、ヒドロキシ安息香酸、けい皮酸、カフェ酸、カテキン類、アスコルビン酸及びカロテノイド等が挙げられる。

プロテアーゼ以外の酵素（Ｋ）としては、セルラーゼ（Ｋ−１）、アミラーゼ（Ｋ−２）、リパーゼ（Ｋ−３）及びオキシドレダクターゼ（Ｋ−４）が含まれる。

セルラーゼ（Ｋ−１）としては、細菌又は真菌起源のものが含まれる。セルラーゼには、化学的に又は遺伝子的に修飾された変異体も含まれる。セルラーゼとしては、バチラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のセルラーゼやフミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）から生産されるセルラーゼとして米国特許第４，４３５，３０７号明細書に開示されているもの等が含まれる。また、特に適当なセルラーゼとしては色彩保護（ｃｏｌｏｒ ｃａｒｅ）に役立つセルラーゼであり、欧州特許出願第０，４９５，２５７号明細書に記載されたセルラーゼが含まれる。
市販のセルラーゼとしては、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）の株により生産されたノボザイムス社のＣｅｌｌｕｚｙｍｅ^TM、ノボザイムス社製Ｅｎｄｏｌａｓｅ^TM、Ｃａｒｅｚｙｍｅ^TM及び花王社のＫＡＣ−５００（Ｂ）^TM等が挙げられる。

アミラーゼ（Ｋ−２）としては、細菌又は真菌起源のものが含まれる。アミラーゼには、化学的に又は遺伝子的に修飾された変異体も含まれる。アミラーゼとしては、英国特許第１，２９６，８３９号明細書に詳細に記載されているＢ．リヘニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の特殊株から得られるα−アミラーゼ等が挙げられる。
市販のアミラーゼとしては、ノボザイムス社の Ｄｕｒａｍｙｌ^TM、Ｔｅｒｍａｍｙｌ^TM、Ｆｕｎｇａｍｙｌ^TM及びＢＡＮ^TM並びにＧｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ社のＲａｐｉｄａｓｅ^TM及びＭａｘａｍｙｌ Ｐ^TM等が挙げられる。

リパーゼ（Ｋ−３）としては、細菌又は真菌起源のものが含まれる。リパーゼには、化学的に又は遺伝子的に修飾された変異体も含まれる。リパーゼの例としては、フミコーラ・ランギノーザ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼ（欧州特許第２５８，０６８号明細書及び欧州特許第３０５，２１６号明細書）、リゾムーコル・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ及びカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）リパーゼ（欧州特許第２３８，０２３号明細書）、Ｃ．アンタークティカ（Ｃ．ｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＡ及びＢ、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ）リパーゼ（欧州特許第２１４，７６１号明細書）、Ｐ．シュードアルカリゲネス（Ｐ．ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、Ｐ．アルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）リパーゼ（欧州特許第２１８，２７２号明細書）、Ｐ．セパシア（Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ）リパーゼ（欧州特許第３３１，３７６号明細書）、Ｐ．スタッツェリ（Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ）リパーゼ、Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）リパーゼ、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）リパーゼ（英国特許第１，３７２，０３４号明細書）、Ｂ．サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）リパーゼ（Ｄａｒｔｏｉｓ 他，（１９９３），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １１３１，２５３−２６０）、Ｂ．ステアロサーモフィラス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）リパーゼ（特公昭６４−７４４９９２号公報）及びＢ．ピュミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）リパーゼ（国際公開第９１／１６４２２号）等が挙げられる。

市販のリパーゼとしては、ジェネンコア社の Ｍ１ Ｌｉｐａｓｅ^TM、Ｌｕｍａ ｆａｓｔ^TM及びＬｉｐｏｍａｘ^TM、ノボザイムス社のＬｉｐｏｌａｓｅ^TM及びＬｉｐｏｌａｓｅ Ｕｌｔｒａ^TM並びに天野エンザイム社のＬｉｐａｓｅ Ｐ“Ａｍａｎｏ”^TM等が挙げられる。

オキシドレダクターゼ（Ｋ−４）としては、ペルオキシダーゼ及びオキシダーゼ（例えばラッカーゼ）が含まれる。
ペルオキシダーゼとしては、植物、細菌又は真菌起源のものが含まれる。ペルオキシダーゼには、化学的に又は遺伝子的に修飾された変異体も含まれる。ペルオキシダーゼとしては、洗浄剤として用いた際の洗浄性の観点から、コプリナス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）（例えばＣ．シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｉｎｅｒｅｕｓ）又はＣ．マクロリザス（Ｃ．ｍａｃｒｏｒｈｉｚｕｓ）の菌株由来のもの）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（Ｂ．ピュミラス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）の菌株由来のもの）及び国際公開第９１／０５８５８号に記載されたペルオキシダーゼが好ましく、特に好ましくは国際公開第９１／０５８５８号に記載されたペルオキシダーゼである。
ラッカーゼとしては、細菌又は真菌起源のものが含まれる。ラッカーゼとしては、トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）（例えばＴ．ビロサ（Ｔ．ｖｉｌｌｏｓａ）又はＴ．ベルシコロール（Ｔ．ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）の菌株由来のもの］、コプリナス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）［例えばＣ．シネレウス（Ｃ．ｃｉｎｅｒｅｕｓ）の菌株由来のもの］及びミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）［例えばＭ．サーモフィラ（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｌｌａ）の菌株由来のもの］等が挙げられる。

本発明のタンパク質溶液（Ｘ）は、洗浄剤として用いた際の洗浄性の観点から、プロテアーゼ以外の酵素（Ｋ）を２種以上を含んでもいい。２種以上を含む場合、セルラーゼとリパーゼとの組み合わせ及びセルラーゼとアミラーゼとの組み合わせ等が挙げられる。

ｐＨ調整剤（Ｌ）としては、従来のｐＨ調整剤が使用でき、ホウ酸バッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー、Ｔｒｉｓバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、硫酸、塩酸、クエン酸、乳酸、ピルビン酸、蟻酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、モノエタノールアミン及びジエタノールアミン等が挙げられる。

本発明のタンパク質溶液（Ｘ）に含まれる界面活性剤（Ｄ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点から、タンパク質溶液（Ｘ）の重量に対して０〜５０が好ましく、さらに好ましくは０〜２５、特に好ましくは０〜１０である。
本発明のタンパク質溶液（Ｘ）に含まれる無機塩（Ｅ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液（Ｘ）の重量に対し０〜１０が好ましく、さらに好ましくは０〜５、特に好ましくは０〜３である。
本発明のタンパク質溶液（Ｘ）に含まれる糖（Ｆ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液（Ｘ）の重量に対し０〜５０が好ましく、さらに好ましくは０〜３０、特に好ましくは０〜２０である。
本発明のタンパク質溶液（Ｘ）に含まれるアミノ酸（Ｇ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液（Ｘ）の重量に対し０〜５０が好ましく、さらに好ましくは０〜３０、特に好ましくは０〜２０である。
本発明のタンパク質溶液（Ｘ）に含まれる低分子有機化合物（Ｈ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性からタンパク質溶液（Ｘ）の重量に対し０〜５０が好ましく、さらに好ましくは０〜３０、特に好ましくは０〜２０である。
本発明のタンパク質溶液（Ｘ）に含まれる脂肪酸（Ｉ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液（Ｘ）の重量に対し０〜５０が好ましく、さらに好ましくは０〜３０、特に好ましくは０〜２０である。
本発明のタンパク質溶液（Ｘ）に含まれる油脂（Ｊ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液（Ｘ）の重量に対し０〜５０が好ましく、さらに好ましくは０〜３０、特に好ましくは０〜２０である。
本発明の液タンパク質溶液（Ｘ）に含まれるプロテアーゼ以外の酵素（Ｋ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液（Ｘ）の重量に対し０〜５０が好ましく、さらに好ましくは０〜３０、特に好ましくは０〜２０である。
本発明のタンパク質溶液（Ｘ）に含まれるｐＨ調整剤（Ｌ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液（Ｘ）の重量に対し０〜２５が好ましく、さらに好ましくは０．０１〜１５、特に好ましくは１〜１０である。

本発明におけるタンパク質溶液（Ｘ）のｐＨは、タンパク質の安定性の観点から、１％（ｗ／ｗ）水溶液で３〜１１が好ましく、さらに好ましくは７〜１０である。
タンパク質溶液（Ｘ）のｐＨは、ｐＨ調整剤（Ｌ）によって適宜調整できる。

本発明のタンパク質溶液（Ｘ）は、各成分を混合することにより得られ、製造方法は特に限定されるものではない。１例を下記に示す。
（１）溶剤（Ｃ）に、プロテアーゼ（Ａ）、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）及び酵素（Ｋ）以外の成分を所定量添加し均一に溶解させる。
（２）プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）を加え、２５℃で均一になるまで攪拌する。
（３）最後にプロテアーゼ（Ａ）及び必要により酵素（Ｋ）を添加し溶解させ、タンパク質溶液（Ｘ）を製造する。

本発明のプロテアーゼ活性回復方法は、上記本発明のタンパク質溶液（Ｘ）のプロテアーゼ活性回復方法であって、吸光度を利用した活性測定法による（Ｘ）のプロテアーゼ活性Ｘｉが、下記タンパク質溶液（Ｓ）の活性を基準として２０％以下であり、（Ｘ）に、（Ｘ）の重量を基準として１００〜１，０００，０００重量％の溶剤（Ｃ）をさらに添加するタンパク質溶液（Ｘ）のプロテアーゼ活性回復方法である。
タンパク質溶液（Ｓ）：タンパク質溶液（Ｘ）において、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）を（Ｂ）と同重量の（Ｃ）で置きかえたタンパク質溶液。
タンパク質溶液（Ｓ）は、タンパク質溶液（Ｘ）において、（Ｂ）を（Ｂ）と同重量の（Ｃ）で置きかえたタンパク質溶液である。例えば、（Ｘ）中の（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の含有量が（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の合計重量を基準として、（Ａ）が２重量％、（Ｂ）が１８重量％、（Ｃ）が８０重量％である場合、（Ｓ）中の（Ａ）は２重量％、（Ｃ）は９８重量％である。

本発明において、吸光度を利用した活性測定法とは、基質（Ｐ）を用いて、一定温度、一定ｐＨ、上述のプロテアーゼ（Ａ）の活性の最適基質濃度の条件下で、酵素反応の生成物が極大吸収をもつ波長での吸光度Ａλを経時的に測定する方法である。
基質（Ｐ）として、どの基質を用いるかは、上記Ｋｉを求める際に使用する基質と同様、タンパク質溶液（Ｘ）中のプロテアーゼ（Ａ）の分類により適宜選択される。
吸光度を利用した活性測定法として、具体的には、下記の測定によって求められる。

＜吸光度を利用した活性測定法＞
○プロテアーゼ活性Ｘｉ
一定量のタンパク質溶液（Ｘ）及び一定量の基質（Ｐ）を添加して酵素反応溶液（Ｖ）を作成する。
酵素反応溶液（Ｖ）の温度は、１０〜８０℃の範囲内で、プロテアーゼ（Ａ）の活性が失活せず、活性があり、吸光度の測定ができる温度で、測定の間一定に保つことができればいい。
酵素反応溶液（Ｖ）中の基質（Ｐ）のモル濃度は、最適基質濃度で上記ミカエリス定数Ｋｍの３分の１倍〜２倍であり、且つ、（Ｖ）中のプロテアーゼ（Ａ）のモル濃度の５〜１０００００倍の濃度であればいい。
酵素反応溶液（Ｖ）について、分光光度計を用いて、波長３００〜４５０ｎｍの範囲内で、酵素反応の生成物が極大吸収をもつ波長での吸光度Ａλを経時的に測定する。測定時の温度は、酵素反応溶液（Ｖ）を作成したときの温度と同じ温度である。酵素反応溶液（Ｖ）を作成直後の吸光度Ａλ₀及び酵素反応溶液（Ｖ）を作成からｈ時間後の吸光度Ａλ_h（３点以上）を測定し、吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλ_h−Ａλ₀）を求める。測定時間は酵素の活性によって異なるが、吸光度が０．８を超えない範囲で０．１以上変化するのが見られれば良い。吸光度の変化ΔＡλを縦軸に、時間ｈを横軸にプロットして、直線の傾き（係数ｋ_X）を求める。

タンパク質溶液（Ｘ）に変えてタンパク質溶液（Ｓ）を使用する以外は同様にして吸光度を測定し、直線の傾き（係数ｋ_S）を求める。

上記タンパク質溶液（Ｘ）及び（Ｓ）は、作成してから３０分以上６時間以内のものを使用することが好ましい。

（Ｘ）のプロテアーゼ活性Ｘｉは、タンパク質溶液（Ｘ）及びタンパク質溶液（Ｓ）を用いた上記の直線の傾き係数ｋ_X及びｋ_Sから、下記数式（３）によって求められる。
プロテアーゼ活性Ｘｉ（％）＝｛ｋ_X／ｋ_S｝×１００ （３）

本発明において（Ｘ）の吸光度を利用した活性測定法によるプロテアーゼ活性Ｘｉは２０％以下であり、プロテアーゼ活性の残存によるプロテアーゼ自身及び／又は他のタンパク質の分解を防止するとの観点並びにプロテアーゼ活性の回復の観点から、０〜１０％が好ましく、さらに好ましくは０．００００１〜５％であり、次にさらに好ましくは０．００１〜３％である。

本発明のプロテアーゼ活性回復方法は、（Ｘ）の重量を基準として（Ｃ）を１００〜１００００００重量％添加する方法である。（Ｃ）の添加量は、プロテアーゼ活性を十分に回復させるとの観点から、５００〜１００００００重量％が好ましく、さらに好ましくは１０００〜１００００００重量％であり、次にさらに好ましくは９９００〜１００００００重量％である。

本発明のプロテアーゼ活性回復方法において、回復とは、（Ｘ）の重量を基準として（Ｃ）を１００〜１００００００重量％添加して希釈した後のタンパク質溶液（Ｙ）のプロテアーゼ活性Ｙｉが、タンパク質溶液（Ｔ）の活性を基準として２０％よりも大きくなることを意味する。プロテアーゼ活性Ｙｉは、産業上で有効なプロテアーゼ活性を得る観点から、２５〜１００％が好ましく、さらに好ましくは４０〜１００％であり、次にさらに好ましくは６０〜１００％であり、特に好ましくは８０〜１００％である。

タンパク質溶液（Ｔ）は、タンパク質溶液（Ｙ）において添加された（Ｃ）と同重量の（Ｃ）をタンパク質溶液（Ｓ）に添加したタンパク質溶液である。

○プロテアーゼ活性Ｙｉ
タンパク質溶液（Ｙ）のプロテアーゼ活性Ｙｉは、上記吸光度を利用した活性測定法において、タンパク質溶液（Ｘ）に変えて（Ｙ）を用いて直線の傾き（係数ｋ_Y）を求め、タンパク質溶液（Ｓ）に変えて（Ｔ）を用いて直線の傾き（係数ｋ_T）を求め、下記数式（４）に当てはめることによって求められる。
プロテアーゼ活性Ｙｉ（％）＝｛ｋ_Y／ｋ_T｝×１００ （４）
活性測定法で使用するタンパク質溶液（Ｙ）及び（Ｔ）は、作成してから３０分以上６時間以内のものを使用する。

本発明のプロテアーゼ活性回復方法は、（Ｘ）に（Ｘ）の重量を基準として（Ｃ）を１００〜１００００００重量％添加するものであれば特に限定されないが、（Ｘ）と（Ｃ）を均一に混合することが重要であり、（Ｃ）添加後の粘度及び温度等が均一な溶液になるまで攪拌することが好ましい。また、（Ｘ）中のタンパク質の変性に問題がなければ、なるべく高い温度（２０〜３０℃）の（Ｃ）を一度に添加したほうが速やかに活性を回復できるので好ましい。１例を下記に示す。
（１）一定量の（Ｘ）に一定量の溶剤（Ｃ）を添加し、２５℃で１２０分攪拌する。

本発明の洗剤組成物は、上記タンパク質溶液（Ｘ）及び界面活性剤（Ｄ）を含有する洗剤組成物である。

界面活性剤（Ｄ）としては、ノニオン性界面活性剤（Ｄ−１）、アニオン性界面活性剤（Ｄ−２）、カチオン性界面活性剤（Ｄ−３）及び両性界面活性剤（Ｄ−４）が含まれる。

ノニオン性界面活性剤（Ｄ−１）としては、脂肪族アルコール（炭素数８〜２４）アルキレンオキサイド（炭素数２〜８）付加物（重合度＝１〜１００）［具体的には、オレイルアルコールエチレンオキサイド１１モル付加物等］、（ポリ）オキシアルキレン（炭素数２〜８、重合度＝１〜１００）グリコール高級脂肪酸（炭素数８〜２４）エステル［具体的には、モノステアリン酸ポリエチレングリコール（重合度＝２０）及びジステアリン酸ポリエチレングリコール（重合度＝３０）等］、多価（２価〜１０価又はそれ以上）アルコール脂肪酸（炭素数８〜２４）エステル［具体的には、モノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸エチレングリコール及びモノラウリン酸ソルビタン等］、多価（２価〜１０価又はそれ以上）アルコール高級脂肪酸（炭素数８〜２４）エステル（ポリ）アルキレンオキサイド付加物（アルキレン基の炭素数２〜８，重合度＝１〜１００）［具体的には、ソルビタンモノラウレートエチレンオキサイド（重合度＝１０）付加物及びメチルグルコースジオレエートエチレンオキサイド（重合度＝５０）付加物等］、脂肪酸Ｎ−ヒドロキシアルキルアミド［具体的には、１：１型ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド及び１：１型ラウリン酸ジエタノールアミド等］、アルキル（炭素数１〜２２）（ポリ）オキシアルキレン（炭素数２〜８、重合度＝１〜１００）フェニルエーテル、アルキル（炭素数８〜２４）（ポリ）オキシアルキレン（炭素数２〜８、重合度＝１〜１００）−アミノアルキル（炭素数８〜２４）−エーテル及びアルキル（炭素数８〜２４）ジアルキル（炭素数１〜６）アミンオキシド［具体的には、ラウリルジメチルアミンオキシド等］等が挙げられる。

アニオン性界面活性剤（Ｄ−２）としては、炭素数８〜２４のアルキルエーテルカルボン酸又はその塩及び炭素数８〜２４のアルキル（ポリ）オキシエチレンエーテルカルボン酸又はその塩［具体的には、（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）ラウリルエーテル酢酸ナトリウム及び（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）ラウリルスルホコハク酸２ナトリウム等］、炭素数８〜２４のアルキル硫酸エステル塩及び炭素数８〜２４のアルキル（ポリ）オキシエチレン硫酸エステル塩［具体的には、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）硫酸ナトリウム及びラウリル（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）硫酸−トリエタノールアミン塩等］、ヤシ油脂肪酸モノエタノールアミド硫酸スルホン酸ナトリウム、炭素数８〜２４のアルキルフェニルスルホン酸塩［具体的には、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム及びドデシルベンゼンスルホン酸モノエタノールアミン塩等］、炭素数８〜２４のアルキルリン酸エステル塩及び炭素数８〜２４のアルキル（ポリ）オキシエチレンリン酸エステル塩［具体的には、ラウリルリン酸ナトリウム及び（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）ラウリルエーテルリン酸ナトリウム等］、脂肪酸塩［具体的には、ラウリン酸ナトリウム及びラウリン酸トリエタノールアミン等］、アシル化アミノ酸塩［具体的には、ヤシ油脂肪酸メチルタウリンナトリウム、ヤシ油脂肪酸ザルコシンナトリウム、ヤシ油脂肪酸ザルコシントリエタノールアミン、Ｎ−ヤシ油脂肪酸アシル−Ｌ−グルタミン酸トリエタノールアミン、Ｎ−ヤシ油脂肪酸アシル−Ｌ−グルタミン酸ナトリウム及びラウロイルメチル−β−アラニンナトリウム等］が挙げられる。

カチオン性界面活性剤（Ｄ−３）としては、第４級アンモニウム塩型［具体的には、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ベヘニルトリメチルアンモニウム、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム及びエチル硫酸ラノリン脂肪酸アミノプロピルエチルジメチルアンモニウム等］及びアミン塩型［具体的には、ステアリン酸ジエチルアミノエチルアミド乳酸塩、ジラウリルアミン塩酸塩及びオレイルアミン乳酸塩等］等が挙げられる。

両性界面活性剤（Ｄ−４）としては、ベタイン型両性界面活性剤［具体的には、ヤシ油脂肪酸アミドプロピルジメチルアミノ酢酸ベタイン、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン、２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン、ラウリルヒドロキシスルホベタイン及びラウロイルアミドエチルヒドロキシエチルカルボキシメチルベタインヒドロキシプロピルリン酸ナトリウム等］、アミノ酸型両性界面活性剤［具体的には、β−ラウリルアミノプロピオン酸ナトリウム等］が挙げられる。

界面活性剤（Ｄ）としては、１種又は２種以上を使用することができる。２種以上の界面活性剤を使用する場合、その組み合わせとしては、ノニオン性界面活性剤とアニオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤とカチオン性界面活性剤及びノニオン性界面活性剤と両性界面活性剤との組み合わせ等が挙げられる。

界面活性剤（Ｄ）として、洗剤として用いた際の洗浄性の観点から、ノニオン性界面活性剤単独での使用、及びノニオン性界面活性剤とアニオン性界面活性剤との組み合わせでの使用が好ましい。
ノニオン性界面活性剤としては、洗浄性の観点から、脂肪族アルコール（炭素数８〜２４）エチレンオキサイド付加物（重合度＝１〜１００）が好ましく、さらに好ましくは脂肪族アルコール（炭素数１２〜１８）エチレンオキサイド付加物（重合度４〜２０）、次にさらに好ましくは脂肪族アルコール（炭素数１２〜１５）エチレンオキサイド付加物（重合度＝８〜１２）、特に好ましくはオレイルアルコールエチレンオキサイド１１モル付加物である。
アニオン性界面活性剤としては、洗浄性の観点から、炭素数８〜２４のアルキルフェニルスルホン酸塩、脂肪酸塩、炭素数８〜２４のアルキル硫酸エステル塩及び炭素数８〜２４のアルキル（ポリ）オキシエチレン硫酸エステル塩が好ましく、さらに好ましくは、炭素数１２〜１６のアルキルフェニルスルホン酸塩及び炭素数８〜１６の脂肪酸塩、次にさらに好ましくは、ドデシルベンゼンスルホン酸モノエタノールアミン塩及びラウリン酸ナトリウムであり、特に好ましくはドデシルベンゼンスルホン酸モノエタノールアミン塩である。

本発明の洗剤組成物中に含まれるタンパク質溶液（Ｘ）の含有量は、洗浄性の観点から、（Ｘ）及び（Ｄ）の合計重量を基準として、４０〜９９重量％が好ましく、さらに好ましくは５０〜９０重量％、特に好ましくは６０〜８０重量％である。
洗剤組成物中に含まれる界面活性剤（Ｄ）の含有量は、洗浄性の観点から、（Ｘ）及び（Ｄ）の合計重量を基準として、１〜６０重量％が好ましく、さらに好ましくは１０〜５０重量％、特に好ましくは２０〜４０重量％である。

本発明の洗剤組成物中に含まれるプロテアーゼ（Ａ）の含有量は、洗浄性の観点から、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）の合計重量を基準として、０．０００００００１〜０．５重量％が好ましく、さらに好ましくは０．０００００００１〜０．２５重量％である。
本発明の洗剤組成物中に含まれるプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）の含有量は、プロテアーゼ活性の抑制及び回復の観点から、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）の合計重量を基準として、０．００００００００１〜１０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．０００００００１〜２重量％である。
本発明の洗剤組成物中に含まれる溶剤（Ｃ）の含有量は、プロテアーゼおよびプロテアーゼ活性阻害剤の安定性の観点から、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）の合計重量を基準として、３９．５〜９８．９９９９９９９８９重量％が好ましく、さらに好ましくは４７．７５〜８９．９９９９９９９８重量％である。
本発明の洗剤組成物中に含まれる界面活性剤（Ｄ）の含有量は、洗浄性の観点から、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）の合計重量を基準として、１〜６０重量％が好ましく、さらに好ましくは１０〜５０重量％、特に好ましくは２０〜４０重量％である。

洗剤組成物中に含まれるプロテアーゼ（Ａ）の含有量は、洗浄性の観点から、洗剤組成物の重量を基準として、０．００００００００８〜０．４重量％が好ましく、さらに好ましくは０．００００００００８〜０．２２である。
洗剤組成物中に含まれるプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）の含有量は、プロテアーゼ活性の抑制の観点から、洗剤組成物の重量を基準として、０．００００００００８〜８重量％が好ましく、さらに好ましくは０．０００００００８〜８重量％である。
洗剤組成物中に含まれる溶剤（Ｃ）の含有量は、プロテアーゼおよびプロテアーゼ活性阻害剤の安定性の観点から、洗剤組成物の重量を基準として、２６〜８５．８重量％が好ましく、さらに好ましくは３９〜８０．６重量％である。
洗剤組成物中に含まれる界面活性剤（Ｄ）の含有量は、洗浄性の観点から、洗剤組成物の重量を基準として、０．８〜６１重量％が好ましく、さらに好ましくは８〜５０．７８重量％である。

本発明において、洗剤組成物中のプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）とプロテアーゼ（Ａ）の重量比（（Ｂ）の重量／（Ａ）の重量）は、０．５〜３０が好ましく、さらに好ましくは０．９〜２０、特に好ましくは１〜２０である。
（Ｂ）と（Ａ）との含有量の比が０．５以上であることで、プロテアーゼ活性を十分抑制でき、長期間保存後も洗浄性を保つことができるので好ましい。また、３０以下であることで、希釈時にプロテアーゼ活性が効率よくもどり、洗浄性が良好となるので好ましい。

洗剤組成物中のプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）とプロテアーゼ（Ａ）とのモル比｛（Ｂ）のモル数／（Ａ）のモル数｝は、０．０１〜３００が好ましく、さらに好ましくは０．１〜３００であり、次にさらに好ましくは１〜３００であり、特に好ましくは１〜１００であり、次に特に好ましくは１〜１０である。
プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）とプロテアーゼ（Ａ）とのモル比が０．０１以上であることで、プロテアーゼ活性を十分抑制でき、長期間保存後もプロテアーゼ活性を保つことができるので好ましい。また、３００以下であることで、希釈時にプロテアーゼ活性が効率よくもどり、洗浄性が良好となるので好ましい。

本発明における洗剤組成物には、上記タンパク質溶液（Ｘ）及び界面活性剤（Ｄ）以外に、無機塩（Ｅ）、糖（Ｆ）、アミノ酸（Ｇ）、脂肪酸（Ｉ）、油脂（Ｊ）、その他の低分子有機化合物（Ｈ）、プロテアーゼ以外の酵素（Ｋ）、ｐＨ調整剤（Ｌ）、ビルダー（Ｍ）、アルカリ剤（Ｎ）及びキレート剤（Ｏ）を含有することができる。

無機塩（Ｅ）、糖（Ｆ）、アミノ酸（Ｇ）、脂肪酸（Ｉ）、油脂（Ｊ）、その他の低分子有機化合物（Ｈ）、プロテアーゼ以外の酵素（Ｋ）及びｐＨ調整剤（Ｌ）、としては、上記のものが挙げられる。

ビルダー（Ｍ）としては、液体洗剤に用いられる公知のものを用いることができ、具体的には、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）等の再汚染防止剤等が挙げられる。

アルカリ剤（Ｎ）として、苛性ソーダ、ソーダ灰、アンモニア、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン、モノエタノールアミン及びトリポリリン酸ソーダ等が挙げられる。

キレート剤（Ｏ）としては、液体洗剤に用いられる公知のものを用いることができる。具体的には、アミノポリ酢酸（ニトリロ三酢酸、イミノ二酢酸、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸、トリエチレンテトラアミン六酢酸及びジエンコル酸等）、有機酸（ジグリコール酸、オキシジコハク酸、カルボキシメチルオキシコハク酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、シュウ酸、リンゴ酸、オキシジコハク酸、グルコン酸、カルボキシメチルコハク酸及びカルボキシメチル酒石酸等）、アミノトリ（メチレンホスホン酸）、１−ヒドロキシエチリデン−１，１−ジホスホン酸、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）、ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸）及びこれらのアルカリ金属若しくは低級アミン塩等が挙げられる。

本発明の洗剤組成物中に含まれる無機塩（Ｅ）の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から洗剤組成物の重量に対し０〜１０％が好ましく、さらに好ましくは０〜５％、特に好ましくは０〜３％である。
本発明の洗剤組成物中に含まれる糖（Ｆ）の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から洗剤組成物の重量に対し０〜５０％が好ましく、さらに好ましくは０〜３０％、特に好ましくは０〜２０％である。
本発明の洗剤組成物中に含まれるアミノ酸（Ｇ）の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から洗剤組成物の重量に対し０〜５０％が好ましく、さらに好ましくは０〜３０％、特に好ましくは０〜２０％である。
本発明の洗剤組成物中に含まれる低分子有機化合物（Ｈ）の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から洗剤組成物の重量に対し０〜５０％が好ましく、さらに好ましくは０〜３０％、特に好ましくは０〜２０％である。
本発明の洗剤組成物中に含まれる脂肪酸（Ｉ）の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から洗剤組成物の重量に対し０〜５０％が好ましく、さらに好ましくは０〜３０％、特に好ましくは０〜２０％である。
本発明の洗剤組成物中に含まれる油脂（Ｊ）の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から洗剤組成物の重量に対し０〜５０％が好ましく、さらに好ましくは０〜３０％、特に好ましくは０〜２０％である。
本発明の洗剤組成物中に含まれるプロテアーゼ以外の酵素（Ｋ）の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から洗剤組成物の重量に対し０〜５０％が好ましく、さらに好ましくは０〜３０％、特に好ましくは０〜２０％である。
本発明の洗剤組成物中に含まれるｐＨ調整剤（Ｌ）の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から洗剤組成物の重量に対し０〜２５が好ましく、さらに好ましくは０．０１〜１５、特に好ましくは１〜１０である。
本発明の洗剤組成物中に含まれるビルダー（Ｍ）の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から洗剤組成物の重量に対し０〜５が好ましく、さらに好ましくは０〜３、次にさらに好ましくは０〜１である。
本発明の洗剤組成物中に含まれるアルカリ剤（Ｎ）の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から洗剤組成物の重量に対し０〜５が好ましく、さらに好ましくは０．１〜４、次にさらに好ましくは０．５〜３である。
本発明の洗剤組成物中に含まれるキレート剤（Ｏ）の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から洗剤組成物の重量に対し０〜５が好ましく、さらに好ましくは０〜３、次にさらに好ましくは０〜２である。

本発明における洗剤組成物のｐＨは、タンパク質の安定性及び洗浄性の観点から、１％（ｗ／ｗ）水溶液で７〜１１が好ましく、さらに好ましくは７〜１０である。
洗剤組成物のｐＨは、ｐＨ調整剤（Ｌ）によって適宜調整できる。

本発明の洗剤組成物は、各成分を混合することにより得られ、製造方法は特に限定されるものではない。１例を下記に示す。
（１）溶剤（Ｃ）にプロテアーゼ（Ａ）、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）及びプロテアーゼ以外の酵素（Ｋ）以外の成分を所定量添加し均一に溶解させる。
（２）プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）を加え、２５℃で均一になるまで攪拌する。
（３）プロテアーゼ（Ａ）及び必要によりプロテアーゼ以外の酵素（Ｋ）を添加し溶解させる。
（４）界面活性剤（Ｄ）を混合し、洗剤組成物を製造する。
また、別の１例として下記に示す。
（１’）上記本発明のタンパク質溶液に界面活性剤（Ｄ）を混合し、２５℃で均一になるまで攪拌する。

以下の実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

＜製造例１＞
配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子（５‘末端側に制限酵素ＮｃｏＩ，３’末端側に制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列を付加し、北海道システムサイエンス社に人工合成を依頼したもの）を制限酵素ＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩで処理し、ｐＥＴ−２２ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＮｃｏＩ制限酵素サイトとＢａｍＨＩ制限酵素サイトに結合し、配列番号１のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ１）（配列番号４）を作成した。得られたプラスミドＰ１を大腸菌Ｅ．Ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）へ形質転換に供した。即ち、制限酵素処理ＰＣＲ産物５μＬを１００μＬのＥ．Ｃｏｌｉ ＤＨ５α コンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ製）に添加し、氷上で３０分間保存した後、４２℃で９０秒間加熱した。ここにＳＯＣ培地（ＴＯＹＯＢＯ製）９００μＬを添加し、３７℃で１時間静置培養した。培養液のうち１００μＬをＬＢ／アンピシリンプレートに塗布し、３７℃で一晩培養し、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）発現株を得た。
得られたプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）発現株をＬＢ培養液（アンピシリン １００ｍｇ／Ｌ含有）１ｍＬに植菌して３０℃で１２時間培養を行い、終夜培養液を作成し、０．５ｍｌをＬＢ培養液（アンピシリン １００ｍｇ／Ｌ含有）５ｍｌに植菌して３０℃３時間振とう培養を行い前培養液を作成した。前培養液を５０ｍＬの培養液｛水５０ｍＬ中のそれぞれの成分の含有量は、酵母エキス（日本製薬社製）１．２ｇ、ポリペプトン（日本製薬社製）０．６ｇ、リン酸２カリウム０．４７ｇ、リン酸１カリウム０．１１ｇ、硫酸アンモニウム０．３５ｇ、リン酸２ナトリウム１２水和物０．６６ｇ、クエン酸ナトリウム２水和物０．０２ｇ、グリセロール０．２ｇ、ラクトアルブミン水解物１．５ｇ、消泡剤（信越シリコーン製、「ＫＭ−７０」）０．３ｇ、１ｍＭ硫酸マグネシウム、微量金属溶液（塩化カルシウム１８．９μｇ、塩化鉄（ＩＩＩ）５００μｇ、硫酸亜鉛７水和物９．０μｇ、硫酸銅５．１μｇ、塩化マンガン４水和物６．７μｇ、塩化コバルト４．９μｇ、エチレンジアミン４酢酸４ナトリウム２００μｇ）、１００ｍｇ／Ｌアンピシリン｝に植菌し微生物培養装置（エイブル社製、製品名「ＢｉｏＪｒ．８」）を用いてｐＨ６．８、３０℃を維持したまま培養を行った。培養開始後１Ｍ ＩＰＴＧ溶液を０．１５ｍＬを加えた。培養開始１４時間後から、グリセリン／タンパク質溶液（５０％ グリセリン、５０ｇ／Ｌ ラクトアルブミン水解物、３３ｇ／Ｌ 消泡剤（信越シリコーン製、「ＫＭ−７０」）、１００ｍｇ／Ｌ アンピシリン）の滴下を開始した。培養開始後、４８時間目に培養液を回収した。
得られた培養液をＨｉｓ-ｔａｇ精製用担体（ＧＥヘルスケア社製 Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）で分離し、配列番号１のアミノ酸配列（Ｈｉｒｕｄｏ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ由来エグリンｃ）のプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）を含む溶液（Ｌ−１）を得た。（Ｌ−１）中のプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）の濃度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定したところ、１ｇ／Ｌ（１３５μＭ）であった。

＜製造例２＞
製造例１において、プラスミドＰ１に変えて、プラスミドＰ２（配列番号５）を用いる以外は同様にして、配列番号２のアミノ酸配列（ジャガイモ由来ペプチダーゼインヒビターＩ）のプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ２）を含む溶液（Ｌ−２）を得た。（Ｌ−２）中のプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ２）の濃度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定したところ、１ｇ／Ｌ（３３３μＭ）であった。

＜製造例３＞
製造例１において、プラスミドＰ１に変えて、プラスミドＰ３（配列番号６）を用いる以外は同様にして、配列番号３のアミノ酸配列（オオムギ由来プロテアーゼインヒビター）のプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ３）を含む溶液（Ｌ−３）を得た。（Ｌ−３）中のプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ３）の濃度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定したところ、１ｇ／Ｌ（１４３μＭ）であった。

＜アルカラーゼのプロテアーゼ活性の最適ｐＨの測定＞
アルカラーゼ（ノボザイムズ社）１ｍＬを９９ｍＬのバッファー１［５０ｍＭ リン酸Ｎａバッファー（ｐＨ８．５、２５℃）水溶液］に溶解させ、アルカラーゼ溶液（Ａ１−１）（０．３７μＭ）とした。
（Ａ１−１）を１５７０μＬ、分光光度計のセル（底面積１ｃｍ×１ｃｍ）に入れた。分光光度計の試料室を２５℃に保ち、セルを試料室内で５分静置し、温調した。ここに、２５℃に温調した基質溶液（１）（Ｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ（Ｂａｃｈｅｍ ＡＧ社製、品名：Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ）をバッファー１溶解して５ｍｇ／ｍＬ（０．１１９ｍＭ）の濃度にしたもの）を４００μＬ添加し、酵素反応溶液（ＩＩ−１）とした。（ＩＩ−１）を作成直後及び５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
同様に、バッファー１に代えてバッファー２［５０ｍＭ 酢酸Ｎａバッファー（ｐＨ５．５、２５℃）水溶液］、バッファー３［５０ｍＭ 酢酸Ｎａバッファー（ｐＨ６．５、２５℃）水溶液］、バッファー４［５０ｍＭ リン酸Ｎａバッファー（ｐＨ６．５、２５℃）水溶液］、バッファー５［５０ｍＭ リン酸Ｎａバッファー（ｐＨ７．５、２５℃）水溶液］、バッファー６［５０ｍＭ ＴＡＰＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ８．５、２５℃）水溶液］及びバッファー７［５０ｍＭ ＴＡＰＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ９．５、２５℃）水溶液］をそれぞれ用いてアルカラーゼ溶液（Ａ２）〜（Ａ７）及び基質溶液（２）〜（７）を作成した。
（Ａ１）に代えて（Ａ２）〜（Ａ７）を、基質溶液（１）に代えて基質溶液（２）〜（７）それぞれ用いる以外は同様にして、酵素反応溶液（ＩＩ−２）〜（ＩＩ−７）を作成し、（ＩＩ−２）〜（ＩＩ−７）を作成直後及び５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
酵素反応溶液（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−７）について、それぞれ（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−７）を作成した直後の吸光度をＡλ₀、ｈ秒後の吸光度をＡλ_hとし、吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλ_h−Ａλ₀）を縦軸に、時間ｈを横軸にプロットし、直線の傾き係数ｋを求た。縦軸を係数ｋ、横軸をｐＨとしてプロットし（図２）、係数ｋが極大値となるｐＨを求めたところ、最適ｐＨはｐＨ８．５であった。
なお、バッファーの種類を変える境目のｐＨ（ｐＨ６.５及び８.５）において、両方のバッファーで活性を測定しておき、片方のバッファーで測定した値を基準として活性を補正した。ｐＨ６.５（バッファー３及び４）では、バッファー４を使用して求めた値をｐＨ６.５での結果とし、バッファー２を用いて求めた係数ｋにはバッファー３と４の比（バッファー４での係数ｋ／バッファー３での係数ｋ）をかけて補正した。同様に、ｐＨ８.５（バッファー１及び７）ではバッファー１での値をｐＨ８.５の結果とし、バッファー７を用いて求めた係数ｋにはバッファー１と７の比（バッファー１での係数ｋ／バッファー７での係数ｋ）をかけて補正した。

＜アルカラーゼのプロテアーゼ活性の最適温度の測定＞
アルカラーゼ溶液（Ａ１−１）（０．３７μＭ）を１５７０μＬ、分光光度計のセル（底面積１ｃｍ×１ｃｍ）に入れた。分光光度計の試料室を２０℃に保ち、セルを試料室内で５分静置した。
次に、セルに、２０℃に温調した基質溶液（１）（０．１１９ｍＭ、ｐＨ８.５）を４００μＬ添加し、酵素反応溶液（ＩＩＩ−１）とした。（ＩＩＩ−１）を作成直後及び５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
分光光度計の試料室をそれぞれ１０℃、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃又は８０℃に設定して温調し、基質溶液（１）も試料室と同じ温度で温調してからセルに添加する以外は同様にして、酵素反応溶液（ＩＩＩ−２）〜（ＩＩＩ−８）を作成した。（ＩＩＩ−２）〜（ＩＩＩ−８）を作成直後及び５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
酵素反応溶液（ＩＩＩ−１）〜（ＩＩＩ−８）について、それぞれ（ＩＩＩ−１）〜（ＩＩＩ−８）を作成した直後の吸光度をＡλ₀、ｈ秒後の吸光度をＡλ_hとし、吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλ_h−Ａλ₀）を縦軸に、時間ｈを横軸にプロットし、直線の傾き係数ｋを求た。縦軸を係数ｋ、横軸を温度としてプロットし（図３）、係数ｋが極大値となる温度を求めたところ、最適温度は５０℃であった。

＜アルカラーゼに対する基質のミカエリス定数Ｋｍの測定＞
アルカラーゼ溶液（Ａ１−１）（０．３７μＭ）を１５７０μＬ、分光光度計のセル（底面積１ｃｍ×１ｃｍ）に入れた。分光光度計の試料室を５０℃に保ち、セルを試料室内で５分静置した。ここに、５０℃に温調した基質溶液（１）（０．１１９ｍＭ、ｐＨ８．５）を４００μＬ添加し、酵素反応溶液（Ｉ−１）とした。（Ｉ−１）を作成直後及び５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
基質溶液（１）において、Ｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅのバッファー１中のモル濃度を０．０２４ｍＭ（基質溶液（８）、１ｍｇ／ｍＬ）、０．２３７ｍＭ（基質溶液（９）、１０ｍｇ／ｍＬ）、０．４７４ｍＭ（基質溶液（１０）、２０ｍｇ／ｍＬ）および１．１９ｍＭ（基質溶液（１１）、５０ｍｇ／ｍＬ）とした溶液を作成した。基質溶液（１）に代えて基質溶液（８）〜（１１）を用いる以外は同様にして酵素反応溶液（Ｉ−２）〜（Ｉ−５）を作成した。（Ｉ−２）〜（Ｉ−５）を作成直後及び５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
（Ｉ−１）〜（Ｉ−５）を作成直後の吸光度をＡλ₀、ｈ秒後の吸光度をＡλ_hとし、それぞれ吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλ_h−Ａλ₀）と４０５ｎｍにおけるモル吸光定数εを用いて下記数式（１）からそれぞれの酵素反応初速度ｖ（Ｍ／ｓ）を算出した。
ｖ＝ΔＡλ／（ε×ｈ×３６００）（１）
算出した酵素反応初速度ｖを用いて、横軸（ｘ軸）にそれぞれの基質濃度［Ｓ］、縦軸（ｙ軸）にそれぞれの基質濃度での酵素反応初速度の逆数１／ｖをプロットし、Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを作成した（図１）。プロットの近似直線とｘ軸との交点（−Ｋｍ）から、ミカエリス定数Ｋｍは０．７ｍＭであった。

＜プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）のアルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉの測定＞
製造例１で得たプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）を含む溶液（Ｌ−１）（１ｇ／Ｌ）１ｍＬを４９９ｍＬのバッファー１（ｐＨ８．５）で希釈し、プロテアーゼ活性阻害剤溶液（Ｂ１−１）（２７０ｎＭ）とした。（Ｂ１−１）をバッファー１で１／５０００００、１／３０００００、１／１０００００および１／５００００倍のモル濃度に希釈したものを（Ｂ１−２）〜（Ｂ１−５）とした。
アルカラーゼ溶液（Ａ１−１）を、バッファー１で２００万倍希釈し、アルカラーゼ溶液（Ａ１−８）（０．１４ｐＭ）とした。
分光光度計のセル（底面積１ｃｍ×１ｃｍ）、アルカラーゼ溶液（Ａ１―８）を８００μＬ及び（Ｂ１−１）を８００μＬ添加し、アルカラーゼ・プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）混合溶液（ｉ−１）を作成した。
分光光度計の試料室を５０℃に保ち、セルを試料室内で３０分静置した。ここに、５０℃に温調した基質溶液（９）（０．２３７ｍＭ、ｐＨ８．５）を４００μＬ添加し、酵素反応溶液（ＩＶ−１）を作成した。（ＩＶ−１）を作成直後及び１０分おきに６時間の４０５ｎｍにおける吸光度を記録した。
（Ｂ１−１）に代えて（Ｂ１−２）〜（Ｂ１−５）及びバッファー１をそれぞれ用いる以外は同様にして、アルカラーゼ・プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）混合溶液（ｉ−２）〜（ｉ−６）を作成し、基質溶液（１１）（１．１９ｍＭ、ｐＨ８．５）を用いて酵素反応溶液（ＩＶ−２）〜（ＩＶ−６）を作成し、同様に吸光度を記録した。
（ＩＶ−１）〜（ＩＶ−６）を作成直後の吸光度をＡλ₀、ｈ時間後の吸光度をＡλ_hとし、それぞれ吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλ_h−Ａλ₀）と４０５ｎｍにおけるモル吸光定数εを用いて下記数式（１）からそれぞれの酵素反応初速度ｖ（Ｍ／ｓ）を算出した。
ｖ＝ΔＡλ／（ε×ｈ×３６００）（１）
（ＩＶ−１）〜（ＩＶ−５）の酵素反応初速度ｖｉ、（ＩＶ−６）（（Ｂ１−１）に代えてバッファー１を用いたもの）の酵素反応初速度をｖｏとし、各（Ｂ１）濃度での相対活性α（ｘ＝ｖｉ／ｖｏ）を算出した。
横軸に１／αを、縦軸に［（Ｂ１）のモル濃度］／（１−α）をプロットし、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎプロットを作成した（図４）。このプロットに近似直線を描いたときの傾きＫｉ（ａｐｐ）、測定時の基質濃度［Ｓ］、ミカエリス定数Ｋｍ、および式Ｋｉ＝Ｋｉ（ａｐｐ）／（１＋［Ｓ］／Ｋｍ）を用いて阻害定数Ｋｉを算出した。近似直線の交点から、Ｋｉは１．２ｐＭであった。

＜プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ２）のアルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉの測定＞
製造例２で得たプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ２）を含む溶液（Ｌ−２）（１ｇ／Ｌ）１ｍＬを９ｍＬのバッファー１（ｐＨ８．５）で希釈し、プロテアーゼ活性阻害剤溶液（Ｂ２−１）（３３．３μＭ）とした。（Ｂ２−１）をバッファー１で１／５０、１／１５、１／１０および１／５倍のモル濃度に希釈したものを（Ｂ２−２）〜（Ｂ２−５）とした。
「プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）のアルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉの測定」において、「アルカラーゼ溶液（Ａ１−８）」に代えて「アルカラーゼ溶液（Ａ１−１）」を用いて、「プロテアーゼ活性阻害剤溶液（Ｂ１−１）〜（Ｂ１−５）」に代えて「プロテアーゼ活性阻害剤溶液（Ｂ２−１）〜（Ｂ２−５）」を用いて、「１０分おきに６時間の４０５ｎｍにおける吸光度を記録」に代えて「５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を記録」する以外は同様の方法を用いて、配列番号２のアミノ酸配列を持つプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ２）のアルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉを求めた。Ｋｉは２．３μＭであった。

＜プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ３）のアルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉの測定＞
製造例３及で得たプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ３）を含む溶液（Ｌ−３）（１ｇ／Ｌ）１ｍＬを９ｍＬのバッファー１（ｐＨ８．５）で希釈し、プロテアーゼ活性阻害剤溶液（Ｂ３−１）（１４．３μＭ）とした。（Ｂ３−１）をバッファー１で１／５０、１／１５、１／１０および１／５倍のモル濃度に希釈したものを（Ｂ３−２）〜（Ｂ３−５）とした。
「プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）のアルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉの測定」において、「アルカラーゼ溶液（Ａ１−８）」に代えて「アルカラーゼ溶液（Ａ１−１）」を用いて、「プロテアーゼ活性阻害剤溶液（Ｂ１−１）〜（Ｂ１−５）」に代えて「プロテアーゼ活性阻害剤溶液（Ｂ３−１）〜（Ｂ３−５）」を用いて、「１０分おきに６時間の４０５ｎｍにおける吸光度を記録」に代えて「５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を記録」する以外は同様の方法を用いて、配列番号３のアミノ酸配列を持つプロテアーゼ活性阻害剤のアルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉを求めた。Ｋｉは０．５ｐＭであった。

＜４−カルボキシフェニルボロン酸のアルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉの測定＞
４−カルボキシフェニルボロン酸（東京化成工業株式会社）５０ｍｇを５０ｍＬのバッファー１（ｐＨ８．５）に溶解させ、カルボキシフェニルボロン酸溶液（Ｂ４−１）（８．２ｍＭ）とした。（Ｂ４−１）をバッファー１で１／１０、１／４、１／２および３／４のモル濃度に希釈したものを（Ｂ４−２）〜（Ｂ４−５）とした。
「プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）のアルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉの測定」において、「アルカラーゼ溶液（Ａ１−８）」に代えて「アルカラーゼ溶液（Ａ１−１）」を用いて、「（Ｂ１−１）〜（Ｂ１−５）」に代えて「（Ｂ４−１）〜（Ｂ４−５）」を用いて、「１０分おきに６時間の４０５ｎｍにおける吸光度を記録」に代えて「５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を記録」する以外は同様の方法を用いて、４−カルボキシフェニルボロン酸のアルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉを求めた。Ｋｉは１９μＭであった。

＜サビナーゼ活性の最適ｐＨの測定＞
サビナーゼ（ノボザイムス社製）１ｍＬをそれぞれバッファー１〜７及びバッファー８［５０ｍＭ ＴＡＰＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ１０．５、２５℃）水溶液］（９９ｍＬ）で希釈し、サビナーゼ溶液（Ａ２−１）〜（Ａ２−８）とした。
「アルカラーゼのプロテアーゼ活性の最適ｐＨの測定］において、「アルカラーゼ溶液（Ａ１−１）〜（Ａ１−７）」に代えて「サビナーゼ溶液（Ａ２−１）〜（Ａ２−８）」を用いて、「基質溶液（１）〜（７）」に代えて「基質溶液（１）〜（７）及び（１２）｛基質溶液（１２）はバッファー８を用いて基質濃度：５ｍｇ／ｍＬ（０．１１９ｍＭ）としたもの｝」を用いる以外は同様にして測定したところ、サビナーゼの活性の最適ｐＨは９．５であった。

＜サビナーゼのプロテアーゼ活性の最適温度の測定＞
「アルカラーゼのプロテアーゼ活性の最適温度の測定」において、「アルカラーゼ溶液（Ａ１−１）」に代えて「サビナーゼ溶液（Ａ２−７）」を用いて、「基質溶液（１）」に代えて「基質溶液（７）（ｐＨ９．５）」を用いて、「バッファー１」に代えて「バッファー７」を用いる以外は同様の方法を用いて、サビナーゼのプロテアーゼ活性の最適温度の測定を測定した。最適温度は５０℃であった。

＜サビナーゼに対する基質のミカエリス定数Ｋｍの測定＞
「アルカラーゼに対する基質のミカエリス定数Ｋｍの測定」において「アルカラーゼ溶液（Ａ１−１）」に代えて、「サビナーゼ溶液（Ａ２−７）」を用いて、「基質溶液（１）及び（８）〜（１１）」に代えて「基質溶液（７）及び（１４）〜（１７）｛基質溶液（１４）〜（１７）は、バッファー７を用いて、それぞれ基質濃度：１ｍｇ／ｍＬ（０．０２４ｍＭ）、１０ｍｇ／ｍＬ（０．２３７ｍＭ）、２０ｍｇ／ｍＬ（０．４７４ｍＭ）、５０ｍｇ／ｍＬ（１．１９ｍＭ）としたもの｝」を用いて、「バッファー１」に代えて「バッファー７」を用いる以外は同様の方法を用いて、サビナーゼのプロテアーゼ活性の最適温度の測定を測定した。ミカエリス定数Ｋｍは０．７ｍＭであった。

＜プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）のサビナーゼに対する阻害定数Ｋｉの測定＞
製造例１で得たプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）を含む溶液（Ｌ−１）（１ｇ／Ｌ）１ｍＬを４９９ｍＬのバッファー７（ｐＨ９．５）で希釈し、プロテアーゼ活性阻害剤溶液（Ｂ１−６）（２７０ｎＭ）とした。（Ｂ１−６）をバッファー７で１／５０００００、１／３０００００、１／１０００００および１／５００００倍のモル濃度に希釈したものを（Ｂ１−７）〜（Ｂ１−１０）とした。
サビナーゼ溶液（Ａ２−７）をバッファー７で２０万倍希釈し、サビナーゼ溶液（Ａ２−９）とした。
「プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）のサビナーゼに対する阻害定数Ｋｉの測定」において、「アルカラーゼ溶液（Ａ１−８）」に代えて、「サビナーゼ溶液（Ａ２−９）」を用いて、「（Ｂ１−１）〜（Ｂ１−５）」に代えて「（Ｂ１−６）〜（Ｂ１−１０）」を用いて、「バッファー１」に代えて「バッファー７」を用いて、「基質溶液（９）及び（１１）」に代えて「基質溶液（１５）及び（１７）」を用いる以外は同様にして、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）のサビナーゼに対する阻害定数Ｋｉを求めた。プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）のサビナーゼに対するＫｉは４．７ｐＭであった。

＜プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ２）のサビナーゼに対する阻害定数Ｋｉの測定＞
製造例２及で得たプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ２）を含む溶液（Ｌ−２）（１ｇ／Ｌ）１ｍＬを９ｍＬのバッファー７（ｐＨ９．５）で希釈し、プロテアーゼ活性阻害剤溶液（Ｂ２−６）（３３．３μＭ）とした。（Ｂ２−６）をバッファー７で１／５０、１／１５、１／１０および１／５倍のモル濃度に希釈したものを（Ｂ２−７）〜（Ｂ２−１０）とした。
「プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ２）のアルカラーゼに対する阻害定数Ｋｉの測定」において、「アルカラーゼ溶液（Ａ１−８）」に代えて、サビナーゼ溶液（Ａ２−９）を用いて、「（Ｂ２−１）〜（Ｂ２−５）」に代えて「（Ｂ２−６）〜（Ｂ２−１０）」を用いて、「バッファー１」に代えて「バッファー７」を用いて、「基質溶液（９）及び（１１）」に代えて「基質溶液（１５）及び（１７）」を用いる以外は同様にして、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ２）のサビナーゼに対する阻害定数Ｋｉを求めた。プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ２）のサビナーゼに対するＫｉは２．５μＭであった。

＜実施例１〜３２＞
表１及び２に記載の割合で、４０℃で配合し、タンパク質溶液（Ｘ−１）〜（Ｘ−３２）を作成した。下記吸光度を利用した活性測定法により、プロテアーゼ活性Ｘｉを測定した。結果を表１及び２に示す。

＜比較例１〜２２＞
表３及び４に記載の割合で、４０℃で配合し、タンパク質溶液（Ｘ’−１）〜（Ｘ’−２２）を作成した。下記吸光度を利用した活性測定法により、プロテアーゼ活性Ｘｉを測定した。結果を表３及び４に示す。

＜タンパク質溶液（Ｘ）の吸光度を利用した活性測定法＞
タンパク質溶液（Ｘ−１）〜（Ｘ−３２）及び（Ｘ’−１）〜（Ｘ’−２２）をそれぞれ１５７０μＬを分光光度計のセル（底面積１ｃｍ×１ｃｍ）に入れ、分光光度計の試料室を２５℃に保ち、セルを試料室内で３０分静置した。ここに、２５℃に温調した基質溶液（１８）｛基質（サクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリド）をバッファー１に溶解して１０ｍｇ／ｍＬ（１６ｍＭ）の濃度にしたもの｝を４００μＬ添加し、酵素反応溶液（Ｖ−１）を作成した。（Ｖ−１）を作成直後及び５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を記録した。
（Ｖ−１）を作成した直後の吸光度をＡλ₀、ｈ時間後の吸光度をＡλ_hとし、吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλ_h−Ａλ₀）を縦軸に、時間ｈを横軸にプロットし、直線の傾き係数ｋ_Xを求た。
ブランクとして、配合直後のタンパク質溶液（Ｘ’−９）〜（Ｘ’−２２）を用いて、同様に測定し、直線の傾き係数ｋ_Sを求た。（Ｘ’−９）〜（Ｘ’−２２）のうち、プロテアーゼ（Ａ）の種類・濃度が同じタンパク質溶液を用いて求めた傾き係数ｋ_Sを用いて、下記数式（３）からタンパク質溶液（Ｘ−１）〜（Ｘ−３２）及び（Ｘ’−１）〜（Ｘ’−２２）のプロテアーゼ活性Ｘｉを求めた。（例えば、タンパク質溶液（Ｘ−１）であれば、プロテアーゼ（Ａ）の種類・濃度が同じタンパク質（Ｘ’−９）を用いて求めた直線の傾き係数ｋ_Xを用いた。）
プロテアーゼ活性Ｘｉ（％）＝｛ｋ_X／ｋ_S｝×１００ （４）

＜配合直後及び３ヶ月保管後のタンパク質溶液（Ｙ）のプロテアーゼ活性＞
配合直後のタンパク質溶液（Ｘ−１）〜（Ｘ−３２）及び（Ｘ’−１）〜（Ｘ’−２２）について、タンパク質溶液を１００μＬと、バッファー１を９．９ｍＬ混合し、タンパク質溶液（Ｙ−１）〜（Ｙ−３２）及び（Ｙ’−１）〜（Ｙ’−２２）を作成した。下記吸光度を利用した活性測定法により、（Ｙ−１）〜（Ｙ−３２）及び（Ｙ’−１）〜（Ｙ’−２２）のプロテアーゼ活性を測定した。結果を表１〜４に示す。
また、４０℃で３ヶ月保管後のタンパク質溶液（Ｘ−１）〜（Ｘ−３２）及び（Ｘ’−１）〜（Ｘ’−２２）を用いて同様にタンパク質溶液（Ｙ−１）〜（Ｙ−３２）及び（Ｙ’−１）〜（Ｙ’−２２）を作成し、プロテアーゼ活性を測定した。結果を表１〜４に示す。

＜タンパク質溶液（Ｙ）の吸光度を利用した活性測定法＞
タンパク質溶液（Ｙ−１）〜（Ｙ−３２）及び（Ｙ’−１）〜（Ｙ’−２２）をそれぞれ１６００μＬを分光光度計のセル（底面積１ｃｍ×１ｃｍ）に入れ、分光光度計の試料室を４０℃に保ち、セルを試料室内で３０分静置した。ここに、４０℃に温調した基質溶液（１８）（Ｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅをバッファー１に溶解して１０ｍｇ／ｍＬ（１６ｍＭ）の濃度にしたもの）をそれぞれ４００μＬ添加し、酵素反応溶液（ＶＩ−１）をそれぞれ作成した。（ＶＩ−１）を作成直後及び５秒おきに２分間および１０分おきに６時間の４０５ｎｍにおける吸光度を記録した。
（ＶＩ−１）を作成した直後の吸光度をＡλ₀、ｈ秒後の吸光度をＡλ_hとし、吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλ_h−Ａλ₀）を縦軸に、時間ｈを横軸にプロットし、直線の傾き係数ｋ_Yを求た。
ブランクとして、配合直後のタンパク質溶液（Ｘ’−９）〜（Ｘ’−２２）を用いて作成したタンパク質溶液（Ｙ’−９）〜（Ｙ’−２２）を用いて、同様に測定し、直線の傾き係数ｋ_Sを求た。（Ｙ’−９）〜（Ｙ’−２２）のうち、プロテアーゼ（Ａ）の種類・濃度が同じタンパク質溶液を用いて求めた傾き係数ｋ_Tを用いて、下記数式（４）からタンパク質溶液（Ｙ−１）〜（Ｙ−３２）及び（Ｙ’−１）〜（Ｙ’−２２）のプロテアーゼ活性Ｙｉを求めた。（例えば、タンパク質溶液（Ｙ−１）であれば、プロテアーゼ（Ａ）の種類・濃度が同じタンパク質（Ｙ’−９）を用いて求めた直線の傾き係数ｋ_Yを用いた。）
プロテアーゼ活性Ｙｉ（％）＝｛ｋ_Y／ｋ_T｝×１００ （４）

＜プロテアーゼ活性の持続性＞
配合直後のプロテアーゼ活性と４０℃で３ヶ月保管後のプロテアーゼ活性との比を、プロテアーゼ活性の持続性として、以下の式にて算出した。
プロテアーゼ活性の持続性（％）＝（４０℃で３ヶ月保管後のプロテアーゼ活性）／（配合直後のプロテアーゼ活性）×１００

なお、表１〜４中の各成分は、下記のものを用いた。
アルカラーゼ溶液（Ａ１−９）：商品名「アルカラーゼ」（ノボザイムズ社製、３７μＭ）
サビナーゼ溶液（Ａ２−１０）：商品名「サビナーゼ」（ノボザイムズ社製、３７μＭ）

表１〜４の評価結果から、比較例１〜２２のタンパク質溶液のうち、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ４）を含む溶液では、タンパク質溶液（Ｘ）の活性を２０％以下に抑制することができず、プロテアーゼ活性の持続性も低い。また、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ３）を含む溶液では、タンパク質溶液（Ｘ）のプロテアーゼ活性が低く、プロテアーゼ活性を抑制できているものの、タンパク質溶液（Ｘ）を希釈したタンパク質溶液（Ｙ）のプロテアーゼ活性が低く、効率よくプロテアーゼ活性を回復できないことが分かる。
一方、実施例１〜３２の本発明のタンパク質溶液は、プロテアーゼ活性を適度に抑制することができ、また、希釈することで効率よく回復することができることが分かる。また、プロテアーゼ活性の持続性が高く、長期的にプロテアーゼ活性を保つことができることがわかる。

＜実施例３３〜４８＞
表５の割合で４０℃で配合し、本発明の洗剤組成物を得た。

＜比較例２３〜３１＞
表６の割合で４０℃で配合し、比較用の洗剤組成物を得た。

なお、表５及び６中、洗剤組成物中の割合は、重量部で示した。

実施例３３〜４８及び比較例２３〜３１で作製した洗剤組成物を用いて下記の洗浄性試験をおこなった。
＜洗浄性試験＞
＜配合直後の洗浄除去率＞
実施例３３〜４８及び比較例２３〜３１で得た洗剤組成物について、洗剤組成物を作成後、直ちに洗剤組成物０．８ｇを水９９９．２ｇに溶解させ溶液を得た。この溶液に、湿式人工汚染布（４ｃｍ×４ｃｍ）５枚を投入し、ターゴトメーター（大栄化学製）を用いて以下の条件にて洗浄及びすすぎをした後、布を取り出し、ギヤーオーブン（ＴＡＢＡＩ製、ＧＰＳ−２２２）を用いて７０℃で６０分間乾燥し、試験布を得た。ついで、多光源分光測色計（スガ試験機製）を使用して、この試験布の５４０ｎｍの反射率を、試験布１枚ごとに表裏２個所ずつ計４個所（試験布５枚で合計２０個所）測定し、この平均値を求め、以下の式にて洗浄除去率（％）を算出した。結果を表５〜６に記載した。
（洗浄条件）
時間：１０分、温度：２５℃、回転速度：１２０ｒｐｍ
（すすぎ条件）
時間：１分、温度：２５℃、回転速度：１２０ｒｐｍ
（洗浄除去率）
洗浄除去率（％）＝｛（Ｒ_W−Ｒ_S）／（Ｒ_I−Ｒ_S）｝×１００
なお、Ｒ_Iは清浄布の反射率、Ｒ_Wは洗浄布の反射率、Ｒ_Sは汚染布の反射率を示す。
また、使用した湿式人工汚染布は、表７の汚垢組成を有する財団法人洗濯科学協会製の湿式人工汚染布（５４０ｎｍにおける反射率が４０±５％）である。

＜４０℃３ヶ月保管後の洗浄除去率＞
実施例３３〜４８及び比較例２３〜３１で得た洗剤組成物について、「配合直後の洗浄除去率」において、「洗剤組成物の作成後、直ちに」に代えて、「洗剤組成物の作成後、４０℃で３ヶ月保管した後」の洗剤組成物を用いる以外は同様に洗浄性試験をおこない、洗浄除去率を算出した。結果を表５〜６に記載した。

＜洗浄性の持続性＞
配合直後の洗浄除去率と４０℃で３ヶ月保管後の洗浄除去率との比を洗浄性の持続性として、以下の式にて算出した。
洗浄性の持続性（％）＝（４０℃で３ヶ月保管後の洗浄除去率）／（配合直後の洗浄除去率）×１００

表５及び６の評価結果から、プロテアーゼ（Ａ）の量が同じ洗剤組成物を比較した場合、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ４）を含むものは配合直後の洗浄除去率は高いものの、３ヶ月保管後の洗浄除去率が低く、洗浄性の持続性が低い。また、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ３）を含むものは、配合直後及び３ヶ月保管後の洗浄除去率が低い。一方、本発明の洗剤組成物は、配合直後及び３ヶ月保管後の洗浄除去率が共に高く、一定の洗浄性を保持しており、洗浄性の持続性が高いことがわかる。

本発明のタンパク質溶液は、プロテアーゼ活性を十分抑制でき、プロテアーゼ及びその他の酵素活性の低下が少なく、また、抑制したプロテアーゼ活性を回復することができるので、衣料用洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤、コンタクトレンズ用洗浄剤、浴用剤、角質除去用化粧料、食品の改質剤（製パン、肉の軟化、水産加工など）、ビールの清澄剤、皮革なめし剤、写真フィルムのゼラチン除去剤、消化助剤及び消炎剤として広範囲に使用できる。また、本発明の洗剤組成物は、衣料用洗浄剤や自動食器洗浄機用洗浄剤等の洗浄剤として使用できる。

Claims (7)

1. プロテアーゼ（Ａ）、下記プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）及び溶剤（Ｃ）を含有するタンパク質溶液（Ｘ）。
   プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）：クランＩＧに分類されるタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤であり、基質（Ｐ）としてベンジルオキシカルボニルフェニルアラニルニトリアニリド、ベンゾイルアルギニンニトリアニリド、フリルアクリロイルグリシルロイシンアミド及びサクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリドのうちいずれか１つを用いて、プロテアーゼ（Ａ）の活性の最適温度、最適ｐＨ及び最適基質濃度の条件下でＨｅｎｄｅｒｓｏｎプロットにより求めた（Ａ）に対する阻害定数Ｋｉが１ｐＭ〜１０μＭであるプロテアーゼ活性阻害剤。
2. タンパク質溶液中のプロテアーゼ（Ａ）、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）及び溶剤（Ｃ）の重量が、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の合計重量を基準として、（Ａ）が０．００００００１〜２０重量％、（Ｂ）が０．００００００１〜５０重量％、（Ｃ）が３０〜９９．９９９９９９８重量％である請求項１に記載のタンパク質溶液（Ｘ）。
3. タンパク質溶液中のプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）とプロテアーゼ（Ａ）とのモル比（（Ｂ）のモル数／（Ａ）のモル数）が０．０１〜３００である請求項１又は２に記載のタンパク質溶液（Ｘ）。
4. プロテアーゼ（Ａ）がセリンプロテアーゼ（Ａ−１）である請求項1〜３のいずれかに記載のタンパク質溶液（Ｘ）。
5. プロテアーゼ（Ａ）がスブチリシンである請求項1〜４のいずれかに記載のタンパク質溶液（Ｘ）。
6. 請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質溶液（Ｘ）のプロテアーゼ活性回復方法であって、
   吸光度を利用した活性測定法による（Ｘ）のプロテアーゼ活性Ｘｉが、下記タンパク質溶液（Ｓ）の活性を基準として２０％以下であり、
   （Ｘ）に、（Ｘ）の重量を基準として１００〜１，０００，０００重量％の溶剤（Ｃ）をさらに添加するタンパク質溶液（Ｘ）のプロテアーゼ活性回復方法。
   タンパク質溶液（Ｓ）：タンパク質溶液（Ｘ）において、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）を（Ｂ）と同重量の（Ｃ）で置きかえたタンパク質溶液。
7. 請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質溶液（Ｘ）及び界面活性剤（Ｄ）を含有する洗剤組成物。

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