JP2011062119A - 生体試料定量用チップ - Google Patents

Abstract

【課題】検体に含まれる標的核酸の定量を行う際に、検体に含まれ得る増幅阻害要因の影響を受けにくく、核酸増幅反応および標的核酸の定量を容易に行うことができ、かつ、標的核酸の定量範囲が広い生体試料定量用チップおよび生体試料定量方法を提供する。
【解決手段】生体試料定量用チップは、検体に含まれる標的核酸の定量に使用する生体試料定量用チップであって、複数の反応容器を含み、複数の反応容器は、標的核酸と共通のプライマーで増幅可能であって、標的核酸とは異なる配列を有する既知量の競合核酸と、標的核酸および競合核酸に共通のプライマーと、標的核酸および競合核酸の増幅産物の一部に結合し、標的核酸の増幅産物と競合核酸の増幅産物とが異なる蛍光変化を示す蛍光プローブと、を含み、各々の反応容器に含まれる競合核酸の量が異なる。
【選択図】図１

Description

本発明は、例えば核酸の定量に使用する生体試料定量用チップおよび生体試料定量方法に関する。

ガラス基板等に微細流路が設けられたマイクロ流体チップを使用して、化学分析や化学合成、あるいはバイオ関連の分析等を行う方法が注目されている。マイクロ流体チップは、マイクロTotal Analytical System（マイクロＴＡＳ）や、ラボオンチップ（Lab-on-a-chip）等とも呼ばれ、従来の装置に比較して試料や試薬の必要量が少ない、反応時間が短い、廃棄物が少ない等のメリットがあり、医療診断、環境や食品のオンサイト分析、医薬品や化学品等の生産等、広い分野での利用が期待されている。試薬の量が少なくてよいことから、検査のコストを下げることが可能となり、また、試料および試薬の必要量が少ないため、反応時間も大幅に短縮されて検査の効率化を図ることができる。特に、医療診断に使用する場合には、試料となる血液等の検体の必要量を少なくすることができるため、患者の負担を軽減できるというメリットがある。

試料として用いるＤＮＡやＲＮＡ等の遺伝子を増幅する方法として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Polymerase Chain Reaction）法がよく知られている。ＰＣＲ法は、ターゲットのＤＮＡおよび試薬を混合したものをチューブに入れ、サーマルサイクラーという温度制御装置で、例えば５５℃、７２℃、９４℃の３段階の温度変化を数分の周期で繰り返し反応させるもので、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）の作用により温度サイクル１回あたり、ターゲットＤＮＡだけを約２倍に増幅することができる。

近年、特殊な蛍光プローブを用いて、増幅反応を行いながらＤＮＡの定量ができるリアルタイムＰＣＲが実用化されている。リアルタイムＰＣＲは、測定の感度および信頼性が高いことから、研究用および臨床検査用として広く用いられている。

しかしながら、リアルタイムＰＣＲ法では、検体中に増幅反応を阻害する物質が存在する場合、係る物質の影響により、得られた結果の信頼性が低い場合がある。また、ＰＣＲに必要な反応液の量は数十μｌが標準的であり、さらに、１つの反応系では基本的に１つの遺伝子の測定しかできないという問題がある。一方、検体から抽出されるＤＮＡの量は一般に少量であり、また、使用する試薬は一般に高価であるため、多数の反応系を同時に測定することは通常困難である。

一方、国際公開番号ＷＯ２００５／０５９５４８号には、標的核酸および内部標準核酸の両方にハイブリダイズする蛍光プローブを用いた測定方法が記載されている。この測定方法によれば、標的核酸および内部標準核酸を共増幅するため、増幅阻害物質の影響を受けにくく、高価なリアルタイムＰＣＲ専用装置が不要である。しかしながら、この測定方法では、特に標的核酸と内部標準核酸との濃度差が大きい場合に定量精度が著しく低下するうえ、定量可能な標準核酸の濃度範囲が狭い。

国際公開番号ＷＯ２００５／０５９５４８

本発明は、検体に含まれる標的核酸の定量を行う際に、検体に含まれ得る増幅阻害要因の影響を受けにくく、核酸増幅反応および標的核酸の定量を容易に行うことができ、かつ、標的核酸の定量範囲が広い生体試料定量用チップおよび生体試料定量方法を提供する。

本発明の第１の態様に係る生体試料定量用チップは、
検体に含まれる標的核酸の定量に使用する生体試料定量用チップであって、
複数の反応容器を含み、
前記複数の反応容器は、
前記標的核酸と共通のプライマーで増幅可能であって、該標的核酸とは異なる配列を有する既知量の競合核酸と、
前記標的核酸および前記競合核酸に共通のプライマーと、
前記標的核酸および前記競合核酸の増幅産物の一部に結合し、該標的核酸の増幅産物と該競合核酸の増幅産物とが異なる蛍光変化を示す蛍光プローブと、
を含み、
各々の前記反応容器に含まれる前記競合核酸の量が異なる。

上記生体試料定量用チップにおいて、
前記複数の反応容器に接続された反応容器導入流路と、前記反応液導入用流路に接続された反応液収容部と、廃液収容部と、をさらに含むことができる。

また、上記生体試料定量用チップにおいて、前記複数の反応容器から構成される反応容器群を複数含み、１の反応容器群を構成する前記複数の反応容器には、同一の標的核酸を増幅させる同一のプライマーが配置され、別の１の反応容器群を構成する前記複数の反応容器には、前記１の反応容器群を構成する反応容器にて増幅される標的核酸とは異なる標的核酸を増幅させる、異なるプライマーが配置されていることができる。

本発明の第２の態様に係る生体試料定量用チップは、
検体に含まれる標的核酸の定量に使用する生体試料定量用チップであって、
第１の反応容器と、
第２の反応容器と、
を備え、
前記第１の反応容器は、
前記標的核酸を増幅させるプライマーと、
前記プライマーで増幅可能であって、該標的核酸とは異なる配列を有する第１の量の競合核酸と、
前記標的核酸および前記競合核酸の増幅産物の一部に結合し、該標的核酸の増幅産物と該競合核酸の増幅産物とが異なる蛍光変化を示す蛍光プローブと、
を含み、
前記第２の反応容器は、
前記第１の量とは異なる第２の量の前記競合核酸と、
前記プライマーと、
前記蛍光プローブと、
を含む。

本発明の第３の態様に係る生体試料定量方法は、
上記第１の態様に係る生体試料定量用チップを用いて、検体に含まれる標的核酸の定量を行う生体試料定量方法であって、
前記複数の反応容器にそれぞれ検体を導入する工程と、
前記複数の反応容器内で核酸増幅反応を行う工程と、
各々の前記反応容器内において、増幅された核酸の一部に結合した前記蛍光プローブが発する蛍光強度を測定する工程と、
各々の前記反応容器内で測定された前記蛍光強度および各々の前記反応容器で用いた前記競合核酸の量に基づいて、下記式（１）で表される回帰曲線を求める工程と、
前記回帰曲線に基づいて、前記検体に含まれる標的核酸の量を推定する工程と、
を含む。

Ｆ＝ａ／（Ｃ＋ｂ）＋ｃ ・・・・・（１）
（式中、Ｆは蛍光強度を示し、Ｃは競合核酸の量を示し、ｂは検体に含まれる標的核酸の量を示し、ａおよびｃは所定の値を示す。）。

上記生体試料定量方法において、
前記回帰曲線を求める工程では、前記核酸増幅反応の前に測定された蛍光強度と、前記核酸増幅反応の後に測定された蛍光強度との比と、各々の前記反応容器で用いた前記競合核酸の量との関係に基づいて該回帰曲線を求めることができる。

この場合、前記回帰曲線を求める工程では、前記核酸増幅反応後において前記蛍光プローブが増幅された核酸の一部に結合している第１の状態で測定された蛍光強度と、前記核酸増幅反応後において前記蛍光プローブが増幅された核酸から解離している第２の状態で測定された蛍光強度との比と、各々の前記反応容器で用いた前記競合核酸の量との関係に基づいて該回帰曲線を求めることができる。

本発明の第４の態様に係る生体試料定量方法は、
検体に含まれる標的核酸の定量に使用する生体試料定量用チップを用いて、前記検体に含まれる標的核酸の定量を行う生体試料定量方法であって、
前記生体試料定量用チップは、第１の反応容器と第２の反応容器とを備え、前記第１の反応容器は、前記標的核酸を増幅させるプライマーと、前記プライマーで増幅可能であって、該標的核酸とは異なる配列を有する第１の量の競合核酸と、前記標的核酸および前記競合核酸の増幅産物の一部に結合し、該標的核酸の増幅産物と該競合核酸の増幅産物とが異なる蛍光変化を示す蛍光プローブと、を含み、前記第２の反応容器は、前記第１の量とは異なる第２の量の前記競合核酸と、前記プライマーと、前記蛍光プローブとを含み、
前記第１および第２の反応容器に前記検体を導入することと、
前記第１および第２の反応容器で核酸増幅反応を行うことと、
前記第１および第２の反応容器において、増幅された核酸の一部に結合した前記蛍光プローブが発する蛍光強度を測定することと、
前記第１および第２の反応容器で測定された前記蛍光強度並びに前記第１および第２の反応容器に含まれる前記競合核酸の量に基づいて、下記式（１）で表される回帰曲線を求めることと、
前記回帰曲線に基づいて、前記検体に含まれる標的核酸の量を推定することと、
を含む。

Ｆ＝ａ／（Ｃ＋ｂ）＋ｃ ・・・・・（１）
（式中、Ｆは前記蛍光強度を示し、Ｃは前記競合核酸の量を示し、ｂは前記検体に含まれる前記標的核酸の量を示し、ａおよびｃは所定の値を示す。）。

上記生体試料定量用チップによれば、前記複数の反応容器に、前記標的核酸と共通のプライマーで増幅可能であって、該標的核酸とは異なる配列を有する既知量の競合核酸と、前記標的核酸および前記競合核酸に共通のプライマーと、前記標的核酸および前記競合核酸の増幅産物の一部に結合し、該標的核酸の増幅産物と該競合核酸の増幅産物とが異なる蛍光変化を示す蛍光プローブとを含み、各々の前記反応容器に含まれる前記競合核酸の量が異なり、前記複数の反応容器を用いて核酸増幅反応を行うことにより、検体を前記複数の反応容器に導入すれば標的核酸の定量ができるため、核酸増幅反応および標的核酸の定量を容易に行うことができる。また、上記生体試料定量用チップを用いた標的核酸の定量では、検体に含まれ得る増幅阻害要因の影響を受けにくく、かつ、標的核酸の定量範囲が広い。また、上記生体試料定量用チップに検体を導入する以外の分注作業が不要であるため、作業量が少なく、かつ試薬の必要量を少なくすることができるため、上記生体試料定量用チップを用いることにより、標的核酸の定量を低コストでかつ高精度で行うことができる。

また、上記生体試料定量方法によれば、上記生体試料定量用チップを用いて、検体に含まれる標的核酸の定量を行う生体試料定量方法であって、各々の前記反応容器内で測定された前記蛍光強度および各々の前記反応容器で用いた前記競合核酸の量に基づいて、上記式（１）で表される回帰曲線を求める工程と、前記回帰曲線に基づいて、前記検体に含まれる標的核酸の量を推定する工程とを含むことにより、検体に含まれ得る増幅阻害要因の影響を受けにくく、かつ、標的核酸の定量範囲が広い。また、上記生体試料定量用チップに検体を導入する以外の分注作業が不要であるため、作業量が少なく、かつ試薬の必要量を少なくすることができるため、標的核酸の定量を低コストでかつ高精度で行うことができる。

図１（Ａ）は、本発明の一実施形態に係るマイクロリアクターアレイの概略構成を示す平面図、図１（Ｂ）は図１（Ａ）のＣ−Ｃ断面図。 図２は、本発明の一実施形態に係るマイクロリアクターアレイが設置された遠心装置を横から見た正面図。 図３は、図２Ａの遠心装置を上から見た平面図。 図２の遠心装置のホルダに装着されたマイクロリアクターアレイを上から見た図。 図２の遠心装置のホルダに装着されたマイクロリアクターアレイの横断面図。 本発明の実施例１で用いた標的核酸および競合核酸の配列例を示す図。 本発明の実施例１で用いたプライマーの配列例を示す図。 本発明の実施例１で用いたＱ−Ｐｒｏｂｅの配列を示す図。 本発明の実施例１で定量された検体中の競合核酸の量（ｌｏｇＣ）と蛍光強度（変化量）Ｆとの関係（回帰曲線）を示す図。

以下に、本発明の一実施形態に係る生体試料定量用チップおよび生体試料定量方法について具体的に説明する。

１．実施形態
１．１．生体試料定量用チップの構成
図１（Ａ）は、本発明の一実施形態に係るマイクロリアクターアレイ（生体試料定量用チップ）１０の概略構成を示す平面図であり、図１（Ｂ）は、図１（Ａ）のＣ−Ｃ断面図である。

マイクロリアクターアレイ１０は、検体に含まれる標的核酸の定量に使用する生体試料定量用チップ（バイオチップ）であり、図１（Ａ）および図１（Ｂ）に示されるように、複数の反応容器１０４を含む反応容器群２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６を含む。マイクロリアクターアレイ１０は、各々の反応容器１０４に接続された反応液導入用流路１０５と、反応液導入用流路１０５に接続された反応液収容部１０７と、廃液収容部１０６とをさらに含む。廃液収容部１０６は反応液収容部１０７に接続されている。さらに、マイクロリアクターアレイ１０には、反応液導入用流路１０５と廃液収容部１０６とを接続する流路１０８、および、反応液収容部１０７にマイクロリアクターアレイ１０の外部より反応液を供給するのに使用する反応液供給口１０９が設けられている。

図１（Ｂ）に示すように、マイクロリアクターアレイ１０は、透明基板１０１，１０２，１０３を貼り合わせて構成されている。透明基板１０１には、複数の反応容器１０４、反応液導入用流路１０５、反応液収容部１０７、および反応液供給口１０９が設けられている。透明基板１０２には、廃液収容部１０６および流路１０８が形成されている。透明基板１０１，１０２，１０３は例えば樹脂基板とすることができ、各部は例えば射出成型により形成することができる。

反応容器１０４はそれぞれ、定量の対象となる標的核酸と共通のプライマーで増幅可能であって、該標的核酸とは異なる配列を有する既知量の競合核酸と、標的核酸および競合核酸に共通のプライマーと、標的核酸および競合核酸の増幅産物の一部に結合し、標的核酸の増幅産物と競合核酸の増幅産物とが異なる蛍光変化を示す蛍光プローブとを含む。より具体的には、反応容器１０４の表面に、競合核酸、プライマー、および蛍光プローブを塗布した後乾燥させることにより、競合核酸、プライマー、および蛍光プローブを反応容器１０４の表面に配置させることができる。また、マイクロリアクターアレイ１０では、同じ反応容器群に属する複数の反応容器１０４に含まれる競合核酸の量がそれぞれ異なるように調整されている。

上述したように、マイクロリアクターアレイ１０は、複数の反応容器群２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６を含む。同一の反応容器群に含まれる複数の反応容器１０４には、同じ競合核酸、同じプライマー、および同じ蛍光プローブが配置されている。また、マイクロリアクターアレイ１０において、異なる反応容器群に含まれる同じ反応容器列（同一の反応容器群に含まれる反応容器１０４の配列方向を行方向とした場合、該行方向と垂直な方向における反応容器１０４の配列）Ａ〜Ｆに属する反応容器１０４には、同じ量の競合核酸を配置させることができる。

１の反応容器群を構成する複数の反応容器１０４の表面には、同一の標的核酸を増幅させる同一のプライマーが配置され、別の１の反応容器群を構成する複数の反応容器１０４の表面には、１の反応容器群を構成する反応容器１０４にて増幅される標的核酸とは異なる標的核酸を増幅させる、異なるプライマーを配置させることができる。これにより、１のマイクロリアクターアレイ１０内で異なる標的核酸の定量を行うことができる。

１の反応容器群を構成する複数の反応容器１０４の表面には、１つの反応容器群を構成する反応容器１０４にて増幅される標的核酸に結合して蛍光量の変化を示すように設計された同一の蛍光プローブが配置されている。この蛍光プローブは、当該標的核酸の競合核酸にも結合して蛍光量の変化を示すように設計されている。さらに、この蛍光プローブは、当該標的核酸に結合した際の蛍光量の変化量と、その競合核酸に結合した際の蛍光量の変化量とが異なるように設計されている。

また、別の１の反応容器群を構成する複数の反応容器１０４の表面には、１の反応容器群を構成する反応容器１０４にて増幅される標的核酸とは異なる標的核酸と、その競合核酸と結合して蛍光量の変化を示す同一の蛍光プローブが配置されている。これにより、１のマイクロリアクターアレイ１０内で異なる標的核酸の回帰曲線を求めることができる。

反応容器１０４は例えば、直径５００μｍの円形断面を有する深さ１００μｍの円筒状である。反応液導入用流路１０５は例えば、反応液の流れる方向に垂直な断面が、幅２００μｍ、深さ１００μｍに設けられている。隣り合う反応容器１０４間の距離は、反応容器１０４間での反応液の混合を防止できるように十分に確保されている。なお、反応容器１０４および反応液導入用流路１０５の表面は、気泡の吸着を防止するため内壁面が親液性となるように表面処理が施されていることが好ましい。また、反応容器１０４および反応液導入用流路１０５の内壁面には、タンパク質等の生体分子の非特異吸着を抑制する表面処理が施されていることが好ましい。

廃液収容部１０６は、流路１０８を介して反応液導入用流路１０５と接続されている。廃液収容部１０６には、後述するように、反応液導入用流路１０５に充填された反応液が排出されるため、反応液導入用流路１０５の容積よりも大きな容積を有していればよい。流路１０８は、透明基板１０２を垂直に貫通するように設けられている（例えば、図１（Ｂ）中φ＝９０°）。

また、透明基板１０１，１０２，１０３の互いに接触する面が撥液性を有するように表面処理を施したり、接触面にシール性を付与したりすることにより、反応容器１０４から反応液が漏れ、基板表面を伝わって別の反応容器１０４に入ることを防ぐことができる。具体的には、接触面をシリコーンゴムやフッ素樹脂でコートする等の方法が挙げられる。

１．２．生体試料定量方法
本発明の一実施形態に係る生体試料定量方法は、本実施形態に係るマイクロリアクターアレイ（生体試料定量用チップ）１０を用いて、検体に含まれる標的核酸の定量を行う生体試料定量方法であって、複数の反応容器１０４にそれぞれ検体を導入する工程と、複数の反応容器１０４内で核酸増幅反応を行う工程と、各々の反応容器１０４内において、増幅された核酸の一部に結合した蛍光プローブが発する蛍光強度を測定する工程と、各々の反応容器１０４内で測定された蛍光強度および各々の反応容器１０４で用いた競合核酸の量に基づいて、下記式（１）で表される回帰曲線を求める工程と、回帰曲線に基づいて、検体に含まれる標的核酸の量を推定する工程と、を含む。

Ｆ＝ａ／（Ｃ＋ｂ）＋ｃ ・・・・・（１）
（式中、Ｆは蛍光強度を示し、Ｃは競合核酸の量を示し、ｂは検体に含まれる標的核酸の量を示し、ａおよびｃは所定の値を示す。）。

１．２．１．反応容器１０４への検体の導入（反応液の充填方法）
まず、マイクロリアクターアレイ１０の反応容器１０４に検体を導入する工程について説明する。本実施形態においては、検体から調製された反応液を反応容器１０４に充填する方法を説明する。最初に、反応液供給口１０９から、ピペット等を用いて反応液収容部１０７に反応液を供給する。

反応液は検体から調製されたものであり、例えば、標的核酸、ＤＮＡポリメラーゼ、およびヌクレオチド（ｄＮＴＰ）を含む液がそれぞれ反応に適した所定の濃度で含まれている。

標的核酸としては、例えば、血液、尿、唾液、髄液のような生体サンプルから抽出されたＤＮＡ、または抽出したＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡ等が挙げられる。

次に、図２および図３に示される遠心装置５０を用いて、マイクロリアクターアレイ１０を回転させる。図２は、遠心装置５０を横から見た正面図であり、図３は、遠心装置５０を上から見た平面図である。

図２および図３に示されるように、遠心装置５０は、マイクロリアクターアレイ１０を装着可能なホルダ（被回転部）５１および回転モータ（回転手段）５２を含む。ホルダ５１は、回転軸Ｏからマイクロリアクターアレイ１０に向かう方向に対して角度θ傾斜している。このため、ホルダ５１に装着されたマイクロリアクターアレイ１０も回転軸Ｏからマイクロリアクターアレイ１０に向かう方向に対して角度θ傾斜する。ここではθ＝４５°である。なお、θは、０°＜θ＜９０°の範囲であればよい。

図４は、遠心装置５０のホルダ５１に装着したマイクロリアクターアレイ１０を上から見た平面図であり、図５は、ホルダ５１に装着したマイクロリアクターアレイ１０の横断面図である。図５（Ａ）〜図５（Ｃ）は、それぞれ図４（Ａ）〜図４（Ｃ）のＤ−Ｄ断面に相当する。

まず、図４（Ａ）および図５（Ａ）に示されるように、回転軸Ｏから見て透明基板１０１が外側になるようにマイクロリアクターアレイ１０をホルダ５１に装着し回転する。これにより、反応液収容部１０７から反応容器１０４へ向かう方向に遠心力がかかり、反応液収容部１０７内の反応液が反応液導入用流路１０５を充填しながら進んで反応容器１０４を充填する。反応液よりも比重の軽い空気は反応液導入用流路１０５内へ押し出され、反応液と入れ替わることにより、反応容器１０４が反応液で満たされる。

この時、反応液は廃液収容部１０６へは送出されない。これは、図５（Ａ）に示されるように、反応液導入用流路１０５から廃液収容部１０６へ向かう流路１０８の方向が遠心力の方向（図中矢印Ｆの方向）に対して１３５度の角度をなしているため、反応液導入用流路１０５から廃液収容部１０６へ向かう方向の遠心力成分が０以下となるからである。

なお、反応液導入用流路１０５から廃液収容部１０６へ向かう流路１０８の方向と遠心力の方向のなす角度が９０度以上１８０度以下であれば、反応液は廃液収容部１０６へ送出されない。よって、θ＝４５°の場合には、図１（Ｂ）に示される透明基板１０２と流路１０８の成す角度φが４５°＜φ≦１３５°の範囲であれば、反応液は廃液収容部１０６へ送出されない。

以上のように、反応液が廃液収容部１０６の方へ流れていかないため、すべての反応容器１０４に効率よく反応液を充填することができ、回転後は図４（Ｂ）および図５（Ｂ）に示されるように、すべての反応容器１０４と反応液導入用流路１０５に反応液が充填された状態となる。

次に、遠心装置５０の回転を一旦停止し、今度は図４（Ｃ）および図５（Ｃ）に示されるように、回転軸Ｏから見て透明基板１０３が外側になるようにマイクロリアクターアレイ１０をホルダ５１に装着し回転する。これにより、今度は反応液導入用流路１０５内の反応液が廃液収容部１０６に送出される。これは、図５（Ｃ）に示されるように、反応液導入用流路１０５から廃液収容部１０６へ向かう流路１０８の方向が、遠心力の方向（図中矢印Ｆの方向）に対して４５度の角度をなしているため、反応液導入用流路１０５から廃液収容部１０６へ向かう方向の遠心力成分が０以上となるからである。なお、反応液導入用流路１０５から廃液収容部１０６へ向かう流路１０８の方向と遠心力の方向のなす角度が０度以上かつ９０度より小さければ、反応液は廃液収容部１０６へ送出される。よって、θ＝４５°の場合には、図１（Ｂ）に示される透明基板１０２と流路１０８の成す角度φが４５°＜φ≦１３５°の範囲であれば、反応液は廃液収容部１０６へ送出される。なお、反応液導入用流路１０５内の反応液は廃液収容部１０６へ送出されるが、反応容器１０４内の反応液は反応容器１０４内に留まる。

このように、反応液導入用流路１０５内の反応液を廃液収容部１０６に送出することにより、各反応容器１０４を分離することができる。

なお、図４（Ｃ）および図５（Ｃ）に示される状態で回転する際、予め反応液供給口１０９から、ピペット等を用いて反応液収容部１０７にミネラルオイルを供給しておくようにしてもよい。この状態でマイクロリアクターアレイ１０を回転させると、反応液導入用流路１０５にミネラルオイルが充填される。この時、反応液の比重がミネラルオイルよりも重いので、反応容器１０４内の反応液はミネラルオイルと入れ替わらない。これにより、個々の反応容器１０４を分離して、反応容器１０４間でのコンタミネーション（ある反応容器内の反応液が、他の反応容器へ混入することによって実験環境が汚染してしまうこと）を防止することができる。また、反応処理中に、反応容器１０４内が乾燥することを防止することもできる。なお、ミネラルオイルの代わりに反応液よりも比重が軽く、反応液と混和せず反応液よりも蒸発しにくい液体を用いても良い。また、一旦、図４（Ｃ）および図５（Ｃ）に示される状態で回転を行って反応液導入用流路１０５内の反応液を廃液収容部１０６に送出した後で、反応液収容部１０７にミネラルオイルを供給し、再度遠心装置５０を回転させてもよい。

以上のような手順でマイクロリアクターアレイ１０に反応液を供給した後、ＰＣＲ処理（生体試料反応処理）を行うことができる。具体的には、マイクロリアクターアレイ１０の開口部をシールした後、マイクロリアクターアレイ１０をサーマルサイクラーに設置してＰＣＲ処理を行う。一般的には、まず、９４℃で２本鎖ＤＮＡを解離させる工程を実行し、次に、プライマーを約５５℃でアニーリングする工程を実行し、次に耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを使用して約７２℃で相補鎖の複製を行う工程を含むサイクルを繰り返す。

ＰＣＲの後、蛍光顕微鏡を用いて個々の反応容器１０４内の蛍光強度を測定し、各反応容器１０４中の反応液に含まれる標的核酸の量を定量することができる。

以上のように、本実施形態に係るマイクロリアクターアレイ１０によれば、遠心力を利用して、反応液導入用流路１０５を通して反応容器１０４内に反応液を供給することにより、ピペットで定量することが難しい非常に少量の反応液での反応処理が可能となる。また、一度に多数の反応容器１０４内で処理を行うことができるため、多種類の検査等を効率よく行うことができる。

また、遠心力により、反応液導入用流路１０５と反応容器１０４に反応液を充填した後、遠心力の係る向きを変えて、再度遠心力により、反応液導入用流路１０５内の反応液を廃液収容部１０６に送出するようにしたので、反応処理時には個々の反応容器１０４を分離することができるため、反応容器間でのコンタミネーションを防ぐことができる。なお、本実施形態では、反応容器１０４に反応液を充填するのに遠心力を利用する例について示したが、遠心力の代わりに、毛管力やポンプによる圧力等を用いて充填するようにしてもよい。

なお、本実施形態では、マイクロリアクターアレイ１０をＰＣＲ反応用の反応装置として用いたが、マイクロリアクターアレイ１０は、他のＤＮＡ増幅反応（例えばランプ（LAMP）法）に利用することができる。

１．２．２．標的核酸の定量
本実施形態に係る生体試料定量方法はさらに、複数の反応容器１０４内で核酸増幅反応を行う工程と、各々の反応容器１０４内において、増幅された核酸の一部に結合した蛍光プローブが発する蛍光強度を測定する工程と、各々の反応容器１０４内で測定された蛍光強度および各々の反応容器１０４で用いた競合核酸の量に基づいて、上記式（１）で表される回帰曲線を求める工程と、回帰曲線に基づいて、検体に含まれる標的核酸の量を推定する工程と、を含む。

上述したように、反応容器１０４の表面には、既知量の競合核酸、プライマー、および蛍光プローブが配置されている。よって、反応容器１０４内で核酸増幅反応を行う工程では、反応容器１０４に予め配置された競合核酸と、反応容器１０４に導入された反応液に含まれる標的核酸とがともに反応容器１０４内で増幅される。

核酸増幅反応では、例えば、標的核酸および競合核酸の両方に蛍光プローブが結合することができ、さらに、蛍光プローブがどちらか一方と結合した際に蛍光の消光が発生するようにしておくことができる。この状態にて、各々の反応容器１０４から生じる蛍光強度を測定する。次いで、各々の反応容器１０４内で測定された蛍光強度および各々の反応容器１０４で用いた競合核酸の量に基づいて、上記式（１）で表される回帰曲線を求め、この回帰曲線に基づいて、検体に含まれる標的核酸の量を推定することができる。

上記式（１）における蛍光強度（Ｆ）は、蛍光プローブが発する蛍光強度そのものでもよいし、あるいは、（ｉ）核酸増幅反応の前に測定された蛍光強度と、核酸増幅反応の後に測定された蛍光強度との比（蛍光変化量）、または、（ｉｉ）核酸増幅後に増幅産物および蛍光プローブが解離する温度まで加熱した状態（核酸増幅反応後において蛍光プローブが増幅された核酸から解離している第１の状態）で測定された蛍光強度と、蛍光プローブが結合している温度（核酸増幅反応後において蛍光プローブが増幅された核酸の一部に結合している第２の状態）で測定された蛍光強度との比（蛍光変化量）であってもよい。

核酸増幅反応において得られるすべての増幅産物が標的核酸（Ｘ）を増幅したものである場合の蛍光変化量をＦｔとし、すべての増幅産物が競合核酸（Ｃ）を増幅したものである場合の蛍光変化量をＦｃとする。拡散増幅反応において競合核酸および標的核酸の両方が存在する場合、両方の増幅産物ができるため、そのときの蛍光変化量Ｆを以下の式（２）で表すことができる。

Ｆ＝ＦｔＸ／（Ｘ＋Ｃ）＋ＦｃＣ／（Ｘ＋Ｃ）
＝〔Ｘ（Ｆｔ−Ｆｃ）／（Ｘ＋Ｃ）〕＋Ｆｃ ・・・・・（２）

上記式（２）において、Ｃは反応容器１０４における競合核酸の量（反応容器１０４内のコピー数）、Ｘは反応容器１０４における標的核酸の量（反応容器１０４内のコピー数）である。上記式（２）から上記式（１）を導くことができる。

すなわち、同じ反応容器群に属する各々の反応容器１０４の蛍光変化量（Ｆ）を縦軸に、各々の反応容器１０４に含まれる競合核酸の量（ｌｏｇＣ）を横軸にしてグラフを描くことにより、上記式（１）に示される式で表される回帰曲線が得られる（例えば後述する図９参照）。この回帰曲線から上記式（１）におけるａ、ｂ、ｃの３つのパラメータが求められ、ｂの値が標的核酸の量に相当する。

蛍光プローブは、ＰＣＲ反応によって増幅された標的核酸の一部に結合し、標的核酸と競合核酸とを識別して蛍光変化を示すものであればよく、例えば、Ｔａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅ（登録商標）、Ｈｙｂ ｐｒｏｂｅ（登録商標）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）、Ｑ−Ｐｒｏｂｅ（登録商標）等を用いることができる。Ｑ−Ｐｒｏｂｅは、標識した蛍光色素にグアニン塩基が近づくと、発する蛍光が減少するという「蛍光消光現象」を利用して目的の遺伝子を検出するプローブである。

Ｑ−Ｐｒｏｂｅは蛍光標識されたシトシンを末端に有し、目的遺伝子に特異的に結合するような配列に設計されており、Ｑ−Ｐｒｏｂｅが目的遺伝子と結合すると、グアニンの影響を受けて蛍光が減少する。本実施形態に係る生体試料定量方法が、Ｑ−Ｐｒｏｂｅを用いた競合ＰＣＲ法を採用する場合、競合核酸が、Ｑ−Ｐｒｏｂｅの蛍光標識末端塩基に対応する塩基がグアニンであるとすると、標的核酸は、Ｑ−Ｐｒｏｂｅの蛍光標識末端塩基に対応する塩基がグアニン以外の塩基であることが必要である。これにより、Ｑ−Ｐｒｏｂｅが標的核酸および競合核酸をともに共増幅した際、競合核酸とＱ−Ｐｒｏｂｅとがハイブリダイズすると、標識蛍光色素の蛍光発光が減少（消光）する一方、標的核酸とＱ−Ｐｒｏｂｅとがハイブリダイズすると、標識蛍光色素の蛍光発光は減少しない。なお、上記の説明については標的核酸と競合核酸とを入れ替えても成立する。従って、Ｑ−Ｐｒｏｂｅが標的核酸または競合核酸のどちらと結合した際に蛍光の消光が発生するかを選択することができる。

本実施形態に係る生体試料定量方法では、マイクロリアクターアレイ１０の複数の反応容器群を用いて、１つの検体から多数の検査項目を定量することができる。このような定量としては、例えば、食中毒の原因菌の遺伝子検査（より具体的には、食品中の病原微生物の検査や、食中毒患者から採取した検体（糞便）中の病原微生物の検査）が挙げられる。

この場合、各反応容器群を構成する反応容器１０４で使用する標的核酸を、食中毒の原因菌となりうる病原微生物の遺伝子とし、これらの標的核酸に対応する競合核酸を設定し、各反応容器群に配置する。各反応容器群で異なる原因菌を定量することができる。食中毒の原因菌としては、例えば、カンピロバクター、サルモネラ、緑膿菌、病原性大腸菌Ｏ−１５７、黄色ブドウ球菌等が挙げられる。そして、上記の各標的核酸および競合核酸に対応するように設計した蛍光プローブ（例えばＱ−Ｐｒｏｂｅ）を各反応容器群を構成する反応容器１０４に配置し、上述した定量方法にしたがって各標的核酸の定量を行う。これにより、一つの検体から多項目の標的核酸の定量を一度に容易に行うことができる。

２．実施例
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されない。

本実施例では、蛍光プローブとしてＱ−Ｐｒｏｂｅ（Kurata et al., Nucleic acids Research, 2001, vol.29, No.6 e34）を用いた場合を例にとり、図１に示されるマイクロリアクターアレイ１０を用いてＰＣＲ法により検体中の標的核酸を定量する方法について説明する。

Ｑ-Ｐｒｏｂｅは、結合した核酸に含まれるグアニンと相互作用して著しく蛍光が消光する。よって、標的核酸および競合核酸の両方にＱ-Ｐｒｏｂｅが結合できるようにし、さらに、Ｑ-Ｐｒｏｂｅがどちらか一方と結合した際に蛍光の消光が発生するようにしておくことにより、既知の競合核酸の量に対する標的核酸の相対量を推定することができる。

標的核酸および競合核酸はＪ−Ｂｉｏ２１（株）から購入した。また、バッファーとして、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ：８．３）、ＫＣｌ：５０ｍＭ、ＭｇＣｌ_２：１．５ｍＭの混合液を使用した。

図６に、標的核酸とおよび競合核酸の配列例を示す。下線を引いた部分にＱ-Ｐｒｏｂｅが結合する。図６に示されるように、蛍光プローブの結合部分（下線部分）の直後が、標的核酸は「ＴＴＴＴ」、競合核酸は「ＧＧＧＴ」となっている。したがって、Ｑ-Ｐｒｏｂｅは競合核酸と結合した際に、結合部分のグアニン（Ｇ）と反応するため、蛍光が消光する。

図１に示されるマイクロリアクターアレイ１０の反応容器１０４の表面に、図７に示される配列を有するプライマーおよび図８に示される配列を有する蛍光プローブ（Ｑ−Ｐｒｏｂｅ）を予め塗布して真空乾燥することにより、プライマーおよび蛍光プローブを反応容器１０４の表面に配置した。Ｑ−Ｐｒｏｂｅ（J-Bio21（株）から購入）は、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ社製）を用いて蛍光標識したものを使用した。

また、反応容器列Ａ〜Ｆの反応容器１０４の表面にそれぞれ、異なる既知量の競合核酸を予め塗布して真空乾燥して配置させた。表１に、反応容器群Ａ〜Ｆの各反応容器１０４に配置された競合核酸の量（コピー数）を示す。

続いて、標的核酸を含む反応液を反応容器１０４に充填し、サーマルサイクラー（Ｍａｓｔｅｒ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）、Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０（ロシュ ダイアグノスティクス社））でＰＣＲを行った。係る反応液は、ライトサイクラー４８０ジェノタイピングマスターおよびウラシルＤＮＡグルコシラーゼ（ロシュ ダイアグノスティクス社から購入）を含む。４つのマイクロリアクターアレイ１０を用意し、標的核酸の量（コピー数）が異なる４つのサンプル１〜４を調製して、定量精度の確認を行った（表２）。蛍光測定は、室温で増幅反応の前後に測定し、さらに、増幅反応後には、６０℃と９５℃で実施した。

反応容器列Ａ〜Ｆでは、競合核酸の量が異なるため、サンプル１〜４それぞれについて、各反応容器１０４の蛍光変化量（Ｆ）を縦軸に、競合核酸の量（ｌｏｇＣ）を横軸にして得られたグラフが図９である。係るグラフにおいて、サンプル１〜４それぞれについて回帰曲線を求め、これらの回帰曲線に基づいて、上記式（１）におけるａ、ｂ、ｃの３つのパラメータが求められ、ｂの値が標的核酸の量に相当する。図９および上記式（１）から、サンプル１〜４におけるｂの値（標的核酸の量）はそれぞれ４０コピー、８５０コピー、９２１０コピー、８９７００コピーと算出された。

なお、本実施例では、１種類の標的核酸の定量結果を示したが、上述したように、反応容器群ごとに、異なる標的核酸および該標的核酸を増幅・定量するための試薬（プライマー、蛍光プローブ）を導入することにより、１つのマイクロリアクターアレイ１０において、異なる複数の標的核酸の定量を行うことができる。

以上のように、本実施例に係るマイクロリアクターアレイ１０によれば、同じ反応容器群に含まれる複数の反応容器１０４各々において、異なる既知量の競合核酸を用いて核酸増幅反応（ＰＣＲ）を行い、増幅された核酸の一部に結合した蛍光プローブが発する蛍光強度を測定することにより、各々の反応容器１０４内で測定された蛍光強度および各々の反応容器１０４で用いた競合核酸の量に基づいて、蛍光変化量Ｆと検体中の競合核酸の量（ｌｏｇＣ）との関係を上記式（１）で表される回帰曲線として求め、係る回帰曲線に基づいて、検体に含まれる標的核酸の量を推定することができる。これにより、標的核酸の定量を高精度でかつ効率良く行うことができる。

本発明に係る実施の形態の説明は以上である。本発明は、実施の形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法および結果が同一の構成、あるいは目的および結果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成または同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。

１０…マイクロリアクターアレイ、５０…遠心装置、５１…ホルダ、５２…回転モータ、１０１，１０２，１０３…透明基板、１０４…反応容器、１０５…反応液導入用流路、１０６…廃液収容部、１０７…反応液収容部、１０８…流路、１０９…反応液供給口、２０１，２０２，２０３，２０４，２０５，２０６…反応容器群、Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ…反応容器列

Claims (8)

1. 検体に含まれる標的核酸の定量に使用する生体試料定量用チップであって、
   複数の反応容器を含み、
   前記複数の反応容器は、
   前記標的核酸と共通のプライマーで増幅可能であって、該標的核酸とは異なる配列を有する既知量の競合核酸と、
   前記標的核酸および前記競合核酸に共通のプライマーと、
   前記標的核酸および前記競合核酸の増幅産物の一部に結合し、該標的核酸の増幅産物と該競合核酸の増幅産物とが異なる蛍光変化を示す蛍光プローブと、
   を含み、
   各々の前記反応容器に含まれる前記競合核酸の量が異なる、生体試料定量用チップ。
2. 請求項１において、
   前記複数の反応容器に接続された反応容器導入流路と、
   前記反応液導入用流路に接続された反応液収容部と、
   廃液収容部と、
   をさらに含む、生体試料定量用チップ。
3. 請求項１または２において、
   前記複数の反応容器から構成される反応容器群を複数含み、
   １の反応容器群を構成する前記複数の反応容器には、同一の標的核酸を増幅させる同一のプライマーが配置され、
   別の１の反応容器群を構成する前記複数の反応容器には、前記１の反応容器群を構成する反応容器にて増幅される標的核酸とは異なる標的核酸を増幅させる、異なるプライマーが配置されている、生体試料定量用チップ。
4. 検体に含まれる標的核酸の定量に使用する生体試料定量用チップであって、
   第１の反応容器と、
   第２の反応容器と、
   を備え、
   前記第１の反応容器は、
   前記標的核酸を増幅させるプライマーと、
   前記プライマーで増幅可能であって、該標的核酸とは異なる配列を有する第１の量の競合核酸と、
   前記標的核酸および前記競合核酸の増幅産物の一部に結合し、該標的核酸の増幅産物と該競合核酸の増幅産物とが異なる蛍光変化を示す蛍光プローブと、
   を含み、
   前記第２の反応容器は、
   前記第１の量とは異なる第２の量の前記競合核酸と、
   前記プライマーと、
   前記蛍光プローブと、
   を含む、生体試料定量用チップ。
5. 請求項１ないし３のいずれか１項に記載の生体試料定量用チップを用いて、検体に含まれる標的核酸の定量を行う生体試料定量方法であって、
   前記複数の反応容器にそれぞれ検体を導入する工程と、
   前記複数の反応容器内で核酸増幅反応を行う工程と、
   各々の前記反応容器内において、増幅された核酸の一部に結合した前記蛍光プローブが発する蛍光強度を測定する工程と、
   各々の前記反応容器内で測定された前記蛍光強度および各々の前記反応容器で用いた前記競合核酸の量に基づいて、下記式（１）で表される回帰曲線を求める工程と、
   前記回帰曲線に基づいて、前記検体に含まれる標的核酸の量を推定する工程と、
   を含む、生体試料定量方法。
   Ｆ＝ａ／（Ｃ＋ｂ）＋ｃ ・・・・・（１）
   （式中、Ｆは蛍光強度を示し、Ｃは競合核酸の量を示し、ｂは検体に含まれる標的核酸の量を示し、ａおよびｃは所定の値を示す。）。
6. 請求項５において、
   前記回帰曲線を求める工程では、前記核酸増幅反応の前に測定された蛍光強度と、前記核酸増幅反応の後に測定された蛍光強度との比と、各々の前記反応容器で用いた前記競合核酸の量との関係に基づいて該回帰曲線を求める、生体試料定量方法。
7. 請求項６において、
   前記回帰曲線を求める工程では、前記核酸増幅反応後において前記蛍光プローブが増幅された核酸の一部に結合している第１の状態で測定された蛍光強度と、前記核酸増幅反応後において前記蛍光プローブが増幅された核酸から解離している第２の状態で測定された蛍光強度との比と、各々の前記反応容器で用いた前記競合核酸の量との関係に基づいて該回帰曲線を求める、生体試料定量方法。
8. 検体に含まれる標的核酸の定量に使用する生体試料定量用チップを用いて、前記検体に含まれる標的核酸の定量を行う生体試料定量方法であって、
   前記生体試料定量用チップは、第１の反応容器と第２の反応容器とを備え、前記第１の反応容器は、前記標的核酸を増幅させるプライマーと、前記プライマーで増幅可能であって、該標的核酸とは異なる配列を有する第１の量の競合核酸と、前記標的核酸および前記競合核酸の増幅産物の一部に結合し、該標的核酸の増幅産物と該競合核酸の増幅産物とが異なる蛍光変化を示す蛍光プローブと、を含み、前記第２の反応容器は、前記第１の量とは異なる第２の量の前記競合核酸と、前記プライマーと、前記蛍光プローブとを含み、
   前記第１および第２の反応容器に前記検体を導入することと、
   前記第１および第２の反応容器で核酸増幅反応を行うことと、
   前記第１および第２の反応容器において、増幅された核酸の一部に結合した前記蛍光プローブが発する蛍光強度を測定することと、
   前記第１および第２の反応容器で測定された前記蛍光強度並びに前記第１および第２の反応容器に含まれる前記競合核酸の量に基づいて、下記式（１）で表される回帰曲線を求めることと、
   前記回帰曲線に基づいて、前記検体に含まれる標的核酸の量を推定することと、
   を含む、生体試料定量方法。
   Ｆ＝ａ／（Ｃ＋ｂ）＋ｃ ・・・・・（１）
   （式中、Ｆは前記蛍光強度を示し、Ｃは前記競合核酸の量を示し、ｂは前記検体に含まれる前記標的核酸の量を示し、ａおよびｃは所定の値を示す。）。

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