JP2013051909A

JP2013051909A - Health checkup method of fish by multiplex rt-pcr using cytokine gene

Info

Publication number: JP2013051909A
Application number: JP2011191778A
Authority: JP
Inventors: Tomoya Kono; 智哉河野; Hiroaki Takayama; 博章高山
Original assignee: University of Miyazaki NUC
Current assignee: University of Miyazaki NUC
Priority date: 2011-09-02
Filing date: 2011-09-02
Publication date: 2013-03-21

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a means for easily and rapidly diagnosing a health condition of fish from a fish side which is a host but not from a pathogen side.SOLUTION: A health checkup method of fish includes steps of: measuring the expression amount of a cytokine gene in a test specimen taken from the fish; and diagnosing the health condition of the fish based on a measuring result.

Description

本発明は、魚類の健康状態の診断方法、および当該方法を実施するために用いるプライマーセットに関する。 The present invention relates to a method for diagnosing the health status of fish and a primer set used for carrying out the method.

これまで魚類、特に養殖魚の疾病(魚病)の診断技術としては、病原体の分離・同定といった検査が主体であった。しかしながら、病原体の分離・同定による診断は、非常に時間がかかり、この間に養殖魚が大量死してしまうケースもある。また、ウイルス性の疾病においては、特定のウイルスを検出できる抗体を作成する必要があり、簡便性や汎用性に乏しい。さらに、近年では温暖化の影響で南方系の魚介類の移入が始まっていることから、今後は未知の病原体の侵襲も予測され、この時、現在の魚病診断技術では、新規の病原体を発見できない可能性がある。 Until now, diagnostic techniques for fish (especially cultured fish) diseases (fish disease) have mainly been tests for isolation and identification of pathogens. However, diagnosis by pathogen isolation / identification is very time consuming, and in some cases, cultured fish die in large quantities. In addition, in the case of viral diseases, it is necessary to create an antibody that can detect a specific virus, which is not easy and versatile. Furthermore, in recent years, the introduction of southern fish and shellfish has started due to the effects of global warming, so the invasion of unknown pathogens is also predicted in the future. It may not be possible.

魚類の病原体は、細菌、ウイルス、真菌類、寄生虫など多岐にわたり、近年では、PCR法やLAMP法といった分子生物学的手法による診断法も開発され、上記のあらゆる病原体の検出が可能にはなっているが、ターゲットとする病原体をあらかじめ決定しておく必要があり、病原体の予測を誤ると診断ができなくなる。 Fish pathogens are diverse, including bacteria, viruses, fungi, and parasites. In recent years, diagnostic methods based on molecular biology techniques such as PCR and LAMP have been developed, making it possible to detect all the above pathogens. However, it is necessary to determine the target pathogen in advance, and if the pathogen is predicted incorrectly, the diagnosis cannot be performed.

このように、従来の魚病診断技術は、病原体の検出に特化しており、ホストである魚類側からのアプローチは専ら発病魚の外部や内部所見によるのみである。 As described above, the conventional fish disease diagnosis technology specializes in pathogen detection, and the approach from the host fish side is solely based on the external and internal findings of the diseased fish.

魚類の生体制御は、高等動物と同様に自然免疫と獲得性免疫からなっている。しかし、高等動物に比べて、魚類の免疫系は、獲得性免疫よりも自然免疫のほうが重要であると指摘されてきた。サイトカインは自然免疫応答に重要な役割を果たす分子であり、生体内における免疫や炎症などの調整機能に深く関わっていることが知られている。最近のゲノム研究により、魚類にも哺乳類とほぼ同じようなサイトカインが存在することが確認されているが（非特許文献１）、サイトカインの発現を魚類の診断に用いた報告例はこれまでない。 The biological control of fish consists of innate immunity and acquired immunity as in higher animals. However, it has been pointed out that innate immunity is more important for fish immune system than for acquired immunity compared to higher animals. Cytokines are molecules that play an important role in innate immune responses, and are known to be deeply involved in regulatory functions such as immunity and inflammation in vivo. Recent genomic studies have confirmed that fish have almost the same cytokines as mammals (Non-patent Document 1), but there have been no reports on the use of cytokine expression for fish diagnosis.

R.Savan, M.Sakai, Genomics of fish cytokines, Comparative Biochemistry and Physiology, Part D 1 (2006) 89-101R. Savan, M. Sakai, Genomics of fish cytokines, Comparative Biochemistry and Physiology, Part D 1 (2006) 89-101

上記のように、従来の魚病診断技術は時間を要する、病原体の種類を選ぶ、など様々な制限があった。 As described above, the conventional fish disease diagnosis technique has various limitations such as time-consuming and selection of pathogen type.

そこで、本発明の課題は、病原体側からではなくホストである魚類側から魚類の健康状態を簡便かつ迅速に診断する手段を提供することにある。 Therefore, an object of the present invention is to provide a means for easily and quickly diagnosing the health condition of fish from the host fish side, not from the pathogen side.

本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討を行った結果、病原体の構成成分の刺激によって複数のサイトカイン遺伝子の発現量が変動することから、それらのサイトカイン遺伝子が魚類の健康状態の指標となることを見出した。そこで、本発明者らは、当該複数のサイトカイン遺伝子をワンアッセイで測定できる系を確立し、本発明を完成させるに至った。 As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have found that the expression levels of a plurality of cytokine genes fluctuate due to stimulation of the constituents of the pathogen, so that these cytokine genes are in the state of fish health. It was found that it becomes an index. Accordingly, the present inventors have established a system that can measure the plurality of cytokine genes in a single assay, and have completed the present invention.

本発明は以下の発明を包含する。
[1] 下記の工程を含む、魚類の健康状態の診断方法。
(1) 魚類から採取した被検試料における、IL-2（配列番号１）、IL-4/13A（配列番号２）、IL-4/13B（配列番号３）、IL-6（配列番号４）、IL-10（配列番号５）、IL-12 p40（配列番号６）、IL-17A/F1（配列番号７）、IL-17A/F2（配列番号８）、IL-17A/F3（配列番号９）、IL-21（配列番号１０）、TGF-β1（配列番号１１）、IFNγ（配列番号１２）、IFNγ2（配列番号１３）、TNFα（配列番号１４）、TNFβ（配列番号１５）、IL-1β（配列番号１６）、IL-7（配列番号１７）、IL-12 p35（配列番号１８）、IL-15（配列番号１９）、IL-15Like（配列番号２０）、IL-18（配列番号２１）、およびI-IFN-1（配列番号２２）から成る群から選択されるサイトカイン遺伝子の発現量を測定する工程
(2) 工程(1)の測定結果に基づいて、魚類の健康状態を評価する工程 The present invention includes the following inventions.
[1] A method for diagnosing the health condition of fish, including the following steps.
(1) IL-2 (SEQ ID NO: 1), IL-4 / 13A (SEQ ID NO: 2), IL-4 / 13B (SEQ ID NO: 3), IL-6 (SEQ ID NO: 4) in test samples collected from fish ), IL-10 (SEQ ID NO: 5), IL-12 p40 (SEQ ID NO: 6), IL-17A / F1 (SEQ ID NO: 7), IL-17A / F2 (SEQ ID NO: 8), IL-17A / F3 (sequence) No. 9), IL-21 (SEQ ID NO: 10), TGF-β1 (SEQ ID NO: 11), IFNγ (SEQ ID NO: 12), IFNγ2 (SEQ ID NO: 13), TNFα (SEQ ID NO: 14), TNFβ (SEQ ID NO: 15), IL-1β (SEQ ID NO: 16), IL-7 (SEQ ID NO: 17), IL-12 p35 (SEQ ID NO: 18), IL-15 (SEQ ID NO: 19), IL-15Like (SEQ ID NO: 20), IL-18 ( A step of measuring the expression level of a cytokine gene selected from the group consisting of SEQ ID NO: 21) and I-IFN-1 (SEQ ID NO: 22)
(2) A process to evaluate the health of fish based on the measurement results of process (1)

[2] 前記サイトカイン遺伝子の発現量が、該遺伝子より転写されるmRNA量から測定される、[1]に記載の方法。
[3] 前記mRNA量の発現量が、RT-PCR法またはリアルタイムRT-PCR法により測定される、[2]に記載の方法。
[4] 前記RT-PCRがマルチプレックスRT-PCRである、[3]に記載の方法。 [2] The method according to [1], wherein the expression level of the cytokine gene is measured from the amount of mRNA transcribed from the gene.
[3] The method according to [2], wherein the expression level of the mRNA level is measured by an RT-PCR method or a real-time RT-PCR method.
[4] The method according to [3], wherein the RT-PCR is multiplex RT-PCR.

[5] 以下の（p1)〜（p22)のいずれかに記載のプライマーセットから成る群から選択されるプライマーセットを用いて遺伝子を増幅する、[4]に記載の方法。
(p1）配列番号25に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号26に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット
(p2）配列番号27に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号28に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット
(p3）配列番号29に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号30に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット
(p4）配列番号31に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号32に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット
(p5）配列番号33に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号34に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット
(p6）配列番号35に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号36に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット
(p7）配列番号37に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号38に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット
(p8）配列番号39に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号40に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット
(p9）配列番号41に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号42に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット
(p10）配列番号43に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号44に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット
(p11）配列番号45に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号46に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット
(p12）配列番号47に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号48に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット
(p13）配列番号49に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号50に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット
(p14）配列番号51に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号52に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット
(p15）配列番号53に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号54に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット
(p16）配列番号55に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号56に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット
(p17）配列番号57に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号58に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット
(p18）配列番号59に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号60に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット
(p19）配列番号61に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号62に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット
(p20）配列番号63に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号64に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット
(p21）配列番号65に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号66に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット
(p22）配列番号67に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号68に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット [5] The method according to [4], wherein the gene is amplified using a primer set selected from the group consisting of the primer sets described in any of (p1) to (p22) below.
(p1) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 25 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 26
(p2) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 27 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 28
(p3) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 29 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 30
(p4) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 31 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 32
(p5) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 33 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 34
(p6) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 35 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 36
(p7) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 37 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 38
(p8) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 39 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 40
(p9) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 41 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 42
(p10) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 43 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 44
(p11) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 45 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 46
(p12) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 47 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 48
(p13) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 49 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 50
(p14) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 51 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 52
(p15) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 53 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 54
(p16) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 55 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 56
(p17) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 57 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 58
(p18) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 59 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 60
(p19) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 61 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 62
(p20) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 63 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 64
(p21) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 65 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 66
(p22) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 67 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 68

[6] 前記サイトカイン遺伝子の発現量が、該遺伝子によってコードされるポリペプチド量から測定される、[1]に記載の方法。
[7] 前記ポリペプチド量が、該ポリペプチド又はその断片に対する抗体を用いて測定される、[6]に記載の方法。
[8] 前記工程(2)において、被検試料における遺伝子発現量と対照試料における遺伝子発現量とを比較することにより遺伝子の発現量を解析し、それにより魚類の健康状態を診断する、[1]〜[7]のいずれかに記載の方法。 [6] The method according to [1], wherein the expression level of the cytokine gene is measured from the amount of polypeptide encoded by the gene.
[7] The method according to [6], wherein the amount of the polypeptide is measured using an antibody against the polypeptide or a fragment thereof.
[8] In the step (2), the gene expression level is analyzed by comparing the gene expression level in the test sample with the gene expression level in the control sample, thereby diagnosing the health condition of the fish. ] The method in any one of [7].

[9] 以下の（p1)〜（p22)の魚類の健康状態診断用プライマーセット。
(p1）配列番号25に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号26に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット
(p2）配列番号27に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号28に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット
(p3）配列番号29に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号30に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット
(p4）配列番号31に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号32に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット
(p5）配列番号33に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号34に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット
(p6）配列番号35に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号36に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット
(p7）配列番号37に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号38に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット
(p8）配列番号39に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号40に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット
(p9）配列番号41に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号42に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット
(p10）配列番号43に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号44に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット
(p11）配列番号45に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号46に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット
(p12）配列番号47に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号48に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット
(p13）配列番号49に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号50に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット
(p14）配列番号51に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号52に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット
(p15）配列番号53に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号54に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット
(p16）配列番号55に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号56に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット
(p17）配列番号57に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号58に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット
(p18）配列番号59に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号60に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット
(p19）配列番号61に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号62に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット
(p20）配列番号63に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号64に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット
(p21）配列番号65に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号66に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット
(p22）配列番号67に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号68に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット
[10] 配列番号１〜２２のいずれかに示す塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズし、該ポリヌクレオチドを検出するための少なくとも15塩基以上の長さを有する魚類の健康状態診断用プローブ。
[11] [9]に記載のプライマーセットを少なくとも含む、魚類の健康状態診断用キット。 [9] A primer set for diagnosing the health condition of fish of the following (p1) to (p22).
(p1) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 25 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 26
(p2) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 27 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 28
(p3) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 29 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 30
(p4) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 31 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 32
(p5) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 33 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 34
(p6) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 35 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 36
(p7) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 37 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 38
(p8) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 39 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 40
(p9) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 41 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 42
(p10) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 43 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 44
(p11) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 45 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 46
(p12) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 47 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 48
(p13) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 49 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 50
(p14) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 51 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 52
(p15) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 53 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 54
(p16) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 55 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 56
(p17) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 57 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 58
(p18) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 59 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 60
(p19) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 61 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 62
(p20) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 63 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 64
(p21) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 65 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 66
(p22) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 67 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 68
[10] A probe for diagnosing a health condition of fish having a length of at least 15 bases for hybridizing to a polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1 to 22 and detecting the polynucleotide.
[11] A kit for diagnosing fish health, comprising at least the primer set according to [9].

本発明によれば、複数のサイトカイン遺伝子の発現動態を同時に解析することにより、魚類の健康状態を迅速かつ簡便に把握することが可能である。よって、本発明は、養殖魚の健康管理や医薬品（抗菌剤、ワクチン、免疫賦活剤）の有効性の評価に有用である。 According to the present invention, it is possible to quickly and easily grasp the health status of fish by simultaneously analyzing the expression kinetics of a plurality of cytokine genes. Therefore, the present invention is useful for health management of cultured fish and evaluation of the effectiveness of pharmaceuticals (antibacterial agents, vaccines, immunostimulants).

サイトカイン遺伝子（13種）の発現をマルチプレックスRT-PCRで解析した結果を示す（プライマー濃度：0.5μM)。The result of analyzing the expression of cytokine genes (13 species) by multiplex RT-PCR is shown (primer concentration: 0.5 μM). サイトカイン遺伝子（13種）の発現をマルチプレックスRT-PCRで解析した結果を示す（プライマー濃度：各遺伝子の発現量に応じて977pMから2500nMに調整)。The result of analyzing the expression of cytokine genes (13 species) by multiplex RT-PCR is shown (primer concentration: adjusted from 977 pM to 2500 nM depending on the expression level of each gene). LPSまたはpolyI:Cで刺激後のフグ頭腎のIL-2遺伝子相対発現量を経時的に測定した結果を示す(control: LPSまたはpolyI:C無刺激）。The result of having measured the relative expression level of IL-2 gene of a puffer head kidney after stimulation with LPS or polyI: C is shown (control: LPS or polyI: C non-stimulation). LPSまたはpolyI:Cで刺激後のフグ頭腎のIL-4/13A遺伝子相対発現量を経時的に測定した結果を示す(control: LPSまたはpolyI:C無刺激）。The result of having measured the relative expression level of IL-4 / 13A gene of a puffer fish head kidney after stimulation with LPS or polyI: C is shown (control: LPS or polyI: C non-stimulation). LPSまたはpolyI:Cで刺激後のフグ頭腎のIL-4/13B遺伝子相対発現量を経時的に測定した結果を示す(control: LPSまたはpolyI:C無刺激）。The result of having measured the relative expression level of IL-4 / 13B gene of a puffer fish head kidney after stimulation with LPS or polyI: C is shown (control: LPS or polyI: C non-stimulation). LPSまたはpolyI:Cで刺激後のフグ頭腎のIL-10遺伝子相対発現量を経時的に測定した結果を示す(control: LPSまたはpolyI:C無刺激）。The result of having measured the relative expression level of IL-10 gene in the puffer head kidney after stimulation with LPS or polyI: C is shown (control: LPS or polyI: C non-stimulation). LPSまたはpolyI:Cで刺激後のフグ頭腎のIL-17A/F1遺伝子相対発現量を経時的に測定した結果を示す(control: LPSまたはpolyI:C無刺激）。The result of having measured the relative expression level of IL-17A / F1 gene of a puffer fish head kidney after stimulation with LPS or polyI: C is shown (control: LPS or polyI: C non-stimulation). LPSまたはpolyI:Cで刺激後のフグ頭腎のIL-17A/F2遺伝子相対発現量を経時的に測定した結果を示す(control: LPSまたはpolyI:C無刺激）。The result of having measured the relative expression level of IL-17A / F2 gene of a puffer fish head kidney after stimulation with LPS or polyI: C is shown (control: LPS or polyI: C non-stimulation). LPSまたはpolyI:Cで刺激後のフグ頭腎のIL-17A/F3遺伝子相対発現量を経時的に測定した結果を示す(control: LPSまたはpolyI:C無刺激）。The result of having measured the relative expression level of IL-17A / F3 gene of a puffer head kidney after stimulation with LPS or polyI: C is shown (control: LPS or polyI: C non-stimulation). LPSまたはpolyI:Cで刺激後のフグ頭腎のIL-21遺伝子相対発現量を経時的に測定した結果を示す(control: LPSまたはpolyI:C無刺激）。The results of measuring the relative expression level of IL-21 gene in puffer kidney after stimulation with LPS or polyI: C are shown over time (control: LPS or polyI: C unstimulated). LPSまたはpolyI:Cで刺激後のフグ頭腎のTGF-β1遺伝子相対発現量を経時的に測定した結果を示す(control: LPSまたはpolyI:C無刺激）。The result of having measured the relative expression level of the TGF-β1 gene in the puffer fish head kidney after stimulation with LPS or polyI: C is shown (control: LPS or polyI: C unstimulated). LPSまたはpolyI:Cで刺激後のフグ頭腎のIFNγ遺伝子相対発現量を経時的に測定した結果を示す(control: LPSまたはpolyI:C 無刺激）。The result of having measured the relative expression level of the IFNγ gene in the puffer head kidney after stimulation with LPS or polyI: C is shown (control: LPS or polyI: C unstimulated).

本発明の魚類の健康状態の診断方法は、魚類から摘出した被検試料におけるサイトカイン遺伝子の発現動態を解析することを特徴とする。 The method for diagnosing the health condition of fish according to the present invention is characterized by analyzing the expression dynamics of a cytokine gene in a test sample excised from fish.

本発明の魚類の健康状態の診断方法は、具体的には、魚類から摘出した被検試料におけるサイトカイン遺伝子の発現量を測定する工程と、該測定結果に基づいて、魚類の健康状態を診断する工程を含む。 Specifically, the method for diagnosing the health condition of fish according to the present invention includes a step of measuring the expression level of a cytokine gene in a test sample extracted from the fish, and diagnosing the health condition of the fish based on the measurement result. Process.

上記のサイトカイン遺伝子は、IL-2（配列番号１; NM_001037994)、IL-4/13A（配列番号２）、IL-4/13B（配列番号３）、IL-6（配列番号４; NM_001032722）、IL-10（配列番号５; AJ539537)、IL-12 p40（配列番号６; NM_001100604）、IL-17A/F1（配列番号７;
AB522594）、IL-17A/F2（配列番号８; AB522595）、IL-17A/F3（配列番号９; AB522596）、IL-21（配列番号１０; NM_001037993）、TGF-β1（配列番号１１）、IFNγ（配列番号１２; AJ616216）、IFNγ2（配列番号１３）、TNFα（配列番号１４;NM_001037985）、TNFβ（配列番号１５; NM_001037986）、IL-1β（配列番号１６）、IL-7（配列番号１７; NM_001136148）、IL-12 p35（配列番号１８; NM_001100605）、IL-15（配列番号１９; NM_001033048）、IL-15Like（配列番号２０; NM_001033640）、IL-18（配列番号２１;NM_001032632）、およびI-IFN-1（配列番号２２; AJ583023）から成る群から選択されるサイトカイン遺伝子をいう。本発明における魚類の健康状態の診断は、上記サイトカイン遺伝子のうち、少なくとも１種以上、好ましくは少なくとも２種以上のサイトカイン遺伝子の発現量を測定することにより行う。少なくとも２種以上のサイトカイン遺伝子の発現量を測定する場合、限定はされないが、例えば、５種、１０種、１５種、２０種等のサイトカイン遺伝子を診断対象とする魚種や診断目的に応じて適宜選択すればよい。 The above cytokine genes are IL-2 (SEQ ID NO: 1; NM_001037994), IL-4 / 13A (SEQ ID NO: 2), IL-4 / 13B (SEQ ID NO: 3), IL-6 (SEQ ID NO: 4; NM_001032722), IL-10 (SEQ ID NO: 5; AJ539537), IL-12 p40 (SEQ ID NO: 6; NM_001100604), IL-17A / F1 (SEQ ID NO: 7;
AB522594), IL-17A / F2 (SEQ ID NO: 8; AB522595), IL-17A / F3 (SEQ ID NO: 9; AB522596), IL-21 (SEQ ID NO: 10; NM_001037993), TGF-β1 (SEQ ID NO: 11), IFNγ (SEQ ID NO: 12; AJ616216), IFNγ2 (SEQ ID NO: 13), TNFα (SEQ ID NO: 14; NM_001037985), TNFβ (SEQ ID NO: 15; NM_001037986), IL-1β (SEQ ID NO: 16), IL-7 (SEQ ID NO: 17; NM_001136148), IL-12 p35 (SEQ ID NO: 18; NM_001100605), IL-15 (SEQ ID NO: 19; NM_001033048), IL-15Like (SEQ ID NO: 20; NM_001033640), IL-18 (SEQ ID NO: 21; NM_001032632), and I A cytokine gene selected from the group consisting of -IFN-1 (SEQ ID NO: 22; AJ583023). The diagnosis of the health condition of fish in the present invention is performed by measuring the expression level of at least one, preferably at least two cytokine genes among the above cytokine genes. When measuring the expression level of at least two or more types of cytokine genes, it is not limited. For example, depending on the fish species and the diagnostic purpose of cytokine genes of 5 types, 10 types, 15 types, 20 types, etc. What is necessary is just to select suitably.

また、本発明において、サイトカイン遺伝子は、配列番号１〜２２に示された塩基配列を有する遺伝子に限定されず、配列番号１〜２２に示された塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有する遺伝子をも包含する。実質的に同一とは、例えば、配列番号１〜２２に示された塩基配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を意味する。ここで、同一性は、例えば、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩＢＬＡＳＴ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。 In the present invention, the cytokine gene is not limited to the gene having the base sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 22, but has a base sequence substantially the same as the base sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 22 Also includes genes. “Substantially the same” means, for example, 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more, and most preferably 99% of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 22. % Identity. Here, for the identity, for example, a homology calculation algorithm NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Alignment Search Tool) is used, and the following conditions (expected value = 10; allow gap; filtering = ON; match score = 1; Mismatch score = -3).

本発明において、魚類の健康状態の診断とは、病原微生物感染の有無や程度の判定、病原体保有状態であるか否かの判定を行うことをいう。 In the present invention, the diagnosis of the health condition of fish refers to the determination of the presence or absence and degree of pathogenic microorganism infection, and the determination of whether or not a pathogen is possessed.

本発明において診断対象となる魚類としては、海水魚及び淡水魚のいずれであってもよく、好ましくは養殖魚であり、より好ましくは海水で生息する養殖魚である。海水で生息する養殖魚としては、特に限定されないが、ハマチ、ブリ、カンパチ、シマアジ、タイ、トラフグ、ヒラメ、サケ、スズキ、サバなどが挙げられる。本発明の方法はまた、淡水で生息する養殖魚、例えばアユ、フナなど、及び観賞魚、例えば金魚、コイ、メダカなどにも適用可能である。 The fish to be diagnosed in the present invention may be either a saltwater fish or a freshwater fish, preferably a cultured fish, more preferably a cultured fish that inhabits in seawater. Examples of cultured fish that inhabit in seawater include, but are not limited to, hamachi, yellowtail, amberjack, striped mackerel, Thailand, trough puffer, flounder, salmon, sea bass, mackerel and the like. The method of the present invention is also applicable to farmed fish that live in fresh water, such as sweetfish, crucian carp, etc., and ornamental fish, such as goldfish, carp, medaka.

本発明において用いられる被検試料としては、魚類より摘出した組織や体液であれば特に限定はされず、魚種によって異なるが、例えば、頭腎、脾臓、胸腺、鰓、腸、血液などが挙げられる。また、本発明において用いられる対照試料としては、健常であることが確認された魚類由来の上記と同様の組織や体液など挙げられる。これらの試料は分離、抽出、濃縮、精製などの前処理を行ってもよい。 The test sample used in the present invention is not particularly limited as long as it is a tissue or body fluid extracted from fish, and varies depending on the fish species, for example, head kidney, spleen, thymus, sputum, intestine, blood and the like. It is done. In addition, examples of the control sample used in the present invention include the same tissues and body fluids derived from fish that have been confirmed to be healthy. These samples may be subjected to pretreatment such as separation, extraction, concentration, and purification.

遺伝子の発現量とは、遺伝子の転写産物であるmRNA量をいう。本発明において、被検試料および対照試料における遺伝子の発現量は、当業者に公知の任意の方法により測定することができ、また、測定は、各方法の常法に従って実施すればよい。各方法について様々なプロトコルが報告されており、当業者であれば公知のプロトコルに従い、又は公知のプロトコルを適宜修正や変更を行い実施することができる。 The expression level of a gene refers to the amount of mRNA that is a transcription product of the gene. In the present invention, the gene expression level in the test sample and the control sample can be measured by any method known to those skilled in the art, and the measurement may be carried out according to a conventional method of each method. Various protocols have been reported for each method, and those skilled in the art can implement according to a known protocol or by appropriately modifying or changing the known protocol.

mRNA量を測定する場合、魚類からのRNAの抽出は、当該技術分野において通常用いられる手法、例えば、グアニジンチオシアネート−トリフルオロ酢酸セシウム法、グアニジン／塩化セシウム法などに従って行うことができる。また、RNA抽出に際しては、RNeasy等の市販のRNA抽出用キットに添付される抽出プロトコルを改良した独自のプロトコルに従って行うことが好ましい。mRNAの調製は、得られた全RNA画分をオリゴdT-セルロースやポリU-セファロース等を用いたアフィニティーカラム法、あるいはバッチ法により処理することによって行う。さらに、ショ糖密度勾配遠心法等によりポリ(A)⁺RNAをさらに分画してもよい。 When measuring the amount of mRNA, extraction of RNA from fish can be performed according to techniques usually used in the art, for example, guanidine thiocyanate-cesium trifluoroacetate method, guanidine / cesium chloride method and the like. In addition, RNA extraction is preferably performed according to a unique protocol obtained by improving the extraction protocol attached to a commercially available RNA extraction kit such as RNeasy. The mRNA is prepared by treating the obtained total RNA fraction by an affinity column method using oligo dT-cellulose, poly U-sepharose or the like, or a batch method. Furthermore, poly (A) ⁺ RNA may be further fractionated by sucrose density gradient centrifugation or the like.

mRNA量の測定は、所望のmRNA量を測定できる方法であれば特に限定されず、公知の方法から適宜選択して用いることができる。例えば、上記のサイトカイン遺伝子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとした遺伝子増幅法、または、上記のサイトカイン遺伝子にハイブリダイズするオリゴ（ポリ）ヌクレオチドをプローブとしたハイブリダイゼーション法を利用することができる。具体的には、RT-PCR法、リアルタイムRT-PCR法、マイクロアレイ法、ノーザンブロット法、ドットブロット法、RNアーゼプロテクションアッセイ法などが挙げられる。上記の方法に用いるプライマーやプローブは、標識し、当該標識のシグナル強度を調べることによりmRNA量を測定することができる。なかでも、リアルタイムRT-PCR法はRNAを直接サンプルに使用でき、遺伝子増幅過程を光学的に測定することで増幅に必要な温度サイクルの回数から遺伝子定量が可能である上で好ましい。また、複数のサイカイン遺伝子を同時にかつ迅速に定量できる点で、複数のプライマーセットを同一反応系で用いるマルチプレックスRT-PCR法やマルチプレックスリアルタイムRT-PCR法がさらに好ましい。 The measurement of the amount of mRNA is not particularly limited as long as it is a method capable of measuring a desired amount of mRNA, and can be appropriately selected from known methods. For example, a gene amplification method using an oligonucleotide that hybridizes to the cytokine gene as a primer, or a hybridization method using an oligo (poly) nucleotide that hybridizes to the cytokine gene as a probe can be used. Specific examples include RT-PCR method, real-time RT-PCR method, microarray method, Northern blot method, dot blot method, RNase protection assay method and the like. Primers and probes used in the above method can be labeled, and the amount of mRNA can be measured by examining the signal intensity of the label. Among these, the real-time RT-PCR method is preferable because RNA can be directly used for a sample and gene quantification can be performed from the number of temperature cycles required for amplification by optically measuring the gene amplification process. In addition, a multiplex RT-PCR method and a multiplex real-time RT-PCR method using a plurality of primer sets in the same reaction system are more preferable in that a plurality of cycaine genes can be simultaneously and rapidly quantified.

遺伝子発現量の測定は、データの再現性の観点から、同一の被検試料の各遺伝子に対して複数のデータを得ることが好ましい。その場合、これらのデータの平均値を各遺伝子の発現量とすることができる。また、これらのデータの分散あるいは標準偏差の値から、再現性を検証することができる。 In the measurement of gene expression level, it is preferable to obtain a plurality of data for each gene of the same test sample from the viewpoint of data reproducibility. In that case, the average value of these data can be used as the expression level of each gene. Also, reproducibility can be verified from the variance or standard deviation value of these data.

次に、上記サイトカイン遺伝子の発現量の測定結果に基づいて魚類の健康状態を診断する。診断は、例えば、上記の各サイトカイン遺伝子について、対照試料における遺伝子発現量に対する被検試料における遺伝子発現量（相対的発現量）を算出することにより行う。ここで、対照試料としては、たとえば、健常魚類より摘出した上記と同様の組織や体液、あるいは、治療用薬剤投与前の疾病罹患魚類より摘出した上記と同様の組織や体液を挙げることができる。また、発現量が一定のGADPHなどのハウスキーピング遺伝子を内部標準遺伝子として被検試料および対照試料においてその発現量を測定し、試料間のRNA量の補正を行なうことが好ましい。測定の結果、被検試料におけるサイトカイン遺伝子の発現量が対照試料におけるサイトカイン遺伝子の発現量に比べて有意に高い場合は、該被検試料を採取した魚類が病原体による疾病に罹患している可能性があり、健康状態が悪いと判定できる。また、被検試料におけるサイトカイン遺伝子の発現量が対照試料におけるサイトカイン遺伝子の発現量と同等か低い場合は、該被検試料を採取した魚類が細病原体による疾病に罹患している可能性が低く、健康状態が良い、あるいは、薬剤治療により病態が改善されたと判定できる。 Next, the health condition of the fish is diagnosed based on the measurement result of the expression level of the cytokine gene. The diagnosis is performed, for example, by calculating the gene expression level (relative expression level) in the test sample with respect to the gene expression level in the control sample for each of the above cytokine genes. Here, examples of the control sample include the same tissues and body fluids as described above extracted from healthy fish, or the same tissues and body fluids as described above extracted from diseased fish before administration of the therapeutic drug. Further, it is preferable to measure the expression level in a test sample and a control sample using a housekeeping gene such as GADPH having a constant expression level as an internal standard gene, and to correct the RNA level between the samples. If, as a result of the measurement, the expression level of the cytokine gene in the test sample is significantly higher than the expression level of the cytokine gene in the control sample, the fish from which the test sample was collected may have a disease caused by a pathogen It can be determined that there is a bad health condition. In addition, when the expression level of the cytokine gene in the test sample is equal to or lower than the expression level of the cytokine gene in the control sample, it is unlikely that the fish from which the test sample was collected suffers from a disease caused by a fine pathogen, It can be determined that the health condition is good or the medical condition has improved the disease state.

遺伝子発現量の定量をRT-PCR法で行う場合、用いられるプライマー（セット）は、前記のサイトカイン遺伝子の各塩基配列に基づき設計し、合成・精製の各工程を経て調製することができる。プライマーのサイズ（塩基数）は、鋳型DNAとの間の特異的なアニーリングが可能とするために、20〜40塩基である。プライマーの設計は、センス鎖（5'末端側）とアンチセンス鎖（3'末端側）からなる１組あるいは１対（２本）のプライマーが互いにアニールしないよう、両プライマー間の相補的配列を避けると共に、プライマー内のヘアピン構造の形成を防止するため自己相補配列をも避けるようにする。さらに、鋳型DNAとの安定な結合を確保するため、GC含量を約50％にし、プライマー内においてGC-richあるいはAT-richが偏在しないようにする。アニーリング温度はTm（melting temperature）に依存するので、特異性の高いPCR産物を得るため、Tm値が55〜65℃で互いに近似したプライマーを選定する。また、PCRにおけるプライマー使用の最終濃度が約0.1〜1μMになるよう調整する等を留意することも必要である。また、プライマー設計用の市販のソフトウェア、例えばOligoTM［National Bioscience Inc.（米国）製］、GENETYX［ソフトウェア開発（株）（日本）製］等を用いることもできる。 When the gene expression level is quantified by the RT-PCR method, the primer (set) to be used can be designed based on each nucleotide sequence of the cytokine gene and prepared through the synthesis and purification steps. The primer size (number of bases) is 20 to 40 bases in order to allow specific annealing with the template DNA. The primer is designed so that a pair of primers consisting of a sense strand (5 'end) and an antisense strand (3' end) or a pair (two) of primers does not anneal with each other. Avoid self-complementary sequences as well as avoid hairpin structures in the primer. Furthermore, in order to ensure stable binding to the template DNA, the GC content is set to about 50% so that GC-rich or AT-rich is not unevenly distributed in the primer. Since the annealing temperature depends on Tm (melting temperature), primers that are close to each other at a Tm value of 55 to 65 ° C. are selected in order to obtain a highly specific PCR product. It is also necessary to pay attention to adjusting the final concentration of primers used in PCR to be about 0.1 to 1 μM. Also, commercially available software for primer design such as Oligo ™ [manufactured by National Bioscience Inc. (USA)], GENETYX [manufactured by Software Development Co., Ltd. (Japan)], etc. can be used.

本発明における上記の各サイトカイン遺伝子を増幅できるプライマーセットとして、具体的には下記のプライマーセット(大文字：ユニバーサル配列、小文字：遺伝子特異的配列)が例示できる。マルチプレックスPCRの場合は、下記のプライマーセットを複数用いることによって、同時に複数のサイトカイン遺伝子を同一反応液中で増幅することができる。
p1) IL-2遺伝子増幅用プライマーセット：
Fw: AGGTGACACTATAGAATAggacgatcatcattgcatca(配列番号25）
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAggatttctcgatcttcacgc(配列番号26）
p2) IL-4/13A遺伝子増幅用プライマーセット：
Fw: AGGTGACACTATAGAATAcaactgtggggatgcttttt(配列番号27）
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAgtttgagggtctcacgtgct(配列番号28）
p3) IL-4/13B遺伝子増幅用プライマーセット:
Fw: AGGTGACACTATAGAATAtcaaagtctggcactgatcg(配列番号29）
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAgatgcaggtgtttggtgagtt(配列番号30）
p4) IL-6遺伝子増幅用プライマーセット:
Fw: AGGTGACACTATAGAATAtgaatggtgattcagaccca(配列番号31）
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAgaaaaagctgctcggctcta(配列番号32）
p5) IL-10遺伝子増幅用プライマーセット:
Fw: AGGTGACACTATAGAATAgctggacctgctcttcaact(配列番号33）
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAactaacggactggcctcctt(配列番号34）
p6) IL12-p40遺伝子増幅用プライマーセット:
Fw: AGGTGACACTATAGAATAtcatctgcttttcccaaacc(配列番号35）
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAgcccttatttcaagcactgg(配列番号36）
p7) IL-17/F1遺伝子増幅用プライマーセット:
Fw: AGGTGACACTATAGAATAtttggttcaggctgatgttg(配列番号37）
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAgcgacttcttgtttgccttc(配列番号38）
p8) IL-17A/F2遺伝子増幅用プライマーセット:
Fw: AGGTGACACTATAGAATAagtgcattgtggggattctc(配列番号39）
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAcattcagccaacctctcaca(配列番号40）
p9) IL-17A/F3遺伝子増幅用プライマーセット:
Fw: AGGTGACACTATAGAATAtcaggcccactgttataccc(配列番号41）
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAgctggctctcttagcgattg(配列番号42）
p10) IL-21遺伝子増幅用プライマーセット:
Fw: AGGTGACACTATAGAATAagaatatgaagccgctggtg(配列番号43）
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAtctcttccagcttcctctgc(配列番号44）
p11) TGF-β1遺伝子増幅用プライマーセット:
Fw: AGGTGACACTATAGAATAgtcgcagttcccttcaacat(配列番号45）
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAtagagttccacccgttggtc(配列番号46）
p12) IFNγ遺伝子増幅用プライマーセット:
Fw: AGGTGACACTATAGAATAtttgcgtggttcagacacat(配列番号47）
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAgcgagcacaagtgtgaaaaa(配列番号48）
p13) IFNγ2遺伝子増幅用プライマーセット:
Fw: AGGTGACACTATAGAATActgtcagcggtacaatgacg(配列番号49）
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAaccatgatgtcgtccacctt(配列番号50）
p14) TNFα遺伝子増幅用プライマーセット:
Fw: AGGTGACACTATAGAATAaagctgctacaacgccattt(配列番号51）
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAtgatcttcatgaccgttgga(配列番号52）
p15) TNFβ遺伝子増幅用プライマーセット:
Fw: AGGTGACACTATAGAATAggaatgcaatttgacgtcct(配列番号53）
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAggaaatcagaagagcagcca(配列番号54）
p16) IL-1β遺伝子増幅用プライマーセット:
Fw: AGGTGACACTATAGAATAtgaacctgtcgacctacgtg(配列番号55）
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAataccagggtgcagaggttg(配列番号56）
p17) IL-7遺伝子増幅用プライマーセット:
Fw: AGGTGACACTATAGAATAtgacctgcgacagaaatcag(配列番号57）
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAcgacacactcgttttggttg(配列番号58）
p18) IL-12p35遺伝子増幅用プライマーセット:
Fw: AGGTGACACTATAGAATAtgttcagtggaatggactgc(配列番号59）
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAtcagacaccgttccttgttg(配列番号60）
p19) IL-15 遺伝子増幅用プライマーセット:
Fw: AGGTGACACTATAGAATAagctgcgcagatgagagact(配列番号61）
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAtttgaactccccttgtttcg(配列番号62）
p20) IL-15 Like遺伝子増幅用プライマーセット:
Fw: AGGTGACACTATAGAATAgcgaatgctgtgtgtcatct(配列番号63）
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAgcttacggatcaggctgaag(配列番号64）
p21) IL-18遺伝子増幅用プライマーセット:
Fw: AGGTGACACTATAGAATAtcccatgacattgcagaaaa(配列番号65）
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAtcatactctttgtggcgcag(配列番号66）
p22) I-IFN-1遺伝子増幅用プライマーセット:
Fw: AGGTGACACTATAGAATAaatctctggagctgctggac(配列番号67）
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAgcctgttgggtcagaacatt(配列番号68） Specific examples of primer sets that can amplify the above cytokine genes in the present invention include the following primer sets (upper case: universal sequence, lower case: gene specific sequence). In the case of multiplex PCR, a plurality of cytokine genes can be simultaneously amplified in the same reaction solution by using a plurality of the following primer sets.
p1) Primer set for IL-2 gene amplification:
Fw: AGGTGACACTATAGAATAggacgatcatcattgcatca (SEQ ID NO: 25)
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAggatttctcgatcttcacgc (SEQ ID NO: 26)
p2) IL-4 / 13A gene amplification primer set:
Fw: AGGTGACACTATAGAATAcaactgtggggatgcttttt (SEQ ID NO: 27)
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAgtttgagggtctcacgtgct (SEQ ID NO: 28)
p3) IL-4 / 13B gene amplification primer set:
Fw: AGGTGACACTATAGAATAtcaaagtctggcactgatcg (SEQ ID NO: 29)
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAgatgcaggtgtttggtgagtt (SEQ ID NO: 30)
p4) IL-6 gene amplification primer set:
Fw: AGGTGACACTATAGAATAtgaatggtgattcagaccca (SEQ ID NO: 31)
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAgaaaaagctgctcggctcta (SEQ ID NO: 32)
p5) IL-10 gene amplification primer set:
Fw: AGGTGACACTATAGAATAgctggacctgctcttcaact (SEQ ID NO: 33)
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAactaacggactggcctcctt (SEQ ID NO: 34)
p6) IL12-p40 gene amplification primer set:
Fw: AGGTGACACTATAGAATAtcatctgcttttcccaaacc (SEQ ID NO: 35)
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAgcccttatttcaagcactgg (SEQ ID NO: 36)
p7) Primer set for amplification of IL-17 / F1 gene:
Fw: AGGTGACACTATAGAATAtttggttcaggctgatgttg (SEQ ID NO: 37)
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAgcgacttcttgtttgccttc (SEQ ID NO: 38)
p8) IL-17A / F2 gene amplification primer set:
Fw: AGGTGACACTATAGAATAagtgcattgtggggattctc (SEQ ID NO: 39)
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAcattcagccaacctctcaca (SEQ ID NO: 40)
p9) IL-17A / F3 gene amplification primer set:
Fw: AGGTGACACTATAGAATAtcaggcccactgttataccc (SEQ ID NO: 41)
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAgctggctctcttagcgattg (SEQ ID NO: 42)
p10) IL-21 gene amplification primer set:
Fw: AGGTGACACTATAGAATAagaatatgaagccgctggtg (SEQ ID NO: 43)
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAtctcttccagcttcctctgc (SEQ ID NO: 44)
p11) TGF-β1 gene amplification primer set:
Fw: AGGTGACACTATAGAATAgtcgcagttcccttcaacat (SEQ ID NO: 45)
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAtagagttccacccgttggtc (SEQ ID NO: 46)
p12) IFNγ gene amplification primer set:
Fw: AGGTGACACTATAGAATAtttgcgtggttcagacacat (SEQ ID NO: 47)
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAgcgagcacaagtgtgaaaaa (SEQ ID NO: 48)
p13) IFNγ2 gene amplification primer set:
Fw: AGGTGACACTATAGAATActgtcagcggtacaatgacg (SEQ ID NO: 49)
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAaccatgatgtcgtccacctt (SEQ ID NO: 50)
p14) TNFα gene amplification primer set:
Fw: AGGTGACACTATAGAATAaagctgctacaacgccattt (SEQ ID NO: 51)
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAtgatcttcatgaccgttgga (SEQ ID NO: 52)
p15) TNFβ gene amplification primer set:
Fw: AGGTGACACTATAGAATAggaatgcaatttgacgtcct (SEQ ID NO: 53)
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAggaaatcagaagagcagcca (SEQ ID NO: 54)
p16) IL-1β gene amplification primer set:
Fw: AGGTGACACTATAGAATAtgaacctgtcgacctacgtg (SEQ ID NO: 55)
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAataccagggtgcagaggttg (SEQ ID NO: 56)
p17) Primer set for IL-7 gene amplification:
Fw: AGGTGACACTATAGAATAtgacctgcgacagaaatcag (SEQ ID NO: 57)
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAcgacacactcgttttggttg (SEQ ID NO: 58)
p18) IL-12p35 gene amplification primer set:
Fw: AGGTGACACTATAGAATAtgttcagtggaatggactgc (SEQ ID NO: 59)
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAtcagacaccgttccttgttg (SEQ ID NO: 60)
p19) Primer set for IL-15 gene amplification:
Fw: AGGTGACACTATAGAATAagctgcgcagatgagagact (SEQ ID NO: 61)
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAtttgaactccccttgtttcg (SEQ ID NO: 62)
p20) IL-15 Like gene amplification primer set:
Fw: AGGTGACACTATAGAATAgcgaatgctgtgtgtcatct (SEQ ID NO: 63)
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAgcttacggatcaggctgaag (SEQ ID NO: 64)
p21) IL-18 gene amplification primer set:
Fw: AGGTGACACTATAGAATAtcccatgacattgcagaaaa (SEQ ID NO: 65)
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAtcatactctttgtggcgcag (SEQ ID NO: 66)
p22) Primer set for I-IFN-1 gene amplification:
Fw: AGGTGACACTATAGAATAaatctctggagctgctggac (SEQ ID NO: 67)
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAgcctgttgggtcagaacatt (SEQ ID NO: 68)

また、上記プライマーセットを構成する配列番号25〜68の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、配列番号25〜68の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと実質的に同一の機能を有する範囲で、その塩基配列に改変を加えたオリゴヌクレオチドであってもよい。そのような改変オリゴヌクレオチドとしては、配列番号25〜68の塩基配列に対して95％以上、好ましくは98％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、対応する各サイトカイン遺伝子増幅用プライマーとして機能しうるオリゴヌクレオチドが挙げられる。改変には、欠失、置換、挿入、又は付加が含まれ、改変させる塩基の数は、３個以下、好ましくは２個以下、より好ましくは１個である。また、塩基の付加は、３'側でも５'側でもよい。 In addition, the oligonucleotide consisting of the base sequences of SEQ ID NOs: 25 to 68 constituting the primer set has the same sequence as that of the oligonucleotide consisting of the base sequences of SEQ ID NOs: 25 to 68. The oligonucleotide may be modified. Such a modified oligonucleotide comprises a nucleotide sequence having 95% or more, preferably 98% or more identity to the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 25 to 68, and corresponding primers for amplifying each cytokine gene. Examples include functional oligonucleotides. Modification includes deletion, substitution, insertion, or addition, and the number of bases to be modified is 3 or less, preferably 2 or less, more preferably 1. The base may be added on the 3 ′ side or the 5 ′ side.

上記のプライマーセットの各オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの合成法として当技術分野で公知の方法、例えば、ホスホトリエチル法、ホスホジエステル法等により、通常用いられるDNA／RNA自動合成装置（例えば、Applied Biosystems社製Model 394など)を利用して合成することが可能である。 Each oligonucleotide of the above primer set is prepared by a DNA / RNA automatic synthesizer (for example, Applied Biosystems) commonly used in the art by methods known in the art, for example, phosphotriethyl method, phosphodiester method, etc. It is possible to synthesize using Model 394 manufactured by the company.

試料から抽出したRNAより合成したcDNAを鋳型として、上記のプライマーセットを用いてPCR増幅を行う。PCR増幅は上記のプライマーセットを用いる以外は特に制限はなく、常法に従って行えばよい。具体的には、鋳型DNAの変性、プライマーへの鋳型へのアニーリング、および耐熱性酵素（TaqポリメラーゼやThermus themophilis由来のTth DNAポリメラーゼなどのDNAポリメラーゼ）を用いたプライマーの伸長反応を含むサイクルを繰り返すことにより、目的とする各サイトカイン遺伝子の特定の遺伝子配列を含む断片を増幅させる。PCR反応液の組成、PCR反応条件（温度サイクル、サイクルの回数等）は、上記のプライマーセットを用いたPCRにおいて高感度でPCR増幅産物が得られるような条件を予備実験等により当業者であれば適切に選択および設定することができる。プライマーのTmに基づいて適当なPCR反応条件を選択する方法は、当該技術分野においてよく知られており、例えば、最初に94℃で5分間の変性反応、次に94℃で50秒間（変性）、55℃で50秒間（アニーリング）、72℃で1分間（伸長）を1サイクルとして30サイクル、最後に72℃で1分間の伸長反応により実施することができる。但し、ここに示した条件は一例に過ぎず、用いる酵素、反応温度、反応時間、サイクル数などは適宜変更することも可能である。このようなPCRの一連の操作は、市販のPCRキットやPCR装置を利用して、その操作説明書に従って行うことができる。PCR装置は、例えば、GeneAmp PCR System 9700（Applied Biosystems社製)、GeneAmp PCR System 9600（Applied Biosystems社製）などが使用できるが、本発明方法においては、RNAをcDNA に変換しPCRを行う（RT-PCR）反応を、１本のチューブ内で連続的に実施することのできる、Takara One Step RT-PCR Kit AMV（TAKARA社製）が好適に使用できる。 PCR amplification is performed using the above primer set using cDNA synthesized from RNA extracted from the sample as a template. PCR amplification is not particularly limited except that the above primer set is used, and may be performed according to a conventional method. Specifically, a cycle including denaturation of template DNA, annealing of the primer to the template, and primer extension using a thermostable enzyme (DNA polymerase such as Taq polymerase or Tth DNA polymerase from Thermus themophilis) is repeated. Thus, a fragment containing a specific gene sequence of each target cytokine gene is amplified. The composition of the PCR reaction solution and the PCR reaction conditions (temperature cycle, number of cycles, etc.) should be determined by a person skilled in the art based on preliminary experiments, etc. under conditions such that a PCR amplification product can be obtained with high sensitivity in PCR using the above primer set. Can be selected and set appropriately. Methods for selecting appropriate PCR reaction conditions based on the Tm of the primer are well known in the art, for example, first a denaturation reaction at 94 ° C. for 5 minutes and then at 94 ° C. for 50 seconds (denaturation). The extension reaction can be carried out at 55 ° C. for 50 seconds (annealing), 72 ° C. for 1 minute (extension) for 30 cycles, and finally 72 ° C. for 1 minute. However, the conditions shown here are only examples, and the enzyme used, the reaction temperature, the reaction time, the number of cycles, etc. can be appropriately changed. Such a series of PCR operations can be performed using a commercially available PCR kit or PCR apparatus according to the operating instructions. For example, GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems), GeneAmp PCR System 9600 (Applied Biosystems) or the like can be used as the PCR apparatus. In the method of the present invention, RNA is converted into cDNA (RT -PCR) The Takara One Step RT-PCR Kit AMV (manufactured by TAKARA), which can be carried out continuously in one tube, can be suitably used.

PCR増幅産物の検出は、アガロースゲル電気泳動やキャピラリー電気泳動などの慣用の電気泳動、DNAハイブリダイゼーションやリアルタイムPCR等の方法を用いて行う。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いて当該PCRを行い、増幅産物を検出することもできる。また、DNAハイブリダイゼーションでは、マイクロアレイなどの固定化担体にPCR増幅産物を結合させ、蛍光または酵素反応等によりPCR増幅産物を確認する。検出用の固定化担体は、検出すべきサイトカイン遺伝子とハイブリダイズしうる配列を有するDNA断片が固定化されている支持体である。支持体としては、例えば、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、ガラス、シリコンチップなどを用いることができる。 PCR amplification products are detected using conventional methods such as agarose gel electrophoresis and capillary electrophoresis, methods such as DNA hybridization and real-time PCR. Alternatively, the amplification product can be detected by performing the PCR using a primer previously labeled with a fluorescent dye or the like. In DNA hybridization, a PCR amplification product is bound to an immobilization carrier such as a microarray, and the PCR amplification product is confirmed by fluorescence or enzymatic reaction. The immobilization carrier for detection is a support on which a DNA fragment having a sequence capable of hybridizing with the cytokine gene to be detected is immobilized. As the support, for example, a nylon film, a nitrocellulose film, glass, a silicon chip, or the like can be used.

また、プローブとしては、各サイトカイン遺伝子の塩基配列の連続する部分配列からなるポリ（オリゴ）ヌクレオチド、あるいは、各サイトカイン遺伝子の塩基配列に対する相補配列の連続する部分配列からなるポリ（オリゴ）ヌクレオチド断片が用いられる。プローブの長さは特に限定されないが、例えば15塩基以上、好ましくは20塩基以上であれば目的とする遺伝子の間で特異的なハイブリッドを形成できる。上記ヌクレオチド断片は、例えば、各塩基配列を有するポリヌクレオチド（cDNA)を適当な制限酵素で切断するか、あるいは、周知の化学合成技術により、in vitroにおいて合成することができる。また、前記のサイトカイン遺伝子を特異的に増幅させるプライマーとして利用可能なオリゴヌクレオチドは、当該遺伝子を特異的に検出するためのプローブとしても使用可能であることは当業者にとって周知であるため、この知見を元にブローブとして利用可能なオリゴヌクレオチドを設計すればよい。 The probe may be a poly (oligo) nucleotide consisting of a continuous partial sequence of the base sequence of each cytokine gene, or a poly (oligo) nucleotide fragment consisting of a continuous partial sequence of a complementary sequence to the base sequence of each cytokine gene. Used. The length of the probe is not particularly limited. For example, a specific hybrid can be formed between target genes as long as it is 15 bases or more, preferably 20 bases or more. The nucleotide fragment can be synthesized in vitro, for example, by cleaving a polynucleotide (cDNA) having each base sequence with an appropriate restriction enzyme, or by a well-known chemical synthesis technique. In addition, since it is well known to those skilled in the art that oligonucleotides that can be used as primers for specifically amplifying the cytokine gene can also be used as probes for specifically detecting the gene, this finding Based on the above, an oligonucleotide that can be used as a probe may be designed.

上記ヌクレオチド断片をプローブとして使用する場合、標識物質により標識化する。標識物質は、特に限定はされないが、例えば、蛍光物質、放射性同位体、酵素、アビジン若しくはビオチンなどを用いることができる。蛍光物質としては、フルオレッセンスイソチオシアネート（FITC）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRIC)、シアニン色素（例えば、Cy Dye^TMシリーズのCy3、Cy5等）、アセチルアミノフルオレン（AFF)などが挙げられ、酵素としては、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼなどが挙げられ、放射性同位体としては、^１２５Ｉや^３Ｈなどが挙げられる。 When the nucleotide fragment is used as a probe, it is labeled with a labeling substance. The labeling substance is not particularly limited, and for example, a fluorescent substance, a radioisotope, an enzyme, avidin, or biotin can be used. Examples of fluorescent substances include fluorescein isothiocyanate (FITC), tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRIC), cyanine dyes (eg Cy3, Cy5 of Cy Dye ^TM series), acetylaminofluorene (AFF), etc. Examples include peroxidase, β-galactosidase, alkaline phosphatase and the like, and examples of the radioisotope include ¹²⁵ I and ³ H.

上記のプローブとして用いるポリ（オリゴ）ヌクレオチド断片は、前記サイトカイン遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションすることを特徴とする。ここで、ストリンジェントな条件とは、前記サイトカイン遺伝子とポリ（オリゴ）ヌクレオチド断片との選択的かつ検出可能な特異的結合を可能とする条件である。ストリンジェント条件は、塩濃度、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）、温度、及びその他公知の条件によって定義される。ストリンジェンシーは、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、又はハイブリダイゼーション温度を上昇させるかによって増加する。例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、NaCl約750 mM以下及びクエン酸三ナトリウム約75mM以下、より好ましくはNaCl約500 mM以下及びクエン酸三ナトリウム約50 mM以下、最も好ましくはNaCl約250 mM以下及びクエン酸三ナトリウム約25 mM以下である。ストリンジェントな有機溶媒濃度は、ホルムアミド約35%以上、好ましくは約50%以上である。ストリンジェントな温度条件は、約30℃以上、好ましくは約37℃以上、より好ましくは約42℃以上である。その他の条件としては、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤（例えば、SDS）の濃度、及びキャリアーDNAの存否等であり、これらの条件を組み合わせることによって、様々なストリンジェンシーを設定することができる。 The poly (oligo) nucleotide fragment used as the probe is characterized by hybridizing with the cytokine gene under stringent conditions. Here, the stringent condition is a condition that enables selective and detectable specific binding between the cytokine gene and the poly (oligo) nucleotide fragment. Stringent conditions are defined by salt concentration, organic solvent (eg, formamide), temperature, and other known conditions. Stringency is increased by decreasing the salt concentration, increasing the organic solvent concentration, or increasing the hybridization temperature. For example, stringent salt concentrations are typically about 750 mM or less NaCl and about 75 mM or less trisodium citrate, more preferably about 500 mM or less NaCl and about 50 mM or less trisodium citrate, most preferably about 250 mM NaCl. And about 25 mM or less of trisodium citrate. The stringent organic solvent concentration is about 35% or more, preferably about 50% or more of formamide. The stringent temperature condition is about 30 ° C. or higher, preferably about 37 ° C. or higher, more preferably about 42 ° C. or higher. Other conditions include the hybridization time, the concentration of the detergent (for example, SDS), the presence or absence of carrier DNA, and various stringencies can be set by combining these conditions.

また、プローブはマイクロアレイなどの固定化担体に固定化して用いてもよい。マイクロアレイの形成方法は特に限定されず、当業者が利用可能ないかなる方法を用いてもよく、例えば、固相担体表面で直接プローブを合成する方法（オン・チップ法）、又は予め調製したプローブを固相担体表面に結合する方法などがある。固相担体表面で直接プローブを合成する場合には、光照射で選択的に除去される保護基を用い、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー技術及び固相合成技術を組み合わせて所定の微少なマトリックス領域でのオリゴヌクレオチドの選択的な合成を行う方法が一般的である。一方、予めプローブを調製して固相担体表面に結合する方法では、プローブ核酸の種類や固相担体の種類に応じて、スポッタ装置によりポリ陽イオン化合物やアミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を有するシランカップリング剤などで表面処理した固相担体の表面に点着する方法、反応活性基を導入したプローブ核酸を合成し、予め反応性基を形成させるように表面処理した固相担体表面に該プローブ核酸を点着して該プローブ核酸を固相担体表面に共有結合により結合固定させる方法などが利用できる。 The probe may be used by being immobilized on an immobilization carrier such as a microarray. The microarray formation method is not particularly limited, and any method available to those skilled in the art may be used. For example, a method of directly synthesizing a probe on the surface of a solid support (on-chip method), or a probe prepared in advance There are methods for binding to the surface of a solid support. When a probe is directly synthesized on the surface of a solid support, a protective matrix that is selectively removed by light irradiation is used, and a predetermined micromatrix is formed by combining photolithography technology and solid phase synthesis technology used for semiconductor manufacturing. A method for selective synthesis of oligonucleotides in a region is common. On the other hand, in the method of preparing the probe in advance and binding it to the surface of the solid phase carrier, depending on the type of probe nucleic acid or the type of solid phase carrier, a polycation compound, an amino group, an aldehyde group, an epoxy group, etc. can be used with a spotter device. A method of spotting on the surface of a solid phase carrier surface-treated with a silane coupling agent or the like, and synthesizing a probe nucleic acid into which a reactive group has been introduced and preliminarily forming a reactive group on the surface of the solid phase carrier surface For example, a method of spotting the probe nucleic acid and covalently binding and fixing the probe nucleic acid to the surface of the solid phase carrier can be used.

またもう一つの態様として、タンパク質量を測定する場合、その測定法としては、例えば、上記サイトカイン遺伝子によりコードされるポリペプチドに対する抗体または抗体断片を用いて測定する方法を用いることができる。具体的には、ブロッティング法、ドットブロット法、プロテインアレイ、免疫沈降法、酵素免疫測定法 (ELISA; enzyme-linked immunosorbent assay）、放射線免疫測定法（RIA；radioimmuno assay）、蛍光抗体法、免疫細胞染色等を挙げることができる。 As another embodiment, when measuring the amount of protein, for example, a measurement method using an antibody or antibody fragment against the polypeptide encoded by the cytokine gene can be used. Specifically, blotting method, dot blot method, protein array, immunoprecipitation method, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), fluorescent antibody method, immune cell Dyeing etc. can be mentioned.

上記測定に用いられる抗体は、当業者に周知の方法を用いて得ることができる。抗体は、ポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体のいずれであってもよい。また、抗体としては、抗体の活性フラグメントであってもよい。活性フラグメントとしては、F(ab')2、Fab'、Fab、Fvなどが挙げられる。 The antibody used for the measurement can be obtained by a method well known to those skilled in the art. The antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. Further, the antibody may be an active fragment of an antibody. Active fragments include F (ab ′) 2, Fab ′, Fab, Fv and the like.

例えば、ポリクローナル抗体は、抗原を感作した哺乳動物（例えば、ウサギ、ラット、マウスなど）から血液を採取し、この血液から公知の方法により血清を分離することにより調製できる。また、モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物から抗体産生細胞（脾臓細胞、リンパ節細胞など）を取り出して骨髄腫細胞などと細胞融合させる。こうして得られたハイブリドーマをクローニングして、その培養物から抗体を回収しモノクローナル抗体とすることができる。 For example, a polyclonal antibody can be prepared by collecting blood from a mammal (eg, rabbit, rat, mouse, etc.) sensitized with an antigen and separating the serum from the blood by a known method. In order to obtain a monoclonal antibody, antibody-producing cells (spleen cells, lymph node cells, etc.) are taken out of the mammal sensitized with the antigen and fused with myeloma cells. The thus obtained hybridoma can be cloned, and the antibody can be recovered from the culture to obtain a monoclonal antibody.

抗原に用いるタンパク質もしくはその部分ペプチドは、例えば前記の塩基配列を有するサイトカイン遺伝子又はその部分遺伝子を発現ベクターに組込み、これを適当な宿主細胞に導入して、形質転換体を作成し、該形質転換体を培養して組み換えタンパク質を発現させ、発現させた組み換えタンパク質を培養体又は培養上清から精製することにより得ることができる。あるいは、これらの遺伝子によってコードされるアミノ酸配列、あるいは全長cDMAによってコードされるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列からなるオリゴペプチドを化学的に合成し、免疫原として用いることもできる。 A protein used for an antigen or a partial peptide thereof is prepared by, for example, incorporating a cytokine gene having the above-described base sequence or a partial gene thereof into an expression vector and introducing the gene into an appropriate host cell to prepare a transformant. It can be obtained by culturing the body to express the recombinant protein, and purifying the expressed recombinant protein from the culture or culture supernatant. Alternatively, an oligopeptide consisting of an amino acid sequence encoded by these genes or a partial amino acid sequence of an amino acid sequence encoded by full-length cDMA can be chemically synthesized and used as an immunogen.

本発明の方法に用いる上記サイトカイン遺伝子の発現量を測定するための試薬を予め組み合わせてキット化することもできる。例えば、キットには、前記のプライマーセット、プローブとして用いるポリ（オリゴ）ヌクレオチド、または抗体のいずれかを少なくとも含んでいればよい。また、該キットには、必要に応じて、RNA抽出用試薬、PCR用緩衝液やDNAポリメラーゼ等のPCR用試薬、染色剤や電気泳動用ゲル等の検出用試薬、固定化担体、標識物質、標識の検出に用いられる基質化合物、陽性や陰性の標準試料、キットの使用方法を記載した指示書等を含めることもできる。なお、キット中の試薬は溶液でも凍結乾燥物でもよい。 Reagents for measuring the expression level of the cytokine gene used in the method of the present invention can be combined in advance to form a kit. For example, the kit may contain at least any of the above primer set, a poly (oligo) nucleotide used as a probe, or an antibody. In addition, the kit contains RNA extraction reagents, PCR reagents such as PCR buffers and DNA polymerase, detection reagents such as stains and electrophoresis gels, immobilization carriers, labeling substances, Substrate compounds used for detection of the label, positive and negative standard samples, instructions describing how to use the kit, and the like can also be included. The reagent in the kit may be a solution or a lyophilized product.

以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものでない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but these examples do not limit the present invention.

（実施例１）魚類診断用マルチプレックスRT-PCRの構築
(1) ターゲット遺伝子
下記表１に示すフグのサイトカイン遺伝子をターゲット遺伝子とした。データベースに登録されていないサイトカイン遺伝子(下表None)については、クローニングし、シークエンシングにより配列を決定した。また、β-actin、GAPDHは内部標準遺伝子として用いた。 (Example 1) Construction of multiplex RT-PCR for fish diagnosis
(1) Target gene The pufferfish cytokine gene shown in Table 1 below was used as a target gene. Cytokine genes not registered in the database (None in the table below) were cloned and sequenced by sequencing. Β-actin and GAPDH were used as internal standard genes.

(2) 全ターゲット遺伝子が発現するRNA溶液の調製
免疫賦活剤によるin vitro刺激により、上記の全ターゲット遺伝子が発現するRNA溶液を調製した。 (2) Preparation of RNA solution expressing all target genes An RNA solution expressing all the target genes was prepared by in vitro stimulation with an immunostimulant.

まず、3尾のフグ（魚体重20g）から頭腎を摘出し、スパチュラ、ステンレスメッシュを用いてすりつぶした。そこに5%FBS（Gibco社製）、1% Streptomycin/Penicillin（MP medicals社製）を含むRPMI培地（wako社製）を加え細胞浮遊液を作製した。得られた細胞浮遊液を1×10⁷cells/mlに調整し4区に分け、最終濃度が10μg/mlになるようにLPS（Sigma社製）、poly I:C（Sigma社製）、PHA（wako社製）、Imiquimod（Lkt Laboratories社製）の免疫賦活剤をそれぞれ添加した。その後、穏やかに懸濁し、22℃で4時間静置した。静置後、4℃で1500rpmの条件で10分間遠心分離し、上清を除去した。その後、RNAlaterに一晩浸し(4℃)、RNAlaterを除いたのち、使用時まで-80℃に保存した。 First, the head kidney was extracted from three puffer fish (fish weight 20 g) and ground using a spatula and a stainless mesh. An RPMI medium (manufactured by wako) containing 5% FBS (manufactured by Gibco) and 1% Streptomycin / Penicillin (manufactured by MP medicals) was added thereto to prepare a cell suspension. The resulting cell suspension was adjusted to 1 × 10 ⁷ cells / ml, divided into 4 sections, LPS (Sigma), poly I: C (Sigma), PHA so that the final concentration was 10 μg / ml. (Wako) and Imiquimod (Lkt Laboratories) immunostimulants were added. Then, it suspended gently and left still at 22 degreeC for 4 hours. After standing, the mixture was centrifuged at 1500 rpm for 10 minutes at 4 ° C., and the supernatant was removed. Thereafter, the plate was soaked in RNAlater overnight (4 ° C.), removed from RNAlater, and stored at −80 ° C. until use.

in vitro刺激した頭腎組織からのRNAの抽出は、４区それぞれISOGEN(NIPPON GENE社製)を用いプロトコルに従って行った。抽出した４区それぞれのRNAはRecombinant DNase 1(TAKARA社製)を用いプロトコルに従ってゲノムDNAの除去を行った。その後、DNase処理したRNAは４区それぞれ100ng/μlになるように調整し、刺激したそれぞれのRNAを混合し、これを全ターゲット遺伝子が発現している鋳型RNA（ポジティブコントロールとして使用）とした。 Extraction of RNA from in vitro stimulated head and kidney tissue was performed according to the protocol using ISOGEN (manufactured by NIPPON GENE) for each of the four sections. The extracted RNA of each of the four sections was subjected to genomic DNA removal using Recombinant DNase 1 (TAKARA) according to the protocol. Thereafter, the DNase-treated RNA was adjusted to 100 ng / μl for each of the four sections, and each of the stimulated RNAs was mixed, and this was used as a template RNA expressing all target genes (used as a positive control).

(3) マルチプレックスRT-PCR用プライマーの構築
上記のターゲット遺伝子について、各PCR産物の大きさが最低6bp以上離れるようにGenomeLab GeXP eXpress Profiler softwareを用いて、各遺伝子に対してFwプライマーおよびRvプライマーを設計した(大文字：ユニバーサル配列、小文字：遺伝子特異的配列)。
[IL-2遺伝子増幅用プライマーセット]
Fw: AGGTGACACTATAGAATAggacgatcatcattgcatca(配列番号25）
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAggatttctcgatcttcacgc(配列番号26）
[IL-4/13A遺伝子増幅用プライマーセット]
Fw: AGGTGACACTATAGAATAcaactgtggggatgcttttt(配列番号27）
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAgtttgagggtctcacgtgct(配列番号28）
[IL-4/13B遺伝子増幅用プライマーセット]
Fw: AGGTGACACTATAGAATAtcaaagtctggcactgatcg(配列番号29）
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAgatgcaggtgtttggtgagtt(配列番号30）
[IL-6遺伝子増幅用プライマーセット]
Fw: AGGTGACACTATAGAATAtgaatggtgattcagaccca(配列番号31）
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAgaaaaagctgctcggctcta(配列番号32）
[IL-10遺伝子増幅用プライマーセット]
Fw: AGGTGACACTATAGAATAgctggacctgctcttcaact(配列番号33）
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAactaacggactggcctcctt(配列番号34）
[IL12 p40遺伝子増幅用プライマーセット]
Fw: AGGTGACACTATAGAATAtcatctgcttttcccaaacc(配列番号35）
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAgcccttatttcaagcactgg(配列番号36）
[IL-17A/F1遺伝子増幅用プライマーセット]
Fw: AGGTGACACTATAGAATAtttggttcaggctgatgttg(配列番号37）
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAgcgacttcttgtttgccttc(配列番号38）
[IL-17A/F2遺伝子増幅用プライマーセット]
Fw: AGGTGACACTATAGAATAagtgcattgtggggattctc(配列番号39）
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAcattcagccaacctctcaca(配列番号40）
[IL-17A/F3遺伝子増幅用プライマーセット]
Fw: AGGTGACACTATAGAATAtcaggcccactgttataccc(配列番号41）
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAgctggctctcttagcgattg(配列番号42）
[IL-21遺伝子増幅用プライマーセット]
Fw: AGGTGACACTATAGAATAagaatatgaagccgctggtg(配列番号43）
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAtctcttccagcttcctctgc(配列番号44）
[TGF-β1遺伝子増幅用プライマーセット]
Fw: AGGTGACACTATAGAATAgtcgcagttcccttcaacat(配列番号45）
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAtagagttccacccgttggtc(配列番号46）
[IFNγ遺伝子増幅用プライマーセット]
Fw: AGGTGACACTATAGAATAtttgcgtggttcagacacat(配列番号47）
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAgcgagcacaagtgtgaaaaa(配列番号48）
[IFNγ2遺伝子増幅用プライマーセット]
Fw: AGGTGACACTATAGAATActgtcagcggtacaatgacg(配列番号49）
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAaccatgatgtcgtccacctt(配列番号50）
[β-actin遺伝子増幅用プライマーセット]
Fw: AGGTGACACTATAGAATAcgtcatggactctggtgatg(配列番号69）
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAgtcaggcagctcgtagctct(配列番号70）
[GAPDH遺伝子増幅用プライマーセット]
Fw: AGGTGACACTATAGAATAtcactgccactcagaagacg(配列番号71）
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAggccttcacaaccttcttga(配列番号72） (3) Construction of primers for multiplex RT-PCR Using the GenomeLab GeXP eXpress Profiler software for the above target genes so that the size of each PCR product is at least 6 bp apart, Fw primer and Rv primer for each gene Was designed (upper case: universal sequence, lower case: gene specific sequence).
[IL-2 gene amplification primer set]
Fw: AGGTGACACTATAGAATAggacgatcatcattgcatca (SEQ ID NO: 25)
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAggatttctcgatcttcacgc (SEQ ID NO: 26)
[IL-4 / 13A gene amplification primer set]
Fw: AGGTGACACTATAGAATAcaactgtggggatgcttttt (SEQ ID NO: 27)
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAgtttgagggtctcacgtgct (SEQ ID NO: 28)
[IL-4 / 13B gene amplification primer set]
Fw: AGGTGACACTATAGAATAtcaaagtctggcactgatcg (SEQ ID NO: 29)
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAgatgcaggtgtttggtgagtt (SEQ ID NO: 30)
[IL-6 gene amplification primer set]
Fw: AGGTGACACTATAGAATAtgaatggtgattcagaccca (SEQ ID NO: 31)
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAgaaaaagctgctcggctcta (SEQ ID NO: 32)
[IL-10 gene amplification primer set]
Fw: AGGTGACACTATAGAATAgctggacctgctcttcaact (SEQ ID NO: 33)
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAactaacggactggcctcctt (SEQ ID NO: 34)
[IL12 p40 gene amplification primer set]
Fw: AGGTGACACTATAGAATAtcatctgcttttcccaaacc (SEQ ID NO: 35)
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAgcccttatttcaagcactgg (SEQ ID NO: 36)
[IL-17A / F1 gene amplification primer set]
Fw: AGGTGACACTATAGAATAtttggttcaggctgatgttg (SEQ ID NO: 37)
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAgcgacttcttgtttgccttc (SEQ ID NO: 38)
[IL-17A / F2 gene amplification primer set]
Fw: AGGTGACACTATAGAATAagtgcattgtggggattctc (SEQ ID NO: 39)
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAcattcagccaacctctcaca (SEQ ID NO: 40)
[IL-17A / F3 gene amplification primer set]
Fw: AGGTGACACTATAGAATAtcaggcccactgttataccc (SEQ ID NO: 41)
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAgctggctctcttagcgattg (SEQ ID NO: 42)
[IL-21 gene amplification primer set]
Fw: AGGTGACACTATAGAATAagaatatgaagccgctggtg (SEQ ID NO: 43)
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAtctcttccagcttcctctgc (SEQ ID NO: 44)
[TGF-β1 gene amplification primer set]
Fw: AGGTGACACTATAGAATAgtcgcagttcccttcaacat (SEQ ID NO: 45)
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAtagagttccacccgttggtc (SEQ ID NO: 46)
[IFNγ gene amplification primer set]
Fw: AGGTGACACTATAGAATAtttgcgtggttcagacacat (SEQ ID NO: 47)
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAgcgagcacaagtgtgaaaaa (SEQ ID NO: 48)
[IFNγ2 gene amplification primer set]
Fw: AGGTGACACTATAGAATActgtcagcggtacaatgacg (SEQ ID NO: 49)
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAaccatgatgtcgtccacctt (SEQ ID NO: 50)
[Primer set for β-actin gene amplification]
Fw: AGGTGACACTATAGAATAcgtcatggactctggtgatg (SEQ ID NO: 69)
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAgtcaggcagctcgtagctct (SEQ ID NO: 70)
[GAPDH gene amplification primer set]
Fw: AGGTGACACTATAGAATAtcactgccactcagaagacg (SEQ ID NO: 71)
Rv: GTACGACTCACTATAGGGAggccttcacaaccttcttga (SEQ ID NO: 72)

(4) RT-PCR反応
(4-1) Singlet反応
設計したプライマーの特異性を確認するため、各遺伝子に特異的なプライマーを用いてRT-PCR反応を行った。反応は（2）で作製したRNAを鋳型とし、GenomeLab GeXP Start Kit (ベックマン・コールター社製)を用いて行った。まずRT反応は、DNase/RNase Free H₂O(9μl)、RT Buffer 5×(4μl)、KAN^rRNA with RI(3μl) 、Rv Primer(0.5μM)(2μl)、Reverse Transcriptase(5 units/μl)(1μl)、Template(100ng/μl)(1μl)を混合し、20μlのボリュームで行った。反応条件は、48℃で1分間、42℃で1時間、95℃で5分間とした。 (4) RT-PCR reaction
(4-1) Singlet reaction In order to confirm the specificity of the designed primer, RT-PCR reaction was performed using primers specific to each gene. The reaction was performed using the RNA prepared in (2) as a template and GenomeLab GeXP Start Kit (manufactured by Beckman Coulter). RT reaction _{First, DNase / RNase Free H 2 O} (9μl), RT Buffer 5 × (4μl), KAN r RNA with RI (3μl), Rv Primer (0.5μM) (2μl), Reverse Transcriptase (5 units / μl ) (1 μl) and Template (100 ng / μl) (1 μl) were mixed and performed in a volume of 20 μl. The reaction conditions were 48 ° C for 1 minute, 42 ° C for 1 hour, and 95 ° C for 5 minutes.

続いて、PCR反応は、RT反応産物を鋳型に、25mM MgCl₂(1μl)、PCR Buffer 5×(4μl)、PCR Fw Primer(0.2μM)(2μl)、DNA Polymerase(Thermo社製)(0.7μl)、Template (9.3μl)を混合し、20μlのボリュームで行った。反応条件は、最初に95℃、10分間の熱変性、次いで、94℃、30秒の熱変性、55℃、60秒のアニーリング、70℃、90秒の伸長を１サイクルとして計45サイクルを行い、その後室温保存とした。当該PCRは、初期の数サイクルでユニバーサル配列を含むPCR産物を生成し、その後、PCR Buffer中に含まれるユニバーサルプライマーを利用することによって遺伝子を増幅させるものである。RT反応およびPCR反応はC1000 Thermal Cycler(BIORAD社製)を用いて行った。 Subsequently, PCR reaction was performed using RT reaction product as a template, 25 mM MgCl ₂ (1 μl), PCR Buffer 5 × (4 μl), PCR Fw Primer (0.2 μM) (2 μl), DNA Polymerase (Thermo) (0.7 μl) ) And Template (9.3 μl) were mixed and performed in a volume of 20 μl. The reaction conditions were 95 ° C, heat denaturation for 10 minutes, then 94 ° C, 30 seconds of heat denaturation, 55 ° C, 60 seconds of annealing, 70 ° C, 90 seconds of extension for one cycle for a total of 45 cycles. Thereafter, it was stored at room temperature. In the PCR, a PCR product containing a universal sequence is generated in the initial several cycles, and then a gene is amplified by using a universal primer contained in the PCR Buffer. RT reaction and PCR reaction were performed using C1000 Thermal Cycler (BIORAD).

(4-2) マルチプレックス反応
各遺伝子プライマーでの非特異反応の確認を行うため、全ターゲット遺伝子のFwプライマーを混合したFwプライマー混合液と、全ターゲット遺伝子のRvプライマーを混合したRvプライマー混合液をそれぞれ調製し、これらの各混合液をFwプライマーおよびRvプライマーとしてマルチプレックスRT-PCR反応を行った。反応は、(4-1)に記載の条件に従った。 (4-2) Multiplex reaction In order to confirm non-specific reaction with each gene primer, Fw primer mixed solution mixed with Fw primer of all target genes and Rv primer mixed solution mixed with Rv primers of all target genes Were prepared, and a multiplex RT-PCR reaction was performed using each of these mixed solutions as an Fw primer and an Rv primer. The reaction followed the conditions described in (4-1).

さらに、全ターゲット遺伝子の増幅効率を、GenomeLab GeXP softwareの検出最適値となるDye Signal 10,000に近づけるよう、特に発現量の高い遺伝子(20,000以上)および低い遺伝子(5,000以下)について、混合前のRvプライマー濃度を977pM から 2500nMの範囲で調整し、Rvプライマー混合液を作製した。この濃度調製後のRvプライマー混合液を用いる以外は、(4-1)に記載の条件に従い、マルチプレックスRT-PCR反応を行った。 In addition, Rv primers before mixing, especially for genes with a high expression level (20,000 or more) and genes with a low expression (5,000 or less) so that the amplification efficiency of all target genes approaches the dye signal 10,000, which is the optimal detection value of GenomeLab GeXP software. The concentration was adjusted in the range of 977 pM to 2500 nM to prepare an Rv primer mixture. A multiplex RT-PCR reaction was performed according to the conditions described in (4-1) except that the Rv primer mixture after this concentration was used.

（5）電気泳動
RT-PCR反応終了後、サンプル1μlをSample Loading Solution (Beckman coulter社製)(39μl)に混合した。その後、全量をCEQサンプルプレート（Beckman coulter社製）に移し、ミネラルオイル(Beckman coulter社製)を1滴添加した。CEQ8000 Automated Sequencer（Beckman coulter社製）にCEQサンプルプレートをセットし電気泳動した。 (5) Electrophoresis
After completion of the RT-PCR reaction, 1 μl of the sample was mixed with Sample Loading Solution (Beckman coulter) (39 μl). Thereafter, the entire amount was transferred to a CEQ sample plate (manufactured by Beckman coulter), and 1 drop of mineral oil (manufactured by Beckman coulter) was added. A CEQ sample plate was set on a CEQ8000 Automated Sequencer (Beckman coulter) and electrophoresed.

（6）解析
得られたピークデータはGenomeLab GeXP softwareを用いて解析し、(4-1)のSinglet反応で得られたデータについては、プライマーの特異性を確認し、(4-2)のマルチプレックス反応で得られたデータについては、各遺伝子の反応及び非特異産物の有無を確認した（図１）。また、プライマー濃度を調整したマルチプレックス反応で得られたデータについては、GenomeLab GeXP softwareの検出限界となるDye Signalが10,000から20,000前後におさまることを確認した（図２）。 (6) Analysis The peak data obtained was analyzed using GenomeLab GeXP software. For the data obtained by the Singlet reaction of (4-1), the specificity of the primer was confirmed, and the multiplicity of (4-2) was confirmed. About the data obtained by plex reaction, the reaction of each gene and the presence or absence of a non-specific product were confirmed (FIG. 1). In addition, regarding the data obtained by the multiplex reaction with the adjusted primer concentration, it was confirmed that the dye signal, which is the detection limit of GenomeLab GeXP software, falls within the range of 10,000 to 20,000 (FIG. 2).

（実施例２）マルチプレックスRT-PCRによるサイトカイン遺伝子発現量の測定
(1) 疑似感染モデル魚の作製
30gのフグにリポポリサッカライド(LPS)溶液(100μg/ml)100μlまたはpolyI:C溶液(100μg/ml)100μlを腹腔内注射した。その後、継時的(4, 8, 12, 24, 48, 120時間)に取り上げ頭腎を摘出した。摘出した頭腎は使用するまでの間RNAlaterに一晩浸し(4℃)、RNAlaterを除いたのち、使用時まで-80℃に保存した。 (Example 2) Measurement of cytokine gene expression level by multiplex RT-PCR
(1) Production of simulated infection model fish
30 g of pufferfish was injected intraperitoneally with 100 μl of lipopolysaccharide (LPS) solution (100 μg / ml) or 100 μl of polyI: C solution (100 μg / ml). Thereafter, the head kidney was removed at successive times (4, 8, 12, 24, 48, 120 hours). The excised head kidney was soaked in RNAlater overnight (4 ° C.) until use, removed from RNAlater, and stored at −80 ° C. until use.

(2) RNAの調製
摘出した頭腎から、ISOGEN(NIPPON GENE社製)を用いてプロトコルに従って全RNAを抽出した。抽出したRNAはRecombinant Dnase 1(TAKARA社製)を用いてプロトコルに従ってゲノムDNAの除去を行った。 (2) Preparation of RNA Total RNA was extracted from the excised head kidney using ISOGEN (NIPPON GENE) according to the protocol. The extracted RNA was subjected to genomic DNA removal using Recombinant Dnase 1 (TAKARA) according to the protocol.

(3) マルチプレックスRT-PCR
検量線の作製のための鋳型として（2）で作製したRNAのうち4時間刺激のものを段階希釈したものを用い、測定するサンプルは（2）で作製したRNA用いて行った。 (3) Multiplex RT-PCR
As a template for preparing a calibration curve, the RNA prepared in (2) was serially diluted with a 4-hour stimulus, and the sample to be measured was the RNA prepared in (2).

マルチプレックスRT-PCRは、IL-2、IL-4/13A、IL-4/13B、IL-6、IL-10、IL-12 p40、IL-17A/F1、IL-17A/F2、IL-17A/F3、IL-21、TGF-β1、IFNγ、IFNγ2の13遺伝子のFwプライマーを混合したFwプライマー混合液と、同13遺伝子のRvプライマーを混合したRvプライマー混合液（実施例1(4-2)で濃度を最適化したプライマー混合液）をそれぞれ調製し、これらの各混合液をFwプライマーおよびRvプライマーとしてGenomeLab GeXP Start Kit (ベックマン・コールター社製)を用いて行った。まずRT反応ではDNase/RN ase Free H₂O(9μl)、RT Buffer 5×(4μl)、KAN^rRNA with RI(3μl)、Rvプライマー混合液 (0.5μM)(2μl)、Reverse Transcriptase(5 units/μl)(1μl)、Template (100ng/μl)(1μl)を混合し、20μlのボリュームで行った。反応条件は、48℃で1分間、42℃で1時間、95℃で5分間とした。次に、PCR反応はRT反応終了後の産物を鋳型に、25mM MgCl₂(1μl)、PCR Buffer 5×(4μl)、Fwプライマー混合液(0.2μM)(2μl)、DNA Polymerase(Thermo社製)(0.7μl)、Template (9.3μl)を混合し、20μlのボリュームで行った。反応条件は、最初に95℃、10分間の熱変性、次いで、94℃、30秒の熱変性、55℃、60秒のアニーリング、70℃、90秒の伸長を１サイクルとして計35サイクルを行い、その後室温保存した。RT反応およびPCR反応はC1000 Thermal Cycler(BIORAD社製)を用いて行った。 Multiplex RT-PCR is available for IL-2, IL-4 / 13A, IL-4 / 13B, IL-6, IL-10, IL-12 p40, IL-17A / F1, IL-17A / F2, IL- 17A / F3, IL-21, TGF-β1, IFNγ, IFNγ2, 13 gene Fw primer mixed solution and 13 gene Rv primer mixed Rv primer mixed solution (Example 1 (4- Primer mixtures whose concentrations were optimized in 2) were prepared, and each of these mixtures was performed using the GenomeLab GeXP Start Kit (manufactured by Beckman Coulter) as the Fw primer and Rv primer. First, for RT reaction, DNase / RNase Free H ₂ O (9 μl), RT Buffer 5 × (4 μl), KAN ^r RNA with RI (3 μl), Rv primer mixture (0.5 μM) (2 μl), Reverse Transcriptase (5 units) / μl) (1 μl) and Template (100 ng / μl) (1 μl) were mixed and performed in a volume of 20 μl. The reaction conditions were 48 ° C for 1 minute, 42 ° C for 1 hour, and 95 ° C for 5 minutes. Next, the PCR reaction uses the product after completion of the RT reaction as a template, 25 mM MgCl ₂ (1 μl), PCR Buffer 5 × (4 μl), Fw primer mixture (0.2 μM) (2 μl), DNA Polymerase (Thermo) (0.7 μl) and Template (9.3 μl) were mixed and performed in a volume of 20 μl. The reaction conditions were 95 ° C, heat denaturation for 10 minutes, then 94 ° C, heat denaturation for 30 seconds, 55 ° C, 60 seconds annealing, 70 ° C, 90 seconds extension for one cycle for a total of 35 cycles. Then, it was stored at room temperature. RT reaction and PCR reaction were performed using C1000 Thermal Cycler (BIORAD).

(4) 電気泳動
RT-PCR反応終了後、サンプル1μlをSample Loading Solution (Beckman coulter社製)(39μl)に混合した。その後、全量をCEQサンプルプレート（Beckman coulter社製）に移し、ミネラルオイル(Beckman coulter社製)を1滴添加した。CEQ8000 Automated Sequencer（Beckman coulter社製）にCEQサンプルプレートをセットし電気泳動した。 (4) Electrophoresis
After completion of the RT-PCR reaction, 1 μl of the sample was mixed with Sample Loading Solution (Beckman coulter) (39 μl). Thereafter, the entire amount was transferred to a CEQ sample plate (manufactured by Beckman coulter), and 1 drop of mineral oil (manufactured by Beckman coulter) was added. A CEQ sample plate was set on a CEQ8000 Automated Sequencer (Beckman coulter) and electrophoresed.

(5) 解析
得られたピークデータはGenomeLab GeXP softwareを用いて解析し、The GeXP eXpress Profilerを用いて対象となる遺伝子のピークデータの決定を行った。同時に、発現データの補正を行うために、発現量の変動が安定している内部標準遺伝子(β-actinまたはGAPDH遺伝子のどちらか)の選択を行った。その後GeXP Quant Toolを用いて解析し、検量線より各遺伝子の発現量を換算し、その後、内部標準遺伝子で補正した各遺伝子の発現量を定量した。結果を図３〜１２に示す。IL-2、IL-4/13A、IL-4/13B、IL-10、IL-17A/F1、IL-17A/F2、IL-17A/F3、IL-21、TGF-β1、IFNγの10遺伝子については、LPSおよびpolyI:Cによる刺激によって発現量が有意に増加することが確認された。従って、これらのサイトカイン遺伝子は、魚類の健康状態を評価する指標として用いることができるといえる。 (5) Analysis The obtained peak data was analyzed using GenomeLab GeXP software, and the peak data of the target gene was determined using The GeXP eXpress Profiler. At the same time, in order to correct the expression data, an internal standard gene (either β-actin or GAPDH gene) whose expression level was stable was selected. Thereafter, the analysis was performed using GeXP Quant Tool, the expression level of each gene was converted from the calibration curve, and then the expression level of each gene corrected with the internal standard gene was quantified. The results are shown in FIGS. 10 genes of IL-2, IL-4 / 13A, IL-4 / 13B, IL-10, IL-17A / F1, IL-17A / F2, IL-17A / F3, IL-21, TGF-β1, IFNγ For, it was confirmed that the expression level was significantly increased by stimulation with LPS and polyI: C. Therefore, it can be said that these cytokine genes can be used as an index for evaluating the health condition of fish.

本発明は、魚類の増養殖分野、魚類用医薬品の研究および製造開発分野製において利用できる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can be used in the field of fish aquaculture, fish pharmaceutical research and production development.

Claims

A method for diagnosing the health condition of fish, comprising the following steps.
(1) IL-2 (SEQ ID NO: 1), IL-4 / 13A (SEQ ID NO: 2), IL-4 / 13B (SEQ ID NO: 3), IL-6 (SEQ ID NO: 4) in test samples collected from fish ), IL-10 (SEQ ID NO: 5), IL-12 p40 (SEQ ID NO: 6), IL-17A / F1 (SEQ ID NO: 7), IL-17A / F2 (SEQ ID NO: 8), IL-17A / F3 (sequence) No. 9), IL-21 (SEQ ID NO: 10), TGF-β1 (SEQ ID NO: 11), IFNγ (SEQ ID NO: 12), IFNγ2 (SEQ ID NO: 13), TNFα (SEQ ID NO: 14), TNFβ (SEQ ID NO: 15), IL-1β (SEQ ID NO: 16), IL-7 (SEQ ID NO: 17), IL-12 p35 (SEQ ID NO: 18), IL-15 (SEQ ID NO: 19), IL-15Like (SEQ ID NO: 20), IL-18 ( A step of measuring the expression level of a cytokine gene selected from the group consisting of SEQ ID NO: 21) and I-IFN-1 (SEQ ID NO: 22)
(2) A process to evaluate the health of fish based on the measurement results of process (1)

The method according to claim 1, wherein the expression level of the cytokine gene is measured from the amount of mRNA transcribed from the gene.

The method according to claim 2, wherein the expression level of the mRNA level is measured by an RT-PCR method or a real-time RT-PCR method.

The method according to claim 3, wherein the RT-PCR is multiplex RT-PCR.

The method according to claim 4, wherein the gene is amplified using a primer set selected from the group consisting of the primer sets according to any one of (p1) to (p22) below.
(p1) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 25 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 26
(p2) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 27 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 28
(p3) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 29 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 30
(p4) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 31 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 32
(p5) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 33 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 34
(p6) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 35 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 36
(p7) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 37 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 38
(p8) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 39 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 40
(p9) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 41 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 42
(p10) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 43 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 44
(p11) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 45 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 46
(p12) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 47 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 48
(p13) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 49 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 50
(p14) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 51 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 52
(p15) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 53 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 54
(p16) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 55 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 56
(p17) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 57 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 58
(p18) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 59 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 60
(p19) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 61 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 62
(p20) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 63 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 64
(p21) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 65 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 66
(p22) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 67 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 68

The method according to claim 1, wherein the expression level of the cytokine gene is measured from the amount of polypeptide encoded by the gene.

The method according to claim 6, wherein the amount of the polypeptide is measured using an antibody against the polypeptide or a fragment thereof.

In the step (2), the gene expression level is analyzed by comparing the gene expression level in the test sample and the gene expression level in the control sample, thereby diagnosing the health condition of the fish. The method in any one of.

The following (p1) to (p22) fish health condition primer sets:
(p1) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 25 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 26
(p2) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 27 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 28
(p3) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 29 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 30
(p4) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 31 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 32
(p5) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 33 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 34
(p6) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 35 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 36
(p7) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 37 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 38
(p8) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 39 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 40
(p9) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 41 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 42
(p10) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 43 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 44
(p11) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 45 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 46
(p12) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 47 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 48
(p13) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 49 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 50
(p14) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 51 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 52
(p15) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 53 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 54
(p16) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 55 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 56
(p17) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 57 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 58
(p18) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 59 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 60
(p19) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 61 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 62
(p20) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 63 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 64
(p21) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 65 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 66
(p22) A primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 67 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 68

A probe for diagnosing fish health conditions which hybridizes to a polynucleotide comprising the base sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1 to 22 and has a length of at least 15 bases for detecting the polynucleotide.

A kit for diagnosing fish health, comprising at least the primer set according to claim 9.