JP2011519554A - 過分極１３ｃ−ピルビン酸塩を用いた１３ｃ−ｍｒ検出によるアラニントランスアミナーゼ（ａｌｔ）活性の測定方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩を含むイメージング媒体を用いた¹³Ｃ−ＭＲ検出によるアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）活性の測定方法に関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩を含むイメージング媒体を用いる¹³Ｃ−ＭＲ検出によるアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）活性の測定方法に関する。

グルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＡＴ）としても知られるＡＬＴは、アラニンとα−ケトグルタル酸塩との間の可逆的なアミノ交換反応によってピルビン酸塩及びグルタミン酸塩を生成する反応を触媒する酵素である。これら４種の代謝産物の転化を媒介することにより、ＡＬＴは糖新生及びアミノ酸代謝において重要な役割を演じる。筋肉及び特定の他の組織において、ＡＬＴはアミノ酸を燃料として分解し、アミノ基がアミノ交換反応によってグルタミン酸塩から回収される。ＡＬＴはα−アミノ基をグルタミン酸塩からピルビン酸塩に転移させてアラニンを生成するが、これは絶食時における血中の主要なアミノ酸である。アラニンは肝臓により取り込まれて逆ＡＬＴ反応でピルビン酸塩からグルコースを生成するが、これはいわゆるアラニン−グルコースサイクルを構成する。このサイクルは骨格筋が嫌気的に働く激しい運動時にも重要であって、タンパク質分解からアンモニア基を生じるばかりでなく、解糖から多量のピルビン酸塩も生じる。

ＡＬＴの恐らく最もよく知られた側面は、それが肝臓の健全性又は肝細胞損傷の指標として臨床的に使用されていることである。ウイルス感染、アルコール性脂肪症、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）及び薬物中毒を含む各種の肝臓損傷状態では、血清ＡＬＴ活性が顕著に上昇する。正常な細胞代謝回転又は非血管源からの放出のため、末梢循環中には低レベルのＡＬＴが存在するものの、肝臓は最高レベルのＡＬＴを含むことが証明されている。肝臓中及び血液中におけるＡＬＴレベルの差は約２０００〜３０００倍であることが示されている。したがって、肝臓ＡＬＴの循環中への「漏れ」のため、血清、血漿又は血液中のＡＬＴの上昇は肝臓損傷のマーカーと見なされる。通常、肝臓損傷の性質によって血中ＡＬＴレベルは大幅に変化する。（正常値の８〜１０倍を超える）極端に高いトランスアミナーゼレベルは、急性ウイルス性肝炎及び／又は薬物誘発肝臓中毒を表すことがある。血清ＡＬＴの軽度で慢性的上昇（２〜８倍）は、一般に慢性肝炎、脂肪肝及び／又は脂肪症の特徴である。しかし、ＡＬＴレベルと肝臓損傷の病因との相関関係に関する機構の詳細の多くはまだ理解されていない。

血清ＡＬＴは臨床化学で最も広く使用されているアッセイの１つであるが、このアッセイには場合によっては不適切な予測因子であるという重大な欠陥が存在する。最近の研究は、肝臓疾患に対する血清ＡＬＴアッセイの特異性について疑問を投げかけた。正常値より高いＡＬＴレベルは、肥満、筋肉疾患、心不全、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病又はアンチトリプシン欠損症のような他の臨床状態としばしば関連している。

肝臓組織の損傷及び／又は疾患を一層直接かつ正確に表示及び／又は診断するＡＬＴ活性の改良された測定方法に対するニーズが存在している。さらに、肝臓組織の損傷及び／又は疾患の治療に対する応答（ライフスタイルの変化又は薬物による治療に対する応答）を評価する際にＡＬＴ活性を測定するための改良された方法に対するニーズも存在している。

ＡＬＴ活性の測定のためには様々な方法が知られているが、これらの大部分は血清ＡＬＴの測定に頼っている。

血清ＡＬＴは、通例、酵素反応で生成されるピルビン酸塩の連続モニタリングによってインビトロで測定される。これは、ピルビン酸塩を接触還元して乳酸塩にすると共に還元形ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）をその酸化形（ＮＡＤ）に酸化する乳酸デヒドロゲナーゼを用いたカップルド酵素反応によって達成される。この反応は、ＮＡＤＨの酸化に原因する（通常は３４０ｎｍでの）吸光度の減少を追跡することにより、分光測光法で測定される。血清ＡＬＴ活性測定のためには、ＩＦＣＣ推奨の処方が存在している。

国際公開第２００５／１１３７６１号には、ＡＬＴポリペプチド及び前記ポリペプチドに対して特異的に結合する抗体が開示されており、かかる抗体は前記ＡＬＴポリペプチドを含む組織に関連する損傷又は疾患を診断又は検出するために使用できる。前記インビトロ診断又は検出では、動物又は患者からの体液試料が使用される。

米国特許第５，７０５，０４５号には、ＡＬＴ及びＡＳＴ（アスパラギン酸トランスアミナーゼ）活性を測定できるバイオセンサーが開示されている。かかるバイオセンサーは、それぞれＡＬＴ及びＡＳＴに対して感受性を有する２組の電極からなっている。このバイオセンサーを用いたアッセイでは、ＡＬＴ及び／又はＡＳＴを含む血清又は血漿のような生物学的液体がバイオセンサー上に配置される。

しかし、上述したＡＬＴ測定方法のすべてが基本的に血液試料を使用しており、したがって上昇したＡＬＴレベルが測定された場合、これらが肝臓損傷又は疾患に原因するものであることは確かでない。したがって、ＡＬＴ活性（特に、肝臓に直接局在したＡＬＴ活性）を測定するための新規で改良された方法に対するニーズが存在している。

国際公開第９２／０１９３７号パンフレット

このたび、¹³Ｃ−ＭＲ検出を使用することで、過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩がＡＬＴ活性をインビボで（例えば、肝臓中で直接に）及びインビトロで測定するための薬剤として使用できることを見出した。

上述の通り、ＡＬＴは、過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩及びグルタミン酸塩から過分極¹³Ｃ−アラニン及びα−ケトグルタル酸塩を生成する可逆反応を触媒する。絶食ラット（肝臓の代謝状態を評価するためのモデル）の肝臓におけるＡＬＴ活性の上昇は非絶食ラットの肝臓に比べて低い¹³Ｃ−アラニン信号となって現れるのに対し、¹³Ｃ−乳酸塩信号は未変化のままである。絶食ラットの肝臓で認められる過分極¹³Ｃ−アラニンレベルの減少は、ＡＬＴで媒介される¹³Ｃ−ピルビン酸塩／¹³Ｃ−アラニン反応平衡のシフト（即ち、高くなったＡＬＴレベルによる¹³Ｃ−アラニンの減少）を示している。絶食時には、ラットのＡＬＴレベルは上昇することが示されているが、これは糖新生基質としてのアラニンの使用及びそれのピルビン酸塩への転化を促進し、結果としてグルコースを生成する（Ｆ．Ｒｏｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２３４（３），１９５８，４７６−４８０）。検出された過分極¹³Ｃ−アラニンの減少はまた、絶食肝臓中における内因性アラニンの減少（即ち、低い出発アラニン）が最終の過分極¹³Ｃ−アラニン平衡に影響を及ぼすことに原因する可能性もあろう。

肝臓中の変化したＡＬＴ活性／変化したアラニン代謝を検出できることは、肝炎、脂肪肝及び肝硬変のような肝臓疾患を研究及び同定するため並びに肝臓疾患の治療をモニターするために有用であろう。

前述した通り、過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩からその代謝産物である過分極¹³Ｃ−乳酸塩、過分極¹³Ｃ−重炭酸塩（¹³Ｃ₁−ピルビン酸塩、¹³Ｃ_1,2−ピルビン酸塩又は¹³Ｃ_1,2,3−ピルビン酸塩の場合のみ）及び過分極¹³Ｃ−アラニンへの代謝転化は、¹³Ｃ−ＭＲを用いてヒト及びヒト以外の動物の体内における代謝過程を研究するために使用できることが判明している。¹³Ｃ₁−ピルビン酸塩は、３７℃のヒト全血中で約４２秒のＴ₁緩和を有する。しかし、過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩から過分極¹³Ｃ−乳酸塩、過分極¹³Ｃ−重炭酸塩及び過分極¹³Ｃ−アラニンへの転化は、¹³Ｃ−ピルビン酸塩出発化合物及びその代謝産物からの信号検出を可能にするのに十分速いことが判明している。アラニン、重炭酸塩及び乳酸塩の量は、検査対象である組織の代謝状態に依存する。過分極¹³Ｃ−乳酸塩、過分極¹³Ｃ−重炭酸塩及び過分極¹³Ｃ−アラニンのＭＲ信号強度は、これらの化合物の量及び検出時における分極の残存率に関係している。したがって、過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩から過分極¹³Ｃ−乳酸塩、過分極¹³Ｃ−重炭酸塩及び過分極¹³Ｃ−アラニンへの転化をモニターすることにより、非侵襲的なＭＲイメージング又はＭＲ分光法を用いることでヒト又はヒト以外の動物の体内における代謝過程をインビボで調べることが可能となる。

さらに、様々なピルビン酸塩代謝産物に由来するＭＲ信号振幅は、組織のタイプに応じて変化するが判明している。アラニン、乳酸塩、重炭酸塩及びピルビン酸塩によって形成される特有の代謝ピークパターンは、検査対象である組織の代謝状態に関するフィンガープリントとして使用でき、したがって健常組織と腫瘍組織との識別を可能にする。腫瘍イメージング（腫瘍組織は高い代謝活性を示す）のための過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩の使用は、国際公開第２００６／０１１８１０号に詳述されている。

さらに、心臓イメージングのための過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩の使用は、国際公開第２００６／０５４９０３号に記載されている。

かくして第１の態様では、本発明は、過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩を含むイメージング媒体を用いた¹³Ｃ−ＭＲ検出によるＡＬＴ活性の測定方法であって、¹³Ｃ−アラニンの信号並びに任意には¹³Ｃ−乳酸塩及び／又は¹³Ｃ−ピルビン酸塩の信号を検出することを含んでなる方法を提供する。

図１は、３Ｄ−¹³Ｃ−ＭＲ分光イメージング取得からの動的曲線（図１ａ）及び単一ボクセルスペクトル（図１ｂ）中の特徴を示している。 図２は、正常ラット及び絶食ラットからの代表的な肝臓スライス局限動的曲線を示している。これらの最終動的曲線は、重ね合わせプロット中の各水平線が３秒ごとに収集された過分極化学種の独立したマグニチュードスペクトルを表す重ね合わせプロットインセットから導かれた。明確さのため、ピルビン酸塩水和物は最終プロットの動的曲線から省いてあり、ピルビン酸塩曲線は見やすくするために１／４の倍率で縮小してある。動的曲線中、各々のマークした点はその時点における¹³Ｃ−ピルビン酸塩（約１７１ｐｐｍ）、¹³Ｃ−乳酸塩（約１８３ｐｐｍ）及び¹³Ｃ−アラニン（約１７６ｐｐｍ）の強度（即ち、関連する重ね合わせプロット中におけるその稜線の軌跡）を表しており、¹³Ｃ−ピルビン酸塩の取込み及び転化を示している。 図３は、正常ラット及び絶食ラットの¹³Ｃ−ＭＲ分光法スライス取得からの¹³Ｃ−乳酸塩／¹³Ｃ−アラニンピーク比に関するすべてのデータ点を示している。三角形マーカーは収集されたデータ点を示し、正方形マーカー／誤差バーは平均値／標準誤差を示している。 図４は、正常ラット（図４ａ）及び絶食ラット（図４ｂ）に関し、１ｃｍ³のボクセル分解能を有する３Ｄ−ＭＲ分光イメージングスペクトルからの代表的な肝臓スライススペクトルの比較を示している。通例、ラットの肝臓は２つのスライスにわたって存在していた。 図５は、正常ラット及び絶食ラット肝臓の３Ｄ−¹³Ｃ−ＭＲ分光イメージング実験からの¹³Ｃ−乳酸塩／総炭素分率（図５ａ）及び¹³Ｃ−アラニン／総炭素分率（図５ｂ）（各ラットの肝臓ボクセルについての平均値）を示している。三角形マーカーは収集されたデータ点を示し、正方形マーカー／誤差バーは平均値±標準誤差を示している。５つの正常¹³Ｃ−アラニン／総炭素点は重なり合っており、したがって下方の２つの点は不明瞭になっていることに注意されたい。

「ＡＬＴ活性の測定」という用語は、ＡＬＴ酵素による¹³Ｃ−ピルビン酸塩から¹³Ｃ−アラニンへの動力学及び／又は最大転化率を測定することによるＡＬＴ活性の初期測定をいう。

「¹³Ｃ−ＭＲ検出」という用語は、¹³Ｃ−ＭＲイメージング又は¹³Ｃ−ＭＲ分光法或いは¹³Ｃ−ＭＲイメージングと¹³Ｃ−ＭＲ分光法の組合せ（即ち、¹³Ｃ−ＭＲ分光イメージング）を意味する。この用語はさらに、様々な時点における¹³Ｃ−ＭＲ分光イメージングも意味する。

「イメージング媒体」という用語は、ＭＲ活性剤（即ち、イメージング剤）として過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩を含む液体組成物を意味する。

本発明の方法で使用するイメージング媒体は、インビボ¹³Ｃ−ＭＲ検出（即ち、ヒト又はヒト以外の動物の生体内での¹³Ｃ−ＭＲ検出）用のイメージング媒体として使用できる。さらに、本発明の方法で使用するイメージング媒体は、例えば、動物体又は人体から導かれる細胞培養物、身体試料（例えば血液）、エクスビボ組織（例えば、生検で得られるエクスビボ組織）又は単離器官に関するインビトロ¹³Ｃ−ＭＲ検出用のイメージング媒体としても使用できる。

「¹³Ｃ−ピルビン酸塩」という用語は、¹³Ｃで同位体濃縮された（即ち、¹³Ｃ同位体の量がそれの天然存在比より多い）¹³Ｃ−ピルビン酸の塩を意味する。

本発明の方法で使用する過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩の同位体濃縮度は、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上であり、９０％を超える同位体濃縮度が最も好ましい。理想的には、濃縮度は１００％である。本発明の方法で使用する前記イメージング媒体中の¹³Ｃ−ピルビン酸塩は、Ｃ１位置（以下¹³Ｃ₁−ピルビン酸塩と表示する）、Ｃ２位置（以下¹³Ｃ₂−ピルビン酸塩と表示する）、Ｃ３位置（以下¹³Ｃ₃−ピルビン酸塩と表示する）、Ｃ１及びＣ２位置（以下¹³Ｃ_1,2−ピルビン酸塩と表示する）、Ｃ１及びＣ３位置（¹³Ｃ_1,3−ピルビン酸塩と表示する）、Ｃ２及びＣ３位置（¹³Ｃ_2,3−ピルビン酸塩と表示する）又はＣ１、Ｃ２及びＣ３位置（以下¹³Ｃ_1,2,3−ピルビン酸塩と表示する）において同位体濃縮することができる。¹³Ｃ₁−ピルビン酸塩は他のＣ位置で同位体濃縮された¹³Ｃ−ピルビン酸塩に比べて３７℃のヒト全血中で高いＴ₁緩和（約４２秒）を有するので、Ｃ１位置のみでの同位体濃縮が好ましい。

「過分極」及び「分極」という用語は以後は互換的に使用され、０．１％を超え、さらに好ましくは１％を超え、最も好ましくは１０％を超える核分極レベルを意味する。

分極レベルは、例えば、固体過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩（例えば、¹³Ｃ−ピルビン酸塩の動的核分極（ＤＮＰ）によって得られる固体過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩）の固体状態¹³Ｃ−ＮＭＲ測定によって決定できる。固体状態¹³Ｃ−ＮＭＲ測定は、好ましくは小さいフリップ角を用いる単パルス取得ＮＭＲシーケンスからなる。ＮＭＲスペクトル中の過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩の信号強度を、分極プロセス前に取得したＮＭＲスペクトル中の¹³Ｃ−ピルビン酸塩の信号強度と比較する。次いで、分極前後における信号強度の比から分極レベルを計算する。

同様に、溶解した過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩に関する分極レベルは、液体状態ＮＭＲ測定によって決定できる。この場合にも、溶解した過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩の信号強度を、既知組成の参照試料（例えば、液体のピルビン酸又は水溶液として溶解したピルビン酸ナトリウム）の信号強度と比較する。次いで、任意には相対濃度に関して補正した、過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩及び既知参照試料の信号積分の比から分極レベルを計算する。分極度はまた、過分極が消失した後における同じ¹³Ｃ−ピルビン酸塩試料の熱平衡信号との比較によって決定することもできる。

ＮＭＲ活性¹³Ｃ核の過分極は、例えば国際公開第９８／３０９１８号、同第９９／２４０８０号及び同第９９／３５５０８号（これらの開示内容はいずれも援用によって本明細書の内容の一部をなす）に記載されている様々な方法によって達成でき、過分極方法には、希ガスからの分極移動、「ブルートフォース（ｂｒｕｔｅ ｆｏｒｃｅ）」、スピン冷凍、パラ水素法及び動的核分極（ＤＮＰ）がある。

過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩を得るためには、¹³Ｃ−ピルビン酸塩を直接に分極させるか、或いは¹³Ｃ−ピルビン酸を分極させ、次いで分極¹³Ｃ−ピルビン酸を（例えば、塩基での中和により）分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩に転化させることが好ましい。

過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩を得るための好適な方法の１つは、国際公開第９８／３０９１８号に記載されている過分極希ガスからの分極移動である。非ゼロ核スピンを有する希ガスは、円偏光の使用によって過分極させることができる。過分極希ガス（好ましくはＨｅ又はＸｅ或いはかかるガスの混合物）を用いて¹³Ｃ核の過分極を達成することができる。過分極ガスは気相中にあってもよく、液体／溶媒中に溶解されてもよく、或いは過分極ガス自体を溶媒として使用してもよい。別法として、ガスを冷却固体表面上に凝縮させ、この形態で使用してもよいし、或いは昇華させてもよい。過分極ガスと¹³Ｃ−ピルビン酸塩又は¹³Ｃ−ピルビン酸とを緊密に混合することが好ましい。したがって、室温で液体である¹³Ｃ−ピルビン酸を分極させるならば、過分極ガスを液体／溶媒中に溶解するか、或いはこれを溶媒として使用することが好ましい。¹³Ｃ−ピルビン酸塩を分極させるならば、過分極ガスをピルビン酸塩も溶解する液体／溶媒中に溶解することが好ましい。

過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩を得るための別の好適な方法は、非常に低い温度及び高い磁場での熱力学的平衡化によって¹³Ｃ核に分極を付与するものである。過分極は、ＮＭＲ分光計の動作磁場及び温度に比べ、非常に高い磁場及び非常に低い温度（ブルートフォース）の使用によって達成される。使用する磁場強度はできるだけ高くすべきであり、好適には１Ｔより高く、好ましくは５Ｔより高く、さらに好ましくは１５Ｔ以上であり、特に好ましくは２０Ｔ以上である。温度は非常に低くすべきであり、例えば４．２Ｋ以下、好ましくは１．５Ｋ以下、さらに好ましくは１．０Ｋ以下、特に好ましくは１００ｍＫ以下である。

過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩を得るための別の好適な方法は、スピン冷凍法である。この方法は、スピン冷凍分極による固体化合物又は系のスピン分極をカバーする。かかる系には、三次若しくはそれ以上の対称軸をもつ好適な結晶質常磁性物質（例えば、Ｎｉ²⁺、ランタニド又はアクチニドイオン）がドープされるか、或いはそれと緊密に混合される。共鳴励起磁場を全く加えないので均一な磁場は必要とされず、その計装はＤＮＰのために必要なものより簡単である。このプロセスは、磁場の方向に直角な軸の周りで試料を物理的に回転させることによって実施される。この方法に関する前提条件は、常磁性種が高度に異方性のｇ因子をもつことである。試料回転の結果として、電子常磁性共鳴が核スピンと接触し、核スピン温度の低下をもたらす。試料回転は、核スピン分極が新たな平衡に達するまで実施される。

好ましい実施形態では、過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩を得るためにＤＮＰ（動的核分極）が使用される。ＤＮＰでは、分極させるべき化合物中のＭＲ活性核の分極は、不対電子を含む化合物である分極剤又はいわゆるＤＮＰ剤によって達成される。ＤＮＰプロセス中には、通常はマイクロ波放射の形態でエネルギーが供給され、これがまずＤＮＰ剤を励起する。基底状態への崩壊に際して、ＤＮＰ剤の不対電子から分極させるべき化合物のＮＭＲ活性核（例えば、¹³Ｃ−ピルビン酸塩中の¹³Ｃ核）への分極の移動が起こる。一般に、ＤＮＰプロセスでは中程度の又は高い磁場及び非常に低い温度が使用されるのであって、例えばＤＮＰプロセスは液体ヘリウム及び約１Ｔ以上の磁場中で実施される。別法として、中程度の磁場及び十分な分極増強が達成される任意の温度を使用することもできる。ＤＮＰ技法は、例えば国際公開第９８／５８２７２号及び同第０１／９６８９５号に一層詳しく記載されており、これらの開示内容はいずれも援用によって本明細書の内容の一部をなしている。

ＤＮＰ法によって化合物を分極させるためには、分極させるべき化合物とＤＮＰ剤との混合物（「試料」）を調製し、次いでこれを凍結して分極用のＤＮＰ分極装置内に固体として挿入するか、或いはＤＮＰ分極装置内に液体として挿入すれば非常に低い周囲温度のために前記装置内で凍結する。分極後、凍結した固体過分極試料は、融解又は適当な溶解媒質中への溶解によって急速に液体状態に移行される。溶解が好ましく、凍結過分極試料の溶解プロセス及びそのための好適な装置は国際公開第０２／３７１３２号に詳述されている。融解プロセス及び融解用の好適な装置は、例えば国際公開第０２／３６００５号に記載されている。

分極させるべき化合物中に高い分極レベルを得るためには、ＤＮＰプロセス中に前記化合物とＤＮＰ剤とが緊密に接触している必要がある。凍結又は冷却時に試料が結晶化するならば、それに当てはまらない。結晶化を避けるためには、試料中にガラス形成剤を存在させる必要があり、或いは凍結時に結晶化せずにガラスを形成する化合物を分極用として選択する必要がある。

前述の通り、¹³Ｃ−ピルビン酸又は¹³Ｃ−ピルビン酸塩が過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩を得るための好適な出発原料である。

同位体濃縮された¹³Ｃ−ピルビン酸塩は、例えば¹³Ｃ−ピルビン酸ナトリウムとして商業的に入手できる。別法として、それはＳ．Ａｎｋｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１７６，１９４８，１３３−１３３５に記載されたようにして合成できる。

¹³Ｃ₁−ピルビン酸の合成のためには、いくつかの方法が当技術分野で知られている。簡単に述べれば、Ｓｅｅｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０（２），１９７５，２３１−２３７には、カルボニル含有出発原料をＳ，Ｓ−アセタール（例えば、１，３−ジチアン又は２−メチル−１，３−ジチアン）として保護及び活性化することに基づく合成経路が記載されている。かかるジチアンをメタレート化し、メチル含有化合物及び／又は¹³ＣＯ₂と反応させる。この参考文献中に略述されているような適当な同位体濃縮¹³Ｃ−成分を使用することで、¹³Ｃ₁−ピルビン酸塩又は¹³Ｃ_1,2−ピルビン酸塩を得ることが可能である。次いで、文献中に記載されている通常の方法を用いてカルボニル官能基を遊離させる。異なる合成経路は酢酸から開始するが、酢酸をまず臭化アセチルに転化させ、次いでＣｕ¹³ＣＮと反応させる。得られたニトリルはアミドを介してピルビン酸に転化される（例えば、Ｓ．Ｈ．Ａｎｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１７６（１９４８），１３３３又はＪ．Ｅ．Ｔｈｉｒｋｅｔｔｌｅ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９７），１０２５を参照されたい）。さらに¹³Ｃ−ピルビン酸は、例えば米国特許第６，２３２，４９７号に記載された方法又は国際公開第２００６／０３８８１１号に記載された方法により、商業的に入手できる¹³Ｃ−ピルビン酸ナトリウムへのプロトン付加によって得ることができる。

ＤＮＰによる¹³Ｃ−ピルビン酸の過分極は、国際公開第２００６／０１１８０９号（その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす）に詳述されている。簡単に述べれば、¹³Ｃ−ピルビン酸は凍結時にガラスを形成するので、それはＤＮＰのためにそのまま使用できる。ＤＮＰ後、凍結過分極¹³Ｃ−ピルビン酸を溶解して中和すること（即ち、¹³Ｃ−ピルビン酸塩に転化させること）が必要である。転化のためには、強塩基が必要である。さらに、¹³Ｃ−ピルビン酸は強酸であるので、この強酸中で安定なＤＮＰ剤を選択する必要がある。好ましい塩基は水酸化ナトリウムであり、水酸化ナトリウムによる過分極¹³Ｃ−ピルビン酸の転化は過分極¹³Ｃ−ピルビン酸ナトリウムを生じる。これは、インビボＭＲイメージング及び／又は分光法（即ち、ヒト又はヒト以外の動物の生体に関して実施されるＭＲイメージング及び／又は分光法）のために使用されるイメージング媒体用の好ましい¹³Ｃ−ピルビン酸塩である。

別法として、¹³Ｃ−ピルビン酸塩（即ち、¹³Ｃ−ピルビン酸の塩）をＤＮＰのために使用できる。好ましい塩は、国際公開第２００７／１１１５１５号（その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす）に詳述されているように、ＮＨ₄ ⁺、Ｋ⁺、Ｒｂ⁺、Ｃｓ⁺、Ｃａ²⁺、Ｓｒ²⁺及びＢａ²⁺、好ましくはＮＨ₄ ⁺、Ｋ⁺、Ｒｂ⁺及びＣｓ⁺、さらに好ましくはＫ⁺、Ｒｂ⁺及びＣｓ⁺、最も好ましくはＣｓ⁺からなる群からの無機陽イオンを含む¹³Ｃ−ピルビン酸塩である。これらの好ましい¹³Ｃ−ピルビン酸塩の合成法もまた、国際公開第２００７／１１１５１５号に開示されている。過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩をインビボＭＲイメージング及び／又は分光法用のイメージング媒体中に使用するならば、ＮＨ₄ ⁺、Ｋ⁺、Ｒｂ⁺、Ｃｓ⁺、Ｃａ²⁺、Ｓｒ²⁺及びＢａ²⁺からなる群からの無機陽イオンを生理学的に非常によく容認される陽イオン（例えば、Ｎａ⁺又はメグルミン）と交換することが好ましい。これは、陽イオン交換カラムの使用のような当技術分野で公知の方法で行うことができる。

さらに他の好ましい塩は、国際公開第２００７／０６９９０９号（その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす）に詳述されているように、有機アミン又はアミノ化合物の¹³Ｃ−ピルビン酸塩（好ましくは、ＴＲＩＳ−¹³Ｃ₁−ピルベート又はメグルミン−¹³Ｃ₁−ピルベート）である。これらの好ましい¹³Ｃ−ピルビン酸塩の合成法もまた、国際公開第２００７／０６９９０９号に開示されている。

本発明の方法で使用する過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩がＤＮＰによって得られるならば、¹³Ｃ−ピルビン酸又は¹³Ｃ−ピルビン酸塩及びＤＮＰ剤を含む分極させるべき試料は、さらに常磁性金属イオンを含み得る。ＤＮＰによって分極させるべき組成物中に常磁性金属イオンが存在することは、国際公開第２００７／０６４２２６号（その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす）に詳述されているように、¹³Ｃ−ピルビン酸／¹³Ｃ−ピルビン酸塩中の分極レベルの向上をもたらすことが判明している。

前述の通り、本発明の方法に係るイメージング媒体は、¹³Ｃ−ＭＲ検出によるインビボＡＬＴ活性測定（即ち、ヒト又はヒト以外の動物の生体におけるＡＬＴ活性測定）のためのイメージング媒体として使用できる。この目的のためには、イメージング媒体はヒト又はヒト以外の動物の生体への投与に適した組成物として提供される。かかるイメージング媒体は、ＭＲ活性剤である¹³Ｃ−ピルビン酸塩に加えて、水性キャリヤー、好ましくは生理学的に容認されかつ薬学的に許容される水性キャリヤー（例えば、水、緩衝液又は食塩水）を含むことが好ましい。かかるイメージング媒体はさらに、通常の薬学的又は獣医学的キャリヤー又は賦形剤（例えば、ヒト医学又は獣医学における診断用組成物のために常用されているような製剤化補助剤）を含むことができる。

さらに、本発明の方法に係るイメージング媒体は、¹³Ｃ−ＭＲ検出によるインビトロＡＬＴ活性測定（即ち、細胞培養物、血液試料のような身体試料、生検組織のようなエクスビボ組織又は単離器官におけるＡＬＴ活性測定）のためのイメージング媒体として使用できる。この目的のためには、イメージング媒体は、例えば細胞培養物、血液試料、生検組織のようなエクスビボ組織又は単離器官への添加に適した組成物として提供される。かかるイメージング媒体は、ＭＲ活性剤である¹³Ｃ−ピルビン酸塩に加えて、インビトロ細胞又は組織アッセイに適合しかつそのために使用される溶媒（例えば、ＤＭＳＯ又はメタノール或いは水性キャリヤー及び非水性溶媒を含む溶媒混合物（例えば、ＤＭＳＯと水又は緩衝液との混合物或いはメタノールと水又は緩衝液との混合物））を含むことが好ましい。当業者には自明の通り、かかるイメージング媒体中には薬学的に許容されるキャリヤー、賦形剤及び製剤化補助剤が存在し得るが、かかる目的のために必要なわけではない。

本発明の方法で使用するイメージング媒体をＡＬＴ活性のインビボ測定（即ち、ヒト又はヒト以外の動物の生体内での測定）のために使用するならば、前記イメージング媒体は好ましくは前記生体に非経口的に（好ましくは静脈内に）投与される。一般に、検査すべき生体はＭＲ磁石内に配置される。専用の¹³Ｃ−ＭＲ ＲＦコイルが、検査対象領域をカバーするように配置される。イメージング媒体の正確な用量及び濃度は、毒性及び投与経路のような一連の因子に依存する。好適には、イメージング媒体は体重１ｋｇ当たりピルビン酸塩１ｍｍｏｌ以下、好ましくは０．０１〜０．５ｍｍｏｌ／ｋｇ、さらに好ましくは０．１〜０．３ｍｍｏｌ／ｋｇの濃度で投与される。投与後４００秒未満、好ましくは１２０秒未満、さらに好ましくは投与後６０秒未満に、ＭＲイメージングシーケンス（好ましくは、検査対象体積をエンコードするもの）を複合した周波数及び空間選択的な方法で適用する。ＭＲシーケンスの正確な適用時間は、検査対象体積に大きく依存する。

本発明の方法で使用するイメージング媒体をＡＬＴ活性のインビトロ測定のために使用するならば、前記イメージング媒体は¹³Ｃ−ピルビン酸塩について１〜１００ｍＭ、さらに好ましくは２０〜９０ｍＭ、最も好ましくは４０〜８０ｍＭである。

本発明の方法に従えば、ＡＬＴ活性は¹³Ｃ−アラニンの信号並びに任意には¹³Ｃ−乳酸塩及び／又は¹³Ｃ−ピルビン酸塩の信号を検出することで測定できる。かかる測定は、¹³Ｃ₁−ピルビン酸塩について示す下記反応に基づいている。式中、^*は¹³Ｃ−標識を表している。

スキーム１に従えば、¹³Ｃ−ピルビン酸塩及びグルタミン酸塩がＡＬＴによって触媒される可逆反応で反応して¹³Ｃ−アラニン及びα−ケトグルタル酸塩を生成する。別の可逆反応では、¹³Ｃ−ピルビン酸塩が¹³Ｃ−乳酸塩に転化される。前述の通り、我々はＡＬＴ活性の上昇が低い¹³Ｃ−アラニン信号となって現れることを見出した。

本発明の文脈中における「信号」という用語は、¹³Ｃ−アラニン並びに任意には¹³Ｃ−乳酸塩及び／又は¹³Ｃ−ピルビン酸塩を表す¹³Ｃ−ＭＲスペクトル中のピークの、ノイズに対するＭＲ信号振幅又は積分又はピーク面積をいう。好ましい実施形態では、信号はピーク面積である。

好ましい実施形態では、¹³Ｃ−アラニン及び¹³Ｃ−乳酸塩の信号が検出される。

本発明の方法の好ましい実施形態では、上述した¹³Ｃ−アラニンの信号並びに任意には¹³Ｃ−乳酸塩及び／又は¹³Ｃ−ピルビン酸塩の信号を用いて、ＡＬＴ活性の指標である代謝プロファイルが生成される。本発明の方法がインビボで（即ち、ヒト又はヒト以外の動物の生体内で）実施されるならば、前記代謝プロファイルは全身から導くことができ、例えば全身のインビボ¹³Ｃ−ＭＲ検出によって得ることができる。好ましくは、前記代謝プロファイルは、検査対象領域又は体積（即ち、前記ヒト又はヒト以外の動物の生体の特定組織、器官又は部分）から生成され、最も好ましくは肝臓から生成される。
る。

本発明の方法の別の好ましい実施形態では、上述した¹³Ｃ−アラニンの信号並びに任意には¹³Ｃ−乳酸塩及び／又は¹³Ｃ−ピルビン酸塩の信号を用いて、ヒト又はヒト以外の動物から導かれる細胞培養物中の細胞、血液試料のような身体試料、生検組織のようなエクスビボ組織又は単離器官の代謝プロファイルが生成される。その場合、前記代謝プロファイルはインビトロ¹³Ｃ−ＭＲ検出によって生成される。好ましくは、前記代謝プロファイルは肝臓細胞、肝臓生検からのエクスビボ組織又は単離肝臓から生成される。

かくして、好ましい実施形態では、過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩を含むイメージング媒体を用いた¹³Ｃ−ＭＲ検出によるＡＬＴ活性の測定方法であって、¹³Ｃ−アラニンの信号並びに任意には¹³Ｃ−乳酸塩及び／又は¹³Ｃ−ピルビン酸塩の信号を検出し、前記信号を用いて代謝プロファイルを生成する方法が提供される。

好ましい実施形態では、¹³Ｃ−アラニン及び¹³Ｃ−乳酸塩の信号を用いて前記代謝プロファイルが生成される。

一実施形態では、¹³Ｃ−アラニン並びに任意には¹³Ｃ−乳酸塩及び／又は¹³Ｃ−ピルビン酸塩のスペクトル信号強度を用いて代謝プロファイルが生成される。別の実施形態では、¹³Ｃ−アラニン並びに任意には¹³Ｃ−乳酸塩及び／又は¹³Ｃ−ピルビン酸塩のスペクトル信号積分を用いて代謝プロファイルが生成される。別の実施形態では、¹³Ｃ−アラニン並びに任意には¹³Ｃ−乳酸塩及び／又は¹³Ｃ−ピルビン酸塩の個別画像からの信号強度を用いて代謝プロファイルが生成される。さらに別の実施形態では、¹³Ｃ−アラニン並びに任意には¹³Ｃ−乳酸塩及び／又は¹³Ｃ−ピルビン酸塩の信号強度を２以上の時点で求めることで¹³Ｃ−アラニン並びに任意には¹³Ｃ−乳酸塩及び／又は¹³Ｃ−ピルビン酸塩の変化速度が計算される。

別の実施形態では、代謝プロファイルは¹³Ｃ−アラニン並びに任意には¹³Ｃ−乳酸塩及び／又は¹³Ｃ−ピルビン酸塩の処理信号データ（例えば、多重ＭＲ検出の信号パターン（即ち、スペクトル又は画像）から導き出される信号の比、補正信号或いは動力学的又は代謝速度定数情報）を含むか、或いはかかる処理信号データを用いて生成される。かくして、好ましい実施形態では、補正¹³Ｃ−アラニン信号（即ち、¹³Ｃ−アラニン／¹³Ｃ−乳酸塩信号及び／又は¹³Ｃ−アラニン／¹³Ｃ−ピルビン酸塩信号）が代謝プロファイル中に含まれるか、或いはそれを用いて代謝プロファイルが生成される。さらに別の好ましい実施形態では、補正¹³Ｃ−アラニン／総¹³Ｃ−炭素信号が代謝プロファイル中に含まれるか、或いはそれを用いて代謝プロファイルが生成される。ここで、総¹³Ｃ−炭素信号は¹³Ｃ−アラニン並びに¹³Ｃ−乳酸塩及び／又は¹³Ｃ−ピルビン酸塩の信号の和である。さらに好ましい実施形態では、¹³Ｃ−アラニンと¹³Ｃ−乳酸塩及び／又は¹³Ｃ−ピルビン酸塩との比が代謝プロファイル中に含まれるか、或いはそれを用いて代謝プロファイルが生成される。

本発明に係る方法の好ましい実施形態で生成された代謝プロファイルは、検査すべき生体、生体部分、細胞、組織、身体試料などのＡＬＴ活性を表し、得られた前記情報は例えば様々な目的のために以後の段階で使用できる。

これらの目的の１つは、ＡＬＴ活性を含む肝臓代謝を変化させる化合物の評価、例えばアルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、シスプラチン）、代謝拮抗物質（例えば、メルカプトプリン、アザチオプリン）、ビンカ（ｖｉｎｃａ）アルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン）又は抗腫瘍抗生物質（例えば、ダクチノマイシン）の評価であり得る。

一実施形態では、本発明の方法はインビトロで実施され、得られた情報がＡＬＴ活性を変化させる可能性がある薬物の効果を（例えば、薬物発見及び／又はスクリーニングプロセスで）評価するために使用される。かかる実施形態では、本発明の方法は適当な細胞培養物又は組織において実施できる。細胞又は組織を可能性のある薬物と接触させ、本発明の方法に従った¹³Ｃ−ＭＲ検出によってＡＬＴ活性を測定する。処理細胞又は組織のＡＬＴ活性を未処理細胞又は組織のＡＬＴ活性と比較することで、可能性のある薬物の効果に関する情報を得ることができる。別法として、処理の前後における細胞又は組織のＡＬＴ活性を測定することでＡＬＴ活性の変化を求めることができる。かかる薬物効果の評価は例えばマイクロプレート上で実施できるが、これは各種の可能性のある薬物及び／又は可能性のある薬物の様々な用量の並行試験を可能にし、したがってそれを高スループットスクリーニングのために好適なものにするであろう。

別の実施形態では、本発明の方法はインビボで実施され、得られた情報がＡＬＴ活性を変化させる可能性がある薬物の効果をインビボで評価するために使用される。かかる実施形態では、本発明の方法は例えば臨床治験において試験動物又は志願者に関して実施できる。試験動物又は志願者に可能性のある薬物を投与し、本発明の方法に従った¹³Ｃ−ＭＲ検出によってＡＬＴ活性を測定する。処置前及び処置後に（例えば、処置を繰り返しながら一定の期間にわたり）ＡＬＴ活性の変化を測定することで、可能性のある薬物の効果に関する情報を得ることができる。かかる薬物効果の評価は、前臨床研究（試験動物）又は臨床治験において実施できる。

別の実施形態では、本発明の方法はインビボ又はインビトロで実施され、得られた情報を用いて疾患に対する治療を受けている罹患患者において治療応答の評価及び／又は治療効果の判定が行われる。例えば、ＡＬＴ活性に影響を与えると予想される抗ウイルス薬でウイルス性肝炎患者を治療する場合、本発明の方法に従ってＡＬＴ活性を測定できる。好適には、前記抗糖尿病薬による治療の開始前及び治療後に（例えば、一定の期間にわたり）、本発明の方法によってＡＬＴ活性を測定する。初期ＡＬＴ活性を治療中及び治療後のＡＬＴ活性と比較することで、抗糖尿病薬がＡＬＴ活性に対して何らかのプラス効果を示すか否か、そして示すならばその程度はどれくらいかを評価することが可能である。上述の目的のために本発明の方法をインビトロで実施するには、もちろん、治療を受ける患者から適当な試料（例えば、組織試料又は血液試料のような身体試料）が得られることが必要である。

前述の通り、本発明の方法で得られた情報は様々な目的のために以後の段階で使用できる。

別の目的は、疾患状態を洞察すること、即ちリスクのある患者の同定、疾患の早期検出、並びに疾患の進行、重篤度及び疾患に関係する合併症の評価であり得る。好ましい目的は、肝臓疾患状態を洞察すること、即ちリスクのある患者の同定、肝臓疾患の早期検出、並びに肝臓疾患の進行、重篤度及び肝臓疾患に関係する合併症の評価である。

かくして、一実施形態では、本発明の方法がインビボ又はインビトロで実施され、得られた情報が肝臓疾患を発症するリスクのある患者及び／又は急性又は慢性肝臓疾患の発症を回避するための予防処置の候補を同定するために使用される。例えば非ウイルス性肝炎のような肝臓関連疾患の早期治療（例えば、ライフスタイルの変化）は、例えば慢性肝炎又は肝硬変のような、かかる肝臓疾患に関連する最も恐ろしい合併症の一部を予防する。リスクのある患者及び／又は糖尿病や高脂血症の制御、超過体重患者の減量及びアルコールの節制を含むライフスタイルの変化のような予防処置の候補を同定するための最適アプローチはまだ決定されていない。したがって、肝臓疾患を発症するリスクのある患者を同定すると共に予防処置の候補を同定するために有用な方法を得ることは有益であろう。本発明の方法は、そのような同定を行うために必要な情報を提供し得る。この実施形態では、本発明の方法を用いることで、最初の時点で初期ＡＬＴ活性を測定し、続いて一定の期間にわたり一定の頻度で（例えば、半年ごと又は１年ごとに）ＡＬＴ活性の測定を行うことができる。ＡＬＴ活性の上昇は肝臓疾患を発症するリスクの増加を表すと予想でき、医師は上昇速度を用いて予防処置及び／又は治療の開始を決定できる。さらに、経時的なＡＬＴ活性測定の結果をＡＳＴ又はＡＬＰ測定のような他の肝臓機能試験からの結果と組み合わせることができ、組み合わせた結果を用いて予防処置及び／又は治療に関する決定を行うことができる。上述の目的のために本発明の方法をインビトロで実施するには、もちろん、治療を受ける患者から適当な試料（例えば、組織試料又は血液試料のような身体試料）が得られることが必要である。別法として、インビボ¹³Ｃ−ＭＲ検出は肝臓イメージングでＡＬＴ活性を直接に検出することを可能にし、したがって得られた情報は、肝臓疾患を発症するリスクのある患者及び／又は急性又は慢性肝臓疾患の発症を回避するための予防処置の候補を同定するため直接かつ簡便に使用できる。

別の実施形態では、本発明の方法はインビボ又はインビトロで実施され、得られた情報が疾患の早期検出のために使用される。この実施形態では、本発明の方法を用いて初期ＡＬＴ活性を測定してそれを正常ＡＬＴ活性（例えば、健常被験体におけるＡＬＴ活性）と比較するか、或いは特定の組織における初期ＡＬＴ活性を測定することができる。

さらに別の実施形態では、本発明の方法はインビボ又はインビトロで実施され、得られた情報が疾患の進行をモニターするために使用される。これは、例えば治療に重大な副作用が伴うため、治療が適用又は推奨されるレベルにまで疾患が進行していない場合の疾患又は障害に関して有用であり得る。かかる状況下では、選択すべき処置は、疾患の進行に関して患者を綿密にモニターして悪化の早期検出を行うことである。この実施形態では、本発明の方法を用いることで、初期ＡＬＴ活性を測定し、続いて一定の期間にわたり一定の頻度でＡＬＴ活性の測定を行うことができる。肝臓疾患に関しては、ＡＬＴ活性の上昇は疾患の進行及び悪化を表すと予想でき、医師は前記上昇を用いて治療の開始を決定することができる。上述の目的のために本発明の方法をインビトロで実施するには、もちろん、治療を受ける患者から適当な試料（例えば、（肝臓）組織試料或いは肝臓生検試料又は血液試料のような身体試料）が得られることが必要である。

さらに別の実施形態では、本発明の方法はインビボ又はインビトロで実施され、得られた情報が疾患の重篤度を判定するために使用される。多くの場合、疾患はその発症から時間の経過と共に進行する。症状の種類及び／又は一定の臨床マーカーの所見に応じ、疾患は一定の段階（例えば、初期（軽症期）、中期（中等症期）及び後期（重症期））によって特徴づけられる。ある種の疾患に関しては、さらに細分された段階が常用される。疾患のステージングのためには、ある種の酵素又はタンパク質発現物のような特異的なものばかりでなく血液値や電解質レベルなどの一般的なものを含む各種の臨床マーカーが使用されることが知られている。このような点から見て、ＡＬＴ活性は、疾患の段階、したがって疾患の重篤度を判定するために（単独で或いは他のマーカー及び／又は症状と組み合わせて）使用される上記のような臨床マーカーであり得る。したがって、本発明の方法を用いて患者におけるＡＬＴ活性を定量的に測定し、得られたＡＬＴ活性値から患者の疾患のステージングを行うことが可能であり得る。例えば初期、中期及び後期の疾患を有する患者におけるＡＬＴ活性を本発明の方法に従って測定し、一定の段階に特有のＡＬＴ活性範囲を画定することにより、一定の疾患段階に特有のＡＬＴ範囲を確定できる。

ＡＬＴ活性は食事状態又は運動のような各種の因子による影響を受けるので、例えば本発明方法の実施に先立って患者に食事計画又は標準化食事を与えることにより、これらの因子を制御することが重要である。また、絶食は¹³Ｃ−アラニン信号の減少をもたらすので、患者を絶食させないことも判明している。

インビボで実施する場合、本発明の方法には解剖学的情報及び／又は（好適であれば）灌流情報を含めることができる。解剖学的情報は、例えば、本発明の方法の前後に適当な造影剤を使用し又は使用せずにプロトン又は¹³Ｃ−ＭＲ画像を取得することで得ることができる。

以下、ピルビン酸塩、¹³Ｃ−ピルビン酸塩及び¹³Ｃ₁−ピルビン酸塩という用語は互換的に使用され、いずれも¹³Ｃ₁−ピルビン酸塩を意味する。ピルビン酸、¹³Ｃ−ピルビン酸及び¹³Ｃ₁−ピルビン酸という用語は互換的に使用され、いずれも¹³Ｃ₁−ピルビン酸を意味する。アラニン、¹³Ｃ−アラニン及び¹³Ｃ₁−アラニンという用語は互換的に使用され、いずれも¹³Ｃ₁−アラニンを意味する。乳酸塩、¹³Ｃ−乳酸塩及び¹³Ｃ₁−乳酸塩という用語は互換的に使用され、いずれも¹³Ｃ₁−乳酸塩を意味する。

実施例１ ＤＮＰ法によって得られた過分極 ¹³ Ｃ ₁ −ピルビン酸塩を含むイメージング媒体の製造
国際公開第９８／３９２７７号の実施例７に従って合成したトリス（８−カルボキシ−２，２，６，６−テトラ（ヒドロキシエチル）ベンゾ［１，２−４，５’］ビス−（１，３）ジチオール−４−イル）メチルナトリウム塩（トリチルラジカル）を試験管内の¹³Ｃ−ピルビン酸（４０ｍＭ）に添加して、トリチルラジカル濃度が１５ｍＭの組成物を得た。

組成物を試験管から試料カップに移し、試料カップをＨｙｐｅｒＳｅｎｓｅ（商標）ＤＮＰ分極装置（Ｏｘｆｏｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）内に挿入した。ＤＮＰ条件下、３．３５Ｔの磁場中において１．４°Ｋでマイクロ波（９３．８９ＧＨｚ）を４５分間照射して組成物を分極させた。

次いで、組成物を１０バールの圧力及び１７０℃の温度で水酸化ナトリウム、ＴＲＩＳ緩衝剤及びＥＤＴＡの水溶液に溶解した。得られたイメージング媒体はｐＨ７．２〜７．９で８０ｍＭの過分極¹³Ｃ₁−ピルビン酸ナトリウムを含み、投与中に約１８％の分極を有していた。

実施例２ 絶食ラット肝臓モデル−動物の前処理
この研究では、絶食ラット及び非絶食ラットの両方において肝臓代謝を調べるために２群のラットを使用した。非絶食ラットには自由に給餌したのに対し、絶食ラットではＭＲ検出の約２４時間前に食物を取り除いた。

実施例３ ¹³ Ｃ−ＭＲ検出
実施例３ａ 動物の前処理
尾静脈中にカテーテルを導入し、次いでラットをＭＲスキャナー内に配置した。

実施例３ｂ 過分極 ¹³ Ｃ−ピルビン酸塩の投与
実施例１で製造したイメージング媒体の３ｍｌを、ラットに尾静脈カテーテルを通して１２秒かけて注射した。

実施例３ｃ ¹³ Ｃ−ＭＲイメージング／分光法
自家製の二重同調¹Ｈ／¹³Ｃ ＲＦコイルをラット腹部の上方に取り付け、肝臓からの信号の位置を確認した。ラットを３Ｔ水平ボア型ＧＥ ＭＲスキャナー内に配置した。

¹³Ｃ−ＭＲ分光法実験のためには、５°のフリップ角を有するスライス選択性（肝臓を中心とする１５ｍｍスラブ選択）ＲＦパルスを注入開始から３秒ごとに印加した。ＭＡＴＬＡＢを用いて処理された収集データをフーリエ変換前に１０Ｈｚローレンツフィルターでアポダイズし、マグニチュードスペクトルから動的データ点を採取した。処理された動的曲線から、¹³Ｃ−乳酸塩ピーク高さ及び¹³Ｃ−アラニンピーク高さを用いて、統計的比較のために使用する¹³Ｃ−乳酸塩／¹³Ｃ−アラニンピーク比を得た（図１参照）。

３Ｄ−¹³Ｃ−ＭＲ分光イメージング実験のためには、可変フリップ角、順序をエンコードするセントリック位相、ＴＥ＝１４０ミリ秒、ＴＲ＝２１５ミリ秒（１４秒の総取得時間）、ＦＯＶ＝８×８ｃｍ及び１ｃｃの分解能を有するダブルスピンエコーシーケンス（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍａｇ．Ｒｅｓｏｎ．１８７：３５７−３６２（２００７））を用いて取得を実施した。処理された３Ｄマグニチュードスペクトルから、各ラットについて、解剖学的画像から見てほとんどが肝臓組織を含むボクセルを手作業で標識した。各肝臓ボクセルに関し、マグニチュードスペクトル中において¹³Ｃ−ピルビン酸塩、¹³Ｃ−ピルビン酸塩水和物、¹³Ｃ−乳酸塩及び¹³Ｃ−アラニンピーク下にある面積を計算し、これら４つの面積の和を総炭素面積と名づけた（図１参照）。各ボクセルについて乳酸塩面積／総炭素面積及びアラニン面積／総炭素面積を計算し、次いですべての肝臓ボクセルにわたって平均することで、試験統計量である平均乳酸塩／総炭素比及び平均アラニン／総炭素比を得た。

図２は、正常ラット及び絶食ラットからの代表的な肝臓スライス局限動的曲線を示している。これらの最終動的曲線は、重ね合わせプロット中の各水平線が３秒ごとに収集された過分極化学種の独立したマグニチュードスペクトルを表す重ね合わせプロットインセットから導かれた。明確さのため、ピルビン酸塩水和物は最終プロットの動的曲線から省いてあり、ピルビン酸塩曲線は見やすくするために１／４の倍率で縮小してある。動的曲線中、各々のマークした点はその時点におけるピルビン酸塩（約１７１ｐｐｍ）、乳酸塩（約１８３ｐｐｍ）及びアラニン（約１７６ｐｐｍ）の強度（即ち、関連する重ね合わせプロット中におけるその稜線の軌跡）を表しており、ピルビン酸塩の取込み及び転化を示している。通例、乳酸塩及びアラニン曲線は注入から約２０〜３０秒後にプラトーに達し、最高の乳酸塩及びアラニンＳＮＲがこの範囲で生じることを意味している。各ボクセルからのＳＮＲは全スライスＭＲＳ実験でのＳＮＲよりはるかに低いので、これは３Ｄ−¹³Ｃ−ＭＲ分光イメージング取得用のイメージング窓を選択するために重要である。定性的には、正常ラットにおける乳酸塩及びアラニン曲線は同様の最大振幅を有するが、絶食ラットでは劇的な差が存在した（図３）。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙランク−サム検定を用いれば、乳酸塩／アラニン比について統計的有意差が存在していた（Ｐ＜０．０１）。

図４は、正常ラット及び絶食ラットの肝臓に関し、１ｃｍ³のボクセル分解能を有する３Ｄ−ＭＲＳＩスペクトルからの代表的なスライスを示している（通例、ラットの肝臓は２つのスライスにわたって存在していた）。すべての絶食肝臓のボクセルスペクトルは高い乳酸塩／アラニン比を示しており、ＭＲＳ取得で見られたことを確証している。定性的には、乳酸塩レベルは正常肝臓スペクトルと絶食肝臓スペクトルとの間で同等に見えるが、アラニンは後者の方が低い。各ラットに関し、平均乳酸塩面積／総炭素面積比及び平均アラニン面積／総炭素面積比を計算した。図５はこれらの乳酸塩分率を示している。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙランク−サム検定を用いれば、正常群と絶食群との間における乳酸塩／総炭素面積の統計的有意差は存在しなかった（Ｐ＝０．４２）が、正常群と絶食群との間におけるアラニン／総炭素面積の統計的有意差は存在していた（Ｐ＜０．０１）。

Claims (9)

1. 過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩を含むイメージング媒体を用いた¹³Ｃ−ＭＲ検出によるＡＬＴ活性の測定方法であって、¹³Ｃ−アラニンの信号並びに任意には¹³Ｃ−乳酸塩及び／又は¹³Ｃ−ピルビン酸塩の信号を検出することを含んでなる方法。
2. ¹³Ｃ−アラニンの信号並びに任意には¹³Ｃ−乳酸塩及び／又は¹³Ｃ−ピルビン酸塩の信号を用いて、検査すべき生体、生体部分、細胞、組織又は身体試料のＡＬＴ活性を表す代謝プロファイルが生成される、請求項１記載の方法。
3. イメージング媒体がインビボ¹³Ｃ−ＭＲ検出のためヒト又はヒト以外の動物の生体に投与される、請求項１又は請求項２記載の方法。
4. イメージング媒体がインビトロ¹³Ｃ−ＭＲ検出のために使用される、請求項１又は請求項２記載の方法。
5. 代謝プロファイルによって得られた情報が、肝臓疾患を発症するリスクのある患者及び／又は急性又は慢性肝臓疾患の発症を回避するための予防処置の候補を同定するために使用される、請求項２記載の方法。
6. ＡＬＴ活性が一定期間にわたり第１の時点及び以後の時点で測定される、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
7. イメージング媒体がヒト又はヒト以外の動物の生体に投与され、投与後４００秒未満にＭＲイメージングシーケンスが適用される、請求項３、請求項５又は請求項６記載の方法。
8. 過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩が¹³Ｃ−ピルビン酸又は¹³Ｃ−ピルビン酸塩の動的核分極によって得られる、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
9. ¹³Ｃ−ＭＲ検出によるＡＬＴ活性の測定方法で使用すべきイメージング媒体の製造のための、過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩の使用。