JP2009517446A - テルペン含有組成物とその作製方法及び使用方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、テルペン及び中空グルカン粒子又は細胞壁粒子を含む組成物と、そのような組成物を調製するための方法に関する。この組成物は、テルペンの安定性及び活性を増大させ、テルペンに適切な担体を提供する。本発明は、そのような組成物を、医学、獣医学、及び農業の分野で使用する方法にも関する。
【選択図】 なし

Description

発明の詳細な説明

本発明は、テルペン、及び中空グルカン粒子、又は細胞壁粒子を含む組成物、並びにそのような組成物を調製するための方法に関する。それらの組成物は、テルペンの安定性及び活性を増大し、テルペンに適切な担体を提供する。本発明はさらに、医学、獣医学、及び農業の分野において、そのような組成物を使用する方法に関する。

テルペンは、自然界に、主として精油の成分として植物に広く存在する化合物である。テルペンのビルディングブロックは、炭化水素イソプレン（Ｃ_５Ｈ_８）_ｎである。テルペンの例には、シトラール、ピネン、ネロール、β−イオノン、ゲラニオール、カルバクロール、オイゲノール、カルボン、テルペニオール（ｔｅｒｐｅｎｉｏｌ）、アネトール、カンファー、メントール、リモネン、ネロリドール、ファルネソール、フィトール、カロテン（ビタミンＡ_１）、スクアレン、チモール、トコトリエノール、ペリリルアルコール、ボルネオール、ミルセン、シメン（ｓｉｍｅｎｅ）、カレン、テルペネン、及びリナロールが含まれる。

テルペンは、一般的に安全と認められる物質（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ａｓ Ｓａｆｅ）（ＧＲＡＳ）として分類されており、香料及びアロマ業界で長年にわたって用いられている。ラットでのシトラールのＬＤ_５０は、約５ｇ／ｋｇであり、これらの化合物が比較的安全であることをさらに示している。さらに、テルペンは酸素（たとえば、空気）に暴露後、約２８日という比較的短い寿命を有する。テルペンはＣＯ_２と水に分解する。このテルペンの分解又は破壊は、本発明の組成物及び方法の安全性及び環境保全性を実証している。

テルペンは、癌細胞の増殖を阻害し、腫瘍の大きさを縮小し、コレステロールレベルを低下し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで微生物に対する殺菌作用を有することが見出されている。Ｏｗａｗｕｎｍｉ（Ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９３、９（３）：１０５〜１０８）は、０．０１％超のシトラールを含む増殖培地が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の濃度を低減し、０．０８％では殺菌作用のあることを示した。米国特許第５６７３４６８号は、消毒又は防腐性洗浄剤として用いられる、パイン油をベースとするテルペン製剤を記載している。米国特許第５８４９９５６号は、コメから発見されたテルペンが抗真菌活性を有することを教示している。米国特許第５９３９０５０号は、２又は３テルペンの組合せを含む口腔衛生抗微生物製品が相乗効果を示したことを記載している。いくつかの米国特許（米国特許第５５４７６７７号、第５５４９９０１号、第５６１８８４０号、第５６２９０２１号、第５６６２９５７号、第５７００６７９号、第５７３０９８９号）は、ある種の水中油型エマルションが抗微生物、アジュバント、及び送達特性を有することを教示している。テルペンは、様々な作用機序を介して作用する、有効かつ非毒性の食事性抗腫瘍剤であることがわかっている（Ｃｒｏｗｅｌｌ等、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｇ．１９９４、５（１）：１〜２２；Ｃｒｏｗｅｌｌ等、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．１９９６、４０１：１３１〜１３６）。テルペン類のゲラニオール、トコトリエノール、ペリリルアルコール、β−イオノン、及びｄ−リモネンは、肝臓のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性、コレステロール合成の律速段階を抑制し、動物のコレステロールレベルを緩やかに低下する（Ｅｌｓｏｎ等、Ｊ．Ｎｕｔｒ．１９９４、１２４：６０７〜６１４）。ｄ−リモネン及びゲラニオールは、乳腫瘍を低減し（Ｅｌｅｇｂｅｄｅ等、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、１９８４、５（５）：６６１〜６６４；Ｅｌｅｇｂｅｄｅ等、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．１９８６、７６（２）：３２３〜３２５；Ｋａｒｌｓｏｎ等、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ、１９９６、７（４）：４２２〜４２９）、移植腫瘍の増殖を抑制した（Ｙｕ等、Ｊ．Ａｇｒｉ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．１９９５、４３：２１４４〜２１４７）。

テルペンはさらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細菌及び真菌（Ｃｈａｕｍｏｎｔ等、Ａｎｎ．Ｐｈａｒｍ．Ｆｒ．１９９２、５０（３）：１５６〜１６６；Ｍｏｌｅｙａｒ等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１９９２、１６（４）：３３７〜３４２；及びＰａｔｔｎａｉｋ等、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｓ、１９９７、８９（３５８）：３９〜４６）、並びにいくつかの内部及び外部寄生生物（Ｈｏｏｓｅｒ等、Ｊ．Ａｍ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．１９８６、１８９（８）：９０５〜９０８）の増殖を阻害することがわかっている。ゲラニオールは、カリウム漏出速度を増大し、膜流動性を妨げることによって、カンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）及びサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株の増殖を阻害することがわかっている（Ｂａｒｄ等、Ｌｉｐｉｄｓ、１９９８、２３（６）：５３４〜５３８）。β−イオノンは、胞子発芽の阻害、及び寒天での増殖阻害によって判別された抗真菌活性を有する（Ｍｉｋｈｌｉｎ等、Ａ．Ｐｒｉｋｌ．Ｂｉｏｋｈｉｍ．Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ、１９８３、１９：７９５〜８０３；Ｓａｌｔ等、Ａｄａｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈ、１９８６、２８：２８７〜２９７）。テプレノン（ゲラニルゲラニルアセトン）は、ヘリコバクターピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）に抗菌作用を有する（Ｉｓｈｉｉ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｖｉｒｏｌ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１９９３、２８０（１−２）：２３９〜２４３）。１％のローズ油を含む市販製品Ｒｏｓａｎｏｌは、いくつかの細菌（シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｕｓ）、大腸菌、及びヘリコバクターピロリ）の増殖を阻害することが示されている。ゲラニオールは、ローズ油の活性成分（７５％）である。ローズ油とゲラニオールは２ｍｇ／ｌの濃度で、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてヘリコバクターピロリの増殖を阻害した。いくつかの薬草剤の抽出物は、ヘリコバクターピロリに阻害作用を有することが示されており、もっとも有効なものはデカーシノールアンゲレート（ｄｅｃｕｒｓｉｎｏｌ ａｎｇｅｌａｔｅ）、デカーシン、マグノロール、ベルベリン、桂皮酸、デカーシノール、及び没食子酸である（Ｂａｅ等、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９９８、２１（９）９９０〜９９２）。カシューアップル、アナカルド酸、及び（Ｅ）−２−ヘキセナールは、ヘリコバクターピロリに対して殺菌作用を示した。

ジテルペン、すなわちトリコラブダルＡ（ｔｒｉｃｈｏｒａｂｄａｌ Ａ）（Ｒ．トリコカルパ由来）は、ヘリコバクターピロリに対して非常に強い抗菌作用を示した（Ｋａｄｏｔａ等、Ｚｅｎｔｒａｌｂｌ．Ｂａｋｔｅｒｉｏｌ、１９９７、２８７（１）：６３〜６７）。

１１種の異なるテルペンの溶液が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験で病原性細菌の増殖の阻害に有効であり、１００ｐｐｍから１０００ｐｐｍの範囲のレベルが有効であった。テルペンは１％ポリソルベート２０を含む水に希釈された（Ｋｉｍ等、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．１９９５、４３：２８３９〜２８４５）。

微生物に対するテルペンの様々な作用様式が存在する可能性があり、それらは（１）細胞膜のリン脂質二重層を妨げ、（２）種々の酵素系（ＨＭＧ還元酵素）を阻害し、（３）遺伝物質を破壊又は不活化することができる。テルペンの作用様式が非常に基本的であるため、たとえばコレステロールを遮断するため、感染因子はテルペンに対する耐性を作ることができないと考えられている。

しかしながら、テルペンの使用にはいくつかの欠点がある。それらには以下のものが含まれる。
−テルペンは液体であるため、取り扱いが困難となり、ある種の目的には不適切となり得る。
−テルペンはあまり水と混和性でなく、水性エマルションを調製するために、一般に洗剤、界面活性剤、又は他の乳化剤の使用を必要とする。しかしながら、高剪断下でテルペンを混合することによって、安定な溶液を得ることができる。
−乾燥粉末テルペン製剤は、一般に低重量パーセントのテルペンを含むのみである。
−テルペンは、水性エマルション系で酸化する傾向があり、長期貯蔵が問題となる。

成分送達系を提供するための現在の噴霧被覆、押し出し、コアセルベーション、分子封入、及び噴霧乾燥／冷却の技法には限界がある。

パン酵母細胞壁はパン酵母細胞に由来し、不溶性バイオポリマー、β−１，３−グルカン、β−１，６−グルカン、マンナン、及びキチンからなる。それらは典型的に、空洞を囲む厚さわずか０．２〜０．３ミクロンの外皮膜を有する直径２〜４ミクロンのミクロスフェアである。この物質は相当な液体保持能力を有し、典型的にその重量の５〜２５倍の液体を吸収する。外皮は充分に多孔性であり、１５００００ダルトンまでの大きさのペイロードが外皮を通過し、球形粒子の中空の空洞に吸収されることができる。パン酵母細胞壁は、いくつかの独特な特性を有し、それらの特性には熱安定性（たとえば、１２１℃まで）、剪断安定性、ｐＨ安定性（たとえば、ｐＨ２〜１２）、及び高濃度で著しい粘性を形成しないことが含まれる。その物理的特性に加えて、この組成物は心血管及び免疫増強的な健康上の利益をもたらす天然の健康的な食物繊維を含有する。

酵母細胞壁は、酵母細胞の可溶性成分から不溶性粒子画分を抽出及び精製することによって、酵母細胞から調製される。真菌細胞壁は、酵母抽出物製造の不溶性副生成物から生成することができる。さらに、酵母細胞は、酵母細胞壁を破壊することなく、水酸化物水溶液で処理することができ、それにより細胞のタンパク質及び細胞内タンパク質が消化され、酵母細胞壁成分は著しくタンパク質に汚染されないまま残され、実質的に変化していないβ（１−６）及びβ（１−３）結合グルカンの細胞壁を有することになる。全グルカン粒子及びそれらを調製する方法のより詳しい説明は、Ｊａｍａｓ等によって、米国特許第４８１０６４６号、並びに同時係属米国特許出願第１６６９２９号、第２９７７５２号、及び第２９７９８２号に記載されている。Ｎｏｖｏｇｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｔｙ Ｌｔｄ．に譲渡された米国特許第６２４２５９４号は、アルカリ抽出、酸抽出、次いで有機溶媒で抽出し、最後に乾燥することによって、酵母グルカン粒子を調製する方法を記載している。ＡＳ Ｂｉｏｔｅｃｈ−Ｍａｃｋｚｙｍａｌに譲渡された米国特許第５４０１７２７号は、酵母グルカン粒子を得る方法、並びに水生動物において抵抗力を高めるために、及びワクチン接種のアジュバントとしてそれらを用いる方法を開示している。Ａｌｐｈａ−Ｂｅｔａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許第５６０７６７７号は、種々の薬剤を送達するためのアジュバント及び送達パッケージとしての中空全グルカン粒子の使用を開示している。上述の特許及び出願の教示は、参照により本明細書の一部とする。

他の種類の酵母及び真菌細胞は、グルカンを含有しない細胞壁を有する。そのような酵母及び真菌の細胞壁は、細胞壁粒子を得るために上述したものと類似の技法によって単離できる。

さらに、多くの植物、藻類、細菌、及び他の微生物の細胞も細胞壁を含む。細胞壁の構造及び構成は微生物間で異なるが、一般に強固であり、比較的不活性な構造である。酵母に関して上に述べたような通常の技法によって、そのような細胞由来の細胞壁粒子を得ることができる。

本出願人等はここに、テルペンを吸収させ、中空グルカン粒子又は細胞壁粒子内部に安定に封入できることを見出した。そのような粒子へのテルペンの封入は、粒子をテルペンと共にインキュベートすることによって達成できる。

本発明によれば、テルペン成分を封入している中空グルカン粒子又は細胞壁粒子を含む組成物が提供される。

本明細書では、「中空グルカン粒子」という用語には、構造成分としてグルカンを含む任意の中空粒子が含まれる。したがって、特にこの用語には、酵母細胞壁（精製又は未精製形態）、又は中空全グルカン粒子が含まれる。「細胞壁粒子」という用語は、グルカンが構造成分ではない、細胞の壁（精製又は未精製形態）を含む粒子を指す。適切な粒子には、植物、藻類、真菌、又は細菌細胞の細胞壁が含まれる。細胞壁粒子は一般に、それらが由来する細胞の形状を保持しており、したがって中空グルカン粒子のように、テルペン成分の封入に適した中空の中心腔を提供する。

本発明では、中空グルカン粒子又は細胞壁粒子は安定にテルペン成分を封入できる必要がある。一般にこれは、中空グルカン粒子又は細胞壁粒子が、テルペン成分（一般に、テルペン成分は比較的高濃度である）と共にインキュベートされる間、その構造を維持できなければならず、テルペン成分が、粒子内に移動できなければならないことを意味する。中空グルカン粒子及び細胞壁粒子は一般に、比較的不活性な材料から形成され、多孔性であり、したがって一般に、中空グルカン粒子及び細胞壁粒子はテルペン成分を封入できると想定され得る。

本発明による組成物は、細菌、ウイルス、マイコプラズマ、真菌、線虫、節足動物及び／又はクモ類を含む種々の感染因子に対して有効である。

本発明による組成物は、以下の利点を提供することができる。
−テルペンのペイロードを最大にする。
−封入されていないペイロードを最小にする。
−ペイロード安定性を制御する。
−ペイロード放出動態を制御する。
−質量及び均一性を増大するために、液体テルペンの固体形態を作る。
−テルペンの取り扱い及び適用を簡易にする。
−テルペンのにおい及び味をマスキングする。

特に適切な中空グルカン粒子又は細胞壁粒子は、真菌細胞壁、好ましくは酵母細胞壁である。酵母細胞壁は、それらが由来する酵母細胞の三次元構造を保持する酵母細胞の調剤である。したがって酵母細胞壁は、テルペン成分が酵母細胞壁内部に封入されることを可能にする中空構造を有する。酵母壁は、適切にはパン酵母細胞に由来することができる（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから入手可能）。所望の特性を有する酵母細胞壁粒子は、Ｎｕｔｒｉｃｅｌｌ ＭＯＳ ５５の商品名で、Ｂｉｏｒｉｇｉｎ（Ｓａｏ Ｐａｏｌｏ、Ｂｒａｚｉｌ）から得ることもできる。これらの粒子は、サッカロマイセスセレビシエの噴霧乾燥抽出物である。

代替となる粒子は、ＳＡＦ−Ｍａｎｎａｎ（ＳＡＦ Ａｇｒｉ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、及びＮｕｔｒｅｘ（Ｓｅｎｓｉｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）の商品名で知られているものである。これらは、酵母抽出物製造工程からの不溶性廃棄流である、中空グルカン粒子である。酵母抽出物の生成中、部分的に自己消化された酵母細胞の可溶性成分は除去されるが、不溶性残留物はテルペンの取り込みに適した材料である。これらの中空グルカン粒子は、約２５〜３５重量％のβ−１，３−グルカンを含む。これらの材料の重要な特性は、それらが１０重量％超の脂質を含有し、テルペンの吸収に非常に有効なことである。さらに、廃棄流産物であるため、それらは中空グルカン粒子の比較的安価な供給源である。

より高い純度を有する代替となる中空グルカン粒子は、Ｎｕｔｒｉｃｅｐｔｓ（Ｎｕｔｒｉｃｅｐｔｓ Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｎｓｖｉｌｌｅ、ＭＮ）及びＡＳＡ Ｂｉｏｔｅｃｈによって製造されるものである。これらの粒子は、追加の細胞内成分を除去し、細胞壁のマンノプロテイン外層を除去して、グルカン５０〜６５重量％の粒子を生じるように、アルカリ抽出されている。

より高い純度の中空グルカン粒子は、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇのＷＧＰ粒子である。これらの粒子は、追加の酵母成分を除去して、グルカン７５〜８５重量％の生成物を生じるように、酸抽出されている。

非常に純度の高い中空グルカン粒子は、Ａｌｐｈａ−ｂｅｔａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）のＡｄｊｕｖａｘ（商標）、及びＮｏｖｏｇｅｎ（Ｓｔａｍｆｏｒｄ、ＣＴ）の微粒子グルカンである。これらの粒子は、残留脂質を除去し、それにより粒子が９０重量％超のグルカンを含むように、有機溶媒抽出されている。

いくつかの実施形態において、たとえば予想される汚染物質を厳密に制御する必要がある場合、高純度のグルカン粒子又は細胞壁粒子が必要とされる可能性がある。このような場合、他の純度の低い生成物より、さらに純度の高い粒子が好ましい。他の実施形態では、経済的理由から、純度の低い粒子が好ましく、それらの粒子も、テルペンの吸収においてより有効であることがわかっている。

好ましくは、中空グルカン粒子又は細胞壁粒子は、脂質１又は２重量％のような、わずかな脂質含量を有する。わずかな含量の脂質が、テルペン成分を封入する粒子の能力を高めることができる。好ましくは、中空グルカン粒子又は細胞壁粒子の脂質含量は、５重量％以上、より好ましくは１０重量％以上である。

場合によって、本発明のテルペン成分は、界面活性剤と会合させることができる。界面活性剤は、非イオン性、カチオン性、又はアニオン性であることができる。適切な界面活性剤の例には、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリグリセリルエステル、モノオレイン酸ポリグリセリル、モノカプリル酸デカグリセリル、ジカプリル酸プロピレングリコール、モノステアリン酸トリグリセロール、ポリオキシエチレンソルビタン、モノオレエート、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、Ｓｐａｎ（登録商標）２０、Ｓｐａｎ（登録商標）４０、Ｓｐａｎ（登録商標）６０、Ｓｐａｎ（登録商標）８０、Ｂｒｉｇ３０、又はそれらの混合物が含まれる。界面活性剤は、エマルションにおいてテルペン成分を保持するように作用し、さらに中空グルカン粒子又は細胞壁粒子へのテルペン成分の封入を助ける。

本発明のテルペン成分は、単一のテルペン、又はテルペンの混合物を含むことができる。テルペンの混合物は、相乗効果をもたらし得る。

本明細書では、「テルペン」という用語は、式（Ｃ_５Ｈ_８）_ｎのテルペンだけでなく、テルペンアルデヒド、又はテルペンポリマーなどのテルペン誘導体も包含する。天然及び合成テルペンが含まれ、たとえば、モノテルペン、セスキテルペン、ジテルペン、トリテルペン、及びテトラテルペンである。さらに、化合物の単一名への言及は、その化合物の種々の異性体を包含するものとする。たとえば、シトラールという用語には、ｃｉｓ異性体シトラール−ａ（又は、ゲラニアール）、及びｔｒａｎｓ異性体シトラール−ｂ（又は、ネラール）が含まれる。

テルペンは、それらを含有する抽出物又は精油の名称、たとえばレモングラス油（シトラール含有）でも知られていることに留意されたい。

米国の規制の妨げを受けず、ＥＰＡ規制４０Ｃ．Ｆ．Ｒ．Ｐａｒｔ １５２（その全体を参照により本明細書の一部とする）に挙げられているテルペンが本発明での使用に適している。

特に本発明での使用に適しているテルペンには、シトラール、ピネン、ネロール、β−イオノン、ゲラニオール、カルバクロール、オイゲノール、カルボン（たとえば、Ｌ−カルボン）、テルペニオール、アネトール、カンファー、メントール、チモール、リモネン、ネロリドール、ファルネソール、フィトール、カロテン（ビタミンＡ_１）、スクアレン、チモール、トコトリエノール、ペリリルアルコール、ボルネオール、ミルセン、シメン、カレン、テルペネン、リナロール、及びそれらの混合物からなる群から選択されたものが含まれる。

好ましくは、本発明に用いられるテルペンは、一般構造Ｃ_１０Ｈ_１６を有するものであり、このサブグループは一般に感染因子に対してより有効である。

より好ましくは、テルペン成分は、ゲラニオール、チモール、シトラール、カルボン（たとえば、Ｌ−カルボン）、オイゲノール、及びβ−イオノンからなる群から選択されたテルペンを含む。

このテルペンは真菌植物感染の処置又は予防に特に有効であることが示されているため、テルペン成分は、適切にはチモールを含むことができる。

特に適した他のテルペンは、いくつかの微生物に対して特に有効であることが実証されているシトラールである。

ゲラニオール、チモール、及びオイゲノールの組合せは、植物感染に対抗するのに特に有効であることが実証されており、したがって、特に適したテルペン成分である。

シトラール単独、又はチモール、オイゲノール、及びシトラールの組合せは、ダニ感染症との闘いにおける特定の効力を実証しており、したがって特に適切なテルペン成分である。

植物感染の処置に高い有効性を示している他のテルペン製剤には、以下のものが含まれる（パーセントは重量による）。
−１００％チモール、
−５０％ゲラニオール、及び５０％チモール、
−５０％オイゲノール、及び５０％チモール、
−３３％ゲラニオール、３３％オイゲノール、及び３３％チモール、
−３３％オイゲノール、３３％チモール、及び３３％シトラール、
−２５％ゲラニオール、２５％オイゲノール、２５％チモール、
−２５％シトラール、
−２０％ゲラニオール、２０％オイゲノール、２０％シトラール、２０％チモール、及び２０％Ｌ−カルボン。

したがって、上述の製剤のいずれかを含むテルペン成分が、本発明での使用に特に適している。

一実施形態において、テルペン成分は、酸素を含有する１種又は複数のテルペンを含む。シトラール、たとえばシトラール９５は、酸素添加Ｃ_１０Ｈ_１６テルペン、Ｃ_１０Ｈ_１６Ｏ ＣＡＳ Ｎｏ．５３９２−４０−５（３，７−ジメチル−２，６−オクタジエン−１−アール）である。シトラールの安定な懸濁液は、約２５００ｐｐｍまで形成することができる。シトラールは、約５００ｐｐｍまで溶液として製造することができる。２５ｐｐｔシトラールのシトラールを取り込んでいる中空グルカン粒子の安定な懸濁液を製造することができる。

本発明の組成物は、１から９９体積％のテルペン、０から９９体積％の界面活性剤、及び１から９９％の中空グルカン粒子又は細胞壁粒子を含むことができる。より詳細には、組成物は、約１０重量％から約６７重量％のテルペン、約０．１〜１０％の界面活性剤、及び約４０〜９０％の中空グルカン粒子又は細胞壁粒子を含むことができる。

適切には、本発明の組成物は、約５００から約１００００ｐｐｍの中空グルカン粒子又は細胞壁粒子を含み、これらの粒子は、約１から約６７％のテルペン成分を含有する。好ましくは、組成物は、約１０００から約２０００ｐｐｍの中空グルカン粒子又は細胞壁粒子を含み、これらの粒子は、約１０から約５０％のテルペン成分を含有する。

特定の組成物には、たとえば、細菌及び真菌の場合、６７％までのＬ−カルボン、６７％までのオイゲノール、６７％までのシトラール、６７％までのチモール及びＬ−カルボン、６７％までのゲラニオール、又は６７％までのシトラール及びＬ−カルボン及びオイゲノール、並びに１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を含む、水又は標準０．９％食塩水中のテルペン封入中空グルカン粒子又は細胞壁粒子、カビの場合、６７％までのシトラール、及び１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を含む、水又は標準０．９％食塩水中のテルペン封入中空グルカン粒子又は細胞壁粒子、或いはマイコプラズマの場合、６７％までのシトラール、６７％までのＬ−カルボン及びオイゲノール、６７％までのオイゲノール、６７％までのゲラニオール、又は６７％までのゲラニオール及びチモール、並びに１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を含む、水又は標準０．９％食塩水中のテルペン封入中空グルカン粒子又は細胞壁粒子を含むことができる。

１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２５、１３０、１４０、１５０、１６０、１７５、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、１１００、１２５０、１３７５、１４２５、１５００、１６００、１７５０、又は２０００ｐｐｍのテルペン封入中空グルカン粒子又は細胞壁粒子の濃度を、本発明の組成物及び方法において、有効濃度として用いることができる。さらに高い濃度（２５ｐｐｔ（すなわち１０００分の１）まで）を製造することができ、本発明において有用である可能性がある。

本発明の組成物は、約１ｐｐｍから約２５ｐｐｔ（２５０００ｐｐｍ）のテルペン成分、好ましくは１００から２０００ｐｐｍのテルペン成分、たとえば２５０、５００、１０００、２０００ｐｐｍのテルペン成分を含むことができる。

本発明のテルペン、界面活性剤、及び他の成分は、容易に購入できるか、又は合成化学者に一般に知られている技法を用いて合成することができる。

本発明に用いられるテルペンは、安全及び規制上の理由から、少なくとも食品グレードのテルペン（米国ＦＤＡ又は米国外の同等の国内規制機関によって規定されたもの）であることが非常に好ましい。

場合によって、組成物は、テルペン成分に加えて、他の食品グレードの活性成分、たとえば他の抗微生物剤、酵素などを含むことができる。

場合によって、組成物は、テルペン成分に加えて、さらなる活性剤、たとえば抗微生物剤、抗真菌剤、殺虫剤、抗炎症剤、麻酔剤などを含むことができる。適切な薬剤には、以下のものが含まれる。
−抗真菌剤：細胞壁ヒドロリアーゼ（中空グルカン粒子又は細胞壁粒子を分解しないと想定される）、細胞壁合成阻害剤、標準的な抗真菌剤、
−抗菌剤：防腐剤、細胞壁加水分解酵素、合成阻害剤、抗生物質、
−殺虫剤：天然殺虫剤、キチナーゼ。

この組成物は、テルペンの酸化を低減するために、抗酸化剤を含むことができる。そのような抗酸化剤の例は、ローズマリー油、ビタミンＣ、又はビタミンＥであることができる。

本発明の組成物は、乾燥粉末の形態であることができる。組成物は、液体、固体、又はゲル様形態で、農業的に、或いは食品又は医薬品として許容される担体又は賦形剤と組み合わせて提供することができる。

固体組成物の場合、適切な担体には、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどが含まれる。適切には、製剤は、錠剤又はペレット剤の形態である。適切であれば、担体はヒト又は動物の食品材料であることもできる。さらに、通常の農業用担体も用いることができる。
組成物のペレット剤、錠剤、又は他の固体形態は、好ましくは、たとえば水などの液体に混入されたときに、組成物の分散を促進する分散剤も含有することができる。適切な分散剤には、キサンタンガム、マルトデキストリン、アルギン酸塩などが含まれる。

液体組成物は、たとえば、組成物を水、食塩水、デキストロース水溶液、グリセロール、エタノールなどに分散して、溶液又は懸濁液を形成することによって調製することができる。所望であれば、これらの組成物は、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤（たとえば、酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、又はオレイン酸トリエタノールアミン）などの少量の非毒性補助物質を含有することができる。そのような液体組成物を調製する方法は、当業者に知られているか又は明らかであり、たとえば、参照により本明細書の一部とするＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｗｉｌｋｉｎｓ（２０００年１２月１５日）を参照されたい。液体組成物も、ヒト又は動物の食品又は飲料液体材料に組成物を分散することによって調製することができる。さらに、適切な農業用液体賦形剤を用いることができる。

経口投与用錠剤及び顆粒剤は、一般に好ましい。錠剤は、結合剤及び潤滑剤を含有することができる。微粉又は顆粒剤は、希釈剤、分散剤、及び／又は界面活性剤を含有することができ、水又はシロップ中に存在させることができる。カプセル剤又は小袋剤は、好都合には、乾燥状態の組成物を含有できる。組成物の非水性溶液又は懸濁液も適しており、懸濁化剤を含有することができる。所望であるか、又は必要である場合、香料、保存剤、懸濁化剤、増粘剤、又は乳化剤を含有させることができる。当然ながら、経口送達方法として、食品又は飲料材料の使用も適している。

非経口投与は一般に、注射を特徴とする。注射剤の場合、一般に、組成物に用いられるすべての材料、及び用いられる任意の賦形剤は、医薬品グレードでなければならないことが理解されるであろう。注射剤は、液体溶液、エマルション、又は懸濁液、注射前に液体に溶解、懸濁するのに適した固体形態、或いはエマルションとして、通常の形態で調製することができる。非経口投与の別のアプローチには、一定レベルの投与量が維持されるように、徐放又は持続放出系を使用することが含まれる。たとえば、参照により本明細書の一部とする、米国特許第３７１０７９５号を参照されたい。非経口用の調剤はさらに、緩衝剤、希釈剤、及び他の適切な添加剤を含有することができる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（オリーブ油など）、及び注射可能有機エステル（オレイン酸エチルなど）である。水性担体には、水、アルコール性／水性溶液、エマルション、又は懸濁液が含まれ、食塩水、及び緩衝媒質が含まれる。他の非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲル液デキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、又は固定油が含まれる。静脈に用いるビヒクルには、流体栄養補給剤、電解質補給剤（リンゲル液デキストロースをベースとするものなど）などが含まれる。保存剤、又は他の添加剤、たとえば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなども存在できる。

局所投与の場合、液剤、懸濁剤、ローション剤、クリーム、ゲル、軟膏、ドロップ、坐剤、噴霧剤、及び粉剤を用いることができる。必要であるか、又は所望であれば、通常の薬剤担体、水性、粉末、又は油性基剤、増粘剤などを用いることができる。

本発明はさらに、テルペン成分を封入している中空グルカン粒子又は細胞壁粒子を調製する方法を提供し、前記方法は、
ａ）テルペン成分を提供するステップ、
ｂ）中空グルカン粒子又は細胞壁粒子を提供するステップ、
ｃ）テルペン封入に適した条件下で、テルペン成分をグルカン粒子又は細胞壁粒子と共にインキュベートするステップ、及び
ｄ）テルペン成分を封入している中空グルカン粒子又は細胞壁粒子を回収するステップを含む。

場合によって、上述の方法はさらに、テルペン成分を封入している粒子を乾燥するステップを含むことができる。乾燥はいくつかの方法で達成することができ、凍結乾燥、流動層乾燥、ドラム乾燥、又は噴霧乾燥を挙げることができるが、いずれもよく知られた方法である。

上述のステップａ）において、テルペン成分は、適切には、場合によって界面活性剤の存在下、水性溶媒の懸濁液として提供される。適切には、溶媒は水である。適切な界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン）であり、好ましくは、界面活性剤は全反応混合物の約０．１から１０体積％、より好ましくは約１％の濃度で存在する。或いは、テルペン成分は、溶媒、たとえば水の真溶液として提供することもできる。水のテルペン真溶液は、真溶液が得られるまで、高剪断下、水中でテルペンを混合することによって得ることができる。国際公開第０３／０２００２４号パンフレットは、水のテルペン真溶液の形成に関するさらなる詳細を提供している。

上述のステップｂ）において、中空グルカン粒子又は細胞壁粒子は、適切には、水又は他の適切な液体の懸濁液として提供される。適切には、懸濁液は、１ｍｌ当たり約１から１０００ｍｇの粒子、好ましくは２００から４００ｍｇ／ｍｌの粒子を含む。或いは、粒子は乾燥粉末として提供し、テルペン−界面活性剤懸濁液に添加することができる。

或いは、粒子は、最小限度に粒子を水和するのに充分であるが、著しく過剰ではない液体に提供される。「流体力学的体積」（ＨＶ）という用語は、最小限度に粒子を水和するのに必要とされる液体の体積を説明するために用いられる。したがって適切には、粒子は、ＨＶからＨＶの１．５倍（１．５ＨＶ）の範囲となる体積で提供される。これによって、それに続く乾燥ステップがより効率的になる。また、低量の液体が用いられる場合（すなわち、およそＨＶから１．５ＨＶ）、最終生成物をペレット又はヌードル形態に押し出すことも可能であり、流動層乾燥に好都合である。

テルペン成分は、室温で中空グルカン粒子又は細胞壁粒子に封入され得ることが見出された。しかしながら、封入速度は３７℃で増大するが、温度は組成物の任意の成分の沸点又は変性温度より低く維持されるべきである。したがって、上述の方法のステップｃ）の適切な条件は、２０から３７℃の温度で大気圧である。特定の封入反応に関する条件の最適化は、通常の実験の問題であろう。

本発明はさらに、微生物を殺す方法を提供し、前記方法は、
ａ）前記微生物を、テルペン成分を封入している中空グルカン粒子又は細胞壁粒子を含む組成物と接触させるステップを含む。

適切な組成物は、上により詳細に定義したものである。

本発明はさらに、患者において感染を予防又は処置する方法を提供し、前記方法は、
ａ）テルペン成分を封入している中空グルカン粒子又は細胞壁粒子を含む組成物を、治療上有効量で前記患者に投与するステップを含む。

適切な組成物は、上により詳細に定義したものである。

患者の感染は、任意の感染因子に起因するものであることができる。それらの感染因子の例には、これに限定されるものではないが、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、アスペルギルスフミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、マイコプラズマアイオワエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｉｏｗａｅ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）、及びマイコプラズマニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が含まれる。

内部投与の場合、組成物は、経口、経膣、経直腸、吸入、又は非経口経路、たとえば、皮内、皮下、筋内、腹腔内、直腸内、動脈内、リンパ内、静脈内、髄腔内、及び気管内経路で投与することができる。これらの経路に適した組成物の製剤は、上述のものである。

外部処置の場合、組成物は、局所的に、たとえばクリーム剤、又は軟膏剤として、或いは創傷を処置するための乾燥粉剤として適用することができる。

上述の方法において投与されるテルペンの量は、所望の結果、すなわち感染の予防及び／又は処置を達成するのに明らかに充分な量であるべきだが、患者に重大な毒性作用を誘発するレベルであるべきではない。

当然ながら、投与される組成物の量は、処置される患者に対する投与様式、すなわち体重、年齢、状態、性別、及び対象における疾患の程度、並びに処方する医師の判断によって決まることになる。投与量、投与計画、及び投与経路は多様であり得る。当業者は、当分野の一般知識、及び下に記載する実施例の手順に基づいて、所与の適用での抗感染量を容易に決定することができるであろう。本明細書では、「患者」という用語は、処置が適用される任意の個体、ヒト又は動物を指すものであることに留意されたい。したがって、患者は、家庭で飼われる動物（たとえば、ネコ、イヌなど）、家畜（たとえば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、実験動物（たとえば、マウス、ウサギ、ラット、モルモットなど）、鳥、及び魚であることができる。適切には、対象は哺乳類、特に霊長類、たとえばヒトである。

別の態様において、本発明は、
ａ）テルペン成分を封入する中空グルカン粒子又は細胞壁粒子を含む組成物の有効量を、前記昆虫又はクモ類に投与する
ステップを含む、昆虫又はクモ類を死滅させる方法を提供する。

本発明により死滅させることのできる昆虫には、たとえばアリ、シロアリ、シラミ、アブラムシ、ノミ、バッタ、キリギリス、アザミウマが含まれる。

本発明により死滅させることのできるクモ類には、たとえばダニ、クモ、及びマダニが含まれる。

一実施形態において、本発明は、植物に蔓延するダニ、たとえばナミハダニを死滅させる方法を提供する。シトラールのみ、又はオイゲノール、チモール、及びシトラールの組合せを含む組成物は、ナミハダニを死滅させるのに特に適切である。

投与は、適切には、この組成物を昆虫又はクモ類に噴霧することによって、又はその他の方法で広く行き渡らせることによって行うことができ、或いは、後に昆虫又はクモ類により摂取される可能性のある植物の葉に、噴霧することによって行うことができる。或いは、昆虫又はクモ類が蔓延している物体を、この組成物に浸漬してもよい。

ヒト、動物に昆虫又はクモ類がたかる場合、この組成物を、たとえばシャンプーなどの形で投与することができる。

布地、たとえば衣類に昆虫又はクモ類がたかる場合、この組成物を、衣服の洗濯中に投与してもよい。たとえば組成物は、衣服の洗剤又は柔軟剤組成物の一部として投与することができる。

さらなる実施形態において、本発明は、植物の感染又は侵襲を処置又は予防する方法を提供し、前記方法は、
ａ）テルペン成分を封入している中空グルカン粒子又は細胞壁粒子を含む組成物を、治療上有効量で、植物、又は植物近くの土壌に投与するステップを含む。

適切な組成物は、上により詳細に定義したものである。

テルペンは、いくつかの植物病原体を除去することが示されており（国際公開第０３／０２００２４号パンフレットを参照のこと）、さらに同時係属米国特許出願第６０／５３８６２７号に記載のとおり、重要な植物寄生生物である線虫を有効に殺す。しかしながら、テルペン単独の懸濁液又は溶液は、やや不安定であり、土壌環境で急速に分解し、したがって有効性を失う。

中空グルカン粒子又は細胞壁粒子にテルペン成分を取り込むことによって、テルペンの放出速度及び分解を低減し、したがって、土壌でのテルペンの作用期間を延長することができる。

適切には、上述の方法で処置又は予防される植物の感染は、線虫による感染である。

処置又は予防することのできる他の植物感染には、真菌植物感染、特に植物の表面に影響を及ぼすものが含まれる。そのような感染には、ベト病、ウドンコ病、又はボトリチス房腐敗病（ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｂｕｎｃｈ ｒｏｔ）が含まれ、これらの感染は特にブドウの木に影響を及ぼす。

一実施形態において、植物感染は、以下の１種又は複数に起因することができる。
アスペルギルスフミガーツス、スクレロチニアホモエオカルパ（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｔａ ｈｏｍｅｏｃａｒｐａ）、リゾクトニアソラニー（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）、コレトトリカムグラミニコーラ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、フィトフトラインフェタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）又はペニシリウム属。

予防又は処置することができる植物侵襲には、昆虫又はクモ類による侵襲が含まれる。処置することができる昆虫侵襲の例には、ハエ、アブラムシ、アリ、バッタ、キリギリス、及びアザミウマによるものが含まれる。予防又は処置することのできるクモ類侵襲の例には、草食性ダニ（ナミハダニを含む）が含まれる。

本発明による組成物は、ダニ、特にナミハダニによる植物侵襲の処置に、特に有効であることが示されている。シトラールのみ、又はオイゲノール、チモール、及びシトラールの組合せを含む組成物は、ナミハダニを死滅させるのに特に適切である。

テルペンをベースとする植物処置の利点は、収穫の直前に適用できることである。

通常の多くの処置は、処置区域に再入するまでに長期間を要する（一般に３週）。これは、所望の時点に作物を収穫することができないため、収穫直前の植物病害の発生は通常の処置では、処置を行えないことを意味している。本発明の組成物は、適切には、収穫までの任意の時点、たとえば、収穫前２１日、収穫前１４日、収穫前７日、或いは収穫前３日又はそれ以降であっても適用できる。

封入テルペンは、特にブドウのベト病、ウドンコ病、及びボトリチス房腐敗病の処置に有効性を示し、したがって、本発明は、これらの疾病を処置又は予防する方法を提供する。さらに、封入されたテルペンは、ナミハダニ侵襲の処置に特に有効であることが示されており、したがって本発明は、そのような侵襲の処置又は予防を行う方法も提供する。

植物感染の予防は、予防手段として、植物を封入テルペンで定期的に処置することによって達成できる。

適切には、本発明の組成物は、噴霧によって適用される。これは、植物の表面に影響を及ぼす植物病害の処置に特に適している。噴霧の場合、水に２ｇ／ｌの組成物を含む調剤を用いることができる。２から４ｇ／ｌの濃度が特に有効であり、必要に応じて、４ｇ／ｌを超える濃度を用いることができる。明らかに、用いられる組成物の濃度は、病原因子を殺すか又は阻害するのに充分であるが、処置される植物を害するほど高濃度でないことが重要である。

植物に噴霧するとき、５００Ｌ／Ｈａ以上の割合が、植物を被覆するのに適している。良好な被覆を確保するために、好ましくは９００Ｌ／Ｈａ以上、より好ましくは１２００Ｌ／Ｈａ以上の割合が用いられる。ブドウの木を処置する場合、１２００Ｌ／Ｈａ以上の割合が適切に有効であることが証明されている。

本発明の組成物は、別法として灌漑によって適用することもできる。これは、線虫、或いは他の土壌媒介性病原体又は寄生生物を処置するのに特に適している。

別の実施形態において、本発明は、殺虫剤として又はクモ駆除剤（すなわち、クモ類を死滅させることが可能な組成物）として、特にダニ駆除剤としての、テルペン成分を封入する中空グルカン粒子又は細胞壁粒子を含む組成物の使用を提供する。

別の実施形態において、本発明は、殺虫剤又はクモ駆除剤、特にダニ駆除剤を調製するための、テルペン成分を封入する中空グルカン粒子又は細胞壁粒子を含む組成物の使用を提供する。

さらなる実施形態において、本発明はさらに、患者又は植物において感染の予防又は処置に用いるための、テルペン成分を封入している中空グルカン粒子又は細胞壁粒子を含む組成物を提供する。適切な組成物は、上により詳細に定義したものである。

さらなる実施形態において、本発明は、微生物に起因する感染を処置する薬剤の製造における、テルペン成分を封入している中空グルカン粒子又は細胞壁粒子を含む組成物の使用を提供する。適切な組成物は、上により詳細に定義したものである。

本発明を以下の非限定的な実施例及び図を参照してさらに説明する。

以下の実施例は、当業者が本発明を製造又は実行することをさらに可能にするために提供されるものである。実施例は単に例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。他に別段の指示のないかぎり、部は体積部又は重量部であり、指示されるとおり、温度はセ氏温度（℃）であるか、又は周囲温度であり、圧力は大気圧であるか、又は大気圧に近い圧力である。組成物、及び組成物を製造又は使用する条件、たとえば、成分の濃度、望ましい溶媒、溶媒混合物、温度、圧力、並びに記載の組成物及び方法から得られる結果を最適化するために用いることのできる他の範囲及び条件には、多数の変形及び組合せがある。それらの最適化には、合理的かつ通常の実験のみを必要とする。

実施例１−パン酵母粒子及び精製酵母グルカン粒子へのテルペン取り込みの実証

以下のプロトコルを実施して、テルペンが酵母細胞壁及び他の中空グルカン粒子に取り込まれることを実証した。

１５０μｌのテルペンを１００μｌの１０％Ｔｗｅｅｎ８０水溶液及び２５０ｍｌの水と混合することによって、シトラールとＬ−カルボンとのエマルションを調製した。

パン酵母粒子（ＹＰ）、又はＬｅｖａｃａｎ（商標）酵母グルカン粒子（ＹＧＰ）、Ｓａｖｏｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．、Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ、ＮＪから入手可能、を水と混合して、２５０ｍｇ／ｍｌの懸濁液を形成した。

５００μｌのＹＰ又はＹＧＰ懸濁液、及び２５０μｌのテルペンエマルションを混合し、継続的に撹拌しながら、一晩インキュベートした。５００μｌのＹＰ又はＹＧＰ懸濁液、及び５００μｌの水をコントロールとして用いた。次いで、外部のエマルションがなくなるまで、粒子を水で洗浄した。その後、乾燥するまで、粒子調剤を凍結及び凍結乾燥した。

その後、粒子を再水和し、光学顕微鏡で検査した。結果を図１から４に示す。

図１は、その中心に暗色領域を有する球形構造を示し、これらは空の中空グルカン粒子である。図２及び３は、明色の内部を有する膨張した外観の球形構造を示し、これらは中心腔に封入されたテルペンを含む粒子であり、図２はシトラール、図３はＬ−カルボンである。図２及び３では、たとえば図２の上部、中央のわずか左に、遊離テルペンの小さな塊も認められる。図４は、水に懸濁されたテルペンの小さな泡としてテルペンエマルションを示している。

実施例２−パン酵母細胞壁粒子（ＹＰ）でのシトラール及びＬ−カルボンの最大取り込みレベルの決定

以下のプロトコルを実施して、ＹＰに取り込まれるテルペンの最大量を求めた。
−４．５ｇのテルペンを０．３ｍｌの水と超音波処理することによって、Ｌ−カルボンとシトラールとのエマルションを調製した。
−４．５ｇのＴｗｅｅｎ８０を４０．５ｍｌの水で超音波処理することによって、１０％Ｔｗｅｅｎ８０溶液を調製した。
−ＹＰを水と混合して、２０ｍｇ／ｍｌの懸濁液を形成することによって、ＹＰ懸濁液を調製した。
−表１に記載したとおり、封入反応を設定した。

シトラール又はＬ−カルボン−水エマルションを、室温で一晩、ＹＰ及びＴｗｅｅｎ８０界面活性剤と混合した。試料を１４０００×ｇで１０分間遠心分離し、水層に浮遊する遊離テルペンの出現を記録した。結果を、表１の遊離テルペンと表示した右側の列に示す。

「遊離テルペン」という表現は、遠心分離した反応混合物において可視であるテルペンの存在を指す。遊離テルペンの不在は、テルペンが粒子に完全に吸収されていることを示す。遊離テルペンの不在から明らかとなる、粒子に吸収されるテルペンの最大容量を、吸収テルペンエマルションの最大容量として記録した。

結果からわかるように、ＹＰ１０ｍｇ当たり、少なくとも１６．５μｌのＬ−カルボンテルペンエマルション、又は少なくとも５μｌのシトラールエマルションを、ＹＰは吸収及び封入することができる。

実施例３−界面活性剤によるテルペン取り込み改善の実証、及びＴｗｅｅｎ８０：テルペンの最適比の決定

以下のプロトコルを実施して、界面活性剤の存在がテルペンの取り込みを改善することを実証し、ＹＰのテルペン取り込み反応に必要とされるＴｗｅｅｎ８０界面活性剤の最小量を求めた。
−４．５ｇのテルペンを０．３ｍｌの水と超音波処理することによって、Ｌ−カルボンとシトラールとのエマルションを調製した。
−４．５ｇのＴｗｅｅｎ８０を４０．５ｍｌの水で超音波処理することによって、１０％Ｔｗｅｅｎ８０溶液を調製した。
−ＹＰを水と混合して、２５０ｍｇ／ｍｌの懸濁液を形成することによって、パンＹＰ懸濁液を調製した。

取り込み反応を、下記の表２に示したとおり設定した。

シトラール又はＬ−カルボン−水エマルションを、室温で一晩、０〜１０体積％のＴｗｅｅｎ８０界面活性剤を含むＹＰと混合した。試料を１４０００×ｇで１０分間遠心分離し、水層に浮遊する遊離テルペンの出現を記録した。結果を、表２の遊離テルペンと表示した右側の列に示す。

「遊離テルペン」という表現は、遠心分離した反応混合物において可視であるテルペンの存在を指す。遊離テルペンの不在は、テルペンがＹＰに完全に吸収され、封入されていることを示す。遊離テルペンの不在から明らかとなる、ＹＰに吸収されるテルペンの最大容量を、吸収テルペンエマルションの最大容量として記録した。

結果からわかるように、１％のＴｗｅｅｎ８０の濃度（すなわち、１０００μｌの反応混合物中、１００μｌの１０％Ｔｗｅｅｎ８０）は、上述の反応において、テルペンの完全な取り込みを可能にするのに充分である。２％のＴｗｅｅｎ８０は結果を改善しないが、濃度０．３３％では遊離テルペンが観察された。これは以下のことを示唆する。
界面活性剤の不在下、テルペンはＹＰ粒子に吸収されるが、界面活性剤の存在は、テルペンの吸収を著しく増大する。
約１％のＴｗｅｅｎ８０の濃度は、適切な取り込みを確保し、同時にＹＰ粒子のテルペンペイロードを最大にするので、ＹＰの取り込みに最適である。

実施例４−高濃度のパン酵母細胞壁粒子（ＹＰ）の最大テルペン取り込み及び封入の決定

以下のプロトコルを実施して、ＹＰが高濃度であるときに、ＹＰに取り込まれるテルペンの最大量を決定した。
−４．５ｇのテルペンを３ｍｌの１％Ｔｗｅｅｎと超音波処理することによって、Ｌ−カルボンとシトラールとのエマルションを調製した。
−０．５ｇのＴｗｅｅｎ８０を９．５ｍｌの水で超音波処理することによって、５％Ｔｗｅｅｎ８０溶液を調製した。
−ＹＰを水と混合して、２５０ｍｇ／ｍｌの懸濁液を形成することによって、ＹＰ懸濁液を調製した。
−表３に示したとおり、封入反応を設定した。

シトラール又はＬ−カルボン−水エマルションを、室温で一晩、ＹＰ及びＴｗｅｅｎ８０界面活性剤と混合した。試料を１４０００×ｇで１０分間遠心分離し、水層に浮遊する遊離テルペンの出現を記録した。結果を、表３の遊離テルペンと表示した右側の列に示す。

「遊離テルペン」という表現は、遠心分離した反応混合物において可視であるテルペンの存在を指す。遊離テルペンの不在は、テルペンがＹＰに完全に吸収されていることを示す。遊離テルペンの不在から明らかとなる、ＹＰに吸収されるテルペンの最大容量を、吸収テルペンエマルションの最大容量として記録した。

表３の結果からわかるように、ＹＰが高濃度であるとき、ＹＰはテルペンを吸収及び封入することができる。ＹＰ１２５ｍｇ当たり、少なくとも１１２．５μｌのＬ−カルボンテルペンエマルション、又は少なくとも７５μｌのシトラールテルペンエマルションを、ＹＰは吸収及び封入した。これは、テルペン封入反応が、試験範囲内のＹＰ濃度に依存していないことを実証している。

実施例５−テルペン吸収に関する市販粒子のスクリーニング

以下のプロトコルを実施して、様々な種類の粒子の取り込み特性を分析した。研究した粒子は、パン酵母細胞壁粒子（Ｂａｋｅｒ’ｓ Ｙｅａｓｔ Ｃｅｌｌ Ｗａｌｌ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ｎｕｔｒｅｘ（商標）Ｗａｌｌｓ（Ｓｅｎｓｉｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）、ＳＡＦ Ｍａｎｎａｎ（商標）（ＳＡＦ Ａｇｒｉ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、Ｎｕｔｒｉｃｅｐｔ Ｗａｌｌｓ（商標）（Ｎｕｔｒｉｃｅｐｔｓ Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｎｓｖｉｌｌｅ、ＭＮ）、Ｌｅｖａｃａｎ（商標）（Ｓａｖｏｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．、Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ、ＮＪ）、及びＷＧＰ（商標）（Ａｌｐｈａ−ｂｅｔａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）であった。

７ｇのテルペンを３ｍｌの３．３％Ｔｗｅｅｎ８０と超音波処理することによって、Ｌ−カルボンとシトラールとのエマルションを調製した。

下記の表４は、純度と、１ｍｇ当たりの酵母粒子数及び充填固体の重量／体積比とを比較するものである。

表４から、１ｍｇ当たりの粒子数は純度に反比例することが結論づけられる。したがって、ＷＧＰの１ｍｇ当たりの粒子数は、パンＹＰよりほぼ１０倍多い。

ＹＰ懸濁液を以下のように調製した。
−ＹＰ ２５０ｍｇ／ｍｌ １％Ｔｗｅｅｎ８０を混合することによって、パン酵母細胞壁粒子懸濁液（ＹＰ）を調製した。
−Ｎｕｔｒｅｘ ＹＧＰ １６３ｍｇ／ｍｌ １％Ｔｗｅｅｎ８０を混合することによって、Ｎｕｔｒｅｘ懸濁液を調製した。
−Ｂｉｏｓｐｒｉｎｇｅｒ ＹＧＰ ２３４ｍｇ／ｍｌ １％Ｔｗｅｅｎ８０を混合することによって、ＳＡＦ Ｍａｎｎａｎ懸濁液を調製した。
−Ｎｕｔｒｉｃｅｐｔｓ ＹＧＰ ９９ｍｇ／ｍｌ １％Ｔｗｅｅｎ８０を混合することによって、Ｎｕｔｒｉｃｅｐｔｓ懸濁液を調製した。
−Ｌｅｖ ＹＧＰ ２１７ｍｇ／ｍｌ １％Ｔｗｅｅｎ８０を混合することによって、Ｌｅｖａｃａｎ懸濁液を調製した。
−ＷＧＰ ＹＧＰ １２１ｍｇ／ｍｌ １％Ｔｗｅｅｎ８０を混合することによって、ＷＧＰ懸濁液を調製した。

上述の粒子の充填体積は同一であり、等しい数の粒子が分析されたことを意味する。

表５に示したとおり、取り込み反応を設定し、一晩インキュベートした。試料を１４０００×ｇで１０分間遠心分離し、水層に浮遊する遊離テルペンの出現、及びペレットの封入テルペンの色を記録した。結果を、表５の右側２列に示す。遊離テルペンの不在から明らかとなる、粒子に吸収されるテルペンの最大容量を、吸収テルペンエマルションの容量として記録した。

結果から、以下の結論に達した。
−低脂質含量の精製粒子は、テルペン吸収において、有効性が低かった。
−純度の低い粒子は、テルペン吸収において、より有効であった。
−ＳＡＦ−Ｍａｎｎａｎ（商標）に封入されたとき、シトラールの黄色分解生成物は形成しなかった。
−試験した単一テルペンレベルでの質的取り込みに基づいて、ＳＡＦ Ｍａｎｎａｎ（商標）が最良であり、Ｎｕｔｒｅｘ（商標）が２番、パン酵母細胞壁粒子が３番であると考えられる。

実施例６−種々の粒子及び種々のインキュベーション温度でのテルペン取り込み速度

以下のプロトコルを適用して、種々の酵母粒子の取り込み速度を比較した。

７ｇのテルペンを３ｍｌの３．３％Ｔｗｅｅｎ８０と超音波処理することによって、Ｌ−カルボンとシトラールとのエマルションを調製した。

１ｍｌの１０％Ｔｗｅｅｎ８０を１０ｍｌの水で超音波処理することによって、１％Ｔｗｅｅｎ８０溶液を調製した。
−５ｇのパンＹＰを２０ｍｌの１％Ｔｗｅｅｎ８０に混合することによって、パンＹＰを調製した。
−２ｇのＮｕｔｒｅｘ（商標）ＹＧＰを２０ｍｌの１％Ｔｗｅｅｎ８０に混合することによって、Ｎｕｔｒｅｘ（商標）ＹＧＰ懸濁液を調製した。
−２ｇのＳＡＦ Ｍａｎｎａｎ（商標）を２０ｍｌの１％Ｔｗｅｅｎ８０に混合することによって、ＳＡＦ Ｍａｎｎａｎ（商標）懸濁液を調製した。
表６に示したとおり、取り込み反応を設定した。

反応物を、室温又は３７℃で、１、３、６、９、及び２４時間インキュベートした。インキュベートした後、試料を１４０００×ｇで１０分間遠心分離し、水層に浮遊する遊離テルペンの出現を記録した。結果を、表６の右側２列に示す。遊離テルペンの不在から明らかとなる、粒子に吸収されるテルペンの最大容量を、吸収テルペンエマルションの容量として記録した。封入ペレットの色を２４時間の時点で記録した。

表６に示した結果及び他の観察から、以下の結論を得ることができる。
−テルペンの取り込み反応には１から３時間を要する。
−テルペンの取り込みは、室温より３７℃で速く起こる。
−ＳＡＦ Ｍａｎｎａｎ（商標）は２つの理由から好ましい粒子であると考えられる。
−両方のテルペンを、より速く、より完全に取り込む。
−３７℃で２４時間後、シトラール分解の特徴である黄色の不在から明らかなように、シトラールは取り込まれたときに安定なままである。

実施例７−粒子取り込みに関する一連の単一テルペン及びテルペン組合せのスクリーニング

以下のプロトコルを適用して、パンＹＰとＳＡＦ Ｍａｎｎａｎ（商標）の取り込み効率を比較した。

テルペンエマルションを以下のとおり調製した。
−Ｌ−カルボン １．５ｍｌの３．３％Ｔｗｅｅｎ８０に４．５ｇのＬ−カルボン。
−シトラール １．５ｍｌの３．３％Ｔｗｅｅｎ８０に４．５ｇのシトラール。
−チモール／Ｌ−カルボン混合物（Ｔ／Ｌ） １．５ｍｌの３．３％Ｔｗｅｅｎ８０に２．２５ｇのチモール及び２．２５ｇのＬ−カルボン。
−オイゲノール １．５ｍｌの３．３％Ｔｗｅｅｎ８０に４．５ｇのオイゲノール。
−ゲラニオール １．５ｍｌの３．３％Ｔｗｅｅｎ８０に４．５ｇのゲラニオール。
−シトラール／Ｌ−カルボン／オイゲノール混合物（Ｃ／Ｌ／Ｅ） １．５ｍｌの３．３％Ｔｗｅｅｎ８０に１．５ｇのシトラール、１．５ｇのＬ−カルボン、及び１．５ｇのオイゲノール。
これらの実験には、０．７５：０．３：０．０５の比率のテルペン：水：界面活性剤を含むエマルションを用いた。

表７及び８に示したとおり、増加容量のテルペンエマルションを、室温で一晩、２５０ｍｇ／ｍｌのパンＹＰ又は２５０ｍｇ／ｍｌのＳＡＦ Ｍａｎｎａｎ（商標）と混合した。試料を１４０００×ｇで１０分間遠心分離し、水層に浮遊する遊離テルペンの出現を記録した。遊離テルペンの不在から明らかとなる、パンＹＰ又はＳＡＦ Ｍａｎｎａｎ（商標）に吸収されるテルペンエマルションの最大容量を、吸収テルペンエマルションの容量として記録した。ペレットの封入テルペンの色を記録した。表７及び８の結果は、すべての単一テルペン及びテルペン組合せが、パンＹＰ又はＳＡＦ Ｍａｎｎａｎ粒子の両方に効率よく取り込まれたことを示している。

結果から、以下の観察を行った。
−すべてのテルペンが、パンＹＰ及びＳＡＦ Ｍａｎｎａｎに取り込まれると考えられた。
−ＳＡＦ Ｍａｎｎａｎは、パンＹＰに比べて高いテルペン取り込み能力を有する。
−テルペンの２種及び３種混合物も効率よく取り込まれると考えられる。
−テルペンオイゲノールはペレットとの会合が認められているため、粒子及び水より高い密度を有すると考えられる。
−ＳＡＦ Ｍａｎｎａｎでは、シトラール及びゲラニオールの場合、取り込みレベルが高く、粒子が軽いと、水層の表面に取り込み粒子が浮遊した。
−シトラールは、ＳＡＦ Ｍａｎｎａｎによって酸化から保護されたが、パンＹＰでは保護されなかった。

各種粒子のおよその最大取り込み量を求め、以下の表９及び１０に示す。取り込みパーセントは、存在する粒子の量に対する取り込まれたテルペンの量の比を表す（重量）。

実施例８−水性エマルション及び封入テルペン製剤におけるテルペン安定性の評価

黄色酸化生成物の形成に関してシトラール製剤を観察することによって、テルペン安定性を評価した。表５〜８の右側の列に示したように、シトラールエマルション及びシトラール封入パンＹＰは、経時的に徐々に黄色が増した。しかしながら、経時的な黄色の低減又は不在から明らかなように、シトラールのＳＡＦ Ｍａｎｎａｎ（商標）への封入によって、シトラール安定性が増大した。

実施例９−最小量の水でのテルペンの取り込み

以下のプロトコルを行って、取り込み製剤を流動層乾燥器に直接押し出すことを可能にするために、非常に高い酵母粒子（ＹＰ）固体濃度で、ＹＰにテルペンの取り込み及び封入を行うことのできる可能性を評価した。ＳＡＦ Ｍａｎｎａｎ（商標）粒子を完全に水和する最小量の水は、固体１ｇ当たり水３．５３ｇであると求められた。これは粒子の流体力学的体積（ＨＶ）又は水吸収能力を定義する。この量の水では、水和粒子は、チキソトロピー性、すなわちマヨネーズのようなずれ揺変性である固い生地の粘稠度を有する。ＨＶを超える４０％までの水を添加することによって、粘度の高い流動性のペーストを生じる。上の実施例で用いた標準的な反応は、３×ＨＶの水で行った。

一連のテルペン（Ｌ−カルボン）取り込み反応は、粒子：テルペン：Ｔｗｅｅｎの比率（１：０．４４：０．０４）を一定に保ち、系の水の量をＨＶ（３．５３ｇ）からＨＶ＋４０％の水（４．９２ｇ）に変化させて行った。コントロールは、３×ＨＶの水、粒子のみ、及びテルペンのみの反応を用いる標準的な取り込み系であった。一晩インキュベートした後、混合物の試料を、遊離テルペン及び粒子へのテルペン取り込みの証拠に関して顕微鏡によって評価し、１５分間にわたって反転した管で流れを評価することによって物流特性を評価した。さらに、反応混合物を５×ＨＶで水和し、ボルテックスして粒子の完全な分散液を得て、テルペンを封入した粒子の沈殿物を遠心分離することによって、遊離油の存在を評価した。結果を、表１１、及び図７から１２に示す。図７から１２は、以下の管の取り込み結果を示す。
図７−管３
図８−管５
図９−管６
図１０−管８
図１１−管１０
図１２−管１１

表１１、及び図７から１２に示した結果は、評価を行ったすべての水の比率で、粒子へのテルペン取り込み及び封入が起こったことを実証している。驚いたことに、粒子を水和する最小量の水を用いる、固い生地の粘稠度を有する反応において取り込み反応が行われたときにも、同等の取り込みが起こった。遊離テルペンの不在は、顕微鏡によって観察され（図７から１２）、さらにテルペンのみのコントロールと比較して上澄みの混濁が著しく低減していることから明らかなように、上澄みの低量のテルペンにおいて観察された。

これらの結果は、テルペンを中空グルカン粒子に取り込む条件に関する理解を広げる。取り込み工程中に粒子を水和する最小量の水を用いる柔軟性によって、反応混合物が標準的な食品グレードの表面一掃生地ミキサーを用いる展性生地様の粘稠度である条件でテルペンを取り込むことが可能になるであろう。最終的な高固体テルペン取り込み混合物の粘稠度は、流動層乾燥のためにヌードル及びペレットを形成する直接押し出しに適している。

この様式でスケールアップ生産するための適切な設備には以下が必要とされる。
ゴーリンホモジナイザ、又は安定なテルペンエマルションを製造する同等物
表面一掃生地混合槽
押し出し機
流動層乾燥器

実施例１０−再水和時、テルペン成分を封入する乾燥中空グルカン粒子分散液において分散を促進する間隙親水コロイド剤の評価

以下のプロトコルを適用して、水和時に、テルペン封入乾燥中空グルカン粒子製剤の分散を増大する間隙親水コロイドの効果を評価した。
ＳＡＦ Ｍａｎｎａｎ（商標）粒子
０．１％Ｔｗｅｅｎ８０
Ｌ−カルボン
キサンタンガム ０．１％Ｔｗｅｅｎ８０中１ｗ／ｖ％

表１２に示したとおり、１．１ｇのＬ−カルボンエマルション（０．７５：０．３：０．０５の比率のＬ−カルボン：水：界面活性剤）を、１ｇのＳＡＦ Ｍａｎｎａｎ、及び０〜１％のキサンタンガムを含有する４．４ｇの０．１％Ｔｗｅｅｎ８０とインキュベートして、ＳＡＦ ＭａｎｎａｎにＬ−カルボンを取り込むことによって、Ｌ−カルボン封入乾燥中空グルカン粒子の水分散液に対するキサンタンガム増量の効果を評価した。

表１２、及び図１３から２０の結果は、テルペン封入粒子の乾燥中に高分子量親水コロイドを用いることによって、均一懸濁液への微粒子の水和及び分散が促進されることを実証している。そのような親水コロイド剤の他の例は、マルトデキストリン、アルギン酸塩などである。

取り込まれたテルペンの安定性を高め、テルペンの持続放出を提供するために、ペレットコーティングを用いることも有益である可能性がある。

実施例１１−黄色ブドウ球菌に対するテルペンエマルション、新鮮パンＹＰ及びＳＡＦ Ｍａｎｎａｎ封入テルペン、並びに凍結乾燥パンＹＰ及びＳＡＦ Ｍａｎｎａｎ封入テルペンの最小阻止濃度（ＭＩＣ）の評価

新鮮中空グルカン粒子封入テルペン製剤と凍結乾燥中空グルカン粒子封入テルペン製剤のＭＩＣを比較するために行ったプロトコルの結果を下記の表１３に示す。単純テルペンエマルションも試験し、比較のために結果を示す。

上記の結果から得た結論は以下のとおりである。
中空グルカン粒子に取り込まれるテルペンは、テルペンＭＩＣを高めると考えられる。一般に、新鮮テルペンエマルションは、封入製剤より〜４〜３７５倍効力が低い。
ＳＡＦ Ｍａｎｎａｎ（商標）に取り込まれたテルペンは、パンＹＰよりわずかに良好に機能する。
新しく取り込まれたテルペン組成物は、凍結乾燥組成物よりわずかに良好に機能する（凍結乾燥中に乾燥組成物からテルペンがいくらか揮発する可能性がある）。
水性エマルションのテルペンは少なくとも３週間安定である。

実施例１２−黄色ブドウ球菌に対するパイロットプラントスケールでの封入テルペンの有効性

黄色ブドウ球菌に対して、パイロットプラントスケールで製造された封入テルペン及び混合物を用いて抗微生物アッセイを行った。材料を含有する新鮮及び凍結乾燥封入テルペン試料は共に、強い抗微生物活性を実証した。結果を下記の表１４に要約する。

テルペンを２．５ｋｇスケールでＳＡＦ Ｍａｎｎａｎ（商標）に封入した。３種のテルペン（ゲラニオール２７５ｇ、オイゲノール３８５ｇ、及びチモール４４０ｇ）の混合物を１００ｇのＴｗｅｅｎ８０及び８Ｌの水に溶解し、均質化した。ＳＡＦ Ｍａｎｎａｎ（商標）（２．５ｋｇ）を添加して、均質懸濁液を形成した。その懸濁液をゴーリンホモジナイザに通して粒径を小さくし、ホモジネートを室温で一晩インキュベートした。封入テルペンの試料を除去し、室温で貯蔵した。次いで、残留する封入テルペンをトレイで凍結し、凍結乾燥した。凍結乾燥封入テルペン粉末を粉砕し、室温で貯蔵した。

パイロットプラントスケールでは、新鮮試料及び凍結乾燥試料は共に、ｗ／ｗテルペンベースで等しく有効であった。

大量調製の結果に基づいて、黄色ブドウ球菌に対する凍結乾燥製剤の予測有効用量は、２００ｐｐｍ（〜５０重量％のテルペンを含有する製剤）又は０．２ｇ／水Ｌである。

実施例１３−マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に対する封入テルペンの有効性

テルペンエマルションを以下のように調製した。
ｂ）シトラール １．５ｍｌの３．３％Ｔｗｅｅｎ８０に４．５ｇのシトラール。
ｃ）Ｌ−カルボン／オイゲノール １．５ｍｌの３．３％Ｔｗｅｅｎ８０に２．２５ｇのＬ−カルボン及び２．２５ｇのオイゲノール。
ｄ）オイゲノール １．５ｍｌの３．３％Ｔｗｅｅｎ８０に４．５ｇのオイゲノール。
ｅ）ゲラニオール １．５ｍｌの３．３％Ｔｗｅｅｎ８０に４．５ｇのゲラニオール。
ｆ）ゲラニオール／チモール混合物 １．５ｍｌの３．３％Ｔｗｅｅｎ８０に２．２５ｇのゲラニオール及び２．２５ｇのチモール。
ｇ）コントロールエマルション ６ｍｌの１％Ｔｗｅｅｎ８０。

ＳＡＦ−Ｍａｎｎａｎ（商標）（２．５ｇ）を、３ｍｌの各エマルション及び７ｍｌの１％Ｔｗｅｅｎ８０と混合し、一晩インキュベートして、テルペン及びテルペン混合物を封入した。封入テルペン製剤を凍結及び凍結乾燥し、粉末を微粉に粉砕した。封入テルペンの懸濁液（２５ｍｇ／ｍｌ）及び非封入テルペンエマルションを、マイコバクテリウムに対する抗菌活性に関してアッセイした。結果を表１５に示す。

実施例１４−封入テルペンの殺線虫活性

シトラールを封入する酵母細胞壁の調製は、上述の手順に従って調製した。中空グルカン粒子は１７．５％のシトラールを含有し、粒子は１０００ｐｐｍの濃度で試験調剤に存在した。これはテルペンが１７５ｐｐｍの濃度で実際上存在したことを意味する。

１．０ｍｌの試験調剤を、根こぶ線虫を含む０．１から０．１５ｍｌの水に添加した。コントロールとして、水１．０を線虫に添加した。

前述のとおり観察を行い、２４及び４８時間後の殺虫率を評価した（すなわち死亡率）。下記の表１６に示した結果は、２組の結果の平均である。

これらの結果は、テルペンを封入している中空グルカン粒子が、わずか１７５ｐｐｍのシトラール濃度に相当する粒子濃度１０００ｐｐｍで、根こぶ線虫の殺虫に有効であることを実証している。

したがって、テルペンを封入している中空グルカン粒子は、殺線虫剤として、溶液中のテルペン、又は界面活性剤を含むテルペンと同程度に有効であると考えられる。テルペンが粒子内部に封入されているにもかかわらず、殺線虫活性は保持される。溶液中のテルペン又は界面活性剤を含むテルペンの場合と同様に、より高濃度の中空グルカン粒子内テルペン、又はより高濃度の粒子によって、さらに高い殺虫率がもたらされることが予期され得る。

実施例１５−封入テルペン及び非封入テルペンの殺真菌性

以下のプロトコルを実施して、種々のテルペン組合せの殺真菌性を評価し、封入組成物と非封入組成物との有効性を比較した。

様々なテルペン製剤の抗真菌性の評価

マイクロタイタープレートアッセイを用いて、種々の病原体に対する、一連のテルペン化合物の最小阻止濃度（ＭＩＣ）を評価した。各有機体に用いたアッセイは後に詳しく記載するが、重要な一般的特徴は次のとおりである。

このアッセイは、静止（増殖阻害）活性と殺菌（殺傷）活性とを識別するために、２つのインキュベーション期間を用いる。第１のインキュベーション期間は、増殖阻害を評価できるが、単なる増殖の阻止と細胞の殺傷とを識別できない。第２のインキュベーション期間の目的は、テルペン暴露を生存する任意の休眠細胞又は阻害細胞が増殖する充分な時間及び栄養分を与えることである。テルペンへの暴露によって殺傷された細胞は新鮮培地で増殖しないが、静真菌作用によって阻害された任意の細胞は、第２のインキュベーション期間に反応し、増殖するはずである。

合計で３１種の異なるテルペン製剤を用いて（表１７）、初期スクリーニング実験を行った。活性の強いテルペン製剤のサブセットを用いて（表１８）、これらの実験を繰り返した。

グルカン粒子に封入された２：１：２の比率のテルペンゲラニオール、オイゲノール、及びチモールの組合せも試験した。この試料はＹＰ−ＧＥＴと称される。封入形態と比較するために、同じ比率の非封入ゲラニオール、オイゲノール、及びチモールの組合せも試験した。

サッカロマイセスセレビシエを用いるＭＩＣアッセイ

９６ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルに、１００μＬのアリコートでサッカロマイセスセレビシエ（５×１０^５細胞／ｍＬ、ＹＰＤ増殖培地）を添加した。プレート毎に少なくとも１列を細胞のみのコントロールと指定し、それらのウェルにはテルペンを加えなかった。種々のテルペン製剤のアリコート（１００μＬ）を残りの列の第１行に加え、１つの行から次の行に合計で７回、１００μＬを移すことによって、連続的に２倍希釈を行った。最後に、すべてのウェルが確実に同じ容量を含有するように、最終行から１００μＬを捨てた。マイクロタイタープレートを３０℃で一晩、静的にインキュベートした。

インキュベートした後、増殖の阻害を記録した（混濁がないことによって明らかとなる）。増殖阻害（≧７５％）は顕微鏡によって視覚的に確認した。

各製剤のＭＩＣを求めた後、マイクロタイタープレートを遠心分離し、非混濁ウェルから使用済み培地を除去した。細胞を新鮮培地（１００μＬ）に再懸濁し、プレートを再び３０℃で一晩インキュベートした。前と同様に増殖阻害の評価を行った。

混合接種物を用いるＭＩＣアッセイ

サッカロマイセスセレビシエに関して記載したとおり、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて、種々のテルペン製剤を連続的に希釈した。次いで、５μＬの混合接種物（カビの生じたブドウの葉から濃度５×１０^４細胞／ｍＬに調製）と共に、融解ＹＰＤ寒天をウェルに添加した。プレートを室温で２４時間、静的にインキュベートし、胞子の増殖を顕微鏡によって視覚的に評価した。

固体培地を使用したため、新鮮培地での第２のインキュベーション期間は実施できなかった。

コレトトリカムグラミニコーラを用いるＭＩＣアッセイ

サッカロマイセスセレビシエに関して記載したとおり、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて、種々のテルペン製剤を連続的に希釈した。コレトトリカムグラミニコーラ（３００胞子／ウェル）を希釈テルペンに添加し、プレートを室温で４８時間、静的にインキュベートした。胞子の発芽と増殖とを顕微鏡によって視覚的に評価した。

各製剤のＭＩＣを求めた後、マイクロタイタープレートを遠心分離し、増殖阻害ウェルから使用済み培地を除去した。胞子を新鮮培地（１００μＬ）に再懸濁し、プレートを再び室温で一晩インキュベートした。前と同様に増殖阻害の評価を行った。

混合接種物

混合接種物の使用はいくつかの問題を提起する。調剤間の胞子含量の変動によってアッセイ間の再現性が不良となり、汚染生物の増殖が胞子発芽の評価を妨げる。単細胞酵母種は、特に胞子増殖のマスキングに問題がある。このアッセイから正確なデータは得られなかったが、テルペンの阻害効果は観察された。

より多数の胞子が用いられたため（約５０／ウェル対約１０／ウェル）、初期スクリーニングアッセイに比べて、繰り返しアッセイの記録において胞子の同定が容易であった。したがって、繰り返しアッセイで得られたデータは、より信頼できるＭＩＣの推定値を提供する可能性がある。

コレトトリカムグラミニコーラ

初期スクリーニングアッセイと比較して、繰り返しアッセイで得られるＭＩＣが一般的に高いのは、以下の理由による可能性がある。
−１週間前のテルペン溶液の使用。
−初期スクリーニングアッセイで用いられたものと比べて高い生存能力を有し、したがって殺菌がより困難である可能性のある新しく調製された胞子の使用。

中空グルカン粒子に封入されたときの同じテルペン製剤と遊離エマルションとしてのテルペン製剤との比較：サッカロマイセスセレビシエＭＩＣアッセイ

９６ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルにＹＰＤ増殖培地（１００μｌ）を添加し、第１行に種々のテルペン製剤のアリコートを加え、この行では総量を２００μｌとした。１列を細胞のみのコントロールと指定し、それらのウェルにはテルペンを加えなかった。１つの行から次の行に合計で７回、１００μｌを移すことによって、連続的な２倍希釈を行った。最後に、すべてのウェルが確実に同じ容量を含有するように、最終行から１００μｌを捨てた。次いで、各ウェルに１００μｌのアリコートでサッカロマイセスセレビシエ（５×１０^５細胞／ｍｌ、ＹＰＤ増殖培地）を添加し、マイクロタイタープレートリーダーを用いて、各ウェルの６２０ｎｍでの吸光度（Ａ_６２０）を測定した。マイクロタイタープレートを３０℃で一晩、静的にインキュベートした。

インキュベートした後、再びＡ_６２０を測定し、増殖の阻害（≧７５％）に関してプレートを評価した。増殖阻害は顕微鏡検査によって視覚的に確認した。

遊離テルペンエマルションは、各製剤のＭＩＣを求めた後、マイクロタイタープレートを遠心分離し、増殖阻害ウェルから使用済み培地を除去した。細胞を新鮮培地（１００μｌ）に再懸濁し、プレートを再び３０℃で一晩インキュベートした。前と同様に増殖阻害の評価を行った。

ＭＩＣと殺真菌ＭＩＣの結果を表１９に要約する。

結果

テルペンエマルション及び酵母封入テルペンの両方で、ＭＩＣは典型的に≦１２５ｐｐｍであり、もっとも活性な製剤は〜６０ｐｐｍで増殖を阻害した。テルペンエマルションで得られたＭＩＣ値は、それぞれの酵母封入製剤で得られた値と類似していた。異なる値が得られた場合、およそ１回の２倍希釈分のみ相違していた。

遊離テルペンエマルションの多くは増殖阻害ＭＩＣで殺真菌性であり、大多数が２倍高い濃度で殺真菌活性を示した。
これらの結果は、グルカン粒子に封入されたテルペンが、少なくとも非封入形態と同程度に真菌の殺菌に有効であることを実証している。さらに、用いられた封入組成物は、４５日間４℃で貯蔵されており、最適以下の〜４重量％のテルペン含量を有するため、能力が低減された可能性がある。

殺真菌活性を求めるアッセイは遠心分離ステップを含み、これはウェルの底部に細胞のペレットを生成することによって、増殖培地において残留するテルペンから微生物細胞を分離しようとする試みである。次いで、このペレットを新鮮培地に再懸濁し、テルペン不在下で２回目のインキュベートを行う。しかしながら、遠心分離ステップは、微生物細胞と酵母粒子を区別することができず、したがって、酵母封入テルペンを用いるとき、細胞ペレットはテルペンを取り込んだ酵母粒子も含有する。結果として、その後、酵母粒子と微生物細胞の両方が新鮮培地に再懸濁される。

この方法論上の問題は、以下の理由から、上述の実験で得られた結果に影響を及ぼすとは考えられない。

これまでの実験で、テルペンエマルションは、テルペンを取り込んだ酵母粒子の代わりに用いられ、殺真菌活性が明らかに示されている。
封入テルペンは拡散によって放出され、封入テルペンの濃度と周囲の培地に放出されたテルペンの濃度は急速に平衡に達する。したがって、遠心分離及び新鮮培地への再懸濁後、増殖培地の放出テルペンの濃度は、増殖阻害活性に必要とされる濃度をはるかに下回る可能性が高い。
殺真菌ＭＩＣウェルの内容物を固体寒天増殖培地に平板培養したとき、増殖は見られなかった。固体増殖培地に平板培養されたとき、大量の寒天プレート全体にわたって残留テルペンが拡散することにより、増殖阻害を引き起こすことができないほど低い局所テルペン濃度となる。したがって、殺真菌ＭＩＣウェルの内容物で増殖が起こらないのは、初期の殺真菌活性によるものに相違ない。対照的に、殺真菌ＭＩＣより低いＭＩＣが得られ、ＭＩＣウェルの内容物が固体寒天増殖培地に平板培養されたとき、増殖が観察され、静真菌効果が示唆された。

実施例１６−野外試験用封入テルペン組成物の調製

以下のプロトコルの目的は、その後の野外試験のために、中空グルカン粒子にテルペン組成物を封入することであった。

材料：
チモール（Ａｌｐｈａ−Ｇａｍｍａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
オイゲノール（Ａｌｐｈａ−Ｇａｍｍａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
ゲラニオール（Ａｌｐｈａ−Ｇａｍｍａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
１％Ｔｗｅｅｎ８０（Ａｌｐｈａ−Ｇａｍｍａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
酵母細胞壁粒子
キサンタンガム

酵母細胞壁粒子は、Ｎｕｔｒｉｃｅｌｌ ＭＯＳ５５の商品名でＢｉｏｒｉｇｉｎ（Ｓａｏ Ｐａｏｌｏ、Ｂｒａｚｉｌ）から入手したものであり、Ａｃｕｃａｒｅｉｒａ Ｑｕａｔａ Ｓ．Ａ．、Ｕｓｉｎａ Ｑｕａｔａ、Ｑｕａｔａ−Ｓａｏ Ｐａｏｌｏ−Ｂｒａｚｉｌ−Ｚｉｐ Ｃｏｄｅ １９７８０ ０００製であった。これらの粒子は、サッカロマイセスセレビシエの噴霧乾燥細胞壁抽出物であり、薄いベージュから黄褐色の流動性粉末である。

プロトコル：以下のプロトコルは１ｋｇの粒子に適していたが、大量生産のために簡単にスケールアップできる。
−テルペン混合物の調製−ガラスのフラスコでゲラニオール３７５ｇ＋オイゲノール５２５ｇ＋チモール６００ｇを混合し、撹拌する。
−２ガロンの白色バケツで６２ｇのＴｗｅｅｎ８０を６．２ｌの水に混合することによって、６．２ｌの１％Ｔｗｅｅｎ８０を調製する。混合して、溶液を形成する。
−６．２ｇのキサンタンガムをＴｗｅｅｎ溶液に添加し、撹拌して溶解する。
−ポリトロンミキサーを用い、白色バケツで１．５ｋｇのテルペン混合物＋６．２ｌの１％Ｔｗｅｅｎ８０／０．１％キサンタンガムを混合することによって、テルペンエマルションを調製する。
−１０００ｇの酵母細胞壁粒子を添加し、ペイントミキサーを用いて混合して、均一な懸濁液を形成する。
−ステップ４のテルペンエマルションを酵母細胞壁粒子に混合しながら添加し、薄いマヨネーズ様粘稠度とする。
−テルペン混合物を缶に注ぎ、一晩インキュベートする。

結果：中空グルカン粒子に封入されたゲラニオール、オイゲノール、及びチモールをペーストとして得た。このペーストは、通常の噴霧乾燥技法によって、容易に乾燥粉末に変換された。このペーストは、以下のプロトコルの「液体」組成物であり、「粉末」は噴霧乾燥形態である。

実施例１７−ベト病に対する封入テルペン組成物の野外試験

ブドウのベト病はプラスモパラビチコラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａ）に起因し、これは世界的にブドウ畑に感染し、収穫量及びワインの品質の点から、ブドウ栽培者にとって破壊的な損失となり得る。この真菌は果実と木のすべての緑色部分を攻撃し、葉を枯らし、花と果実を腐らせる。この疾病は、葉の上面の不規則な淡黄色又は黄緑色の斑点、葉の病変部の下面を覆う密集した灰白色の綿様の真菌生育物として発現する。果実も綿毛の生育物で覆われる可能性があり、感染の時期に応じて、茶色になり柔らかくなるか、又はまったく柔らかくならない可能性がある。ベト病は、風や雨による胞子の分散によって広がり、感染には湿潤な条件を必要とする。これは高湿な環境で特に問題となる。この疾病の管理には、殺真菌剤を初期に適用し、その後、適切な間隔で反復適用することによる、予防措置が推奨されている。一部の処置には耐性が生じており、異なる殺真菌剤を交代で用いることによって耐性の発現を最小限度にすることはできるが、依然として問題である。

この試験の目的は、ブドウのベト病の予防に関して、液体又は粉末（噴霧乾燥）製剤として供給される実施例１６の封入テルペン製剤（ＹＧＰ−ＧＥＴ）の有効性を調べることであった。

Ｋｉｒ−Ｙｉａｎｎｉブドウ畑のサイト２０に、それぞれ０．１ｈａに及ぶ４つの隣接するブロックを特定した。

Ｋｉｒ−Ｙｉａｎｎｉは海抜３００ｍにある３５ｈａのブドウ畑である。北と西はカシ混合林に接し、南と東には果樹園とブドウ畑を見渡す。

４つのブロックはすべて、テルペン製剤を適用する前に、複数の製品で処置されていた。２００４年６月２６日、用量０．５ｇ／ｌ又は２ｇ／ｌで、テルペン粉末製剤を４つのブロックの２つに噴霧した（図２１の概略図を参照のこと）。３つ目のブロックを、通常のボルドー液（Ｂｏｒｄｅａｕｘ ｍｉｘ）及び水和硫黄剤で処置し、残りのブロックは、未処置のままとした。翌週にわたって、各ブロックのブドウをベト病の徴候に関してモニターした。

Ｋｉｒ−Ｙｉａｎｎｉブドウ畑のサイト１８に、それぞれ０．１ｈａに及ぶ４つの隣接するさらなるブロックを特定した。４つのブロックはすべて、テルペン製剤を適用する前に、複数の製品で処置されていた。２００４年６月２６日、用量１ｇ／ｌ又は４ｇ／ｌで、テルペン液体製剤を４つのブロックの２つに噴霧した（図２１）（注記：テルペン液体製剤１ｇは、１ｍｌの体積を有する）。残りの２ブロックのうち、１つは未処置のままとし、１つは２００４年６月２８日に、ベト病の通常の処置剤であるＭｉｋａｌ（登録商標）を噴霧した。翌週にわたって、各ブロックのブドウをベト病の徴候に関してモニターした。

両方のサイトにおいて、テルペン製品は、１２００Ｌ／Ｈａの割合で適用した。

ブドウの以下の生長段階を記録した。
−発芽、２００４年３月２６日
−開花、２００４年６月１日
−ヴェレゾン、２００４年８月６日

本試験の適用は、ヴェレゾン前に行った。

２００４年の生育期は例外的に遅く、全期間を通じて湿潤であった。ベト病の疾病圧力は極めて高く、ボトリチスのレベルは高く、ウドンコ病の圧力は中程度であった。粉末及び液体ＹＧＰ−ＧＥＴ製剤はいずれも室温で貯蔵した。特別な貯蔵条件は用いなかった。

比較製品の詳細

粉末製剤試験：ボルドー液、Ｍａｎｉｃａ Ｓｐａ、Ｉｔａｌｙ製造、Ｍｏｓｃｈｏｌｉｏｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＳＡによってＧｒｅｅｃｅで包装；水和硫黄剤

液体製剤試験：Ｍｉｋａｌ（登録商標）（ホセチルＡｌ５０％、ホルペット２５％）、Ｂａｙｅｒ ＣｒｏｐＳｃｉｅｎｃｅ製造、Ｂａｙｅｒ Ｈｅｌｌａｓ ＳＡによってＧｒｅｅｃｅで流通。これらの比較製品は以下のように適用した。用量１５ｇ／ｌで発芽前に１回適用、その後、用量６．５ｇ／ｌで１年毎にさらに２回適用。３回の適用はすべて１０００Ｌ／Ｈａの噴霧割合を用いた。

粉末製剤試験：ボルドー液（２ｇ／ｌ）及び水和硫黄剤（２．２ｇ／ｌ）を２００４年６月２６日に適用した。

液体製剤試験：Ｍｉｋａｌ（３．２ｇ／ｌ）を２００４年６月２８日に適用した。

ベト病の症状に関してブドウの木を視覚的に検査した。疾病の発症は、葉に平均２つの油性斑点があることを特徴とした。さらなる斑点の出現を予防する処置は、ベト病に対して有効な防御を提供するとみなした。

結果

ＹＧＰ−ＧＥＴ粉末製剤（噴霧乾燥）
ボルドー液による通常の処置は、ベト病に対して良好な防御を提供した。コントロールのブドウの木では、ベト病の軽度の症状が観察された。０．５ｇ／ｌのテルペン製品濃度は防御せず、２ｇ／ｌのテルペン製品濃度は、コントロールよりわずかに良好な防御を提供した。注記：直前に殺虫剤処置を行ったため、このサイトの疾病圧力は非常に低かった。

粉末製剤は非常に細かく、空中に分散するため、溶解が困難であった。このことが製品の有効性に悪影響を及ぼした可能性がある。

ＹＧＰ−ＧＥＴ液体製剤
用量４ｇ／ｌで投与したとき、このテルペン製剤は露出樹冠でベト病に対して優れた防御を提供した。１ｇ／ｌの用量では防御されなかった。コントロールのブロックでは、ベト病の重篤な症状が認められた。

液体製剤は使用が容易であり、心地よいにおいを有した。

考察
ベト病は収穫量及びワインの品質に影響を及ぼすため、ブドウ栽培者にとって破壊的な損失となり得る。ひとたび定着すると、感染は急速に広がることができるため、この疾病の管理は予防が中心となる。粉末製剤を噴霧したサイトにおいて、ＹＧＰ−ＧＥＴは、低用量（０．５ｇ／ｌ）では有効性を示さず、２ｇ／ｌの用量では通常の処置剤より有効性が低かった。このサイトでは、直前の殺虫剤適用により疾病圧力が低く、それがテルペン処置の外見上の有効性を限定した可能性がある。しかしながら、２ｇ／ｌ未満のテルペン製品の用量は不充分であるとみなされた。

液体製剤を噴霧したサイトでは、４ｇ／ｌの高い用量レベルで、露出樹冠に優れた防御が提供された。このサイトでは過度の植物生長によって、樹冠内部の古い生育物に比べて、外部の若い枝の処置がより有効であった。この処置は浸透性でないため、テルペン製品による完全な葉面被覆が有用である。通常の浸透性処置剤に用いられるより約３０％増の量で、テルペン処置剤を用いて良好な被覆が達成されると推定される。

結論：
ＹＧＰ−ＧＥＴ液体製剤の葉面適用は、４ｇ／ｌの濃度でベト病の制御に非常に有効であった。より低い濃度である０．５ｇ／ｌの粉末、及び１ｇ／ｌの液体は有効でなかった。

実施例１８−ウドンコ病に対する封入テルペン組成物の野外試験

ブドウのウドンコ病は、真菌のウンキヌラネカトル（Ｕｎｃｉｎｕｌａ ｎｅｃａｔｏｒ）に起因し、ブドウの木の生長、果実の品質、及び木の耐冬性を低下させる。ワイン用のブドウでは、果実のわずか３％の感染レベルであってもワインの品質に影響を及ぼし得る。この疾病は、粉末状で白色の葉の被覆物に拡大する真菌生育物の小さな灰白色の斑点を特徴とする。この真菌生育物は果実にも生じることがあり、果実が割れる可能性がある。暖かく湿潤な条件を必要とするベト病とは対照的に、ウドンコ病は、雨天条件ではなく、湿気のある日陰を好むため、より乾燥した生育期に問題となり得る。ウドンコ病の管理には、殺真菌剤を初期に適用し、その後、適切な間隔で反復適用することによる、予防措置が推奨されている。

この研究は、ブドウのウドンコ病の予防に関して、ＹＧＰ−ＧＥＴ組成物適用の有効性を調べることを目的とした。

Ｋｉｒ−Ｙｉａｎｎｉブドウ畑のサイト１８に、それぞれ０．１ｈａに及ぶ３つの隣接するブロックを特定した。２００４年７月１９日、用量２ｍｌ／ｌでＹＧＰ−ＧＥＴ液体製剤を３つのブロックの１つに噴霧し、１つは未処置のままとした。残りのブロックは、通常の処置剤であるＥｑｕｅｓｉｏｎ（２．５ｇ／ｌ）、Ａｌｌｉｅｔｅ（０．９ｇ／ｌ）、及びＰｕｎｃｈ（０．０７５ｍｌ／ｌ）を噴霧した（図２２を参照のこと）。翌週にわたって、各ブロックのブドウの木をウドンコ病の徴候に関してモニターした。

Ｋｉｒ−Ｙｉａｎｎｉブドウ畑のサイト２０に、それぞれ０．１ｈａに及ぶ３つの隣接するさらなるブロックを特定した。２００４年７月２０日、用量２ｍｌ／ｌでＹＧＰ−ＧＥＴ液体製剤を３つのブロックの１つに噴霧し、残りの２つのブロックは未処置のままとした（図２２を参照のこと）。翌週にわたって、各ブロックのブドウの木をウドンコ病の徴候に関してモニターした。

いずれのサイトも、それらのブロックは複数の製品で事前に処置されており、テルペン製品の事前適用が含まれる。

すべてのテルペン処置剤は、完全な被覆を確実にするために、１２００Ｌ／Ｈａの割合で適用した。

ブドウの以下の生長段階を記録した。
−発芽、２００４年３月２６日
−開花、２００４年６月１日
−ヴェレゾン、２００４年８月６日

本試験の適用は、ヴェレゾン前に行った。

２００４年の生育期は例外的に遅く、全期間を通じて湿潤であった。ベト病の疾病圧力は極めて高く、ボトリチスのレベルは高く、ウドンコ病の圧力は中程度であった。

比較製品の詳細
サイト２０では比較製品を用いなかった。サイト１８に用いた比較処置を以下に詳しく述べる。

Ｐｕｎｃｈ（登録商標）（フルシラゾール４０％）、Ｄｕｐｏｎｔ
２００４年７月１９日、製造業者の使用説明書に従って、ウドンコ病の予防処置剤として、用量０．０７５ｍｌ／ｌでＰｕｎｃｈを適用した。

追加製品の詳細
サイト２０では追加の製品を用いなかった。サイト１８に用いた追加製品を以下に詳しく述べる。

Ｅｑｕｅｓｉｏｎ系（ファモキサドン２２．５％、及びシモキサニル３０％）
Ａｌｌｉｅｔｅ（ホセチルＡｌ８０％）

２００４年７月１９日、ベト病の予防処置剤として、Ｅｑｕｅｓｉｏｎ（２．５ｇ／ｌ）及びＡｌｌｉｅｔｅ（０．９ｇ／ｌ）を適用した。用量は製造業者の使用説明書に従って決定した。

これらの比較製品及び追加製品は、総合的害虫管理スケジュールの通常の処置剤である。

ブドウの木をウドンコ病の症状に関して視覚的に検査した。

結果：
サイト１８
コントロールブロックでは、花硬及び茎の約２０％が黒色であったが、これはウドンコ病の中程度の感染を示している。通常の処置を行ったブロック、及びテルペン処置を行ったブロックでは、すべての茎と房が緑色であったが、これは適切な防御が提供されたことを示している。

サイト２０
いずれのブロックでも、ウドンコ病感染の証拠は認められなかった。

追加的観察
生育期の終わりに、サイト１８及び２０のブロックは、ブドウ畑の残りの部分と比べて、概して疾病による低いストレスを示した。

ウドンコ病感染は、ブドウの木の生長、果実の品質、及び木の耐冬性を低下させることによって、栽培者に相当な損失をもたらす。さらに、果実のわずか３％の感染レベルであってもワインの品質に影響を及ぼし得る。ひとたび定着すると、感染は急速に広がることができるため、この疾病の管理は予防が中心となる。この研究では、サイト１８において、テルペン製品ＹＧＰ−ＧＥＴの適用はウドンコ病感染を有効に予防し、テルペン製品が示した制御レベルは、通常の処置剤によって提供されるものと同等であった。しかしながら、ウドンコ病感染が不足していたため、サイト２０の結果は確定的でない。感染の不足は、この研究に先立って、殺虫剤が広範に適用され、疾病圧力の低下をもたらしたためであると思われる。

サイト１８及び２０において、疾病によるストレスが低レベルであることは、これらのサイトに適用された初期のテルペン処置が長期的な感染の制御に有益である可能性のあることを示唆している。

結論：
ＹＧＰ−ＧＥＴは、通常の処置剤によって提供されるものと同等の制御レベルで、ウドンコ病感染を有効に予防した。

実施例１８−ウドンコ病に対する封入テルペン組成物のさらなる野外試験

この研究は、Ｇｒｉｍｓｏｎ Ｓｅｅｄｌｅｓｓ食用ブドウのウドンコ病の処置に関して、ＹＧＰ−ＧＥＴの有効性を調べることを目的とした。

Ｔｓｉｇａｒａｓブドウ畑（Ｋｉｒ−Ｙｉａｎｎｉブドウ畑の約８０ｋｍ南）の０．１ｈａのプロットは、２００４年７月１日のＣｉｓｔｅｉｎｅ適用中、不注意で未処置のまま残された。このプロットのブドウの木は、その後、葉、茎、及び果実にウドンコ病の重い症状を示した。２００４年７月１２日、この未処置プロットに１２００Ｌ／Ｈａの割合で、３ｍｌ／ｌの液体ＹＧＰ−ＧＥＴ製剤を噴霧し、ブドウ畑の残りの部分に、比較製品Ｒｏｇａｎａを噴霧した。２４時間後、ウドンコ病の症状に関して、ブドウの木を評価した。
ブドウの木は、高リラ型トレリス（ｈｉｇｈ ｌｙｒｅ ｔｒｅｌｌｉｓ）システムに仕立てられた。

比較製品の詳細
Ｒｏｇａｎａ（フェンブコナゾール５％、ビノカップ（ｂｉｎｏｃａｐ）１６％）、ＢＡＳＦ（ＢＡＳＦ Ａｇｒｏ Ｈｅｌｌａｓ Ｓ．Ａ．、Ａｔｈｅｎｓ、Ｇｒｅｅｃｅ）製造
２００４年７月１２日、ウドンコ病の処置剤として、Ｔｓｉｇａｒａｓブドウ畑にＲｏｇａｎａを適用した。用量は製造業者の使用説明書に従って決定した。

ブドウの木をウドンコ病の症状に関して視覚的に検査した。

結果
ＹＧＰ−ＧＥＴの適用前、ウドンコ病の重い症状が明らかであった。ＹＧＰ−ＧＥＴのわずか２４時間後、ウドンコ病の白色の粉が黒色に変わったが、これは有効な抗真菌活性を示している。この時点で疾病が有効に阻止されたため、さらなる処置剤は適用しなかった。ＹＧＰ−ＧＥＴは通常の処置剤と同等の有効性を示した。

考察：
この研究では、ＹＧＰ−ＧＥＴを用いて、定着したウドンコ病感染が迅速かつ有効に処置された。適用のわずか２４時間後、それ以前には重症であったウドンコ病感染が、テルペン製品を適用することにより、通常の処置剤と同等の有効性で阻止された。

この研究から得られた予備データは、ＹＧＰ−ＧＥＴが予防的能力を示すことに加えて、定着した真菌感染の処置にも有効である可能性を示唆している。

実施例１９−ウドンコ病に対する封入テルペン組成物のさらなる野外試験

背景及び原理
本試験では、有機製品を用いてウドンコ病を制御するタスマニアのブドウ畑（Ｆｒｏｇｍｏｒｅ Ｃｒｅｅｋ Ｖｉｎｅｙａｒｄ、Ｈａｔｈａｗａｙ Ｔｒａｄｉｎｇ Ｐｔｙ Ｌｔｄ、Ｂｏｘ １８７、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ ＴＡＳ ７０２５、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）のプログラムの一部として、ＹＧＰ−ＧＥＴの使用を調べた。この研究の目的は、シャルドネ種のブドウの木において、ウドンコ病の有機的制御におけるＹＧＰ−ＧＥＴ適用の短期有効性を調べることであった。

この試験では、ブドウの木（シャルドネ種）を２００５年２月７日にテルペン製品で処置するか、又は未処置のまま（コントロール）とした。事前の有機処置によって抑制されていたが、試験前のウドンコ病の重症度は商業的に許容できないレベルであるとみなされ、６つの積極的処置プロットと６つのコントロールプロットは同等であった。作物段階はおよそＥ−Ｌ３３−３４（ヴェレゾン前）であった。

ＹＧＰ−ＧＥＴ（４ｍｌ／ｌ）（液体製剤）を、事前にミルクで処置されていた６つのシャルドネプロットに噴霧した。６つのシャルドネプロットを未処置のコントロールとしたが、それらのプロットは事前に油／ホエーで処置されていた。プロット当たりの木の数は、典型的に７本であった。

このプロトコルに用いたＹＧＰ−ＧＥＴの組成の詳細を表２０に示す。

ウドンコ病の重症度を、テルペン処置３日前に評価し、処置３日後に再び評価した。各プロットにおいて、無作為に２０房のブドウを選択し（各パネルサイドで１０房）、活性なウドンコ病菌のコロニーが被覆している房の面積パーセントとして、疾病の重症度を評価した。その後、栽培者が試験領域全体に硫黄及び植物油ベースの噴霧補助剤（Ｓｙｎｅｒｔｒｏｌ Ｈｏｒｔｉ油）を噴霧したため、さらなる評価は不可能であった。

処置される植物の数／領域
試験製品：事前にミルクで処置されている、６つのシャルドネプロット（合計でブドウの木約４２本）に、ＹＧＰ−ＧＥＴ（４ｍｌ／ｌ）を適用する。

コントロール：コントロールとして用いる６つのシャルドネプロット（合計でブドウの木約４２本）には処置剤を適用しなかったが、それらのプロットは事前に油／ホエーで処置されていた。

栽培方法
ブロックＢ２にヴィティスヴィニフェラ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）（シャルドネ種）のブドウ：アーチ型の茎を持つバーチカルシュートポジショニング。

栽培配置
間隔：列間の距離２．５ｍ、木の間（列内）の距離１．２５ｍ、ヘクタール当たりのブドウ３２００本。列の方位は北から南であった。

樹冠密度
ポイントコドラート法を用いて、シャルドネの木の試験前における樹冠密度の特徴を明らかにした（表２１）。事前に硫黄で処置したか、又は未処置であるシャルドネプロット内において、樹冠の代表的な部分を選択することによって、２００５年１月１３日に測定を行った。各処置前のそれぞれのプロットで１０個の測定を行った（すなわち、硫黄処置プロットで合計６０個の測定、未処置コントロールプロットで６０個の測定）。さらに、３つの直立した枝（プロット当たり）の節の長さと数を測定した。

一般的条件
実験材料によるこれらのプロットの前処置は、未処置コントロールと比較して、ウドンコ病を抑制した。しかしながら、ミルク処置プロット、及び油／ホエー処置プロットの両方で同等であったが、ウドンコ病のレベルは商業的に許容されないレベルであるとみなされた。

適用方法、用量、及び投与計画
２００５年２月７日、多用途車の平板トレイに搭載したポンプとホースリールに接続したハンドガンを用いて、ＹＧＰ−ＧＥＴ処置剤（４ｍｌ／ｌ）を適用した。噴霧はポンプ圧１５００〜１６００ｋＰａ（２００〜２３０ｐｓｉ）で駆動し、約６３ｍｌ／秒で送達した。通常の処置剤の標準的噴霧量（約９００Ｌ／Ｈａ）を用いた。

活性なウドンコ病菌コロニーが被覆しているブドウの房の面積（％）として評価されるウドンコ病の重症度を、各プロットで無作為に選択した２０房（各パネルサイドで１０房）に関して評価した。疾病の重症度を、ＹＧＰ−ＧＥＴ処置剤の適用３日前、２００５年２月４日に評価し、テルペン適用の３日後、２００５年２月１０日に再び評価した。

逆正弦変換を用いてデータを変換して、平均分離度を求めた。

結果
処置前、テルペンで処置する６プロットのシャルドネ種ブドウの房におけるウドンコ病の平均重症度（２０．４％）は、６つのコントロールプロットの平均重症度（２３．２％、表２２）と類似していた。これらのデータの逆正弦変換に基づく統計的分析によって、処置前の疾病重症度に有意差のないことが見出された（表２３）。

しかしながら、処置３日後、ウドンコ病の平均重症度は、コントロールで３７．８％であったのに対し、ＹＧＰ−ＧＥＴ処置した房では２３．８％であった（表２２）。これらのデータの逆正弦変換は、より狭い面積が活性ウドンコ病菌コロニーで被覆されていたテルペン処置したブドウの房に統計的な有意差を示した（ｐ＝０．０５８、表２３）。

考察：
ウドンコ病によるブドウの木の感染は、木の生長、及び耐性、並びに果実やワインの品質に有害な影響を及ぼすことによって、栽培者に相当な損失をもたらし得る。有機的に管理されたブドウ畑では、栽培者は、元素硫黄などの処置剤の代替物を探している。

この研究は、オーストラリア、タスマニアの有機ブドウ畑において、液体製剤としての封入テルペン製剤（４ｍｌ／ｌ）のウドンコ病制御における有効性を調べた。テルペン適用のわずか３週間前に他の実験処置剤を用いたが、ウドンコ病感染レベルは依然として商業的に許容されないレベルとみなされた。シャルドネの木をＹＧＰ−ＧＥＴで処置して３日後、処置したブドウのウドンコ病の重症度は、未処置コントロールの重症度より有意に低かった。未処置コントロールでは、処置前評価と処置後評価との間の６日間に、感染の重症度が悪化したが、処置した木では不変であった。したがって、処置前に胞子形成ウドンコ病菌のコロニーが定着していたブドウの房において、ＹＧＰ−ＧＥＴは疾病増大を減速させたと考えられる。推定されるところでは、存在するコロニーはある程度胞子形成を続けたが、コロニーの拡大は阻害された。その後、栽培者が試験領域全体に硫黄を噴霧したため、さらに長期間の有効性評価は不可能であった。

これらの有望なデータは、ブドウの木のウドンコ病制御におけるＹＧＰ−ＧＥＴの有効性を実証している。

実施例２０−ボトリチスに対する封入テルペン組成物の野外試験

ブドウのボトリチス房腐敗病は、果実の収穫に重大な損失をもたらし得る一般的な真菌であるボトリチスシネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）に起因する。果実が感染の主たる部位であるが、この疾病は花と葉にも影響を及ぼし得る。初期には、感染した果実は軟らかく、水気が多く見え、高湿度で水分の多い条件下では、灰色の真菌生育物に覆われることもある。時間が経過すると、感染した果実はしなびて、落下する。ボトリチスは、空気循環の悪い高湿度条件を好み、割れているか、又は損傷した果実が、特に感染の拡大を受けやすい。ボトリチスの管理方策には、良好な空気循環を促進すること、損傷を防ぐこと、生育期の適切な時期に殺真菌剤を適用することが含まれる。

この研究の目的は、ブドウのボトリチス感染の処置における、ＹＧＰ−ＧＥＴの有効性を調べることであった。
２００４年１０月中旬（Ｔｅｌｄｏｒ（登録商標）適用３週間後）、Ｋｉｒ−Ｙｉａｎｎｉでのボトリチスの出現は、付随する立ち入り禁止期間によって計画された収穫が妨げられるため、通常の農薬で処置することができなかった。したがって、２つの隣接する０．１ｈａのプロットをブドウ畑のサイト７に特定し、２００４年１０月１２日、それらのプロットの１つを４ｍｌ／ｌのＹＧＰ−ＧＥＴ液体製剤で処置し、他方は未処置のままとした（図２３を参照のこと）。３日後に作物を収穫し、各プロットの感染果実の比率を求めた（総収穫量の重量％）。その後、処置プロット及び非処置プロット両方の非感染果実を、発酵槽で混合した。

サイト７は、テルペン製剤の適用前に複数の製品で処置されていたが、依然としてボトリチス感染を示した。

ブドウの木には、１２００Ｌ／Ｈａの割合で、４ｍｌ／ｌのＹＧＰ−ＧＥＴ液体製剤を単回適用した。

ブドウの以下の生長段階を記録した。
−発芽、２００４年３月２６日
−開花、２００４年６月１日
−ヴェレゾン、２００４年８月６日
−収穫、２００４年１０月１５日

本研究の適用は、収穫３日前に行った。
２００４年の生育期は例外的に遅く、全期間を通じて湿潤であった。ベト病の疾病圧力は極めて高く、ウドンコ病の圧力は中程度であり、ボトリチスのレベルは高かった。

ここでは収穫前の殺虫剤期間制限のため、他の方法では処置できなかったボトリチス感染に対するＹＧＰ−ＧＥＴの潜在的有効性を評価するために、ＹＧＰ−ＧＥＴを適用した。

テルペン製品適用前のサイトの視覚的評価によって、ボトリチス感染の証拠が明らかとなった。収穫後、果実をコンベヤベルトに広げ、感染した果実を手作業で非感染果実から分離し、その後粉砕した。感染果実の比率は、それぞれのプロットに関して、総収穫量の（重量）パーセントとして算出した。

結果
ＹＧＰ−ＧＥＴ適用前のサイトの視覚的評価によって、ボトリチス感染の証拠が明らかとなった。収穫後（ＹＧＰ−ＧＥＴ適用３日後）、感染果実の比率は、処置プロット及び未処置プロットでそれぞれ１３％及び２３％であった。試験領域は統計的有意性を評価するには充分でなかった。しかしながら、ＹＧＰ−ＧＥＴ処置は疾病の進行を明らかに減速した。

未処置プロット及びテルペン処置プロットの非感染果実を混合することによって、発酵は影響を受けなかった。

考察
ボトリチスの通常の処置は、収穫３週間前に停止しなければならず、作物の収穫量及び品質に相当な損害が生じる期間が残される。収穫まで用いることができるか、又は現存する製品より収穫間近まで継続できる処置剤の開発は、作物の収穫量及びワインの品質に著しい改善をもたらすことができ、栽培者に相当な利益となるであろう。本研究において、テルペン製品ＹＧＰ−ＧＥＴによる処置は、収穫のわずか３日前に、定着したボトリチス感染の進行を明らかに減速し、未処置プロットに比べて、テルペン処置プロットの感染果実の比率を低下させた。さらに、収穫間近にＹＧＰ−ＧＥＴを用いたにもかかわらず、処置ブドウと未処置ブドウの組合せによって発酵は影響を受けなかった。

これらの結果は、ＹＧＰ−ＧＥＴが、定着したボトリチス感染の衝撃の低減に有効であり、その後の発酵に有害な影響を与えることなく、収穫近くに用いることができることを示唆している。

実施例２１−定着したベト病の処置に関する封入テルペンの評価、及びその後のブドウ品質の評価

２００４年８月２５日、２５０リットル当たり１０００ｇの割合で組成物を適用して、ＹＧＰ−ＧＥＴの試験を行った。

１００％感染し、ベト病によって実質的に葉が損失しているカベルネソービニヨンのブドウ畑に噴霧した。残存する葉は、ベト病の典型的な徴候である葉の上部の黄色斑点及び葉の底部の綿毛状生育物から明らかなように、ベト病の斑点が感染していた。葉の多くはほぼ全体が黄色であったが、これは実質的な感染を示している。この葉の損失及び感染は一般にブドウの成熟を遅らせ、多くの場合、これらのブドウはワイン製造に適した完全に熟したブドウにはならない。

ブドウの木に時折、完全に未成熟（すなわち、直径〜１ｃｍで長円形の硬い暗緑色の果実）の房が認められたことは、これらの木がヴェレゾン前、おそらく開花時かそれ以前に感染した可能性が高いことを示していた。初期に銅（ボルドー、又は塩基性硫酸銅）の適用は用いられなかった。このブドウ畑は、先の収穫においてカベルネソービニヨンから作物が生産されない程度にまで重度に感染していた。ベト病菌を接触致死させるための炭酸水素カリウム処置剤、それに続く長期的な浸透性防御のためのスチルブリン（Ｓｔｉｌｂｏｕｒｉｎ）適用にもかかわらず、前年の葉の損失は１００％であった。

２００４年９月１９日、本試験で処置したブドウを摘み、粉砕し、ブドウ液について以下の観察を行った（表２４）。

これらの結果は、処置した木のブドウは未処置のブドウより熟していることを示している。ブドウ自体の観察は、未処置のブドウは平均して、ヴェレゾンを過ぎたばかりのブドウであることを示す、薄い色で、一部は透明なピンク／紫／緑の色合いであるが、処置したブドウは平均して、完全に熟しているか、又はほぼ完全に熟しているブドウに特有の濃い紫色であり、不透明であることを示した。

これらのブドウの試食により、処置したブドウは、熟したカベルネソービニヨンに特有の風味豊かな味わいを有したが、未処置のブドウは風味豊かな味わいではなかった。未処置のブドウは、青リンゴの酸味があり、これは良好なワインの製造には不適切な高いリンゴ酸／酒石酸比であろうことを示している。

これらのブドウの相違を実証し、処置したブドウがワイン製造に適していることを実証するために、これらのブドウからワインを製造する準備として、ブドウを粉砕し、茎を取った。ブドウ栽培者は、この処置剤がワインの風味に影響を及ぼすであろうと懸念していたが、本出願人の提案で、栽培者はＹＧＰ−ＧＥＴ適用の翌日に処置したブドウを試食し、残存する味も香りもないことを見出した。

処置したブドウと未処置のブドウとの相違は、ブドウ液の色においてさらに実証される。未処置のブドウの果汁は、淡い緑がかった色／無色（白ワインブドウ液にやや似ている）であり、処置したブドウの果汁は、粉砕直後の熟したカベルネソービニヨン種のブドウに特有のピンクがかった色であった。これらの結果は、少なくとも短期間では、ＹＧＰ−ＧＥＴは、殺菌しベト病の再感染を阻止することにより、晩夏のブドウ畑の処置に有効であることを示している。

ベト病の制御におけるＹＧＰ−ＧＥＴの長期有効性に関するさらなる調査が役立つであろうが、提示された結果は、ＹＧＰ−ＧＥＴが有用な処置剤であることを示している。

遅発性ベト病は作物を壊滅させるが、現在のところ、収穫の直前に適用でき、防御を提供する能力を保持する有効な処置剤はない。ＹＧＰ−ＧＥＴの大きな長所は、迅速に殺菌し、他の接触性殺真菌剤より長期にわたってその有効性を維持することである。

ベト病に対して確立された実績を有するいくつかの抗真菌剤が市場にはあるが、いずれも作物が収穫できるまで、適用後にいくらかの期間を必要とする。いくつかの処置剤（硫黄含有製品など）は、温度が８５°Ｆを超えた場合、用いることができない。銅含有殺真菌剤の植物毒性もブドウの種類に応じて著しい。接触性殺真菌剤は長期的な効果を持たず、そのため多くの場合、より長く作用する殺真菌剤を２回目に適用する必要があるが、関連規則（たとえば、ＰＨＩ（収穫前期間）、ＲＥＩ（立ち入り禁止期間））によって制限される可能性がある。

ベト病の多くの通常の処置剤は、再入場の制限（ＲＥＩ及び／又はＰＨＩ）を有し、これは６６日のＰＨＩを有し、もっとも熟している時点で栽培者がブドウを収穫できなくなるマンコゼブ（Ｍａｎｃｏｚｅｂ）などを適用することを恐れて、栽培者がこの処置剤を適用できないことを意味する。

ベト病はミシシッピ川東部で生産される多くの不良なワインの主因に関係があるとされている。ＹＧＰ−ＧＥＴは、急速に成長しているこの産業において、感染したブドウを適切に熟させ、もっとも熟している時点で摘むことを可能にできる。

有利には、ＹＧＰ−ＧＥＴは、様々な「有機」委員会（多くは自ら決定）によってこの製品が「有機」ガイドライン下でのブドウ栽培における使用に適切であると承認されるのに適しているべきである。これにより米国及び世界的に急速に成長している市場セグメントに別のニッチが開かれる。

実施例２２−封入テルペン及び非封入テルペンの殺真菌特性のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価

さらなる試験を行い、実施例１５に示した３１種の非封入テルペン調剤、並びにグルカン粒子に封入された調剤１６及び２２を評価した。

これらのアッセイを行うために、２００００の胞子を１／３強度のポテトデキストロースブロス（ＰＤＢ）に入れ、充分な量の選択したテルペン製剤を加えて、１０から１０００ｐｐｍの範囲の濃度を得た。これらの試験材料を、ボトリチスシネレア（Ｂ．ｃ．）胞子を含む個別の滅菌蓋付きエッペンドルフ管に入れ、２４時間インキュベートして、その後、遠心分離によって胞子を回収し、テルペン溶液を捨てた。胞子／バイオマスを滅菌水で洗い、再び遠心分離し、その後、３００μｌの１／３強度ＰＤＢに戻し、９６ウェルプレートに移した。菌糸に成長する生存胞子の光学密度を経時的に測定した。殺真菌活性は、菌糸成長の不在によって明らかとなる、テルペン暴露２４時間後の２００００胞子の全殺滅として定義される。

これらの結果は、本試験の条件下で、いくつかの製剤は統計的に有意なレベルで殺真菌性でなかったことを示唆している（結果を記載していない）。それらは１、２、４、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２３、２４、２５、２７、２８、２９、３０であった。組成の詳細は実施例１５（表１７）を参照されたい。

もっとも有効な化合物の最小阻止濃度を表２６に示す。

水中化合物と中空グルカン粒子に封入された化合物との比較試験

中空グルカン粒子に封入された製剤１６（ゲラニオール、オイゲノール、及びチモール）及び２２（オイゲノール、チモール、及びシトラール）の試料を、前に記載した技法に従って調製した。その後、非封入製剤に関して前に記載したプロトコルを用いて、封入製剤及び非封入製剤の殺真菌特性を評価した。

図２４に示したとおり、水に懸濁したテルペンと比較して、封入テルペン製剤の結果は大きく異なっていた。

最小有効濃度を下記の表２６に示す。

このように、材料１６及び２２による結果は、水性懸濁液の場合と、グルカン粒子に封入して試験を行った場合とで大きく異なっている（注記：後記のとおり、水に懸濁したテルペンによる結果にはいくらかのばらつきがあり、上記の実験はこの一例である）。ＭＩＣ値はいくつかの試験から複合したものである。重要なことに、封入テルペン製剤の結果には、水性テルペン懸濁液に付随するばらつきの問題がない。水に懸濁したテルペンでは５回の個別の試験を行い、ＹＰでは３回行った。

封入テルペン製剤は、容易に水と混和し、テルペン製剤は水性媒質に徐放される。これにより胞子はテルペンにより長い時間暴露される。

試験媒質で懸濁液中の非封入テルペン製剤をモニターすることに問題があり、この点について結果に影響を及ぼした可能性がある。

実施例２３−ダニに対する封入組成物の効力

トマトを含めた様々な植物を与えたナミハダニを、この研究で使用した。本発明の研究の目的は、商用温室内で予備的にｉｎ ｐｌａｎｔａ実験を実施して、ナミハダニ（ＴＳＳＭ、テトラニクスウルチカエ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｕｒｔｉｃａｅ））及びトマトの葉の疾病（ボトリチス）に対する２種のＹＰ−テルペン混合物の効力を決定することであった。天然に生ずるナミハダニの個体群を使用した。

ＹＰ−４（シトラール）及びＹＰ−２２（チモール、オイゲノール、及びシトラール）（１６％テルペン製剤）を使用した。

３月２８日に、２列に並ぶ６８本のトマトの木（リコペルシコンエスクレンタムｖａｒ．トラスト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ ｖａｒ．Ｔｒｕｓｔ））を、６本葉期で、黒色プラスチックマルチでカバーされた自然の土壌に植え替えた；この試験は、トマト種として「トラスト」を使用して実施したが、この種は、「ボア（Ｂｏａ）」などのその他の種類よりもＴＳＳＭの影響を受けやすい。植物同士のスペースは、列毎に１２インチであり、交互にずらした。生長するにつれて、単一の生長点に対して垂直に、この植物を剪定し格子に這わせた。処置当たり２本の木のブロックがしおれ、４つの反復試験片と２列の中でランダム化した。２本の未処置の木が、すべてのブロックを切り離した。テルペン製剤ＹＰ−４及びＹＰ−２２を、下記の日付：５月１１日（注記：この実施例のすべての日付は２００５年のものである）、６月２日及び１５日、７月１日及び１８日に、４ｍｌ／Ｌの速度で付着させて、葉濡れ状態にした。コントロールの処置は、同じ日に葉濡れ状態になるまで水で処置した。

収量データ（果実の数及び重量）、疾病の発生、及びＴＳＳＭによる葉の損傷％を、５月２７日に開始して７月２９日に試験が終了するまで、１〜２週毎に記録した。

平方ｃｍ当たりのダニの数も、７月２５日に測定した。葉のサンプルを、地面から約１．５ｍ（低）及び地面から約２．５ｍ（高）の木から採取した。葉を、湿らせた紙のバッグに入れて、乾燥しないようにした。各葉の裏側を顕微鏡で検査し、カウントを行った。生きているダニ（活発に動いており、また静止しているもの）の総数を決定した。静止期にあるダニは、死んだダニと容易に区別可能な特徴的なポーズをとる。メスとオスとの間、又は成虫と幼虫との間では、区別がなされなかった。

この試験は、いくつかの点に関し、２つの要因によって複雑化された。第１に、ほとんどのトマトの温室栽培では、より古い老化した葉を、木が生長すると共に除去する。このようにすると、これらのより古い葉と共にかなりの量のダニが除去されるので、ダニの個体群が減少する。これらのより古い葉は、試験の厳格さを増すための尺度として、意図的に木に残された。

第２に、第４の反復試験においてＹＰ−２２で処置した木の１本である、試験中の１本の木は、木の重篤な形成異常を引き起こすウイルスに感染するようになった。これは、ダニに極めて魅力的でありダニの複製を引き起こしやすいという、驚くべき結果ももたらす。この結果、この木を取り囲んでダニの個体群が爆発的に増加した。この木を、７月２５日あたりに試験から除いたが、このウイルスに感染した木から得られた非常に高いレベルのダニは、時間と共に隣接したプロットにまで広がり、結果を歪めた。

この非常に高いダニ個体群は、いかなる生成物によっても制御できなかった。ダニの個体群は、たとえ引き落とされたとしても、非常に素早く回復する。このような理由で、本明細書に報告されたデータは、ｒｅｐ−ｂｙ−ｒｅｐベースで経時的に結果を示す。

早期真菌疾病
この試験の初期に、おそらくはボトリチスシネラによる、低レベルの真菌疾病が生じたようであった。この疾病は、ダニによる損傷が酷くなりすぎてこれ以上ランク付けができなくなるまで、評価が行われた。結果を、下記の表２５に示す。

ダニ損傷のランク付け
ウイルスの木という観点から、この考察は、個々の反復試験による結果に焦点を当てることになり、その後に要約が続く。ダニ損傷評価の結果を、図２６ａ〜ｄに示す。反復試験１（図２６ａ）は、本発明者等が非常に望んでいたような結果をもたらし、ＹＰ−２２は、実験の過程全体を通してナミハダニ（ＴＳＳＭ）損傷のランク付けを大幅に低下させた。処置は５月１１日に開始し、したがって、６月１５日の最初のＴＳＳＭランク付けでの差は妥当であった。反復試験２（図２６ｂ）は、実験の始めのＴＳＳＭ損傷が非常に低いこと以外、同様の時間的経過に従った。反復試験４（図２６ｄ）について、次に論ずる；その結果は反復試験３（図２６ｃ）に影響を及ぼす。６月２３日まで、ＴＳＳＭランク付けはその他の反復試験と一致していたが、７月１日までは著しく増加し、ＹＰ−２２で最大であった。これは疑いなく、ウイルス感染した木がＹＰ−２２で処置したものであることにより生じた。このウイルス感染は、非常に誘引的であるために又は爆発的なダニ増殖が可能になったために、或いはこの両方によって、劇的にダニの個体群を増加させた。いずれにせよ、ダニの個体群は非常に多くなった。ダニの個体群は、ＴＰ−２２で処理したウイルス感染の木から、この反復試験におけるその他の木に急速に広がり、したがって７月１１日までは、すべてのＴＳＳＭランク付けが反復試験４で非常に高かった。ハウス及び実験の残りの部分に蔓延しないように、反復試験４の木を、この回の後に廃棄した。反復試験３において、７月１日まではＴＳＳＭランク付けが上昇し始め、この後に、急速に低下し始めた。このように、疑いなく反復試験３は、反復試験４の１本の木で開始されたダニから、ますます高くなる圧力を受けた。任意の処置が、ウイルス感染した木から生ずる爆発的な個体群増殖を包含したということは、ないであろう。

図２７は、ＹＰ−４で処置された植物とコントロールとの比較を示す写真である。封入されたテルペン組成物ＹＰ−４による処置は、より健康でより生産的な植物をもたらすことが、明らかにわかる。

ダニの数
ダニを、地面から約１．５ｍ（低）及び地面から約２．５ｍ（高）の各植物から採取した葉の下側から、顕微鏡で数え上げた。その結果を表２７に示す。

これらのデータは、良好なダニの制御を示す。この害虫に関して予測されるように、コントロール植物におけるダニ数／葉には大きなばらつきがある。しかし、両方の処置、特にＹＰ−２２による処置での最大数は、コントロールより著しく少ない。

ダニは、この研究において、特にＹ−２２によって制御された。しかし、非常に高いダニの圧力が生じた場合、ＹＰ−２２は、適正な制御をもたらすのに不充分であった。この研究の一部における非常に高いダニ個体群により、どのダニ駆除剤も、良好な制御を行うことはできないようである。本発明者等が２週間毎に材料を付着させたこと、及びダニが良好な回復能力を有するので、ＹＰ試験材料が残留活性を有していたことも注目に値する；これはほぼ確実に、封入の結果としてもたらされた。

結果は、使用される製剤、付着速度、及び付着頻度が最適化されていなかったので、極めて励みになるものであった。疑いなく、テルペン混合物、付着速度、付着頻度を最適化することによって、効力を改善することが可能と考えられる。そのような最適化は、実現するための試行錯誤の問題と考えられる。

さらに、効力を増大させるのに使用することができる、少なくとも２つのタイプの補助剤がある。Ｓｉｌｗｅｔは、タンクミックスとして殺虫剤に添加される、有機シリコーン界面活性剤である。良好なデータは、この材料がダニ駆除剤の活性を増大させることを示す（要求に応じて参照可能）。これは、すべての植物に使用することができ、容易に入手可能である。本発明者等は、生物制御剤に類似した材料が、真菌疾病制御の効力を増強することも示すデータを有する。或いはＳｔｉｒｒｕｐは、殺虫剤の堆積物にダニを引き付け、材料の吸収を高めるフェロモン製品である。

実施例２４−ウドンコ病の制御に対する封入されたテルペンのｉｎ ｖｉｔｒｏ評価

本発明の研究は、もっとも有効なテルペン混合物と、これらがウドンコ病に関して活性であるときのレベルを決定するために実施した。

酵母細胞壁に封入された３１種のテルペン又はテルペン混合物（ＹＰ−テルペン）について、評価した；特定の組成物に関して使用されたコードを、実施例１５の表１７に示す。

プロトコルの開発は、生物の基礎生物学によって進められた。真菌は、絶対病原体であり、そのためブドウの葉以外では培養することができない。したがって本発明者等は、植物（「リースリング」の苗木）に接種し、大量の胞子形成を有する感染した葉を洗浄することによって、分生子を収集した。

Ｒｅｕｖｅｎｉによって使用された方法（２００１；Ｃａｎ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌ．２３：５２〜５９）の、変形例を用いた。ウニシヌラネカターに感染した１から２枚の葉を、滅菌した５０ｍＬプラスチック管に入れた。Ｔｗｅｅｎ−２０（７．５ｍＬ、０．０００５％）をこの管に添加し、葉を３０秒間激しく混合した。分生子を、ペトロフ−ハウザー（Ｐｅｔｒｏｆｆ−Ｈａｕｓｅｒ）カウントチャンバーを使用してカウントし、１〜２×１０^５分生子／ｍＬに調節した。
ＹＰ−テルペンを、４０００ｐｐｍの希釈標準溶液に希釈した。反応は、６００μＬのシリコン処理したエッペンドルフ管で行われ、最終的な反応体積は６０μＬであった。ＹＰテルペンをこの管内で希釈することにより、最終濃度が１００、２５０、５００、７５０、又は１０００ｐｐｍのテルペンが得られた。分生子懸濁液４０μＬを各管に添加し、各管を短時間混合した。水及び試験材料３２（粒子のみ、テルペン無し）を、コントロールとして含めた。テルペンが存在しない状態で胞子発芽に悪影響を及ぼすことなく、胞子の阻害に十分な接触時間が得られるように、試験材料及び分生子を１〜１．５時間インキュベートした。この簡単な浸漬は、寒天表面でのテルペン混合物が素早く揮発又は水に吸収されるので、テルペンとの適切な接触時間を可能にするのに不可欠であった。
顕微鏡用スライドガラスを、１．５％素寒天７５０μＬでコーティングした。スライドガラスを、水分ブロッターがそれぞれ収容されている発芽ボックスに入れた。分生子及びテルペン混合物を寒天上に直接配置しようと試みた場合、おそらくは不充分な接触時間のために、テルペンの影響は少ししかなかった。蓋を各ボックスに置き、材料を、ベンチトップ上で、室温で４８時間インキュベートさせた。いくつかの実験において、テルペンのレベルが異なっているスライドを、同じボックス内に収容した。この技法は、高レベルのテルペンを有するスライドからの揮発性物質が、より低いレベルの材料を有するスライド上の分生子を阻害するので、誤った結果をもたらすことがわかった。したがって最終的なデータは、同じ試験材料をわずか１つ又は２つのレベルで収容するボックス内のスライドから得られた。

４８時間後、光学顕微鏡を使用してスライドの検査をした。各分生子のはっきりとした輪郭を得るために、位相差の様々な設定を使用した。ＹＰは、分生子よりも何倍も小さく、これら２種を区別することは容易であった。スポット当たり、少なくとも１００個の胞子が発芽したと推定され；観察可能な胞子の数が１００個未満の場合、見出されたすべての胞子がカウントされた。少なくとも１０個の発芽した分生子の、発芽管の長さも同様に測定したが、このデータは後に、あまり有用ではないことが見出された。

本発明者等は、少しの割合の分生子が、葉から洗い落とされたときに既に発芽していることも見出した。これは、ウドンコ病分生子が発芽するのに自由水を必要とせず、したがっていかなる時でも発芽できることから予測される。したがって本発明者等は、これが０時間の水コントロールで頻繁に観察されたレベルであることから、最大４％の発芽を、本発明者等の殺真菌活性のカットオフと設定した。ウドンコ病感染の年齢も、いくらかのばらつきをもたらした。３週齢よりも古い感染では、コントロールにおいて全体的な発芽がより低いレベルであり（寒天スライド上の水コントロールで３６％）、それに対してより若い感染では、より高い発芽レベル（約７０％）が得られた。本発明者等は、すべての試験材料について数回観察し、阻害が生じたレベルでデータを収集した。試験当たり３つの反復試験片を使用した。

結果：
材料の濃度は、テルペンが１００から１０００ｐｐｍに及んだ。すべての試験材料は、少なくとも試験がなされた最高濃度で殺真菌性であった。４種類の殺真菌効力が、３１種の製剤で確立された。テルペン製剤、及び最小阻害用量（殺真菌性）に基づくそれらのグループ分けを、以下に示す。
グループＡ（＞１００ｐｐｍ、＜２５０ｐｐｍ）：７、１０、２２、及び３０
グループＢ（＞２５０、＜５００）：１、２、３、７、８、１３、１４、１６、１９、２０、２３〜２９、及び３１
グループＣ（＞５００、＜７５０）：４、６、９、１１、１５、１８、及び２１
グループＤ（＞７５０、＜１０００）：５、１２、及び１７

殺真菌用量を、顕微鏡観察により決定された反応後４８時間のウドンコ病分生子の発芽に基づいて、計算した。ウドンコ病分生子は、コントロールにおいて２４時間以内に発芽するので、発芽が４８時間で生じなかった場合は、胞子が死滅したとみなした。２〜３の例において、本発明者等は７２時間以上観察を続けたが、さらなる情報は得られなかった。

実施例２５−ベト病の制御に対する封入されたテルペンのｉｎ ｖｉｔｒｏ評価

本発明の研究は、もっとも有効なテルペン混合物と、これらがベト病に関して活性であるレベルを決定するために実施した。

プラスモパラビチコラ、ブドウのベト病の起因物を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、すべての研究で使用した。これは、コーネル（Ｃｏｒｎｅｌｌ）の同僚から得られた野生型病原株であった。生物を、「リースリング」種子から得られた苗木の葉の表面に維持した。

プロトコルの開発は、生物の基礎生物学によって進められた。真菌は、絶対病原体であり、そのためブドウの葉以外では培養することができない。したがって本発明者等は、植物（「リースリング」の苗木）に接種し、感染した葉を水で穏やかに洗浄することによって、胞子嚢を収集した。本発明者等は、当初、カバースリップを有するスライドガラス上で胞子嚢を観察することにより、アッセイを実施しようとした。しかし、本発明者等は経時的にスライドを見たかったのであるが、それはこの方法ではまったく不可能であった。使用された体積は、適切な評価には少なすぎ、胞子嚢はしばしば、カバースリップの圧力によって崩壊する可能性があり、遊走子は、放出後に非常に素早く胞嚢に包まれる可能性がある。凹部スライドを使用する、Ｒｅｕｖｅｎｉによって使用された方法（２００１；Ｃａｎ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌ．２３：５２〜５９）の変形例を使用した。これらのスライドはカバースリップを必要とせず、遊走子は何時間も自分で動くことができ、使用された体積によって、経時的な複数の評価が可能になった。

すべての実験において、プラスモパラビチコラに感染した１〜３枚の葉から得た胞子嚢を、滅菌水で穏やかに洗浄してビーカーに入れ、ペトロフハウザーカウントチャンバーを使用してカウントした。胞子嚢の濃度は、少なくとも１×１０^５／ｍｌであった。

ＹＰ−テルペンを、４０００ｐｐｍの希釈標準溶液に希釈した。反応は、６００μＬのシリコン処理したエッペンドルフ管で行われ、最終的な反応体積は１００μＬであった。ＹＰテルペンをこの管内で希釈することにより、最終濃度が１０、５０、１００、２５０、及び５００ｐｐｍのテルペンが得られた。胞子嚢懸濁液７５μＬを各管に添加し、この懸濁液を上下にピペットで移動させることによって穏やかに混合した。水及び試験材料３２（ＹＰのみ、テルペン無し）を、コントロールとして含めた。

アッセイ＃１−閉管
テルペンが１０、５０、及び１００ｐｐｍである３１種の試験材料すべてについて予備評価を行って、効力の正確な範囲を推定した（すなわち、その後の８時間にわたり、自動性遊走子は観察されなかった）。胞子嚢が発芽したことが観察され、また遊走子がコントロール中に観察されたら（０．５〜１時間後）、１５μＬを、１つずつ管から凹部スライドガラスに移し、直ぐに、光学顕微鏡を使用して観察した。自動性遊走子が見られた場合は、この濃度をさらに観察しなかった。スライドをきれいに拭き取った。２〜３時間毎に、管からの新しい試験材料を用いてこのプロセスを繰り返した。８時間後、最初の１００個の胞子嚢の発芽％を決定した。サンプルを室温で放置し、翌日、再び観察した。殺活性の基準は、（ａ）胞子嚢発芽が０時間コントロール以下（１０％以下）であること、及び（ｂ）自動性遊走子が無いことであった。有効用量の胞子嚢発芽のパーセンテージは、水コントロール（８７％）及びＹＰ−３２コントロール（７６％）に比べ、１．８％から６．７％に及んだ。

このアッセイにおいて、胞子嚢は、密封容器内で試験材料に常に接触していた。

アッセイ＃２−１時間のインキュベーション
上述のアッセイシステムは、密閉管内に材料が存在する場合に胞子嚢発芽及び自動性遊走子が存在せず、試験材料が試験溶液中に絶えず浸漬されるので、殺（すなわち、致死）濃度に関する正確なデータを提供することができない。遠心分離は胞子嚢及び遊走子にとって致命的であるので、本発明者等は、溶液中の材料から細胞を除去することができない。したがって、密閉したエッペンドルフ管内での１時間のインキュベーション後、試験混合物（４０μｌ）を凹部スライドに移した。この薄い層では、テルペンが空気中に揮発すると予測され、したがって殺濃度がより正確に決定される。

水分ブロッターがそれぞれ収容されている発芽ボックス内に、スライドを保存した。２時間毎に、スライドを、自動性遊走子に関して検査した。２４時間後に自動性遊走子が観察されない濃度を、このアッセイではＭＩＣとみなした。

結果：
試験材料の濃度は、アッセイ毎に異なったが、全体的にテルペンは１０から５００ｐｐｍに及んだ。すべての試験材料は、両方のアッセイで少なくとも試験がなされた最高濃度で、有効であった。３種類の最小有効濃度（ＭＩＣ）が、各試験毎に３１種のテルペンに関して確立された。各試験材料毎のＭＩＣは、自動性遊走子が存在しない濃度である。

試験番号を使用して列挙されたグループは、下記のとおりである。

アッセイ＃１−ＭＩＣ−密閉管（テルペン懸濁液への一定の浸漬）
グループＡ（＜５０ｐｐｍ）：３、７、１１、１４、１７、１９、２５、及び２６
グループＢ（＞５０、＜１００）：１、４、８、１０、１３、１６、２０、２２、２３、２７、２８、３０、及び３１
グループＣ（＞１００、＜２５０）：２、５、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、及び２９

アッセイ＃２−ＭＩＣ−１時間のインキュベーション（テルペンは、薄層からの揮発によって消散した）
グループＡ（＜１００ｐｐｍ）：４
グループＢ（＞１００、＜２５０）：３、７、８、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、及び２２〜３１
グループＣ（＞２５０、＜５００）：１、２、５、６、９、１２、１５、１８、及び２１

３１種のＹＰ−テルペン試験材料に関し、プラスモパラビチコラの胞子嚢から自動性遊走子が放出されるのを阻害する能力について評価した。２つのアッセイを実施した。第１の試験では、本発明者等は、胞子嚢の発芽と、密閉管内でインキュベートした材料からの遊走子の自動性との両方について試験をし；第２の試験では、本発明者等は、密閉管内で１時間だけインキュベートした後の、凹部スライドでの遊走子の自動性のみ評価した。

自動性遊走子が存在しないことは、試験材料の効力を決定するのにもっとも明らかな方法であり、したがって、決定的な基準として使用された。遊走子の自動性は、この病原体による感染に極めて重要である。胞子嚢発芽の阻害は、ベト病の制御に向けた第１のステップであり：胞子嚢が無傷のままである場合は、遊走子は放出されないことになる。胞子嚢発芽に関する本発明者等のデータは、発芽が決して０％ではないとしても、上述のＭＩＣを裏付けている。いくつかの胞子嚢は、葉から収集したときに既に発芽していた。０時間（遊走子は観察されない）での発芽％は、６％から１６％に及んだ。

第１のアッセイにおいて、テルペンは、理想的な試験条件下で遊走子の放出を制御した。間違いなく、試験材料は、ベト病の病原体に対して殺効果を発揮する。しかしアッセイ＃２は、テルペンが揮発性によって消散する、植物の葉においても生ずることになる状況で、致死率のより良好な試験を提供する。これらを総合すれば、２つのアッセイは、ＹＰ−テルペン材料がブドウのベト病の病原体を制御する生体外での能力に関し、完全な評価を提供する。

実施例２６−ボトリチスシネラの制御に対する封入されたテルペンのｉｎ ｖｉｔｒｏ評価

酵母細胞壁に封入された１５種のテルペン又はテルペン混合物について、評価した。試験がなされた製剤は、Ｌ−カルボンを含有していなかった。

ボトリチスシネラをすべての研究で使用した。株の識別名はＢ３６であり、コーネル大学から得た。この生物を、２５℃でＶ８寒天上に維持した。

この研究のプロトコルは、レサズリン（Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ）アッセイの態様と、Ｂ．シネラで先に使用された別のプロトコルとを組み合わせる。レサズリンの存在によって、本発明者等は、酵母粒子の存在下でテルペンの殺レベルを測定することが可能になる。

ボトリチスシネラの胞子を水中で収集し、濃度を１×１０^５胞子／ｍＬに調節した。ＹＰテルペンを、滅菌した１．５ｍＬエッペンドルフ管内で、最終濃度１００、２５０、又は５００ｐｐｍに希釈した。胞子懸濁液５０μＬ、及び１／３強度ＰＤＢ ３７５μＬを、この管に添加した。懸濁液を短時間混合し、室温で２４時間インキュベートした。次いで各管の内側を、滅菌した楊枝を使用して掻き取って、壁面から菌糸を解放した。

静真菌アッセイ：
２４時間後、試験懸濁液５０μｌの２つの個別のサンプルを取り出し、１／３強度ＰＤＢ ３０μｌ及び２５０ｐｐｍレサズリン２０μＬと一緒にマイクロタイタープレートのウェル内に置いた。これらの混合物を、一晩１６〜２０時間にわたってインキュベートした。次いで目視観察を行った。試験混合物が紫のままの、ＹＰ及び胞子懸濁液の濃度を、静真菌性とみなした。レサズリン懸濁液は紫であるが、生物活性によって低減する場合には、溶液がピンクになり、次いで透明になる。

殺真菌アッセイ：
試験懸濁液の２つのサンプルを取り出した後、管を、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけ、上澄みを廃棄した。ＹＰ、ボトリチス胞子、及び任意の発芽した菌糸を含有した沈殿物を、水４００μＬで洗浄した。管を再び遠心分離にかけ、ペレットを、滅菌した１／３ＰＤＢ ４００μｌに再懸濁した。各管に、２５０ｐｐｍレサズリン１５０μＬを添加した。管を混合し、室温で一晩、１６〜２０時間にわたってインキュベートした。目視評価を行い、試験混合物が紫のままのＹＰ及び胞子懸濁液の濃度を、殺真菌性とみなした。
７２時間後、管の目視評価を再び行い、紫のサンプルが殺真菌性であるとみなした。

各ウェル又は管に、色のランク付けをした。色に変化がないものを４とランク付けし；透明なウェルを０とランク付けした。ランク付けが３以上のものを静的（色の変化が少ししかなく、又はまったくない）とみなし、ランク付け４（まったく変化しない）のみを殺性とみなした。

各濃度での各試験材料の３つの反復試験片を、各実験毎に使用し、各実験を２回行った。

結果：
静真菌試験−すべての試験材料は、試験がなされた少なくとも最高濃度で静真菌性であった。効力に関する基準は、コントロールに対して増殖阻害が少なくとも７５％であった。効力の範囲を、１５種のテルペンに関して確立し、それらを以下に示す。
グループＡ（＜１００ｐｐｍ）：３、７、１０、１６、１９、及び２６
グループＢ（＞１００、＜２５０）：１、２、６、１１、１３、１７、及び２２
グループＣ（＞２５０、＜５００）：４及び８

殺真菌試験−殺真菌試験での色の変化の目視評価を、２回測定した：１６〜２０時間後に１回、再び７２時間後に１回。２０時間後、すべての試験材料は、試験がなされた少なくとも最高濃度で静真菌性であった。しかし７２時間後には、わずかなサンプルだけが、依然として殺真菌性であるとみなされた。各時点での各テルペンに関する効力範囲を、以下に示す。

１６〜２０時間後：
グループＡ（＞１００、＜２５０）：２、３、６、７、１０、１３、１６、１７、１９、２２、及び２６
グループＢ（＞２５０、＜５００）：１、４、８、及び１１

７２時間後：
グループＡ（＞１００、＜２５０）：７
グループＢ（＞２５０、＜５００）：１、３、１０、１３、１６、１９、２２、及び２６
グループＣ（＞５００）：２、４、６、８、１１、及び１７

複合ランク付け
効力の各範囲にランク付けを行った（グループＡ＝１、Ｂ＝２、及びＣ＝３）。下記の表（表２８から３０）は、各試験毎のランク付けと、各ＹＰテルペン毎の全体的なランク付けを示す。数が小さいほど、効力はより良好になる。

８種のもっとも有効な試験材料は、チモール（Ｔ）を単独で又は混合物成分として有する。

考察：
先のｉｎ ｖｉｔｒｏ研究において、Ｌ−カルボンを含有したＹＰテルペン試験材料は、重要な植物病原体の制御に際し、最小限の有効性をもたらした。したがって、この成分を含有した１６種の試験材料は、除外された。

レサズリンを、指示染料として含めた。ボトリチスがレサズリンを分解するにつれ、紫からピンク、ピンクから透明へと色の変化が生ずる。静真菌アッセイでは、サンプルを、９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、レサズリンと１６〜２０時間反応させ、その後、色の変化の目視評価を行った。遠心分離及び洗浄の後、管内の残りの材料をレサズリンと反応させて、殺真菌評価を行った。

試験材料ＹＰ−７は、各試験においてもっとも有効なサンプルであった。ＹＰ−７は、生体外でウドンコ病を制御する際にもっとも有効な材料でもある。

結論：
すべてのＹＰ試験材料は、少なくとも５００ｐｐｍで、ボトリチスシネラに対して静真菌性であった。１６〜２０時間後、すべての材料は、少なくとも５００ｐｐｍで殺真菌性とみなされた。しかし７２時間後には、１０種類の試験材料しか、依然として殺真菌性とはみなされなかった。
もっとも有効なものは、２５０から５００ｐｐｍの間で殺真菌性であった。

実施例２７−植物細菌の制御に対する封入されたテルペンのｉｎ ｖｉｔｒｏ評価

試験がなされた３種の細菌はすべて、プロテオバクテリアであり、グラム陰性である。これらは、主にリポ多糖からなる外膜を有する。エルウィニアアミロボーラは、腸内細菌科にある。この科のその他の細菌には、サルモネラ種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、及びセラチアマルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）が含まれる。シュードモナスシリンゲは、シュードモナス科にある。この科のその他の重要なメンバーには、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（日和見病原体）が含まれる。キサントモナスカンペストリスｐｖ．ファセオリに密接に関係しているものは、米及びニンジンに感染するものを含めたいくつかの重要な病原型である。シュードモナスとキサントモナスとは、非常に密接に関係している。

２０世紀の間、侵襲された植物材料の導入は、欧州、中東、及びニュージーランドにＥ．アミロボーラを定着させる役割を果たした。Ｅ．アミロボーラは、リンゴ及び西洋ナシに火傷病を引き起こす。１９９５年、火傷病は、世界で最大の西洋ナシ産地である北イタリアのポー川流域で、最初に観察された。１９９５年以来、イタリア政府は、Ｅ．アミロボーラを根絶しようとして５０００００本の西洋ナシの木を伐採した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｐｓｎｅｔ．ｏｒｇ／ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／ＬｅｓｓｏｎｓＰｌａｎｔＰａｔｈ／ＦｉｒｅＢｌｉｇｈｔ／ＨＩＳＴＯＲＹ．ＨＴＭ）。

一般的なインゲン葉焼け病及びかさ枯病は、経済的にもっとも重要で広く知られたドライビーンズ及びサヤインゲンの疾病の１つである。米国、カナダ、及びコロンビアは、これら豆類の最大の栽培者の一部である。ほとんどの経営戦略では、認定された無菌種子のみを植え、作物を輪作し、薬剤散布を毎週行う（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｐｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｃｏｍ／ｃｏｍｍｏｎｂｅａｎ．ａｓｐ）。

方法：
エルウィニアアミロボーラ（株Ｅａ２７３；リンゴの火傷病）、シュードモナスシリンゲｐｖ．ファセオリコーラ（株Ｐｐｈ ＭＦ；豆のかさ枯病）、及びキサントモナスカンペストリスｐｖ．ファセオリ（株Ｘｐｈ ＸＰＷ；豆の一般的な胴枯病）を、この研究で使用した。これらの株は、コーネル大学から得た。

培養−３種の細菌すべてを、ＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）プレート（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９）上で、２８℃で培養した。スタータカルチャー（ＬＢブロス５０ｍＬ）にプレートから接種し、一晩成長させた（１７０ｒｐｍ、２８℃）。スタータカルチャー１ｍＬを、新しい５０ｍＬのＬＢブロスフラスコに移し、静止期に達するまで同じ条件下で成長させた。培養物を、その光学密度（ＯＤ）に関して６２０ｎｍで読み取り、次いでＬＢブロスで希釈することにより、１０５〜１０６細胞／ｍＬが得られた。この希釈された材料を、マイクロタイタープレートアッセイのウェルに接種するのに使用した。

静菌アッセイ：
プレートアッセイを、成長培地としてＬＢブロスを使用して実施した。ＹＰ−テルペン試験材料を、７．８から１０００ｐｐｍの範囲が得られるように、プレート内で希釈した（Ａｌテルペン）。希釈された細菌を各ウェルに添加することにより、最終的なウェル体積２００μＬが得られた。コントロールウェルは、いかなるＹＰ−テルペンも含有しなかった。プレートを、その初期測定値（初期ＯＤ）に関して６２０ｎｍで読み取り、２８℃で２日間インキュベートした。

２日後、プレートを再び６２０ｎｍで読み取った（最終ＯＤ）。最終ＯＤから初期ＯＤを差し引くことにより（δＯＤ）、経時的な成長変化が示される。効力に関する基準は、コントロールに対する増殖阻害が少なくとも７５％であった。したがって、試験ウェルにおけるδＯＤは、細菌の制御に有効であるとみなすために、コントロールウェルにおける成長の２５％未満でなければならなかった。

殺菌アッセイ：
静菌アッセイが終了した後、プレートを、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄みを除去し、新鮮なＬＢブロス１００μＬを各ウェルに添加した。プレートを６２０ｎｍで読み取り（初期ＯＤ）、２８℃で３〜４日間インキュベートし、再び６２０ｎｍで読み取った（最終ＯＤ）。有効濃度は、コントロールに対して少なくとも７５％の増殖阻害で得られた。

２つの反復試験片を各ＹＰ−テルペン毎に使用し、両方（静的及び殺的）のアッセイを、各細菌毎に３回実施した。

結果：
静菌アッセイ−３種の細菌すべてに関し、あらゆる試験材料は、試験がなされた少なくとも最高濃度で静菌的であった。アッセイは、４８時間実施した。効力に関する基準は、コントロールに対して少なくとも７５％の増殖阻害であった。効力の範囲は３１種のテルペンに関して確立され、その範囲を以下に示す。

殺菌アッセイ−多数のテルペン製剤は、試験がなされた最高濃度での細菌の死滅に有効ではなかった。効力の範囲が３１種のテルペンに関して確立され、それらを下記の表３２に示す。

各試験において、エルウィニアは、ＹＰ−テルペン製剤に対してもっとも感受性のある病原体であり、その後にキサントモナスが続き、次いでシュードモナスであった。

ランク付けを、各細菌に対する各アッセイ毎に、各ＹＰ−テルペンに行った。格付け番号が低いほど、試験材料の効力はより良好になる。静的及び殺的ランク付けを乗ずることによって、組合せのスコアが得られた。この番号は、ＹＰ−テルペンが各細菌をどのようにうまく制御したかを示している。３つの組合せスコア（各細菌毎に１つ）を加算して複合スコアを得たが、これは、３種すべての細菌全体にわたるＹＰ−テルペンの効力を示す。表３３は、各試験材料の組成物と一緒に、複合（全体）スコアに基づいた効力の順にＹＰ−テルペンを列挙する。

考察：
これらの細菌を制御するための８種の最良のＹＰ−テルペン製剤は、それぞれチモールを含有する。Ｌ−カルボンを含有するほとんどの組合せは、これらの細菌を制御するのに非常に不充分である。

実施例２４から２７の結果の概要

封入されたテルペンの、ある組合せは、あるタイプの植物病原体に対して特定の効力を示した。これらの組合せは、下記のとおりであることが観察された。
−すべての生物に関し、もっとも有効な組合せは７（ゲラニオール及びチモール）、１０（オイゲノール及びチモール）、及び１３（チモール及びシトラール）でありこれは小差で２位である。
−７（ゲラニオール及びチモール）は、真菌／卵菌の制御に関して全体的にもっとも有効である。
−１３（チモール及びシトラール）は、細菌に関して全体的にもっとも有効である。
−組合せ１０（オイゲノール及びチモール）は、真菌と細菌の両方に対して非常に有効である。
−次の効力のグループ分けは、３（チモール）、１９（ゲラニオール、チモール、及びシトラール）、及び２２（オイゲノール、チモール、＆シトラール）である。
−４番目にランク付けされたグループは、１６（ゲラニオール、オイゲノール、＆チモール）、及び２６（ゲラニオール、オイゲノール、チモール＆シトラール）からなる。
−特にベト病に関しては、４（Ｃ）が非常に有効であるが、その他に関しては最上位ではない。

これらの結果は、４種のテルペンであるシトラール、オイゲノール、ゲラニオール、及びチモールが、単独で又は組合せで特に酵母グルカン粒子に封入された場合、強力な抗菌及び抗真菌活性を示すことを示している。ほとんどの場合、チモールの存在は有意である。

表３４から３６に、様々な製剤の性能のランク付けをまとめる。

空の酵母細胞壁の光学顕微鏡写真を示す図である。 Ｌ−カルボン封入酵母細胞壁の光学顕微鏡写真を示す図である。 シトラール封入酵母細胞壁の光学顕微鏡写真を示す図である。 テルペンエマルションの光学顕微鏡写真を示す図である。 流体力学的体積（ＨＶ）の水における酵母細胞壁の光学顕微鏡写真を示す図である。 流体力学的体積（ＨＶ）の５倍の水におけるテルペン封入酵母細胞壁の光学顕微鏡写真を示す図である。 ＨＶの水におけるテルペン封入酵母細胞壁の光学顕微鏡写真を示す図である。 ＨＶ＋５％の水におけるテルペン封入酵母細胞壁の光学顕微鏡写真を示す図である。 ＨＶ＋１０％の水におけるテルペン封入酵母細胞壁の光学顕微鏡写真を示す図である。 ＨＶ＋２０％の水におけるテルペン封入酵母細胞壁の光学顕微鏡写真を示す図である。 ＨＶ＋３０％の水におけるテルペン封入酵母細胞壁の光学顕微鏡写真を示す図である。 ＨＶ＋４０％の水におけるテルペン封入酵母細胞壁の光学顕微鏡写真を示す図である。 キサンタンガムを含まない、テルペン成分封入乾燥中空グルカン粒子の分散を示す光学顕微鏡写真を示す図である。 ０．０７ｇの１％キサンタンガムを含む、図１３と同様の光学顕微鏡写真を示す図である。 ０．１４ｇの１％キサンタンガムを含む、図１３と同様の光学顕微鏡写真を示す図である。 ０．２８ｇの１％キサンタンガムを含む、図１３と同様の光学顕微鏡写真を示す図である。 ０．５５ｇの１％キサンタンガムを含む、図１３と同様の光学顕微鏡写真を示す図である。 １．１ｇの１％キサンタンガムを含む、図１３と同様の光学顕微鏡写真を示す図である。 ２．２ｇの１％キサンタンガムを含む、図１３と同様の光学顕微鏡写真を示す図である。 ４．４ｇの１％キサンタンガムを含む、図１３と同様の光学顕微鏡写真を示す図である。 サイト１８及び２０の処置区域の概略を示す図である。 サイト１８及び２０の処置区域の概略を示す図である。 サイト７の処置区域の概略を示す図である。 封入テルペン製剤と非封入テルペン製剤の比較を示すグラフである。 トマトの木における真菌疾病の進行を表すグラフである。 トマトの木の４つの反復試験片における、ダニ疾病のランク付けを表すグラフである。 トマトの木の４つの反復試験片における、ダニ疾病のランク付けを表すグラフである。 トマトの木の４つの反復試験片における、ダニ疾病のランク付けを表すグラフである。 トマトの木の４つの反復試験片における、ダニ疾病のランク付けを表すグラフである。 ＹＰ−４及びコントロールで処置した木の比較を示す写真である。

Claims (28)

1. ａ）テルペン成分を封入する中空グルカン粒子又は細胞壁粒子を含む組成物の有効量を、昆虫又はクモ類に投与するステップ
   を含む、昆虫又はクモ類を死滅させる方法。
2. 昆虫が、アリ、シロアリ、シラミ、アブラムシ、ノミ、バッタ、キリギリス、及びアザミウマからなる群から選択される請求項１に記載の方法。
3. クモ類が、ダニ、クモ、及びマダニからなる群から選択される請求項１に記載の方法。
4. 組成物を、植物を侵襲するダニ又は昆虫に投与する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
5. ダニがナミハダニである請求項４に記載の方法。
6. テルペン成分が、シトラールのみ、又はオイゲノール、チモール、及びシトラールの組合せを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
7. 昆虫又はクモ類に組成物を噴霧又はその他の手法により散布することによって、前記組成物を投与する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
8. 後に昆虫又はクモ類に摂取される可能性のある植物の葉に、噴霧又はその他の手法によって散布することによって組成物を投与する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
9. 昆虫又はクモ類に侵襲された物体を組成物中に浸漬することによって、前記組成物を物体に投与する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
10. 組成物を、シャンプーなどの形で投与する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
11. 組成物を布地に投与する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
12. 組成物を、布地の洗浄中に投与する請求項１１に記載の方法。
13. ａ）植物又は前記植物付近の土壌に、テルペン成分を封入する中空グルカン粒子又は細胞壁粒子を含んだ組成物を、治療上有効な量で投与するステップ
    を含む、植物侵襲の処置を又は予防する方法。
14. 侵襲が昆虫又はクモ類によるものである請求項１３に記載の方法。
15. クモ類が草食性のダニである請求項１４に記載の方法。
16. 草食性のダニがナミハダニである請求項１５に記載の方法。
17. 昆虫が、ハエ、アブラムシ、アリ、バッタ、キリギリス、及びアザミウマからなる群から選択される請求項１４に記載の方法。
18. テルペン成分がシトラールからなる請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
19. テルペン成分が、オイゲノール、チモール、及びシトラールの組合せを含む請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
20. 植物を収穫する少し前に、組成物を付着させる請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 収穫の２１日前以降に組成物を付着させる請求項２０に記載の方法。
22. 予防対策として組成物を定期的に付着させる請求項１３〜２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 組成物を噴霧によって付着させる請求項１３〜２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 組成物を灌漑によって付着させる請求項１３〜２２のいずれか一項に記載の方法。
25. 殺虫剤又はクモ駆除剤としての、テルペン成分を封入する中空グルカン粒子又は細胞壁粒子を含む組成物の使用。
26. ダニ駆除剤としての請求項２５に記載の組成物の使用。
27. 殺虫剤又はクモ駆除剤の調製における、テルペン成分を封入する中空グルカン粒子又は細胞壁粒子を含む組成物の使用。
28. ダニ駆除剤の調製における請求項２７に記載の組成物の使用。

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