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JP2010529024A - Ｃｒｉｐｔｏ結合分子 - Google Patents

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Abstract

本発明は、抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体及びその一部のヒト化型、並びに、単独で又は他の薬剤と併用した、癌のような疾患の治療におけるその使用に関する。本発明により、有効量の、Ｃｒｉｐｔｏに結合する結合分子を被験体に投与する工程を含む、該被験体の腫瘍の増殖を阻害する方法であって、該結合分子が、３週間毎に１回投与され、それにより該被験体の腫瘍の増殖を阻害する方法が提供される。有効量のＣｒｉｐｔｏに結合する結合分子及び追加の化学療法剤を被験体に投与して、それにより該被験体の腫瘍の増殖を阻害する工程を含む、該被験体の腫瘍の増殖を阻害する方法もまた提供される。

Description

（関連出願の参照）
本出願は、2007年6月1日に出願された、「Cripto Binding Molecules」と題された米国特許出願第60/932,879号の利益を主張する。本出願は、2006年1月5日に出願された「Cripto Binding Molecules」と題された国際特許出願PCT/US 2006/000502号に関連する。本出願はまた、2005年1月5日に出願された、「Purification and Preferential Synthesis of Binding Molecules」と題された米国特許出願第60/641691号に関連する。本出願はまた、2003年6月27日に出願された、「Purification and Preferential Synthesis of Polypeptides」と題された米国特許出願第60/483877号及び、2003年10月3日に出願された、「Purification and Preferential Synthesis of Antigen Binding Polypeptides」と題された米国特許出願第60/508,810号に関連する。本出願はまた、2004年6月28日に出願された、「Purification and Preferential Synthesis of Binding Molecules」と題された米国特許出願第10/880,320号に関連する。本出願はまた、2004年9月20日に出願された、「Cripto-Specific Antibodies」と題された米国特許出願第10/945,853号、2003年10月23日に出願された、「Cripto Blocking Antibodies and Uses Thereof」と題された米国特許出願第10/693,538号、2002年3月22日に出願された、「Antibodies Directed to the Ligand Binding Domain of Cripto」と題された米国特許出願第60/367,002号；2001年6月26日に出願された、「Cripto Blocking Antibodies and Uses Thereof」と題された米国特許出願第60/301,091号；2001年5月17日に出願された、「Antibodies Directed to the Ligand Binding Domain of Cripto」と題された米国特許出願第60/293,020号；並びに、2001年4月26日に出願された、「Antibodies Directed to the Ligand Binding Domain of Cripto」と題された米国特許出願第60/286,782号に関連する。これらの出願のそれぞれの内容は、参照することにより全文が組み込まれる。
抗体、及びその種々の加工された形は、種々の疾患に苦しむ患者を治療するために現在用いられている有効な治療薬である。これらの抗体の一部は、腫瘍細胞の表面上に存在する抗原を認識する。Criptoは、多くの腫瘍細胞で過剰発現している188アミノ酸の細胞表面タンパク質である。Criptoは、ヒト胚性癌腫ライブラリーのcDNAスクリーニングで単離された（非特許文献１（Ciccodicola et al., 1989, EMBO J. 8:1987-91）)。Criptoは、当初EGFファミリーのメンバーとして分類されていたが（非特許文献１（Ciccodicola et al., 上記）参照)、その後の分析で、Criptoは既知のEGF受容体のいずれとも結合せず、そのEGF様ドメインは実際にはEGFファミリーとは異なることが示された（非特許文献２（Bianco et al., 1999, J. Biol. Chem. 274:8624-29）)。
Criptoタンパク質の過剰発現は、多くの組織における腫瘍と関連している（脳、乳房、精巣、結腸、肺、卵巣、膀胱、子宮、頸部、膵臓及び胃が挙げられるが、これらに限定されない）。非特許文献３（Panico et al., 1996, Int. J. Cancer 65:51-56）; 非特許文献４（Byrne et al., 1998, J. Pathology 185:108-11）; 非特許文献５（De Angelis et al., 1999, Int. J. Oncology 14:437-40）。
Criptoに結合するマウス抗体は記載されている。しかしながら、マウス抗体はヒトの治療薬として適用性を有するが、それはヒト由来ではないため、免疫原性のある可能性がある。このような抗体の投与は、中和抗体応答（ヒト抗マウス抗体（HAMA)応答）をもたらす場合があり、この応答は、例えば、慢性又は再発性疾患状態の治療において、抗体を繰り返し投与することが望ましい場合、特に問題である。また、それらはマウスの定常ドメインを含有するため、ヒトエフェクター機能を示さない場合がある。
免疫原性の問題を軽減する目的で、「ヒト化」抗体が産生されることが多い。1つのプロトコルでは、マウス由来の抗体のCDRを、ヒトのフレームワーク領域に移動させ、「CDR移植」抗体を得る。しばしば、フレームワーク領域における抗原結合に潜在的に影響を与える可能性のあるアミノ酸残基は、対応するマウス残基に復帰突然変異（backmuate）させる。
しかしながら、ヒトでの免疫原性が潜在的に低いために、ヒト化抗体が望ましいが、その産生は予測できない。例えば、抗体の配列を改変することにより、抗原結合親和性を実質的に若しくは更には完全に失う、又は結合特異性を失う恐れがある。更に、配列の改変にかかわらず、「ヒト化抗体」は依然としてヒトで免疫原性を示す場合がある。このような抗体は、毒素、放射性標識等のような抗腫瘍剤を送達するために、Cripto陽性腫瘍細胞を標的化するための手段を提供する。このような結合型抗体分子、及びそれを投与するための投与計画の開発は、多大な効果をもたらすであろう。
Ciccodicola et al., 1989, EMBO J. 8:1987-91 Bianco et al., 1999, J. Biol. Chem. 274:8624-29 Panico et al., 1996, Int. J. Cancer 65:51-56 Byrne et al., 1998, J. Pathology 185:108-11 De Angelis et al., 1999, Int. J. Oncology 14:437-40
本発明は、少なくとも部分的に、マイタンシノイド（maytansoid）に結合したヒト化抗Cripto抗体B3F6.1（B3F6.1-DM4）が、単回投与又は隔週投与計画で投与されたとき、インビボ動物モデルにおいて腫瘍細胞の増殖を阻害するのに有効であるという発見に基づいている。これらのモデルにおける隔週投与は、ヒトにおけるB3F6.1-DM4の有効量が、3週間毎に1回投与するという投与計画を含むことを示す。本発明は、更に、B3F6.1-DM4の単回投与が、インビボ動物モデルにおいて確立した腫瘍の増殖を阻害するのに有効であるという発見にも基づいている。本発明は、更に、例えば、5’-フルオロウラシル等の代謝拮抗物質等の追加剤と共にB3F6.1-DM4を投与すると、インビボ動物モデルにおけるインビボでの腫瘍細胞の増殖を相乗的に阻害するという発見にも基づいている。
したがって、1つの態様では、本発明は、有効量のCriptoに結合する結合分子を被験体に投与することを含む、被験体の腫瘍の増殖を阻害する方法であって、前記結合分子を3週間毎に1回投与し、それにより被験体の腫瘍の増殖を阻害する方法を提供する。
1つの実施形態では、結合分子は抗Cripro抗体である。1つの実施形態では、結合分子は、ヒト化抗Cripto抗体である。1つの実施形態では、抗Cripto抗体は、例えばDM4等のマイタンシノイドに結合する。1つの実施形態では、マイタンシノイドは、例えばSPDB等のヘテロ二官能性架橋剤を介して抗体に結合する。1つの実施形態では、平均3.5分子のDM4が抗Cripto抗体に結合している。
1つの実施形態では、被験体は、脳、乳房、精巣、結腸、直腸、肺、卵巣、膀胱、子宮、頸部、膵臓及び胃から成る群から選択される器官の癌に罹患している。好ましい実施形態では、被験体は結腸癌に罹患している。
1つの実施形態では、結合分子（例えば、B3F6.1-DM4等の、マイタンシノイドに結合しているヒト化抗Cripto抗体等）の有効量は、約5mg/kg、約10mg/kg、約15mg/kg、約25mg/kg及び約40mg/kgから成る群から選択される。
別の態様では、本発明は、有効量のCriptoに結合する結合分子及び例えば代謝拮抗物質等の化学療法剤を被験体に投与して、被験体の腫瘍の増殖を阻害することを含む、被験体の腫瘍の増殖を阻害する方法を提供する。
1つの実施形態では、結合分子及び例えば代謝拮抗物質等の化学療法剤は、相乗的に作用する。
1つの実施形態では、化学療法剤は代謝拮抗物質である。1つの実施形態では、代謝拮抗物質はピリミジン類似体である。1つの実施形態では、ピリミジン類似体は5’-フルオロウラシルである。
1つの実施形態では、結合分子は抗Cripto抗体である。1つの実施形態では、結合分子はヒト化抗Cripto抗体である。1つの実施形態では、抗Cripto抗体は、例えばDM4等のマイタンシノイドに結合する。1つの実施形態では、マイタンシノイドは、例えばSPDB等のヘテロ二官能性架橋剤を介して抗体に結合さすれる。1つの実施形態では、平均3.5分子のDM4が抗Cripto抗体に結合する。
1つの実施形態では、結合分子及び例えば代謝拮抗物質等の化学療法剤を、単回投与で投与する。1つの実施形態では、結合分子及び例えば代謝拮抗物質等の化学療法剤を隔週投与する。1つの実施形態では、結合分子及び例えば代謝拮抗物質等の化学療法剤を、3週間毎投与する。
1つの実施形態では、結合分子（例えば、B3F6.1-DM4等の、マイタンシノイドに結合しているヒト化抗Cripto抗体等）の有効量は、約5mg/kg、約10mg/kg、約15mg/kg、約25mg/kg及び約40mg/kgから成る群から選択される。好ましい実施形態では、結合分子の有効量は15mg/kgである。
1つの実施形態では、結合分子及び例えば代謝拮抗物質等の化学療法剤を、腹腔内に、経口で、鼻腔内に、皮下に、筋肉内に、局所的に、又は静脈内に投与する。
1つの実施形態では、被験体は、脳、乳房、精巣、結腸、直腸、肺、卵巣、膀胱、子宮、頸部、膵臓及び胃から成る群から選択される器官の癌に罹患している。好ましい実施形態では、被験体は結腸癌に罹患している。
更に別の態様では、本発明は、被験体の腫瘍の増殖を阻害する方法であって、(i)確立した腫瘍を有する患者を選択する工程と、(ii)被験体に、有効量のCriptoに結合する結合分子を投与して、被験体の腫瘍の増殖を阻害する工程と、を含む方法を提供する。1つの実施形態では、結合分子は抗Cripto抗体である。1つの実施形態では、結合分子はヒト化抗Cripto抗体である。1つの実施形態では、抗Cripto抗体は、例えばDM4等のマイタンシノイドに結合する。1つの実施形態では、マイタンシノイドは、例えばSPDB等のヘテロ二官能性架橋剤を介して抗体に結合する。1つの実施形態では、平均3.5分子のDM4が抗Cripto抗体に結合する。
1つの実施形態では、結合分子を単回投与で投与する。1つの実施形態では、結合分子を隔週投与する。1つの実施形態では、結合分子を、3週間毎投与する。
1つの実施形態では、結合分子（例えば、B3F6.1-DM4等の、マイタンシノイドに結合しているヒト化抗Cripto抗体等）の有効量は、約5mg/kg、約10mg/kg、約15mg/kg、約25mg/kg及び約40mg/kgから成る群から選択される。1つの実施形態では、結合分子（例えば、B3F6.1-DM4等のマイタンシノイドに結合しているヒト化抗Cripto抗体）の有効量は、少なくとも約15mg/kgである。1つの実施形態では、結合分子（例えば、B3F6.1-DM4等のマイタンシノイドに結合しているヒト化抗Cripto抗体）の有効量は、少なくとも約25mg/kgである。1つの実施形態では、結合分子（例えばB3F6.1-DM4等のマイタンシノイドに結合しているヒト化抗Cripto抗体）の有効量は少なくとも約40mg/kgである。
1つの実施形態では、結合分子を、腹腔内に、経口で、鼻腔内に、皮下に、筋肉内に、局所的に、又は静脈内に投与する。
1つの実施形態では、被験体は、脳、乳房、精巣、結腸、直腸、肺、卵巣、膀胱、子宮、頸部、膵臓及び胃から成る群から選択される器官の癌に罹患している。好ましい実施形態では、被験体は結腸癌に罹患している。
更に別の態様では、本発明は、Criptoに結合する結合分子の単回有効量を被験体に投与して、被験体の腫瘍の増殖を阻害することを含む、被験体の腫瘍の増殖を阻害する方法を提供する。
1つの実施形態では、結合分子は抗Cripto抗体である。1つの実施形態では、結合分子は、ヒト化抗Cripto抗体である。1つの実施形態では、抗Cripto抗体は、マイタンシノイドに結合する。好ましい実施形態では、マイタンシノイドはDM4である。好ましい実施形態では、平均3.5分子のDM4が1分子の抗体に結合している。1つの実施形態では、マイタンシノイドは、ヘテロ二官能性架橋剤を介して抗体に結合する。1つの実施形態では、ヘテロ二官能性架橋剤は、4-(2-ピリジルジチオ)ブタン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（SPDB)である。
1つの実施形態では、単回有効量は、約5mg/kg、約10mg/kg、約15mg/kg、約25mg/kg、及び約40mg/kgから成る群から選択される。
1つの実施形態では、被験体は、脳、乳房、精巣、結腸、直腸、肺、卵巣、膀胱、子宮、頸部、膵臓及び胃から成る群から選択される器官の癌に罹患している。
別の態様では、本発明は、(a)治療的に有効な量の、Criptoに結合する結合分子と、(b)pHが5.0である、10mMのコハク酸ナトリウムと、(c)120mMのL-グリシンと、(d)120mMのグリセロールと、(e)0.01%のポリソルベート80と、を含む液体水性医薬品製剤を提供する。
1つの実施形態では、結合分子はヒト化抗Cripto抗体である。1つの実施形態では、ヒト化抗Cripto抗体はマイタンシノイドに結合する。1つの実施形態では、マイタンシノイドはDM4である。好ましい実施形態では、平均3.5分子のDM4が1分子の抗体に結合する。1つの実施形態では、マイタンシノイドは、ヘテロ二官能性架橋剤を介して抗体に結合する。1つの実施形態では、ヘテロ二官能性架橋剤は4-(2-ピリジルジチオ)ブタン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（SPDB)である。好ましい実施形態では、結合分子（例えば、DM4に結合したヒト化抗Cripto抗体)の濃度は5mg/mlである。
確立したCT-3異種移植腫瘍を有する胸腺欠損ヌードマウスの腫瘍重量の変化に対する、種々の投与計画における、静脈内投与されたB3F6.1-DM4の単回投与（25及び40mg/kg/注射）又は2回投与（25及び40mg/kg/注射）の効果を示す図である。 確立したCT-3異種移植腫瘍を有する胸腺欠損ヌードマウスの腫瘍重量の変化に対する、それぞれ静脈内投与された、B3F6.1-DM4の単回投与（15mg/kg/注射）、5-フルオロウラシルの単回投与（30mg/kg/注射）、及びB3F6.1-DM4の単回投与（15mg/kg/注射）と5-フルオロウラシルの単回投与（30mg/kg/注射）との組み合わせの効果を示す図である。 大きなCT-3異種移植腫瘍、例えば550〜775mgの平均腫瘍重量を有する腫瘍、を有する胸腺欠損ヌードマウスの腫瘍重量の変化に対する、静脈内投与されたB3F6.1-DM4の単回投与（15及び25mg/kg/注射）の効果を示す図である。 確立したヒト精巣異種移植腫瘍を有する胸腺欠損ヌードマウスの腫瘍重量の変化に対する、B3F6.1-SMCC-DM1の単回投与（5、10及び15mg/kg/注射）又はB3F6.1-SPDB-DM4の単回投与（5、10及び15mg/kg/注射）の効果を示す図である。
本発明は、少なくとも部分的に、マイタンシノイドに結合した、ヒト化抗Cripto抗体B3F6.1（B3F6.1-DM4）が、単回投与又は隔週投与計画で投与されたとき、動物モデルにおいてインビボで腫瘍細胞の増殖を阻害するのに有効であるという発見に基づいている。マウスモデルにおける隔週投与は、霊長類における3週間毎に1回の投与に相当し、これはヒトでのB3F6.1-DM4の有効量が、3週間毎に1回投与するという投与計画を含むことを示す。本発明は、更に、B3F6.1-DM4の単回投与が、インビボマウスモデルにおける確立した腫瘍の増殖を阻害するのに有効であるという発見にも基づいている。本発明は、更に、例えば、5’-フルオロウラシル等の代謝拮抗物質のような化学療法剤等の追加剤と共にB3F6.1-DM4を投与すると、インビボマウスモデルにおけるインビボでの腫瘍細胞の増殖を相乗的に阻害するという発見にも基づいている。
したがって、本発明は、有効量のCriptoに結合する結合分子、例えばマイタンシノイドに結合したヒト化抗Cripto抗体（例えば、B3F6.1-DM4）を患者に投与することを含む、被験体の腫瘍の増殖を阻害する方法であって、前記結合分子を3週間毎に1回投与する方法を提供する。本発明は、更に、有効量の、Criptoに結合する結合分子、例えばマイタンシノイドに結合したヒト化抗Cripto抗体（例えば、B3F6.1-DM4）及び例えば5’-フルオロウラシル等のピリミジン類似体等の代謝拮抗物質等の追加の化学療法剤を被験体に投与して、被験体の腫瘍の増殖を阻害することを含む、被験体の腫瘍の増殖を阻害する方法を提供する。本発明はまた、確立した腫瘍を有する患者を選択する工程と、被験体に、有効量のCriptoに結合する結合分子を投与して、被験体の腫瘍の増殖を阻害する工程と、を含む、被験体の腫瘍の増殖を阻害する方法を提供する。
本発明を更に説明する前に、便宜上、特定の用語を以下に記載する。
I.定義
本発明の結合分子は、ヒトCripto分子に特異的に結合する結合部位を含む、少なくとも1つの結合ドメインを含むポリペプチド分子である。ヒトCriptoの代表的な配列を、配列番号6（CR-1）及び配列番号7（CR-3）に示す。CR-1は、未分化ヒト奇形腫細胞で発現するヒトCriptoタンパク質をコードする構造遺伝子に対応し、CR-3は、サイレント置換及びリプレイスメント置換の両方を表す、コード領域に7つの塩基置換を含むmRNAの完全なコピーに対応する。CR-1は3番染色体に位置し、CR-3はXq21-q22に位置する。Dono et al. 1991. Am J Hum Genet. 1991 49:555。
好ましくは、本発明の結合分子は、マウスB3F6抗体由来の少なくとも1つのCDR（例えば、1、2、3、4、5又は好ましくは6個のCDR)を含む。マウスB3F6抗体は、Criptoのアミノ酸残基46〜62にわたるドメインのエピトープに結合する。マウスB3F6抗体を作製するハイブリドーマ（B3F6.17とも呼ばれる）は、受け入れ番号PTA-3319でATCCに寄託された。抗体は、CHO細胞で発現するCripto融合タンパク質でマウスを免疫することにより、作製された。免疫に用いられる融合タンパク質は、ヒトIgG1 Fcドメインに融合したCriptoのアミノ酸残基1〜169[配列番号6のアミノ酸1〜169]を含んでいた（コンストラクトは、CR（del C)-Fcと呼ばれる）。B3F6抗体を作製する方法は、例えば、国際公開第02/088170号に、より詳細に記載されている。具体的には、代表的なヒト化B3F6抗体は、国際公開第06/74397号に見出すことができる。B3F6抗体の1種のヒト化バージョンを産生するCHO細胞は、受け入れ番号PTA-7284でATCCに寄託された。
本明細書で使用するとき、「確立した腫瘍」は、もはや栄養素、例えば酸素が徐々に被験体の血管系から腫瘍の中心に浸透することができず、よって腫瘍は栄養素を受容するために自身の血管供給を必要とするような、十分な大きさの固形腫瘍である。
1つの実施形態では、本課題の方法は、血管化腫瘍を治療するために用いられる。血管化腫瘍は、確立した血管系の特徴を有する腫瘍を含む。このような腫瘍は、その大きさ及び／又は血管若しくは血管形成のマーカーの存在により同定される。
本発明の1つの実施形態では、併用療法を用いて、確立した腫瘍、例えば、もはや栄養素が徐々に被験体の血管系から腫瘍の中心に浸透することができず、よって腫瘍は栄養素を受容するために自身の血管供給を必要とするような、十分な大きさの固形腫瘍、すなわち血管化腫瘍を治療する。1つの実施形態では、併用療法を用いて、少なくとも約1mm×1mmの寸法を有する腫瘍を治療する。本発明の別の実施形態では、併用療法を用いて、少なくとも約2mm×2mmである腫瘍を治療する。本発明の更に別の実施形態では、併用療法を用いて、少なくとも約5mm×5mmである腫瘍を治療する。本発明の他の実施形態では、腫瘍は少なくとも約1cm3の体積を有する。1つの実施形態では、本発明の併用療法を用いて、触診により、又はMRI、超音波若しくはCATスキャンのような、当該技術分野において周知であるイメージング技術により見つけるのに十分大きな腫瘍を治療する。
本明細書で使用するとき、指定されたタンパク質に「由来する」という用語は、ポリペプチドの起源を指す。1つの実施形態では、特定の出発ポリペプチドに由来するポリペプチド又はアミノ酸配列は、CDR配列又はそれに関連する配列である。1つの実施形態では、特定の出発ポリペプチドに由来するアミノ酸配列は、隣接していない。例えば、1つの実施形態では、1、2、3、4、5又は6個のCDRが出発ポリペプチドに由来する。1つの実施形態では、特定の出発ポリペプチド若しくはアミノ酸配列に由来するポリペプチド又はアミノ酸配列は、出発配列又は、少なくとも3〜5アミノ酸、5〜10アミノ酸、少なくとも10〜20アミノ酸、少なくとも20〜30アミノ酸、若しくは少なくとも30〜50アミノ酸から成るその一部と本質的に同一であるアミノ酸配列を有する、又はそうでなければ出発配列にその源を有すると当業者が同定可能である。1つの実施形態では、出発抗体に由来する１つ以上のCDRを変化させて、変異CDR配列がCripto結合活性を維持している、変異CDR配列を作製する。
本発明の結合分子は、それらが由来するB3F6抗体とはアミノ酸配列が異なるように改変してもよいことを、当業者は理解するであろう。例えば、保存的置換若しくは「非本質的な」アミノ酸残基の変化を導く、ヌクレオチド又はアミノ酸置換を作製してもよい（例えば、CDR及び／又はフレームワーク残基に）。本発明の結合分子は、Criptoに結合する能力を維持する。
ポリペプチドの非天然変異体をコードしている単離された核酸分子は、コードされているタンパク質に１つ以上のアミノ酸置換、付加又は欠失を導入するように、免疫グロブリンのヌクレオチド配列に、１つ以上のヌクレオチド置換、付加又は欠失を導入することにより、作製できる。突然変異は、部位特異的突然変異誘発及びPCR介在突然変異誘発のような標準的な技術により導入してよい。好ましくは、保存的アミノ酸置換は、１つ以上の非本質的なアミノ酸残基で行われる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術分野において規定されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。したがって、免疫グロブリンポリペプチドの非本質的なアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基で置換してもよい。別の実施形態では、アミノ酸のストリングを、側鎖ファミリーのメンバーの順序及び／又は組成の異なる構造的に類似のストリングで置換することができる。
あるいは、別の実施形態では、突然変異は、免疫グロブリンのコード配列の全て又は一部に沿ってランダムに導入してもよい。
1つの実施形態では、結合分子は1つの結合部位を含む。別の実施形態では、結合分子は少なくとも2つの結合部位を含む。1つの実施形態では、結合分子は2つの結合部位を含む。1つの実施形態では、結合分子は3つの結合部位を含む。別の実施形態では、結合分子は4つの結合部位を含む。
1つの実施形態では、本発明の結合分子は単量体である。別の実施形態では、本発明の結合分子は多量体である。例えば、1つの実施形態では、本発明の結合分子（ｉｎｄｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）は二量体である。1つの実施形態では、本発明の二量体は、2つの同一単量体サブユニットを含むホモ二量体である。別の実施形態では、本発明の二量体は、2つの同一ではない単量体サブユニットを含むヘテロ二量体である。二量体のサブユニットは、１つ以上のポリペプチド鎖を含んでよい。例えば、1つの実施形態では、二量体は、少なくとも2つのポリペプチド鎖を含む。1つの実施形態では、二量体は、2つのポリペプチド鎖を含む。別の実施形態では、二量体は4つのポリペプチド鎖を含む（例えば、抗体分子の場合のように）。
本発明の好ましい結合分子は、ヒトのアミノ酸配列に由来する、フレームワーク及び／又は定常領域のアミノ酸配列を含む。例えば、1つの実施形態では、本発明の結合分子は、キメラ抗体である。別の実施形態では、本発明の結合分子はヒト化抗体である。しかしながら、結合ポリペプチドは、別の哺乳類種に由来するフレームワーク及び／又は定常領域の配列を含んでよい。例えば、霊長類のフレームワーク領域（例えば、非ヒト霊長類）、重鎖部、及び／又はヒンジ部を、対象結合分子に含んでもよい。1つの実施形態では、１つ以上のマウスのアミノ酸が、結合ポリペプチドのフレームワーク領域に存在してもよく、例えば、ヒト又は非ヒト霊長類のフレームワークアミノ酸配列は、対応するマウスアミノ酸残基が存在する、１つ以上のアミノ酸復帰突然変異を含んでよい。本発明の好ましい結合分子は、出発B3F6マウス抗体より免疫原性が低い。
本明細書で使用するとき、用語「重鎖部」は、免疫グロブリンの重鎖に由来するアミノ酸配列を含む。重鎖部を含むポリペプチドは、CH1ドメイン、ヒンジ（例えば、上方、中央及び／又は下方ヒンジ領域）ドメイン、CH2ドメイン、CH3ドメイン、又はこれらの変異体若しくは断片の少なくとも1つを含む。1つの実施形態では、本発明のポリペプチドは、CH1ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、及びCH2ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、CH1ドメイン及びCH3ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、CH1ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、及びCH3ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、CH3ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。1つの実施形態では、本発明のポリペプチドは、CH2ドメインの少なくとも一部（例えば、CH2ドメインの全て又は一部）を欠く。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、完全なIg重鎖を含む。上記のように、自然発生的免疫グロブリン分子とはアミノ酸配列が異なるように、これらのドメイン（例えば、重鎖部）を改変してよいことを、当業者は理解するであろう。
1つの実施形態では、本発明の結合分子のポリペプチド鎖の少なくとも2つは、抗体又は免疫グロブリン分子に由来する少なくとも1つの重鎖部を含む。1つの実施形態では、本発明のポリペプチドの少なくとも2つの重鎖部が、異なるポリペプチド鎖上に存在し、例えば、少なくとも1つのジスルフィド結合を介して（A型）又は非共有結合性相互作用を介して（B型）相互作用して、二量体のそれぞれの単量体が少なくとも1つの重鎖部を含む、二量体ポリペプチドを形成する。
1つの実施形態では、二量体の1つのポリペプチド鎖の重鎖部は、二量体の第2ポリペプチド鎖の重鎖部と同一である。1つの実施形態では、本発明の二量体の単量体（又は半量体）は、互いに同一である。別の実施形態では、それらは同一ではない。例えば、各単量体は、異なる標的結合部位を含んでよい。
1つの実施形態では、本発明の結合分子は、共有結合性相互作用、例えば、ジスルフィド結合により結合し、二量体である。1つの実施形態では、本発明の二量体は、１つ以上のジスルフィド結合により結合する。別の実施形態では、本発明の二量体は、１つ以上、好ましくは2つのジスルフィド結合により結合する。別の実施形態では、本発明の二量体は、１つ以上、好ましくは3つのジスルフィド結合により結合する。別の実施形態では、本発明の二量体は、１つ以上、好ましくは4つのジスルフィド結合により結合する。別の実施形態では、本発明の二量体は、１つ以上、好ましくは5つのジスルフィド結合により結合する。別の実施形態では、本発明の二量体は、１つ以上、好ましくは6つのジスルフィド結合により結合する。別の実施形態では、本発明の二量体は、１つ以上、好ましくは7つのジスルフィド結合により結合する。別の実施形態では、本発明の二量体は、１つ以上、好ましくは8つのジスルフィド結合により結合する。別の実施形態では、本発明の二量体は、１つ以上、好ましくは9つのジスルフィド結合により結合する。別の実施形態では、本発明の二量体は、１つ以上、好ましくは10個のジスルフィド結合により結合する。更なる実施形態では、本発明の二量体は、ジスルフィド結合により結合しないが、例えば、非共有結合性相互作用により結合する。
ポリペプチドの重鎖部は、異なる免疫グロブリン分子に由来してもよい。例えば、ポリペプチドの重鎖部は、IgG1分子に由来するCH1ドメイン及びIgG3分子に由来するヒンジ領域を含んでよい。別の実施形態では、重鎖部は、部分的にIgG1分子に由来し、部分的にIgG3分子に由来するヒンジ領域を含んでよい。別の実施形態では、重鎖部は、部分的にIgG1分子に由来し、部分的にIgG4分子に由来するキメラヒンジを含んでよい。
本明細書で使用するとき、用語「軽鎖部」は、免疫グロブリン軽鎖に由来するアミノ酸配列を含む。好ましくは、軽鎖部はVL又はCLドメインの少なくとも1つを含む。
1つの実施形態では、本発明のポリペプチドは、Ig分子に由来しないアミノ酸配列又は１つ以上の部分を含む。代表的な改変については、以下により詳細に記載する。例えば、1つの実施形態では、本発明のポリペプチドは、可動リンカー配列を含んでもよい。別の実施形態では、ポリペプチドを改変して、１つ以上の機能部（例えば、PEG、薬物、プロドラッグ、及び／又は検出可能なラベル）を付加してもよい。
「キメラ」タンパク質は、自然界では元来結合していない第2アミノ酸配列に結合している第1アミノ酸配列を含む。アミノ酸配列は、通常、融合ポリペプチド中で一緒になっている別々のタンパク質中に存在してよく、又はそれらは通常、同じタンパク質中に存在してよいが、融合ポリペプチド中では新たな並びで配置される。キメラタンパク質は、例えば、化学合成により、又はペプチド領域が所望の関係でコードされているポリヌクレオチドを作製し翻訳することにより、作製できる。代表的なキメラポリペプチドとしては、融合タンパク質及び本発明のキメラヒンジ連結ペプチドが挙げられる。
1つの実施形態では、本発明の結合ポリペプチドは融合タンパク質である。1つの実施形態では、本発明の融合タンパク質は、結合ドメイン（少なくとも1つの結合部位を含む）及び二量化ドメイン（少なくとも1つの重鎖部を含む）を含むキメラ分子である。重鎖部は、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4サブタイプ、IgA、IgE、IgD又はIgMのような免疫グロブリンのいずれかに由来してよい。1つの実施形態では、融合タンパク質は、合成連結ペプチドを更に含む。
本発明の別の実施形態では、結合分子は「抗体−融合タンパク質キメラ」である。このような分子は、抗体の少なくとも1つの結合ドメインと少なくとも1つの融合タンパク質とを結合させた分子を含む。好ましくは、2つのポリペプチド間の界面は、免疫グロブリン分子のCH3ドメインである。
ポリヌクレオチド又はポリペプチドに適用するとき、用語「異種」は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドが、比較する実体の残りとは遺伝子型が異なる実体に由来することを意味する。例えば、異種ポリヌクレオチド又は抗原は、異なる種、異なる細胞型、又は異なる個体の同じ細胞型由来であってよい。
用語「リガンド結合ドメイン」又は「リガンド結合部」は、本明細書で使用するとき、任意のネイティブな受容体（例えば、細胞表面受容体）又は、少なくとも質的リガンド結合能力、好ましくは対応するネイティブな受容体の生物活性を保持している、その任意の領域若しくは誘導体を指す。
用語「受容体結合ドメイン」又は「受容体結合部」は、本明細書で使用するとき、ネイティブなリガンド又は、少なくとも質的受容体結合能力、好ましくは対応するネイティブなリガンドの生物活性を保持している、その領域若しくは誘導体を指す。
1つの実施形態では、本発明の結合分子は、「抗体」又は「免疫グロブリン」分子であり、例えば、自然発生的抗体若しくは免疫グロブリン分子（又はその抗原（ａｎｔｉｂｅｎ）結合断片）、又は類似の方法で抗原を抗体分子に結合させる遺伝子操作された抗体分子である。本明細書で使用するとき、用語「免疫グロブリン」は、いずれかの関連する特異的免疫反応性を有するかどうかにかかわらず、2つの重鎖及び2つの軽鎖の組み合わせを有するポリペプチドを指す。「抗体」は、目的の抗原（例えば、抗原関連抗原）に対して著しい既知の特異的免疫反応活性を有する、このようなアセンブリを指す。抗体及び免疫グロブリンは、それらの間に鎖間共有結合を有する又は有しない、重鎖及び軽鎖を含む。脊椎動物系における基本的な免疫グロブリン構造は比較的よく理解されている。
以下でより詳細に論じるように、総称「免疫グロブリン」は、生化学的に区別できる、抗体の5種の異なるクラスを含む。5種の抗体のクラスは全て本発明の範囲内であり、以下の議論は一般的にIgGクラスの免疫グロブリン分子を対象とする。IgGに関して、免疫グロブリンは、分子量およそ23,000ダルトンの2本の同一のポリペプチド軽鎖及び分子量53,000〜70,000ダルトンの2本の同一の重鎖を含む。4本の鎖は、「Y」字型で、ジスルフィド結合により結合し、軽鎖が重鎖と一まとめにされ、それが「Y」字の開口から始まり、可変領域を通じて続く。
軽鎖及び重鎖は両方、構造的及び機能的に相同な領域に分割される。用語「定常」及び「可変」は、機能的に用いられる。この点で、軽鎖の可変領域（VL)及び重鎖の可変領域（VH)の両方は、抗原認識及び特異性を決定すると理解されよう。対照的に、軽鎖の定常領域（CL)及び重鎖の定常領域（CH1、CH2又はCH3)は、分泌、経胎盤性移動性、Fc受容体結合、補体結合等のような、重要な生物学的性質を与える。慣例により、定常領域ドメインの番号が大きくなるにつれて、抗体の抗原結合部位又はアミノ末端からより遠位になる。N末端は可変領域であり、C末端は定常領域であり、CH3及びCLドメインは実際に、それぞれ重鎖及び軽鎖のカルボキシ末端を含む。
本明細書で使用するとき、用語「可変領域CDRアミノ酸残基」は、配列又は構造に基づく方法を用いて同定したとき、CDR又は相補性決定領域におけるアミノ酸を含む。本明細書で使用するとき、用語「CDR」又は「相補性決定領域」は、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見られる不連続な抗原結合部位を意味する。これらの具体的な領域は、Kabat et al., J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977) 及びKabat et al., Sequences of protein of immunological interest. (1991)に記載されており、互いに比較したとき、定義がアミノ酸残基の重複又は部分集合を含む場合は、Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) 及びMacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996) により記載されている。上記に引用した参考文献のそれぞれにより定義されているCDRを包含するアミノ酸残基を、比較のために記載する。好ましくは、用語「CDR」は、配列比較に基づいてKabatにより定義されているCDRである。
本明細書で使用するとき、「可変領域フレームワーク（FR)アミノ酸残基」は、Ig鎖のフレームワーク領域内のアミノ酸残基を指す。用語「フレームワーク領域」又は「FR領域」は、本明細書で使用するとき、（例えば、KabatのCDRの定義を用いて）可変領域の一部であるが、CDRの一部ではないアミノ酸残基を含む。それ故、可変領域のフレームワークは、長さ約100〜120アミノ酸であるが、CDRの外側のアミノ酸のみを含む。重鎖可変領域の具体例及びKabatらにより定義されたCDRでは、フレームワーク領域1は、アミノ酸1〜30を包含する可変領域のドメインに対応し、フレームワーク領域2は、アミノ酸36〜49を包含する可変領域のドメインに対応し、フレームワーク領域3は、アミノ酸66〜94を包含する可変領域のドメインに対応し、フレームワーク領域4は、アミノ酸103から可変領域の末端までの可変領域のドメインに対応する。軽鎖のフレームワーク領域は、軽鎖（light claim）可変領域CDRのそれぞれにより同様に分離される。同様に、Chothiaら又はMcCallumらによるCDRの定義を用いて、フレームワーク領域の境界は、上述のようなそれぞれのCDR末端により分離される。好ましい実施形態では、CDRはKabatにより定義されたものである。
自然発生的抗体では、各単量体抗体上に存在する6つのCDRは、抗体が水性環境における三次元配置をとるときに、特異的に配置されて抗原結合部位を形成する、アミノ酸の短く、不連続な配列である。重鎖及び軽鎖の可変領域の残りは、アミノ酸配列の分子間可変性が低く、フレームワーク領域と呼ばれる。フレームワーク領域は、主にβ−シート構造をとり、CDRはβ−シート構造に連結し、場合によってはその一部を形成するループを形成する。したがって、これらのフレームワーク領域は、鎖間非共有結合性相互作用により、6つのCDRを正確な配向に位置づけるスカフォールドを形成するよう作用する。この位置づけられたCDRにより形成される抗原結合部位は、免疫反応性抗原上のエピトープに相補的な表面を画定する。この相補的な表面は、抗体の免疫反応性抗原エピトープへの非共有結合を促進する。当業者は、CDRの位置を容易に同定できる。
既に示したように、種々の免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造及び三次元配置は周知である。本明細書で使用するとき、用語「VHドメイン」は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインを含み、用語「CH1ドメイン」は、免疫グロブリン重鎖の第1（最もアミノ末端側）定常領域を含む。CH1ドメインは、VHドメインに隣接し、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域のアミノ末端側である。
本明細書で使用するとき、用語「CH2ドメイン」は、従来の番号付けスキームを用いて、抗体の例えばおよそ残基244〜残基360に延在する重鎖分子の一部を含む（残基244〜360、Kabat番号付けシステム；及び残基231〜340、EU番号付けシステム、Kabat EA et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest. Bethesda、US Department of Health and Human Services、NIH. 1991)。CH2ドメインは、別のドメインと接近して対になっていない点で独特である。むしろ、2つのN-結合型分岐糖鎖は、インタクトなネイティブIgG分子の2つのCH2ドメイン間に介在する。CH3ドメインは、CH2ドメインからIgG分子のC末端まで延在し、およそ108残基を含むことも詳細に記録されている。
本明細書で使用するとき、用語「ヒンジ領域」は、CH1ドメインをCH2ドメインに結合させる重鎖分子の一部を含む。ヒンジ領域は、およそ25残基を含み、可動性であり、したがって2つのN末端の抗原結合領域を独立に動かすことができる。ヒンジ領域は、3つの区別できるドメイン、上方、中央、及び下方ヒンジドメインに更に細かく分けることができる（Roux et al. J. Immunol. 1998 161:4083)。
軽鎖は、カッパ又はラムダ（k、l）のいずれかに分類される。各重鎖のクラスは、カッパ又はラムダ軽鎖のいずれかと結合できる。一般に、軽及び重鎖は、互いに共有結合し、2つの重鎖の「尾」部分は、免疫グロブリンがハイブリドーマ、B細胞又は遺伝子操作された宿主細胞のいずれかにより産生されるとき、共有ジスルフィド結合又は非共有結合により互いに結合している。重鎖では、アミノ酸配列は、Y字型の叉状末端のN末端から、各鎖の底部のC末端に及ぶ。当業者は、重鎖が、その中にいくつかのサブクラス（例えば、g1〜g4）を有する、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ又はイプシロン（g、m、a、d、e）に分類されることを理解するであろう。抗体の「クラス」を、それぞれ、IgG、IgM、IgA、IgG又はIgEと決定するのは、この鎖の性質である。免疫グロブリンのサブクラス（アイソタイプ）、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等は、特徴がはっきりしており、機能的分化を与えることが知られている。これらのクラス及びアイソタイプのそれぞれの改変されたバージョンは、本開示を考慮して当業者に容易に識別可能であり、したがって本発明の範囲内である。
上記に示したように、可変領域により、抗体は抗原上のエピトープを選択的に認識し、特異的に結合することができる。つまり、抗体のVLドメイン及びVHドメインは、結合して、三次元抗原結合部位を画定する可変領域を形成する。この四次抗体構造は、Yの各腕部の端部に存在する抗原結合部位を形成する。より具体的には、抗原結合部位は、VH及びVL鎖のそれぞれ上の3つの相補性決定領域（CDR)により画定される。
用語「断片」は、インタクトな若しくは完全な抗体又は抗体鎖よりも少ないアミノ酸残基を含む、抗体若しくは抗体鎖の部分又は一部を指す。用語「抗原結合部位」は、抗原に結合する、又は抗原結合（すなわち、特異的結合）のために、インタクトな抗体と（すなわち、それらが由来するインタクトな抗体と）競合する、免疫グロブリン又は抗体のポリペプチド断片を指す。本明細書で使用するとき、抗体分子の「抗原結合断片」としては、抗体の抗原結合断片、例えば、抗体軽鎖（VL)、抗体重鎖（VH)、単鎖抗体（scFv)、F(ab’)2断片、Fab断片、Fd断片、Fv断片、及び単一ドメイン抗体断片（DAb)が挙げられる。断片は、例えば、インタクトな若しくは完全な抗体又は抗体鎖の化学的又は酵素的処理を介して、又は組換え手段により、得ることができる。
本明細書で使用するとき、用語「結合部位」は、関心標的分子（例えば、抗原、リガンド、受容体、基質又は阻害剤）への選択的結合に関与するポリペプチドの領域を含む。結合ドメインは、少なくとも1つの結合部位を含む。代表的な結合ドメインとしては、抗体可変ドメイン、リガンドの受容体結合ドメイン、受容体のリガンド結合ドメイン又は酵素的ドメインが挙げられる。
本明細書で使用するとき、用語「結合価」は、ポリペプチド内の潜在的標的結合部位の数を指す。各標的結合部位は、1つの標的分子又は標的分子上の特異的部位に特異的に結合する。ポリペプチドが1を超える標的結合部位を含むとき、各標的結合部位は、同じ又は異なる分子に特異的に結合できる（例えば、異なるリガンド、若しくは異なる抗原、又は同じ抗原上の異なるエピトープに結合できる）。本結合分子は、ヒトCripto分子に特異的な少なくとも1つの結合部位を有する。
用語「特異性」は、所与の標的に特異的に結合する（例えば、免疫反応する）能力を指す。ポリペプチドは、単一特異的であって、標的に特異的に結合する１つ以上の結合部位を含有してよく、又はポリペプチドは多特異的であって、同じ又は異なる標的に特異的に結合する２つ以上の結合部位を含有してよい。
1つの実施形態では、本発明の結合分子は、1つを超える標的に対して特異的である。例えば、1つの実施形態では、本発明の多特異的結合分子は、Cripto及び腫瘍細胞で発現している第2分子に結合する。腫瘍細胞上で発現する抗原に結合する抗原結合部位を含む代表的な抗体は、当該技術分野において既知であり、このような抗体に由来する１つ以上のCDRを、本発明の結合分子に含むことができる。代表的な抗体としては、2B8、Lym1、Lym2、LL2、Her2、B1、MB1、BH3、B4、B72.3、5E8及び5E10が挙げられる。
1つの実施形態では、本発明の結合分子は、連結ペプチドを含む。本発明の連結ペプチドは合成である。本明細書で使用するとき、ポリペプチドに関して用語「合成」とは、自然に発生しないアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。例えば、改変された形の自然発生ポリペプチド（例えば、付加、置換又は欠失のような突然変異を含む）、又はアミノ酸の直鎖状配列で、自然界では元来結合していない第2アミノ酸配列（自然発生であってもなくてもよい）に結合している第1アミノ酸配列（自然発生であってもなくてもよい）を含む、非自然発生ポリペプチドである。
本発明の連結ペプチドは、本発明の結合分子の2つのドメイン（例えば、結合ドメイン及び二量化ドメイン）を連結する。例えば、連結ペプチドは、結合部位を含む結合ドメインに重鎖部を連結する。1つの実施形態では、連結ペプチドは、ポリペプチド鎖の直鎖状アミノ酸配列で、CH1及びCH2ドメイン、CH1及びCH3ドメイン、ヒンジ及びCH1ドメイン、ヒンジ及びCH3ドメイン、VH及びヒンジドメイン、又はCH3ドメイン及び非免疫グロブリンポリペプチド）のような、2つの重鎖定常領域ドメインを連結する。好ましくは、このような連結ペプチドは、結合分子に可動性を与え、ジスルフィド結合を介した二量化を促進する。1つの実施形態では、本発明の連結ペプチドを用いて、領域欠失コンストラクトで、１つ以上の重鎖ドメイン（例えば、定常領域ドメインの少なくとも一部（例えば、CH2ドメインの少なくとも一部）及び／又はヒンジ領域の少なくとも一部（例えば、下方ヒンジ領域ドメインの少なくとも一部）を置換する。例えば、1つの実施形態では、VHドメインは連結ペプチドを介してCH3ドメインに融合する（連結ペプチドのC末端がCH3ドメインのN末端に結合し、連結ペプチドのN末端がVHドメインのC末端に連結する）。別の実施形態では、VLドメインは連結ペプチドを介してCH3ドメインに融合する（連結ペプチドのC末端がCH3ドメインのN末端に結合し、連結ペプチドのN末端がVLドメインのC末端に連結する）。別の実施形態では、CH1ドメインは連結ペプチドを介してCH3ドメインに融合する（連結ペプチドのC末端がCH3ドメインのN末端に結合し、連結ペプチドのN末端がCH1ドメインのC末端に連結する）。
1つの実施形態では、合成連結ペプチドは、定常領域ドメインの一部を含む。例えば、1つの実施形態では、CH2ドメインを置換する連結ペプチドは、CH2ドメインの一部を含んでよい。
1つの実施形態では、連結ペプチドは、gly-serリンカーを含む又はそれから成る。本明細書で使用するとき、用語「gly-serリンカー」は、グリシン及びセリン残基から成るペプチドを指す。代表的なgly/serリンカーは、アミノ酸配列GGGSSGGGSG（配列番号8）を含む。1つの実施形態では、本発明の連結ペプチドは、上方ヒンジ領域の少なくとも一部（例えば、IgG1、IgG3又はIgG4分子に由来する）、中央ヒンジ領域の少なくとも一部（例えば、IgG1、IgG3又はIgG4分子に由来する）、及び一連のgly/serアミノ酸残基（例えば、GGGSSGGGSG（配列番号8）のようなgly/serリンカー）を含む。1つの実施形態では、連結ペプチドは、自然発生IgG1又はIgG3ヒンジ領域と比較したとき、１つ以上のアミノ酸の置換を含む。別の実施形態では、連結ペプチドは、国際公開第02/060955号に記載のようなアミノ酸配列を含む。連結ペプチドについては、以下により詳細に記載する。
本明細書で使用するとき、用語「ジスルフィド結合」は、2つの硫黄原子間に形成される共有結合を含む。アミノ酸システインは、第2チオール基とジスルフィド結合又は架橋を形成できるチオール基を含む。大部分の自然発生IgG分子では、CH1及びCL領域はジスルフィド結合により結合し、2本の重鎖は、Kabatの番号付けシステムを用いて239及び242に対応する位置で2つのジスルフィド結合により結合される（EU番号付けシステムでは、226又は229の位置）。
1つの実施形態では、本発明の結合分子は、抗体結合部位を含む。例えば、1つの実施形態では、本発明の結合分子は完全長抗体分子である。別の実施形態では、本発明の結合分子は、抗体分子の断片である。別の実施形態では、本発明の結合分子は、改変された又は合成抗体分子である。
本発明の結合分子は、当該技術分野において既知である技術を用いて作製できる。1つの実施形態では、本発明のポリペプチドは、「組み換えでつくられた」すなわち組み換えDNA技術を用いてつくられた抗体分子である。抗体分子を作製する代表的な技術については、以下でより詳細に論じる。
1つの実施形態では、本発明のポリペプチドは、改変された抗体である。本明細書で使用するとき、用語「改変された抗体」は、自然発生的ではないように変えられた抗体の合成形を含み、例えば、少なくとも2つの重鎖部であるが、2つの完全な重鎖ではないものを含む抗体（ドメイン欠失抗体又はミニボディのような）；２つ以上の異なる抗原又は単一抗原上の異なるエピトープに結合するよう変えられた、抗体の多特異的形（例えば、二特異的、三特異的等）；scFv分子に結合する重鎖分子等である。scFV分子は当該技術分野において既知であり、例えば、米国特許第5,892,019号に記載されている。更に、用語「改変された抗体」は、抗体の多価形を含む（例えば、三価、四価等、同じ抗原の３つ以上のコピーに結合する抗体）。別の実施形態では、本発明の結合分子は、CH2ドメインを欠く少なくとも1つの重鎖部を含み、受容体リガンド対の1つのメンバーの結合部を含むポリペプチドの結合ドメインを含む融合タンパク質である。
1つの実施形態では、本発明による用語「改変された抗体」は、定常領域ドメインの１つ以上の少なくとも一部が欠失している、又はそうでなければ、およそ同じ免疫原性を有する全体の、変えられていない抗体と比較したとき、非共有結合性二量化する能力、腫瘍の部位に局在化する能力の向上、又は血清半減期の短縮のような、所望の生化学的特徴を与えるように変えられている、免疫グロブリン、抗体、若しくは免疫反応性断片、又はこれらの組み換え体を含む。1つの実施形態では、本発明のポリペプチドは、免疫グロブリンの重鎖に類似しているポリペプチド鎖を含むが、１つ以上の重鎖ドメインの少なくとも一部を欠く、ドメイン欠失抗体である。より好ましくは、改変された抗体の定常領域の1つの全ドメインが欠失し、更により好ましくは、CH2ドメインの全て又は一部が欠失する。
好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、ヒトにおける有害な免疫応答を誘発しない。
1つの実施形態では、本発明の結合分子は、定常領域、例えば、重鎖定常領域を含み、これは野性型定常領域と比べて改変されている。つまり、本明細書に開示されている本発明のポリペプチドは、3つの重鎖定常領域（CH1、CH2又はCH3）の１つ以上及び／又は軽鎖定常領域ドメイン（CL)に対する変更又は改変を含んでよい。代表的な改変としては、１つ以上のドメインにおける１つ以上のアミノ酸の付加、欠失又は置換が挙げられる。
本明細書で使用するとき、用語「悪性腫瘍」とは、非良性腫瘍又は癌を指す。本明細書で使用するとき、用語「癌」は、細胞の増殖が無秩序である又は制御されていないことを特徴とする悪性腫瘍を含む。代表的な癌としては、癌腫、肉腫、白血病及びリンパ腫が挙げられる。用語「癌」は、原発性悪性腫瘍（例えば、細胞が元の腫瘍の部位以外の被験体の体内の部位に移動していないもの）及び続発性悪性腫瘍（例えば、転移、元の腫瘍の部位とは異なる二次部位に腫瘍細胞の移動から生じるもの）を含む。
本明細書で使用するとき、用語「操作された」は、合成手段による核酸又はポリペプチド分子の操作（例えば、組み換え技術、インビトロペプチド合成、ペプチドの酵素的若しくは化学的カップリング、又はこれらの技術のいくつかの組み合わせによる）を含む。好ましくは、本発明の結合分子は、操作されて、例えば、本発明の連結ペプチドを発現する。
本明細書で使用するとき、用語「結合した」、「融合した」又は「融合」は互換的に用いられる。これらの用語は化学的共役又は組み換え手段を含むいずれかの手段による、もう２つの要素又は成分の結合を指す。「インフレーム融合」は、元のORFの正確なリーディングフレームを維持する方法で、２つ以上のオープンリーディングフレーム（ORF)を連結させて、連続したより長いORFを形成することを指す。したがって、得られる組み換え融合タンパク質は、元のORFによりコードされているポリペプチドに一致する２つ以上のセグメントを含む単一タンパク質である（セグメントは、通常、自然界ではそのように連結していない）。したがって、リーディングフレームは融合したセグメント全体にわたって連続であるが、セグメントは、例えば、インフレームリンカー配列により物理的に又は空間的に分離される場合もある。
ポリペプチドの文脈で、「直鎖状配列」又は「配列」は、配列中で互いに隣接する残基がポリペプチドの一次構造で連続である、アミノ末端からカルボキシ末端方向への、ポリペプチド中のアミノ酸の順序である。
本明細書で使用するとき、語句「結合分子の投与による利益を享受する被験体」は、例えば、結合分子により認識される抗原の検出のために用いられる結合分子の投与（例えば、診断的処置用）、及び／又は、結合分子により認識された標的を低減する又は除去するための、結合分子による治療から利益を享受する、哺乳類の被験体のような被験体を含む。例えば、1つの実施形態では、被験体は、循環又は血清からの可溶性又は粒子状分子（例えば、毒素又は病原体）の低減若しくは除去、又は標的を発現する細胞（例えば、腫瘍細胞）の集団の低減若しくは除去による利益を享受することができる。本明細書により詳細に記載するように、結合分子は、結合していない形で用いることができる、又は例えば、薬物、プロドラッグ又は同位体に結合することもできる。
II.ヒト化
1つの実施形態では、本発明の結合分子は、少なくとも1つのヒト化B3F6抗体可変領域、例えば、軽鎖又は重鎖可変領域を含む、又はそれに由来する。
用語「ヒト化抗体」は、実質的にヒト抗体鎖（「アクセプター抗体」と呼ばれる）に由来する可変領域フレームワーク残基及び実質的に非ヒト抗体（「ドナー抗体」と呼ばれる）に由来する少なくとも1つの相補性決定領域（「CDR」）を含む少なくとも1本の鎖を含む抗体を指し、この場合抗Cripto抗体、例えば、B3F6である。好ましくは、定常領域は、存在する場合、実質的に又は完全にヒト免疫グロブリン由来である。
マウスB3F6抗体は、国際公開第2006 074397号に記載されている。マウスB3F6抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の配列を、それぞれ配列番号39及び配列番号40で提供する。マウスB3F6のCDRを以下の表1に記載する。
マウスB3F6抗体の可変軽鎖は、マウスのサブグループカッパ2のメンバーであり、113個のアミノ酸重複中92.9%の同一性を有する（マウスのサブグループカッパ2の共通配列は配列番号41に示す）。可変重鎖は、マウスのサブグループ2Bのメンバーであり、128個のアミノ酸重複中80.5%の同一性を有する（マウスのサブグループ2Bの共通配列は配列番号42に示す）。可変軽鎖はヒトのサブグループカッパ2に一致し、114個のアミノ酸重複中76.3%の同一性を有する（ヒトのサブグループカッパ2の共通配列は配列番号43に示す）。可変重鎖はヒトのサブグループ1に一致し、129個のアミノ酸重複中65.1%の同一性を有する（ヒトのサブグループ1の共通配列は配列番号44に示す）。
1つの実施形態では、本発明の抗原結合分子は、B3F6抗体分子の少なくとも1本の重鎖又は軽鎖CDRを含む。別の実施形態では、本発明の抗原結合分子は、少なくとも2つのCDR B3F6抗体分子を含む。別の実施形態では、本発明の抗原結合分子は、B3F6抗体分子由来の少なくとも3つのCDRを含む。別の実施形態では、本発明の抗原結合分子は、B3F6抗体分子由来の少なくとも4つのCDRを含む。別の実施形態では、本発明の抗原結合分子は、B3F6抗体分子由来の少なくとも5つのCDRを含む。別の実施形態では、本発明の抗原結合分子は、B3F6抗体分子由来の少なくとも6つのCDRを含む。1つの実施形態では、少なくとも1つのCDR（又は結合分子中に存在する1超のB3F6のCDR由来の少なくとも1つのCDR）が、自然発生B3F6分子のCDRとは配列が異なるが、B3F6に結合する能力は保持するよう改変される。
ヒト化抗体は、組み換えDNA技術を用いて産生することができ、例えば、Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1989), 86:10029-10033；Jones et al., Nature, (1986), 321:522-25；Riechmann et al., Nature, (1988), 332:323-27；Verhoeyen et al., Science, (1988), 239:1534-36；Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1989), 86:3833-37；米国特許第5,225,539号、同第5,530,101号、同第5,585,089号、同第5,693,761号、同第5,693,762号、同第6,180,370号を参照のこと。
例えば、好ましい非ヒトドナー抗体がヒト化のために選択されているとき、適切なヒトのアクセプター抗体は、例えば、発現したヒト抗体遺伝子の配列データベース、生殖系列Ig配列、又はいくつかのヒト抗体の共通配列から得ることができる。非ヒトCDRのヒト可変ドメインフレームワークへの置換は、ヒト可変ドメインフレームワークが、そのCDRの起源である非ヒト可変ドメインフレームワークと同じ又は類似の構造をとる場合、正確な空間的配向を保持させる可能性が最も高い。これは、そのフレームワーク配列が、CDRが由来する非ヒト可変フレームワークドメインと高度の配列同一性を示すヒトアクセプター抗体由来のヒト可変ドメインを得ることにより達成される。重鎖及び軽鎖可変フレームワーク領域は、同じ又は異なるヒト抗体配列に由来してよい。好ましくは、ヒトアクセプター抗体は、ドナー抗体のカノニカル及びインターフェース残基を保持する。更に、ヒトアクセプター抗体は、好ましくは、CDRループの長さにおいて実質的な類似性を有する。Kettleborough et al., Protein Engineering 4:773 (1991)； Kolbinger et al., Protein Engineering 6:971 (1993)及びCarterらの国際公開第92/22653号を参照のこと。
ドナー抗体及び適切なヒトアクセプター抗体のCDRを同定した場合、次の工程は、もしあるとすれば、得られるヒト化抗体の性質を最適化するために、置換されるべき、これらの成分由来の残基を決定することである。典型的には、抗原結合のために必要な、非ヒトドナー免疫グロブリン軽鎖又は重鎖のアミノ酸の一部又は全て（例えば、１つ以上のCDR）を用いて、ヒトアクセプター抗体の軽鎖又は重鎖由来の対応するアミノ酸を置換する。ヒトアクセプター抗体は、抗原結合に必要ではないアミノ酸の一部又は全てを保持する。一般に、ヒトアミノ酸残基のマウスによる置換は最小限に抑えられる、なぜなら、マウス残基の導入により、抗体の、ヒトにおけるヒト抗マウス抗体（HAMA)応答を誘発するリスクが増大するためである。免疫応答を決定するための、当該技術分野において認識されている方法を実施して、具体的な患者における又は臨床試験中のHAMA応答をモニタすることができる。ヒト化抗体を投与された患者は、前記治療の投与の開始時に及び全体を通して免疫原性評価を受けてよい。HAMA応答は、例えば、表面プラズモン共鳴技術（BIACORE）及び／又は固相ELISA分析を含む、当業者に既知の方法を用いて、患者から採取した血清サンプル中で、ヒト化治療用薬剤に対する抗体を検出することにより測定される。
必要な場合、ヒトフレームワーク領域における１つ以上の残基を、ヒト化抗体の抗原に対する結合親和性を保存するように、マウス抗体の対応する位置の残基に変更することができる。この変更は、時に「復帰突然変異」と呼ばれる。ヒト可変領域フレームワーク残基由来の特定のアミノ酸は、CDR構造及び／又は抗原への結合に対して考えられる影響に基づいて、復帰突然変異のために選択される。ヒト可変フレームワーク領域を有するマウスCDR領域の配置は、構造的制限をもたらす場合があり、これは特定のアミノ酸残基の置換により補正されない限り、結合親和性の喪失を導く。
1つの実施形態では、復帰突然変異のためのアミノ酸残基の選択は、部分的に、当該技術分野において認められている技術を用いて、コンピュータモデリングにより決定できる。一般に、免疫グロブリン鎖又はそのドメインの解析された構造から開始される分子モデルが作成される。モデル化される鎖は、アミノ酸配列の類似性について、解析された三次元構造（例えば、X線構造）の鎖又はドメインと比較され、最も高い配列類似性を示す鎖又はドメインが、分子モデルの構築のための開始点として選択される。モデル化される免疫グロブリン鎖又はドメインにおける実際のアミノ酸と、開始構造におけるそれとの間の差を考慮して、解析された開始構造を修正する。修正された構造は、次いで、複合免疫グロブリンに組み立てられる。最後に、モデルを、エネルギー最小化により、及び全ての原子が互いに適切な距離内にあり、結合長及び結合角が化学的に許容可能な制限内にあることを立証することにより、精巧にする。
別の実施形態では、知識ベースのアプローチ又はデータベース解析をヒト化に用いてもよい。例えば、このようなヒト化戦略は、目視検査及びRosok et al （Rosok MJ、et al.、1996. J. Biol. Chem. 271: 22611-22618)に記載されている方法に従った、V領域配列の分析に基づいてもよい。カノニカル決定要因、表面残基、及び潜在的接触残基が同定される。潜在的接触残基については注目されており、Chothia et al. （Chothia C and Lesk AM. 1987. J. Mol. Biol. 196: 901-917)により定義されているCDRループの構造定義、Kabat et al. （Kabat EA, Wu TT, Reid-Miller M, Parry HM, and Gottesman KS. 1987. Sequences of Protein of Immunological Interest, U.S. department of Health and Human Services, NIH, Bethesda, MD)により定義されている配列の超可変性、及びMacCallum et al.（MacCallum RM、Martin ACR、and Thorton JM. 1996. J. Mol. Biol. 262: 732-745)により定義されているような潜在的抗原接触残基に従って広く分類されている。Kabatの番号付け及び定義に従って、マウスのCDRループは、アクセプターヒトフレームワーク上にその全体が移植される。Padlan （Padlan EA. 1991. Mol Immunol. 28: 489-498)により定義されているようなパッキング残基が同定され、Singer et al. （Singer II et al. 1993. J. Immunol. 150: 2844-2857)に記載されている戦略に従ってパッキング残基を保存する試みが行われている。フレームワーク配列中の各残基は、Harris及びBajorath （Harris L and Bajorath J. 1995. Protein Science 4: 306-310)に記載されているように、抗体のヒト化に対する、低、中又は高「リスク位置」に割り当てられる。
一般に、低リスク位置は、ヒトを保つ。非同一である中及び高リスクアミノ酸位置の多くは、ヒト化抗体配列の公的又は私的コレクションを参照してもよい。以前のヒト化抗体配列の総説には、ヒトのアミノ酸残基又はマウス（復帰突然変異）アミノ酸残基包含が、機能的結合活性がもたらしたかどうかが記載されていた。置換が考えられる場合、アミノ酸置換マップ（D. Bordo and P. Argos. 1991. J. Mol. Biol. 217: 721-729)を参照して、残基の機能的互換性を確認してもよい。
置換のためのアミノ酸残基の選択はまた、部分的に、特定の位置におけるアミノ酸の特徴の試験、又は特定のアミノ酸の置換若しくは突然変異誘発の効果の実験に基づいた観察により、決定できる。例えば、非ヒト可変領域フレームワーク残基と、選択されたヒト可変領域フレームワーク残基のアミノ酸が異なるとき、ヒトフレームワークアミノ酸は、通常、ドナー抗体由来のアミノ酸がカノニカル残基、インターフェースパッキング残基、又は結合部位に近接する異常若しくは稀な残基であるとき、非ヒトドナー抗体由来の等価なフレームワークアミノ酸により置換されるべきである。
1つの実施形態では、本発明の結合分子は、ヒトアミノ酸残基の、アミノ酸残基がインターフェースパッキング残基である、対応するマウスアミノ酸残基への少なくとも1つの復帰突然変異を更に含む。「インターフェースパッキング残基」は、例えば、Novotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:4592-66 (1985)により定義されているような、VLとVHとの界面の残基を含む。
1つの実施形態では、本発明の結合分子は、ヒトアミノ酸残基の、カノニカル残基である、対応するマウスのアミノ酸残基への少なくとも1つの復帰突然変異を更に含む。「カノニカル残基」は、CDR構造にとって重要であることが既知である、カノニカル又は構造クラス内の保存されたフレームワーク残基である（Tramontano et al.、J. Mol. Biol. 215:175 (1990)、この全文は本明細書に参照することにより組み込まれる）。カノニカル残基としては、軽鎖の2、25、27B、28、29、30、33、48、51、52、64、71、90、94及び95並びに重鎖の残基24、26、27 29、34、54、55、71及び94が挙げられる。更なる残基（例えば、CDR構造決定残基）は、Martin and Thorton (1996) J. Mol. Biol. 263:800の方法論に従って同定できる。
1つの実施形態では、本発明の結合分子は、ヒトアミノ酸残基の、アミノ酸残基がCDRと相互作用できる位置にある、対応するマウスアミノ酸残基への少なくとも1つの復帰突然変異を更に含む。特に、軽鎖の2、48、64及び71、並びに重鎖の26〜30、71及び94（Kabatに従った番号付け）の位置のアミノ酸は、多くの抗体のCDRと相互作用できることが知られている。軽鎖の35並びに重鎖の93及び103の位置のアミノ酸もまた、CDRと相互作用する可能性が高い。
置換のためのフレームワーク残基を選択する代表的な技術は、例えば、米国特許第5,585,089号に記載されている。この特許では、変更してもよいヒトフレームワークアミノ酸のいくつかのカテゴリーが記載されている。1つの実施形態では、カテゴリー2のアミノ酸は、対応するマウス残基に復帰突然変異される。具体的には、カテゴリー2のアミノ酸は、異常である（すなわち、「稀な」、これは本明細書で使用するとき、代表的なデータバンクで、ヒト重鎖（それぞれ軽鎖）V領域配列の約20%未満であるが通常約10%未満の位置で発生するアミノ酸を指す）ヒトアクセプター免疫グロブリンのフレームワーク内のアミノ酸であり、その位置におけるドナーアミノ酸がヒト配列で典型的である場合（すなわち、「一般的」、これは本明細書で使用するとき、代表的なデータバンクで、約25%超であるが、通常約50%超の配列で生じるアミノ酸を指す）、ヒトアクセプターアミノ酸ではなく、非ヒトドナーアミノ酸（例えば、マウスのアミノ酸）を選択してよい。この基準は、ヒトフレームワーク中の特殊なアミノ酸が、抗体構造を崩壊させないことを補助する。更に、異常なアミノ酸を、ヒト化抗体で典型的に発生するドナー抗体由来のアミノ酸で置換することにより、ヒト化抗体の免疫原性を低下させることができる。
全てのヒト軽鎖及び重鎖可変領域配列は、それぞれ、互いに特に相同性であり、特定の非常に重要な位置では同じアミノ酸を有する配列の「サブグループ」に分類される（Kabat et al., 前掲書中)。ヒトアクセプター抗体中のアミノ酸がヒト配列の中で「稀」であるか「一般的」であるかを決定するとき、同じサブグループにあるヒト配列のみをアクセプター配列として見なすことが望ましい場合が多い。
1つの実施形態では、カテゴリー3のアミノ酸は、対応するマウス残基に復帰突然変異される、カテゴリー3の残基は、ヒト化免疫グロブリン鎖の一次配列内の3CDRの１つ以上に隣接し、アクセプターアミノ酸ではなくドナーアミノ酸を選択してよい。これらのアミノ酸は、CDRのアミノ酸と相互作用する可能性が特に高く、アクセプターから選択される場合、ドナーCDRを変形させて親和性を低下させる可能性が高い。更に、隣接するアミノ酸は、抗原と直接相互作用する場合があり（Amit et al., Science, 233, 747-753 （1986))、ドナーからこれらのアミノ酸を選択することは、元の抗体に親和性をもたらす全ての抗原接触を維持するために望ましい場合がある。
1つの実施形態では、カテゴリー4のアミノ酸は、対応するマウス残基に復帰突然変異される。カテゴリー4のアミノ酸は、典型的には元のドナー抗体の3次元モデルにおいて、CDRの外側の特定のアミノ酸がCDRに近接し、水素結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用等によりCDR内のアミノ酸と相互作用する可能性が高いアミノ酸である。そのアミノ酸位置では、アクセプター免疫グロブリンアミノ酸ではなく、ドナー免疫グロブリンアミノ酸を選択してよい。この基準に従ったアミノ酸は、一般に、CDR内のいくつかの原子の約3オングストローム単位内に側鎖原子を有し、上記に列挙したような、確立された化学力に従ってCDR原子と相互作用することができる原子を含まなくてはならない。
水素結合を形成できる原子の場合、3オングストロームはその核間で測定されるが、結合を形成しない原子では、3オングストロームはそのファンデルワールス表面間で測定される。それゆえ後者の場合、核は相互作用が可能であると見なされる原子では、約6オングストローム以内でなければならない（3+ファンデルワールス半径の和）。多くの場合、核は4又は5〜6Å離れるであろう。アミノ酸がCDRと相互作用できるかどうかの決定では、構造の観点から、これらの8アミノ酸がよりフレームワークの一部として挙動するため、重鎖CDR2の最後の8アミノ酸をCDRの一部と見なさないことが好ましい。
CDR内のアミノ酸と相互作用でき、それ故カテゴリー4に属するフレームワークのアミノ酸は、別の方法で区別できる。各フレームワークアミノ酸の溶媒接触可能表面積は、(1)インタクトな抗体において、(2)CDRの除去された抗体から成る仮説上の分子において、という2つの方法で算出される。約10平方オングストローム以上というこれらの数の間の著しい差は、フレームワークアミノ酸の溶媒への接触がCDRにより少なくとも部分的にブロックされ、それ故アミノ酸がCDRと接触することを示す。アミノ酸の溶媒接触可能表面積は、当該技術分野において既知であるアルゴリズムを使用して、抗体の3次元モデルに基づいて算出できる（Connolly, J. Appl. Cryst. 16, 548 (1983)及び Lee and Richards, J. Mol. Biol. 55, 379 (1971)）。フレームワークアミノ酸も、時折、次にCDRと接触する別のフレームワークアミノ酸の構造に影響を及ぼすことによってCDRと間接的に相互作用する場合がある。
フレームワーク内のいくつかの位置におけるアミノ酸は、特に軽鎖の位置2、48、64及び71並びに重鎖の26〜30、71及び94（Kabatの前掲書に従った番号付け）において、多くの抗体のCDRと相互作用できることが既知であり（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901 (1987)、Chothia et al., Nature 342, 877 (1989)及び Tramontano et al., J. Mol. Biol. 215, 175 (1990)）、これらの全ては、参照することにより本明細書に組み込まれる）、それ故これらのアミノ酸は一般的にカテゴリ4である。1つの実施形態では、本発明のヒト化免疫グロブリンは、これらに加えて、カテゴリー4のドナーアミノ酸（異なる場合）を含む。軽鎖の位置35並びに重鎖の93及び103にあるアミノ酸も、CDRと相互作用する可能性が高い。したがって、1つの実施形態では、アクセプターアミノ酸ではなく１つ以上のドナーアミノ酸（それらが異なるとき）をヒト化免疫グロブリンに含んでよい。他方、軽鎖の最初の5アミノ酸のような、カテゴリー4に存在する場合のある特定の位置は、時に、ヒト化免疫グロブリンにおいて親和性を失うことなく、アクセプター免疫グロブリンから選択することができる。
ヒト化免疫グロブリン内のアミノ酸をドナーからとることができるときを記載する上記カテゴリーに加えて、ヒト化免疫グロブリン内の特定のアミノ酸は、それらがカテゴリー5に分類される場合、ドナー又はアクセプターのいずれからも選ぶことができない。上述したように、ドナー免疫グロブリン内の所与の位置のアミノ酸がヒト配列にとって「稀」であり、アクセプター免疫グロブリン内のその位置のアミノ酸もヒト配列にとって「稀」である場合、ヒト化免疫グロブリン内のその位置のアミノ酸は、ヒト配列に「特有である」いくつかのアミノ酸となるように選択できる。好ましい選択肢は、アクセプター配列と同じサブグループに属する既知のヒト配列内のその位置で最も頻繁に発生するアミノ酸である。
1つの実施形態では、本発明の結合分子は、3つのB3F6軽鎖CDR（CDRL1、CDRL2、及びCDRL3）及びヒト軽鎖フレームワーク領域を含む。1つの実施形態では、最も好適な、発現しているヒト軽鎖フレームワークは、ヒトgi-21669417（BAC01733)（配列番号45）である。1つの実施形態では、本発明の結合分子は、2および100から成る群から選択される少なくとも1つの位置における、ヒトアミノ酸残基の、対応するマウスアミノ酸残基への少なくとも1つの復帰突然変異を更に含む。1つの実施形態では、本発明の結合分子は、2及び100から成る群から選択される1つの位置における、ヒトアミノ酸残基の、対応するマウスアミノ酸残基への1つの復帰突然変異を更に含む。別の実施形態では、結合分子は、ヒト化B3F6軽鎖の位置2及び100における復帰突然変異を含む。別の実施形態では、本発明の結合分子は、ヒト化B3F6軽鎖の位置2における復帰突然変異（backmuation）及び少なくとも1つの追加の復帰突然変異を含む。別の実施形態では、本発明の結合分子は、ヒト化B3F6軽鎖の位置100における復帰突然変異及び少なくとも1つの追加の復帰突然変異を含む。
1つの実施形態では、本発明の結合分子は、3つのB3F6重鎖CDR（CDRH1、CDRH2、及びCDRH3）及びヒト重鎖フレームワーク領域を含む。本発明の1つの実施形態では、最も好適な、発現しているヒト重鎖フレームワークは、gi-14289106 （AAK57792)（配列番号46）である。1つの実施形態では、本発明の結合分子は、1、48、67、71、73、81、82b、93、及び112から成る群から選択される少なくとも1つの位置における、ヒトアミノ酸残基の、対応するマウスアミノ酸残基への少なくとも1つの復帰突然変異を含む。1つの実施形態では、本発明の結合分子は、1、48、67、71、73、81、82b、93、及び112から成る群から選択される1つの位置における、ヒトアミノ酸残基の、対応するマウスアミノ酸残基への1つの復帰突然変異を含む。1つの実施形態では、本発明の結合分子は、1、48、67、71、73、81、82b、93、及び112から成る群から選択される2つの位置における、ヒトアミノ酸残基の、対応するマウスアミノ酸残基への2つの復帰突然変異を含む。1つの実施形態では、本発明の結合分子は、1、48、67、71、73、81、82b、93、及び112から成る群から選択される3つの位置における、ヒトアミノ酸残基の、対応するマウスアミノ酸残基への3つの復帰突然変異を含む。1つの実施形態では、本発明の結合分子は、1、48、67、71、73、81、82b、93、及び112から成る群から選択される4つの位置における、ヒトアミノ酸残基の、対応するマウスアミノ酸残基への4つの復帰突然変異を含む。1つの実施形態では、本発明の結合分子は、1、48、67、71、73、81、82b、93、及び112から成る群から選択される5つの位置における、ヒトアミノ酸残基の、対応するマウスアミノ酸残基への5つの復帰突然変異を含む。1つの実施形態では、本発明の結合分子は、1、48、67、71、73、81、82b、93、及び112から成る群から選択される6、3位置（six three positions）における、ヒトアミノ酸残基の、対応するマウスアミノ酸残基への6つの復帰突然変異を含む。1つの実施形態では、本発明の結合分子は、1、48、67、71、73、81、82b、93、及び112から成る群から選択される7つの位置における、ヒトアミノ酸残基の、対応するマウスアミノ酸残基への7つの復帰突然変異を含む。1つの実施形態では、本発明の結合分子は、1、48、67、71、73、81、82b、93、及び112から成る群から選択される8つの位置における、ヒトアミノ酸残基の、対応するマウスアミノ酸残基への復帰突然変異を更に含む。1つの実施形態では、本発明の結合分子は、1、48、67、71、73、81、82b、93、及び112から成る群から選択される9つの位置における、ヒトアミノ酸残基の、対応するマウスアミノ酸残基への9つの復帰突然変異を含む。
1つの実施形態では、本発明は、B3F6抗体のヒト化可変領域及びそのようなヒト化可変領域を含むポリペプチドに関する。
1つの実施形態では、本発明の結合分子は、配列番号52のアミノ酸1〜112に示すCDRの移植された軽鎖可変領域配列を含む。1つの実施形態では、本発明の結合分子は、配列番号55のアミノ酸1〜121に示すCDRの移植された軽鎖可変領域配列を含む。
1つの実施形態では、本発明の結合分子は、配列番号47に示す軽鎖バージョン1可変領域配列を含む。1つの実施形態では、本発明の結合分子は、配列番号48に示す重鎖バージョン1可変領域配列を含む。1つの実施形態では、本発明の結合分子は、配列番号49に示す重鎖バージョン2可変領域配列を含む。
別の実施形態では、本発明の結合分子は配列番号50に示す軽鎖バージョン2可変領域配列を含む。1つの実施形態では、本発明の結合分子は、配列番号51に示す重鎖バージョン3可変領域配列を含む。
1つの実施形態では、本発明の結合分子は、配列番号52に示すCDRの移植された軽鎖を含む。1つの実施形態では、本発明の結合分子は、配列番号53に示すバージョン1軽鎖を含む。1つの実施形態では、本発明の結合分子は、配列番号54に示すバージョン2軽鎖を含む。
1つの実施形態では、本発明の結合分子は、配列番号55に示すCDRの移植された重鎖を含む。1つの実施形態では、本発明の結合分子は、配列番号56に示すバージョン1重鎖を含む。1つの実施形態では、本発明の結合分子は、配列番号57に示すバージョン2重鎖を含む。1つの実施形態では、本発明の結合分子は配列番号58に示すバージョン3重鎖を含む。
1つの実施形態では、本発明の結合分子は、配列番号59に示すCDRの移植されたドメイン欠失重鎖を含む。1つの実施形態では、本発明の結合分子は、配列番号60に示すバージョン1ドメイン欠失重鎖を含む。1つの実施形態では、本発明の結合分子は、配列番号61に示すバージョン2ドメイン欠失重鎖を含む。1つの実施形態では、本発明の結合分子は、配列番号62に示すバージョン3ドメイン欠失重鎖を含む。
1つの実施形態では、本発明の結合分子は、任意のシグナル配列を含む、配列番号63に示すCDRの移植された軽鎖配列を含む。1つの実施形態では、本発明の結合分子は、任意のシグナル配列を含む、配列番号64に示すバージョン1軽鎖配列を含む。1つの実施形態では、本発明の結合分子は、任意のシグナル配列を含む、配列番号65に示すバージョン2軽鎖配列を含む。
1つの実施形態では、本発明の結合分子は、任意のシグナル配列を含む、配列番号66に示すCDRの移植された重鎖配列を含む。1つの実施形態では、本発明の結合分子は、任意のシグナル配列を含む、配列番号67に示すバージョン1重鎖配列を含む。1つの実施形態では、本発明の結合分子は、任意のシグナル配列を含む、配列番号68に示すバージョン2重鎖配列を含む。1つの実施形態では、本発明の結合分子は、任意のシグナル配列を含む、配列番号69に示すバージョン3重鎖配列を含む。
1つの実施形態では、マウスB3F6のCDR及びヒトフレームワーク領域を含む軽鎖を、マウスB3F6のCDR及びヒトフレームワーク領域を含む重鎖と組み合わせる。1つの実施形態では、マウスB3F6のCDR及びヒトフレームワーク領域を含む軽鎖を、ヒトフレームワークアミノ酸残基の、対応するマウスアミノ酸残基への少なくとも1個の復帰突然変異を含むB3F6重鎖のヒト化バージョンと組み合わせる。別の実施形態では、ヒトフレームワークアミノ酸残基の、対応するマウスアミノ酸残基への少なくとも1個の復帰突然変異を含む、B3F6軽鎖のヒト化バージョンを、ヒトフレームワークアミノ酸残基の、対応するマウスアミノ酸残基への少なくとも1個の復帰突然変異を含むB3F6重鎖のヒト化バージョンと組み合わせる。別の実施形態では、マウスB3F6のCDR及びヒトフレームワーク領域及びヒトフレームワークアミノ酸残基の、対応するマウスアミノ酸残基への少なくとも1個の復帰突然変異を含む軽鎖を、B3F6重鎖のヒト化バージョンと組み合わせる。代表的な組合せは、国際公開第2006 074397号の実施例に更に詳細に記載されている。例えば、1つの実施形態では、国際公開第2006 074397号の実施例のヒト化L1軽鎖を、国際公開第2006 074397号の実施例のH1重鎖と組み合わせて、バージョン1ヒト化B3F6抗体を作製する。別の実施形態では、国際公開第2006 074397号の実施例のヒト化L1軽鎖を、国際公開第2006 074397号の実施例のH2重鎖と組み合わせて、バージョン2ヒト化B3F6抗体を作製する。このバージョンのヒト化B3F6は、受け入れ番号PTA-7284でATCCに寄託されたCHO細胞株により産生される。別の実施形態では、国際公開第2006 074397号の実施例のヒト化L1軽鎖を、国際公開第2006 074397号の実施例のH3重鎖と組み合わせて、バージョン3ヒト化B3F6抗体を作製する。別の実施形態では、国際公開第2006 074397号の実施例のヒト化L2軽鎖を、国際公開第2006 074397号の実施例のH1重鎖と組み合わせて、バージョン4ヒト化B3F6抗体を作製する。別の実施形態では、国際公開第2006 074397号の実施例のヒト化L2軽鎖を、国際公開第2006 074397号の実施例のH2重鎖と組み合わせて、バージョン5ヒト化B3F6抗体を作製する。別の実施形態では、国際公開第2006 074397号の実施例のヒト化L2軽鎖を、国際公開第2006 074397号の実施例のH3重鎖と組み合わせて、バージョン6ヒト化B3F6抗体を作製する。このような組合せが本発明の範囲内であることは当業者に明らかであろう。
1つの実施形態では、本発明の結合分子は、American Type Culture Collection (ATCC) 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110に、ブダベスト条約の条件の下でATCC受け入れ番号PTA-7284で寄託された細胞株によって作製されたヒト化抗体である。
II.結合分子の形
A.抗体又はその部分
1つの実施形態では、本発明の結合分子は抗体分子である。例えば1つの実施形態では、本発明の結合分子は、Criptoに結合するヒト化抗体又はその一部である。別の実施形態では、本発明の結合分子は、多価であり、Criptoに結合するヒト化抗体の抗原結合断片及び抗体の第2抗原結合断片を含む。
1つの実施形態では、他の抗Cripto抗体を作製することができる。更に、多価抗Cripto抗体に導入するための結合部位を作製することができる。例えば、抗体は、好ましくは、哺乳類において関連抗原（例えば、精製された腫瘍関連抗原又はこのような抗原を含む細胞若しくは細胞抽出物）及びアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射することにより産生される。この免疫は、典型的には、活性化した脾細胞又はリンパ球からの抗原反応性抗体の産生を含む、免疫応答を誘発する。得られた抗体は、ポリクローナル調製物を提供するために動物の血清から回収できるが、モノクローナル抗体（MAb）の相同な調製物を提供するために脾臓、リンパ節又は末梢血液から個々のリンパ球を単離することが望ましいことが多い。好ましくは、リンパ球は脾臓から得られる。
この周知のプロセス（Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)）では、抗原を注射された哺乳類由来の、比較的短命である又は致死のリンパ球を不死腫瘍細胞株（例えば骨髄腫細胞株）と融合させ、それにより、不死であり、B細胞の遺伝的にコードされた抗体を産生できるハイブリッド細胞、すなわち「ハイブリドーマ」を産生する。得られたハイブリッドは、単一抗体の形成のための特定の遺伝子を含む各個々の株による選択、希釈、及び再増殖によって、単一の遺伝子株に分離される。それらは所望の抗原に対して同種であり、その純粋な遺伝的系統に関連して「モノクローナル」と呼ばれる抗体を産生する。
このように調製されたハイブリドーマ細胞を、好ましくは、融合していない親骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する１つ以上の物質を含有する好適な培地に播種して、増殖させる。当業者は、ハイブリドーマの形成、選択及び増殖のための試薬、細胞株及び培地が多数の供給元から市販されており、標準化プロトコルが十分に確立されていることを理解するであろう。一般的に、ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地を、所望の抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、又は例えばラジオイムノアッセイ（RIA)又は酵素結合免疫吸着検定法（ELISA)のようなインビトロアッセイにより決定される。所望の特異性、親和性及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンは希釈手順を制限することによりサブクローニングされ、標準的な方法により増殖される（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp 59-103 (Academic Press, 1986)）。サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、培養培地、腹水又は血清から、例えばプロテイン-A、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又は親和性クロマトグラフィー等のような従来の精製手順によって分離できることが、更に理解されるであろう。
別の実施形態では、所望のモノクローナル抗体をコードするDNAは、容易に単離され、従来の手順を使用して（例えばマウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）配列決定できる。単離及びサブクローニングされたハイブリドーマ細胞は、このようなDNAの好ましい供給源として機能する。いったん単離されると、DNAは発現ベクター内に配置でき、これは次に、他の免疫グロブリンを産生しない、大腸菌細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO)細胞又は骨髄腫細胞のような、原核又は真核宿主細胞にトランスフェクトされる。より具体的には、単離したDNA（本明細書に記載のように合成できる）を使用して、参照することにより本明細書に組み入れられる、1995年1月25日に出願されたNewmanらの米国特許第5,658,570号に記載されているように、抗体製造のために定常及び可変領域配列クローニングすることができる。本質的に、これは選択された細胞からのRNAの抽出、cDNAへの変換、及びIg特異的プライマーを用いるPCRによる増幅を必要とする。この目的のために好適なプライマーは、米国特許第5,658,570号にも記載されている。以下でより詳細に論じるように、所望の抗体を発現する軽質転換細胞を比較的大量に増殖させて、免疫グロブリンの臨床用及び商用供給品を提供できる。
当業者は、また、抗体又は抗体断片（例えば抗原結合部位）をコードするDNAも、例えばpdファージ又はFdファージミド技術を使用して、抗体ファージライブラリから得られることも認識するであろう。代表的な方法は例えば欧州特許第368 684(B1)号；米国特許第5,969,108号、Hoogenboom, H.R. and Chames. 2000. Immunol. Today 21:371；Nagy et al. 2002. Nat. Med. 8:801；Huie et al. 2001. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:2682；Lui et al. 2002. J. Mol. Biol. 315:1063に記載されており、これらのそれぞれが参照することにより本明細書に組み入れられる。いくつかの刊行物（例えばMarks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992)）には、鎖シャッフリングによる高親和性ヒト抗体の産生に加えて、大型ファージライブラリを構築するための戦略としてのコンビナトリアル感染及びインビボ組換えについても記載されている。別の実施形態では、リボソームディスプレイを使用して、ディスプレイプラットフォームとしてバクテリオファージに取って代わることができる（例えばHanes et al. 2000. Nat. Biotechnol. 18:1287；Wilson et al. 2001. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:3750又はIrving et al. 2001 J. Immunol. Methods 248:31を参照のこと。更に別の実施形態では、細胞表面ライブラリーを抗体についてスクリーニングすることができる（Boder et al. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:10701；Daugherty et al. 2000 J. Immunol. Methods 243:211。このような手順は、モノクローナル抗体の単離及びそれに続くクローニングのための従来よりのハイブリドーマ技術の代替方法を提供する。
本発明の別の実施形態では、本発明の結合分子の結合部位は、ヒト又は実質的にヒト抗体によって提供できる。ヒト又は実質的にヒト抗体は、内因性免疫グロブリン産生のできないトランスジェニック動物（例えばマウス）中で作製できる（例えば、米国特許第6,075,181号、同第5,939,598号、同第5,591,669号及び同第 5,589,369号を参照のこと、このそれぞれは参照することにより本明細書に組み入れられる）。例えば、キメラ及び生殖細胞系突然変異体マウスにおける抗体重鎖連結領域のホモ接合型欠失は、内因性抗体産生を完全に阻害することが記載されている。ヒト免疫グロブリン遺伝子アレイのこのような生殖細胞系突然変異体マウスへの移入は、抗原チャレンジ時にヒト抗体の産生をもたらすであろう。SCIDマウスを使用してヒト抗体を産生する別の好ましい手段は、参照することにより本明細書に組み入れられる、米国特許第5,811,524号に開示されている。これらのヒト抗体に関連する遺伝物質もまた、本明細書に記載するように単離及び操作できることが理解されるであろう。
組換え抗体を産生するための更に別の非常に有効な手段は、Newman, Biotechnology, 10: 1455-1460 (1992)によって開示されている。具体的には、この技術は、サル可変ドメイン及びヒト定常配列を含有する霊長類化抗体の産生をもたらす。この参考文献は、参照にすることよりその全文が本明細書に組み入れられる。更に、この技術は、それぞれが参照することにより本明細書に組み入れられる、同一譲受人による米国特許第5,658,570号、同第5,693,780号及び同第5,756,096号にも記載されている。
別の実施形態では、リンパ球は顕微操作によって選択することができ、可変遺伝子が単離される。例えば末梢血液単核細胞は、免疫化哺乳類から単離し、インビトロで約7日間培養できる。培養物はスクリーニング基準を満たす特異的IgGについてスクリーニングできる。陽性ウェルからの細胞を単離できる。個々のIg産生B細胞は、FACSにより、又は補体介在溶血斑アッセイでそれらを同定することによって単離できる。Ig産生B細胞は、チューブ内に顕微操作することができ、VH及びVL遺伝子は例えばRT-PCRを用いて増幅できる。VH及びVL遺伝子は、抗体発現ベクター内にクローニングして、発現のために細胞（例えば真核又は原核細胞）にトランスフェクトできる。
更に、本発明の結合分子を産生するのに有用な遺伝子配列は、多数の異なる供給源から得ることができる。例えば上記で広範囲にわたって論じたように、種々のヒト抗体遺伝子は、公的にアクセス可能な寄託株の形で利用可能である。抗体及び抗体をコードする遺伝子の多くの配列が公開されており、好適な抗体遺伝子を、当該技術分野において認められている技術を使用して、これらの配列から化学合成することができる。本発明のこの態様に適合するオリゴヌクレオチド合成技術は当業者に周知であり、いくつかの市販の自動合成機のいずれかを使用して実施できる。更に、本明細書に記載する数種の重鎖及び軽鎖をコードするDNA配列は、市販のDNA合成販売者のサービスを通じて入手できる。上述の方法のいずれかを使用して得られた遺伝物質を、次いで変更又は合成して、本発明のポリペプチドを提供し得ることができる。
あるいは、抗体産生細胞株は、当業者に周知の技術を使用して選択及び培養することができる。このような技術は種々の研究室マニュアル及び主要刊行物に記載されている。この点で、以下に記載するような本発明で用いるのに好適な技術は、補遺を含み、その全文が参照することにより本明細書に組み入れられる、Current Protocols in Immunology, Coligan et al., Eds., Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, New York (1991)に記載されている。
本発明の範囲が抗原結合DNA配列の対立遺伝子、変異体及び突然変異体を更に包含することが、更に理解されるであろう。
周知であるように、RNAは元のハイブリドーマ細胞から、又は他の形質転換された細胞から、例えばグアニジンイソチオシアネート抽出及び沈殿と、それに続く遠心分離又はクロマトグラフィーのような標準的な技術によって単離できる。望ましい場合、mRNAは全RNAから、オリゴdTセルロースでのクロマトグラフィーのような標準的な技術によって単離できる。好適な技術は当該技術分野においてよく知られている。
1つの実施形態では、抗体の軽鎖及び重鎖をコードするcDNAは、周知の方法に従って逆転写酵素及びDNAポリメラーゼを使用して、同時に又は個別にいずれかで作製できる。PCRは、共通定常領域のプライマーによって、又は公開された重鎖及び軽鎖DNA並びにアミノ酸配列に基づいたより特異的なプライマーによって開始できる。上述したように、PCRを使用して、抗体軽鎖及び重鎖をコードするDNAクローンを単離することもできる。この場合、ライブラリーを、共通プライマー又はマウス定常領域プローブのような、より大きい相同性プローブによりスクリーニングすることができる。
DNA、典型的にはプラスミドDNAは、当該技術分野において既知の技術を使用して細胞から単離し、制限酵素マッピングをして、例えば組換えDNA技術に関連する上述の参考文献で詳細に記載されている、標準的な周知の技術に従って配列決定できる。無論DNAは、単離プロセス又は次の解析中のいずれの時点にでも本発明に従って合成できる。本発明の結合分子で使用するための代表的な抗体又はその断片は、本明細書で記載した標的を認識する抗体を含む。
ある実施形態では、抗体の抗原結合断片は、当該技術分野において周知の技術を使用して産生できる。
B.改変された抗体
1つの実施形態では、本発明の結合分子は、改変された抗体、すなわち、及び抗体に由来するが、野生型抗体ではない分子、例えばミニボディ（ミニボディは当該技術分野において記載されている方法を使用して作製できる（例えば米国特許第5,837,821号又は国際公開第94/09817A1号を参照のこと））等を含む、又はそれから成る。
1.ドメイン欠失抗体
1つの実施形態では、本発明の結合分子は、１つ以上のドメインが部分的に又は完全に欠失している合成定常領域を含む（「ドメイン欠失抗体」）。特に好ましい実施形態では、適合性改変抗体は、CH2ドメイン全体が除去されているドメイン欠失コンストラクト又は変異体を含む（ΔCH2コンストラクト）。他の好ましい実施形態では、短い連結ペプチドを、欠失したドメインと置換して、可変領域に可動性及び移動の自由を与えることができる。当業者は、抗体の異化率に対するCH2ドメインの調節特性のために、このようなコンストラクトが特に好ましいことを理解するであろう。
別の実施形態では、本発明の改変抗体はCH2ドメイン欠失抗体である。ドメイン欠失コンストラクトは、IgG1ヒト定常ドメインをコードするベクター（例えばIDEC Pharmaceuticals, San Diego製）を使用して得ることができる（例えば国際公開第02/060955A2号及び同第02/096948A2号を参照のこと）。この代表的なベクターは、CH2ドメインを欠失して、ドメイン欠失IgG1定常領域を発現する合成ベクターを提供するように操作された。C2B8抗体、5E8抗体、B3F6抗体のマウス可変領域、又はヒト化CC49抗体の可変領域をコードする遺伝子は、次いで合成ベクターに挿入され、クローニングされた。形質転換された細胞内で発現したとき、これらのベクターはC2B8.DCH2、5E8.DCH2、B3F6.DCH2又は huCC49.DCH2又はそれぞれを提供した。これらのコンストラクトは、それらを単量体サブユニットの特に魅力的な候補にする多くの特性を示す。
ヒンジ領域連結ペプチドG1/G3/Pro243Ala244Pro245 + [Gly/Ser]（配列番号5）を用いて構築された、CH2ドメイン欠失キメラB3F6(chB3F6ΔCH2)抗体は、国際公開第2006 074397号に記載されている。「chB3F6」は、それぞれ、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインに融合した、マウス重鎖及び軽鎖可変ドメインから成る、キメラ抗CRIPTOモノクローナル抗体である。G1/G3/Pro243Ala244Pro245 + [GlySer]ヒンジ連結ペプチドを含有する、それぞれヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインに融合したマウス重鎖及び軽鎖可変ドメインから成る、重鎖CH2ドメイン欠失キメラ抗CRIPTOモノクローナル抗体（chB3F6)のDNA配列を配列番号1に示す。軽鎖CH2ドメイン欠失chB3F6のDNA配列を、配列番号2に示す。G1/G3/Pro243Ala244Pro245 + [GlySer]ヒンジ連結ペプチドを含有する重鎖CH2ドメイン欠失chB3F6のアミノ酸配列を、配列番号3に示す。軽鎖CH2ドメイン欠失chB3F6のアミノ酸配列を、配列番号4に示す。ドメイン欠失抗体（ヒンジ連結ペプチド（HCP)を含む）を作製するために用いられる定常領域配列を、配列番号70に示し、完全長抗体を作製するために用いられる完全長IgG1定常領域配列を配列番号71に示す。ヒト化ドメイン欠失B3F6抗体もまた産生されており、国際公開第2006 074397号の実施例により詳細に記載されている。
これらの代表的なコンストラクトが、CH3ドメインを本発明のそれぞれのポリペプチドのヒンジ領域に直接融合するように操作されたことに留意すべきである。他のコンストラクトでは、ヒンジ領域と合成CH2及び／又はCH3ドメインとの間にペプチドスペーサを提供することが望ましい場合がある。例えばCH2ドメインが欠失し、残りのCH3ドメイン（合成又は非合成）が5〜20アミノ酸のスペーサでヒンジ領域に連結される、適合性コンストラクトを発現させることができる。例えば定常ドメインの調節要素が遊離したままでアクセスできるように、又はヒンジ領域が可動性のままであるように、このようなスペーサを添加してよい。例えばCH2ドメイン及び下方ヒンジ領域に置換された短いアミノ酸スペーサGGSSGGGGSG（配列番号8）を有するドメイン欠失B3F6コンストラクト（B3F6.DCH2 [gly/ser]）を使用できる。他の代表的な結合ペプチドを表2に示す。これらの結合ペプチドは、本発明のポリペプチドにいずれかと共に使用できる。好ましくは、結合ペプチドは、CH2重鎖ドメインを欠くポリペプチドと共に使用される。好ましくは本発明と適合性のあるいずれのリンカーも、比較的非免疫原性であり、本発明のポリペプチドの非共有結合を阻害しない。
1つの実施形態では、本発明のポリペプチドは、それが単量体サブユニット間の所望の共有又は非共有会合を許容する限り、数個の、又は更には1個のアミノ酸の欠失又は置換を有する免疫グロブリン重鎖を含む。例えばCH2ドメインの選択した範囲における1個のアミノ酸の突然変異は、Fc結合を実質的に減少させ、それにより腫瘍の局在化を増加させるのに十分であってよい。同様に、調節されるエフェクタ機能（例えば補体結合）を制御する１つ以上の定常領域ドメインの一部を単に欠失させることが望ましい場合がある。定常領域のこのような部分欠失は、抗体の選択された特徴（血清半減期）を改善することができ、その一方で対象定常領域ドメインインタクトに関連する他の望ましい機能を残す。更に、上記で言及したように、開示した抗体の定常領域は、得られたコンストラクトの特性を強化する１つ以上のアミノ酸の突然変異又は置換を通して合成できる。この点で、実質的に改変抗体の立体配置及び免疫原性特性を維持しながら、保存された結合部位（例えばFc結合）によって提供された活性を妨害することが可能である。更に他の好ましい実施形態は、エフェクタ機能のような望ましい特徴を向上させるために、又は更なる細胞毒又は炭水化物の結合を与えるために、１つ以上のアミノ酸の定常領域への付加を含んでよい。このような実施形態では、選択した定常領域ドメインに由来する特異的配列を挿入又は複製することが望ましい場合がある。
定常領域がいくつかのエフェクタ機能を仲介することは、当該技術分野において既知である。例えば補体のC1成分の抗体への結合は、補体系を活性化する。補体の活性化は、細胞病原体のオプソニン化及び溶解において重要である。補体の活性化はまた炎症反応を刺激して、自己免疫過敏症にも関与しうる。更に、抗体はFc領域を介して細胞に結合し、抗体Fc領域のFc受容体部位は細胞のFc受容体（FcR)に結合する。IgG（ガンマ受容体）、IgE（イプシロン受容体）、IgA（アルファ受容体）及びIgM（ミュー受容体）を含む、異なるクラスの抗体に対して特異的である多数のFc受容体が存在する。細胞表面上のFc受容体への抗体の結合は、抗体被覆粒子の貪食及び破壊、免疫複合体の排除、キラー細胞による抗体被覆標的細胞の溶解（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害、又はADCC)と呼ばれる）、炎症伝達物質の放出、免疫グロブリン産生の胎盤通過及び制御を含む、多くの重要かつ多様な生物学的応答を誘発する。
1つの実施形態では、エフェクタ機能は、標的細胞を除去することができないと考えられるIgG4抗体の定常領域を使用することにより、またはFc変異体を作製することにより除去又は低下させることができ、ここで、エフェクタ機能にとって重要なFc領域の残基は、当該技術分野において既知の技術、例えば米国特許第5,585,097号を使用して突然変異される。例えば、定常領域ドメインの欠失又は不活性化（点突然変異又は他の手段を通して）は、循環する改変抗体のFc受容体結合を減少させ、それにより腫瘍の局在化を増加させる。他の場合では、本発明と一致する定常領域の改変は、補体結合を緩和し、それにより結合した（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）細胞毒の血清半減期及び非特異的結合を低減させることができる。定常領域の更に他の改変を使用して、抗原特異性又は抗体可動性の上昇に起因する局在化の向上を可能にする、ジスルフィド結合又はオリゴ糖部分を改変できる。より一般には当業者は、本明細書で記載したように改変した抗体は、容易に認識できる又はできない、多くのわずかな効果を発揮しうることを理解するであろう。しかしながら、改変によって得られた生理学的特性、生物学的利用能及び他の生化学効果、例えば、腫瘍の局在化、体内分布及び血清半減期は、過度の実験を行うことなく、周知の免疫技術を使用して、容易に測定及び定量できる。
1つの実施形態では、抗体の改変形は、前駆体全体又は親抗体から当該技術分野において既知の技術を使用して作製できる。代表的な技術は以下でより詳細に論じる。
重鎖部を含むポリペプチドは、免疫グロブリン分子に由来しない他のアミノ酸配列又は部分を含んでいても、いなくてもよい。このような改変については以下で更に詳細に記載する。例えば、1つの実施形態では、本発明のポリペプチドは、可動性リンカー配列を含むことができる。別の実施形態では、ポリペプチドを改変して、薬物又はPEGのような機能部を付加することができる。
2.二重特異性結合分子
1つの実施形態では、本発明の結合分子は二重特異性である。例えば1つの実施形態では、結合分子はCripto及び別の分子に結合する。1つの実施形態では、本発明の二重特異性結合分子は、１つ以上の腫瘍分子又は腫瘍細胞増殖に関連する分子に結合する、追加の結合部位を含んでよい。1つの実施形態では、新生物形成疾患では、開示したポリペプチドの抗原結合部位（すなわち可変領域又はその免疫反応性断片若しくは組換え体）は、悪性疾患の部位で、選択された腫瘍関連分子と結合する。新生物形成腫瘍細胞増殖に関連する報告された分子の数及び関連抗体の数を考えると、当業者は、本請求された結合分子の結合部位がそれ故多数の抗体全体のいずれか1つに由来してもよいことを認識するであろう。より一般的には、本発明で有用な結合部位は、選択した条件に関連する標的又はマーカーと反応するいずれかの抗体（文献で既に報告されている抗体も含む）から得ることができる又は由来し得る。更に、開示したポリペプチドを産生するために使用する、親若しくは前駆体抗体、又はその断片は、マウス、ヒト、キメラ、ヒト化、非ヒト霊長類又は霊長類化であってよい。他の好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、本明細書に記載するような変更された定常ドメインを有する単一鎖抗体コンストラクト（参照することにより本明細書に組み入れられる、米国特許第5,892,019号に開示されているような）を含んでよい。結果として、抗体のこれらの種類のいずれを使用しても、本発明の二重特異性分子内に組み込むことができる結合部位を得ることができる。
本明細書で使用するとき、「腫瘍関連分子」は、一般的に腫瘍細胞に関連する、すなわち正常細胞と比較して同じ又は高い程度で発現している、任意の抗原又は標的分子を意味する。より一般的には、腫瘍関連分子は、非悪性細胞における発現とは無関係に、新生物形成細胞での免疫反応性抗体の局在化を提供する任意の分子を含む。このような分子は、比較的腫瘍特異的であり、その発現は悪性細胞の表面に限定される場合がある。あるいは、このような分子は悪性及び非悪性細胞の両方で見出すことができる。例えば、CD20は、非ホジキンリンパ腫の治療のための免疫治療抗体に対する極めて有効な標的であることが証明されている、悪性及び非悪性B細胞の両方の表面に見られるpan B抗原である。
この点で、CD2、CD3、CD5、CD6及びCD7のようなpan T細胞抗原もまた、本発明の意味での腫瘍関連分子を含む。更に他の代表的な腫瘍関連分子は、Lewis Y、MAGE−1、MAGE−3、MUC−1、HPV16、HPV E6＆E7、TAG−72、CEA、L6−抗原、CD19、CD22、CD37、CD52、HLA−DR、EGF受容体及びHER2受容体が挙げられるが、これらに限定されない。多くの場合、これらの抗原の各免疫反応性抗体は、文献で報告されている。当業者は、これらの抗体のそれぞれが、本発明による本発明のポリペプチドの前駆体として機能し得ることを理解するであろう。
腫瘍関連分子と反応することが既に報告されている抗体を、本明細書に記載のように変更して、本発明のポリペプチドに１つ以上の結合部位を提供することができる。対象ポリペプチドに結合部位を提供するために使用できる（又は結合部位が由来しうる）代表的な抗体は、2B8及びC2B8（Zevalin（登録商標）及びRituxan（登録商標）、IDEC Pharmaceuticals Corp., San Diego）、Lym1及びLym2（Techniclone）、LL2（Immunomedics Corp., New Jersey）、HER2（Herceptin（登録商標）、Genentech Inc., South San Francisco）、B1（Bexxar（登録商標）、Coulter Pharm., San Francisco）、Campath（登録商標）（Millennium Pharmaceuticals, Cambridge）、MB1、BH3、B4、B72．3（Cytogen Corp.）、CC49（National Cancer Institute）及び5E10（University of Iowa）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、すぐ上で列挙した抗体と同じ腫瘍関連抗原に結合する。特に好ましい実施形態では、ポリペプチドは、2B8、C2B8、CC49及びC5E10と同じ抗原に由来する、又はそれらに結合し、更により好ましくは、ドメイン欠失抗体（すなわちΔCH2抗体）を含む。
第1の好ましい実施形態では、本発明の二重特異性分子はRituxan（登録商標）と同じ腫瘍関連抗原に結合する。Rituxan（登録商標）（リツキシマブ、IDEC−C2B8及びC2B8としても知られている）は、ヒトB細胞リンパ腫の治療用に、最初にFDAに認可されたモノクローナル抗体であった（そのそれぞれが参照することにより本明細書に組み入れられる、米国特許第5,843,439号、同第5,776,456号及び同第5,736,137号を参照のこと）。Y2B8（90Yで標識された2B8；Zevalin（登録商標）；イブリツモマブチウキセタン）は、C2B8のマウス親である。Rituxan（登録商標）は、増殖阻害性であり、報告によれば、インビトロで化学療法剤によるアポトーシスに対して特定のリンパ腫細胞株を感作させる、キメラ抗CD20モノクローナル抗体である。この抗体はヒト補体に効率的に結合し、強力なFcR結合を有し、補体依存性（CDC）及び抗体依存性（ADCC）機構の両方を介して、インビトロでヒトリンパ球を有効に死滅させることができる（Reff et al., Blood 83: 435-445 (1994)）。当業者は、本開示によるCripto及びCD20+に結合する二重特異性結合分子が、CD20+悪性疾患を示す患者を有効に治療するために結合形又は非結合形で使用できることを理解するであろう。更に一般的には、本明細書で開示するポリペプチドを「裸の」すなわち非結合状態で、又は多くの障害のいずれか1つを有効に治療する細胞毒性剤に結合しれた状態のいずれかで使用できることを、繰り返し言わなければならない。
本発明の他の好ましい実施形態では、本発明の二重特異性ポリペプチドは、CC49抗体からの（又はCC49抗体に由来する）結合部位を含むことができる。以前に暗示したように、CC49は、ヒト起源、特にLS174T腫瘍細胞株の特定の腫瘍細胞の表面に結合した、ヒト腫瘍関連抗原TAG−72に結合する。LS174T［American Type Culture Collection（本明細書ではATCC）番号CL 188］は、LS180（ATCC番号CL 187）結腸線癌株の変異体である。
TAG−72に対する結合特異性を有する多くのマウスモノクローナル抗体が開発されていることが、更に理解されるであろう。B72.3と呼ばれるこれらのモノクローナル抗体の1つは、ハイブリドーマB72.3（ATCC番号HB−8108）によって産生されたマウスIgG1である。B72.3は、ヒト乳癌抽出物を免疫原として使用して開発された第1世代モノクローナル抗体である（例えば、そのそれぞれが参照することにより本明細書に組み入れられる、Colcher et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 78:3199-3203 (1981)；並びに、米国特許第4,522,918号及び同第4,612,282号を参照のこと）。TAG-72に対する他のモノクローナル抗体は、「CC」（結腸癌用）と呼ばれる。Schlomら（参照することにより本明細書に組み入れられる、米国特許第5,512,443号）により記載されているように、CCモノクローナル抗体は、B72.3で精製されたTAG-72を使用して調製された、第2の世代マウスモノクローナル抗体のファミリーである。TAG-72に対する比較的良好な結合親和性のために、以下のCC抗体がATCCに寄託されており、利用制限が要求されている：CC49（ATCC番号HB 9459）；CC83（ATCC 番号HB 9453）；CC46（ATCC 番号HB 9458）；CC92（ATTCC番号HB 9454）；CC30（ATCC番号HB 9457）；CC11（ATCC番号9455）；及びCC15（ATCC 番号HB 9460）。米国特許第5,512,443号は、当該技術分野において既知の組換えDNA技術によって、例えばマウス定常領域をヒト定常領域（Fc）ドメインに置換することにより、開示した抗体をそのキメラ形に変更できることを更に教示している。マウス及びキメラ抗TAG-72抗体の開示以外に、Schlomらの国際出願第PCT/US99/25552号に開示されたヒト化CC49抗体の変異体、及び米国特許第5,892,019号に開示された単鎖コンストラクトも産生されており、そのそれぞれが参照することにより本明細書に組み入れられる。当業者は、上述の抗体、コンストラクト又は組換え体、及びその変形のそれぞれを、本発明の二重特異性分子を作製するのに合成及び使用できることを理解するであろう。
上述した抗TAG-72抗体に加えて、種々のグループが、ドメイン欠失CC49及びB72.3抗体の構成及び部分的特徴付けについても報告している（例えばCalvo et al. Cancer Biotherapy, 8(1):95-109 (1993)、 Slavin-Chiorini et al. Int. J. Cancer 53:97-103 (1993)及びSlavin-Chiorini et al. Cancer. Res. 55:5957-5967 (1995)。このようなコンストラクトを、本発明の二重特異性結合分子に含んでもよい。
1つの実施形態では、本発明の二重特異性結合分子は、CD23に結合する（米国特許第6,011,138号）。好ましい実施形態では、本発明の二重特異性結合分子は、5E8抗体と同じエピトープに結合する結合部位を含む。別の実施形態では、本発明の結合分子は、抗CD23抗体、例えば5E8抗体由来の少なくとも1個のCDRを含む。
別の実施形態では、本発明の二重特異性分子は、C5E10抗体（又はC5E10抗体と同じ腫瘍関連抗原に結合する結合部位）に由来する結合部位を含む。同時係属出願09/104,717号で記載したように、C5E10は、前立腺腫瘍細胞株（例えばDU145、PC3、又はND1）に対して特異性であると思われるおよそ115kDaの糖タンパク質決定基を認識する抗体である。したがって、本発明と併せて、C5E10抗体によって認識された同じ腫瘍関連抗原に特異的に結合する二重特異性ポリペプチド（例えばCH2ドメイン欠失抗体）は、新生物形成疾患の治療のために、結合又は非結合形で産生及び使用できる。特に好ましい実施形態では、結合分子は、ATCC受け入れ番号PTA-865を有するハイブリドーマ細胞株から分泌されるような、C5E10抗体の抗原結合領域の全部又は一部に由来する、又はそれを含む。得られる結合分子は次に、以下で述べるように放射性核種に結合し、本明細書の方法に従って前立腺癌に罹患している患者に投与することができる。
別の実施形態では、リガンドは、例えば特定の受容体への結合を付与するために本発明の結合分子に含んでよい、又は受容体を、例えば循環からリガンドを除去するために結合分子に組み込んでもよい。対象二重特異性結合分子に含まれ得る代表的なリガンド及びその受容体としては、以下が挙げられる。
a.サイトカイン又はサイトカイン受容体
サイトカインはリンパ球の増殖、分化、及び機能活性化に対する多面発現性効果を有する。種々のサイトカイン又はその受容体結合部は、本発明の融合タンパク質で利用できる。代表的なサイトカインとしては、インターロイキン（例えばIL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-Il、IL-12、IL-13、及びIL-18）、コロニー刺激因子（CSF）（例えば顆粒球CSF（G-CSF）、顆粒球−マクロファージCSF（GM-CSF）、及び単球マクロファージCSF（M-CSF））、腫瘍壊死因子（TNF）アルファ及びベータ、並びに、例えばインターフェロン−α、β、又はγのようなインターフェロン（米国特許第4,925,793号及び同第4,929,554号）が挙げられる。
サイトカイン受容体は、典型的には、リガンド特異性アルファ鎖及び共通ベータ鎖より成る。代表的なサイトカイン受容体としては、GM-CSF、IL-3（米国特許第5,639,605号）、IL-4（米国特許第5,599,905号）、IL-5（米国特許第5,453,491号）、IFNγ（欧州特許第0240975号）の受容体、及び受容体のTNFファミリー（例えばTNFα（例えばTNFR-1（欧州特許第417,563号）、TNFR-2（欧州特許第417,014号）リンホトキシンベータ受容体）が挙げられる。
b.接着タンパク質又はその受容体
接着分子は、細胞を互いに相互作用させる膜結合タンパク質である。白血球ホーミング受容体及び細胞接着分子を含む、その受容体結合部の種々の接着タンパク質を、本発明の結合分子に組み込むことができる。白血球ホーミング受容体は、炎症中白血球細胞表面上で発現し、細胞外マトリクス成分への結合を仲介するβ−1インテグリン（例えばVLA-1、2、3、4、5、及び6）、及び血管内皮上の細胞接着分子（CAM）と結合するβ2−インテグリン（例えばLFA-1、LPAM-1、CR3、及びCR4）を含む。代表的なCAMとしては、ICAM-1、ICAM-2、VCAM-1、及びMAdCAM-1が挙げられる。他のCAMとしては、E-セレクチン、L-セレクチン、及びP-セレクチンを含むセレクチンファミリーのCAMが挙げられる。
c.ケモカイン又はその受容体
感染部位に向かう白血球の移動を刺激する走化性タンパク質である、ケモカインを、本発明の結合分子に組み込むことができる。代表的なケモカインとしては、マクロファージ炎症タンパク質（MIP-1-α及びMIP-1-β）、好中球走化性因子、及びRANTES（活性化のときに制御、正常にT細胞が発現及び分泌している）を含む。
d.増殖因子又は増殖因子の受容体
増殖因子若しくはその受容体（又は、その受容体結合若しくはリガンド結合部）、又はそれらに結合する分子を、本発明の結合分子に組み込むことができる。代表的な増殖因子としては、アンギオポエチン、血管内皮増殖因子（VEGF）及びそのアイソフォーム（米国特許第5,194,596号）；上皮増殖因子（EGF）；aFGF及びbFGFを含む線維芽細胞増殖因子（FGF）；心房性ナトリウム利尿因子（ANF）；肝臓増殖因子（HGF；米国特許第5,227,158号及び同第6,099,841号）、骨由来神経栄養因子（BDNF）、ニューロトロフィン-3、-4、-5、若しくは6（NT-3、NT-4、NT-5、又はNT-6）のような神経栄養因子、又はNGF-β血小板由来増殖因子（PDGF）（米国特許第4,889,919号、同第4,845,075号、同第5,910,574号、及び同第5,877,016号）のような神経成長因子； TGF-アルファ及びTGF-ベータ（国際公開第90／14359号）のような形質転換増殖因子（TGF）、骨形成タンパク質（BMP）を含む骨誘導因子；インスリン様増殖因子-I及びII（IGF-I及びIGF-II；米国特許第6,403,764号及び同第6,506,874号）；エリスロポエチン（EPO）；幹細胞因子（SCF）、トロンボポエチン（c-Mplリガンド）、及びWntポリペプチド（米国特許第6,159,462号）が挙げられる。
使用できる代表的な増殖因子受容体としては、EGF受容体（EGFR）；VEGF受容体（例えばFlt1又はFlk1/KDR）、PDGF受容体（国際公開第90／14425号）；HGF受容体（米国特許第5,648,273号及び同第5,686,292号）；IGF受容体（例えばIGFR1及びIGFR2）並びに、NGF、BDNF、及びNT-3に結合する、p75NTR又はp75とも呼ばれる低親和性受容体（LNGFR）、及び受容体チロシンキナーゼのtrkファミリーのメンバーである高親和性受容体（例えばtrkA、trkB（欧州特許第455,460号）、trkC（欧州特許第522,530号））を含む神経栄養性受容体が挙げられる。別の実施形態では、IGFR1及びVEGFの両方が標的化される。更に別の実施形態では、VLA4及びVEGFが標的化される。
他の細胞表面受容体及び／又はそのリガンドも標的化できる（例えばTNFファミリー受容体又はそのリガンド（本明細書で更に詳細に述べるように）。
e.ホルモン
本発明の結合分子において、標的化剤として使用するためにそれらに結合する代表的な成長ホルモン又は分子としては、レニン、ヒト成長ホルモン（HGH；米国特許第5,834,598号）、N-メチオニルヒト成長ホルモン；ウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン（PTH）；甲状腺刺激ホルモン（TSH）；チロキシン；プロインスリン及びインスリン（米国特許第5,157,021号及び同第6,576,608号）；卵胞刺激ホルモン（FSH）、カルシトニン、黄体形成ホルモン（LH）、レプチン、グルカゴン；ボンベシン；ソマトロピン；ミュラー阻害物質；レラキシン及びプロレラキシン；ゴナドトロピン関連ペプチド；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；OBタンパク質；又はミュラー阻害物質が挙げられる。
f.凝固因子
本発明の結合分子において、標的化剤として使用するための代表的な血液凝固因子としては、凝固因子（例えば因子V、VII、VIII、X、IX、XI、XII及びXIII、フォンウィルブランド因子）；組織因子（米国特許第5,346,991号、同第5,349,991号、同第5,726,147号、及び同第6,596,84号）；トロンビン及びプロトロンビン；フィブリン及びフィブリノゲン；プラスミン及びプラスミノーゲン；ウロキナーゼ又はヒト尿若しくは組織型プラスミノーゲン活性化因子（t-PA）のようなプラスミノーゲン活性化因子が挙げられる。
C.融合タンパク質
本発明は、１つ以上の免疫グロブリンドメインを含む結合分子にも関する。1つの実施形態では、本発明の融合タンパク質は、結合ドメイン（少なくとも1つの結合部位を含む）及び二量化ドメイン（少なくとも1つの重鎖部を含む）を含む。例えば、1つの実施形態では、本発明の結合分子は少なくとも1つのヒト化B3F6結合部位及び二量化ドメインを含んでよい。1つの実施形態では、対象融合タンパク質は二重特異性である（第1標的のための1つの結合部位と、第2標的のための第2結合部位を有する）。1つの実施形態では、対象融合タンパク質は多価である（同じ標的に対する2つの結合部位を有する）。
1つの実施形態では、融合タンパク質はB3F6結合部位、少なくとも1つの重鎖ドメイン及び合成連結ペプチドを含む。
文献で報告された代表的な融合タンパク質としては、T細胞受容体（Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2936-2940 (1987))；CD4 （Capon et al., Nature 337:525-531 (1989)； Traunecker et al., Nature 339:68-70 (1989)； Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. USA 9:347-353 (1990)； 及びByrn et al., Nature 344:667-670 (1990)）；L−セレクチン（ホーミング受容体）（Watson et al., J. Cell. Biol. 110:2221-2229 (1990)；及び Watson et al., Nature 349:164-167 (1991)）；CD44（Aruffo et al., Cell 61:1303-1313 (1990)）；CD28及びB7（Linsley et al., J. Exp. Med. 173:721-730 (1991)）；CTLA-4（Lisley et al., J. Exp. Med. 174:561-569 (1991)); CD22 （Stamenkovic et al., Cell 66:1133-1144 (1991)）；TNF受容体（Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539 (1991)； Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 27:2883-2886 (1991)及び Peppel et al., J. Exp. Med. 174:1483-1489 (1991)）；並びにIgE受容体a（Ridgway and Gorman,J．Cell．Biol．Vol．115,Abstract No．1448（1991））の融合が挙げられる。
1つの実施形態では、本発明の融合タンパク質を調製するとき、結合ドメイン（例えばヒト化B3F6結合ドメイン）をコードする核酸は、免疫グロブリン定常ドメイン配列のN末端をコードする核酸のC末端に融合される。N末端融合も可能である。1つの実施形態では、融合タンパク質はCH2及びCH3ドメインを含む。融合はまた、定常ドメインのFc部分のC末端に、又は重鎖のCH1又は軽鎖の対応する領域のすぐN末端に行うこともできる。
1つの実施形態では、リガンド又は受容体ドメインの配列は、免疫グロブリン分子のFcドメインのN末端に融合される。重鎖の定常領域全体をリガンド又は受容体ドメインの配列に融合させることも可能である。1つの実施形態では、化学的にIgG Fcを画定するパパイン切断部位（すなわち、重鎖の定常領域の第1の残基を114と考えると、残基216）の、又は他の免疫グロブリンの類似部位のすぐ上流のヒンジ領域で開始する配列が、融合で使用される。融合が行われる正確な部位は重要ではない；特定の部位が周知であり、分子の生物活性、分泌、又は結合特徴を最適化するために選択できる。融合タンパク質を作製する方法は当該技術分野において既知である。
二重特異性融合タンパク質では、融合タンパク質は多量体として、特にヘテロ二量体又はヘテロ四量体として構築される。一般的に、これらの構築された免疫グロブリンは公知のユニット構造を有する。基本的な4鎖構造ユニットは、IgG、IgD、及びIgEが存在する形である。4鎖ユニットは、高分子量免疫グロブリンにて反復される；IgMは一般的に、ジスルフィド結合によって結合された4個の基本ユニットの五量体として存在する。IgAグロブリン、及び時にIgGグロブリンもまた、血清中で多量体形で存在できる。多量体の場合、4個のユニットはそれぞれ同じであっても、異なっていてもよい。
融合タンパク質は、例えば国際公開第0069913A1号及び国際公開第0040615A2号で教示される。融合タンパク質は、当該技術分野において周知である方法を使用して調製できる（例えば米国特許第5,116,964号及び同第5,225,538号を参照のこと）。通常、リガンド又は受容体ドメインは、重鎖（又は重鎖部）の定常領域のN末端へC末端側に、可変領域の代わりに融合される。リガンド結合受容体の任意の膜貫通領域又は脂質若しくはリン脂質アンカー認識配列は、好ましくは融合の前に不活性化又は欠失される。リガンド又は受容体ドメインをコードするDNAは、所望のORFセグメントをコードするDNAの5’及び3’末端における、又はそれに近接した制限酵素によって切断される。得られるDNA断片は、次いで重鎖の定常領域をコードするDNA内へ容易に挿入される。融合が行われる正確な部位は、可溶性融合タンパク質の分泌又は結合特徴を最適化するために経験的に選択できる。融合タンパク質をコードするDNAは、次いで、発現のために宿主細胞内にトランスフェクトされる。
III.合成連結ペプチド
1つの実施形態では、本発明の二量体の少なくとも1本のポリペプチド鎖は、合成連結ペプチドを含む。1つの実施形態では、本発明の二量体の少なくとも2本の鎖は連結ペプチドを含む。好ましい実施形態では、本発明の二量体の2本の鎖は連結ペプチドを含む。
1つの実施形態では、連結ペプチドを使用して、単一のポリペプチド鎖内のフレーム内の2つの重鎖部を結合することができる。例えば1つの実施形態では、本発明の連結ペプチドを使用して、CH3ドメイン（又は合成CH3ドメイン）をヒンジ領域（又は合成ヒンジ領域）に融合させることができる。別の実施形態では、本発明の連結ペプチドを使用して、CH3ドメイン（又は合成CH3ドメイン）をCH1ドメイン（又は合成CH1ドメイン）に融合させることができる。更に別の実施形態では、連結ペプチドはヒンジ領域（又は合成ヒンジ領域）とCH2ドメイン（又は合成CH2ドメイン）との間でペプチドスペーサとして作用することができる。
別の実施形態では、CH3ドメインは細胞外タンパク質ドメイン（例えばVLドメイン（又は合成ドメイン）、VHドメイン（又は合成ドメイン）、CH1ドメイン（又は合成ドメイン）、ヒンジドメイン（又は合成ヒンジ））に、又は受容体のリガンド結合部又はリガンドの受容体結合部）に融合できる。例えば1つの実施形態では、VH又はVLドメインは、連結ペプチドを介してCH3ドメインに融合できる（連結ペプチドのC末端がCH3ドメインのN末端に結合され、連結ペプチドのN末端がVH又はVLドメインのC末端に結合される）。別の実施形態では、CH1ドメインは、連結ペプチドを介してCH3ドメインに結合される（連結ペプチドのC末端がCH3ドメインのN末端に結合され、連結ペプチドのN末端がCH1ドメインのC末端に結合される）。別の実施形態では、本発明の連結ペプチドを使用して、CH3ドメイン（又は合成CH3ドメイン）をヒンジ領域（又は合成ヒンジ領域）又はその一部に融合することができる。更に別の実施形態では、連結ペプチドはヒンジ領域（又は合成ヒンジ領域）とCH2ドメイン（又は合成CH2ドメイン）との間のペプチドスペーサとして作用することができる。
1つの実施形態では、連結ペプチドはgly/serスペーサを含む、又はそれから成ることができる。例えばCH2ドメイン及び下部ヒンジ領域（CH2［gly/ser］）を置換した、短いアミノ酸スペーサGGSSGGGGSG（配列番号8）を有するドメイン欠失コンストラクトを使用できる。別の実施形態では、連結ペプチドはアミノ酸配列IGKTISKKAK（配列番号15）を含む。
別の実施形態では、連結ペプチドは免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部を含むことができる。ヒンジドメインは、3つの区別できる領域、上方、中央、及び下方ヒンジ領域に更に細かく分けることができる(Roux et al. J. Immunol. 1998 161:4083)。IgG1及びIgG3ヒンジのこれらの領域を包含するポリペプチド配列を表３に示す。例えば、異なる抗体アイソタイプに由来するヒンジ要素を組合せる、キメラヒンジドメインを構築できる。1つの実施形態では、連結ペプチドはIgG1ヒンジ領域の少なくとも一部を含む。別の実施形態では、連結ペプチドはIgG3ヒンジ領域の少なくとも一部を含むことができる。別の実施形態では、連結ペプチドはIgG1ヒンジ領域の少なくとも一部及びIgG3ヒンジ領域の少なくとも一部を含むことができる。1つの実施形態では、連結ペプチドはIgG1の上方及び中央ヒンジ、並びに単一IgG3の中央ヒンジ反復モチーフを含むことができる。
代表的な連結ペプチドは、例えば国際公開第06/74397号に教示されている。
1つの実施形態では、本発明の連結ペプチドは非自然発生免疫グロブリンヒンジ領域ドメイン、例えばヒンジ領域ドメインを含むポリペプチド中には元来見られないヒンジ領域ドメイン及び／又は自然発生免疫グロブリンヒンジ領域ドメインとはアミノ酸配列が異なるように変更されたヒンジ領域ドメインを含む。1つの実施形態では、ヒンジ領域ドメインに突然変異を生じさせて、本発明の連結ペプチドを作製することができる。1つの実施形態では、本発明の連結ペプチドは、天然発生数のシステインを含まないヒンジドメインを含み、すなわち連結ペプチドは自然発生ヒンジ分子よりも少ないシステイン、又はより多い数のシステインを含む。好ましい実施形態では、連結ペプチドをポリペプチドに組み込むことにより、二量体分子の50％、60％、70％、80％又は90％超が、2つの重鎖部が少なくとも1つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合された形で存在する組成物が得られる。
本発明の1つの実施形態では、連結ペプチドは、Kabat番号付けシステムのアミノ酸位置243（位置230、EU番号付けシステム）に対応するアミノ酸位置にプロリン残基を含むヒンジ領域ドメインを含む。1つの実施形態では、連結ペプチドは、Kabat番号付けシステムの位置244（位置246、EU番号付けシステム）に対応するアミノ酸位置にアラニン残基を含む。別の実施形態では、本発明の連結ペプチドは、位置245（Kabat番号付けシステム；位置247、EU番号付けシステム）に対応するアミノ酸位置にプロリン残基を含む。1つの実施形態では、連結ペプチドは、Kabat番号付けシステムの位置239（位置226、EU番号付けシステム）に対応するアミノ酸位置にシステイン残基を含む。1つの実施形態では、連結ペプチドは、Kabat番号付けシステムの位置239（位置226、EU番号付けシステム）に対応するアミノ酸位置にセリン残基を含む。1つの実施形態では、連結ペプチドは、Kabat番号付けシステムの位置242（位置229、EU番号付けシステム）に対応するアミノ酸位置にシステイン残基を含む。1つの実施形態では、連結ペプチドは、Kabat番号付けシステムの位置242（位置229、EU番号付けシステム）に対応するアミノ酸位置にセリン残基を含む。
1つの実施形態では、連結ペプチドは、例えば2つの重鎖部がジスルフィド結合を介して結合する、又はジスルフィド結合を介して結合しない、ポリペプチドの特定のアイソフォームの選択的合成を引き起こすように選択できる。例えば国際公開第2006 074397号の実施例に記載のように、G1/G3/Pro243+［gly/ser］リンカー（配列番号26）、G1/G3/Pro243Ala244Pro245+［gly/ser］リンカー（配列番号5）、Pro243+［gly/ser］リンカー（配列番号33）、及びPro243Ala244Pro245+［gly/ser］リンカー（配列番号32）連結ペプチドは、検出不可能なB型を含まないA型 CH2ドメイン欠失抗体のみを産生した。これに対して、CH2ドメイン欠失Cys242Ser:Pro243（配列番号31）、及びCH2ドメイン欠失Cys242Ser:Pro243Ala244Pro245（配列番号32）では、いずれもB型アイソフォームが優先的に生じた。これらの合成ヒンジ領域連結ペプチドは、したがって、A型又はB型アイソフォームの有利な合成に有用である。このことは4つ全てのヒトアイソタイプのCH3ドメインの中で、高程度の相同性に基づく抗体のいずれのアイソタイプ（例えばIgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4）にも当てはまる（同一及び保存アミノ酸残基を含めて、IgG1 CH3ドメインはIgG2のCH3に対して98．13％相同であり、IgG3のCH3に対して97．20％相同であり、IgG4のCH3に対して96．26％相同である）。本発明の連結ペプチド及び種々の結合分子を指す挿入句は、特に指摘しない限り均等な用語を表す。
1つの実施形態では、本発明の連結ペプチドは、可動性gly/serリンカーに続くヒンジ領域ドメインを含む。代表的な連結ペプチドを表2及び配列番号5、25〜34に示す。１つ以上のアミノ酸置換、付加又は欠失が連結ペプチド内に導入されるように、連結ペプチドをコードするヌクレオチド配列内に１つ以上のヌクレオチド置換、付加又は欠失を導入することによって、これらの代表的な連結ペプチドの変異体形を作製できることが理解されるであろう。例えば、突然変異は、部位特異的突然変異誘発及びPCR介在突然変異誘発のような、標準的な技術によって導入してよい。好ましくは、保存的アミノ酸置換は、連結ペプチドの、A型又はB型の合成を選択的に向上させる能力が変化しないよう、１つ以上の非本質的なアミノ酸残基で行われる。したがって、免疫グロブリンポリペプチドの非本質的なアミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基で置換される。別の実施形態では、アミノ酸のストリングを、側鎖ファミリーのメンバーの順序及び／又は組成の異なる構造的に類似のストリングで置換することができる。
本発明の連結ペプチドは、可変長でありうる。1つの実施形態では、本発明の連結ペプチドの長さは、約15〜約50アミノ酸である。別の実施形態では、本発明の連結ペプチドの長さは、約20〜約45アミノ酸である。別の実施形態では、本発明の連結ペプチドの長さは、約25〜約40アミノ酸である。別の実施形態では、本発明の連結ペプチドの長さは、約30〜約35アミノ酸である。別の実施形態では、本発明の連結ペプチドの長さは、約24〜約27アミノ酸である。別の実施形態では、本発明の連結ペプチドの長さは、約40〜約42アミノ酸である。
連結ペプチドは、当該技術分野において既知の技術を使用してポリペプチド配列に導入できる。例えば、1つの実施形態では、重複伸長によるスプライシング（Splicing by Overlap Extension）（SOE）法（Horton, R.M. 1993 Methods in Molecular Biology, Vol 15:PCR Protocols: Current Methods and applications. Ed. B.A. White）を使用してよい。改変はDNA配列解析によって確認できる。プラスミドDNAを使用して、産生されたポリペプチドの安定的産生のために宿主細胞を形質転換することができる。
1つの実施形態では、対象連結ペプチドの１つをポリペプチドに組み込むことにより、少なくとも2つの結合部位及び少なくとも2つのポリペプチド鎖を有する結合分子を含む組成物が得られ、ここでポリペプチド鎖の少なくとも2本が合成連結ペプチドを含み、50％超の分子は、2つの重鎖部が少なくとも1つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合する形で存在する。別の実施形態では、60％超の分子は、2つの重鎖部が少なくとも1つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合する形で存在する。別の実施形態では、70％超の分子は、2つの重鎖部が少なくとも1つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合する形で存在する。別の実施形態では、80％超の分子は、2つの重鎖部が少なくとも1つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合する形で存在する。別の実施形態では、90％超の分子は、2つの重鎖部が少なくとも1つの鎖間ジスルフィド結合を介して結合する形で存在する。
IV.結合分子の発現
上述のような本発明のポリペプチドを提供するための単離された遺伝物質の操作後に、次に本請求した結合分子を提供する、所望の量のポリペプチドを産生するために使用できる宿主細胞内に導入するために、典型的には、発現ベクターに遺伝子を挿入する。
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、本明細書では、明細書及び特許請求の範囲の目的のために、細胞内の所望の遺伝子内に導入して、遺伝子を発現させるための媒体として、本発明に従って使用されるベクターを意味する。当業者に既知であるように、このようなベクターはプラスミド、ファージ、ウィルス及びレトロウィルスから成る群から容易に選択できる。一般に、本発明に適合するベクターは、選択マーカー、所望の遺伝子のクローニングを促進するための適切な制限酵素認識部位、並びに真核若しくは原核細胞に入る及び／又は真核又は原核細胞で複製する能力を含む。
本発明の目的のために、多数の発現ベクター系を使用できる。例えば、ベクターの1つのクラスは、ウシパピローマウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ワクシニアウィルス、バキュロウィルス、レトロウィルス（RSV、MMTV又はMOMLV）又はSV40ウィルスのような動物ウィルスに由来するDNA要素を利用する。他のベクターは、内部リボソーム結合部位を備えたポリシストロニック系の使用を含む。更に、DNAがその染色体内に組み込まれた細胞は、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカーを導入することにより選択できる。マーカーは栄養要求性宿主に対する原栄養性、殺生物剤耐性（例えば抗生物質）又は銅のような重金属に対する耐性を備えてよい。選択可能なマーカー遺伝子は、発現すべきDNA配列に直接結合できる、又は同時形質転換によって同じ細胞内に導入できる。mRNAの最適な合成には追加の要素が必要な場合もある。これらの要素は、シグナル配列、スプライスシグナルに加えて、転写プロモータ、エンハンサ、及び終止シグナルを含んでよい。特に好ましい実施形態では、クローニングされた可変領域遺伝子は発現ベクター内に、上述のような重鎖及び軽鎖定常領域遺伝子（好ましくはヒト）合成物と共に挿入される。好ましくは、これは、NEOSPLAと呼ばれるIDEC,Inc．の専売発現ベクターを使用して実施される（米国特許第6,159,730号）。このベクターは、サイトメガロウィルスプロモータ／エンハンサ、マウスベータグロビンメジャープロモータ、SV40複製開始点、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのエクソン1及びエクソン2、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びリーダー配列を含有する。国際公開第2006 074397号の実施例で見られるように、このベクターは、可変及び定常領域遺伝子の包含時における抗体の非常に高レベルの発現、CHO細胞へのトランスフェクト、それに続くG418含有培地での選択、及びメトトレキサート増幅を引き起こすことが見出されている。ベクター系は米国特許第5,736,137号及び同第5,658,570号でも教示されており、それぞれ全文が参照することにより本明細書に組み入れられる。この系は高い発現レベル、例えば＞30pg／細胞／日を提供する。他の代表的なベクター系は、例えば米国特許第6,413,777号に開示されている。
他の好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、2001年11月16日に出願され、その全文が本明細書に組み込まれている同時係属米国特許仮出願第60/331,481号で開示されているもののようなポリシストロニックコンストラクトを使用して発現させることができる。これらの新規発現系では、抗体の重鎖及び軽鎖のような、複数の関心遺伝子産物は、単一のポリシストロニックコンストラクトから産生できる。これらの系は、真核宿主細胞内に比較的高レベルの本発明のポリペプチドを提供するために、内部リボソーム侵入部位（IRES）を有利に使用する。適合するIRES配列は、これもまた本明細書に組み込まれている米国特許第6,193,980号に開示されている。当業者は、このような発現系を使用して、本出願に開示された全範囲のポリペプチドを有効に産生できることを理解するであろう。
より一般的には、いったんポリペプチドの単量体サブユニット（例えば改変された抗体）の単量体サブユニットをコードするベクター又はDNA配列が調製されると、発現ベクターを適切な宿主細胞内に導入することができる。つまり、宿主細胞を形質転換できる。プラスミドの宿主細胞への導入は、当業者に周知の種々の技術によって達成できる。これらとしては、トランスフェクション（電気泳動及びエレクトロポレーションを含む）、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エンべロープ化DNAとの細胞融合、マイクロインジェクション、及びインタクトなウィルスによる感染が挙げられるが、これらに限定されない。Ridgway, A. A. G. "Mammalian Expression Vectors" Chapter 24.2, pp. 470-472 Vectors, Rodriguez and Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, Mass. 1988)を参照のこと。最も好ましくは、宿主へのプラスミド導入はエレクトロポレーションによる。形質転換した細胞を、軽鎖及び重鎖の産生に適切な条件化で増殖させて、重鎖及び／又は軽鎖タンパク質合成に関してアッセイする。代表的なアッセイ技術としては、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、又は蛍光細胞分析分離装置分析（FACS）、免疫組織化学的検査等が挙げられる。
本明細書で使用するとき、用語「形質転換」は、広い意味で遺伝子型を変化させ、結果としてレシピエント細胞の変化を引き起こす、レシピエント宿主細胞へのDNAの導入を指すために使用する。
これらの同じ系統ともに「宿主細胞」は、組換えDNA技術を使用して構築され、少なくとも1つの非相同遺伝子をコードするベクターによって形質転換された細胞を指す。組換え宿主からの抗体の単離のためのプロセスの説明では、「細胞」及び「細胞培養物」という用語は、明確に別途規定されない限り、抗体源を示すために互換的に使用される。換言すれば、「細胞」からのポリペプチドの回収は、全細胞の遠心沈殿からの回収、又は培地及び懸濁細胞の両方を含有する細胞培養物からの回収、のいずれを意味する場合もある。
タンパク質発現に使用される宿主細胞株は、最も好ましくは哺乳類起源のものである；当業者は、その中で発現する所望の遺伝子産物に最も適した特定の宿主細胞株を選択的に決定する能力を備えていると見なされる。代表的な宿主細胞株としては、DG44及びDUXB11（チャイニーズハムスター卵巣系、DHFRマイナス）、HELA（ヒト子宮頸癌）、CVI（サル腎臓系）、COS（CVIのSV40 T抗原による誘導体）、R1610（チャイニーズハムスター線維芽細胞）BALBC/3T3（マウス線維芽細胞）、HAK（ハムスター腎臓系）、SP2/O（マウス骨髄腫）、P3.times.63-Ag3.653（マウス骨髄腫）、BFA-1c1BPT（ウシ内皮細胞）、RAJI（ヒトリンパ球）及び293（ヒト腎臓）が挙げられるが、これらに限定されない。CHO細胞が特に好ましい。宿主細胞株は、典型的には、商業サービス、American Tissue Culture Collectionから、又は公開された文献から入手できる。
インビトロ産生により、大量の所望のポリペプチドを得るためにスケールアップすることが可能になる。組織培養条件下で哺乳類の細胞を培養する技術は当該技術分野において既知であり、例えばエアリフトリアクタ内又は連続スターラーリアクタ内での均質懸濁培養、又は例えば中空ファイバ、マイクロカプセル内、アガロースマイクロビーズ若しくはセラミックカートリッジ上での固定化若しくは捕捉細胞培養が挙げられる。必要ならば及び／又は所望ならば、例えば合成ヒンジ領域ポリペプチドの選択的生合成後に、又は本明細書に記載したHICクロマトグラフィー工程前若しくはその後に、慣習的なクロマトグラフィー法、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、DEAE−セルロース上でのクロマトグラフィー又は（免疫）親和性クロマトグラフィーによって、ポリペプチドの溶液を精製することができる。
本発明のポリペプチドをコードする遺伝子はまた、細菌又は酵母又は植物細胞のような、発現した非哺乳類細胞であってもよい。この点で、細菌のような種々の単細胞非哺乳類微生物；すなわち培養又は発酵で増殖させることができる微生物も形質転換できることが理解されるであろう。形質転換しやすい細菌としては、大腸菌又はサルモネラの菌株のような腸内細菌科のメンバー；枯草菌のようなバチルス科；肺炎球菌；ストレプトコッカス、及びインフルエンザ菌が挙げられる。細菌中で発現するとき、ポリペプチドは、典型的には、封入体の一部となることが更に理解されるであろう。ポリペプチドは単離し、精製し、次に機能分子に組織化（assemble）しなければならない。抗体の4価形が望ましい場合、サブユニットは4価抗体に自己組織化される（国際公開第02/096948A2号）。
原核生物（prokaryate）に加えて、真核微生物も使用できる。ビール酵母菌、又は一般的なパン酵母は、真核微生物の中で最も一般的に使用されているが、多くの他の菌株も一般的に入手可能である。酵母での発現では、例えばプラスミドYRp7（Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)； Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979)；Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)）が一般的に使用される。このプラスミドは、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母の変異株、例えばATCC番号44076又はPEP4−1に対する選択マーカーを提供するTRP1遺伝子を既に含有している（Jones, Genetics, 85:12 (1977)）。酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのtrp1損傷の存在は、トリプトファンの非存在下における増殖によって形質転換を検出するために有効な環境を提供する。
V.結合分子の標識または結合
本発明の結合分子は、非結合形で使用してもよく、又は例えば標的検出を促進するために、若しくは患者の撮像若しくは治療のために、種々のエフェクタ、すなわち機能部の少なくとも1つに結合してもよい。本発明のポリペプチドは、精製を実施するとき、精製の前後のいずれかに標識又は結合できる。特に本発明のポリペプチドは、細胞毒（放射性同位体、細胞毒性薬、又は毒素のような）治療剤、細胞増殖抑制剤、生物毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウィルス、脂質、生体応答調節物質、医薬品、免疫活性リガンド（例えば、リンホカイン又は得られる分子が新生物形成細胞及びT細胞のようなエフェクタ細胞の両方に結合する他の抗体）、PEG、又は撮像に有用である検出可能な部分に結合してよい。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、腫瘍の血管新生を減少させる分子に結合することができる。他の実施形態では、開示した組成物は、薬物又はプロドラッグに結合した本発明のポリペプチドを含んでよい。本発明の更に他の実施形態は、リシン、ゲロニン、緑膿菌外毒素又はジフテリア毒素のような、特異的生物毒素又はその細胞毒性断片に結合した本発明のポリペプチドの使用を含む。使用する結合又は非結合ポリペプチドの選択は、癌の種類及び段階、補助治療の使用（例えば化学療法又は外部放射線）並びに患者の状態に依存する。当業者が本明細書の教示を考慮してこのような選択を容易に行えることが理解されよう。
以前の研究では、同位体によって標識された抗腫瘍抗体を使用して、動物モデル、及び場合によってはヒトで、固形腫瘍に加えてリンパ腫／白血病の細胞の破壊に成功したことが理解されるであろう。代表的な放射性同位体としては：90Y、125I、131I、123I、111In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re及び188Reが挙げられる。放射性核種は、核DNAでの複数の鎖切断を引き起こす電離放射線を生成することによって作用して、細胞死を導く。治療結合体を産生するのに使用される同位体は、典型的には、短い路長を有する高エネルギーa-又はb-粒子を生成する。このような放射性核種は、それらが近接している細胞、例えば結合体が結合又は侵入した新生物形成細胞を死滅させる。それらは非局在化細胞にはほとんど、又は全く効果を有しない。放射性核種は本質的に非免疫原性である。
本発明と併せた放射性標識された結合体の使用に関して、本発明のポリペプチドは直接標識してもよく（ヨウ素化によって等）、又はキレート剤の使用を通して間接的に標識してもよい。本明細書で使用するとき、「間接標識」及び「間接標識手法」という句はいずれも、キレート剤が結合分子に共有結合し、少なくとも1つの放射性核種がキレート剤に結合することを意味する。このようなキレート剤は、ポリペプチド及び放射性同位体の両方に結合するため、典型的には、二官能性キレート剤と呼ばれる。特に好ましいキレート剤は、1-イソチオシクマトベンジル-3-メチルジエチレン（methyldiothelene）トリアミン五酢酸（「MX-DTPA」）及びシクロヘキシルジエチレントリアミン五酢酸（「CHX-DTPA」）誘導体を含む。他のキレート剤は、P-DOTA及びEDTA誘導体を含む。間接標識に特に好ましい放射性核種としては、111In及び90Yが挙げられる。
本明細書で使用するとき、「直接標識」及び「直接標識手法」という句はいずれも、放射性核種がポリペプチドに直接共有結合する（典型的には、アミノ酸残基を介して）ことを意味する。更に具体的には、これらの結合技術としては、ランダム標識及び部位特異的標識が挙げられる。後者の場合では、標識は、結合体のFc部分にのみ存在するN結合型糖残基のような、ポリペプチドの特定の部位に向けられる。更に、種々の直接標識技術及びプロトコルは、本発明に適合する。例えばテクネチウム-99m標識ポリペプチドは、リガンド交換プロセスにより、ペルテクネート（TcO4 −）を二価のスズイオン溶液で還元して、還元されたテクネチウムをセファデックスカラム上でキレート化し、ポリペプチドをこのカラムに適用することにより、又は例えばペルテクネート、SnCl2のような還元剤、ナトリウム−カリウムフタレート溶液のような緩衝溶液、及び抗体をインキュベートすることによる、バッチ標識技術により調製できる。いずれにしても、抗体を直接標識するために好ましい放射性核種は当該技術分野において周知であり、直接結合に特に好ましい放射性核種は、チロシン残基を介して共有結合した131Iである。本発明によるポリペプチドは、例えば放射性ヨウ化ナトリウム若しくはカリウム及び、例えば次亜塩素酸ナトリウム、クロラミンT等のような化学酸化剤、又はラクトペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ及びグルコースのような酵素的酸化剤を用いて誘導してよい。しかしながら、本発明の目的のためには、直接標識手法が特に好ましい。キレート剤及びキレート剤結合体に関する特許は、当該技術分野において既知である。例えばGansowの米国特許第4,831,175号は、多置換ジエチレントリアミン五酢酸キレート及びそれを含有するタンパク質結合体、並びにその調製方法を目的とする。Gansowの米国特許第5,099,069号、同第5,246,692号、同第5,286,850号、同第5,434,287号及び同第5,124,471号も、多置換DTPAキレートに関する。これらの特許は、その全文が本明細書に組み込まれる。適合する金属キレート剤の他の例は、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）、1,4,8,11−テトラアザテトラデカン、1,4,8,11−テトラアザテトラデカン−1,4,8,11−四酢酸、1−オキサ−4,7,12,15−テトラアザヘプタデカン−4,7,12,15−四酢酸等である。シクロヘキシル−DTPA又はCHX−DTPAは特に好ましく、以下に広範に例示される。更に他の適合するキレート剤は、未だ発見されていないものを含めて、当業者は容易に認識でき、明らかに本発明の範囲内である。
同時係属出願第08/475,813号、同第08/475,815号及び同第08/478,967号においてキレート化を促進するために使用される特異的二官能性キレート剤を含む、適合するキレート剤は、好ましくは三価金属に高い親和性を提供するように選択され、腫瘍対非腫瘍比の上昇及び骨取り込みの低下に加えて、標的部位、すなわちB細胞リンパ腫腫瘍部位における放射性核種のインビボ保持の向上も示す。しかしながら、これらの特徴の全てを有する、又は有しない他の二官能性キレート剤が当該技術分野において既知であり、腫瘍治療にも有益であり得る。本明細書の教示に従って、ポリペプチドは診断及び治療目的で種々の放射性標識に結合し得ることも理解されるであろう。このために、参照することにより全文が本明細書に組み込まれる上述の同時係属出願は、治療用抗体投与前の腫瘍の診断的「撮像」のための、放射性標識治療結合体を開示している。「In2B8」結合体は、ヒトCD20抗原に特異性であるマウスモノクローナル抗体、2B8を含み、これは111Inに、二官能性キレート剤、すなわち、1−イソチオシアナトベンジル−3−メチル−DTPA及び1−メチル−3−イソチオシアナトベンジル−DTPAの1：1混合物を含む、MX−DTPA（ジエチレントリアミン五酢酸）を介して結合される。111Inは、約１〜約10mCiで、検出可能な毒性を伴わずに安全に投与できるため、診断用放射性核種として特に好ましく；撮像データは一般的に、次の90Y−標識抗体分布を予測する。大部分の撮像試験が5mCi111In標識抗体を利用する、なぜならこの用量が安全であり、かつ、より少ない用量と比較して撮像効率が向上するためであり、抗体投与の3〜6日後に最適な撮像が行われる。例えばMurray, J. Nuc. Med. 26: 3328 (1985)及び Carraguillo et al., J. Nuc. Med. 26: 67 (1985)を参照のこと。
上で示したように、種々の放射性核種を本発明に適用可能であり、当業者は、種々の状況下でどの放射性核種が最も適切であるかを容易に決定できる。例えば131Iは、標的免疫療法に使用される周知の放射性核種である。しかしながら131Iの臨床有用性は、8日間の物理的半減期；血液及び腫瘍部位の両方におけるヨウ化抗体の脱ハロゲン化；及び腫瘍での局在化用量沈着にとって最適以下であり得る放射特性（例えば、大きなガンマ成分）を含むいくつかの因子によって制限される場合がある。優れたキレート剤の出現により、金属キレート基がタンパク質に結合する機会は、111In及び90Yのような他の放射性核種を利用する機会を増加させた。90Yは放射免疫療法用途における利用に関して、いくつかの利点をもたらす；90Yの64時間という半減期は抗体の腫瘍への蓄積を可能にするのに十分長く、例えば131Iとは異なり、90Yは、100〜1,000細胞直径の組織における範囲で、その崩壊時にガンマ線照射を伴わない高エネルギーの純粋なベータ放射体である。更に、透過放射線の最少量により、90Yで標識された抗体の外来患者への投与が可能になる。更に、細胞死滅のための標識抗体の内部移行は必要なく、イオン化放射線の局所放射は、標的分子を欠く隣接腫瘍細胞にとって致死性であるはずである。
当業者は、結合するべき選択された薬剤に応じて種々の技術を使用して、これらの非放射性結合体を組織化できることも理解するであろう。例えば、ビオチンとの結合体は、例えばポリペプチドを、ビオチンN−ヒドロキシスクシンイミドエステルのようなビオチンの活性化エステルと反応させることにより調製される。同様に、蛍光マーカーとの結合体は、例えば上に挙げたようなカップリング剤の存在下で、又はイソチオシアナート、好ましくはフルオレセイン−イソチオシアナートとの反応により調製できる。本発明のポリペプチドと、細胞増殖抑制／細胞毒性物質及び金属キレートとの結合体は、類似の方式で調製される。
多くのエフェクタ部は、抗体が結合できる好適な官能基が欠如している。1つの実施形態では、エフェクタ部、例えば薬物又はプロドラッグは、連結部を通じて抗体に結合する。1つの実施形態では、連結部は、特定の部位において細胞毒性の活性化を可能にする化学結合を含有する。好適な化学結合は当該技術分野において周知であり、ジスルフィド結合、酸不安定結合、光不安定結合、ペプチダーゼ不安定結合、スルフヒドリル基とマレイミド基との間に形成されるチオエーテル結合、及びエステラーゼ不安定結合が挙げられる。最も好ましくは、連結部は、ジスルフィド結合又はチオエーテル結合を含む。本発明によると、連結部は、好ましくは反応性化学基を含む。特に好ましい反応性化学基は、N−スクシンイミジルエステル及びN−スルホスクシンイミジルエステルである。好ましい実施形態では、反応性化学基は、チオール基間のジスルフィド結合を介して、エフェクタに共有結合できる。1つの実施形態では、エフェクタ分子はチオール基を含むように改変される。当業者は、チオール基が水素原子に結合した硫黄原子を含有し、典型的には当該技術分野において、「−SH」又は「RSH」と表示することができるスルフヒドリル基と呼ばれることも理解するであろう。
1つの実施形態では、連結部を用いて、エフェクタ部分を結合分子と結合することができる。本発明の連結部は、切断可能であっても、切断不可能であってもよい。1つの実施形態では、切断可能な連結部は、細胞質及び遊離スルフヒドリル基を持つ分子がより高濃度である他の領域のような、連結部がより低い酸化還元電位の環境で切断可能であるように、酸化還元切断性連結部である。酸化還元電位の変化に起因する、切断可能な連結部の例としては、ジスルフィドを含有する連結部が挙げられる。細胞質のより低い酸化還元電位が連結部の切断を促進する場合、本発明の結合タンパク質の細胞内摂取時に切断刺激が与えられ得る。別の実施形態では、pHの低下がマイタンシノイドカーゴの標的細胞内への放出を誘発する。pHの低下は、エンドソーム輸送、腫瘍増殖、炎症、及び心筋虚血のような多くの生理学的及び病理学的プロセスに関わる。pHは、生理学的な7．4からエンドソームでは5〜6又はリソソームでは4〜5へ降下する。癌細胞のリソソーム又はエンドソームを標的化するのに使用できる酸感受性連結部の例としては、アセタール、ケタール、オルトエステル、ヒドラゾン、トリチル、シスアコニチル、又はチオカルバモイルで見られるような酸切断性結合を含むものが挙げられる（例えばWillner et al., (1993), Bioconj. Chem., 4: 521-7；米国特許第4,569,789号、同第4,631,190号、同第5,306,809,及び同第5,665,358号を参照のこと）。他の代表的な酸感受性連結部は、ジペプチド配列Phe-Lys及びVal-Lysを含む（King et al., (2002), J. Med. Chem., 45: 4336-43）。切断刺激は、低pHエンドソームコンパートメント（例えばリソソーム）への細胞内取り込み輸送時に与えることができる。他の代表的な酸切断性連結部は、２つ以上のマイタンシノイドの結合のために、２つ以上の酸切断性結合を含有する部分である（King et al., (1999), Bioconj. Chem., 10: 279-88；国際公開第98/19705号）。
切断性連結部は、特定の標的細胞、例えばリソソーム又は腫瘍関連酵素に関連する生物学的に供給される切断剤に対して感受性であってよい。酵素的に切断され得る連結部の例としては、ペプチド及びエステルが挙げられるが、これらに限定されない。代表的な酵素切断性連結部としては、カテプシンB又はプラスミンのような、腫瘍関連プロテアーゼに対して感受性である連結部が挙げられる（Dubowchik et al., (1999), Pharm. Ther., 83: 67-123；Dubowchik et al., (1998), Bioorg. Med. Chem. Lett., 8: 3341-52；de Groot et al., (2000), J. Med. Chem., 43: 3093-102；de Groot et al., (1999)m 42: 5277-83）。カテプシンB切断性部位としては、ジペプチド配列バリン−シトルリン及びフェニルアラニン−リジンが挙げられる（Doronina et al., (2003), Nat. Biotech., 21(7): 778-84)； Dubowchik et al., (2002), Bioconjug. Chem., 13: 855-69）。他の代表的な酵素切断性部位としては、チメト（Thimet）オリゴペプチダーゼ（TOP）、好中球、マクロファージ、及び他の顆粒球によって選択的に放出される酵素のようなトラウズ（trouse）プロテアーゼにより認識される、4〜16アミノ酸のオリゴペプチド配列（例えばSuc-β-Ala-Leu-Ala-Leu）によって形成された部位が挙げられる。
更なる実施形態では、連結部は本発明の結合分子を下記式の連結分子と反応させることにより形成される。
X-Y-Z
式中、
Xは、結合部分であり；
Yは、スペーサ部分であり；
Zは、エフェクタ結合部分である。
用語「結合分子結合部分」は、リンカーの、本発明の結合分子への共有結合を可能にする部分を含む。
結合部分は、水素原子及び、結合分子がその意図する機能を実施するのを可能にする他の置換基で所望により置換される、例えば1〜60個の炭素、酸素、窒素、硫黄原子の共有結合鎖を含んでよい。結合部分はペプチド、エステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、エーテル、チオエーテル等、官能基を含んでよい。好ましくは、結合部分は、本発明の結合分子を形成するために、少なくとも1つの抗原結合部位を含むポリペプチドの反応性官能基と反応できるように選択される。結合部分の例としては、例えばアミノ、カルボキシレート、及びチオール結合部分が挙げられる。
アミノ結合部分は、本発明の結合分子が形成されるように、ポリペプチドのアミノ基と反応する部分を含む。アミノ結合部分は当該技術分野において既知である。アミノ結合部分の例としては、活性化カルバミド（例えば、結合分子のアミノ基と反応して、尿素基を含む連結部を形成できる）、アルデヒド（例えば結合分子のアミノ基と反応できる）、及び活性化イソシアナート（結合分子のアミノ基と反応して、尿素基を含む連結部を形成できる）が挙げられる。アミノ結合部分の例としては、N−スクシンイミジル、N−スルホスクシンイミジル、N−フタルイミジル、N−スルホフタルイミジル、2−ニトロフェニル、4−ニトロフェニル、2,4−ジニトロフェニル、3−スルホニル−4−ニトロフェニル、又は3−カルボキシ−4−ニトロフェニル部分が挙げられるが、これらに限定されない。
カルボキシレート結合部分は、本発明の結合分子が形成されるように、ポリペプチドのカルボキシレート基と反応する部分を含む。カルボキシレート結合部分は当該技術分野において既知である。カルボキシレート結合部分の例としては、結合分子のCOOH基と反応して、エステル、チオエステル、又はアミド基を含む連結部を形成できる、活性化エステル中間体及び活性化カルボニル中間体が挙げられるが、これらに限定されない。
チオール結合部分は、本発明の結合分子が形成されるようにポリペプチドに存在するチオール基と反応する部分を含む。チオール結合部分は当該技術分野において既知である。チオール結合部分の例としては、活性化アシル基（結合分子のスルフヒドリルと反応して、チオエステルを含む連結部を形成できる）、活性化アルキル基（結合分子のスルフヒドリルと反応して、チオエステル部分を含む連結部を形成できる）、マレイミド又はアクリル基のようなマイケル（Michael）アクセプター（結合分子のスルフヒドリルと反応して、マイケル型付加生成物を形成できる）、酸化還元反応を介してスルフヒドリル基と反応する基、活性化ジスルフィド基（結合分子のスルフヒドリル基と反応して、例えばジスルフィド部分を含む連結部を形成できる）が挙げられる。他のチオール結合部分としては、アクリルアミド、アルファ−ヨードアセトアミド、及びシクロプロパン−1,1−ジカルボニル化合物が挙げられる。更に、チオール結合部分は、結合分子のチオールを修飾して、連結分子が結合して本発明の結合分子を形成できる別の反応性種を形成する部分を含んでよい。
スペーサ部分Yは、１つ以上のアミノ酸残基を含有できる原子の共有結合又は共有結合鎖である。それは水素、又は得られる結合分子がその意図する機能を実施するのを可能にする他の置換基で所望により置換される、0〜60個の炭素、酸素、硫黄又は窒素原子を含んでもよい。1つの実施形態では、Yはアルキル、アルケニル、アルキニル、エステル、エーテル、カルボニル、又はアミド部分を含む。
別の実施形態では、結合分子のチオール基は、ケトン又はアルデヒドのような、反応性カルボニル基のような反応性基に変換される。結合部分は、次にケトン又はアルデヒドと反応して、本発明の所望の化合物を形成する。カルボニル反応性結合部分の例としては、ヒドラジン、ヒドラジド、O−置換ヒドロキシルアミン、アルファ−ベータ−不飽和ケトン、及びH2C=CH-CO-NH-NH2が挙げられるが、これらに限定されない。結合部分の他の例及び本発明の結合分子を形成するために使用できるチオール部分を修飾する方法は、Pratt, M. L. et al. J Am Chem Soc. 2003 May 21;125(20):6149-59及びSaxon, E. Science. 2000 Mar 17;287(5460):2007-10に記載されている。
連結分子は、エフェクタ部分又はその誘導体と反応して、本発明の結合分子を形成することができる分子であってよい。例えば、エフェクタ部分は、ジスルフィド結合を通じて分子の残りの部分に連結できる。このような場合、連結部は、それが適切なエフェクタ部分誘導体と結合でき、そのエフェクタ部分が本発明の結合分子と結合するように選択される。上述のように、連結部及び／又はリンカーは、全体として、リンカーが適切な環境で切断されるように選択できる。
特に好ましいリンカー分子としては、例えばN−スクシンイミジル3−（2−ピリジルジチオ）プロピオネート（SPDP）（例えばCarlsson et al., Biochem. J., 173, 723-737 (1978)を参照のこと）、N−スクシンイミジル4−（2−ピリジルジチオ）ブタノエート（SPDB）（例えば米国特許第4,563,304号を参照のこと）、N−スクシンイミジル4−（2−ピリジルジチオ）ペンタノエート（SPP）（例えばCAS登録番号 341498−08−6を参照のこと）、N−スクシンイミジル4−（N−マレイミドメチル）シクロヘキサン（ｃｙｃｌｏｈｅ−ｘａｎｅ）−1−カルボキシレート（SMCC）（例えばYoshitake et al., Eur. J. Biochem., 101, 395-399 (1979)を参照のこと）、及びN−スクシンイミジル4−メチル−4−［2−（5−ニトロ−ピリジル）−ジチオ］ペンタノエート（SMNP）を含む（例えば、米国特許第4,563,304号を参照のこと）が挙げられる。本発明の組成物で使用するために最も好ましいリンカー分子は、SPP、SMCC、及びSPDBである。好ましい実施形態では、SPDBは、エフェクタ部分を本発明の結合分子に連結するために使用される。
本発明の1つの実施形態では、リンカー分子SPP、SMCC又はSPDBを用いて、抗Cripto結合分子をマイタンシノイドに連結する。1つの実施形態では、SPDB架橋剤を用いて、DM4を抗Cripto結合分子に連結する。別の実施形態では、SPDBを用いて、DM1を抗Cripto結合分子に連結する。別の実施形態では、SMCCを用いて、DM4を抗Cripto結合分子に連結する。別の実施形態では、SMCCを用いて、DM1を抗Cripto結合分子に連結する。別の実施形態では、SPPを用いて、DM4を抗Cripto結合分子に連結する。別の実施形態では、SPPを用いて、DM1を抗Cripto結合分子に連結する。好ましい実施形態では、抗Cripto結合分子は、ヒト化抗Cripto抗体である。
本発明で使用するための好ましい細胞毒性エフェクタ部分は、特に癌治療に使用される細胞毒性薬である。本明細書で使用するとき、「細胞毒又は細胞毒性剤」は、細胞の成長及び増殖に有害であり、細胞又は悪性疾患を減少、阻害又は破壊するように作用できる任意の薬剤を意味する。代表的な細胞毒としては、放射性核種、生物毒素、酵素的に活性な毒素、細胞増殖抑制又は細胞毒性治療剤、プロドラッグ、免疫学的に活性なリガンド及び、サイトカインのような生体応答調節物質が挙げられるが、これらに限定されない。免疫反応性細胞又は悪性細胞の増殖を遅延又は低速化するように作用するいずれの細胞毒も、本発明の範囲内である。
代表的な細胞毒としては、一般に、細胞増殖抑制剤、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗増殖剤、チューブリン結合剤、ホルモン及びホルモン拮抗剤等が挙げられる。本発明と適合する代表的な細胞増殖抑制剤としては、メクロレタミン、トリエチレンホスホラミド、シクロホスファミド、イホスファミド、クロラムブシル、ブスルファン、メルファラン又はトリアジコンのようなアルキル化物質、またカルムスチン、ロムスチン、又はセムスチンのようなニトロソ尿素化合物が挙げられる。
結合に特に好ましい部分は、マイタンシノイドである。マイタンシノイドは、マイテヌス(Maytenus)属に属する東アフリカの低木から最初に単離されたが、その後Actinosynnema pretiosumのような土壌細菌の代謝産物であることも発見された（例えば米国特許第3,896,111号を参照のこと）。マイタンシノイドは、マイタンシン、マイタンシノール、マイタンシノールのC−3エステル、及び他のマイタンシノール類似体及び誘導体を含むことが当該技術分野において既知である（例えば、米国特許第5,208,020号及び同第6,441,163号を参照のこと）。マイタンシノールのC−3エステルは自然発生であってもよく、又は合成により得てもよい。更に、自然発生及び合成C−3マイタンシノールエステルはいずれも、単純なカルボン酸とのC−3エステル、又はN−メチル−L−アラニンの誘導体とのC−3エステルとして分類でき、後者は前者よりも細胞毒性が強い。合成マイタンシノイド類似体も当該技術分野において既知であり、例えばKupchan et al., J. Med. Chem., 21, 31-37 (1978)に記載されている。マイタンシノール並びにその類似体及び誘導体を生成する方法は、例えば米国特許第4,151,042号に記載されている。
抗体結合体として使用するために好適なマイタンシノイドは、当該技術分野において既知の方法を使用して、天然源から単離する、合成的に生成する、又は半合成により生成することができる。更に、マイタンシノイドは、十分な細胞毒性が最終的な結合分子中で保存される限り、任意の好適な方法で改変できる。
反応性化学基を含有する連結部を含む特に好ましいマイタンシノイドは、連結部がジスルフィド結合を含有し、結合部分がN−スクシンイミジル又はN−スルホスクシンイミジルエステルを含む、マイタンシノールのC−3エステル及びその類似体である。マイタンシノイドの多くの位置は、例えばエフェクタ結合部分を通じて、連結部を化学的に連結する位置として作用することができる。例えば、ヒドロキシル基を有するC−3位、ヒドロキシメチルによって修飾されるC−14位、ヒドロキシによって修飾されるC−15位及びヒドロキシ基を有するC−20位は、全て有用である。連結部は、最も好ましくはマイタンシノールのC−3位に連結される。最も好ましくは、本発明の組成物及び方法に関連して使用されるマイタンシノイドは、N2’−デアセチル−N2’−（−3−メルカプト−1−オキソプロピル）−マイタンシン（DM1）又はN2’−デアセチル−N2’−（4−メルカプト−4−メチル−1−オキソペンチル）−マイタンシン（DM4）である。これらの種々の連結部は、ヒトの体内で異なる半減期を有する結合化抗体を放出することが知られている。具体的には、SPP-DM1リンカー結合体は、ヒトでおよそ24〜48時間の半減期を有し、SPDB-DM4リンカー結合体は、ヒトでおよそ5日間の半減期を有し、SMCC-DM1リンカー結合体は、ヒトでおよそ6日間の半減期を有する。具体的には、SPP及び SPDBリンカーは、近接する腫瘍細胞に再び入ることができる代謝物質を産生し、腫瘍細胞を殺すのに寄与することができるいわゆる「傍観者（bystander）」効果を生み出す。対照的に、SMCC-DM1リンカー系は、近接する腫瘍細胞に再び入ることができる代謝物質産物を産生しない。したがって、SMCC-DM1リンカー系を含む抗体結合体、例えばB3F6-SMCC-DM1は、「傍観者」殺活性を必要としない腫瘍の治療で有用である。SPDB-DM4リンカー系を含む抗体結合体、例えばB3F6-SPDB-DM4は、「傍観者」殺活性を必要とする又はしない、両方の腫瘍で腫瘍増殖を阻害するのに有用である。
他の化学結合との連結部も、他のマイタンシノイドが可能なように、本発明の状況で使用することが可能である。連結部に組み込むことができる他の化学結合の具体例としては、例えば酸不安定結合、チオエーテル結合、光不安定結合、ペプチダーゼ不安定結合及びエステラーゼ不安定結合のような上述の結合が挙げられる。連結部及び／又はエフェクタ結合部分を備えたマイタンシノイドを産生する方法は、例えば米国特許第5,208,020号、同第5,416,064号、及び同第6,333,410号に記載されている。
マイタンシノイドの連結部（及び／又はエフェクタ結合部分）は、典型的には、そして好ましくは、抗体をマイタンシノイドに結合するために使用されるより大きなリンカー分子の一部である。任意の好適なリンカー分子を、連結分子が、それぞれ、マイタンシノイド及び抗体の細胞毒性及び標的化特徴の保持を提供する限り、本発明に関連して使用できる。連結分子は、マイタンシノイド及び抗体が互いに化学的に結合する（例えば共有結合）ように、化学結合を通じて（上述したような）マイタンシノイドを抗体に結合する。望ましくは、連結分子はジスルフィド結合又はチオエーテル結合を通じて、マイタンシノイドを抗体に化学的に結合する。最も好ましくは、抗体はジスルフィド結合を介して、マイタンシノイドに化学的に結合する。
本発明の好ましい結合化結合分子は、のマイタンシノイド（例えばDM4又はDM1）に結合される抗Cripto抗体である。好ましい本発明の抗Cripto抗体−マイタンシノイド結合体は、1分子の抗体に結合する、約0.5〜10分子のマイタンシノイド、例えばDM4を有する。好ましくは、1分子の抗体に結合する、平均約1〜8分子のマイタンシノイド、例えばDM4、又は、1分子の抗体に結合する、平均約2〜6分子のマイタンシノイド、例えばDM4が存在する。好ましくは、1分子の抗体に結合する、平均約3〜5分子のマイタンシノイド、例えばDM4、より好ましくは、平均約3〜4分子のマイタンシノイド、例えばDM4が存在する。好ましい実施形態では、1分子の抗体に結合する、平均約3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9又は 4.0分子のマイタンシノイド、例えばDM4が存在する。特に好ましい実施形態では、本発明の抗Cripto抗体−マイタンシノイド結合体は、1分子の抗体に結合する、平均約3.5分子のマイタンシノイド、例えばDM4を有する。1つの実施形態では、少なくとも約50％の本発明の抗Cripto抗体−マイタンシノイド結合体が、2、3又は4分子のマイタンシノイド、例えばDM4を有する。
細胞毒性剤の他の好ましいクラスとしては、例えば、薬物のアントラサイクリンファミリー、ビンカ薬、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞毒性ヌクレオシド、薬物のプテリジンファミリー、ジイネン、及びポドフィロトキシンが挙げられる。これらのクラスの特に有用なメンバーとしては、例えばアドリアマイシン、カルミノマイシン、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、ドキソルビシン、アミノプテリン、メトトレキサート、メトプテリン、ミトラマイシン、ストレプトニグリン、ジクロロメトトレキサート、マイトマイシンC、アクチノマイシン−D、ポルフィロマイシン、5−フルオロウラシル、フロクスウリジン、フトラフール、6−メルカプトプリン、シタラビン、シトシンアラビノシド、ポドフィロトキシン、又はエトポシド若しくはエトポシドホスフェートのようなポドフィロトキシン誘導体、メルファラン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ロイロシジン、ビンデシン、ロイロシン等が挙げられる。本明細書の教示と適合する更に他の細胞毒としては、タキソール、タキサン、サイトカラシンB、グラミシジンD、エチジウムブロミド、エメチン、テノポシド、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトザントロン、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、並びにピューロマイシン及びその類似体又はホモログが挙げられる。コルチコステロイド、例えばプレドニゾン、プロゲスチン、例えばヒドロキシプロゲステロン又はメドロプロゲステロン、エストロゲン、例えばジエチルスチルベストロール、アンチエストロゲン、例えばタモキシフェン、アンドロゲン、例えばテストステロン、及びアロマターゼ阻害剤、例えばアミノグルテチミドのようなホルモン及びホルモン拮抗剤も本明細書の教示と適合する。上述のように、当業者は、本発明の結合体を調製する目的にとって、その化合物の反応をより好都合にするために、所望の化合物への化学修飾を行ってよい。
特に好ましい細胞毒の1例は、カリケアマイシン、エスペラマイシン又はジネマイシンを含む、抗腫瘍抗生物質のエンジインファミリのメンバー又は誘導体を含む。これらの毒素はきわめて強力であり、核DNAを切断することによって作用して、細胞死をもたらす。インビボで切断されて、多くの不活性であるが、免疫原性であるポリペプチド断片を与えることができるタンパク毒素とは異なり、カリケアマイシン、エスペラマイシン及び他のエンジインのような毒素は、本質的に非免疫原性である小分子である。これらの非ペプチド毒素は、モノクローナル抗体及び他の分子を標識するために既に使用されている技術によって、二量体又は四量体に化学的に連結される。これらの連結技術は、コンストラクトのFc部分のみに存在するN連結型糖残基を介する部位特異的連結を含む。このような部位特異的連結方法は、コンストラクトの結合特性に対する連結の考えられる作用を低下させる利点を有する。
他の細胞毒の中で、ポリペプチドは、リシンサブユニットA、アブリン、ジフテリア毒素、ボツリヌス、シアンジノシン、サキシトキシン、志賀毒素、破傷風、テトロドトキシン、トリコテシン、ベルクロゲン（verrucologen）又は毒性酵素のような生体毒素とも結合できることが理解されるであろう。好ましくは、このようなコンストラクトは、抗体−毒性コンストラクトの直接発現を可能にする遺伝子操作技術を使用して作製される。本発明の本発明のポリペプチドに結合できる他の生体応答調節物質は、リンホカイン及びインターフェロンのようなサイトカインを含む。本開示を考慮すると、当業者が従来の技術を使用してこのようなコンストラクトを容易に形成できることが提起される。
開示したポリペプチドと併用できる適合する細胞毒の別のクラスは、腫瘍又は免疫反応性細胞を有効に対象とすることができる放射線増感薬である。このような薬物は、電離放射線に対する感受性を向上させ、それにより放射線療法の有効性を上昇させる。腫瘍細胞によって内部移行された抗体結合体は、放射線増感剤を、放射線増感が最大となる核により近づける。未結合の放射線増感剤が連結された本発明のポリペプチドは血液から迅速に排除され、残りの放射性増感剤は標的腫瘍に局在化し、正常組織における取り込みは最小限に抑える。血液からの迅速な排除の後、補助放射線療法は、3つの方法：1.)腫瘍を特異的に対象とする外部ビーム照射、2.)腫瘍に直接注入された放射能、又は3.)同じ標的化抗体を用いた全身放射免疫療法のうち1つで投与される。この手法の潜在的に魅力的な変形は、治療用放射性同位体を放射線増感された免疫結合体に結合させ、それにより患者に単一の薬物を投与するという利便性をもたらすものである。
1つの実施形態では、ポリペプチドの安定性又は有効性を向上させる部分は結合されてよい。例えば1つの実施形態では、PEGを本発明のポリペプチドに結合させて、そのインビボでの半減期を延長することができる。Leong, S.R., et al. 2001. Cytokine 16:106; 2002；Adv. in Drug Deliv. Rev. 54:531又はWeir et al. 2002. Biochem. Soc. Transactions 30:512。
以前に暗示したように、適合する細胞毒はプロドラッグを含んでよい。本明細書で使用するとき、用語「プロドラッグ」は、親薬物と比較して腫瘍細胞に対する細胞毒性が低く、酵素的に活性化できる又はより活性な親形に変換できる薬剤的に活性な物質の前駆体又は誘導体形を指す。本発明に適合するプロドラッグとしては、ホスフェート含有プロドラッグ、チオホスフェート含有プロドラッグ、サルフェート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、所望により置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ又は所望により置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、5−フルオロシトシン及び、より活性の強い細胞毒性遊離薬物に変換することができる他の5−フルオロウリジンプロドラッグが挙げられるが、これらに限定されない。1つの実施形態では、マイタンシノイドのような細胞毒性剤は、ジスルフィド結合の加水分解により放出されるプロドラッグとして投与される。本発明で使用するためのプロドラッグ形に誘導体化できる細胞毒性薬の更なる例は、上述したこれらの化学療法剤を含む。
VI.結合分子の投与
本発明のポリペプチドを調製して、被験体に投与する方法は、当業者に周知である、又は当業者によって容易に決定される。本発明のポリペプチドの投与経路は、経口、非経口、吸入又は局所的であってよい。用語非経口は、本明細書で使用するとき、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸又は膣投与を含む。非経口投与の静脈内、動脈内、皮下及び筋肉内形が一般的に好ましい。これら全ての投与形は、明らかに本発明の範囲内であると考えられるが、投与形は、注射用、具体的には、静脈内若しくは動脈内注射又は点滴用の溶液である。通常、注射に好適な医薬品組成物は、緩衝剤（例えば酢酸塩、リン酸塩、又はクエン酸塩緩衝液）、界面活性剤（例えばポリソルベート）、所望により安定剤（例えばヒトアルブミン）等を含んでよい。しかしながら、本明細書の教示と適合する他の方法では、ポリペプチドは有害細胞集団の部位へ直接送達されて、それにより罹患組織の治療剤への曝露を増大させることができる。
非経口投与のための製剤としては、滅菌水溶液又は非水溶液、懸濁剤、及びエマルションが挙げられる。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、及びオレイン酸エチルのような注射用有機エステルが挙げられる。水性キャリアとしては、生理食塩水及び緩衝媒体を含む、水、アルコール性／水性溶液、エマルション又は懸濁液を含む。本発明において、薬剤的に許容可能なキャリアとしては、0.01〜0.1M及び好ましくは0.05Mのリン酸塩緩衝液又は0.8%食塩水が挙げられるが、これらに限定されない。他の一般的な非経口賦形剤としては、リン酸ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル、又は固定油が挙げられる。静脈内賦形剤としては、流体及び栄養補充剤、電解質補充剤、例えばリンゲルデキストロースに基づくもの等が挙げられる。例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガス等のような、防腐剤及び他の添加剤が存在してもよい。より具体的には、注射用途に好適な医薬品組成物としては、滅菌水溶液（水溶性の場合）、又は滅菌注射用溶液又は分散液の即時調製のための分散剤及び滅菌粉剤が挙げられる。このような場合には、組成物を滅菌しなくてはならず、容易な注射性（syringability）が存在する程度まで流体であるべきである。それは製造及び保管条件下で安定であるべきであり、好ましくは、細菌及び真菌のような微生物の汚染作用から保護される。キャリアは、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）を含む溶媒または分散媒、及びこれらの好適な混合物であってよい。適切な流動性は、レシチンのようなコーティングの使用により、分散剤の場合には要求された粒径の維持により、及び界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成できる。多くの場合、組成物に等張剤、例えば糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、組成物に吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含むことによってもたらすことができる。
いずれの場合にも、滅菌注射用溶液は、必要量の活性化合物（例えばポリペプチド単独、又は他の活性剤と組合せて）を、本明細書で列挙した成分の1種又は組合せを含む適切な溶媒に組み込むことにより調製でき、必要に応じて、続いて濾過滅菌を行う。一般的に、分散剤は、活性化合物を、基礎分散媒及び上に列挙した必要な他の成分を含有する滅菌賦形剤に組み込むことにより調製される。滅菌注射用液剤の調製のための滅菌粉剤の場合、好ましい調製方法は真空乾燥及び凍結乾燥であり、それにより活性成分に、その以前に滅菌濾過した溶液からの任意の追加の所望成分を加えたものの粉末が得られる。注射用製剤は当該技術分野において既知の方法に従って、加工され、アンプル、袋、瓶、注射器又はバイアルのような容器に充填されて、無菌条件下で密封される。更に、製剤は包装され、そのそれぞれが参照することにより本明細書に組み込まれる同時係属米国出願第09/259,337号及び同第09/259,338号に記載されているようなキットの形で販売される。このような製品は、好ましくは、関連組成物が自己免疫又は腫瘍性疾患に罹患している、又は罹患しやすい被験体を治療するために有用であることを示すラベル又はパッケージ挿入物を有する。
上述の状態の治療のための、本発明の組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬物、及び治療が予防的であるか治療的であるかを含む、多くの異なる因子に応じて変化する。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳類を含む非ヒト哺乳類を治療することもできる。治療用量は、安全性及び有効性を最適化するために、当業者に既知の通常の方法を使用して用量設定できる。
抗体による受動免疫のために、用量は、例えば宿主体重の約0.0001〜100mg/kg、より通常には0.01〜50mg/kg、更により通常には0.1〜40mg/kg（例えば0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、4 mg/kg、8 mg/kg等）の範囲であり得る。例えば用量は、1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg又は50mg/kg体重であってよく、又は1〜50mg/kgの範囲内の任意の用量、好ましくは少なくとも1mg/kgであってよい。上記範囲の中間の用量も、本発明の範囲内であると意図される。
用量はまた、例えば、0.0037〜3700mg/m2、より通常には0.37〜1850mg/m2、更により通常には3.7mg/m2〜1480mg/ m2の範囲であり得る。用量はまた、例えば、1〜1000mg/m2、より通常には6mg/m2〜500mg/m2、より通常には10mg/m2〜200mg/m2、より通常には20〜80mg/m2、更により通常には50〜75mg/m2、最も通常には60〜70mg/m2の範囲でもあり得る。用量はまた、24〜90mg/m2の範囲でもあり得る。上記範囲の中間の用量も、本発明の範囲内であると意図される。
被験体には、このような用量を毎日、又は1日おきに、毎週又は実証的分析によって決定された任意の他のスケジュールに従って投与することができる。代表的な治療は、例えば少なくとも6ヶ月の長期間にわたる、複数回の用量での投与を必要とする。追加の代表的な治療計画は、2週間毎（隔週）に1回、3週間毎に1回、4週間毎に1回、又は毎月1回、又は3〜6ヶ月毎1回の投与を必要とする。本発明の1つの実施形態では、代表的な治療計画は、（例えば、マイタンシノイドに結合したヒト化抗Cripto抗体、例えばB3F6.1-DM4の）3週間毎に1回の投与を必要とする。特に好ましい実施形態では、（例えば、マイタンシノイドに結合したヒト化抗Cripto抗体、例えばB3F6.1-DM4の）3週間毎に1回の代表的な投与計画が、結腸癌の治療に特に有用である。別の実施形態では、代表的な治療計画は、（例えば、マイタンシノイドに結合したヒト化抗Cripto抗体、例えばB3F6.1-DM4の）単回用量での投与を必要とする。好ましい実施形態では、（例えば、マイタンシノイドに結合したヒト化抗Cripto抗体、例えばB3F6.1-DM4の）単回用量の代表的な治療計画は、確立した又は進行した腫瘍の治療に特に有用である。特に好ましい実施形態では、（例えば、マイタンシノイドに結合したヒト化抗Cripto抗体、例えばB3F6.1-DM4の）単回用量の代表的な治療計画は、確立した又は進行した結腸腫瘍の治療に特に有用である。
代表的な投与スケジュールとしては、例えば、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg又は40mg/kgでの単回用量の投与が挙げられる。代表的な投薬スケジュールとしては更に、例えば、25〜40mg/kgでの隔週の投与量が挙げられる。投薬スケジュールとしては、例えば、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg又は40mg/kgでの隔週の投与量が挙げられる。1つの実施形態では、代表的な投薬スケジュールとしては、3週間毎に1回投与される、例えば25〜40mg/kgの用量が挙げられる。1つの実施形態では、代表的な投薬スケジュールとしては、3週間毎に1回投与される、例えば、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg又は40mg/kgの用量が挙げられる。上記範囲の中間の用量もまた、本発明の範囲内であると意図される。いくつかの方法では、異なる結合特異性を有する2種以上のモノクローナル抗体を同時に投与し、この場合投与されるそれぞれの抗体の用量は、指示した範囲内に含まれてよい。
本明細書に記載するような代表的な用量は、被験体の体表面積(BSA)あたりに投与される結合分子の量（例えば、ミリグラムで）、例えばmg/m2として表すこともできることを、当業者は理解するであろう。被験体の体表面積は、当該技術分野において既知の方法に従って算出できる。例えば、体表面積は、以下のモステラー（Mosteller）式を用いて算出してもよい。
BSA(m2)=([高さ(cm)×重量(kg)]/3600)1/2
デュボイス（DuBois）及びデュボイス式、ヘイコック（Haycock）式、ゲーハン及びジョージ（Gehan and George）式、並びにボイド（Boyd）式を含む、BSAを算出するための他の方法も、当該技術分野において既知である。任意の所与の種においてmg/kgで表された用量は、用量にその種の適切な「表面積対重量比」（km）を乗じることにより、mg/m2の等価用量に変換できる。代表的な種のkm因子としては、以下のものが挙げられる：マウスでは3.0kg/m2、ラットでは5.9kg/m2、サルでは12kg/m2、イヌでは20kg/m2、ヒトの小児では25kg/m2、及びヒトの成人では37kg/m2（例えば、Freireich, EJ et al. Cancer Chemother. Rep. 1966 50(4):219-244を参照のこと）。したがって、例えば、ヒトの成人では、100 mg/kgの用量は、100mg/kg×37kg/m2 = 3700mg/ m2と等価である。
1つの実施形態では、本発明の結合分子は、複数の機会に投与できる。1回の投薬の間隔は例えば毎日、毎週、隔週、3週間毎、毎月、又は毎年であってよい。間隔はまた、患者のポリペプチド又は標的分子の血中濃度を測定することによって示されるように、不規則でもよい。いくつかの方法では、用量は、特定の血漿結合分子又は毒素濃度、例えば1〜1000μg/ml又は25〜300μg/mlを達成するために調整される。あるいは、結合分子は持続放出製剤としても投与でき、この場合、より頻度の低い投与が必要とされる。用量及び頻度は、患者内での抗体の半減期に応じて変化する。一般に、ヒト化抗体は最長半減期を示し、キメラ抗体及び非ヒト抗体がそれに続く。1つの実施形態では、本発明のヒト化抗体（例えば、結合化されたヒト化抗体、例えばB3F6.1-DM4）の半減期は、約100時間、又は約4.2日である。1つの実施形態では、本発明の結合分子は、非結合形で、1回又は複数回投与できる。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、結合形で、1回又は複数回投与できる。更に別の実施形態では、本発明の結合分子は、非結合形で、次に結合形で1回又は複数回投与することができ、又は逆も同様である。
投与の用量及び頻度は、例えば、治療が早期悪性疾患に対するものであるか、末期悪性疾患に対するものであるかどうかに応じて、変動し得る。1つの用途では、本抗体又はそのカクテルを含有する組成物は、より少ない用量で投与される。この用途では、正確な量は再度、患者の健康及び全身免疫の状態に応じて決定するが、一般的に0.1〜25mg／用量、特に0.5〜2.5mg／用量の範囲である。比較的少ない用量が、比較的稀な間隔で長期間にわたって投与される。一部の患者は、その残りの生涯にわたって治療を受け続ける。
他の治療用途では、疾患の進行が減速又は終止するまで、好ましくは患者が疾患症状の部分的又は完全な回復を示すまで、時に比較的短い間隔で、比較的多い用量（例えば用量あたり約1〜400mg/kgの結合分子（例えば抗体）、放射性免疫結合体では5〜25 mg/kgの用量がより一般的に使用され、細胞毒−薬物結合分子ではより多い用量、例えば5〜50mg/kgである）が必要である。その後、患者にはより少ない投与計画で投与してよい。
1つの実施形態では、本発明の結合分子（例えば、DM4のようなマイタンシノイドに結合したヒト化抗Cripto抗体）を、確立した腫瘍、例えば比較的大きなサイズの腫瘍を有する患者に投与することができる。1つの実施形態では、本発明の結合分子（例えば、DM4のようなマイタンシノイドに結合したヒト化抗Cripto抗体）を、進行した腫瘍、例えば再発（recurrant）腫瘍又は耐性腫瘍、例えば他の治療に応答しない腫瘍を有する患者に投与することができる。このような治療用途では、単回用量（例えば、約1〜100 mg/kg、5〜50 mg/kg、より好ましくは約10〜40 mg/kg、更により好ましくは15〜30 mg/kg、例えば15 mg/kg、20 mg/kg、25 mg/kg及び30 mg/kgが挙げられる上記用量の中間用量を含む）を投与することができる。
1つの実施形態では、本発明の結合分子の単回用量は、少なくとも1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、3ヶ月、6ヶ月又はそれを超えて維持される、抗腫瘍応答を生じさせる。1つの実施形態では、本発明の結合分子の複数回用量、例えば、隔週の用量、又は3週間毎に１回の用量は、少なくとも1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、3ヶ月、6ヶ月又はそれを超えて維持される、抗腫瘍応答を生じさせる。
1つの実施形態では、被験体は、（例えばベクター内で）本発明の結合分子をコードする核酸分子によって治療できる。ポリペプチドをコードする核酸の用量は、患者あたりDNA約10ng〜1g、100ng〜100mg、1μg〜10mg、又は30〜300μgの範囲である。感染性ウィルスベクターに対する用量は、用量あたり10〜100ビリオン、又はそれを超えて変動する。
治療剤は、非経口、局所的、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内又は筋肉内手段により、予防的及び／又は治療的処置のために投与できる。抗体の投与には、筋肉内注射又は静脈内注射が好ましい。いくつかの方法では、特定の治療用抗体を頭蓋に直接注射する。いくつかの方法では、抗体は、Medipad（商標）デバイスのような、持続放出組成物又はデバイスとして投与される。
A.他の薬剤と組み合わせた投与
本発明の薬剤は所望により、治療の必要がある疾患又は状態を治療するのに有効である（例えば予防的又は治療的）他の薬剤と組合せて投与することができる。好ましい追加の薬剤は、当該技術分野において認識され、特定の疾患に対して標準的に投与される薬剤である。
本発明の90Y標識ポリペプチドの有効な単回治療用量（すなわち治療的に有効な量）は、約5〜約75mCi、より好ましくは約10〜約40mCiの範囲である。131I標識抗体の有効な単回治療非骨髄破壊的用量は、約5〜約70mCi、より好ましくは約5〜約40mCiの範囲である。131I標識抗体の有効な単回治療破壊的用量（すなわち自家骨髄移植を必要とする場合がある）は、約30〜約600mCi、より好ましくは約50〜約500mCi未満の範囲である。キメラ抗体と併せて、マウス抗体と比べて循環半減期がより長いために、ヨウ素131標識キメラ抗体の有効な単回治療非骨髄破壊的用量は、約5〜約40mCi、より好ましくは約30mCi未満の範囲である。例えば111In標識の撮像基準は、典型的には、約5mCi未満である。
131I及び90Yでは多くの臨床経験が得られているが、他の放射性標識も当該技術分野において既知であり、同様の目的に使用されている。更に他の放射性同位体が撮像に使用される。例えば本発明の範囲に適合する追加の放射性同位体としては、123I、125I、32P、57Co、64Cu、67Cu、77Br、81Rb、81Kr、87Sr、113In、127Cs、129Cs、132I、197Hg、203Pb、206Bi、177Lu、186Re、212Pb、212Bi、47Sc、105Rh、109Pd、153Sm、188Re、199Au、225Ac、211At、及び213Biが挙げられるが、これらに限定されない。この点でアルファ、ガンマ及びベータ放射体は本発明に全て適合する。更に本開示を考慮して、当業者は、過度の実験をすることなく選択した治療コースと適合する放射性核種を容易に決定できることが提起される。このために、既に臨床診断に使用されている追加の放射性核種としては、125I、123I、99Tc、43K、52Fe、67Ga、68Gaに加えて、111Inが挙げられる。抗体はまた、標的化免疫療法での潜在的使用のために種々の放射性核種によって標識もされている（Peirersz et al. Immunol. Cell Biol. 65: 111-125 (1987)）。これらの放射性核種は、188Re及び186Reに加えて、より少ない程度の199Au及び67Cuも含む。米国特許第5,460,785号は、このような放射性同位体に関する追加のデータを提供し、それは参照することにより本明細書に組み込まれる。
本発明の結合分子が結合形で使用されるか又は非結合形で使用されるかどうかにかかわらず、本発明の主な利点は、骨髄抑制患者、特に放射線療法若しくは化学療法のような補助療法を受けている、又は受けていた患者でこれらのポリペプチドを使用する能力であることが理解されるであろう。他の好ましい実施形態では、ポリペプチド（ここでも、結合又は非結合形）は、化学療法剤を用いた複合治療計画で使用できる。当業者は、このような治療計画が、開示した抗体及び1種以上の化学療法剤の連続した、同時の、並行した又は同じ時間にわたる投与を含んでよいことを理解するであろう。本発明のこの態様の特に好ましい実施形態は、例えばD4マイタンシノイドのようなマイタンシノイドに結合した、毒素結合結合分子の投与を含む。
結合分子はすぐ上で述べたように投与できるが、他の実施形態では、結合及び非結合ポリペプチドは、別の方法で健康な患者に第1選択治療剤として投与できることを強調しなければならない。このような実施形態では、ポリペプチドは正常又は平均赤色骨髄予備能を有する患者に、並びに／又は外部ビーム照射若しくは化学療法のような補助療法を受けなかった、及び受けていない患者に投与することができる。
しかしながら上述したように、本発明の選択した実施形態は、骨髄抑制患者への、又は放射線療法若しくは化学療法のような1種以上の補助療法と組合せた若しくは併用した、ポリペプチドの投与（すなわち複合治療計画）を含む。本明細書で使用するとき、補助療法と併用した又は組合せたポリペプチドの投与は、治療及び開示したポリペプチドの連続した、同時の、同じ時間にわたる、並行した、付随の又は同時の投与又は適用を意味する。当業者は、複合治療計画の種々の構成要素の投与又は適用は、治療の全体的な有効性を向上させるために時間調節できることを理解するであろう。例えば化学療法剤は、本発明の放射性免疫結合体の数週間後以内に、標準的な周知の治療コースで投与できる。反対に、細胞毒結合ポリペプチドは、腫瘍局在化外部ビーム照射に続いて静脈内投与できる。更に他の実施形態では、ポリペプチドは、1種以上の選択された化学療法剤を1回の外来診療で並行投与してもよい。当業者（例えば熟練の腫瘍専門医）は、選択した補助療法及び本明細書の教示に基づいて、過度の実験をすることなく有効な複合治療計画を容易に識別できるであろう。
この点で、ポリペプチド（結合又は非結合のいずれか）及び化学療法剤の組合せを任意の順序で、患者に治療上の利益をもたらす任意の時間枠で投与できることが理解されるであろう。つまり、化学療法剤及びポリペプチドは任意の順序で、又は並行に投与できる。選択した実施形態では、本発明のポリペプチドは、以前に化学療法を受けた患者に投与される。更に他の実施形態では、ポリペプチド及び化学療法治療は、実質的に同時又は並行に投与される。例えば患者には、一連の化学療法を受けながら結合分子を与えることができる。好ましい実施形態では、結合分子はいずれかの化学療法剤又は治療から1年以内に投与される。他の好ましい実施形態では、ポリペプチドはいずれかの化学療法剤又は治療から10、8、6、4、又は2ヶ月間以内に投与される。更に他の好ましい実施形態では、ポリペプチドはいずれかの化学療法剤又は治療から4、3、2又は1週間以内に投与される。更に他の実施形態では、ポリペプチドは選択した化学療法剤又は治療から5、4、3、2又は1日以内に投与される。患者に2種の薬剤又は治療をおよそ数時間又は数分以内に（すなわち実質的に同時に）投与できることが更に理解されるであろう。
更に、本発明により、骨髄抑制患者は、血球数の低下を示す任意の患者を意味すると見なされるものとする。当業者は、骨髄抑制の臨床指標として慣習的に使用される複数の血球数パラメータが存在し、患者において骨髄抑制が発生している程度を容易に測定できることを理解するであろう。当該技術分野において受け入れられている骨髄抑制測定の例は、絶対好中球数（ANC）又は血小板数である。このような骨髄抑制又は部分的骨髄破壊は、おそらく種々の生化学疾患又は疾病の結果、又はそれどころか、従来の化学療法又は放射線療法の結果であり得る。この点で当業者は、従来の化学療法を受けた患者が典型的には、赤色骨髄予備能の低下を示すことを理解するであろう。上述したように、このような被験体は、死亡率又は罹患率の上昇を引き起こす貧血又は免疫抑制のような許容できない副作用のために、最適レベルの細胞毒（すなわち放射性核種）を使用して治療できないことが多い。
1つの実施形態では、本発明の結合分子（結合又は非結合のいずれか）は、追加の薬剤、例えば化学療法剤、例えば代謝拮抗物質と組み合わせて投与される。1つの実施形態では、結合分子は、単独で腫瘍細胞の増殖を阻害するよう作用するよりも、追加の薬剤と組み合わせた方がより良好に機能又は作用する（例えば、相加的に又は相乗的に）。この実施形態では、追加の薬剤、例えば化学療法剤と組み合わせた結合分子の投与は、結合分子又は追加の薬剤、例えば化学療法剤のいずれかのみの投与よりも有効に腫瘍細胞の増殖を阻害する。好ましくは、併用療法は、例えば50%、60%、70%、80%、90%、95%又はそれを超えて、腫瘍の増殖を阻害する。当業者は、使用される追加の薬剤に応じて、これらの計画にふさわしい標準的な用量及びスケジューリングを容易に決定できるであろう。1つの実施形態では、追加の薬剤は、代謝拮抗物質、例えばピリミジン類似体、例えば5’-フルオロウラシルである。1つの実施形態では、追加の薬剤は、ピリミジン類似体、例えば5’-フルオロウラシルである。1つの実施形態では、追加の薬剤は、ピリミジン類似体、例えば5’-フルオロウラシルであり、結合分子（例えばB3F6.1）は、マイタンシノイド、例えばDM4のような毒素に結合する。1つの実施形態では、5’-フルオロウラシルは、30mg/kgの用量で投与される。1つの実施形態では、5’-フルオロウラシルは、最大耐容性用量で投与される。1つの実施形態では、5’-フルオロウラシルは、30mg/kgの用量で投与され、結合分子、例えばマイタンシノイド（例えばDM4）に結合したヒト化抗Cripto抗体は、15mg/kgの用量で投与される。本発明の結合分子（例えば、マイタンシノイド、例えばDM4のような毒素に結合した本発明の結合分子）と、ピリミジン類似体、例えば5’-フルオロウラシルのような代謝拮抗物質との併用投与は、結腸癌の治療に特に有用である。好ましい実施形態では、マイタンシノイド（例えばDM4）に結合したヒト化抗Cripto抗体は、結腸癌の治療のために、5’フルオロウラシルと組み合わせて投与される。
より具体的には、本発明の結合又は非結合ポリペプチドを使用して、約2000/mm3未満の ANC及び約150,000/mm3未満の血小板数を有する患者を有効に治療することができる。より好ましくは、本発明のポリペプチドを使用して、約1500/mm3未満、約1000/mm3未満、又は更により好ましくは約500/mm3未満のANCを有する患者を治療できる。同様に、本発明のポリペプチドを使用して、約75,000/mm3未満、約50,000/mm3未満、又は更には約10,000/mm3未満の血小板数を有する患者を治療できる。より一般的な意味で、当業者は、政府実施指針及び手順を使用していつ患者に骨髄抑制するかを容易に決定できるであろう。
上で示したように、多くの骨髄抑制患者が化学療法、注入放射線療法又は外部ビーム放射線療法を含む治療コースを受けている。後者の場合、外部放射線源は悪性疾患の局所照射用である。放射線療法注入法は、放射性試薬を悪性腫瘍内に外科的に配置して、それにより疾患部位に選択的に照射する。いずれの場合にも、開示したポリペプチドを使用して、原因にかかわらず、骨髄抑制を示す患者の障害を治療することができる。
この点で本発明のポリペプチドは、インビボでの新生物形成細胞の増殖を消滅、減少、阻害又は制御するいずれかの化学療法剤若しくは薬剤と併用して、又は組合せて（例えば複合治療計画を提供するために）使用できることが更に理解されるであろう。上述したように、このような薬剤は赤色骨髄予備能の減少を引き起こすことが多い。この減少の全部又は一部を、このような患者における新形成の積極的な治療を好都合に可能にする、骨髄毒性の低下した本発明の化合物によって相殺することができる。他の好ましい実施形態では、本明細書で開示する放射性標識された免疫結合体は、新生物形成細胞の放射性核種に対する感受性を向上させる放射線増感剤と共に有効に使用できる。例えば、放射線増感化合物は、放射性標識された結合分子が血流から大部分排除された後であるが、1つ又は複数の腫瘍の部位に治療的に有効なレベルで依然として残存している間に、投与できる。
本発明のこれらの態様に関して、本発明に適合する代表的な化学療法剤としては、アルキル化剤、ビンカアルカロイド（例えばビンクリスチン及びビンブラスチン）、プロカルバジン、メトトレキサート及びプレドニゾンが挙げられる。4種の薬物の組合せであるMOPP（メクロレタミン（mechlethamine）（ナイトロジェンマスタード）、ビンクリスチン（オンコビン）、プロカルバジン及びプレドニゾン）は、種々のリンパ腫を治療するに非常に有効であり、本発明の好ましい実施形態を含む。MOPP耐性患者では、ABVD（例えばアドリアマイシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン及びダカルバジン）、Ch1VPP（クロランブシル、ビンブラスチン、プロカルバジン及びプレドニゾン）、CABS（ロムスチン、ドキソルビシン、ブレオマイシン及びストレプトゾトシン）、MOPP及びABVD、MOPP及びABV（ドキソルビシン、ブレオマイシン及びビンブラスチン）又はBCVPP（カルムスチン、シクロホスファミド、ビンブラスチン、プロカルバジン及びプレドニゾン）の組合せを使用することができる。Arnold S. Freedman and Lee M. Nadler, Malignant Lymphomas, in Harrison's Principles of Internal Medicine 1774-1788 (Kurt J. Isselbacher et al., eds., 13th ed. 1994) 及びV. T. DeVita et al., (1997)、並びに標準的な投薬及びスケジューリングのために本明細書に引用した参考文献。これらの治療は変更せずに使用できる、又は特定の患者のために必要に応じて、本明細書に記載のような1種以上の本発明のポリペプチドと組合せて変更できる。
本発明の状況で有用である追加の計画は、代謝拮抗物質の使用を含む。用語「代謝拮抗物質」は、本明細書で使用するとき、葉酸類似体、プリン類似体及びピリミジン類似体が挙げられるが、これらに限定されない。葉酸類似体の非限定的な例としては、例えば、メトトレキサート、ペメトレキセド、及びラルチトレキセドが挙げられる。プリン類似体の非限定的な例としては、例えば、アザチオプリン、6-メルカプトプリン、メルカプトプリン、チオグアニン、フルダラビン、ペントスタチン及びクラドリビンが挙げられる。ピリミジン類似体の非限定的な例としては、例えば、5’-フルオロウラシル、フロクスウリジン、及びシトシンアラビノシドが挙げられる。本発明の好ましい代謝拮抗物質は、ピリミジン類似体である。当業者は、これらの計画のそれぞれに対して、標準的な用量及びスケジュールを容易に決定できるであろう。
本発明の状況で有用である追加の計画は、シクロホスファミド若しくはクロランブシルのような単一のアルキル化剤、又はCVP（シクロホスファミド、ビンクリスチン及びプレドニゾン）、CHOP（CVP及びドキソルビシン）、C−MOPP（シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン及びプロカルバジン）、CAP−BOP（CHOP及びプロカルバジン並びにブレオマイシン）、m−BACOD（CHOP及びメトトレキサート、ブレオマイシン並びにロイコボリン）、ProMACE−MOPP（プレドニゾン、メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド並びにロイコボリン及び標準MOPP）、ProMACE−CytaBOM（プレドニゾン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド、シタラビン、ブレオマイシン、ビンクリスチン、メトトレキサート及びロイコボリン）及びMACOP−B（メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、固定用量プレドニゾン、ブレオマイシン及びロイコボリン）のような組合せの使用を含む。当業者は、これらの計画のそれぞれに対して、標準的な用量及びスケジュールを容易に決定できるであろう。CHOPはまた、ブレオマイシン、メトトレキサート、プロカルバジン、ナイトロジェンマスタード、シトシンアラビノシド及びエトポシドとも組合せられている。他の適合する化学療法剤としては、2-クロロデオキシアデノシン（2-CDA）、2'-デオキシコホルマイシン及びフルダラビンが挙げられるが、これらに限定されない。
寛解を達成できなかった又は再発した、中及び高悪性度NHLを有する患者には、救済療法が使用される。救済療法には、単独又は組合せで投与されるシトシンアラビノシド、シスプラチン、エトポシド及びイホスファミドのような薬物を使用する。特定の腫瘍性疾患の再発又は攻撃的形では、以下のプロトコル：IMVP−16（イホスファミド、メトトレキサート及びエトポシド）、MIME（メチル−gag、イホスファミド、メトトレキサート及びエトポシド）、DHAP（デキサメタゾン、高用量シタラビン及びシスプラチン）、ESHAP（エトポシド、メチルプレジソロン（ｍｅｔｈｙｐｒｅｄｉｓｏｌｏｎｅ）、HDシタラビン、シスプラチン）、CEPP（B）（シクロホスファミド、エトポシド、プロカルバジン、プレドニゾン及びブレオマイシン）及びCAMP（ロムスチン、ミトキサントロン、シタラビン及びプレドニゾン）が、それぞれ周知の投与速度及びスケジュールを用いて使用されることが多い。
本発明のポリペプチドと組み合わせて使用される化学療法剤の量は、被験体によって変化してもよく、又は当該技術分野において既知のことに従って投与してもよい。例えばBruce A Chabner et al., Antineoplastic Agents, in Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics 1233-1287 ((Joel G. Hardman et al., eds., 9th ed. 1996)を参照のこと。1つの実施形態では、本発明のポリペプチドと組み合わせて用いられる化学療法剤は、最大耐量で投与してもよい。
1つの実施形態では、本発明の結合分子は、例えば予防治療として原発性腫瘍、転移又は前癌増殖若しくは組織を除去するために、外科処置を受けた、受けている、又は受けるであろう被験体に投与してよい。
別の実施形態では、本発明の結合分子は生物薬と併せて投与される。癌の治療に有用な生物薬は当該技術分野において既知であり、本発明の結合分子は例えばこのような既知の生物薬と併せて用途してよい。
例えばFDAは、乳癌の治療のために次の生物薬を認可している：Herceptin（登録商標）（トラスツズマブ、Genentech Inc., South San Francisco, CA；HER2陽性乳癌で抗腫瘍活性を有するヒト化モノクローナル抗体）；Faslodex（登録商標）（フルベストラント、AstraZeneca Pharmaceuticals, LP, Wilmington, DE；乳癌を治療するために使用されるエストロゲン受容体拮抗剤）；Arimidex（登録商標）（アナストロゾール、AstraZeneca Pharmaceuticals, LP；エストロゲンを作製するために必要な酵素である、アロマターゼを遮断する非ステロイド性アロマターゼ阻害剤）；Aromasin（登録商標）（エキセメスタン、Pfizer Inc., New York, NY；乳癌の治療で使用される不可逆性ステロイド性アロマターゼ不活性化剤）；Femara（登録商標）（レトロゾール、Novartis Pharmaceuticals, East Hanover, NJ；FDAにより認可された乳癌を治療するための非ステロイド性アロマターゼ阻害剤）；及びNolvadex（登録商標）（タモキシフェン、AstraZeneca Pharmaceuticals, LP；FDAにより認可された乳癌を治療するための非ステロイド性抗エストロゲン）。本発明の結合分子を組合せてよい他の生物薬としては：Avastin（商標）（ベバシズマブ、Genentech Inc.；血管新生を阻害するように設計された最初のFDA認可治療）；及びZevalin（登録商標）（イブリツモマブチウキセタン、Biogen Idec, Cambridge, MA；B細胞リンパ腫の治療のために現在認可されている放射性同位元素標識されたモノクローナル抗体）が挙げられる。
更にFDAは、結腸直腸癌の治療のために次の生物薬を認可している：Avastin（商標）；Erbitux（商標）（セツキシマブ、ImClone Systems Inc., New York, NY,、及びBristol-Myers Squibb, New York, NY；は、上皮増殖因子受容体（EGFR）に対するモノクローナル抗体である）；Gleevec（登録商標）（メシル酸イマチニブ；タンパク質キナーゼ阻害剤）；及びErgamisol（登録商標）（塩酸レバミゾール、Janssen Pharmaceutica Products, LP, Titusville, NJ；デュークス（Dukes）分類のC段階の結腸癌の患者での外科切除後に、5-フルオロウラシルと組合せた補助治療として、1990年にFDAによって認可された免疫調節物質）。
非ホジキンリンパ腫の治療で使用するために、現在認可されている治療としては：Bexxar（登録商標）（トシツモマブ及びヨウ素I−131トシツモマブ、GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC；放射性分子（ヨウ素I−131）に連結されたマウスモノクローナル抗体（トシツモマブ）を含む多段階治療）；Intron（登録商標）A（インターフェロンアルファ-2b、Schering Corporation, Kenilworth, NJ；アントラサイクリン含有併用化学療法と併せた、濾胞状非ホジキンリンパ腫の治療のために認可されたインターフェロンの種類（例えばシクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾン［CHOP］））；Rituxan（登録商標）（リツキシマブ、Genentech Inc., South San Francisco, CA及びBiogen Idec, Cambridge, MA；非ホジキンリンパ腫の治療のために認可されたモノクローナル抗体；Ontak（登録商標）（デニロイキンディフチトクス、Ligand Pharmaceuticals Inc., San Diego, CA；インターロイキン-2に遺伝的に融合されたジフテリア毒素の断片から成る融合タンパク質）；及びZevalin（登録商標）（イブリツモマブチウキセタン、Biogen Idec；B細胞非ホジキンリンパ腫の治療のためにFDAによって認可された放射性同位元素標識されたモノクローナル抗体）が挙げられる。
白血病の治療では、本発明の結合分子と組み合わせて使用できる代表的な生物薬としては、Gleevec（登録商標）；Campath（登録商標）-1H（アレムツズマブ、Berlex Laboratories, Richmond, CA；慢性リンパ球性白血病の治療で使用されるモノクローナル抗体の種類）が挙げられる。更に、Genasense（オブリメルセン、Genta Corporation, Berkley Heights, NJ；白血病を治療するために開発中のBCL-2アンチセンス療法を使用できる（例えば単独で、又はフルダラビン及びシクロホスファミドのような1種以上の化学療法薬と組合せて）を、本請求する結合分子と共に投与してよい。
肺癌の治療では、代表的な生物薬としては、Tarceva（商標）（エルロチニブHCL、OSI Pharmaceuticals Inc., Melville, NY；ヒト上皮増殖因子受容体1（HER1）経路を標的化するように設計された小分子）が挙げられる。
多発性骨髄腫の治療では、代表的な生物薬としては、Velcade（登録商標）Velcade（ボルテゾミブ、Millennium Pharmaceuticals, Cambridge MA；プロテアソーム阻害剤）が挙げられる。追加の生物薬としては、Thalidomid（登録商標）（サリドマイド、Clegene Corporation, Warren, NJ；免疫調節剤であり、骨髄腫細胞の増殖及び生存並びに抗血管新生を阻害する能力を含む、複数の作用を有すると考えられる）が挙げられる。
他の代表的な生物薬としては、ImClone Systems, Inc., New York, NYによって開発されたMOAB IMC−C225が挙げられる。
更に、本請求した結合分子は、抗癌免疫応答を調節するために、ワクチン又は他の薬剤（例えばサイトカイン）と併せて投与してよい。例えばMelacine（登録商標）（Corixa Corporation, Seattle, WA）は、T3N0M0切除メラノーマの治療に対して有望な結果を有することが報告されている同種腫瘍ワクチンである。GMK（登録商標）（Progenics Pharmaceutical, Inc., Tarrytown, NY）は、補助第III相薬剤として、メラノーマ再発のリスクが高い患者に投与されるガングリオシド抗原である。抗ガストリン治療ワクチン（登録商標）（Aphton Corporation, Miami, FL）は、ホルモンG17およびグリエクステネド（ｇｌｙｅｘｔｅｎｅｄ）を中和するものであり、結腸直腸、膵臓、及び胃癌の患者への第III相臨床試験中である。CeaVac（登録商標）（Titan Pharmaceuticals, Inc., South San Francisco, CA）は、結腸直腸癌で研究されている抗イディオタイプ抗体ワクチンである。最後に、Theratope（登録商標）（Biomira Inc., Edmonton, Alberta, Canada）は、転移性乳癌患者で第III相薬剤として調査されている合成炭水化物の治療ワクチンである（Pharmaceutical Research and Manufacturers of America, 2000）。
別の実施形態では、本発明の結合分子は、抗血管新生剤、例えばエンドスタチン（微小血管内皮細胞産生を停止させる内因性腫瘍由来内皮特異性阻害剤）；抗VEGF抗体；サリドマイド；又は血管の基底膜の合成及び分解を阻害するマトリクスメタロプロテイナーゼ阻害剤と併せて投与してよい。
上述したように、本発明のポリペプチド、その免疫反応性断片又は組換え体は、哺乳類の疾患のインビボでの治療に対して、治療的に有効な量で投与してよい。この点で、開示した抗体は活性剤の投与を容易にし、安定性を高めるために調合されることが理解されるであろう。好ましくは、本発明による医薬品組成物は、生理食塩水、非毒性緩衝液、防腐剤などのような薬剤的に許容可能な非毒性滅菌キャリアを含む。例えば、本発明による医薬品組成物は、pH緩衝剤としてのコハク酸、安定剤としてのL-グリシン、グリセロール及びポリソルベート80のうち任意の１種又は全て、溶媒としてのWFI及びpH調節剤としての水酸化ナトリウムを含むことができる。好ましい実施形態では、本発明の医薬品組成物は、10mMのコハク酸ナトリウム、120mMのL-グリシン、120mMのグリセロール、0.01%のポリソルベート80をpH5.0で含む。好ましくは、抗Cripto結合分子、例えばヒト化抗Cripto抗体−マイタンシノイド結合体、例えばB3F6.1-DM4は、約1 mg/ml〜約10 mg/ml、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10 mg/mlの濃度で、医薬品製剤中に存在する。好ましい実施形態では、抗Cripto結合分子、例えばヒト化抗Cripto抗体−マイタンシノイド結合体、例えばB3F6.1-DM4は、5 mg/mlの濃度で医薬品製剤中に存在する。1つの実施形態では、このような製剤は、抗体1分子あたり平均3.5分子のDM4を有する抗Cripto抗体を含む。本発明の医薬品製剤は、2℃〜8℃、例えば5℃の温度で、少なくとも12ヶ月、好ましくは少なくとも24ヶ月、最も好ましくは少なくとも36ヶ月間安定である。本発明の医薬品製剤は、25℃のような加速温度で、少なくとも3ヶ月、好ましくは少なくとも6ヶ月、より好ましくは少なくとも12ヶ月間安定である。
本出願の目的のために、治療剤へ結合した、又は結合していないポリペプチド、その免疫反応性断片又は組換え体の薬剤的に有効な量は、標的への有効な結合を達成するのに、また例えば疾患又は障害の症状を寛解させるために、又は物質若しくは細胞を検出するための利益を得るのに十分な量を意味すると見なされる。腫瘍細胞の場合、ポリペプチドは、好ましくは新生物形成の又は免疫反応性細胞の選択した免疫反応性抗原と相互作用することができ、これらの細胞死を増加させるであろう。無論、本発明の医薬品組成物は、ポリペプチドの薬剤的に有効な量を提供するために単回用量で投与してもよく、又は複数回用量で投与してもよい。
本開示の範囲に従って、本発明のポリペプチドは、上述の治療方法に従って、ヒト若しくは他の動物に治療又は予防効果を生じさせるのに十分な量投与してよい。本発明のポリペプチドは、このようなヒト又は他の動物に、既知の方法に従って、本発明の抗体を従来の薬剤的に許容可能なキャリア又は希釈剤と組合せることにより調製された従来の剤形で投与することができる。当業者は、薬剤的に許容可能なキャリア又は希釈剤の形及び特徴は、それと組合せる活性成分の量、投与経路及び他の周知の変形によって決定されることを理解するであろう。当業者は、本発明によるポリペプチドの1種以上を含むカクテルが特に有効であると立証し得ることを更に理解するであろう。
VII.使用方法
本発明の分子は、主に治療目的で使用できる。本発明の好ましい実施形態は、このような治療が必要な哺乳類被験体で、疾患、例えば新生物形成性疾患を診断及び／又は治療するための化合物、組成物、キット及び方法を提供する。好ましくは、被験体はヒトである。
本発明のポリペプチドは、多くの異なる用途で有用であろう。例えば1つの実施形態では、対象結合分子を、例えばELISAアッセイを使用してインビトロでCriptoを検出するためのアッセイで使用してよい。代表的なアッセイは当該技術分野において既知であり、例えば米国出願第20040077025号を参照のこと。
別の実施形態では、対象結合分子は撮像技術を使用してCripto保有細胞の存在を検出するために有用である。このような用途では、以下で更に記載するように、結合分子を検出可能な部分、例えば放射性標識に結合することが望ましい場合がある。
別の実施形態では、対象結合分子は、本発明の結合分子により認識される標的を有する細胞（例えばCriptoのエピトープ）を減少又は除去するために有用である。別の実施形態では、対象結合分子は、循環中の可溶性標的分子の濃度低下、又は除去に有効である。
1つの実施形態では、本発明の結合分子は腫瘍の大きさを減少させて、腫瘍の増殖を阻害し、及び／又は腫瘍保有被験体の生存時間を延長する。したがって本発明はまた、ヒト又は他の動物の腫瘍を、このようなヒト又は動物にポリペプチドの有効な非毒性量を投与することによって治療する方法にも関する。当業者は、日常の実験によって、ポリペプチドの悪性疾患を治療する目的のために有効な非毒性量を決定することができる。例えば、ポリペプチドの治療的に活性な量は、被験体の病期（例えばステージI対ステージIV）、年齢、性別、内科的合併症（例えば、免疫抑制状態又は疾患）及び被験体の体重、並びに被験体において所望の反応を誘発する抗体の能力のような要因によって変化しうる。投薬計画は、最適な治療反応を提供するために調整できる。例えば、いくつかに分割した用量を毎日投与してもよく、又は用量を治療状況の緊急性によって示されるように比例的に減少させてもよい。しかしながら、一般的には、有効用量は、約0.05〜120ミリグラム／キログラム体重／日、好ましくは約0.1〜100ミリグラム／キログラム体重／日、より好ましくは約0.5〜50ミリグラム／キログラム体重／日の範囲にあると予想される。
明確化の目的で「哺乳類」は、ヒト、家畜、及び動物園の動物、競技用動物、ペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、メウシ等を含む、哺乳類として分類される任意の動物を指す。好ましくは、哺乳類はヒトである。「治療」は、治療的処置及び予防又は防止手段の両方を指す。治療が必要な哺乳類としては、既に疾患又は障害に罹患している哺乳類に加えて、疾患又は障害を防止すべき哺乳類も挙げられる。したがって、哺乳類は、疾患又は障害を有すると診断されている、又は疾患の素因がある、若しくは疾患に罹患しやすい場合がある。
一般に、開示した発明を使用して、結合分子による癌性細胞の標的化を可能にするマーカーを含む、任意の新生物を治療的に治療できる。好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、固形腫瘍を治療するために使用される。治療できる代表的な癌としては、前立腺癌、胃癌、例えば結腸癌、結腸直腸癌、皮膚癌、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、肺癌、非小細胞肺癌、及び膵臓癌が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、本発明の抗体を使用して、カポジ肉腫、CNS新形成（毛細血管細胞芽腫、髄膜腫及び脳転移）、メラノーマ、胃腸及び腎肉腫、横紋筋肉腫、神経膠芽腫（好ましくは多形神経膠芽腫）、平滑筋肉腫、網膜芽細胞腫、卵巣の乳頭状嚢胞腺癌、ウィルムス腫瘍又は小細胞肺癌を治療できる。本開示を考慮すると、過度の実験をすることなく、上述の新形成それぞれに関連した腫瘍関連分子のための適切なポリペプチドを得られることが理解されるであろう。
開示した発明による治療に適している代表的な血液悪性疾患としては、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫に加えて、ALL-L3（バーキット型白血病）、慢性リンパ球性白血病（CLL）及び単球細胞白血病を含む白血病が挙げられる。本発明の化合物及び方法は、低悪性度／濾胞状非ホジキンリンパ腫（NHL）、細胞リンパ腫（FCC）、マントル細胞リンパ腫（MCL）、びまん性大細胞リンパ腫（DLCL）、小リンパ球性（SL）NHL、中悪性度／濾胞状NHL、中悪性度びまん性NHL、高悪性度免疫芽球性NHL、高悪性度リンパ芽球性NHL、高悪性度小非開裂細胞型NHL、巨大病変NHL及びワルデンシュトレームマクログロブリン血症を含む、種々のB細胞リンパ腫を治療するのに特に有効であることが理解されるであろう。これらのリンパ腫は、分類系の変更のために異なる名称を有することが多く、異なる名称で分類されたリンパ腫を有する患者も本発明の併用治療計画の利益を享受することが、当業者に明らかであるはずである。上述の新形成疾患に加えて、開示した発明を有利に使用して、適合性腫瘍関連分子を有する更なる悪性疾患を治療できることが理解されるであろう。
本発明の1つの実施形態では、Criptoに特異的に結合することができ、特に腫瘍増殖がアクチビンBシグナリングの消失又は低下によって仲介される場合、患者の腫瘍細胞の増殖を阻害する分子が提供される。特定の実施形態では、腫瘍細胞は、脳、頭部、頸部、前立腺、乳房、精巣、結腸、結腸直腸、肺、非小細胞肺、卵巣、膀胱、子宮、子宮内膜、子宮頸部、膵臓及び胃の腫瘍細胞である。他の実施形態では、本発明の結合分子はCriptoに特異的に結合して、Criptoを過剰発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する。1つの実施形態では、腫瘍細胞は、脳、乳房、精巣、結腸、結腸直腸、肺、非小細胞肺、卵巣、膀胱、子宮、子宮内膜、子宮頸部、膵臓及び胃癌に由来する細胞株のような、Criptoを過剰発現する細胞株である。
本発明は、制限するものとして解釈すべきでない、以下の実施例によって更に説明される。本出願を通じて引用された全ての参考文献、特許及び公開特許出願の内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
（実施例１）
毒素に結合しているヒト化B3F6抗体は、インビボモデルにおいて単回又は隔週で2回投与したとき、ヒト結腸腫瘍細胞の増殖阻害に有効である。
以下の材料及び方法をこの実施例で用いた。
マウス
6〜7週齢の218匹の雌SCIDベージュ（ｂｅｉｇｅ）(C.B.-17/IcrHsd-Prkcd Lyst Skid Beige)マウス(Harlan Sprague Dawley, Madison, WI)で、研究を開始した。動物は、腫瘍の移植前に少なくとも2日間研究室に順応させた。飼育ケースを換気したケージラックに置き、餌及び水を自由に与えた。
腫瘍モデル
原発性ヒト結腸腫瘍由来のCT-3腫瘍断片は元々、Sera Care, Inc (Oceanside, CA) (Peter Chu, Biogen Idec, San Diegoにより送られた)から入手した。連続的に移植されたインビボ異種移植株をBiogen Idec, Inc.で樹立し、第3異種移植世代由来の断片を凍結保存した。これらの凍結保存した断片(Biogen Idec cryo reg #0226)を解凍し、この研究のために移植する前に雌SCIDベージュマウスで3〜5世代、インビボ皮下連続継代した。マウスに移植された腫瘍組織のサンプルで、細菌培養を実施した。細菌学培養物（ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ｃｕｌｔｕｒｅｓ）は移植後24時間及び48時間の両方で、細菌汚染について陰性であった。
−1日目に、BioMedics動物用IDチップ (Model IMI-1000; Seaford, DE)をマウスの左側腹部に皮下移植した。0日目に、12匹のドナー動物から腫瘍を採取し、壊死組織を除去して、刻み、CT-3腫瘍の3mm3断片を各マウスの右側腹部に皮下移植した。腫瘍の大きさ及び体重測定値は、5日目から開始して少なくとも週に2回記録した。最低100mgの腫瘍が測定されたとき（15日目）、非進行性成長の腫瘍を除いて、腫瘍の大きさに基づき、マウスを治療群及び対照群にランダム化した（表1を参照）。
試験品及び正の化学療法剤
マイタンシンDM4結合体(2000-112、5.9mg/ml)を、ImmunoGen, Inc (Cambridge, MA)においてImmunoGen腫瘍活性化プロドラッグ(TAP)技術によって調製した。臨床等級のAdrucil(5-フルオロウラシル、NDC 0703-3015-11)はSicor Pharmaceuticals（ロット番号06A625、有効期限2007年7月)から入手した。
研究群及び治療計画
研究群及び治療計画を表1に記載する。賦形剤対照（10mMクエン酸塩緩衝液、pH5．5、135mM塩化ナトリウム）を、15日目に静脈内に単回投与した。25mg/kg又は40mg/kgのB3F6.1-DM4を、15日目に静脈内に単回投与した。あるいは、25mg/kg又は40mg/kgのB3F6.1-DM4を、q14dx2（2回の用量）で静脈内に投与した。全ての治療は15日目に開始した。
抗癌活性の評価
腫瘍測定値はデジタルカリパスを使用して決定した。体重及び腫瘍の大きさの測定値を5日目に記録して、研究終了まで週2回継続した。長楕円の体積を計算するための式:腫瘍体積（mm3）＝（長さ×幅2）÷2を使用して、2次元腫瘍測定値から腫瘍体積（mm3）を概算した。単位密度を仮定して、体積を重量に変換した（すなわち1mm3＝1mg）。
統計解析
各治療群及び賦形剤対照群間に何らかの統計的に有意差があるかどうかを判定するために、各研究終了時の平均腫瘍重量に対してスチューデントのt検定を実施した。
移植後の腫瘍生着率は95％であり、腫瘍重量が厳しい（ｔｉｇｈｔ）範囲の内にあるマウスを選択して治療を開始した。賦形剤対照群の腫瘍増殖は十分に、このモデルで見られる典型的な範囲内であった。
図1は、種々の計画で静脈内投与された、単回投与(25及び40mg/kg/注射)又は2回投与(25及び40mg/kg/注射)のB3F6.1-DM4の、確立したCT-3異種移植腫瘍を持つ胸腺欠損ヌードマウスにおける腫瘍重量の変化に対する影響を示す。25mg/kg/注射又は40mg/kg/注射で静脈内投与されたB3F6.1-DM4の単回投与は、5週目（49日目）まで有意に腫瘍増殖を阻害した。q14dx2で、25mg/kg/注射にてB3F6.1-DM4を静脈内投与することにより、及びq14dx2で、40mg/kg/注射にてB3F6.1-DM4を静脈内投与することにより治療した他のコホートは、研究が終了するまで（70日目）、研究を通じて（8週間）腫瘍増殖の有意な阻害を示した。これらの結果は、60〜70mg/m2の単回投与は、このインビボマウスモデルにおいて5週目まで腫瘍の後退を引き起こすことを示す。これらの結果は、更に、隔週投与されたB3F6.1-DM4の2回分の用量が、すなわちq14dx2、このインビボマウスモデルで腫瘍阻害を持続させることを示す。マウスにおけるq14dx2投与は、霊長類における3週間毎に1回の投与と等価である。これらの結果は、したがって、ヒトにおける有効量のB3F6.1-DMFが、3週間毎に1回の投与の投与計画を含むことを示す。
（実施例２）
ヒト化B3F6抗体は、インビボモデルにおいて化学療法剤と併用投与したとき、相乗的にヒト結腸腫瘍細胞の増殖阻害に有効である。
マウス
6〜7週齢の218匹の雌SCIDベージュ(C.B.-17/IcrHsd-Prkcd Lyst Skid Beige)マウス(Harlan Sprague Dawley, Madison, WI)で、研究を開始した。動物は、腫瘍の移植前に少なくとも2日間研究室に順応させた。飼育ケースを換気したケージラックに置き、餌及び水を自由に与えた。
腫瘍モデル
原発性ヒト結腸腫瘍由来のCT-3腫瘍断片は元々、Sera Care, Inc (Oceanside, CA) (Peter Chu, Biogen Idec, San Diegoにより送られた)から入手した。連続的に移植されたインビボ異種移植株をBiogen Idec, Inc.で樹立し、第3異種移植世代由来の断片を凍結保存した。これらの凍結保存した断片(Biogen Idec cryo reg #0226)を解凍し、この研究のために移植する前に、雌SCIDベージュマウスで3〜5世代、インビボ皮下連続継代した。マウスに移植された腫瘍組織のサンプルで、細菌培養を実施した。細菌学培養物は移植後24時間及び48時間の両方で、細菌汚染について陰性であった。
−1日目に、BioMedics動物用IDチップ(Model IMI-1000; Seaford, DE)をマウスの左側腹部に皮下移植した。0日目に、8匹のドナー動物から腫瘍を採取し、壊死組織を除去して、刻み、CT-3腫瘍の3mm3断片を各マウスの右側腹部に皮下移植した。腫瘍の大きさ及び体重測定値は、5日目から開始して少なくとも週に2回記録した。最低100mgの腫瘍が測定されたとき（15日目）、非進行性成長の腫瘍を除いて、腫瘍の大きさに基づき、マウスを治療及び対照群にランダム化した（表2を参照）。
試験品及び正の化学療法剤
マイタンシンDM4結合物（2000-112、5.9mg/ml)を、ImmunoGen, Inc (Cambridge, MA)でImmunoGen腫瘍活性化プロドラッグ(TAP)技術によって調製した。臨床等級のAdrucil(5-フルオロウラシル、NDC 0703-3015-11)はSicor Pharmaceuticals（ロット番号06A625、有効期限2007年7月)から入手した。
研究群及び治療計画
研究群及び治療計画を表2に記載する。賦形剤対照（クエン酸塩緩衝液）は15日目に10ml/kgで静脈内に単回投与した。15mg/kg/注射でB3F6.1-DM4を、15日目に静脈内に単回投与した。30mg/kgの5-フルオロウラシルを、15日目に静脈内に単回投与した。更に、15日目に静脈内に単回投与した30mg/kgの5-フルオロウラシルの投与と組み合わせて、15日目に15mg/kg/注射でB3F6.1-DM4を静脈内に単回投与した。
抗癌活性の評価
腫瘍測定値はデジタルカリパスを使用して決定した。体重及び腫瘍の大きさの測定値を6日目に記録して、研究終了まで週2回継続した。長楕円の体積を計算するための式：腫瘍体積（mm3）＝（長さ×幅2）÷2を使用して、2次元腫瘍測定値から腫瘍体積（mm3）を概算した。単位密度を仮定して、体積を重量に変換した（すなわち1mm3＝1mg）。
統計解析
各治療群及び賦形剤対照群間に何らかの統計的に有意差があるかどうかを判定するために、各研究終了時の平均腫瘍重量に対してスチューデントのt検定を実施した。
移植後の腫瘍生着率は95％であり、腫瘍重量が厳しい範囲の内にあるマウスを選択して治療を開始した。賦形剤対照群の腫瘍増殖は十分に、このモデルで見られる典型的な範囲内であった。
図２は、それぞれ静脈内投与した、B3F6.1-DM4の単回投与(15mg/kg/注射)又は5-フルオロウラシルの単回投与(30mg/kg/注射の)の、確立したCT-3異種移植腫瘍を持つ胸腺欠損ヌードマウスにおける腫瘍重量の変化に対する影響を示す。静脈内投与された、15mg/kg/注射でのB3F6.1-DM4又は30mg/kg/注射 での5-フルオロウラシルの単回投与は、研究が終了する（34日目）まで、研究全体を通して有意に腫瘍増殖を阻害した。30mg/kg/注射の5-フルオロウラシルと併せて15mg/kg/注射のB3F6.1-DM4で治療した他のコホートは、研究が終了する（34日目）まで、研究全体を通して、B3F6.1-DM4又は5-フルオロウラシル単独と比較したとき、腫瘍増殖の著しい相乗的阻害（80%の阻害）を示した。これらの結果は、追加の化学療法剤、例えば、5-フルオロウラシル（30mg/kg）の単回投与と組み合わせた15mg/kg（45mg/m2)のB3F6.1-DM4の単回投与が、このインビボマウスモデルにおいて3週目まで腫瘍増殖の相乗的阻害をもたらすことを実証する。これらの結果は、追加の化学療法剤、例えば、5-フルオロウラシルと併用した抗Cripto抗体、例えば、B3F6.1-DM4を含む、併用療法が、ヒトの癌、例えば、結腸癌に対する有効な治療であることを示す。
（実施例３）
ヒト化B3F6抗体は、インビボモデルにおいて大きなヒト結腸癌腫瘍の増殖阻害に有効である。
以下の材料及び方法をこの実施例で用いた。
マウス
6〜7週齢の210匹の雌SCIDベージュ(C.B.-17/IcrHsd-Prkcd Lyst Skid Beige)マウス(Harlan Sprague Dawley, Madison, WI)で、研究を開始した。動物は、腫瘍の移植前に少なくとも2日間研究室に順応させた。飼育ケースを換気したケージラックに置き、餌及び水を自由に与えた。
腫瘍モデル
原発性ヒト結腸腫瘍のCT-3腫瘍断片は元々、Sera Care, Inc (Oceanside, CA) (Peter Chu, Biogen Idec, San Diegoにより送られた)から入手した。連続的に移植されたインビボ異種移植株をBiogen Idec, Inc.で樹立し、第3異種移植世代の断片を凍結保存した。これらの凍結保存した断片(Biogen Idec cryo reg #0239)を解凍し、この研究のために移植する前に、雌SCIDベージュマウスで2世代、インビボ皮下連続継代した。マウスに移植された腫瘍組織のサンプルで、細菌培養を実施した。細菌学培養物は移植後24時間及び48時間の両方で、細菌汚染について陰性であった。
−1日目に、BioMedics動物用IDチップ (Model IMI-1000; Seaford, DE)をマウスの左側腹部に皮下移植した。0日目に、14匹のドナー動物から腫瘍を採取し、壊死組織を除去して、刻み、CT-3腫瘍の3mm3断片を各マウスの右側腹部に皮下移植した。腫瘍の大きさ及び体重測定値は、6日目から開始して少なくとも週に2回記録した。最低80mgの腫瘍が測定されたとき（18日目）、非進行性成長の腫瘍を除いて、腫瘍の大きさに基づき、マウスを治療群及び対照群にランダム化した（表3を参照）。
試験品及び正の化学療法剤
マイタンシンDM4結合物（2000-112、5.9mg/ml)を、ImmunoGen, Inc (Cambridge, MA)でImmunoGen腫瘍活性化プロドラッグ(TAP)技術によって調製した。臨床等級のAdrucil(5-フルオロウラシル、NDC 0703-3015-11)はSicor Pharmaceuticals（ロット番号06A625、有効期限2007年7月)から入手した。
研究群及び治療計画
研究群及び治療計画を表3に記載する。賦形剤対照（10mMクエン酸塩緩衝液、pH5．5、135mM塩化ナトリウム）は18日目に静脈内に10 ml/kgを単回投与し、更に18日目から、10 ml/kg、q2dx6 (M, W及び F)の用量で、0.9%の生理食塩水を腹腔内に投与した。15mg/kg又は25mg/kgのB3F6.1-DM4は30日目に静脈内に単回投与した。
抗癌活性の評価
腫瘍測定値はデジタルカリパスを使用して決定した。体重及び腫瘍の大きさの測定値を6日目に記録して、研究終了まで週2回継続した。長楕円の体積を計算するための式:腫瘍体積（mm3）＝（長さ×幅2）÷2を使用して、2次元腫瘍測定値から腫瘍体積（mm3）を概算した。単位密度を仮定して、体積を重量に変換した（すなわち1mm3＝1mg）。群は39日目に終了した。
統計解析
各治療群及び賦形剤対照群間に何らかの統計的に有意差があるかどうかを判定するために、各研究終了時の平均腫瘍重量に対してスチューデントのt検定を実施した。
移植後の腫瘍生着率は95％であり、18日目に腫瘍重量が厳しい範囲の内にあるマウスを選択して治療を開始した。賦形剤対照群の腫瘍増殖は十分に、このモデルで見られる典型的な範囲内であった。
図３は、静脈内投与されたB3F6.1-DM4の単回投与(15及び25mg/kg/注射)の、大きなCT-3異種移植腫瘍、例えば、550〜775mgの平均腫瘍重量を有する腫瘍を持つ胸腺欠損ヌードマウスにおける腫瘍重量の変化に対する影響を示す。静脈内投与された、15mg/kg/注射又は25mg/kg/注射のB3F6.1-DM4は、研究が終了するまで（39日目）有意に腫瘍増殖を阻害した。これらの結果は、B3F6.1-DM4の単回投与が、このインビボマウスモデルで、大きな腫瘍、例えば、ヒト結腸癌腫瘍の増殖を阻害するのに有効であることを示す。これらの結果は、抗Cripto抗体、例えば、B3F6.1-DM4の投与が、単回投与でさえ、ヒトの大きな確立した腫瘍の有効な治療であることを示す。
（実施例４）
異なるリンカーを介して毒素に結合したヒト化B3F6抗体は、ヒト精巣癌細胞の増殖阻害に有効である。
以下の材料及び方法をこの実施例で用いた。
マウス
6〜7週齢の雌SCIDベージュ(C.B.-17/IcrHsd-Prkcd Lyst Skid Beige)マウス(Harlan Sprague Dawley, Madison, WI)で、研究を開始した。動物は、腫瘍の移植前に少なくとも2日間研究室に順応させた。飼育ケースを換気したケージラックに置き、餌及び水を自由に与えた。
腫瘍モデル
ヒト精巣癌腫瘍は、Biogen Idec, Inc.で樹立した、連続継代したインビボドナー株由来の凍結保存固形腫瘍断片から入手した。腫瘍断片を凍結保存から取り出し、移植する前に雌の胸腺欠損ヌードマウスで3世代、インビボ皮下連続継代した。マウスに移植された腫瘍組織のサンプルで、細菌培養を実施した。細菌学培養物は移植後24時間及び48時間の両方で、細菌汚染について陰性であった。
−1日目に、BioMedics動物用IDチップ (Model IMI-1000; Seaford, DE)をマウスの左側腹部に皮下移植した。0日目に、ドナー動物から腫瘍を採取し、壊死組織を除去して、刻み、CT-3腫瘍の3mm3断片を各マウスの右側腹部に皮下移植した。腫瘍の大きさ及び体重測定値は、5日目から開始して少なくとも週に2回記録した。最低100mgの腫瘍が測定されたとき、非進行性成長の腫瘍を除いて、腫瘍の大きさに基づき、マウスを治療群及び対照群にランダム化した（表4を参照）。
試験品及び正の化学療法剤
マイタンシンDM4結合物（2000-112、5.9mg/ml)を、ImmunoGen, Inc (Cambridge, MA)でImmunoGen腫瘍活性化プロドラッグ(TAP)技術によって調製した。臨床等級のAdrucil(5-フルオロウラシル、NDC 0703-3015-11)はSicor Pharmaceuticals（ロット番号06A625、有効期限2007年7月)から入手した。
研究群及び治療計画
研究群及び治療計画を表4に記載する。賦形剤対照（10mMクエン酸塩緩衝液、pH5.5、135mM塩化ナトリウム）は、14日目に静脈内に単回投与した。5mg/kg、10mg/kg又は15mg/kgのB3F6.1-SMCC-DM1を、14日目に単回投与で静脈内投与した。5mg/kg、10mg/kg又は15mg/kgのB3F6.1-SPDB-DM4を、14日目に単回投与で静脈内投与した。2mg/kgのシス−白金を14日目から開始して、q2dx6で腹腔内投与した。
抗癌活性の評価
腫瘍測定値はデジタルカリパスを使用して決定した。体重及び腫瘍の大きさの測定値を0日目に記録して、研究終了まで週2回継続した。長楕円の体積を計算するための式:腫瘍体積（mm3）＝（長さ×幅2）÷2を使用して、2次元腫瘍測定値から腫瘍体積（mm3）を概算した。単位密度を仮定して、体積を重量に変換した（すなわち1mm3＝1mg）。
統計解析
各治療群及び賦形剤対照群間に何らかの統計的に有意差があるかどうかを判定するために、各研究終了時の平均腫瘍重量に対してスチューデントのt検定を実施した。
移植後の腫瘍生着率は95％であり、厳しい大きさの範囲の内にあるマウスを選択して治療を開始した。賦形剤対照群の腫瘍増殖は十分に、このモデルで見られる典型的な範囲内であった。
図４は、静脈内投与されたB3F6.1-SMCC-DM1の単回投与(5、10及び15mg/kg/注射)、又はB3F6.1-SPDB-DM4の単回投与(5、10及び15mg/kg/注射)の、確立したヒト精巣異種移植腫瘍を持つ胸腺欠損ヌードマウスにおける腫瘍重量の変化に対する影響を示す。14日目に静脈内投与された、5mg/kg、10mg/kg又は15mg/kgでのB3F6.1-SMCC-DM1の単回投与は、研究が終了するまで（34日目）研究全体を通して、有意に腫瘍増殖を阻害した（およそ50%の腫瘍阻害）。14日目に静脈内投与された、5、10及び15mg/kg/注射のB3F6.1-SPDB-DM4で治療された他のコホートは、研究が終了するまで（34日目）研究全体を通して、著しく、有意に腫瘍増殖を阻害した（およそ80〜90%の腫瘍阻害）。これらの結果は、5〜15mg/kgでのB3F6.1-SMCC-DM1の単回投与が、インビボマウスモデルで3週間目まで腫瘍の増殖を阻害することを実証する。これらの結果は更に、5〜15mg/kgでのB3F6.1-SPDB-DM4の単回投与が、インビボマウスモデルで3週間目まで腫瘍の増殖を著しく阻害することを示す。マウスにおけるq14dx2投与は、霊長類における3週間毎に1回の投与と等価である。
この実施例では、B3F6抗体に結合した種々のリンカー−マイタンシン結合体が、異なる半減期を有する結合したB3F6抗体から放出される。具体的には、SPP-DM1リンカー結合体は、ヒトでおよそ24〜48時間の半減期を有し、SPDB-DM4リンカー結合体は、ヒトでおよそ5日の半減期を有し、SMCC-DM1リンカー結合体は、ヒトでおよそ6日の半減期を有する。SPP及びSPDBリンカーは、近接する腫瘍細胞に再び入ることができる代謝物質を産生し、腫瘍細胞を殺すのに寄与することができる、いわゆる「傍観者（bystander）」効果を生み出す。対照的に、SMCC-DM1リンカー系は、近接する腫瘍細胞に再び入ることができる代謝物質産物を産生しない。この実施例で提示された結果は、SMCC-DM1リンカー系を含むB3F6-SMCC-DM1分子が、腫瘍、例えば、精巣癌種で活性であり、これは「傍観者殺」活性を必要としない。この実施例で提示された結果はまた、SPDB-DM4リンカー系を含むB3F6-SPDB-DM4分子が、SPP-DM1リンカー系又はSMCC-DM1リンカー系を含むB3F6結合体より、腫瘍増殖の阻害においてより有効であることを示す。
均等物
当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書で記載した本発明の具体的な実施形態の多くの均等物を認識、又は確認できるであろう。このような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることを意図する。
PTA-3319
PTA-7284

Claims (66)

  1. 有効量の、Criptoに結合する結合分子を被験体に投与する工程を含む、該被験体の腫瘍の増殖を阻害する方法であって、該結合分子が、3週間毎に1回投与され、それにより該被験体の腫瘍の増殖を阻害する方法。
  2. 前記結合分子が抗Cripto抗体である、請求項1に記載の方法。
  3. 前記結合分子がヒト化抗Cripto抗体である、請求項2に記載の方法。
  4. 前記ヒト化抗Cripto抗体が、マイタンシノイド（maytansoid）に結合される、請求項3に記載の方法。
  5. 前記マイタンシノイドがDM4である、請求項4に記載の方法。
  6. 前記抗体1分子に結合している平均3.5分子のDM4が存在する、請求項5に記載の方法。
  7. 前記マイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｏｉｄ）が、ヘテロ二官能性架橋剤を介して前記抗体に結合される、請求項4に記載の方法。
  8. 前記ヘテロ二官能性架橋剤が、4-(2-ピリジルジチオ)ブタン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(SPDB)である、請求項7に記載の方法。
  9. 前記被験体が、脳、乳房、精巣、結腸、肺、卵巣、膀胱、子宮、頸部、膵臓及び胃から成る群から選択される器官の癌に罹患している、請求項1に記載の方法。
  10. 前記被験体が結腸癌に罹患している、請求項1に記載の方法。
  11. 前記結合分子の前記有効量が、約5mg/kg、約10mg/kg、約15mg/kg、約25mg/kg、及び約40mg/kgから成る群から選択される、請求項1に記載の方法。
  12. 有効量のCriptoに結合する結合分子及び追加の化学療法剤を被験体に投与して、それにより該被験体の腫瘍の増殖を阻害する工程を含む、該被験体の腫瘍の増殖を阻害する方法。
  13. 前記結合分子及び前記化学療法剤が相乗的に作用する、請求項12に記載の方法。
  14. 前記化学療法剤が代謝拮抗物質である、請求項12に記載の方法。
  15. 前記代謝拮抗物質がピリミジン類似体である、請求項14に記載の方法。
  16. 前記ピリミジン類似体が5’-フルオロウラシルである、請求項15に記載の方法。
  17. 前記結合分子が抗Cripto抗体である、請求項12に記載の方法。
  18. 前記結合分子がヒト化抗Cripto抗体である、請求項17に記載の方法。
  19. 前記ヒト化抗Cripto抗体がマイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｏｉｄ）に結合される、請求項18に記載の方法。
  20. 前記マイタンシノイドがDM4である、請求項19に記載の方法。
  21. 前記抗体1分子に結合している平均3.5分子のDM4が存在する、請求項19に記載の方法。
  22. 前記マイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｏｉｄ）が、ヘテロ二官能性架橋剤を介して前記抗体に結合される、請求項19に記載の方法。
  23. 前記ヘテロ二官能性架橋剤が、4-(2-ピリジルジチオ)ブタン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(SPDB)である、請求項22に記載の方法。
  24. 前記結合分子及び前記化学療法剤が単回投与で投与される、請求項12に記載の方法。
  25. 前記結合分子及び前記化学療法剤が隔週投与される、請求項12に記載の方法。
  26. 前記結合分子及び前記化学療法剤が3週間毎投与される、請求項12に記載の方法。
  27. 前記結合分子の前記有効量が、約5mg/kg、約10mg/kg、約15mg/kg、約25mg/kg、及び約40mg/kgから成る群から選択される、請求項9に記載の方法。
  28. 前記結合分子の前記有効量が、15mg/kgでる、請求項27に記載の方法。
  29. 前記結合分子及び前記化学療法剤が、腹腔内に、経口で、鼻腔内に、皮下に、筋肉内に、局所的に、又は静脈内に投与される、請求項12に記載の方法。
  30. 前記被験体が、脳、乳房、精巣、結腸、肺、卵巣、膀胱、子宮、頸部、膵臓及び胃から成る群から選択される器官の癌に罹患している、請求項12に記載の方法。
  31. 前記被験体が結腸癌に罹患している、請求項12に記載の方法。
  32. (i)確立した腫瘍を有する患者を選択する工程と、
    (ii)有効量のCriptoに結合する結合分子を該被験体に投与し、それにより該被験体の腫瘍の増殖を阻害する工程と、
    を含む、該被験体の腫瘍の増殖を阻害する方法。
  33. 前記結合分子が抗Cripto抗体である、請求項32に記載の方法。
  34. 前記結合分子がヒト化抗Cripto抗体である、請求項33に記載の方法。
  35. 前記抗Cripto抗体が、マイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｏｉｄ）に結合される、請求項34に記載の方法。
  36. 前記マイタンシノイドがDM4である、請求項35に記載の方法。
  37. 前記抗体1分子に結合している平均3.5分子のDM4が存在する、請求項36に記載の方法。
  38. 前記マイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｏｉｄ）が、ヘテロ二官能性架橋剤を介して前記抗体に結合される、請求項35に記載の方法。
  39. 前記ヘテロ二官能性架橋剤が、4-(2-ピリジルジチオ)ブタン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(SPDB)である、請求項38に記載の方法。
  40. 前記結合分子が単回投与で投与される、請求項32に記載の方法。
  41. 前記結合分子が隔週投与される、請求項32に記載の方法。
  42. 前記結合分子が3週間毎投与される、請求項32に記載の方法。
  43. 前記結合分子の前記有効量が、約5mg/kg、約10mg/kg、約15mg/kg、約25mg/kg、及び約40mg/kgから成る群から選択される、請求項32に記載の方法。
  44. 前記結合分子の前記有効量が、約15mg/kgである、請求項32に記載の方法。
  45. 前記結合分子の前記有効量が、約25mg/kgである、請求項32に記載の方法。
  46. 前記結合分子が、腹腔内に、経口で、鼻腔内に、皮下に、筋肉内に、局所的に、又は静脈内に投与される、請求項32に記載の方法。
  47. 前記被験体が、脳、乳房、精巣、結腸、肺、卵巣、膀胱、子宮、頸部、膵臓及び胃から成る群から選択される器官の癌に罹患している、請求項32に記載の方法。
  48. 前記被験体が結腸癌に罹患している、請求項32に記載の方法。
  49. 単回有効量のCriptoに結合する結合分子を被験体に投与し、それにより該被験体の腫瘍の増殖を阻害する工程を含む、該被験体の腫瘍の増殖を阻害する方法。
  50. 前記結合分子が抗Cripto抗体である、請求項49に記載の方法。
  51. 前記結合分子がヒト化抗Cripto抗体である、請求項50に記載の方法。
  52. 前記抗Cripto抗体が、マイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｏｉｄ）に結合される、請求項51に記載の方法。
  53. 前記マイタンシノイドがDM4である、請求項52に記載の方法。
  54. 前記抗体1分子に結合している平均3.5分子のDM4が存在する、請求項53に記載の方法。
  55. 前記マイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｏｉｄ）が、ヘテロ二官能性架橋剤を介して前記抗体に結合される、請求項52に記載の方法。
  56. 前記ヘテロ二官能性架橋剤が、4-(2-ピリジルジチオ)ブタン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(SPDB)である、請求項55に記載の方法。
  57. 前記単回有効量が、約5mg/kg、約10mg/kg、約15mg/kg、約25mg/kg、及び約40mg/kgから成る群から選択される、請求項49に記載の方法。
  58. 前記被験体が、脳、乳房、精巣、結腸、肺、卵巣、膀胱、子宮、頸部、膵臓及び胃から成る群から選択される器官の癌に罹患している、請求項49に記載の方法。
  59. (a)治療的に有効な量の、Criptoに結合する結合分子と、
    (b)pH5.0
    である、10mMのコハク酸ナトリウムと、
    (c)120mMのL-グリシンと、
    (d)120mMのグリセロールと、
    (e)0.01%のポリソルベート80と、
    を含む、液体水性医薬品製剤。
  60. 前記結合分子がヒト化抗Cripto抗体である、請求項59に記載の医薬品製剤。
  61. 前記ヒト化抗Cripto抗体がマイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｏｉｄ）に結合される、請求項60に記載の医薬品製剤。
  62. 前記マイタンシノイドがDM4である、請求項61に記載の医薬品製剤。
  63. 前記抗体1分子に結合している平均3.5分子のDM4が存在する、請求項62に記載の医薬品製剤。
  64. 前記マイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｏｉｄ）が、ヘテロ二官能性架橋剤を介して前記抗体に結合される、請求項61に記載の医薬品製剤。
  65. 前記ヘテロ二官能性架橋剤が、4-(2-ピリジルジチオ)ブタン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(SPDB)である、請求項64に記載の医薬品製剤。
  66. 前記結合分子の濃度が5mg/mlである、請求項63に記載の医薬品製剤。
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