JP2011168555A - 鑑別方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】外用で投与すべき素材の鑑別方法において、抗菌ペプチド産生促進作用、取り分け、β−ディフェンシン1産生遺伝子(hBD1mRNA)発現促進作用を指標とする外用で投与すべき素材の鑑別方法を確立することにより、皮膚バリア機能向上用に好適な、新規な作用機序を有する抗菌ペプチド産生促進作用による皮膚バリア機能向上作用を有する素材、当該素材を含有してなる組成物。
【選択図】図1
Description
<1> 刺激感受性の高い人のための肌状態を改善するために外用で投与すべき素材の鑑別方法であって、ヒトの皮膚乃至はヒトの皮膚細胞に対する、抗菌ペプチドの産生促進作用の度合いを計測し、該促進作用が大きい場合には、肌改善作用が大きい素材であると鑑別し、小さい場合には肌改善作用が低いと鑑別することを特徴とする、外用で投与すべき素材の鑑別方法。
<2> 前記の抗菌ペプチドは、β−ディフェンシン1〜4(hBD1〜4:human β−defensin−1〜4)、又は、LL−37であることを特徴とする、<1>に記載の外用で投与すべき素材の鑑別方法。
<3> 前記の抗菌ペプチドが、上皮細胞由来の抗菌ペプチドであることを特徴する、<1>又は<2>に記載の外用で投与すべき素材の鑑別方法。
<4> 前記の上皮系細胞が、表皮細胞であることを特徴とする、<1>〜<3>に記載の外用で投与すべき素材の鑑別方法。
<5> 前記上皮系細胞由来の抗菌ペプチドが、β−ディフェンシン1(hBD1:human β−defensin−1)であることを特徴とする、<1>〜<4>の何れか一項に記載の外用で投与すべき素材の鑑別方法。
<6> 前記hBD1の産生量が、hBD1産生遺伝子発現量で換算されることを特徴とする、<1>〜<5>の何れか一項に記載の外用で投与すべき素材の鑑別方法。
<7> 前記外用で投与すべき素材が、表皮細胞におけるタイトジャンクション(TJ:Tight junction)の形成促進作用を更に有することを特徴とする、<1>〜<6>の何れか一項に記載の外用で投与すべき素材の鑑別方法。
<8> 前記刺激感受性の高い人は、テ−プストリッピングで回収された角層において、皮膚における炎症を認めず、重層剥離が10%以上認められる人であることを特徴とする、<1>〜<7>何れか一項に記載の外用で投与すべき素材の鑑別方法 。
<9> <1>〜<8>に記載の 外用で投与すべき素材の鑑別方法であって、外用で投与すべき素材としての的確性を認められた素材を含有してなる組成物。
<10> 化粧料(但し、医薬部外品を含む)であることを特徴とする、<9>に記載の組成物。
<11> 皮膚外用剤であることを特徴とする、<9>又は<10>に記載の組成物。
<12> 炎症を有しない人であって、肌荒れ状態が存在し、該肌荒れが無処置においては炎症を誘起すると印象を持った人が使用すべき皮膚外用剤であることを特徴とする、<9>〜<11>の何れか1項に記載の組成物。
<13> 肌に適した化粧料の選択方法であって、被験者からテ−プストリッピングにより採取された皮膚角層を顕微鏡で観察し、その形状より皮膚の刺激性感受性を判定し、感受性が高いと認められた場合に、<9>〜<12>の何れか一項に記載の組成物を選択することを特徴とする、化粧料の選択方法。
本発明の外用で投与すべき素材の鑑別方法は、刺激感受性の高い人の肌状態を改善するために外用で投与すべき素材の鑑別方法であって、ヒトの皮膚乃至はヒトの皮膚細胞に対する、抗菌ペプチド産生促進作用の度合いを計測し、該作用が大きい場合には、肌改善作用が大きい素材であると鑑別し、小さい場合には、肌改善作用が小さいと鑑別することを特徴とする、外用で投与すべき素材の鑑別方法である。皮膚バリア機能には、皮膚の最外層の角層及び角層細胞間脂質における角層細胞の形状特性、並びに、連続的に細胞を繋ぎ止める細胞間接着構造体であるTJ及びAJ(Adherens junction)等の細胞間接着構造体が大きな役割を果たしている。特に、細胞と細胞の接合部分の結合状態に重要な役割を果たすTJ形成状態は、肌の刺激感受性と深く関与することが知られている(例えば、特開2005−345191号公報参照)。本発明における刺激感受性の高い人とは、温度、湿度、過度の摩擦、生活リズムの変調、ストレスなどの要因により角層細胞間におけるTJ等の細胞接着構造体の形成状態の悪化又は崩壊により皮膚バリア機能が低下し、外的刺激や物理的刺激に対する刺激感受性が高くなっており、炎症が認められない人であれば、特段の限定なく適応することが出来る。この様な刺激感受性の高い人に関し、具体例を挙げれば、テ−プストリッピングにより回収された角層において、皮膚における炎症を認めず、重層剥離が10%以上認められる人が好適に例示出来る。
本発明の外用で投与すべき素材の鑑別方法は、刺激感受性の高い人のための肌状態を改善するために外用で投与すべき素材の鑑別方法であって、ヒトの皮膚乃至はヒトの皮膚細胞に対する、抗菌ペプチド産生促進作用の度合いを計測し、該作用が大きい場合には、肌改善作用が大きい素材であると鑑別し、小さい場合には、肌改善作用が小さいと鑑別することを特徴とする、外用で投与すべき素材の鑑別方法である。本発明の外用で投与すべき素材の鑑別方法により外用で投与すべき的確性を有する素材としては、鑑別における指標となる抗菌ペプチド産生促進作用が大であると鑑別された成分が好適に例示出来る。抗菌ペプチド産生促進作用を有する成分には、抗菌ペプチド産生促進作用を有する成分に加え、抗菌ペプチドの分解を抑制する作用を有する成分、抗菌ペプチドの角層への分泌を促進する作用を有する成分も包含される。また、前記抗菌ペプチド産生促進作用を評価する方法としては、抗菌ペプチド産生量の増加を確認することが出来る評価方法であれば特段の限定なく適応することが出来、具体例を挙げれば、ヒトの皮膚乃至はヒトの皮膚細胞において産生される抗菌ペプチド量や角層に分泌される抗菌ペプチド量を直接測定する方法のほか、抗菌ペプチド産生酵素の活性化作用を評価する方法、抗菌ペプチド産生遺伝子の発現促進作用を評価する方法、抗菌ペプチドの角層への分泌を促進する作用を評価する方法等が好適に例示出来る。これらの内、好ましいものを具体的に例示すれば、後記の「抗菌ペプチド遺伝子(hBD1mRNA)発現量の測定」に記載されたβ−ディフェンシン1(DEF1)遺伝子発現促進作用評価方法が好適に例示出来る。本発明の抗菌ペプチド産生促進作用を指標とした鑑別方法において、抗菌ペプチド産生促進作用が大であると判別される素材としては、抗菌ペプチド産生促進作用を示す素材であれば特段の限定なく適応出来る。前述した「抗菌ペプチド遺伝子(hBD1mRNA)発現量の測定」を例に挙げれば、前記評価系において抗菌ペプチド産生促進作用が大である判別される成分としては、β−ディフェンシン1mRNA発現促進作用がコントロ−ル群に比較し、1.4倍以上の増加を示す成分が好適に例示出来、より好ましくは、2.0倍以上の増加を示す成分、さらに好ましくは、統計的な有意差を持ってβ−ディフェンシン1mRNA産生促進作用を有する成分が好適に例示出来る。さらに、同様の基準は、残りの抗菌ペプチド産生促進作用評価におけるmRNA発現促進作用の評価基準として適応することが出来る。
本発明の組成物は、前記の外用で投与すべき素材の鑑別方法により抗菌ペプチド産生促進作用が大であると判別された成分を含有することを特徴とする。本発明の鑑別方法において指標となる抗菌ペプチド産生促進作用としては、上皮系細胞由来の抗菌ペプチド産生促進作用が好適に例示出来、より好ましくは、表皮細胞由来の抗菌ペプチド産生促進作用が好適に例示出来る。前記抗菌ペプチドを具体的に例示すれば、β−ディフェンシン1〜4(DEF1〜4)又はLL−37が好適に例示出来、より好ましいものとしては、β−ディフェンシン1(DEF1)が好適に例示出来る。本発明の抗菌ペプチド産生促進作用が大であると判別される成分は、本発明において抗菌ペプチド産生促進作用を有すると判別される抗菌ペプチド産生促進作用を有する成分であれば特段の限定なく適応すること出来、より好ましくは、後述する「抗菌ペプチド遺伝子(hBD1mRNA)発現量の測定」にいて抗菌ペプチド産生促進作用が大であると判別される成分が好適に例示出来る。前記「抗菌ペプチド遺伝子(hBD1mRNA)発現量の測定」において、抗菌ペプチド産生促進作用が大であると判別される成分、即ち、β−ディフェンシン1(DEF1)遺伝子発現促進作用が大であると判別される成分としては、β−ディフェンシン1mRNA産生促進作用がコントロ−ル群に比較し、1.3倍以上の増加を示す成分が好適に例示出来、より好ましくは、1.5倍以上の増加を示す成分、さらに好ましくは、統計的な有意差を持ってβ−ディフェンシン1mRNA産生促進作用を有する成分が好適に例示出来る。
下記の手順に従い、ヒト抗菌ペプチドの経皮上電気抵抗値(TER値)を測定することにより、TJ等の細胞間接着構造体の形成促進作用による皮膚バリア機能向上作用を評価した。本試験に用いた抗菌ペプチドは、β−ディフェンシン1(DEF1、(株)ペプチド研究所)、β−ディフェンシン2(DEF2、(株)ペプチド研究所)、β−ディフェンシン3(DEF3、(株)ペプチド研究所)、β−ディフェンシン4(DEF4、(株)ペプチド研究所)、LL−37((株)ペプチド研究所)より購入した抗菌ペプチドを用いた。また、ヒト抗菌ペプチドには分類されないペプチドとして、皮膚において発現が確認され抗菌作用を有するメラニン細胞刺激ホルモン(α−MSH: α−melanocyte stimulating hormone、(株)ペプチド研究所)、皮膚において発現が確認されているが抗菌作用を有さないプロラクチン放出ホルモン(PRH: Prolactin releasing hormone、(株)ペプチド研究所)に関し、同様にTER値を測定した。試験操作方法を以下に示す。
2)トリプシン処理により、12穴、或いは、24穴のトランズウェルに1×105(cells/cm2)となるよう播種した。
3)播種3日目にTER値を測定し、培地を1.45mM Ca2+ Humedia-KG2に被験物質を添加した溶液と交換した。但し、被験物質としては、前記抗菌ペプチド、α−MSH又はPRHが含まれ、抗菌ペプチドを溶解する溶媒としては、0.1% CH3COOHもしくは純水を使用し、被験物質の最終濃度は、0.5又は5(μg/mL)に設定した。
4)被験物質添加後24、48、72、96、120時間後のTER値を測定した。結果を図1及び図2に示す。
以下の手順に従い、β−ディフェンシン1mRNA発現促進作用を評価した。本試験に用いた植物抽出物は、丸善製薬株式会社等より購入した植物抽出物を用いた。以下に試験手順を示す。
1)正常ヒト表皮角化細胞(NHEK)(倉敷紡績株式会社)をHumedia-KG2(倉敷紡績株式会社)でサブコンフルエントになるまで培養した。
2)トリプシン処理により、NHEKを96well plateに1×104(cells/well)播種した。
3)被験物質(植物抽出液の固形分)をジメチルスルホキシド(DMSO、和光純薬工業株式会社)により溶解し、10(w/v%)、或いは0.1(w/v%)エキス液を作成した。それらを1.45M Ca2+ Humedia-KG2に1/1000量ずつ添加した培地を作成し、播種3日後にその培地と置換し、さらに48時間培養した(各被験物質の最終固形分濃度は1×10−2(w/v%)、或いは1×10−4(w/v%))。また、1.45M Ca2+ Humedia-KG2にDMSOのみを1/1000量添加した培地も作成し、それによって培養した細胞をベヒクルコントロール群とした。
4)FastLane Cell Multiplex Kit(QIAGEN社)を用い、mRNAを安定化したライセ−トを調製した。
5)前記4)にて調製したライセ−トをテンプレ−トとし、QuantiTect Multiplex RT-PCR Kit(QIAGEN社)を用いたリアルタイム(RT-PCR)により、各被験物質添加時のhBD1 mRNA発現量を検出し、ddCt法にて相対定量値を算出した。また、内在性コントロ−ルとしてTBP(TATA Binding Protein (TATA box結合因子で、ハウスキ−ピング遺伝子の一種))のmRNA発現量も同時に測定し、ddCt法にて相対定量値を算出した。結果を図3及び図4に示す。
試験例1に記載の方法に従い、前記試験においてヒト抗菌ペプチド産生促進作用を有する成分に関し、TER値を測定することにより皮膚バリア機能を評価した。結果を図5〜8に示す。
表1に示す処方に従って、本発明の抗菌ペプチド産生促進作用を有する成分を含有する皮膚外用剤(ロ−ション化粧料)を作製した。即ち、処方成分を80℃で攪拌し、可溶化し、しかる後に、攪拌下冷却して、ロ−ション化粧料(化粧料1〜21)を得た。
表3及び表4に示す処方に従って、本発明の皮膚外用剤である乳化剤形の化粧料を製造した。即ち、イ、ロ、ハの成分を80℃に加温し、イの中にニを加えて溶解させ、混練りしてゲルを形成させ、これにロを加え希釈し、これに攪拌下、徐々にハを加えて乳化し、攪拌冷却し、「本発明の抗菌ペプチド産生促進作用を有する成分」を含有する皮膚外用剤である油中水乳化剤形の化粧料22〜25を得た。
パネラ−を使用し、化粧料(化粧料7、9、15及び20)及び比較例1に付いて、テ−プストリッピングによって作成した肌荒れモデルでの、肌荒れ改善作用を評価した。即ち、左右の前腕に3cm×5cmの部位を3つずつ作成し、テ−プストリッピングを各部位15回行い、経皮的散逸水分量(TEWL)をC+K社製の「テヴァメ−タ−」で計測した。その後、一日一度検体を50μL塗布し、この作業を6日間続け、7日目に再度TEWLを計測した。最初の日のTEWL値から7日目のTEWL値を減じ、最初の日のTEWL値で除し、100を乗じてTEWL改善率(%)を算出した。n数は15とした。結果を表4に示す。これより、本発明の皮膚外用剤は肌荒れ改善作用に優れることがわかる。
Claims (13)
- 刺激感受性の高い人のための肌状態を改善するために外用で投与すべき素材の鑑別方法であって、ヒトの皮膚乃至はヒトの皮膚細胞に対する、抗菌ペプチドの産生促進作用の度合いを計測し、該促進作用が大きい場合には、肌改善作用が大きい素材であると鑑別し、小さい場合には肌改善作用が低いと鑑別することを特徴とする、外用で投与すべき素材の鑑別方法。
- 前記の抗菌ペプチドは、β−ディフェンシン1〜4(hBD1〜4:human β−defensin−1〜4)、又は、LL−37であることを特徴とする、請求項1に記載の外用で投与すべき素材の鑑別方法。
- 前記の抗菌ペプチドが、上皮細胞由来の抗菌ペプチドであることを特徴する、請求項1又は2に記載の外用で投与すべき素材の鑑別方法。
- 前記の上皮系細胞が、表皮細胞であることを特徴とする、請求項1〜3に記載の外用で投与すべき素材の鑑別方法。
- 前記上皮系細胞由来の抗菌ペプチドが、β−ディフェンシン1(hBD1:human β−defensin−1)であることを特徴とする、請求項1〜4の何れか一項に記載の外用で投与すべき素材の鑑別方法。
- 前記hBD1の産生量が、hBD1産生遺伝子発現量で換算されることを特徴とする、請求項1〜5の何れか一項に記載の外用で投与すべき素材の鑑別方法。
- 前記外用で投与すべき素材が、表皮細胞におけるタイトジャンクション(TJ:Tight junction)の形成促進作用を更に有することを特徴とする、請求項1〜6の何れか一項に記載の外用で投与すべき素材の鑑別方法。
- 前記刺激感受性の高い人は、テ−プストリッピングで回収された角層において、皮膚における炎症を認めず、重層剥離が10%以上認められる人であることを特徴とする、請求項1〜7何れか一項に記載の外用で投与すべき素材の鑑別方法 。
- 請求項1〜8に記載の 外用で投与すべき素材の鑑別方法であって、外用で投与すべき素材としての的確性を認められた素材を含有してなる組成物。
- 化粧料(但し、医薬部外品を含む)であることを特徴とする、請求項9に記載の組成物。
- 皮膚外用剤であることを特徴とする、請求項9又は10に記載の組成物。
- 炎症を有しない人であって、肌荒れ状態が存在し、該肌荒れが無処置においては炎症を誘起すると印象を持った人が使用すべき皮膚外用剤であることを特徴とする、請求項9〜11何れか1項に記載の組成物。
- 肌に適した化粧料の選択方法であって、被験者からテ−プストリッピングにより採取された皮膚角層を顕微鏡で観察し、その形状より皮膚の刺激性感受性を判定し、感受性が高いと認められた場合に、請求項9〜12の何れか一項に記載の組成物を選択することを特徴とする、化粧料の選択方法。
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