JP2013040232A - Hollow nanoparticle of head-tail type copolymer - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ジスルフィド架橋により水中で安定化された中空ナノ微粒子に関し、より詳細にはポリアミドアミンデンドロンのヘッド部とポリ-Ｌ-リシンのテイル部とを有するヘッド-テイル型ブロック共重合体のベシクルからなり、該ポリ-Ｌ-リシン間がジスルフィド架橋されている水中で安定な中空ナノ微粒子に関する。 The present invention relates to a hollow nanoparticle stabilized in water by disulfide crosslinking, and more particularly, a vesicle of a head-tail block copolymer having a polyamidoamine dendron head portion and a poly-L-lysine tail portion. The present invention relates to a hollow nanoparticle that is stable in water and is disulfide-bridged between the poly-L-lysine.
ブロック共重合体が選択溶媒中での自己組織化により形成する多分子集合体は、高分子ミセルやロッド、ラメラ、ベシクルなど様々な形態をとることが報告されている(非特許文献１〜４)。
樹木状高分子であるポリアミドアミン(ＰＡＭＡＭ)デンドロンとポリペプチドであるポリ-Ｌ-リシン(ＰＬＬ)からなるヘッド-テイル型ブロック共重合体は、水/高濃度メタノール混合溶媒中で、自己組織化によりベシクルを形成することが知られている(非特許文献５〜７)。
It has been reported that multimolecular assemblies formed by block copolymers by self-assembly in a selective solvent take various forms such as polymer micelles, rods, lamellas, and vesicles (Non-Patent Documents 1 to 4). ).
A head-tail block copolymer consisting of dendritic polymer polyamidoamine (PAMAM) dendron and polypeptide poly-L-lysine (PLL) is self-assembled in water / high concentration methanol mixed solvent. Is known to form vesicles (Non-Patent Documents 5 to 7).
上記のヘッド-テイル型ブロック共重合体が高濃度メタノール/水混合溶媒中で形成するベシクルは、水中に移行すると崩壊してしまう。ベシクル構造を維持するために分散媒としてメタノール含有溶媒を必要とする限り、該ベシクルからなる中空ナノ微粒子を、例えば遺伝子ベクターやドラッグデリバリーシステム(ＤＤＳ)として応用・発展させることはできない。 The vesicle formed by the above-mentioned head-tail type block copolymer in a high concentration methanol / water mixed solvent is disintegrated when transferred to water. As long as a methanol-containing solvent is required as a dispersion medium in order to maintain the vesicle structure, the hollow nanoparticle made of the vesicle cannot be applied or developed as, for example, a gene vector or a drug delivery system (DDS).
そこで、テイル間に不可逆的架橋を導入することにより水中で安定化されたヘッド-テイル型共重合体(ＰＡＭＡＭデンドロン−ポリ-Ｌ-リシン)の中空ナノ微粒子及びその製造方法が開発されている(非特許文献９及び特許文献１)。
この技術による中空ナノ微粒子において、ベシクル内部に保持された物質は、周囲環境のｐＨ低下に伴い放出されるか又は(物質がアニオン性である場合には)自発的に漏出する。いずれにしても、物質は、重合体からなる殻を通過する必要があり、その結果、物質の放出/漏出は緩慢である。
Thus, hollow nano-particles of a head-tail type copolymer (PAMAM dendron-poly-L-lysine) stabilized in water by introducing irreversible crosslinking between the tails and a method for producing the same have been developed ( Non-Patent Document 9 and Patent Document 1).
In the hollow nanoparticle by this technique, the substance held inside the vesicle is released as the pH of the surrounding environment decreases or spontaneously leaks out (if the substance is anionic). In any case, the substance needs to pass through a shell made of polymer, so that the release / leakage of the substance is slow.
物質(特に、遺伝子や薬物のような治療薬)の送達という観点からは、目的の部位に到達した後は、ベシクルが崩壊することにより内部に保持された物質が速やかに放出されることが好都合である場合が多い。
例えば、(特に動物)細胞内は、還元剤であるグルタチオンが、細胞外に比べ１０〜１００倍高い濃度(１〜１００ｍＭ)で存在し、還元環境にあることが知られている(非特許文献８)。
よって、水中で安定であるが、特定の環境(例えば、所定の還元環境)下で崩壊する中空ナノ微粒子についての必要性が存在していた。
From the viewpoint of delivery of a substance (especially a therapeutic agent such as a gene or drug), it is advantageous that after reaching the target site, the substance held inside is quickly released by the collapse of the vesicle. In many cases.
For example, it is known that glutathione, which is a reducing agent, is present in cells (especially animals) at a concentration (1 to 100 mM) that is 10 to 100 times higher than that outside the cells and is in a reducing environment (non-patent literature). 8).
Thus, there has been a need for hollow nanoparticles that are stable in water, but disintegrate under certain circumstances (eg, a predetermined reducing environment).
したがって、本発明は、ポリアミドアミンデンドロンのヘッド部とポリ-Ｌ-リシンのテイル部とを有するヘッド-テイル型ブロック共重合体のベシクルからなり、ポリ-Ｌ-リシン間がジスルフィド架橋されている水中で安定な中空ナノ微粒子を提供する。 Accordingly, the present invention comprises a head-tail type block copolymer vesicle having a polyamidoamine dendron head portion and a poly-L-lysine tail portion, wherein the poly-L-lysine is disulfide-bridged in water. And stable hollow nano-particles.
また、本発明は、上記ヘッド-テイル型ブロック共重合体を１００/０〜５０/５０の水/水と混和性のアルコール混合溶媒に溶解させ；得られる溶液に、水/アルコール比が３０/７０〜０/１００となるまでアルコールを滴下して、該ブロック共重合体を中空ナノ微粒子に自己組織化させ；得られた自己組織体においてポリ-Ｌ-リシンにチオール基含有リンカーを導入し；酸化条件下でチオール基含有リンカー間にジスルフィド結合を生成させてテイル部をジスルフィド架橋することを含んでなる、水中で安定な中空ナノ微粒子の製造方法を提供する。 In the present invention, the head-tail type block copolymer is dissolved in 100/0 to 50/50 water / water miscible alcohol mixed solvent; the resulting solution has a water / alcohol ratio of 30 / Alcohol is dropped until 70 to 0/100 to cause the block copolymer to self-assemble into hollow nanoparticles; a thiol group-containing linker is introduced into poly-L-lysine in the obtained self-assembly; Provided is a method for producing a hollow nanoparticle that is stable in water, which comprises forming a disulfide bond between thiol group-containing linkers under oxidizing conditions to disulfide bridge the tail portion.
本発明の中空ナノ微粒子によれば、例えば運搬体/送達剤(ベクター、キャリア又はＤＤＳ製剤)として利用可能な、水中で安定であるが特定の還元環境/条件下で崩壊する中空ナノ微粒子が提供される。
本発明の中空ナノ微粒子の製造方法によれば、単分散の上記中空ナノ微粒子が容易に製造できる。
The hollow nanoparticle of the present invention provides a hollow nanoparticle that can be used as a carrier / delivery agent (vector, carrier or DDS formulation), for example, which is stable in water but disintegrates under a specific reducing environment / condition. Is done.
According to the method for producing hollow nanoparticles of the present invention, the monodispersed hollow nanoparticles can be easily produced.
＜中空ナノ微粒子＞
本発明の中空ナノ微粒子は、ポリアミドアミンデンドロンのヘッド部とポリ-Ｌ-リシンのテイル部とを有するヘッド-テイル型ブロック共重合体のベシクルからなり、ポリ-Ｌ-リシン間がジスルフィド架橋されていることを特徴とする。この構成により、本発明の中空ナノ微粒子は水中で安定である(すなわち、水中でベシクル構造を維持できる)が、特定の還元環境条件下で崩壊する。本発明においては、特に言及しない限り、「水」は、還元剤を含有しない水を意味する。
<Hollow nanoparticle>
The hollow nanoparticle of the present invention comprises a head-tail block copolymer vesicle having a polyamidoamine dendron head portion and a poly-L-lysine tail portion, and the poly-L-lysine is disulfide-crosslinked. It is characterized by being. With this configuration, the hollow nanoparticle of the present invention is stable in water (ie, can maintain a vesicle structure in water), but disintegrates under a specific reducing environment condition. In the present invention, unless otherwise specified, “water” means water containing no reducing agent.
本発明の中空ナノ微粒子は、好ましくは３００μＭ、より好ましくは５００μＭ以上、より好ましくは１ｍＭ以上のグルタチオンの存在下で崩壊する。
本発明において、ベシクルが「崩壊する」とは、必ずしも全てのベシクルが崩壊することを意味せず、所定の割合のベシクルが崩壊することをいう。所定の割合のベシクルの崩壊は、散乱光強度の低下として理解される。よって、例えば「３００μＭのグルタチオンの存在下で崩壊する」とは、還元剤を含まない水(例えば、蒸留水)中の中空ナノ微粒子分散液の散乱光強度を１００％としたとき、３００μＭのグルタチオン添加後８時間以内に散乱光強度が例えば４０％未満に低下することを意味するものとする。
The hollow nanoparticle of the present invention is preferably disintegrated in the presence of 300 μM, more preferably 500 μM or more, more preferably 1 mM or more glutathione.
In the present invention, “collapse” of vesicles does not necessarily mean that all vesicles collapse, but means that a predetermined percentage of vesicles collapse. A predetermined percentage of vesicle decay is understood as a decrease in scattered light intensity. Therefore, for example, “disintegrate in the presence of 300 μM glutathione” means that when the scattered light intensity of the hollow nanoparticle dispersion in water containing no reducing agent (eg, distilled water) is 100%, 300 μM glutathione. It means that the scattered light intensity falls to, for example, less than 40% within 8 hours after the addition.
ポリ-Ｌ-リシン間のジスルフィド架橋は、ポリ-Ｌ-リシンの側鎖アミノ基(εアミノ基)を介するが、水中で安定なベシクル構造を維持でき、特定の還元環境(例えば、３００μＭ以上のグルタチオンの存在)下で崩壊する限り、ポリ-Ｌ-リシンの全ての側鎖アミノ基がジスルフィド架橋に関与している必要はない。 Although the disulfide bridge between poly-L-lysine is via the side chain amino group (ε-amino group) of poly-L-lysine, it can maintain a stable vesicle structure in water and has a specific reducing environment (for example, 300 μM or more). All side chain amino groups of poly-L-lysine need not be involved in disulfide bridges as long as they decay in the presence of glutathione).
好ましくは、ポリ-Ｌ-リシン間のジスルフィド架橋は、εアミノ基間の結合-Ｌ1-Ｓ-Ｓ-Ｌ2-による。前記式中、Ｌ1及びＬ2は独立して、-(ＣＨ2)n-、-Ｃ6Ｈ4-、-(ＣＨ2)n-Ｃ6Ｈ4-、-Ｃ6Ｈ4-(ＣＨ2)n-、-(ＣＨ2)m-Ｃ6Ｈ4-(ＣＨ2)p-、-(ＣＨ2)m-ＮＨ-ＣＯ-(ＣＨ2)p-、-ＣＯ-(ＣＨ2)n-、-Ｃ(=ＮＨ2 +)-(ＣＨ2)n-、-ＣＯ-Ｃ6Ｈ4-、-ＣＯ-(ＣＨ2)n-Ｃ6Ｈ4-、-ＣＯ-Ｃ6Ｈ4-(ＣＨ2)n-、-ＣＯ-(ＣＨ2)m-Ｃ6Ｈ4-(ＣＨ2)p-、-ＣＯ-(ＣＨ2)m-ＮＨ-ＣＯ-(ＣＨ2)p-又は-ＣＯ-(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)m-ＮＨ-ＣＯ-(ＣＨ2)p-を表す。ここで、ｎ、ｍ及びｐはそれぞれ独立して１〜１４の整数であり(ただしｍ＋ｐ≦１４)、好ましくは１〜６の整数である。ｐはより好ましくは１〜３の整数である。
Ｌ1及びＬ2中のアルキレン基は置換されていてもよい。置換基は好ましくはＣ1〜4アルキル基である。
Preferably, the disulfide bridge between poly-L-lysine is due to the linkage between the ε-amino groups -L 1 -SSL 2- . In the above formula, L 1 and L 2 are independently — (CH 2 ) n —, —C 6 H 4 —, — (CH 2 ) n —C 6 H 4 —, —C 6 H 4 — (CH 2) n -, - (CH 2) m -C 6 H 4 - (CH 2) p -, - (CH 2) m -NH-CO- (CH 2) p -, - CO- (CH 2) n -, - C (= NH 2 +) - (CH 2) n -, - CO-C 6 H 4 -, - CO- (CH 2) n -C 6 H 4 -, - CO-C 6 H 4 - (CH 2) n -, - CO- (CH 2) m -C 6 H 4 - (CH 2) p -, - CO- (CH 2) m -NH-CO- (CH 2) p - or -CO - (CH 2 CH 2 O) m -NH-CO- (CH 2) p - represents a. Here, n, m, and p are each independently an integer of 1 to 14 (where m + p ≦ 14), and preferably an integer of 1 to 6. p is more preferably an integer of 1 to 3.
The alkylene group in L 1 and L 2 may be substituted. Substituent is preferably C 1 ~ 4 alkyl group.
Ｌ1及びＬ2の具体例として、-Ｃ(=ＮＨ2 +)-(ＣＨ2)3-、-ＣＯ-ＣＨ(ＮＨＣＯＣＨ3)-(ＣＨ2)2-、-ＣＯ-ＣＨ2-、-ＣＯ-(ＣＨ2)2-、-ＣＯ-(ＣＨ2)5-ＮＨ-ＣＯ-(ＣＨ2)2-、-ＣＯ-Ｃ6Ｈ4-Ｃ(ＣＨ3)-、-ＣＯ-(ＣＨ2)5-ＮＨ-ＣＯ-Ｃ6Ｈ4-Ｃ(ＣＨ3)-、-ＣＯ-(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)4-ＮＨ-ＣＯ-(ＣＨ2)2-及び-ＣＯ-(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)12-ＮＨ-ＣＯ-(ＣＨ2)2-(ここで、前記のいずれの式においても、アルキレン基はＣ1〜4アルキル基で置換されていてもよい)が挙げられる。 Specific examples of L 1 and L 2 include —C (═NH 2 + ) — (CH 2 ) 3 —, —CO—CH (NHCOCH 3 ) — (CH 2 ) 2 —, —CO—CH 2 —, — CO— (CH 2 ) 2 —, —CO— (CH 2 ) 5 —NH—CO— (CH 2 ) 2 —, —CO—C 6 H 4 —C (CH 3 ) —, —CO— (CH 2 ) 5 -NH-CO-C 6 H 4 -C (CH 3 )-, -CO- (CH 2 CH 2 O) 4 -NH-CO- (CH 2 ) 2 -and -CO- (CH 2 CH 2 O) 12 -NH-CO- (CH 2) 2 - ( wherein, in said any formula, the alkylene group may be substituted with C 1 ~ 4 alkyl group).
本発明において、ポリアミドアミンデンドロンは、世代数が３.０〜４.０であることが好ましい。ポリアミドアミンデンドロンにおいて、好ましい繰り返し単位は、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2Ｎ＜である。
末端基(又は表面基)は親水性基であり、例えばヒドロキシ基、アミノ基、(Ｃ1〜Ｃ4)アシル基、カルボキシル基、カルボキシル(Ｃ1〜Ｃ4)アルキル基、スルホ基、スルホ(Ｃ1〜Ｃ4)アルキル基であり、好ましくはヒドロキシ基である。
In the present invention, the polyamidoamine dendron preferably has a generation number of 3.0 to 4.0. In the polyamidoamine dendron, a preferred repeating unit is —CH 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2 N <.
The terminal group (or surface group) is a hydrophilic group, for example, a hydroxy group, an amino group, a (C 1 -C 4 ) acyl group, a carboxyl group, a carboxyl (C 1 -C 4 ) alkyl group, a sulfo group, a sulfo group ( a C 1 -C 4) alkyl group, preferably a hydroxy group.
繰り返し単位をＸ(好ましくは、Ｘ＝−ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2Ｎ＜)、末端基をＹとすると３.０世代のポリアミドアミンデンドロンは式：
−ＣＨ2ＣＨ2−Ｎ(Ｘ(Ｘ(ＸＹ2)2)2
で表され、４.０世代のポリアミドアミンデンドロンは式：
−ＣＨ2ＣＨ2−Ｎ((Ｘ(Ｘ(Ｘ(ＸＹ2)2)2)2
で表される。
When the repeating unit is X (preferably X = —CH 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2 N <) and the end group is Y, the 3.0 generation polyamidoamine dendron is represented by the formula:
—CH 2 CH 2 —N (X (X (XY 2 ) 2 ) 2
The 4.0 generation polyamide amine dendron is represented by the formula:
-CH 2 CH 2 -N ((X (X (X (XY 2) 2) 2) 2
It is represented by
１つの実施形態において、ポリアミドアミンデンドロンは３.５世代である。繰り返し単位が−ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2Ｎ＜であり、末端基がカルボキシ基である３.５世代のポリアミドアミンデンドロンは、次式で表される。 In one embodiment, the polyamidoamine dendron is 3.5 generations. A 3.5th generation polyamidoamine dendron in which the repeating unit is —CH 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2 N <and the terminal group is a carboxy group is represented by the following formula.
ポリ-Ｌ-リシン：
は、重合度が例えば６０〜１２０、好ましくは７０〜１１０である。
Poly-L-lysine:
Has a degree of polymerization of, for example, 60 to 120, preferably 70 to 110.
本発明の中空ナノ微粒子の粒径は、ナノメートルオーダーである。例えば、平均粒径は１００〜３００ｎｍであり得る。１つの好ましい実施形態において、粒径分布は単分散(例えば、多分散指数０.１５以下、より好ましくは０.１以下である。下限は特に限定されない(当然のことながら０以上である)が、例えば０.０３であり得る)である。 The particle size of the hollow nanoparticle of the present invention is on the order of nanometers. For example, the average particle size can be 100-300 nm. In one preferred embodiment, the particle size distribution is monodisperse (eg, a polydispersity index of 0.15 or less, more preferably 0.1 or less. The lower limit is not particularly limited (which is naturally 0 or more). For example, 0.03).
本発明の中空ナノ微粒子は、その表面を、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)−ポリカルボン酸ブロック共重合体でコーティングされていてもよい。コーティングにより、中空ナノ微粒子の生体適合性が向上する。
ＰＥＧ−ポリカルボン酸ブロック共重合体の例としては、ＰＥＧ−ポリアクリル酸(ＰＡＡ)共重合体、ＰＥＧ−ポリメタクリル酸(ＰＭＡ)共重合体、ＰＥＧ−ポリグリコール酸(ＰＡＧ)共重合体、ＰＥＧ−ポリアスパラギン酸が挙げられる。
The surface of the hollow nanoparticle of the present invention may be coated with a polyethylene glycol (PEG) -polycarboxylic acid block copolymer. The coating improves the biocompatibility of the hollow nanoparticle.
Examples of PEG-polycarboxylic acid block copolymers include PEG-polyacrylic acid (PAA) copolymer, PEG-polymethacrylic acid (PMA) copolymer, PEG-polyglycolic acid (PAG) copolymer, PEG-polyaspartic acid.
本発明の中空ナノ微粒子は、水性媒体、特に医薬的に許容され得る水性媒体(例えば、水、生理食塩水、緩衝化生理食塩水)に分散させた水性分散液として提供され得る。１つの好ましい実施形態において、水性分散液中の本発明の中空ナノ微粒子の粒径分布は単分散である。 The hollow nanoparticle of the present invention can be provided as an aqueous dispersion dispersed in an aqueous medium, particularly a pharmaceutically acceptable aqueous medium (for example, water, physiological saline, buffered physiological saline). In one preferred embodiment, the particle size distribution of the hollow nanoparticles of the present invention in the aqueous dispersion is monodispersed.
本発明の中空ナノ微粒子は、好適には、繰り返し単位が−ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2Ｎ＜であり、末端基が親水性基である３.０〜４.０世代(好ましくは３.５世代)のポリアミドアミンデンドロンのヘッド部とポリ-Ｌ-リシン(重合度は６０〜１２０、より好ましくは７０〜１１０である)のテイル部とを有するヘッド-テイル型ブロック共重合体の１００/０〜５０/５０の水/メタノール混合溶媒の溶液に、該溶液の水/メタノールが３０/７０〜０/１００(より好ましくは２０/８０〜０/１００、より好ましくは２０/８０〜１０/９０)となるようにメタノールを滴下して形成される自己組織体において、ポリ-Ｌ-リシン(の側鎖アミノ基)にチオール含有リンカー(特に、２-イミノチオランに由来するもの)を導入し、酸化条件下でチオール基含有リンカー間にジスルフィド結合を生成させてテイル部をジスルフィド架橋して得られた中空ナノ微粒子である。 The hollow nanoparticle of the present invention preferably has a repeating unit of —CH 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2 N <, and a 3.0 to 4.0 generation (preferably 3. 5th generation) polyamidoamine dendron head portion and poly-L-lysine (degree of polymerization of 60 to 120, more preferably 70 to 110) tail portion. In a solution of 0-50 / 50 water / methanol mixed solvent, water / methanol of the solution is 30 / 70-0 / 100 (more preferably 20 / 80-0 / 100, more preferably 20 / 80-10 / 90) In a self-organized body formed by dropping methanol so as to obtain a thiol-containing linker (especially one derived from 2-iminothiolane) into poly-L-lysine (side chain amino group thereof), Contains thiol groups under oxidizing conditions By generating a disulfide bond that is hollow nanoparticles obtained tail portion by a disulfide bridge between the anchor.
＜中空ナノ微粒子の製造方法＞
本発明の中空ナノ微粒子の製造方法は、
ポリアミドアミンデンドロンのヘッド部とポリ-Ｌ-リシンのテイル部とを有するヘッド-テイル型ブロック共重合体を、１００/０〜５０/５０の水/水と混和性のアルコール混合溶媒に溶解させ、
得られる溶液に、水/アルコール比が３０/７０〜０/１００となるまでアルコールを滴下して、該ブロック共重合体を中空ナノ微粒子に自己組織化させ、
得られた自己組織体においてポリ-Ｌ-リシンにチオール基含有リンカーを導入し、
酸化条件下でチオール基含有リンカー間にジスルフィド結合を生成させてテイル部をジスルフィド架橋することを含んでなることを特徴とする。
<Method for producing hollow nanoparticle>
The method for producing the hollow nanoparticle of the present invention,
A head-tail type block copolymer having a polyamidoamine dendron head portion and a poly-L-lysine tail portion is dissolved in a water / water miscible alcohol mixed solvent of 100/0 to 50/50,
Alcohol is dropped into the resulting solution until the water / alcohol ratio is 30/70 to 0/100, and the block copolymer is self-assembled into hollow nanoparticles,
Introducing a thiol group-containing linker into poly-L-lysine in the obtained self-assembly,
A disulfide bond is formed between thiol group-containing linkers under oxidizing conditions, and the tail portion is disulfide-bridged.
ヘッド-テイル型ブロック共重合体は、公知の方法(例えば、Bioconjugate Chem., 17, 3(2006)に記載の方法)に基づいて製造できる。 The head-tail type block copolymer can be produced based on a known method (for example, the method described in Bioconjugate Chem., 17, 3 (2006)).
簡潔には、ヘッド部のポリアミドアミンデンドロンは、例えば、一方のアミノ基を保護したエチレンジアミンに、マイケル付加反応と続くエステルアミド交換反応とからなる１サイクルの反応を所望の世代数と同じ数のサイクル繰り返し、任意に(上記のような)末端基を付加することにより製造することができる。例えば、世代数３.５のポリアミドアミンデンドロンは、マイケル付加反応とエステルアミド交換反応とからなる反応サイクルを３.５サイクル繰り返す。ここで、「３.５サイクル」とは、３サイクルの反応後、マイケル付加反応を行い、エステルアミド交換反応を行わないことを意味する。
繰り返し単位が−ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2Ｎ＜であるポリアミドアミンデンドロンを作製する場合、アクリル酸メチルを用いるマイケル付加反応とエチレンジアミンを用いるエステルアミド交換反応との反応サイクルを用いことができる。
Briefly, the polyamidoamine dendron of the head portion is obtained by, for example, converting one amino group-protected ethylenediamine into one cycle reaction consisting of a Michael addition reaction and a subsequent esteramide exchange reaction, as many as the desired number of cycles. It can be prepared by repeatedly and optionally adding end groups (as described above). For example, a generation 3.5 polyamidoamine dendron repeats a reaction cycle consisting of a Michael addition reaction and an ester amide exchange reaction for 3.5 cycles. Here, “3.5 cycles” means that after 3 cycles of reaction, a Michael addition reaction is performed and no ester amide exchange reaction is performed.
When producing a polyamide amine dendron in which the repeating unit is —CH 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2 N <, a reaction cycle of a Michael addition reaction using methyl acrylate and an ester amide exchange reaction using ethylene diamine can be used.
一方、テイル部(ポリ-Ｌ-リシン)は、例えば、ε-ベンジルオキシカルボニル-Ｌ-リシン無水物の重合反応により製造できる。
ヘッド部とテイル部は、別々に製造した後に結合してもよいし、予め製造したヘッド部に対してテイル部を、又は予め製造したテイル部に対してヘッド部を形成してもよい。
On the other hand, the tail portion (poly-L-lysine) can be produced, for example, by a polymerization reaction of ε-benzyloxycarbonyl-L-lysine anhydride.
The head portion and the tail portion may be combined after being manufactured separately, or the tail portion may be formed with respect to the head portion manufactured in advance, or the head portion may be formed with respect to the tail portion manufactured in advance.
このブロック共重合体は１００/０〜５０/５０の水/水と混和性のアルコール混合溶媒に容易に溶解する。水と混和性のアルコールとしては、好ましくは低級アルコール、より好ましくはＣ1〜Ｃ4アルコール、最も好ましくはメタノールである。 This block copolymer is easily dissolved in 100/0 to 50/50 water / water miscible alcohol mixed solvent. The water-miscible alcohols, preferably lower alcohols, more preferably C 1 -C 4 alcohol, most preferably methanol.
得られる溶液に、該溶液中の水/水と混和性のアルコール比３０/７０〜０/１００(好ましくは２０/８０〜０/１００、より好ましくは２０/８０〜１０/９０)までアルコールを滴下すると、ブロック共重合体が単分散の自己組織体(中空ナノ微粒子)を形成する。 Alcohol is added to the resulting solution up to a water / water miscible alcohol ratio of 30/70 to 0/100 (preferably 20/80 to 0/100, more preferably 20/80 to 10/90). When dropped, the block copolymer forms a monodispersed self-organized body (hollow nanoparticle).
この時点(ジスルフィド架橋処理前)の自己組織体は、水中又は高水/低アルコール混合溶媒中に移すとベシクル構造が崩壊し、ブロック共重合体は溶解する。
得られる自己組織体をジスルフィド架橋処理すると、自己組織体は、水中でもベシクル構造が維持されるようになる。
When the self-assembled body at this point (before disulfide crosslinking treatment) is transferred into water or a mixed solvent of high water / low alcohol, the vesicle structure is destroyed and the block copolymer is dissolved.
When the obtained self-organized body is subjected to a disulfide crosslinking treatment, the self-organized body maintains a vesicle structure even in water.
チオール含有リンカー-Ｌ-ＳＨ(式中：Ｌは上記Ｌ1及びＬ2について定義と同じ)は、第一級アミノ基と反応性であるチオール化剤を用いてポリ-Ｌ-リシンの側鎖アミノ基(εアミノ基)に導入することができる。第一級アミノ基と反応性であるチオール化剤は、例えば、２-イミノチオラン、そのＣ1〜4アルキル置換誘導体(Goff, D. A.及びCarroll, S. F., BioConjugate Chem., 1: 381-386 (1990))及びそれらの塩(好ましくは塩酸塩)、Ｎ-アセチルホモシステインチオラクトン(ＮＡＨＣＴ)、Ｎ-スクシンイミジルＳ-アセチルチオアセテート(ＳＡＴＡ)、スクシンイミジル３-(２-ピリジルジチオ)プロピオネート(ＳＰＤＰ)及びその誘導体(例えば、ＬＣ-ＳＰＤＰ(スクシンイミジル６-(３-[２-ピリジルジチオ]プロピオンアミド)ヘキサノエート)、スルホ-ＬＣ-ＳＰＤＰ、(ＰＥＧ)4又ハ12-ＳＰＤＰ)、４-スクシンイミジルオキシカルボニル-メチル(２-ピリジルジチオ)トルエン(ＳＭＰＴ)及びその誘導体(例えば、スルホ-ＬＣ-ＳＭＰＴ)、３,３'-ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)(ＤＴＳＳＰ)、ジメチル３,３'-ジチオビスプロピオンイミデート(ＤＴＢＰ)である。
２-イミノチオラン、その誘導体及びそれらの塩並びにＮＡＨＣＴは、一段階での(ジスルフィド基のチオール基への還元工程を経ることなく)チオール基の導入が可能であるので好ましい。
Thiol-containing linker-L-SH (wherein L is as defined above for L 1 and L 2 ) is a side chain of poly-L-lysine using a thiolating agent that is reactive with primary amino groups It can be introduced into an amino group (ε amino group). Thiol agents that are reactive with the primary amino group is, for example, 2-iminothiolane, the C 1 ~ 4 alkyl-substituted derivatives (Goff, DA and Carroll, SF, BioConjugate Chem, 1 :. 381-386 (1990) ) And their salts (preferably hydrochloride), N-acetylhomocysteine thiolactone (NAHCT), N-succinimidyl S-acetylthioacetate (SATA), succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP) and its Derivatives (eg, LC-SPDP (succinimidyl 6- (3- [2-pyridyldithio] propionamido) hexanoate), sulfo-LC-SPDP, (PEG) 4 or C 1 2 -SPDP), 4-succinimidyl Oxycarbonyl-methyl (2-pyridyldithio) toluene (SMPT) and its derivatives (eg sulfo-LC-SMPT), 3,3′-dithiobis (sulfosuccinimidylpropylene Sulfonate) (DTSSP), dimethyl 3,3'-dithio-bis propionimidate (DTBP).
2-Iminothiolane, its derivatives and their salts, and NAHCT are preferable because thiol groups can be introduced in one step (without going through a reduction step of disulfide groups to thiol groups).
チオール化剤は、自己組織体の分散媒体と同じ水/水と混和性のアルコール混合溶媒に溶解させて添加する。
チオール化剤の添加量は、ヘッド-テイル型共重合体のポリ-Ｌ-リシン中の側鎖アミノ基に対して例えば０.０１〜１０当量、好ましくは０.０５〜２当量、より好ましくは０.１〜１等量である。全量を１回で添加してもよいし、２回又はそれ以上に分けて添加してもよい。
チオール化剤として、ジスルフィド基-Ｓ-Ｓ-を含有するものを使用する場合、還元剤(例えば、ＤＴＴ)を用いてジスルフィド基-Ｓ-Ｓ-をチオール基-ＳＨに還元する。
その後、酸化条件下(例えば酸素バブリング下)で、チオール基間にジスルフィド結合を形成させる。
The thiolating agent is added after being dissolved in the same water / water miscible alcohol mixed solvent as the dispersion medium of the self-organized body.
The amount of the thiolating agent added is, for example, 0.01 to 10 equivalents, preferably 0.05 to 2 equivalents, more preferably the side chain amino group in the poly-L-lysine of the head-tail type copolymer. 0.1 to 1 equivalent. The whole amount may be added at once, or may be added in two or more portions.
When using a thiolating agent containing a disulfide group —S—S—, the disulfide group —S—S— is reduced to a thiol group —SH using a reducing agent (eg, DTT).
Thereafter, disulfide bonds are formed between thiol groups under oxidizing conditions (eg, under oxygen bubbling).
本発明の方法によれば、ポリ-Ｌ-リシン間がジスルフィド架橋され水中で安定な中空ナノ微粒子が、従来の分粒処理を要することなく、狭い単分散で取得することができる。
なお、適切な場合には、公知の方法(例えばフィルタリングや超音波処理)により更に分粒してもよい。
According to the method of the present invention, hollow nano-particles that are disulfide-crosslinked between poly-L-lysine and stable in water can be obtained with a narrow monodispersion without requiring conventional sizing treatment.
If appropriate, the particles may be further sized by a known method (for example, filtering or ultrasonic treatment).
実施例１：ポリアミドアミン(ＰＡＭＡＭ)デンドロンのヘッド部とポリ-Ｌ-リシン(ＰＬＬ)のテイル部とを有するヘッド-テイル型ブロック共重合体から形成されるベシクルへのジスルフィド架橋導入による中空ナノ微粒子の調製
Haradaら(Bioconjugate Chem., 17, 3(2006))に記載される方法に従って、次式(２)で示されるヘッド-テイル型共重合体(ＰＡＭＡＭデンドロン世代数は３.５、ＰＬＬ数平均重合度は１０１) ５.０ｍｇに蒸留水５００μｌを加えて溶解させた後、更にメタノール５００μｌを加えた。
Example 1: Hollow nano-particles by introducing disulfide bridges into vesicles formed from a head-tail block copolymer having a polyamidoamine (PAMAM) dendron head and a poly-L-lysine (PLL) tail Preparation of
According to the method described in Harada et al. (Bioconjugate Chem., 17, 3 (2006)), the head-tail type copolymer represented by the following formula (2) (PAMAM dendron generation number is 3.5, PLL number average polymerization) The degree was 101) 500 mg of distilled water was added to 5.0 mg and dissolved, and then 500 μl of methanol was further added.
続いて、攪拌しながら、メタノール１５００μｌを１５分かけて滴下し、溶媒組成を体積分率にして水：メタノール＝２：８にまで変化させ、該溶媒中で該ヘッド-テイル型共重合体のベシクルを形成させた。その後、再び５分間超音波を照射し、十分時間静置して粒径を安定させた後、形成されたベシクルの粒径を動的光散乱(ＤＬＳ)測定(レーザーゼータ電位計ELS-8000F、大塚電子株式会社製；２０℃)により確認した(図１)。Ｚ−平均粒径が１７４.９ｎｍの単分散なベシクルが形成されていることが確認された。 Subsequently, with stirring, 1500 μl of methanol was dropped over 15 minutes, the solvent composition was changed to a volume fraction of water: methanol = 2: 8, and the head-tail copolymer was mixed in the solvent. Vesicles were formed. Then, after irradiating the ultrasonic wave again for 5 minutes and allowing to stand for a sufficient time to stabilize the particle size, the particle size of the formed vesicle was measured by dynamic light scattering (DLS) (laser zeta electrometer ELS-8000F, This was confirmed by Otsuka Electronics Co., Ltd. (20 ° C.) (FIG. 1). It was confirmed that monodisperse vesicles having a Z-average particle diameter of 174.9 nm were formed.
この溶液２.５ｍｌに、ＰＡＭＡＭデンドロン-ＰＬＬのリシン残基数(εアミノ基数)に対して０.１等量の２-イミノチオラン塩酸塩を滴下した。撹拌後、１日静置し、その後酸素バブリングを行った。更に２-イミノチオラン塩酸塩を合計０.２５当量となるように添加した。１日間の静置後、酸素バブリングを行った。
こうして、ＰＬＬ中の第一級アミンにチオール基を導入して、ＰＬＬ間にジスルフィド結合を生成させた。この反応のスキームを下記に示す。
To 2.5 ml of this solution, 0.1 equivalent of 2-iminothiolane hydrochloride was added dropwise to the number of lysine residues (ε amino groups) of PAMAM dendron-PLL. After stirring, the mixture was allowed to stand for 1 day, and then oxygen bubbling was performed. Further, 2-iminothiolane hydrochloride was added to a total of 0.25 equivalents. After standing for 1 day, oxygen bubbling was performed.
In this way, a thiol group was introduced into the primary amine in the PLL to generate a disulfide bond between the PLLs. The scheme of this reaction is shown below.
外相５００ｍｌの蒸留水に対して透析を行うことにより溶媒を水へと置換した。得られたジスルフィド架橋ベシクルの水中での形態を透過型電子顕微鏡(ＴＥＭ)観察(JEM-2000FEXII、日本電子株式会社製)により、粒径分布を上記と同様なＤＬＳ測定により確認した。得られたＴＥＭ写真を図２に、粒径分布を図３に示す。 The solvent was replaced with water by dialysis against 500 ml of distilled water in the outer phase. The morphology of the obtained disulfide crosslinked vesicles in water was confirmed by DLS measurement similar to the above by observation with a transmission electron microscope (TEM) (JEM-2000FEXII, manufactured by JEOL Ltd.). The obtained TEM photograph is shown in FIG. 2, and the particle size distribution is shown in FIG.
ＴＥＭ観察により、中空ベシクル構造を有する粒径約２８０ｎｍの球状粒子が確認された。このことから、ＰＡＭＡＭデンドロン-ＰＬＬブロック共重合体の自己組織化ベシクルが、ＰＬＬ間のジスルフィド架橋により、水中で安定化されることが理解できる。また、観察された粒径は、下記に示すＤＬＳ測定による粒径分布とよい一致を示した。 By TEM observation, spherical particles having a hollow vesicle structure and a particle size of about 280 nm were confirmed. From this, it can be understood that the self-assembled vesicle of the PAMAM dendron-PLL block copolymer is stabilized in water by the disulfide bridge between the PLLs. Moreover, the observed particle size showed good agreement with the particle size distribution by DLS measurement shown below.
ＤＬＳ測定により、Ｚ−平均粒径が２３８.４ｎｍの単分散な微粒子の存在が観察された。すなわち、ＤＬＳ測定によっても、ジスルフィド架橋によりベシクル構造が安定化され、水系溶媒中で安定に存在していることが確認された。また、架橋前のベシクルの水/メタノール混合溶媒中での粒径と比較すると、ジスルフィド架橋ベシクルの水中での粒径は６０ｎｍ程度大きい。この粒径増大は、ＰＬＬの第一級アミンが水中でプロトン化して正電位を帯びる結果、ＰＬＬ間の静電反発により粒径が増大したものと考えられる。 The presence of monodispersed fine particles having a Z-average particle diameter of 238.4 nm was observed by DLS measurement. That is, DLS measurement also confirmed that the vesicle structure was stabilized by disulfide crosslinking and existed stably in an aqueous solvent. In addition, the particle size in water of the disulfide crosslinked vesicle is about 60 nm larger than the particle size in the water / methanol mixed solvent of the vesicle before crosslinking. This increase in particle size is considered to be due to the electrostatic primary repulsion between PLLs resulting in an increase in particle size as a result of the primary amine of PLL being protonated in water and having a positive potential.
この溶液を凍結乾燥後、水で再構成させたところ、水中での中空ナノ微粒子の再分散が観察され、中空ナノ微粒子は凍結乾燥が可能であることが確認された。
よって、本発明の中空ナノ微粒子は、凍結乾燥による長期保存が可能であることが理解される。
When this solution was freeze-dried and then reconstituted with water, re-dispersion of the hollow nanoparticle in water was observed, and it was confirmed that the hollow nanoparticle could be freeze-dried.
Therefore, it is understood that the hollow nanoparticle of the present invention can be stored for a long time by freeze-drying.
＜チオール含有リンカーの導入率＞
次に、ジスルフィド架橋中空ナノ微粒子を凍結乾燥により回収し、1Ｈ ＮＭＲによってチオール基含有リンカーの反応率を算出した。
回収したジスルフィド架橋中空ナノ微粒子を少量のＤＣｌを加えたＤ2Ｏに溶解して、1Ｈ ＮＭＲスペクトルを測定した。得られたスペクトルを図４に示す。
<Introduction rate of thiol-containing linker>
Next, disulfide-bridged hollow nanoparticles were collected by freeze-drying, and the reaction rate of the thiol group-containing linker was calculated by 1 H NMR.
The recovered disulfide-bridged hollow nanoparticles were dissolved in D 2 O to which a small amount of DCl was added, and 1 H NMR spectrum was measured. The obtained spectrum is shown in FIG.
架橋構造導入によって生成したジスルフィド結合に隣接するメチレンに由来する２.６ｐｐｍのピーク(ｘ)、ジスルフィド結合に対してβ位のメチレンに由来する２.１ｐｐｍのピーク(ｖ)、γ位のメチレンに由来する３.３ｐｐｍのピーク(ｗ)の積分値から、架橋剤はＰＬＬの側鎖の一級アミンの２２％と反応していると求められた。 2.6 ppm peak (x) derived from methylene adjacent to the disulfide bond formed by the introduction of the cross-linked structure, 2.1 ppm peak (v) derived from methylene at the β position relative to the disulfide bond, methylene at the γ position From the integral value of the derived 3.3 ppm peak (w), it was determined that the crosslinking agent had reacted with 22% of the primary amine on the side chain of the PLL.
＜チオール含有リンカーによるジスルフィド架橋の形成率＞
残存するチオール基を比色分析法であるＥｌｌｍａｎ法で定量した。Ｅｌｌｍａｎ法によれば、チオール基が存在すれば、５,５'-ジチオビス(２-ニトロ安息香酸)(ＤＴＮＢ)と反応して、５-メルカプト-２-ニトロベンゾ安息香酸が生成されるので、その極大吸収波長である４１２ｎｍに吸光が観察される。
上記で得られたジスルフィド架橋中空ナノ微粒子の水溶液１００μｌに脱気した超純水を加え、全量３ｍｌにした。この溶液に、脱気した０.１Ｍのリン酸緩衝液(ｐＨ８.０)を６ｍｌ加え、更に脱気０.１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ８.０)中０.４ｍｇ/ｍｌのＤＴＮＢ溶液１ｍｌを加え、１５分間遮光して静置した。静置後、JASCO V-550 UV/vis spectrophotometerを用いてＵＶ測定を行った。
その結果、４１２ｎｍに極大吸収は観察されなかった。このことは、上記で得られたジスルフィド架橋中空ナノ微粒子中にチオール基が残存していないことを示す。すなわち、導入されたチオール基がほとんど全てジスルフィド結合の形成に使用されたことを示唆している。
<Disulfide bridge formation rate by thiol-containing linker>
The remaining thiol groups were quantified by the Ellman method, which is a colorimetric analysis method. According to the Ellman method, if a thiol group is present, it reacts with 5,5′-dithiobis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB) to produce 5-mercapto-2-nitrobenzobenzoic acid. Absorption is observed at 412 nm which is the maximum absorption wavelength.
Deaerated ultrapure water was added to 100 μl of the aqueous solution of the disulfide-bridged hollow nanoparticle obtained above to make a total volume of 3 ml. To this solution was added 6 ml of degassed 0.1 M phosphate buffer (pH 8.0), and 1 ml of 0.4 mg / ml DTNB solution in degassed 0.1 M phosphate buffer (pH 8.0) was further added. In addition, it was allowed to stand for 15 minutes with light shielding. After standing, UV measurement was performed using JASCO V-550 UV / vis spectrophotometer.
As a result, no maximum absorption was observed at 412 nm. This indicates that no thiol group remains in the disulfide-bridged hollow nanoparticle obtained above. That is, it is suggested that almost all of the introduced thiol groups were used for the formation of disulfide bonds.
実施例２：中空ナノ微粒子の平均粒径へのｐＨの影響
実施例１で調製された中空ナノ微粒子溶液について、０.１Ｎ塩酸及び０.１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨを変化させることにより、種々ｐＨ条件下での中空ナノカプセルのＺ−平均粒径を上記と同様なＤＬＳ測定により評価した。
図５に中空ナノ微粒子の平均粒径のｐＨ依存性を示す。
ｐＨ１０程度の高ｐＨ条件下では収縮し、粒径は、ジスルフィド架橋導入前の自己組織化ベシクルの粒径と同程度になる。
一方、低ｐＨ条件下では、膨潤して粒径が増大する。これは、ｐＨの低下に伴い、第一級、第二級、第三級アミノ基が順次プロトン化し、その結果中空ナノ微粒子が正電荷を帯びるため、ベシクル膜内のイオン浸透圧が増加し静電反発が引き起こされることによると考えられる。
まとめると、本発明の中空ナノ微粒子は、高ｐＨ環境下では凝集を引き起こすが、酸性〜弱アルカリ条件(ｐＨ４〜１０)下では単分散性を維持した状態で存在することが確認された。
Example 2: Effect of pH on the average particle size of hollow nanoparticles By changing the pH of the hollow nanoparticle solution prepared in Example 1 using 0.1 N hydrochloric acid and 0.1 M aqueous sodium hydroxide solution The Z-average particle size of the hollow nanocapsules under various pH conditions was evaluated by DLS measurement similar to the above.
FIG. 5 shows the pH dependence of the average particle size of the hollow nanoparticle.
Shrinkage occurs under a high pH condition of about pH 10, and the particle size is approximately the same as the particle size of the self-assembled vesicle before the introduction of disulfide bridges.
On the other hand, under low pH conditions, it swells and the particle size increases. This is because the primary, secondary, and tertiary amino groups are sequentially protonated as the pH is lowered, and as a result, the hollow nanoparticle is positively charged, so that the ion osmotic pressure in the vesicle membrane is increased and the static pressure is increased. This is thought to be due to an electric repulsion.
In summary, it was confirmed that the hollow nanoparticle of the present invention causes aggregation under a high pH environment, but exists in a state of maintaining monodispersity under acidic to weak alkaline conditions (pH 4 to 10).
実施例３：中空ナノ微粒子の還元環境応答性
＜散乱光強度測定による評価＞
不可逆的架橋型中空ナノ微粒子の及びジスルフィド架橋型中空ナノ微粒子それぞれの水溶液５００μｌに、グルタチオン濃度が０、１、５、１０、１００、５００μＭ、１、５ｍＭとなるように蒸留水又はグルタチオン水溶液を加えて全量を２ｍｌとした。不可逆的架橋型中空ナノ微粒子は、架橋剤としてエチレングリコールジグリシジルエーテル(ＥＧ１)を用いて、特開２００９−２６９９９８号公報に記載の方法に従って製造した。
蒸留水又はグルタチオン水溶液の添加前、及び添加後０.５、１、２、４、８、２４、４８時間に散乱光強度を測定した(日本分光製分光蛍光光度計FP-6500)。
測定結果を図６に示す。ＥＧ１架橋中空ナノ微粒子については、低濃度、いずれの濃度のグルタチオン存在下においても散乱光強度の変化はほとんど観測されなかった。これは、還元条件下で、中空ベシクル形態が維持されることを示唆する。
Example 3: Reduction environment response of hollow nanoparticle <Evaluation by measuring scattered light intensity>
Distilled water or aqueous glutathione solution is added to 500 μl of each of the irreversible crosslinked hollow nanoparticle and disulfide crosslinked hollow nanoparticle so that the glutathione concentration is 0, 1, 5, 10, 100, 500 μM, and 1 5 mM. The total volume was 2 ml. Irreversible cross-linked hollow nano-particles were produced according to the method described in JP 2009-269998 A using ethylene glycol diglycidyl ether (EG1) as a cross-linking agent.
The scattered light intensity was measured before addition of distilled water or aqueous glutathione solution and 0.5, 1, 2, 4, 8, 24, and 48 hours after the addition (Spectrofluorimeter FP-6500 manufactured by JASCO Corporation).
The measurement results are shown in FIG. For the EG1-crosslinked hollow nanoparticle, almost no change in the intensity of scattered light was observed even in the presence of low concentrations of glutathione at any concentration. This suggests that the hollow vesicle morphology is maintained under reducing conditions.
一方、ジスルフィド架橋中空ナノ微粒子については、グルタチオンの非存在下(すなわち、還元剤を含有しない水中)及び１、５μＭのグルタチオンの存在下では、散乱光強度の劇的な減少は見られなかった。グルタチオン１０、１００μＭの存在下では、添加の３０分後までは散乱光強度は劇的に減少したが、その後更に劇的に減少することはかった。グルタチオン５００μＭの存在下では、散乱光強度は１０、１００μＭの存在下と比較して顕著に低下したが、その後更なる劇的な減少が観察されないという挙動は似通っていた。
対照的に、グルタチオンを１、５ｍＭの存在下では添加後３０分間までは、散乱光強度の劇的な減少が観察され、４時間後までには値が３００ｃｐｓ程度になった。ＰＡＭＡＭデンドロン−ＰＬＬを水中に分散させたとき、散乱光強度は２００ｃｐｓ程度である。
これのデータより、本発明のジスルフィド架橋中空ナノ微粒子は、１ｍＭ、５ｍＭのグルタチオン存在下では、ジスルフィド結合がチオール基に還元され、自己組織化ベシクルが解離することが示唆される。一方、１、５μＭの低濃度グルタチオン存在下では、ジスルフィド結合の還元が起こらず、自己組織化ベシクルの形態が維持されることが示唆される。１０、１００、５００μＭのグルタチオン存在下では、散乱光強度の減少は観測されたが、ベシクルは完全には解離しない。
On the other hand, for disulfide-bridged hollow nanoparticles, no dramatic decrease in scattered light intensity was observed in the absence of glutathione (ie, in water containing no reducing agent) and in the presence of 1,5 μM glutathione. In the presence of glutathione 10, 100 μM, the scattered light intensity decreased dramatically until 30 minutes after addition, but did not decrease more dramatically thereafter. In the presence of 500 μM glutathione, the scattered light intensity was significantly reduced compared to the presence of 10,100 μM, but the behavior was not similar after that no further dramatic decrease was observed.
In contrast, in the presence of 1,5 mM glutathione, a dramatic decrease in scattered light intensity was observed up to 30 minutes after addition, and the value reached about 300 cps by 4 hours. When PAMAM Dendron-PLL is dispersed in water, the scattered light intensity is about 200 cps.
These data suggest that in the presence of 1 mM and 5 mM glutathione, the disulfide-bridged hollow nanoparticle of the present invention reduces the disulfide bond to a thiol group and dissociates the self-assembled vesicle. On the other hand, in the presence of glutathione at a low concentration of 1,5 μM, disulfide bond reduction does not occur, suggesting that the form of self-assembled vesicles is maintained. In the presence of 10, 100, and 500 μM glutathione, a decrease in scattered light intensity was observed, but the vesicles were not completely dissociated.
ＤＴＴ濃度が１、５、１０、１００、５００μＭの存在下についても同様な測定を行った。
結果を図７に示す。グルタチオンとＤＴＴの還元能の違いによる濃度のずれはみられるが、高濃度のＤＴＴ存在下では、高濃度のグルタチオン存在下と同様に、ジスルフィド架橋中空ナノ微粒子が解離することが示唆される。一方、１μＭ程度の低濃度のＤＴＴ存在下では、ジスルフィド架橋中空ナノ微粒子は、形態が維持されることも示唆される。
Similar measurements were performed in the presence of DTT concentrations of 1, 5, 10, 100, and 500 μM.
The results are shown in FIG. Although there is a concentration shift due to the difference in reducing ability between glutathione and DTT, it is suggested that disulfide-bridged hollow nanoparticles are dissociated in the presence of a high concentration of DTT, as in the presence of a high concentration of glutathione. On the other hand, it is also suggested that in the presence of DTT at a low concentration of about 1 μM, the morphology of the disulfide-bridged hollow nanoparticle is maintained.
実施例４：ジスルフィド架橋中空ナノ微粒子及び不可逆的架橋型の中空ナノ微粒子の細胞内動態
実施例１に記載のように、水/メタノールの混合溶媒中で自己組織体(ベシクル)を作製した。この自己組織体溶液(２ｍｌ)にローダミン６Ｇ溶液(溶媒：水/メタノール＝２/８、１.０ｍｇ/ｍｌ）を１０μｌ加え、１日静置した。
ジスルフィド架橋中空ナノ微粒子の作製のためには、得られた溶液に、ＰＡＭＡＭデンドロン-ＰＬＬのリシン残基数に対して０.２５当量の２-イミノチオラン塩酸塩を滴下し、１日間の静置後、酸素バブリングを行った。
不可逆的架橋型の中空ナノ微粒子の作製のためには、上記で得られた溶液に、ＰＡＭＡＭデンドロン-ＰＬＬのリシン残基数に対してエポキシ基が２０当量のＥＧ１を滴下し撹拌した。
次いで、得られた両溶液に、ＰＡＭＡＭデンドロン-ＰＬＬのＰＬＬ側鎖の第一級アミンに対して１５当量のＮＨＳ-フルオレセインを加えた。その後、外相５００ｍｌの蒸留水に対して３日間透析して溶媒を水へと置換すると共に、過剰なＮＨＳ-フルオレセインと内包されていないローダミン６Ｇを除去した。
Example 4: Intracellular dynamics of disulfide crosslinked hollow nanoparticles and irreversibly crosslinked hollow nanoparticles As described in Example 1, self-organized bodies (vesicles) were prepared in a mixed solvent of water / methanol. To this self-organized body solution (2 ml), 10 μl of rhodamine 6G solution (solvent: water / methanol = 2/8, 1.0 mg / ml) was added and allowed to stand for 1 day.
In order to prepare disulfide-bridged hollow nanoparticles, 0.25 equivalent of 2-iminothiolane hydrochloride with respect to the number of lysine residues in PAMAM dendron-PLL was added dropwise to the resulting solution, and after standing for 1 day. Oxygen bubbling was performed.
In order to produce irreversible cross-linked hollow nano-particles, EG1 having 20 equivalents of epoxy groups to the number of lysine residues in PAMAM dendron-PLL was added dropwise to the solution obtained above and stirred.
Then, to both solutions obtained, 15 equivalents of NHS-fluorescein was added to the primary amine of the PLL side chain of PAMAM dendron-PLL. Thereafter, the mixture was dialyzed against 500 ml of distilled water of the outer phase for 3 days to replace the solvent with water, and excess NHS-fluorescein and unencapsulated rhodamine 6G were removed.
松並ボトムディッシュにＨｅＬａ細胞２×１０5を撒き、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地１.５ｍｌ中３７℃で２４時間培養し、０.３６ｍＭ ＣａＣｌ2と０.４２ｍＭ ＭｇＣｌ2を含むＰＢＳ(ＰＢＳ＋)で３回洗浄した。
得られた細胞に、上記で作製したローダミン６Ｇを内包するジスルフィド架橋中空ナノ微粒子の溶液を血清含有ＤＭＥＭ培地で１００倍希釈したもの３６０μｌ加え、更に培地を加えて全量１.５ｍｌとして４時間培養後、ＰＢＳ＋で２回洗浄した。
共焦点顕微鏡により細胞内でのローダミン６Ｇ及びフルオレセインの分布を観察した。
2 × 10 5 HeLa cells were seeded on a Matsunami bottom dish, cultured in 1.5 ml of DMEM medium containing 10% FCS for 24 hours at 37 ° C., and then washed with PBS containing 0.36 mM CaCl 2 and 0.42 mM MgCl 2 (PBS +). Washed twice.
To the obtained cells, 360 μl of the solution of disulfide-bridged hollow nanoparticle encapsulating Rhodamine 6G prepared above diluted 100-fold with serum-containing DMEM medium was added, and the medium was further added to a total volume of 1.5 ml and cultured for 4 hours. Washed twice with PBS +.
The distribution of rhodamine 6G and fluorescein in the cells was observed with a confocal microscope.
図８に観察結果を示す。(Ａ)は、不可逆的架橋型の中空ナノ微粒子とインキュベートした細胞から得られた共焦点顕微鏡写真である。(Ｂ)は、ジスルフィド架橋型の中空ナノ微粒子とインキュベートした細胞から得られた共焦点顕微鏡写真である。いずれにも、ローダミン６Ｇに由来する赤色蛍光及びフルオレセインに由来する緑色蛍光が観察される。
それぞれについて２つの画像を重ねると、不可逆的架橋型の中空ナノ微粒子とインキュベートした細胞では、黄色蛍光のみが観察される。これは、同じ位置から緑色蛍光及び赤色蛍光が発せられていることを示し、ローダミン６Ｇ及びフルオレセインが同位置に局在していることを意味する。すなわち、不可逆的架橋型の中空ナノ微粒子からは、ローダミン６Ｇが放出されないことが示唆される。
FIG. 8 shows the observation results. (A) is a confocal micrograph obtained from cells incubated with irreversible cross-linked hollow nanoparticles. (B) is a confocal micrograph obtained from cells incubated with disulfide-bridged hollow nanoparticles. In both cases, red fluorescence derived from rhodamine 6G and green fluorescence derived from fluorescein are observed.
When two images are superimposed on each other, only yellow fluorescence is observed in cells incubated with irreversibly crosslinked hollow nanoparticles. This indicates that green fluorescence and red fluorescence are emitted from the same position, which means that rhodamine 6G and fluorescein are localized at the same position. That is, it is suggested that rhodamine 6G is not released from the irreversible crosslinked hollow nanoparticle.
一方、ジスルフィド架橋型の中空ナノ微粒子とインキュベートした細胞では、黄色蛍光と共に赤色蛍光も観察される。これは、赤色蛍光を発する物質が緑色蛍光を発する物質とは離れて位置していることを示す。すなわち、ジスルフィド架橋型の中空ナノ微粒子から、ローダミン６Ｇが放出されることが示唆される。
本実施例の結果を、動物細胞内には高濃度のグルタチオンが存在すること及び実施例３の結果と考え合わせれば、本発明のジスルフィド架橋中空ナノ微粒子は、(還元剤を含有しない)水中及び低濃度の還元剤の存在下で安定であり、動物細胞内のような高濃度の還元剤の存在下で不安定化し、このため内包する物質を放出することができる。よって、本発明のジスルフィド架橋中空ナノ微粒子は、目的物質(例えば、遺伝子や薬物などの治療剤)を細胞内に送達することに極めて有用であることが理解される。
On the other hand, red fluorescence as well as yellow fluorescence is observed in cells incubated with disulfide-bridged hollow nanoparticles. This indicates that the substance emitting red fluorescence is located away from the substance emitting green fluorescence. That is, it is suggested that rhodamine 6G is released from the disulfide-bridged hollow nanoparticle.
Considering the result of this example together with the presence of a high concentration of glutathione in animal cells and the result of Example 3, the disulfide-bridged hollow nanoparticle of the present invention can be used in water (containing no reducing agent) and in water. It is stable in the presence of a low concentration of reducing agent and can be destabilized in the presence of a high concentration of reducing agent, such as in animal cells, thus releasing the encapsulated material. Therefore, it is understood that the disulfide-bridged hollow nanoparticle of the present invention is extremely useful for delivering a target substance (for example, a therapeutic agent such as a gene or a drug) into cells.
Claims (8)
得られる溶液に、水/アルコール比が３０/７０〜０/１００となるまでアルコールを滴下して、該ブロック共重合体を中空ナノ微粒子に自己組織化させ、
得られた自己組織体においてポリ-Ｌ-リシンにチオール基含有リンカーを導入し、
酸化条件下でチオール基含有リンカー間にジスルフィド結合を生成させてテイル部をジスルフィド架橋すること
を含んでなる、水中で安定な中空ナノ微粒子の製造方法。 A head-tail type block copolymer having a polyamidoamine dendron head portion and a poly-L-lysine tail portion is dissolved in a water / water miscible alcohol mixed solvent of 100/0 to 50/50,
Alcohol is dropped into the resulting solution until the water / alcohol ratio is 30/70 to 0/100, and the block copolymer is self-assembled into hollow nanoparticles,
Introducing a thiol group-containing linker into poly-L-lysine in the obtained self-assembly,
A method for producing hollow nanoparticle that is stable in water, comprising forming a disulfide bond between thiol group-containing linkers under oxidizing conditions to disulfide bridge the tail portion.
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