JP2010513462A - 第ＶＩＩおよび第ＶＩＩａ因子組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、第ＶＩＩ因子もしくは第ＶＩＩａ因子ポリペプチドまたはそのポリペプチドバリアントおよび緩衝剤としてヒスチジンを含んでなる安定化組成物に関する。
【選択図】なし

Description

［関連出願へのクロスリファレンス］
本願は、２００６年１２月２０日に出願された米国仮特許出願第６０／８７０，９４８号への優先権およびその利益を請求し、その開示は全ての目的のためにその全部が引用することにより本明細書に組み込まれる。

本発明は、第ＶＩＩ因子もしくは第ＶＩＩａ因子ポリペプチドまたはそのポリペプチドバリアントの貯蔵安定性組成物に関する。

血液凝固カスケードにおける重要な血液凝固タンパク質、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）は、肝臓において合成されそして５０キロダルトン（ｋＤａ）の分子量を有する一本鎖糖タンパク質として血液中に分泌されるビタミンＫ依存性血漿タンパク質である。ＦＶＩＩチモーゲンは、単一部位Ｒ１５２−Ｉ１５３でのタンパク質分解切断により活性型第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）に転化され、単一のジスルフィド架橋により連結された２本鎖をもたらす。組換ヒトＦＶＩＩａは、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ^(R)の名称でＮｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋから市販されており、そして出血エピソードの処置に、例えば血友病もしくは外傷において使用され、血液凝固／凝血を促進する。ヒトＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａの組換えで製造されたバリアントもまた、報告されている。

ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ^(R)は、使用前に再構成されなければならない凍結乾燥したＦＶＩＩａ製品である。ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ^(R)のバイアル（１．２ｍｇ）は、１．２ｍｇの組換えヒトＦＶＩＩａ（ｒｈＦＶＩＩａ）、５．８４ｍｇのＮａＣｌ、２．９４ｍｇのＣａＣｌ_２，２Ｈ_２Ｏ、２．６４ｍｇのグリシルグリシン、０．１４ｍｇのポリソルベート８０および６０．０ｍｇのマンニトールを含有し；それは２．０ｍｌの注射用水によりｐＨ５．５に再構成される。再構成されると、該タンパク質は使用のために２〜８℃で２４時間安定である。

使いやすさのために液体形態でＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａのような治療用タンパク質を提供できることは一般に好都合であるが、乾燥形態とは対照的に液体形態のタンパク質の減少した安定性のために、そのようなタンパク質は、十分な長期貯蔵安定性を得るために乾燥形態、例えば凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）（凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ））形態で提供されることが多い。貯蔵中のタンパク質の不安定性は、変性もしくは凝集の結果としての物理的不安定性、および加水分解、アミド分解もしくは酸化の結果としての化学的不安定性を包含する様々な原因を有し得る。この化学的および／もしくは物理的分解の結果には、ＦＶＩＩ活性のかなりの喪失だけでなく、タンパク質凝集体の存在に起因する免疫原性反応も包含することができる。さらに、自己タンパク質分解ドメインを有するタンパク質およびペプチドは、液体投与形態物における貯蔵の際に自己消化する傾向があるので、これらによって特別な課題が提示される。

ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａタンパク質の凍結乾燥製剤は、例えば特許文献１、特許文献２、特許文献３および特許文献４に記述される。ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａの様々な組成物もしくは製剤が既知であるが、まだ改善の余地がある。

ＷＯ ０１／１２６５３ ＷＯ ０３／０９２７３１ ＷＯ ２００４／０００３４７ ＷＯ ２００５／０５８２８３

［発明の要約］
１つの態様において、本発明は、再構成組成物におけるヒスチジンの濃度が少なくとも約５ミリモル（ｍＭ）である、第ＶＩＩ因子もしくは第ＶＩＩａ因子ポリペプチド（例えば、ｒｈＦＶＩＩもしくはｒｈＦＶＩＩａ）および緩衝剤としてヒスチジンを含んでなる、水での再構成に適当な凍結乾燥組成物を提供する。組成物は、賦形剤もしくは担体を含んでなることができる。ある態様において、組成物は、再構成組成物におけるヒスチジンの濃度が少なくとも約５ｍＭである、製薬学的に許容しうる賦形剤もしくは担体および第ＶＩＩ因子もしくは第ＶＩＩａ因子ポリペプチドおよび緩衝剤としてヒスチジンを含んでなる製薬学的組成物である。

別の態様において、本発明は、再構成組成物におけるヒスチジンの濃度が少なくとも約５ｍＭである、第ＶＩＩ因子もしくは第ＶＩＩａ因子ポリペプチドバリアント（例えば、本明細書に記述されるような凝固活性を有するＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアント）および緩衝剤としてヒスチジンを含んでなる、水での再構成に適した凍結乾燥組成物を提供する。組成物は、賦形剤もしくは担体を含んでなることができる。ある態様において、そのような組成物は、再構成組成物におけるヒスチジンの濃度が少なくとも約５ｍＭである、製薬学的に許容しうる賦形剤もしくは担体および第ＶＩＩ因子もしくは第ＶＩＩａ因子ポリペプチドバリアント（例えば、本明細書に記述されるような凝固活性を有するＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアント）および緩衝剤としてヒスチジンを含んでなる製薬学的組成物である。

別の態様において、本発明は、第ＶＩＩ因子もしくは第ＶＩＩａ因子ポリペプチド（例えば、ｒｈＦＶＩＩもしくはｒｈＦＶＩＩａ）を含んでなる貯蔵安定性組成物を製造する方法を提供し、該方法は、ヒスチジン緩衝剤および水と第ＶＩＩ因子もしくは第ＶＩＩａ因子ポリペプチドの混合物を準備して少なくとも５ｍＭのヒスチジン濃度を有する水性組成物をもたらすこと、および得られる水性組成物を凍結乾燥に供して凍結乾燥組成物をもたらすことを含んでなる。組成物は、賦形剤もしくは担体を含んでなることができる。ある態様において、そのような組成物は製薬学的に許容しうる賦形剤もしくは担体を含んでなる製薬学的組成物である。

別の態様において、本発明は、第ＶＩＩ因子もしくは第ＶＩＩａ因子ポリペプチドバリアント（例えば、本明細書に記述されるような凝固活性を有するＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアント）を含んでなる貯蔵安定性組成物を製造する方法を提供し、該方法は、ヒスチジン緩衝剤および水と第ＶＩＩ因子もしくは第ＶＩＩａ因子ポリペプチドバリアントの混合物を準備して少なくとも５ｍＭのヒスチジン濃度を有する水性組成物をもたらすこと、および得られる水性組成物を凍結乾燥に供して凍結乾燥組成物をもたらすことを含んでなる。組成物は、賦形剤もしくは担体を含んでなることができる。ある態様において、そのような組成物は製薬学的に許容しうる賦形剤もしくは担体を含んでなる製薬学的組成物である。

別の態様において、本発明は、組成物が水で再構成されている、ＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチド（例えば、ｒｈＦＶＩＩもしくはｒｈＦＶＩＩａ）またはＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアント（例えば、本明細書に記述されるような凝固活性を有するＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアント）を含んでなる本発明の組成物の治療的に有効な量を処置もしくは予防を必要とする患者に投与することを含んで
なる、ＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドまたはＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントの投与により処置できる症状を処置するかもしくは予防する方法を提供する。

別の態様において、本発明は、賦形剤もしくは担体および哺乳類における血餅形成を増加するために有効な量の活性を有するＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチド（例えば、ｒｈＦＶＩＩもしくはｒｈＦＶＩＩａ）またはＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントを含んでなる本発明の組成物を哺乳類に投与することを含んでなる、増加した血餅形成が望ましい疾患もしくは症状を有する哺乳類における血餅形成を増加する方法を提供する。

本発明のさらなる態様は、以下に記述される。

同じ温度で貯蔵した液体形態の同じ組成物および対照として−８０℃で貯蔵した同一の凍結乾燥組成物と比較した４０℃で２８日間貯蔵後の本発明の組成物の、本明細書に記述される「第Ｘ因子活性化アッセイ」を用いて決定される、ＦＶＩＩａ活性（Ｕ／ｍｇ）を示す（Ｔ０、Ｔ７、Ｔ１４、Ｔ２１、Ｔ２８＝それぞれ、０、７、１４、２１および２８日で行われた分析）。 同じ温度で貯蔵した液体形態の同じ組成物および対照として−８０℃で貯蔵した同一の凍結乾燥組成物と比較した４０℃で２８日間貯蔵後の本発明の組成物における、ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより決定される、凝集タンパク質の量（ダイマーおよびポリマーパーセントにおける）を示す。 同じ温度で貯蔵した液体形態の同じ組成物および対照として−８０℃で貯蔵した同一の凍結乾燥組成物と比較した４０℃で２８日間貯蔵後の本発明の組成物における、ＲＰ−ＨＰＬＣにより決定される、酸化タンパク質のパーセンテージを示す。 同じ温度で貯蔵した液体形態の同じ組成物および対照として−８０℃で貯蔵した同一の凍結乾燥組成物と比較した４０℃で２８日間貯蔵後の本発明の組成物における、ＲＰ−ＨＰＬＣにより決定される、重鎖分解のパーセンテージを示す。 異なる温度で１年までの間貯蔵後の本発明の組成物における、本明細書に記述されるＰＡＣＴアッセイにより決定される、相対効能を示す。 異なる温度で１年までの間貯蔵後の本発明の組成物における、ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより決定される、凝集タンパク質の量（ダイマーおよびポリマーパーセントにおける）を示す。 −８０℃で貯蔵した同じ組成物に対する５℃、２５℃および４０℃の温度で１年までの間貯蔵後の本発明の組成物における、ＲＰ−ＨＰＬＣにより決定される、重鎖分解度を示す。 異なる温度で１年までの間貯蔵後の本発明の組成物における、下記の通り決定される、オスモル濃度を示す。 −８０℃で貯蔵した同じ組成物に対する５℃、２５℃および４０℃の温度で１年までの間貯蔵後の本発明の組成物における、下記の通り決定される、酸化度を示す。

［発明の詳細な記述］
本発明は、第ＶＩＩもしくは第ＶＩＩａ因子ポリペプチド（例えば、ｒｈＦＶＩＩもしくはｒｈＦＶＩＩａポリペプチド）または第ＶＩＩもしくは第ＶＩＩａ因子ポリペプチドバリアント（例えば、本明細書に記述されるような凝固活性を有する組換えＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアント）の安定化組成物もしくは製剤、特に貯蔵安定性凍結乾燥組成物もしくは製剤、そして１つの態様において、室温で貯蔵安定性である組成物もしくは製剤を提供する。

本発明は、第ＶＩＩ因子もしくは第ＶＩＩａ因子ポリペプチド（例えば、組換えｈＦＶＩＩもしくはｈＦＶＩＩａポリペプチド）または第ＶＩＩもしくは第ＶＩＩａ因子ポリペプチドバリアント（例えば、本明細書に記述されるような凝固活性を有する組換えＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアント）およびヒスチジン、グリシン、アルギニン、クエン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩およびリン酸塩、ならびにその塩から選択される緩衝剤を含んでなる、水もしくは別の液体での再構成に適当な、製薬学的組成物もしくは製剤を包含する、凍結乾燥組成物もしくは製剤に関する。好ましい態様において、緩衝剤はアミノ酸、特にヒスチジンである。

１つの態様において、本発明は、再構成組成物もしくは製剤におけるヒスチジンの濃度が少なくとも約５ｍＭである、第ＶＩＩ因子もしくは第ＶＩＩａ因子ポリペプチド（例えば、組換えｈＦＶＩＩもしくはｈＦＶＩＩａポリペプチド）または第ＶＩＩもしくは第ＶＩＩａ因子ポリペプチドバリアント（例えば、本明細書に記述される組換えｈＦＶＩＩもしくはｈＦＶＩＩａポリペプチドバリアント）および緩衝剤としてヒスチジンを含んでなる、水もしくは他の媒質での再構成に適当な凍結乾燥製薬学的組成物もしくは製剤を提供する。さらに詳細に以下に記述されるように、組成物は典型的には張性調整剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、カルシウムのような２価の陽イオン、界面活性剤、酸化防止剤および／もしくは防腐剤のような１つもしくはそれ以上の追加成分を含む。

本発明の別の態様は、ヒスチジン緩衝剤および水、ならびに場合により下記のような追加成分と第ＶＩＩ因子もしくは第ＶＩＩａ因子ポリペプチド（例えば、組換えｈＦＶＩＩもしくはｈＦＶＩＩａポリペプチド）またはそのポリペプチドバリアントの混合物を準備して少なくとも５ｍＭのヒスチジン濃度を有する水性組成物をもたらすこと、および得られる水性組成物を凍結乾燥に供して凍結乾燥組成物をもたらすことを含んでなる、第ＶＩＩ因子もしくは第ＶＩＩａ因子ポリペプチド（例えば、組換えｈＦＶＩＩもしくはｈＦＶＩＩａポリペプチド）またはそのポリペプチドバリアントを含んでなる貯蔵安定性組成物を製造する方法に関する。

本発明のさらなる態様には、本発明の再構成組成物の治療的に有効な量を処置もしくは予防を必要とする患者に投与することを含んでなる、第ＶＩＩもしくは第ＶＩＩａ因子ポリペプチド（例えば、組換えｈＦＶＩＩもしくはｈＦＶＩＩａ）またはＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアント（例えば、以下にさらに記述されるような凝固活性を有する組換えＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアント）の投与により処置できる症状を処置するかもしくは予防する方法、ならびに第ＶＩＩもしくは第ＶＩＩａ因子ポリペプチドまたはＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントの投与により処置できる症状を処置するかもしくは予防するための薬剤の製剤のための本発明の組成物の使用が包含される。

定義
以下の記述および請求項において、以下の定義が適用される：
「ＦＶＩＩ」もしくは「ＦＶＩＩポリペプチド」という用語は、一般に、一本鎖形態で提供されるＦＶＩＩ分子をさす。

「ＦＶＩＩａ」もしくは「ＦＶＩＩａポリペプチド」という用語は、一本鎖形態のＲ１５２とＩ１５３の間のペプチド結合が切断されている、その活性化二本鎖形態で提供されるＦＶＩＩａポリペプチド分子をさす。

「ｒＦＶＩＩ」および「ｒＦＶＩＩａ」という用語は、それぞれ、組換え技術により製造される、それぞれ、ＦＶＩＩおよびＦＶＩＩａ分子をさす。これらは野生型ヒト配列を有することができ、もしくはヒト配列のバリアントであることができる。

「ｈＦＶＩＩ」および「ｈＦＶＩＩａ」という用語は、それぞれ、野生型ヒトＦＶＩＩおよびＦＶＩＩａをさす。ヒトＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａタンパク質のポリペプチド配列は周知であり、そして例えばＵＳ４，７８４，９５０にそして受託番号Ｐ０８７０９でＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔに開示され；それはまた配列番号：１として以下に再生される。「ｒｈＦＶＩＩ」および「ｒｈＦＶＩＩａ」という用語は、それぞれ、組換え技術によって製造される、それぞれ、ヒトＦＶＩＩおよびヒトＦＶＩＩａ分子をさす。

「ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ」という用語は、ＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａを意味する。

「親」ＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａ分子は、それからＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａバリアントが例えばアミノ酸置換、挿入もしくは欠失によって得られるＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａ分子を示すものとする。親ＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドは任意のＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドであり、従って、任意の起源、例えば非ヒト哺乳類起源に由来することができるが、親ポリペプチドはｈＦＶＩＩもしくはｈＦＶＩＩａであることが多い。

ポリペプチド「バリアント」は、その親ポリペプチドと１個もしくはそれ以上のアミノ酸残基において、通常は１〜１５個のアミノ酸残基において（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４もしくは１５個のアミノ酸残基において）、例えば１〜１２個のアミノ酸残基、１〜１０個のアミノ酸残基において、例えば１〜８、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３もしくは１〜２個のアミノ酸残基において異なるポリペプチドであり、ここで、親ポリペプチドとポリペプチドバリアントとの間の違いは、例えばアミノ酸置換、挿入および／もしくは欠失である。

「ポリペプチド配列」は、文脈により、アミノ酸のポリマー（タンパク質、ポリペプチドなど）もしくはアミノ酸ポリマーを表す文字列である。遺伝暗号の縮重を考慮して、特定のポリペプチド配列をコードする１つもしくはそれ以上の核酸、またはその相補的な核酸をポリペプチド配列から決定することができる。

アミノ酸位置を同定するために使用する用語は、以下のとおり説明される：Ｇ１２４は、位置１２４がヒトＦＶＩＩのアミノ酸配列においてグリシン残基により占められることを示す。Ｇ１２４Ｒは、位置１２４のグリシン残基がアルギニン残基で置換されていることを示す。代替置換は、「／」で示される。多数の置換は、「＋」で示され、例えばＫ１４３Ｎ＋Ｎ１４５Ｓ／Ｔは、アスパラギン残基での位置１４３におけるリシン残基の置換およびセリンもしくはトレオニン残基での位置１４５におけるアスパラギン残基の置換を含んでなるアミノ酸配列を意味する。さらなるアミノ酸残基の挿入、例えばＧ１２４の後のアラニン残基の挿入は、Ｇ１２４ＧＡにより示される。

一般に、本発明の組成物の本明細書における説明は、再構成組成物における、すなわち
、水性の液体、典型的には注射用滅菌水の適量に本発明の凍結乾燥組成物を溶解することにより調製される水性組成物における様々な成分の量をさす。再構成後の組成物における水の量は、凍結乾燥前の元の組成物における水の量に対応することが多い。従って、本発明の組成物における様々な成分の量は、あるいはまた、凍結乾燥前の同じ成分の量であると考えることができ、すなわち、本記述および請求項において定義される組成物は、あるいはまた、示される成分量、濃度もしくはｐＨ値を有する水性組成物の凍結乾燥から調製されているかもしくはそれにより得ることができると特徴付けることができる。

本発明の組成物および方法
１つの態様において、本発明は少なくとも１つのＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチド（例えば、組換えｈＦＶＩＩもしくはｈＦＶＩＩａ）および／または本明細書に記述される少なくとも１つのＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアント（例えば、本明細書に記述される凝固活性を有するＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアント）の新規組成物もしくは製剤を提供する。あるそのような組成物もしくは製剤は、ＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドまたはＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントへの任意の実質的な損傷（例えば、タンパク質分解もしくは他の分解、または凝集または変性、ここで、分解、凝集もしくは変性は、例えば減少した効能もしくは免疫原性の危険性のために治療的使用に不適当な組成物をもたらす）を被ることなしに長期貯蔵の間（例えば少なくとも約３ヶ月、例えば少なくとも約６ヶ月、少なくとも約１年、少なくとも約１８ヶ月、少なくとも約２年の期間にわたって）安定である。

本発明によれば、組換え第ＶＩＩもしくは第ＶＩＩａ因子ポリペプチド（例えば、組換えｈＦＶＩＩもしくはｈＦＶＩＩａポリペプチド）または組換えＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントは、好ましくは少なくとも約５ｍＭの濃度で（ここで、該濃度は再構成組成物に基づく）、緩衝剤としてヒスチジンを含有しそして典型的には張性調整剤、カルシウムもしくは別の２価の陽イオン、界面活性剤、酸化防止剤または防腐剤のような１つもしくはそれ以上の追加成分とともに凍結乾燥組成物において調合される。好ましくは、組成物はその活性型のＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａポリペプチドまたはＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａポリペプチドバリアント、例えば、それぞれ、組換えヒト第ＶＩＩａ因子もしくは組換えＦＶＩＩａポリペプチドバリアントを含有する。

緩衝剤
本発明によれば、組換えＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチド（例えば、組換えｈＦＶＩＩもしくはｈＦＶＩＩａポリペプチド）または本明細書に記述される組換えＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントの組成物もしくは製剤は、緩衝剤としてヒスチジンを含有する凍結乾燥組成物に基づいて提供され、特にここで、再構成組成物は少なくとも約５ｍＭ、好ましくは少なくとも約１０ｍＭの、そして好ましくは約１０ｍＭより大きい濃度で、例えば約１００ｍＭまでの濃度でヒスチジンを含んでなる。再構成組成物におけるヒスチジンの濃度は典型的には約５０ｍＭまで、例えば約４０ｍＭまで、例えば約３０ｍＭもしくは２５ｍＭまでであり、そして一般に少なくとも約１０ｍＭ、しばしば少なくとも約１２ｍＭ、例えば少なくとも約１５ｍＭである。１つの態様において、ヒスチジン緩衝剤は約１２〜５０ｍＭ、例えば約１２〜４０ｍＭ、例えば約１２〜３０ｍＭ、例えば約１５〜２５ｍＭの範囲の濃度で再構成組成物において存在することができる。ヒスチジンバッファーは、好ましくは、ｐＨを調整する場合にナトリウムイオンの添加を避けるために、ヒスチジン塩基およびヒスチジン塩、例えばヒスチジン−ＨＣｌ、ヒスチジン硫酸塩もしくはヒスチジン−アルギニンを混合することにより調製される。あるいはまた、所望の値にｐＨを調整するためにヒスチジンに酸もしくは塩基を加えることができる。

本発明の組成物のｐＨは、好ましくは、患者への投与の際の苦痛もしくは不快感を最小
限に抑えるように、すなわち、極めて中性のｐＨ値を選択し、そして例えばＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドまたはそのポリペプチドバリアントの安定性へのｐＨの影響を考慮に入れることにより選択される。ｐＨは一般に約２．５〜約９．０の範囲である。適当なｐＨ範囲は例えば約２．５〜約４．０、例えば約３．０もしくは３．５；約４．０〜約８．０、例えば約５．０〜約７．０、例えば約５．５、６．０もしくは６．５；または約５．０〜約９．０、例えば約６．０〜約８．０、例えば約６．０、６．５、７．０もしくは７．５であることができる。好ましい態様において、ｐＨは約５．５〜約７．０、典型的には約６．０〜約７．０、例えば約６．２〜約６．８、例えば約６．４〜６．６の範囲、例えば約６．５である。

追加成分
ＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドおよび／またはＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントならびに緩衝剤に加えて、本発明の組成物は張性調整剤、カルシウムのような２価の陽イオン、界面活性剤、酸化防止剤および／もしくは防腐剤のような１つもしくはそれ以上の追加の賦形剤もしくは担体を含むことができる。本発明の製薬学的組成物は、ＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドおよび／またはＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントならびに緩衝剤に加えて、張性調整剤、カルシウムのような２価の陽イオン、界面活性剤、酸化防止剤および／もしくは防腐剤のような１つもしくはそれ以上の追加の製薬学的に許容しうる賦形剤もしくは担体を含むことができる。等張化剤もしくは張性調整剤は、等張性を保証するかもしくはそうでなければ液体組成物の張性を所望のレベルに調整するために加えられ、そしてグリセロール、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールもしくはマンニトールのような多価糖アルコール、好ましくは３価以上の糖アルコール、ショ糖もしくはトレハロースのような糖、またはグリシンもしくはアルギニンのようなアミノ酸が包含される。また、張性調整剤としての使用に適当であるのは、例えば塩化物を対イオンとする、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩もしくはマグネシウム塩のような中性塩、例えば塩化ナトリウムである。２つもしくはそれ以上の張性調整剤の混合物もまた用いることができる。１つの態様において、張性調整剤は糖、好ましくはショ糖もしくはトレハロース、より好ましくはトレハロースである。張性調整剤が糖アルコールもしくは糖である場合、再構成組成物における張性調整剤の濃度は典型的には約５０ｍＭ〜約１０００ｍＭ、例えば約１００ｍＭ〜約５００ｍＭ、例えば、約１５０ｍＭ〜約３００ｍＭ、例えば約２００ｍＭ〜約２５０ｍＭである。張性調整剤が塩もしくはアミノ酸のようなイオン化合物である場合、イオン化合物の量は、糖アルコールもしくは糖についての上記の範囲に対応するイオン強度をもたらすように適応される。

ある場合において、例えば中性塩の使用により与えられる、組成物における高いイオン強度、例えば少なくとも約２５０ｍＭ、少なくとも３００ｍＭもしくは少なくとも４００ｍＭ、例えば約５００ｍＭまでもしくは約１０００ｍＭまでを有することは好都合であり得る。ＦＶＩＩのそのような高イオン強度組成物は、ＷＯ ２００４／１１２８２８に記述される。

凍結乾燥保護剤（Ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）および／もしくは凍結保護剤は、それぞれ、水分除去および凍結中に生じる応力からタンパク質を保護するために本発明の組成物に含むことができる。凍結保護剤はまた、凍結乾燥の後の貯蔵中にその凍結乾燥形態のタンパク質を保護する働きをすることもできる。さらに、ある凍結保護剤はまた凍結乾燥保護剤として働くこともでき、そして張性調整剤として組成物に含むことができる糖アルコールもしくは糖のようなある成分は、凍結乾燥保護剤および／もしくは凍結保護剤としてさらに働くことができる。

凍結乾燥保護剤は例えば糖、例えばショ糖もしくはトレハロースのような二糖、または
ヒスチジン、アルギニンおよび／もしくはグリシンのようなアミノ酸であることができる。凍結保護剤は例えば糖、特にショ糖もしくはトレハロースのような二糖、またはグリセロール、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールもしくはマンニトールのような糖アルコール、またはヒスチジン、アルギニンもしくはグリシンのようなアミノ酸であることができる。好ましい態様において、ショ糖もしくはトレハロースのような糖、特にトレハロースが凍結乾燥保護剤／凍結保護剤としてそして張性調整剤として用いられる。この場合、糖の総量は張性調整剤を扱う段落において上記に示したとおりである。

本発明の組成物は、組成物を安定化するのに役立つように、典型的には塩化カルシウムのようなカルシウム塩もしくは塩化マグネシウムのようなマグネシウム塩、例えば塩化カルシウムの形態の、２価の陽イオンを含有することが多い。再構成組成物におけるカルシウムイオンもしくは他の２価の陽イオンの濃度は、通常は約１ｍＭ〜約４０ｍＭ、例えば約２ｍＭ〜約３０ｍＭ、例えば約２ｍＭ〜約２０ｍＭ、例えば約５ｍＭ〜約１５ｍＭ、例えば約１０ｍＭである。

界面活性剤もしくは洗剤、特に非イオン性界面活性剤は、ポリペプチドの可溶化を助けるためにならびに表面誘起（攪拌もしくは凍結）凝集からポリペプチドを保護する（それはまた剪断表面応力にさらされた際のタンパク質の変性および凝集の危険性も減らす）ために存在することができる。適当な非イオン性界面活性剤には、例えば、ポリソルベート（ポリオキシエチレンソルビタンエステル、例えばポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ^(R)−２０）、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ^(R)−８０）など）、ポリオキサマー（ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマー、例えばポロキサマー１８４、ポロキサマー１８８など）およびプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）^(R)ポリオールが包含される。好ましい非イオン性界面活性剤の例は、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ^(R)−２０）である。界面活性剤は、典型的には約０．００１％（ｗ／ｖ）〜約０．５％、例えば約０．００１％〜約０．０５％、例えば約０．００５％〜約０．０２５％、例えば約０．０１％もしくは約０．０２％の濃度で再構成組成物において存在する。

さらに、組成物は酸化防止剤、例えばアスコルビン酸、メチオニン、ベンジルアルコールもしくはビタミンＥ；充填剤もしくは増量剤、例えば澱粉；またはキレート剤、例えばＥＤＴＡのような様々な賦形剤を含んでなることができる。好ましい態様において、酸化防止剤はメチオニンである。再構成組成物における酸化防止剤の濃度は、典型的には約１ｍＭ〜約４０ｍＭ、例えば約２ｍＭ〜約３０ｍＭ、例えば約５ｍＭ〜約２０ｍＭ、例えば約１０ｍＭである。

防腐剤は微生物増殖を遅らせるために加えることができ、そして典型的には例えば約０．１％〜２％（ｗ／ｖ）の量で加えられる。本発明での使用に適当な防腐剤にはフェノール、ベンジルアルコール、メタ−クレゾール、オルト−クレゾール、パラ−クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ハロゲン化ベンザルコニウム（例えば、塩化、臭化もしくはヨウ化ベンザルコニウム）、塩化ヘキサメトニウム、メチルもしくはプロピルパラベンのようなアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノールおよび３−ペンタノールが包含される。

好ましい態様において、本発明の組成物はヒスチジン、トレハロース、塩化カルシウム、Ｔｗｅｅｎ^(R)−２０およびメチオニンを含んでなる。より好ましくは、その再構成形態の本発明のこの態様の組成物は約６．０〜約７．０のｐＨを有し、そして約１０ｍＭ〜約３０ｍＭのヒスチジン、例えば約１５〜約２５ｍＭのヒスチジン、約１５０ｍＭ〜約３００ｍＭのトレハロース、約２ｍＭ〜約２０ｍＭの塩化カルシウム、約０．００１％〜約
０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ^(R)−２０および約５ｍＭ〜約３０ｍＭのメチオニンを含んでなる。

さらなる態様において、組成物はグリシルグリシンを含有しない。

水分含量
ＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチド（例えば、組換えｈＦＶＩＩもしくはｈＦＶＩＩａポリペプチド）または本明細書に記述される組換えＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントは、液体形態で貯蔵される場合よりも乾燥形態で貯蔵される場合により安定であることが見出されているので、本発明の組成物は長期貯蔵用の乾燥形態で提供されることは上記の説明から明らかである。任意の凍結乾燥サイクルの成功の重要な決定要因は、凍結乾燥生成物に残存するのが見出される残留水の量であることは当該技術分野において既知である。従って、本発明の組成物の分水量（もしくは「水分含量」）は３％（ｗ／ｗ）以下、好ましくは２％以下、例えば約１％以下であるべきである。凍結乾燥した製薬学的組成物の含水量の決定方法は、当該技術分野において周知である；例えばＷＯ ２００３／０９２７３１を参照。周知の技術の一例はカール・フィッシャー滴定であり、それはサンプル中の微量の水を決定するために電量もしくは容量滴定を用いる。

安定性
本発明の組成物は、約２〜８℃の温度で、そして好ましくは約２０〜２５℃、すなわち「室温」のようなより高い温度で貯蔵することができる例えば使い捨てもしくはマルチ用途（ｍｕｌｔｉ−ｕｓｅ）バイアル、プレフィルドシリンジ、アンプルまたはカートリッジにおける長期貯蔵に適していると考えられる。「長期貯蔵」および「貯蔵安定性」という用語は、組成物が、ポリペプチドへの任意の実質的な損傷（例えば、タンパク質分解もしくは他の分解、または凝集または変性、ここで、分解、凝集もしくは変性は、例えば減少した効能もしくは免疫原性の危険性のために治療的使用に不適当な組成物をもたらす）を被ることなしに、既定温度、例えば２〜８℃、例えば約５℃で、そしてより好ましくは２０〜２５℃で、長期間、典型的には少なくとも約３ヶ月、好ましくは少なくとも約６ヶ月、より好ましくは少なくとも約１年、例えば少なくとも約１８ヶ月、例えば約２年までの期間にわたって貯蔵できることをさす。タンパク質の貯蔵安定性は、例えば、同じ貯蔵条件に供された対照組成物と比較するかまたは貯蔵に供されていないかもしくは例えば約−８０℃での低温貯蔵に供されている同じ組成物と比較した場合の活性に関して測定することができる。測定される活性は、例えばアミド分解活性もしくは凝固活性、例えば以下の材料および方法の節に記述される「第Ｘ因子活性化アッセイ」もしくは「ＰＡＣＴアッセイ」により決定されるような活性であることができる。ＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドまたはＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントのアミド分解もしくは凝固活性を決定するための適当なアッセイならびに他のＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａアッセイは当該技術分野において既知であり、そして例えばＷＯ ０１／５８９３５およびＷＯ
０３／０９３４６５に記述される。また、以下の材料および方法の節に記述される「全血アッセイ」および「凝固活性を測定する方法」も参照。

貯蔵安定性は、あるいはまたもしくはさらに、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、分析超遠心または他の直交もしくは補足法を用いて、当該技術分野において既知である方法により凝集体形成のレベルに関して測定することができる。従って、本発明の組成物の改善された貯蔵安定性は、物理的安定性、例えば減少した凝集体形成、および／または化学的安定性、例えば減少した分解もしくは減少した酸化を含んでなるものとする。

好ましい態様において、本発明の貯蔵安定性組成物は「熱安定性」であり、組成物が約２０℃の周囲温度で貯蔵される場合に、そして好ましくは約２５℃の温度で貯蔵される場合に上記に概説したような安定性特性を有することを意味する。従って、ＦＶＩＩもしく
はＦＶＩＩａポリペプチドまたはそのポリペプチドバリアントを含んでなる本発明の組成物は、好ましくは、少なくとも約３ヶ月、好ましくは少なくとも約６ヶ月、より好ましくは少なくとも約１年、例えば少なくとも約１８ヶ月、例えば約２年までの期間にわたる貯蔵の際に、２０℃の温度で、そして好ましくは２５℃で安定なものである。

本発明の組成物は、例えば上記に説明したような、定義された条件（温度および時間）下での貯蔵後に以下の基準の１つもしくはそれ以上をそれが満たす場合に「安定である」と見なすことができる。安定性の評価のために、試験する貯蔵組成物は、時間０での（すなわち、貯蔵期間の開始時の）同じ組成物もしくは−８０℃で同じ時間の長さにわたって凍結乾燥形態で貯蔵されている同じ組成物のいずれかであることができる対照と比較される。対照組成物は、典型的には、−８０℃で貯蔵した凍結乾燥組成物である。
・例えば本明細書に記述される「第Ｘ因子活性化アッセイ」もしくは「ＰＡＣＴアッセイ」を用いて決定される、生物活性：少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の対照と比較した生物活性。
・例えば下記のようなＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて決定される、凝集度：３％以下（絶対的に）、好ましくは２．５％以下、より好ましくは２％以下、さらにより好ましくは１．５％以下、例えば１％以下の対照と比較した凝集の増加。
・例えば下記のようなＲＰ−ＨＰＬＣにより決定されるような、酸化：酸化は、対照の酸化度と比較して５％以下（絶対的に）、好ましくは３％以下、より好ましくは２％以下、そして最も好ましくはわずか１％以下しか増加すべきではない。
・例えば下記のようなＲＰ−ＨＰＬＣにより決定されるような、重鎖分解は、対照の重鎖分解度と比較して５％以下（絶対的に）、好ましくは３％以下、より好ましくは２％以下、最も好ましくはわずか１％以下しか増加すべきではない。

凍結乾燥組成物は、例えば、使用直前の溶媒での再構成用に使い捨てもしくは再使用バイアル、プレフィルドシリンジ、アンプルまたはカートリッジにおいて包装することができる。溶媒は典型的には滅菌水であるが、場合により凍結乾燥組成物において他に存在することができる１つもしくはそれ以上の成分、例えば張性調整剤、非イオン性界面活性剤、酸化防止剤もしくは防腐剤を含んでもよい。投与を容易にするために、本発明の凍結乾燥組成物はあるいはまたプレフィルド２コンパートメントシリンジにおいて包装することができ、ここで、コンパートメントの一方はＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドまたはそのポリペプチドバリアントを含んでなる凍結乾燥組成物を含有し、そしてもう一方のコンパートメントは溶媒、典型的には滅菌水を含有し、従って、ＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドまたはそのポリペプチドバリアントを含んでなる乾燥組成物を投与の直前に適量の水と迅速にそして容易に混合することを可能にする。本発明の組成物の再構成に使用する水は、製薬産業においてこの目的のために一般に用いられるタイプの滅菌水、例えば注射用滅菌水（ＷＦＩ）、点眼用溶解液、緩衝用水もしくは食塩水である。ＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドまたはそのポリペプチドバリアントの量に対する再構成に使用する水の量は、凍結乾燥前の元の組成物における水の量に対応することが多いが必ずしもそうではない。下記のように、本発明の再構成組成物におけるポリペプチドもしくはポリペプチドバリアントの濃度は典型的には約０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌ、より典型的には０．１〜５ｍｇ／ｍｌ、例えば約０．２〜２ｍｇ／ｍｌ、典型的には約０．４〜１．５ｍｇ／ｍｌ、例えば約０．５〜１．０ｍｇ／ｍｌの範囲である。所望に応じて、ＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドまたはそのポリペプチドバリアントを濃縮する手段として凍結乾燥を用いることができ、その場合、再構成組成物における水の量は、凍結乾燥前の元の組成物における量より少ない。

ポリペプチド
本発明に従って調合することができるポリペプチドには、特に組換えヒトＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチド（そのポリペプチド配列は、配列番号：１に示される）ならびにその組換えＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアント（例えば、配列番号：１に示されるヒトＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドのポリペプチドバリアント）が包含され、本明細書に詳細に記述されるもの、そして好ましくは活性型を包含する。興味のあるＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントには、例えば、ＷＯ ０１／５８９３５、ＷＯ ０３／０９３４６５、ＷＯ ２００４／０２９０９１、ＷＯ ２００４／１１１２４２、ＷＯ ９９／２０７６７、ＷＯ ００／６６７５３、ＷＯ ８８／１０２９５、ＷＯ ９２／１５６８６、ＷＯ ０２／２９０２５、ＷＯ ０１／７０７６３、ＷＯ ０１／８３７２５、ＷＯ ０２／０２７６４、ＷＯ ０２／２２７７６、ＷＯ ０２／３８１６２、ＷＯ ０２／０７７２１８、ＷＯ ０３／０２７１４７、ＷＯ ０３／０３７９３２、ＷＯ ２００４／０００３６６、ＷＯ ２００４／０２９０９０およびＷＯ ２００４／１０８７６３に記述されるものが包含される。

ＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントは、例えば、野生型ヒトＦＶＩＩ（配列番号：１）のアミノ酸配列と１〜１５個のアミノ酸残基において（例えば、１〜１５個以下のアミノ酸残基において）、典型的には１〜１２もしくは１〜１０個のアミノ酸残基において、例えば１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３もしくは１〜２個のアミノ酸残基または１個のアミノ酸残基において異なるポリペプチドバリアントをもたらす、配列番号：１に示される野生型ヒトＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチド配列と比較して１個もしくはそれ以上のアミノ酸置換、挿入および／もしくは欠失を含むことができ、ここで、配列番号：１に示される野生型ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ配列とのアミノ酸配列の違い（１つもしくは複数）は、典型的には１個もしくはそれ以上のアミノ酸置換である。そのようなアミノ酸置換は、例えば、Ｎ−グリコシル化部位（例えば、インビボで（例えば、グリコシル化哺乳類細胞におけるポリペプチドの製造によって）もしくはインビトログリコシル化（すなわち、場合により架橋剤を用いて、ポリペプチドバリアントの結合基に炭水化物分子を共有結合することを通常は伴うインビトロで行われる合成的グリコシル化）によりグリコシル化することができるＮ−グリコシル化部位）を包含する１個もしくはそれ以上のグリコシル化部位を導入するか、またはポリペプチドに１個もしくはそれ以上のＰＥＧ化部位を導入する目的で、そして／あるいは例えば凝固活性を改善するためのＧ１ａドメイン（ｈＦＶＩＩａのアミノ酸残基１〜４５）における１個もしくはそれ以上のアミノ酸置換によって、野生型ポリペプチドの凝固活性を改善するかもしくはそうでなければ改変するために行うことができる。ＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントは、典型的に凝固活性を有する。凝固活性は、本明細書に記述される凝固アッセイの１つもしくは当該技術分野において既知である多数の凝固アッセイの１つを用いて測定することができる。凝固活性を有する典型的なＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントは以下に説明され、そしてＷＯ ０１／５８９３５、ＷＯ ０３／０９３４６５、ＷＯ ２００４／０２９０９１およびＷＯ ２００４／１１１２４２にさらに詳細に記述される。あるいはまた、ＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントが抗凝固剤として働くように設計される場合、本発明の組成物は減少した凝固活性を有するＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントを含んでなることができる。

本発明の組成物における使用に適当な好ましいＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントは、Ｇ１ａドメイン（ヒトＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａの残基１〜４５）における少なくとも１つの改変および／もしくは非ポリペプチド部分の結合部位を導入する少なくとも１つのアミノ酸改変を含む。非ポリペプチド部分には、例えば糖部分もしくは非ポリペプチドポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーが包含される。そのような改変の限定されない例は、以下に提供される。

Ｇ１ａドメインの改変：１つの態様において、本発明は１５個以下のアミノ酸残基（例えば１２個以下、１０、８、７、６、５、４、３、２、１個のアミノ酸残基）において配列番号：１におけるｈＦＶＩＩもしくはｈＦＶＩＩａのポリペプチド配列と異なるポリペプチド配列を含んでなる凝固活性を有する組換えＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントを提供し、該ポリペプチドバリアントはＧ１ａドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸改変、特にＧ１ａドメインにおける該改変のない同様のポリペプチドと比較して増加したリン脂質膜結合親和性をもたらす少なくとも１つの改変を有する。Ｇ１ａドメインにおけるそのような改変は、例えばＷＯ ９９／２０７６７、ＷＯ ００／６６７５３およびＷＯ ０３／０９３４６５に開示され、そして配列番号：１に対して位置１０、１１、２８、３２、３３および３４の１つもしくはそれ以上における改変を含む。バリアントにおけるアミノ酸位置は、典型的に、配列番号：１のアミノ酸位置に従って番号を付けられる。好ましくは、バリアントは少なくとも位置１０もしくは３２、好ましくは両方における改変を含む。従って、バリアントは位置１０におけるグルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸もしくはアスパラギン残基、好ましくはグルタミン残基の置換；および／または位置３２におけるグルタミン酸もしくはアスパラギン酸残基、好ましくはグルタミン酸の置換を含むことができる。好ましくは、バリアントは位置１０および３２の両方での置換、より好ましくは置換Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅを含む。

別の態様において、本発明は、配列番号：１におけるｈＦＶＩＩもしくはｈＦＶＩＩａのポリペプチド配列と１５個以下のアミノ酸残基（例えば１２個以下、１０、８、７、６、５、４、３、２、１個のアミノ酸残基）において異なるポリペプチド配列を含んでなる凝固活性を有する組換えＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントを提供し、該ポリペプチドバリアントは、配列番号：１のアミノ酸位置１０、１１、２８、３２、３３、３４および／もしくは３６における１個もしくはそれ以上のアミノ酸少なくとも１個のアミノ酸置換を有し、ここで、バリアントにおけるアミノ酸位置は配列番号：１に従って番号が付けられる。

別の態様において、凝固活性を有するＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントは、配列番号：１の位置２８でグルタミン酸もしくはフェニルアラニン残基のアミノ酸置換；または位置３３における疎水性アミノ酸残基の置換を含み、置換は配列番号：１のＤ３３Ｉ、Ｄ３３Ｌ、Ｄ３３Ｍ、Ｄ３３Ｖ、Ｄ３３Ｆ、Ｄ３３ＹおよびＤ３３Ｗよりなる群、特にＤ３３Ｆから選択される。

別の態様において、凝固活性を有するＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントは、配列番号：１の位置３４における負に荷電した残基のアミノ酸置換、すなわちＡ３４ＥもしくはＡ３４Ｄ、好ましくはＡ３４Ｅを含む。あるいはまた、バリアントは配列番号：１の位置３４における置換により導入される疎水性アミノ酸残基を含むことができる。この場合、配列番号：１の位置３４に導入される疎水性アミノ酸残基はＩ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、ＹおよびＷよりなる群から選択することができる。この位置における好ましい置換には、Ａ３４ＥおよびＡ３４Ｌが包含される。

別の態様において、凝固活性を有するＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントは、配列番号：１の位置３６におけるアミノ酸置換を含む。好ましくは、位置３６における置換により導入されるアミノ酸残基は負に荷電したアミノ酸残基、すなわちＲ３６ＥもしくはＲ３６Ｄ、特にＲ３６Ｅである。

別の態様において、凝固活性を有するＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリア
ントは、配列番号：１の位置３８におけるアミノ酸置換、特に位置３８における置換より導入される負に荷電したアミノ酸残基、すなわちＫ３８ＥもしくはＫ３８Ｄ、特にＫ３８Ｅを含む。

別の態様において、ＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントは、配列番号：１の位置３と４の間に少なくとも１個の（典型的には１個の）アミノ酸残基の挿入を含む。挿入されるアミノ酸残基は、好ましくは疎水性アミノ酸残基である。典型的な挿入は、配列番号：１の位置３のアミノ酸残基（アラニン）と位置４のアミノ酸残基（フェニルアラニン）との間にチロシン残基の導入を含んでなり、この挿入はＡ３ＡＹと表される。

Ｇ１ａドメインに多数の置換を有するそのようなＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントの具体例には：配列番号：１に対してＰ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ａ３４Ｅ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ｒ３６Ｅ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ｋ３８Ｅ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ａ３４Ｅ＋Ｒ３６Ｅ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ｒ３６Ｅ＋Ｋ３８Ｅ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ａ３４Ｅ＋Ｋ３８Ｅ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ａ３４Ｅ＋Ｒ３６Ｅ＋Ｋ３８Ｅ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ａ３４Ｌ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ａ３４Ｌ＋Ｒ３６Ｅ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ａ３４Ｌ＋Ｋ３８Ｅ；およびＰ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ａ３４Ｌ＋Ｒ３６Ｅ＋Ｋ３８Ｅが包含される。バリアントにおけるアミノ酸位置は、配列番号：１に従って番号が付けられる。多数のそのようなバリアントは凝固活性を有する。凝固活性は、本明細書に記述される凝固アッセイの１つもしくは当該技術分野において既知である多数の凝固アッセイの１つを用いて測定することができる。

グリコシル化部位の導入：別の態様において、本発明の組成物において使用する、凝固活性を有するものを包含する、ＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントは、野生型配列（配列番号：１）を有するｈＦＶＩＩもしくはｈＦＶＩＩａと比較してＮ−グリコシル化部位（例えばインビボＮ−グリコシル化部位を包含する）を導入する１つもしくはそれ以上のアミノ酸改変、典型的にはアミノ酸置換を含んでなるポリペプチド配列を含んでなる。Ｎ−グリコシル化部位は配列Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ／Ｃを有し、ここで、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸残基であり、Ｎはアスパラギンであり、そしてＳ／Ｔ／Ｃはセリン、トレオニンもしくはシステインのいずれか、好ましくはセリンもしくはトレオニン、そして最も好ましくはトレオニンである。従って、例えばインビボＮ−グリコシル化を包含するＮ−グリコシル化のための結合部位は、バリアント配列において必要なＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔ／Ｃトリプレットを得るために１もしくは２個のアミノ酸残基のアミノ酸改変、典型的にはアミノ酸置換により導入することができる。

ｈＦＶＩＩもしくはｈＦＶＩＩａポリペプチド配列（配列番号：１）に対して１個もしくはそれ以上の導入されたＮ−グリコシル化部位を有するＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントは、天然ｈＦＶＩＩ／ｈＦＶＩＩａ配列（配列番号：１）に対して１〜５個の追加のＮ−グリコシル化部位、例えば１〜４もしくは１〜３個の追加のＮ−グリコシル化部位、例えば１、２もしくは３個の追加のＮ−グリコシル化部位を含んでなることができる。１つの特定の態様において、ＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントは、天然ｈＦＶＩＩ／ｈＦＶＩＩａ配列に対して１〜５個の追加のインビボＮ−グリコシル化部位、例えば１〜４もしくは１〜３個の追加のインビボＮ−グリコシル化部位、例えば１、２もしくは３個の追加のインビボＮ−グリコシル化部位を含んでなることができる。ヒトＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａは、位置Ｎ１４５、Ｎ３２２、Ｓ５２およびＳ６０で４個の天然に存在するグリコシル化部位を有し、ここで、Ｓ５２およびＳ６０はＯ−グリコシル化部位であり、そしてＮ１４５およびＮ３２２はＮ−グリコシル化部位である。１個もしくはそれ以上のＮ−グリコシル化部位への糖部分の結合は、インビトロで（例えば、場合により架橋剤を用いて、典型的にはポリペプチドバリアントの結合基に炭水化物分子を共有結合することを伴う、インビトロで行われる既知の合成的グリコシル化
技術により）もしくはインビボグリコシル化ができる宿主細胞（例えば、酵母、真菌もしくは哺乳類細胞のような真核細胞）におけるポリペプチドバリアントの発現により行うことができる。典型的な哺乳類細胞には、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞（例えば、ＣＨＯ−Ｉ細胞）、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ細胞などが包含される。

アミノ酸置換（１個もしくは複数）により導入されるＮ−グリコシル化部位（例えばインビボＮ−グリコシル化部位）をもたらす置換の具体例には、Ａ５１Ｎ、Ｇ５８Ｎ、Ｔ１０６Ｎ、Ｋ１０９Ｎ、Ｇ１２４Ｎ、Ｋ１４３Ｎ＋Ｎ１４５Ｔ、Ａ１７５Ｔ、Ｉ２０５Ｓ、Ｉ２０５Ｔ、Ｖ２５３Ｎ、Ｔ２６７Ｎ、Ｔ２６７Ｎ＋Ｓ２６９Ｔ、Ｓ３１４Ｎ＋Ｋ３１６Ｓ、Ｓ３１４Ｎ＋Ｋ３１６Ｔ、Ｒ３１５Ｎ＋Ｖ３１７Ｓ、Ｒ３１５Ｎ＋Ｖ３１７Ｔ、Ｋ３１６Ｎ＋Ｇ３１８Ｓ、Ｋ３１６Ｎ＋Ｇ３１８Ｔ、Ｇ３１８ＮおよびＤ３３４Ｎよりなる群から選択されるアミノ酸置換が包含され、ここで、バリアントにおけるアミノ酸位置は配列番号：１における位置に従って番号が付けられる。好ましいアミノ酸置換には、Ｔ１０６Ｎ、Ｉ２０５ＴおよびＶ２５３Ｎの１つもしくはそれ以上が包含される。

１つの態様において、１個のみのＮ−グリコシル化部位（例えばインビボＮ−グリコシル化部位）がアミノ酸置換により導入されている。別の態様において、２個もしくはそれ以上のＮ−グリコシル化部位（例えばインビボＮ−グリコシル化部位）がアミノ酸置換により導入されている。２個のＮ−グリコシル化部位をもたらす好ましいアミノ酸置換には、Ｔ１０６Ｎ＋Ａ１７５Ｔ、Ｔ１０６Ｎ＋Ｉ２０５Ｔ、Ｔ１０６Ｎ＋Ｖ２５３Ｎ、Ｔ１０６Ｎ＋Ｔ２６７Ｎ＋Ｓ２６９Ｔ、Ａ１７５Ｔ＋Ｉ２０５Ｔ、Ａ１７５Ｔ＋Ｖ２５３Ｎ、Ａ１７５Ｔ＋Ｔ２６７Ｎ＋Ｓ２６９Ｔ、Ｉ２０５Ｔ＋Ｖ２５３Ｎ、Ｉ２０５Ｔ＋Ｔ２６７Ｎ＋Ｓ２６９ＴおよびＶ２５３Ｎ＋Ｔ２６７Ｎ＋Ｓ２６９Ｔよりなる群から、より好ましくはＴ１０６Ｎ＋Ｉ２０５Ｔ、Ｔ１０６Ｎ＋Ｖ２５３ＮおよびＩ２０５Ｔ＋Ｖ２５３Ｎよりなる群から選択されるアミノ酸置換が包含され、ここで、バリアントにおけるアミノ酸位置は配列番号：１における位置に従って番号が付けられる。

さらなる態様において、３個もしくはそれ以上のＮ−グリコシル化部位（例えばインビボＮ−グリコシル化部位）が置換により導入されている。３個のＮ−グリコシル化部位をもたらす好ましい置換の例には、Ｉ２０５Ｔ＋Ｖ２５３Ｎ＋Ｔ２６７Ｎ＋Ｓ２６９ＴおよびＴ１０６Ｎ＋Ｉ２０５Ｔ＋Ｖ２５３Ｎよりなる群から選択される置換が包含され、ここで、バリアントにおけるアミノ酸位置は配列番号：１における位置に従って番号が付けられる。

Ｇ１ａドメインにおける改変および導入されたＮ−グリコシル化部位を有するポリペプチドバリアント：さらなる態様において、本発明の組成物は、上記のそれぞれの節に記述されるようなＧ１ａドメインにおける少なくとも１つの改変および少なくとも１個の導入されたＮ−グリコシル化部位（例えばインビボＮ−グリコシル化部位）を有するポリペプチド配列を含んでなる凝固活性を有するＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントを含んでなることができる。

Ｇ１ａドメインにおける多数の置換および少なくとも１個の導入されたＮ−グリコシル化部位を含んでなる凝固活性を有する「組み合わされた」ＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントの具体例には：Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ｔ１０６Ｎ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ａ３４Ｅ＋Ｔ１０６Ｎ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ｒ３６Ｅ＋Ｔ１０６Ｎ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ａ３４Ｅ＋Ｒ３６Ｅ＋Ｔ１０６Ｎ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ｉ２０５Ｔ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ａ３４Ｅ＋Ｉ２０５Ｔ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ｒ３６Ｅ＋Ｉ２０５Ｔ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ａ３４Ｅ＋Ｒ３６Ｅ＋Ｉ２０５Ｔ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ｖ２５３Ｎ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ａ３４Ｅ＋Ｖ２５３Ｎ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ｒ３６Ｅ＋Ｖ２５３Ｎ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ａ３４Ｅ＋Ｒ３６Ｅ＋Ｖ２５３Ｎ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ｔ
１０６Ｎ＋Ｉ２０５Ｔ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ａ３４Ｅ＋Ｔ１０６Ｎ＋Ｉ２０５Ｔ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ｒ３６Ｅ＋Ｔ１０６Ｎ＋Ｉ２０５Ｔ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ａ３４Ｅ＋Ｒ３６Ｅ＋Ｔ１０６Ｎ＋Ｉ２０５Ｔ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ｔ１０６Ｎ＋Ｖ２５３Ｎ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ａ３４Ｅ＋Ｔ１０６Ｎ＋Ｖ２５３Ｎ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ｒ３６Ｅ＋Ｔ１０６Ｎ＋Ｖ２５３Ｎ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ａ３４Ｅ＋Ｒ３６Ｅ＋Ｔ１０６Ｎ＋Ｖ２５３Ｎ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ｉ２０５Ｔ＋Ｖ２５３Ｎ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ａ３４Ｅ＋Ｉ２０５Ｔ＋Ｖ２５３Ｎ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ｒ３６Ｅ＋Ｉ２０５Ｔ＋Ｖ２５３Ｎ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ａ３４Ｅ＋Ｒ３６Ｅ＋Ｉ２０５Ｔ＋Ｖ２５３Ｎ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ｔ１０６Ｎ＋Ｉ２０５Ｔ＋Ｖ２５３Ｎ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ａ３４Ｅ＋Ｔ１０６Ｎ＋Ｉ２０５Ｔ＋Ｖ２５３Ｎ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ｒ３６Ｅ＋Ｔ１０６Ｎ＋Ｉ２０５Ｔ＋Ｖ２５３Ｎ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ａ３４Ｅ＋Ｒ３６Ｅ＋Ｔ１０６Ｎ＋Ｉ２０５Ｔ＋Ｖ２５３Ｎ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ａ３４Ｌ＋Ｔ１０６Ｎ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ａ３４Ｌ＋Ｉ２０５Ｔ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ａ３４Ｌ＋Ｖ２５３Ｎ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ａ３４Ｌ＋Ｔ１０６Ｎ＋Ｉ２０５Ｔ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ａ３４Ｌ＋Ｔ１０６Ｎ＋Ｖ２５３Ｎ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ａ３４Ｌ＋Ｉ２０５Ｔ＋Ｖ２５３Ｎ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ａ３４Ｌ＋Ｔ１０６Ｎ＋Ｉ２０５Ｔ＋Ｖ２５３Ｎ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ａ３４Ｌ＋Ｒ３６Ｅ＋Ｔ１０６Ｎ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ａ３４Ｌ＋Ｒ３６Ｅ＋Ｉ２０５Ｔ；Ｐｌ０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ａ３４Ｌ＋Ｒ３６Ｅ＋Ｖ２５３Ｎ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ａ３４Ｌ＋Ｒ３６Ｅ＋Ｔ１０６Ｎ＋Ｉ２０５Ｔ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ａ３４Ｌ＋Ｒ３６Ｅ＋Ｔ１０６Ｎ＋Ｖ２５３Ｎ；Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ａ３４Ｌ＋Ｒ３６Ｅ＋Ｉ２０５Ｔ＋Ｖ２５３Ｎ；およびＰ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ａ３４Ｌ＋Ｒ３６Ｅ＋Ｔ１０６Ｎ＋Ｉ２０５Ｔ＋Ｖ２５３Ｎが包含され；ここで、バリアントにおけるアミノ酸位置は配列番号：１における位置に従って番号が付けられる。

組織因子結合部位における改変を有するポリペプチドバリアント：別の態様において、本発明の組成物は、Ｌ３９、Ｉ４２、Ｓ４３、Ｋ６２、Ｌ６５、Ｆ７１、Ｅ８２およびＦ２７５よりなる群から選択される配列番号：１における少なくとも１つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を有するポリペプチド配列を含んでなる凝固活性を有するＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントを含んでなることができ、ここで、バリアントにおけるアミノ酸位置は配列番号：１における位置に従って番号が付けられる。ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ分子の組織因子（ＴＦ）結合部位におけるこれらのアミノ酸置換は、ｈＦＶＩＩ／ｈＦＶＩＩａと比較して改善された凝固活性をもたらす。ＴＦ結合部位中のこれらのアミノ酸位置における好ましい置換には以下のもの：Ｌ３９Ｅ、Ｌ３９ＱもしくはＬ３９Ｈ；Ｉ４２Ｒ；Ｓ４３Ｑ；Ｋ６２ＥもしくはＫ６２Ｒ；Ｌ６５ＱもしくはＬ６５Ｓ；Ｆ７１Ｄ、Ｆ７１Ｅ、Ｆ７１Ｎ、Ｆ７１ＱもしくはＦ７１Ｙ；Ｅ８２ＱもしくはＥ８２Ｎ；Ｆ２７５Ｈが包含され、ここで、バリアントにおけるアミノ酸位置は配列番号：１における位置に従って番号が付けられる。この態様のＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントは、例えば、配列番号：１におけるこれらのアミノ酸置換の１、２もしくは３つを含んでなることができる。好ましい置換にはＳ４３Ｑ、Ｋ６２Ｅ、Ｌ６５ＱおよびＦ７１Ｙの１つもしくはそれ以上、特にＳ４３Ｑ、Ｋ６２ＥおよびＬ６５Ｑの１つもしくはそれ以上が包含され、ここで、バリアントにおけるアミノ酸位置は配列番号：１における位置に従って番号が付けられる。ＴＦ結合部位における改変を有するこのタイプのバリアントについてのさらなる情報は、ＷＯ ２００４／０２９０９１に見出されることができる。ＴＦ結合部位におけるこれらの置換は、所望に応じて、本明細書において他の所で記述される他のタイプの改変、例えば上記のようなＧ１ａドメインにおける改変（例えば、アミノ酸置換、挿入もしくは欠失）、少なくとも１個のＮ−グリコシル化部位（例えばインビボＮ−グリコシル化部位）の導入および／もしくは下記のようなＰＥＧポリマーとの連結の１つもしくはそれ以上と組み合わせることができることが理解される。

導入されたＰＥＧ化部位を有するポリペプチドバリアント：さらなる態様において、本
発明の組成物は、リシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、ヒスチジン残基およびチロシン残基よりなる群、好ましくはシステインもしくはリシン残基から選択される結合基に連結された少なくとも１個のポリマー分子、特にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）もしくは他のポリアルキレンオキシドを有するＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントを含んでなることができる。

様々なポリペプチドをポリエチレングリコール部分と連結する方法（「ＰＥＧ化」）は、当該技術分野において既知である。例えば、ＷＯ ０１／５８９３５は、ＰＥＧ化のための少なくとも１個の導入されたそして／もしくは除かれた結合部位、例えば、場合によりＰＥＧ化が所望されない位置における１個もしくはそれ以上のリシン残基の除去と組み合わせて、１個もしくはそれ以上の導入されたリシン残基、または１個もしくはそれ以上の導入されたシステイン残基（この場合、場合により１個もしくはそれ以上のシステイン残基の除去と組み合わせて）を有するようにｈＦＶＩＩもしくはｈＦＶＩＩａ配列（配列番号：１）に対して改変されているＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントにＰＥＧ部分を結合することができる方法を記述する。ＰＥＧ化に関するさらなる情報は、例えば、ＰＥＧポリマーに連結されたＦＶＩＩａのようなビタミンＫ依存性ポリペプチド、例えば野生型ヒトＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａおよび置換Ｐ１０ＱおよびＫ３２Ｅを有するＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａのバリアントを開示するＷＯ ０２／０２７６４に、そしてＮ末端でＰＥＧ化されたタンパク質を製造する方法を記述するＷＯ ９６／１１９５３に、そしてＮｅｋｔａｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ Ｃａｔａｌｏｇ ２００５−２００６，“Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ”（Ｎｅｋｔａｒ
Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）に見出されることができる。本発明の組成物における使用のためのＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントはまた、１個もしくはそれ以上のＰＥＧポリマーの結合に加えて、例えば増加したリン脂質膜結合親和性および／もしくは増加した組織因子非依存性活性を与えるために、そして／または１個もしくはそれ以上の導入されたＮ−グリコシル化部位（例えば、導入されたインビボＮ−グリコシル化部位）を与えるために本明細書において他に記述されるアミノ酸改変の１つもしくはそれ以上を含むこともできることが理解される。

他の改変：さらなる態様において、本発明の組成物における使用のためのバリアントは、場合により上記の改変の１つもしくはそれ以上に加えて、位置７４、７７および１１６よりなる群から選択される位置における少なくとも１個のさらなるアミノ酸置換、特にＰ７４Ｓ、Ｅ７７Ａおよび／もしくはＥ１１６Ｄを含んでなることができ、ここで、バリアントにおけるアミノ酸位置は配列番号：１における位置に従って番号が付けられる。なおさらなる態様において、ＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントは、ポリペプチドの固有の活性を増加することが既知である１つもしくはそれ以上の突然変異を含んでなるポリペプチド配列を含んでなることができる、例えばＷＯ ０２／２２７７６に記述されるもの。例えば、バリアンントは、１５７、１５８、２９６、２９８、３０５、３３４、３３６、３３７および３７４よりなる群から選択される配列番号：１のアミノ酸位置における少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば置換）を含んでなることができ、ここで、バリアントにおけるアミノ酸位置は配列番号：１における位置に従って番号が付けられる。そのような置換の例には、Ｖ１５８Ｄ、Ｅ２９６Ｄ、Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５ＶおよびＫ３３７Ａの１つもしくはそれ以上が包含される。

組換えＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａポリペプチド（例えば、ｈＦＶＩＩもしくはｈＦＶＩＩａ）または本明細書に記述されるその任意の組換えＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントは任意の適当な生物により、例えば哺乳類、酵母もしくは細菌細胞、真核細胞が好ましいが、より好ましくはインビボグリコシル化ができる宿主細胞、特にＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞もしくはＢＨＫ細胞のような哺乳類細胞において製造することができる。
例えば哺乳類細胞を用いる組換えＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａポリペプチドならびにそのポリペプチドバリアントの製造方法は、組換えポリペプチドのその後の精製および単離の方法がそうであるように、当該技術分野において周知である。例えば、ＷＯ ０１／５８９３５、ＷＯ ０３／０９３４６５およびＷＯ ２００５／００２６１５を参照。

本発明の組成物（再構成後）におけるＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドまたはＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントの濃度は異なることができ、そして約０．００１〜１００ｍｇ／ｍｌ、例えば約０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌ、典型的には約０．１〜５ｍｇ／ｍｌ、例えば約０．２〜２ｍｇ／ｍｌ、例えば約０．４〜１．５ｍｇ／ｍｌ、例えば約０．５〜１．０ｍｇ／ｍｌの範囲である。例えば、濃度は水での再構成後のＮｏｖｏＳｅｖｅｎ^(R)のものと同様であることができ、それは約０．６ｍｇ／ｍｌであるか、もしくは約１．０ｍｇ／ｍｌのようにわずかに高い。凝固活性を有する組換えＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントについて、ポリペプチドの濃度はある場合においてわずかに低い、例えば約０．１〜０．５ｍｇ／ｍｌ、例えば約０．２〜０．４ｍｇ／ｍｌであることができる。

さらなる態様
さらなる態様において、本発明は、ヒスチジン緩衝剤および水とＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドまたはそのポリペプチドバリアントの混合物を準備して少なくとも５ｍＭのヒスチジン濃度を有しそして場合により張性調整剤、カルシウムもしくは別の２価の陽イオン、界面活性剤、酸化防止剤または防腐剤の１つもしくはそれ以上のような他の成分を有する水性組成物をもたらすこと、および得られる水性組成物を凍結乾燥に供して例えば本明細書において他の所で記述されるような凍結乾燥組成物をもたらすことを含んでなる、ＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドまたはそのポリペプチドバリアントを含んでなる貯蔵安定性組成物を製造する方法に関する。このタイプの凍結乾燥タンパク質組成物は、「凍結乾燥ケーキ」と呼ばれることが多い。ＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドまたはそのポリペプチドバリアントの組成物を安定させるためにこの方法において使用する緩衝剤および任意の他の追加成分の性質および量は上記のとおりであることが理解される。バイアルもしくはプレフィルド２コンパートメントシリンジのような別のタイプの容器への調合された薬剤物質の充填および凍結乾燥方法は、凍結乾燥されるタンパク質の量ならびに凍結乾燥が行われる容器のタイプにより決まる。タンパク質もしくはポリペプチド組成物もしくは製剤および凍結乾燥に適当な方法は文献に記述され、そして当業者に既知である。

なおさらなる態様において、本発明は、ＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドまたは本明細書に記述されるようなＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントを含んでなる本発明の再構成組成物の治療的に有効な量を処置もしくは予防を必要とする哺乳類に投与することを含んでなる、ＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドまたはＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントの投与により処置できる哺乳類（例えば、非ヒト霊長類、ヒト、マウス、サルなど）における症状を治療的にもしくは予防的に処置するかもしくは予防する方法、ならびにＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａまたはそのポリペプチドバリアントの投与により処置できる哺乳類における症状を処置するかもしくは予防するための薬剤の製造のためのＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドまたは本明細書に記述されるようなＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントを含んでなる本発明の組成物の使用に関する。

ＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａまたはそのポリペプチドバリアントの投与により（そして／またはその組成物により）哺乳類において予防的にもしくは治療的に処置できる症状には、例えば血液因子欠乏症、特に血友病ＡもしくはＢ、ならびに外傷（鈍的および穿通性外傷の両方）と関連する出血、脳内出血（ＩＣＨ）、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、熱傷、静
脈瘤出血、胃腸出血、外科的出血、移植（例えば、組織移植もしくは臓器移植）、フィブリン溶解処置、抗凝固処置、分娩後出血、ウイルス誘発性出血、フォンヴィルブラント病および血小板減少症が包含されるがこれらに限定されるものではない。ＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａまたはＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントの投与により処置することができる症状に関するさらなる情報についてはＷＯ ２００６／１１４１０５を参照。

本発明はまた、哺乳類における血餅形成を増加するために有効な量の少なくとも１つのＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドまたは少なくとも１つのＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントを含んでなる本発明の組成物を増加した血餅形成を必要とする哺乳類に投与することを含んでなる、増加した血餅形成が望ましい疾患もしくは症状を有する哺乳類における血餅形成を増加する方法も提供する。増加した血餅形成が望ましい疾患もしくは症状には、血友病ＡもしくはＢのような血友病、ならびに外傷（鈍的および穿通性外傷の両方）と関連する出血、脳内出血（ＩＣＨ）、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、熱傷、静脈瘤出血、胃腸出血、外科的出血、移植（例えば、組織移植もしくは臓器移植）、フィブリン溶解処置、抗凝固処置、分娩後出血、ウイルス誘発性出血、フォンヴィルブラント病および血小板減少症が包含されるがこれらに限定されるものではない。ＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａまたはＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントの投与により増加した血餅形成が促進され得る疾患および症状に関するさらなる情報についてはＷＯ ２００６／１１４１０５を参照。

本発明の組成物は、単回もしくは頻回注射（ボーラスもしくは注入）として哺乳類に投与することができ、そして例えば非経口、例えば皮下、筋肉内もしくは静脈内投与することができる。典型的には、本発明の組成物は哺乳類に静脈内投与される。ポリペプチドの投薬量は、例えば処置される症状および患者の体重により決まるが、ｒｈＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ^(R)）に使用される投薬量と同様であることが多く、例えば約２０〜約３００μｇ／ｋｇ、典型的には約２５〜約１５０μｇ／ｋｇ、例えば約４０〜約１２０μｇ／ｋｇである。

本発明は、本発明の組成物を説明する以下の限定されない実施例によりさらに記述される。

材料および方法
組換えＦＶＩＩａポリペプチドバリアントの製造
以下の実施例において使用する組換え第ＶＩＩａ因子ポリペプチドバリアントは、組換えｈＦＶＩＩａのバリアントであった。このポリペプチドバリアントは、配列番号：１に示される野性型ヒトＦＶＩＩａのポリペプチド配列と比較して置換Ｐ１０Ｑ＋Ｋ３２Ｅ＋Ａ３４Ｅ＋Ｒ３６Ｅ＋Ｔ１０６Ｎ＋Ｖ２５３Ｎを含んでなった。凝固活性を有するこのＦＶＩＩａポリペプチドバリアントは、実質的にＷＯ ２００４／１１１２４２に記載の通りＣＨＯ−Ｋ１細胞において製造され、そして実質的にＷＯ ２００６／０７４６６４に記載の通り精製された。

ＦＶＩＩ組成物もしくは製剤の製造
上記に概説した通り製造した凍結薬剤物質を融解し、滅菌濾過し、そして実施例１および３において以下に示される凍結乾燥パラメーターを用いて凍結乾燥した。タンパク質（ポリペプチド）もしくは賦形剤濃度についての調整は行わなかった。

吸光度
タンパク質（ポリペプチド）濃度およびタンパク質回収パーセントは、Ａ_２８０で吸光
度を測定することにより決定した。組成物もしくは製剤は、吸光度を測定する前に微量遠心した。分析は、９６ウェル石英プレートを用いて二重反復（１５０μｌ／ウェル）で行った。各組成物もしくは製剤のそれぞれのバッファーは、読み取りのブランクに使用した。補正ｍｇ／ｍｌ計算は、１．２の消衰係数に基づいた。

ｐＨ測定
ｐＨの読み取りは、Ｃｏｒｎｉｎｇ ｐＨメーター４４０を用いて較正後に行った。

再構成時間
凍結乾燥組成物もしくは製剤を下記のように滅菌水において再構成した：バイアルを４５℃の角度で傾け、そして水をガラスに滴下した。タイマーを開始し、そしてバイアルを回転させ、そして完全に溶解しているか視覚的に調べた。再構成が目視検査により認められるとタイマーを止めた。

オスモル濃度
３つの基準（１００、２９０および１０００ｍｍｏｌ／ｋｇ）を用いて較正しそしてクリーンテスト（ｃｌｅａｎ ｔｅｓｔ）で試験したＶａｐｒｏ^(R)浸透圧計をオスモル濃度を決定するために使用した。組成物もしくは製剤を測定するために以下の基準を用いた：１００±２、２９０±３、１０００＋５および１０未満のクリーンテストレベル。試験するために、溶質を含まないペーパーディスク上に１０μｌのサンプルを置いた。周囲チャンバー温度と密閉空間内の露点温度との差を測定するために細線熱電対湿度計を使用した。これらの温度間の差は露点温度降下であり、それは溶液蒸気圧の関数である。サンプルの読み取り中に、装置が較正を維持していることを保証するために全ての３つのサンプルについて２９０スタンダード（２９０ ｓｔａｎｄａｒｄ）を測定した。

凝集度
凝集度は、５０ｍＭホウ酸、５００ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８．５においてＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｃａｔ．＃１７−１５７１−０１）からのＳｕｐｅｒｄｅｘ^TM ２００ ＨＲ １０／３００カラムを使用してＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて決定した。凝集パーセントは、全タンパク質ピーク面積と比較した高分子型の相対ピーク面積として計算される。全回収パーセント（％ＴＲｃ）は、ｔ_０のピーク面積の合計をその後の時間点のピーク面積の合計で割ることにより計算される。

重鎖分解および酸化
重鎖分解および酸化は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ^TM Ｃ５、２．０ｘ２５０ｍｍ、３００Ａ、５ミクロンカラムを用いた逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）の結果の分析により決定された。ジスルフィド結合を切断するためにＦＶＩＩａポリペプチドバリアントサンプルを還元剤（ジチオスレイトール）で処理しそして７５℃に１０分間加熱した。その結果として、以下の成分の相対的存在を単離しそして定量するために、両方ともトリフルオロ酢酸で酸性化した水およびアセトニトリルの直線勾配におけるＲＰ−ＨＰＬＣ分離を用いることが可能であった：
・ＦＶＩＩａポリペプチドバリアントの軽鎖
・ＦＶＩＩａポリペプチドバリアントの重鎖
・ＦＶＩＩａポリペプチドバリアントの４つの重鎖分解産物
・ＦＶＩＩａポリペプチドバリアントの重鎖の３つの酸化形態
・一本鎖ＦＶＩＩポリペプチドバリアント、および
・ｄｅｓ−Ｇｌａ ＦＶＩＩａポリペプチドバリアント。

生物活性（第Ｘ因子活性化アッセイ）
実施例２および３の生物活性（効能）は、リン脂質依存性（組織因子非依存性）第Ｘ因子活性化アッセイを用いて決定された。このアッセイは、Ｎｅｌｓｅｓｔｕｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００１；２７６：３９８２５−３９８３１における３９８２６頁に詳細に記述されている。簡潔に言えば、アッセイするＦＶＩＩａポリペプチドもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントをＢＳＡを含有するＴｒｉｓバッファーにおいてリン脂質源（好ましくは、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリンの組み合わせ）および再脂質化第Ｘ因子と混合する。特定のインキュベーション時間後に過剰のＥＤＴＡの添加により反応を止める。次に、第Ｘａ因子の濃度を発色性基質（Ｓ−２７６５、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）の添加後に４０５ｎｍでの吸光度変化から測定する。バックグラウンドの補正後にＦＶＩＩａポリペプチドもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントの組織因子非依存性活性を１０分後の吸光度変化として決定する。Ｕ／ｍｇ単位のＦＶＩＩａポリペプチドもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントの比活性は、同じサンプル上で、Ｕ／ｍｌ単位で表される第Ｘ因子活性化アッセイの結果をｍｇ／ｍｌ単位で表されるＡ_２８０吸光度測定の結果で割ることにより見出されることができる。

生物活性（ＰＡＣＴアッセイ）
実施例４におけるサンプルの活性を決定するためにリン脂質活性化凝固時間（ＰＡＣＴ）アッセイを用いた。ＰＡＣＴアッセイは改変された「活性化部分トロンボプラスチン時間」（ＡＰＴＴ）アッセイであるが、通常のＡＰＴＴアッセイは凝固の接触経路（ｃｏｎｔａｃｔ ｐａｔｈｗａｙ）（内因系経路としても知られている）をモニターするが、ＰＡＣＴアッセイにおいて、一つにはＡＰＴＴアッセイにおいて用いられるカオリンもしくは他のケイ酸塩をリン脂質で置換することにより、接触経路は阻害され、従って、接触経路による第Ｘａ因子への第Ｘ因子の転化を妨げる。結果として、トロンビン形成、従って、ＰＡＣＴアッセイにおける凝固時間は、ＦＶＩＩａポリペプチドもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントとリン脂質との間の相互作用により決まる。

ＰＡＣＴアッセイは、人工凝固活性化因子としてリン脂質小胞を用いて再石灰化クエン酸ヒトＦＶＩＩ欠乏血漿の組織因子非依存性ＦＶＩＩａ誘導性もしくはＦＶＩＩａバリアント誘導性凝固を測定する。簡潔に言えば、一定量の均質化したリン脂質小胞（ホスファチジルセリン：ホスファチジルコリン：ホスファチジルエタノールアミン（２０：４０：４０の比率）；８ミリリットル（ｍｌ）の血漿当たり３２０マイクロリットル（μｌ）の５ｍＭの超音波処理したＰＳ：ＰＣ：ＰＥリン脂質小胞）をクエン酸ヒトＦＶＩＩ欠乏血漿に加える。次に、サンプルを加え（例えば、０．６２５ｎＭ〜１０ｎＭの間のＦＶＩＩａポリペプチド濃度、もしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアント濃度を用いて）、そしてカルシウムイオン（１００μｌの血漿に５０μｌのカルシウムバッファー（１９．２ｍＭのＨＥＰＥＳ、１４４ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．３５、４０ｍＭのＣａＣｌ_２、５７．６ミリグラム／ミリリットル［ｍｇ／ｍｌ］のＢＳＡを含有する））の添加により凝固反応を開始する。凝固をリアルタイムで３２５ナノメートル（ｎｍ）で分光光度法でモニターする。凝固時間は、カルシウムイオンの添加による反応の開始から３２５ｎｍでの吸光度により決定した場合の血餅検出までの経過時間である。対照基準を１．００の効能とみなし、そしてサンプルの効能は、同じＰＡＣＴ値を得るために必要とされる基準の量と比較してサンプルの相対量を測定することによりこの基準に対して決定される。

全血アッセイ
ＦＶＩＩａおよびそのＦＶＩＩａポリペプチドバリアントの凝固活性を１段階アッセイにおいて測定し、そして凝固時間をＴｈｒｏｍｂｏｔｒａｃｋ ＩＶ凝固計（Ｍｅｄｉｎｏｒ）上で記録した。１００μｌのＦＶＩＩａもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントを１０ｍＭのグリシルグリシン、５０ｍＭのＮａＣｌ、３７．５ｍＭのＣａＣｌ_２、ｐＨ７．３５を含有するバッファーにおいて希釈し、そして反応カップに移した。抗凝固剤として１０％の０．１３Ｍクエン酸３ナトリウムを含有する５０μｌの血液の添加により凝固反応を開始した。データは、ＥｘｃｅｌもしくはＰＲＩＳＭソフトウェアを用いて分
析した。凝固活性は、血餅形成を得るために必要な時間を反映する。従って、より少ない凝固時間は、より高い凝固活性に対応する。

凝固活性を測定する方法
ＦＶＩＩａもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントの凝固活性は、本質的にＷＯ９２／１５６８６に記述されるように標準的な１段階凝固アッセイを用いて測定される。簡潔に言えば、試験するサンプルを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１％ＢＳＡにおいて希釈し、そして１００μｌを１００μｌのＦＶＩＩ欠乏血漿および１０ｍＭのＣａ^＋＋を含有する２００μｌのトロンボプラスチンＣとインキュベーションする。凝固時間を測定し、そして連続希釈でクエン酸正常ヒト血漿のプールを用いる標準曲線と比較する。

抗凝固活性を測定する方法
不活性ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａポリペプチドもしくはそのバリアントの抗凝固活性は、上記（凝固活性を測定する方法）の１段階凝固アッセイを用いて測定することができ、ここで、不活性コンジュゲートは限られた量の再脂質化組織因子に関して野生型ＦＶＩＩと競合する。アッセイは、本質的に参考文献として本明細書に組み込まれるＷＯ ９２／１５６８６、実施例ＩＩＩに記載の通り行われる。野生型ＦＶＩＩの凝固時間を延長する不活性コンジュゲートの能力を記録し、そして抗凝固活性の尺度とみなす。

Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ＤＯ３０５乾燥オーブンを有するＭｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ＤＬ３６ ＫＦ電量計を用いてカール・フィッシャー分析により水分含量について凍結乾燥ケーキを分析した。

本実施例において、緩衝剤としてのヒスチジン、コハク酸塩および酢酸塩の適性を比較した。以下の表における「Ｎｏ．」という用語は、組成物もしくは製剤に与えられた識別番号をさす。試験した組成物もしくは製剤は、下記のとおりであった：

水性組成物もしくは製剤の透析後に、０．５ｍｇ／ｍｌのＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントを含有する、１ｍｌの各組成物もしくは製剤を３ｍｌの凍結乾燥バイアルに入れ（各製剤について２０バイアル）、そして以下のパラメーターに従って凍結乾燥した。

二次乾燥後に、全てのバイアルを６００ｍＴｏｒｒで窒素でバックフィルし（ｂａｃｋｆｉｌｌｅｄ）、そして栓をした（１３ｍｍ Ｗｅｓｔストッパー）。凍結乾燥組成物もしくは製剤を４０℃で貯蔵し、そして０、７、１４および２８日で、
吸光度（Ａ_２８０、タンパク質回収％の決定用）、ｐＨ、再構成時間およびオスモル濃度を包含する様々な分析に供した。さらに、凝集度をＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて決定し；重鎖分解および酸化をＲＰ−ＨＰＬＣにより決定し；そして効能を第Ｘ因子活性化アッセイを用いて決定した。

結果
２つのコハク酸塩組成物もしくは製剤を除いて、組成物もしくは製剤は全て、４０℃で２８日までの後に許容しうるタンパク質回収（Ａ_２８０）およびオスモル濃度を示した。しかしながら、１４日後に試験した場合、コハク酸塩組成物もしくは製剤は、他の組成物もしくは製剤と比較して非常に低いＡ_２８０およびオスモル濃度を有した。これは、コハク酸カルシウムの沈殿に起因すると考えられる。

コハク酸塩もしくはヒスチジンで緩衝化した組成物もしくは製剤は、２８日までの間許容しうるｐＨ安定性を示し、一方、酢酸塩で緩衝化した組成物もしくは製剤のｐＨは不安定であり、開始から比較的大きいｐＨ増加を示した。

凍結乾燥組成物もしくは製剤は全て、４０℃で２８日までの間貯蔵した場合に３０秒以内に容易に再構成することができた。

上記の結果を考慮して、ヒスチジンは緩衝剤として酢酸ナトリウムもしくはコハク酸ナトリウムのいずれかよりも有益であると結論付けられた。ヒスチジン組成物もしくは製剤の凝集度は全ての３つのｐＨ値５．５、６．０および６．５で許容できるが、ヒスチジン組成物もしくは製剤のＳＥＣ−ＨＰＬＣ結果は、ｐＨが増加するにつれてわずかに減少した凝集があることを示した。ヒスチジン組成物もしくは製剤は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ（凝集）、ＲＰ−ＨＰＬＣ（重鎖分解および酸化）および第Ｘ因子活性化アッセイ（効能）により評価した場合にｐＨ６．５で安定であることが見出された。従って、ｐＨ６．５のヒスチジンがさらなる実験のための緩衝剤として選択された。

バッファーとして酢酸ナトリウムもしくはヒスチジンのいずれかを含有する組成物もしくは製剤について、上記のものと同一であるが張性調整剤としてトレハロースの代わりにショ糖を含有する（ショ糖の量は、それぞれの組成物もしくは製剤について上記の表に示されるトレハロースの量と同じである）組成物もしくは製剤もまた試験した。ショ糖を含有する組成物もしくは製剤の結果は、トレハロースを含有するものに匹敵した。しかしながら、ショ糖の存在下での酸化生成物の形成の任意の潜在的な増加した危険性を減らすために、トレハロースがその後の実験における張性調整剤として選択された。

実施例１における上記の通り以下の水性組成物もしくは製剤を製造しそして凍結乾燥に供した。組成物もしくは製剤の各々は、０．６ｍｇ／ｍｌのＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントを含有し、そして６．５のｐＨを有した。以下の表における「Ｎｏ．」という用語は、組成物もしくは製剤に与えられた識別番号をさす。

実施例１における上記の通りバイアルを４０℃で２８日間貯蔵しそして０、１４および２８日で分析した。比較目的のために、液体形態の同じ組成物もしくは製剤を４０℃で２１日間貯蔵し、そして０、７および２１日で分析した。比活性（Ｕ／ｍｇ）もまた凍結乾燥組成物もしくは製剤については０、１４および２８日で、そして液体組成物もしくは製剤については０、７および２１日で決定した。さらに、各液体組成物もしくは製剤の２つのバイアルを凍結融解分析用に−８０℃で凍結した。

結果
凍結乾燥バイアルにおける凍結乾燥ケーキの外観は、組成物もしくは製剤Ｎｏ．１０を除いて組成物もしくは製剤間で均一であった。凍結乾燥組成物もしくは製剤は全て、４０℃で２８日間貯蔵した後に約３０秒もしくはそれ未満以内に容易に再構成することができた。

４０℃で２８日間のインキュベーション後の凍結乾燥組成物もしくは製剤は、２１日間同じ温度で貯蔵した液体組成物もしくは製剤より低い凝集度および高い回収を有した。液体組成物もしくは製剤の凍結融解応力処理は、タンパク質に影響を与えないように思われた。１０ｍＭのＣａＣｌ_２を含有する液体組成物もしくは製剤は、２ｍＭのみのＣａＣｌ_２を含有する匹敵する組成物もしくは製剤より７日および２１日後に低い凝集度を有することが見出された。予想されるように、ＳＥ−ＨＰＬＣにより分析した場合の総合的データは、凍結乾燥組成物もしくは製剤が液体組成物もしくは製剤より安定であることを示す。

凍結乾燥組成物もしくは製剤は、０日と比較して１４および２８日で酸化の１％未満の増加を有し、メチオニンを含有する組成物もしくは製剤は、メチオニンなしの組成物もしくは製剤と比較して酸化のわずかに低い増加（０．２〜０．５％）を示した。

Ｔｗｅｅｎ^(R)−２０の異なる量の効果は、液体もしくは凍結乾燥組成物もしくは製剤のいずれにおいても見られなかった。しかしながら、わずかに高い量のＴｗｅｅｎ^(R)−２０（例えば、０．００５％よりむしろ０．０１％）もしくは他の界面活性剤は、凍結乾
燥の前の濾過もしくは他の精製工程後に界面活性剤が組成物もしくは製剤に存在することを保証するために好都合であり得る。

凍結乾燥組成物もしくは製剤の水分含量を０および２８日で測定した。２８日での１つの組成物もしくは製剤（Ｎｏ．７）を除いて、０日および２８日の両方での水分含量は３％未満であり、そして多くの場合において２％未満であった。０〜２８日の間の各組成物もしくは製剤の水分含量の違いは、製剤Ｎｏ．７を除いて、１％未満であった。

４０℃で貯蔵した液体組成物もしくは製剤について、比活性は急速に減少し、平均して７日後に初期値の半分を少し上回るまで（５４％）そして２１日後に約１８％まで下がった。対照的に、４０℃で１４もしくは２８日間貯蔵した凍結乾燥組成物もしくは製剤の比活性は０日で決定された活性のものに近く、平均して１４日で測定した場合に８２％そして２８日で９０％のままであった。最も有望な組成物もしくは製剤（Ｎｏ．９）は、４０℃で２８日後に初期比活性の９８．７％を有した。１０ｍＭ ＣａＣｌ_２を含有する液体組成物もしくは製剤の比活性は、２ｍＭのみのＣａＣｌ_２を含有する液体組成物もしくは製剤のものより高かったが、これは凍結乾燥組成物もしくは製剤については当てはまらなかった。

ＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアント（０．６２ｍｇのバリアント／ｍｌ溶媒の濃度で３６６ｍｇのポリペプチドバリアント）を含んでなる基本組成物もしくは製剤を２０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６．５、２３０ｍＭのトレハロース、１０ｍＭのＣａＣｌ_２、１０ｍＭのメチオニンおよび０．００５％のＴｗｅｅｎ−２０^(R)において製造した。実施例２の組成物もしくは製剤Ｎｏ．８に対応する組成物もしくは製剤は、１８５．５ｍｌの基本ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａバリアント組成物もしくは製剤に２．７８３ｍｌの１％重量／容積（ｗ／ｖ）のストック溶液のＴｗｅｅｎ−２０^(R)を加えそして０．２マイクロメーター（μｍ）膜を通して濾過することにより製造し、３５個の２０ｍｌ凍結乾燥バイアル（Ｍｕｅｌｌｅｒ ＆ Ｍｕｅｌｌｅｒ）用に十分であった。残りの基本組成物もしくは製剤、２４９．５ｍｌは、１２４８μｌの１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０^(R)ストック溶を加えることにより実施例２の組成物もしくは製剤Ｎｏ．１０に対応するように調合した。これは、４９個の同様の２０ｍｌ凍結乾燥バイアル用に十分であった。凍結乾燥を以下のパラメーターに従って行った：

二次乾燥後に、全てのバイアルを６００ｍＴｏｒｒで窒素でバックフィルし、そして栓をした（２０ｍｍ Ｄａｉｋｙｏストッパー）。これらの組成物もしくは製剤を４０℃もしくは−８０℃（−８０℃＝対照組成物もしくは対象製剤）のいずれかで貯蔵し、そして次に５．０ｍｌの水で再構成し、そして実施例１および２における上記の通り１４および２８日後に分析した。さらに、４０℃で液体形態で貯蔵した同一の組成物もしくは製剤を０、７および２１日で比較目的のために分析した。４０℃で２８日間貯蔵した本発明の凍
結乾燥組成物もしくは製剤は：
・ケーキ外観
・水分含量：０日でそして２８日後に２％未満
・再構成時間：１３〜２０秒（ｓｅｃ）
・ｐＨ安定性
・酸化
・生物活性：両方の凍結乾燥組成物もしくは製剤は、４０℃で１４もしくは２８日後にそれらの完全な初期比活性を維持した。
・凝集体レベル：４０℃で２８日間貯蔵した両方の組成物もしくは製剤の凝集体レベルは、初期レベルとそして−８０℃で４０日間貯蔵した同じ組成物もしくは製剤のレベルと非常に類似し、優れた安定性を示した。
を包含する全ての試験したパラメーターにおいてよく機能することが見出された。

比活性、凝集体形成、酸化および重鎖分解についての４０℃で貯蔵した本発明の凍結乾燥組成物もしくは製剤の分析の結果は、４０℃で貯蔵した液体組成物もしくは製剤ならびに−８０℃で貯蔵した同じ凍結乾燥組成物もしくは製剤について得られる結果と比較して０．０１％Ｔｗｅｅｎ^(R)−２０を含有する本発明の上記の組成物もしくは製剤について図１〜４に示される。これらの図は、本発明の凍結乾燥組成物もしくは製剤が４０℃で２８日の貯蔵後に十分に安定であり、−８０℃で貯蔵した対照組成物もしくは製剤と同程度に優れた比活性、凝集体形成、酸化および重鎖分解のレベルを示すことを表す。対照的に、液体組成物もしくは製剤は、４０℃で２１日後に活性のかなりの喪失ならびに凝集体形成、酸化および重鎖分解の増加を示す。

他の実施例において使用する同じＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントおよび実施例３のものに対応する組成物もしくは製剤および実施例２の組成物もしくは製剤Ｎｏ．８（２０ｍＭのヒスチジン、１０ｍＭのＣａＣｌ_２、２３０ｍＭのトレハロース、１０ｍＭのメチオニン、０．０１％のＴｗｅｅｎ^(R)２０、ｐＨ６．５）を用いて４つの異なる温度で長期安定性研究を行った。安定性研究は、−８０℃、５℃、２５℃および４０℃の公称温度で貯蔵した凍結乾燥薬剤生成物に行った。全ての充填バイアルを直立位置で貯蔵し、そして研究中遮光した。サンプルを以下の時間点で再構成しそして分析した：１５日、３７日、８８日、１９１日、２６８日および３６５日。２５℃および４０℃で貯蔵したサンプルは、再構成および分析の約２週前に輸送用に（ｆｏｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）５℃に冷却した。これらのサンプルについて、サンプルを５℃に冷却した時点を用いる（３７、８８および１９１日の代わりにそれぞれ２８日、６６日および１７５日）。５℃および−８０℃で貯蔵したサンプルのみ最初の半年後に分析した。

上記のように決定された、相対効能（ＰＡＣＴアッセイ）、凝集タンパク質の量（ダイマーおよびポリマーパーセント）、重鎖分解（−８０℃サンプルに対する）、オスモル濃度、および酸化（−８０℃サンプルに対する）のデータは、それぞれ、図５、６、７、８および９に示される。これらの図の各々において、点線は各図の平均値の上および下の２つの標準偏差を示し、一方、点線の間の横線は測定の全ての平均を表す。相対効能（図５）の決定について、各データ点は３つのサンプルの平均を表す。図６〜９について、各データ点は単一のサンプルをアッセイした結果である。

全体で、図５〜９に提供されるデータは、ＦＶＩＩａバリアントが、本発明の組成物において貯蔵される場合に、研究の全期間にわたって、すなわち１年までの間試験した温度で安定であることを示す。これは、図５に示されるようなバリアントの活性にならびに図６、７、８および９に示されるような化学的および物理的安定性に当てはまる。興味深いことに、２５℃および４０℃の比較的高い温度でさえ、ＦＶＩＩａバリアントはこの組成
物において非常に安定であるように思われ、これは、本発明の組成物が周囲温度でのＦＶＩＩａの長期貯蔵に適していることを示唆する。１年までの間貯蔵したサンプルについて、５℃で貯蔵した組成物と−８０℃で貯蔵したものとの間で有意な差は認められなかった。従って、本実施例の結果は、本発明の組成物が広範囲の温度条件下でＦＶＩＩａに長期貯蔵安定性を与えることを示す。

前述の発明は明確さおよび理解の目的のために多少詳細に記述されているが、本発明の真の範囲からそれることなしに形態および詳細の様々な変更を行うことができることは、本開示の読み取りから当業者に明らかである。本明細書に記述される実施例および態様は説明目的のためだけであることそしてそれを踏まえた様々な改変もしくは変更が当業者に示唆されそして本願の精神および範囲ならびに添付の請求項の範囲内に包含されることが理解される。本願に引用される全ての公開、特許、特許出願および／もしくは他の文書は、各個々の公開、特許、特許出願および／もしくは文書が全ての目的のためにその全部が引用することにより本明細書に組み込まれることが個々に示される場合と同じ程度に全ての目的のためにそれらの全部が引用することにより本明細書に組み込まれる。

Claims (38)

1. 再構成組成物におけるヒスチジンの濃度が少なくとも約５ｍＭである、第ＶＩＩ因子もしくは第ＶＩＩａ因子ポリペプチドおよび緩衝剤としてヒスチジンを含んでなる、水での再構成に適した凍結乾燥した製薬学的組成物。
2. 再構成組成物におけるヒスチジンの濃度が少なくとも約１０ｍＭである請求項１の組成物。
3. 再構成組成物におけるヒスチジンの濃度が約１２ｍＭ〜約５０ｍＭ、例えば約１２ｍＭ〜約４０ｍＭ、例えば約１５ｍＭ〜約２５ｍＭである請求項１の組成物。
4. 張性調整剤をさらに含んでなる前記請求項のいずれかの組成物。
5. 張性調整剤がグリセロール、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールもしくはマンニトールのような多価糖アルコール；ショ糖もしくはトレハロースのような糖；グリシンのようなアミノ酸；およびナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩もしくはマグネシウム塩のような中性塩よりなる群から選択される請求項４の組成物。
6. 張性調整剤がトレハロースである請求項５の組成物。
7. 再構成組成物における張性調整剤の濃度が約５０ｍＭ〜約１０００ｍＭ、例えば約１００ｍＭ〜約５００ｍＭ、例えば約１５０ｍＭ〜約３００ｍＭである請求項４〜６のいずれかの組成物。
8. カルシウムもしくはマグネシウム塩をさらに含んでなる前記請求項のいずれかの組成物。
9. 塩化カルシウムを含んでなる請求項８の組成物。
10. 再構成組成物におけるカルシウムもしくはマグネシウム塩の濃度が約１ｍＭ〜約４０ｍＭ、例えば約２ｍＭ〜約３０ｍＭ、例えば約５ｍＭ〜約２０ｍＭである請求項８もしくは９の組成物。
11. 酸化防止剤をさらに含んでなる前記請求項のいずれかの組成物。
12. 酸化防止剤がアスコルビン酸、メチオニン、ベンジルアルコールおよびビタミンＥよりなる群から選択される請求項１１の組成物。
13. 酸化防止剤がメチオニンである請求項１２の組成物。
14. 再構成組成物における酸化防止剤の濃度が約１ｍＭ〜約４０ｍＭ、例えば約２ｍＭ〜約３０ｍＭ、例えば約５ｍＭ〜約２０ｍＭである請求項１１〜１３のいずれかの請求項の組成物。
15. 界面活性剤をさらに含んでなる前記請求項のいずれかの組成物。
16. 界面活性剤が非イオン性界面活性剤である請求項１５の組成物。
17. 非イオン性界面活性剤がポリソルベート、ポリオキサマーおよびプルロニック^(R)ポリ
    オールよりなる群から選択される請求項１６の組成物。
18. 非イオン性界面活性剤がＴｗｅｅｎ^(R)−２０、Ｔｗｅｅｎ^(R)−８０もしくは別のポリソルベートである請求項１７の組成物。
19. 再構成組成物における非イオン性界面活性剤の濃度が約０．００１％（ｗ／ｖ）〜約０．５％、例えば約０．００１％〜約０．０５％である請求項１６〜１８のいずれかの組成物。
20. 再構成組成物のｐＨが約５．０〜約７．０である前記請求項のいずれかの組成物。
21. 再構成組成物のｐＨが約５．５、約６．０もしくは約６．５である請求項２０の組成物。
22. 再構成組成物のｐＨが約６．０〜約７．０、例えば約６．２〜約６．８、例えば約６．４〜６．６である請求項２０の組成物。
23. 再構成組成物におけるＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドの濃度が約０．１〜５ｍｇ／ｍｌ、例えば約０．２〜２ｍｇ／ｍｌ、典型的には約０．４〜１．５ｍｇ／ｍｌ、例えば約０．５〜１．０ｍｇ／ｍｌである前記請求項のいずれかの組成物。
24. ポリペプチドが組換えヒトＦＶＩＩａもしくはそのバリアントである前記請求項のいずれかの組成物。
25. 再構成した形態の組成物が約６．０〜約７．０のｐＨを有し、そして約１０ｍＭ〜約３０ｍＭのヒスチジン、約１５０ｍＭ〜約３００ｍＭのトレハロース、約２ｍＭ〜約２０ｍＭの塩化カルシウム、約０．００１％〜約０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ^(R)−２０および約５ｍＭ〜約３０ｍＭのメチオニンを含んでなる請求項１の組成物。
26. 組成物がグリシルグリシンを含有しない前記請求項のいずれかの組成物。
27. 水分含量が３％（ｗ／ｗ）以下である前記請求項のいずれかの組成物。
28. −８０℃で同じ期間にわたって貯蔵した同一の凍結乾燥対照組成物と比較して２〜８℃で６ヶ月間貯蔵後に分析した場合に以下の特性：
    ａ）対照組成物の生物活性の少なくとも８０％である本明細書に記載の「第Ｘ因子活性化アッセイ」を用いて決定される生物活性、
    ｂ）対照組成物の凝集度より３％以下高いＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて決定した場合の凝集度、
    ｃ）対照組成物の酸化度より５％以下大きいＲＰ−ＨＰＬＣを用いて決定される酸化度、および
    ｄ）対照組成物の重鎖分解度より５％以下大きいＲＰ−ＨＰＬＣを用いて決定される重鎖分解度
    の１つもしくはそれ以上を示す前期請求項のいずれかの組成物。
29. −８０℃で同じ期間にわたって貯蔵した同一の凍結乾燥対照組成物と比較して２〜８℃で１年間貯蔵後に分析した場合に該特性の１つもしくはそれ以上を示す請求項２８の組成物。
30. −８０℃で同じ期間にわたって貯蔵した同一の凍結乾燥対照組成物と比較して２〜８℃
    で１年間貯蔵後に分析した場合に該特性の全てを示す請求項２８の組成物。
31. −８０℃で同じ期間にわたって貯蔵した同一の凍結乾燥対照組成物と比較して２０℃で６ヶ月間貯蔵後に分析した場合に該特性の１つもしくはそれ以上を示す請求項２８の組成物。
32. −８０℃で同じ期間にわたって貯蔵した同一の凍結乾燥対照組成物と比較して２０℃で６ヶ月間貯蔵後に分析した場合に該特性の全てを示す請求項２８の組成物。
33. ヒスチジン緩衝剤および水と第ＶＩＩ因子もしくは第ＶＩＩａ因子ポリペプチドの混合物を準備して少なくとも５ｍＭのヒスチジン濃度を有する水性組成物をもたらすこと、および得られる水性組成物を凍結乾燥に供して凍結乾燥組成物をもたらすことを含んでなる、第ＶＩＩ因子もしくは第ＶＩＩａ因子ポリペプチドを含んでなる貯蔵安定性組成物の製造方法。
34. 水性組成物が凍結乾燥の前に張性調整剤、カルシウムもしくはマグネシウム塩、非イオン性界面活性剤、酸化防止剤および防腐剤から選択されるの１つもしくはそれ以上の成分をさらに含んでなる請求項３３の方法。
35. 組成物が水で再構成されている、請求項１〜３２のいずれかに記載の組成物の治療的に有効な量を処置もしくは予防を必要とする患者に投与することを含んでなる、第ＶＩＩａ因子の投与により処置できる症状の処置もしくは予防方法。
36. 第ＶＩＩａ因子の投与により処置できる症状を処置するかもしくは予防するための薬剤の製造のための請求項１〜３２のいずれかに記載の組成物の使用。
37. 哺乳類における血餅形成を増加するために有効な量の請求項１の組成物を哺乳類に投与することを含んでなる、増加した血餅形成が望ましい疾患もしくは症状を有する哺乳類における血餅形成の増加方法。
38. ＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドまたはＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａポリペプチドバリアントが凝固活性を有する請求項１の組成物。

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