JP2011020926A - 修飾ペプチド及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】（１）生体内又は生体表面等の生体環境においても持続的に使用できるペプチドを提供する。（２）ペプチドの製造方法において高い収率を達成する。
【解決手段】Ｎ末端がチアゾリジン環であり、かつＣ末端がリジンε−ラクタム環であることを特徴とする両端が修飾されたペプチド。
【選択図】なし

Description

本発明は、修飾ペプチド及びその製造方法に関する。

近年、医薬、食品、又は化粧品等の様々な分野において、ペプチドが注目されている。例えば、生理活性、及び抗微生物活性等をはじめとする有用活性を示す種々の機能性ペプチドを有効成分として配合すること等が広く行われている。

しかしながら、生体内又は生体表面等の生体環境において従来のペプチドは加水分解されやすく、このため目的を達成する前に分解してしまう等の問題点があった。

そこで、機能性ペプチドに対して化学修飾を施すことにより加水分解耐性を付与しようとする試みが行われてきた。例えば、配列中のペプチド結合をその構造等価体に置き換えて加水分解耐性を付与し、構造および機能の特徴を維持した類縁体を設計・合成する試みが行われている（非特許文献１）。

しかしながら、機能性ペプチドを修飾することによってその有用活性が劇的に低下してしまうことが報告されている（非特許文献２）。このため機能性ペプチドに対してその有用活性を維持しつつ加水分解耐性を付与することは困難を極め、この課題は長らく解決されていなかった。

また、ペプチドの製造方法としては、「化学合成法」と組換えＤＮＡ技術による「生物学的生産法」の２種類が主に用いられている。化学合成法では、任意のアミノ酸および修飾基からなるペプチドの製造が可能であるものの、大量の有機溶媒・副生成物の生成を伴うとともに、生産コストが極めて高い。一方、生物学的生産法では、水性の培養液中等で大量生産が可能であるものの、生産生物が利用可能なアミノ酸（一般的には、天然アミノ酸）からなるペプチド配列のみに限定され、特に、ペプチド両末端には修飾基が施されない状態で単離されることが一般的である。これらの生産法の利点を活用する方法として、まず目的ペプチドを含む融合タンパク質もしくは融合ペプチドをいったん取得してから、次に目的ペプチドを切り出すという方法が行われている。例えば、培養微生物において目的ペプチドを含む融合タンパク質もしくは融合ペプチドをいったん発現により取得した後、目的ペプチドを化学的処理により切り出すことが行われている。

しかしながら、従来の製造方法は目的ペプチドの生産収率が悪い等の問題点があった。

有機合成化学協会誌、２００８年、６６巻９号、８４６─８５７ Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．， Ａｐｒｉｌ ７， ２００９， ｖｏｌ． １０６， ｎｏ． １４， ｐｐ ５８０１−５８０６

本発明は、生体内又は生体表面等の生体環境においても持続的に使用できるペプチドを提供することを課題とする。また、ペプチドの製造方法において高い収率を達成することも課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく、種々の処理方法を検討する等して多大な試行錯誤を重ねた結果、格段に優れた加水分解耐性を示す修飾されたペプチド（以下、本明細書において修飾されたペプチドのことを単に「修飾ペプチド」ということがある。）を取得することに成功した。機能性ペプチドを修飾して得られる修飾ペプチドはその有用活性を失うであろうことが従来技術から予測された。本発明者らは、この修飾が驚くべきことに予測に反してペプチドの有用活性に大きな影響を与えないことを見出した。

さらに本発明者らは、所定の方法によることでこの修飾ペプチドを高収率で製造できるという驚くべき知見を得た。

この技術的思想を基礎として、本発明者らはさらに多大な時間と労力をかけることにより一層優れた修飾ペプチド及びその製造方法を開発することに成功し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は次の通りである：
項１．Ｎ末端がチアゾリジン環であり、かつＣ末端がリジンε−ラクタム環であることを特徴とする両端が修飾されたペプチド。

項２．前記ペプチドが、生理活性又は抗微生物活性を有するものである、項１記載の修飾されたペプチド。

項３．前記ペプチドが、抗ウイルス活性を有するものである、項２記載の修飾されたペプチド。

項４．前記ペプチドが、抗ＨＩＶ活性を有するものである、項２記載の修飾されたペプチド。

項５．前記ペプチドが、
（ａ）配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配列；又は
（ｂ）配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
を有するものである、項４記載の修飾されたペプチド。

項６．項２〜５のいずれか記載の修飾されたペプチドを含む、医薬組成物。

項７．項２〜５のいずれか記載の修飾されたペプチドを含む、食品。

項８．項１〜５のいずれか記載のペプチドを製造する方法であって、
（１）次の式：
Ｘ_１−Ｃｙｓ−Ａ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘ_２
（式中、Ａは、システイン残基を含まない項１〜５のいずれか記載のペプチドのアミノ酸配列であり、かつ
Ｘ_１及びＸ_２は、同一又は異なって任意のアミノ酸残基若しくは任意のアミノ酸配列である）
で表されるペプチド
をＳ−シアノ化する工程；及び
（２）工程（１）により得られるＳ−シアノ化ペプチドをアルカリ処理する工程
を含む方法。

項９．前記Ｘ_１がアミノ酸残基である場合にはそのアミノ酸残基がアスパラギン残基若しくはリジン残基であり；
前記Ｘ_１がアミノ酸配列である場合にはそのアミノ酸配列のＣ末端がアスパラギン残基若しくはリジン残基である、項８に記載の方法。

項１０．前記工程（２）におけるアルカリ処理を、炭酸塩により行う、項８又は９に記載の方法。

本発明の修飾ペプチドは、加水分解耐性を有している。特に、高いエキソペプチダーゼ耐性を有している。

また、本発明の修飾ペプチドは、生理活性及び抗微生物活性をはじめとする有用活性を修飾前と比べて著しく損なうことなく維持している。

このように本発明の修飾ペプチドは、生体内又は生体表面等の生体環境において持続的に使用できる。特に、血清中において持続的な生物活性を示す。

そして、本発明の修飾ペプチドの製造方法は、目的のアミノ酸配列を含むペプチドから高い効率で一部を切り出して、そのアミノ酸配列からなる修飾ペプチドを取得することができる。

このように本発明の修飾ペプチドの製造方法は、修飾ペプチド製造において高い収率を達成できる。このため、より安価に、かつより大量に修飾ペプチドを製造できる。特に、組換えタンパク質から一部を切り出して修飾ペプチドを取得しようとする場合に高い収率を達成できる。

本発明の修飾ペプチドを製造する方法を模式的に表した図面である。この図においては原料ペプチドが組換えタンパク質（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）である例が示されている。なお、Ａのアミノ酸配列部分がＴａｒｇｅｔ ｐｅｐｔｉｄｅと表記されている。白抜き矢印の箇所で「Ａのアミノ酸配列部分」を特異的に切り出し、かつ環化反応によりＡのアミノ酸配列の両端を環化することによって、Ａのアミノ酸配列の両端が環化されたペプチドを取得することを図示している。 実施例で用いたモデルペプチドを図示した図面である。Ｎ末端側からアスパラギン又はリジン、そしてシステインの順番になるように、これら２つのアミノ酸残基をそれぞれＳＣ３４ＥＫの両端側に配置させ、さらにＮ末端側にはチオレドキシンタグを付けたことを示している。なお、図中、「Ｘ」は同一又は異なってアスパラギン又はリジンであることを、「ＴＲＸ」はチオレドキシンタグを示している。 修飾されたＳＣ３４ＥＫについて、α−ヘリックス構造に基づく物理化学的な特徴が損なわれていないかについて円二色性スペクトルより解析した結果を示す図面である。 修飾されたＳＣ３４ＥＫについて、熱安定性が損なわれていないかについて円二色性スペクトルより解析した結果を示す図面である。 修飾されたＳＣ３４ＥＫについて、エキソペプチダーゼ耐性を検証した結果を示す図面である。

１．修飾ペプチド
本発明の修飾ペプチドは、Ｎ末端がチアゾリジン環であり、かつＣ末端がリジンε−ラクタム環であることを特徴とする両端が修飾されたペプチドである。より詳細には、本発明の修飾ペプチドは、（１）核となるペプチド（以下、「核ペプチド」ということがある。）、（２）核ペプチドのＮ末端側アミノ酸のＮ末端を修飾しているチアゾリジン環、及び（３）核ペプチドのＣ末端側アミノ酸のＣ末端を修飾しているリジンε−ラクタム環から構成される。

（１）核ペプチド
核ペプチドとしては、生理活性又は抗微生物活性をはじめとする有用活性を有するペプチド（本明細書においてそのようなペプチドのことを「機能性ペプチド」ということがある。）を使用することができる。

本明細書において「生理活性」とは、生体の生理的機能に対して何らかの作用を示す活性をいう。例えば、神経伝達物質様活性、神経栄養因子様活性、ホルモン様活性、成長因子様活性、オータコイド様活性、サイトカイン様活性、及びフェロモン様活性等が挙げられる。

抗微生物活性は任意の抗微生物活性でよく限定されない。例えば、抗細菌（バクテリア；bacteria）活性、抗菌（Fungi）活性、及び抗ウイルス活性等が挙げられる。

抗ウイルス活性としては、例えば、抗ＨＩＶ活性等が挙げられる。抗ＨＩＶ活性を有する核ペプチドとしては、例えば、ＨＩＶウイルスと標的細胞との膜融合を阻害する活性を有するペプチド等が挙げられる。そのようなペプチドとしては、例えば、ＨＩＶ−１のｇｐ４１のＨＲ２領域由来のペプチド等が挙げられる。具体的には、例えば、配列番号１のアミノ酸配列からなるＳＣ３４ＥＫ（Ｏｔａｋａ Ａ． ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２００２，４１，Ｎｏ．１６）、配列番号２のアミノ酸配列からなるＳＣ３５ＥＫ（同）、及び配列番号３のアミノ酸配列からなるＴ−２０ＥＫ（Ｏｉｓｈｉ Ａ． ｅｔ ａｌ．，２００８，５１，Ｎｏ．３）等が挙げられる。抗ＨＩＶ−１活性を有する核ペプチドとしては、さらに配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ抗ＨＩＶ−１活性を有するペプチド等も挙げられる。前記欠失等されたアミノ酸配列としては、アミノ酸配列全体の８０％以内のアミノ酸が欠失等されたアミノ酸配列が好ましく、アミノ酸配列全体の８５％以内のアミノ酸が欠失等されたアミノ酸配列がより好ましく、アミノ酸配列全体の９０％以内のアミノ酸が欠失等されたアミノ酸配列がさらに好ましい。

本発明の修飾ペプチドは両端を修飾することによってもその有用活性を失うことなく維持している。これはチアゾリジン環及びリジンε−ラクタム環の環構造を伴う末端修飾基により、それぞれの末端からのペプチダーゼ等による分解を受けにくいためであると考えられる。

（２）チアゾリジン環
チアゾリジン環は核ペプチドのＮ末端側アミノ酸のＮ末端を修飾している。具体的には、チアゾリジン−カルボニル基、例えば２−イミノチアゾリジン−４−カルボニル基（式（Ｉ））が核ペプチドのＮ末端側アミノ酸のＮ末端アミノ基とアミド結合を形成して結合している。

チアゾリジン環は、本発明の効果を妨げない限り、チアゾリジン環構造を基本骨格としつつ種々の置換基を有していてもよい。

（３）リジンε−ラクタム環
リジンε−ラクタム環は核ペプチドのＣ末端側アミノ酸のＣ末端を修飾している。具体的には、リジンε−ラクタム環（式（ＩＩ））のアミノ基が核ペプチドのＣ末端側アミノ酸のＣ末端カルボキシル基とアミド結合を形成して結合している。

リジンε−ラクタム環は、本発明の効果を妨げない限り、リジンε−ラクタム環構造を基本骨格としつつ種々の置換基を有していてもよい。
２．修飾ペプチドを含む組成物
本発明の修飾ペプチドを含む組成物としては、例えば、医薬品又は食品等が挙げられる。なお、本明細書において「食品」には飲料が含まれる。

本発明の修飾ペプチドを含む医薬品又は食品には、本発明の修飾ペプチドを一種類のみ含有させてもよいし、二種類以上を併用して含有させてもよい。

本発明の医薬品又は食品における本発明の修飾ペプチドの含有割合は、修飾ペプチドの有用作用が発揮される範囲内で選択できる。

本発明の医薬品又は食品のｐＨとしては、特に限定されないが、ペプチドの安定性や投与（注射）時に投与部位周辺に好ましくない影響を与えることを避けるという点ではｐＨ６〜８が好ましい。

本発明の医薬品又は食品の形態は限定されない。液状、半液状、固形状のいずれであってもよい。

本発明の医薬品又は食品は、本発明の効果を妨げない限り、修飾ペプチドの他に、必要に応じて種々の成分を含有することができる。

本発明の医薬品に含まれる修飾ペプチドの核ペプチドは、特定の薬理活性を示すものである。この場合、核ペプチドは好ましくは、抗ウイルス活性を有するものであり、より好ましくは抗ＨＩＶ活性を有するものである。

本発明の医薬品の形態は、適用対象となる患部、適用方法等に応じて適宜設定される。形態として、具体的には、錠剤、顆粒、散剤、坐剤、カプセル剤等の固形状；クリーム剤、ゲル剤、軟膏剤等の半固形状；液剤、ローション剤等の液状等が例示される。

本発明の医薬品の投与量や投与頻度については、医薬品の使用目的、形態、対象症例の種類や症状の程度、被投与者の年齢、及び修飾ペプチドの薬理活性の程度等に応じて適宜設定される。例えば、本発明の医薬品の１日当たりの投与量の平均としては、例えばＦｕｚｅｏｎ（Ｔ−２０）の投与量（９０ｍｇ×２回 ／ １日）を参考に算出すると修飾ペプチドの量に換算して、通常２〜２００ｍｇ程度が挙げられる。

また、本発明の医薬品は、例えば、１日当たり１回の頻度で若しくは２又は３回程度に分割して投与してもよく、また、２日〜１週間分の投与量を一度にまとめて投与してもよい。
３．修飾ペプチドを製造する方法
本発明の修飾ペプチドを製造する方法は、
（工程１）次の式：
Ｘ_１−Ｃｙｓ−Ａ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘ_２
（式中、Ａは、システイン残基を含まない任意のアミノ酸配列であり、かつ
Ｘ_１及びＸ_２は、同一又は異なって任意のアミノ酸若しくは任意のアミノ酸配列である）
で表されるペプチド（以下、「原料ペプチド」ということがある。）
をＳ−シアノ化する工程（以下、「Ｓ−シアノ化工程」ということがある。）；及び
（工程２）工程１により得られるＳ−シアノ化ペプチドをアルカリ処理する工程（以下、「アルカリ処理工程」ということがある。）
を含む方法である。

本製造方法により、図１に示すように、原料ペプチドを出発物質として、Ａのアミノ酸配列の両端が修飾されたペプチドを最終生成物として得ることができる。具体的には、原料ペプチドからＡのアミノ酸配列部分を特異的切断反応により切り出し、かつ環化反応によりＡのアミノ酸配列の両端を環化することによって、Ａのアミノ酸配列の両端が修飾されたペプチドを得ることができる。より詳細には、次の通りである。なお、Ａについての説明は、本発明の修飾ペプチドにおける核ペプチドのアミノ酸配列についての説明と変わるところがないため省略する。

（１）原料ペプチド
原料ペプチドは、例えばそれをコードする塩基配列を含むＤＮＡを培養微生物等において発現させること等によって得ることができる。具体的には、そのＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを用意し、これを大腸菌に導入して原料ペプチドを含むポリペプチドを発現させ、これを精製すること等によって得ることができる。また、この際には、発現したポリペプチドの精製をより効率よく行うために、精製用のタグ配列を付加した形でポリペプチドを発現させてもよい。この場合、精製用のタグ配列としては、例えば、ヒスチジンタグ、グルタチオンタグ、ビオチンタグ、ＦＬＡＧタグ等を用いることができる。

原料ペプチドは、その他にもペプチド合成等によって得ることもできる。

（２）Ｓ−シアノ化工程
Ｓ−シアノ化工程は、システイン基をＳ−シアノ化する工程である。これにより引き続いて行われるアルカリ処理工程において特異的に切断される部位が決定されることになる。具体的には、Ｓ−シアノ化されたシステイン基のＮ末端側アミド結合が特異的に切断されることになる。

本製造方法は、Ａのアミノ酸配列の両端が修飾されたペプチドを最終生成物として得ることを最終目的としている。したがって、もしＡにシステイン残基が含まれていると、このＡ中のシステイン残基もＳ−シアノ化されてそのＮ末端側アミド結合が切断されてしまう。そうすると、Ａのアミノ酸配列の両端が修飾されたペプチドを得ることができなくなってしまうため、Ａはシステイン残基を含まないアミノ酸配列である必要がある。

Ｓ−シアノ化反応は、限定されないが、例えば、０．５ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、及びＣＤＡＰを含む酢酸溶液中で処理すること等により行うことができる。Ｓ−シアノ化反応は、この他にも例えばｐＨ７〜９の緩衝液中で２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸（２−ｎｉｔｒｏ−５−ｔｈｉｏｃｙａｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ （ＮＴＣＢ））を反応させること等によっても行うことができる。

温度は例えば、０〜５０℃で行うことができる。反応効率の点では、２０〜５０℃で行うことが好ましい。

反応時間は例えば、１０〜３００分間行うことができる。収率の点では３０分以上行うことが好ましい。

（３）アルカリ処理工程
アルカリ処理工程は、Ｓ−シアノ化システイン残基のＮ末端側アミド結合を切断し、かつ所定の切断箇所を環化する工程である。

アルカリ処理により、Ａのアミノ酸配列のＮ末端側のＳ−シアノ化工程でＳ−シアノ化されたシステイン残基が環化してチアゾリジン環となる。この際、同時にＮ末端側アミド結合が特異的に切断され、Ａの部分が切り出される。

ところで原料ペプチドのＸ_１は、任意のアミノ酸若しくは任意のアミノ酸配列である。Ｘ_１はＳ−シアノ化されるシステイン残基を介して、Ａと結合している。このＳ−シアノ化されるシステイン基とＸ_１の間のアミド結合がアルカリ処理工程により切断される。このようにＸ_１は切断部位に隣接している。したがって、Ｘ_１がアミノ酸であるときはその種類が、又はＸ_１がペプチドであるときはＣ末端のアミノ酸（切断部位に隣接するアミノ酸）の種類が、アルカリ処理工程による切断反応の反応性に影響を与える。どのアミノ酸であったとしても切断反応は問題なく行われるが、アスパラギン若しくはリジンであれば、これらの残基の側鎖官能基の特性に基づく環化反応の進行（アスパルチミド若しくはリジンε−ラクタム形成）により、上述のチアゾリジン環形成反応を促進し、反応効率が高くなるため好ましい。反応効率の点ではその中でもリジンがより好ましい。

原料ペプチドのＸ_２も、任意のアミノ酸若しくは任意のアミノ酸配列である。Ｘ_２はリジン基及びＳ−シアノ化されるシステイン基を介して、Ａと結合している。Ｘ_２はＸ_１とは異なり切断部位には隣接していないため、アルカリ処理工程による切断反応の反応性に影響を与えることはない。

アルカリ処理反応は、限定されないが、例えば、種々の塩基で処理すること等により行うことができる。種々の塩基としては、限定されないが、例えば、アンモニア、アミン、及び弱酸塩、金属水酸化物等を用いることができる。これらを単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。アミンとしては、例えば、トリエチルアミン、及びイソプロピルエタノールアミン等を用いることができる。弱酸塩としては、例えば、酢酸塩、炭酸水素塩、及び炭酸塩等を用いることができる。金属水酸化物としては、水酸化ナトリウム、水酸化リチウム等を用いることができる。塩としては、例えば、ナトリウム、カリウム等を用いることができる。反応効率の点では、炭酸塩の水溶液が好ましく、炭酸塩の中でもＫ_２ＣＯ_３の水溶液がより好ましい。

塩基濃度は、塩基の種類にもよるが、例えば、０．１〜５Ｍの塩基を用いることができる。炭酸塩の水溶液の場合は、例えば、０．１〜２Ｍの炭酸塩を用いることができる。

温度は例えば、０〜５０℃で行うことができる。反応効率の点では、２０〜５０℃で行うことが好ましい。

反応時間は例えば、１０〜３００分間行うことができる。収率の点では３０分以上行うことが好ましい。

以下、本発明を試験例及び実施例に基づき具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの具体例に限定されるものではない。

試験例１．核ペプチド両端の同時切断反応に関する検討
（１）モデルペプチドの合成
次の式（ＩＩＩ）：

［Ａｃは、アセチル基であり、かつＸは任意のアミノ酸残基である（ただし、システイン残基を除く）。なお、Ｎ末端のチロシンのＮ末端側はアセチル化されており、かつＣ末端のリジンのＣ末端側はアミド化されている。Ｙはチロシン、Ｅはグルタミン酸、Ｑはグルタミン、Ｋはリジン、Ｃはシステイン、Ｆはフェニルアラニンをそれぞれ示している。］
で表されるペプチドをモデルペプチドとして用いた。

モデルペプチドは次のようにして合成した。ペプチド固相合成法により標準的なＦｍｏｃ（ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）合成法にて合成した。固相としてＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ樹脂（Ｎａｖａｂｉｏｃｈｅｍ社製）を８３ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ用いた。アミノ酸側鎖の保護には、チロシン、セリン及びスレオニンに関してはｔ−Ｂｕを；アスパラギン酸及びグルタミン酸に関してはｔ−Ｂｕエステルを、リジンに関してはＢｏｃを、システイン、ヒスチジン、アスパラギン及びグルタミンに関してはＴｒｔを；アルギニンに関しては２，２，４，６，７−ｐｅｎｔａｍｅｔｈｙｌｄｉｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ−５−ｓｕｌｆｏｎｙｌ（ｐｂｆ）を、それぞれ用いた。

保護ペプチド樹脂の構築は、Ｆｍｏｃアミノ酸を５当量の試薬（Ｆｍｏｃアミノ酸、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、ＨＯＢｔ・Ｈ_２Ｏ）を用いて縮合させた後、２０％ピペリジン含有ＤＭＦ中で１分間×２回、２０分間×１回ずつ処理してＦｍｏｃ基を除去することを、各アミノ酸ごとに繰り返すことにより行った。

最終的に得られた保護ペプチド樹脂をＴＦＡ／Ｈ_２Ｏ／ｍ−クレゾール／チオアニソール／１，２−エタンジチオール（８０：５：５：５：５）中で２時間室温にて処理した後、樹脂を濾去した。次いで氷冷した乾燥ジエチルエーテル３０ｍＬを濾液に加えた。生成した粉末を遠心分離により回収し、氷冷した乾燥ジエチルエーテル１５ｍＬで３回洗浄した。分取ＨＰＬＣにより生成物の精製を行い、無色の粉末状のモデルペプチドを得た。

モデルペプチドのシステインを次のようにしてＳ−シアノ化した。まず、モデルペプチド（例えば、Ｘがリジン残基である場合は５．８ｍｇ）を含む０．１Ｎ酢酸溶液０．５８ｍｌを、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート［１−ｃｙａｎｏ−４−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｂｏｒａｔｅ（ＣＤＡＰ）；入手先ＳＩＧＭＡ；品番Ｃ２７７６］を含む０．１Ｎ酢酸溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）０．１８２ｍＬに添加した。室温で３０分間撹拌した後、分取ＨＰＬＣにより精製してＳ−シアノ化ペプチドの凍結乾燥物を得た。分取ＨＰＬＣによる精製は次の通り行った。Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＡＲＩＩ分取用カラム（２０×２５０ｍｍ、流速１０ｍＬ／分、ナカライテスク製）を使用した。Ｘがリジン残基である場合、Ｓ−シアノ化ペプチドは５．７ｍｇであり、収率は９７％であった。

（２）切断反応に関する検討
続いてＳ−シアノ化モデルペプチド１ｍｇを３Ｍ ＮＨ_３溶液０．１ｍＬ中において２０℃で２０分間処理することにより、Ｓ−シアノ化されたＸのＣ末端側アミド結合を特異的に切断した。

この切断反応の産物を逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）で分析することにより、次の式（ＩＶ）〜式（ＶＩＩＩ）で表されるペプチドが得られた。ＲＰ−ＨＰＬＣは次の通り行った。Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＡＲＩＩ分析用カラム（４．６×２５０ｍｍ、流速 １ｍＬ／分、ナカライテスク製）を用いた。溶出された生成物をＵＶ（２２０ｎｍ）で検出した。溶媒系としては、０．１ｖ／ｖ％ＴＦＡ（溶媒Ａ）及び０．１ｖ／ｖ％ＴＦＡ含有ＭｅＣＮ（溶媒Ｂ）を用いた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲ ｐｌｕｓ、島津製作所）、又はＱｑＴｏｆ（ＱＳＴＡＲ ｐｕｌｓａｒ ｉ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて分析を行った。ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＶＡＮＣＥ５００を用いて測定した。

式（ＩＶ）及び式（Ｖ）で表されるペプチドは、Ｘがアスパラギンでもリジンでもないアミノ酸であるときに得られるＮ末端側の断片である。式（ＩＶ）で表されるペプチドはＣ末端側がカルボキサミド基となっており、式（Ｖ）で表されるペプチドはＣ末端側がカルボン酸となっている。

式（ＶＩ）で表されるペプチドは、Ｃ末端側の断片である。そのＮ末端側は２−チアゾリジン環となっている。具体的には、２−イミノチアゾリジン−４−カルボニル基となっている。

式（ＶＩＩ）で表されるペプチドは、Ｘがアスパラギンであるときにのみ得られるＮ末端側の断片である。そのＣ末端側は分子内環化反応により環状のアスパルチミド基となっている。

式（ＶＩＩＩ）で表されるペプチドは、Ｘがリジンであるときにのみ得られるＮ末端側の断片である。そのＣ末端側は分子内環化反応によりリジンε−ラクタム環となっている。

これらのペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣで解析することにより、式（ＩＩＩ）で表されるペプチドの切断率（％）を算出した。

切断率は、具体的には次のようにして算出した。まずＲＰ−ＨＰＬＣで全ての産物についてピーク面積を測定した。次に、式（ＩＶ）又は式（Ｖ）、式（ＶＩ）、並びに式（ＶＩＩ）又は式（ＶＩＩＩ）で表されるそれぞれのペプチドのピーク面積の合計に基づいて切断率（％）を算出した。

１９種類のアミノ酸残基のうちいずれのアミノ酸残基をＸとした場合により高い切断率が得られるか検討した。Ｘがアスパラギンである場合に切断率７９％、またＸがリジンであるときには切断率８２％であり、この二つの場合に最も高い切断率が得られることが分かった。なお、Ｘがアスパラギンである場合、式（ＩＶ）で表されるペプチドと式（ＶＩＩ）で表されるペプチドの比率は５３：４７であった。また、Ｘがリジンである場合、式（ＩＶ）で表されるペプチドと式（ＶＩＩＩ）で表されるペプチドの比率は２２：７８であった。

末端が環化されたペプチドを効率的に得るという点では、Ｘがリジンである場合が特に有利であることが分かった。

（２）核ペプチド両端の同時切断反応に関する検討
（１）の検討結果から、次の式：
Ｘ_１−Ｃｙｓ−Ａ−Ｃｙｓ−Ｘ_２
（式中、Ａは、任意のアミノ酸配列からなる核ペプチドであり、かつ
Ｘ_１及びＸ_２は、同一又は異なって任意のアミノ酸若しくは任意のアミノ酸配列である）
で表されるそれぞれのペプチドをまずＳ−シアノ化し、その後にそのＳ−シアノ化ペプチドをアルカリ処理することによって、ペプチドＸ_１のＣ末端側アミド結合、及び核ペプチドのＣ末端側アミド結合が同時に切断される結果、核ペプチドを高効率で切り出せることが期待された。

さらに、次の式：
Ｘ_１−Ｃｙｓ−Ａ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘ_２；又は
Ｘ_１−Ｃｙｓ−Ａ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｘ_２
（式中、Ａは、任意のアミノ酸配列からなる核ペプチドであり、かつ
Ｘ_１及びＸ_２は、同一又は異なって任意のアミノ酸若しくは任意のアミノ酸配列である）
で表されるそれぞれのペプチドを同様に処理すれば、両端が環状構造となった状態で核ペプチドを切り出せることが期待された。

なお、両端が環状構造となった状態とは、（１）の検討結果が示すように、Ｎ末端側が２−イミノチアゾリジン環であり、かつＣ末端側がアスパルチミド基、又はリジンε−ラクタム環となった状態である。

そこで、両端が環状構造となった状態で核ペプチドを切り出す反応を実際に行うことができるか否かを、上のモデルペプチド（のうちＸがアスパラギン又はリジンであるモデルペプチド）をそれぞれ用いて検証した。

検証は具体的には次の通り行った。まずＳ−シアノ化反応は前述の通り行った。次にアルカリ処理反応を種々の塩基を用いて行い、いずれの塩基を用いた場合に両端が環状構造となった状態で核ペプチドを切り出すことができるか検討した。種々の塩基としては、３Ｍ ＮＨ_３、０．５Ｍ ＮＨ_３、１Ｍ Ｅｔ_３Ｎ、１Ｍ （ｉ−Ｐｒ）_２ＥｔＮ、１Ｍ ＡｃＯＮａ、１Ｍ ＮａＨＣＯ_３、１Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３、０．３Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３、１Ｍ Ｋ_２ＣＯ_３、及び０．３Ｍ Ｋ_２ＣＯ_３の計１０種類を検討した。アルカリ処理は全て２０℃で２０分間行った。

検証の結果、炭酸塩の水溶液を用いた場合に、末端が環化された式（ＶＩＩ）又は式（ＶＩＩＩ）のペプチドを特に高効率で得られることが明らかになった。炭酸塩の中でもＫ_２ＣＯ_３の水溶液を用いた場合に、これらのペプチドをさらに高効率で得られることも明らかになった。

以上の通り、両端が環状構造となった状態で核ペプチドを切り出す反応に関して、それを実現するための処理方法を確立した。

実施例１．本発明の修飾ペプチドの製造
試験例１で確立した処理方法に基づいて、実際に修飾された核ペプチドを切り出すことができるか検証した。
（１）モデルペプチドの設定
核ペプチドのモデルペプチドとして、抗ＨＩＶ活性ペプチド（ＨＩＶ融合阻害剤）であるＳＣ３４ＥＫを用いた。ＳＣ３４ＥＫは、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドである。このペプチドは、ＨＩＶのエンベロープ糖タンパク質であるｇｐ４１のＣ末端側のα−へリックス構造を基にして設計されたものである。ＨＩＶ感染の膜融合過程では、ｇｐ４１のＮＨＲ及びＣＨＲによる逆平行型６−ｈｅｌｉｃａｌ ｂｕｎｄｌｅ構造形成が必要であることが知られており、ＳＣ３４ＥＫはこの過程を阻害することにより野生型のみならずエンフュービルタイド（ｅｎｆｕｖｉｒｔｉｄｅ、Ｔ−２０）耐性を示すようなＨＩＶ−１株に対しても抗ウイルス活性を発揮する。

（２）モデルペプチドのチオレドキシン融合タンパク質の発現
まず、ＳＣ３４ＥＫをチオレドキシンと融合させた融合タンパク質を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１株）において発現させた。なお、図２に示す通り、Ｎ末端側からアスパラギン又はリジン、そしてシステインの順番になるように、これら２つのアミノ酸残基をそれぞれＳＣ３４ＥＫの両端側に配置させた（図２中、Ｘは同一又は異なってアスパラギン又はリジンである。）。このようにすることで、Ｓ−シアノ化及びそれに続くアルカリ処理によってＳＣ３４ＥＫが切り出されることが期待される。

まずＰＣＲ増幅の鋳型として、配列番号２で表されるｃＤＮＡ塩基配列を有する核酸（ＫＫＣ−ＳＣ３４ＥＫ−ＫＣＷ）、及び配列番号３で表されるｃＤＮＡ塩基配列を有する核酸（ＫＮＣ−ＳＣ３４ＥＫ−ＮＣＷ）を化学合成した。これらは２箇所ずつＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩによる制限酵素認識部位（ＧＧＡＴＣＣ）と（ＣＴＣＧＡＧ）を有している。大腸菌における使用頻度が高いコドンに置き換えられている。ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩにより切断した各断片をｐＥＴ３２ａベクターに挿入した。これらのプラスミド（ｐＥＴ３２ａ−ＫＫＣ−ＳＣ３４ＥＫ−ＫＣＷ、及びｐＥＴ３２ａ−ＫＮＣ−ＳＣ３４ＥＫ−ＮＣＷ）を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）−ＲＩＬ株を強制発現のため形質転換した。単離されたコロニーを拾い出し、１０ｍＬの５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ培地中で３０℃で振とうしながら一晩培養した。この培養液を５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ培養液（１Ｌ）に移した。ＯＤ_６００が３０℃で０．６〜０．８に達した時点で、１ｍＭのＩＰＴＧを添加することによりタンパク質発現を開始させた。その後２５℃で６時間さらに培養を続けた後、４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することにより細胞を回収した。細胞をＢ−ＰＥＲ（ＰＩＥＲＣＥ）溶液に懸濁し、ソニケーションにより破砕した。３０分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清に０．５ｍＭ ＴＣＥＰを添加してＮｉ−ＮＴＡアガロースカラム（ＱＩＡＧＥＮ）に移した。カラムを洗浄バッファー（２０ｍＭ リン酸、ｐＨ６．０、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ）で洗浄した。１０〜２００ｍＭイミダゾールを含む０．５ｍＭ ＴＣＥＰ含有リン酸バッファー（ｐＨ６．０）を用いてタンパク質を溶出した。融合タンパク質の発現及び精製は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０〜２０％勾配ゲル）を用いて解析した。融合タンパク質の収量は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＢＩＯ−ＲＡＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて測定した。

（３）修飾された核ペプチドの切り出し
融合タンパク質を、０．５ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン［ｔｒｉｓ（２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ（ＴＣＥＰ）；入手先ＳＩＧＭＡ、品番Ｃ４７０６］、及び１０ｍＭＣＤＡＰを含む０．１Ｎ酢酸溶液中で３０分間処理することにより、Ｓ−シアノ化した。この処理の間、システイン残基は還元状態に保たれることになる。

得られたＳ−シアノ化融合タンパク質を０．３Ｍ Ｋ_２ＣＯ_３で３０分間アルカリ処理することにより、両端が環状構造となった状態でＳＣ３４ＥＫを切り出した。ＬＣ−ＭＳにより生成物を解析した。また、分取ＨＰＬＣにより生成物を精製した。

切り出されたＳＣ３４ＥＫのＮ末端側は２−イミノチアゾリジン−４−カルボニル基となっている。これに対して、ＳＣ３４ＥＫの両端側にシステインとともにアスパラギンを配置させた場合Ｃ末端側は２−アスパルチミド基となっている。一方、ＳＣ３４ＥＫの両端側にシステインとともにリジンを配置させた場合Ｃ末端側はリジンε−ラクタム環となっている。

収率についてみると、ＳＣ３４ＥＫの両端側にシステインとともにアスパラギンを配置させた場合は修飾されたＳＣ３４ＥＫを２４％得ることができた。ＳＣ３４ＥＫの両端側にシステインとともにリジンを配置させた場合は修飾されたＳＣ３４ＥＫを２１％得ることができた。

（４）修飾された核ペプチドの評価
これらの修飾されたＳＣ３４ＥＫについて、次に示す通り、（ｉ）抗ＨＩＶ活性、（ｉｉ）物理化学的特性、及び（ｉｉｉ）生物学的安定性をそれぞれ評価した。対照のために、ＳＣ３４ＥＫ、及びＳＣ３４ＥＫの両末端の無修飾体（Ｎ末端無保護、かつＣ末端カルボン酸）についても活性を同様に評価した。

まず、これらの修飾されたＳＣ３４ＥＫについて、抗ＨＩＶ活性をそれぞれ評価した。評価は次の通り改良されたＭＡＧＩ ａｓｓａｙにより行った（Ｋｏｄａｍａ，Ｅ．Ｉ． ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ２００１，４５，１５３９−１５４６；Ｍａｅｄａ Ｙ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃ．Ｄｉｓ．，１９９８，１７７，１２０７−１２１３）。標的細胞（Ｈｅｌａ−ＣＤ４−ＬＴＲ−β−ｇａｌ）１０４ ｃｅｌｌｓ／ウェルを９６ウェルのフラットマイクロタイター培養プレートに播種した。翌日、ＨＩＶ−１クローンＮＬ４−３を６０ＭＡＧＩ Ｕ／ウェル、６０の青い細胞が４８時間後に出現するように播種した。その後、被検体を添加して培養した。４８時間後にＸ−ｇａｌ（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）により染色される細胞数を数えた。被検体の活性は、ＨＩＶ−１の複製を５０％阻止する濃度（ＥＣ_５０）で評価した。その結果、表１に示すように、これらの修飾されたＳＣ３４ＥＫは、ＳＣ３４ＥＫと同等の活性を示すことが明らかになった。環状構造を導入すると活性が損なわれることが予測されたが、この結果はそれに反するものであった。

また、これらの修飾されたＳＣ３４ＥＫについて、α−へリックス構造に基づく物理化学的な特徴が損なわれていないかについても検証した。この物理化学的な特徴は、抗ＨＩＶ活性に関連する重要な特徴である。解析は円二色性スペクトルより次の通り行った。ペプチド１０μＭを５ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．２）中において３７℃で３０分間処理した。ＣＤスペクトルを円二色性分光光度計（日本分光製Ｊ−７１０）を用いて２５℃で平均８スキャンにて測定した。０．２５分の平衡化の後、１．０秒間のインテグレーションタイムを経てから、０．５℃毎の熱変性を測定した。

その結果、図３に示すように、α−へリックス構造に基づく物理化学的な特徴が損なわれていないことが明らかになった。

さらに、これらの修飾されたＳＣ３４ＥＫについて、熱安定性が損なわれていないかについても検証した。円二色性スペクトル解析により、熱変性の中間点（融点Ｔｍ）を、［θ］_２２２値に基づいて算出した。

その結果、図４に示すように、熱安定性が損なわれていないことが明らかになった。

最後に、エキソペプチダーゼにより惹き起こされる分解に対する耐性を検証した。マウス血清中にてそれぞれのペプチドを３７℃にて２４時間インキュベートし、その間に経時的にサンプリングしてＲＰ−ＨＰＬＣ解析を行った。その結果、図５に示すように、両端が修飾されていないＳＣ３４ＥＫはすぐに分解してしまうことが明らかになった。また、Ｎ末端側がチアゾリジン環、Ｃ末端側が２−アスパルチミド基となっている修飾されたＳＣ３４ＥＫも徐々に分解することが明らかになった。これに対して、驚くべきことに、Ｎ末端側がチアゾリジン環、Ｃ末端側がリジンε−ラクタム環となっている修飾された骨格ペプチドは生分解耐性が著しく改善されており、両端がアミド化又はアシル化されているＳＣ３４ＥＫと同等の生分解耐性を示すことが明らかになった。この修飾された骨格ペプチドは２４時間インキュベートした後においても安定であった。

Claims (10)

1. Ｎ末端がチアゾリジン環であり、かつＣ末端がリジンε−ラクタム環であることを特徴とする両端が修飾されたペプチド。
2. 前記ペプチドが、生理活性又は抗微生物活性を有するものである、請求項１記載の修飾されたペプチド。
3. 前記ペプチドが、抗ウイルス活性を有するものである、請求項２記載の修飾されたペプチド。
4. 前記ペプチドが、抗ＨＩＶ活性を有するものである、請求項２記載の修飾されたペプチド。
5. 前記ペプチドが、
   （ａ）配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配列；又は
   （ｂ）配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
   を有するものである、請求項４記載の修飾されたペプチド。
6. 請求項２〜５のいずれか記載の修飾されたペプチドを含む、医薬組成物。
7. 請求項２〜５のいずれか記載の修飾されたペプチドを含む、食品。
8. 請求項１〜５のいずれか記載のペプチドを製造する方法であって、
   （１）次の式：
   Ｘ_１−Ｃｙｓ−Ａ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘ_２
   （式中、Ａは、システイン残基を含まない請求項１〜５のいずれか記載のペプチドのアミノ酸配列であり、かつ
   Ｘ_１及びＸ_２は、同一又は異なって任意のアミノ酸残基若しくは任意のアミノ酸配列である）
   で表されるペプチド
   をＳ−シアノ化する工程；及び
   （２）工程（１）により得られるＳ−シアノ化ペプチドをアルカリ処理する工程
   を含む方法。
9. 前記Ｘ_１がアミノ酸残基である場合にはそのアミノ酸残基がアスパラギン残基若しくはリジン残基であり；
   前記Ｘ_１がアミノ酸配列である場合にはそのアミノ酸配列のＣ末端がアスパラギン残基若しくはリジン残基である、請求項８に記載の方法。
10. 前記工程（２）におけるアルカリ処理を、炭酸塩により行う、請求項８又は９に記載の方法。

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