JP2009545300A - ｍｉＲＮＡの使用及びｍｉＲＮＡを含む組成物 - Google Patents

Abstract

心臓特異的ｍｉＲ、ｍｉＲ−１３３、及びｍｉＲ−１は、心筋細胞（ＣＭＣ）の肥大の決定において、及び、その発現レベルの回復がＣＭＣ肥大の徴候を軽減することができるということにおいて重大な意味を持っている。

Description

本発明は、治療におけるｍｉＲＮＡの使用、及び、ｍｉＲＮＡを含んだ組成物に関する。

長い一次転写物（ｐｒｉ−ｍｉＲ）として第一に転写されるＭｉＲは、リボヌクレアーゼＩＩＩ酵素のドローシャ（Ｄｒｏｓｈａ）により核内で処理され、プレｍｉＲとして既知の、ステムループ構造を含有した６０〜１２０ヌクレオチドの前駆体を生じる。核外輸送因子のエクスポーチン−５及びＲａｎ−ＧＴＰ補助因子により細胞質内に輸送されるこの前駆体は、リボヌクレアーゼ酵素のダイサーにより最終的に切断され、成熟ｍｉＲを放出する。

発達する証拠は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）が基本的な細胞機能及び発癌に結びつけられることを示している。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）は、２２ｎｔまでの小さな保存されたＲＮＡ分子であり^１、主に標的ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに対する塩基対合を介して、動物及び植物において遺伝子発現を負に調節し、ｍＲＮＡ切断及び／又は翻訳抑制を生じる^１。現在、３００個を超えるｍｉＲが、ヒト及び他の真核生物種において同定されている（ｍｉＲレジストリ、www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna/index.shtml）。

ｍｉＲは、系統的に保存され^２〜５、例えば細胞の増殖及びアポトーシス^６、７、神経発生^２、造血^８、９、脂肪代謝^１０、インスリン分泌^１１、並びにストレス応答^１２等、種々の基本的な生物学的過程に関与する。実際、生物情報学的分析により、各ｍｉＲが何百もの標的を制御することができると予想され、従って、ｍｉＲがほとんど全ての生物学的経路において役割を果たすことができると示唆している^１３。近年の研究により、ｍｉＲは癌に結びつけられ、癌抑制因子又は発癌遺伝子として作用することができると示されている^１４。逆に、例えば心疾患等の他の異常な状態におけるｍｉＲの起こり得る関与は、まだ調査されていない。

いくつかのｍｉＲ遺伝子は、組織特異的な様式で発現される^１。筋特異的なｍｉＲ−１は、心室ＣＭＣの増殖を制御する転写因子であるＨａｎｄ２を介して心筋細胞（ＣＭＣ）の増殖を阻害する^１５。一方、ｍｉＲ−１は、複雑な回路を介してＣＭＣの分化を好む。特に、ｍｉＲ−１は、（ａ）ＳＲＦ及びＭｙｏＤ等の筋分化因子により活性化され、（ｂ）主に転写因子ＭＥＦ２Ｃを介して、筋分化の抑制物質であるＨＤＡＣ４の翻訳を抑制する^１５。ショウジョウバエにおいて、ｄｍｉＲ−１は、筋前駆細胞の分化を制御することに関与している^１６。ｄｍｉＲ−１の標的は、心細胞の分化において役割を果たす膜結合型のノッチリガンドであるデルタを含む^１６。

種々のシグナル伝達経路を活性化するサイトカインを含めた細胞外刺激又は圧刺激により媒介される肥大を経ることによって、ＣＭＣはストレスに応答する。これらの刺激は、次に、例えば心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）、骨格筋アクチン（ＳｋＡ）、及びβ−ミオシン重鎖（β−ＭＨＶ）等、収縮、カルシウムの処理、及び代謝に関与する蛋白質をコードする心臓遺伝子発現の再プログラム、及び、「胎児の」心臓遺伝子の活性化を誘発する。この転写性再プログラムは、心機能の減少と相関する^１７。逆に、薬物治療又は左心室補助装置の移植に応じた心機能における改善は、心臓遺伝子発現の正常化により成し遂げられる^１７。

心臓特異的ｍｉＲ、ｍｉＲ−１３３、及びｍｉＲ−１は、心筋細胞（ＣＭＣ）の肥大の決定において、及び、その発現レベルの回復がＣＭＣ肥大の徴候を軽減することができるということにおいて重大な意味を持っている。

従って、第１の態様において本発明は、好ましくはＳＥＱ ＩＤ番号１（ｍｉＲ−１３３）、若しくはＳＥＱ ＩＤ番号２（ｍｉＲ−１）、又は、その変異体若しくは異型のうち全て又は実質的な部分を含むＲＮＡの、心疾患の治療又は予防に対する薬物の製造における使用を提供している。

ＳＥＱ ＩＤ番号１は、３’−ＵＧＵＣＧＡＣＣＡＡＣＵＵＣＣＣＣＵＧＧＵＵ−５’である。

ＳＥＱ ＩＤ番号２は、３’−ＡＵＧＵＡＵＧＡＡＧＡＡＡＵＧＵＡＡＧＧＵ−５’である。

ｍｉＲ１３３に関連するものには、マイナーな異型であるｍｉＲ−１３３ａ及びｍｉＲ−１３３ｂが含まれることが理解されるであろう。ｍｉＲ−１３３ａの配列は、上記のＳＥＱ ＩＤ番号１に与えられているものであり、ｍｉＲ−１３３ｂの配列は、ｍｉＲ−１３３ａの（上記下線部分）３’−ＵＧが単にｍｉＲ−１３３ｂの３’−Ａと交換される点において異なっている。従って、ｍｉＲ−１３３ｂの配列は、３’−ＡＵＣＧＡＣＣＡＡＣＵＵＣＣＣＣＵＧＧＵＵ−５’（ＳＥＱ ＩＤ番号１５）である。ｍｉＲ−１３３ｂのアンタゴｍｉＲ（Ａｎｔｏｇｍｉｒ）も認識される。ｍｉＲ−１３３ｂは好ましいけれども、ｍｉＲ−１３３ａはさらにより好ましい。

ｍｉＲは、ｍＲＮＡのうち、ｍｉＲが相互に作用する部分に直接対応する必要はない。従って、どこがｍＲＮＡ上の結合部位であるのか常に明確なわけではなく、実際、ｍｉＲは、同じｍＲＮＡ上の１又は複数の部位と相互作用することが可能である。しかし、一般には、ｍｉＲはＵＴＲと結合することが判ってきており、本発明のｍｉＲの結合は一般的にＵＴＲに関連して論議されるけれども、ｍｉＲ結合の状況においてＵＴＲに関連するものはどれも、ｍｉＲが結合する、又は、ｍｉＲが相互に作用するいかなるｍＲＮＡ部位に関連するものも同様に含むことが理解されるであろう。

好ましいアンタゴｍｉＲは、ｍｉＲ１３３又はｍｉＲ１に対する相補であり、好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ番号１及びＳＥＱ ＩＤ番号２に対する配列であり、
ＳＥＱ ＩＤ番号１３（５’−ＡＣＡＧＣＵＧＧＵＵＧＡＡＧＧＧＧＡＣＡＡ−３’）及び
ＳＥＱ ＩＤ番号１４（５’−ＵＡＣＡＵＡＣＵＵＣＵＵＵＡＣＡＵＵＣＣＡ−３’）
として提供される。

上記のＳＥＱ ＩＤにおいて、ボールドセプタマー（ｂｏｌｄ ｓｅｐｔａｍｅｒ）は、標的ＲＮＡに対する結合を開始するための種子配列であることを考慮されるため保存されることが好ましいので、活性を確実にするためにいかなる変異体又は異型においてもこれらの配列を保持することが非常に好ましい。

添付の図７及び８からわかるように、ｍｉＲ−１３３は、ＮＥＬＦ−Ａ及びＣＤＣ−４２のｍＲＮＡにそれぞれ２つの推測上の部位で結合する。示されている４つの部位はどれも、完璧な組合せではない。従って、ｍｉＲ−１３３の配列は、依然として標的ｍＲＮＡに結合しながら修飾することができることが理解されるであろう。

ｍｉＲ−１３３の配列は、依然として十分なレベルのＣＤＣ−４２ｍＲＮＡに対する結合を示しながら、５０％以下まで変異又は変わることができるが、変異体及び異型は、４０％以下、好ましくは３０％以下、より好ましくは２０％以下までｍｉＲ−１３３とは異なることが一般的には好ましい。特に、配列の差は１０％以下であることが好ましく、配列において変異がないことが最も好ましい。しかし、ＳＥＱ ＩＤ番号１（ｍｉＲ−１３３）又はＳＥＱ ＩＤ番号２（ｍｉＲ−１）の端を切断することが望ましい場合がある。これは、ｍｉＲ−１３３の末端のうちそれぞれ又はどちらかから１又は複数のヌクレオチドを除去することによるものであり得る。所望であれば、より多くのヌクレオチドを除去することができるが、ヌクレオチドの除去を合計で５残基以下に限定することが一般的には好ましい。

本発明のＲＮＡは、上記のように任意で修飾されたＳＥＱ ＩＤ番号１又はＳＥＱ ＩＤ番号２の配列から成り得る。本発明のＲＮＡは、そのような配列をその一部として１又は複数の追加の配列と共に含み、より長いポリヌクレオチド配列を形成することもできる。一般的には好ましくないけれども、以下で論議される変異体は追加のヌクレオチドを配列内に含むことができるということにも注目されたい。そのような追加が生じた場合、好ましくはスポット変異として、そのような内部の追加を３ヌクレオチド以下に限定することが好ましい。３’及び５’末端のうちの一末端若しくはもう一方の末端、又は、両方の末端における追加の配列を介して生じるより長いポリヌクレオチド配列は、好ましくは、結合するｍＲＮＡよりも短くあるべきであり、いかなる場合であっても、ＣＭＣにおいて抗肥大作用を働かせることができなくてはならない。そのような作用は、付随する実施例に記述されているように、肥大を誘発して、推測上のＲＮＡが誘発された肥大に対抗することができるかどうかをアッセイすることによって測定することができる。

本発明のＲＮＡは、概して約１５０個までのヌクレオチドから成り得る。これは、一般的に一次転写物の形状をとり、ほぼ、又は、好ましくはちょうどＳＥＱ ＩＤ番号１の長さのオリゴヌクレオチドまで細胞質内で切断される。

本発明のＲＮＡは、ＣＭＣにおいて抗肥大作用を働かせることができなくてはならないが、そのような作用は、示される活性に先立ち前記ＲＮＡの細胞内処理が生じる場合、前記ＲＮＡにより直接示される必要がない。

本発明の好ましいＲＮＡは、少なくともＳＥＱ ＩＤ番号１又はＳＥＱ ＩＤ番号２のシチジン四量体を含み、ＣＤＣ−４２ｍＲＮＡにもＮＥＬＦ−ＡｍＲＮＡにも結合する能力を有している。

本発明のＲＮＡは、一般に、ＣＭＣにおいてその作用を有し、本発明のＲＮＡを細胞内に導入するためのいかなる適した手段も容認できる。適した方法には、遺伝子銃及びウイルスカプシドが含まれる。特に、例えば、ＣＭＣ抗原を認識する抗体に結合される媒体を用いたＣＭＣを標的にするいかなる送達方法も好ましい。本発明は、従って、規定されたＲＮＡの使用をさらに提供し、薬物は、前記ＲＮＡをＣＭＣ内に導入するのに適したベクターを含む。

本発明のＲＮＡを含んだ薬物を用いた治療は、肥大の状態からの短期間の解放を提供する。より長期の解放が必要とされる場合、本発明のＲＮＡをコードするＤＮＡの細胞への導入が、本発明の一態様として提供される。例えばアデノウイルス等、適したレトロウイルス及びレンチウイルスの使用を含めた、標的細胞をｉｎ ｖｉｖｏで形質転換するためのいかなる適した技術も使用することができる。当該ＲＮＡをコードするＤＮＡは、発現可能な遺伝子の形状であることが好ましく、ｍｉＲを直接発現することができるか、又は、好ましくは、上記のように一次転写物を発現することができる。そのような遺伝子はどれも、特に転写の開始及び終結に対する転写制御配列を含んでいることが好ましいと理解されるであろう。そのような遺伝子は、単に標的細胞を形質移入するために使用することができるプラスミド内に、又は、本発明のＤＮＡに対応するＲＮＡの逆転写を介して、当該ＤＮＡをゲノム内に組み込むよう適切に選択され得るレトロウイルス等の送達媒体内に特に存在する。

ｍｉＲ−１３３の発現が有害であると決定される例において、アンチセンス配列を有した低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を本発明のＲＮＡに投与することが従って望ましい場合がある。そのようなｓｉＲＮＡは、必ずしもｍｉＲの全長に結合しなくてはならないわけではなく、必要とされるのは全て、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が形成される様式でｓｉＲＮＡがｍｉＲに結合することであると当業者は認識するであろう。ｄｓＲＮＡの形成はｍｉＲの作用を阻止し、一般的にｄｓＲＮＡを消化する。ｓｉＲＮＡを投与するための適した手段は、上記のｍｉＲに対する手段であり、ＣＭＣの肥大が生じる程度までｍｉＲのレベルを下げることは一般的に好ましくないと理解されるであろう。

本発明のｓｉＲＮＡを使用して、ｍｉＲ−１３３の存在を検出することもできる。例えば、ラベルされたｓｉＲＮＡを使用して、所望のｍｉＲの存在を検出するためのプレートを形成することができる。抗ｍｉＲ−１３３抗体を類似の様式で使用し、試料内のｍｉＲのレベルを決定することもでき、ｍｉＲ−１３３のレベルの決定を使用して、ＣＭＣ肥大の有無又はその傾向を示すことができる。

ｍｉＲ−１３３の内在的発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ モデルでもｉｎ ｖｉｖｏモデルでも心肥大において劇的に減少する。ｍｉＲ−１３３強制発現は、増加したＣＭＣサイズ、蛋白質合成、細胞骨格の構造認識、及び胎児遺伝子の再発現を含めた肥大特徴のパラメータを抑制する。逆に、デコイ配列によるｍｉＲ−１３３の抑制は、アゴニスト治療後よりもさらにより明白な劇的なＣＭＣの肥大を誘発する。ｍｉＲ−１３３の標的が、心臓の起源に関与する核因子ＮＥＬＦ−Ａ、及び、肥大に結びつけられるシグナル伝達キナーゼＣＤＣ−４２を含むことも確立した。従って、ｍｉＲ−１３３の過剰発現又は発現低下は、ｍＲＮＡ発現は未修飾であるのに対して、蛋白質レベルでのＮＥＬＦ−Ａ及びＣＤＣ４２の逆変動（ｉｎｖｅｒｓｅ ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ）を引き起こす。理論により拘束されることなく、ｍｉＲ−１３３は心肥大を制御する主要な遺伝子であることがわかる。

上記のように、ｍｉＲは、標的であるセンス配列に対して１００％忠実である必要はない。実際、完全な組合せは、ｄｓＲＮＡの形成を介して標的ｍＲＮＡを切断することができる。ｄｓＲＮＡの形成及び標的ｍＲＮＡの切断が本発明の範囲内に含まれる一方で、前記ＲＮＡが標的の３’ＵＴＲに結合して翻訳を阻止又は防ぐことができる場合、ＲＮＡはＵＴＲに対して１００％忠実である必要はない。

本発明は、これらのｍｉＲの変異体及び異型をさらに提供する。この点において、常に、結果として生じるｍｉＲが３’ＵＴＲと相互作用して随伴のコード配列の翻訳を阻止又は防ぐことができる場合、変異体は、欠失、挿入、逆位、又は置換のうち少なくとも１つを含むことができる。３’ＵＴＲとの増強された相同性が好ましい。異型は、一般的に自然発生の変異体であり、通常１又は複数の置換を含む。

本発明のＲＮＡは、いかなる適した形状でも標的部位に提供することができる。この点において、標的部位は、例えばｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｔｒｏで存在することができ、当該ＲＮＡの唯一の要求は、ＯＲＦの翻訳を阻止又は防ぐことができるよう十分に標的の３’ＵＴＲと相互作用することである。

当該ＲＮＡは直接提供することができるか、又は、当該ＲＮＡを直接コードする、若しくはその前駆体をコードするベクターを用いて標的細胞を形質転換することができる。適した前駆体は、例えば長い一次転写物として転写される必要はないけれども、成熟ｍｉＲを提供するよう処理される前駆体である。

当該ＲＮＡが直接提供される場合、これは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社（www.dharmacon.com, Boulder, CO, USA）から入手可能なもの等、安定した形状で提供することができる。

特に、本発明は、治療におけるｍｉＲ−１３３の使用を提供する。

投与されることになるＲＮＡのレベルは、熟練の医師により容易に決定されるが、約１ｍｇ／ｋｇから１キログラムあたり数百マイクログラムまでさまざまであり得る。

アンチセンスｍｉＲＮＡ又はセンスインヒビターの好ましい送達方法は、当業者には容易に明らかなように、当技術分野において既知のいかなる遺伝子治療法によるものであり得る。そのような方法には、いわゆる「遺伝子銃」法、又は、ウイルスカプシド、特に、好ましくは適したプロモーターの制御下で前記ポリヌクレオチドをカプセルに包む若しくは封入するアデノウイルス若しくはレンチウイルスカプシド内の送達が含まれる。

注入による好ましい投与方法は、例えば、静脈内投与又は筋肉内投与を含む。しかし、本発明のポリヌクレオチドは、適切に処方される場合、経皮的又は経口的投与等の他の方法によって投与することができるということも理解されたい。

本発明は、本発明のマイクロＲＮＡをｉｎ ｖｉｖｏで転写することができるように、第１の適したプロモーターに操作可能に連結されたポリヌクレオチド配列、特に、当該マイクロＲＮＡをコードするＤＮＡ配列も含む。同様に、本発明は、本発明のセンスマイクロＲＮＡインヒビターのｉｎ ｖｉｖｏでの発現のために同様に第２の適したプロモーターに操作可能で連結したポリヌクレオチド、特に、当該センスマイクロＲＮＡインヒビターをコードするポリヌクレオチドを提供するＤＮＡも提供する。

このように、（ａ）ｍｉＲ−１３３及びｍｉＲ−１の発現は、ｉｎ ｖｉｖｏで心肥大に対して逆相関する。さらに、（ｂ）機能研究により、ＣＭＣにおけるｍｉＲ−１３３の過剰発現が、ＣＭＣサイズの増加も、肥大を規定するその他の「特徴」パラメータの増加も阻止すると示され、逆に、（ｃ）デコイ配列を介した内在性のｍｉＲ−１３３又はｍｉＲ−１の遮断は、いかなる肥大刺激の非存在下においてさえも、劇的なＣＭＣ肥大を本質的に誘発する。意義深いことに、これらの機能研究を、新生仔のＣＭＣにおいても成人のＣＭＣにおいてもｉｎ ｖｉｔｒｏ並びにｉｎ ｖｉｖｏで行った。

肥大の確立の基礎をなしている可能性がある２種類のｍｉＲ−１３３の標的、ＣＤＣ４２及びＮＥＬＦ−Ａを同定した。ＣＤＣ４２の作用機構はすでに叙述されているが、ＮＥＬＦ−Ａの機能経路はまだわからないでいる。ＮＥＬＦ−ＡはＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩの活性を調節する^２６一方で、ＣＤＣ４２は肥大中に生じる細胞骨格の再構築と付随している^{２８、２９}。これに関して、ＮＥＬＦ−Ａは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩと相互作用することによって肥大中のＲＮＡ合成を調節するｃｄｋ−９／サイクリンＴ複合体^３１と相互作用する^３０。心肥大及び心臓発生におけるＮＥＬＦ−Ａの関与はＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩ依存性であり得る。

２種類の標的のみが同定されてきたけれども、さらなる標的を同定することが可能である。前記ｉｎ ｖｉｖｏでの研究は、ＡｄＤｅｃｏｙによるｍｉＲ−１３３の全抑制が、標準的なアゴニスト刺激による後の誘発よりもさらにより明白な著しい肥大を本質的に引き起こすと示している。特に、前記ＡｄＤｅｃｏｙは、肥大中に上方調節された特徴分子それぞれの発現を増加する。このことは、多数の一次標的を制御し、その結果、生理学的プログラムから肥大特異的プログラムまで心臓遺伝子の発現をシフトする「主要な遺伝子」としてｍｉＲ−１３３は機能すると強く示唆している。

従って、（ａ）正常な蛋白質発現対ｍｉＲ−１３３により抑制されたＣＭＣの差異分析が、心肥大の基礎をなす新しい分子の発見を生じることができるということがおそらくある。従って、本発明は、ＣＭＣ細胞、又は、従ってモデルを提供する細胞の培養物内のｍｉＲ−１３３のレベルを調節することを含めたＣＭＣ肥大を調査する方法をさらに提供する。さらに、（ｂ）ｉｎ ｖｉｖｏでの機能研究により、ｍｉＲ−１３３の過剰発現又は抑制がそれぞれ心肥大を阻止又は誘発すると示される一方で、ｍｉＲ−１３３のレベルは、例えば圧力の過負荷により誘発された肥大等の「疾患」ｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて変更される。このように、本発明は、心筋症、特に心肥大及び心不全の診断及び治療におけるｍｉＲ−１３３の使用を構想する。

心肥大において、バイシストロニックなｍｉＲ−１３３及びｍｉＲ−１の起こり得る相互作用が存在する。骨格筋芽細胞の培養において、ｍｉＲ−１３３ａ及びｍｉＲ−１は、同じ一次ＲＮＡ内に転写されるけれども、それぞれ分化又は増殖を促進する^３２。ｉｎ ｖｉｖｏモデルにより、心肥大においてｍｉＲ−１３３及びｍｉＲ−１は同一のパターンに従い発現低下されることが示され（図１）、これら２種類のｍｉＲは、肥大発生の基礎をなす同調的な２組の標的ｍＲＮＡの翻訳から障害物を取り除くよう機能的に相互作用することができると示唆している。

本発明は、次に、本発明を限定することのない付随の図及び実施例を参考にして記述される。本明細書において引用される全ての参考文献は、他に記載がない限り、参照により援用される。

マウスの心肥大におけるｍｉＲ−１３３及びｍｉＲ−１発現に関するパネルである。（ａ）上のパネルは、偽手術されたマウス、大動脈アーチが収縮された（ＴＡＣ）マウス、及び、Ａｋｔ遺伝子導入マウス由来の全ＲＮＡを使用したｍｉＲ−１３３発現（代表的結果）のノーザンブロット分析である。下のパネルは、濃度測定分析により得られた相対発現値である（平均±ＳＤ、１つの群あたり最小ｎ＝５マウス）。偽手術されたマウスと比較した場合、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１である。（ｂ）ａにおいて示されたのと同様の、ｍｉＲ−１発現の結果である。 Ａｄ１３３を用いた新生仔ＣＭＣの感染及びアゴニスト誘発性肥大の阻止に関するパネルである。（ａ）Ａｄ１３３に感染した２９３細胞株由来の全ＲＮＡを用いたｍｉＲ−１３３発現のノーザンブロット分析である（１、対照；２、感染多重度１；３、感染多重度５０）。（ｂ）Ａｄ１３３に感染した（感染多重度１００）又は感染していない新生仔ＣＭＣ、及び、１００μＭのフェニレフリン（ＰＥ）若しくは１００ｎＭのエンドセリン−１（ＥＴ１）で処理した又は処理していない新生仔ＣＭＣにおいて、ＣＭＣ^３Ｈロイシン取込みとして評価した肥大レベルである（平均±ＳＤ、１つの群あたり最小３つの実験）。＊Ｐ＜０．０１対モック、゜Ｐ＜０．０１対モック＋ＰＥ若しくは＋ＥＴ１。（ｃ）アクチン（赤）及びＡＮＦ（緑）蛋白質に対して免疫染色したモック並びにＡｄ１３３に感染した細胞の共焦点顕微鏡法を示している。（ｄ）新生仔ＣＭＣから抽出された全ＲＮＡで行ったドットブロットである。ＧＡＰＤＨ発現に規準化された「胎児」心臓遺伝子の発現レベルは、モック細胞と比較した倍の誘発（ｆｏｌｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）として評価されている（平均±ＳＤ、１つの群あたり最小ｎ＝３の実験）。＊Ｐ＜０．０１対モック；^ΔＰ＜０．０５、゜Ｐ＜０．０１対モック＋ＰＥ。 ＡｄＤｅｃｏｙを用いた新生仔ＣＭＣの感染及びフェニレフリン（ＰＥ）の存在下又は非存在下での肥大の誘発に関するパネルである。（ａ）左のパネルは、ＣＭＣ^３Ｈロイシン取込みアッセイである（平均±ＳＤ、１つの群あたり最小３つの実験）。右のパネルは、ｍｉＲ−１３３のノーザンブロットである。（ｂ）アクチン（赤）及びＡＮＦ（緑）蛋白質に対して免疫染色したモック並びにＡｄＤｅｃｏｙに感染した細胞の共焦点分析である。（ｄ）ＡｄＤｅｃｏｙに感染したＣＭＣにおける「胎児」心臓遺伝子のドットブロット分析であり、モック対照値と比較した倍の誘発として評価されている（平均±ＳＤ、１つの群あたり最小３つの実験）。＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１対モック；゜Ｐ＜０．０１対モック＋ＰＥ。他の詳細に関しては、図３の説明を参照。 心肥大に対するＡｄＤｅｃｏｙ及びＡｄ１３３のｉｎ ｖｉｖｏでの作用に関するパネルである。（ａ）上のパネルは、ｗｔマウスにおけるＡｄＤｅｃｏｙ遺伝子導入後の左心室ＣＭＣサイズの相対度数分布分析及び累積度数分布分析である（１つの群あたりｎ＝１０）。遺伝子導入の１４日後にＣＭＣを単離し、細胞サイズをｉｍａｇｅＪで分析した（ｎ＝４００）。その値は、任意の単位によって表され、モックと比較した場合、Ｐ＜０．００１である。下のパネルは、ＣＭＣから抽出された全ＲＮＡのドットブロットである（処理されたそれぞれの群に対してｎ＝４）。ＧＡＰＤＨ発現に規準化された「胎仔」心臓遺伝子の発現レベルは、モック細胞と比較した倍の誘発として評価されている（平均±ＳＤ）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１対モック。（ｂ）上のパネルは、ＡｋｔＴｇマウスにおけるＡｄ１３３遺伝子導入後の左心室ＣＭＣサイズを示している（ｎ＝１０）。モックと比較した場合、Ｐ＜０．０５である。下のパネルは、ＣＭＣにおける全ＲＮＡ発現のドットブロットである（ｎ＝４）。＊Ｐ＜０．０５対モック。 デコイ−１３３のｉｎ ｖｉｖｏでの作用の時間経過に関するグラフである。生理食塩水の群と比較した場合、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１である。 アンタゴｍｉＲ−１のｉｎ ｖｉｖｏでの作用を示したグラフである。生理食塩水の群と比較した場合、＊Ｐ＜０．０５である。 ｍｉＲ−１３３標的遺伝子、ＮＥＬＦ−Ａの同定に関するパネルである。（ａ）偽手術されたマウス、ＡｋｔＴｇマウス、及びＴＡＣマウス由来のＮＥＬＦ−Ａのウェスタンブロットである。（ｂ）モック、Ａｄ１３３、及びＡｄＤｅｃｏｙに感染した２９３細胞株のウェスタン（左）及びノーザン（右）ブロットである。（ｃ）ＮＥＬＦ−Ａ発現に対して免疫染色された、モック、Ａｄ１３３、及びＡｄＤｅｃｏｙに感染した成体ＣＭＣを示している（感染多重度２００）。（ｄ）上のパネルは、ｍｉＲ−１３３により標的にされたＮＥＬＦ−Ａ ｍＲＮＡ ３’ＵＴＲ部位を示している。下のパネルは、ｍｉＲ−１３３オリゴマーを同時導入した野生型又は成熟ｍｉＲ−１３３相補的部位を含有したＮＥＬＦ−Ａ ３’ＵＴＲを用いて行ったルシフェラーゼレポーターアッセイである（平均±ＳＤ値、１つの群あたり最小で５つの実験）。対照非標的オリゴマーが含まれている。＊＊Ｐ＜０．０１ｖｓ対照；°Ｐ＜０．０５ｖｓ野生型３’ＵＴＲ＋ｍｉＲ−１３３。 ｍｉＲ−１３３標的遺伝子、ＣＤＣ４２の同定に関するパネルである。（ａ）偽手術されたマウス、ＡｋｔＴｇマウス、及びＴＡＣマウス由来のＣＤＣ４２のウェスタンブロットである。（ｂ）モック、Ａｄ１３３、及びＡｄＤｅｃｏｙに感染した２９３細胞株のウェスタン（左）及びノーザン（右）ブロットである。（ｃ）モック、Ａｄ１３３、及びＡｄＤｅｃｏｙに感染し、ＣＤＣ４２発現に対して免疫染色された成体ＣＭＣを示している（感染多重度２００）。（ｄ）上のパネルは、ｍｉＲ−１３３により標的にされたＣＤＣ４２ ｍＲＮＡ ３’ＵＴＲ部位を示している。下のパネルは、ｍｉＲ−１３３オリゴマーを同時導入した野生型のＣＤＣ４２ ３’ＵＴＲを用いて行ったルシフェラーゼレポーターアッセイである（平均±ＳＤ値、１つの群あたり最小で４つの実験）。非標的オリゴマーが対照として含まれている。＊＊Ｐ＜０．０１対対照。

胎仔及び成体組織におけるｍｉＲ−１３３及びｍｉＲ−１発現に関するパネルである。（ａ及びｂ）ヒトｍｉＲ−１３３−ａ−１／ａ−２及びｍｉＲ−１−１／−２前駆体アイソフォームを含んだマイクロアレイチップにより評価された、ヒト７週胚組織におけるｍｉＲ−１３３及びｍｉＲ−１の相対発現を示している（左のパネル）。結果をノーザンブロットにより確証した（右のパネル）。（ｃ）成体マウス組織におけるｍｉＲ−１３３発現のマイクロアレイ分析である。（ｄ）左のパネルは、胚発生中のマウスの心臓におけるｍｉＲ−１３３発現のマイクロアレイ分析である。右のパネルは、マウス発生から１６日及び１８日後に行われたインサイツハイブリダイゼーションを示している（左は胸部矢状切片、右は心臓切片である。トルイジンブルー染色及びｍｉＲ−１３３探索がそれぞれ上のパネル及び下のパネルに示されている）。マイクロアレイの結果が、中央値と比較した倍の増加（ｆｏｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ）によって表されている。ＣＭＣは心筋細胞である。 上のパネル：ＡｄＤｅｃｏｙの構造を示している（ｍｉＲ−１３３ａに相補的なタンデム「デコイ」配列は赤で示されている）。下のパネル：新生仔ＣＭＣをモック及びＡｄＤｅｃｏｙに感染させた（感染多重度２００）。感染の３時間後、１００μＭのフェニレフリンを添加した。２４時間後、ＧＦＰ発現を評価した。 モック（Ａ）、Ａｄ１３３（Ｂ）、又はＡｄＤｅｃｏｙ（Ｃ）に感染した成体ＣＭＣ（感染多重度２００）の、感染の４８時間後に評価された形態学的分析を示している（平均±ＳＤ値）。各群あたり少なくとも３００個のＣＭＣを無作為に選択した。モックと比較した場合、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５である。値は、任意の単位によって表されている。 ３’ＵＴＲＮＥＬＦ−Ａ「種子」配列の変異を示している。

〔材料及び方法〕
ヒト組織及びマウス
ヒト胚及び胎児を、制度ガイドラインに従い^３３合法的中絶によって受精後５〜１０週で得た。前もって完全に説明をうけた上での母親からの承諾を得た。標準的な多数の基準に従い形態学的段階により年齢を注意深く確立した。異なる器官を倒立顕微鏡の下で解剖し、全ＲＮＡ抽出まで液体窒素の下保存した。Ｃ５７／Ｂ１６マウスに対する実験を、制度ガイドラインに従い行った。

ｍｉＲ分析
マイクロアレイ
マイクロアレイ分析を記載されたように行った^１８。処理されたスライドをＳｃａｎＡｒｒａｙ ＸＬ５Ｋにより走査し、発現レベルをＱＵＡＮＴＡＲＲＡＹソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）により分析した。ＧＥＮＥＳＰＲＩＮＧソフトウェアバージョン６．１．１（Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社）を使用して生データを分析し、負の値を０．０１に変えるよう各ｍｉＲの平均値を変換し、ｐｅｒ−ｃｈｉｐ５０パーセンタイル法（ｐｅｒ−ｃｈｉｐ ５０^ｔｈ ｐｅｒｃｅｎｔｉｌｅ ｍｅｔｈｏｄ）を使用してその中央値を規準化した^８、１８。

ノーザンブロット
低分子量に濃縮された全ＲＮＡを、チオシアン酸グアニジンフェノールクロロホルムの標準手順に従い単離し、記載されたようにハイブリッド形成した^６。使用したプローブは：
ｍｉＲ−１３３ａ、５’−ＡＣＡＧＣＴＧＧＴＴＧＡＡＧＧＧＧＡＣＣＡＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ番号：３）
ｍｉＲ−１、５’−ＴＡＣＡＴＡＣＴＴＴＡＣＡＴＴＣＣＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ番号：４）及び
荷重制御として、Ｍｅｔ−ｔＲＮＡ、５’−ＴＧＧＴＡＧＣＡＧＡＧＧＡＴＧＧＴＴＴＣＧＡＴＣＣＡＴＣＧＡＣＣＴＣＴＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ番号：５）である。

Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（www.scioncorp.com）により発現レベルを分析した。

インサイツハイブリダイゼーション
１０〜１８日のマウス胚、１日齢及び成体のマウス由来の７μｍのＯＣＴ切片をパラフィン固定し、１０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫで処理し、さらに、^３３ＰｍｉＲ−１３３プローブ／ｍｌとハイブリッド形成させた。標準手順に従い、アンチセンスＲＮＡオリゴを５’末端でラベルし、ハイブリッド形成をＲＴにて一晩実行した。対比染色を０．０２％のトルイジンブルーにおいて行い、スライドをＰｅｒｍｏｕｎｔ液内でマウントした。Ｏｌｙｍｐｕｓの顕微鏡を使用して画像を撮った。

Ｉｎ ｖｉｖｏでの実験
圧力過負荷心肥大の誘発
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｈａｒｌａｎ社）を使用した。記載されているように、ケタミン−キシラジン（それぞれ１００又は２．５ｍｇ／Ｋｇ）の混合物を用いた麻酔下で、大動脈バンド形成（ＴＡＣ）を介して圧力−過負荷モデルを得た^３４。

Ａｋｔ遺伝子導入マウス
心臓特異的に恒常的活性型のＡｋｔを過剰発現する遺伝子導入マウスは、以前に記載された^１９。特に、Ａｋｔ過剰発現は、ＣＭＣサイズ及び求心性ＬＶ肥大の有意な増加を誘発する。

心エコー分析
ＴＡＣの前及び１週間後に、ＨＰＳｏｎｏｓ ５５００超音波心臓検査計を使用して経胸壁心エコーをイソフルラン麻酔下で行った。記載されているように、１５ＭＨｚの線形変換器を使用して、２次元、Ｍモード、及びドップラーの心エコー検査を行った^３５。

プラスミド及びベクター
アデノウイルスｍｉＲ−１３３ａ（Ａｄ１３３）
ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｈｉｇｈ ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用することによって、ｍｉＲ−１３３ａ前駆体ＤＮＡをマウスゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。増幅した断片（６８３ｂｐ）を、第一に、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローニングし、次に、ウイルス作製のため、ＣＭＶプロモーターの下、アデノウイルスベクターＶＱ Ａｄ５ＣＭＶ Ｋ−ＮｐＡ（ＶｉｒａＱｕｅｓｔ Ｉｎｃ．社）に挿入した。

アデノウイルスｍｉＲ−１３３ａデコイ（ＡｄＤｅｃｏｙ）（図１０）
スペースにより隔てられたｍｉＲ−１３３ａ（「デコイ」）に相補的なタンデム配列を含むようＥＧＦＰ３’ＵＴＲを修飾した。次に、ＥＧＦＰ−修飾された３’ＵＴＲを、ＣＭＶにより駆動されるＶＱ Ａｄ５ＣＭＶ Ｋ−ＮｐＡベクターにサブクローニングした（上のパネル）。ｍｉＲレベルが下方制御された場合、ＥＧＦＰセンサーレベルは増加する（下）。より重要なことは、デコイ配列が内在性のｍｉＲ−１３３を隔離し、その活性を遮断することである（図３ｂ、パネル右）。

ｐＧＬ−３’ＵＴＲプラスミド
ルシフェラーゼレポーター実験に対して、ｍｉＲ−１３３と特異的に相互作用すると予想されたＮＥＬＦ−Ａ及びＣＤＣ−４２の３’ＵＴＲセグメントを、ＰＣＲ（ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ）Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｈｉｇｈ ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によりマウスゲノムＤＮＡから増幅した。ルシフェラーゼ遺伝子の終止コドンからすぐ下流のＸｂａ Ｉ部位を使用して、標的遺伝子由来の３’ＵＴＲを標準手順によりｐＧＬ３−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）にサブクローニングした。ＮＥＬＦ−Ａに対しては、２５０ｂｐの断片から成る３’ＵＴＲを増幅した。ＣＤＣ−４２に対しては、１４００ｂｐの断片である３’ＵＴＲを増幅した。

Ｉｎ ｖｉｔｒｏでの機能研究
マウス心筋細胞（ＣＭＣ）の単離、培養、及び処理
標準的な酵素技術^３６に従い、新生仔ＣＭＣを１日齢の子から単離した。ペニシリン（１００Ｕ ｍｌ^−１）、ストレプトマイシン（１００μｇ ｍｌ^−１）、ヘペス（２５ｍＭ）、グルタミン（２ｍＭ）、１０％の新生ウシ血清、及び、５％の胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を追加したＤ−ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ社）において、ＣＭＣを２４時間培養した。処理の２４時間前に、培地を血清無しの培地に変えた。アゴニスト処理は、１００μＭのフェニレフリン（ＰＥ）又は１００ｎＭのエンドセリン−１（ＥＴ１）の添加を必要とし、処理の４８時間後に細胞を分析した。アデノウイルス感染（感染多重度は結果に記されている）を血清無しの培地において行い、感染の５時間後培地を取り換え、細胞を４８時間さらにインキュベートした。アデノウイルスベクターと組み合わせて使用した場合、感染後に新しい培地と取り換える際に１００μＭのＰＥ又は１００ｎＭのＥＴ１を添加した。標準的な酵素技術^３６を使用して、成体ＣＭＣを１２〜１６週齢の雄のマウスから単離した。新しく単離したＣＭＣを、２０μｇ／ｍＬのラミニンでプレコートしたディッシュ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社）内で、１ｍＭのＣａＣｌ_２、１５ｍＭのブタンジオンモノキシム、２５ｍＭのヘペス、及び、ペニシリンをプラスしたストレプトマイシン１％を追加したＤ−ＭＥＭにおいて、０．５から１ｘ１０^４／ｃｍ^２の密度で培養した。次に、細胞を記載されたように処理した^３６。

蛍光顕微鏡
培養したＣＭＣを、４％ＰＦＡにおいて固定し、ＰＢＳ内でリンスし、２０分間ブロッキングバッファーで浸透処理して（０．１％のトリトンＸ１００、１％の正常なロバの血清、１％の冷水魚ゼラチン、及び２０ｎＭのグリシン）、最終的に、４℃で一晩、希釈したバッファーにおいて、抗ＡＮＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、抗ＮＥＬＦ−Ａ／ＷＨＳＣ２（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社）、又は、抗ＣＤＣ４２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ社）の抗体で染色した。長期の洗浄後、第２の抗体（Ｓｉｇｍａ社）及び／又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６ファロイジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を、４℃で１時間添加した。その後、細胞をバッファーで再度大規模に洗浄した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｒａｄｉａｎｃｅ ２０００ 共焦点／２光子顕微鏡により画像表示するまで、スライドを冷蔵庫内で保存した。蛍光パターンを確認するために、実験を少なくとも２回繰り返した。

ウェスタンブロット
標準手順に従いウェスタンブロットによって、ＮＥＬＦ−Ａ及びＣＤＣ４２の発現をライセートにおいて評価した。抗ＮＥＬＦ−Ａ（Ａｂｃａｍ社）及び抗ＣＤＣ４２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ社）のポリクローナルな抗体を、それぞれＴＢＳＴ−１％ミルクにおいて１：２０００で、及び、ＴＢＳＴ−５％ＢＳＡにおいて１：１０００で希釈した。内部制御として、抗アクチン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社）のモノクローナルな抗体を使用した。

〔^３Ｈ〕ロイシン取込みアッセイ
１日齢の新生仔マウスＣＭＣを使用して、〔^３Ｈ〕ロイシンの取込みによる蛋白質合成を評価した。２４時間の血清不足の後、１μＣｉ／ｍｌの〔^３Ｈ〕ロイシンの添加に先立ち４８時間、ＣＭＣを、モック、Ａｄ１３３、又はＡｄＤｅｃｏｙに重感染、及び／又は、薬物で処理した。放射能アッセイの前に、細胞を１２時間さらにインキュベートした。

細胞サイズの測定
ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ Ｊ１．３２ｊソフトウェア（http://rsb.info.nih.gov/ij/）を使用して、ＣＭＣの表面積、周囲長、長さ、及び幅を測定した。平均３５０〜４００個のＣＭＣ細胞を、細胞サイズの測定のために無作為に選択した。

ドットブロット
Ｔｒｉｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を使用して、全ＲＮＡを対照及び処理済みの新生仔又は成体のＣＭＣから単離した。ドットブロットのために、精密濾過装置（ＢｉｏＲａｄ社）を使用して、２μｇの変性ＲＮＡを減圧下でナイロン膜（ＢｒｉｇｈｔＳｔａｒ−Ｐｌｕｓ、Ａｍｂｉｏｎ社）に適用した。プレハイブリダイゼーション（５５℃で１時間）及びハイブリダイゼーション（５５℃で一晩）を、１０ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを追加したＵｌｔｒａＨｙｂ ｂｕｆｆｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ社）において行った。〔^３２Ｐ〕ｄＡＴＰでラベルされたｃＤＮＡプローブを、以下のオリゴヌクレオチドの末端ラベリングにより得た。

ＡＮＦ
（５’ＡＡＴＧＴＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＣＧＴＧＡＣＡＣＡＣＣＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＡＧＧＡＴＣＴＴＴＴＧＣＧＡＴＣＴＧＣＴＣＡＡＧ）（ＳＥＱ ＩＤ番号：６）
心臓のアクチン
（５’ＴＧＴＡＣＡＡＴＧＡＣＴＧＡＴＧＡＧＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＧＧＧＧＣＴＣＡＧＡＧＧＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＧＣＡＣＡＡＴＡＣ）（ＳＥＱ ＩＤ番号：７）
骨格のアクチニン
（５’ＴＧＧＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＡＡＴＧＧＣＴＧＧＣＴＴＴＡＡＴＧＣＴＴＣＡＡＧＴＴＴＴＣＣＡＴＴＴＣＣＴＴＴＣＣＡＣＡＧＧＧ）（ＳＥＱ ＩＤ番号：８）
α−ＭＨＣ
（５’ＣＧＡＡＣＧＴＴＡＴＧＴＴＴＡＴＴＧＴＧＴＡＴＴＧＧＣＣＡＣＡＧＣＧＡＡＧＧＧＴＣＴＧＣＴＧＡＧＡＧ）（ＳＥＱ ＩＤ番号：９）
β−ＭＨＣ
（５’−ＧＣＴＴＴＡＴＴＣＴＧＣＴＴＣＣＡＣＣＴＡＡＡＧＧＧＣＴＧＴＴＧＣＡＡＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＴＣＴＧＡＧＧＧＣＴＴＣ）（ＳＥＱ ＩＤ番号：１０）
ＧＡＤＰＨ
（５’ＧＧＡＡＣＡＴＧＴＡＧＡＣＣＡＴＧＴＡＧＴＴＧＡＧＧＴＣＡＡＴＧＡＡＧ）（ＳＥＱ ＩＤ番号：１１）

Ｉｎ ｖｉｖｏでの機能研究
ｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子導入のために、イケダ（Ｉｋｅｄａ）等^３７から修正した方法を使用して、動物をＡｄ１３３又はＡｄＤｅｃｏｙで処理した。Ａｋｔ Ｔｇ又はｗｔマウスを、それぞれＡｄ１３３又はＡｄＤｅｃｏｙの遺伝子導入のために使用した。モック感染を対照において適用した。各群は、１０匹の成体マウスを含んだ。動物を最初に単一容量のケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ ＢＷ）キシラジン（２．５ｍｇ／Ｋｇ ＢＷ）で麻酔し、次に、Ｏ_２中０．５〜２．０％のイソフルランに維持された圧調節呼吸器で挿管及び換気した。小さな左前下の開胸を介して、結紮糸で大動脈及び肺動脈の周りを囲み、オクルダーチューブに突き通した。動脈圧の測定のため、及び、大動脈弁の上に配置されたカテーテルの先端を用いて注入を行うために、右の頸動脈をカニューレ処置した。動物を１９〜２１℃の核心温度までクールダウンさせ、８０〜１００／分の心拍数に達した。肺動脈及び大動脈をふさぎ、特に、（１）ＣＰ液（２ｎｇのサブスタンスＰを追加した、全容積が１００μｌの、１１０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＫＣｌ、１．２ｍＭのＣａＣｌ_２、１６ｎＭのＭｇＣｌ_２、及び、１０ｍＭのＮａＨＣＯ_３）；（２）３ｓ後に、心臓の停止を達成するために、２５ｍＭのＫＣｌ及び２ｎｇのサブスタンスＰを含有したＣＰ液（１００μｌ）；（３）４５秒後に、１０ｍＭのＫＣｌ及び１ｎｇのサブスタンスＰを有したＣＰ液（７５μｌ）中のＡｄベクター（９．２ｘ１０^１０ウイルス粒子）の３つの注入を隣接する大動脈根内に行った。３分後、どちらの係蹄もはずし、ドブタミン（２０μｇ／ｋｇ／分）の大動脈内の注入を開始した。動脈圧が約６５〜７０ｍｍＨｇに達した場合、その動物を電気パッド（４２℃）上に置き、胸を閉じて胸腔内の空気を抜いた。自発呼吸後に動物から抜管し、完全に覚醒するまで念入りに観察した。全てのプロトコールは、カリフォルニア大学のＳａｎ Ｄｉｅｇｏ Ａｎｉｍａｌ Ｓｕｂｊｅｃｔｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより認可された。

標的分析
ルシフェラーゼアッセイ
２９３ＦＴ又はＨｅＬａ細胞（１つのウェルあたり５ｘ１０^４個の細胞）に：（ａ）それぞれ０．０２〜０．８ｍｇのｐＧＬ３−３’ＵＴＲプラスミド、（ｂ）２０ｐｍｏｌの安定性が強化された、ｍｉＲ−１３３ａオリゴヌクレオチドの２１−Ｏ−メチル非標的ＲＮＡ対照（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｉｎｃ．社）、又は（ｃ）Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を形質移入した。形質移入された細胞の割合を評価するために、ＧＦＰ−Ｅｍｄプラスミドも形質移入した。ＦＡＣＳ分析から４８時間後、細胞を溶解し、そのルシフェラーゼ活性をＦｅｍｔｏｍａｓｔｅｒＦＢ １２（Ｚｙｌｕｘ社）を使用することにより測定した。相対的なレポーター活性を、ｐＧＬ３−３’ＵＴＲ対照オリゴヌクレオチドの同時形質移入に対する規準化によって得た。

３’ＵＴＲ ＮＥＬＦ−Ａの変異原性（図１２）
６ヌクレオチドの変異を、ｍｉＲ−１３３と相互作用する２つの「種子」配列に挿入した。修飾した及びＨＰＬＣ精製したオリゴマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を、Ｐｆｕ酵素を用いて行われる増幅に使用し、変異原性を続けた（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）。

統計的分析
統計的及び発生頻度分布分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４．０により行った。２つ又は３つの群間の差を、それぞれスチューデントのｔ−検定又は一元配置ＡＮＯＶＡを用いて比較した。ｐ＜０．０５の値を統計学的に有意であるとみなした。

〔結果〕

ｍｉＲ−１３３及びｍｉＲ−１は、心筋及び骨格筋において選択的に発現される。
ＣＭＣ肥大におけるｍｉＲ遺伝子のあり得る役割を調査するために、生理的条件及び病理学上の条件双方の下、ヒト及びマウス由来の胎性及び成体の心臓におけるｍｉＲの発現プロファイルを評価した。１６１のヒト及び８４のマウス前駆体ｍｉＲから生じた、遺伝子特異的な４０塩基長のオリゴヌクレオチドプローブを含有したマイクロアレイチップ^８、１８を使用することによって分析を行った。２種類のｍｉＲ、ｍｉＲ−１３３及びｍｉＲ−１は、肥大性の心臓において著しく減少した。マイクロアレイチップ及びノーザンブロット分析により、ｍｉＲ−１３３もｍｉＲ−１も、ヒト胚性及び成体の組織由来の心筋及び骨格筋において特異的に発現されることが明らかになった（図９ａ、ｂ）。マイクロチップ分析により示されているように、ｍｉＲ−１３３はマウスの心筋及び骨格筋組織においても発現され、ｍｉＲ−１３３発現は、Ｅ１２日から少なくともＥ１７日までマウス胚の発生において増加される（図９ｄ）。これは、ｍｉＲ−１３３が、他の細胞からは実質的に欠けていたけれども、胚性の心筋及び骨格筋において選択的に発現されると実証したインサイツハイブリダイゼーションにより確証した（図９ｄ右）。

ｍｉＲ−１３３及びｍｉＲ−１のレベルは、心肥大に対して逆相関している。
ｍｉＲ−１３３及びｍｉＲ−１の発現が心肥大中に調節されるかどうかを決定するために、２つのマウスモデル：（ａ）大動脈アーチが収縮した（ＴＡＣ）マウス、及び（ｂ）Ａｋｔ活性変異体が選択的に心臓で過剰発現したＴｇマウス^１９を分析した（表１の血行動態データを参照）。第１のモデルでは、多数のシグナル伝達経路が圧力過負荷により同時に誘発され、ＣＭＣ肥大を引き起こす^２０。第２のモデルでは、肥大は、ｍＲＮＡ翻訳及び遺伝子発現に対するＡｋｔの下流作用により媒介される^２１。ＴＡＣの１週間後、心臓の重さを量り、左心室、右心室、及び心房に分けた。偽手術された非遺伝子組み換えの同腹子対照を含んだ。ＴＡＣで処理したマウスでは、予測されたように、心筋肥大が、増加した心臓胎児遺伝子（ＡＮＦ、ＳｋＡ、及びβ−ＭＨＣ）の発現と付随した（結果は示されていない）。ノーザンブロット分析により示されているように、ＴＡＣ処理した心臓においてもＡｋｔ過剰発現の心臓においても心肥大は、ｍｉＲ−１３３の発現レベルもｍｉＲ−１の発現レベルも減少した（図１ａ、ｂ；表２も参照）。その減少は、特に、左心室（どちらのモデルも２分の１）において、及び、心房（ＴＡＣ肥大では２分の１、さらに、ＡｋｔＴｇマウスでは３〜４分の１）において顕著であった。右心室では、減少はＴＡＣモデルにおいて観察されず、右心室の肥大に結びつけられなかったけれども、ｍｉＲ−１３３発現もｍｉＲ−１発現もＡｋｔＴｇマウスにおいては有意に減少した（表２）。概して、これらのｉｎ ｖｉｖｏモデル由来のデータは、ｍｉＲ−１３３及びｍｉＲ−１の発現と心筋肥大との逆相関を示している。

ｍｉＲ−１３３の過剰発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで心肥大を阻止する。
これらの観察の機能的意義を評価するために、ＣＭＣ肥大のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおけるｍｉＲ−１３３過剰発現の作用を検査した。新生仔マウスのＣＭＣを、成熟ｍｉＲ内に処理されるマウスｍｉＲ−１３３ａ−２前駆体配列（Ａｄ１３３）由来の６８３ｂｐから成る発現カセットを含有したアデノウイルスベクターに感染させた（図２ａ）。ｉｎ ｖｉｖｏでの肥大のモデルとしてｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＭＣ肥大を誘発するために、フェニレフリン（ＰＥ）又はエンドセリン１（ＥＴ）処理を用いた^１７（図２）。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのアゴニスト誘発性の肥大における明確に区別できる特徴は：（ｉ）増加した細胞サイズ、（ｉｉ）^３〔Ｈ〕ロイシン取込みにより測定された、増加した蛋白質合成、（ｉｉｉ）ＡＮＦ、ＳｋＡ及びβ−ミオシン重鎖を含めた胎児遺伝子の上方調節、（ｉｖ）アクトミオシン鎖の再構成及び後の細胞骨格の再構築、並びに（ｖ）ＡＮＦ蛋白質における核周囲の局在化である。ＰＥ及びＥＴにより誘発されたこれらの作用全てを、Ａｄ１３３を用いたＣＭＣ感染により妨ぎ（図２）、その結果、ｍｉＲ−１３３はＣＭＣ肥大の基礎をなす分子機構を制御すると示した。

「デコイ」配列による内在性のｍｉＲ−１３３の抑制が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで心肥大を誘発する。
内在性のｍｉＲ−１３３発現の阻止における機能的影響を分析するために、マウスｍｉＲ−１３３ａに相補的なタンデム「デコイ」配列と３’ＵＴＲで連結したＥＧＦＰレポーター遺伝子から成る発現カセットを有するＡｄベクターを構築した（ＡｄＤｅｃｏｙ、図１０上を参照）。類似のアプローチが、造血細胞において最近報告された^２２。新生仔マウスＣＭＣのＡｄＤｅｃｏｙ感染は、無刺激の細胞と比較して、ＰＥ誘発性の肥大におけるＥＧＦＰ発現の著しい増加を明らかにした。この結果は、ｍｉＲ−１３３発現の減少がデコイ配列に対するその結合を防ぎ、従って、ＥＧＦＰ ｍＲＮＡが翻訳されるのを可能にすると示している（図１０下）。次に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの機能アッセイを行った。新生仔マウスＣＭＣのＡｄＤｅｃｏｙ感染は、ｍｉＲ−１３３のレベルを完全に抑制する一方で、^３〔Ｈ〕ロイシン取込み及び胎児の遺伝子発現に基づき劇的な肥大を引き起こした（図３）。著しく、前記感染は^３〔Ｈ〕ロイシンの増加を誘発し、該増加は、ＰＥにより誘発されたものよりも有意に多かった（図３ａ）。さらに、胚性のストレス遺伝子及びＡＮＦの核周囲の局在化、並びに細胞サイズパラメータも、ＡｄＤｅｃｏｙにより著しく増加した（図３ｂ、ｃ、データは示されていない）。

最後に、上記の結果が、類似しているが異なるモデルシステムにおいて再現することができるかどうか決定するために、成体マウスＣＭＣをＡｄＤｅｃｏｙ又はＡｄ１３３に感染させた。新生仔のＣＭＣ実験と一致して、ｍｉＲ−１３３過剰発現は反対の作用を及ぼしたけれども、デコイ配列を用いた内在性のｍｉＲ−１３３の抑制は成体ＣＭＣサイズを大きくした（図１１）。

概して、これらの結果により、ｍｉＲ−１３３は心肥大において中心的役割を果たすことが示されている。特に、ｍｉＲ−１３３の発現低下及び肥大は量的に関係している。実際、ＡｄＤｅｃｏｙは全ｍｉＲ抑制及びより明白な肥大を誘発するけれども、アゴニスト処理は、肥大に結びつけられるｍｉＲ発現の減少を引き起こした。

ｍｉＲ−１３３及びｍｉＲ−１はｉｎ ｖｉｖｏで心肥大を調節する。
本発明者等によるｉｎ ｖｉｔｒｏデータは、ｍｉＲ−１３３が心肥大の有力なモジュレーターであると強く示唆している。肥大に対するｍｉＲ−１３３の作用をｉｎ ｖｉｖｏで決定するために、成体マウスの心筋への冠動脈遺伝子の送達に基づき、一連の実験を行った^２３。特に、ＡｄＤｅｃｏｙをｗｔマウスに、及び、Ａｄ１３３をＡｋｔＴｇ動物に送達した。

ＡｄＤｅｃｏｙに感染したｗｔマウスの心筋を、遺伝子導入の１４日後に評価した（図４ａ）。単離した左心室ＣＭＣの分析は、モック対照の値と比較して、細胞サイズの有意な増加を明らかにした（平均±ＳＤ ＡＵ値、各０．１３９±０．００３対０．０９４±０．００５、Ｐ＜０．００１）（上のパネル）。この研究成果を、心肥大のマーカーの上方制御によりさらに支持した（下のパネル）。特に、左心室ＣＭＣのうち４０％までのみを感染させ（ＧＦＰ発現に基づき対照群において評価した、データは示されていない）、ｍｉＲ−１３３レベルは穏やかに減少した（０．６９±０．０４倍、データは示されていない）。これらの研究成果を考慮すると、ＡｄＤｅｃｏｙの作用は特に著しい。興味深いことに、ｍｉＲ−１発現も減少し（０．８１±０．０７、示されていない）、前記２つのｍｉＲ間の関連を示唆している。

ｍｉＲ−１３３の過剰発現はｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＭＣ肥大を阻止するため、心肥大に対するＡｄ１３３感染の作用をＡｋｔＴｇマウスにおいて検査した（図４ｂ）。Ａｄ１３３感染の１４日後、骨格のα−アクチンを除いて胚性遺伝子の発現において有意な減少を誘発したけれども（下のパネル）、ｍｉＲ−１３３の過剰発現は左心室ＣＭＣの細胞サイズを減少させた（モック対Ａｄ１３３感染したマウスにおいて、それぞれ０．４８５±０．０１９及び０．３３３±０．００７ＡＵ、Ｐ＜０．０５）（上のパネル）。

概して、これら２つのモデルにおいて得た結果は互いを捕捉して強化し、本発明者等によるｉｎ ｖｉｔｒｏでの機能研究と一致して、ｍｉＲ−１３３はｉｎ ｖｉｖｏで心肥大の重要なモジュレーターであると示している。

次に、デコイ配列の過剰発現を介したｍｉＲ−１３３阻止の作用をｉｎ ｖｉｖｏで決定することを目標とした別の一連の実験を行った。ｍｉＲ−１３３又はそのデコイの発現がテトラサイクリン誘発性の（Ｔｅｔ）オペロンにより駆動されるコンストラクトを作製した。Ｔｅｔオペロン、最小ＣＭＶプロモーター、ｍｉＲ−１３３又はデコイ配列、及び、終止配列−ＰｏｌｙＡを含有したＤＮＡ断片を使用して遺伝子導入マウスを作製した。親切にもＤｒ．Ｗｏｌｆｇａｎｇ Ｄｉｌｌｍａｎｎの研究室（ＵＣＳＤ）によって提供された心臓特異的α−ミオシン重鎖（α−ＭＨＣ）下で、リバーステトラサイクリン応答性転写活性化因子ｒｔＴＡを発現するマウスと創始者（Ｆ０）を交雑させた。

デコイ−１３３オペロンもｒｔＴＡも陽性であるＦ１動物において、通常のストレスのない条件下でデコイｍｉＲ−１３３を誘発し、心肥大の主要な心エコーパラメータ及び形態計測パラメータを調べた。データは、２種類の主要な心肥大の心エコーパラメータである、左心室拡張期／収縮期の後壁厚（ＬＶＰＷｄ、ＬＶｐＷｓ）及び心室中隔厚（ＩＶｓｄ）の有意な増加を示している（図５）。屠殺後に得た重量測定パラメータである、体重に対する左心室重量（ＬＶ／ＢＷ）の比も、ｍｉＲ−１３３デコイのテトラサイクリン誘発後に有意に増加した（図５）。ｍｉＲ−１３３に加えて、ｍｉＲ−１も心肥大に関与しているかどうかｉｎ ｖｉｖｏで決定するために、ｍｉＲ−１に対抗するアンタゴｍｉＲと命名された３’−コレステロール結合ｍｉＲ−１アンチセンス分子^３３を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏでの実験を行った。塩基全てを２’−ＯＭｅ修飾した。ｍｉＲ−１に相補的なアンタゴｍｉＲ配列は：
５’−Ｐ−ＵＡＣＡＵＡＣＵＵＣＵＵＵＡＣＡＵＵＣＣＡ−コレステロール３’
である。このヌクレオチド部分は（ＳＥＱ ＩＤ番号：１２）である。

アンタゴｍｉＲオリゴヌクレオチドを脱保護及び脱塩し、さらに、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）により精製した。Ｃ５７ＢＬ／６雌マウス（８週齢）に、Ａｌｚｅｔ浸透圧ミニポンプ（モデル１００３Ｄ、Ａｌｚａ社）を介して８０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量でアンタゴｍｉＲを受けさせた。ミニポンプを調製し、３７１Ｃの無菌の０．９％生理食塩水で満たされたペトリ皿内に、移入前に少なくとも４時間配置して、薬物の連続送達のためにポンプを刺激した。対照には生理食塩水のミニポンプを受けさせた。

心エコー及び形態計測分析を、アンタゴｍｉＲ−１で処理したマウス及び生理食塩水の対照群に対して行った（図６）。処理の３０日後に行った分析により、ＬＶＰＷｓ及びＩＶｓ等の収縮期機能のパラメータの増加と共に、ＩＶＳｄ厚及びＬＶ／ＢＷ比の有意な増加が明らかになった。

ＮＥＬＦ−Ａ及びＣＤＣ４２は、ｍｉＲ−１３３の重要な標的である。
観察した肥大−調節処理に関与する１又は複数のあり得るｍｉＲ標的を同定するために、ソフトウェアプログラムＴａｒｇｅｔＳｃａｎ（http://genes.mit.edu/targetscan/）^１、ｍｉＲａｎｄａ（http://www.microrna.org/）^２４、及び、ＰｉｃＴａｒ（http://pictar.bio.nyu.edu/）^２５を使用して、推測上の１又は複数のｍｉＲ標的を捜した。興味深いことに、その分析は心臓の発生及び肥大に関連した多様なｍｉＲ−１３３標的遺伝子を示唆した。ｍＲＮＡ３’ＵＴＲ領域が基準の「種子」配列及びｍｉＲ−１３３にマッチするフランキングヌクレオチドを含むＮＥＬＦ−Ａ／ＷＨＳＣ２並びにＣＤＣ４２に焦点をおいた（図７及び８、下のパネル）。ＲＮＡポリメラーゼＩＩと相互作用してその機能を負に制御する核分子であるＮＥＬＦ−Ａ^２６は、多数の異常の中で心臓の形成不全により特徴づけられるウォルフ・ヒルシュホーン症候群に結びつけられる^２７。ＣＤＣ４２は、心肥大中に細胞骨格及び筋原繊維の再構築に関与する、低分子量ＧＴＰ結合蛋白質のＲｈｏサブファミリー（ＲｈｏＡ、Ｒａｃ１、及びＣＤＣ４２）のメンバーである^２８。単離されたネズミＣＭＣにおいて、活性化された、ＣＤＣ４２を含めた低分子量ＧＴＰ結合蛋白質の過剰発現は、種々の肥大の特徴を誘発する^２９。

いくつかの証拠が、ＮＥＬＦ−Ａ及びＣＤＣ４２は心肥大においてｍｉＲ−１３３により制御されると示している。特に、（ａ）ＴＡＣ処理したマウス及びＡｋｔＴｇマウスにおいて、ｍｉＲ−１３３発現レベルは前記２種類の蛋白質の量に対し逆相関している（図７ａ、８ａ；図２も参照）。さらに、（ｂ）新生仔ＣＭＣにおいても成体ＣＭＣにおいても、ｍＲＮＡレベルは無修飾であるけれども、ＡｄＤｅｃｏｙ又はＡｄ１３３の感染によるｍｉＲ−１３３の過剰発現又は発現低下は、それぞれ前記２種類の蛋白質の増加又は著しい発現低下を引き起こしている（図７ｂ、ｃ、図８ｂ、ｃ）。

これらのデータは、ＮＥＬＦ−Ａ及びＣＤＣ４２のｍＲＮＡがＣＭＣにおいてｍｉＲ−１３３により標的にされることを示唆している。この仮説をテストするために、ｍｉＲ−１３３陰性２９３ＦＴ及びＨｅＬａ細胞株においてルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。ホタルルシフェラーゼ遺伝子の下流に挿入された３’ＵＴＲ領域に、ｍｉＲ−１３３又は対照非標的ｍｉＲを同時導入した。図７ｄ及び８ｄに示されているように、ＮＥＬＦ−Ａ及びＣＤＣ４２の野生型ＵＴＲを用いたｍｉＲ−１３３の形質移入は、ルシフェラーゼ活性の有意な減少を誘発した。これとは対照的に、ＮＥＬＦ−Ａ又はＣＤＣ４２ＵＴＲへの対照非標的ｍｉＲの同時導入はこの抑制を無効にし、従って、ｍｉＲ−１３３−ＵＴＲ相互作用の特異性を示した。ＮＥＬＦ−Ａ３’ＵＴＲは２種類の「種子」標的配列を含むため（図７ｄ）、種子配列において６ヌクレオチドの置換をそれぞれ含む２種類の変異したＵＴＲも検査した（図１１）。これらの変異はルシフェラーゼ活性の抑制を無効にし、どちらの種子配列もｍｉＲ−１３３誘発性翻訳の抑制を媒介することが必要であると示した。少なくとも４つの種子標的部位が、ＣＤＣ４２の長い（１．４Ｋｂ）３’ＵＴＲに存在する（２つの「ハイスコア」部位が図８ｄに示されている）。

参考文献

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Claims (16)

1. ＳＥＱ ＩＤ番号１若しくはＳＥＱ ＩＤ番号２、又は、その変異体若しくは異型のうち全て又は実質的な部分を含むＲＮＡの、心疾患の治療又は予防に対する薬物の製造における使用。
2. 前記ＲＮＡがＮＥＬＦ−Ａ及びＣＤＣ−４２のｍＲＮＡに結合することができる、請求項１に記載の使用。
3. 前記ＲＮＡが、配列の点でＳＥＱ ＩＤ番号１又はＳＥＱ ＩＤ番号２の配列とは５０％以下まで異なり、依然としてｉｎ ｖｉｖｏでＣＤＣ−４２ｍＲＮＡに結合することができる、請求項１又は２に記載の使用。
4. 前記配列の変異が、４０％以下、好ましくは３０％以下、より好ましくは２０％以下である、請求項３に記載の使用。
5. 前記ＲＮＡがＳＥＱ ＩＤ番号１の配列を含む、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の使用。
6. 前記ＲＮＡがＳＥＱ ＩＤ番号２の配列を含む、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の使用。
7. 前記ＲＮＡが１５０ヌクレオチド以下である、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の使用。
8. 前記ＲＮＡが一次転写物の形状で提供される、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の使用。
9. 前記ＲＮＡがＳＥＱ ＩＤ番号１から成る、請求項５に記載の使用。
10. 前記ＲＮＡがＳＥＱ ＩＤ番号２から成る、請求項６に記載の使用。
11. 前記薬物が、前記ＲＮＡをＣＭＣ内に導入するのに適したベクターを含む、請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の使用。
12. 前記薬物が、規定のＲＮＡをコードする核酸配列を含有したベクターを含み、該ベクターが、前記コードする核酸配列を用いてＣＭＣを形質転換するのに適している、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の使用。
13. 前記核酸配列がＤＮＡである、請求項１２に記載の使用。
14. 前記核酸配列がＲＮＡである、請求項１２に記載の使用。
15. ＳＥＱ ＩＤ番号１の変異体又は異型。
16. ＳＥＱ ＩＤ番号２の変異体又は異型。

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