JP2011504535A - 結合体化されたβ−１，３−結合グルカン - Google Patents

Abstract

β−１，３結合を排他的に、または主として有するグルカンを免疫原として使用する。該グルカンは、β−１，３−結合グルコース残基を含む。任意選択で、該グルカンはβ−１，６−結合グルコース残基を含んでいてもよいが、β−１，６−結合残基に対するβ−１，３−結合残基の比が少なくとも８：１である、および／またはβ−１，３結合のみによって他の残基に連結された少なくとも５つの隣接する非末端残基の配列が１つ以上存在するものとする。グルカンは、通常、結合体化された形態で使用する。好ましいグルカン供給源はカードランであり、これは、結合体化前に、適当な形態に加水分解されてもよい。

Description

この出願は、２００７年１１月２６日に出願された米国仮出願第６１／００４，３３３号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。

本発明は、ワクチン、より詳細には、真菌感染および疾患に対するワクチンに関する。

発明の背景
真菌感染は、いくつかの臨床場面において、特に、免疫無防備状態の患者において流行する。このような真菌に対する治療用および予防用ワクチン接種において、抗真菌薬、特にアゾール系のものに対する耐性の発現への関心が高まっている［１（非特許文献１）］。真菌病原体の中でも、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓは、最も流行性のものの１つである。この生物体は、ヒトにおいて広く見られる日和見感染症の主要因子の１つであり、カンジダ症（これは、通常患者および免疫無防備状態の患者の両方に見られる状態）を引き起こす。抗カンジダワクチンを提供する試みが数例行なわれた。

グルカンは、とりわけ、真菌の細胞壁に見られるグルコース含有多糖類である。α−グルカンは、グルコースサブユニット間に１つ以上のα−結合を含むものであり、β−グルカンは、グルコースサブユニット間に１つ以上のβ−結合を含むものである。典型的な真菌の細胞壁には、β−１，３−グルカン細線維が互いに絡み合っており、キチン細線維と架橋して内部骨格層を形成しており、一方、外部層は、キチンとβ−１，３−グルカンとによって該内部層に結合されたβ−１，６−グルカンおよびマンノタンパク質からなる。

Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓは、細胞壁の５０〜７０％がβ−１，３−グルカンおよびβ−１，６−グルカンで構成されている。抗真菌ワクチンとしてのβ−グルカンの使用は参考文献２（非特許文献２）に概説されている。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのβ−１，６−グルカンに対する防御的抗体をマウスにおいて生成させた［３（特許文献１），４（非特許文献３）］。マンノタンパク質枯渇Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞のワクチン接種によって抗β−１，６−グルカン抗体を生成させたマウスは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓによる全身性抗原刺激に対してある程度の防御を有することが示された。さらに、このような抗β−１，６−グルカン抗体で受動免疫処置したマウスは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに対する防御レベルの上昇を示した。同様に、抗β−１，３−グルカン抗体はＣ．ａｌｂｉｃａｎｓに対して防御的であることがわかっており、β−１，３−グルカンに結合するモノクローナル抗体は、播種性実験的カンジダ症を防御することができた［５（非特許文献４）］。

国際公開第２００６／０３０３１８号

Ｄｅｅｐｅ、Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ．（１９９７）１０：５８５〜５９６ ＣａｓｓｏｎｅおよびＴｏｒｏｓａｎｔｕｃｃｉ、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２００６）５：８５９〜６７ Ｔｏｒｏｓａｎｔｕｃｃｉら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ（２００５）２０２：５９７〜６０６ Ｐａｎｇら、Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ（２００５）６９：５５３〜８

本発明の目的は、感染、特に真菌感染に対して防御的および／または治療的免疫応答を誘導するためのさらなる良好なグルカン抗原を提供することである。

発明の概要
本発明は、医薬における使用のためのグルカンに関する。本発明のグルカンは、（ｉ）排他的にβ−１，３−結合グルコース残基を有するか、または（ｉｉ）β−１，３−結合グルコース残基およびβ−１，６−結合グルコース残基の両方を含むかのいずれかであり得る、ただし、β−１，６−結合残基に対するβ−１，３−結合残基の比が少なくとも８：１である、および／またはβ−１，３結合のみによって他の残基に連結された少なくとも５つの隣接する非末端残基の配列が１つ以上存在するものとする。特に、グルカンは、（ｉ）排他的にβ−１，３−結合グルコース残基を有するか、または（ｉｉ）β−１，３−結合グルコース残基およびβ−１，６−結合グルコース残基の両方を含むかのいずれかであり得る、ただし、β−１，６−結合残基に対するβ−１，３−結合残基の比が少なくとも８：１であるものとする。一実施形態において、グルカンは、排他的に１，３結合を有する線状β−Ｄ−グルコピラノースである。グルカンは、カードラン、パラミロン（ｐａｒａｍｙｌｏｎ）、またはその断片であり得る。グルカンは、カードランの加水分解断片であり得る。特定の実施形態において、グルカンは、２〜６０個のグルコース単糖単位を有する。グルカンは、免疫原としての使用のためのものであり得る。特に、グルカンは、例えば、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに対する防御的抗体応答の提供における使用のためのものであり得る。

また、本発明は、担体分子に連結された本発明のグルカンを含む結合体にも関する。担体分子は、細菌毒素またはその非毒性誘導体であり得る。特定の一実施形態において、担体はＣＲＭ１９７である。

また、本発明は、本発明のグルカンまたは結合体を、薬学的に許容され得る担体とのとの組み合わせで含む医薬組成物に関する。

さらに、本発明は、本発明のグルカン、結合体または医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における免疫応答を惹起するための方法に関する。

図１は、糖および結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーンは：（１）ＣＲＭ１９７；（２）ＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリン；（３）ＣＲＭ１９７に結合体化させた水解型カードラン；（４）破傷風トキソイド単量体、Ｔｔ；（５）Ｔｔに結合体化させたラミナリン；（６）Ｔｔに結合体化させた水解型カードランである。 図２は、結合体のＳＥＣ−ＨＰＬＣプロフィールを示す。図２Ａは、ＣＲＭ１９７結合体のプロフィールを示し、図２Ｂは、Ｔｔ結合体のプロフィールを示す。両方の場合において、最も右側のピークは、結合体化されていない担体のプロフィールである。最小ピークはカードラン結合体である。第３のピークはラミナリン結合体である。 図３は、合成グルカンの結合体化の概要である。 図４は、合成グルカンの結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。 図５は、種々の個々のアジュバントおよび併用アジュバントと合わせて腹腔内投与によって投与した、ＣＲＭ１９７または破傷風トキソイドのいずれかに結合体化させたラミナリンに対するＩｇＧ ＧＭＴを示す。 図６は、種々の個々のアジュバントおよび併用アジュバントと合わせて皮下投与によって投与した、ＣＲＭ１９７または破傷風トキソイドのいずれかに結合体化させたラミナリンに対するＩｇＧ ＧＭＴを示す。 図７は、種々の個々のアジュバントおよび併用アジュバントと合わせて腹腔内投与によって投与した、ＣＲＭ１９７または破傷風トキソイドのいずれかに結合体化させたカードランに対するＩｇＧ ＧＭＴを示す。 図８は、種々の個々のアジュバントおよび併用アジュバントと合わせて皮下投与によって投与した、ＣＲＭ１９７または破傷風トキソイドのいずれかに結合体化させたカードランに対するＩｇＧ ＧＭＴを示す。 図９は、種々の糖用量のラミナリン結合体に対するＩｇＧ ＧＭＴを示す。 図１０は、種々の糖用量のカードラン結合体単独または個々のアジュバントと合わせたカードラン結合体に対するＩｇＧ ＧＭＴを示す。 図１１は、種々の糖用量のラミナリン結合体単独または個々のアジュバントと合わせたラミナリン結合体に対するＩｇＧ ＧＭＴ（抗ＧＧＺｙｍおよび抗ラミナリン）を示す。 図１２は、腹腔内投与によって投与した、合成グルカンおよびラミナリン結合体単独または種々の個々のアジュバントおよび併用アジュバントと合わせラミナリン結合体に対するＩｇＧ ＧＭＴ（抗ラミナリン）を示す。 図１３は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓでの抗原刺激前の、ＭＦ５９と合わせたＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンまたはＣＲＭ１９７およびＭＦ５９単独で処置したマウスの生存率を示す。 図１４は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓでの抗原刺激前の、ＭＦ５９と合わせたＣＲＭ１９７に結合体化したカードランまたはＭＦ５９単独で処置したマウスの生存率を示す。 図１５は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓでの抗原刺激前の、ＭＦ５９と合わせた２種類の合成グルカン結合体またはＭＦ５９単独で処置したマウスの生存率を示す。

発明の詳細な説明
参考文献３および５で使用されている市販のβ−グルカンは、ラミナリンおよびプスツランであった。ラミナリンは、褐藻類および海草類に見られ、一部β−１，６分枝を有するβ−１，３グルカンである。β（１−３）：β（１−６）比は、供給源が異なると異なり、例えば、Ｅｉｓｅｎｉａ ｂｉｃｙｃｌｉｓのラミナリンでは３：２と小さいが、Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｄｉｇｉｔｉｔａｔａのラミナリンでは７：１と大きい［６］。プスツランは、Ｕｍｂｉｌｉｃａｒｉａ ｐａｐｕｌｌｏｓａ由来の非真菌線状β−１，６−結合グルカンである。スクレログルカン（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）およびスキゾフィランなどの他のグルカンは、３：１のβ（１−３）：β（１−６）比を有する。（参考文献７の表２参照）。他の天然の混合型β−グルカンとしては、レンチナンおよびソニフィランが挙げられる。

本発明によれば、β−１，３結合を排他的に、または主として有するグルカンが、免疫原として使用される。本発明者らは、このようなグルカンは、他の結合を含むグルカン、特に、β−１，３結合を含み、β−１，６結合の割合が大きいグルカンよりも免疫原性が高い場合があり得ることを見出した。本発明のグルカンは、β−１，３−結合グルコース残基を含むものである。任意選択で、本グルカンはβ−１，６−結合グルコース残基含んでいてもよい、ただし、β−１，６−結合残基に対するβ−１，３−結合残基の比が少なくとも８：１である、および／またはβ−１，３結合のみによって他の残基に連結された少なくとも５つの隣接する非末端残基の配列が１つ以上存在するものとする。本発明者らは、β−１，３結合のみによって他の残基に連結された５つの隣接する非末端残基の存在により、例えば、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに対する防御的抗体応答がもたらされ得ることを見出した。グルカンは、通常、結合体化された形態で使用される。

したがって、本発明は、医薬における使用のためのグルカンを提供し、これは（ｉ）排他的にβ−１，３−結合グルコース残基を有するか、または（ｉｉ）β−１，３−結合グルコース残基およびβ−１，６−結合グルコース残基の両方を含むかのいずれかである、ただし、β−１，６−結合残基に対するβ−１，３−結合残基の比が少なくとも８：１である、および／またはβ−１，３結合のみによって他の残基に連結された少なくとも５つの隣接する非末端残基の配列が１つ以上存在する。したがって、特定の実施形態では、本発明は、医薬における使用のためのグルカンを提供し、これは、（ｉ）排他的にβ−１，３−結合グルコース残基を有するか、または（ｉｉ）β−１，３−結合グルコース残基およびβ−１，６−結合グルコース残基の両方を含むかのいずれかである、ただし、β−１，６−結合残基に対するβ−１，３−結合残基の比が少なくとも８：１である。

また、本発明は、担体分子に連結されたグルカンを含む結合体を提供し、このグルカンは、（ｉ）排他的にβ−１，３−結合グルコース残基を有するか、または（ｉｉ）β−１，３−結合グルコース残基およびβ−１，６−結合グルコース残基の両方を含むかのいずれかである、ただし、β−１，６−結合残基に対するβ−１，３−結合残基の比が少なくとも８：１である、および／またはβ−１，３結合のみによって他の残基に連結された少なくとも５つの隣接する非末端残基の配列が１つ以上存在する。したがって、特定の実施形態では、本発明は、担体分子に連結されたグルカンを含む結合体を提供し、このグルカンは、（ｉ）排他的にβ−１，３−結合グルコース残基を有するか、または（ｉｉ）β−１，３−結合グルコース残基およびβ−１，６−結合グルコース残基の両方を含むかのいずれかである、ただし、β−１，６−結合残基に対するβ−１，３−結合残基の比が少なくとも８：１である。

好ましいグルカンは、排他的に１，３結合を有する線状β−Ｄ−グルコピラノースである。

グルカン
本発明では、Ｄ−グルコース残基間にβ−１，３結合を排他的に、または主として有するグルカンが使用される。グルカンは、好ましくは線状である。

したがって、グルカンは、β−１，３−結合グルコース残基のみで構成されたものであってもよい。とはいえ、任意選択で、グルカンは、β−１，３−結合グルコース残基ではない単糖残基を含むものであってもよい（例えば、β−１，６−結合グルコース残基を含むものであってもよい）が、このような他の残基に対するβ−１，３−結合グルコース残基の比は、少なくとも８：１（例えば、≧９：１、≧１０：１、≧１１：１、≧１２：１、≧１３：１、≧１４：１、≧１５：１、≧１６：１、≧１７：１、≧１８：１、≧１９：１、≧２０：１、≧２５：１、≧３０：１、≧３５：１、≧４０：１、≧４５：１、≧５０：１、≧７５：１、≧１００：１など）である、および／またはβ−１，３結合のみによって他の残基に連結された少なくとも５つ（例えば、≧５、≧６、≧７、≧８、≧９、≧１０、≧１１、≧１２、≧１３、≧１４、≧１５、≧１６、≧１７、≧１８、≧１９、≧２０、≧３０、≧４０、≧５０、≧６０など）の隣接する非末端残基の配列が１つ以上（例えば、≧１、≧２、≧３、≧４、≧５、≧６、≧７、≧８、≧９、≧１０、≧１１、≧１２など）存在するものとする。「非末端」により、該残基が、グルカンの遊離端に存在しているものではないことを意図する。一部の実施形態において、隣接する非末端残基は、担体分子、リンカーまたは他のスペーサー（後述）にカップリングされた残基を全く含まないものであってもよい。

対照的に、Ｌ．ｄｉｇｉｔａｔａ由来のラミナリンのβ−１，６結合グルコースに対するβ−１，３−結合グルコースの比は、反復構造が以下のとおりであるため７：１である：

特定の比率および／または配列を有する混合型β−１，３／β−１，６グルカンは、天然に見られるものであってもよく、人工的に作製したものであってもよい。例えば、該グルカンは、全部または一部が化学合成によって作製されたものであり得る。β−１，３／β−１，６グルカンの化学合成のための方法は、参考文献８〜１８により当該技術分野でよく知られている。また、特定の比率および任意選択の配列を有する混合型β−１，３／β−１，６グルカンも、上記のＬ．ｄｉｇｉｔａｔａ ラミナリン（７：１の比を有する）から出発して、β−１，６−グルカナーゼ（グルカンエンド−１，６−β−グルコシダーゼ、１，６−β−Ｄ−グルカングルカノヒドロラーゼなどとしても知られている；ＥＣ ３．２．１．７５）で、所望の比率および／または配列に達するまで処理することにより作製され得る。

β−１，３−結合グルコースのみを含むグルカンが所望される場合、β−１，６−グルカナーゼが純粋なβ−１，３−グルカンを最終的に生成するように、このプロセスを最後まで遂行してもよい。しかしながら、より簡便には、純粋なβ−１，３−グルカンを使用するのがよい。これは、例えば、（１→３）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ（そのいくつかは既知であり、多くの生物体（例えば、細菌、酵母、植物および真菌）に由来のものである）を使用し、化学的および／または酵素的合成による合成によって作製され得る。β−１，３グルカンの化学合成のための方法は、例えば参考文献１９〜２２により当該技術分野でよく知られている。合成の有用な代替的方法として、天然のβ−１，３−グルカン、例えば、カードラン（以前はＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ｖａｒ．ｍｙｘｏｇｅｎｅｓとして知られていたアグロバクテリウム属由来の線状β−１，３−グルカン；例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから市販（カタログＣ７８２１））またはパラミロン（ユーグレナ属由来のβ−１，３−グルカン）などが使用され得る。高レベルのβ−１，３−グルカンをもたらす生物体は当該技術分野で知られており、例えば、参考文献２３および２４のアグロバクテリウム属、または参考文献２５のＥｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓである。

本発明での使用のためのβ−１，３−結合グルカンの好ましい供給源は、カードランである。カードランは、典型的には、少なくとも１００ｋＤａの分子量および少なくとも約４５０単位のＤＰ（重合度）で入手される。カードランは、グルコース６分子で１らせんの平行で同相の右巻き三重らせんを形成しており、これにより水に不溶性である。したがって、天然形態では、カードランは、免疫処置にあまり適していない。したがって、本発明では、カードラン水解物を使用してもよい。カードランの酸加水分解により、主鎖が分解されて平均分子量が減少され得、その結果、可溶性となり、化学的および物理的操作を受けやすくなる。理想的には、本発明では、以下に示す範囲の平均分子量を有するカードラン水解物が使用される。加水分解を使用するのではなく、酵素による消化を使用してもよい（例えば、β−１，３−グルカナーゼなどのグルカナーゼにより）。消化は、カードランが以下に示す範囲の平均分子量を有するまで進行させてもよい。

天然カードランは非常に高い分子量を有するが、本発明で使用されるグルカンは、水性媒体中での可溶性を改善するために低分子量を有するもの、特に、６０個以下の単糖単位（例えば、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０ ３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４個）を含むものである。２〜６０の範囲の数のグルコース単糖、例えば、１０〜５０個または２０〜４０個のグルコース単位を有するグルカンが使用され得る。２５〜３０個のグルコース単糖単位を有するグルカンが特に有用である。１１〜１９個、例えば１３〜１７個、特に１５個のグルコース単糖単位を有するグルカンも有用である。したがって、下記の構造：

（式中、ｎ＋２は、２〜６０、例えば１０〜５０または２０〜４０の範囲である。好ましくは、ｎ＋２は、２５〜３０または１１〜１９、例えば１３〜１７の範囲である。本発明者らは、ｎ＋２＝１５が好適であることを見い出した）
を有するグルカンが、本発明における使用に具体的に想定される。

排他的にまたは主にβ−１，３−結合を有するグルカン（上記に規定）は、好ましくは単一の分子種である。この実施形態において、グルカン分子はすべて、配列に関して同一である。したがって、グルカン分子はすべて、その構造的特性（例えば、分子量など）に関して同一である。典型的には、この形態のグルカンは、例えば、上記の方法を用いて化学合成によって得られる。例えば、参考文献２０には、単一のβ−１，３結合種の合成が記載されている。あるいはまた、他の実施形態では、グルカンは、天然グルカンから、例えば、上記のようなＬ．ｄｉｇｉｔａｔａ、アグロバクテリウム属またはユーグレナ属由来のグルカンから、必要とされる単一の分子種が得られるまでグルカンを精製して得られるものであり得る。このようにして精製された天然グルカンは市販されている。単一の分子種であるグルカンは、グルカン試料の多分散性（Ｍｗ／Ｍｎ）を測定することにより確認され得る。このパラメーターは、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳによって、例えば参考文献２６に記載のようにして簡便に測定され得る。本発明のこの実施形態における使用に好適なグルカンは、約１の（例えば、１．０１またはそれより小さい）多分散性を有するものである。本発明者らは、特にアジュバントをさらに含む組成物中で使用される場合に、単一の分子種であるグルカンが、より多分散の（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｅ）グルカンよりも免疫原性であり得ることを見出した。

カードランの溶解度は、イオン性基を導入することにより増大させることができる（例えば硫酸化によって、特にカードランのＯ−６に）。かかる修飾を本発明で使用してもよいが、分子の抗原性が改変されることがあり得るので、理想的には回避する。

β−１，３結合を排他的に、または主として有するグルカン（上記に規定）を含むことに加え、本発明の組成物は、第２のグルカンを含んでいてもよく、該第２のグルカンは、β−１，６−結合グルコース残基に対するβ−１，３−結合グルコース残基の比が７：１以下のものであり得る。例えば、組成物は、ラミナリングルカンおよびカードラングルカンの両方を含むものであり得る。

結合体
純粋なβ−グルカンは免疫原として不充分である。したがって、防御的有効性のため、β−グルカンは、グルカン−担体結合体として免疫系に提示され得る。炭水化物抗原の免疫原性を高めるための担体タンパク質との結合体化の使用は、よく知られており［例えば、参考文献２７〜３５などに概説］、特に、小児科用ワクチンに使用される［３６］。

本発明は、（ｉ）上記規定のグルカンと（ｉｉ）担体分子との結合体を提供する。

担体分子はグルカンに、直接またはリンカーを介して共有結合により結合体化され得る。任意の適当な結合体化反応が使用され得、所望される場合に任意の適当なリンカーが使用され得る。

担体に対するグルカン抗原の結合は、好ましくは、例えば、担体タンパク質のリジン残基の側鎖内、またはアルギニン残基の側鎖内の−ＮＨ_２基によるものである。グルカンが遊離アルデヒド基を有する場合、これは該担体内のアミンと反応し、還元的アミノ化によって結合体が形成され得る。また、担体に対する結合は、例えば、システイン残基の側鎖内の−ＳＨ基によるものであってもよい。あるいはまた、グルカン抗原は担体に、リンカー分子を介して結合され得る。

グルカンは、典型的には、結合体化前に活性化または官能性付与させる。活性化は、例えば、シアニル化試薬（ＣＤＡＰ（例えば、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート［３７，３８など］）など）を伴うものであり得る。他の適当な手法は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ−ニトロ安息香酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ−ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵ（参考文献３３の序論も参照のこと）を使用するものである。

タンパク質との直接結合は、例えば、参考文献３９および４０に記載のような、グルカンの酸化、続いてタンパク質の還元的アミノ化を含み得る。

リンカー基を介した結合は、任意の既知の手順（例えば、参考文献４１および４２に記載の手順）を用いて行なわれ得る。典型的には、リンカーは、グルカンのアノマー炭素を介して結合される。好ましい型の結合はアジピン酸リンカーであり、これは、遊離−ＮＨ_２基（例えば、アミノ化によってグルカンに導入）にアジピン酸をカップリングさせ（例えば、ジイミド活性化を使用）、次いで、得られた糖−アジピン酸中間体にタンパク質をカップリングさせることにより形成され得る［３５，４３，４４］。同様に好ましい型の結合はグルタル酸リンカーであり、これは、遊離−ＮＨ_２基にグルタル酸を同様にしてカップリングさせることにより形成され得る。また、アジピン酸（Ａｄｉｐｉｄ）およびグルタル酸リンカーは、グルカンとの直接カップリングによって、すなわち、事前に遊離基（例えば、遊離−ＮＨ_２基）をグルカンに導入せずに、続けて、得られた糖−アジピン酸／グルタル酸中間体にタンパク質をカップリングさせることによっても形成され得る。別の好ましい型の結合はカルボニルリンカーであり、これは、修飾グルカンの遊離ヒドロキシル基とＣＤＩとの反応［４５，４６］後、タンパク質との反応によってカルバメート結合を形成することによっても形成され得る。他のリンカーとしては、β−プロピオンアミド［４７］、ニトロフェニルエチルアミン［４８］、ハロゲン化ハロアシル［４９］、グリコシド結合［５０］、６−アミノカプロン酸［５１］、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ＳＰＤＰ）［５２］、アジピン酸ジヒドラジド ＡＤＨ［５３］、Ｃ_４〜Ｃ_１２部分［５４］などが挙げられる。また、カルボジイミド縮合を使用することもできる［５５］。

二官能性リンカーを使用し、グルカン内のアミン基（例えば、アミノ化によってグルカンに導入）にカップリングさせるための第１の基と、担体にカップリングさせる（典型的には、担体内のアミンにカップリングさせる）ための第２の基を提供してもよい。あるいはまた、第１の基は、グルカンに直接（すなわち、事前に基（例えば、アミン基）をグルカンに導入せずに）カップリングできるものである。

一部の実施形態において、二官能性リンカー内の第１の基は、このように、グルカン上のアミン基（−ＮＨ_２）と反応できるものである。この反応は、典型的にはアミン水素の求電子性置換を伴う。他の実施形態において、二官能性リンカー内の第１の基は、グルカンと直接反応できるものである。どちらの組の実施形態も、二官能性リンカー内の第２の基は、典型的には、担体上のアミン基と反応できるものである。この場合も、この反応は、典型的にはアミンの求電子性置換を伴う。

グルカンと担体の反応がともにアミンを伴う場合、二官能性リンカーを使用することが好ましい。例えば、式Ｘ−Ｌ−Ｘであって、式中、２つのＸ基は、互いに同じであり、アミンと反応することができ、Ｌは、リンカー内の連結部分であるホモ二官能性リンカーが使用され得る。同様に、式Ｘ−Ｌ−Ｘであって、式中、２つのＸ基は異なっており、アミンと反応することができ、Ｌは、リンカー内の連結部分であるヘテロ二官能性リンカーが使用され得る。好ましいＸ基はＮ−オキシスクシンイミドである。Ｌは、好ましくは、式Ｌ’−Ｌ^２−Ｌ’（式中Ｌ’はカルボニルである）を有するものである。好ましいＬ^２基は、１〜１０個の炭素原子（例えば、Ｃ_１、Ｃ_２、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６、Ｃ_７、Ｃ_８、Ｃ_９、Ｃ_１０）を有する直鎖アルキル、例えば、−（ＣＨ_２）_４−または−（ＣＨ_２）_３である。

同様に、グルカンとの反応が直接カップリングを伴い、担体との反応がアミンを伴う場合も、二官能性リンカーを使用することが好ましい。例えば、式Ｘ−Ｌ−Ｘであって、式中、２つのＸ基は、互いに同じであり、グルカン／アミンと反応することができ、Ｌは、リンカー内の連結部分であるホモ二官能性リンカーが使用され得る。同様に、式Ｘ−Ｌ−Ｘであって、式中、２つのＸ基は異なっており、一方はグルカンと反応でき、他方はアミンとでき、Ｌは、リンカー内の連結部分であるヘテロ二官能性リンカーが使用され得る。好ましいＸ基はＮ−オキシスクシンイミドである。Ｌは、好ましくは、式Ｌ’−Ｌ^２−Ｌ’（式中Ｌ’はカルボニルである）を有するものである。好ましいＬ^２基は、１〜１０個の炭素原子（例えば、Ｃ_１、Ｃ_２、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６、Ｃ_７、Ｃ_８、Ｃ_９、Ｃ_１０）を有する直鎖アルキル、例えば、−（ＣＨ_２）_４−または−（ＣＨ_２）_３−である。

先の２つの段落で記載した二官能性リンカーにおける使用のための他のＸ基は、ＨＯ−Ｌ−ＯＨと結合させるとエステルを形成するもの、例えば、ノルボラン、ｐ−ニトロ安息香酸、およびスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドである。

本発明での使用のためのさらなる二官能性リンカーとしては、アクリロイルハロゲン化物（例えば、塩化物）およびハロアシルハライドが挙げられる。

リンカーは、一般的に、グルカンとのカップリング中に、グルカンに対してモル過剰で添加する。

好ましい担体タンパク質は、細菌毒素（ジフテリアあるいは破傷風毒素など）もしくはトキソイドまたはその変異体である。これらは、結合体ワクチンに一般的に使用されている。ＣＲＭ_１９７ジフテリア毒素変異体が特に好ましい［５６］。

他の適当な担体タンパク質としては、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質複合体［５７］、合成ペプチド［５８，５９］、熱ショックタンパク質［６０，６１］、百日咳タンパク質［６２，６３］、サイトカイン［６４］、リンホカイン［６４］、ホルモン［６４］、増殖因子［６４］、種々の病原体由来の抗原由来の多数のヒトＣＤ４^＋ Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質［６５］（Ｎ１９［６６］など）、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のプロテインＤ［６７〜６９］、ニューモリシン［７０］またはその非毒性誘導体［７１］、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ［７２］、鉄分取込みタンパク質［７３］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素ＡまたはＢ［７４］、組換え緑膿菌エキソプロテインＡ（ｒＥＰＡ）［７５］などが挙げられる。担体タンパク質の混合物を使用することも可能である。単一の担体タンパク質が多数の異なるグルカンを担持していてもよい［７６］。

結合体は、過剰の担体（ｗ／ｗ）または過剰のグルカン（ｗ／ｗ）を有するもの、例えば、１：５〜５：１の比で有し得る。過剰の担体タンパク質を有する結合体が典型的であり、例えば、０．２：１〜０．９：１の範囲であるか、または等重量である。結合体には、少量の遊離（すなわち、結合体化されていない）担体が含まれていてもよい。所与の担体タンパク質が本発明の組成物中に、遊離形態と結合体化形態の両方で存在する場合、結合体化されていない形態は、好ましくは、組成物全体の担体タンパク質の総量の５％以下であり、より好ましくは２％未満（重量基準）で存在する。

結合体が本発明の免疫原性組成物のグルカン成分を構成する場合、該組成物に、免疫原として遊離担体タンパク質も含まれることがあり得る［７７］。

結合体化後、遊離グルカンと結合体化グルカンを分離してもよい。多くの適当な方法があり、例えば、疎水性クロマトグラフィー、タンジェンシャル限外濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、ダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）などがある［参考文献７８，７９などもまた参照のこと］。タンジェンシャルフロー限外濾過が好ましい。

結合体内のグルカン部分は、好ましくは、上記規定の低分子量グルカンまたはオリゴ糖である。オリゴ糖は、典型的には、結合体化前にサイズ調整する。

タンパク質−グルカン結合体は、好ましくは、水および／または生理学的緩衝液に可溶性である。

本発明者らは、グルカンと担体タンパク質間にスペーサーが存在させると、免疫原性が改善され得ることを見い出した。これに関連して、「スペーサー」は、単一の共有結合よりも長い部分である。このスペーサーは、上記のようなリンカーであってもよい。あるいはまた、これは、グルカンとリンカーの間に共有結合された部分であってもよい。典型的には、該部分はグルカンに、リンカーまたは担体とのカップリング前に共有結合させる。例えば、スペーサーは、１〜１０個の炭素原子（例えば、Ｃ_１、Ｃ_２、Ｃ３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６、Ｃ_７、Ｃ_８、Ｃ_９、Ｃ_１０）、典型的には１〜６個の炭素原子（例えば、Ｃ_１、Ｃ_２、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６）を有する直鎖アルキルを含むＹ部分である。本発明者らは、６個の炭素原子を有する直鎖アルキル（すなわち、−（ＣＨ_２）_６）が特に好適であり、短鎖（例えば、−（ＣＨ_２）_２）のものよりも大きな免疫原性がもたらされ得ることを見い出した。典型的には、Ｙはグルカンのアノマー炭素に、通常、−Ｏ-結合を介して結合される。しかしながら、Ｙは、グルカンの他の部分に連結されていてもよい、および／または他の結合を介して連結されていてもよい。Ｙの他端は、任意の適当な結合によってリンカーに結合させる。典型的には、Ｙは、上記のような二官能性リンカーに対する結合が容易になるようにアミン基で終結させたものである。したがって、このような実施形態では、Ｙはリンカーに−ＮＨ−結合によって結合される。したがって、下記の構造：

（式中、ｎ＋２は、２〜６０、例えば１０〜５０または２０〜４０の範囲である。好ましくは、ｎ＋２は、２５〜３０または１１〜１９、例えば１３〜１７の範囲である。本発明者らは、ｎ＋２＝１５が好適であることを見い出した。Ｙは、上記のとおりである。「ＬＩＮＫＥＲ」は、上記のような任意選択のリンカーであり、「ＣＡＲＲＩＥＲ」は、上記のような担体分子である）
を有する結合体が、本発明における使用に具体的に想定される。

医薬組成物
本発明は、（ａ）本発明のグルカンまたは結合体、（ｂ）薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物を提供する。かかる担体の充分な論考は、参考文献８０において入手可能である。

微生物感染症は、身体の種々の領域を侵すため、本発明の組成物は種々の形態で調製され得る。例えば、該組成物は注射用剤として、液状の液剤または懸濁剤のいずれかとして調製され得る。また、液状ビヒクル中の液剤または懸濁剤に適した注射前の固形形態を調製してもよい。該組成物は、局所投与のためには、例えば、軟膏、クリーム剤または粉末剤として調製され得る。該組成物は、経口投与のためには、例えば、錠剤もしくはカプセル剤として、またはシロップ剤（任意選択でフレーバーを添加）として調製され得る。該組成物は、肺内投与のためには、例えば、微粉末またはスプレーを使用し、吸入剤として調製され得る。該組成物は、坐剤または膣坐薬として調製され得る。該組成物は、経鼻、経耳または経眼投与のためには、例えば、滴剤、スプレー剤または粉末剤として調製され得る［例えば、８１］。上記組成物は、うがい薬に含められ得る。上記組成物は、凍結乾燥され得る。

医薬組成物は、好ましくは滅菌されたものである。好ましくは発熱物質を含まない。該組成物は、好ましくは、例えばｐＨ６〜ｐＨ８、一般的にはｐＨ７前後に緩衝化したものである。

また、本発明は、本発明の医薬組成物を内包する送達デバイスを提供する。デバイスは、例えば、シリンジまたは吸入器であり得る。

本発明の医薬組成物は、好ましくは、免疫学的有効量のグルカン免疫原を含む免疫原性組成物である。「免疫学的有効量」により、単回用量または一連のものの一部としての個体への該量の投与が、処置または予防に有効であることを意図する。この量は、処置対象の個体の健康状態および体調、処置対象の個体（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）の年齢、分類群、個体の免疫機構が抗体を合成する能力、所望される防御の程度、ワクチンの配合、病状に対する処置担当医師の評価、ならびに他の関連要素に応じて異なる。この量は、常套的な治験によって決定され得る比較的広い範囲を含むことが予測される。投薬処置は、単回用量スケジュールまたは複数用量スケジュール（例えば、ブースター投与量を含む）であり得る。上記組成物は、他の免疫調節剤（ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔ）と組み合わせて投与され得る。

製剤化したら、本発明の組成物を被験体に直接投与してもよい。処置対象の被験体は動物であり得る；特に、ヒト被験体が処置され得る。

本発明の免疫原性組成物は、治療的（すなわち、既に存在する感染を処置するため）または予防的（すなわち、将来的な感染を予防するため）に使用され得る。治療的免疫処置は、免疫無防備状態の被験体におけるカンジダ感染の処置に特に有用である。

β−グルカンそれ自体がアジュバントであると報告されているが、免疫原性組成物は、この組成物を受ける患者において誘起される免疫応答（体液性および／または細胞性）を増強する機能を果たし得るさらなるアジュバントを含んでいてもよい。本発明で使用され得るアジュバントとしては、限定されないが、以下のものが挙げられる。

・無機質含有組成物、例えば、カルシウム塩およびアルミニウム塩（またはその混合物）。カルシウム塩としては、リン酸カルシウム（例えば、参考文献８２に開示された「ＣＡＰ」粒子）が挙げられる。アルミニウム塩としては、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩などが挙げられ、該塩には、任意の適当な形態（例えば、ゲル、結晶性、非晶質など）が採用される。このような塩への吸着が好ましい。また、無機質含有組成物は、金属塩の粒子として製剤化され得る［８３］。水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムとして知られるアジュバントが使用され得る。これらの名称は慣用的であるが、便宜上のためだけに使用され、存在している実際の化合物の正確な記述でもない（例えば、参考文献１６６の第９章参照）。本発明では、アジュバントとして一般に使用されている任意の「水酸化物」または「リン酸塩」アジュバントが使用され得る。「水酸化アルミニウム」として知られているアジュバントは、典型的にはアルミニウムのオキシ水酸化物塩であり、これは、通常、少なくとも部分的に結晶性である。「リン酸アルミニウム」として知られているアジュバントは、典型的にはヒドロキシリン酸アルミニウムであり、多くの場合、少量の硫酸塩も含まれている（すなわち、ヒドロキシリン酸アルミニウム硫酸塩）。このアジュバントは、沈降によって得られ得、沈降時の反応条件および濃度は、該塩中のヒドロキシルのリン酸塩の置換の程度に影響を及ぼす。本発明では、水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムの混合物を使用してもよい。この場合、水酸化アルミニウムよりもリン酸アルミニウムを多く、例えば、少なくとも２：１、例えば≧５：１、≧６：１、≧７：１、≧８：１、≧９：１などの重量比で存在させるのがよい。患者に投与するための組成物中のＡｌ^＋＋＋の濃度は、好ましくは、１０ｍｇ／ｍｌ未満、例えば、≦５ｍｇ／ｍｌ、≦４ｍｇ／ｍｌ、≦３ｍｇ／ｍｌ、≦２ｍｇ／ｍｌ、≦１ｍｇ／ｍｌなどである。好ましい範囲は、０．３〜１ｍｇ／ｍｌである。最大０．８５ｍｇ／用量が好ましい。

・サポニン［参考文献１６６の第２２章］、これは、広範な植物種の樹皮、葉、茎、根、さらには花にも見られるステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種群である。Ｑｕｉｌｌａｉａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ樹木の樹皮由来のサポニンは、アジュバントとして広く研究されている。また、サポニンは、Ｓｍｉｌａｘ ｏｒｎａｔａ（ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ）、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ｂｒｉｄｅｓ ｖｅｉｌ）、およびＳａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（ｓｏａｐ ｒｏｏｔ）から商業的に入手することもできる。サポニンアジュバント製剤としては、ＱＳ２１などの精製製剤、ならびにＩＳＣＯＭなどの脂質製剤が挙げられる。ＱＳ２１は、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ^ＴＭとして市販されている。サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製されている。このような手法が使用された具体的な精製画分が同定されており、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃが挙げられる。好ましくは、サポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１の作製方法は、参考文献８４に開示されている。サポニン製剤には、ステロール（コレステロールなど）が含まれることがあり得る［８５］。サポニンとコレステロールの組合せは、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と称される特殊な粒子を形成するために使用され得る［参考文献１６６の第２３章］。また、ＩＳＣＯＭは、典型的にはリン脂質、例えば、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンなどを含むものである。任意の既知のサポニンがＩＳＣＯＭに使用され得る。好ましくは、ＩＳＣＯＭは、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡおよびＱＨＣの１種類以上を含むものである。ＩＳＣＯＭは、参考文献８５〜８７にさらに説明されている。任意選択で、ＩＳＣＯＭＳは、さらなる洗剤を含まないものであり得る［８８］。サポニン系アジュバントの開発の概説は、参考文献８９と９０を見るとよい。

・細菌ＡＤＰ−リボシル化毒素（例えば、大腸菌熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ」、コレラ毒素「ＣＴ」、または百日咳毒素「ＰＴ」）およびその無毒化誘導体、例えば、ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２［９１］として知られている変異体毒素など。粘膜アジュバントとしての無毒化ＡＤＰ−リボシル化毒素の使用は、参考文献９２に記載されており、非経口アジュバントとしての使用は、参考文献９３に記載されている。

・生体接着剤および粘膜接着剤、例えば、エステル化ヒアルロン酸ミクロスフェア［９４］またはキトサンおよびその誘導体［９５］など。

・生分解性で非毒性である物質（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）で形成されたミクロ粒子（すなわち、約１００ｎｍ〜約１５０μｍの直径、より好ましくは約２００ｎｍ〜約３０μｍの直径、または約５００ｎｍ〜約１０μｍの直径の粒子）。ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）が好ましく、任意選択で処理して、負の電荷を有する表面（例えば、ＳＤＳで）または正の電荷を有する表面（例えば、ＣＴＡＢなどのカチオン性洗剤）を有するようにしたもの。

・リポソーム（参考文献１６６の第１３章および１４章）。アジュバントとしての使用に適したリポソーム製剤の例は、参考文献９６−９８に記載されている。

・ムラミルペプチド、例えば、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（「ｔｈｒ−ＭＤＰ」）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−イソｇｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド（「ＤＴＰ−ＤＰＰ」、または「Ｔｈｅｒａｍｉｄｅ^ＴＭ」）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（「ＭＴＰ−ＰＥ」）など。

・ポリオキシドニウムポリマー［９９，１００］または他のＮ−酸化型ポリエチレン−ピペラジン誘導体。

・メチルイノシン５’−モノリン酸塩（「ＭＩＭＰ」）［１０１］。

・ポリヒドロキシル化ピロリジジン化合物［１０２］、例えば、式：

（式中、Ｒは、水素、直鎖または分枝状の非置換または置換飽和または不飽和のアシル、アルキル（例えば、シクロアルキル）、アルケニル、アルキニルおよびアリール基を含む群から選択される）
を有するもの、またはその薬学的に許容され得る塩もしくは誘導体。例としては、限定されないが、カスアリン、カスアリン−６−α−Ｄ−グルコピラノース、３−エピ−カスアリン、７−エピ−カスアリン、３，７−ジエピ−カスアリンなどが挙げられる。

・ＣＤｌｄリガンド、例えば、α−グリコシルセラミド［１０３〜１１０］（例えば、α−ガラクトシルセラミド）、フィトスフィンゴシン含有α−グリコシルセラミド、ＯＣＨ、ＫＲＮ７０００［（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−（Ｎ−ヘキサコサノイルアミノ）−１，３，４−オクタデカントリオール］、ＣＲＯＮＹ−１０１、３”−Ｏ−スルホ−ガラクトシルセラミドなど。

・γイヌリン［１１１］またはその誘導体、例えば、アルガムリンなど。

・水中油型乳剤。種々のかかる乳剤が知られており、典型的には、少なくとも１種類の油と、少なくとも１種類の界面活性剤を含むものであり、油類（１種類または複数種）および界面活性剤（１種類または複数種）は生分解性（代謝性）および生体適合性である。乳剤中の油滴は、一般的には５μｍ未満の直径であるが、さらにはサブミクロン直径を有するものであってもよい。このような小サイズは、マイクロフルイダイザーにより得られ、安定な乳剤が得られる。濾過滅菌に供することができるため、２２０ｎｍ未満のサイズを有する液滴が好ましい。

・免疫刺激性オリゴヌクレオチド、例えば、ＣｐＧモチーフ（リン酸結合によってグアノシン残基に連結された非メチル化シトシン残基を含むジヌクレオチド配列）、またはＣｐＩモチーフ（イノシンに連結されたシトシンを含むジヌクレオチド配列）、または二本鎖ＲＮＡ、またはパリンドローム配列を含むオリゴヌクレオチド、またはポリ（ｄＧ）配列を含むオリゴヌクレオチドを含むものなど。免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド修飾／類似体（ホスホロチオエート修飾）を含むものであってもよく、二本鎖（ＲＮＡを除く）であっても、単鎖であってもよい。参考文献１１２、１１３および１１４には、可能な類似体置換（例えば、２’−デオキシ−７−デアザグアノシンでのグアノシンの置換）が開示されている。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、参考文献１１５〜１２０にさらに論考されている。ＣｐＧ配列はＴＬＲ９に対するものである（モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴなど）［１２１］。ＣｐＧ配列は、Ｔｈ１免疫応答の誘発に特異的であり得（ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮ（オリゴデオキシヌクレオチド）、あるいは、Ｂ細胞応答の誘発に対してより特異的であり得る（ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮなど）。ＣｐＧ−ＡおよびＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮは、参考文献１２２〜１２４に論考されている。好ましくは、ＣｐＧはＣｐＧ−Ａ ＯＤＮである。好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端が受容体の認識に利用可能となるように構築される。任意選択で、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列をその３’末端で結合させ「イムノマー」を形成してもよい。例えば、参考文献１２１および１２５〜１２７を参照のこと。有用なＣｐＧアジュバントはＣｐＧ７９０９であり、ＰｒｏＭｕｎｅ^ＴＭ（Ｃｏｌｅｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）としても知られている。他には、ＣｐＧ １８２６がある。ＣｐＧ配列の使用の代替法として、あるいはさらに、ＴｐＧ配列が使用され得［１２８］、このオリゴヌクレオチドには、非メチル化ＣｐＧモチーフが含まれていないものであり得る。免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ピリミジンリッチであり得る。例えば、これは、１つより多くの連続チミジンヌクレオチドを含み得る（例えば、参考文献１２８に開示されたＴＴＴＴ）、および／または＞２５％のチミジン（例えば、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）のヌクレオチド組成を有し得る。例えば、１つより多くの連続シトシンヌクレオチドを含み得る（例えば、参考文献１２８に開示されたＣＣＣＣ）、および／または＞２５％のシトシン（例えば、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）のヌクレオチド組成を有し得る。このようなオリゴヌクレオチドは、非メチル化ＣｐＧモチーフが含まれていないものであり得る。免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、典型的には少なくとも２０個のヌクレオチドを含む。これは、１００個より少ないヌクレオチドを含むものであるのがよい。

特に有用な免疫刺激性オリゴヌクレオチド系アジュバントは、ＩＣ３１^ＴＭ［１２９］として知られているものである。したがって、本発明で使用されるアジュバントは、（ｉ）少なくとも１つ（好ましくは多数の）ＣｐＩモチーフを含むオリゴヌクレオチド（例えば、１５〜４０ヌクレオチド）と、（ｉｉ）少なくとも１つ（好ましくは多数の）Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓトリペプチド配列を含むポリカチオンポリマー、例えばオリゴペプチド（例えば、５〜２０アミノ酸）の混合物を含み得る。オリゴヌクレオチドは、２６ｍｅｒ配列５’−（ＩＣ）_１３−３’（配列番号１）を含むデオキシヌクレオチドであり得る。ポリカチオンポリマーは、１１ｍｅｒアミノ酸配列ＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ（配列番号２）を含むペプチドであり得る。

・３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（「３ｄＭＰＬ」、「ＭＰＬ^ＴＭ」としても知られている）［１３０〜１３３］。水性条件では、３ｄＭＰＬは、異なるサイズ（例えば、＜１５０ｎｍまたは＞５００ｎｍの直径）を有するミセル状の凝集物または粒子を形成し得る。これらのいずれかまたは両方が本発明で使用され得、常套的なアッセイによって、良い方の粒子が選択され得る。より小さい粒子（例えば、３ｄＭＰＬの透明な水性懸濁液が得られるのに充分に小さい）の方が、活性が優れるため、本発明による使用に好ましい［１３４］。好ましい粒子は２２０ｎｍ未満、より好ましくは２００ｎｍ未満または１５０ｎｍ未満または１２０ｎｍ未満の平均直径を有するものであり、さらには、１００ｎｍ未満の平均直径を有するものであってもよい。しかしながら、ほとんどの場合、平均直径は５０ｎｍより小さくない。

・イミダゾキノリン化合物、例えば、イミキモド（「Ｒ−８３７」）［１３５，１３６］、レシキモド（「Ｒ−８４８」）［１４１］など、およびその類似体；ならびにその塩（例えば、塩酸塩）。免疫刺激性イミダゾキノリンに関するさらなる詳細は、参考文献１３８〜１４２を見るとよい。

・チオセミカルバゾン化合物（参考文献１４３に開示されたものなど）。また、活性化合物の製剤化、製造およびスクリーニングのための方法も参考文献１４３に記載されている。チオセミカルバゾンは、ＴＮＦ−αなどのサイトカイン生成のためのヒト末梢血単核球の刺激に特に有効である。

・トリプタントリン化合物（参考文献１４４に開示されたものなど）。また、活性化合物の製剤化、製造およびスクリーニングのための方法も参考文献１４４に記載されている。チオセミカルバゾンは、ＴＮＦ−αなどのサイトカイン生成のためのヒト末梢血単核球の刺激に特に有効である。

・ヌクレオシド類似体、例えば：（ａ）イサトラビン（ＡＮＡ−２４５；７−チア−８−オキソグアノシン）：

およびそのプロドラッグ；（ｂ）ＡＮＡ９７５；（ｃ）ＡＮＡ−０２５−１；（ｄ）ＡＮＡ３８０；（ｅ）参考文献１４５〜１４７に開示された化合物ロキソリビン（７−アリル−８−オキソグアノシン）［１４８］など。

・参考文献１４９に開示された化合物、例えば：アシルピペラジン化合物、インドールジオン化合物、テトラヒドライソキノリン（ＴＨＩＱ）化合物、ベンゾシクロジオン化合物、アミノアザビニル化合物、アミノベンズイミダゾールキノリノン（ＡＢＩＱ）化合物［１５０，１５１］、ヒドラフタルアミド化合物、ベンゾフェノン化合物、イソオキサゾール化合物、ステロール化合物、キナジリノン化合物、ピロール化合物［１５２］、アントラキノン化合物、キノキサリン化合物、トリアジン化合物、ピラザロピリミジン化合物、およびベンズアゾール化合物［１５３］。

・アミノアルキルグルコサミニドリン酸塩誘導体（ＲＣ−５２９［１５４，１５５］など）。

・ホスファゼン（例えば、参考文献１５６および１５７に記載のポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン］（「ＰＣＰＰ」）など）
・置換型尿素あるいは式Ｉ、ＩＩもしくはＩＩＩの化合物、またはその塩：

（参考文献１５８に規定、「ＥＲ８０３０５８」、「ＥＲ８０３７３２」、「ＥＲ８０４０５３」、ＥＲ８０４０５８）、「ＥＲ８０４０５９」、「ＥＲ８０４４４２」、「ＥＲ８０４６８０」、「ＥＲ８０４７６４」、ＥＲ８０３０２２または「ＥＲ８０４０５７」など、例えば：

・ＯＭ−１７４などの大腸菌由来のリピドＡの誘導体（参考文献１５９および１６０に記載）。

・リン酸基含有非環式主鎖に連結された脂質を含む化合物（ＴＬＲ４アンタゴニストＥ５５６４［１６１，１６２］：

など）。

このようなおよび他のアジュバント活性物質は、参考文献１６６および１６７に、より詳細に論考されている。

組成物中の抗原およびアジュバントは、代表的に混合物である。

組成物は、上記アジュバントのうちの２つ以上を含み得る。例えば、それらは、有利に、水中油型乳剤および３ｄＭＰＬなどの両方を含み得る。

本発明で有用な具体的な水中油型乳剤アジュバントとしては、限定されないが、以下のものが挙げられる。

・スクアレン、Ｔｗｅｅｎ８０およびＳｐａｎ８５のサブミクロン乳剤。この乳剤の組成は、容量基準で、約５％のスクアレン、約０．５％のポリソルベート８０および約０．５％のＳｐａｎ８５であり得る。重量の観点からは、これらの比は、４．３％のスクアレン、０．５％のポリソルベート８０および０．４８％のＳｐａｎ８５となる。このアジュバントは、「ＭＦ５９」として知られており［１６３〜１６５］、参考文献１６６の第１０章および参考文献１６７の第１２章に、より詳細に記載されている。ＭＦ５９乳剤は、好都合には、クエン酸イオンを含むもの（例えば、１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液）である。

・スクアレン、トコフェロールおよびＴｗｅｅｎ８０の乳剤。この乳剤は、リン酸緩衝生理食塩水を含み得る。また、これは、Ｓｐａｎ８５（例えば、１％で）および／またはレシチンを含み得る。この乳剤は、２〜１０％のスクアレン、２〜１０％のトコフェロールおよび０．３〜３％のＴｗｅｅｎ８０を有し得、スクアレン：トコフェロールの重量比は、より安定な乳剤が得られるため、好ましくは≦１である。スクアレンおよびＴｗｅｅｎ８０は、約５：２の容量比で存在し得る。かかる乳剤の一例は、Ｔｗｅｅｎ８０をＰＢＳに溶解させて２％溶液を得、次いで、９０ｍｌのこの溶液を（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールと５ｍｌのスクアレン）の混合物と混合し、次いでこの混合物を微小流動化することにより作製され得る。得られる乳剤は、例えば、１００〜２５０ｎｍ、好ましくは約１８０ｎｍの平均直径のサブミクロン油滴を有し得る。

・スクアレン、トコフェロールおよびＴｒｉｔｏｎ洗剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）の乳剤。この乳剤は、３ｄ−ＭＰＬ（下記参照）もまた含み得る。この乳剤は、リン酸緩衝液を含み得る。

・ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ洗剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）およびトコフェロール（例えば、α−トコフェロールスクシネート）を含む乳剤。この乳剤は、これらの３種類の成分を、約７５：１１：１０の質量比で含むもの（例えば、７５０μｇ／ｍｌのポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および１００μｇ／ｍｌのα−トコフェロールスクシネート）を含み得、これらの濃度は、抗原由来のこれらの成分の任意の寄与を含むはずである。また、この乳剤は、スクアレンを含み得る。また、この乳剤は、３ｄ−ＭＰＬ（下記参照）も含み得る。水相には、リン酸緩衝液が含まれ得る。

・スクアラン、ポリソルベート８０およびポロキサマー４０１（「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ^ＴＭＬ１２１」）の乳剤。この乳剤は、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中で製剤化され得る。この乳剤は、ムラミルジペプチドのための有用な送達ビヒクルであり、トレオニル−ＭＤＰとともに「ＳＡＦ−１」アジュバント［１６８］（０．０５〜１％のＴｈｒ−ＭＤＰ、５％のスクアラン、２．５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１および０．２％のポリソルベート８０）に使用されている。また、「ＡＦ」アジュバント［１６９］（５％のスクアラン、１．２５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１および０．２％のポリソルベート８０）の場合のように、Ｔｈｒ−ＭＤＰなしで使用することもできる。微小流動化が好ましい。

・０．５〜５０％の油類、０．１〜１０％のリン脂質、および０．０５〜５％の非イオン系界面活性剤を有する乳剤。参考文献１７０に記載のように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカルジオリピンである。サブミクロン液滴のサイズが好都合である。

・非代謝性の油類（軽鉱油など）と、少なくとも１種類の界面活性剤（レシチン、Ｔｗｅｅｎ８０またはＳｐａｎ８０など）とのサブミクロン水中油型乳剤。ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン脂肪親和性結合体（例えば、ＧＰＩ−０１００（参考文献１７１に記載、グルクロン酸のカルボキシル基を介したデスアシルサポニンへの脂肪族アミンの付加によって作製））、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミドおよび／またはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンなどの添加剤を含めてもよい。

・サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）とステロール（例えば、コレステロール）がらせん状ミセルとして会合している乳剤［１７２］。

医療処置および用途
また、本発明は、医薬における使用のための、例えば、哺乳動物の抗体応答を惹起することにおける使用のための、本発明のグルカンまたは結合体を提供する。

また、本発明は、本発明のグルカン、結合体または医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の免疫応答を惹起するための方法を提供する。

また、本発明は、哺乳動物において微生物感染を予防または処置するための医薬の製造における本発明のグルカンまたは結合体の使用を提供する。

これらの方法および使用によってもたらされる免疫応答としては、一般的に抗体応答、好ましくは防御的抗体応答が挙げられる。糖免疫処置後の抗体応答の評価方法は、当該分野で周知である。抗体応答は、好ましくはＩｇＡまたはＩｇＧ応答である。免疫応答は、予防的および／または治療的であり得る。哺乳動物は、好ましくはヒトである。

グルカン（特に、β−グルカン）は、ほぼすべての病原性真菌（特に、免疫無防備状態の被験体の感染症に関与するもの）、また細菌病原体および原生動物の必須かつ主要な多糖構成成分であるため、抗グルカン免疫は、広範な病原体および疾患に対して有効性を有し得る。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでの免疫処置に生成される抗グルカン血清は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓと交差反応性である。このようなヒト感染性真菌因子には化学療法が不充分であるため、抗真菌薬耐性が生じるため、ならびに予防用および治療用ワクチンの必要性の認識が増大しているため、広域スペクトル免疫は特に有用である。

本発明の使用および方法は、カンジダ属種（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓなど）；クリプトコックス属種（Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓなど）；エンテロコッカス属種（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓなど）；連鎖球菌属種（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅおよびＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓなど）；リーシュマニア属種（Ｌ．ｍａｊｏｒなど）；アカントアメーバ属種（Ａ．ｃａｓｔｅｌｌａｎｉなど）；アスペルギルス属種（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓおよびＡ．ｆｌａｖｕｓなど）；ニューモシスティス属種（Ｐ．ｃａｒｉｎｉｉなど）；ミコバクテリウム属種（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓなど）；シュードモナス属種（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａなど）；ブドウ球菌属種（Ｓ．ａｕｒｅｕｓなど）；サルモネラ属種（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍなど）；コクシジオイデス属種（Ｃ．ｉｍｍｉｔｉｓなど）；白癬菌属種（Ｔ．ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍなど）；ブラストミセス属種（Ｂ．ｄｅｒｍａｔｉｄｉｓなど）；ヒストプラスマ属種（Ｈ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｍなど）；パラコクシジオイデス属種（Ｐ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓなど）；フィチウム属種（Ｐ．ｉｎｓｉｄｉｏｓｕｍなど）；ならびにエシェリキア属種（大腸菌など）の感染症の処置／防御に特に有用である。

該使用および方法は、限定されないが：カンジダ症（例えば、肝脾カンジダ症、浸潤性カンジダ症、慢性粘膜皮膚カンジダ症および播種性カンジダ症）；カンジダ血症；アスペルギルス症、クリプトコックス症、皮膚真菌症、スポロトリクス症および他の皮下真菌症、ブラストミセス症、ヒストプラスマ症、コクシジウム症、パラコクシジオイデス症、ニューモシスティス症、鵞口瘡、結核症、ミコバクテリア症、呼吸器系感染症、猩紅熱、肺炎、膿痂疹、リウマチ熱、セプシス、敗血症、皮膚および内臓リーシュマニア症、角膜アカントアメーバ症、嚢胞性線維症、腸チフス、胃腸炎ならびに溶血性尿毒症症候群などの疾患の予防／処置に特に有用である。抗Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ活性は、ＡＩＤＳ患者の感染症の処置に特に有用である。

治療的処置の有効性は、本発明の組成物の投与後の微生物感染をモニタリングすることにより試験することができる。予防的処置の有効性は、該組成物の投与後のβ−グルカンに対する免疫応答（例えば、抗β−グルカン抗体）をモニタリングすることにより試験することができる。

本発明の組成物は、一般的には患者に直接投与する。直接送達は、非経口注射（例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、もしくは組織の間隙空間に）、または直腸内、経口、膣内、局所、経皮、皮内、経眼、経鼻、耳内もしくは肺内投与によって行なわれ得る。注射または鼻腔内投与が好ましい。

本発明は、全身性および／または粘膜免疫を誘起するために使用され得る。

本発明に従って調製されるワクチンは、小児および成人両方の処置に使用され得る。したがって、被験体は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、または少なくとも５５歳であり得る。ワクチン接種に好ましい被験体は、高齢者（例えば、≧５０歳、≧６０歳、好ましくは≧６５歳）、または若年齢者（例えば、≦５歳）である。ワクチンは、これらの群のみに適しているのではなく、集団において、より一般的に使用され得る。

処置は、単回用量スケジュールであってもよく、複数用量スケジュールであってもよい。複数用量は、初回刺激免疫処置スケジュールおよび／または追加刺激免疫処置スケジュールにおいて使用され得る。複数用量スケジュールでは、種々の用量を同じ経路で与えてもよく、異なる経路で与えてもよく、例えば、非経口で初回免疫刺激し、経粘膜で追加免疫刺激する、経粘膜で初回免疫刺激し、非経口で追加免疫刺激するなどである。免疫未処置患者には１回より多くの投与（典型的には２回の投与）が特に有用である。複数用量は、典型的には少なくとも１週間空けて投与する（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）。

本発明の結合体を非グルカン抗原と併用し、多様な病原体に対する同時免疫処置のための単一の組成物にしてもよい。併用ワクチンの作製の代替法として、結合体を患者に、他のワクチンと実質的に同時（例えば、同じ医療診察中または健康管理従事者もしくはワクチン接種施設への訪問時）に投与してもよい。このような併用ワクチンにおける使用のため、または同時投与のための抗原としては、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、黄色ブドウ球菌および／または緑膿菌免疫原、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、髄膜炎菌（例えば、血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５および／またはＹに対して、糖または結合体化糖）、肺炎連鎖球菌（例えば、糖または結合体化糖）などが挙げられる。

本発明の組成物は、特に患者が既に感染している場合、抗真菌薬とともに使用され得る。抗真菌薬により即時性の治療効果がもたらされ、一方、免疫原性組成物により長期持続性効果がもたらされる。好適な抗真菌薬としては、限定されないが、アゾール（例えば、フルコナゾール、イトラコナゾール）、ポリエン（例えば、アンフォテリシンＢ）、フルシトシン、およびスクアレンエポキシダーゼインヒビター（例えば、テルビナフィン）が挙げられる［参考文献１７３も参照のこと］。抗真菌薬と免疫原性組成物は、別々に投与してもよく、併用して投与してもよい。別々に投与する場合、典型的には互いに７日以内に投与する。免疫原性組成物を最初に投与した後、抗真菌薬を１回より多く投与するのがよい。

定義
用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘ「を含む」組成物は、排他的にＸからなるものであってもよく、何か付加的なものを含むもの（例えば、Ｘ＋Ｙ）であってもよい。

文言「実質的に」は「完全に」を除外せず、例えば、Ｙが「実質的にない」組成物は、Ｙが完全にないものであり得る。必要に応じて、文言「実質的に」は、本発明の定義で省略されていることがあり得る。

数値ｘに関する用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。

特に記載のない限り、２つ以上の成分を混合する工程を含むプロセスは、なんら特定の混合順序を必要としない。したがって、成分は、任意の順序で混合され得る。３つの成分が存在する場合は、２つの成分を互いに合わせ、次いで、この組合せを第３の成分と合わせてもよいなどである。

動物（特にウシ）由来の物質を細胞の培養に使用する場合、感染性海綿状脳症（ＴＳＥ）のない、特にウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）のない供給源から得られたものであるべきである。全般的には、動物由来物質の完全非存在下で細胞を培養することが好ましい。

化合物を身体に組成物の一部として投与する場合、該化合物を、代替的に、適当なプロドラッグに置き換えてもよい。

発明を実施するための形態
カードラン結合体化（１）
＞１００ｋＤａの初期ＭＷを有するカードランを、ＤＭＳＯ中ＨＣｌ（０．５Ｍ）を用いた酸加水分解により、８５℃で１０分間処理した。この加水分解生成物は、２５単位前後のＤＰを有していた。

加水分解された物質をリン酸ナトリウム緩衝液（４００ｍＭ，ｐＨ６．８）で中和し、水で希釈して、出発物質の１０：１希釈液を得た。最終濃度を１ｍｇ／ｍｌとした。希釈後、一部沈降が検出され得た。この沈殿物は、おそらく高ＭＷ糖である。

酢酸アンモニウムを添加し、次いでナトリウムシアノボロヒドリドを添加した。ｐＨを７．０に調整した後、混合物を３７℃で３〜５日間インキュベートした。この処理により、第１級アミノ基がカードラン断片の還元末端に導入された。次いで、このアミノ糖を、３ｋＤａカットオフ膜を用いた限外濾過によって精製した。アミノ基をＨａｂｅｅｂ法によって概算した。

乾燥させたアミノオリゴ糖を蒸留水中で、４０ｍＭのアミノ基濃度で可溶化させ、次いで９容量のＤＭＳＯを添加した後、トリエチルアミンを２００ｍＭの最終濃度で添加した。得られた溶液に、アジピン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドジエステルを、４８０ｍＭの最終濃度で添加した。このようにして生成したエステル基を、放出されたＮ−ヒドロキシスクシンイミド基の解析によって概算した。

乾燥させた活性化オリゴ糖を、ＣＲＭ_１９７含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に添加した。反応液を攪拌下、室温で一晩維持した。最終物質は、タンパク質１ｍｏｌあたりのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのｍｏｌに関して約５０：１の比を有していた。

次いで、この結合体を、３０ｋＤａカットオフ膜を用いた限外濾過によって精製した。結合体を、ＳＤＳ−Ｐａｇｅ、ＳＥＣ−ＨＰＬＣおよびＮＭＲによって特徴付けた。また、この糖（全体および結合体化されていない糖）ならびにタンパク質の含有量を概算した。

担体としてＣＲＭ１９７の代わりに破傷風トキソイドを使用し、結合体を、同じ方法で調製した。

調製した５種類の結合体のロットについて、糖：タンパク質の比は以下のとおりであった（過剰の担体）：

図１は、実施例の結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示し、図２は、そのＳＥＣ−ＨＰＬＣプロフィールを示す。

結合体化（２）
合成カードラン（１５−ｍｅｒ）およびラミナリン（１７−ｍｅｒ）結合体を、図３に記載の方法にしたがって調製した。簡単には、表示した合成オリゴ糖を蒸留水中で、４０ｍＭのアミノ基濃度で可溶化させた。次いで、９容量のＤＭＳＯを添加した後、トリエチルアミンを最終濃度２００ｍＭまで添加した。１５ｍｅｒ−Ｃ６β（１−３）−ＣＲＭ結合体では、グルタル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドジエステルを、最終濃度２４０ｍＭまで添加した。１５ｍｅｒ−Ｃ６β（１−３）−ＣＲＭおよび１７ｍｅｒ−Ｃ６β（１−３）−ＣＲＭの結合体では、アジピン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドジエステルを、最終濃度４８０ｍＭまで添加した。次いで、この活性化オリゴ糖を、８０％ｖ／ｖジオキサンを用いた沈降によって精製した。各反応で生成したエステル基の数を、放出されたＮヒドロキシスクシンイミド基の量を測定することにより概算した。次いで、乾燥させた活性化オリゴ糖を、３０ｍｇ／ｍＬのＣＲＭ１９７溶液（１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中）に添加した。反応液を攪拌下、室温で一晩維持した。最終物質は、タンパク質１ｍｏｌあたりのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのｍｏｌに関して約５０：１の比を有していた。

次いで、結合体をＳＤＳ−ＰａｇｅおよびＳＥＣ−ＨＰＬＣによって特徴付けた。糖およびタンパク質の含有量は、以下のとおりに概算された。

図４は、これらの結合体の７％ｔｒｉｓ−アセテートゲル（ウェルあたり２０μｇロードした）上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。

免疫原性試験（１）
カードラン結合体化（１）に記載のようにして調製したカードラン結合体を免疫原性試験においてマウスに投与し、先行技術において報告されたようにして（例えば、参考文献１７４および１７５の場合のようにして）調製したラミナリン−ＣＲＭ１９７結合体と比較した。カードラン結合体の２つ以上のロットを試験した。

ＣＤ２Ｆ１マウス（４〜６週齢）を、１０匹の１８の群にて試験した。結合体を糖用量５μｇで投薬容量１５０μｌにて使用し、第１、７および２１日目に腹腔内投与した。血液試料を第０、２１および３５日目に採取し、抗ＧＧＺｙｍ抗体レベルをＥＬＩＳＡ［３，４］によって評価した。結合体は、アジュバントなし、または以下のアジュバント：（ａ）水酸化アルミニウムアジュバント；（ｂ）ＭＦ５９水中油型乳剤アジュバント；（ｃ）（ａ）と１０μｇのＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドＣｐＧとの併用；（ｄ）（ｂ）とＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの併用とともにのいずれかで投与した。

抗グルカン抗体（ＧＭＴ）および第３５日目の応答マウス（％）の数を表１に報告する。

カードラン結合体は、概してラミナリン結合体よりも免疫原性が高い。

免疫原性試験（２）
さらなる実験では、免疫原性試験（１）に記載のようにして調製したラミナリン結合体およびカードラン結合体に、アジュバントとしてα−ガラクトシルセラミド（１００ｎｇ）またはＬＴ−Ｋ６３（２μｇ）もまた、単独または他のアジュバントとの併用のいずれかで加えた。また、ＣｐＧアジュバントも、３つの異なる用量（０．５μｇ、５μｇおよび１０μｇ）で試験した。詳細は、１群あたり８匹のマウスとしたこと以外は、先の免疫原性試験の場合と同様にした。結果を表２に示す。

この場合も、カードラン結合体は、概して、ラミナリン結合体よりも免疫原性が高い。

免疫原性試験（３）
さらなる研究において、ＣＲＭ１９７または破傷風トキソイドのいずれかに結合体化させたラミナリンまたはカードランを、種々の個々のアジュバントおよび併用アジュバントと合わせ、マウスに皮下または腹腔内投与によって投与した。結合体は、免疫原性試験（１）に記載のようにして調製した。

ＣＤ２Ｆ１マウス（４〜６週齢）を、１０匹の１２の群にて試験した。結合体を糖用量５μｇで投薬容量１５０μｌにて使用し、第１、１４および２８日目に皮下または腹腔内投与によって投与した。血液試料を第０、２８および４２日目に採取し、抗ＧＧＺｙｍ抗体レベルをＥＬＩＳＡによって評価した。

第１群〜第３群には、それぞれ、３回の同一用量のＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンを、以下のアジュバント：（ａ）水酸化アルミニウムアジュバント（３００μｇ）；（ｂ）（ａ）およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドＣｐＧ １８２６（１０μｇ）の併用；ならびに（ｃ）ＭＦ５９水中油型乳剤アジュバント（７５μｌ）とともに与えた。第４群〜第６群は、それぞれ、グルカンをラミナリンではなくカードランとしたこと以外は第１群〜第３群と同様に処置した。第７群〜第９群は、それぞれ、ラミナリンをＣＲＭ１９７ではなく破傷風トキソイドに結合体化させたこと以外は、第１群〜第３群と同様に処置した。同様に、第１０群〜第１２群は、それぞれ、カードランをＣＲＭ１９７ではなく破傷風トキソイドに結合体化させたこと以外は、第４群〜第６群と同様に処置した。

マウスへのラミナリン結合体の腹腔内投与後、第４２日目の抗グルカン抗体（ＧＭＴ）を図５に示す。皮下投与後の対応する結果を図６に示す。結果は、概して結合体を皮下投与によって投与した場合の方が良好な応答が見られたことを示す。さらに、特に、結合体を皮下投与によって投与した場合、一般的に、ＣＲＭ１９７を担体タンパク質として使用した方が良好な結果が得られた。

同様に、カードラン結合体の腹腔内投与後、第４２日目の抗グルカン抗体（ＧＭＴ）を図７に示す。皮下投与後の対応する結果を図８に示す。ＣＲＭ１９７を担体タンパク質として使用した場合、結合体を皮下投与によって投与した場合の方が良好な応答が見られた。

免疫原性試験（４）
別の試験において、ＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンまたはカードランを、異なる用量の糖を用いてマウスに投与した。結合体は、免疫原性試験（１）に記載のようにして調製した。

ＣＤ２Ｆ１マウス（４〜６週齢）を、８匹の１２の群にて試験した。結合体を糖用量１０μｇ、５μｇ、１μｇまたは０．１μｇで投薬容量１５０μｌにて使用し、第１、１４および２８日目に投与した。血液試料を第０、２８および４２日目に採取し、抗ＧＧＺｙｍ抗体レベルをＥＬＩＳＡによって評価した。また、抗ラミナリン抗体レベルも、ＥＬＩＳＡにおいてＧＧ−Ｚｙｍをラミナリンに置き換えることにより、参考文献１７５に記載のようにして測定した。

第１群には、３回の同一用量のＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンを、アジュバントなし、および糖用量５μｇで与えた。第２群には、３回の同一用量のＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンを、水酸化アルミニウムアジュバント（３００μｇ）とともに糖用量５μｇで与えた。この群に投与した結合体の精製時には、リン酸緩衝液を使用した。第３群〜第６群には、３回の同一用量のＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンを水酸化アルミニウムアジュバント（３００μｇ）とともに、それぞれ、糖用量１０μｇ、５μｇ、１μｇまたは０．１μｇで与えた。これらの群に投与した結合体の精製時には、参考文献１７６に記載のように、ヒスチジン緩衝液を使用した。

第７群〜第１２群は、グルカンをラミナリンではなくカードランとしたこと以外は、第１群〜第６群と同様に処置した。

種々の糖用量のラミナリン結合体の投与後、第４２日目の抗グルカン抗体（ＧＭＴ）を図９に示す。結果は、すべての用量で応答が見られ、最良の応答は糖用量５μｇで得られたことを示す。

カードラン結合体の投与後、第４２日目の抗グルカン抗体（ＧＭＴ）を図１０に示す。この場合も、結果は、すべての糖用量で応答が見られたことを示す。最良の応答は、糖用量１０μｇおよび５μｇで得られた。

ラミナリン結合体投与後、第４２日目の抗グルカン抗体（ＧＭＴ）を図１１に示す。抗ＧＧＺｙｍ抗体ＥＬＩＳＡを用いて得られた結果を、抗ラミナリン抗体ＥＬＩＳＡのものと比較する。抗ラミナリン抗体ＥＬＩＳＡを使用した方が高力価が観察された。

免疫原性試験（５）
別の試験において、結合体化（２）に記載のようにして調製した結合体およびＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンを、種々の個々のアジュバントおよび併用アジュバントと合わせ、マウスに腹腔内投与によって投与した。ＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンは、結合体化前にアミノ化工程なしで調製したＣＲＭ１９７に対するラミナリンの代替ロット（ロット１１ＡＤ）以外は、免疫原性試験（１）に記載のようにして調製した。

ＣＤ２Ｆ１マウス（４〜６週齢）を、１６匹の１１の群にて試験した。結合体を５μｇの糖用量で投薬容量１５０μｌにて使用し、腹腔内投与によって第１、１４および２８日目に投与した。血液試料を第０、２８および４２日目に採取し、抗ラミナリン抗体レベルをＥＬＩＳＡによって評価した。

第１群〜第３群には、それぞれ、３回の同一用量のａ）１７ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭ結合体；ｂ）１５ｍｅｒ−Ｃ６β（１−３）−ＣＲＭ結合体；またはｃ）１５ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭ結合体を、すべてアジュバントなしで与えた。第４群〜第６群には、それぞれ、３回の同一用量のａ）１７ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭ結合体；ｂ）１５ｍｅｒ−Ｃ６β（１−３）−ＣＲＭ結合体；またはｃ）１５ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭ結合体を、すべてＭＦ５９水中油型乳剤アジュバント（７５μｌ）とともに与えた。第７群および第８群には、それぞれ、３回の同一用量のＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンを、ａ）アジュバントなし；またはｂ）ＭＦ５９水中油型乳剤アジュバント（７５μｌ）とともに与えた。第９群および第１０群には、それぞれ、３回の同一用量のＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンを、ａ）高用量のＩＣ３１（１０００ｎｍｏｌ／ｍｌを超えるオリゴデオキシヌクレオチドおよび４０ｎｍｏｌ／ｍｌのペプチドを有する４９．５μｌの試料）と合わせたＭＦ５９水中油型乳剤アジュバント（７５μｌ）；またはｂ）水酸化アルミニウムアジュバント（３００μｇ）とともに与えた。第１１群には、３回の同一用量の異なるＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリン調製物をＭＦ５９水中油型乳剤アジュバント（７５μｌ）とともに与えた。

結合体の投与後、第４２日目の抗ラミナリン抗体（ＧＭＴ）を図１２に示す。結果は、合成カードランおよびラミナリンの結合体は、他の結合体と同様の免疫原性を有することを示す。アジュバントを存在させた場合、免疫原性は、関連するグルカンの合成型を使用することにより改善され得る（１７ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭ／ＭＦ５９の投与後に見られた応答（バー４）を、ＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリン／ＭＦ５９の投与後に見られた応答（バー７および１１）と比較）。合成グルカンの免疫原性は、より長いスペーサーをグルカンと担体タンパク質との間に使用することにより改善され得る（１５ｍｅｒ−Ｃ６β（１−３）−ＣＲＭおよび１５ｍｅｒ−Ｃ６β（１−３）−ＣＲＭ／ＭＦ５９の投与後に見られた応答（バー２および５）を、１５ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭおよび１５ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭ／ＭＦ５９の投与後に見られた応答（バー３および６）と比較）。アジュバントの非存在下では、合成グルカンに対する免疫原性は、β−１，６−分枝を存在させないことによって改善され得る（１５ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭの投与後に見られた応答（バー３）を、１７ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭの投与後に見られた応答（バー１）と比較）。対照的に、アジュバントの存在下では、合成グルカンに対する免疫原性は、β−１，６−分枝を存在させることによって改善され得る（１７ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭ／ＭＦ５９の投与後に見られた応答（バー４）を、１５ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭ／ＭＦ５９の投与後に見られた応答（バー６）と比較）。ＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンでは、結合体化前のアミノ化工程の省略によって免疫原性は妨害されなかった（バー８および１１を比較）。

能動防御試験（１）
別の試験において、ＭＦ５９アジュバントと合わせたＣＲＭ１９７に結合体化されたグルカンを受けたマウスが、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓでの抗原刺激に対して生存する能力を試験した。結合体は、免疫原性試験（１）に記載のようにして調製した。

雌の４週齢のＣＤ２Ｆ１マウス（Ｈａｒｌａｎ）を、３回の用量にて、ＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンまたはカードランで免疫処置した。各用量は、マウス１匹あたり１０μｇの多糖（０．２ｍｌのＰＢＳ中）：ＭＦ５９（１：１ ｖ／ｖ）からなるものとした。

免疫処置スケジュールは：
・第０日目−皮下投与による初回用量
・第１４日目−腹腔内投与による２回目の用量
・第２８日目−腹腔内投与による３回目の用量
・第３５日目−採血
・第４０日目−マウス１匹あたり、静脈内投与による５．０×ｌ０^５（ラミナリン結合体での免疫処置後）または２．５×１０^５（カードラン結合体での免疫処置後）のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ菌株ＢＰ細胞（０．２ｍｌのＰＢＳ中）の真菌抗原刺激
とした。

防御エンドポイントを、死亡率（メジアン生存期間（ＭＳＴ）および死亡例／全抗原刺激マウスの比）に関して測定した。

図１３は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓでの抗原刺激前の、ＭＦ５９と合わせたＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンまたはＣＲＭ１９７およびＭＦ５９単独で処置したマウスの生存率を示す。表３においても、ＭＳＴに関して、結合体で処置したマウスで、より長い生存が示されている。

図１４は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓでの抗原刺激前の、ＭＦ５９と合わせたＣＲＭ１９７に結合体化したカードランまたはＭＦ５９単独で処置したマウスの生存率を示す。表４においても、ＭＳＴに関して、結合体で処置したマウスで、より長い生存が示されている。

生存は、ＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンを受けたマウスよりも、ＣＲＭ１９７に結合体化したカードランを受けたマウスの方が長かった。

能動防御試験（２）
同様の試験において、ＭＦ５９アジュバントと合わせたＣＲＭ１９７に結合体化された合成グルカンを受けたマウスが、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓでの抗原刺激に対して生存する能力を試験した。結合体は、結合体化（２）に記載のようにして調製した。この試験では、真菌抗原刺激は、５．０×ｌ０^５細胞の静脈内投与によるものとした。

図１５は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓでの抗原刺激前の、ＭＦ５９と合わせた１５ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭ、ＭＦ５９と合わせた１７ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭまたはＭＦ５９単独で処置したマウスの生存率を示す。表５においても、ＭＳＴに関して、１５ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭ結合体で処置したマウスで、より長い生存が示されている。

１５ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭでの処置により生存が長くなったが、１７ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭでの処置は、なんら効果を有しないようであった。この結果は、グルカン内の防御的抗体応答の誘導を担うエピトープが、β−１，３結合のみによって他の残基に連結された隣接する少なくとも５つの非末端残基を含むことを示唆する。理論に拘束されることを望まないが、この効果が、能動防御試験（１）において、ＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンを受けたマウスよりもＣＲＭ１９７に結合体化したカードランを受けたマウスで見られた防御的抗体応答が大きかったことに寄与している可能性があると考えられる。ＣＲＭ１９７に結合体化したカードラン（この場合、グルカンはβ−１，３−結合残基のみを含む）は、ＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリン（この場合、グルカンは、β−１，３−結合残基およびβ−１，６−結合残基を含む）よりも多くの割合の防御的エピトープを含んでいる可能性がある。

本発明は、一例として説明したにすぎず、本発明の範囲および精神の範囲内で変形が行われ得ることは理解されよう。

参考文献

Claims (18)

1. 医薬における使用のためのグルカンであって、該グルカンは、（ｉ）排他的にβ−１，３−結合グルコース残基を有するか、または（ｉｉ）β−１，３−結合グルコース残基およびβ−１，６−結合グルコース残基の両方を含むかのいずれかである、ただし、β−１，６−結合残基に対するβ−１，３−結合残基の比が少なくとも８：１である、および／またはβ−１，３結合のみによって他の残基に連結された少なくとも５つの隣接する非末端残基の配列が１つ以上存在する、グルカン。
2. （ｉ）排他的にβ−１，３−結合グルコース残基を有するか、または（ｉｉ）β−１，３−結合グルコース残基およびβ−１，６−結合グルコース残基の両方を含むかのいずれかである、ただし、β−１，６−結合残基に対するβ−１，３−結合残基の比が少なくとも８：１である、請求項１に記載のグルカン。
3. 前記グルカンが、排他的に１，３結合を有する線状β−Ｄ−グルコピラノース、請求項１または２に記載のグルカン。
4. カードラン、パラミロン、またはその断片である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のグルカン。
5. カードランの加水分解断片である、請求項３に記載のグルカン。
6. ２〜６０個のグルコース単糖単位を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のグルカン。
7. 単一の分子種である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のグルカン。
8. 下記の構造：
   を有し、式中、ｎ＋２は１１〜１９の範囲である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のグルカン。
9. ｎ＋２＝１５である、請求項８に記載のグルカン。
10. 免疫原としての使用のためのものである、請求項１〜９のいずれか一項に記載のグルカン。
11. 防御的抗体応答の提供における使用のためのものである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のグルカン。
12. 担体分子に連結された請求項１〜１１のいずれか一項に記載のグルカンを含む結合体。
13. 前記担体分子が細菌毒素またはその非毒性誘導体である、請求項１２に記載の結合体。
14. 前記担体がＣＲＭ１９７である、請求項１３に記載の結合体。
15. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載のグルカンまたは結合体を、薬学的に許容され得る担体との組み合わせで含む医薬組成物。
16. 免疫原性組成物である、請求項１５に記載の組成物。
17. アジュバントを含む、請求項１６に記載の組成物。
18. 請求項１〜１７のいずれか一項に記載のグルカン、結合体または医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における免疫応答を惹起するための方法。