[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

JP2011527568A - 補体アンタゴニストおよびその使用 - Google Patents

補体アンタゴニストおよびその使用 Download PDF

Info

Publication number
JP2011527568A
JP2011527568A JP2011517368A JP2011517368A JP2011527568A JP 2011527568 A JP2011527568 A JP 2011527568A JP 2011517368 A JP2011517368 A JP 2011517368A JP 2011517368 A JP2011517368 A JP 2011517368A JP 2011527568 A JP2011527568 A JP 2011527568A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
oligomer
rna
pat
lna
nucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2011517368A
Other languages
English (en)
Inventor
フランク・バース
キース・フルイター
Original Assignee
アカデミス・ツィーケンフイス・バイ・ドゥ・ウニヴェルシテット・ファン・アムステルダム
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by アカデミス・ツィーケンフイス・バイ・ドゥ・ウニヴェルシテット・ファン・アムステルダム filed Critical アカデミス・ツィーケンフイス・バイ・ドゥ・ウニヴェルシテット・ファン・アムステルダム
Publication of JP2011527568A publication Critical patent/JP2011527568A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/135—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline
    • A61K31/136—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline having the amino group directly attached to the aromatic ring, e.g. benzeneamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/74—Synthetic polymeric materials
    • A61K31/785—Polymers containing nitrogen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/215—IFN-beta
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39591—Stabilisation, fragmentation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/334—Modified C
    • C12N2310/3341—5-Methylcytosine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

哺乳動物の補体、例えば補体成分6(C6)の発現を阻害またはブロックするように設計されたアンタゴニストが開示される。本発明は、哺乳動物で急性または慢性の神経損傷に続く神経再生の強化のための医薬の調製での使用を含む、広範囲の用途を有する。追加の適用には、単独使用または別の薬剤との併用による、多発性硬化症の治療での使用が含まれる。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2008年7月10日に出願の米国特許仮出願第61/079,501号の継続出願である。本出願は、米国特許仮出願第61/079,501号、ならびにそれぞれ2008年7月10日に出願の以下の米国特許仮出願第61/079,554号、第61/079,497号および第61/079,488号の優先権を主張する。米国特許仮出願第61/079,501号、第61/079,554号、第61/079,497号および第61/079,488号の各々の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、例えば補体成分6(C6)の発現を調節するための組成物および方法を特徴とする。一実施形態では、本発明は、そのタンパク質の発現を低減またはブロックするアンタゴニストに関する。本発明は、神経系への急性または慢性の損傷の後に哺乳動物で神経再生を促進するための使用を含む、多種多様の用途を有する。
補体系は、免疫応答の重要な要素であると認識されている約30のタンパク質の群を含む。この系は、古典的(通常抗体依存性)または代替(通常抗体依存性)経路によって活性化することができる。いずれの経路を経た活性化でも、C5コンベルターゼと呼ばれる酵素の生成をもたらす。このコンベルターゼは、他の機能の中でも終末補体経路としばしば呼ばれるものを開始する、C5bと呼ばれるタンパク質の形成を助ける。この経路の目標は、侵入する病原体の膜の中で膜攻撃複合体(MAC)を形成し、それによって溶解を引き起こすことである。MACは、C5bと一緒に補体タンパク質C6、C7、C8および(C9)nを逐次集合させることによって一般に形成される。一般には、Walport, M.J. 2001. N. Engl. J. Med. 344: 1058〜1066頁および1140〜1144頁を参照。
補体系の天然および合成の阻害剤の報告がある。これらには、例えば特定の小分子、タンパク質、抗体、フラバノイドおよび多糖類が含まれる。S. Bureevaら(2005) Drug Discovery Today 10: 1535頁を参照。
神経変性は、多くの急性および慢性の神経障害の特徴である。ウォラー変性(WD)と呼ばれる軸索変性の一様式は、損傷に遠位の軸索部分が死に至る非常に破壊的な過程である。最初の異常は損傷の後数時間という早い時期に見ることができ、1,2日後により可視的WBが明らかとなる(Ballin RHおよびThomas PK (1969) Acta Neuropathol (Berl) 14: 237頁)。例えば、髄鞘は崩壊し、捕食細胞によって呑食される(Leonhardら(2002) Eur. J. Neurosci. 16: 1654頁)。これらの過程には、最終的な神経修復および再生が併う。特定の補体成分がミエリン食作用を媒介するという報告がある(Daileyら(2002) J. Neurosci 18: 6713頁およびLiu (1999) J. Peripher. Nerv. Syst. 4: 123頁)。これらの過程を媒介するためにどの補体成分が必要であるかに関して多少の不確実性があるが、速やかなWDにはMACの形成が必要不可欠であると報告されている(Ramaglia, V.ら(2007) J. Neurosci. 27: 7663頁)。
様々な核酸アンタゴニストが公知である。例えば、様々なアンチセンスオリゴマーが、いくつかの治療的、診断的および研究用途のために有用であることが示されている(例えば、Cheson, BD (2007) Ther Clin Risk Manag. 3(5):855頁(例えばオブリマーセン(oblimersen)の好ましい臨床試験データについて記載)を参照)。RNAアンタゴニストの一つのタイプである短鎖干渉RNA(siRNA)が、有用な治療用および研究用の道具であると提唱されている(McManusおよびSharp、(2002) Nature Reviews Genetics 3: 737頁)。不連続なパッセンジャー鎖とのRNAi誘導サイレンシング複合体などの他のRNAアンタゴニストも、報告されている(Leuschnerら(2006) EMBO Reports 7:314頁)。
例えば哺乳動物の補体成分6(C6)タンパク質の活性をブロックまたは阻害するアンタゴニストを入手することが望ましいであろう。MACの形成に関連することが知られているかまたはそれが疑われる神経障害を予防、治療するかまたはその程度を低減するために用いることができるアンタゴニストを入手することが、さらに望ましいであろう。
米国特許仮出願第61/079,501号 米国特許仮出願第61/079,554号 米国特許仮出願第61/079,497号 米国特許仮出願第61/079,488号 米国特許第7,378,499号 米国特許第3,687,808号 米国特許第4,469,863号 米国特許第4,476,301号 米国特許第5,023,243号 米国特許第5,177,196号 米国特許第5,188,897号 米国特許第5,264,423号 米国特許第5,276,019号 米国特許第5,278,302号 米国特許第5,286,717号 米国特許第5,321,131号 米国特許第5,399,676号 米国特許第5,405,939号 米国特許第5,453,496号 米国特許第5,455,233号 米国特許第5,466,677号 米国特許第5,476,925号 米国特許第5,519,126号 米国特許第5,536,821号 米国特許第5,541,306号 米国特許第5,550,111号 米国特許第5,563,253号 米国特許第5,571,799号 米国特許第5,587,361号 米国特許第5,194,599号 米国特許第5,565,555号 米国特許第5,527,899号 米国特許第5,721,218号 米国特許第5,672,697号 米国特許第7,335,764号 米国特許第5,625,050号 米国特許第5,034,506号 米国特許第5,166,315号 米国特許第5,185,444号 米国特許第5,214,134号 米国特許第5,216,141号 米国特許第5,235,033号 米国特許第5,264,562号 米国特許第5,264,564号 米国特許第5,405,938号 米国特許第5,434,257号 米国特許第5,470,967号 米国特許第5,489,677号 米国特許第5,541,307号 米国特許第5,561,225号 米国特許第5,596,086号 米国特許第5,602,240号 米国特許第5,610,289号 米国特許第5,608,046号 米国特許第5,618,704号 米国特許第5,623,070号 米国特許第5,663,312号 米国特許第5,633,360号 米国特許第5,677,437号 米国特許第5,792,608号 米国特許第5,646,269号 米国特許第5,677,439号 米国特許第5,539,082号 米国特許第5,714,331号 米国特許第5,719,262号 国際公開第98/39352号 国際公開第99/14226号 国際公開第00/56746号 国際公開第00/56748号 国際公開第01/25248号 国際公開第02/28875号 国際公開第03/006475号 米国特許出願公開第2007/0191294号 国際公開第03/095467号 米国特許第6,670,461号 米国特許第6,794,499号 米国特許第7,034,133号 米国特許第7,053,207号 米国特許第7,060,809号 米国特許第7,084,125号 米国特許第4,981,957号 米国特許第5,118,800号 米国特許第5,319,080号 米国特許第5,359,044号 米国特許第5,393,878号 米国特許第5,446,137号 米国特許第5,466,786号 米国特許第5,514,785号 米国特許第5,519,134号 米国特許第5,567,811号 米国特許第5,576,427号 米国特許第5,591,722号 米国特許第5,597,909号 米国特許第5,610,300号 米国特許第5,627,053号 米国特許第5,639,873号 米国特許第5,646,265号 米国特許第5,658,873号 米国特許第5,670,633号 米国特許第5,792,747号 米国特許第5,700,920号 米国特許第4,845,205号 米国特許第5,130,302号 米国特許第5,134,066号 米国特許第5,175,273号 米国特許第5,367,066号 米国特許第5,432,272号 米国特許第5,457,187号 米国特許第5,459,255号 米国特許第5,484,908号 米国特許第5,502,177号 米国特許第5,525,711号 米国特許第5,552,540号 米国特許第5,587,469号 米国特許第5,594,121号 米国特許第5,596,091号 米国特許第5,614,617号 米国特許第5,645,985号 米国特許第5,830,653号 米国特許第5,763,588号 米国特許第6,005,096号 米国特許第5,750,692号 米国特許第5,681,941号 国際特許出願第PCT/US92/09196号 米国特許出願第09/334/30号 米国特許第4,828,979号 米国特許第4,948,882号 米国特許第5,218,105号 米国特許第5,525,465号 米国特許第5,541,313号 米国特許第5,545,730号 米国特許第5,552,538号 米国特許第5,578,717号 米国特許第5,580,731号 米国特許第5,591,584号 米国特許第5,109,124号 米国特許第5,118,802号 米国特許第5,138,045号 米国特許第5,414,077号 米国特許第5,486,603号 米国特許第5,512,439号 米国特許第5,578,718号 米国特許第4,587,044号 米国特許第4,605,735号 米国特許第4,667,025号 米国特許第4,762,779号 米国特許第4,789,737号 米国特許第4,824,941号 米国特許第4,835,263号 米国特許第4,876,335号 米国特許第4,904,582号 米国特許第4,958,013号 米国特許第5,082,830号 米国特許第5,112,963号 米国特許第5,214,136号 米国特許第5,245,022号 米国特許第5,254,469号 米国特許第5,258,506号 米国特許第5,262,536号 米国特許第5,272,250号 米国特許第5,292,873号 米国特許第5,317,098号 米国特許第5,371,241号 米国特許第5,391,723号 米国特許第5,416,203号 米国特許第5,451,463号 米国特許第5,510,475号 米国特許第5,512,667号 米国特許第5,565,552号 米国特許第5,567,810号 米国特許第5,574,142号 米国特許第5,585,481号 米国特許第5,587,371号 米国特許第5,595,726号 米国特許第5,597,696号 米国特許第5,599,923号 米国特許第5,599,928号 米国特許第5,688,941号 米国特許第5,013,830号 米国特許第5,149,797号 米国特許第5,220,007号 米国特許第5,256,775号 米国特許第5,366,878号 米国特許第5,403,711号 米国特許第5,491,133号 米国特許第5,565,350号 米国特許第5,623,065号 米国特許第5,652,355号 米国特許第5,652,356号 米国特許第5,700,922号 国際公開第2007/107162号(PCT/DK2007/000146) PA 2006 00433(DK) PA 2006 01254(DK) 国際公開第2008/044928号(PCT/NL2007/050490) 国際公開第2007/044928号
Walport, M.J. 2001. N. Engl. J. Med. 344: 1058〜1066頁および1140〜1144頁 S. Bureevaら(2005) Drug Discovery Today 10: 1535頁 Ballin RHおよびThomas PK (1969) Acta Neuropathol (Berl) 14: 237頁 Leonhardら(2002) Eur. J. Neurosci. 16: 1654頁 Daileyら(2002) J. Neurosci 18: 6713頁 Liu (1999) J. Peripher. Nerv. Syst. 4: 123頁 Ramaglia, V.ら(2007) J. Neurosci. 27: 7663頁 Cheson, BD (2007) Ther Clin Risk Manag. 3(5):855頁 McManusおよびSharp、(2002) Nature Reviews Genetics 3: 737頁 Leuschnerら(2006) EMBO Reports 7:314頁 Sambrookら(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Plainview, N.Y.) Innisら編、(1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press、New York) InnisおよびGelfand編、(1995) PCR Strategies (Academic Press、New York) InnisおよびGelfand編、(1999) PCR Methods Manual (Academic Press、New York) Experimental Immunochemistry、2版、Charles C. Thomas、Springfield、IL.133〜240頁のKabat, E. AおよびMayer, M. M. (1961) Complement and Complement Fixations Ramaglia, V.ら(2007) J. Neurosci. 27:7663頁 MyersおよびMiller (1988) CABIOS 4:11〜17頁 Smithら(1981) Adv. Appl. Math. 2:482頁 NeedlemanおよびWunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443〜453頁 PearsonおよびLipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444〜2448頁 KarlinおよびAltschul (1993) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 90:5873〜5877頁 HenikoffおよびHenikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915頁 NeedlemanおよびWunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443〜453頁 Benson, D. A.ら(1997) Nucl. Acids. Res. 25: 1頁 Nielsenら、Science、1991、254、1497〜1500頁 Martinら、Hely. Chim. Acta、1995、78、486〜504頁 The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering、858〜859頁、Kroschwitz, J. I.編、John Wiley & Sons、1990 Englischら、Angewandte Chemie、International Edition、1991、30、613頁 Sanghvi, Y. S.、Chapter 15、Antisense Research and Applications、289〜302頁、Crooke, S. T.およびLebleu, B.編、CRC Press、1993 Neilson, P.ら(1994) NAR 22:703頁 Neilson, P.ら(1995) Bioorganic & Med. Chem. (1995) 19〜28頁 Sanghvi, Y. S.、Crooke, S. T.およびLebleu, B.編、Antisense Research and Applications、CRC Press、Boca Raton、1993、276〜278頁 Letsingerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1989、86、6553〜6556頁 Manoharanら、Bioorg. Med. Chem. Let.、1994、4、1053〜1060頁 Manoharanら、Ann. N.Y. Acad. Sci.、1992、660、306〜309頁 Manoharanら、Bioorg. Med. Chem. Let.、1993、3、2765〜2770頁 Oberhauserら、Nucl. Acids Res.、1992、20、533〜538頁 Saison-Behmoarasら、EMBO J.、1991、10、1111〜1118頁 Kabanovら、FEBS Lett.、1990、259、327〜330頁 Svinarchukら、Biochimie、1993、75、49〜54頁 Manoharanら、Tetrahedron Lett.、1995、36、3651〜3654頁 Sheaら、Nucl. Acids Res.、1990、18、3777〜3783頁 Manoharanら、Nucleosides & Nucleotides、1995、14、969〜973頁 Manoharanら、Tetrahedron Lett.、1995、36、3651〜3654頁 Mishraら、Biochim. Biophys. Acta、1995、1264、229〜237頁 Crookeら、J. Pharmacol. Exp. Ther.、1996、277、923〜937頁 Crooke, R. M. (1998)、Crooke, S. T. Antisense research and Application。Springer-Verlag、Berlin, Germany、131巻、103〜140頁 Dass C R. J Pharm Pharmacol 2002; 54(1):3〜27頁 Tillman, LGら(2008) J. of Pharmaceutical Sciences、Jan. 97(1) 225頁 Gonzalez, FMら(2003) Eur. J. Pharm. Biopharm、Jan: 55(1): 19〜26頁 Aouadi, Mら(2009) Nature 458: 1180頁 Ramaglia, V.ら(2007) J. Neurosci. 27:7663頁 Wolf, SL (2001) Stroke 32:1635頁 S. Van Tuijlら(2002) Spinal Cord 40:51頁 Sheikh, Kら(1980) Rheumatology 19:83頁 Chan A.Weら(2001) J. Neurol. Neurosurg. Psychology 55:56頁 Mayuko. Wら(2005) J. Jap. Soc. For Surgery of the Hand (2005) 22:842頁 Ristic Sら(2000)Clin Orthop Relat Res. 370:138頁 Feliciano DV、Moore EE、Mattox KL. Trauma。3版。Stamford, Conn: Appleton & Lange; 1996:853頁のColohan ARら(1996) Injury to the peripheral nerves
本発明は、例えば哺乳動物の補体成分6(C6)タンパク質の活性を低減またはブロックするアンタゴニストを特徴とする。例示的なアンタゴニストは、膜攻撃複合体(MAC)の形成に関連することが知られているかまたはそれが疑われる神経障害を予防、治療するかまたはその程度を低減するために用いることができる。特定のアンタゴニストは、哺乳動物の補体6(C6)タンパク質の発現をブロックまたは低減する、一本鎖および多重鎖の核酸(一般的に約1、2または約3本の鎖)を特徴とする。本発明は、急性または慢性の神経傷害の後に哺乳動物で神経再生を促進するための使用を含む、多種多様の用途を有する。
一態様では、本発明は、配列番号1(ヒト)、配列番号402(ラット)または配列番号403(マウス)によって表される補体成分6(C6)配列、またはその天然に存在する対立遺伝子変異体(allelic variant)をコードする核酸の対応する領域に少なくとも80%の配列同一性を有する連続した核酸塩基配列を有する、長さが約10〜50ヌクレオチドのオリゴマーを提供する。好ましいオリゴマーは少なくとも1つのヌクレオチド類似体を含み、例えばPCRアッセイで測定した場合、哺乳動物でのC6 mRNAの発現レベルを少なくとも約20%低減することができる。
単純さのために、特記されない場合、句「哺乳動物の補体成分6(C6)」は、「C6」、「哺乳動物C6タンパク質」などと略される。
別の態様では、本発明は、第一のオリゴマー(パッセンジャー鎖)、および哺乳動物のC6タンパク質、特にヒト、ラット、またはマウスのC6をコードする核酸分子を好ましくは標的にする第二のオリゴマー(アンチセンス鎖)を好ましくは含む、二本鎖の核酸化合物を特徴とする。一実施形態では、本化合物の各鎖は約12〜35核酸塩基を含み、アンチセンス鎖は、配列番号1(ヒト)、配列番号402(ラット)または配列番号403(マウス)によって表される補体成分6(C6)配列、またはその天然に存在する対立遺伝子変異体をコードする核酸の対応する領域に少なくとも80%の配列同一性を有する連続した核酸塩基配列からなる。好ましいオリゴマーは、少なくとも1つのオリゴヌクレオチド類似体を含む。
別の態様では、本発明は、配列番号1(ヒト)、配列番号402(ラット)または配列番号403(マウス)によって表される補体成分6(C6)配列、またはその天然に存在する対立遺伝子変異体をコードする核酸の対応する領域に少なくとも80%の配列同一性を有する連続した核酸塩基配列からなるアンチセンス鎖を含む二本鎖コア領域を有するRNA複合体を含む組成物を特徴とする。好ましくは、オリゴマーは少なくとも1つのオリゴヌクレオチド類似体を含み、RNA複合体は、アンチセンス鎖とハイブリダイズする不連続なパッセンジャー鎖をさらに含む。
本発明は、細胞または組織で、ヒトC6などの哺乳動物のC6の発現を低減または阻害する方法をさらに提供する。一実施形態では、この方法は、細胞または組織でC6タンパク質の発現を低減または阻害するのに十分な量で、細胞または組織を本発明の少なくとも1つのオリゴマー、二本鎖の化合物または他の組成物と接触させる段階を含む。
本発明は、補体系の望ましくない活性、特にMACの望ましくない形成によって媒介される障害を治療、予防するか、またはその症状を軽減するための方法も提供する。一実施形態では、この方法は、それを必要とする哺乳動物に、哺乳動物でのMAC形成を低減またはブロックするのに十分な量で本発明の組成物を(治療的または予防的に)投与する段階を含む。本発明の範囲内の好ましい障害は、神経再生が不十分であるかさもなければ異常であるものである。
本発明は、哺乳動物でC6の発現を低減または阻害し、その中の神経再生を高めるのに十分な、ある量の本発明の少なくとも1つの組成物を、哺乳動物に(治療的または予防的に)投与する段階を含む、哺乳動物で神経再生を高める方法もさらに提供する。好ましくは、哺乳動物でMACの形成も低減または阻害される。
本発明の実施は、重要な利点を提供する。
例えば、肝臓が時々核酸を捕捉し、肝臓外を標的とする核酸ベースの治療法の活性を低減することがあるとの報告がある。
しかし、肝臓は補体タンパク質合成の主要な部位である。したがって、発明化合物の捕捉作用は、C6タンパク質の発現を有利に低減またはブロックすると考えられている。
さらに、急性または慢性の神経障害を有するかまたはそれが疑われる哺乳動物でのMAC形成を低減または阻害するために、本発明の化合物を単独で、または他の剤(少なくとも1つの他の発明組成物を含む)と一緒に用いることができる。損傷の前、その間またはその後の本発明の使用は、哺乳動物で神経再生を促進する手助けとなると考えられている。
本発明のさらなる使用および利点を、下で述べる。
補体アンチセンスLNAによるマウスでの処置から3日後のC6補体mRNAレベルを示すグラフである。バッチ番号(Y軸)は、実施例2で説明する。 補体タンパク質C6、C8aまたはC8bを標的とするLNA修飾オリゴヌクレオチドによる処置後のマウス血清中の膜攻撃複合体(MAC)活性の効力を示すグラフである。オリゴヌクレオチドは、1週間投与された。 C6 mRNAの補正レベルに対する、マウスへのオリゴ1010(配列番号413)の様々な量の投与を示すグラフである。対応するsiRNA構築物の結果も示す。
述べたように、本発明は、例えば哺乳動物のC6の活性を好ましくはブロックまたは阻害するアンタゴニストを特徴とする。本明細書で「核酸アンタゴニスト」への言及は、核酸、および好ましくは、本明細書で開示される1つまたは複数の核酸類似体を含むか、またはそれらからなる化合物を意味する。「RNAアンタゴニスト」は、その目的の機能が、特定のRNAの発現を低減またはブロックすることである核酸アンタゴニストである。
一態様では、本発明は、好ましくはC6の生成量を減少させるために、哺乳動物のC6をコードする核酸分子の機能を低下させるために用いるオリゴマー化合物(オリゴマー)を提供する。一例は、アンチセンス化合物である。この目標は、例えば、哺乳動物のC6をコードする1つまたは複数の核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物を提供することによって達成される。本明細書で用いるように、用語「標的核酸」および「C6をコードする核酸」は、哺乳動物のC6をコードするDNA、そのようなDNAから転写される哺乳動物のC6をコードするRNA(前mRNAおよびmRNAを含む)、さらにそのようなRNAから誘導されるcDNAを包含する。対象の特定の哺乳動物のC6は、表3(配列番号1)によって表されるcDNA配列によってコードされるヒト補体成分6(C6)である。対象の別の哺乳動物のC6は、それぞれ配列番号402および403によって表されるラットおよびマウスのC6配列である。
本明細書で用いるように、「オリゴヌクレオチド」は、リボ核酸(RNA)またはデオキシリボ核酸(DNA)またはその類似体のオリゴマーまたはポリマーなどの、発明化合物の成分を指す。この用語は、天然の核酸塩基、糖および共有結合的ヌクレオシド間(骨格)結合で構成されるオリゴヌクレオチド、ならびに天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。そのような修飾または置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば強化された細胞の取込み、強化された核酸標的への親和性、および例えばヌクレアーゼの存在下での安定性の増加などの望ましい特性のために、天然形態よりもしばしば好ましい。したがって、複数形を含む本発明による「オリゴマー」は、天然に存在する核酸塩基、糖および共有結合的骨格結合を含むオリゴヌクレオチド、ならびにその1つまたは複数の類似体を含む構築物である。
本文脈で、用語「ヌクレオチド」は、その第一の炭素を通して窒素性塩基、例えばアデニン(A)、シトシン(C)、チミン(T)、グアニン(G)またはウラシル(U)に結合し、その第五の炭素原子を通してヌクレオシド間の結合基(下で定義される)または末端基(本明細書で定義される)に結合している2-デオキシリボース(DNA)単位またはリボース(RNA)単位を意味する。したがって、本明細書で用いる場合、用語「ヌクレオチド」は、その第一の炭素を通して窒素性塩基、例えばA、C、T、GまたはUに結合し、その第五の炭素原子を通してリン酸基または末端基に結合しているリボース単位を含むRNA単位(またはモノマー)を包含する。同様に、用語「ヌクレオチド」は、その第一の炭素を通して窒素性塩基、例えばA、C、T、GまたはUに結合し、その第五の炭素原子を通してリン酸基または末端基に結合している2-デオキシリボース単位を含むDNA単位(またはモノマー)も包含する。用語「ヌクレオチド」は、本明細書に記載のそのようなRNAおよびDNAモノマーの変異体または類似体も包含する。
「ヌクレオシド」は、その第一の炭素を通して窒素性塩基、例えばアデニン(A)、シトシン(C)、チミン(T)、グアニン(G)またはウラシル(U)に結合している2-デオキシリボース(DNA)単位またはリボース(RNA)単位を意味する。したがって、本明細書で用いる場合、用語「ヌクレオシド」は、その第一の炭素を通して窒素性塩基、例えばA、C、T、GまたはUに結合しているリボース単位を含むRNA単位(またはモノマー)を包含する。同様に、用語「ヌクレオシド」は、その第一の炭素を通して窒素性塩基、例えばA、C、T、GまたはUに結合している2-デオキシリボース単位を含むDNA単位(またはモノマー)も包含する。用語「ヌクレオシド」は、本明細書で提供されるそのようなRNAおよびDNAモノマーの変異体または類似体も包含する。個々のヌクレオシドは、本明細書で提供されるような天然に存在する結合および合成の結合などのヌクレオシド間の連結基によって連結されることが理解されよう。
アンチセンスオリゴマー
理論に縛られることを望まないが、その標的核酸とのオリゴマー化合物の特異的ハイブリダイゼーションが、その核酸の正常な機能を妨害すると考えられている。それと特異的にハイブリダイズする化合物による標的核酸の機能のこの調節は、「アンチセンス」と一般に呼ばれる。妨害されるDNAの機能には、例えば複製および転写が含まれる。妨害されるRNAの機能には、少なくとも一部の生活機能、例えばタンパク質翻訳部位へのRNAの転位、RNAからのタンパク質の翻訳、RNAをスプライシングして1つまたは複数のmRNA種を生成すること、およびRNAに関与するかまたはそれによって促進されることがある触媒活性が含まれる。標的核酸機能に対するそのような妨害の全体的影響は、哺乳動物のC6タンパク質の発現の調節である。本発明との関連で、「調節」は、オリゴマーの不在下での発現などの適する対照と比較しての、遺伝子の発現の増加(刺激)または減少(阻害)を意味する。本発明との関連で、阻害は遺伝子発現の調節の好ましい形態であり、mRNAが1つの標的である。
本明細書で用いるように、「ハイブリダイゼーション」は相補的ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基の間の水素結合を一般に指し、それは、ワトソンクリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合であることができる。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成を通して対になる相補的核酸塩基である。本明細書で用いるように、「相補的」は、2つのヌクレオチドの間の正確な対合の能力を指す。例えば、オリゴヌクレオチドの特定の位置のヌクレオチドがDNAまたはRNA分子の同じ位置のヌクレオチドと水素結合が可能な場合、そのオリゴヌクレオチドおよびDNAまたはRNAはその位置でお互いに相補的であるとみなされる。オリゴヌクレオチドおよびDNAまたはRNAは、各分子中の十分な数の対応する位置が、お互いに水素結合できるヌクレオチドによって占有される場合、お互いに相補的である。したがって、「特異的にハイブリダイズすることが可能」および「相補的」は、オリゴヌクレオチドとDNAまたはRNA標的との間で安定的および特異的結合が起こるような、十分な程度の相補性または正確な対合を表すために用いられる用語である。
発明化合物の配列は、特異的にハイブリダイズすることが可能であるために、その標的核酸のそれに100%相補的である必要性はないものと理解される。例えばアンチセンス化合物は、標的DNAまたはRNA分子へのその化合物の結合が標的DNAまたはRNAの正常な機能を妨害して、有用性の喪失を引き起こす場合、および特異的結合が所望である条件下で、すなわち、in vivoアッセイまたは治療処置の場合には生理学的条件下で、in vitroアッセイの場合にはそのアッセイが実施される条件下で、標的外の配列へのアンチセンス化合物の非特異的結合を回避するために十分な程度の相補性がある場合、特異的にハイブリダイズすることが可能である。
本発明の好ましいオリゴマーは、コンピュータでの設計、および、場合によってはin vitroおよび/またはin vivo試験を通して一般に特定される。好ましい発明配列が相補的である標的部位は、以下において「活性部位」と呼び、したがってターゲティングのための好ましい部位である。したがって、本発明の別の実施形態は、これらの活性部位とハイブリダイズする化合物を包含する。
本発明の目的は、特定のオリゴマーを、例えばアンチセンス化合物として用いることである。特定の核酸をアンチセンスまたは他の発明化合物の「標的にする」ことは、多段階のプロセスである。ターゲティングプロセスは、その機能を調節する核酸配列の特定から通常始まる。これは、例えば、その発現が特定の障害もしくは疾患状態に関連する細胞遺伝子(またはその遺伝子から転写されるmRNA)、または感染性因子からの核酸分子であることができる。本発明では、標的は、哺乳動物のC6タンパク質をコードする核酸分子、特に表3(配列番号1、402および403)に表すヒト、ラットおよびマウスのC6配列である。ターゲティングプロセスは、それらに限定されないがタンパク質の発現の検出または調節を含む、アンチセンス相互作用が起こるためのこの遺伝子中の1部位または複数部位の判定も含む。
追加の考慮事項には、望ましくない標的と交差ハイブリダイズする能力、および液中で困難な二次構造をとる能力の低下したオリゴマーを選択することが含まれる。低毒性およびmiRNA様種子領域のモチーフ、ならびにパッセンジャー鎖媒介オフターゲティングのために、本発明のより好ましいオリゴマーが選択される。本発明によるさらなる好ましいオリゴマーは、例えば表4A〜4Eおよび表5A〜5Fに示す。
次に表4A〜4Eに関し、配列番号2、24、46、68、90、112、134、156、178、200は表3(配列番号1)によって表されるヒトC6配列の好ましい標的であり、すぐ下の配列はそれぞれより好ましくない順のオリゴマーを示す。したがって、配列番号2はヒトC6の1つの好ましい標的であり、配列番号3〜23で表されるオリゴマーは、その部位を標的にするのにより好ましくない順序である。同じく表4A〜4Eに関し、さらに好ましい標的には、配列番号222、225、228、231、234、237、240、243、246および249で表される配列が含まれ、そのRNAおよび逆相補バージョンは各標的のすぐ下に示す。ラットおよびマウスのC6は、同一であるかまたは非常に類似した標的部位を有すると予想される。
特定の実施形態のためのさらに好ましいオリゴマーは、ヒト、ラットおよびマウス配列(例えば、表5A〜5F;配列番号292)の間で、100%の配列同一性を示す。理解されるように、そのようなオリゴマーは、実質的なミスマッチの問題または各哺乳動物のために複数のオリゴマー設計を有する必要性なしに、ヒト、ラットおよびマウスで用いることができる。
本発明によるより特定のオリゴマーは、標的に十分に相補的であり、すなわち、十分によく、および十分な特異性でハイブリダイズして、目的の結果を与える。好ましくは、所望の効果は、例えば、タンパク質を監視するための抗C6抗体を用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)および/または免疫学的手法で測定される、対応するC6 mRNAの量の低減または完全な阻害として現れる、ヒト、ラットまたはマウスのC6タンパク質などの哺乳動物のC6の発現の低減または完全な阻害である。
1つのPCR手法では、対象の任意の生物体から抽出されるcDNAまたはゲノムDNAから対応するDNA配列を増幅するためのPCR反応で使用するために、オリゴヌクレオチドプライマーを設計することができる。適するcDNAの例は、表1(配列番号1)によって表されるヒトC6配列である。PCRプライマーの設計およびPCRクローニングの方法は当技術分野で一般に公知であり、Sambrookら(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Plainview, N.Y.)、以下「Sambrook」に開示されている。Innisら編、(1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press、New York); InnisおよびGelfand編、(1995) PCR Strategies (Academic Press、New York);およびInnisおよびGelfand編、(1999) PCR Methods Manual (Academic Press、New York)も参照。PCRの公知の方法には、対プライマー、ネスト状のプライマー、単一の特異的プライマー、変性プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分ミスマッチプライマーなどを用いる方法が含まれるが、これらに限定されない。qPCRを実施するための方法は、実施例のセクションに記載する。
所望により、特定のオリゴマーの追加の機能を試験することができ、任意選択で総溶血((CH50)アッセイ)として知られるものを用いて定量化してもよい。この手法では、オリゴマーの1つまたは複数が投与された哺乳動物から、血漿、血液または他の適する生体試料が単離される。このアッセイは、抗赤血球抗体でコーティングされたヒツジ赤血球の標準化された懸濁液の50%を溶解する試験試料の能力を測る。任意の成分に欠陥がある場合、総補体活性は異常であると言われる。例えば、Experimental Immunochemistry、2版、Charles C. Thomas、Springfield、IL.133〜240頁のKabat, E. AおよびMayer, M. M. (1961) Complement and Complement Fixationsを参照。
別の手法では、所望により、Ramaglia, V.ら(2007) J. Neurosci. 27:7663頁によって記載されている免疫学的手法を用いて、MACの形成を検出および定量化することができる。
本発明のさらに好ましいオリゴマーは、ヒト、ラットまたはマウスのC6をコードするmRNAをブロックまたは低減する優れた能力を示す。より具体的には、そのようなオリゴマーは、ヒト、ラットまたはマウスなどの哺乳動物で特定のC6 mRNAのレベルを、適するPCRアッセイ、好ましくはqPCRによる測定で少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、最高約100%低下させることができる。さらに好ましいオリゴマーは、齧歯動物などの哺乳動物の宿主で実質的に無毒性である。すなわち、オリゴマーの治療量が適する期間(例えば、約1〜約10mg/kg IPを数日間または数週間毎日)哺乳動物に投与され、肝臓がその哺乳動物から切り取られて、核酸、一般的にRNAの原料として用いられるアッセイの過程で、それらは哺乳動物を殺さない。標準手順を用いて肝臓から核酸を調製し、Roche Lightcycler 480および製造業者によって推奨されるユニバーサルプローブを用いて、C6 mRNAレベルを測定するためにqPCRにかける。いくつかの発明オリゴマーが比較的無毒性であり、かつマウスC6 mRNAを少なくとも約20%、30%、40%、少なくとも約50%、60%、70%、少なくとも約80%以上、最高約90%、95%、約99%または100%減少させることができることが見出された実施例1で、例示的なアッセイを提供する。本明細書で「オリゴマー検証試験」への言及は、無毒性およびin vivoでC6 mRNA発現を阻害する能力を確認するための、前述の特異的アッセイを指す。
オリゴマーの好ましい使用は、MACの形成に関連することが知られているかまたはそれが疑われる神経障害を予防、治療すること、またはその程度を低減することを特徴とする。
本発明は適するオリゴマーの1つまたは組合せを提供するが、一般に好ましいオリゴマーは、約10〜約50核酸塩基の長さ、例えば、約12〜約45核酸塩基の長さ、約15〜約40核酸塩基の長さ、約16〜約35核酸塩基の長さであり、約18〜約30核酸塩基の長さが多くの用途のために有用である。好ましくは、オリゴマーは、合計10〜50核酸塩基、例えば、約12〜約45核酸塩基の長さ、約15〜約40核酸塩基の長さ、約16〜約35核酸塩基の長さの連続した核酸塩基配列を含み、約18〜約30核酸塩基の長さが多くの用途のために有用であり、そこでは、連続した核酸塩基配列は、対象の哺乳動物のC6をコードする核酸の対応する領域に少なくとも80%の配列同一性、例えば、約85%、約90%、約95%または約98%の配列同一性である。対象の特定の配列は、配列番号1によって表されるヒトC6、配列番号402によって表されるラットC6および配列番号403によって表されるマウスC6(ならびに、配列番号1、402および403の天然に存在する対立遺伝子変異体)である。「天然に存在する対立遺伝子変異体」は、周知の分子生物学的技術、例えば本明細書で概説されるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)およびハイブリダイゼーション技術を使って同定することができる。
対の核酸間の相同性の程度は、戦略の1つまたは組合せで測定することができる。一手法では、配列同一性割合は検査で測定される。比較のための配列の整列方法は、当技術分野で周知である。したがって、任意の2つの配列間の同一性割合の測定は、数値計算用アルゴリズムを用いて達成することができる。そのような数値計算用アルゴリズムの非限定例は、MyersおよびMiller (1988) CABIOS 4:11〜17頁のアルゴリズム、Smithら(1981) Adv. Appl. Math. 2:482頁の局所相同性アルゴリズム、NeedlemanおよびWunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443〜453頁の相同性整列アルゴリズム、PearsonおよびLipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444〜2448頁の類似検索方法、KarlinおよびAltschul (1993) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 90:5873〜5877頁のアルゴリズムである。
これらの数値計算用アルゴリズムのコンピュータによる実行を配列比較のために用いて、配列同一性を測定することができる。そのような実行には、それらに限定されないが、PC/遺伝子プログラム中のCLUSTAL(Intelligenetics、Mountain View, Calif.から入手可能)、ALIGNプログラム(バージョン2.0)、 ALIGN PLUSプログラム(バージョン3.0、著作権1997)、ならびに、Genetics Computer GroupのWisconsin Geneticsソフトウェアパッケージ、バージョン10(Acceirys、9685 Scranton Road, San Diego, Calif., 92121, USAから入手可能)中のGAP、BESTFIT、BLAST、FASTAおよびTFASTAが含まれる。Wisconsin Geneticsソフトウェアパッケージのバージョン10で用いられるスコアリングマトリックスは、BLOSUM62である(HenikoffおよびHenikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915頁を参照)。これらのプログラムを用いる整列は、デフォルトのパラメータを用いて実行することができる。整列に関する他の考慮事項は、当分野の研究者の技術の範囲内である。米国特許第7,378,499号およびその中で引用される参考文献も参照。
特に明記しない限り、本明細書で提供されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列の同一性/類似性の値は、GAPをデフォルトパラメータで用いて、または任意の同等プログラムを用いて得られる値を指す。「同等プログラム」は、問題の任意の2つの配列について、好ましいプログラムによって生成される対応する整列と比較した場合、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基マッチおよび同一の配列同一性割合を有する整列を生成する、任意の配列比較プログラムを意図する。さらなる情報については、NeedlemanおよびWunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443〜453頁を参照。
本発明の目的のために、本明細書に記載のヒト、ラットおよびマウスのC8配列への配列同一性割合の測定のためのヌクレオチドまたはタンパク質配列の比較は、好ましくはWisconsin Geneticsソフトウェアパッケージ(バージョン10以降)中のGAPプログラムまたは任意の同等のプログラムを用いて実施される。ヌクレオチド配列のGAP分析のために、50のGAP重量および3の長さが用いられた。
本明細書で用いるように、2つの核酸またはポリペプチド配列との関連で、「配列同一性」または「同一性」は、特定の比較ウインドウの上で最大対応のために整列させた場合に同じである、2つの配列中の残基を指す。配列同一性の割合がタンパク質に関して用いられる場合、同一でない残基位置は保存的なアミノ酸置換がしばしば異なることが認識され、そこでは、アミノ酸残基は類似した化学特性(例えば、電荷または疎水性)を有する他のアミノ酸残基のために置換され、したがって分子の機能的特性を変更しない。配列が保存的な置換で異なる場合、配列同一性割合は、置換の保存的な性質について補正するために上方向に調節することができる。そのような保存的な置換が異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われる。この調整を実施するための手段は、当業者に周知である。一般的に、これは、完全ではなく部分的なミスマッチとして保存的な置換を評価し、それによって配列同一性割合を高めることを含む。したがって、例えば、同一のアミノ酸に1のスコアが与えられ、非保存的置換にゼロのスコアが与えられる場合、保存的な置換は0と1との間のスコアが与えられる。保存的な置換のスコアリングは、例えばプログラムPC/GENE(Intelligenetics、Mountain View, Calif.)で実施されるように計算される。
本明細書で用いるように、「配列同一性の割合」は、比較ウインドウの上で2つの最適に整列させた配列を比較することで測定される値を意味し、そこで、比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列の一部は、2つの配列の最適整列のための参照配列(付加または欠失を含まない)と比較して、付加または欠失(すなわち、ギャップ)を含むことができる。その割合は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両配列に存在する位置の数を決定して一致する位置の数を与え、一致する位置の数を比較ウインドウ中の位置の総数で割り、その結果に100を掛けて配列同一性の割合を与えることによって計算される。
ヌクレオチド配列が実質的に同一であることの別の指標は、2つの分子がストリンジェントな条件下でお互いとハイブリダイズする場合である。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびpHで特異的配列の熱融点(Tm)より約5℃低くなるように選択される。しかし、本明細書で別途認められる所望のストリンジェンシー度によっては、ストリンジェントな条件は約1℃〜約20℃の温度を包含する。ストリンジェントな条件下でお互いとハイブリダイズしない核酸であっても、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一であるならば実質的に同一である。これは、例えば遺伝子コードによって許される最大コドン変性を用いて核酸のコピーが作製される場合に起こることができる。2つの核酸配列が実質的に同一であることの1つの指標は、第一の核酸によってコードされるポリペプチドが、第二の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性である場合である。
前述のオリゴマーの一実施形態では、連続する核酸塩基配列は、対象の哺乳動物のC6、特に配列番号1をコードする核酸の対応する領域に関して、約3以下、例えば約1以下または約2以下の個数のミスマッチしか含まない。例えば、連続する核酸塩基配列は、対象の哺乳動物のC6をコードする核酸の対応する領域に対して、単一のミスマッチしか含むことができない。あるいは、連続する核酸塩基配列は、対象の哺乳動物のC6をコードする核酸の対応する領域とのミスマッチを含まない(例えば、それと完全に相補的である)。別の実施形態では、オリゴマーの核酸塩基配列は、連続する核酸塩基配列からなる。
本発明の実施は、本明細書で規定するヒト、ラットおよびマウスの配列を含む、広範囲の哺乳動物のC6配列に適合する。そのようなタンパク質の核酸およびタンパク質配列は、U.S. National Center for Biotechnology Information ((NCBI)-Genetic Sequence Data Bank (Genbank))から入手可能である。詳細には、配列リストは、National Library of Medicine、38A, 8N05, Rockville Pike, Bethesda, Md. 20894のGenbankから得ることができる。Genbankは、インターネットでも利用可能である。Genbankの記載については、一般には、Benson, D. A.ら(1997) Nucl. Acids. Res. 25: 1頁を参照。具体的に引用されていないタンパク質および核配列は、Genbankまたは本明細書に開示されている他の源で見ることができる。例えば、ラットC6配列を開示している(NM_016704)、マウスC6配列を開示している(NM_176074)を参照。
他のオリゴマーの実施形態は、本発明の範囲内である。例えば、一実施形態では、オリゴマーの連続する核酸塩基配列は、例えば相補的ヒト、ラットまたはマウスのC6標的RNAとの二重鎖で形成される場合にはRNアーゼHを動員することができる、少なくとも6、例えば約7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30〜32核酸塩基残基の連続する部分配列を含む。「RNアーゼHを動員する」ことは、その酵素が、その酵素の活性を検出および定量化することができるアッセイの1つまたは組合せによって判定される複合体に接触することを意味する。例として、RNアーゼHは、RNA:DNA二重鎖のRNA鎖を切断する、細胞内エンドヌクレアーゼである。したがって、RNアーゼHの活性化は、RNA標的の切断をもたらし、それによって遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率を大きく高める。RNA標的の切断は、ゲル電気泳動によって常法により検出することができる。
したがって一実施形態では、オリゴマーの連続する核酸塩基配列は、相補的な哺乳動物C6の標的との二重鎖で形成される場合にRNアーゼHを動員する能力がある、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9または少なくとも10核酸塩基残基の連続する部分配列を含むことができる。別の実施形態では、連続する部分配列は、相補的な哺乳動物C6の標的RNAとの二重鎖で形成される場合にRNアーゼHを動員する能力がある、少なくとも9または少なくとも10の核酸塩基の長さ、例えば少なくとも12核酸塩基または少なくとも14核酸塩基の長さ、例えば14、15または16の核酸塩基残基である。
本発明用のさらに好ましいオリゴマーは、使用目的に適する長さである。したがって一実施形態では、オリゴマーは、約8〜約50核酸塩基、約9〜約50ヌクレオチド、約10〜約50ヌクレオチド、約9〜約40核酸塩基、約10〜約35核酸塩基、約10〜約22核酸塩基、例えば約12〜約18核酸塩基、約14、約15または約16の核酸塩基、約10、11、12、13または約14の核酸塩基の長さを有する。
理解されるように、ヌクレオシドは塩基と糖の組合せである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常複素環塩基である。そのような複素環塩基の2つの最も一般的なクラスは、プリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合で連結されるリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドについては、リン酸基は糖の2’、3’または5’ヒドロキシル部分に連結されてもよい。オリゴヌクレオチドの形成では、リン酸基は隣接するヌクレオシドを共有結合的にお互いに連結し、線形重合化合物を形成する。次に、この線形重合構造のそれぞれの末端をさらに結合して環状構造を形成することができるが、開いた線形構造が一般に好ましい。オリゴヌクレオチド構造中で、リン酸基は、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成すると一般に言われる。RNAおよびDNAの正常な結合または骨格は、3’から5’へのホスホジエステル結合である。
特定の適用のために前述のオリゴマーが好ましいが、1つまたは複数のオリゴヌクレオチド類似体を有するオリゴマーの使用がしばしば好ましい(本明細書でオリゴヌクレオチド「模倣体または誘導体」と称することもある)。したがって一発明実施形態では、本発明のオリゴマーは、1つまたは複数の非核酸塩基化合物を単独で、またはその中の修飾された骨格もしくは非天然のヌクレオシド間結合と組み合わせて含む。この明細書で定義されるように、修飾骨格を有するオリゴヌクレオチドには、骨格にリン原子を保持するもの、および骨格にリン原子を有しないものが含まれる。この明細書のために、および本分野で時々言及されるように、それらのヌクレオシド間骨格にリン原子を有しない修飾オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオシドであると考えることもできる。
例示的な修飾オリゴヌクレオチド骨格には、例えば、ホスホロチオエート、キラルのホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、リン酸トリエステル、アミノアルキルリン酸トリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホネート、例えば3’-アルキレンホスホネート、5’-アルキレンホスホネートおよびキラルのホスホネート、ホスフィナート、ホスホラミデート、例えば3’-アミノホスホラミデートおよびアミノアルキルホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキル-ホスホネート、チオノアルキルリン酸トリエステル、正常な3’-5’結合を有するセレノホスフェートおよびボラノホスフェート、これらの2’-5’結合類似体、ならびに1つまたは複数のヌクレオチド間結合が、3’から3’、5’から5’または2’から2’結合である、逆極性を有するものが含まれる。逆極性を有する好ましいオリゴヌクレオチドは、3’末端のヌクレオチド間結合に単一の3’-3’結合、すなわち、無塩基(核酸塩基が欠落しているかその代わりにヒドロキシル基を有する)であってもよい単一の逆転ヌクレオシド残基を含む。様々な塩、混合塩および遊離酸の形態も含まれる。そのような組成物の作製および使用に関する開示については、例えば、米国特許第3,687,808号;第4,469,863号;第4,476,301号;第5,023,243号;第5,177,196号;第5,188,897号;第5,264,423号;第5,276,019号;第5,278,302号;第5,286,717号;第5,321,131号;第5,399,676号;第5,405,939号;第5,453,496号;第5,455,233号;第5,466,677号;第5,476,925号;第5,519,126号;第5,536,821号;第5,541,306号;第5,550,111号;第5,563,253号;第5,571,799号;第5,587,361号;第5,194,599号;第5,565,555号;第5,527,899号;第5,721,218号;第5,672,697号、第7,335,764号および第5,625,050号を参照。
したがって一発明実施形態では、本発明のオリゴマーは、完全にホスホロチオール化(phosphorothiolyated)されている骨格を有する。
その中にリン原子を含まない追加の修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または1つまたは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式のヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらには、モルホリノ結合(一部、ヌクレオシドの糖部分から形成される);シロキサン骨格;スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格;ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格;メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格;リボアセチル骨格;アルケン含有骨格;スルファミン酸骨格;メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格;スルホン酸およびスルホンアミド骨格;アミド骨格;ならびに、混合したN、O、SおよびCH2構成部分を有する他のものを有するものが含まれる。そのような組成物の作製および使用に関する開示については、例えば、米国特許第5,034,506号;第5,166,315号;第5,185,444号;第5,214,134号;第5,216,141号;第5,235,033号;第5,264,562号;第5,264,564号;第5,405,938号;第5,434,257号;第5,466,677号;第5,470,967号;第5,489,677号;第5,541,307号;第5,561,225号;第5,596,086号;第5,602,240号;第5,610,289号;第5,602,240号;第5,608,046号;第5,610,289号;第5,618,704号;第5,623,070号;第5,663,312号;第5,633,360号;第5,677,437号;第5,792,608号;第5,646,269号、第7,335,764号および第5,677,439号を参照。
他のオリゴヌクレオチド類似体では、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合、すなわち骨格は、他の基で置換される。塩基単位は、適当な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。そのようなオリゴマー化合物の1つは、ペプチド核酸(PNA)と呼ばれる。PNA化合物では、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格で置換される。核酸塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に、直接または間接に結合される。例えば、米国特許第5,539,082号;第5,714,331号;第5,719,262号およびNielsenら、Science、1991、254、1497〜1500頁を参照。
本発明の追加の実施形態は、ホスホロチオエート骨格、ならびにヘテロ原子骨格、特に上記の米国特許第5,489,677号の--CH2--NH--O--CH2--、--CH2--N(CH3)--O--CH2--[メチレン(メチルイミノ)またはMMI骨格として知られる]、--CH2--O--N(CH3)--CH2--、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--および--O--N(CH3)--CH2--CH2--[天然のホスホジエステル骨格は--O--P--O--CH2--で表される]、および上記の米国特許第5,602,240号のアミド骨格を有するオリゴヌクレオシドを有するオリゴマーである。例えば、上記の米国特許第5,034,506号のモルホリノ骨格構造を有するさらなるオリゴヌクレオチド。
本発明による修飾オリゴマーは、1つまたは複数の置換された糖部分を含むこともできる。例示的なオリゴヌクレオチドは、2’位に以下の:OH;F;O-、S-またはN-アルキル;O-、S-またはN-アルケニル;O-、S-またはN-アルキニル;またはO-アルキル-O-アルキル、の1つを含み、式中、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換されたかもしくは無置換のC1〜C10アルキルまたはC2〜C10アルケニルおよびアルキニルであってもよい。O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、およびO(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2が特に好ましく、式中、nおよびmは1〜約10である。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、2’位に以下の1つを含む: C1〜C10低級アルキル、置換された低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、O-アルカリルまたはO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、RNA切断基、レポーター基、インターカレータ、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善する基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善する基、および類似した特性を有する他の置換基。好ましい修飾には、2’-メトキシエトキシ(2’-O--CH2CH2OCH3、別名2’-O--(2-メトキシエチル)または2’-MOE) (Martinら、Hely. Chim. Acta、1995、78、486〜504頁)、すなわち、アルコキシアルコキシ基が含まれる。さらなる好ましい修飾には、以下の実施例に記載の、2’-ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわちO(CH2)2ON(CH3)2基、別名2’-DMAOE、および同じく以下の実施例に記載の、2’-ジメチルアミノエトキシエトキシ(当技術分野で2’-O-ジメチルアミノエトキシエチルまたは2’-DMAEOEとしても知られる)、すなわち2’-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2が含まれる。
好ましい修飾には、2’-ヒドロキシル基が糖環の3’または4’炭素原子に連結され、それによって二環式糖部分を形成するロック核酸(Locked Nucleic Acids: LNA)が含まれる。結合は、例えば、2’酸素原子と4’炭素原子とを架橋するメチレン(--CH2--)n基であり、式中、nは1または2である。LNAおよびその調製は、国際公開第98/39352号および国際公開第99/14226号に記載されている。
さらに適するLNAモノマー(「ロック核酸モノマー」、「ロック核酸残基」、「LNAモノマー」または「LNA残基」と呼ばれることもある)は、例えば国際公開第00/56746号、国際公開第00/56748号、国際公開第01/25248号、国際公開第02/28875号、国際公開第03/006475号、米国特許出願公開第2007/0191294号、国際公開第03/095467号、米国特許第6,670,461号、第6,794,499号、第7,034,133号、第7,053,207号(L-Ribo-LNA)、第7,060,809号および第7,084,125号(Xylo-LNA)に開示される、二環式ヌクレオチド類似体を指す。LNAモノマーは、その化学式に関して定義することもできる。したがって、本明細書で用いる「LNAモノマー」の例は、以下の構造
を有し、上式で、Xは、O、SおよびNRH--からなる群から選択され、式中、RHはHまたはアルキル、例えばC1〜6アルキルであり; Yは(--CH2)rであり、式中、rは1〜6の整数であり;但しX=Oの場合、rは2でない。ZおよびZ*は、独立に不在であるか、またはヌクレオシド間結合基、末端基および保護基からなる群から選択され;Bは核酸塩基である。一実施形態では、r=1であり、XはOであり、Z、Z*のそれぞれは、独立に不在であるか、またはヌクレオシド間結合基、末端基および保護基からなる群から選択され、Bは核酸塩基である。前述のLNAモノマーは、例えば米国特許出願公開第2007/0191294号に記載のβ-D形、α-L形であることができる。
句「LNAモノマー」には、1つまたは複数のヌクレオチドがアミノ-LNA、チオ-LNAまたは両方によって置換されるオリゴマーも含まれる。「アミノ-LNA」および「チオ-LNA」は、ペントース環の酸素原子がそれぞれ窒素または硫黄原子で置換される、上記式に示すLNAモノマーを意味する。そのようなLNAモノマーの作製および使用方法は、例えば、米国特許第7,060,809号;第7,034,133号;第6,794,499号;第6,670,461号;およびその中の引用文献に開示されている。特定の置換は、C-もしくはT-アミノ-LNA、またはC-もしくはT-チオLNAである。特定のアミノ-LNAおよびチオ-LNA類似体は、Ribotask A/Sから入手可能である。
句「C1〜6アルキル」は、最長鎖が1〜6個の炭素原子を有する直鎖または分枝状の飽和炭化水素鎖、例えばメチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチルおよびヘキシルを意味する。分枝状炭化水素鎖は、任意の炭素が炭化水素鎖で置換されるC1〜6アルキルを意味するものとする。
末端基の具体例には、水素、アジド、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、Prot-O--、Act-O--、メルカプト、Prot-S--、Act-S--、C1〜6アルキルチオ、アミノ、Prot-N(RH)--、Act-N(RH)--、モノまたはジ(C1〜6アルキル)アミノ、任意選択で置換されたC1〜6アルコキシ、任意選択で置換されたC1〜6アルキル、任意選択で置換されたC2〜6アルケニル、任意選択で置換されたC2〜6アルケニルオキシ、任意選択で置換されたC2〜6アルキニル、任意選択で置換されたC2〜6アルキニルオキシ、保護されたモノホスフェートを含むモノホスフェート、保護されたモノチオホスフェートを含むモノチオホスフェート、保護されたジホスフェートを含むジホスフェート、保護されたジチオホスフェートを含むジチオホスフェート、保護されたトリホスフェートを含むトリホスフェート、保護されたトリチオホスフェートを含むトリチオホスフェートからなる群から選択される末端基が含まれ、ここで、Protは--OH、--SHおよび--NH(RH)の保護基であり、Actは--OH、--SHおよび--NH(RH)の活性化基であり、RHは水素またはC1〜6アルキルである。
本文脈で、用語「C1〜4アルキル」は、最長鎖が1〜4個の炭素原子を有する直鎖または分枝状の飽和炭化水素鎖、例えばメチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチルおよびtert-ブチルを意味するものとする。分枝状炭化水素鎖は、任意の炭素が炭化水素鎖で置換されるC1〜4アルキルを意味するものとする。
本明細書で用いる場合、用語「C1〜6アルコキシ」は、C1〜6アルキルオキシ、例えばメトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、イソプロポキシ、n-ブトキシ、イソブトキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシ、ペントキシ、イソペントキシ、ネオペントキシおよびヘキソキシを意味するものとする。
本文脈では、用語「C2〜6アルケニル」は、2〜6個の炭素原子を有し、1つまたは複数の二重結合を含む、直鎖または分枝状の炭化水素基を意味するものとする。C2〜6アルケニル基の例示的な例には、アリル、ホモアリル、ビニル、クロチル、ブテニル、ブタジエニル、ペンテニル、ペンタジエニル、ヘキセニルおよびヘキサジエニルが含まれる。不飽和(二重結合)の位置は、炭素鎖に沿う任意の位置であってもよい。
本文脈では、用語「C2〜6アルキニル」は、2〜6個の炭素原子を含み、1つまたは複数の三重結合を含む、直鎖または分枝状の炭化水素基を意味するものとする。C2〜6アルキニル基の例示的な例には、アセチレン、プロピニル、ブチニル、ペンチニルおよびヘキシニルが含まれる。不飽和(三重結合)の位置は、炭素鎖に沿う任意の位置であってもよい。当分野の技術者に公知であるように、「C2〜6アルキニル」がジインまたはエンジインであるように、1つを超える結合が不飽和であってもよい。
--OHおよび--SH基の保護基の例には、4,4’-ジメトキシトリチロキシ(DMT)、4-モノメトキシトリチロキシ(MMT)などの置換されたトリチル;トリチロキシ、任意選択で置換された9-(9-フェニル)キサンテニロキシ(ピキシル)、任意選択で置換されたメトキシテトラヒドロ-ピラニロキシ(mthp);シリロキシ、例えばトリメチルシリロキシ(TMS)、トリイソプロピルシリロキシ(TIPS)、tert-ブチルジメチルシリロキシ(butyldimethylsilyloxy)(TBDMS)、トリエチルシリロキシ、フェニルジメチルシリロキシ; tert-ブチルエーテル;アセタール(2つのヒドロキシ基を含む);アシロキシ、例えばアセチルまたはハロゲン置換アセチル、例えばクロロアセチロキシまたはフルオロアセチロキシ、イソブチリロキシ、ピバロイロキシ、ベンゾイロキシおよび置換されたベンゾイル、メトキシメチロキシ(MOM)、ベンジルエーテルまたは置換されたベンジルエーテル、例えば2,6-ジクロロベンジロキシ(2,6-Cl2Bzl)が含まれる。さらに、ZまたはZ*がヒドロキシルである場合、それらは、任意選択でリンカーを通して、固体支持体への付着によって保護されてもよい。
上に示すように、化合物中のLNAモノマーの実際位置によって、ヌクレオシド間結合に役立つZおよびZ*は、独立に不在であるか、またはヌクレオシド間結合基、末端基および保護基からなる群から選択される。LNAモノマーが3’末端に位置する実施形態では、Zは末端基で、Z*はヌクレオシド間結合であることが理解されよう。LNAモノマーが5’末端に位置する実施形態では、Zは不在であり、Z*は末端基である。LNAモノマーがヌクレオチド配列内に位置する実施形態では、Zは不在であり、Z*はヌクレオシド間結合基である。
本発明での使用に適する他の適する末端基、保護基および特定のLNAモノマーの例は、例えば、米国特許出願公開第2007/0191294号およびその中の引用文献に見ることができる。
本発明で用いるための他のヌクレオチド類似体には、2’-メトキシ(2’-O--CH3)、2’-アミノプロポキシ(2’-OCH2CH2CH2NH2)、2’-アリル(2’--CH2-CH=CH2)、2’--O-アリル(2’-O--CH2-CH=CH2)および2’-フルオロ(2’-F)が含まれる。2’-修飾は、アラビノ(上)位置またはリボ(下)位置であることができる。好ましい2’-アラビノ修飾は、2’-Fである。類似した修飾をオリゴヌクレオチドの他の位置、特に3’末端ヌクレオチドまたは2’-5’結合オリゴヌクレオチドの糖の3’位置、および5’末端ヌクレオチドの5’位置に加えることもできる。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体(糖誘導体)を有することもできる。そのような類似体の作製および使用に関する開示については、例えば、米国特許第4,981,957号;第5,118,800号;第5,319,080号;第5,359,044号;第5,393,878号;第5,446,137号;第5,466,786号;第5,514,785号;第5,519,134号;第5,567,811号;第5,576,427号;第5,591,722号;第5,597,909号;第5,610,300号;第5,627,053号;第5,639,873号;第5,646,265号;第5,658,873号;第5,670,633号;第7,335,764号、第5,792,747号および第5,700,920号を参照。
本発明の範囲内のオリゴマーには、1つまたは複数の核酸塩基の修飾、置換および/または付加を有するものが含まれる。本明細書で用いるように、「未修飾の」または「天然の」核酸塩基には、プリン塩基アデニン(A)およびグアニン(G)、ならびにピリミジン塩基チミジン(T)、シトシン(C)およびウラシル(U)が含まれる。修飾核酸塩基には、他の合成および天然の核酸塩基、例えば、5-メチルシトシン(5-me-C)、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニル(--C≡C--CH3)ウラシルおよびシトシン、ならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、6-アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシル(偽ウラシル)、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシルおよび他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、2-F-アデニン、2-アミノ-アデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザアデニンならびに3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニンが含まれる。さらなる修飾核酸塩基には、三環式ピリミジン、例えばフェノキサジンシチジン(1H-ピリミド[5,4-b][1,4]ベンゾキサジン-2(3H)-オン)、フェノチアジンシチジン(1H-ピリミド[5,4-b][1,4]ベンゾチアジン-2(3H)-オン)、G-クランプ、例えば置換されたフェノキサジンシチジン(例えば9-(2-アミノエトキシ)-H-ピリミド[5,4-b][1,4]ベンゾキサジン-2(3H)-オン)、カルバゾールシチジン(2H-ピリミド[4,5-b]インドール-2-オン)、ピリドインドールシチジン(H-ピリド[3’,2’:4,5]ピロロ[2,3-d]ピリミジン-2-オン)が含まれる。修飾核酸塩基には、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環、例えば、7-デアザアデニン、7-デアザグアノシン、2-アミノピリジンおよび2-ピリドンで置換されたものを含めることもできる。さらなる核酸塩基には、米国特許第3,687,808号に開示のもの、The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering、858〜859頁、Kroschwitz, J. I.編、John Wiley & Sons、1990に開示のもの、Englischら、Angewandte Chemie、International Edition、1991、30、613頁に開示のもの、およびSanghvi, Y. S.、Chapter 15、Antisense Research and Applications、289〜302頁、Crooke, S. T.およびLebleu, B.編、CRC Press、1993に開示のものが含まれる。
多くの発明適用について、免疫系の望ましくない刺激を低減またはブロックするために、ヌクレオシド類似体が少なくともメチル化シトシンを含むオリゴマーを有することが好ましい。実施例のセクションを参照。
本発明の範囲内の追加のオリゴマーには、その中に少なくとも1つ(例えば、1、2、3または4個)の非環式ヌクレオチド、好ましくは3’,4”-セコヌクレオチド類似体、例えばNeilson, P.ら(1994) NAR 22:703頁およびNeilson, P.ら(1995) Bioorganic & Med. Chem. (1995) 19〜28頁に開示のものを有するものが含まれる。そのような非環式(acylic)ヌクレオチドのより具体的な例には、3’,4’-セコチミジン(セコ-RNA-チミジン)、3’4’-セコシトシン(セコ-RNA-シトシン)、3’,4’-セコアデニン(セコ-RNA-アデニン)および3’-4-セコグアニン(セコ-RNA-グアニン)が含まれる。3’4’-セコシトシン(セコ-RNA-シトシン)基の構造を、下に提供する:
3’,4’-セコ核酸を作製および使用するためのさらなる材料は、Ribotask A/S(Odense、DK)から得ることができる。理論に束縛されることを望まないが、セコ-RNAの使用は、少なくとも一部、siRNAなどの核酸の酵素的分解に依存するものを含む、本発明の特定の組成物の有用性を高める助けとなることができると考えられている。
上記の核酸塩基のあるものは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を高めるために有用であることができる。これらには、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジンおよびN-2、N-6およびO-6置換プリン、例えば、2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシトシンが含まれる。5-メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を0.6〜1.2℃増加させることが示され(Sanghvi, Y. S.、Crooke, S. T.およびLebleu, B.編、Antisense Research and Applications、CRC Press、Boca Raton、1993、276〜278頁)、現在、2’-O-メトキシエチル糖およびLNAなどの本明細書で開示される特定の他の修飾と組み合わせた場合、特により好ましい塩基置換である。例えば、米国特許第3,687,808号、第4,845,205号;第5,130,302号;第5,134,066号;第5,175,273号;第5,367,066号;第5,432,272号;第5,457,187号;第5,459,255号;第5,484,908号;第5,502,177号;第5,525,711号;第5,552,540号;第5,587,469号;第5,594,121号、第5,596,091号;第5,614,617号;第5,645,985号;第5,830,653号;第5,763,588号;第6,005,096号;第7,335,764号、第5,750,692号および第5,681,941号を参照。
上記の発明オリゴマーの1つまたは組合せを所与の適用で用いることはしばしば好ましいが、そのような組成物は、使用目的に合うように所望によりさらに修飾されてもよい。したがって一実施形態では、本発明の特定のオリゴマーは、オリゴヌクレオチドの活性、細胞内分布または細胞の取込みを高める、1つまたは複数の部分またはコンジュゲート体と化学的に連結されてもよい。したがって、本発明の化合物は、第一または第二のヒドロキシル基などの官能基に共有結合されるコンジュゲート基を含むことができる。本発明のコンジュゲート基には、インターカレータ、リポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を高める基およびオリゴマーの薬物動態特性を高める基が含まれる。一般的なコンジュゲート基には、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリンおよび色素が含まれる。本発明との関連で薬力学的特性を高める基には、オリゴマーの取込みを改善する基、オリゴマーの耐崩壊性を高める基、および/またはRNAとの配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基が含まれる。本発明との関連で薬物動態特性を高める基には、オリゴマーの取込み、分布、代謝または排出を改善する基が含まれる。代表的なコンジュゲート基は、例えば国際特許出願第PCT/US92/09196号に開示されている。コンジュゲート部分には、それらに限定されないが、脂質部分、例えば、コレステロール部分(Letsingerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1989、86、6553〜6556頁)、コール酸(Manoharanら、Bioorg. Med. Chem. Let.、1994、4、1053〜1060頁)、チオエーテル、例えばヘキシル-S-トリチルチオール(Manoharanら、Ann. N.Y. Acad. Sci.、1992、660、306〜309頁;Manoharanら、Bioorg. Med. Chem. Let.、1993、3、2765〜2770頁)、チオコレステロール(Oberhauserら、Nucl. Acids Res.、1992、20、533〜538頁)、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基(Saison-Behmoarasら、EMBO J.、1991、10、1111〜1118頁;Kabanovら、FEBS Lett.、1990、259、327〜330頁;Svinarchukら、Biochimie、1993、75、49〜54頁)、リン脂質、例えばジ-ヘキサデシル-ラック-グリセロールまたはトリエチルアンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-ラック-グリセロ-3-H-ホスホネート(Manoharanら、Tetrahedron Lett.、1995、36、3651〜3654頁;Sheaら、Nucl. Acids Res.、1990、18、3777〜3783頁)、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖(Manoharanら、Nucleosides & Nucleotides、1995、14、969〜973頁)、またはアダマンタン酢酸(Manoharanら、Tetrahedron Lett.、1995、36、3651〜3654頁)、パルミチル部分(Mishraら、Biochim. Biophys. Acta、1995、1264、229〜237頁)、あるいはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分(Crookeら、J. Pharmacol. Exp. Ther.、1996、277、923〜937頁)が含まれる。本明細書で開示されるアンチセンス化合物を含む本発明の化合物は、活性薬剤物質、例えばアスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、(S)-(+)-プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、2,3,5-トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾチアジアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメチシン(indomethicin)、バルビツール剤、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗細菌剤または抗生物質にコンジュゲートされてもよい。オリゴヌクレオチド-薬剤コンジュゲート体およびそれらの調製は、例えば米国特許出願第09/334130号(1999年6月15日に出願)に記載されている。そのような化合物の作製および使用に関する開示については、米国特許第4,828,979号;第4,948,882号;第5,218,105号;第5,525,465号;第5,541,313号;第5,545,730号;第5,552,538号;第5,578,717号、第5,580,731号;第5,580,731号;第5,591,584号;第5,109,124号;第5,118,802号;第5,138,045号;第5,414,077号;第5,486,603号;第5,512,439号;第5,578,718号;第5,608,046号;第4,587,044号;第4,605,735号;第4,667,025号;第4,762,779号;第4,789,737号;第4,824,941号;第4,835,263号;第4,876,335号;第4,904,582号;第4,958,013号;第5,082,830号;第5,112,963号;第5,214,136号;第5,082,830号;第5,112,963号;第5,214,136号;第5,245,022号;第5,254,469号;第5,258,506号;第5,262,536号;第5,272,250号;第5,292,873号;第5,317,098号;第5,371,241号、第5,391,723号;第5,416,203号、第5,451,463号;第5,510,475号;第5,512,667号;第5,514,785号;第5,565,552号;第5,567,810号;第5,574,142号;第5,585,481号;第5,587,371号;第5,595,726号;第5,597,696号;第5,599,923号;第5,599,928号、第7,335,764号および第5,688,941号も参照。
理解されるように、所与の化合物のすべての位置が一様に修飾されることは必ずしも必要でないかまたは望ましくない。前記の修飾の2つ以上を、単一の化合物に、またはオリゴヌクレオチドの中の単一のヌクレオシドにも組み込むことができる。本発明は、キメラ化合物であるオリゴマーも含む。例えば「キメラ」オリゴマー化合物、またはオリゴマー「キメラ」は、本発明との関連で、2つ以上の化学的に異なる領域を含み、オリゴヌクレオチド化合物の場合、その各々は少なくとも1つのモノマー単位、すなわちヌクレオチドまたはその類似体で構成される、アンチセンス化合物などのオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ分解耐性の増加、細胞の取込みの増加および/または標的核酸への結合親和性の増加をオリゴヌクレオチドに付与するようにオリゴヌクレオチドが修飾されている、少なくとも1つの領域を一般に含む。オリゴヌクレオチドの追加の領域は、RNA:DNAまたはRNA:RNAハイブリッドを切断することができる酵素の基質の役目を果たすことができる。例として、RNアーゼHは、RNA:DNA二重鎖のRNA鎖を切断する、細胞内エンドヌクレアーゼである。したがって、RNアーゼHの活性化は、RNA標的の切断をもたらし、それによって遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率を大きく高める。その結果、キメラオリゴヌクレオチドが用いられる場合、同じ標的領域とハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと比較して、より短いオリゴヌクレオチドで同等の結果をしばしば得ることができる。RNA標的の切断は、ゲル電気泳動によって、および必要に応じて当技術分野で公知である関連核酸ハイブリダイゼーション技術によって、常法により検出することができる。
本明細書で用いる用語「少なくとも1つ」は、1以上の整数、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17その他を含む。
本発明のキメラアンチセンス化合物は、上に述べたように2つ以上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび/またはオリゴヌクレオチド模倣体の複合構造物として形成されてもよい。そのような化合物は、当技術分野でハイブリッド、ウィングマー(wingmer)またはギャップマー(gapmer)とも呼ばれている。例えば、米国特許第5,013,830号;第5,149,797号;第5,220,007号;第5,256,775号;第5,366,878号;第5,403,711号;第5,491,133号;第5,565,350号;第5,623,065号;第5,652,355号;第5,652,356号;第5,700,922号、第7,335,764号および米国特許出願公開第2007/0191294号を参照。
この発明に従って用いられるオリゴマーは、固相合成の周知技術を通して都合よく、および型通りに作製することができる。そのような合成のための機器は、例えばApplied Biosystems (Foster City、Calif.)を含むいくつかのベンダーによって販売されている。当技術分野で公知であるそのような合成のための任意の他の手段を、さらに、または代わりに使用してもよい。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などのオリゴヌクレオチドを調製するために類似技術を用いることは、周知である。好ましくは、本発明によるオリゴマーはin vitroで合成され、生物起源の組成物、またはそのような組成物のin vivo合成を導くように設計された遺伝子ベクター構築物を含まない。一本鎖オリゴマーが、多くの発明適用のために好ましい。
述べたように、一部の発明実施形態では、その標的へのオリゴマーの親和性を高めることが有用である。これは、本明細書に開示の方法の1つまたは組合せによって達成することができる。一手法では、連続する核酸塩基配列は、2’-MOEおよびLNAモノマーを含む、本明細書に開示のものなどの少なくとも1つの親和性増強ヌクレオチド類似体を含む。少なくとも1つの親和性増強ヌクレオチド類似体を含むオリゴマーの一実施形態では、連続する核酸塩基配列は、合計約2、3、4、5、6、7、8、9または約10個の親和性増強ヌクレオチド類似体、例えば5〜8個の親和性増強ヌクレオチド類似体を含む。別の実施形態では、本発明のオリゴマーは、少なくとも1つの親和性増強ヌクレオチド類似体を含み、残りの核酸塩基は、DNAヌクレオチドまたはRNAヌクレオチドまたは本明細書に記載の非環式ヌクレオチドからなる群から選択される。
上記のオリゴマーのより具体的な実施形態では、オリゴマーは、5’〜3’方向に式A-B-C、および任意選択で式A-B-C-Dの核酸塩基の配列を含み、式中、
<<A>>は、少なくとも1つのヌクレオチド類似体、例えば1、2、3、4、5または6個のヌクレオチド類似体、例えば2〜5個のヌクレオチド類似体、例えば2、3または4個のヌクレオチド類似体、あるいは2、3または4個の連続的なヌクレオチド類似体からなるかまたはそれを含み、
<<B>>は、RNアーゼHを動員することができる少なくとも5つの連続的な核酸塩基からなるかそれをまたは含む(相補的RNA分子、例えば哺乳動物のC6標的、例えば配列番号1で表されるヒトC6核酸との二重鎖で形成される場合)。一実施形態では、RNアーゼHを動員することができる、5、6、7、8、9、10、11または12個の連続的な核酸塩基、または6〜10個、または7〜9個、例えばRNアーゼHを動員することができる8個の連続的な核酸塩基などのオリゴマーのDNA核酸塩基、および
<<C>>は、1、2、3、4、5または6個のヌクレオチド類似体、好ましくは2〜5個のヌクレオチド類似体、例えば2、3または4個のヌクレオチド類似体、最も好ましくは2、3または4個の連続的なヌクレオチド類似体などの、少なくとも1つのヌクレオチド類似体からなるかまたはそれを含み、
<<D>>が存在する場合、それは、1つまたは複数のDNAヌクレオチド、例えば1〜3個または1〜2個のDNAヌクレオチドからなるかまたはそれを含み、好ましくはそれらからなる。
前述の組成物の一実施形態では、オリゴマーは、A、B、CまたはDの少なくとも1つに少なくとも1つの非環式ヌクレオチドを、好ましくは領域Bに同上の1、2、3または4つ、例えば約1つまたは約2つの非環式ヌクレオチドをさらに含む。好ましくは、非環式ヌクレオチドは、上に記載の3’,4’-セコチミジン(セコ-RNA-チミジン)、3’4’-セコシトシン(セコ-RNA-シトシン)、3’,4’-セコアデニン(セコ-RNA-アデニン)および3’-4-セコグアニン(セコ-RNA-グアニン)からなる群から選択される。
一実施形態では、領域Aは、2、3または4個の連続的なヌクレオチド類似体からなるかまたはそれらを含む。さらに、Bは、相補的RNA、例えば哺乳動物のC6核酸標的との二重鎖で形成される場合、RNアーゼHを動員することができる約7、8、9または約10個の連続的なDNAヌクレオチドまたは同等の核酸塩基からなることまたはそれらを含むことができる。また、上記のオリゴマーのCは、約2、3または約4個の連続的なヌクレオチド類似体からなることまたはそれらを含むことができる。領域Dは、上に規定する通り、存在する場合、1、2個のDNAヌクレオチドからなることができる。したがって、一実施形態では、上で定義されるように、領域Aは3つの連続するヌクレオチド類似体からなるかまたはそれらを含み;上で定義されるように、Bは、相補的RNA、例えば哺乳動物のC6標的との二重鎖で形成される場合、RNアーゼHを動員することができる約7、8、9または約10個の連続的なDNAヌクレオチドまたは同等の核酸塩基からなるかまたはそれらを含み;上で定義されるように、Cは約3つの連続するヌクレオチド類似体からなるかまたはそれらを含み;領域Dは、存在する場合、1、2個のDNAヌクレオチドからなる。
上記のオリゴマーの特定の実施形態では、連続する核酸塩基配列は、約10、11、12、13または約14個の核酸塩基からなり、ここで、領域Aは、約1、2または約3個の連続するヌクレオチド類似体からなり;領域Bは、相補的RNA、例えば哺乳動物のC6核酸標的との二重鎖で形成される場合、RNアーゼHを動員することができる約7、8または約9個の連続的なDNAヌクレオチドまたは同等の核酸塩基からなり;領域Cは、約1、2または約3個の連続するヌクレオチド類似体からなり;領域Dは、存在する場合、1つのDNAヌクレオチドからなる。
多くの発明適用のために、領域Bが少なくとも1つのLNAモノマー(核酸塩基)を含むオリゴマーを有することが一般に好ましい。例えば、そのようなLNAは、α-L-オキシLNAなどのα-L配置であることができる。さらに適するヌクレオチド類似体(上で定義される領域A、B、CおよびDの1つまたはすべてであるかどうかにかかわらず)は、以下からなる群から独立にまたは集団で選択される:ロック核酸(LNA)単位; 2’-O-アルキル-RNA単位、2’-OMe-RNA単位、2’-アミノ-DNA単位、2’-フルオロ-DNA単位、PNA単位、HNA単位およびINA単位。好ましい発明実施形態では、ヌクレオチド類似体はLNAモノマーを含み、より好ましくはそれらからなる。
特定のオリゴマーが少なくとも1つのLNAモノマー(単位と呼ばれることもある)を含む発明実施形態では、一般に約1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個のLNA単位、例えば2〜8個のヌクレオチドLNA単位が有用である。特定の発明適用のためには、オキシ-LNA、チオ-LNA、[β]-D-オキシ-LNAおよびアミノ-LNAから選択されるものを含む、β-Dおよびα-L配置またはそれらの組合せのいずれかの、他のLNAモノマーが有用となる。一実施形態では、オリゴマーのすべてのLNAモノマーは、[β]-D-オキシ-LNAである。したがって特定の発明実施形態では、領域AおよびCのヌクレオチド類似体または核酸塩基は、[β]-D-オキシ-LNAである。
指摘したように、また特定の適用のために、少なくとも1つの修飾核酸塩基を含むオリゴマーを有することが有用となる。一実施形態では、修飾核酸塩基は、5-メチルシトシン、イソシトシン、偽イソシトシン、5-ブロムウラシル、5-プロピニルウラシル、6-アミノプリン、2-アミノプリン、イノシン、ジアミノプリンおよび2-クロロ-6-アミノプリンからなる群から選択される。
本発明の実施は、本明細書に開示される異なるオリゴマーの1つまたは組合せの使用に適合する。例えば、および一実施形態では、発明は、対応する哺乳動物のC6核酸(例えば、mRNA)と、少なくとも40℃、例えば少なくとも50℃のTmでハイブリダイズする。特定の実施形態では、オリゴマーは、対応する哺乳動物のC6核酸(例えば、mRNA)と、90℃以下、例えば80℃以下のTmでハイブリダイズする。
ほとんどの発明実施形態では、前に記載の修飾骨格を有するオリゴマーが、特にin vivoでの使用に一般に好ましい。一実施形態では、ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびボラノホスフェートからなる群から独立に選択される。特定の実施例では、オリゴマーは少なくとも1つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。ヌクレオシド間結合は、DNAまたはRNA単位に隣接して、もしくはそれらの間に、または領域B(上に述べたように)の中にあることができ、ホスホロチオエート結合である。発明オリゴマーの一例では、少なくとも1対の連続的ヌクレオチド類似体は、ホスホジエステル結合である。一部の実施形態では、連続的ヌクレオチド類似体間のすべての結合は、好ましくはホスホジエステル結合であり、例えばすべてのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合であってもよい。
本発明によるより具体的なオリゴマーには、表4A〜4Eおよび表5A〜5Fに示し、上で言及した好ましい標的部位を標的にするものが含まれる。そのようなオリゴマーは、約10〜約20個のヌクレオチド、例えば約12〜約18個のヌクレオチドから一般になり、そこの骨格は完全または部分的にホスホロチオール化されている。さらに好ましいオリゴマーは、好ましくはオリゴマーの3’および5’末端に置かれる、約1〜約6(6)個のLNAモノマーをさらに含む。より具体的なオリゴマーは、各末端に置かれるそのようなLNAモノマー(すなわち、ウィングマーまたはギャップマー)の約2個または3個を含む。
少なくとも1つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分が共有結合で前記化合物に結合している前記オリゴマーのいずれも想定される。例には、上で指摘した基が含まれる。
本発明の追加のオリゴマーは、下の実施例および表で提供する。
二本鎖化合物
指摘するように、本発明は、パッセンジャー鎖、および哺乳動物の補体成分6(C6)タンパク質、例えば本明細書で提供されるヒト、ラットおよびマウスの配列をコードする核酸分子を標的にしたアンチセンス鎖を含む二本鎖化合物も提供する。一実施形態では、各鎖は、約12〜約35個の核酸塩基、好ましくは約12〜約30個のヌクレオチド、より好ましくは約14〜約25個のヌクレオチドを含み、多くの適用のためには約15〜約20個のヌクレオチド(例えば、18または19個のヌクレオチド)が好ましい。好ましくは、アンチセンス鎖は、配列番号1(ヒト)、402(ラット)または403(マウス)によって表される補体成分6(C6)配列、またはその天然に存在する対立遺伝子変異体をコードする核酸の対応する領域に、少なくとも約80%、85%、90%、95%、98%、99%、最大約100%の配列同一性を有する連続した核酸塩基配列からなる。また、好ましくは、オリゴマーは、LNAモノマーなどの少なくとも1つのオリゴヌクレオチド類似体を含む。
本発明による好ましい二本鎖化合物は、本明細書で開示されるオリゴマーの1つまたは組合せを用いて作製することができる。より好ましいオリゴマーは、例えば表4A〜4Eおよび表5A〜5Fに関してすでに述べたそれらの好ましい標的部位を標的にするように設計される。二本鎖化合物で用いるためのさらに好ましいオリゴマーは、本明細書、特に実施例のセクションに記載の動物試験によって判定される場合、基本的に無毒性である。そのようなオリゴマーは、アッセイによって、C6mRNA発現を低減させる良好な能力をさらに示すことができる。
二本鎖化合物の一実施形態では、パッセンジャー鎖およびアンチセンス鎖の1つまたは両方は、前に記載の、ホスホロチオエート結合などの少なくとも1つの修飾ヌクレオシド間結合(オリゴヌクレオチド骨格)を含む。特定の実施形態では、パッセンジャー鎖およびアンチセンス鎖のヌクレオシド間結合のすべては、ホスホロチオエート結合である。一般的に、パッセンジャー鎖は、少なくとも1つのLNAモノマー、例えば約1〜約10個のLNAモノマー(例えば2、3、4、5、6、7、または9個のLNAモノマー)をさらに含む。一実施形態では、少なくとも1つのLNAモノマーは、パッセンジャー鎖の5’末端に位置し、例えば少なくとも2つのLNAモノマーは、パッセンジャー鎖の5’末端に位置する。あるいは、またはさらに、少なくとも1つのLNAモノマーは、パッセンジャー鎖の3’末端に位置し、例えば少なくとも2つのLNAモノマーは、パッセンジャー鎖の3’末端に位置する。二本鎖化合物のさらなる実施形態は、アンチセンス鎖が少なくとも1つのLNAモノマー、例えば約1〜約10個のLNAモノマー(例えば2、3、4、5、6、7、または9個のLNAモノマー)を含む構築物を含む。一発明実施例では、少なくとも2つのLNAモノマーがアンチセンス鎖の3’末端に位置し、例えば少なくとも3つのLNAモノマーがアンチセンス鎖の3’末端に位置する実施形態など、化合物の少なくとも1つのLNAモノマーはアンチセンス鎖の3’末端に位置する。しかし、他の実施形態では、1個またはゼロ(0)個のLNAモノマーがアンチセンス鎖の5’末端に位置することが有益のことがある。本発明の二本鎖化合物は、パッセンジャー鎖が少なくとも1つのLNAを含み、アンチセンス鎖が少なくとも1つのLNAモノマーを含む、例えば約1〜約10個のLNAモノマー(例えば2、3、4、5、6、7、または9個のLNAモノマー)を含み、アンチセンス鎖が約1〜約10個のLNAモノマー(例えば2、3、4、5、6、7、または9個のLNAモノマー)を含む構築物を含む。
第一のオリゴマー(パッセンジャー鎖)および第二のオリゴマー(アンチセンス鎖)を含んでいる前述の二本鎖化合物の一実施形態では、アンチセンス鎖が3’末端に少なくとも1つのLNAモノマーを含む実施形態など、パッセンジャー鎖は、5’末端に少なくとも1つのLNAモノマー(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個のLNAモノマー)、および3’末端に少なくとも1つのLNAモノマー(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個のLNAモノマー)を含む。例として、パッセンジャー鎖は、5’末端に少なくとも1つのLNAモノマー(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個のLNAモノマー)、および3’末端に少なくとも1つのLNAモノマー(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個のLNAモノマー)を含む。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は3’末端に少なくとも2つのLNAモノマーを含む。特定の実施形態では、パッセンジャー鎖は5’末端に少なくとも2つのLNAモノマーおよび3’末端に少なくとも2つのLNAモノマーを含み、例えば、アンチセンス鎖は3’末端に少なくとも2つのLNAモノマーを含むことができる。したがって特定の発明実施形態では、パッセンジャー鎖は5’末端に少なくとも2つのLNAモノマーおよび3’末端に少なくとも2つのLNAモノマーを含み、例えば、アンチセンス鎖は3’末端に少なくとも3つのLNAモノマーを含む。しかし、特定の発明実施形態では、1個またはゼロ(0)個のLNAモノマーがアンチセンス鎖の5’末端に位置することが有益である。
好ましい実施形態では、組成物中のTは、U(T=>U)によって置換される。しかし、LNAモノマーのいくつかまたは好ましくはすべてについては、TはUによって置換されず、すなわちT=Tである。
パッセンジャー鎖が、5’末端から順番に数えて9〜13位の少なくとも1つに少なくとも1つのLNAモノマーを含むものを含む、より具体的な二本鎖組成物が本発明の範囲内である。例えば、パッセンジャー鎖は、5’末端から順番に数えて10位にLNAモノマーを含むことができる。あるいは、またはさらに、パッセンジャー鎖は、その中の11位および/または12位にLNAモノマーを含むことができる。
二本鎖化合物の特定の実施形態では、その中の第一および第二のオリゴマー(パッセンジャーおよびアンチセンス鎖)は、各々約17〜約25個のヌクレオチド、例えば18〜約24個のヌクレオチド、約19〜約23個のヌクレオチドおよび約20〜約22個のヌクレオチドを含む。
発明目的を達成することを所望の場合、パッセンジャーおよびアンチセンス鎖の各々は、3’オーバーハングを独立に含むことができる。あるいは、またはさらに、化合物は、その中に位置する少なくとも1つ(例えば1、2、3、4または5個)の非環式ヌクレオシド、例えばセコ-RNA-チミジン、セコ-RNA-シトシン、セコ-RNA-アデニンおよびセコ-RNA-グアニンを含むことができる。一実施形態では、非環式ヌクレオチドは、パッセンジャー鎖の上に位置する。別の実施形態では、非環式ヌクレオチドは、化合物のアンチセンス鎖の上に位置する。
一発明実施形態では、第一のオリゴマー、第二のオリゴマーまたは両方の核酸塩基は、配列番号222、225、228、231、234、237、240、243、246および249(表4A〜4Eを参照)によって例示される標的、ならびに各標的の下に示すそのRNAおよび逆相補バージョンとハイブリダイズするように設計される。ラットおよびマウスのC6は、同一であるかまたは非常に類似した標的部位を有すると予想される。二本鎖化合物の構成要素として用いるためのそのような特異オリゴマーの群には、例えば糖基、核酸塩基またはヌクレオシド間結合の1つまたは複数が、本明細書に開示のように修飾されているこれらの配列の誘導体が含まれる。特定の修飾は、ホスホロチオエート結合および少なくとも1つのLNAモノマーを含むかまたは事実上それらからなるように、配列を修飾することを含む。
したがって、および一実施形態では、二本鎖化合物は、すべてのホスホロチオエート結合およびアンチセンス鎖の3’末端の約1、2または3個のLNAモノマー、例えば同上の2つを特徴とする。一実施形態では、パッセンジャーまたはパッセンジャー鎖は、パッセンジャー鎖の5’末端の1、2または3個のLNAモノマー、例えば同上の2つを含む。
一部の発明実施形態では、例えば鎖間のより強いハイブリダイゼーションが望ましい場合、LNAモノマーでより多くの置換を有することが有益なことがある。したがって、一実施形態では、二本鎖化合物は、すべてのホスホロチオエート結合およびアンチセンス鎖の3’末端の約1、2または3個のLNAモノマー、例えば同上の2つを特徴とする。パッセンジャー鎖は、パッセンジャー鎖の5’末端の1、2または3個のLNAモノマー、例えば同上の2つを含む。しかし一実施形態では、パッセンジャー鎖は、パッセンジャー鎖の3’および5’末端の間に、例えば5’末端(1位)3’オーバーハング位置と比較して3、9、13および15の位置に、追加の1、2、3、4または5個のLNAモノマーを含む。
目的の結果が達成されるならば、本明細書ですでに開示されている二本鎖化合物の他の実施形態が可能である。例えば、二本鎖化合物のパッセンジャー鎖およびアンチセンス鎖の両方は、ホスホジエステルヌクレオチド間結合を含むことまたはそれらから事実上なることができる。しかし、他の実施形態では、パッセンジャー鎖もしくはアンチセンス鎖に、または両方の鎖に少なくとも1つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合、例えば約1〜約19個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合(例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18または19個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合)を有することが有益なことがある。本発明のこの実施例では、パッセンジャー鎖の5’末端から数えて9-10-11位は、修飾されていない。二本鎖化合物の追加の実施形態は、パッセンジャー鎖が、パッセンジャー鎖の3’末端に位置する少なくとも2個、最高7個のLNAモノマー、例えば少なくとも2個のLNAモノマーを含む構築物を含む。あるいは、またはさらに、少なくとも1つのLNAモノマーがパッセンジャー鎖の5’末端に位置する。あるいは、またはさらに、少なくとも1個、または最高4個のLNAモノマーが、パッセンジャー鎖の5’末端から数えて3、9、13または15位に位置する。二本鎖化合物のさらなる実施形態は、アンチセンス鎖が少なくとも1つのLNAモノマー、例えば約1〜約3個のLNAモノマー(例えば2、3個のLNAモノマー)を含む構築物を含む。一発明実施例では、少なくとも2つのLNAモノマーがアンチセンス鎖の3’末端に位置し、例えば少なくとも3つのLNAモノマーがアンチセンス鎖の3’末端に位置する実施形態など、化合物の少なくとも1つのLNAモノマーは、アンチセンス鎖の3’末端に位置する。しかし、他の実施形態では、1個またはゼロ(0)個のLNAモノマーがアンチセンス鎖の5’末端に位置することが有益のことがある。
例えば、以下の構造が可能であり(太字、下線付きのL=LNA、r=RNA):
ここで、構造に関して、化合物は、少なくとも1つの任意選択のホスホロチオエートを含むことができ、例えばそれらは完全にホスホロチオール化(phosphorothiolayted)されてもよい。C残基が存在する場合、in vivo適用のために用いられる場合に免疫応答を低下または消滅させるために、追加の化合物は任意選択のメチルCを含むことができる。本明細書で述べる他の修飾が可能である。
より具体的な発明実施形態では、以下の構造が可能であり、式中、LNAは太字の下線付きテキストで表される:
使用目的などのパラメータによって、他の実施形態が可能である。
理論に束縛されることを望むことなく、一部の例では、本発明の特定の二本鎖化合物は、その中に少なくとも1個の非環式ヌクレオチド類似体、好ましくはアンチセンスおよびパッセンジャー鎖の1つまたは両方に置かれる同上の1、2、3または4個を有することが有益なことがあると考えられている。好ましい非環式ヌクレオチドは、本明細書に開示の3’,4’-セコヌクレオチド、より好ましくは3’,4’-セコチミジン(セコ-RNA-チミジン)、3’4’-セコシトシン(セコ-RNA-シトシン)、3’,4’-セコアデニン(セコ-RNA-アデニン)および3’-4-セコグアニン(セコ-RNA-グアニン)である。一実施形態では、アンチセンス鎖は、好ましくは3’および5’末端の間、例えば3’末端から約3〜約20個のヌクレオチド、好ましくは3’末端から約5〜約19個のヌクレオチドに位置する1つの非環式ヌクレオチドを含む。一実施形態では、アンチセンス鎖は、1、2または3個のLNAモノマー、例えば3”末端に位置する同上の2個をさらに含む。パッセンジャー鎖は、一実施形態では、3’末端の1、2または3個の非環式ヌクレオチド、好ましくは同上の1個を含む。
一実施形態では、以下の化合物が可能であり(太字の下線付きのL=LNA、r=RNA、下線付きイタリックのS=セコ):
ここで、化合物は、少なくとも1つの任意選択のホスホロチオエートを含むことができ、例えばそれは完全にホスホロチオール化されてもよい。C残基が存在する場合、in vivo適用のために用いられる場合に免疫応答を低下または消滅させるために、追加の化合物は任意選択のメチルCを含むことができる。本明細書で述べる他の修飾が可能である。
したがって一実施形態では、以下の化合物が本発明の範囲内であり、式中、下線付き/イタリック体のテキストはセコ誘導体であり、太字の下線付きテキストはLNAである:
特定の発明化合物は、少なくとも1つのLNAモノマーを有する化合物を広義に表すために、本明細書で「siLNA」と呼ぶこともある。本明細書で用いるように、用語「siRNA」は、RNAまたは修飾RNAモノマーの二本鎖を指す。一般的なsiRNA化合物では、2つの鎖はお互いに相補的な約19個のヌクレオチドを通常有し、それによって、長さが約19ヌクレオチドで各鎖が2つのオーバーハングヌクレオチドの3’末端を有する二本鎖を形成する。本発明のsiRNAはわずかにより長いかまたはより短いことがあり、オーバーハングが有るかまたは無いことが理解されよう。特定のsiRNA構築物の選択は、使用目的などの認識されるパラメータによって決まる。siRNAでは、1つのオリゴマー鎖は誘導性で、標的RNA(アンチセンス鎖)に相補的であり、他のオリゴマー鎖(パッセンジャー鎖)は標的RNAと同じ配列を有し、したがって誘導性/アンチセンス鎖に相補的である。本明細書では、「マイクロRNA」(「miRNA」)および「短いRNA」(「shRNA」)などの調節RNA、ならびにtRNA、snRNA、scRNA、rRNAなどの様々な構造的RNAは、用語「siRNA」で互換的に用いられる。用語「mRNA」は、標的遺伝子の現在既知のmRNA転写産物、および同定できる任意のさらなる転写産物を意味する。
本発明によるそのような二本鎖化合物は、少なくとも1つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分にコンジュゲートする(すなわち、共有結合する)ことができる。例には、前に記載のものが含まれる。
理解されるように、in vitroまたはin vivoで安定であるために、siLNAまたはsiRNA化合物の配列はその標的核酸に100%相補的である必要はない。したがって、用語「相補的」および「特異的にハイブリダイズ可能」は、標的外のmRNAの機能に影響せずに標的の正常な機能の所望の妨害を提供するために、siLNAまたはsiRNA化合物が、標的分子に十分に強く、特異的に結合することを意味する。
不連続鎖RNA複合体
別の態様では、本発明は、一般的にRNAまたはその1つまたは複数のオリゴヌクレオチド類似体を含むかまたはそれらからなる核酸複合体、および好ましくは薬学的に許容される希釈剤、担体またはアジュバントを含む組成物を提供する。一実施形態では、複合体は、配列番号1(ヒト)、402(ラット)または403(マウス)によって表される補体成分6(C6)配列、またはその天然に存在する対立遺伝子変異体をコードする核酸の対応する領域に、少なくとも約80%の配列同一性、少なくとも約85%、90%、95%、98%、99%、最大約100%の配列同一性を有する連続した核酸塩基配列からなるアンチセンス鎖を含む、コアの二本鎖領域を含む。好ましい複合体は少なくとも1つのオリゴヌクレオチド類似体を含み、RNA複合体は、アンチセンス鎖と一般にハイブリダイズする不連続なパッセンジャー鎖をさらに含む。ほとんどの適用について、不連続なパッセンジャー鎖は、ニックまたはギャップまたはリンカーまたは本明細書に記載の他のそのような割込みなどの不連続部を含む。
上記の一実施形態では、RNA複合体は、対応する標的核酸の核酸修飾を媒介することが一般にできる。好ましくは、核酸修飾は、RNA干渉、遺伝子サイレンシング、遺伝子抑制、翻訳停止、翻訳阻害、RNA分解、RNA切断およびDNAメチル化からなる群の1つまたは複数から選択される。一般的なRNA複合体は標的RNAの分解を媒介するか、または標的RNAの翻訳阻害、または両方の組合せを媒介する。
本発明の特定のRNA複合体では、コア二本鎖領域は、約15〜約40個の塩基対、例えば18塩基対、19塩基対、20塩基対、21塩基対、22塩基対および23塩基対を含む。一実施形態では、RNA複合体は、1つまたは複数のオーバーハング、例えば1、2個のオーバーハングを含む。オーバーハングの例は、3’-オーバーハングである。一実施形態では、RNA複合体のパッセンジャーは、3’-オーバーハングを含む。
様々なオーバーハング長が本発明に適合するが、一般に、オーバーハングの長さは約1〜約8ヌクレオチド、例えば1ヌクレオチド、2ヌクレオチドおよび3ヌクレオチドである。適合するRNA複合体は、両端が平滑なものを含む、少なくとも1つの平滑末端を含むことができる。RNA複合体の長さは、約18〜約22個の塩基対を含む、目的の結果を達成するのに十分なほとんどいかなる長さであることもできる。この実施形態では、アンチセンス鎖およびパッセンジャー鎖が、約1〜約3ヌクレオチドの3’-オーバーハングを各々含むことが好ましい。
指摘するように、本発明の特定のRNA複合体は不連続なパッセンジャー鎖を含む。一実施形態では、複合体は少なくとも第一および第二のRNA分子を含み、それらは一緒に、任意選択で1つまたは複数のさらなるRNA分子と、不連続なパッセンジャー鎖を形成する。好ましくは、第一のRNA分子はアンチセンス鎖の下流部分とハイブリダイズし、第二のRNA分子はアンチセンス鎖の上流部分とハイブリダイズする。一実施形態では、パッセンジャー鎖は約1〜約4個のさらなるRNA分子を含み、それらは好ましくは、第一および第二のRNA分子と一緒に不連続なパッセンジャー鎖を形成する。別の実施形態では、パッセンジャー鎖は、第一および第二のRNA分子だけを含み、例えばさらなるRNA分子を含まない。
パッセンジャー鎖の上の不連続部は、例えば1つまたは複数のニックによって形成することができ、ここで、パッセンジャー鎖の少なくとも第一および第二のRNA分子、任意選択でさらなるRNA分子はそれによって分離される。しかし所望の場合、パッセンジャー鎖の少なくとも第一および第二のRNA分子および任意選択で前記さらなるRNA分子は、以下からなる群から選択されるものなどの、1つのギャップ、または任意選択で複数のギャップによって分離される:1ヌクレオチドギャップ、2ヌクレオチドギャップ、3ヌクレオチドギャップ、4ヌクレオチドギャップ、5ヌクレオチドギャップ、6ヌクレオチドギャップ、7ヌクレオチドギャップ、8ヌクレオチドギャップ、9ヌクレオチドギャップ、l0ヌクレオチドギャップ、11ヌクレオチドギャップおよび12ヌクレオチドギャップ。不連続部がリンカーに関係する実施形態では、パッセンジャー鎖の第一のRNA分子は、リンカーによってアンチセンス鎖に連結されてもよい。一実施形態では、リンカーは、パッセンジャー鎖の第一のRNA分子の5’末端をアンチセンス鎖の3’末端に連結する。別の実施形態では、パッセンジャー鎖の第二のRNA分子は、リンカーによってアンチセンス鎖に連結されてもよい。所望により、リンカーは、パッセンジャー鎖の第二のRNA分子の3’末端をアンチセンス鎖の5’末端に連結することができる。パッセンジャー鎖の少なくとも第一および第二のRNA分子、および任意選択でパッセンジャー鎖の前記さらなるRNA分子は、リンカーによって、または任意選択で複数のリンカーによって連結されてもよい。一本鎖RNAリンカーでないそれらなどの様々なリンカーが、本発明に適合する。
RNA複合体の一部の発明実施形態では、アンチセンス鎖はパッセンジャー鎖に共有結合しない。所望により、不連続なパッセンジャー鎖を形成するRNA分子は、不連続なパッセンジャー鎖を形成するいかなる他のRNA分子にも共有結合しない。
本発明による特定のRNA複合体は、3つの非結合RNA分子、すなわちアンチセンス鎖、および一緒に不連続のパッセンジャー鎖を形成する第一および第二のRNA分子を特徴とする。一実施形態では、不連続のパッセンジャー鎖は、位置3、位置4、位置5、位置6、位置、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21、位置22、位置23、位置24、位置25の群から選択される位置に不連続部を有する。好ましくは、その位置は、パッセンジャー鎖中の、アンチセンス鎖と塩基対を形成しているパッセンジャー鎖の第一のヌクレオチドから5’〜3’方向に計算される。
一部の発明実施形態については、RNA複合体の5末端がリン酸化されるか、またはリン酸化が可能であるRNA複合体を有することが有益である。一実施形態では、第一のRNA分子は、5’末端リン酸基および3’末端ヒドロキシ基を含む。別の実施形態では、第二のRNA分子は、5’末端リン酸基および3’末端ヒドロキシ基を含む。特定の実施形態では、不連続なパッセンジャー鎖を形成するすべてのRNA分子は、各々5’末端リン酸基および3’末端ヒドロキシ基を含む。
本明細書で開示されるものなどの少なくとも1つのヌクレオチド類似体を含むか、または場合によってはそれからなるRNA複合体を有することが、しばしば有益である。一実施形態では、RNA複合体のパッセンジャー鎖は、少なくとも1つのヌクレオチド類似体、例えば2〜10個のヌクレオチド類似体を含む。あるいは、またはさらに、パッセンジャー鎖の第一のRNA分子は、1つまたは複数のヌクレオチド類似体、例えば少なくとも2つのヌクレオチド類似体を含む。あるいは、またはさらに、パッセンジャー鎖の第二のRNA分子は、1つまたは複数のヌクレオチド類似体、例えば少なくとも2つのヌクレオチド類似体を含む。
RNA複合体がヌクレオチド類似体を含む実施形態では、類似体の位置は、好ましくは第一および/または第二のRNA分子の3つの末端(5’または3’それぞれ(respectfully))核酸塩基単位の中である。あるいは、またはさらに、パッセンジャー鎖のさらなるRNA分子のうちの少なくとも1つは、少なくとも1つのヌクレオチド類似体を含む。例えば、不連続なパッセンジャー鎖の一部を形成する各さらなるRNA分子は、少なくとも1つのヌクレオチド類似体を、例えばパッセンジャー鎖の5’末端から数えて位置10および12に含む。一実施形態では、不連続なパッセンジャー鎖の一部を形成する各RNA分子は、少なくとも1つのヌクレオチド類似体、例えば少なくとも2つのヌクレオチド類似体を含む。
一実施形態では、パッセンジャー鎖は、パッセンジャー鎖の3’および5’末端の間に、例えば5’末端(1位)および3’オーバーハング位置と比較して3、9、13および15の位置に、追加の1、2、3、4または5個のLNAモノマーを含む。しかし本発明のこの例では、パッセンジャー鎖は、例えば、位置10および11の間で2つの部分に分割される。したがって一実施形態では、パッセンジャー鎖の各部分は、少なくとも1つのLNAモノマー、例えば同上の1、2、3、4、5、6または7個、より好ましくは同上の5または6個を含み、そのうち1、2または3個、または4個のLNAモノマーはパッセンジャー鎖の1つに位置し、残りのモノマーは他の鎖に位置する。
望ましい融点特性を有するRNA複合体を作製、使用することが、しばしば有益である。したがって一実施形態では、ホスホジエステル結合による相補的RNA分子との二重鎖で形成される場合、不連続なパッセンジャー鎖を形成する第一、第二の、および任意選択でさらなるRNA分子の各々の融点(Tm)は、少なくとも40℃である。
本発明のRNA複合体の好ましい長さは、使用目的によって導かれる。したがって一実施形態では、不連続なパッセンジャー鎖を形成する第一、第二の、および任意選択でさらなるRNA分子の各々の長さは、少なくとも3核酸塩基単位である。一実施形態では、アンチセンス鎖が不連続なパッセンジャー鎖で形成される二重領域の中で少なくとも1つのヌクレオチド類似体を含む例など、アンチセンス鎖は少なくとも1つのヌクレオチド類似体を含む。あるいは、またはさらに、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の3’末端から数えて4核酸塩基内である位置に、少なくとも1つのヌクレオチド類似体を含む。一実施形態では、アンチセンス鎖の最も5’寄りの約9個の核酸塩基単位に存在する核酸塩基の少なくとも1つは、ヌクレオチド類似体である。別の実施形態では、アンチセンス鎖の3’末端から4〜10核酸塩基内の領域に存在する核酸塩基の少なくとも1つは、ヌクレオチド類似体である。さらに別の実施形態では、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5’末端からの位置11にヌクレオチド類似体を有する。さらに別の実施形態では、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5’末端からの位置10および12にRNAヌクレオチドを有する。他の実施形態では、アンチセンス鎖の最も5’寄りの核酸塩基単位は、RNAヌクレオチド単位である。あるいは、またはさらに、アンチセンス鎖は、少なくとも2つのヌクレオチド類似体を含む。
多種多様なヌクレオチド類似体が、本発明に適合する。一般的に、適する類似体は、RNA複合体のA形またはA/B形の立体構造の形成に適合するか、または適合することが疑われるものである。例示的な類似体には、2’-O-アルキル-RNAモノマー、2’-アミノ-DNAモノマー、2’-フルオロ-DNAモノマー、LNAモノマー、アラビノ核酸(ANA)モノマー、2’-フルオロ-ANAモノマー、HNAモノマー、INAモノマーからなる群が含まれる。好ましいヌクレオチド類似体は不連続なパッセンジャーおよび/またはアンチセンス鎖に存在し、本明細書ですでに開示されているものなどの、少なくとも1つのLNAモノマーからなる。あるいは、またはさらに、不連続なパッセンジャーおよび/またはアンチセンス鎖に存在するヌクレオチド類似体は、少なくとも1つの2’-MOE-RNA(2’-O-メトキシエチル-RNA)単位または2’フルオロDNA単位、例えば、2’-MOE-RNA(2’-O-メトキシエチル-RNA)単位または2’フルオロDNA単位から独立に選択される約1〜約25単位を含む。
指摘するように、少なくとも1つのヌクレオチドが少なくとも1つのLNA単位で置換されるRNA複合体を有することが、しばしば有益である。一実施形態では、1つまたは複数のLNA単位は、D-βおよびL-α配置のいずれかまたはそれらの組合せの、オキシ-LNA、チオ-LNAおよびアミノ-LNAからなる群から独立に選択される。所望により、アンチセンス鎖に存在するヌクレオチド類似体は、少なくとも1つのLNA単位を含み、および/または、パッセンジャー鎖に存在するヌクレオチド類似体は少なくとも1つのLNA単位を含む。一実施形態では、アンチセンス鎖に存在するヌクレオチド類似体は、LNA単位である。あるいは、またはさらに、パッセンジャー鎖に存在するすべてのヌクレオチド類似体は、LNA単位である。様々な好ましいLNAモノマーが、上に開示されている。
本明細書に記載のRNA複合体の多くの実施形態では、不連続なパッセンジャー鎖に存在するヌクレオチド類似体の少なくとも1つは、アンチセンス鎖に存在する相補的ヌクレオチド類似体と塩基対を形成する。一実施形態では、パッセンジャー鎖はいかなるヌクレオチド類似体も含まず、および/または、別の実施形態では、アンチセンス鎖はいかなるヌクレオチド類似体も含まない。別の実施形態では、アンチセンス鎖および不連続な鎖は、約18〜約22塩基対の相補的二重鎖を形成する。一実施形態では、二重鎖はミスマッチを含むことができる。
一実施形態では、アンチセンス鎖またはパッセンジャー鎖(または、別個の実体として、もしくはRNA複合体中のヌクレオチド類似体を合わせた合計としてその両方)に存在するヌクレオチド類似体の数は、以下からなる群から選択される:少なくとも1つのヌクレオチド類似体、例えば少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24および少なくとも25個のヌクレオチド類似体。好適には、ヌクレオチド類似体の数は、20未満、例えば18未満、例えば16未満、例えば14未満、例えば12未満、例えば10未満であることができる。
一実施形態では、不連続のパッセンジャー鎖(またはアンチセンス鎖、または、別個の実体として、もしくはRNA複合体中のヌクレオチド類似体を合わせた合計としてその両方)に存在するヌクレオチド類似体は、少なくとも1つの2’-O-アルキル-RNAモノマー(例えば、2’OME)、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24または25個の2’-O-アルキル-RNAモノマー(例えば、2’OME)を含む。2’OMEおよびLNAを含むかまたはそれらからなる複合体も、想定される。
一実施形態では、それは同じであっても異なってもよいが、不連続のパッセンジャー鎖(またはアンチセンス鎖、または別個の実体として、もしくはRNA複合体中のヌクレオチド類似体を合わせた合計としてその両方)に存在するヌクレオチド類似体は、少なくとも1つの2’-フルオロ-DNAモノマー、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24または25個の2’-フルオロ-DNAモノマーを含む。
多くの発明適用のために、不連続なパッセンジャー鎖に存在する少なくとも1つのLNAモノマーを有することが一般に好ましい。一実施形態では、それは同じであっても異なってもよいが、不連続のパッセンジャー鎖(またはアンチセンス鎖、または別個の実体として、もしくはRNA複合体中のヌクレオチド類似体を合わせた合計としてその両方)に存在するヌクレオチド類似体は、少なくとも1つのLNAモノマー、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24または25個のLNAモノマーを含む。
一実施形態では、1つまたは複数のLNA単位は、D-βおよびL-α配置のいずれかまたはそれらの組合せの、オキシ-LNA、チオ-LNAおよびアミノ-LNAからなる群から独立に選択される。一実施形態では、アンチセンス鎖に存在するヌクレオチド類似体は、少なくとも1つのロック核酸(LNA)単位、例えば少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または少なくとも20個のLNA単位を含む。好適には、LNA単位の数は、20未満、例えば18未満、例えば16未満、例えば14未満、例えば12未満、例えば10未満であることができる。一実施形態では、アンチセンス鎖に存在するすべてのヌクレオチド類似体は、ロック核酸(LNA)単位である。
別の実施形態では、アンチセンス鎖は、少数のヌクレオチド類似体単位、例えばLNA単位を含むだけである。一般的に、アンチセンス鎖に存在するヌクレオチド単位は、アンチセンス鎖の3’側の半分の範囲内、例えばアンチセンス鎖の位置1〜9、例えばアンチセンス鎖の位置1、2、3、4、5、6、7、8または9、例えば3オーバーハングの領域中、または、アンチセンス鎖の3’末端から測って、二重鎖の最初の3つ、例えば第一、第二または第三の核酸塩基位置に位置するのが好ましい。
一実施形態では、パッセンジャー鎖(またはアンチセンス鎖、または別個の実体として、もしくはRNA複合体中のヌクレオチド類似体を合わせた合計としてその両方)に存在するヌクレオチド類似体は、少なくとも1つのLNA単位、例えば少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または少なくとも20個のLNA単位を含む。好適には、LNA単位の数は、20未満、例えば18未満、例えば16未満、例えば14未満、例えば12未満、例えば10未満であることができる。一実施形態では、パッセンジャー鎖に存在するすべてのヌクレオチド類似体は、ロック核酸(LNA)モノマー(単位)である。
一実施形態では、不連続なパッセンジャー鎖に存在するヌクレオチド類似体の少なくとも1つは、アンチセンス鎖に存在する相補的ヌクレオチド類似体と塩基対を形成する。
一実施形態では、不連続なパッセンジャー鎖に存在するすべてのヌクレオチド類似体は、3’オーバーハングに存在するヌクレオチド類似体(存在する場合)以外の、アンチセンス鎖に存在する相補的ヌクレオチド類似体と塩基対を形成する。
一実施形態では、アンチセンス鎖に存在するすべてのヌクレオチド類似体は、3’オーバーハングに存在するヌクレオチド類似体(存在する場合)以外の、不連続なパッセンジャー鎖に存在する相補的ヌクレオチド類似体と塩基対を形成する。一実施形態では、パッセンジャー鎖は、1〜5個のヌクレオチド類似体、例えばLNA単位、例えば2LNA単位を有する、9〜11ヌクレオチド(核酸塩基)のRNA分子、例えば10ヌクレオチドRNA分子、および1〜5個のヌクレオチド類似体単位、例えばLNA単位、例えば3個のLNA残基を含む、11〜13ヌクレオチドRNA分子、例えば12ヌクレオチドRNA分子からなるかまたはそれらを含む。
限定ではなく例として、以下の特定の発明複合体は以下の構造を有し、式中、太字の下線付きテキストがLNAである:
本発明のRNA複合体(sisiRNAとも呼ばれる)の作製および使用に関するさらなる開示は、そのような複合体の作製および使用に関連する開示に関する、国際公開第2007/107162号(PCT/DK2007/000146)、PA 2006 00433(DK)およびPA 2006 01254(DK)で見出すことができる。
本発明の実施は、本明細書で開示されるRNA複合体の1つまたは組合せを用いて達成することができる。一実施形態では、本RNA複合体は、非モジュラーパッセンジャー鎖を含む天然のRNA複合体と比較して、標的外の影響が減少している。一実施形態では、RNA複合体は、非モジュラーパッセンジャー鎖を含む天然のRNA複合体と比較して、低下した免疫応答を生成する。別の実施形態では、本RNA複合体は、非モジュラーパッセンジャー鎖を含むRNA複合体と比較して、標的核酸に対して長期影響を及ぼす。したがって一実施形態では、本RNA複合体は、非モジュラーパッセンジャー鎖を含むRNA複合体と比較して、その標的核酸に対して強い影響を及ぼす。好ましい標的核酸は、配列番号1(ヒト)、配列番号402(ラット)または配列番号403(マウス)として開示されているC6配列である。
本発明のRNA複合体は、戦略の1つまたは組合せによって作製することができる。一手法では、その方法は、コア二本鎖領域を含むRNA複合体が形成される条件下で、アンチセンス鎖を、不連続なパッセンジャー鎖を形成する少なくとも2つのRNA分子、および任意選択でパッセンジャー鎖のさらなるRNA分子とインキュベートすることを含む。好ましくは、RNA複合体は、対応する細胞内RNAのRNA干渉を媒介することができ、前記インキュベーションは薬学的に許容される希釈剤、担体またはアジュバントの中で起こるか、または前記RNA複合体は、薬学的に許容される希釈剤、担体またはアジュバントとその後混合される。
前述のRNA複合体は、様々な用途を有する。一実施形態では、本発明は、下記のものなどの膜攻撃複合体(MAC)の望ましくない形成に関連する疾患の治療のための医薬の製造のための、本明細書で定義されるRNA複合体の使用を特徴とする。
患者で疾患を治療、予防するかもしくはその開始を低減するか、またはその症状を軽減する方法も提供され、その方法は、本明細書に開示されるRNA複合体の1つまたは複数を、好ましくは本明細書に記載の薬学的に許容される緩衝剤、アジュバントまたは媒体と併用投与することを含む。
本発明は、細胞または生物体で標的RNA(または遺伝子発現)のレベルを低減させる方法であって、細胞または生物体を、その遺伝子発現を調節するのに十分である本明細書で定義される少なくとも1つのRNA複合体と接触させることを含む方法も特徴とする。好ましくは、RNA複合体のアンチセンス鎖は、標的RNAの領域に本質的に相補的である。
述べるように、本発明での使用に適するRNA複合体は、少なくとも1つのヌクレオチド類似体を含むことができる。一実施形態では、パッセンジャー鎖の第一のRNA分子は、5’末端から9位に2’-O-メチルリボースを含まない。別の実施形態では、パッセンジャー鎖の第一のRNA分子は、5’末端から9位に2’-O-メチルリボースを含まない。
本発明は、細胞または生物体で標的核酸の核酸修飾を媒介する方法であって、好ましくは以下の段階の少なくとも1つ、好ましくはそれらのすべてを含む方法も提供する。
a.前記細胞または生物体を、本明細書で定義されるRNA複合体と、標的特異的核酸修飾が起こることができる条件下で接触させる段階と、
b. RNA複合体のアンチセンス鎖によって誘導される標的特異的核酸修飾を媒介する段階。
前述の方法の一実施形態では、核酸修飾を媒介する段階は、RNA干渉、遺伝子サイレンシング、RNA分解、RNA切断およびDNAメチル化からなる群から選択される。
本発明は、細胞または生物体の遺伝子機能を調べる方法であって、以下の段階を含む方法も提供する。
a.遺伝子によってコードされるRNA、例えばmRNAまたは他の機能的RNAを標的にする本明細書で定義されるRNA複合体を、分解またはサイレンシングまたは抑制のために細胞または生物体に導入し、それによって試験細胞または試験生物体を生成する段階と、
b.遺伝子によってコードされるRNAの分解またはサイレンシングまたは抑制が起こる条件下で試験細胞または試験生物体を維持し、それによって、遺伝子のmRNAレベルが低下している試験細胞または試験生物体を生成する段階と、
c.段階bで生成される試験細胞または生物体の表現型を観察し、観察された表現型を適当な対照細胞または対照生物体の表現型と任意選択で比較し、それによって遺伝子の機能に関する情報を提供する段階。
本発明の実施は、特に発明化合物(例えば、アンチセンス、siRNA、sisiRNA)がLNAモノマーを含む実施形態で、重要な利点を提供する。
例えば、本発明の化合物がLNAモノマー(例えば、アンチセンス化合物、siLNA、sisiLNA)を含む実施形態の1つの利点は、血清などの体液中でのそれらの改善された安定性である。したがって、本発明の一実施形態は、例えばヌクレアーゼ(エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ)に対する耐性の増加を通して、生じるsiLNA化合物またはアンチセンスオリゴマーの体液中での安定性を高めるために、標準のDNAまたはRNAオリゴヌクレオチドへのLNAモノマーの組込みを含む。したがって、本発明の化合物は、LNAモノマーの組込みのために、その上昇した融点および/またはその増強されたヌクレアーゼ耐性の結果として、循環半減期の延長を示す。安定性の程度は、用いるLNAモノマーの数、オリゴヌクレオチドにおけるそれらの位置、および用いるLNAモノマーの種類によって決まる。DNAおよびホスホロチオエートと比較して、核酸分解に対してオリゴヌクレオチドを安定させる、以下の順序の能力を確立することができる: DNA<<ホスホロチオエート、LNA-ホスホジエステル<LNA-ホスホロチオエート。
多くの適用について、本発明による好ましい化合物は、血清(例えばヒト、ウシまたはマウス血清)中で、例えば37℃の生理的食塩水中の10%ウシ胎児血清中で5時間インキュベートする場合、対応するssDNA、ssRNAまたはdsRNA化合物よりも小さい程度に分解する化合物を含む。好ましくは、本発明の化合物の最初の量の25%未満が5時間後に分解し、より好ましくは本発明の化合物の最初の量の50%未満が5時間後に分解し、さらにより好ましくは本発明の化合物の最初の量の75%未満が5時間後に分解する。別の実施形態では、本発明の化合物の最初の量の25%未満が10時間後に分解するのが好ましく、本発明の化合物の最初の量の50%未満が10時間後に分解するのがより好ましい。
上記のことから明らかなように、本発明の化合物は1つまたは複数のLNAモノマーを単独で、または天然に存在するかもしくはヌクレオチド類似体であるヌクレオチドと一緒に含むことができる。他のそのような残基は、本明細書に記載の残基のいずれかでよく、例えば、天然のRNAモノマー、天然のDNAモノマー、ならびにヌクレオチド変異体および類似体、例えば上の「ヌクレオチド」の定義に関連して指摘したものなどが含まれる。そのようなヌクレオチド変異体および類似体の具体例には、2’-F、2’-O-Me、2’-O-メトキシエチル(MOE)、2’-O-(3-アミノプロピル)(AP)、ヘキシトール核酸(HNA)、2’-F-アラビノ核酸(2’-F-ANA)およびD-シクロヘキセニルヌクレオシド(CeNA)が含まれる。さらに、ヌクレオシド間結合は、上に述べたようなホスホロジエステル、ホスホロチオエートまたはN3’-P5’ホスホロアミデートヌクレオシド間結合であってもよい。
一般に、1つまたは複数のLNAモノマーを含む本発明の化合物の個々の鎖は、鎖中のヌクレオチドの総数に基づき、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%または少なくとも約20%のLNAモノマーを含む。特定の実施形態では、本発明の化合物は、鎖中のヌクレオチドの総数に基づき、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%または少なくとも約90%のLNAモノマーを含む。
本発明の化合物は、米国特許出願公開第2007/0191294号および国際公開第2007/107162号によって提供される合成を含む、本明細書に開示の技術を用いて製造することができる。
医薬組成物および投与
本発明の化合物の好ましい使用は、急性または慢性の神経障害に関連する症状の治療、予防および/または緩和のための薬剤としてである。強力で安全な薬剤の設計は、親和性/特異性、体液中安定性、細胞取込み、作用様式、薬物動態特性および毒性などの多様なパラメータの微調整をしばしば必要とする。これらおよび他のパラメータは、当分野の技術者に公知となる。
したがって、本発明のさらなる態様は、本発明による化合物、および薬学的に許容される希釈剤、担体またはアジュバントを含む医薬組成物に関する。
さらなる態様では、本発明は、医薬としての本発明による化合物に関する。
理解されるように、投薬は、治療する神経障害の重症度および応答性に依存し、治療クールは数日から数カ月の間、または治療が達成されるかもしくは疾患状態の軽減が達成されるまで持続する。最適な投薬スケジュールは、患者体内での薬剤蓄積の測定から計算することができる。最適な投薬量は、個々の発明化合物の相対的な効力および/または治療する適応症によって異なってもよい(下記参照)。一般に、それは、in vitroおよびin vivo動物モデルで有効であることが見出されるEC50値に基づいて推定することができる。一般に、投薬量は体重1kgにつき0.01マイクログラム〜1gであって、1日、1週、1カ月または1年に1回または複数回、あるいは2〜10年に1回でも、あるいは数時間から最高数カ月までの連続注入によっても投与することができる。投薬の繰返し率は、体液または体組織における薬剤の測定された滞留時間および濃度に基づいて推定することができる。治療成功に続いて、疾患状態の再発を予防するために、患者に維持療法を受けさせることが望ましいことがある。
理解されるように、本発明は、有効成分として本発明の少なくとも1つの化合物(例えば、アンチセンス化合物、siLNA、siRNA、sisiLNA)を含む医薬組成物も特徴とする。本発明による医薬組成物が任意選択で薬用担体を含むこと、および医薬組成物が任意選択でさらなる化合物、例えば抗炎症化合物(例えば、非ステロイド系およびステロイド系の抗炎症剤)および/または免疫調節化合物を含むことを理解すべきである。
本発明の化合物は、様々な薬学的に許容される塩で使用することができる。本明細書で用いるように、その用語は、本明細書で特定される化合物の所望の生物活性を保持し、最小限の望ましくない毒物的影響を示す塩を指す。そのような塩の非限定例は、亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウム、ナトリウム、カリウムなどの金属カチオン、またはアンモニア、N,N-ジベンジルエチレンジアミン、D-グルコサミン、テトラエチルアンモニウムもしくはエチレンジアミンから形成されるカチオンで形成される、有機アミノ酸および塩基付加塩で形成することができる。
本発明の一実施形態では、本発明化合物は、プロドラッグの形であってもよい。オリゴヌクレオチドは、特性上、負に荷電しているイオンである。細胞膜の親油性のために、オリゴヌクレオチドの細胞内取込みは、中性または親油性同等物と比較して低減される。この極性による「妨害」は、プロドラッグ手法を用いて回避することができる(例えば、Crooke, R. M. (1998)、Crooke, S. T. Antisense research and Application。Springer-Verlag、Berlin, Germany、131巻、103〜140頁を参照)。この手法では、それが投与されるときオリゴが中性であるように、オリゴヌクレオチドは保護された方法で調製される。これらの保護基は、オリゴが細胞によって取り込まれるときにそれらを除去することができるような方法で設計される。そのような保護基の例は、S-アセチルチオエチル(SATE)またはS-ピバロイルチオエチル(t-ブチル-SATE)である。これらの保護基はヌクレアーゼ耐性であり、細胞内で選択的に除去される。
薬学的に許容される結合剤およびアジュバントは、製剤化される薬剤の一部を含むことができる。カプセル、錠剤およびピルその他は、例えば以下の化合物を含むことができる:結合剤としての微結晶性セルロース、ゴムまたはゼラチン;賦形剤としてのデンプンまたはラクトース;滑沢剤としてのステアリン酸;様々な甘味料または着香剤。カプセルについては、投薬単位は、脂肪油のような液体担体を含むことができる。同様に、糖または腸溶剤のコーティングが、投薬単位の一部であってもよい。本発明化合物は、活性医薬成分の乳剤、およびミセル乳剤を形成する脂質であってもよい。本発明の化合物は、所望の作用を損なわない任意の物質と、または所望の作用を補う物質と混合されてもよい。これらは、他のヌクレオチド化合物を含む他の薬剤を含むこともできよう。非経口、皮下、皮内または局所の投与については、製剤は無菌の希釈剤、緩衝剤、張性調節剤および抗細菌物質を含むことができる。活性化合物は、分解または体内からの速い除去から保護する、制御放出特性を有するインプラントまたはマイクロカプセルを含む担体で調製されてもよい。静脈内投与については、好ましい担体は生理的食塩水またはリン酸緩衝食塩水である。
好ましくは、発明化合物は、単位製剤中に、例えば薬学的に許容される担体または希釈剤中に、治療する患者で重大な副作用を引き起こすことなく患者に治療的有効量を送達するのに十分な量で含まれる。
本発明の医薬組成物は、局所または全身の治療が所望されるかどうかによって、および治療する領域によって、いくつかの方法で投与することができる。投与は、(a)経口(b)経肺で、例えば、ネブライザーによるものを含む、粉末またはエアゾールの吸入またはガス注入による投与;気管内、鼻腔内、(c)膣および直腸デリバリーを含む、表皮、経皮、眼内および粘膜を含む局所投与;あるいは(d)静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内の注射または注入を含む非経口投与;あるいは脳内、例えばクモ膜下または脳室内投与であってもよい。一実施形態では、医薬組成物はIV、IP、経口的、局所的に、またはボーラス注射として投与され、あるいは標的器官に直接投与される。局所投与のための医薬組成物および製剤には、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴剤、スプレー、坐薬、液体および粉末を含めることができる。従来の薬用担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤などが必要なこと、または望ましいことがある。コーティングされたコンドーム、手袋などが役立つこともある。好ましい局所製剤には、本発明の化合物が、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化剤および界面活性剤などの局所デリバリー剤との混合物であるものが含まれる。経口投与のための組成物および製剤には、粉末または粒剤、微粒子状物質、ナノ粒子状物質、水または非水性媒体中の懸濁液または溶液、カプセル、ゲルカプセル、小袋、錠剤またはミニ錠剤が含まれるが、それらに限定されない。非経口、クモ膜下または脳室内投与のための組成物および製剤は、緩衝剤、希釈剤および他の適する添加剤、例えば、それらに限定されないが浸透エンハンサー、担体化合物および他の薬学的に許容される担体または賦形剤を含むこともできる無菌水溶液を含むことができる。
本発明の医薬組成物には、溶液、乳剤およびリポソーム含有製剤が含まれるが、これらに限定されない。これらの組成物は、それらに限定されないが、予め形成された液体、自己乳化固体および自己乳化半固体を含む、様々な成分から生成することができる。腫瘍組織への薬剤のデリバリーは、それらに限定されないが、カチオン性リポソーム、シクロデキストリン、ポルフィリン誘導体、分枝鎖デンドリマー、ポリエチレンイミンポリマー、ナノ粒子およびマイクロスフェアを含む、担体仲介型デリバリーによって高めることができる(Dass C R. J Pharm Pharmacol 2002; 54(1):3〜27頁)。単位投薬量剤形で便利に提供することができる本発明の医薬製剤は、医薬品産業で周知である従来の技術によって調製することができる。そのような技術は、有効成分を薬用担体または賦形剤と一緒にする段階を含む。一般に、製剤は、有効成分を液状担体または微粉固体担体またはその両方と一様にかつ緊密に合わせ、次に、必要に応じて生成物を成形することによって調製される。本発明の組成物は、多くの可能な剤形、例えば、それらに限定されないが錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、ソフトゲルおよび坐薬のいずれかに製剤化することができる。本発明の組成物は、水性、非水性または混合媒体中の懸濁液として製剤化することもできる。水性懸濁液は、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび/またはデキストランを含む、懸濁液の粘度を高める物質をさらに含むことができる。懸濁液は、安定剤を含むこともできる。本発明の化合物は、活性薬剤物質、例えば、アスピリン、イブプロフェン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗細菌剤または抗生物質にコンジュゲートすることもできる。他の有用なコンジュゲート体は、上で開示されている。
オリゴヌクレオチドを齧歯動物またはヒト患者などの哺乳動物に経口的利用を可能にする希釈剤、担体および緩衝剤は、本発明の範囲内である。そのような担体の特定の例は、カプリン酸塩、例えばカプリン酸ナトリウムである。オリゴヌクレオチドの経口投与に適する製剤の作製に関する情報については、Tillman, LGら(2008) J. of Pharmaceutical Sciences、Jan. 97(1) 225頁、Gonzalez, FMら(2003) Eur. J. Pharm. Biopharm、Jan: 55(1): 19〜26頁、Aouadi, Mら(2009) Nature 458: 1180頁、およびそこで開示されている参考文献を参照。
本発明の特定の製剤または投与経路が、唯一の活性剤として単一の発明化合物を含むことができることはいうまでもない。しかし、他の発明実施形態では、製剤または投与経路は、2つ以上の発明化合物、例えばそのような化合物の2、3、4、5、6、7、8、9または10個を含む。一般に、用いる発明化合物の数は、5未満、例えば1、2または3個である。例えば、そのような製剤または投与は、第一の核酸を標的にする1つまたは複数のsiLNAまたはsisiLNA化合物、ならびに第二の核酸標的を標的にする1つまたは複数の追加のsiLNAまたはsisiLNA化合物を含むことができる。2つ以上を組み合わせた化合物は、一緒に、または逐次的に用いることができる。
本発明の化合物は、上に示すいくつかの治療適用のために有用である。一般に、本発明の治療法は、哺乳動物、特にヒトへの、所望の化合物(または1つまたは複数の化合物、例えば同上の1、2、3または4個)の治療的有効量の投与を含む。特定の実施形態では、本発明は、(a)本発明の1つまたは複数の化合物、および(b)1つまたは複数の他の剤、例えば本明細書に開示のものなどの抗炎症剤または補体アンタゴニストを含む医薬組成物を提供する。本発明の化合物と用いられる場合、そのような組成物および剤は、個々に、逐次的に、または急性または慢性の神経障害の予防または治療のために許容されるものを含む他の療法を含む1つまたは複数の他のそのような組成物および剤と一緒に用いることができる。
本発明の化合物は、診断、治療および予防のための研究試薬として利用することができる。研究では、本化合物は、細胞および実験動物で標的遺伝子の合成を特に阻害し、それによって標的の機能解析を、または治療的介入のための標的としてのその有用性の評価を促進するために用いることができる。一実施形態では、本発明のオリゴマー、siRNAおよびsisiRNA組成物は、ノーザンブロッティング、in-situハイブリダイゼーションまたは類似の技術によって細胞および組織で標的の発現を検出および数量化するために用いることができる。治療法については、標的の発現を調節することによって治療することができる疾患または障害を有する疑いがある動物またはヒトが、本発明による化合物を投与することによって治療される。本発明の化合物または組成物の1つまたは複数の治療的または予防的に有効な量を投与することによって、標的の発現に関連する疾患または状態を有するかまたはその傾向があることが疑われる動物、特にマウスおよびラットを治療する方法およびヒトを治療する方法がさらに提供される。
神経再生
記載のように、本発明は、補体系の望ましくない活性によって媒介される障害を治療、予防するか、またはその症状を軽減するための方法をさらに提供する。一実施形態では、本方法は、本発明の少なくとも1つの化合物、特に本明細書に記載の少なくとも1つの医薬組成物を、それを必要とする哺乳動物(例えば、霊長類または非霊長哺乳動物、特にヒト患者)に投与することを含む。句「補体系の望ましくない活性によって媒介される障害」は、神経再生の不能または不全によって全体的に、または一部表される神経障害を意味する。そのような障害の例には、末梢神経系(PNS)または中枢神経系(CNS)の神経への急性または慢性の損傷に続く、神経再生の不能または不全を表すものが含まれる。神経再生(または、損傷を受けた神経の機能の改善)の不能または不全は、当分野で公知である検査によって検出すること、および場合によっては定量化することができる。例えば、Ramaglia, V.ら(2007) J. Neurosci. 27:7663頁(とりわけ、ラットで神経変性および再生を検出し、任意選択で定量化するためのアッセイを記載)、Wolf, SL (2001) Stroke 32:1635頁(モーター機能試験)、S. Van Tuijlら(2002) Spinal Cord 40:51頁(モーター機能試験)、Sheikh, Kら(1980) Rheumatology 19:83頁(モーター機能試験)、Chan A.Weら(2001) J. Neurol. Neurosurg. Psychology 55:56頁(感覚機能試験)およびMayuko. Wら(2005) J. Jap. Soc. For Surgery of the Hand (2005) 22:842頁(複数の感覚機能試験)、ならびにそこで引用される参考文献を参照。
軸索再生の改善を監視する方法が記載されており、一般に、ヒト患者で実施することができる様々な機能検査を含む。そのような検査は、Weinsteinの増強感覚検査(WEST)、Semmes-Weinsteinのモノフィラメント検査(SWMT)、その他などの、感覚および/またはモーター機能の回復を一般に監視する。神経再生を検出および監視する方法ならびに様々な神経傷害を分類する方法については、国際公開第2008/044928号(PCT/NL2007/050490)、Ristic Sら(2000)Clin Orthop Relat Res. 370:138頁、およびそこで引用される参考文献を参照。本発明の化合物の適当な用量は、本明細書で記載されるこれらの検査または他の許容される検査によって、軸索再生を促進することを示すことができるものである。「有効用量」、「治療的な量」または関連する句は、これらのまたは他の許容される検査によって判定される所望の治療結果を達成するのに十分な量を意味する。
本発明の組成物および方法は、急性または慢性の神経損傷に関連する症状を予防、治療または軽減するために用いることができる。急性または慢性であれ、軸索再生を必要とする状態は、例えば国際公開第2007/044928号およびそこで引用される参考文献で開示されている。末梢神経への急性外傷は、鈍的外傷、または弾丸または他の物体などの貫通ミサイルからのものを含め、比較的一般的である。神経のきれいな断裂をもたらす穿刺創傷または異物(例えば、ガラス、板金)からの傷害は、尺骨神経ニューラプラキシーおよび橈骨神経病変および麻痺を含め、骨折および骨折転位から生じる神経損傷がそうであるように公知である。一般に、急性神経損傷は、疼痛閾値の低下であるアロディニアおよび過形成、および有害刺激に対する反応の増加として現れる、持続的な神経障害性疼痛をしばしば起こす。Feliciano DV、Moore EE、Mattox KL. Trauma。3版。Stamford, Conn: Appleton & Lange; 1996:853頁のColohan ARら(1996) Injury to the peripheral nervesを参照。
本発明の範囲内のさらなる急性神経損傷には、外傷性脳損傷(TBI)ならびに脊髄および末梢/感覚神経への急性傷害、神経傷害を含む様々なスポーツ傷害が含まれる。国際公開第2007/044928号およびそこで引用される参考文献を参照。
急性神経損傷に応じて軸索再生を促進することが所望である実施形態では、一般に、傷害の後できるだけ早く、例えば傷害の後の約24、12、6、3、2、1時間またはそれ未満の時間以内、好ましくは5、10、20、30または40分以内に、少なくとも1つの発明化合物(例えば、同上の1つ、2つまたは3つ)を投与することが好ましい。さらに、本発明化合物の少なくとも1つを、神経損傷の多少の危険に関連する医療的介入(例えば、手術)の前に、予防的に(予防措置として)投与してもよい。この発明実施形態では、神経再生は有利に強化され、回復時間は短縮される。
指摘するように、本発明は、神経系への慢性損傷に関連する症状を治療、予防または軽減するために有用である。非限定例には、国際公開第2007/044928号にすでに記載されているものが含まれ、例えば、多くの慢性脱髄性神経障害(CMT1型)、HMSN(CMT)疾患1Aおよび1B型、HNPPおよび他の圧迫性麻痺、Bethlemミオパシー、肢帯筋ジストロフィー、Miyoshiミオパシー、股関節点状軟骨発育不全、HMSN-Lom、PXE(偽黄色腫症エラスチカ)、CCFDN(先天性白内障顔異形症および神経障害)、アルツハイマー病、ハンチントン病、シャルコー-マリー-ツース病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、ギランバレー症候群(GBS、別名急性炎症性脱髄性多発性ニューロパシーまたはAIDP)、ロイコジストロフィー、パーキンソン病、モーター神経疾患、糖尿病性神経障害、遠位性軸索障害、例えば代謝性もしくは毒性神経錯乱から生じるもの(例えば、糖尿病、腎不全、薬剤または毒物(例えば、抗癌剤)への曝露、栄養失調またはアルコール症に関係する)、単神経障害、神経根障害(例えば、脳神経VII;顔面神経の)、ハンセン病(らい)、および神経叢病、例えば上腕神経炎、ならびに局所圧迫性神経障害(例えば、手根管圧迫症候群)が含まれる。
治療目標が慢性神経傷害を治療することである実施形態では、より長期の投与プロトコルが一般に好まれる。したがって一実施形態では、特定の適応症に関連する症状を治療または軽減するために、少なくとも1つの発明化合物(例えば、同上の1つ、2つまたは3つ)が、本明細書で指摘される任意の許容される経路によって必要に応じて少なくとも24時間、好ましくは数日、数週間または数カ月、最大数年まで投与される。
指摘するように、本発明の化合物は、補体系の望ましくない活性によって媒介される障害を治療、予防するか、またはその症状を軽減するために単独で、または他の剤と組み合わせて用いることができる。炎症が障害に付随するかまたは付随することが疑われる一実施形態では、本方法は、少なくとも1つの抗炎症剤(例えば、同上の1つ、2つまたは3つ)および/または補体阻害剤を投与する段階を含む。抗炎症剤の非限定例は、ステロイド(例えば、コルチコステロイド)または非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)である。他の適するステロイドの例には、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、トリアムシノロン(kenacort)、メチルプレドニゾロン(medrol)、プレドニソロン(prelone)、プレドニゾンおよびデキサメタゾン(decadron)が含まれる。例示的なNSAIDには、アセチルサリチル酸(アスピリン、ecotrin)、コリンサリチル酸マグネシウム(trilisate)、コックス-2阻害剤、ジクロフェナク(voltaren、cataflam、coltaren-XR)、ジフルニサル(dolobid)、エトドラク(lodine)、フェノプロフェン(nalfon)、フルルビプロフェン(ansaid)、イブプロフェン、インドメタシン(indocin、indocin-SR)、ケトプロフェン、メクロフェナメート(meclomen)、ナブメトン(relafen)、ナプロキセン(naprosyn、naprelan、anaprox、aleve)、オキサプロジン(daypro)、フェニルブタゾン(butazolidine)、ピロキシカム(feldene)、サルサラート(disalcid、salflex)、トルメチン(tolectin)およびバルデコキシブ(bextra)が含まれる。
本発明の組成物が多発性硬化症に関連する症状を予防、治療または軽減するために用いられる実施形態では、組成物は単独で、または1つまたは複数の承認薬、例えばRebif(登録商標)(インターフェロンβ-1a、Serono, Pfizer)、Avonex(登録商標)(インターフェロンβ-1a、Biogen-Idec)、Betaseron(登録商標)(インターフェロンβ-1b、Bayer Schering)、Copaxone(登録商標)(ガラティラメルアセテート、Teva)、Novantrone(登録商標)(ミトザントロン、Serono)およびTysabri(登録商標)(ナタリズマブ、Biogen-Idec)と組み合わせて用いることができる。さらに詳細に下で述べるように、発明化合物の同時投与は、特定の時間にわたって患者を承認薬のより少ない量に曝露させ、それによって望ましくない副作用の可能性を低減させる。
薬剤休止日
述べるように、少なくとも1つの発明化合物を投与することによって、本明細書で指摘される障害を予防、治療、またはその程度を低減することが可能である。しかし、所望の効果を達成するために対象を連続的に化合物に曝露させる必要はないことが分かっている。すなわち、「薬剤休止日」と本明細書で呼ばれる期間、化合物の投与を、時には実質的に低減させることが可能である。薬剤休止日の間、補体mRNAは、本発明化合物の投与の後の数日間、数週間、最高約1カ月間、低いままである(対照と比較して、およびqPCRを用いて、約10%未満、20%、30%、40%、50%以上)。これらの条件下で生成される補体mRNAの量は、コードされるタンパク質の正常レベルを生成するには不十分であると考えられている。単独でのまたは別の薬剤との併用による発明化合物の投与は、この期間中必要でない。薬剤休止日以後、1つまたは複数の発明化合物の単独投与、または他の薬剤との併用投与を再開することができる。
本発明のこの態様の実施は、重要な利点を提供する。
例えば、本発明の使用は、侵襲性で、時に痛みを伴い、しばしば反復的で高価な治療プロトコルからの待望の解放を、ヒト患者に提供することができる。潜在的に重大な副作用を低減すること、遅らせること、または場合によっては除去することができる。例として、吐き気、インフルエンザ様の症状、注射部位反応、脱毛症、感染、肺炎、月経上の問題、うつ病、胆石症および/または進行性多巣性白質脳症(PNL)を起こす危険が、多発性硬化症治療薬を投与された一部の患者で報告されている。これらのおよび他の副作用は、場合により、本発明の実施によって軽減または回避することができる。
さらに、薬剤の繰り返される頻繁な投薬に関連する費用が、本発明の使用によって削減することができる。例えば、Rebif(登録商標)、Avonex(登録商標)、Betaseron(登録商標)およびCopaxone(登録商標)の各々は、多発性硬化症患者に週に1回または複数回、通常痛みを伴う注射によって投与されると言われている。発明化合物の同時投与は、1回の投与に必要とされる薬剤の減少をもたらすと考えられている。あるいは、またはさらに、薬剤のより頻繁でない投与が必要とされる。いずれにせよ、患者の治療費用が低下し、患者の快適性が向上する。多発性硬化症を治療するために用いられる他の薬剤は、数カ月ごとに患者に投与されると言われる(例えば、Novantrone(登録商標)およびTysabri(登録商標))。これらの実施形態でさえ、本発明の実施は、必要とされる薬剤の量を減少させること、またはより頻繁でない投薬をもたらすことができ、それによってより少ない副作用の危険およびより低い費用を提供する。
本発明のさらなる目的は、発明化合物の単独投与、または既知の薬剤との併用投与が薬剤休止期間中低減される、本明細書で言及される障害を予防、治療、またはその症状を軽減する方法を提供することである。一実施形態では、薬剤休止期間中、薬剤の投与は完全に除去される。薬剤休止期間の後、またはその間時々、本発明化合物、既知の薬剤(または両方)は、その前に投与される量と実質的に同じであるかまたは異なる(例えば、より低い)量で、哺乳動物に再び投与される。その第二の薬剤投与の後に、所望により別の薬剤休止日が続くことができる。したがって、本発明の特徴は、所望の治療結果を達成するために、各薬剤休止日の後に、発明化合物、既知の薬剤の少なくとも1つ(または両方)の量の投与が好ましくは続く、少なくとも1日の薬剤休止日を提供することである。
したがって特定の実施形態では、発明化合物は、多発性硬化症を起こしている(かまたはその疑いのある)ヒト患者に投与される。本発明化合物は、単独で、または既知の多発性硬化症薬剤、例えばRebif(登録商標)、Avonex(登録商標)、Betaseron(登録商標)、Copaxone(登録商標)、Novantrone(登録商標)またはTysabri(登録商標)と組み合わせて、治療的有効量で投与することができる。薬剤休止期間中、本発明化合物および/または多発性硬化症薬剤のさらなる投与は、実質的に減少させることまたは回避することさえできる。本方法は、1日、2日、3日以上の薬剤休止日を特徴とする治療計画を提供するために、1回、2回、3回、または必要なだけ頻繁に繰り返してもよい。本発明方法は、多発性硬化症に関連する症状を予防、治療または軽減するために必要に応じて、例えば数日ごと、数週間ごと、数カ月ごと、最大患者の寿命まで繰り返すことができる。
薬剤休止日の誘導の前に、本発明化合物または既知の薬剤の量は、好ましくは、しかし排他的にではなく、治療的有効量である。一実施形態では、本発明化合物の量は、対照と比較して、および例えばpPCRで測定して、補体mRNAの存在を低減させるのに一般に十分である。薬剤休止日を開始するために、本発明化合物または既知薬剤の量は、低減されるかまたは完全に除去される。薬剤休止期間は、レベルが上記の対照より下に留まる限り、in vivoの補体mRNAのいかなる特定のレベルとも結びつかない。薬剤休止期間の後、哺乳動物は、少なくとも1つの発明化合物の単独での、または本明細書で指摘の、多発性硬化症を治療するために用いられるものなどの既知の薬剤との併用によるさらなる投与を含む、追加の療法を受けさせることができる。
特定の薬剤休止日プロトコルの使用は、患者の健康状態、性別、障害の重症度、投与される既知薬剤の種類などの認識されているパラメータによって導かれる。
本発明は、哺乳動物でC6の発現を低減または阻害し、その中の神経再生を高めるのに十分な本発明の少なくとも1つの化合物の量を、哺乳動物に(治療的または予防的に)投与する段階を含む、哺乳動物で神経再生を高める方法もさらに提供する。神経再生強化を評価する方法は、モーターおよび感覚神経機能を検出し、任意選択で定量化する様々な検査を含めて、本明細書に記載されている。
所望により、本明細書に開示される本発明化合物の1つまたは複数を、記名発明者による以下の同時係属の特許出願で開示される化合物の1つまたは複数と組み合わせることができ、それらの出願は、補体成分のアンタゴニスト(C8-α)およびその使用、補体成分のアンタゴニスト(C8-β)およびその使用、ならびに補体成分のアンタゴニスト(C9)およびその使用と題され、各出願は本出願と同じ出願日を有する。この実施形態では、異なるMAC複合体成分を標的とする化合物を組み合わせることは、その複合体の発現を低減させることができる。
本明細書で「発明化合物」もしくは類似の句、または「本発明の組成物」もしくは類似の句への言及は、本明細書で開示される組成物を意味する。
他のより具体的な実施形態は、本発明の範囲内である。例えば、本発明は、配列番号1によって表される補体成分6(C6)配列、またはオリゴマーが少なくとも1つのヌクレオチド類似体を含むその天然に存在する対立遺伝子変異体をコードする核酸の対応する領域に少なくとも95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する連続した核酸塩基配列を有する、長さが約10〜50ヌクレオチドのオリゴマーを提供する。好ましくは、オリゴマーは、qPCRアッセイで測定した場合、哺乳動物でのC6 mRNAの発現レベルを少なくとも20%低減することができる。一実施形態では、オリゴマーは、修飾ヌクレオシド間結合および修飾核酸塩基の少なくとも1つをさらに含む。例が本明細書で提供され、以下からなる群から選択される修飾糖部分を含む: 2’-O-メトキシエチル修飾糖部分、2’-メトキシ修飾糖部分、2’-O-アルキル修飾糖部分、および二環式糖部分。この実施形態で用いるための一般に好ましい二環式糖部分は、LNAモノマーである。より特定の実施形態では、オリゴマーは、オリゴマーの3’および5’末端のそれぞれで2つまたは3つのLNAモノマーを含むギャップマーである。一実施例では、オリゴマーは、5’および3’のウィングセグメント(wing segument)の間に位置する1つまたは複数の2’-デオキシヌクレオチドをさらに含む。任意選択で、ギャップマーは、オリゴマーの3’末端、5’末端または3’および5’末端の両方に置かれる追加の2’-デオキシヌクレオチドを含むことができる。上記の発明実施例で用いるための一般に有用な修飾ヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。修飾核酸塩基は、5-メチルシトシンであってもよい。より小さなオリゴマー、例えば長さが約12〜約20ヌクレオチド、より具体的には長さが約15〜約18ヌクレオチド、例えば長さが15、16、17、18または19ヌクレオチドがしばしば有用である。
多くの発明実施形態のための一般に有用なオリゴマーは、配列番号1のATG開始部位(「A」から開始する)からの位置約1〜332、253〜653、266〜766、526〜926、853〜1253のヌクレオチド、詳細には約32〜232、353〜553、466〜666、626〜826および953〜1153のヌクレオチド、より詳細には約82〜182、403〜503、516〜616、676〜776、1003〜1103のヌクレオチド、さらにより詳細には112〜152、433〜473、546〜586、706〜746、1015〜1055のヌクレオチド、例えば下の表1および2で言及する特異的標的部位を標的にするものである。理解されるように、そのようなオリゴマーは、目的の結果が達成されるならば、配列番号1によって表される配列との100%未満の配列同一性を有することができる。したがって一実施形態では、オリゴマーは、配列番号1によって表される補体成分C6配列に関して、1、2、3、4または5個のミスマッチを含む。一般に有用なオリゴマーは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
本明細書で開示される少なくとも1つのオリゴマー、および薬学的に許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントを含む医薬組成物も提供される。多くの発明実施形態のために、経口的に許容される製剤として提供されるオリゴマーが有用である。
細胞または組織中の補体成分6(C6)の発現をin vivoで低減または阻害する方法がさらに提供され、前記方法は、補体成分6(C6)の発現が低減または阻害されるように、前記細胞または組織を請求項1に記載のオリゴマーと接触させる段階を含む。本方法は、オリゴマーの投与の後に、補体成分6(C6)(例えば、免疫検出法による)、タンパク質をコードするmRNA(例えば、pPCRによる)および膜攻撃複合体(MAC、例えばCH50アッセイによる)の少なくとも1つを測定するさらなる段階を含むことができる。
細胞または組織中の膜攻撃複合体(MAC)の生成をin vivoで低減または阻害する方法も本発明の範囲内であり、前記方法は、MACの発現が低減または阻害されるように、前記細胞または組織を請求項1に記載のオリゴマーと接触させる段階を含む。本方法は、オリゴマーの投与の後に、補体成分6(C6)(例えば、免疫検出法による)、タンパク質をコードするmRNA(例えば、pPCRによる)および膜攻撃複合体(MAC、例えばCH50アッセイによる)の少なくとも1つを測定するさらなる段階を含むことができる。
本発明は、補体系の望ましくない活性によって媒介される障害を治療、予防するか、またはその症状を軽減するための方法をさらに提供する。好ましくは、本方法は、本明細書で開示される医薬組成物の少なくとも1つを、その必要性のある哺乳動物に投与することを含む。一実施形態では、前記障害は、多発性硬化症(例えば、RRMS型)などの慢性脱髄性神経障害である。本方法は柔軟性があり、医薬組成物が1つまたは複数の発明化合物を含むように用いることができる。あるいは、前記医薬組成物は、既知の薬剤、例えばRebif(登録商標)(インターフェロンβ-1a)、Avonex(登録商標)(インターフェロンβ-1a)、Betaseron(登録商標)(インターフェロンβ-1b)、Copaxone(登録商標)(ガラティラメルアセテート)、Novantrone(登録商標)(ミトザントロン)およびTysabri(登録商標)(ナタリズマブ)(すべて多発性硬化症の治療のため)の少なくとも1つをさらに含むことができる。
補体系の望ましくない活性によって媒介される障害を治療、予防するか、またはその症状を軽減するための方法も提供される。好ましくは、本方法は、本明細書で開示される医薬組成物の少なくとも1つをその必要性のある哺乳動物に投与することを含み、さらに、抗炎症剤および補体阻害剤の1つまたは複数の投与を含む。
本発明方法が有用である特定の障害は、急性または慢性であってもよい神経外傷である。急性神経外傷の例は、外傷性脳損傷(TBI)である。
軸索再生を必要とする状態の治療のための医薬の製造のための、本発明の組成物の少なくとも1つ(例えば、1、2または3個)の使用がさらに提供される。
多発性硬化症などの慢性脱髄状態の治療のための医薬の製造のための、本発明の組成物の少なくとも1つ(例えば、1、2または3個)の使用がさらに提供される。
以下の実施例は、本発明がより完全に理解されるように、例示目的のためだけに与えられる。これらの実施例は、特段の指示がない限り、いかなる形であれ本発明の範囲を制限するものではない。
本明細書で指摘するすべての参考文献の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
（実施例1：肝臓における補体合成のアンチセンス阻害剤）
補体成分C6は主に肝臓で発現され、この器官から循環中に分泌される。C6の肝臓での発現のノックダウンは、MAC複合体を形成する能力を実質的に低下させ、したがって補体系の効力を低下させる。全身投与されたアンチセンスオリゴヌクレオチドが肝臓で有効であることを、多くの研究が確認している。
アンチセンスオリゴヌクレオチド
補体成分C6に対するアンチセンスオリゴマーが、齧歯動物とヒトとの間で高い相同性を有する配列に対して設計された(表5A〜5F、3A〜3Fを参照)。アンチセンスオリゴヌクレオチド(15〜18量体)を、ロック核酸(LNA)で化学的に修飾した。LNAはオリゴをヌクレアーゼから保護し、相補的mRNA配列への親和性(Tm)を高めるので、高い効力を有する短い15〜18量体オリゴヌクレオチドの使用を可能にする。18ヌクレオチドより短いオリゴマーは、より長いオリゴマーと比較して先天性の免疫応答を活性化させる傾向が弱い。オリゴヌクレオチドは、ギャップマーとして設計した。このことは、オリゴの5’末端の最後の3つの部位および3’末端の最後から2番目から数えて3つの部位はLNA部分を含むが、中央および3’末端の最後の部位位置はDNA類似体以外からなることを意味する。
一般的なギャップマー設計の例を下に示す:
上式で、L=LNAおよびd=DNA。全オリゴは、腎クリアランスを低減させてin vivo循環時間を長くするために、ホスホロチオール化される。免疫刺激を低減させるために、すべてのC残基をメチル-Cに変換した。
Table 1(表1)に示すLNA修飾オリゴマーのすべては、完全にホスホロチオール化された。
すべてのオリゴマー(ODN)は、ポリスチレンプライマー支持体を用いる130〜185μmoleスケールのAKTA Oligopilot(GE Healthcare)で、ホスホラミダイト手法を用いて合成した。ODNをイオン交換(IEX)によって精製し、ミリポア膜を用いて脱塩した。ODNは、LC/MS(Agilent)によって特徴づけた。ODNの分子量は、Biflex III MALDI(Brucker instruments、Leipzig, Germany)で、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析(MALDI-TOF)によって確認した。
in vivoオリゴ効力試験
培養した細胞系は補体タンパク質を発現しない(または非常に低いレベルでしか発現しない)ので、オリゴヌクレオチドの効力をin vivoで直接試験することができる。最初のスクリーニングの目標は、in vivo効力を有する可能性のあるオリゴのセットを初期設計のリストから同定することであった。8〜10週齢のマウスNMRI系統(Charles River、Netherlands)に、PBSに溶解させた5mg/kgのオリゴを1日に1回注射した(腹腔内IPまたは静脈内(IV))。対照として、最初のスクリーニングのときだけPBS注射を与えた。各処置について、群につき5匹のマウスを用いた。3日間の処置の後に、マウスを4日目に屠殺した。肝臓試料を取り出し、タンパク質レベルの検出のためにウェスタンブロット法、およびmRNAレベルのために定量qPCRを用いて、タンパク質成分のノックダウンレベルを測定するために用いる。
ウェスタンイムノブロットは、ミニプロテアン系(Biorad)を用いて標準の条件下でアクリルアミド電気泳動を変性させた後に実行することができる。補体タンパク質は、市販の特異的モノクローナルおよびポリクローナル抗体を用いて検出される。タンパク質の免疫検出(Immunodection)は、Lumi-Light増強化学発光キット(Roche)およびLAS-3000 darkbox画像システム(FujiFilm、Tokyo, Japan)を用いて行われる。qPCRは、Lightcycler480システム(Roche)においてユニバーサルプローブ(Roche)を用いて実行した。
可能性のあるリード候補の選択の後、対照として特定のミスマッチバージョン(最小限の3つのミスマッチ)を設計することができる。
オリゴヌクレオチドの長期投与(>4日)を、浸透圧ミニポンプ(Alzet、Durect Co.、Cupertino, Ca, USA)を用いて行った。これらのポンプは、製造業者の指示に従って、背面に移植される。移植後安定したデリバリー速度に速やかに到達するために、ポンプを始動させるため移植の前に37℃で20時間、浸透圧ミニポンプをPBS中でインキュベートする。毎日の注射を必要としないので、これらのポンプの使用は、長期実験で動物のストレスを軽減する。in vitro試験は、Alzetミニポンプが24時間以内に安定したポンピング速度に到達することを示す。浸透圧ミニポンプは、PBSに溶解させたオリゴヌクレオチドで満たした。
ミニ毒性スクリーニング
血清中のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(ASAT)およびアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALAT)レベルを測定するために、血液試料を採取する。血清中のASATおよびALATレベルは、適当なキット(Roche Diagnostics)とH747(Hitachi/Roche)による標準の診断手順を用いて測定される。IPTT-200トランスポンダチップおよびDAS 5002チップリーダー(Biomedic Data Systems、Seaford, Dellaware, USA)を用いて、各マウスについて毎日体重を監視し、マウスの体温を測定する。
（実施例2：オリゴヌクレオチドによる3日間の処置後のin vivoでの補体mRNAレベル）
NMRI nu/nuマウスでC6 mRNAのレベルを低下させるために、上の表1に示すLNAオリゴヌクレオチドを用いた。1匹のPBS対照マウスを含め、処置群につき4匹の動物を用いた(合計15匹のマウス)。マウスは、1、2および3日目に各オリゴのIP注射(動物1kgにつき5mg)を投与された。マウスを4日目に屠殺し、肝臓を摘出した。RNAは、従来の手法を用いて調製した。C6mRNAは、製造業者の指示に従ってRoche lightcycler480およびユニバーサルプローブでqPCRを用いて定量化した。
図1は、補体アンチセンスLNAオリゴヌクレオチドによる3日間の処置後の、in vivoでの補体mRNAレベルを示す。2匹の動物が3日目に死に、1匹の動物が4日目に病的に見えたので、Oligo 1008(配列番号405)は有毒であった。
（実施例3：CH50アッセイBalb/Cマウス）
補体成分に対するアンチセンスオリゴマーを、齧歯動物とヒトとの間で高い相同性を有する配列に対して設計した。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、ロック核酸(LNA)で化学的に修飾した。LNAはオリゴをヌクレアーゼから保護し、相補的mRNA配列への親和性(Tm)を高める。オリゴヌクレオチドは、ギャップマーとして設計した。このことは、オリゴの5’末端の最後の3つの部位および3’末端の最後から2番目から数えて3つの部位はLNA部分を含むが、中央および3’末端の最後の部位はDNA類似体以外からなることを意味する。
すべてのアンチセンスオリゴヌクレオチド(ODN)は、市販のDNAおよびLNAホスホラミダイト(Exiqon A/S、Denmark)を用いる自動DNA合成装置で、すべてがホスホロチオエートの誘導体として合成した。すべてのODNで、5-メチル-Cを用いた。DMT-オンODNは、逆相HPLC(RP-HPLC)によって精製した(純度>95%)。DMT基の除去の後、ODNをAE-HPLCによって特徴づけし、予想される分子量を、ESI-MSおよびマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析(MALDI-TOF)によってBiflex III MALDI(Brucker instruments、Leipzig, Germany)で確認した。
マウス。動物を含むすべての実験は、地元の倫理委員会によって是認され、オランダの法律に完全に適合する。皮下に移植したALZET 1002浸透圧ミニポンプ(Durect Corporation、Cupertino, CA, USA)を用いて、7〜8週齢雌Balb/Cマウス(Harlan)にオリゴヌクレオチドを投与した。ODNおよびsiRNAは、PBSに溶解させた。投薬量は図に示す通り。
CH50溶血性アッセイ。循環中の膜攻撃複合体(MAC)活性に及ぼす肝臓中の補体ノックダウンの影響を測定するために、溶血性CH50アッセイを用いた。このアッセイは、血清中のMACの溶血性活性を測定する。感作赤血球をマウスの血清に加えて、MACの活性は、分光計を用いて赤血球溶解の量として測定することができる。血液をマウスから採取し、これを氷上で1時間凝固させた。次に、血清を単離し、20ul試料に等分し、液体窒素で直ちに凍結させた。CH50アッセイは、マウス抗ラビット赤血球ポリクローナル抗血清(Paul Morgan、Cardiff University)を用いて感作させたウサギ赤血球を用いて実行した。アッセイの感度を高めるために、ウサギ赤血球は使用時に少なくとも1カ月齢であった(しかし、3カ月齢を超えない)。37℃の10μlのマウス血清の存在下で、感作ウサギ赤血球(50μl)をベロナール緩衝食塩水(40μl)にインキュベートする。100%溶解値を得るために、100μlの水を加える。30〜60分後、残りの赤血球を遠心沈降させ、分光計を用いてOD405 nmを測定する。
図2は、2つの対照と比較して、Oligo 1009(配列番号409)、Oligo 1010(配列番号413)、Oligo 1014(C8a適用、配列番号327)、Oligo 1018(C8b適用、配列番号336)、Oligo 1019(C8b適用、配列番号338)がMAC形成を阻害する能力を示したことを示す。qPCRで測定した場合、すべてのオリゴヌクレオチドは、肝臓でのそれらの目的の標的のノックダウンを少なくとも70%媒介した。投薬量は、5mg/kg/日を2週間。オリゴ1614は、補体レベルに対する活性のないスクランブル化オリゴヌクレオチド対照である。MAC活性は、上記のCH50溶血性アッセイを用いて測定した。データは、群につき5匹のマウスの平均±SEMで表す。
（実施例4：siRNA構築物は、C6 mRNAを低減させる）
上で概説される手順を用いて、Oligo 1010(配列番号413)を作製した。0.5mg/kg〜5mg/kgを、上に述べたようにマウスに注射した。以下の通り、C6発現を測定するためにqPCRを用いた:動物を屠殺し、保存液としてRNA later(Ambion)を用いて肝臓試料を取り出した。Magnalyzerおよびmagnalyzerビーズ(Roche)を用いて肝臓をトリゾール(trizol)でホモジナイズした。製造業者(Invitrogen)の指示に従ってTrizolを用いてRNAを単離した。cDNAは、oligodTプライマーおよびSuperScriptII酵素(Invitrogen)を用いて作製した。qPCRは、ユニバーサルプローブプライマー(Roche)およびLightcycler480(Roche)を用いて実行した。すべてのデータは、ハウスキーピング遺伝子/ローディング対照としてHprt1(ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ1)を用いて補正した。すべての反応を3反復で実行し、qPCR条件は、製造業者(Roche)によって推奨される標準であった。さらに、アンチセンスオリゴOligo 1010(配列番号413)が標的とする配列に対して相同的なLNA修飾siRNAを、作製した。
アンチセンスオリゴOligo 1010(配列番号413)が標的とする配列に対して相同的なLNA修飾siRNAも設計した。このsiRNAは、両方の鎖の3’オーバーハングにLNA修飾を、およびセンス(パッセンジャー)鎖の5’末端に1つのLNAを有する。
LNA修飾siRNAは、自動DNA/RNAシンセサイザーで合成した。RNA合成周期(1〜5μmolスケール)、O2’-TBDMS保護RNAホスホラミダイトおよび一般的な試薬を用い、すべてのモノマーの段階的カップリング収率は、>99%であった。修飾ヌクレオチドの組込みのために、10分間のカップリング時間を用いた。標準的な脱保護、精製およびワークアップの後、生じたsiRNAの組成および純度(>80%)を、MALDI-MS分析およびイオン交換HPLCによって確認した。
図3は、Balb/Cマウスに投与されたOligo 1010の量とC6 mRNAの補正レベルとの間に、線形相関があったことを示す。図は、対照と比較して、siRNA構築物がC6 mRNAを低減させたことも示す。詳細には、qPCRで測定した場合、相同的なLNA修飾siRNA配列による処置の効果と比較して、Oligo 1010は、Balb/Cマウスの肝臓でのC6 mRNA発現に対してin vivoで用量効果を有した。データは、群につき5匹のマウスの平均±SEMで表す。
（実施例5：神経圧挫アッセイ）
神経圧挫アッセイは、圧挫の後の末梢神経の回復に対する補体阻害の影響を測定する。アッセイは、Ramaglia, V.ら(2007)7月18日: 27(29) 7663頁およびそこに開示されている参考文献によって一般に開示されている。簡潔には、動物をアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは対照としてPBSで14日間処置し、その後神経圧挫を加える。すべての外科的手順は、深いイソフルラン麻酔(1.5v/lのイソフルランおよび1.0v/lのO2)の下で、無菌的に実施した。上腿の切開を通して、左の坐骨神経を曝露させた。神経は、平滑な鉗子を用いて、坐骨神経ノッチのレベルで3×10秒間押しつぶした。右の足は、対照の役目を果たした。疑似手術を実施し、坐骨神経を曝露させたがその妨害をしなかった。次に、筋肉および皮膚を縫合で閉じた。手術後の回復期間中、マウスは痛覚消失の状態にあった。それらを、損傷の直前にブプレノルフィン(Temgesic(登録商標)、Schering-Plough、The Netherlands)の1用量(0.05mg/kg)で、および損傷の1日後に第二の用量の鎮痛薬で処置した。感覚機能は、フットフリック(footflick)試験を用いて測定した。この試験では、2本の刺激電極を用いて足裏に可変電流(0.1〜0.5mA)を与える。動物がその足を引っ込めた場合、応答は陽性と評価した。引込み応答を引き出すために必要な最小電流(mA)を記録した。値は、正常な機能(右の対照足)の割合で表す。このアッセイを用いて、本発明の少なくとも1つのオリゴマーが、フットフリック(footlick)試験で有意な活性を示した。詳細には、適する担体中のオリゴマーを投与されたマウスは、7日目頃にフットフリックアッセイで50%の回復を示した。未処置の動物は、11日目頃に同じ回復を示した。
本明細書で指摘されるすべての参考文献(すべての特許文書および学術文書を含む)の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明は、その好ましい実施形態に関して詳細に記載されている。しかし、当分野の当業者が、この開示を考慮した後、本発明の精神および範囲内で変更および改善を加えることができることはいうまでもない。

Claims (30)

  1. 配列番号1によって表される補体成分6(C6)配列、またはその天然に存在する対立遺伝子変異体をコードする核酸の対応する領域に少なくとも95%の配列同一性を有する連続した核酸塩基配列を有する、長さが約10〜50ヌクレオチドのオリゴマーであって、少なくとも1つのヌクレオチド類似体を含み、qPCRアッセイで測定した場合、哺乳動物でのC6 mRNAの発現レベルを少なくとも20%低減することができるオリゴマー。
  2. 修飾されたヌクレオシド間結合および修飾された核酸塩基の少なくとも1つをさらに含む、請求項1に記載のオリゴマー。
  3. 前記ヌクレオチド類似体が、2’-O-メトキシエチル修飾糖部分、2’-メトキシ修飾糖部分、2’-O-アルキル修飾糖部分、および二環式糖部分からなる群から選択される修飾糖部分である、請求項2に記載のオリゴマー。
  4. 前記二環式糖部分がロック核酸(LNA)モノマーである、請求項3に記載のオリゴマー。
  5. 前記オリゴマーの3’および5’末端のそれぞれで2つまたは3つのLNAモノマーを含むギャップマーである、請求項4に記載のオリゴマー。
  6. 前記オリゴマーの5’および3’ウィングセグメント、ならびに任意選択で5’および3’末端の片方または両方の間に位置する2’-デオキシヌクレオチドをさらに含む、請求項5に記載のオリゴマー。
  7. 前記修飾されたヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項2に記載のオリゴマー。
  8. 前記修飾された核酸塩基が5-メチルシトシンである、請求項2に記載のオリゴマー。
  9. 長さが約12〜約20ヌクレオチドである、請求項1に記載のオリゴマー。
  10. 長さが約15〜約18ヌクレオチドである、請求項9に記載のオリゴマー。
  11. 配列番号1のATG開始部位(「A」から開始する)を出発点とする、ヌクレオチド約1〜332、253〜653、266〜766、526〜926、853〜1253を標的にする、請求項1に記載のオリゴマー。
  12. 配列番号1のATG開始部位を出発点とする、ヌクレオチド約112〜152、433〜473、546〜586、706〜746または1015〜1055を標的にする、請求項11に記載のオリゴマー。
  13. 配列番号1によって表される補体成分C6配列に少なくとも96%、97%、98%または99%の配列同一性を有する、請求項1に記載のオリゴマー。
  14. 配列番号1によって表される補体成分C6配列に関して、1、2または3個のミスマッチを含む、請求項1に記載のオリゴマー。
  15. アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項1に記載のオリゴマー。
  16. 請求項1に記載のオリゴマー、および薬学的に許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントを含む医薬組成物。
  17. 細胞または組織中の補体成分6(C6)の発現をin vivoで低減または阻害する方法であって、補体成分6(C6)の発現が低減または阻害されるように、前記細胞または組織を請求項1に記載のオリゴマーと接触させる段階を含む方法。
  18. 前記オリゴマーの投与の後に、補体成分6(C6)、前記タンパク質をコードするmRNAおよび膜攻撃複合体(MAC)の少なくとも1つを測定する段階をさらに含む、請求項17に記載の方法。
  19. 細胞または組織中の膜攻撃複合体(MAC)の生成をin vivoで低減または阻害する方法であって、前記MACの発現が低減または阻害されるように、前記細胞または組織を請求項1に記載のオリゴマーと接触させる段階を含む方法。
  20. 前記オリゴマーの投与の後に、前記MAC、補体成分6(C6)および補体成分6をコードするmRNAの少なくとも1つを測定する段階をさらに含む、請求項19に記載の方法。
  21. 補体系の望ましくない活性によって媒介される障害を治療、予防するか、またはその症状を軽減するための方法であって、その必要性のある哺乳動物に請求項16に記載の医薬組成物を投与する段階を含む方法。
  22. 前記障害が慢性脱髄性神経障害である、請求項21に記載の方法。
  23. 前記慢性脱髄性神経障害が多発性硬化症である、請求項22に記載の方法。
  24. Rebif(登録商標)(インターフェロンβ-1a)、Avonex(登録商標)(インターフェロンβ-1a)、Betaseron(登録商標)(インターフェロンβ-1b)、Copaxone(登録商標)(ガラティラメルアセテート)、Novantrone(登録商標)(ミトザントロン)およびTysabri(登録商標)(ナタリズマブ)の少なくとも1つを投与する段階をさらに含む、請求項23に記載の方法。
  25. 補体系の望ましくない活性によって媒介される障害を治療、予防するか、またはその症状を軽減するための方法であって、その必要性のある哺乳動物に請求項16に記載の医薬組成物を投与する段階を含み、抗炎症剤および補体阻害剤の1つまたは複数の投与をさらに含む方法。
  26. 前記障害が神経外傷である、請求項21に記載の方法。
  27. 前記神経外傷が外傷性脳損傷(TBI)である、請求項26に記載の方法。
  28. 軸索再生を必要とする状態の治療のための医薬の製造のための、少なくとも1つの請求項1に記載の組成物の使用。
  29. 慢性脱髄性状態の治療のための医薬の製造のための、少なくとも1つの請求項1に記載の組成物の使用。
  30. 前記慢性脱髄性状態が多発性硬化症である、請求項27に記載の使用。
JP2011517368A 2008-07-10 2009-07-10 補体アンタゴニストおよびその使用 Pending JP2011527568A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US7950108P 2008-07-10 2008-07-10
US61/079,501 2008-07-10
PCT/NL2009/050418 WO2010005310A2 (en) 2008-07-10 2009-07-10 Complement antagonists and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2011527568A true JP2011527568A (ja) 2011-11-04

Family

ID=41507609

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2011517368A Pending JP2011527568A (ja) 2008-07-10 2009-07-10 補体アンタゴニストおよびその使用

Country Status (18)

Country Link
US (2) US8703730B2 (ja)
EP (1) EP2320925B1 (ja)
JP (1) JP2011527568A (ja)
KR (1) KR20110044983A (ja)
CN (2) CN103740713A (ja)
AU (1) AU2009270020B2 (ja)
CA (1) CA2730203C (ja)
CY (1) CY1117476T1 (ja)
DK (1) DK2320925T3 (ja)
ES (1) ES2566008T3 (ja)
HR (1) HRP20160261T1 (ja)
HU (1) HUE027169T2 (ja)
IL (1) IL210506A (ja)
NZ (1) NZ591057A (ja)
PL (1) PL2320925T3 (ja)
SI (1) SI2320925T1 (ja)
SM (1) SMT201600098B (ja)
WO (1) WO2010005310A2 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015518704A (ja) * 2012-04-02 2015-07-06 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 膜タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド
JP2022000023A (ja) * 2015-07-22 2022-01-04 ウェイブ ライフ サイエンシズ リミテッドWave Life Sciences Ltd. オリゴヌクレオチド組成物およびその方法
JP7459691B2 (ja) 2012-04-23 2024-04-02 ヴィコ セラピューティクス ビー．ヴイ． 神経筋障害の治療のための改善された特徴を有するｒｎａ調節オリゴヌクレオチド

Families Citing this family (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8097712B2 (en) 2007-11-07 2012-01-17 Beelogics Inc. Compositions for conferring tolerance to viral disease in social insects, and the use thereof
US8962584B2 (en) 2009-10-14 2015-02-24 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem, Ltd. Compositions for controlling Varroa mites in bees
WO2011105902A2 (en) 2010-02-23 2011-09-01 Academisch Ziekenhuis Bij De Universiteit Van Amsterdam Antagonists of complement component 8-beta (c8-beta) and uses thereof
WO2011105901A2 (en) 2010-02-23 2011-09-01 Academisch Ziekenhuis Bij De Universiteit Van Amsterdam Antagonists of complement component 9 (c9) and uses thereof
WO2011105900A2 (en) 2010-02-23 2011-09-01 Academisch Ziekenhuis Bij De Universiteit Van Amsterdam Antagonists of complement component 8-alpha (c8-alpha) and uses thereof
ES2641642T3 (es) 2010-03-08 2017-11-10 Monsanto Technology Llc Moléculas de polinucleótido para regulación génica en plantas
US10760086B2 (en) 2011-09-13 2020-09-01 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US20130326731A1 (en) 2011-09-13 2013-12-05 Daniel Ader Methods and compositions for weed control
CN103930549B (zh) 2011-09-13 2020-09-18 孟山都技术公司 用于杂草控制的方法和组合物
EP2756085B1 (en) 2011-09-13 2019-03-20 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for weed control
BR112014005958A2 (pt) 2011-09-13 2020-10-13 Monsanto Technology Llc métodos e composições químicas agrícolas para controle de planta, método de redução de expressão de um gene accase em uma planta, cassete de expressão microbiana, método para fazer um polinucleotídeo, método de identificação de polinucleotídeos úteis na modulação de expressão do gene accase e composição herbicida
US9416363B2 (en) 2011-09-13 2016-08-16 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
MX350774B (es) 2011-09-13 2017-09-15 Monsanto Technology Llc Métodos y composiciones para el control de malezas.
PL2755467T4 (pl) 2011-09-13 2018-01-31 Monsanto Technology Llc Sposoby i kompozycje do kontroli chwastów
US10806146B2 (en) 2011-09-13 2020-10-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US10829828B2 (en) 2011-09-13 2020-11-10 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
UA116089C2 (uk) 2011-09-13 2018-02-12 Монсанто Текнолоджи Ллс Спосіб та композиція для боротьби з бур'янами (варіанти)
US9878056B2 (en) 2012-04-02 2018-01-30 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides
CA2873828A1 (en) 2012-05-24 2013-11-28 A.B. Seeds Ltd. Naked dsrna for silencing target molecules in plant seeds
EP3622810B1 (en) 2012-09-24 2024-01-03 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Methods and compositions for extending shelf life of plant products
US10260089B2 (en) 2012-10-29 2019-04-16 The Research Foundation Of The State University Of New York Compositions and methods for recognition of RNA using triple helical peptide nucleic acids
WO2014096958A1 (en) 2012-11-02 2014-06-26 Academisch Medisch Centrum Inosine monophosphate and salts thereof for use in the treatment of complement-related disorders
JP6452614B2 (ja) 2012-11-15 2019-01-16 ロシュ イノベーション センター コペンハーゲン エーエス オリゴヌクレオチドコンジュゲート
US10683505B2 (en) 2013-01-01 2020-06-16 Monsanto Technology Llc Methods of introducing dsRNA to plant seeds for modulating gene expression
BR112015015975A2 (pt) 2013-01-01 2018-11-06 A. B. Seeds Ltd. moléculas de dsrna isoladas e métodos de uso das mesmas para silenciamento das moléculas alvo de interesse.
CN105188382B (zh) 2013-01-15 2019-02-19 孟山都技术公司 用于植物害虫控制的方法和组合物
MY177989A (en) 2013-01-30 2020-09-28 Hoffmann La Roche Lna oligonucleotide carbohydrate conjugates
BR112015022797A2 (pt) 2013-03-13 2017-11-07 Monsanto Technology Llc método para controle de ervas daninhas, composição herbicida, cassete de expressão microbiano e método de produção de polinucleotídeo
EP3604535A3 (en) 2013-03-13 2020-04-22 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for weed control
US20140283211A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Monsanto Technology Llc Methods and Compositions for Plant Pest Control
US10568328B2 (en) 2013-03-15 2020-02-25 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
WO2015010026A2 (en) 2013-07-19 2015-01-22 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling leptinotarsa
US9850496B2 (en) 2013-07-19 2017-12-26 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling Leptinotarsa
WO2015038939A2 (en) * 2013-09-13 2015-03-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulators of complement factor b
AU2014341879B2 (en) 2013-11-04 2020-07-23 Beeologics, Inc. Compositions and methods for controlling arthropod parasite and pest infestations
UA119253C2 (uk) 2013-12-10 2019-05-27 Біолоджикс, Інк. Спосіб боротьби із вірусом у кліща varroa та у бджіл
MX368629B (es) 2014-01-15 2019-10-08 Monsanto Technology Llc Metodos y composiciones para el control de malezas utilizando polinucleotidos de 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (epsps).
EP3125676A4 (en) 2014-04-01 2018-02-14 Monsanto Technology LLC Compositions and methods for controlling insect pests
MX2016014294A (es) 2014-05-01 2017-02-02 Ionis Pharmaceuticals Inc Composiciones y metodos para modular la expresion del factor b del complemento.
AU2015280252A1 (en) 2014-06-23 2017-01-12 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for regulating gene expression via RNA interference
WO2015200539A1 (en) 2014-06-25 2015-12-30 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for delivering nucleic acids to plant cells and regulating gene expression
AU2015296700B2 (en) 2014-07-29 2021-10-21 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling insect pests
CA2971542A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Regenesance B.V. Antibodies that bind human c6 and uses thereof
WO2016118007A1 (en) 2015-01-21 2016-07-28 Regenesance B.V. Means and methods for counteracting complement-mediated hemolytic anemia
UA124255C2 (uk) 2015-01-22 2021-08-18 Монсанто Текнолоджі Елелсі Інсектицидна композиція та спосіб боротьби з leptinotarsa
UY36703A (es) 2015-06-02 2016-12-30 Monsanto Technology Llc Composiciones y métodos para la administración de un polinucleótido en una planta
US10655136B2 (en) 2015-06-03 2020-05-19 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for introducing nucleic acids into plants
AU2017212500B9 (en) 2016-01-26 2023-05-11 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling insect pests

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003066805A2 (en) * 2001-10-23 2003-08-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of complement component c3 expression
WO2008044928A1 (en) * 2006-10-10 2008-04-17 Academisch Ziekenhuis Bij De Universiteit Van Amsterdam Complement inhibition for improved nerve regeneration

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2305812A3 (en) * 2002-11-14 2012-06-06 Dharmacon, Inc. Fuctional and hyperfunctional sirna
AU2005248147A1 (en) * 2004-05-11 2005-12-08 Alphagen Co., Ltd. Polynucleotides for causing RNA interference and method for inhibiting gene expression using the same
CA2903896A1 (en) * 2005-11-04 2007-05-18 Genentech, Inc. Use of complement pathway inhibitors to treat ocular diseases
ATE466081T1 (de) * 2005-12-22 2010-05-15 Opko Ophthalmics Llc Zusammensetzungen und verfahren zur regulierung eines komplementsystems

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003066805A2 (en) * 2001-10-23 2003-08-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of complement component c3 expression
WO2008044928A1 (en) * 2006-10-10 2008-04-17 Academisch Ziekenhuis Bij De Universiteit Van Amsterdam Complement inhibition for improved nerve regeneration

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6014003685; Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ． Ｖｏｌ．　３０，　Ｎｏ．　９, 2002, ｐ．　１９１１-１９１８ *
JPN6014003687; Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ． Ｖｏｌ．　３５，　Ｎｏ．　２, 2007, ｐ．　６８７-７００ *
JPN6014003689; Ｍｏｌ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒ． Ｖｏｌ．　５，　Ｎｏ．　７, 2006, ｐ．　１６８３-１６９２ *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015518704A (ja) * 2012-04-02 2015-07-06 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 膜タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド
JP7459691B2 (ja) 2012-04-23 2024-04-02 ヴィコ セラピューティクス ビー．ヴイ． 神経筋障害の治療のための改善された特徴を有するｒｎａ調節オリゴヌクレオチド
JP2022000023A (ja) * 2015-07-22 2022-01-04 ウェイブ ライフ サイエンシズ リミテッドWave Life Sciences Ltd. オリゴヌクレオチド組成物およびその方法
JP7441816B2 (ja) 2015-07-22 2024-03-01 ウェイブ ライフ サイエンシズ リミテッド オリゴヌクレオチド組成物およびその方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP2320925B1 (en) 2015-12-23
CA2730203A1 (en) 2010-01-14
AU2009270020A2 (en) 2011-01-27
PL2320925T3 (pl) 2016-06-30
SMT201600098B (it) 2016-04-29
CN103740713A (zh) 2014-04-23
IL210506A0 (en) 2011-03-31
US20150211003A9 (en) 2015-07-30
WO2010005310A2 (en) 2010-01-14
SI2320925T1 (sl) 2016-05-31
US20110171176A1 (en) 2011-07-14
AU2009270020B2 (en) 2014-09-25
CY1117476T1 (el) 2017-04-26
US8703730B2 (en) 2014-04-22
CN102149390A (zh) 2011-08-10
HRP20160261T1 (hr) 2016-06-03
ES2566008T3 (es) 2016-04-08
IL210506A (en) 2015-06-30
CA2730203C (en) 2016-12-13
WO2010005310A3 (en) 2010-04-15
US9089555B2 (en) 2015-07-28
AU2009270020A1 (en) 2010-01-14
NZ591057A (en) 2012-11-30
US20140301982A1 (en) 2014-10-09
EP2320925A2 (en) 2011-05-18
DK2320925T3 (en) 2016-03-21
HUE027169T2 (en) 2016-10-28
KR20110044983A (ko) 2011-05-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9089555B2 (en) Complement antagonists and uses thereof
JP7037681B2 (ja) Ｔｍｐｒｓｓ６発現を調節するための化合物及び方法
KR101877698B1 (ko) 결합 조직 성장 인자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 그의 용도
US10912792B2 (en) Compounds and methods for modulating angiotensinogen expression
JP6538736B2 (ja) Ｇｃｇｒ発現のアンチセンス調整
CN105814204B (zh) 促血管生成素样3表达的调节
JP2018150351A (ja) 結合組織増殖因子（ｃｔｇｆ）をターゲティングするアンチセンス化合物を用いた、ケロイドまたは肥厚性瘢痕の治療法
US20110237646A1 (en) Modulation of transthyretin expression for the treatment of cns related disorders
JP2015501155A (ja) Ｇｃｃｒ発現のアンチセンス調整
JP2010510807A (ja) 高コレステロール血症を治療するための方法
JP2010539950A (ja) 線維芽細胞増殖因子受容体４発現のアンチセンスモジュレーション
JP2021500903A (ja) ＥＮａＣ発現の調節因子
WO2011105902A2 (en) Antagonists of complement component 8-beta (c8-beta) and uses thereof
WO2011105900A2 (en) Antagonists of complement component 8-alpha (c8-alpha) and uses thereof
WO2011105901A2 (en) Antagonists of complement component 9 (c9) and uses thereof
AU2014280940A1 (en) Complement antagonists and uses thereof
TW202321452A (zh) 用於抑制血管生成素樣３（ａｎｇｐｔｌ３）蛋白表達的組合物和方法
WO2021030867A1 (en) Method of modulating adiposity

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20120620

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20140203

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20140425

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20140507

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20140801

A711 Notification of change in applicant

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711

Effective date: 20141209

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20141209

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20150302