JP2010535020A - 頚動脈小体由来の幹細胞及びその使用 - Google Patents

Abstract

表現型マーカーＧＦＡＰ（グリア線維酸性タンパク質）が陽性であり、表現型マーカーＴＨ（チロシンヒドロキシラーゼ）及びネスチンが陰性であることを特徴とする、頚動脈小体から得られる成体幹細胞が記載されている。これらの幹細胞は、増殖、自己複製、並びに前駆細胞及び分化細胞への分化を起こすことができる。任意の方法によって増殖した前記幹細胞、前駆細胞、及び分化細胞は、アルツハイマー病又はパーキンソン病などの神経変性疾患の治療に用いることができる。

Description

本発明は、頚動脈小体（ＣＢ）由来の幹細胞の単離及び特徴づけ、それらの増殖及び分化のための方法、並びに研究と治療の両方における、例えば、アルツハイマー病又はパーキンソン病などの神経変性疾患の治療におけるそれらの潜在的な適用に関する。

神経伝達物質、神経調節物質、又は酵素を分泌する神経系細胞又は神経傍細胞は、薬物療法の代替として、神経変性疾患の治療に用いられている。これらの細胞は、今までのところ成果は限られているが、臨床研究に実験的に用いられている。

１９７０年代の終わりと１９８０年代の初めにおいて、ドーパミン分泌性クロム親和性細胞を有する副腎髄質の線条体内移植の有益な効果が、ラットのパーキンソン病の実験モデルにおいて観察された。

パーキンソン病患者における神経傍副腎髄質自家移植片の治療効果は、１９８０年代に調べられた。これらの移植片は、ほとんど機能性も初期拒絶も示さなかった。齧歯類のパーキンソン病の実験モデルを用いての胎児の黒質から得られる神経系細胞の移植片の有益な効果が、１９８０年代の初めに観察された。これらの移植片の機能性及び生存は、クロム親和性副腎細胞の移植片のそれよりも良いが、それらの臨床使用は、倫理的又は法的基準のために特定の国だけに限定される。さらに、患者における二重盲検試験で得られた結果は、予想よりも好ましくなく、場合によっては、胎児細胞の移植が、望ましくない運動合併症を生じる。非ヒトの、例えば、ブタ由来の黒質の胎児細胞での異種移植片の使用が、臨床的に試験されている。しかしながら、このテクノロジーは、強い免疫学的拒絶及び種間の感染性病原体の移行の恐れなどのいくつかの非常に重要な制限を有する。

頚動脈小体は、頚動脈の分岐部近くに位置する化学受容器及び支持細胞の小さなクラスターである。それは、２つの細胞型：Ｉ型（グロムス）細胞及びＩＩ型（支持）細胞で構成されている。グロムス細胞は、神経冠由来であり、その神経冠は、神経外胚葉由来である。それらは、呼吸中枢へ導くシナプス形成ニューロンにおける興奮性シナプス後電位を引き起こす、アセチルコリン、ＡＴＰ、及びドーパミンを含む様々な神経伝達物質を放出する。ＩＩ型細胞は、グリアに似ており、グリアのマーカーＳ１００を発現し、支持細胞として機能する。

１９９０年代の終わりに、パーキンソン病の治療で、齧歯類のその疾患モデルにおいて、頚動脈小体グロムス細胞の凝集物を発生させた（Ｅｓｐｅｊｏら、１９９８；Ｎｅｕｒｏｎ ２０、１９７〜２０６）。後で、その技術が霊長類モデルにおいて可能であることが確認された（Ｌｕｑｕｉｎら、１９９９；Ｎｅｕｒｏｎ ２２、７４３〜７５０）。最後に、パーキンソン病患者での最初の臨床試験が行われ（Ａｒｊｏｎａら、２００３；Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ ５３、３２１〜３２８）、可能性が高い主な原因として、移植のために入手できるグロムス組織の量が少ないために、改善は常に部分的であった。

幹細胞の適用からのドーパミン作動性細胞の再生能の原理に基づく細胞療法は、神経変性疾患の治療に有望な治療経路を表す。この分野における研究の主な目的の１つは、神経変性疾患の治療において安全且つ効果的に適用することができる幹細胞の最良の型を同定することである。神経変性疾患の治療に適した幹細胞の型は、完全に機能する特定の細胞（例えば、ドーパミン作動性細胞）に分化する能力、神経組織内への組込み能力、及び必要というわけではないが、場合により、隣接細胞と電気化学的接触を確立する能力と共に、十分な増殖能を有するべきであり、最後に、その適用は、免疫学的拒絶の問題によっても倫理規定によっても制限されるべきではない。

これに関連して、米国特許出願ＵＳ２００３／００９５９５６は、神経変性疾患、例えば、パーキンソン病の治療に有用の可能性がある、マウス胎児脳及び線条体から、並びに幼若及び成体マウス脳組織から得られる、ＧＦＡＰ−／ネスチン＋表現型を有する細胞を含む未分化神経系細胞集団の使用を記載する。しかしながら、これらの細胞は、本発明により提供されるネスチン＋細胞とは異なるが、これは、後者が、頚動脈小体に由来し（且つ、脳にも線条体にも由来しない）、且つ脳又は線条体から単離されたネスチン＋前駆体は有しない性質である、グロムス細胞（ＴＨ＋、並びに低酸素及び低血糖に感受性がある）に分化する性質を示すからである。さらに、国際特許出願ＷＯ００／２９５４９は、神経冠（ＮＣＳＣ）由来の幹細胞を培養する方法であって、低酸素条件下で前記ＮＣＳＣを培養することを含む方法を記載する；前記ＮＣＳＣは、神経伝達物質の欠乏に関連した神経変性疾患、例えば、パーキンソン病又はアルツハイマー病の治療に有用の可能性がある。本発明により提供される細胞は、前記特許出願ＷＯ００／２９５４９に定義されたものとは異なる細胞である；さらに、低酸素がインビボでのＣＢの成長を刺激することがずっと以前から知られているため、本発明において、ＣＢ由来の細胞の増殖を刺激するために低酸素が用いられる。

細胞療法による神経変性疾患の治療の理解においてかなりの進展があったが、前記神経変性疾患の治療に安全且つ効果的に用いることができる成体幹細胞集団は見出されていない。前記細胞集団は、神経変性疾患により引き起こされる損傷を修復するための単純且つ効果的な方法を提供するものと考えられる。したがって、既存の治療の効力を改善すること、並びに神経変性疾患により引き起こされる損傷を修復することができる代替法を探索することがまだ必要とされている。

加えて、異なる適用を目的とする細胞型を発生させるために成体幹細胞を単離、培養、維持、増殖、及び分化することの必要性もまだある。前記適用は、疾患、例えば、神経変性疾患、心臓疾患などを治療するための自己幹細胞の使用を含み得る。

さて、驚くべきことに、本発明者らは、成体末梢神経系（ＰＮＳ）において、より具体的には、頚動脈小体（ＣＢ）において、幹細胞の存在を発見した。前記成体幹細胞は、当初考えられ得たことに反して、グロムス細胞（又はＩ型細胞）ではなく、支持細胞又はＩＩ型細胞である。本記載の実施例に示されているように、前記成体幹細胞は、分裂する能力（増殖）、長期にわたる細胞分裂によって自分自身を再生する能力（自己複製）、及び、特定の生理学的又は実験的条件下で誘導されて他の型の特定の分化細胞に分化する能力（分化）を有する。さらに、栄養因子、神経伝達物質、神経調節物質、酵素などを発現及び分泌する能力がある細胞凝集物を得ることを可能にする、ＣＢの増殖のためのインビトロ方法を本発明者らは開発した。前記成体幹細胞又は前記増殖方法によって得られる細胞凝集物での移植は、臨床診療、特に、神経変性疾患の治療において有用であり得る。

背景技術ですでに述べられているように、神経変性疾患の治療のための頚動脈小体から得られる細胞での自家移植は、変性疾患の治療に用いられているが、これは、これらの病態において、いくつかの分子（例えば、神経伝達物質、成長因子など）の欠乏を、前記分子を発現及び分泌する能力がある細胞を移植することで代償できることが知られているためである。どんな場合であれ、ＣＢから得られるグロムス細胞での自家移植は、アルツハイマー病又はパーキンソン病などの疾患によって引き起こされる損傷を緩和するには不十分であるとわかり、したがって、前記治療を改善すること、又はそれらに代わるものを見出すことが必要である。以下に詳細に記載された実験により、本発明により提供される方法によって得られるグロムス細胞は、より大量のその細胞を得ることができることに加え、現在、存在しているＣＢ由来の細胞の自家移植片による治療方法を改善することを可能にすることが示されている。

したがって、一態様において、本発明は、表現型マーカーＧＦＡＰ（グリア線維酸性タンパク質；ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅＩＤ２６７０）が陽性であり、表現型マーカーＴＨ（チロシンヒドロキシラーゼ；ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅＩＤ：７０５４）及びネスチン（ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅＩＤ：１０７６３）が陰性であることを特徴とする、以下「本発明の幹細胞」と称する、ＣＢから得られる単離された成体幹細胞に関する。

別の態様において、本発明は、表現型マーカーネスチンが陽性であることを特徴とする、以下「本発明の前駆細胞」と称する、前記の本発明の幹細胞由来の単離された成体前駆細胞に関する。特定の実施形態において、前記の本発明の前駆細胞は、表現型マーカーＧＦＡＰがわずかに陽性又は弱陽性であり、表現型マーカーネスチンが陽性である。別の特定の実施形態において、前記の本発明の前駆細胞は、表現型マーカーＧＦＡＰが陰性であり、表現型マーカーネスチンが陽性である。

別の態様において、本発明は、表現型マーカーネスチンが陰性であり、特殊分化マーカーが陽性であることを特徴とする、以下「本発明の分化細胞」と称する、前記細胞型のいずれか由来（即ち、本発明の幹細胞由来、又は本発明の前駆細胞由来）の成体分化細胞に関する；特定の実施形態において、前記特殊分化マーカーはチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）又は平滑筋アクチン（ＳＭＡ）である。

別の態様において、本発明は、以下「本発明の不死化細胞」と称する、可逆的に不死化した細胞に関し、前記細胞は、本発明の幹細胞、本発明の前駆細胞、又は本発明の分化細胞である。

別の態様において、本発明は、本発明の幹細胞、本発明の前駆細胞、本発明の分化細胞、本発明の不死化細胞、及びそれらの組合せを含む群から選択される細胞のセットを含む、以下「本発明の細胞集団」と称する、ＣＢ由来の単離された細胞集団に関する。

別の態様において、本発明は、神経冠に特異的な培地中、低酸素条件下で、前記の本発明の幹細胞又は前駆細胞を培養することを含む、前記の本発明の幹細胞又は前記の本発明の前駆細胞の増殖のための方法に関する。

別の態様において、本発明は、治療有効量の前記の本発明の幹細胞、前駆細胞、若しくは分化細胞、若しくはそれらの組合せ、又は前記の本発明の不死化細胞、又は前記の本発明の細胞集団、及び薬学的に許容される賦形剤を含む、以下、本発明の薬学的組成物と称する、薬学的組成物に関する。

別の態様において、本発明は、神経変性疾患の治療のための薬学的組成物の開発、例えば、アルツハイマー病の治療、パーキンソン病の治療、神経系の虚血性病変の治療、神経系の外傷性病変の治療、又は神経系の自己免疫性病変の治療における、前記の本発明の幹細胞、前駆細胞、若しくは分化細胞、若しくはそれらの組合せ、又は前記の本発明の不死化細胞、又は前記の本発明の細胞集団の使用に関する。

別の態様において、本発明は、治療有効量の前記の本発明の幹細胞、前駆細胞、若しくは分化細胞、若しくはそれらの組合せ、又は治療有効量の前記の本発明の不死化細胞、又は治療有効量の前記の本発明の細胞集団、好ましくは、本発明の分化細胞、特に、好ましくはニューロスフェアの形をとる、グロムス細胞（ネスチン−／ＴＨ＋）を、前記疾患に冒された領域に移植すること（ｇｒａｆｔｉｎｇ）（移植すること（ｉｍｐｌａｎｔｉｎｇ）、又は移植すること（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｎｇ））を含む、疾患、好ましくは、神経変性疾患、又は神経系の虚血性、外傷性、若しくは自己免疫性病変によって引き起こされた疾患の治療の方法に関する。

別の態様において、本発明は、潜在的な治療用化合物に対する細胞応答のインビトロ評価のための方法であって、本発明の幹細胞、前駆細胞、若しくは分化細胞、若しくはそれらの組合せ、及び／又は本発明の不死化細胞、及び／又は本発明の細胞集団を含む培養物を、潜在的な治療用化合物と接触させる段階と、前記培養物に存在する細胞に前記化合物によって引き起こされる効果を評価する段階とを含む方法に関する。

別の態様において、本発明は、ＧＤＮＦの製造のための、前記の本発明の幹細胞、前駆細胞、若しくは分化細胞、若しくはそれらの組合せ、又は前記の本発明の不死化細胞、又は前記の本発明の細胞集団の使用に関する。

成体頚動脈小体における長期低酸素により誘導された神経発生を示す図である。ＢｒｄＵで処理され、且つ長期低酸素（１０％Ｏ_２）に曝されたマウスから単離された頚動脈小体の免疫組織化学的分析。パネルＡは、低酸素刺激（２１日間）に応答した、ニューロンのＴＨ＋グロムス細胞の塊の典型的成長を示す。パネルＢは、７日間の低酸素後の増殖性細胞におけるＢｒｄＵの取り込み、及び結果として生じた、分化した子孫のマーキングを示す。ＴＨ染色はグロムス細胞を示し、ＢｒｄＵでの染色は増殖性細胞を示し、ＤＡＰＩ蛍光は核を示す。パネルＣ：長期低酸素に曝された動物における時間（横軸）の関数としての、細胞数及び頚動脈小体の実質の容積（縦軸）における変動。パネルＤ：１カ月間、正常酸素圧（２１％Ｏ_２）に戻した動物における頚動脈小体の成長の可逆性。棒グラフは、再正常酸素圧の頚動脈小体におけるＴＨ＋細胞の数及びＴＨ且つＢｒｄＵ二重陽性細胞の数の定量化を正常酸素圧と低酸素の値と比較する（＊正常酸素圧で有意に異なる、ｐ＜０．０１；＃低酸素で有意に異なる、ｐ＜０．０５）。パネルＥ及びＦは、異なる倍率における、再正常酸素圧の頚動脈小体の切片の例を示し、グロムス細胞の約半分が、新しい細胞に取って代わられていることを示している。スケール：パネルＡ、Ｂ、及びＥにおいて５０ミクロン、パネルＦにおいて１０ミクロン。 既存の、及び新しく形成されたＴＨ＋グロムス細胞の神経冠（ＮＣ）の起源を示す図である。パネルＡ：ｌｏｘＰ隣接Ｗｎｔ１−ｃｒｅ／ＬａｃＺトランスジェニックマウスを用いる頚動脈小体における神経冠由来細胞の調査のためのストラテジー。この動物モデルにおいて、Ｗｎｔ１が陽性である細胞及びすべてのそれらの誘導体は、ガラクトシダーゼを発現し、したがって、Ｘ−ｇａｌでの染色後、青色沈殿物を示す（パネルＢにおける矢じり印）。パネルＣ：Ｂに示された同じ切片中のＴＨ、ＢｒｄＵ、及び核（ＤＡＰＩ）の免疫組織化学的検出。パネルＤは、２つの画像の複合版を示し、ＢｒｄＵ陽性及びＢｒｄＵ陰性の両方のグロムス細胞が神経冠由来であることを示す。黒色矢じり印にマークされたＢｒｄＵ＋、ＴＨ−、及びＬａｃＺ＋細胞は、一過性増幅性前駆体を表し得る。スケール：１０ミクロン。 インビトロでの頚動脈小体由来の幹細胞のニューロスフェアの形成及び多能性を示す図である。パネルＡ：１０日間の培養後に生じたニューロスフェアの明視野写真。細部は、ニューロスフェアに現れる典型的な肥厚部又は糸球体（矢じり印）の例を示す。パネルＢは、ニューロスフェアの薄切片の免疫組織化学的分析を示し（左側の明視野）、ニューロスフェアの核におけるネスチン＋前駆体の存在、及び糸球体におけるＴＨ＋グロムス細胞の存在を示している（右）。パネルＣは、多数の分化したＴＨ＋細胞を含む２つの長い糸球体を有する、かなり成長している（２０日間の培養）ニューロスフェアを示す。パネルＤは、接着性基質上にニューロスフェアを再び蒔いた後の、頚動脈小体前駆体の平滑筋細胞（ＳＭＡ＋）への分化を示す。パネルＥは、より高い倍率における、Ｄの四角形の領域の画像を示す。コロニーの中心におけるＴＨ＋グロムス細胞の存在に注目されたい。スケール：パネルＡ及びＥにおいて１００ミクロン、パネルＢ及びＣにおいて５０ミクロン、パネルＤにおいて１ｍｍ。 頚動脈小体由来の幹細胞の同定を示す図である。パネルＡ：時間の関数としてのラット頚動脈小体のニューロスフェアのインビトロでの形成。グロムス細胞（ＴＨ＋）の出現より、ネスチン＋前駆体からなるニューロスフェアの核の形成が先行する。パネルＢは、マーカーとしてＨＮＫ−１及びｐ７５を用いる頚動脈小体の細胞のフローサイトメトリ分析を示す。二重陰性細胞（選択ウィンドウ＃３）のみが、培養中、成長し、ニューロスフェアを形成する能力があった。ＨＮＫ−１（ウィンドウ＃１）とｐ７５＋（ウィンドウ＃２）の分離は、常にネガティブな結果を生じた。パネルＣは、ＨＮＫ−１＋細胞がすべて、ＴＨ＋グロムス細胞であったことを示す。パネルＤにおいて、正常酸素圧、低酸素、及び再正常酸素圧のマウスの頚動脈小体におけるグリアＧＦＡＰマーカー及びＢｒｄＵの免疫組織化学的検出を見ることができる。ＧＦＡＰでの染色の消失及びその後の出現は、低酸素によって活性化されたＩＩ型グリア細胞が、頚動脈小体の前駆細胞であることを示唆すると考えられる。スケール：パネルＡ及びＤにおいて５０ミクロン、パネルＣにおいて１０ミクロン。 低酸素に応答して、ＩＩ型グリア細胞がＩ型神経細胞に分化することを示す図である。パネルＡ：グロムス細胞への分化能を有する頚動脈小体前駆体のグリア系譜を試験するためのストラテジー。低酸素に曝されたｌｏｘＰ隣接ＧＦＡＰ−ｃｒｅ／ＬａｃＺトランスジェニックマウスの頚動脈小体の免疫組織化学的分析を、ＬａｃＺ＋として現れたＩＩ型細胞由来の誘導体を調査するために用いた。パネルＢ：トランスジェニック且つ低酸素の頚動脈小体の薄切片のＸ−ｇａｌ染色であり、２つの異なる細胞における青色沈殿物（矢じり印）の存在を示す。パネルＣは、ＴＨ、ＢｒｄＵ、及び核の免疫組織化学的検出を示す。パネルＤにおける２つの画像の重ね合わせ（併合）は、この糸球体における２つの新しく形成されたグロムス細胞がＩＩ型ＧＦＡＰ＋細胞由来であることを示す。スケール：１０ミクロン。 インビトロで幹細胞から発生したグロムス細胞が、成熟した化学受容器及び電気生理学的応答を示す図である。パネルＡ：ニューロスフェアから分離されたグロムス細胞（ＴＨ＋）群、及び単細胞からのカテコールアミン作動性分泌を記録するために用いられた炭素繊維電極の概略図。パネルＢ：低酸素（１４５ｍｍＨｇから１５ｍｍＨｇまでのＯ_２分圧の変化）又は低血糖（５ｍＭグルコースから０グルコースまでの変化）などの生理的刺激に応答した、培養中のグロムス細胞群から得られた典型的な電流測定記録。それぞれの電流測定スパイクは、単一の開口分泌事象を表す。パネルＣ：Ｏ_２及びグルコースのレベルの降下によって誘導される分泌速度の定量的概要。パネルＤは、ニューロスフェアの糸球体に存在するグロムス細胞から記録された電位開口型流入（カルシウム）及び流出（カリウム）での典型的なパッチクランプ記録を示す。パネルＥは、カリウム流束の対応する電流／電位曲線を示し、パネルＦは、カリウムチャネルを細胞内セシウムで遮断した後に得られたカルシウム流束でのパッチクランプ記録を示す。インビボの成熟グロムス細胞において記載されたものと非常に類似した、これらの電気生理学的細胞性質が、これらの化学受容細胞における開口分泌の制御に必須であることに留意されたい。パネルＡにおけるスケール：２０ミクロン。 新しく形成されたグロムス細胞がインビボでＧＤＮＦを産生することを示す図である。長期低酸素に曝されたヘテロ接合性ＧＤＮＦ／ＬａｃＺマウスの頚動脈小体の免疫組織化学的分析を、新しく形成されたグロムス細胞におけるＧＤＮＦの産生を観察するために行った。パネルＡは、Ｘ−ｇａｌで染色されたこれらの頚動脈小体の１つの薄切片の、低倍率での画像を示す。上頚神経節（ＳＣＧ）及び内頚動脈（ＩＣＡ）の位置もまた示されている。頚動脈小体におけるＸ−ｇａｌの沈着物の濃度に注目されたい。パネルＢは、Ａにおける四角形の領域の、より高倍率での画像を示し、ガラクトシダーゼの発現、したがって、ＧＤＮＦの産生を示す、２つの明るい青色の沈殿物（矢じり印）を有する。パネルＣ：同じ切片におけるＴＨ、ＢｒｄＵ、及び核の免疫組織化学的検出。パネルＤにおける画像の重ね合わせ（併合）は、沈殿物（矢じり印）が新しく形成されたグロムス細胞におけるＧＤＮＦの産生に対応することを示す。スケール：パネルＡにおいて５０ミクロン、パネルＢ、Ｃ、及びＤにおいて１０ミクロン。 成体頚動脈小体における神経発生のモデルを示す図である。上端。血管及びそれを取り囲む求心性神経線維を有する頚動脈小体糸球体の概略図。グロムス神経細胞は、ＩＩ型グリア細胞によって囲まれている。低酸素によって活性化された一過性増幅性前駆体もまた示されている。下端。低酸素／再正常酸素圧のサイクル中に頚動脈小体で起こる仮説上の一連の細胞事象。 頚動脈小体のＧＦＡＰ＋幹細胞から始まるニューロスフェアの形成及び多能性を示す図である。（Ａ）左：ｌｏｘＰ隣接ＧＦＡＰ−ｃｒｅ／ＬａｃＺマウスの頚動脈小体から分散したＧＦＡＰ＋、Ｘ−ｇａｌ＋細胞から生じたニューロスフェアの明視野写真。右：ＴＨ＋細胞（矢じり印）の免疫組織化学的同定。（Ｂ）の拡大画像は、ＴＨ＋細胞（矢じり印）におけるＸ−ｇａｌの沈着物の局在を示す。（Ｃ）左：接着性基質上で培養されたＧＦＡＰ＋、Ｘ−ｇａｌ＋細胞からのニューロスフェアの明視野写真。右：ＴＨ＋細胞（矢じり印）の免疫組織化学的同定。（Ｄ）の拡大画像は、ＳＭＡ＋平滑筋細胞におけるＸ−ｇａｌの沈着物の局在を示す。スケール：パネル（Ａ）において１０ミクロン、パネル（Ｂ）及び（Ｄ）において５ミクロン、パネル（Ｃ）において５０ミクロン。 インビボでの低酸素／再正常酸素圧への曝露中の頚動脈小体の前駆体の定量的分析を示す図である。（Ａ〜Ｃ）正常酸素圧下、又は低酸素（１６日間）／再正常酸素圧（１８日間）のサイクルに曝されたラットの頚動脈小体におけるＧＦＡＰ＋、ネスチン＋細胞（矢じり印）、及びＧＦＡＰ弱、ネスチン＋の代表的例。スケール：パネル（Ａ）及び（Ｃ）において５ミクロン、（Ｂ）において１０ミクロン。（Ｄ）実験中の頚動脈小体の様々な細胞型の量の変化を示す定量的グラフ。ＧＦＡＰ＋及び／又はネスチン＋細胞のカウントについては、頚動脈小体を分散させ、細胞を、培養液に蒔いたすぐ後に、免疫組織化学的分析のために固定した。ＩＩ型ＧＦＡＰ細胞が組織スライス内で同定することが困難であり、さらに、ネスチンでの染色もまた分散した細胞中の方がうまく機能するため、この手順は必要であった。低酸素下でのＧＦＡＰ＋細胞の顕著な減少、及びネスチン＋細胞の平行した増加に注目されたい。再正常酸素圧中、逆転現象が起きる（ＧＦＡＰ＋細胞集団の回復、及びネスチン＋細胞の数の減少）。（Ｅ）低酸素中の頚動脈小体のＧＦＡＰ＋又はネスチン＋前駆体の増殖。３つの独立した実験に基づいて計算された細胞数の平均値は以下である：正常酸素圧（１１１個のＧＦＡＰ＋細胞のうち３．６％ＧＦＡＰ＋、ＢｒｄＵ＋；６９個のネスチン＋細胞のうち５．７％ネスチン＋、ＢｒｄＵ＋）、低酸素６日間（３０個のＧＦＡＰ＋細胞のうち２９．４％ＧＦＡＰ＋、ＢｒｄＵ＋；２４７個のネスチン＋細胞のうち３５．６％ネスチン＋、ＢｒｄＵ＋）、低酸素１６日間（２５個のＧＦＡＰ＋細胞のうち６４．３％ＧＦＡＰ＋、ＢｒｄＵ＋；２４８個のネスチン＋細胞のうち５７．８％ネスチン＋、ＢｒｄＵ＋）。 ヒト頚動脈小体由来のニューロスフェアの形成を示す図である。パネル（Ａ）：頚動脈小体の解体前のヒト頚動脈分岐部の明視野写真。パネル（Ｂ）は、解体後のヒト頚動脈小体を示す。パネル（Ｃ）は、また明視野内であり、細胞分散を生じるための酵素処理の前のヒト頚動脈小体の様々な小片を示す。パネル（Ｄ）は、培養の１０日後、ヒト頚動脈小体の分散した細胞から得られた２つのニューロスフェアの明視野写真を示す。齧歯類での前の写真に記載されたものと非常に類似した形態学的及び機能的特徴である、ニューロスフェアの表面の肥厚部又は糸球体の存在（矢じり印）に注目されたい。パネル（Ｅ）は、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）に対する免疫組織化学的分析により、前述の糸球体が、事実上、ニューロスフェアにおいて前駆体から分化した、頚動脈小体のグロムス細胞であることを示す。すべての細胞の核は、明瞭さをよりいっそう高めるために、ＤＡＰＩで染色されている。 ニューロスフェアに存在する細胞が、インビトロでＧＤＮＦを産生できることを示す図である。パネルＡは、１０日間の培養から生じ、且つニューロスフェアの細胞内でＧＤＮＦプロモーターにより調節されるβ−ガラクトシダーゼの発現を検証するためにＸ−ｇａｌで染色した、ＧＤＮＦ／ＬａｃＺマウスから得られたニューロスフェアの明視野写真を示す；黒色矢印は、酵素の発現を示す青色沈着物の局在を指している。パネルＢは、ニューロスフェアの薄切片の免疫組織化学的分析を提示し、糸球体におけるＴＨ＋グロムス細胞の存在及びそれらの局在を示す。パネルＣに示された２つの画像の併合（重ね合わせ）は、ＴＨ＋グロムス細胞の局在においてＸ−ｇａｌの青色沈着物の出現がどのように起こっているかを示し、これらの細胞のＧＤＮＦのインビトロでの発現を得る可能性を実証している。

本発明は、一般的に、頚動脈小体（ＣＢ）から得られる成体幹細胞（本発明の幹細胞）、前記成体幹細胞由来の前駆細胞（本発明の前駆細胞）、前記の本発明の幹細胞又は前駆細胞由来の分化細胞（本発明の分化細胞）、前記細胞のセットを含む単離された細胞集団（本発明の細胞集団）、それらの増殖のための方法（本発明の増殖方法）、及び、治療における、特に、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病など）又は神経系の虚血性、外傷性、若しくは自己免疫性病変によって引き起こされる疾患の治療におけるその使用を含むその適用に関する。

定義
本記載をより良く理解するために、本発明との関連において用いられるいくつかの用語及び表現の意味を下記に説明する。追加の定義は、必要な場合にその記載と共に含めるものとする。

本明細書に用いられる場合、用語「対象」は、動物、好ましくは、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット、マウスなど）及び霊長類（例えば、サル、ヒトなど）を含む哺乳細胞を指す。特定の実施形態において、前記対象はヒトである。

用語「成体幹細胞」は、幹細胞の特徴を示す、分化組織に存在する細胞を指す。「成体」とは、後胚期を意味する。成体幹細胞は、分化組織内にあり、且つ増殖能、自己複製能、及び１つ又は複数の細胞型への分化能を示す未分化細胞である。その用語は、幹細胞が、胎生期より後の成長期における動物の組織又は器官から単離されていることを意味する。本発明の成体幹細胞は、対象のＣＢに存在する。細胞は、好ましくは、ヒトなどの哺乳動物から単離することができる。成体幹細胞は、それらの起源、胚盤胞の内部細胞塊によって限定される胚性幹細胞とは異なる。本発明による成体幹細胞は、任意の非胚性組織から単離してもよく、新生児、少年少女、青年、及び成人患者が挙げられる。一般的に、本発明の幹細胞は、非新生仔の哺乳動物、より好ましくは非新生児のヒトから単離される。

用語「由来前駆細胞」（本記載において、一過性増幅体、一過性増幅性細胞、又は中間前駆体とも呼ばれる）は、本記載においては、ＣＢから得られる本発明の幹細胞から生じ、分化組織細胞への分化能を有し、且つ幹細胞より特殊化された増殖性細胞を示す。その用語は、それ自体より分化している子孫を生じる能力を有する細胞を指す。例えば、その用語は、増殖能があり、且つ次には、分化した又は分化可能な娘細胞を生じることができる多数の母細胞を産生する能力を有するより多くの前駆細胞を生じる能力がある、未分化細胞、又は最終分化に達しない程度まで分化した細胞を指す場合もある。本発明による前駆細胞は、真の幹細胞より分化しており、真の幹細胞の多分化能をすでにいくらか制限している。用語「由来分化又は特殊化細胞」は、本記載においては、幹細胞又は由来前駆体から生じる、組織において規定された機能を果たすよう最終的に特殊化されている細胞、及び増殖能又は分化能をほとんど有しない細胞を意味する。用語「分化」は、より特殊化されて、さらに分裂又は分化する能力がない最終分化細胞になることにより近づいている細胞に関連することが知られたマーカーを発現する細胞の形成を指す。

用語「可逆的不死化細胞」は、ある瞬間、不死化状態にあるが、逆不死化の工程を用いて、後の時点で非不死化状態へ戻すことができる細胞に関する。

用語「特殊分化又は分化マーカー」は、本記載においては、「分化又は特殊化細胞」を同定し、幹細胞及び前駆細胞からそれを区別する表現型マーカーを意味する。

本発明の細胞は、特定の表現型マーカーが陽性であり、他が陰性である。「陽性」とは、マーカーが細胞内に発現していることを意味する。発現しているとみなされるためには、マーカーは検出可能レベルで存在しなければならない。「検出可能レベル」とは、ＰＣＲ、ブロッティング、又はＦＡＣＳ分析などの標準実験室方法の１つを用いて検出することができることを意味する。遺伝子は、発現がＰＣＲの３０サイクル後、合理的に検出することができる場合（細胞あたり少なくとも１００コピーの細胞内発現レベルに対応する）には、本発明の集団の細胞によって発現しているとみなされる。用語「発現する」及び「発現」は、対応する意味を有する。この閾値より低い発現レベルにおいて、マーカーは、発現していないとみなされ、それゆえ、細胞は、このマーカーが陰性であると記載される。マーカーは、発現が細胞あたり約１０〜２０コピーのレベルで合理的に検出することができない場合には、本発明の細胞によって発現していないとみなされる。これらの陽性レベルと陰性レベルの間において、細胞は、特定のマーカーが弱陽性の場合があり、例えば、本発明による前駆細胞は、ＧＦＡＰが弱陽性（±）で、且つネスチンが陽性（＋）である。本発明の細胞におけるマーカーの発現レベルと、例えば胚性幹細胞などの別の細胞における同じマーカーの発現レベルとの間の比較は、好ましくは、同じ種から単離されている２つの細胞型を比較することによって行うことができる。好ましくは、この種は哺乳動物であり、より好ましくは、この種はヒトである。そのような比較は、便利には、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）実験を用いて行うことができる。

幹細胞集団は、集団の細胞の少なくとも約７０％がマーカーの検出可能な発現を示す場合には、マーカーを発現しているとみなされる。他の態様において、集団の細胞の少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又はそれ以上が、マーカーの検出可能な発現を示す。特定の態様において、集団の細胞の少なくとも約９９％又は１００％が、マーカーの検出可能な発現を示す。発現は、ＲＴ−ＰＣＲ実験の使用を通して、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を通して、又は特異的抗体を用いる免疫組織化学法を通して、検出することができる。このリストは例としてのみ提供され、限定することを意図するものではないことは認識されるべきである。

幹細胞集団は、単離された幹細胞集団の少なくとも約７０％がマーカーの検出可能な発現を示さない場合には、特定のマーカーが陰性であるとみなされる。他の実施形態において、集団の細胞の少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％、又は１００％がマーカーの少しの検出可能な発現も示すべきではない。この場合もやはり、検出可能な発現の欠如は、ＲＴ−ＰＣＲ実験の使用を通して、ＦＡＣＳを用いて、又は免疫組織化学法を用いて、証明することができる。

用語「単離された」は、それが言及する細胞又は細胞集団が、その自然環境内にはないことを示す。細胞又は細胞集団は、周囲組織から実質的に分離されている。いくつかの実施形態において、試料が、少なくとも約７５％、８５％、９０％、９５％、又はそれ以上の本発明による幹細胞、前駆細胞、分化細胞、又は不死化細胞を含む場合には、細胞又は細胞集団は周囲組織から実質的に分離されている。換言すれば、試料が、本発明の細胞以外に約２５％未満、いくつかの実施形態においては、約１５％未満、及びいくつかの実施形態においては、約５％未満の物質を含む場合には、試料は周囲組織から実質的に分離されている。そのようなパーセンテージ値は、重量によるパーセンテージを指す。その用語は、細胞の起源である生物体から取り出されており、且つ培養中に存在する細胞を含む。その用語はまた、細胞の起源である生物体から取り出され、その後、生物体に再挿入されている細胞を含む。再挿入された細胞を含む生物体は、その細胞が取り出された同じ生物体であってもよく、又は異なる生物体であってもよい。

用語「神経冠由来細胞に特異的な培地」（「ＮＣ培地」とも呼ばれる）は、本記載においては、神経冠（ＮＣ）由来の末梢神経系（ＰＮＳ）の前駆体の成長を促進する血清及び一連の栄養因子を含む培地を意味する。適切な栄養因子の例は本明細書に記載されている。

用語「生物活性を有する分子」は、本記載においては、一群の細胞の生物学に限定された効果を生じる、例えば、それらの生存又はそれらの増殖若しくは分化挙動に影響する分子を意味する。

用語「治療有効量の細胞」は、本記載においては、細胞療法により特定の疾患の治療において有益な効果を得るのに必要な細胞の量を意味する。

用語「混合培養物」は、本記載においては、同じプレート上に存在する様々な異なる細胞型の培養物を意味し、それは互いに同じ由来のものでもよく、そうでなくてもよい。

用語「純粋な培養物」は、本記載においては、ただ１つの型の細胞だけが存在する培養物、又はただ１つの型の細胞だけが非常に（実質的に）濃縮された培養物を意味する。実際、非常に濃縮された培養物を得ることができるが、１００％純粋な培養物を得ることは技術的に難しい。特定の実施形態において、本発明の幹細胞［ＧＦＡＰ＋／ＴＨ−／ネスチン−］又は本発明の分化細胞［ＴＨ＋／ネスチン−］の７０％より多い、８０％より多い、９０％より多い、９５％より多い、又はそれ以上の純度の培養物は、特定の蛍光マーカーを用いるフローサイトメトリによる分離によって得ることができる。

用語「本発明の細胞集団」は、調製物が、細胞に加えて、細胞培地などの非細胞成分、例えば、タンパク質、アミノ酸、核酸、ヌクレオチド、補酵素、抗酸化剤、金属などを含む可能性がある細胞の調製物を指す。さらに、細胞組成物は、細胞成分の成長又は生存能に影響しないが、特定の形式における、例えば、カプセル化のためのポリマーマトリックスとして、又は薬学的調製物として、細胞を提供するために用いられる成分を有することができる。

用語「細胞系譜のマッピング」は、本記載においては、マーキングのその後のトラッキングのために前駆細胞をマーキングするという意味での細胞系譜のトラッキング、及び前記前駆細胞に由来し、したがってマーキングされる細胞の調査を意味する。

「神経変性疾患」は、既知又は未知の原因の神経系に影響する病態であり、且つアポトーシス又はネクローシスによるニューロンの進行性死を含む病態である；前記神経変性疾患の例示的な非限定的例として、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症などが挙げられる。

神経系の「虚血性病変」は、脳の一部への血流の欠乏によって生じる病変であって、前記領域に血液を供給する動脈の閉塞によるものである。

神経系の「外傷性病変」は、例えば、機械的傷害による、ニューロン又はその部分の破壊によって特徴づけられる（例えば、交通事故に起因する外傷性延髄病変）。

神経系の「免疫学的病変」（例えば、多発性硬化症など）は、免疫系の異常刺激後の自己免疫反応に起因する。

本明細書に用いられる場合、用語「低酸素」は、哺乳動物の１つ又は複数の組織における酸素が、生理的レベルより下に、例えば、最適未満のレベルまで低下している状態を意味すると定義される。低酸素溶液の例は、５％ＣＯ_２及び９５％Ｎ_２で泡立って、約１５ｍｍＨｇのＯ_２圧力に達しているものである。

本明細書に用いられる場合、用語「神経冠に特異的な培地」は、この型の細胞の成長を可能にする培地を意味する。用語「培養基」又は「培地」は、当技術分野において認識されており、一般的に、生細胞の培養に用いられる任意の物質又は調製物を指す。たいていの基本培地は、一般的に、以下の４つの基本的化学群を含む：アミノ酸、炭水化物、無機塩、及びビタミン。基本培地は、一般的に、より複雑な培地についての基礎としての役割を果たし、それに、血清、緩衝剤、成長因子、脂質などのサプリメントが加えられる。基本培地の例として、イーグル基本培地、最小必須培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改変イーグル培地、培地１９９、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅｓ Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１０及びＨａｍ’ｓ Ｆ−１２、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ、ＤｕｌｂｅｃｃｏのＭＥＭ／Ｆ−Ｉ２、ＲＰＭＩ １６４０、及びＩｓｃｏｖｅの改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。神経冠に特異的な培養基の例は、１５％のニワトリ胚抽出物（Ｓｔｅｍｐｌｅ及びＡｎｄｅｒｓｏｎ、１９９２；Ｃｅｌｌ ７１、９７３〜９８５）、１％のＮ_２サプリメント（Ｇｉｂｃｏ）、２％のＢ２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｃａｍｂｒｅｘ、Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）、２０ｎｇ／ｍｌのヒト組換え塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、２０ｎｇ／ｍｌのヒト組換えインスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、並びに塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、及びヒト組換え上皮成長因子（ＥＧＦ）を含んだ２０ｎｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含むＤ−ＭＥＭ：Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）である。この培地において、３％の固定酸素レベル、３７℃で、制御されたＣＯ_２レベルのインキュベータ（例えば、ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）内で細胞を培養することができる。

本記載及び特許請求の範囲を通して、「含む」という語及びその変形型は、他の技術的特徴、添加物、成分、又は段階を排除することを意図するものではない。当業者にとって、本発明の他の目的、利点、及び特徴は、一部には本記載から、及び一部には、本発明の実践的適用から明らかになるであろう。

本発明の細胞及び細胞集団
本発明の幹細胞
一態様において、本発明は、表現型マーカーＧＦＡＰ（グリア線維酸性タンパク質）が陽性であり、表現型マーカーＴＨ及びネスチンが陰性であることを特徴とする、ＣＢ起源の単離された成体幹細胞（本発明の幹細胞）に関する。したがって、前記の本発明の幹細胞は、ＣＢから得られ、且つＧＦＡＰ＋／ＴＨ−／ネスチン−表現型を有する。

頚動脈小体由来のこれらの幹細胞を定義する特定の特性は、以下の特徴によって要約することができる：
− すでに述べられているように、それらは、グリアＧＦＡＰマーカーが陽性であり、マーカーＴＨ及びネスチンが陰性である細胞である。
− それらは、両方の細胞型の膜と密接に会合して、Ｉ型細胞の糸球体の周囲に細胞延長部（通常、１つ又は２つ）を有して、インビボで発生する。
− それらは、連続的低酸素刺激に応答してそれらの休止表現型（ＧＦＡＰの発現及び延長部）を喪失する。
− それらの休止表現型を喪失することで、それらは、ネスチンが陽性であり、ＧＦＡＰ又はＴＨが陰性の、円めの度合いが強い中間前駆体に変えられる。
− それらは、ＴＨが陽性の頚動脈小体の成熟グロムス細胞に分化する能力があり、且つ生理的刺激に応答して、ドーパミンなどのカテコールアミン及びＧＤＮＦなどの栄養因子を分泌する能力がある。したがって、それらの分化を誘導することによって、それらは、ＧＤＮＦの製造用の供給源として用いることができる。
− それらは、低酸素刺激が消失した場合、休止表現型（ＧＦＡＰの発現及び延長部）をインビボで回復する能力がある。
− それらは、増殖する能力、インビトロで成長する能力、ネスチン陽性前駆体及びＴＨ陽性グロムス細胞のニューロスフェア又はコロニーを形成する能力がある。
− それらは、神経組織へ組み込まれることができる。
− それらは、隣接細胞との化学的又は電気化学的接触を確立することができる。
− それらは、患者へ注入される場合、それらがその言及された患者のＣＢから得られているならば、免疫応答を誘導しない可能性がある。
− グリアＧＦＡＰマーカーが陽性であり、マーカーＴＨ及びネスチンが陰性であることに加えて、それらは、それらの局在性（ＣＢ）及びＣＢグロムス細胞との共局在などの他の機能的性質、低酸素に対する応答性、インビトロで成長して、ネスチン陽性前駆体及びＴＨ陽性グロムス細胞のニューロスフェア又はコロニーを形成する能力により、特異的である。

ＧＦＡＰマーカーは、脳のグリア細胞、末梢グリア、及び様々な器官に局在したグリア細胞に「類似した」細胞（例えば、頚動脈小体のＩＩ型細胞）の特徴を示す。ＧＦＡＰは、正確な機能が未知である、細胞骨格のタンパク質である。

マーカーネスチンは、中枢神経系、末梢神経系、及びＣＢなどの「神経傍」器官におけるいくつかの異なる型の神経前駆体の特徴を示す。ネスチンの機能は、確実にはわかっていない。

ＴＨは、カテコールアミン作動性細胞のいくつかの異なるサブタイプの特異的マーカーである。ＴＨの機能は、アミノ酸チロシンをカテコールアミン群の神経伝達物質（ドーパミン、ノルアドレナリン、又はアドレナリン）へ変換する第１反応（チロシンの水酸化）の触媒として働くことである。

最初は、本発明の幹細胞は、例２に記載されたものなどの方法によって同定された。この方法は、本発明の一態様を形成する。簡単には、低酸素に曝された成体ラット由来のＣＢを、酵素的に分散させ、その細胞を、非接着のために処理された培養プレート上でＮＣ培地に蒔き、それに従って、浮遊状態での成長及びニューロスフェアの生成を誘導した。ニューロスフェアは、増殖及び自己複製の特徴を有する（それらは幹細胞である）単細胞から生じる（クローン増殖）コロニーである。頚動脈小体を分散させ、その細胞を培養すると、幹細胞（全細胞のうちのわずかな集団）のみが、ニューロスフェアを形成する能力を有する。次に、事前にブロッキング溶液でブロッキングされた前記ニューロスフェアの薄切片を一次抗体（抗ＧＦＡＰ、抗ＴＨ、及び抗ネスチン）と、その後に対応する二次抗体とインキュベートする段階と、最後に、（細胞核を染色する）ＤＡＰＩで対比染色する段階とを含む標準免疫細胞化学的プロトコールによって、前記ニューロスフェアに存在する様々な細胞を分析した。得られた結果より、ＧＦＡＰ＋／ＴＨ−／ネスチン−表現型を有する、低酸素にかけられたラットのＣＢ由来の細胞の存在が明らかにされた。その後、これらの細胞を分析し、それらの増殖能、自己複製能、及び分化能を観察した（例２）。追加の試験により、前記のＣＢ由来幹細胞がグリア型の支持細胞（ＩＩ型）であることが明らかにされた（例３）。

次に、ヒトドナーから単離された頚動脈小体に同じ方法を適用して、この種における頚動脈小体由来の幹細胞の存在を検証した。この方法は、本発明のさらなる態様を形成する。例６に記載されているように、心臓ドナー由来の２つの頚動脈分岐部へのその方法の適用により、糸球体の様式において表面に肥厚部を有する、ニューロスフェアの形をとる神経前駆体を培養中、得ることが可能になった。ニューロスフェアの免疫細胞化学的分析により、肥厚部が、事実上、ＴＨ＋グロムス細胞の群であることが明らかにされ、ヒトにおいて頚動脈小体に特異的な幹細胞の存在を確認し、それらのインビトロでのグロムス細胞への分化能を実証した。

この記載により提供される情報に基づいて、本発明の幹細胞は、対象のＣＢから当業者に知られた通常の方法によって得ることができる。特定の実施形態において、前記対象は、齧歯類（例えば、ラット又はマウス）又は霊長類（例えば、ヒト）などの哺乳動物である。

本発明の幹細胞の表現型マーカーは、通常、陽性／陰性選択に基づく、任意の適切な技術によって同定することができる。特定の実施形態において、免疫細胞化学的プロフィールに基づいて本発明の幹細胞を特徴づけることを目的として、本発明の幹細胞における存在又は非存在を確認しなければならない前記表現型マーカーに対する抗体、好ましくはモノクローナル抗体を用いることができるが、当業者に知られた他の通常の技術、例えば、ＲＴ−ＰＣＲもまた用いることができる。したがって、特定の実施形態において、ＧＦＡＰに対するモノクローナル抗体を、選択された細胞において前記マーカーの存在を分析するために用い、ＴＨ及びネスチンに対するモノクローナル抗体を、前記の選択された細胞において前記マーカーの存在を分析するために用いる。ＧＦＡＰ＋／ＴＨ−／ネスチン−表現型を有するそれらの細胞は、ＣＢ起源であり、増殖能、自己複製能、及び他の細胞型への分化能を有し、本発明の幹細胞を構成する。前記モノクローナル抗体については、市販されているか、又は通常の方法によって当業者が得ることができる。材料及び方法に関するセクションでは、異なる細胞型の免疫細胞化学的特徴づけを行う１つの手段が記載されている。

本発明の幹細胞は、それらが増殖能及び自己複製能を有するため、インビトロで増殖することができる。簡単には、前記の本発明の幹細胞は、単離及び特徴づけの後、適切な培地中で、インビトロで維持することができ、増殖することができる。特定の実施形態において、本発明の幹細胞を、ニューロスフェアの形成を可能にするために非接着性表面上で成長させる。さらに、特定の実施形態において、（ＮＣ培地として前に定義された）培養基は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、及びそれらの組合せから選択された少なくとも１つの成長因子、好ましくはＦＧＦを、１０ｎｇ／ｍｌ〜４０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２０ｎｇ／ｍｌの濃度で含む。或いは、培地は、ＦＧＦに加えて、ＥＧＦ及び／又はＩＧＦ−Ｉなどの他の成長因子を（それぞれ）１０ｎｇ／ｍｌ〜４０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２０ｎｇ／ｍｌの濃度で含み得る。前記成長因子（ＦＧＦ、ＥＧＦ、及びＩＧＦ−Ｉ）は、天然若しくは組換え型であり得、又は代替として、当業者によく知られている、前記成長因子（ＦＧＦ、ＥＧＦ、及びＩＧＦ−Ｉ）の機能性変異体も用いることができる。別の特定の実施形態において、培地は、栄養分の主要供給源として、ニワトリ胚抽出物を培地全体の少なくとも５重量％、好ましくは５重量％〜２０重量％、さらに好ましくは１５重量％の濃度で含む。さらに、有利には、汚染を防ぐ目的として、培地は、抗生物質、例えば、ペニシリン及び／又はストレプトマイシンを、培地全体に対して０．５重量％から２重量％までの典型的濃度で含む。

必要に応じて、本発明の幹細胞は、細胞集団をクローン化するのに適している方法を用いてクローン的に増殖することができる（例３）。或いは、本発明の幹細胞の集団を収集することができ、細胞を別々のプレート上に（又はマルチウェルプレートのウェルに）蒔くことができる。別の代替の実施形態において、各ウェル中に単細胞を（例えば、約０．１個〜約１個の細胞／ウェルで）入れる操作を容易にするために、前記幹細胞をランダムな関係にマルチウェルプレート上でサブクローニングすることができる。もちろん、本発明の幹細胞は、低密度で（例えば、ペトリ皿で）クローン化することができ、適切な装置（例えば、クローニングリング）を用いて他の細胞から単離することができる。クローン集団は、適切な培養基、例えば、ＮＣ培地中で増殖することができる。

したがって、この本発明の態様は、細胞集団が本質的に本発明の細胞のみを含む、即ち、細胞集団が純粋である、単離された幹細胞の集団を提供する。多くの態様において、細胞集団は、少なくとも約７０％（他の態様において、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、又は１００％）の本発明の幹細胞を含む。

単離された細胞は、それらの発生表現型が評価することができるまで、培養することができる。本発明の幹細胞は、本発明の前駆細胞（ネスチン＋）、例えば、ＧＦＡＰがわずかに陽性又は弱陽性であり、ネスチンが陽性の細胞（ＧＦＡＰ±／ネスチン＋）、又はＧＦＡＰが陰性であり、ネスチンが陽性の細胞（ＧＦＡＰ−／ネスチン＋）へ、及び本発明の分化細胞（ネスチン−／特殊分化マーカー＋）、例えば、ＴＨ＋（グロムス細胞）、ＳＭＡ＋（平滑筋細胞）などへの異なる細胞型への分化能を有する（例えば、例２参照）。１つ又は複数の細胞型へ分化する本発明の幹細胞の能力は、当業者に知られた通常の方法によって試験することができる。

必要に応じて、本発明の幹細胞は、例示として、但し非限定的に、遺伝子組換えの工程、それらのゲノム内での欠失又は挿入などを含む任意の通常の方法によって遺伝子改変することができる。安定的にも条件的にも不死化細胞を得るために用いられる１つの可能な方法は、本発明の不死化細胞に関して後で論じられているように、プラスミドｐＥＦ３２１Ｔ又はｐＲＩＴＡそれぞれでのリポフェクションによる本発明の幹細胞の安定的トランスフェクションに基づいている。

いずれの本発明の幹細胞も、それらがレシピエント患者から得られている場合、細胞集団の患者への注入によって免疫応答を誘発しないことが予想される。ドナーを用いて幹細胞を得る場合、免疫応答は、ドナーのハプロタイプをレシピエントのそれらに適合させることによって最小化することができる。本発明の特定の態様において、単離された幹細胞集団の細胞の少なくとも約７０％が免疫応答を誘発しない場合には、幹細胞集団は、免疫応答を誘発しないとみなされる。いくつかの実施形態において、単離された幹細胞集団の細胞の少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、９９％、又はそれ以上は、免疫応答を誘発しない。好ましくは、本発明の細胞は、抗体媒介性免疫応答を誘発せず、及び／又は体液性免疫応答を誘発せず、及び／又は混合リンパ球免疫応答を誘発しない。

免疫応答を誘発する本発明の細胞の能力が様々な方法で試験できることが当業者に理解されるであろう。ほんの例示としてであるが、幹細胞ドナーとは異なる個体由来のＴ細胞と本発明の細胞を培養することによって本発明の細胞が免疫応答を誘発するかどうかを明らかにすることが可能である。細胞が免疫応答を引き起こす能力があるためには、そのような細胞の培養がＴ細胞の増殖の刺激をもたらすであろう。この能力を試験するためのアッセイは、当業者によく知られている。

一実施形態において、幹細胞ドナーとは異なる個体由来のＴ細胞との単離された幹細胞のインキュベーション後に引き起こされるＩＬ２、ＩＦＮγ、ＴＮＦβ、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ１０、ＩＬ３、ＴＮＦα、及びＴＧＦβの１つ又は複数の発現レベルが、非適合個体から単離された最終分化細胞との等価のＴ細胞集団のインキュベーション後のＩＬ２、ＩＦＮγ、ＴＮＦβ、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ１０、ＩＬ３、ＴＮＦα、及びＴＧＦβの１つ又は複数の発現レベルの約５０％未満、好ましくは約４０％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、又は約１０％未満、又はそれ以下である場合には、本発明の細胞は免疫応答を誘発しないとみなされるものとする。

本発明の前駆細胞
別の態様において、本発明は、表現型マーカーネスチンが陽性であることを特徴とする、以下「本発明の前駆細胞」と称する、前記の本発明の幹細胞由来の単離された成体前駆細胞に関する；即ち、本発明の前駆細胞は、本発明の幹細胞から、即ち、ＣＢから生じ、且つネスチン＋表現型を有する。特定の実施形態において、前記の本発明の前駆細胞は、表現型マーカーＧＦＡＰがわずかに陽性又は弱陽性であり、表現型マーカーネスチンが陽性であり［ＧＦＡＰ±／ネスチン＋］、一方、別の特定の実施形態において、前記の本発明の前駆細胞は、表現型マーカーＧＦＡＰが陰性であり、表現型マーカーネスチンが陽性である［ＧＦＡＰ−／ネスチン＋］。神経前駆体ではあるが、米国特許出願第２００３／００９５９５６号に記載された脳及び線条体由来のＧＦＡＰ−／ネスチン＋細胞などの、ＣＢで発見されたものとは異なる起源及び（それらが分化する細胞型に関しての）性質を有するＧＦＡＰ−／ネスチン＋細胞が存在し、それらは、起源（脳又は線条体対ＣＢ）だけでなく、さらに、それらが、本発明の前駆細胞によって示される性質である、グロムス細胞（ＴＨ＋、且つ低酸素及び低血糖に感受性がある）へ分化する性質を欠くという点においても本発明の前駆細胞とは異なる。

したがって、これらの細胞を特徴づける性質は以下のように要約することができる：
− それらは、マーカーネスチンが陽性であり、一般的に、マーカーＧＦＡＰ及びＴＨが陰性である細胞であるが、それらの一部は、それらの発生の瞬間に依存して表現型ＧＦＡＰマーカーが弱陽性であり得る。
− それらは、円みを帯びているか、又は非常に薄い延長部を有し、それらは、インビボでＩ型細胞の糸球体と共に配置している。
− それらは、連続的低酸素刺激に応答して、増殖し、したがって、数が増加する細胞である。
− それらは、頚動脈小体のＧＦＡＰ陽性幹細胞由来である。
− それらは、頚動脈小体の成熟グロムス細胞へ分化する能力があり、ＴＨが陽性であり、生理的刺激に応答してドーパミンなどのカテコールアミン及びＧＤＮＦなどの栄養因子を分泌する能力がある。したがって、それらの分化を誘導することによって、それらは、ＧＤＮＦの製造用の供給源として用いることができる。
− それらは、低酸素刺激が消失した場合、頚動脈小体のＧＦＡＰ陽性静止幹細胞に転換する能力がある細胞である。
− それらは、インビトロで成長し、ネスチン陽性前駆体及びＴＨ陽性グロムス細胞のニューロスフェア又はコロニーを形成する能力がある細胞である。

すでに述べられているように、特定の実施形態において、本発明の前駆細胞は、表現型マーカーＧＦＡＰがわずかに陽性又は弱陽性であり、表現型マーカーネスチンが陽性である、即ち、それは、ＧＦＡＰ＋／ネスチン＋表現型を有する；これは、他にも可能な理由はあるが、本発明の幹細胞［ＧＦＡＰ＋／ネスチン−］が本発明の前駆細胞に分化する時、それはネスチン＋表現型を獲得し、且つＧＦＡＰ表現型を喪失し、そのため、それらの発生の瞬間に依存して、ＧＦＡＰがわずかに陽性又は弱陽性である表現型を有する本発明の前駆細胞が観察され得るという事実によると思われる。

本発明の前駆細胞は、例２に記載されたものなどの方法によって得ることができる。この方法は、本発明の一態様を形成する。簡単には、低酸素に曝された成体ラットのＣＢを酵素的に分散させ、その細胞を、非接着のために処理された培養プレート上のＮＣ培地に蒔き、ニューロスフェアを得た。前記ニューロスフェアの薄切片の抗ＧＦＡＰ抗体及び抗ネスチン抗体並びにＤＡＰＩでの対比染色を用いた免疫細胞化学的分析により、低酸素に曝されたラットのＣＢの幹細胞から得られた前記ニューロスフェアの中心コアに、ＧＦＡＰ＋／ネスチン＋表現型を有する細胞及びＧＦＡＰ−／ネスチン＋表現型を有する細胞の存在が明らかにされた（本発明の前駆細胞）。その後、これらの細胞を分析し、それらの増殖能、自己複製能、及び分化能を観察した（例２）。

この記載により提供される情報に基づいて、本発明の前駆細胞は、対象のＣＢから、又は対象のＣＢの幹細胞から当業者の誰にでも知られた通常の方法によって得ることができる。特定の実施形態において、前記対象は、齧歯類（例えば、ラット又はマウス）又は霊長類（例えば、ヒト）などの哺乳動物である。

本発明の前駆細胞の表現型マーカーは、すでに述べられているものなどの任意の適切な技術によって同定することができる。特定の実施形態において、免疫細胞化学的プロフィールを用いて本発明の前駆細胞を特徴づけることを目的として、本発明の前駆細胞における存在又は非存在を確認しなければならない前記表現型マーカーに対する抗体、好ましくはモノクローナル抗体を用いることが可能であるが、当業者に知られた他の通常の技術もまた用いることができる。したがって、特定の実施形態において、ＧＦＡＰに対するモノクローナル抗体を、選択された細胞において前記マーカーの存在（わずかな）又は非存在を分析するために用い、ネスチンに対するモノクローナル抗体を、前記の選択された細胞において前記マーカーの存在を分析するために用いる。ＣＢ由来、又はＣＢの幹細胞由来などのＧＦＡＰ＋／ネスチン＋又はＧＦＡＰ−／ネスチン＋表現型を有し、且つ増殖能、自己複製能、及び他の細胞型への分化能を有するそれらの細胞は、本発明の前駆細胞を構成する。前記モノクローナル抗体については、市販されているか、又は通常の方法によって当業者が得ることができる。材料及び方法に関するセクションでは、異なる型の細胞の免疫細胞化学的特徴づけを行う１つの方法が記載されている。

本発明の前駆細胞は、それらが増殖能及び自己複製能を有するため、インビトロで増殖することができる。簡単には、前記の本発明の前駆細胞は、単離及び特徴づけの後、適切な培地中で、インビトロで維持することができ、増殖することができる。特定の実施形態において、本発明の前駆細胞を、ニューロスフェアの形成を可能にするために非接着性表面上で成長させる。さらに、特定の実施形態において、（ＮＣ培地として前に定義された）培地は、ｂＦＧＦを含むＦＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、及びそれらの組合せから選択された少なくとも１つの成長因子、好ましくはＦＧＦを、１０ｎｇ／ｍｌ〜４０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２０ｎｇ／ｍｌの濃度で含む。又は、培地は、ＦＧＦに加えて、ＥＧＦ及び／又はＩＧＦ−Ｉを１０ｎｇ／ｍｌ〜４０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２０ｎｇ／ｍｌの濃度（それら、それぞれ）で含み得る。前記成長因子（ＦＧＦ、ＥＧＦ、及びＩＧＦ−Ｉ）は、天然若しくは組換え型であり得、又は代替として、当業者によく知られている、前記成長因子（ＦＧＦ、ＥＧＦ、及びＩＧＦ−Ｉ）の機能性変異体も用いることができる。別の特定の実施形態において、培地は、栄養分の主要供給源として、ニワトリ胚抽出物を培地全体の少なくとも５重量％、好ましくは５重量％〜２０重量％、さらに好ましくは１５重量％の濃度で含む。さらに、有利には、汚染を防ぐ目的として、培地は、抗生物質、例えば、ペニシリン及び／又はストレプトマイシンを、培地全体に対して０．５重量％から２重量％までの典型的濃度で含む。

必要に応じて、本発明の前駆細胞は、細胞集団をクローン化するのに適している方法を用いてクローン的に増殖することができる。簡単には、一次培養で得られたニューロスフェアを機械的又は酵素的に単細胞へ解離させることができ、これらの細胞を、それらの二次増殖として、非接着条件下、ＮＣ培地中で再び培養することができる。

本発明の前駆細胞は、本発明の分化細胞（ネスチン−／特殊分化マーカー＋）、例えば、ネスチン−／ＴＨ＋細胞（グロムス細胞）、ネスチン−／ＳＭＡ＋細胞（平滑筋細胞）などへの異なる細胞型への分化能を有する（例えば、例２参照）。１つ又は複数の細胞型へ分化する本発明の幹細胞の能力は、当業者に知られた通常の方法によって試験することができる。

必要に応じて、本発明の前駆細胞は、例示として、但し非限定的に、遺伝子組換えの工程、そのゲノム内での欠失又は挿入などを含む任意の通常の方法によって遺伝子改変することができる。安定的にも条件的にも不死化細胞を得るために用いられる可能な方法の１つは、本発明の不死化細胞に関して後で論じられているように、プラスミドｐＥＦ３２１Ｔ又はｐＲＩＴＡそれぞれでのリポフェクションによる本発明の前駆細胞の安定的トランスフェクションに基づいている。

本発明の分化細胞
別の態様において、本発明は、表現型マーカーネスチンが陰性であり、特殊分化マーカー（ＭｄｅＥ）が陽性であることを特徴とする、以下「本発明の分化細胞」と称する、前記細胞型のいずれか由来（即ち、本発明の幹細胞由来、又は本発明の前駆細胞由来）の成体分化細胞に関する；即ち、本発明の分化細胞は、本発明の幹細胞から、又は本発明の前駆細胞から、即ち、ＣＢから生じ、ネスチン−／ＭｄｅＥ＋表現型を有する。

今度の場合も、これらの細胞を特徴づける性質は、以下の通り概要を示すことができる：
− それらは、マーカーＴＨが陽性であり、マーカーＧＦＡＰ及びネスチンが陰性である細胞である。
− それらは円みを帯びており、集まって糸球体を形成する。
− それらは、連続的低酸素刺激に応答して、頚動脈小体の幹細胞（ＧＦＡＰ＋）から始まって前駆細胞（ネスチン＋）を経由する分化によって生じる。
− それらは、電位開口型カルシウム及びナトリウムチャネルを有し、且つ低酸素又は低血糖などの生理的刺激に応答してドーパミン型の神経伝達物質を分泌する最終分化細胞である。
− それらは、頚動脈小体の主要な化学受容器機能を果たす。
− それらは、ＧＤＮＦ型の栄養因子を産生及び分泌することができる。したがって、それらは、ＧＤＮＦの製造に用いることができる。
− それらは、インビトロで、ネスチン陽性前駆体から始まる分化によって、ニューロスフェアの表面上で糸球体の形をとって現れる。

本発明の分化細胞は、本発明の幹細胞及び／又は本発明の前駆細胞を、前記細胞の所望の分化細胞への分化を可能にする条件下で、培養することを含む方法によって得ることができる。この記載により提供される情報に基づいて、本発明の分化細胞は、対象のＣＢから、又は対象のＣＢの幹細胞から、又は対象のＣＢの前記幹細胞由来の前駆細胞から当業者の誰にでも知られた通常の方法によって得ることができる。特定の実施形態において、前記対象は、齧歯類（例えば、ラット又はマウス）又は霊長類（例えば、ヒト）などの哺乳動物である。本発明の分化細胞の表現型マーカーは、すでに述べられているものなどの任意の適切な技術によって、例えば、本発明の分化細胞における存在又は非存在を確認しなければならない前記表現型マーカーに対するモノクローナル抗体を用いて、同定することができるが、当業者に知られた他の通常の技術もまた用いることができる。

特定の実施形態において、前記ＭｄｅＥは、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）であり、前記の本発明の分化細胞は、ネスチン−／ＴＨ＋表現型（グロムス細胞）を有する。簡単には、前記分化細胞（グロムスネスチン−／ＴＨ＋細胞）は、例２に記載されたものなどの方法によって得ることができる。簡単には、低酸素に曝された成体ラットのＣＢを酵素的に分散させ、その細胞を、非接着のために処理された培養プレート上のＮＣ培地に蒔き、それによってニューロスフェアを得、そのニューロスフェアは、ＣＮＳ由来及びＰＮＳ由来のニューロスフェア（一般的に、球状）と対照的に、特徴的な形態の１つ又は２つの突起部を有する（図３Ａ）。抗ネスチン抗体及び抗ＴＨ抗体並びにＤＡＰＩでの対比染色を用いた前記ニューロスフェアの薄切片の免疫細胞化学的分析により、狭い線維の組織を介して中心コアに連結した、糸球体突起部内にネスチン−／ＴＨ＋表現型を有する分化細胞の凝集物の存在が明らかにされ、それは、数週間の培養後、成長して、成体ＣＢのサイズに達する（図３Ｃ）。

別の特定の実施形態において、前記ＭｄｅＥは、平滑筋アクチン（ＳＭＡ）であり、前記の本発明の分化細胞は、ネスチン−／ＳＭＡ＋表現型を有する（典型的には神経冠に由来する細胞型）。簡単には、前記分化細胞（ネスチン−／ＳＭＡ＋細胞）は、例２に記載されているような方法によって得ることができる。簡単には、（低酸素に曝された成体ラットのＣＢから得られた）ニューロスフェアを接着性基質上の培養液に蒔く。抗ネスチン抗体及び抗ＳＭＡ抗体並びにＤＡＰＩでの対比染色を用いた、結果として生じた細胞の免疫細胞化学的分析により、ネスチン−／ＳＭＡ＋表現型を有する分化細胞の存在が明らかにされた（図３Ｄ）。

必要に応じて、本発明の分化細胞は、例示として、但し非限定的に、遺伝子組換えの工程、そのゲノム内での欠失又は挿入などを含む任意の通常の方法によって遺伝子改変することができる。安定的にも条件的にも不死化細胞を得るために用いられる可能な方法の１つは、本発明の不死化細胞に関して後で論じられているように、プラスミドｐＥＦ３２１Ｔ又はｐＲＩＴＡそれぞれでのリポフェクションによる本発明の前駆細胞の安定的トランスフェクションに基づいている。

本発明の不死化細胞
以下「本発明の細胞」と称する、本発明の幹細胞、本発明の前駆細胞、及び／又は本発明の分化細胞は、必要に応じて、可逆的不死化の過程を受けることができる。

したがって、別の態様において、本発明は、以下「本発明の不死化細胞」と称する、可逆的不死化細胞に関し、前記細胞は、本発明の細胞、即ち、本発明の幹細胞、本発明の前駆細胞、又は本発明の分化細胞である。

特定の実施形態において、本発明の細胞は、治療目的のために、例えば、前記細胞、又は好ましくは前記幹細胞由来の分化細胞を、損傷が生じているＣＮＳ又はＰＮＳの領域に移植することによって、神経細胞の再生を促進するために用いることができる、本発明の機能性可逆的不死化細胞を得ることを目的として、可逆的不死化の工程を受ける。

本明細書に用いられる場合、用語「不死化」又は「不死化した」は、老化を避けて、培養中、無制限に増殖する細胞、又は細胞の生成の工程に関する。本発明によれば、不死化は、細胞がいくつかの点で、特に、腫瘍細胞の増殖特性に関して、腫瘍細胞のように挙動するように、細胞培養物が転換される工程に関する。このように、「可逆的不死化細胞」は、ある瞬間、不死化状態にあるが、逆不死化の工程を用いて、後の時点で非不死化状態へ戻すことができる細胞に関する。

特定の実施形態において、前記の本発明の細胞は、ＳＶ４０ウイルスのＴ抗原のロングアームをコードする遺伝子、テロメラーゼの触媒サブユニットをコードする遺伝子、Ｂｍｉ−１タンパク質をコードする遺伝子など、老化を防ぐための発癌遺伝子（又は発癌遺伝子の組合せ）を含む「除去可能なポリヌクレオチド」を含むベクターでの形質転換によって本発明の細胞を不死化する段階；前記の本発明の不死化細胞を成長させる段階；本発明の細胞の機能的性質を維持する本発明のクローン細胞系を選択する段階、及び本発明の不死化細胞から発癌遺伝子（又は発癌遺伝子の組合せ）を除去する段階を含む方法によって可逆的に不死化することができる。

例示として、安定的にも条件的にも本発明の不死化細胞を得るために潜在的に用いることができる方法には、ＣＢの一次培養物由来の分散細胞の、プラスミドｐＥＦ３２１Ｔ又はｐＲＩＴＡそれぞれでのリポフェクションによる安定的なトランスフェクションに基づいた方法が挙げられる。

プラスミドｐＥＦ３２１Ｔ［Ｋｉｍら、１９９０、Ｇｅｎｅ ９１、２１７〜２２３］は、伸長因子１α（ＥＦ−１α）の普遍的プロモーター下のＳＶ４０ウイルスのＴ抗原のロングアームを発現し、それは、それを発現する細胞を不死化する能力がある。この抗原は、細胞を腫瘍性細胞へ転換する一連の癌原遺伝子を活性化する。その後、得られた様々なクローンを、それぞれにおいて、ＣＢを構成するものの中でどの細胞型が不死化しているかを同定することを目的として、分子生物学、組織学、及び免疫組織化学の技術を用いて特徴づける。

プラスミドｐＲＩＴＡ（Ｔ抗原での可逆的不死化）［Ｔｏｂｉａｓ Ｍら、２００４、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３２、５５２９〜５５３８］は、ドキシサイクリンに応答するトランス活性化因子ｔＴＡが結合している双方向性プロモーターＰ_ｂｉＴＡを有する。この活性化因子は、ドキシサイクリンの存在下で、ＳＶ４０のＴ抗原のｍＲＮＡの発現、したがって、細胞増殖を可能にし、細胞を可逆的不死性へ転換する。ドキシサイクリンの非存在下では、リプレッサーｒｔＴＡ２Ｍ２（ＳＶ４０のＴ抗原のリプレッサー）のｍＲＮＡが発現し、不死化を可逆性にし、したがって、細胞増殖を減速させる。リプレッサーの発現については、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子のそれ、及びネオマイシン抵抗性カセットのそれに連結しており、それは、ネオマイシンでクローンを選択し、且つ蛍光顕微鏡を用いて不死化の可逆性を検証することを可能にする。増殖が復帰する前に様々なクローンを選択し、分子生物学、免疫組織化学、及び電気生理学の技術によって特徴づける。ＧＦＡＰ＋細胞（本発明の幹細胞）を有するクローンは、ＰＣＲによって同定し、選択することができる。さらに、必要に応じて、グロムス細胞の典型的マーカー（ＴＨ＋）を有し、且つＧＤＮＦを産生するクローンにおいて、増殖工程の逆転は、培地からドキシサイクリンを除去し、ネオマイシンを加えることによって可能であり、必要なら、それらは、パーキンソン病の動物モデルの線条体内移植に用いられる。

特定の実施形態において、前記の本発明の可逆的不死化細胞は、本発明の可逆的不死化幹細胞、又は本発明の可逆的不死化前駆細胞、又は本発明の可逆的不死化分化細胞であり、有利には、本発明の可逆的不死化分化細胞である。

別の特定の実施形態において、本発明は、本発明の可逆的不死化細胞、即ち、本発明の可逆的不死化幹細胞及び／又は本発明の可逆的不死化前駆細胞及び／又は本発明の可逆的不死化分化細胞の２つ以上の型の組合せを提供する。

本発明の細胞集団
別の態様において、本発明は、本発明の幹細胞、本発明の前駆細胞、本発明の分化細胞、本発明の不死化細胞、及びそれらの組合せを含む群から選択される細胞のセットを含む、以下「本発明の細胞集団」と称する、ＣＢ由来の単離された細胞集団に関する。前記細胞の特徴は、すでに述べられている。本発明の細胞は、高い血清含有量（典型的には、２０％より多い）及び約１０重量％の量のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの凍結保存剤を有する適切な培地、例えば、ＮＣ培地中、−８０℃で凍結することによって長期間、保存することができる。

前記の本発明の細胞集団は、必要に応じて、移植のための細胞バンクに入れておくことができる。特定の実施形態において、前記細胞バンクは、重要な抗原の少なくとも１つ又は複数の遺伝子、即ち、組織適合性抗原をコードする遺伝子（例えば、ヒト集団に存在する主要組織適合複合体（ＭＨＣ）の対立遺伝子）についてホモ接合性の、複数の本発明の可逆的不死化細胞、好ましくは本発明の可逆的不死化分化細胞を含む。前記バンクから、移植を必要とする対象のＭＨＣの対立遺伝子と適合性の組織適合性抗原の１つ又は複数の対立遺伝子についてホモ接合性である本発明の可逆的不死化細胞を選択することが可能である。

必要に応じて、本発明の細胞集団は、再構成後その生存能に影響することも損なうこともない条件下で凍結状態にしておくことができる。

本発明の幹細胞、前駆細胞、及び分化細胞の増殖
別の態様において、本発明は、神経冠に特異的な培養基中、低酸素条件下で、前記の本発明の幹細胞又は前駆細胞を培養することを含む、以下「本発明の増殖方法」と称する、前記の本発明の幹細胞又は前記の本発明の前駆細胞の増殖又は調製のための方法に関する。

したがって、本発明のこの態様によれば、上記の本発明の態様のいずれか１つによる幹細胞を調製する方法が提供されており、その方法は、低酸素に曝された生物体から単離された頚動脈小体を分散させる段階と、ニューロスフェアを形成する能力を有する細胞を単離する段階とを含む。好ましくは、本発明の細胞は、グロムス組織から単離される。適切な細胞は、グリア型の支持細胞（ＩＩ型）である。

グロムス組織については、好ましくは、当技術分野において知られた技術を用いて酵素的に分散させる。分散に適した酵素として、コラゲナーゼ（Ｉ型、ＩＩ型、及び／又はＩＶ型）、トリプシン、及びエラスターゼが挙げられる。グロムス組織は、例えば、微細ピンセットを用いて、及び／又はそれらを機械的にピペッティングすることによって、さらに分散させることができる。

特定の実施形態において、前記の本発明の幹細胞又は前駆細胞は、ニューロスフェア形成に必要な浮遊状態下での培養を可能にする、ニューロスフェアの形成を可能にするための非接着性表面上で培養される。

神経冠に特異的な前記培地は、培地、栄養源、抗生物質、及び成長因子を含む。特定の実施形態において、前記培地はＤＭＥＭ：Ｆ−１２である；前記栄養源は、ニワトリ胚抽出物、好ましくは胚体を培地全体の少なくとも５％、好ましくは５％〜２０％、より好ましくは１５％の濃度で含む；前記抗生物質は、培養基全体に対して０．５〜２重量％の典型的濃度でのペニシリン、ストレプトマイシン、及びそれらの混合物から選択される；並びに、前記成長因子は、１０〜４０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２０ｎｇ／ｍｌの濃度（それらそれぞれ）でのｂＦＧＦを含むＦＧＦ又はその機能性変異体、ＩＧＦ−Ｉ又はその機能性変異体、ＥＧＦ又はその変異体、及び前記因子の組合せから選択される。前記成長因子（ＦＧＦ、ＥＧＦ、及びＩＧＦ−Ｉ）は天然でも組換え型でもあり得るが、代替として、当業者によく知られている前記成長因子の機能性変異体を用いることも可能である。具体的な実施形態において、神経冠に特異的な前記培養基（ＮＣ培地）は、ヒト組換えｂＦＧＦ、ヒト組換えＩＧＦ−Ｉ、及びヒト組換えＥＧＦを含む。加えて、必要に応じて、神経冠に特異的な培地は、窒素源及びＢ２７を追加することができる。

培養は、低酸素条件で、即ち、１５％未満、好ましくは１〜１０％、より好ましくは２〜５％、さらに好ましくは３％の酸素濃度の存在下で、行われる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、２０００、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２０、７３７０〜７３７６参照）。そのような条件は、クローン原性増殖を刺激する。

さらに、前記培養は、３５℃〜３９℃の温度、好ましくは３７℃で行われる。

本発明の増殖方法を用いて、述べられた前記細胞型（本発明の幹細胞又は本発明の前駆細胞）のいずれかの純粋培養物か、又は前記細胞型の混合培養物かのどちらかの治療有効量などの相当量を得ることが可能である。

これらの方法により生じた細胞は、それらの増殖能、自己複製能、及び分化能を観察することによって検出することができる。自己複製能を試験することについては、個々の一次ニューロスフェアを、ポリＬ−リシンで処理された接着性基質上に再び蒔き、ＮＣ培地と４８時間、インキュベートすることができる。次に、それらを、トリプシンで脱離させ、機械的に分散させ、最後に、ＮＣ培地を含む非接着性プレート上で再び培養する。二次ニューロスフェアは、１０日間の培養後、カウントすることができる。

細胞は、それぞれがＧＦＡＰ、ＴＨ、及びネスチンの１つに結合する１つ、２つ、又は３つの抗体を用いて検出することができる。適切な抗体は市販されており、例えば、ウサギで産生された抗ＴＨ抗体（１：１０００、Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ、Ｒｏｇｅｒ、ＡＲ）、及びこれもまたウサギで産生された抗ＧＦＡＰ抗体（１：５００、ＤＡＫＯ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ、ＣＯ）がある。マーカーを免疫組織化学的分析によって検出するために、組織切片を用いることができる。まず、切片を、ブロッキング溶液（１０％のヤギ血清、０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、及び０．３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ）を加えたリン酸緩衝液）で室温、１時間、事前にブロッキングする。マーカーに対する（例えば１：１００に、希釈された）一次抗体を組織上で４℃、一晩、インキュベートし、続いて、二次抗体（例えば１：２００に、希釈されたフルオレセイン結合二次抗体；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ；又はＡｌｅｘａ ５６８と結合した二次抗体（１：５００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ））で室温で４時間インキュベートする。最後に、組織を、リン酸緩衝食塩水［ＰＢＳ］中に調製された７０％のグリセロールでの集合の前に、核をマーキングするために、例えば、２．５ｍｇ／ｍｌの４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールジヒドロクロライド［ＤＡＰＩ］（Ｓｉｇｍａ）で室温、１０分間、染色してもよい。

細胞の単離に用いられる特定の方法は、本発明の本質的特徴ではない。とは言っても、本発明の幹細胞の物理的及び機能的特性の知識を用いて、これらの細胞を組織から単離するのに利用することができるいくつかの方法が当技術分野において知られている。この方法は例示としてのみ提供され、限定することを意図するものではない。

もちろん、上記のものの代わりとなる、当技術分野において知られたいくつかの物理的分離方法のいずれか１つを用いて、本発明の細胞を選択し、これらを他の細胞型から区別することができる。そのような物理的方法として、本発明の細胞によって特異的に発現したマーカーに基づく、ＦＡＣＳ及び様々な通常のイムノアフィニティー方法を挙げることができる。例えば、抗ＧＦＡＰ抗体を用いるＦＡＣＳ分析が、精製された細胞集団を提供することは当業者にとって明らかであろう。しかしながら、いくつかの実施形態において、上記で列挙された他の同定可能なマーカーの１つ又は複数を任意で既知の幹細胞マーカーと共に用いて、ポジティブ選択か又はネガティブ選択のいずれかによるＦＡＣＳ分析をさらに１ラウンドを行うことによって、細胞集団をさらに精製することは好ましいことがある。

適用
薬学的組成物
別の態様において、本発明は、治療有効量の前記の本発明の幹細胞、前駆細胞、若しくは分化細胞、若しくはそれらの組合せ、又は前記の本発明の不死化細胞、又は前記の本発明の細胞集団、及び薬学的に許容される賦形剤を含む、以下、本発明の薬学的組成物と称する、薬学的組成物に関する。

可逆的不死化細胞を含めた、前記細胞及び細胞集団の固有の特徴は、前に記載されている。

特定の実施形態において、本発明の薬学的組成物は、治療有効量の、前記の本発明の分化細胞、又は前記の本発明の可逆的不死化分化細胞、又は前記の本発明の分化細胞及び／若しくは前記の本発明の可逆的不死化分化細胞を含む本発明の細胞集団を含む。

本明細書に用いられる場合、用語「治療有効量」は、所望の治療効果を生じる能力がある本発明の薬学的組成物が含まなければならない、本発明の幹細胞、前駆細胞、若しくは分化細胞、若しくはそれらの組合せの量、又は前記の本発明の不死化細胞の量、又は前記の本発明の細胞集団の量を指す；一般的に、前記治療有効量は、とりわけ、細胞の固有の特徴及び追求される所望の治療効果によって決定される。一般的に、投与されなければならない本発明の細胞の治療有効量は、とりわけ、治療される疾患の重症度、対象の固有の特徴、冒された領域などに依存する。こういうわけで、本記載に述べられた用量は、上記の因子に依存する前記用量を調整しなければならないこの分野の専門家にとっての規準としてのみみなされなければならない。例示として、但し非限定的に、本発明の薬学的組成物は、約１×１０^５〜１×１０^９個、好ましくは１×１０^６〜１×１０^８個、より好ましくは１×１０^７〜５×１０^７個の本発明の幹細胞、前駆細胞、若しくは分化細胞、若しくはそれらの組合せ、又は本発明の不死化細胞を含む単一用量として投与することができる。投与は、患者の状態及び進行に依存して、数日間、数週間、又は数カ月の時間間隔で繰り返すことができ、それは、いずれの場合にも、専門家によって設定されなければならない。

本発明の幹細胞、前駆細胞、又は分化細胞、本発明の不死化細胞、及び本発明の細胞集団に存在する細胞は、自己、同種異系、又は異種の起源の細胞であり得る。特定の実施形態において、前記細胞は自己起源であり、それらが投与されることになっている対象のＣＢから単離され、したがって、前記細胞に対する抗原性及び／又は免疫原性応答に関連した潜在的な合併症を低減する。

必要に応じて、本発明の幹細胞、前駆細胞、又は分化細胞、又はそれらの組合せ、本発明の不死化細胞、及び本発明の細胞集団のそれらは、上記のように、効力を増加させる、罹患率を低下させる、又は方法を促進するために細胞の単一の型を選択すること、又は細胞集団を濃縮することを目的として、抗体による陽性及び／又は陰性細胞の選択を用いて、精製することができる。特定の実施形態において、前記の本発明の薬学的組成物は、大部分は、本発明の分化細胞、例えば、グロムス細胞（ＴＨ＋／ネスチン−）、又は本発明の可逆的不死化分化細胞、例えば、可逆的不死化グロムス細胞、又は前記細胞、例えば、グロムス細胞が実質的に濃縮された本発明の細胞集団を含む。

本発明によれば、本発明の幹細胞、前駆細胞、又は分化細胞、本発明の可逆的不死化細胞、及び本発明の細胞集団の細胞は、それらに追加の処理を施す必要なしに、又は前記細胞を精製するための追加の処理を施した後、対象に投与することができる。さらに、前記の本発明の幹細胞、前駆細胞、又は分化細胞、前記の本発明の不死化細胞、及び本発明の細胞集団の細胞は、単独か、又は他の細胞集団と共に、例えば、それらが移植されることになっているＣＮＳ若しくはＰＮＳの領域の他の細胞と共にかのいずれかで、投与することができる。

本明細書に用いられる場合、用語「薬学的に許容される賦形剤」は、それが連邦政府若しくは中央政府の規制機関によって承認されなければならないという事実、又は動物及びヒトでの使用が一般的に認められた、米国薬局方若しくはヨーロッパ薬局方、若しくはいくつかの他の薬局方に収載されたものを指す。用語「媒体」は、本発明の幹細胞、前駆細胞、又は分化細胞、本発明の可逆的不死化細胞、及び本発明の細胞集団の細胞が共に投与されなければならない希釈剤、賦形剤、担体、又はアジュバントに関する；明らかに、前記媒体は、細胞と適合性でなければならない。前記媒体の例示的な非限定的例として、任意で血清、好ましくは自己血清を追加した、任意の生理的適合性媒体、例えば、等張液（例えば、滅菌食塩水（０．９％ＮａＣｌ）、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、乳酸リンゲル液など）；培地（例えば、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、ＭｃＣｏｙなど）；又は好ましくは、コラーゲン、コラーゲン−グリコサミン−グリカン、フィブリン、ポリ塩化ビニル、ポリリシン又はポリオルニチンなどのポリアミノ酸、ヒドロゲル、アガロース、硫酸デキストリン、シリコンなどの固体、半固体、ゼラチン状、又は粘性の支持媒質が挙げられる。さらに、特別な実施形態において、必要に応じて、支持媒質は、成長因子又は他の作用物質を含む。支持媒質が固体、半固体、又はゼラチン状の場合には、細胞は、後でより固い相へ変換されるように処理される媒体の液相に導入することができる。媒体が固体構造を有する本発明のいくつかの実施形態において、前記媒体は、病変の形に従って形成することができる。

本発明の薬学的組成物は、必要に応じて、細胞の所望の治療効果を増加させる、及び／又は調節するために、必要な時に、添加剤、例えば、緩衝剤、表面活性剤、保存剤なども含むことができる。薬学的に許容される担体は、細胞の生存能を支持する細胞培地を含んでもよい。培地は、一般的に、レシピエントにおいて免疫応答を誘発することを避けるために無血清である。担体は、一般的に、緩衝化しており、及び／又は発熱物質を含まない。また、細胞懸濁液を安定させるために、金属のキレート化剤を加えることが可能である。本発明の薬学的組成物の液体培地における細胞の安定性は、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸などの追加の物質を加えることによって向上させることができる。本発明の薬学的組成物に用いることができる前記の薬学的に許容される物質は、一般的に、当業者に知られており、通常、細胞組成物の製造に用いられる。適切な薬学的媒体の例は、Ｅ．Ｗ． Ｍａｒｔｉｎによる「レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）」に記載されている。前記媒体に関する追加の情報は、製薬技術（即ち、製剤学）のいずれのマニュアルにも見出すことができる。

本発明の薬学的組成物は、適切な薬学的投与型で投与される。このために、本発明の薬学的組成物は、選択された投与型に従って製剤化される。製剤は、投与方法に適応する。特別な実施形態において、薬学的組成物は、治療を必要とする対象に移植、注射、又は注入によって投与するために、液体、固体、又は半固体の剤形に、例えば、懸濁液の形に、調製される。例示的な非限定的例として、他の投与経路も用いることができるが、非経口的に対象へ投与するための、薬学的に許容される賦形剤、例えば、等張液、例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、又は任意の他の適切な薬学的に許容される媒体を含む滅菌懸濁液中の本発明の薬学的組成物の製剤が挙げられる。

本発明の薬学的組成物の、それを必要とする対象への投与は、通常の手段を用いて行われる。特定の実施形態において、前記の本発明の薬学的組成物は、注射器、カテーテル、トロカール、カニューレなどの適切な装置を用いて非経口的に対象へ投与することができる。すべての場合において、本発明の薬学的組成物は、細胞組成物の投与に適し、且つ当業者に知られた機器、器具、及び装置を用いて投与される。

別の実施形態において、有効であることが意図される部位への本発明の薬学的組成物の直接投与は有利の可能性がある。この方法において、所望の器官又は組織への本発明の薬学的組成物の直接投与は、適切な装置、例えば、適切なカニューレを挿入することにより、注入（逆流機構を含む）により、又は本特許に記載された若しくは当技術分野において知られた他の手段により、罹患器官又は組織の外面上の直接投与（例えば、注射によるなど）によって達成することができる。好ましい実施形態において、本発明の薬学的組成物は、ＣＮＳ又はＰＮＳの損傷領域へ直接、投与される。

本発明の薬学的組成物は、当業者に知られた通常の方法によって、その適用の瞬間まで保存することができる。短期保存（６時間未満）については、本発明の薬学的組成物は、栄養溶液を追加して、又は追加せずに、密封容器に室温で、又は室温より低い温度で、保存することができる。中期保存（４８時間未満）は、好ましくは、２〜８℃で行われ、本発明の薬学的組成物は、細胞接着を防ぐ材料で作られた、又はその材料で裏打ちされた容器中に、さらに、等浸透圧緩衝液を含む。長期保存は、好ましくは、適切な凍結保存、及び細胞機能の保持を促進する条件下の保存によって行われる。

具体的な実施形態において、本発明の薬学的組成物は、併用療法に用いることができる。好ましい具体的な実施形態において、前記の薬学的組成物は、神経変性疾患の治療のための、又は神経系の虚血性、外傷性、若しくは自己免疫性病変によって引き起こされる疾患の治療のための追加の薬学的組成物と併用して投与される。このように、本発明の細胞は、単剤療法として、又は前記疾患の治療のための他の通常の方法と併用した治療として用いることができる。

本発明の薬学的組成物は、すでに記載されているように、神経変性疾患の治療に、又は神経系の虚血性、外傷性、若しくは自己免疫性病変によって引き起こされる疾患の治療に有用な追加の薬物との併用療法に用いることができる。前記の追加の医薬品は、同じ薬学的組成物の一部を形成することができ、又は代わりとして、本発明の薬学的組成物の投与に対して同時又は連続（時間的に逐次）投与として別個の組成物の形で供給することができる。具体的な実施形態において、前記の追加の薬学的組成物を、本発明の幹細胞、前駆細胞、及び／又は分化細胞を含む薬学的組成物に対して同時に投与し、又は逐次的に、任意の順序で、投与し、時間をかけて散開させる、即ち、本発明の薬学的組成物を、最初に投与し、その後、神経変性疾患の治療のための、又は神経系の虚血性、外傷性、若しくは自己免疫性病変によって引き起こされる疾患の治療のための他の追加の医薬品又は他の薬学的組成物を投与することができ、或いは前記疾患の治療のための他の追加の医薬品又は他の薬学的組成物を最初に投与し、その後、本発明の薬学的組成物を投与することができる。或いは、これらの２つの成分のいずれも同じ組成物に一緒に混合し、一緒に投与することができる。別の代替の実施形態において、前記の本発明の薬学的組成物、及び前記神経変性疾患の治療のための、又は神経系の虚血性、外傷性、若しくは自己免疫性病変によって引き起こされる疾患の治療のための他の追加の医薬品又は他の薬学的組成物を、同時に投与する。

本発明の細胞及び細胞集団の治療的使用
別の態様において、本発明は、神経変性疾患の治療のための薬学的組成物の開発、例えば、アルツハイマー病の治療、パーキンソン病の治療、神経系の虚血性病変の治療、神経系の外傷性病変の治療、又は神経系の自己免疫性病変の治療における、前記の本発明の幹細胞、前駆細胞、若しくは分化細胞、若しくはそれらの組合せ、又は前記の本発明の不死化細胞、又は前記の本発明の細胞集団の使用に関する。

特定の実施形態において、前記細胞は、本発明の分化細胞、又は本発明の可逆的不死化分化細胞、又は前記の本発明の分化細胞及び／若しくは前記の本発明の可逆的不死化分化細胞を含む本発明の細胞集団の細胞である。前記細胞は、自己、同種異系、又は異種の起源であり得るが、特定の実施形態において、前記細胞は自己起源であり、それらが投与されることになっている対象のＣＢから単離され、したがって、前記細胞に対する抗原性及び／又は免疫原性応答に関連した潜在的な合併症を低減する。さらに、特定の実施形態において、前記細胞はニューロスフェアの形をとる。

別の態様において、本発明は、治療有効量の前記の本発明の幹細胞、前駆細胞、若しくは分化細胞、若しくはそれらの組合せ、又は治療有効量の前記の本発明の不死化細胞、又は治療有効量の前記の本発明の細胞集団、好ましくは、任意で可逆的に不死化した、本発明の分化細胞を、前記疾患に冒された領域に移植すること（ｇｒａｆｔｉｎｇ）（移植すること（ｉｍｐｌａｎｔｉｎｇ）又は移植すること（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｎｇ））を含む、疾患、好ましくは、神経変性疾患、又は神経系の虚血性、外傷性、若しくは自己免疫性病変によって引き起こされた疾患の治療の方法に関する。特定の実施形態において、前記神経変性疾患は、アルツハイマー病又はパーキンソン病である。さらに、特定の実施形態において、前記細胞は、グロムス細胞（ネスチン−／ＴＨ＋）、好ましくは、ニューロスフェアの形をとるグロムス細胞である。

前記細胞及び／又はニューロスフェアの移植は、先行技術で知られた技術によって行うことができるが、好ましくは、硬性カニューレを用いる定位手術によって移植される。移植される組織（細胞及び／又はニューロスフェア）の局在化及び量は、疾患の型及び重症度に依存する。パーキンソン病患者の場合、細胞移植は、好ましくは、尾状核及び／又は被殻で両側性に行われる。好ましくは、最低１０^６個の細胞、１０^７個の細胞、１０^８個の細胞、又はそれ以上が脳の両側に移植される。別の実施形態において、細胞を、生体適合性インプラントに付着した損傷組織へ移植してもよい。この実施形態内において、細胞を、患者への移植の前に、インビトロで生体適合性インプラントに付着させてもよい。当業者にとって明らかであるように、移植の前に、細胞をインプラントに付着させるためにいくつかの接着剤のいずれか１つを用いてもよい。ほんの一例として、そのような接着剤には、フィブリン、インテグリンファミリーの１つ又は複数のメンバー、カドヘリンファミリーの１つ又は複数のメンバー、セレクチンファミリーの１つ又は複数のメンバー、１つ又は複数の細胞接着分子（ＣＡＭ）、免疫グロブリンファミリーの１つ又は複数、及び１つ又は複数の人工接着剤を挙げることができる。このリストは、例示としてのみ提供されるのであって、限定することを意図するものではない。１つ又は複数の接着剤の任意の組合せを用いてもよいことは、当業者にとって明らかであろう。

別の実施形態において、患者へのマトリックスの移植の前に、細胞をマトリックスに包埋してもよい。一般的に、マトリックスは、患者の損傷組織へ移植される。マトリックスの例として、コラーゲンベースのマトリックス、フィブリンベースのマトリックス、ラミニンベースのマトリックス、フィブロネクチンベースのマトリックス、及び人工マトリックスが挙げられる。このリストは、例示としてのみ提供されるのであって、限定することを意図するものではない。

さらなる実施形態において、細胞を、マトリックス形成成分と共に患者へ移植又は注射してもよい。これは、細胞が、注射又は移植後、マトリックスを形成するのを可能にし、細胞が患者内の適当な位置に留まることを確実にすることができる。マトリックス形成成分の例として、フィブリン糊、液体アルキル、シアノアクリレートモノマー、可塑剤、デキストランなどの多糖、エチレンオキシドを含むオリゴマー、ポロキサマー及びプルロニックなどのブロックコポリマー、Ｔｗｅｅｎ及びＴｒｉｔｏｎ‘８’などの非イオン性界面活性剤、及び人工マトリックス形成成分が挙げられる。このリストは、例示としてのみ提供されるのであって、限定することを意図するものではない。１つ又は複数のマトリックス形成成分の任意の組合せを用いてもよいことは、当業者にとって明らかであろう。

さらなる実施形態において、細胞をミクロスフェア内に入れてもよい。この実施形態内において、細胞を、ミクロスフェアの中心内にカプセル化してもよい。また、この実施形態内において、細胞を、ミクロスフェアのマトリックス材へ包埋してもよい。マトリックス材としては、任意の適切な生分解性ポリマーを挙げることができ、それらには、アルギン酸塩、ポリエチレングリコール（ＰＬＧＡ）、及びポリウレタンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。このリストは、例示としてのみ提供されるのであって、限定することを意図するものではない。

さらなる実施形態において、移植用の医療装置に細胞を付着させてもよい。そのような医療装置の例として、ステント、ピン、ステッチ、スプリット、ペースメーカー、人工関節、人工皮膚、及びロッドが挙げられる。このリストは、例示としてのみ提供されるのであって、限定することを意図するものではない。細胞を、医療装置に様々な方法によって付着させてもよいことは当業者にとって明らかであろう。例えば、細胞を、フィブリン、インテグリンファミリーの１つ又は複数のメンバー、カドヘリンファミリーの１つ又は複数のメンバー、セレクチンファミリーの１つ又は複数のメンバー、１つ又は複数の細胞接着分子（ＣＡＭ）、免疫グロブリンファミリーの１つ又は複数、及び１つ又は複数の人工接着剤を用いて医療装置に付着させてもよい。このリストは、例示としてのみ提供されるのであって、限定することを意図するものではない。１つ又は複数の接着剤の任意の組合せを用いてもよいことは、当業者にとって明らかであろう。

前記の本発明の幹細胞、前駆細胞、又は分化細胞、及び前記の本発明の不死化細胞、及び前記の本発明の細胞集団は、上記の方法を用いて得ることができる。

潜在的な治療用化合物に対する細胞応答のインビトロ評価方法
別の態様において、本発明は、潜在的な治療用化合物に対する細胞応答のインビトロ評価のための方法であって、本発明の幹細胞、前駆細胞、若しくは分化細胞、若しくはそれらの組合せ、及び／又は本発明の不死化細胞、及び／又は本発明の細胞集団を含む培養物を、潜在的な治療用化合物と接触させる段階と、前記培養物に存在する細胞に前記化合物によって引き起こされた効果を評価する段階とを含む方法に関する。

特定の実施形態において、前記細胞は、任意でニューロスフェアの形をとる、本発明の分化細胞、特に、グロムス細胞に分化した細胞（ネスチン−／ＴＨ＋）である。

ＧＤＮＦの製造のための本発明の細胞の使用
驚くべきことに、例７に示されているように、頚動脈小体由来の幹細胞から生じたニューロスフェアは、ＧＤＮＦを合成する能力も獲得しているインビボで新たに形成されたグロムス細胞と同様に、インビトロでＧＤＮＦを産生することができる（例４参照）。産生は、グロムス細胞に対応するニューロスフェア領域で検出することができる。したがって、本発明の幹細胞、前駆細胞、若しくは分化細胞、若しくはそれらの組合せ、又は本発明の細胞集団は、ＧＤＮＦの製造に用いることができる。

その目的のために、本発明の分化細胞は、連続的低酸素刺激下で培養するなどの、幹細胞及び／又は前駆細胞の所望の分化細胞への分化を可能にする条件下で、本発明の幹細胞及び／又は前駆細胞を培養することを含む方法によって得られるはずである；分化の後、細胞を、ＧＤＮＦの製造にそれらを用いるために正常酸素圧下で培養することができる。したがって、本記載によって提供される情報に基づいて、本発明の分化細胞は、ＣＢから、又はＣＢの幹細胞から、又はＣＢの前記幹細胞由来の前駆細胞から、当業者に知られた通常の方法によって得て、且つ培養することができる。

ヒトから得られた本発明の細胞を用いることが好ましいが、これは、パーキンソン病の治療のための治療剤としてＧＤＮＦの有用性を評価するために行われた臨床試験中に観察された障壁の一部をこれが解決することができたからである。霊長類研究により、ＧＤＮＦ遺伝子を受けた動物において（治療を受けなかった動物と比較して）運動能力の改善が示された。治療された動物において、パーキンソン病様症状は低減し、動物を屠殺した後、健康なドーパミンニューロンの数が、有意に増加したことが見出された。所見の概要は、Ｋｏｒｄｏｗｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９０、７６７（２０００）で発表された。これや、Ｄｏｎ Ｇａｓｈ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｋｅｎｔｕｃｈｙ、ＵＳＡ）によって行われた他の研究に基づいて、ＧＤＮＦのヒトの無作為化二重盲検試験が開始された。この試験から得られた結果は、議論の余地があり、ＧＤＮＦからの利益はほとんど示されなかった。試験中見出された他の局面は、いくらかの参加者における「中和抗体」の検出であった。これらの２つの理由により、臨床試験担当の会社が、２００４年、ＧＤＮＦの試験を中止することに至った。試験中に観察された中和抗体の出現及び好ましくない結果は、用いられたＧＤＮＦが細菌から単離された組換えＧＤＮＦであったという事実に関連し得ることが示唆されたため、ヒト細胞から直接得られたＧＤＮＦは、中和抗体を生じず、パーキンソン病の治療のための治療剤としてより有用であることが証明され得る。したがって、本発明の分化したヒト細胞の培養物からのその産生及び単離は、パーキンソン病の治療に見出された問題の一部を克服するのに有用であり得る。

以下の実施例は、本発明を例示するが、それを限定するものとみなしてはならない。

本発明の開発及びその適用の実施例に用いられた材料及び方法は、下記に詳述されている。前記実施例は本発明を限定しない−それらの目的は、それを例示し、頚動脈小体における幹細胞の存在、それらの増殖及び分化を促進する方法、並びにその使用を実証することである。

材料及び方法
１．動物
これらの研究に用いられる野生型ウィスターラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）、及びトランスジェニックマウスについては、欧州委員会によって規定されたガイドライン（８６１６０９／ＥＥＣ）に従って、飼育し、取り扱った。トランスジェニックマウス（ｌｏｘＰ隣接ＧＦＡＰ−Ｃｒｅ／ＬａｃＺ、ＧＤＮＦ／ＬａｃＺ）は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から入手され、ｌｏｘＰ隣接Ｗｎｔ１−Ｃｒｅ／ＬａｃＺマウスは、Ａｎｄｒｅｗ ＭｃＭａｈｏｎ博士（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＵＳＡ）によって供給された。トランスジェニック動物のジェノタイピングについては、それらを作製した研究者の指示に従ってＰＣＲにより行った。

２．インビボでの長期低酸素の処理及びＢｒｄＵの供給
月齢２〜３カ月の野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、Ｏ_２及びＣＯ_２のレベルの調節、並びに温度及び湿度のモニタリングを提供する、このための特別の密閉チャンバー（ＣＯＹ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ＩＮＣ．、Ｇｒａｓｓ Ｌａｋｅ、ＭＩ）を用いて、１０％酸素を有する環境大気に長期間、曝した。頚動脈小体における増殖事象を明らかにするために、マウスに、実験全体を通して７日ごとに、５０ｍｇ／ｋｇの５−ブロモ−２−デオキシウリジン［ＢｒｄＵ］（Ｓｉｇｍａ）を腹腔内に注射した。加えて、飲料水に１ｍｇ／ｍｌのＢｒｄＵを追加した。低酸素／正常酸素圧処理後の動物の処理は、４％の固定剤パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（Ｓｉｇｍａ）の心臓内注入による全組織の固定化を含んだ。次に、頚動脈分岐部を取り出し、ＰＦＡ中、２時間、後固定した。３０％スクロース（Ｓｉｇｍａ）中の１２時間の凍結保護後、分岐部を、水溶性グリコール及び樹脂に基づいた配合剤であるコンパウンドＯＣＴ（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）に包埋して、ブロックを形成し、分岐部をクリオスタットで切断することを可能にして、１０ミクロンの厚さをもつ頚動脈小体のスライスを得た。

３．免疫組織化学的分析
組織切片において免疫組織化学的分析によりＢｒｄＵを検出するために、ＤＮＡを、２Ｍ ＨＣｌで、室温で４５分間、変性させ、その後、０．１Ｍホウ酸ナトリウムで中和する。次に、切片を、ブロッキング溶液（１０％のヤギ血清、０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、及び０．３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ）を加えたリン酸緩衝液）で室温、１時間、事前にブロッキングする。ＢｒｄＵに対する一次抗体（１：１００、Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ）を、組織上、４℃で一晩、インキュベートし、続いて、フルオレセインと結合した二次抗体（１：２００、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）と室温で４時間、インキュベートした。ＤＮＡの変性／再生の段階を含まないことを除いてＢｒｄＵについてと同じプロトコールに従って、用いた他の抗体は、以下であった：ウサギで産生されたマウス抗ＴＨ抗体（１：１０００、Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ、Ｒｏｇｅｒ、ＡＲ）及びこれもまたウサギで産生されたマウス抗ＧＦＡＰ抗体（１：５００、ＤＡＫＯ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ、ＣＯ）、両方とも、それらに続いて、Ａｌｅｘａ ５６８と結合した抗ウサギ二次抗体（１：５００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を用いた。最後に、リン酸緩衝食塩水［ＰＢＳ］中に調製された７０％のグリセロールでの集合の前に、核をマーキングするために、組織を、２．５ｍｇ／ｍｌの４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールジヒドロクロライド［ＤＡＰＩ］（Ｓｉｇｍａ）で、室温、１０分間、染色する。これらの試験において、ＴＨ＋細胞は赤色、ＢｒｄＵ＋は緑色、ＤＡＰＩ＋は青色で可視化した。

４．頚動脈小体の単細胞への解離
生後２０日のウィスターラットの頚動脈小体を、解体し、冷リン酸緩衝液中に置いた。グロムス組織を、酵素溶液（０．６ｍｇコラゲナーゼＩＩ、０．３ｍｇトリプシン、７．５マイクロリットルのブタエラスターゼ（ストック：２５０Ｕ／ミリリットル）、及び５ｍＭストックからの１０マイクロリットルのＣａＣｌ_２を含む１ｍｌリン酸緩衝液）中、３７℃で２０分間、インキュベートした。次に、グロムス組織を、微細ピンセットを用いて解体し、３７℃でさらに７分間、インキュベートし、最後に、細胞を、それらを機械的にピペッティングすることによって分散させた。細胞密度を、サイトメータ（Ｓｉｇｍａ）を用いて測定した。

５．ニューロスフェアの形をとるインビトロでの成長の試験
分散した頚動脈小体細胞を、個々に同定可能なニューロスフェアの形成を促進し得るクローン密度で、典型的には非接着性のために処理された６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）内で培養した。クローン成長及び個別化の実験については、非接着性のために処理されたプレートを用いたが、６ウェルの代わりに９６ウェルのものを用いた。培地は以下を含んだ：Ｄ−ＭＥＭ：Ｆ−１２（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、（Ｓｔｅｍｐｌｅ及びＡｎｄｅｒｓｏｎ、１９９２；Ｃｅｌｌ ７１、９７３〜９８５に記載されているように調製された）１５％のニワトリ胚抽出物、１％のＮ_２サプリメント（Ｇｉｂｃｏ）、２％のＢ２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｃａｍｂｒｅｘ、Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）、２０ｎｇ／ｍｌのヒト組換え塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、２０ｎｇ／ｍｌのヒト組換えインスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−１）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、並びに塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、及びヒト組換え上皮成長因子（ＥＧＦ）を含む２０ｎｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。この研究を通して、この培地組成は、神経冠培地（ＮＣ培地）と呼ばれる。すべての培養を、調節されたＣＯ_２レベル、３％の固定酸素レベル、及び３７℃でのインキュベータ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐ．、Ｗａｌｔａｒｍ、ＭＡ）内で行った。

頚動脈小体由来の幹細胞の自己複製能を試験するために、個々の一次ニューロスフェアを用い、それらを、ポリＬ−リシンで処理された接着性基質上に再び蒔き、ＮＣ培地と４８時間、インキュベートした。次に、それらをトリプシンで脱離させ、機械的に分散させ、最後に、細胞を非接着性プレート上、ＮＣ培地で再び培養した。１０日間の培養後、二次ニューロスフェアをカウントした。

ニューロスフェア内の様々な細胞の免疫細胞化学的同定については、これらを４％ＰＦＡ中に固定し、薄切片を得るために、完全な頚動脈小体についてと同じプロトコールをそれらに適用した（凍結保護、包埋、及び１０ミクロンの微細切断）。

他の場合において、ニューロスフェアを、接着性のために処理されたプレート上に再び蒔き、ＮＣ培地と１０日間インキュベートし、コロニーが増殖した時点で、４％ＰＦＡで固定した。その後、以下の典型的な免疫細胞化学的プロトコールを適用した：室温で１時間の事前ブロッキング、一次抗体との１時間、及び二次抗体とのもう１時間のインキュベーション、並びに最後の、細胞核を青色に染色するＤＡＰＩでの対比染色。ブロッキング溶液は、組織について用いられたのと同じであった（上記参照）。接着性の条件下の試料に用いた抗体は以下であった：マウスで産生された抗ＴＨ抗体（１：５００、Ｓｉｇｍａ）、続いて、ヤギで産生され、且つローダミンと結合した抗マウス二次抗体（１：１００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）、及び抗平滑筋アクチン抗体（ＳＭＡ、Ｓｉｇｍａ）、続いて、ロバで産生され、且つＣｙ２と結合した抗マウス二次抗体（１：２００、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）。ニューロスフェアの薄切片上で用いられた抗体は以下であった：ウサギで産生されたマウス抗ＴＨ抗体（組織についてのと同じ、上記参照）、及びマウスで産生されたラット抗ネスチン抗体（１：２００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、続いて、ロバで産生され、且つＣｙ２と結合した抗マウス二次抗体（１：２００、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）。ネスチン陽性細胞を緑色に可視化した。

６．フローサイトメトリ
サイトメトリによるすべての分析及び細胞分離を、３レーザーフローサイトメトリモデルＭｏＦｌｏ（ＤＡＫＯ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）で行った。分散した頚動脈小体細胞を、染色溶液に再懸濁し、様々な抗体と、それぞれ４℃で２０分間、インキュベートした。染色溶液は以下を含んだ（５０ｍｌについて）：４４ｍｌのＬ１５培地（Ｇｉｂｃｏ）、０．５ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｃａｍｂｒｅｘ）、０．５ｍｌのＨＥＰＥＳ １Ｍ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）、０．１ｇのＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）、及び５ｍｌの蒸留脱イオン水。フローサイトメトリに用いた抗体は以下の通りであった：ウサギで産生されたマウス抗ｐ７５抗体（１：２０００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、続いて、ヤギで産生され、且つフルオレセイン−５−イソチオシアネート［ＦＩＴＣ］と結合した抗ウサギ二次抗体（１：２００、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）、及びマウス抗ＨＮＫ−１（１：６００、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ／ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）、続いて、ヤギで産生され、且つフィコエリトリン［ＰＥ］と結合した抗マウス二次抗体（１：２００、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）。残存する非接着抗体を洗浄した時点で、細胞を、２ｍｇ／ｍｌの７−アミノ−アクチノマイシンＤ［７−ＡＡＤ］（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を含む染色培地に再懸濁した。死細胞を、サイトメータでそれらの７−ＡＡＤ陽性表現型によって排除した。

７．細胞分泌の電流測定記録
頚動脈小体から成長したいくつかのニューロスフェアを、ポリＬ−リシンで処理されたカバーガラス上に再び蒔き、通常の培養基中で一晩、インキュベートした。付着したニューロスフェアを有するカバーガラスを、記録チャンバーへ移し、ＮａＣｌ １１７ｍＭ、ＫＣｌ ４．５ｍＭ、ＮａＨＣＯ_３ ２３ｍＭ、ＭｇＣｌ_２ １ｍＭ、ＣａＣｌ_２ ２．５ｍＭ、グルコース５ｍＭ、及びスクロース５ｍＭを含む溶液で連続的に灌流した。「低血糖性」溶液は、グルコースの代わりにスクロース５ｍＭ、即ち、総スクロース１０ｍＭを有し、重量モル浸透圧濃度の変化を防いだ。「正常酸素圧」溶液については、５％ＣＯ_２、２０％Ｏ_２、及び７５％Ｎ_２のガス混合物で泡立たせた（Ｏ_２圧１４５ｍｍＨｇ）。「低酸素」溶液については、約１５ｍｍＨｇのチャンバー内Ｏ_２圧に達するように、５％ＣＯ_２及び９５％Ｎ_２で泡立たせた。すべての実験を、約３６℃のチャンバー内温度で行った。フェムトクーロン（ｆＣ）／分での分泌速度については、一定時間、記録電極に移動した電荷量として計算した（Ｐａｒｄａｌ及びＬｏｐｅｚ−Ｂａｒｎｅｏ、２００２；Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ５、１９７〜１９８）。

８．「パッチクランプ」技術による記録
ニューロスフェアの糸球体におけるグロムス細胞の電位依存性巨視的流量を、本発明者らの研究室で以前適合させた、「パッチクランプ」技術の「全細胞（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｅｌｌ）」の構成を用いて記録した（Ｌｏｐｅｚ−Ｂａｒｎｅｏら、１９８８；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１、５８０〜５８２）。カリウムの巨視的流量を記録することについて、記録溶液の組成は以下であった：内部：８０グルタミン酸カリウム８０ｍＭ、ＫＣｌ ５０ｍＭ、ＭｇＣｌ_２ １ｍＭ、Ｈｅｐｅｓ １０ｍＭ、ＭｇＡＴＰ ４ｍＭ，エチレングリコール四酢酸［ＥＧＴＡ］０．１ｍＭ（ｐＨ７．２）；並びに外部：ＮａＣｌ １１７ｍＭ、ＫＣｌ ４．５ｍＭ、ＮａＨＣＯ_３ ２３ｍＭ、ＭｇＣｌ_２ １ｍＭ、ＣａＣｌ_２ ２．５ｍＭ、グルコース５ｍＭ、及びスクロース５ｍＭ（５％ＣＯ_２で泡立たせることによってｐＨを調整）。静止時に固定された電位は、−８０ｍＶであった。カルシウムの巨視的流量を記録するための実験については、溶液の組成は以下であった：内部：ＣｓＣｌ １００ｍＭ、ＣｓＦ ２５ｍＭ、ＭｇＣｌ_２ ２ｍＭ、Ｈｅｐｅｓ １０ｍＭ、ＭｇＡＴＰ ４ｍＭ、ＥＧＴＡ ０．５ｍＭ（ｐＨ７．２）；並びに外部：ＢａＣｌ_２ １０ｍＭ、ＮａＣｌ １４０ｍＭ、ＫＣｌ ２．７ｍＭ、Ｈｅｐｅｓ １０ｍＭ、及びグルコース５ｍＭ（ｐＨ７．４）。静止時の保持電位は−８０ｍＶであった。

９．統計的解析
統計データは、平均±標準偏差として示され、実験の反復数を括弧に入れている。統計的有意性については、マッチドペアスチューデントｔ検定によって推定した。

１０．ヒト頚動脈小体のニューロスフェアの獲得
２つの頚動脈分岐部を、６０歳未満の心臓ドナーから入手した。頚動脈小体を、顕微鏡下、頚動脈から解離させ、組織をその間ずっと、冷やし、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液中に浸漬した。摘出するとすぐに、頚動脈小体を小断片へと切断し、すぐに、酵素的分散にかけた。分散溶液は、６０μｌのＣａＣｌ_２（ストック５ｍＭ）、１．６ｍｇトリプシン、２．５ｍｇコラゲナーゼＩ型、２．５ｍｇコラゲナーゼＩＶ型、及び７．５μｌブタエラスターゼを有する６ｍｌのリン酸緩衝液から構成された。ヒトグロムス組織を、分散溶液中、３７℃で２０分間、撹拌しながら、インキュベートした。その後、微細ピンセットを用いて組織を解体し、再び３７℃でさらに１０分間、インキュベートし、最後に、組織を機械的にピペッティングすることによって細胞を分散させた。齧歯類細胞についてと同じものを含むが、ボランティアドナー由来の末梢血から標準血液学的方法（キットの名前：Ｖａｃｕｅｔｔｅ Ｚ血清ＳＥＰクロットアクチベーター（ｃｌｏｔ ａｃｔｉｖａｔｏｒ））に従って得られたヒト血清にニワトリ血清が置き換わっている培地を含む低接着性プレート上に、分散した時点で、細胞を蒔いた。培養の１０日後、ヒトニューロスフェアを写真に撮り、免疫組織化学的研究について齧歯類由来のものと同じ方法で処理した。

１１．Ｘ−ｇａｌでの染色
分散した細胞、組織の切片、又はニューロスフェアの切片を、β−ガラクトシダーゼの発現を検出するために染色し、Ｘ−ｇａｌを含む緩衝液中、３７℃で一晩、それらをインキュベートした。緩衝液については、ＭｇＣｌ_２ ２ｍＭ（Ｓｉｇｍａ）、フェロシアン化カリウム５ｍＭ（Ｓｉｇｍａ）、及びフェリシアン化カリウム（Ｓｉｇｍａ）を追加したＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）で調製した。Ｘ−ｇａｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を、使用直前に、１ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで緩衝液に加えた。

（例１）
低酸素による頚動脈小体の成長の誘導及び神経冠由来の新しいグロムス細胞の発生
野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの等圧雰囲気における低酸素（１０％Ｏ_２）への３週間の曝露は、血管の拡張及び増加、加えて実質の増殖により、最初のサイズに対して約２〜３倍の頚動脈小体のサイズの増加を引き起こし、ＴＨ＋グロムス細胞（チロシンヒドロキシラーゼが陽性）の数が増加した（図１Ａ）。

新しいグロムス細胞の増殖及び形成の分析については、Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＢｒｄＵで処理し、その後、数日間、正常酸素圧（２１％Ｏ_２）又は低酸素（１０％Ｏ_２）環境下に置いた。ＴＨ＋且つＢｒｄＵ＋の細胞は、正常酸素圧動物には観察されず、増殖の欠如が示された（図１Ｂ、左）。対照的に、低酸素下での数日後、ＣＢの成長が明らかになる前でさえも、多数のＴＨ＋且つＢｒｄＵ＋細胞が観察され（図１Ｂ右における矢印）、新しいグロムス細胞の出現を示した。低酸素に応答してＣＢで生じた変化は、図１Ｃに時間の関数として示されている。ＣＢの肥大に平行して、低酸素条件下の処理中、新たに形成されたＴＨ＋グロムス細胞の数もまた、２〜３倍、増加した。

この定量的分析によりまた、ＣＢの組織におけるＢｒｄＵの取り込みが、低酸素条件の適用後の第１日目から観察される一方で、新しいグロムス細胞（ＢｒｄＵ＋、ＴＨ＋）のみが、低酸素下での５日後又は６日後に出現し始めることが明らかにされた。これらのデータは、新しい神経細胞の出現の前の増殖及び分化の工程の存在を示唆すると考えられる。さらに、低酸素で長期間処理されたマウスを正常酸素圧環境へ再導入した場合（再正常酸素圧）、ＣＢの正常サイズの回復がグロムス細胞の数の減少と平行して、進行した。このように、再正常酸素圧ＣＢにおいて、グロムス細胞の約５０％がＢｒｄＵ＋であった（図１Ｄ〜Ｆ、矢印）。これらのデータは、今度の場合も、前駆体又は前駆細胞（ＢｒｄＵ＋、ＴＨ＋）の存在を示し、低酸素下でのそれらの増殖（ＢｒｄＵの取り込み）は、それらのグロムス細胞（ＴＨ＋）への分化に先行することを示す。さらに、低酸素によって誘導された構造的改変は、若いマウス（４〜６週間、図１Ｃ）及び高齢のマウス（８カ月を超す；ＴＨ＋細胞：正常酸素圧下１５５５＋２５、ｎ＝４、及び低酸素下２４７０±３５８、ｎ＝３）の両方において類似していることが観察された。

グロムス細胞を生じる前駆細胞の神経起源を、神経冠由来の細胞がマーキングされるｌｏｘＰ隣接Ｗｎｔ１−Ｃｒｅ／ＬａｃＺトランスジェニックマウスを用いる細胞系譜分析によって試験した（Ｃｈａｉら、２０００、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２７、１６７１〜１６７９；Ｊｉａｎｇら、２０００、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２７、１６０７〜１６１６）（図２Ａ）。これらの動物のＣＢは、ＴＨ＋細胞と共局在しているＸ−ｇａｌの大量の沈積物を含む。Ｘ−ｇａｌの沈殿物はまた、ＢｒｄＵ＋、ＴＨ＋細胞にも観察された（図２Ｂ〜Ｃ）。これらのデータは、既存のグロムス細胞と、低酸素に曝された動物に新しく形成されたグロムス細胞の両方が、神経冠から生じることを示す。

（例２）
頚動脈小体の自己複製性及び多能性幹細胞の同定
低酸素に曝された成体齧歯類においてグロムス細胞を生じる前駆体の同定については、若いウィスターラット（＞Ｐ２０）の頚動脈小体を酵素的に分散させ、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、及びＥＧＦを含む神経冠（ＮＣ）培地にその細胞を蒔いた（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９９９、Ｃｅｌｌ ９６、７３７〜７４９）。非接着のために処理された培養プレートを用いて、浮遊状態で成長を誘導し、それに従って、ニューロスフェアを得た。クローン原性増殖については、インビボでのＣＢの成長の低酸素による刺激を模倣する条件である、中程度の低酸素（３％Ｏ_２）下での細胞の培養によって刺激した（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、２０００、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２０、７３７０〜７３７６）。

これらの実験において、蒔かれた細胞の１．０４±０．４％（ｎ＝６調製物）がニューロスフェアを生じた（図３Ａ）。培養の１０日後、ニューロスフェアの直径は、８５±３４マイクロメートル（ｎ＝１１２）であり、それは、他の神経前駆体集団から得られたニューロスフェアについて記載されたものに匹敵する値である（Ｍｏｌｏｆｓｋｙら、２００３、Ｎａｔｕｒｅ ４２５、９６２〜９６７）。ニューロスフェアの成長は、ＮＣのための培地（ＮＣ培地）に成長因子の存在を必要とし、さらに、得られたニューロスフェアは、培養が正常酸素圧（２１％Ｏ_２）の条件で行われた場合には、著しく小さい。なおさらに、ニューロスフェアの形成の効率は、高齢の動物において０．１７±０．０２％（ｎ＝３調製物）に減少することも観察される。

しかしながら、中枢神経系（ＣＮＳ）及び末梢神経系（ＰＮＳ）の他の領域由来のニューロスフェアの典型的な球状と比較して（Ｄｏｅｓｔｓｃｈら、１９９９、Ｃｅｌｌ ９７、７０３〜７１６；Ｍｏｌｏｆｓｋｙら、２００３、Ｎａｔｕｒｅ ４２５、９６２〜９６７）、ＣＢ由来のニューロスフェアの大部分（１０日間の培養時点で＞８５％）は、特徴的に１つ又は２つの突起部を有した（図３Ａの矢印）。ニューロスフェアの薄切片の免疫細胞化学的分析により、中心コアにおけるネスチンの存在（ネスチン＋）（神経前駆細胞の典型的マーカー）、及び細い繊維の組織を介して中心コアに連結され（図３Ｂ）、且つ形において生体内原位置でのＣＢの特徴を示す糸球体を連想させる、糸球体突起部における分化したＴＨ＋且つネスチン−細胞の凝集物が明らかにされた。培養の数週間後、これらの糸球体は、成体ＣＢのサイズに達するまで、成長した（図３Ｃ）。

ニューロスフェアのクローン起源を、超低接着性の９６ウェルプレートを用いる細胞の個々のプレーティングでの実験によって確認した。培養の１０日後、単細胞を受け入れ、顕微鏡下で２回、調べられた多数のウェルは、糸球体を含む単一のニューロスフェアを有し、これらのニューロスフェアがＣＢ起源のたった１個の細胞の増殖から生じたことを示した。ニューロスフェアの形成の推定効率は、１１．６±１．５％（実験ｎ＝４）であり、細胞全部の培養での実験で得られた値より有意に高かった。この差は、単に、細胞全部のプレーティングでの実験における、死細胞及び細胞残渣の存在による培養中の細胞の生存率の低下が原因にすぎない可能性がある。とにかく、ニューロスフェアの形成の推定頻度により、正常ラットＣＢにおいてほぼ２００〜３００個程度の幹細胞が存在するはずであると示唆される。

さらに、ＣＢの前駆細胞の自己複製能もまた、同じ条件で培養して分散した細胞の一次ニューロスフェアの解離、及びＮＣ培地を含む非接着性ディッシュ上での再プレーティングにより試験した。得られた二次ニューロスフェアの数（一次ニューロスフェアあたり７±２、ｎ＝１０）は、他の神経前駆体集団に関する文献（Ｍｏｌｏｆｓｋｙら、２００３、Ｎａｔｕｒｅ ４２５、９６２〜９６７）に記載された値より有意に少なかった。しかしながら、強い酵素処理及び激しい破壊工程を必要とする、ＣＢのニューロスフェアの解離工程中に遭遇する困難からすれば、細胞が損傷を受けた可能性があり、その結果として、それらの二次的成長が変化していることが示唆される。この意味において、試験がより良い条件で行われたとしてもＣＢの前駆細胞のより大きな自己複製能はあり得ないとすることは不可能である。

大きなニューロスフェアの中心コアにおけるＴＨ−、ネスチン−細胞の存在（図３Ｂ及び３Ｃ）は、グロムス細胞に加えて、ＣＢの前駆細胞が他の細胞型に分化できることを示唆する。これは、接着性基質上で培養液に再び蒔かれたニューロスフェアにおける免疫細胞化学的分析によって検証された。ＣＢの幹細胞は、典型的には培養中の神経冠に由来する細胞型である、ＳＭＡ＋細胞（平滑筋アクチンの特異的抗原）に分化する能力があった（図３Ｄ）（Ｋｒｕｇｅｒら、２００２、Ｎｅｕｒｏｎ ３５、６５７〜６６９）。ＧＦＡＰ＋染色はニューロスフェアに現れないが、これは、インビボでの実験に示されているように（例３参照）、細胞が、増殖工程を開始した瞬間、このマーカーを喪失するからである。したがって、ＣＢの前駆体は、神経冠由来の他の幹細胞に似た挙動をし（Ｂｉｘｂｙら、２００２、Ｎｅｕｒｏｎ ３５、６４３〜６５６）、クローン原性コロニーを生成する能力、及び自己複製する能力、及び複数の細胞型へ分化する能力がある。

（例３）
グリア型の支持細胞はＣＢの幹細胞である
今まで、特定の状況において、グロムス細胞は、有糸分裂周期に入ることができると常に考えられてきた（Ｎｕｒｓｅ及びＶｏｌｌｍｅｒ、１９９７、Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １８４、１９７〜２０６；Ｗａｎｇ及びＢｉｓｇａｒｄ、２００２、Ｍｉｃｒｏｓｃ Ｒｅｓ Ｔｅｃｈ ５９、１６８〜１７７）。しかしながら、ＴＨ＋グロムス細胞が、解離後、数日間、培養中、維持され得ることは十分、確立されている（Ｌｏｐｅｚ−Ｂａｒｎｅｏら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１、５８０〜５８２；Ｖｉｌｌａｄｉｅｇｏら、２００５、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２５、４０９１〜４０９８）。グロムス細胞の増殖がＣＢニューロスフェアを生じるかどうかを検証するために、ニューロスフェアの形成の異なる段階で免疫細胞化学的分析を行った（図４Ａ）。最初は、ニューロスフェアは小さく、ＴＨ−、ネスチン＋細胞及び他のネスチン−細胞の群によって形成された。この段階のすぐ後に、成長するニューロスフェアの周辺部にいくつかのＴＨ＋細胞と共に小さな胚核の出現（突起部）がある。ＴＨ＋細胞の数は、前に記載されたグロムス細胞の特徴的な凝集物を形成するまで徐々に増加する。この連続的発達は、解離及びプレーティング後、（成熟グロムス細胞とは異なる）前駆細胞が増殖し、自己複製を起こして、ニューロスフェアの中心コアを形成し、それが前駆体の成熟グロムス細胞（ＴＨ＋）への分化に先行することを示唆する。

フローサイトメトリによる分離により、ＴＨ＋細胞はニューロスフェアの形成を開始しないことが示唆されたが、これは、神経冠由来のニューロン前駆体のマーカーであるＨＮＫ−１を大量に発現する細胞（図４Ｂのウィンドウ＃１）（Ｙｏｕｎｇら、１９９８、Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２０２、６７〜８４）が決してニューロスフェアを生じないからである。図４Ｃに示されているように、マーカーＨＮＫ−１によって濃縮された集団はすべて、ＴＨ＋グロムス細胞であった。

しかしながら、神経冠由来の幹細胞の他の集団の典型的マーカーであるｐ７５を強く発現する細胞（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９９９、Ｃｅｌｌ ９６、７３７〜７４９）（図４Ｂのウィンドウ＃２）の画分の分離は、ニューロスフェアの生成を増加させなかった。幹細胞のマーカー（ｃ−ｒｅｔ、ＣＤ１３３、インテグリンα−４、及びＳＳＥＡ−１）を用いた他の分析もまた、フローサイトメトリによりＣＢ由来の前駆体の集団を濃縮することに成功しないことがわかった。幹細胞の同定の鍵は、正常酸素圧の動物のＣＢにおいて、ＩＩ型細胞は明らかにＧＦＡＰマーカーで同定されたが（ＧＦＡＰ＋）、前記マーカーは、低酸素への曝露で、ＢｒｄＵ＋又は増殖性細胞の数が増加すると同時に、次第に消失した（図４Ｄ）。さらに、ＩＩ型細胞を低酸素環境にもっていくと、増殖マーカーネスチンの出現がまたあり、それは、正常酸素圧環境に戻すと消失する（図９Ａ〜Ｄ）。低酸素動物を正常酸素圧大気に戻すとすぐに、ＧＦＡＰ＋細胞が再出現し、ＣＢはその本来のサイズに戻った。これらのデータより、ＩＩ型細胞が、低酸素に応答して活性化の過程を起こしており、したがって、ＣＢの幹細胞であり得ることが示唆された。

ＣＢの幹細胞の同定の直接的証拠は、ｌｏｘＰ隣接ＧＦＡＰ−Ｃｒｅ／ＬａｃＺトランスジェニックマウスを用いる細胞系譜をマッピングするためのインビボでの実験によって得られた（図５Ａ）。これらの動物モデルにおいて、ＧＦＡＰのトランスジェニックプロモーターは、脳においてかなり活性があり、そこでは、多くの細胞（グリア細胞及びニューロン）がＧＦＡＰ＋前駆体から生じ、その結果として、すべてがＢ−ｇａｌ＋としてマーキングされて現れる（Ｍａｌａｔｅｓｔａら、２００３、Ｎｅｕｒｏｎ ３７、７５１〜７６４）。対照的に、ＧＦＡＰのトランスジェニックプロモーターの活性は、正常酸素圧下のＣＢにおいてかなり低く、さらに、Ｂ−ｇａｌ＋細胞は、低酸素条件にかけられたことがない動物のＣＢにおいて検出されなかった。ＧＦＡＰのトランスジェニックプロモーターの活性化については、動物を低酸素／再正常酸素圧のサイクル下に置き、支持細胞におけるＧＦＡＰ発現の消失と再出現、及びトランスジェニック構成の活性化を引き起こした。これらの動物において、低酸素への２回目の曝露は、ＣＢの成長、及び新しいグロムス細胞（ＴＨ＋且つＢｒｄＵ＋）におけるＸ−ｇａｌの選択的沈着を生じた。これは、それらがＧＦＡＰ＋前駆体由来であることを実証する。ＢｒｄＵ＋、ＴＨ＋細胞でのＸ−ｇａｌの沈着の局在は、細胞の分散及び単離された細胞の染色によって確認された。

Ｘ−ｇａｌの沈着を示すＣＢのＩＩ型ＧＦＡＰ＋細胞が幹細胞であることが図９からわかるが、これは、その細胞が、ニューロスフェア（ＴＨ＋グロムス細胞）の形で成長を生じているからである。

（例４）
インビトロで発生したグロムス細胞は、電気生理学的及び神経化学的特徴である、成熟化学受容器を有する
グロムス細胞は、電気的に興奮性であり、且つ血液中の特定の物理化学的変量を感知することができるため、生理学的に非常に複雑である。Ｏ_２又は細胞外グルコースの濃度の降下によって活性化する場合、ＣＢのグロムス細胞は、カテコールアミン放出の急増を示し、それは、電流測定によってモニターすることができる（Ｐａｒｄａｌら、２０００、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７、２３６１〜２３６６、Ｐａｒｄａｌ及びＬｏｐｅｚ−Ｂａｒｎｅｏ、２００２、Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ５、１９７〜１９８）。これらの低酸素及び低血糖への同じ応答が、本発明の幹細胞又は前駆細胞からインビトロで得られたグロムス細胞で検出された（図６Ａ〜Ｃ）。

インビトロで発生した糸球体のグロムス細胞については、「パッチクランプ」技術によって分析した。図６Ｄは、新しいグロムス細胞が内向きイオン電流、続いて大きな外向き電流を示すことを示している（図６Ｅ）。正常なグロムス細胞に起こるように、Ｃｓ^＋での外向き電流の遮断により、電位開口型Ｃａ^２＋チャネルの存在が明らかにされている（図６Ｆ）。これらのデータは、ＣＢの前駆体からインビトロで生じたＴＨ＋細胞が、成熟グロムス細胞と同じ機能的特徴を有することを示す。

しかしながら、高度にドーパミン作動性であることに加えて、ＣＢのグロムス細胞は、ドーパミン作動性ニューロンの生存を促進する強力な神経栄養因子である、大量のＧＤＮＦを産生することができる。ヘテロ接合性ＧＤＮＦ／ＬａｃＺノックアウトマウスにおいて、ＧＤＮＦの産生は、グロムス細胞に選択的に濃縮されているように見えるＸ−ｇａｌの沈着物の出現によってマーキングされる（Ｓａｎｃｈｅｚら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ ３８２、７０〜７３）。この同じツールを用いて、実験は、前述のマウスの低酸素への曝露が、インビボでＣＢにおいてＴＨ＋、ＢｒｄＵ＋細胞にＸ−ｇａｌの沈着物を生じることを示した（図７Ａ〜Ｄ）。これらのデータは、新たに形成されたグロムス細胞もまた、ＧＤＮＦを合成する能力を獲得していることを示す。

（例５）
パーキンソン病における細胞療法への適用性
ドーパミン作動性ニューロンを選択的に破壊する毒性物質、６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）による黒質の一側性病変に基づいたウィスターラットにおけるパーキンソン病のモデルを実験に用いた。黒質の９０％より多くの病変を有するラットは、ヒトにおけるパーキンソン病に似た症状：無動、硬直、運動の側方化（ラットにおける回転運動）、及び知覚運動障害を示した。これらの機能的欠陥は、適切な一連の試験で評価することができた。さらに、運動の側方化は、アンフェタミン（５ｍｇ／ｋｇ）の注射によって悪化させることができ、その物質は、極度の（病変側への）「同側性回転運動」を引き起こし、その頻度が、１時間あたり３６０回転より多い場合には、９０％より多い病変を示していた。

各パーキンソン病様ラットについて、１マイクロリットルの６−ＯＨＤＡ（４ｍｇ／ｍｌ；座標ＡＰ＝−５．３；Ｌ＝−２．３；Ｖ＝−８．２）での黒質の一側性病変から１０日目に、頚動脈小体由来の約２０個のニューロスフェアを、除神経した線条体（座標、十字縫合に対してＡＰ＝０．２；Ｌ＝−３；Ｖ＝−５．５）に移植した。頚動脈小体ニューロスフェアは、カルシウム又はマグネシウムは含まないが、コラゲナーゼ（０．６ｍｇ／ｍｌ）及びトリプシン（０．３ｍｇ／ｍｌ）を含む生理溶液中、２０分間のインキュベーションによる頚動脈小体の分散及び解離後に得られた。神経冠由来の幹細胞に特異的な栄養因子を含む培養基を有する非接着性プレート上に、分散した細胞を蒔いた。この方法によって得られた各ニューロスフェアは、５０〜１００個のグロムス細胞又は完全に分化したＩ型細胞を含んだ。

ニューロスフェアの移植後１０日目、３０日目、及び９０日目に、移植片の機能性及び効力を、神経化学的、形態学的、及び行動的観点から評価した。神経化学的調査は、脳組織のスライスにおける線条体内ドーパミンレベルの電流測定記録に基づいた。形態学的調査は、ドーパミン産生細胞の存在又は非存在を示すチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）に対する抗体での染色を用いる、免疫細胞化学的性状についてであった。行動評価は、動物の運動反応及び感覚運動反応を評価するための適切な一連の試験を用いて行われた。

機能の結果は非常にポジティブであった：電流測定記録は、移植なしの除神経した線条体においてドーパミンの９０％より多い降下を検出したが、進化の３カ月間の移植を有する線条体におけるドーパミンレベルの６５％までの回復を明らかにした。形態学的調査により、糸球体内に会合した、チロシンヒドロキシラーゼが陽性であり、またＧＤＮＦ型の栄養因子を発現するグロムス細胞を有する移植片の存在が示された（図７）。前述のものは、以下の非常に良好な行動回復と相関した：ａ）自発性とアンフェタミン誘導性の両方の回転運動は、最初の１カ月の間に消えた、及びｂ）感覚運動性反射は３カ月後に回復した。

（例６）
ヒト頚動脈小体における幹細胞の同定
ヒト組織における頚動脈小体由来の幹細胞の存在を実証するために、著者らは、セビーリャ（Ｓｅｖｉｌｌｅ）におけるＶｉｒｇｅｎ ｄｅｌ Ｒｏｃｉｏ Ｈｏｓｐｉｔａｌの臓器提供プログラム（Ｏｒｇａｎ Ｄｏｎａｔｉｏｎｓ ｐｒｏｇｒａｍｍｅ）に登録した。それに従って、彼らは、６０歳未満の血管組織のより良好な保存を示す心臓ドナーの２つの頚動脈分岐部（図１１Ａ）の受け取りを開始した。頚動脈小体（図１１Ｂ）を解体して、スライスし（図１１Ｃ）、その後、酵素処理を施した。分散した細胞を、ヒト血清を含む神経冠培地中、低酸素条件下で培養した。培養の１０日後、神経前駆体の存在が観察され、ニューロスフェアの形をとって成長し（図１１Ｄ）、齧歯類において記載されたものと外観が非常に類似して、即ち、糸球体の様式において表面に肥厚部が存在した（図１１Ｄの矢じり印）。これらのニューロスフェアの詳細な免疫細胞化学的調査により、肥厚部が、事実上、前駆体から始まって分化中であるＴＨ＋グロムス細胞の群（図１１Ｅ）であることが明らかにされた。したがって、これらの所見は、ヒトにおける頚動脈小体に特異的な幹細胞の存在を確認し、インビトロでのそれらのグロムス細胞への分化能を示す。

（例７）
ニューロスフェアによるＧＤＮＦの産生の実証
すでに述べられているように、頚動脈小体由来の幹細胞は、ＴＨが陽性の頚動脈小体の成熟グロムス細胞へ分化する能力があり、且つ生理的刺激に応答して、ドーパミンなどのカテコールアミン及びＧＤＮＦなどの栄養因子を分泌する能力がある細胞である。これがそうであることを確認するために、ニューロスフェアがＧＤＮＦを産生することができるかを検証する試験を行った。

このために、頚動脈小体を、（ＧＤＮＦプロモーターの調節下でβ−ガラクトシダーゼを発現するマウスである）ＧＤＮＦ／ＬａｃＺトランスジェニックマウスから取り出し、解体し、細胞を、ウィスターラットについて記載されたものと同様の方法で分散させ、それらをインビトロで培養して、ニューロスフェアを得た。ニューロスフェアを、「ニューロスフェアの形をとるインビトロでの成長の試験」のセクションに記載されているように、接着性のために処理されたプレート上に再び蒔き、その後、この同じ方法セクションに記載された免疫細胞化学的試験プロトコールをプレートに適用した。加えて、酵素β−ガラクトシダーゼの発現を検証するために、Ｘ−ｇａｌでの染色工程をプレート上で行った。

試験結果は図１２に示されており、そこでは、Ｘ−ｇａｌの沈着物の出現（パネルＡ）が、グロムス細胞の領域である、抗ＴＨ抗体による蛍光が検出される領域に生じることが示されている。さらに、点の密度は、染色された細胞におけるＧＤＮＦの高レベルの産生と相関し、インビトロでのニューロスフェアにおけるＧＤＮＦの産生が頚動脈小体由来の幹細胞から生じたことを実証する。

結論
神経発生が成体哺乳動物の脳の特定のニッチに維持されることは知られていたが、ＰＮＳにおける胚中心の存在は知られていなかった。今、驚くべきことに、本発明者らは、成体マウスのＣＢにおける幹細胞の存在を発見した。着手された研究は、ニューロン様グロムス細胞の新たな生成が、ＣＢに存在する幹細胞の集団に依存し、それらが、インビトロで多能性の自己複製コロニーを形成することを実証した。インビボでの細胞系譜の分析は、予想外にも、ＣＢの幹細胞が、グリア表現型を有する支持細胞又はＩＩ型細胞であることを示している。

今まで頚動脈小体の細胞凝集物で行われた自家移植がパーキンソン病患者の症状を軽減していたが（Ａｒｊｏｎａら、２００３）、老齢のＣＢの組織学的完全性に存在する、この治療を制限する因子、及び移植に利用可能な組織量の不十分さがあることが観察された。本発明者らによって行われた実験により、本発明の増殖方法によって処理された成体齧歯類のＣＢの幹細胞及び／又は前駆細胞が、培養の１０日後、いかにグロムス細胞を非常に効率的に生じることができるかが示されている。

さらに、単一ニューロスフェアにおける３週間より長い期間のグロムス細胞の凝集物を超える培養は、完全なＣＢのサイズに達することができ、治療処置に用いる大量の細胞バイオマスを得ることが可能になる。さらに、これらの新しい細胞は、生体内原位置での成体グロムス細胞と同じ化学受容器及び電気生理学的性質を有し（図６）、高度にカテコールアミン作動性であり、ＧＤＮＦなどの栄養因子を合成し（図７）、パーキンソン病に対する細胞療法において非常にポジティブな結果を生んでいる。

このように、行われた試験は以下のことを明らかにした：
ａ）ＣＢはＰＮＳの胚中心であり、そこでは、成体神経細胞の神経発生が、成体神経系組織が動物の生涯を通して新しいニューロンを生じる前駆体を保持するという、哺乳動物のＣＮＳで起こっている通りに、インビボで起こる；
ｂ）ＣＢの胚中心は、インビボで顕著な再生能を有し、長期低酸素に対する適応中、重要な生理的役割をもつ；
ｃ）ＣＢは、自己複製能（ＩＩ型細胞）、並びにインビボ及びインビトロでのＩ型又はグロムス細胞への分化能を有する多能性幹細胞を含む；並びに
ｄ）本発明の増殖方法によって得られた細胞の移植は、神経変性疾患の臨床的特徴を逆転させる能力がある。

Claims (23)

1. 表現型マーカーＧＦＡＰ（グリア線維酸性タンパク質）が陽性であり、表現型マーカーＴＨ（チロシンヒドロキシラーゼ）及びネスチンが陰性であることを特徴とする、頚動脈小体起源の単離された成体幹細胞。
2. 表現型マーカーネスチンが陽性であることを特徴とする、請求項１に記載の前記幹細胞由来の単離された成体前駆細胞。
3. マーカーＧＦＡＰが弱陽性であり、表現型マーカーネスチンが陽性であることを特徴とする、請求項２に記載の前駆細胞。
4. マーカーＧＦＡＰが陰性であり、表現型マーカーネスチンが陽性であることを特徴とする、請求項２に記載の前駆細胞。
5. 表現型マーカーネスチンが陰性であり、特殊分化マーカーが陽性であることを特徴とする、請求項１に記載の前記幹細胞由来又は請求項２から４までのいずれか一項に記載の前記前駆細胞由来の分化成体細胞。
6. 前記特殊分化マーカーがチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）であることを特徴とする、請求項５に記載の分化細胞。
7. 前記特殊分化マーカーが平滑筋アクチン（ＳＭＡ）であることを特徴とする、請求項５に記載の分化細胞。
8. 遺伝子操作されていることを特徴とする、請求項１から７までのいずれか一項に記載の細胞。
9. 請求項１に記載の幹細胞、請求項２から４までのいずれか一項に記載の前駆細胞、及び請求項３から５までのいずれか一項に記載の分化細胞を含む群から選択されることを特徴とする可逆的不死化細胞。
10. ヒト起源の、請求項１から８までのいずれか一項に記載の細胞。
11. 請求項１から１０までのいずれか一項に記載の細胞又はそれらの組合せのセットを含む、頚動脈小体由来の単離された細胞集団。
12. 治療有効量の請求項１から１０までのいずれか一項に記載の細胞若しくはそれらの組合せ又は請求項１１に記載の細胞集団、及び薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物。
13. 神経変性疾患の治療のための薬学的組成物の開発、神経系の虚血性病変の治療、神経系の外傷性病変の治療、又は神経系の自己免疫性病変の治療における、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の細胞若しくはそれらの組合せ、又は請求項１１に記載の細胞集団の使用。
14. 前記神経変性疾患がアルツハイマー病又はパーキンソン病である、請求項１３に記載の使用。
15. 前記細胞が、請求項１に記載の前記幹細胞由来又は請求項２から４までのいずれか一項に記載の前記前駆細胞由来の新規グロムス細胞（ネスチン−／ＴＨ＋）である、請求項１３又は１４のいずれかに記載の使用。
16. 前記の新規グロムス細胞がニューロスフェア内にある、請求項１５に記載の使用。
17. 請求項１に記載の幹細胞又は請求項２から４までのいずれか一項に記載の前駆細胞の調製又は増殖のための方法であって、神経冠に特異的である培地中、低酸素条件下で前記の幹細胞又は前駆細胞を培養することを含む方法。
18. 前記の幹細胞又は前駆細胞が非接着性表面上で培養されることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
19. 神経冠に特異的である前記培地が培地、栄養源、抗生物質、及び成長因子を含むことを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
20. 前記成長因子が、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）又はその機能性変異体、インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）又はその機能性変異体、上皮成長因子（ＥＧＦ）又はその変異体、及び前記因子の組合せから選択されることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
21. 前記の幹細胞又は前駆細胞の培養が、１５％未満、好ましくは１〜１０％、より好ましくは２〜５％、さらに好ましくは３％の酸素濃度の存在下で行われることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
22. 潜在的な治療用化合物に対する細胞応答のインビトロ評価のための方法であって、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の細胞を含む培養物を、潜在的な治療用化合物と接触させる段階と、前記培養物に存在する細胞に前記化合物によって引き起こされる効果を評価する段階とを含む方法。
23. ＧＤＮＦの製造のための、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の細胞又は請求項１１に記載の細胞集団の使用。