JP2011527182A - 可溶性キャノーラタンパク質単離物の製造 - Google Patents

Abstract

酸性水性環境において可溶性で透明なアルブミンおよびグロブリンの両タンパク質画分を含むキャノーラタンパク質単離物を提供する。キャノーラタンパク質単離物は、低ｐＨで水に完全に可溶性であり、フィチン酸が少なく、食用、ペットフード用および水産養殖用の製品に有用である。

Description

本出願は、２００８年７月１１日出願の米国仮特許出願第６１／１２９，６７３号に基づく、米国特許法第１１９条（ｅ）の下での優先権を主張する。
発明の分野
本発明は、キャノーラタンパク質単離物の製造に関する。

発明の背景
少なくとも１００ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有するキャノーラ油糧種子タンパク質単離物は、共に本譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれた、同時係属の２００２年５月３日出願の米国特許出願第１０／１３７，３９１号（米国特許出願公開第２００３−０１２５５２６Ａ１号およびＷＯ０２／０８９５９７）および２００４年６月９日出願の米国特許出願第１０／４７６，２３０号（米国特許出願公開第２００４−０２５４３５３Ａ１号）に記載の方法によって油糧種子粗粉から形成することができる。この手順は、塩水溶液を用いてキャノーラ油糧種子粗粉を抽出するステップと、得られたタンパク質水溶液を残留油糧種子粗粉から分離するステップと、選択的膜技術を用いてイオン強度を実質的に一定に維持しながら、水溶液のタンパク質濃度を少なくとも約２００ｇ／Ｌに増加させるステップと、得られた濃縮タンパク質溶液を冷水中に希釈し、タンパク質のミセルの形成をもたらすステップと、タンパク質のミセルを沈降させて非晶質、粘着性で、ゼラチン状のグルテン様タンパク質ミセル塊（ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｃｅｌｌａｒ ｍａｓｓ）（ＰＭＭ）を形成するステップと、タンパク質ミセル塊を、少なくとも約１００ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有する上澄み液から回収するステップとを含む多数のステップのプロセスを含む。本明細書で用いる場合、タンパク質含量は、乾燥重量基準で測定される。回収したＰＭＭは乾燥することができる。

本方法の一実施形態では、ＰＭＭ沈降ステップからの上澄み液を処理して、キャノーラタンパク質単離物を上澄み液から回収する。この手順は、最初に限外濾過膜を使用して上澄み液を濃縮し、濃縮物を乾燥させることによって行うことができる。得られるキャノーラタンパク質単離物は、少なくとも約９０ｗｔ％、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有する。

米国特許出願第１０／１３７，３９１号に記載の手順は、基本的に回分式手順である。共に本譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれた、同時係属の２００２年１１月１９日出願の米国特許出願第１０／２９８，６７８号（米国特許出願公開第２００４−００３９１７４Ａ１号およびＷＯ０３／０４３４３９）および２００５年３月１５日出願の米国特許出願第１０／４９６，０７１号（米国特許出願公開第２００７−００１５９１０号）では、キャノーラタンパク質単離物を作るための連続プロセスが記載されている。それによると、キャノーラ油糧種子粗粉を塩水溶液と連続的に混合し、その混合物をパイプを通して輸送し、同時にキャノーラ油糧種子粗粉からタンパク質を抽出してタンパク質水溶液を形成し、そのタンパク質水溶液を選択的膜操作によって連続的に輸送して、イオン強度を実質的に一定に維持しながらタンパク質水溶液のタンパク質含量を少なくとも約５０ｇ／Ｌに増加させ、得られた濃縮タンパク質溶液を冷水と連続的に混合してタンパク質のミセルの形成をもたらし、そのタンパク質のミセルを連続的に沈降させ、同時に所望の量のＰＭＭが沈降容器に蓄積するまで上澄み液を連続的にあふれさせる（ｏｖｅｒｆｌｏｗｅｄ）。ＰＭＭを沈降容器から回収し、乾燥させることができる。ＰＭＭは、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％のタンパク質含量を有する。上記のように、あふれた上澄み液を処理してそこからキャノーラタンパク質単離物を回収することができる。

キャノーラ種子は、約１０〜約３０ｗｔ％のタンパク質を含むことが知られており、いくつかの異なるタンパク質成分が同定されている。これらのタンパク質には、クルシフェリン（ｃｒｕｃｉｆｅｒｉｎ）として知られている１２Ｓグロブリン、７Ｓタンパク質およびナピン（ｎａｐｉｎ）として知られている２Ｓ貯蔵タンパク質が含まれる。本譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれた、同時係属の２００３年４月１５日出願の米国特許出願第１０／４１３，３７１号（米国特許出願公開第２００４−００３４２００号およびＷＯ０３／０８８７６０）および２００５年４月２９日出願の米国特許出願第１０／５１０，７６６号（米国特許出願公開第２００５−０２４９８２８号）に記載のように、濃縮タンパク質水溶液を希釈してＰＭＭを形成し、上澄み液を処理して追加のタンパク質を回収することを含む上記手順によって、異なるタンパク質プロファイルの単離物の回収がもたらされる。

この点について、ＰＭＭ由来のキャノーラタンパク質単離物は、約６０〜約９８ｗｔ％の７Ｓタンパク質、約１〜約１５ｗｔ％の１２Ｓタンパク質および０〜約２５ｗｔ％の２Ｓタンパク質のタンパク質成分含量を有する。上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物は、約６０〜約９５ｗｔ％の２Ｓタンパク質、約５〜約４０ｗｔ％の７Ｓタンパク質および０〜約５ｗｔ％の１２Ｓタンパク質のタンパク質成分含量を有する。したがって、ＰＭＭ由来のキャノーラタンパク質単離物は、主として７Ｓタンパク質であり、上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物は、主として２Ｓタンパク質である。上記米国特許出願第１０／４１３，３７１号および第１０／５１０，７６６号に記載のように、２Ｓタンパク質は、約１４０００ダルトンの分子サイズを有し、７Ｓタンパク質は約１４５０００ダルトンの分子質量を有し、１２Ｓタンパク質は約２９００００ダルトンの分子サイズを有する。

本譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれた、同時係属の２００５年１月２１日出願の米国特許出願第１１／０３８，０８６号（ＷＯ２００５／０６７７２９）および２００８年６月２０日出願の第１２／２１３，５００号（米国特許出願公開第２００８／０２９９２８２号）に記載のように、上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物を処理して、広範囲のｐＨ値での溶解度および水性媒体中の透明度を含め、上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物によって共有されない特性を有する形態を得ることができる。これらの特性により、特に酸性のｐＨ値で、処理した上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物を利用してキャノーラタンパク質強化飲料を得ることが可能になる。

キャノーラは、菜種またはアブラナとしても知られている。

米国特許出願公開第２００３−０１２５５２６号 米国特許出願公開第２００４−０２５４３５３号 米国特許出願公開第２００４−００３９１７４号 米国特許出願公開第２００７−００１５９１０号 米国特許出願公開第２００４−００３４２００号 米国特許出願公開第２００５−０２４９８２８号 ＷＯ２００５／０６７７２９ 米国特許出願公開第２００８−０２９９２８２号

本発明者らは今回、上記手順の穏やかな処理条件を保持しつつも、タンパク質ミセル塊を沈殿させることなく、酸性水性環境において可溶性で透明なアルブミンおよびグロブリンの両タンパク質画分を含むキャノーラタンパク質単離物を製造する方法を発見した。得られたキャノーラタンパク質単離物は、低ｐＨで水に完全に可溶性であるだけでなく、フィチン酸が少なく、食用、ペットフード用および水産養殖用の製品に有用でもある。

本発明の一態様によると、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％のキャノーラタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を製造する方法であって、
（ａ）少なくとも約５℃の温度でキャノーラ種子粗粉（ｃａｎｏｌａ ｓｅｅｄ ｍｅａｌ）を抽出して、粗粉からキャノーラタンパク質を可溶化し、約５〜約４０ｇ／Ｌのタンパク質含量および約５〜約６．８のｐＨを有するタンパク質水溶液を形成するステップと、
（ｂ）タンパク質水溶液を使用済み油糧種子粗粉から分離するステップと、
（ｃ）選択的膜技術を用いてイオン強度を実質的に一定に維持しながら、タンパク質水溶液のタンパク質濃度を約５０〜約２５０ｇ／Ｌに増加させて、第１の濃縮タンパク質溶液を得るステップと、
（ｄ）任意選択で第１の濃縮タンパク質溶液を透析濾過するステップと、
（ｅ）第１の濃縮タンパク質溶液にカルシウム塩溶液を添加して約１５〜約２５ｍＳの導電率にし、第１の濃縮タンパク質溶液中に沈殿を形成させるステップと、
（ｆ）沈殿を第１の濃縮タンパク質溶液から除去するステップと、
（ｇ）約２〜約９０℃、好ましくは約１０〜約５０℃、より好ましくは約２０〜約３０℃の温度の、約２〜約２０、好ましくは約１０〜約１５、より好ましくは約１０倍容の水（ｖｏｌｕｍｅｓ ｏｆ ｗａｔｅｒ）で、清澄化した第１の濃縮タンパク質溶液を希釈するステップと、
（ｈ）得られた溶液を約２．５〜約４．０のｐＨに酸性化して、酸性化した透明なタンパク質溶液を製造するステップと、
（ｉ）選択的膜技術を用いてイオン強度を実質的に一定に維持しながら、酸性化した透明なタンパク質溶液の濃度を約５０〜約２５０ｇ／Ｌに増加させて、第２の濃縮タンパク質溶液を得るステップと、
（ｊ）任意選択で第２の濃縮タンパク質溶液を透析濾過するステップと、
（ｋ）任意選択で第２の濃縮タンパク質溶液を乾燥させて、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を得るステップと
を含む方法が提供される。

本発明に従って、この手順のいくつもの変法を採用して、酸性水性環境において可溶性で透明なアルブミンおよびグロブリンの両画分から構成されるキャノーラタンパク質単離物を得ることができる。

１つのこのような変法では、油糧種子粗粉からの分離の後、溶液の濃縮の前に、塩化カルシウムをタンパク質水溶液に添加することができる。塩化カルシウムを添加した後、このステップで形成した沈殿を除去する。

得られたキャノーラタンパク質水溶液を、上記のように、濃縮、希釈、ｐＨ調整、さらなる濃縮および乾燥の各ステップによってさらに処理することができる。

したがって、本発明の別の態様では、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のキャノーラタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を製造する方法であって、
（ａ）少なくとも約５℃の温度でキャノーラ油糧種子粗粉を抽出して、粗粉からキャノーラタンパク質を可溶化し、約５〜約４０ｇ／Ｌのタンパク質含量および約５〜約６．８のｐＨを有するキャノーラタンパク質水溶液を形成するステップと、
（ｂ）キャノーラタンパク質水溶液を油糧種子粗粉から分離するステップと、
（ｃ）タンパク質水溶液にカルシウム塩溶液を加えて約１５〜約２５ｍＳ、好ましくは約１７〜約２０ｍＳの導電率にし、キャノーラタンパク質溶液中に沈殿を形成させるステップと、
（ｄ）沈殿をキャノーラタンパク質水溶液から除去するステップと、
（ｅ）選択的膜技術を用いてイオン強度を実質的に一定に維持しながら、タンパク質水溶液のタンパク質濃度を約５０〜約２５０ｇ／Ｌに増加させて、濃縮タンパク質溶液を得るステップと、
（ｆ）任意選択で濃縮タンパク質溶液を透析濾過するステップと、
（ｇ）温度が約２〜約９０℃の約２〜約２０、好ましくは約１０〜約１５倍容の水（ｖｏｌｕｍｅｓ ｏｆ ｗａｔｅｒ）で、濃縮タンパク質溶液を希釈するステップと、
（ｈ）得られた溶液を約２．５〜約４．０、好ましくは約３〜約３．５のｐＨに酸性化して、酸性化した透明なタンパク質溶液を製造するステップと、
（ｉ）選択的膜技術を用いてイオン強度を実質的に一定に維持しながら、酸性化した透明なタンパク質溶液の濃度を約５０〜約２５０ｇ／Ｌに増加させて、第２の濃縮タンパク質溶液を得るステップと、
（ｊ）任意選択で第２の濃縮タンパク質溶液を透析濾過するステップと、
（ｋ）任意選択で第２の濃縮タンパク質溶液を乾燥させて、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を形成するステップと
を含む方法が提供される。

あるいは、得られたキャノーラタンパク質水溶液を、２倍容の水（ｔｗｏ ｖｏｌｕｍｅｓ ｏｆ ｗａｔｅｒ）などによって希釈して導電率を減少させ、次いでＨＣｌでｐＨを調整することができる。次いで、得られた溶液を濃縮し、透析濾過してさらに導電率を減少させ、透明な低ｐＨの溶液を得て、乾燥に備えることができる。

本発明のさらなる態様によると、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のキャノーラタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を製造する方法であって、
（ａ）少なくとも約５℃の温度でキャノーラ油糧種子粗粉を抽出して、粗粉からキャノーラタンパク質を可溶化し、約５〜約４０ｇ／Ｌのタンパク質含量および約５〜約６．８のｐＨを有するキャノーラタンパク質水溶液を形成するステップと、
（ｂ）キャノーラタンパク質水溶液を油糧種子粗粉から分離するステップと、
（ｃ）タンパク質水溶液にカルシウム塩溶液を添加して約１５〜約２５ｍＳ、好ましくは約１７〜約２０ｍＳの導電率にし、キャノーラタンパク質水溶液中に沈殿を形成させるステップと、
（ｄ）沈殿をキャノーラタンパク質水溶液から除去するステップと、
（ｅ）温度が約２〜約９０℃の約０．５〜約１０倍容の水（ｖｏｌｕｍｅｓ ｏｆ ｗａｔｅｒ）で、キャノーラタンパク質水溶液を希釈するステップと、
（ｆ）得られた水溶液を約２．５〜約４．０、好ましくは約３〜約３．５のｐＨに酸性化して、酸性化した透明なタンパク質溶液を製造するステップと、
（ｇ）選択的膜技術を用いてイオン強度を実質的に一定に維持しながら、酸性化した透明なタンパク質溶液の濃度を約５０〜約２５０ｇ／Ｌに増加させて、濃縮タンパク質溶液を得るステップと、
（ｈ）任意選択で濃縮タンパク質溶液を透析濾過するステップと、
（ｉ）任意選択で濃縮タンパク質溶液を乾燥させて、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を得るステップと
を含む方法が提供される。

別のこのような変法では、塩化カルシウムを部分濃縮キャノーラタンパク質溶液に添加して、得られた沈殿を部分濃縮キャノーラタンパク質溶液から除去することができる。次いで、上記の希釈、ｐＨ調整、さらなる濃縮および乾燥の各ステップの前に、清澄化した溶液を最後の濃縮のために膜系に戻すことができる。

本発明のさらなる態様によると、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のキャノーラタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を製造する方法であって、
（ａ）少なくとも約５℃の温度でキャノーラ油糧種子粗粉を抽出して、粗粉中のキャノーラタンパク質を可溶化し、約５〜約４０ｇ／Ｌのタンパク質含量および約５〜約６．８のｐＨを有するタンパク質水溶液を形成するステップと、
（ｂ）タンパク質水溶液を使用済み油糧種子粗粉から分離するステップと、
（ｃ）選択的膜技術を用いてイオン強度を実質的に一定に維持しながら、タンパク質水溶液のタンパク質濃度を約５０ｇ／Ｌ以下に増加させて、部分濃縮タンパク質溶液を得るステップと、
（ｄ）部分濃縮タンパク質溶液にカルシウム塩溶液を添加して約１５〜約２５ｍＳ、好ましくは約１７〜約２０ｍＳの導電率にし、部分濃縮タンパク質溶液中に沈殿を形成させるステップと、
（ｅ）沈殿を部分濃縮タンパク質溶液から除去するステップと、
（ｆ）選択的膜技術を用いてイオン強度を実質的に一定に維持しながら、部分濃縮タンパク質溶液のタンパク質濃度を約５０〜約２５０ｇ／Ｌにさらに増加させて、濃縮タンパク質溶液を得るステップと、
（ｇ）任意選択で濃縮タンパク質溶液を透析濾過するステップと、
（ｈ）温度が約２〜約９０℃の約２〜約２０倍容の水（ｖｏｌｕｍｅｓ ｏｆ ｗａｔｅｒ）で、濃縮タンパク質溶液を希釈するステップと、
（ｉ）得られた溶液を約２．５〜約４．０、好ましくは約３〜約３．５のｐＨに酸性化して、酸性化した透明なタンパク質溶液を製造するステップと、
（ｊ）選択的膜技術を用いてイオン強度を実質的に一定に維持しながら、酸性化した透明なタンパク質溶液の濃度を約５０〜約２５０ｇ／Ｌに増加させて、第２の濃縮タンパク質溶液を得るステップと、
（ｋ）任意選択で第２の濃縮タンパク質溶液を透析濾過するステップと、
（ｌ）任意選択で第２の濃縮タンパク質溶液を乾燥させて、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を得るステップと
を含む方法が提供される。

あるいは、乾燥の前に、清澄化した部分濃縮キャノーラタンパク質溶液を十分に希釈して導電率を減少させ、ｐＨ調整し、次いで濃縮して透析濾過することができる。

したがって、本発明のさらなる態様では、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を製造する方法であって、
（ａ）少なくとも約５℃の温度でキャノーラ油糧種子粗粉を抽出して、粗粉からキャノーラタンパク質を可溶化し、約５〜約４０ｇ／Ｌのタンパク質含量および約５〜約６．８のｐＨを有するタンパク質水溶液を形成するステップと、
（ｂ）タンパク質水溶液を使用済み油糧種子粗粉から分離するステップと、
（ｃ）選択的膜技術を用いてイオン強度を実質的に一定に維持しながら、タンパク質水溶液のタンパク質濃度を、約５０ｇ／Ｌ以下に増加させて、部分濃縮タンパク質溶液を得るステップと、
（ｄ）濃縮タンパク質溶液にカルシウム塩溶液を添加して約１５〜約２５ｍＳ、好ましくは約１７〜約２０ｍＳの導電率にし、部分濃縮タンパク質溶液中に沈殿を形成させるステップと、
（ｅ）沈殿を部分濃縮タンパク質溶液から除去するステップと、
（ｆ）温度が約２〜約９０℃の約０．５〜約２０倍容の水（ｖｏｌｕｍｅｓ ｏｆ ｗａｔｅｒ）で、濃縮タンパク質溶液を希釈するステップと、
（ｇ）得られた溶液を約２．５〜約４．０、好ましくは約３〜約３．５のｐＨに酸性化して、酸性化した透明なタンパク質溶液を製造するステップと、
（ｈ）選択的膜技術を用いてイオン強度を実質的に一定に維持しながら、酸性化したキャノーラタンパク質溶液のタンパク質濃度を約５０〜約２５０ｇ／Ｌに増加させて、濃縮タンパク質溶液を得るステップと、
（ｉ）任意選択で濃縮タンパク質溶液を透析濾過するステップと、
（ｊ）任意選択で濃縮タンパク質溶液を乾燥させて、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を得るステップと
を含む方法が提供される。

さらなるこのような変法では、塩化カルシウム水溶液をキャノーラタンパク質抽出塩として使用して、キャノーラタンパク質を油糧種子粗粉から抽出し、フィチン酸塩を使用済み粗粉と共に除去することができる。このようにして製造したキャノーラタンパク質溶液を、濃縮および乾燥の前に、十分な倍容の水（ｅｎｏｕｇｈ ｖｏｌｕｍｅｓ ｏｆ ｗａｔｅｒ）で十分に希釈して導電率を減少させ、次いでｐＨ調整することができる。

本発明の別の態様によると、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のキャノーラタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を製造する方法であって、
（ａ）少なくとも約５℃の温度で、好ましくは約１．０Ｍ未満、より好ましくは約０．１〜約０．１５Ｍの濃度を有するカルシウム塩の水溶液でキャノーラ種子粗粉を抽出して、粗粉からキャノーラタンパク質を可溶化し、約５〜約４０ｇ／Ｌのタンパク質含量および約５〜約６．８のｐＨを有するキャノーラタンパク質水溶液を形成するステップと、
（ｂ）タンパク質水溶液を油糧種子粗粉から分離するステップと、
（ｃ）温度が約２〜約９０℃の約０．５〜約１０倍容の水（ｖｏｌｕｍｅｓ ｏｆ ｗａｔｅｒ）で、タンパク質水溶液を希釈するステップと、
（ｄ）得られた希釈キャノーラタンパク質溶液を約２．５〜約４、好ましくは約３〜約３．５のｐＨに酸性化して、酸性化した透明なタンパク質溶液を製造するステップと、
（ｅ）選択的膜技術を用いてイオン強度を実質的に一定に維持しながら、酸性化した透明なタンパク質溶液の濃度を約５０〜約２５０ｇ／Ｌに増加させて、濃縮タンパク質溶液を得るステップと、
（ｆ）任意選択で濃縮タンパク質溶液を透析濾過するステップと、
（ｇ）任意選択で濃縮溶液を乾燥させて、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を得るステップと
を含む方法が提供される。

本発明の方法により製造するキャノーラタンパク質単離物は、加工食品および飲料のタンパク質強化（ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、油の乳化、焼き上げ食品における素地形成剤（ｂｏｄｙ ｆｏｒｍｅｒ）および気体を捕捉する製品中の発泡剤などの、タンパク質単離物の従来の用途に使用することができる。さらに、キャノーラタンパク質単離物は、肉類似品（ｍｅａｔ ａｎａｌｏｇ）において有用なタンパク質繊維を形成することができ、卵白をつなぎとして使用する場合に、食品中の卵白代用品または増量剤（ｅｘｔｅｎｄｅｒ）として使用することができる。キャノーラタンパク質単離物は、栄養補助剤として使用することができる。キャノーラタンパク質単離物の他の用途は、ペットフード、動物飼料、工業および化粧用途、ならびにパーソナルケア製品にある。

発明の概略説明
キャノーラタンパク質単離物を提供するプロセスの最初のステップは、キャノーラ種子粗粉からタンパク質性物質を可溶化させることを含む。キャノーラ油糧種子粗粉から回収したタンパク質性物質は、キャノーラ種子中に天然に存在するタンパク質であってよく、またはそのタンパク質性物質は、遺伝子操作によって改変されているが、天然のタンパク質の特徴的な疎水性および極性の特性を有しているタンパク質であってもよい。キャノーラ粗粉は、例えば高温ヘキサン抽出法または冷オイル押出法によって得られる、異なるレベルの非変性タンパク質を有するキャノーラ油糧種子から、キャノーラ油を除去することによって得られる任意のキャノーラ粗粉であってもよい。キャノーラ油糧種子からのキャノーラ油の除去は、通常、本明細書に記載のタンパク質単離物の回収手順とは別の操作として行われる。

塩の存在が、油糧種子粗粉からの可溶性タンパク質の除去を増大させるので、タンパク質可溶化は食品グレードの塩溶液を使用することによって最も効率的に行われる。キャノーラタンパク質単離物を食品以外へ使用するつもりである場合、非食品グレードの化学製品を使用することができる。塩化カリウムなどの他の塩を使用することができるが、塩は通常塩化ナトリウムである。塩溶液は、相当の量のタンパク質の可溶化が行われるのを可能にするため、少なくとも約０．０５Ｍ、好ましくは少なくとも約０．１０Ｍの濃度を有する。塩溶液の濃度が増加するにつれて、油糧種子粗粉中のタンパク質の可溶化の程度は、最大値に達するまで最初は増加する。その後の濃度の増加は、可溶化される全体のタンパク質を増加させない。最大のタンパク質可溶化をもたらす食品グレードの塩溶液の濃度は、当該塩に応じて変わる。一般に、約０．８Ｍ未満の濃度値、より好ましくは約０．１Ｍ〜約０．１５Ｍの値を利用するのが好ましい。

回分プロセスでは、タンパク質の塩可溶化を、約５℃〜約７５℃の温度で、通常約１０〜約６０分である可溶化時間を短縮するために、好ましくは攪拌を伴って行う。全体として高い製品収率を得るために、油糧種子粗粉から実質的に可能な限り多くのタンパク質を抽出するように可溶化を行うことが好ましい。

この温度より低いと可溶化が実際的でないくらい遅くなるので、約５℃の下限温度を選択し、一方でタンパク質の変性温度のため約７５℃の好ましい上限温度を選択する。

連続プロセスでは、キャノーラ油糧種子粗粉からのタンパク質の抽出を、キャノーラ油糧種子粗粉からのタンパク質の連続的抽出を行うのに調和した任意の方法で行う。一実施形態では、キャノーラ油糧種子粗粉を食品グレードの塩溶液と連続的に混合し、その混合物を、ある長さを有するパイプまたは導管を通して、本明細書に記載のパラメータによる所望の抽出を行うのに十分な滞留時間をもたらす流速で輸送する。このような連続的手順では、塩可溶化ステップは、好ましくはキャノーラ油糧種子粗粉から実質的に可能な限り多くのタンパク質を抽出するように可溶化を行うために、迅速に、約１０分までの時間で行う。連続的手順での可溶化は、約１０℃と約７５℃との間、好ましくは約１５℃と約３５℃との間の温度で行う。

食品グレードの塩水溶液は、一般的に約５〜約６．８、好ましくは約５．３〜約６．２のｐＨを有し、この塩溶液のｐＨは、抽出ステップで使用するために、必要に応じて、任意の好都合な酸、通常は塩酸、またはアルカリ、通常は水酸化ナトリウムを使用することによって、約５〜約６．８の範囲内の任意の所望の値に調整することができる。

可溶化ステップ中の食品グレードの塩溶液中の油糧種子粗粉の濃度は、広範囲で変えられる。典型的な濃度値は、約５〜約１５％ｗ／ｖである。

塩水溶液によるタンパク質抽出ステップは、キャノーラ粗粉中に存在しうる脂肪を可溶化する追加的な効果を有し、それによって脂肪が水相中に存在するという結果になる。

抽出ステップから得られたタンパク質溶液は、一般的に約５〜約４０ｇ／Ｌ、好ましくは約１０〜約３０ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。

塩水溶液は、酸化防止剤を含むことができる。酸化防止剤は、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸などの任意の好都合な酸化防止剤とすることができる。使用する酸化防止剤の量は、溶液の約０．０１〜約１ｗｔ％で変えることができ、好ましくは約０．０５ｗｔ％である。酸化防止剤は、タンパク質溶液中のフェノール類の酸化を抑制するのに役立つ。

次いで、抽出ステップから得られた水相を、デカンター型遠心分離機の使用に続いて、ディスク型遠心分離および／または濾過によって残留する粗粉を除去することによるなどの任意の好都合な方法で、残留するキャノーラ粗粉から分離することができる。分離した残留粗粉は処分するために乾燥することができる。

キャノーラタンパク質の最終単離物の色は、分離したタンパク質水溶液と、粉末活性炭または他の色素吸着剤を混合し、引き続いて濾過により好都合に吸着剤を除去してタンパク質溶液を得ることによって、明色およびより弱い黄色（ｌｅｓｓ ｉｎｔｅｎｓｅ）の観点から、改善することができる。色素の除去に透析濾過を使用することもできる。

このような色素除去ステップは、任意の適当な色素吸着剤を使用して、一般的に分離したタンパク質水溶液の周囲温度で、任意の好都合な条件下で行うことができる。粉末活性炭は、約０．０２５％〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約０．０５％〜約２％ｗ／ｖの量を使用する。

本譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれた、米国特許第５，８４４，０８６号および第６，００５，０７６号に記載のように、キャノーラ種子粗粉が相当の量の脂肪を含んでいる場合、分離したタンパク質水溶液および以下に述べる濃縮タンパク質水溶液に、上記特許に記載の脱脂ステップを行うことができる。色改善ステップを行う場合、このステップは第１脱脂ステップの後に行うことができる。

水のみの使用では、塩水溶液よりもキャノーラ油糧種子粗粉からのタンパク質の抽出が少ない傾向があるが、塩水溶液によるキャノーラ油糧種子粗粉の抽出の代替法として水のみを使用して抽出を行うことができる。このような代替法を使用する場合、以下で説明する濃縮ステップ中にタンパク質を溶液中に維持するために、残留油糧種子粗粉からの分離後に、上記の濃度で塩をタンパク質溶液に添加することができる。第１脂肪除去ステップを行う場合、塩は一般的にこのような操作の完了後に添加する。

別の代替手順は、一般的に約９．９までの、約６．８を超える比較的高いｐＨ値で、食品グレードの塩溶液によりキャノーラ油糧種子粗粉を抽出するというものである。食品グレードの塩溶液のｐＨは、水酸化ナトリウム水溶液などの任意の好都合な食品グレードのアルカリを使用することによって、所望のアルカリ性値に調整することができる。あるいは、油糧種子粗粉は、一般的に約ｐＨ３までの、約ｐＨ５未満の比較的低いｐＨで、塩溶液により抽出することができる。このような代替法を使用する場合、油糧種子粗粉の抽出ステップから得られた水相は、デカンター型遠心分離に続いて、ディスク型遠心分離および／または濾過を使用して残留する粗粉を除去することによるなどの任意の好都合な方法で、残留するキャノーラ粗粉から分離する。分離した残留粗粉は処分するために乾燥することができる。

次いで、高ｐＨまたは低ｐＨ抽出ステップから得られたタンパク質水溶液を、以下に述べるさらなる処理の前に、上記のように、約５〜約６．８、好ましくは約５．３〜約６．２の範囲にｐＨ調整する。このようなｐＨ調整は、必要に応じて、任意の好都合な塩酸などの酸または水酸化ナトリウムなどのアルカリを使用して行うことができる。

キャノーラタンパク質水溶液を濃縮してそのタンパク質濃度を増加させると同時に、そのイオン強度を実質的に一定に維持する。このような濃縮は、一般的に約５０〜約２５０ｇ／Ｌ、好ましくは約２００ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する濃縮タンパク質溶液を得るように行う。

濃縮ステップは、異なる膜材料および構造を考慮して、約３０００〜約１０００００ダルトン、好ましくは約５０００〜約１００００ダルトンなどの適当な分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔ−ｏｆｆ）を有し、連続操作の場合には、タンパク質水溶液が膜を通過する際に所望の濃縮度が可能になるような寸法にする、中空繊維膜またはスパイラル膜（ｓｐｉｒａｌ−ｗｏｕｎｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ）などの膜を使用した、限外濾過または透析濾過などの任意の好都合な選択的膜技術を使用するなど、回分操作または連続操作に調和した任意の好都合な方法で行うことができる。

次いで、濃縮タンパク質溶液を、抽出溶液と同じモル濃度およびｐＨの塩水溶液を使用して、透析濾過ステップに供することができる。このような透析濾過は、約２〜約２０倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）の透析濾過溶液、好ましくは約５〜約１０倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）の透析濾過溶液を使用して行うことができる。透析濾過操作では、膜を通して透過液（ｐｅｒｍｅａｔｅ）を通過させることにより、キャノーラタンパク質水溶液からさらなる量の汚染物質を除去する。透析濾過操作は、さらなる有意の量の汚染物質および目に見える色が透過液（ｐｅｒｍｅａｔｅ）中に存在しなくなるまで行うことができる。このような透析濾過は、濃縮ステップ用のものと同じ膜を使用して行うことができる。しかしながら、所望であれば、透析濾過ステップは、異なる膜材料および構造を考慮して、約３０００〜約１０００００ダルトン、好ましくは約５０００〜約１００００ダルトンの範囲の分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔ−ｏｆｆ）を有する膜などの、異なる分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔ−ｏｆｆ）を有する分離膜を使用して行うことができる。

透析濾過ステップの少なくとも一部の間で、酸化防止剤を透析濾過媒体中に存在させることができる。酸化防止剤は、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸などの任意の好都合な酸化防止剤であってよい。透析濾過媒体中で使用する酸化防止剤の量は、使用する物質に依存し、約０．０１〜約１ｗｔ％で変えることができ、好ましくは約０．０５ｗｔ％である。酸化防止剤は、キャノーラタンパク質単離物の濃縮溶液中に存在するフェノール類の酸化を抑制するのに役立つ。

濃縮ステップおよび透析濾過ステップは、任意の好都合な温度、一般的には約２０℃〜約６０℃、好ましくは約２０〜約３０℃で、所望の程度の濃縮を行うための時間行うことができる。使用する温度および他の条件は、ある程度、濃縮を行うために使用する膜装置および溶液の所望のタンパク質濃度に依存する。

周知のように、限外濾過および同様の選択的膜技術は、低分子量の種が膜を通過するのを許すと同時に、高分子量の種が膜を通過するのを阻止する。低分子量の種には、食品グレードの塩のイオン種だけでなく、炭水化物、色素および抗栄養因子（ａｎｔｉ−ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ ｆａｃｔｏｒｓ）などの供給源材料から抽出された低分子量物質、ならびに任意の低分子量形タンパク質も含まれる。膜の分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔ−ｏｆｆ）は、通常、異なる膜材料および構造を考慮して、相当の割合のタンパク質を溶液中に確実に保持すると同時に、汚染物質が通過するのを許すよう選択する。

濃縮され、場合により透析濾過されたタンパク質溶液は、必要に応じて、米国特許第５，８４４，０８６号および第６，００５，０７６号に記載のようにさらなる脱脂操作に供することができる。

濃縮され、場合により透析濾過されたタンパク質溶液は、上記色除去操作の代替として、ある色除去操作に供することができる。本明細書では、粒状活性炭（ＧＡＣ）と同様に粉末活性炭も使用することができる。色吸着剤として使用することができる他の物質は、ポリビニルピロリドンである。

色吸着剤処理ステップは、任意の好都合な条件下、一般的にはキャノーラタンパク質溶液の周囲温度で行うことができる。粉末活性炭は、約０．０２５％〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約０．０５％〜約２％ｗ／ｖの量を使用することができる。ポリビニルピロリドンを色吸着剤として使用する場合、約０．５％〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約２％〜約３％ｗ／ｖの量を使用することができる。色吸着剤は、濾過などの任意の好都合な手段によって、キャノーラタンパク質溶液から除去することができる。

任意選択の色除去ステップから得られた、濃縮され、場合により透析濾過されたキャノーラタンパク質溶液は、微生物負荷（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｌｏａｄ）を減少させるために、低温殺菌に供することができる。このような低温殺菌は、任意の所望の低温殺菌条件下で行うことができる。一般に、濃縮され、場合により透析濾過されたキャノーラタンパク質溶液を、約５５℃〜約７０℃、好ましくは約６０℃〜約６５℃の温度で、約１０〜約１５分間、好ましくは約１０分間加熱する。次いで、低温殺菌した濃縮キャノーラタンパク質溶液を、以下に説明するさらなる処理のために、好ましくは約２５℃〜約４０℃の温度に冷却することができる。

濃縮ステップならびに任意選択の透析濾過ステップ、色素除去ステップおよび低温殺菌ステップの後で、次の希釈ステップ中にミセルが沈殿するのを防ぐために、食品グレードのカルシウム塩、通常は塩化カルシウムを得られた溶液に添加する。この添加により、主としてフィチン酸カルシウムを含む沈殿の形成が引き起こされる。十分な塩化カルシウムを添加して、一般的に約１５〜約２５ｍＳ、好ましくは約１７〜約２０ｍＳの導電率を有する溶液を得る。塩化カルシウムは、濃い水溶液としてまたは乾燥形態で添加することができる。

塩化カルシウムの添加は、約２０〜約３５℃の周囲温度で行うことができるが、約５〜約７０℃の範囲の温度を使用することができる。塩化カルシウムを添加した後、沈殿したフィチン酸塩を、遠心分離などによってタンパク質溶液から除去する。

次いで、保持液（ｒｅｔｅｎａｔｅ）を所望の希釈度を得るのに必要な体積を有する水と混合することによって、フィチン酸塩沈殿からの濃縮タンパク質溶液を希釈する。塩化カルシウムの添加の結果として、この希釈は、タンパク質ミセルの沈殿を生じない。濃縮タンパク質溶液は、一般的に約２〜約２０倍、好ましくは約１０〜約１５倍に希釈する。

濃縮タンパク質溶液と混合する水は、約２°〜約９０℃、好ましくは約１０°〜約５０℃、より好ましくは約２０°〜約３０℃の温度である。

次いで、希釈した保持液（ｒｅｔｅｎａｔｅ）を、塩酸などの任意の適当な酸を添加することによって、約２．５〜約４．０、好ましくは約３〜約３．５のｐＨに調整し、透明なキャノーラタンパク質水溶液を得る。

透明なキャノーラタンパク質水溶液を濃縮してそのタンパク質濃度を増加させると同時に、そのイオン強度を実質的に一定に維持する。このような濃縮は、一般的に約５０〜約２５０ｇ／Ｌ、好ましくは約１００〜約１５０ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する濃縮タンパク質溶液を得るよう行う。

濃縮ステップは、異なる膜材料および構造を考慮して、約３０００〜約１０００００ダルトン、好ましくは約５０００〜約１００００ダルトンなどの適当な分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔ−ｏｆｆ）を有し、連続操作の場合には、タンパク質水溶液が膜を通過する際に所望の濃縮度が可能になるような寸法にする、中空繊維膜またはスパイラル膜（ｓｐｉｒａｌ−ｗｏｕｎｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ）などの膜を使用した、限外濾過または透析濾過などの任意の好都合な選択的膜技術を使用するなど、回分操作または連続操作に調和した任意の好都合な方法で行うことができる。

次いで、濃縮タンパク質溶液を、水を使用して透析濾過ステップに供することができる。水は、その自然のｐＨ、透析濾過されるタンパク質溶液に等しいｐＨ、または中間の任意のｐＨとすることができる。このような透析濾過は、約２〜約２０倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）の透析濾過溶液、好ましくは約５〜約１０倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）の透析濾過溶液を使用して行うことができる。透析濾過操作では、膜を通して透過液（ｐｅｒｍｅａｔｅ）を通過させることにより、透明なキャノーラタンパク質水溶液からさらなる量の汚染物質を除去する。透析濾過操作は、さらなる有意の量の汚染物質および目に見える色が透過液（ｐｅｒｍｅａｔｅ）中に存在しなくなるまで行うことができる。このような透析濾過は、濃縮ステップ用のものと同じ膜を使用して行うことができる。しかしながら、所望であれば、透析濾過ステップは、異なる膜材料および構造を考慮して、約３０００〜約１０００００ダルトン、好ましくは約５０００〜約１００００ダルトンの範囲の分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔ−ｏｆｆ）を有する膜などの、異なる分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔ−ｏｆｆ）を有する分離膜を使用して行うことができる。

透析濾過ステップの少なくとも一部の間で、酸化防止剤を透析濾過媒体中に存在させることができる。酸化防止剤は、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸などの任意の好都合な酸化防止剤であってよい。透析濾過媒体中で使用する酸化防止剤の量は、使用する物質に依存し、約０．０１〜約１ｗｔ％で変えることができ、好ましくは約０．０５ｗｔ％である。酸化防止剤は、濃縮キャノーラタンパク質単離物溶液中に存在するフェノール類の酸化を抑制するのに役立つ。

濃縮ステップおよび透析濾過ステップは、任意の好都合な温度、一般的には約２０°〜約６０℃、好ましくは約２０°〜約３０℃で、所望の程度の濃縮を行うための時間行うことができる。使用する温度および他の条件は、ある程度、濃縮を行うために使用する膜装置および溶液の所望のタンパク質濃度に依存する。

濃縮され、任意選択で透析濾過された透明なキャノーラタンパク質水溶液は、噴霧乾燥または凍結乾燥などの任意の好都合な技術により乾燥させることができる。乾燥の前に、キャノーラタンパク質溶液に上記の低温殺菌ステップを行うことができる。乾燥キャノーラタンパク質単離物は、乾燥重量基準で約９０ｗｔ％を超えるタンパク質、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％のタンパク質（ケルダールＮ×６．２５として計算）の高いタンパク質含量を有する。キャノーラタンパク質単離物は、フィチン酸含量が低く、一般的に約１．５重量％未満である。

上記のように、キャノーラタンパク質単離物を製造するための本明細書に記載の手順についてのいくつかの変法があり、それは本明細書に概説したステップのいくつかの改変を含む。

本発明で製造するキャノーラタンパク質単離物は、アルブミンおよびグロブリンの両画分を含み、酸性水性環境において可溶性であり、炭酸および非炭酸両方の飲料に含ませるのに理想的な単離物を作り、これら飲料にタンパク質強化（ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）をもたらす。このような飲料は、約２．５〜約５にわたる広範囲の酸性ｐＨ値を有する。本発明で提供するキャノーラタンパク質単離物は、例えば１２液量オンスの量当たり少なくとも約５ｇのキャノーラタンパク質単離物など、任意の好都合な量でこのような飲料に添加して、このような飲料にタンパク質強化（ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）をもたらすことができる。添加されたキャノーラタンパク質単離物は、飲料に溶解し、飲料の透明度を損なわない。

例１：
この例は、本発明の一実施形態による新規なキャノーラタンパク質単離物の製造を説明する。

キャノーラ粗粉「ａ」ｋｇを、周囲温度で「ｃ」Ｍ ＮａＣｌ溶液「ｂ」Ｌに添加し、３０分間攪拌してタンパク質水溶液を得た。残留するキャノーラ粗粉を除去し、得られたタンパク質溶液を遠心分離により部分的に清澄化して、「ｅ」重量％のタンパク質含量を有する部分的に清澄化したタンパク質溶液「ｄ」Ｌを製造した。次いで、部分的に清澄化したタンパク質溶液を濾過してさらに清澄化し、「ｇ」重量％のタンパク質含量を有する容積「ｆ」Ｌの溶液を得た。

タンパク質抽出溶液の一定分量「ｈ」Ｌを、「ｊ」ダルトンの分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔ−ｏｆｆ）を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜で濃縮して容積を「ｉ」Ｌに減少させ、次いで、同じ膜で「ｌ」Ｍ ＮａＣｌ溶液「ｋ」Ｌにより透析濾過した。次いで、透析濾過した保持液（ｒｅｔｅｎａｔｅ）を６０℃で１０分間低温殺菌した。得られた低温殺菌した濃縮タンパク質溶液は、「ｍ」重量％のタンパク質含量を有していた。

次いで、濃縮溶液を、濃い溶液からの食品グレード塩化カルシウムの添加によって、「ｎ」ＭＳの導電率に調整した。次いで、保持液（ｒｅｔｅｎａｔｅ）を遠心分離して塩化カルシウムの添加時に形成した沈殿を除去した。次いで、沈殿「ｏ」ｋｇを、１９ＭＳ塩化カルシウム溶液「ｐ」Ｌに再懸濁させ、遠心分離して可能な限り多くの溶液タンパク質を回収した。次いで、洗浄ステップからの上澄み液を、処理した保持液（ｒｅｔｅｎａｔｅ）と合わせた。例の１つでは、この洗浄手順を再度繰り返した。次いで、清澄化した保持液（ｒｅｔｅｎａｔｅ）「ｑ」Ｌを、「ｒ」倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）のＲＯ水中に入れて希釈した（注：この希釈を行う際、ミセルは形成されなかった）。次いで、この溶液を、ＨＣｌで「ｓ」のｐＨに調整した。２つの実験についてのパラメータ「ａ」〜「ｔ」を以下の表Ｉに示す。

次いで、ｐＨ調製した透明な溶液を、「ｕ」ダルトンの分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔ−ｏｆｆ）を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を使用して限外濾過によって容積を「ｔ」Ｌに減少させ、次いで、濃縮液を、同じ膜で水「ｖ」Ｌにより透析濾過した。透析濾過した濃縮液は、「ｗ」重量％のタンパク質を含有していた。

濾過したタンパク質溶液の全体のタンパク質回収率は、「ｘ」ｗｔ％であった。濃縮液を噴霧乾燥して、最終生成物を形成した。この最終生成物に「ｙ」Ｃ７００という名称を与え、この最終生成物は「ｚ」％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有する。２つの実験についてのパラメータ「ｔ」〜「ｚ」を以下の表ＩＩに示す。

例２：
この例は、本発明の別の態様による新規なキャノーラタンパク質単離物の製造を説明する。

キャノーラ粗粉２０ｋｇを、周囲温度で０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液２００Ｌに添加し、３０分間攪拌してタンパク質水溶液を得た。残留するキャノーラ粗粉を除去し、得られたタンパク質溶液を遠心分離により部分的に清澄化して、１．３０重量％のタンパク質含量を有する部分的に清澄化したタンパク質溶液１５３Ｌを製造した。次いで、部分的に清澄化したタンパク質溶液を濾過してさらに清澄化し、１．２９重量％のタンパク質含量を有する容積１７２Ｌの溶液を得た。

次いで、濾液を、濃い溶液の食品グレード塩化カルシウムの添加によって、１８．５７ｍＳの導電率に調整した。次いで、濾液を遠心分離して、塩化カルシウムの添加時に形成した沈殿を除去して、処理した濾液１６０Ｌを得た。

処理した濾液１６０Ｌを、１０００００ダルトンの分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔ−ｏｆｆ）を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜で濃縮することによって容積を６．８８Ｌに減少させた。このサンプルは透析濾過しなかった。次いで、保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を６０℃で１分間低温殺菌した。得られた低温殺菌した濃縮タンパク質溶液は、１９．４４重量％のタンパク質含量を有していた。驚いたことに、低温殺菌ステップは、著しいタンパク質の沈殿を生じた。

次いで、低温殺菌した保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）６．７４Ｌを、１０倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）の冷（３℃）逆浸透精製水中に入れて希釈し、ＨＣｌでｐＨを３に調整した。次いで、溶液を、遠心分離および濾過により清澄化し、低温殺菌ステップで形成したと考えられる固体を除去した。

次いで、ｐＨ調整した透明な溶液を、１００００ダルトンの分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔ−ｏｆｆ）を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を使用して、限外濾過によって７６．５Ｌから２０．５ｋｇに濃縮した。透析濾過は行わなかった。濃縮タンパク質溶液は、４．０８重量％のタンパク質を含んでいた。

濾過したタンパク質溶液の全タンパク質回収率は、３７．８ｗｔ％であった。濃縮液を炭素処理し、噴霧乾燥して最終生成物を形成した。ＢＷ−ＳＡ０８２−Ｄ２１−０８Ａ Ｃ７００ＦＣという名称を与えたこの最終生成物は、９８．６３％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有していた。
例３：
この例は、本発明の別の態様による、乾燥させると新規なキャノーラタンパク質単離物を提供するであろうサンプルの製造を説明する。

キャノーラ粗粉６０ｋｇを、周囲温度で０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液６００Ｌに添加し、３０分間攪拌してタンパク質水溶液を得た。残留するキャノーラ粗粉を除去し、得られたタンパク質溶液を遠心分離により部分的に清澄化して、１．７８重量％のタンパク質含量を有する部分的に清澄化したタンパク質溶液５１１Ｌを製造した。次いで、部分的に清澄化したタンパク質溶液を濾過してさらに清澄化し、１．５１重量％のタンパク質含量を有する容積５３４Ｌの溶液を得た。

十分な塩化カルシウムを一定分量５００ｍｌの濾過したタンパク質溶液に添加し、導電率を２０．６ｍＳに上げた。ＣａＣｌ_２の添加によって白色沈殿の形成がもたらされ、これを遠心分離によって除去して透明な溶液を得た。

次いで、処理して清澄化したタンパク質溶液を、３倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）の逆浸透精製水で希釈し、ＨＣｌで溶液のｐＨを３．０５に調整した。濁りは形成されず、溶液の透明度は高いままであった。希釈し、酸性化した溶液のタンパク質含量は、０．５３重量％であった。

次いで、希釈し、酸性化した溶液１４５０ｍｌを、１００００ダルトンの分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔ−ｏｆｆ）を有するＨｙｄｒｏｓａｒｔ膜を備えたＶｉｖａｆｌｏｗ２００限外濾過ユニットで容積を２００ｍｌに減少させた。次いで、部分濃縮タンパク質溶液を、同じ膜でｐＨ３の逆浸透精製水２００ｍｌにより透析濾過して導電率を減少させた。

次いで、透析濾過した溶液をさらに濃縮して、１２．３９重量％のタンパク質含量を有する透明な保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）約３０ｍｌを得た。
例４
この例は、本発明の別の態様による新規なキャノーラタンパク質単離物の製造を説明する。

キャノーラ粗粉６０ｇを、周囲温度で０．１０Ｍ ＣａＣｌ_２溶液６００ｍｌに添加し、３０分間攪拌してタンパク質水溶液を得た。残留するキャノーラ粗粉を除去し、得られたタンパク質溶液を遠心分離および濾過により清澄化して、１．１７重量％のタンパク質含量を有する清澄化したタンパク質溶液３３０ｍｌを製造した。清澄化したタンパク質溶液を２倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）の逆浸透精製水で希釈し、０．４１重量％のタンパク質含量を有する希釈溶液９９０ｍｌを得た。この溶液のｐＨを、希塩酸を添加することによって３．０３に下げた。希釈およびｐＨ調整の両ステップの後で、タンパク質溶液は透明であった。

一定分量９２０ｍｌの希釈し、酸性化したタンパク質溶液を、１００００ダルトンの分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔ−ｏｆｆ）を有するＨｙｄｒｏｓａｒｔ膜を備えたＶｉｖａｆｌｏｗ２００限外濾過ユニットで濃縮することにより容積を３５ｍｌに減少させた。濃縮タンパク質溶液は、６．８４重量％のタンパク質含量を有していた。

一定分量３２ｍｌの濃縮タンパク質溶液を、最初の濃縮ステップで使用したものと同じ膜で、５倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）の逆浸透精製水（１６０ｍｌ）により透析濾過した。透析濾過した濃縮タンパク質溶液は、７．０６重量％のタンパク質含量を有していた。

最初の濾過したタンパク質溶液の全タンパク質回収率は、６０．４％であった。透析濾過した濃縮タンパク質溶液を凍結乾燥して最終生成物を形成した。Ｃ７０１という名称を与えたこの最終生成物は、９３．４２％（Ｎ×６．２５）ｗ．ｂ．のタンパク質含量を有していた。
開示の概要
本開示を要約すると、本発明は、酸性水性環境において可溶性で透明なアルブミンおよびグロブリンの両画分から構成されるキャノーラタンパク質単離物を形成する新規な手順を提供する。本発明の範囲内で、改変が可能である。

Claims (32)

1. 少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のキャノーラタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を製造する方法であって、
   （ａ）少なくとも約５℃の温度でキャノーラ油糧種子粗粉を抽出して、前記粗粉からキャノーラタンパク質を可溶化し、約５〜約４０ｇ／Ｌのタンパク質含量および約５〜約６．８のｐＨを有するタンパク質水溶液を形成するステップと、
   （ｂ）前記タンパク質水溶液を前記使用済み油糧種子粗粉から分離するステップと、
   （ｃ）選択的膜技術を用いてイオン強度を実質的に一定に維持しながら、前記タンパク質水溶液のタンパク質濃度を約５０〜約２５０ｇ／Ｌに増加させて、第１の濃縮タンパク質溶液を得るステップと、
   （ｄ）任意選択で前記第１の濃縮タンパク質溶液を透析濾過するステップと、
   （ｅ）前記第１の濃縮され、任意選択で透析濾過したタンパク質溶液にカルシウム塩溶液を添加して約１５〜約２５ｍＳの導電率にし、前記第１の濃縮タンパク質溶液中に沈殿を形成させるステップと、
   （ｆ）前記沈殿を前記第１の濃縮タンパク質溶液から除去するステップと、
   （ｇ）温度が約２°〜約９０℃の約２〜約２０倍容の水（ｖｏｌｕｍｅｓ ｏｆ ｗａｔｅｒ）で、前記清澄化した第１の濃縮タンパク質溶液を希釈するステップと、
   （ｈ）前記得られた溶液を約２．５〜約４．０のｐＨに酸性化して、酸性化した透明なタンパク質溶液を製造するステップと、
   （ｉ）選択的膜技術を用いてイオン強度を実質的に一定に維持しながら、前記酸性化した透明なタンパク質溶液の濃度を約５０〜約２００ｇ／Ｌに増加させて、第２の濃縮タンパク質溶液を得るステップと、
   （ｊ）任意選択で前記第２の濃縮タンパク質溶液を透析濾過するステップと、
   （ｋ）任意選択で前記第２の濃縮タンパク質溶液を乾燥させて、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を得るステップと
   を含む方法。
2. 前記カルシウム塩が塩化カルシウムである、請求項１に記載の方法。
3. 十分な塩化カルシウム溶液を、前記濃縮し、任意選択で透析濾過したタンパク質溶液に添加して、約１７〜約２０ｍＳの導電率を有する溶液を得る、請求項２に記載の方法。
4. 前記第１の濃縮タンパク質溶液を、約１０〜約１５溶液の水で希釈する、請求項１に記載の方法。
5. 前記得られた溶液を、約３〜約３．５のｐＨに酸性化する、請求項１に記載の方法。
6. 少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のキャノーラタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を製造する方法であって、
   （ａ）少なくとも約５℃の温度でキャノーラ油糧種子粗粉を抽出して、前記粗粉からキャノーラタンパク質を可溶化し、約５〜約４０ｇ／Ｌのタンパク質含量および約５〜約６．８のｐＨを有するキャノーラタンパク質水溶液を形成するステップと、
   （ｂ）前記キャノーラタンパク質水溶液を前記油糧種子粗粉から分離するステップと、
   （ｃ）前記タンパク質水溶液にカルシウム塩溶液を添加して約１５〜約２５ｍＳの導電率にし、前記濃縮タンパク質溶液中に沈殿を形成させるステップと、
   （ｄ）前記沈殿を前記キャノーラタンパク質水溶液から除去するステップと、
   （ｅ）選択的膜技術を用いてイオン強度を実質的に一定に維持しながら、前記タンパク質水溶液のタンパク質濃度を約５０〜約２５０ｇ／Ｌに増加させて、第１の濃縮タンパク質溶液を得るステップと、
   （ｆ）任意選択で前記第１の濃縮タンパク質溶液を透析濾過するステップと、
   （ｇ）温度が約２°〜約９０℃の約２〜約２０倍容の水（ｖｏｌｕｍｅｓ ｏｆ ｗａｔｅｒ）で、前記第１の濃縮タンパク質溶液を希釈するステップと、
   （ｈ）前記得られた溶液を約２．５〜約４．０のｐＨに酸性化して、酸性化した透明なタンパク質溶液を製造するステップと、
   （ｉ）選択的膜技術を用いてイオン強度を実質的に一定に維持しながら、前記酸性化した透明なタンパク質溶液の濃度を約５０〜約２５０ｇ／Ｌに増加させて、第２の濃縮タンパク質溶液を得るステップと、
   （ｊ）任意選択で前記第２の濃縮タンパク質溶液を透析濾過するステップと、
   （ｋ）任意選択で前記第２の濃縮タンパク質溶液を乾燥させて、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を得るステップと
   を含む方法。
7. 前記カルシウム塩が塩化カルシウムである、請求項６に記載の方法。
8. 十分な塩化カルシウム溶液を、前記タンパク質水溶液に添加して約１７〜約２０ｍＳの導電率にする、請求項７に記載の方法。
9. 前記第１の濃縮タンパク質溶液を、約１０〜約１５倍容の水（ｖｏｌｕｍｅｓ ｏｆ ｗａｔｅｒ）で希釈する、請求項６に記載の方法。
10. 前記得られた溶液を、約３〜約３．５のｐＨに酸性化する、請求項６に記載の方法。
11. 少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のキャノーラタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を製造する方法であって、
    （ａ）少なくとも約５℃の温度でキャノーラ油糧種子粗粉を抽出して、前記粗粉からキャノーラタンパク質を可溶化し、約５〜約４０ｇ／Ｌのタンパク質含量および約５〜約６．８のｐＨを有するタンパク質水溶液を形成するステップと、
    （ｂ）前記タンパク質水溶液を前記使用済み油糧種子粗粉から分離するステップと、
    （ｃ）選択的膜技術を用いてイオン強度を実質的に一定に維持しながら、前記タンパク質水溶液のタンパク質濃度を約５０ｇ／Ｌ以下に増加させて、部分濃縮タンパク質溶液を得るステップと、
    （ｄ）前記部分濃縮タンパク質溶液にカルシウム塩溶液を添加して約１５〜約２５ｍＳの導電率にし、前記部分濃縮タンパク質溶液中に沈殿を形成させるステップと、
    （ｅ）前記沈殿を前記部分濃縮タンパク質溶液から除去するステップと、
    （ｆ）選択的膜技術を用いてイオン強度を実質的に一定に維持しながら、前記部分濃縮タンパク質溶液のタンパク質濃度を約５０〜約２５０ｇ／Ｌにさらに増加させて、第１の濃縮タンパク質溶液を得るステップと、
    （ｇ）任意選択で前記第１の濃縮タンパク質溶液を透析濾過するステップと、
    （ｈ）温度が約２°〜約９０℃の約２〜約２０倍容の水（ｖｏｌｕｍｅｓ ｏｆ ｗａｔｅｒ）で、前記第１の濃縮タンパク質溶液を希釈するステップと、
    （ｉ）前記得られた溶液を約２．５〜約４．０のｐＨに酸性化して、酸性化した透明なタンパク質溶液を製造するステップと、
    （ｊ）選択的膜技術を用いてイオン強度を実質的に一定に維持しながら、前記酸性化した透明なタンパク質溶液の濃度を約５０〜約２５０ｇ／Ｌに増加させて、第２の濃縮タンパク質溶液を得るステップと、
    （ｋ）任意選択で前記第２の濃縮タンパク質溶液を透析濾過するステップと、
    （ｌ）任意選択で前記第２の濃縮タンパク質溶液を乾燥させて、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を得るステップと
    を含む方法。
12. 前記カルシウム塩が塩化カルシウムである、請求項１１に記載の方法。
13. 十分な塩化カルシウム溶液を、前記タンパク質水溶液に添加して約１７〜約２０ｍＳの導電率にする、請求項１２に記載の方法。
14. 前記第１の濃縮タンパク質溶液を、約１０〜約１５倍容の水（ｖｏｌｕｍｅｓ ｏｆ ｗａｔｅｒ）で希釈する、請求項１１に記載の方法。
15. 前記得られた溶液を、約３〜約３．５のｐＨに酸性化する、請求項１１に記載の方法。
16. 少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のキャノーラタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を製造する方法であって、
    （ａ）少なくとも約５℃の温度で、カルシウム塩の水溶液でキャノーラ種子粗粉を抽出して、前記粗粉からキャノーラタンパク質を可溶化し、約５〜約４０ｇ／Ｌのタンパク質含量および約５〜約６．８のｐＨを有するキャノーラタンパク質水溶液を形成するステップと、
    （ｂ）前記タンパク質水溶液を前記油糧種子粗粉から分離するステップと、
    （ｃ）温度が約２°〜約９０℃の約０．５〜約１０倍容の水（ｖｏｌｕｍｅｓ ｏｆ ｗａｔｅｒ）で、前記タンパク質水溶液を希釈するステップと、
    （ｄ）前記得られた希釈キャノーラタンパク質溶液を約２．５〜約４のｐＨに酸性化して、酸性化した透明なタンパク質溶液を製造するステップと、
    （ｅ）選択的膜技術を用いてイオン強度を実質的に一定に維持しながら、前記酸性化した透明なタンパク質溶液の濃度を約５０〜約２５０ｇ／Ｌに増加させて、濃縮タンパク質溶液を得るステップと、
    （ｆ）任意選択で前記濃縮タンパク質溶液を透析濾過するステップと、
    （ｇ）任意選択で前記濃縮溶液を乾燥させて、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を得るステップと
    を含む方法。
17. 前記カルシウム塩が塩化カルシウムである、請求項１６に記載の方法。
18. 前記カルシウム塩の水溶液が１．０Ｍ未満の濃度である、請求項１７に記載の方法。
19. 前記カルシウム塩の水溶液が約０．１０〜約０．５５Ｍの濃度である、請求項１８に記載の方法。
20. 前記得られた溶液を、約３〜約３．５のｐＨに酸性化する、請求項１６に記載の方法。
21. 少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を製造する方法であって、
    （ａ）少なくとも約５℃の温度でキャノーラ油糧種子粗粉を抽出して、前記粗粉からキャノーラタンパク質を可溶化し、約５〜約４０ｇ／Ｌのタンパク質含量および約５〜約６．８のｐＨを有するタンパク質水溶液を形成するステップと、
    （ｂ）前記タンパク質水溶液を前記使用済み油糧種子粗粉から分離するステップと、
    （ｃ）選択的膜技術を用いてイオン強度を実質的に一定に維持しながら、前記タンパク質水溶液のタンパク質濃度を約５０ｇ／Ｌ以下に増加させて、部分濃縮タンパク質溶液を得るステップと、
    （ｄ）前記部分濃縮タンパク質溶液にカルシウム塩溶液を添加して約１５〜約２５ｍＳの導電率にし、前記部分濃縮タンパク質溶液中に沈殿を形成させるステップと、
    （ｅ）前記沈殿を前記部分濃縮タンパク質溶液から除去するステップと、
    （ｆ）温度が約２〜約９０℃の約０．５〜約２０倍容の水（ｖｏｌｕｍｅｓ ｏｆ ｗａｔｅｒ）で、前記部分濃縮タンパク質溶液を希釈するステップと、
    （ｇ）前記得られた溶液を約２．５〜約４．０のｐＨに酸性化して、酸性化した透明なタンパク質溶液を製造するステップと、
    （ｈ）選択的膜技術を用いてイオン強度を実質的に一定に維持しながら、前記酸性化したキャノーラタンパク質溶液のタンパク質濃度を約５０〜約２５０ｇ／Ｌに増加させて、濃縮タンパク質溶液を得るステップと、
    （ｉ）任意選択で前記濃縮タンパク質溶液を透析濾過するステップと、
    （ｊ）任意選択で前記濃縮タンパク質溶液を乾燥させて、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を得るステップと
    を含む方法。
22. 前記カルシウム塩が塩化カルシウムである、請求項２１に記載の方法。
23. 十分な塩化カルシウム溶液を、前記タンパク質水溶液に添加して約１７〜約２０ｍＳの導電率にする、請求項２２に記載の方法。
24. 前記得られた溶液を、約３〜約３．５のｐＨに酸性化する、請求項２１に記載の方法。
25. 少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のキャノーラタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を製造する方法であって、
    （ａ）約５℃の温度でキャノーラ油糧種子粗粉を抽出して、前記粗粉からキャノーラタンパク質を可溶化し、約５〜約４０ｇ／Ｌのタンパク質含量および約５〜約６．８のｐＨを有するキャノーラタンパク質水溶液を形成するステップと、
    （ｂ）前記キャノーラタンパク質水溶液を前記油糧種子粗粉から分離するステップと、
    （ｃ）前記タンパク質水溶液にカルシウム塩溶液を添加して約１５〜約２５ｍＳの導電率にし、前記濃縮タンパク質溶液中に沈殿を形成させるステップと、
    （ｄ）前記沈殿を前記キャノーラタンパク質水溶液から除去するステップと、
    （ｅ）温度が約２°〜約９０℃の約０．５〜約１０倍容の水（ｖｏｌｕｍｅｓ ｏｆ ｗａｔｅｒ）で、前記キャノーラタンパク質水溶液を希釈するステップと、
    （ｆ）前記得られた水溶液を約２．５〜約４．０のｐＨに酸性化して、酸性化した透明なタンパク質溶液を製造するステップと、
    （ｇ）選択的膜技術を用いてイオン強度を実質的に一定に維持しながら、前記酸性化した透明なタンパク質溶液の濃度を約５０〜約２５０ｇ／Ｌに増加させて、濃縮タンパク質溶液を得るステップと、
    （ｈ）任意選択で前記濃縮タンパク質溶液を透析濾過するステップと、
    （ｉ）任意選択で前記濃縮タンパク質溶液を乾燥させて、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を得るステップと
    を含む方法。
26. 前記カルシウム塩が塩化カルシウムである、請求項２５に記載の方法。
27. 十分な塩化カルシウム溶液を、前記タンパク質水溶液に添加して約１７〜約２０ｍＳの導電率にする、請求項２６に記載の方法。
28. 前記得られた溶液を、約３〜約３．５のｐＨに酸性化する、請求項２５に記載の方法。
29. 少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有し、キャノーラタンパク質のアルブミンおよびグロブリンの両画分を含み、かつ酸性水性環境において可溶性であるキャノーラタンパク質単離物。
30. 前記酸性水性環境が約２．５〜約５にわたるｐＨを有する飲料である、請求項２９に記載のキャノーラタンパク質単離物。
31. 約１．５重量％未満のフィチン酸含量を有する、請求項２９に記載のキャノーラタンパク質単離物。
32. 少なくとも約１００ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有する、請求項２９に記載のキャノーラタンパク質単離物。