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JP2009236610A - Skin wrinkle evaluation method - Google Patents

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JP2009236610A JP2008081503A JP2008081503A JP2009236610A JP 2009236610 A JP2009236610 A JP 2009236610A JP 2008081503 A JP2008081503 A JP 2008081503A JP 2008081503 A JP2008081503 A JP 2008081503A JP 2009236610 A JP2009236610 A JP 2009236610A
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for non-invasively and quantitatively evaluating a state of wrinkles on a skin owing to a change in the interior of the skin such as a corium layer, etc. <P>SOLUTION: The state of wrinkles on the skin is evaluated based on the orientation of collagen in the interior of the skin. Extra-short pulse light is applied preferably to the interior of the skin to detect second harmonic generation light (SHG light) generated. Measurement of the orientation of collagen in the interior of the skin is performed based on a detection result thereof. <P>COPYRIGHT: (C)2010,JPO&INPIT

Description

本発明は皮膚しわの状態を評価する方法に関する。具体的には、真皮層等の皮膚内部の変化から生じる皮膚のしわの状態を、非侵襲的且つ定量的に評価する方法に関する。   The present invention relates to a method for evaluating the condition of skin wrinkles. Specifically, the present invention relates to a method for non-invasively and quantitatively evaluating the state of skin wrinkles resulting from changes in the skin such as the dermis layer.

加齢に伴う皮膚老化現象の1つとしてしわの増加が挙げられるが、美容等の観点から、特に女性においてしわの防止及び改善に対する関心が非常に高まっている。顔など美容的に最も関心の高い部位は日光に曝されている部位であるため、そのような日光露光部で皮膚が伸縮する部位に生じる目尻などのしわについては、ヒトでそのグレードを評価する基準や、動物モデルによる評価モデルが確立されている。しかし、しわ発生のメカニズムの詳細については未だ明らかでない点が多く、しわ形成に密接に関わるパラメーターを定量的に評価する方法も存在していなかった。   One of the skin aging phenomena associated with aging is an increase in wrinkles. From the viewpoint of beauty and the like, there is a great interest in preventing and improving wrinkles, particularly in women. Since the most cosmetically interested parts such as the face are exposed to sunlight, the grades of wrinkles such as the corners of the eyes where the skin expands and contracts in such sun exposure parts are evaluated by humans. Standards and evaluation models based on animal models have been established. However, the details of the mechanism of wrinkle generation have not yet been clarified, and there has been no method for quantitatively evaluating parameters closely related to wrinkle formation.

従来、非侵襲的に皮膚状態を定量する方法としては、皮膚粘弾性、角質水分量、経皮水分蒸散量(TEWL)などを測定する方法が用いられてきた。しかし、何れの測定方法も原理的に皮膚表面(最外層)から測定を行なうため、皮膚表面の状態が定量値に大きく影響してしまう。このため、日光に曝されている部位に生じるしわのように、真皮層等の皮膚内部の変化から生じるしわについて、しわの状態を反映した定量的なパラメーターを皮膚内部から非侵襲的且つ直接的に得ることは困難であった。また、近年、超音波エコーのような臨床診断装置や共焦点レーザー生体顕微鏡、皮膚光コヒーレンス断層撮影装置(OCT)など、生体の内部構造を画像として観察可能な手段が開発されているが、何れもコラーゲン情報のみを抽出して詳細に評価することは困難であった。
一方、しわ形成には、真皮状態が大きく関与すると考えられるが、真皮状態を非侵襲的に測定する方法として、近年、SHG光(第2高調波発生光)が着目されている。これは、超短パルス光(例えばフェムト秒オーダー)を生体組織に照射すると、コラーゲン分子が特異的に有する非線形光学特性によって、照射したレーザー光の一部が波長変換され、照射レーザーの半波長の光が発生することを応用した技術である。(非特許文献4)。
SHG光を用いた生体におけるコラーゲンの構造観察が提案されており、皮膚科学的な診断に有用である(非特許文献5)。また、コラーゲンゲルなどのインビトロでの三次元培養においても、SHG光を用いたコラーゲンの構造観察の検討がなされている(非特許文献6)。特許文献1には、コラーゲンゲル培養により得られる培養組織試料に入射光として超短パルス光を照射し、発生したSHG光を検出することにより、培養組織試料の成育程度を評価することが記載されている。更に、非特許文献7では、SHG光発生効率の入射レーザー偏光依存性を利用すると、コラーゲンの配向を解析することができることが報告されている。
しかしながら、今までコラーゲンの配向と、しわとの関連性について評価した報告は存在しておらず、SHG光の偏光特性で測定したコラーゲンの配向でしわ状態を評価する技術については存在していなかった。
Conventionally, as a method for non-invasively quantifying the skin state, a method of measuring skin viscoelasticity, keratin moisture, transdermal moisture transpiration (TEWL), or the like has been used. However, since any measurement method is performed in principle from the skin surface (outermost layer), the state of the skin surface greatly affects the quantitative value. For this reason, for wrinkles caused by changes in the skin, such as the dermis layer, such as wrinkles that are exposed to sunlight, quantitative parameters that reflect the state of wrinkles can be determined non-invasively and directly from within the skin. It was difficult to get to. In recent years, means capable of observing the internal structure of a living body as an image such as a clinical diagnostic apparatus such as an ultrasound echo, a confocal laser scanning microscope, and a skin light coherence tomography apparatus (OCT) have been developed. It was difficult to extract only collagen information and evaluate it in detail.
On the other hand, it is considered that the dermis state is greatly involved in wrinkle formation. However, in recent years, SHG light (second harmonic generation light) has attracted attention as a method for noninvasively measuring the dermis state. This is because when a living tissue is irradiated with ultra-short pulse light (eg, femtosecond order), a portion of the irradiated laser light is wavelength-converted due to the nonlinear optical properties that the collagen molecules specifically have, and the half-wavelength of the irradiated laser This technology applies the generation of light. (Non-Patent Document 4).
Structure observation of collagen in a living body using SHG light has been proposed and is useful for dermatological diagnosis (Non-Patent Document 5). In addition, in three-dimensional culture in vitro such as collagen gel, investigation of the structure of collagen using SHG light has been studied (Non-patent Document 6). Patent Document 1 describes that the degree of growth of a cultured tissue sample is evaluated by irradiating a cultured tissue sample obtained by collagen gel culture with ultrashort pulse light as incident light and detecting the generated SHG light. ing. Furthermore, Non-Patent Document 7 reports that the orientation of collagen can be analyzed using the incident laser polarization dependency of SHG light generation efficiency.
However, there has been no report evaluating the relationship between collagen orientation and wrinkles until now, and there has been no technology for evaluating the wrinkle state based on collagen orientation measured by the polarization characteristics of SHG light. .

「皮膚の抗老化最前線」、(株)エヌ・ティー・エス発行、2006年7月"Forefront of skin anti-aging", published by NTS, July 2006 「皮膚の測定・評価マニュアル集」、技術情報協会発行、2003年11月"Skin Measurement / Evaluation Manual Collection", Technical Information Association, November 2003 「現場レベルでの皮膚測定・評価 〜トラブル事例・対策〜」、サイエンス&テクノロジー株式会社発行、2007年2月"Skin measurement and evaluation at the field level-trouble cases and countermeasures", published by Science & Technology Co., Ltd., February 2007 Roth S. et al., Biopolymers. 1981;20(6):1271-90Roth S. et al., Biopolymers. 1981; 20 (6): 1271-90 Lin SJ. et al., Eur J Dermatol. 2007 Sep-Oct;17(5):361-6. ReviewLin SJ. Et al., Eur J Dermatol. 2007 Sep-Oct; 17 (5): 361-6. Review Zoumi A. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Aug 20;99(17):11014-9Zoumi A. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Aug 20; 99 (17): 11014-9 Yasui T. et al., J Biomed Opt. 2004 Mar-Apr;9(2):259-64Yasui T. et al., J Biomed Opt. 2004 Mar-Apr; 9 (2): 259-64 特開2007-49990号公報JP 2007-49990 A

本発明は、真皮層等の皮膚内部の変化に起因する皮膚のしわの状態を、非侵襲的且つ定量的に評価する方法を提供することを目的とする。   An object of the present invention is to provide a method for non-invasively and quantitatively evaluating the state of wrinkles in the skin caused by changes in the skin such as the dermis layer.

本発明者等は、皮膚の表面に観察される、皮膚の伸縮、光老化、又はその複合要因(UV等の露光部における皮膚の伸縮)等の皮膚内部の変化によって生じるしわと、その奥の皮膚内部、特に真皮層におけるコラーゲンの配向とが、密接に関連していることを初めて明らかにした。   The present inventors have observed that wrinkles caused by changes in the skin, such as skin expansion and contraction, photoaging, or complex factors (skin expansion and contraction in exposed areas such as UV) observed on the surface of the skin, It was revealed for the first time that the orientation of collagen in the skin, particularly in the dermis layer, is closely related.

真皮層のコラーゲンの観察には、コラーゲン線維構造を非侵襲的かつ選択的に計測可能なSHG光(第2高調波発生光)顕微鏡を用いる。これは、超短パルス光(例えばフェムト秒オーダー)を生体組織に照射すると、コラーゲン分子が特異的に有する非線形光学特性によって、照射したレーザー光の一部が波長変換され、照射レーザーの半波長の光が発生することを応用した技術である。   For the observation of collagen in the dermis layer, an SHG (second harmonic generation light) microscope capable of noninvasively and selectively measuring the collagen fiber structure is used. This is because when a living tissue is irradiated with ultra-short pulse light (for example, femtosecond order), a portion of the irradiated laser light is wavelength-converted due to the nonlinear optical characteristics that the collagen molecules specifically have, and the half wavelength of the irradiated laser This technology applies the generation of light.

このSHG光発生効率の入射レーザー偏光依存性を利用して、皮膚表面におけるしわの存在と、皮膚内部におけるコラーゲンの配向との関係について解析したところ、これらが相関を有していることを見出した。本発明者等はこの技術を応用して、皮膚内部におけるコラーゲンの配向度合いによって皮膚のしわを評価する方法を新たに確立し、本発明を完成させた。   Using the dependence of the SHG light generation efficiency on the incident laser polarization, the relationship between the presence of wrinkles on the skin surface and the orientation of collagen inside the skin was found to be correlated. . The present inventors have applied this technique to newly establish a method for evaluating skin wrinkles based on the degree of collagen orientation in the skin, thereby completing the present invention.

即ち、本発明の主旨は、皮膚内部のコラーゲンの配向に基づいて、皮膚におけるしわの状態を評価する工程を含んでなる、皮膚しわの評価方法に存する(請求項1)。
ここで、皮膚内部のコラーゲンの配向は、真皮層のコラーゲンの配向であることが好ましい(請求項2)。
また、皮膚におけるしわの状態が、皮膚の伸縮によって生じるしわの形成であることが好ましく(請求項3)、また、光老化によって生じるしわの形成であることも好ましい(請求項4)。
また、前記評価が、皮膚内部のコラーゲンの配向状態に基づく、皮膚にしわが形成される可能性及び/又はその方向の予測であることも好ましい(請求項5)。
更に、本発明の評価方法は、皮膚内部に超短パルス光を照射し、発生した第2高調波発生光(SHG光)を検出し、その検出結果に基づいて皮膚内部のコラーゲンの配向を測定する工程を更に含んでなることが好ましい(請求項6)。
ここで、検出されたSHG光の偏光異方性に基づいて皮膚内部のコラーゲンの配向を測定することが好ましい(請求項7)。
また、超短パルス光がフェムト秒モード同期レーザー光であることが好ましい(請求項8)。
また、超短パルス光が、クロム・フォルステライトレーザー光、チタン・サファイアレーザー光、ファイバーレーザー光、又はネオジウム・ガラスレーザー光であることが好ましい(請求項9)。
That is, the gist of the present invention resides in a method for evaluating skin wrinkles, comprising a step of evaluating the state of wrinkles in the skin based on the orientation of collagen in the skin (claim 1).
Here, the orientation of the collagen inside the skin is preferably the orientation of the collagen in the dermis layer.
In addition, the wrinkle state in the skin is preferably wrinkle formation caused by stretching and contracting of the skin (Claim 3), and it is also preferably wrinkle formation caused by photoaging (Claim 4).
In addition, it is also preferable that the evaluation is a prediction of the possibility and / or direction of wrinkle formation on the skin based on the orientation state of collagen in the skin (Claim 5).
Further, the evaluation method of the present invention irradiates the inside of the skin with ultrashort pulse light, detects the generated second harmonic generation light (SHG light), and measures the orientation of collagen inside the skin based on the detection result. It is preferable that the method further comprises a step of (Claim 6).
Here, it is preferable to measure the orientation of collagen in the skin based on the polarization anisotropy of the detected SHG light.
The ultrashort pulse light is preferably femtosecond mode-locked laser light.
Further, it is preferable that the ultrashort pulse light is a chrome forsterite laser light, a titanium / sapphire laser light, a fiber laser light, or a neodymium glass laser light.

本発明の評価方法によれば、真皮層等の皮膚内部におけるコラーゲンの配向を、皮膚のしわを評価するためのパラメーターとして用いることにより、皮膚の伸縮、光老化、又はその複合要因(UV等の露光部における皮膚の伸縮)等、皮膚内部の変化によって生じるしわの状態を、非侵襲的且つ定量的に評価することが可能である。   According to the evaluation method of the present invention, by using the orientation of collagen in the skin such as the dermis layer as a parameter for evaluating the wrinkle of the skin, it is possible to expand / contract the skin, photoaging, or a complex factor thereof (such as UV). It is possible to non-invasively and quantitatively evaluate the state of wrinkles caused by changes in the skin, such as the expansion and contraction of the skin in the exposed area.

また、皮膚内部に超短パルス光を照射して発生したSHG光の検出結果を用いることにより、皮膚内部のコラーゲンの配向を非侵襲的且つ直接的に評価することが可能である。   Further, by using the detection result of SHG light generated by irradiating the inside of the skin with ultrashort pulse light, it is possible to noninvasively and directly evaluate the orientation of collagen inside the skin.

次に、具体的な実施の形態を挙げて、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施の態様に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない限りにおいて、任意の変更を加えて実施することが可能である。   Next, the present invention will be described in detail with specific embodiments. However, the present invention is not limited to these embodiments, and any changes can be made without departing from the gist thereof. In addition, it can be implemented.

本発明に係る皮膚しわの評価方法(適宜「本発明の評価方法」という。)は、皮膚内部のコラーゲンの配向に基づいて、皮膚におけるしわの状態を評価する工程を含んでなる。
ここで「皮膚内部のコラーゲンの配向」は、好ましくは真皮層のコラーゲンの配向である。真皮層の約70%を占めるコラーゲン線維(真皮コラーゲン線維)は、皮膚の形態や機械的特性(張りや弾性等)を決定する上で重要な役割を果たしており、老化により生じる皮膚のしわの形成や状態に深く関与していると考えられる。
本発明者等は、後述の実施例で示すように、皮膚の伸縮、光老化、又はその複合要因(UV等の露光部における皮膚の伸縮)等の皮膚内部の変化によって生じたしわを有する皮膚では、皮膚のしわに沿って皮膚内部のコラーゲンが配向していることを見出した。この知見を基に、本発明の評価方法では、皮膚内部のコラーゲンの配向の有無及び/又はその方向を測定し、その測定結果に基づいて、皮膚におけるしわの様々な状態の評価を行なう。
具体的に、好適な態様によれば、皮膚におけるしわの状態として、皮膚の伸縮、光老化、又はその複合要因(UV等の露光部における皮膚の伸縮)等の皮膚内部の変化によるしわの形成を評価することができる。即ち、皮膚内部のコラーゲンが皮膚のしわに沿って配向している場合、そのしわが皮膚の伸縮、光老化、又はその複合要因(UV等の露光部における皮膚の伸縮)等の皮膚内部の変化に起因するしわであると判定することができる。
また、別の好適な態様によれば、皮膚内部のコラーゲンの配向状態に基づいて、皮膚にしわが形成される可能性及び/又は方向を予測することもできる。即ち、皮膚にしわが殆ど(或いは全く)存在しない場合でも、皮膚内部においてコラーゲンが一定の方向に配向している場合には、皮膚に今後しわが形成される可能性が高いと判断することができる。また、そのしわの方向は、コラーゲンの配向方向と平行であると予測することができる。
The method for evaluating skin wrinkles according to the present invention (referred to as “the evaluation method of the present invention” as appropriate) includes a step of evaluating the state of wrinkles in the skin based on the orientation of collagen in the skin.
Here, “the orientation of collagen in the skin” is preferably the orientation of collagen in the dermis layer. Collagen fibers (dermis collagen fibers) occupying about 70% of the dermis layer play an important role in determining skin morphology and mechanical properties (such as tension and elasticity), and the formation of skin wrinkles caused by aging It is thought to be deeply involved in the state.
As shown in the examples described later, the present inventors have skin with wrinkles caused by changes in the skin such as skin stretching, photoaging, or complex factors thereof (skin stretching in exposed areas such as UV). Then, it discovered that the collagen inside the skin was orientating along the wrinkle of skin. Based on this knowledge, in the evaluation method of the present invention, the presence / absence and / or direction of collagen in the skin is measured, and various states of wrinkles in the skin are evaluated based on the measurement result.
Specifically, according to a preferred embodiment, wrinkle formation in the skin is caused by changes in the skin such as skin expansion and contraction, photoaging, or complex factors thereof (skin expansion and contraction in exposed areas such as UV). Can be evaluated. That is, when the collagen inside the skin is oriented along the skin wrinkles, the wrinkles are changes in the skin, such as skin expansion and contraction, photoaging, or complex factors (skin expansion and contraction in exposed areas such as UV). It can be determined that the wrinkle is caused by the wrinkles.
Moreover, according to another suitable aspect, possibility and / or direction that a skin is wrinkled can also be estimated based on the orientation state of collagen inside the skin. That is, even when there is little (or no) wrinkle in the skin, it can be determined that there is a high possibility that wrinkles will be formed in the skin if the collagen is oriented in a certain direction inside the skin. . Moreover, the direction of the wrinkle can be predicted to be parallel to the orientation direction of collagen.

皮膚内部におけるコラーゲンの配向を定量的に測定する手法としては、制限されるものではないが、以下に説明するような、第2高調波発生光(SHG(Second Harmonic Generation)光)の検出に基づく手法が挙げられる。
即ち、好適な態様によれば、本発明の評価方法は、皮膚内部に超短パルス光を照射し、発生したSHG光を検出し、その検出結果に基づいて皮膚内部のコラーゲンの配向を測定する工程を更に含んでなる。
SHG光とは、ピークパワーの高い超短パルス光が非中心対象性物質に照射されることによって発生する二次の非線形光学応答であり、通常の反射や散乱等の線形光学応答では、周波数(ω)が変化しないのに対して、SHG光は、周波数が入射光の2倍(2ω)に変換されることが知られている。
皮膚内部に存在するコラーゲン線維の分子は、3重らせん構造の非中心対称性を有するため、特異的にSHG光を発生する生体構成物質として知られている。発生するSHG光の強度は、コラーゲンの濃度や配向等に依存する。このSHG光を検出することにより、皮膚内部におけるコラーゲンの密度、分布、配向等の情報を取得することができる。皮膚内部のコラーゲンは主に真皮層に局在しているので、図1に示すように、皮膚に超短パルス光を照射し、発生する生体SHG光を検出することにより、特に真皮層におけるコラーゲンの密度、分布、配向等の情報を選択的に計測することが可能になる。
即ち、かかるSHG光の検出に基づく手法によれば、皮膚内部のコラーゲン線維分子に固有の非線形光学特性を利用するため、組織染色等が不要であり、生体組織のありのままの状態におけるインビボ(in vivo)での測定が可能である。また、このようして得られるSHG光の強度は皮膚内部のコラーゲンの濃度に依存しているので、その強度情報からコラーゲンの濃度分布を可視化することができる。SHG光の検出は非線形光学効果を利用した手法であるため、極めて高い空間分解能での3次元イメージングが可能である。
A technique for quantitatively measuring the orientation of collagen in the skin is not limited, but is based on detection of second harmonic generation light (SHG (Second Harmonic Generation) light) as described below. A method is mentioned.
That is, according to a preferred aspect, the evaluation method of the present invention irradiates the inside of the skin with ultrashort pulse light, detects the generated SHG light, and measures the orientation of collagen inside the skin based on the detection result. And further comprising a step.
SHG light is a second-order nonlinear optical response generated by irradiating a non-center target substance with ultrashort pulse light having a high peak power. In a linear optical response such as normal reflection or scattering, the frequency ( It is known that the frequency of SHG light is converted to twice that of incident light (2ω) while ω) does not change.
Collagen fiber molecules present in the skin are known as biological constituents that specifically generate SHG light because they have a non-centrosymmetrical triple helical structure. The intensity of the generated SHG light depends on the concentration and orientation of collagen. By detecting this SHG light, information such as the density, distribution, orientation, etc. of collagen in the skin can be obtained. Since the collagen inside the skin is mainly localized in the dermis layer, as shown in FIG. 1, by irradiating the skin with ultra-short pulse light and detecting the generated living SHG light, collagen in the dermis layer is particularly obtained. It is possible to selectively measure information such as density, distribution, and orientation.
That is, according to the technique based on the detection of the SHG light, since the non-linear optical characteristic inherent to the collagen fiber molecule in the skin is used, tissue staining or the like is unnecessary, and in vivo (in vivo) in the state of living tissue. ) Measurement is possible. Moreover, since the intensity | strength of SHG light obtained in this way is dependent on the density | concentration of the collagen inside skin, collagen density | concentration distribution can be visualized from the intensity | strength information. Since the detection of SHG light is a technique using a nonlinear optical effect, three-dimensional imaging with extremely high spatial resolution is possible.

SHG光を得るために照射する超短パルス光としては、例えば、フェムト秒モード同期レーザー光が挙げられる。フェムト秒モード同期レーザー光は、フェムト秒(10−15秒)オーダーの超短パルスレーザー光であり、非常に高い瞬時ピークパワーを有する。このようなフェムト秒モード同期レーザー光の照射手段は特に制限されない。例としては、チタン・サファイアレーザー、クロム・フォルステライトレーザー、ファイバーレーザー光、ネオジウム・ガラスレーザー等のレーザー光源等が挙げられる。超短パルス光の具体的なパルス長は、通常300fs(フェムト秒)以下、中でも100fs以下が好ましい。下限は特に制限されないが、通常は100fs以上である。パルス幅が短くなればなるほど、SHG光の発生効率は高くなる。
また、超短パルス光としては、近赤外領域の波長を有する超短パルス光を使用することが好ましい。近赤外領域は生体組織における吸収と散乱が少なく、良好な生体透過性を有する波長帯であるため、近赤外超短パルス光を用いれば、レーザー光を皮膚内部に対して表皮越しに入射させて生体SHG光を誘起し、その後方散乱SHG光を表皮越しに検出することができる。その他にも、近赤外超短パルス光を用いれば、バックグラウンド光(拡散反射光、蛍光)との分離が容易である、低侵襲的・深浸透性である、熱的ダメージが小さい等の利点が得られる。
具体的には、超短パルス光の中心波長が、通常700nmから1550nm程度、中でも800nmから1300nm程度、更には1200nmから1300nmの範囲内にあることが好ましい。この観点から、超短パルス光の光源としては、クロム・フォルステライトレーザーが好ましい。クロム・フォルステライトレーザーを用いれば、例えば、中心波長1250nm近傍の超短パルス光を得ることが可能となる。
Examples of the ultrashort pulse light to be irradiated to obtain SHG light include femtosecond mode-locked laser light. The femtosecond mode-locked laser beam is an ultrashort pulse laser beam on the order of femtosecond ( 10-15 seconds), and has a very high instantaneous peak power. The irradiation means of such femtosecond mode-locked laser light is not particularly limited. Examples include laser light sources such as titanium / sapphire laser, chromium / forsterite laser, fiber laser light, and neodymium / glass laser. The specific pulse length of the ultrashort pulse light is usually 300 fs (femtosecond) or less, preferably 100 fs or less. Although a minimum in particular is not restrict | limited, Usually, it is 100 fs or more. The shorter the pulse width, the higher the generation efficiency of SHG light.
Further, as the ultrashort pulse light, it is preferable to use ultrashort pulse light having a wavelength in the near infrared region. The near-infrared region is a wavelength band that absorbs and scatters less in living tissue and has good biological permeability, so if you use near-infrared ultrashort pulse light, laser light is incident on the skin through the epidermis. It is possible to induce living body SHG light and detect the backscattered SHG light through the epidermis. In addition, if near-infrared ultrashort pulse light is used, it is easy to separate from background light (diffuse reflected light, fluorescence), minimally invasive and deeply penetrating, and low thermal damage. Benefits are gained.
Specifically, it is preferable that the center wavelength of the ultrashort pulse light is usually in the range of about 700 nm to 1550 nm, in particular, about 800 nm to 1300 nm, and more preferably in the range of 1200 nm to 1300 nm. From this point of view, a chrome forsterite laser is preferable as the light source of the ultrashort pulse light. If a chrome forsterite laser is used, for example, it is possible to obtain ultrashort pulse light having a center wavelength of around 1250 nm.

SHG光の検出結果からコラーゲンの配向を把握する具体的な手法としては、検出されたSHG光の偏光異方性に基づいて把握する手法が挙げられる。この手法は、生体におけるSHG光の発生効率が、入射レーザー光の偏光の方向とコラーゲンの配向の方向との関係に強く依存することを利用するものである。
生体SHG光は、コラーゲン線維分子の構造の非中心対称性に起因しているため、コラーゲン線維分子の中心軸、即ち配向状態に敏感である。図2は、生体SHG光の発生に関する入射レーザー光の偏光状態と、コラーゲン線維の配向との関係を示している。図2に示すように、レーザー光がコラーゲン線維の断面方向から入射する場合、あらゆる偏光に対してコラーゲン線維の構造が中心対称性配置となるため、SHG光は発生しない。一方、それ以外の方向からの入射に対しては、コラーゲン線維の構造の非中心対称性により、生体SHG光が発生する。この場合、SHG光の発生効率は、入射レーザー光の偏光とコラーゲン線維の配向との関係に強く依存する。例えば、両者が平行な場合には強い生体SHG光が発生する一方で、直交した場合には非常に微弱となる。よって、かかるSHG光の偏光異方性を解析するにより、コラーゲン線維の配向状態を評価することができる。
A specific method for grasping the orientation of collagen from the detection result of SHG light includes a method for grasping based on the polarization anisotropy of the detected SHG light. This method utilizes the fact that the generation efficiency of SHG light in a living body strongly depends on the relationship between the direction of polarization of incident laser light and the direction of orientation of collagen.
The biological SHG light is sensitive to the central axis of the collagen fiber molecule, that is, the orientation state, because it originates from the non-centrosymmetric property of the structure of the collagen fiber molecule. FIG. 2 shows the relationship between the polarization state of incident laser light and the orientation of collagen fibers related to the generation of biological SHG light. As shown in FIG. 2, when the laser light is incident from the cross-sectional direction of the collagen fiber, the structure of the collagen fiber is centrally symmetric with respect to any polarized light, so that no SHG light is generated. On the other hand, for incidence from other directions, living body SHG light is generated due to the non-centrosymmetrical structure of the collagen fiber. In this case, the generation efficiency of SHG light strongly depends on the relationship between the polarization of incident laser light and the orientation of collagen fibers. For example, strong biological SHG light is generated when the two are parallel to each other, while it is very weak when they are orthogonal to each other. Therefore, the orientation state of the collagen fibers can be evaluated by analyzing the polarization anisotropy of the SHG light.

具体的には、入射レーザー光の偏光方向がコラーゲン線維の配向方向と直交するときに得られるSHG光強度をI、入射レーザー光の偏光方向がコラーゲン線維の配向方向と平行のときに得られるSHG光信号強度をIとすると、SHG光の偏光異方性は、以下の式(I)で定義されるα値によって数値化することができる。
上記式(I)で求められるαの値が1に近ければ、入射レーザー光の偏光方向に対してコラーゲン線維が垂直に配向しており、逆に−1に近ければ、入射レーザー光の偏光方向に対してコラーゲン線維が平行に配向しているということになる。従って、このα値を算出して解析すれば、コラーゲン線維の配向を把握することが可能となる。
具体的な解析手法の例を挙げると、例えば、所定の皮膚領域について得られたα値を3次元イメージング化し、得られたα値の3次元イメージから、その皮膚領域の皮膚内部におけるコラーゲンの配向状態の分布情報を抽出することができる。更には、このα値の分布を統計学的に処理することにより、詳細なコラーゲン配向分布を得ることができる。例えば、α値のヒストグラムを作成し、そのヒストグラムのピーク位置から測定領域における平均的なコラーゲン配向方位を、またヒストグラムの分布幅(半値全幅)からコラーゲンの配向がどの程度揃っているかを、それぞれ定量的に評価することが可能になる。また、簡易的にα値の平均値からこれらの評価を行うことも可能である。
上述のように、皮膚のしわ形成に深く関連していると考えられる真皮層のコラーゲン配向を、非接触で高感度に可視化することが可能な手段はこれまで存在しなかったことから、本発明で使用されるSHG光の検出に基づく手法は、皮膚計測においても革新的な手法であると言える。
Specifically, the SHG light intensity obtained when the polarization direction of the incident laser light is orthogonal to the orientation direction of the collagen fibers is I 、, and is obtained when the polarization direction of the incident laser light is parallel to the orientation direction of the collagen fibers. If the SHG optical signal intensity is I , the polarization anisotropy of the SHG light can be quantified by an α value defined by the following formula (I).
If the value of α obtained by the above formula (I) is close to 1, the collagen fibers are oriented perpendicular to the polarization direction of the incident laser light, and conversely if close to −1, the polarization direction of the incident laser light. This means that the collagen fibers are oriented in parallel. Therefore, if this α value is calculated and analyzed, the orientation of the collagen fibers can be grasped.
As an example of a specific analysis method, for example, the α value obtained for a predetermined skin region is three-dimensionally imaged, and the orientation of collagen in the skin of the skin region is obtained from the three-dimensional image of the obtained α value. State distribution information can be extracted. Furthermore, a detailed collagen orientation distribution can be obtained by statistically processing the α value distribution. For example, create a histogram of the α value, determine the average collagen orientation in the measurement area from the peak position of the histogram, and determine how well the collagen is aligned from the distribution width (full width at half maximum) of the histogram. Evaluation becomes possible. It is also possible to simply perform these evaluations from the average value of α values.
As described above, since there has been no means capable of visualizing the collagen orientation of the dermis layer, which is thought to be deeply related to the formation of wrinkles in the skin, with high sensitivity without contact, the present invention. It can be said that the technique based on the detection of SHG light used in is an innovative technique in skin measurement.

次に、本発明の評価方法を達成するための具体的な態様について説明する。なお、本発明の評価方法は、以下の形態に限定されるものではない。   Next, a specific mode for achieving the evaluation method of the present invention will be described. In addition, the evaluation method of this invention is not limited to the following forms.

図3は、本発明の評価方法における超短パルス光の照射及びSHG光の検出に使用可能なSHG顕微鏡システムの一例を示す構成概略図である。このSHG顕微鏡システムは、光源1、被検体10を配置するステージ11、光検出器(例えば、光電子増倍管)13、及びコンピューター14を備えている。光源1と被検体10との間には、NDフィルター(neutral density filter)2、偏光子3、位相差板4(例えば、1/2波長板、電気光学変調器など)、ミラー5、ダイクロイックミラー6、ガルバノミラー7、第1レンズ121、第2レンズ122、及び対物レンズ8がこの順序で配置されている。被検体10と光検出器13との間には、対物レンズ8、第2レンズ122、第1レンズ121、ガルバノミラー7、ダイクロイックミラー6、SHG光透過フィルター12がこの順序で配置されている。光検出器13は、コンピューター14と接続している。また、対物レンズ8はピエゾステージ9に取り付けられている。なお、実線Xは入射レーザー光(超短パルス光)、点線Yは反射SHG光を示す。
まず、光源1から超短パルス光Xが出射され、NDフィルター2で適度なレーザー光強度に調節された後、偏光子3並びに位相差板4を通過する。位相差板の種類に応じて得られる偏光は、ミラー5で反射され、ダイクロイックミラー6を透過した後、ガルバノミラー7で反射される。さらに、第1レンズ121と第2レンズ122を通過した後、対物レンズ8によりステージ11上の被検体10に集光される。被検体10で発生したSHG光の後方散乱成分Yを対物レンズ8で集め、入射レーザー光Xと同一の光路を逆に戻す。SHG光Yは、第2レンズ122と第1レンズ121を通過し、ガルバノミラー7で反射される。ダイクロイックミラー6はSHG光Yのみを反射し、SHG光透過フィルター12によってSHG光Yのみが抽出される。抽出されたSHG光Yは、光検出器13で光検出される。そして検出結果がコンピューター14に入力され、イメージング処理が行なわれる。
入射レーザー光は、偏光子3で直線偏光にされた後、位相差板4(例えば、1/2波長板)で任意方向の直線偏光に変換することができる。更に、被検体10上のビームスポットは、ガルバノミラー7、第1レンズ121、及び第2レンズ122によって、被検体10の2次元面内を高速走査することができる。あるいは、ステージ11によって被検体10を2次元面内で走査することもできる。また、対物レンズ8を取り付けたピエゾステージ9によって、ビームスポットを被検体10の深さ方向に走査することも可能である。このようにして、SHG偏光異方性の2次元又は3次元空間分布を分析することが可能となる。
図3に示すシステムにおいて、例えば、ミラー5は必須の構成要素ではなく、適宜省くことができる。また、面内の2次元分布測定が不要の場合には、ガルバノミラー7,第1レンズ121、第1レンズ122を、深さ(光軸)方向の分布測定が不要の場合にはピエゾステージ9を適宜省くこともできる。
FIG. 3 is a schematic configuration diagram showing an example of an SHG microscope system that can be used for irradiation with ultrashort pulse light and detection of SHG light in the evaluation method of the present invention. This SHG microscope system includes a light source 1, a stage 11 on which a subject 10 is arranged, a photodetector (for example, a photomultiplier tube) 13, and a computer 14. Between the light source 1 and the subject 10, an ND filter (neutral density filter) 2, a polarizer 3, a phase difference plate 4 (for example, a half-wave plate, an electro-optic modulator, etc.), a mirror 5, and a dichroic mirror 6, the galvanometer mirror 7, the first lens 121, the second lens 122, and the objective lens 8 are arranged in this order. Between the subject 10 and the photodetector 13, the objective lens 8, the second lens 122, the first lens 121, the galvano mirror 7, the dichroic mirror 6, and the SHG light transmission filter 12 are arranged in this order. The photodetector 13 is connected to the computer 14. The objective lens 8 is attached to the piezo stage 9. A solid line X indicates incident laser light (ultra short pulse light), and a dotted line Y indicates reflected SHG light.
First, the ultrashort pulse light X is emitted from the light source 1, adjusted to an appropriate laser light intensity by the ND filter 2, and then passes through the polarizer 3 and the phase difference plate 4. Polarized light obtained according to the type of the phase difference plate is reflected by the mirror 5, passes through the dichroic mirror 6, and then is reflected by the galvano mirror 7. Further, after passing through the first lens 121 and the second lens 122, the light is condensed on the subject 10 on the stage 11 by the objective lens 8. The backscattered component Y of the SHG light generated in the subject 10 is collected by the objective lens 8 and the same optical path as that of the incident laser light X is reversed. The SHG light Y passes through the second lens 122 and the first lens 121 and is reflected by the galvanometer mirror 7. The dichroic mirror 6 reflects only the SHG light Y, and only the SHG light Y is extracted by the SHG light transmission filter 12. The extracted SHG light Y is detected by the photodetector 13. Then, the detection result is input to the computer 14 and an imaging process is performed.
The incident laser light can be converted into linearly polarized light in an arbitrary direction by the phase difference plate 4 (for example, a half-wave plate) after being converted into linearly polarized light by the polarizer 3. Furthermore, the beam spot on the subject 10 can be scanned at high speed in the two-dimensional plane of the subject 10 by the galvanometer mirror 7, the first lens 121, and the second lens 122. Alternatively, the subject 10 can be scanned in a two-dimensional plane by the stage 11. Further, it is possible to scan the beam spot in the depth direction of the subject 10 by the piezo stage 9 to which the objective lens 8 is attached. In this way, it is possible to analyze a two-dimensional or three-dimensional spatial distribution of SHG polarization anisotropy.
In the system shown in FIG. 3, for example, the mirror 5 is not an essential component and can be omitted as appropriate. When in-plane two-dimensional distribution measurement is unnecessary, the galvanometer mirror 7, the first lens 121, and the first lens 122 are connected to the piezo stage 9 when distribution measurement in the depth (optical axis) direction is not required. Can be omitted as appropriate.

評価対象となる皮膚は、人間由来のものでもよく、その他の動物由来のものでもよい。また、生体から採取した皮膚組織を測定してもよいが、本発明の測定方法の利点である非侵襲性を生かすためには、生体の皮膚を原位置のまま測定対象とすることが好ましい。
皮膚における測定対象位置も特に制限されず、表皮下の皮膚内部であればよいが、上述のように真皮層のコラーゲンの配向が特にしわと深い関連性を有することから、真皮層を測定対象位置とすることが好ましい。真皮層の深さは生物や身体部位によって大きく異なるが、人間の場合には通常、皮膚表面から0.1mm〜4mm程度の深さである。
The skin to be evaluated may be derived from humans or may be derived from other animals. Although skin tissue collected from a living body may be measured, in order to take advantage of the non-invasiveness that is an advantage of the measuring method of the present invention, it is preferable to use the skin of the living body as a measurement object in its original position.
The measurement target position on the skin is not particularly limited as long as it is inside the epidermis skin. However, since the collagen orientation in the dermis layer has a particularly deep relationship with wrinkles as described above, the dermis layer is measured at the measurement target position. It is preferable that The depth of the dermis layer varies greatly depending on the organism or body part, but in the case of human beings, it is usually about 0.1 mm to 4 mm deep from the skin surface.

以上説明した本発明の評価方法によれば、皮膚内部(好ましくは真皮層)におけるコラーゲンの配向を、皮膚のしわを評価するためのパラメーターとして用いることにより、皮膚の伸縮、光老化、又はその複合要因(UV等の露光部における皮膚の伸縮)等の皮膚内部の変化から生じるしわの状態を、非侵襲的且つ定量的に評価することが可能である。
具体的には、皮膚内部(好ましくは真皮層)におけるコラーゲンの配向方向と、皮膚のしわの配向方向との関係を調べることにより、皮膚のしわが皮膚の伸縮、光老化、又はその複合要因(UV等の露光部における皮膚の伸縮)等のによるものか否かを判断するための評価基準とすることができる。
また、皮膚内部のコラーゲンの配向状態に基づいて、皮膚にしわが形成される可能性及び/又は方向を予測することもできる。即ち、皮膚にしわが殆ど(或いは全く)存在しない場合でも、皮膚内部においてコラーゲンが一定の方向に配向している場合には、皮膚に今後しわが形成される可能性が高いと判断することができる。また、そのしわの方向は、コラーゲンの配向方向と平行であると予測することができる。
また、超短パルス光(好ましくはクロム・フォルステライトレーザー光)を皮膚内部に照射して、発生したSHG光の検出結果(特に、SHG光の偏光異方性)を用いることにより、皮膚内部のコラーゲンの配向を非侵襲的且つ直接的に評価することが可能である。
According to the evaluation method of the present invention described above, the orientation of collagen in the skin (preferably the dermis layer) is used as a parameter for evaluating skin wrinkles, so that the skin is stretched, photoaged, or a composite thereof. It is possible to non-invasively and quantitatively evaluate the state of wrinkles caused by changes in the skin such as factors (stretching of the skin in exposed areas such as UV).
Specifically, by examining the relationship between the orientation direction of collagen in the skin (preferably the dermis layer) and the orientation direction of the wrinkle of the skin, the skin wrinkle is caused by the expansion and contraction of the skin, photoaging, or a complex factor thereof ( It can be used as an evaluation criterion for judging whether or not the skin is stretched or contracted in an exposed portion such as UV.
In addition, the possibility and / or direction of wrinkle formation on the skin can be predicted based on the orientation state of collagen inside the skin. That is, even when there is little (or no) wrinkle in the skin, it can be determined that there is a high possibility that wrinkles will be formed in the skin if the collagen is oriented in a certain direction inside the skin. . Moreover, the direction of the wrinkle can be predicted to be parallel to the orientation direction of collagen.
Further, by irradiating the inside of the skin with ultrashort pulse light (preferably chromium forsterite laser light) and using the detection result of the generated SHG light (particularly the polarization anisotropy of the SHG light), Collagen orientation can be assessed non-invasively and directly.

本発明の評価方法は、しわ抑制剤(抗しわ剤)の臨床的評価に用いることができる。即ち、光老化によるしわを抑制するために、例えば酸化チタン、酸化亜鉛、パラメトキシ桂皮酸エステル、パラアミノ安息香酸エステル等の各種の紫外線吸収、散乱、遮蔽物質をしわ抑制剤として配合した化粧料(サンスクリーン、サンプロテクト化粧品)や、紫外線によって生じるフリーラジカルによる悪影響を軽減する酸化防止剤等をしわ抑制剤として配合した化粧料等が提案されているが、本発明の評価方法を用いれば、これらのしわ抑制剤がどの程度の効力を有するかを、非侵襲的且つ定量的に評価することが可能である。
また、本発明の評価方法は、しわ抑制剤(抗しわ剤)となる物質のスクリーニングにも用いることができる。即ち、しわ抑制剤の候補となる物質について、それらが実際にしわを抑制する効果を有するか否かを、本発明の評価方法を用いて評価すれば、生体の皮膚を評価系として使用することが可能となり、しわ抑制剤をより確実且つ効率的に選定することが可能となる。
The evaluation method of the present invention can be used for clinical evaluation of a wrinkle inhibitor (anti-wrinkle agent). In other words, in order to suppress wrinkles due to photoaging, cosmetics (such as titanium oxide, zinc oxide, paramethoxycinnamic acid ester, paraaminobenzoic acid ester, etc.) containing various UV absorption, scattering and shielding substances as wrinkle inhibitors are used. Screens, sun protect cosmetics), and cosmetics formulated with wrinkle inhibitors with antioxidants that reduce the adverse effects caused by free radicals caused by ultraviolet rays have been proposed. It is possible to evaluate non-invasively and quantitatively how effective a wrinkle inhibitor is.
The evaluation method of the present invention can also be used for screening for a substance that becomes a wrinkle inhibitor (anti-wrinkle agent). That is, with respect to substances that are candidates for wrinkle inhibitors, if the evaluation method of the present invention is used to evaluate whether or not they actually have an effect of suppressing wrinkles, biological skin can be used as an evaluation system. Therefore, it becomes possible to select a wrinkle inhibitor more reliably and efficiently.

以下、実施例を用いて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。   EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated further in detail using an Example, this invention is not limited to these Examples.

6週齢の雄のヘアレスマウスに、10週間に亘って断続的に紫外線UV−Bを照射した。照射開始時のUV−B強度は40mJ/cmとし、徐々にUV−B強度を上昇させて、照射終了時のUV−B強度は200mJ/cmとした。UV−B照射終了後の16週齢雄ヘアレスマウスの背中皮膚を、光老化マウスの皮膚サンプルとして用いた。また、UV−B照射処理を行なわなかった16週齢雄ヘアレスマウスの背中皮膚を、コントロールマウスの皮膚サンプルとして用いた。
まず、光老化マウス及びコントロールマウスの各皮膚サンプルを目視で観察したところ、コントロールマウスの皮膚サンプルには、目視されるしわは殆ど形成されていないが、光老化マウスの皮膚サンプルには、体の左右方向(頭尾方向に直交する方向)に、特徴的な深いしわが見られた。
Six-week-old male hairless mice were irradiated with ultraviolet UV-B intermittently for 10 weeks. The UV-B intensity at the start of irradiation was 40 mJ / cm 2 , the UV-B intensity was gradually increased, and the UV-B intensity at the end of irradiation was 200 mJ / cm 2 . The back skin of 16-week-old male hairless mice after completion of UV-B irradiation was used as a skin sample for photoaged mice. Further, the back skin of a 16-week-old male hairless mouse that was not subjected to UV-B irradiation treatment was used as a skin sample of a control mouse.
First, each skin sample of the photoaged mouse and the control mouse was visually observed. The skin sample of the control mouse had almost no visible wrinkles, but the skin sample of the photoaged mouse had no body wrinkles. Characteristic deep wrinkles were seen in the left-right direction (direction perpendicular to the head-to-tail direction).

次に、これらの光老化マウス及びコントロールマウスの各皮膚サンプルを用いて、SHG光に関するデータの測定を行なった。
測定装置としては、図3に示す測定装置を用いた。光源としてはクロム・フォルステライトレーザーを用い、照射する超短パルス光の波長は1250nm、周波数は75MHz、パルス長は90fs(フェムト秒)とした。
各皮膚サンプルの皮膚表面から100μm、150μm、200μm、及び250μmの深さの位置に超短パルス光を照射し、SHG光の検出を行なった。また、各測定部位に対して入射超短パルスレーザー光の偏光方向を変化させてSHG光の信号強度を検出し、超短パルス光の偏光方向が垂直方向で各皮膚サンプルのしわ走行方向と直交な場合(マウスの頭尾方向と平行な場合)に得られたSHG光の信号強度をI、超短パルス光の偏光方向が水平方向で各皮膚サンプルのしわの走行方向と平行な場合(マウスの頭尾方向と直交な場合)に得られたSHG光の信号強度をIとして、上述の式(I)を用いてα値を算出した。
Next, data on SHG light was measured using the skin samples of these photo-aged mice and control mice.
As the measuring device, the measuring device shown in FIG. 3 was used. A chrome forsterite laser was used as the light source, and the wavelength of the ultrashort pulse light to be irradiated was 1250 nm, the frequency was 75 MHz, and the pulse length was 90 fs (femtosecond).
SHG light was detected by irradiating ultrashort pulse light at a depth of 100 μm, 150 μm, 200 μm, and 250 μm from the skin surface of each skin sample. In addition, the signal intensity of the SHG light is detected by changing the polarization direction of the incident ultrashort pulse laser light for each measurement site, and the polarization direction of the ultrashort pulse light is vertical and orthogonal to the wrinkle running direction of each skin sample. When the signal intensity of the SHG light obtained in the case of (when parallel to the head-to-tail direction of the mouse) is I 、, the polarization direction of the ultrashort pulse light is horizontal and parallel to the wrinkle running direction of each skin sample ( the signal intensity of the SHG light obtained when craniocaudal direction orthogonal) of the mouse as I was calculated α value using the aforementioned formula (I).

コントロールマウス及び光老化マウスの各皮膚サンプルについて、皮膚表面から100μm、150μm、200μm、及び250μmの深さの位置から得られたSHG光のイメージを図4に示す。また、そのSHG光の偏光異方性を表わすα値のイメージ及びヒストグラムを、それぞれ図5及び図6に示す。   FIG. 4 shows images of SHG light obtained from the skin surfaces of the control mouse and the photoaged mouse from the depths of 100 μm, 150 μm, 200 μm, and 250 μm from the skin surface. Also, an image of α value representing the polarization anisotropy of the SHG light and a histogram are shown in FIGS. 5 and 6, respectively.

なお、図4及び図5の何れも、上列の4枚の画像はコントロールマウスの皮膚サンプルから得られたイメージを表わし、下列の4枚の画像は光老化マウスの皮膚サンプルから得られたイメージを表わす。また、各列は左から順に、それぞれ皮膚表面から100μm、150μm、200μm、及び250μmの深さの位置から得られたイメージを表わす。図4及び図5の各画像は何れも、皮膚サンプル上の400μm×400μmの領域に対応する。また、図4及び図5の各画像において、上下方向がマウスの頭尾方向に相当し、左右方向がマウスの頭尾方向に直交する方向、即ちしわの方向に相当する。   In both FIG. 4 and FIG. 5, the four images in the upper row represent images obtained from the skin sample of the control mouse, and the four images in the lower row are images obtained from the skin sample of the photoaged mouse. Represents. Each column represents an image obtained from the positions of depths of 100 μm, 150 μm, 200 μm, and 250 μm from the skin surface in order from the left. Each of the images in FIGS. 4 and 5 corresponds to a 400 μm × 400 μm region on the skin sample. 4 and 5, the vertical direction corresponds to the head-to-tail direction of the mouse, and the left-right direction corresponds to the direction orthogonal to the head-to-tail direction of the mouse, that is, the wrinkle direction.

図4はSHGイメージで、コントロールマウスの皮膚サンプルと光老化マウスの皮膚サンプルのコラーゲン像を検出している。さらに偏光解析を行うことにより同位置のコラーゲンの配向を示した(図5)。   FIG. 4 is an SHG image in which collagen images of a skin sample of a control mouse and a skin sample of a photoaged mouse are detected. Furthermore, the orientation of collagen at the same position was shown by performing ellipsometry (FIG. 5).

一方、図5では、各列右側のグラフに示すように、α値が0の場合を白として、α値が正の値(1に近い値)を取る部分を青色で示し、α値が負の値(−1に近い値)を取る部分を赤色で示すことにより、α値をイメージ化している。
図5のα値イメージから、コントロールマウスの皮膚サンプルが、赤と青が混在した比較的等方的なコラーゲン配向を示しているのに対し、光老化マウスの皮膚サンプルでは全体的に赤く表示されており、水平方向のコラーゲン配向が優位であることが分かる。水平方向のコラーゲン配向はしわの走行方向と一致している。
On the other hand, in FIG. 5, as shown in the graph on the right side of each column, the portion where the α value is 0 is white, the portion where the α value takes a positive value (a value close to 1) is shown in blue, and the α value is negative. The portion taking the value of (a value close to -1) is shown in red, thereby imaging the α value.
From the α value image of FIG. 5, the skin sample of the control mouse shows a relatively isotropic collagen orientation in which red and blue are mixed, whereas the skin sample of the photoaged mouse is displayed in red overall. It can be seen that the horizontal collagen orientation is superior. The collagen orientation in the horizontal direction coincides with the running direction of the wrinkles.

また、図6は、図5の各画像におけるα値のデータを、縦軸をピクセル数、横軸をα値としてヒストグラム化したものである。図6のα値のヒストグラムによれば、コントロールマウスの皮膚サンプルでは、何れの深さにおいてもヒストグラムの中心がゼロ付近に存在するのに対し、光老化マウスの皮膚サンプルでは、ヒストグラムの中心が負の方向(しわの走行方向)にずれていることが分かる。また、光老化マウスの皮膚サンプルにおけるヒストグラムの幅は、コントロールマウスの皮膚サンプルのものと比較すると何れの深さにおいても狭くなっており、光老化マウスの皮膚サンプルの方がコラーゲン配向がよく揃っていることが分かる。   FIG. 6 is a histogram of the α value data in each image of FIG. 5 with the vertical axis representing the number of pixels and the horizontal axis representing the α value. According to the α value histogram of FIG. 6, the center of the histogram exists near zero at any depth in the skin sample of the control mouse, whereas the center of the histogram is negative in the skin sample of the photoaged mouse. It can be seen that the direction is shifted in the direction of wrinkles (the direction of wrinkles). In addition, the width of the histogram in the skin sample of the photo-aged mouse is narrower at any depth than that of the skin sample of the control mouse, and the skin sample of the photo-aged mouse has a better collagen orientation. I understand that.

以上の結果から、皮膚内部のコラーゲンの配向と、皮膚の伸縮によって皮膚の露光部に生じたしわの方向との間には相関があること、ひいては、皮膚内部のコラーゲンの配向に基づいて皮膚のしわの状態を評価することが可能であることが分かる。
また、皮膚内部のコラーゲンの配向を測定する上で、SHG光の検出に基づく手法が有効であることが分かる。
更には、検出されたSHG光の偏光異方性をα値で表わし、このα値を統計的に処理したヒストグラムが、皮膚内部のコラーゲンの配向を表わす定量的な指標となり、ひいては皮膚におけるしわの状態を表わす定量的な指標としても使用できることが分かる。
From the above results, there is a correlation between the orientation of the collagen inside the skin and the direction of wrinkles generated in the exposed area of the skin due to the expansion and contraction of the skin. It can be seen that the wrinkle state can be evaluated.
It can also be seen that a technique based on detection of SHG light is effective in measuring the orientation of collagen inside the skin.
Further, the polarization anisotropy of the detected SHG light is expressed by an α value, and a histogram obtained by statistically processing the α value becomes a quantitative index indicating the orientation of collagen inside the skin, and thus wrinkles in the skin. It can be seen that it can also be used as a quantitative index representing the state.

本発明の評価方法によって最も直接的な効果を期待できるのは皮膚美容分野であり、特に皮膚老化診断が興味深い。皮膚老化診断は、近年のアンチエイジングや皮膚美容に対する意識の高まりと共に、今後大きな進展が予想される分野である。特に、本発明の評価方法を化粧品関連分野(例えば、抗しわ化粧品)と有機的に融合することができれば、極めて大きな市場(例えば、加齢や日焼けに伴う皮膚のしわや弾力性低下の評価、化粧品・塗薬の効用テストほか)が生成されると期待される。また、今後日本が直面する高齢化社会において老化問題は切実な問題であり、社会ニーズという観点からも皮膚老化診断の需要は大きい。   The most direct effect can be expected by the evaluation method of the present invention is in the field of skin cosmetics, and skin aging diagnosis is particularly interesting. Skin aging diagnosis is a field that is expected to make great progress in the future as awareness of anti-aging and skin beauty increases in recent years. In particular, if the evaluation method of the present invention can be organically integrated with cosmetic-related fields (for example, anti-wrinkle cosmetics), an extremely large market (for example, evaluation of skin wrinkles and reduced elasticity due to aging and sunburn, It is expected that cosmetics and coatings will be generated. In addition, the aging problem is a serious problem in the aging society that Japan will face in the future, and there is a great demand for skin aging diagnosis from the viewpoint of social needs.

SHG光の検出に基づく皮膚内部のコラーゲンの配向の測定を説明するための模式図である。It is a schematic diagram for demonstrating the measurement of the orientation of the collagen inside skin based on the detection of SHG light. 生体SHG光の発生に関する入射レーザー光の偏光状態と、コラーゲン線維の配向との関係を示す図である。It is a figure which shows the relationship between the polarization state of the incident laser beam regarding generation | occurrence | production of living body SHG light, and the orientation of a collagen fiber. 本発明の評価方法における超短パルス光の照射及びSHG光の検出に使用可能なSHG顕微測光システムの一例を示す構成概略図である。1 is a schematic configuration diagram illustrating an example of an SHG microphotometry system that can be used for irradiation with ultrashort pulse light and detection of SHG light in the evaluation method of the present invention. コントロールマウス及び光老化マウスの各皮膚サンプルについて、皮膚表面から100μm、150μm、200μm、及び250μmの深さの位置から得られた、SHG光のイメージである。It is the image of SHG light obtained from the skin surface of a control mouse | mouth and a photo-aging mouse | mouth from the position of the depth of 100 micrometers, 150 micrometers, 200 micrometers, and 250 micrometers from the skin surface. コントロールマウス及び光老化マウスの各皮膚サンプルについて、皮膚表面から100μm、150μm、200μm、及び250μmの深さの位置から得られた、SHG光の偏光異方性から求めたα値のイメージである。It is an image of the α value obtained from the polarization anisotropy of SHG light obtained from the positions of depths of 100 μm, 150 μm, 200 μm, and 250 μm from the skin surface for each skin sample of the control mouse and the photoaged mouse. コントロールマウス及び光老化マウスの各皮膚サンプルについて、皮膚表面から100μm、150μm、200μm、及び250μmの深さの位置から得られた、SHG光の偏光異方性から求めたα値のヒストグラムである。It is the histogram of (alpha) value calculated | required from the polarization | polarized-light anisotropy of SHG light obtained from the position of 100 micrometers, 150 micrometers, 200 micrometers, and the depth of 250 micrometers from the skin surface about each skin sample of a control mouse | mouth and a photoaging mouse | mouth.

符号の説明Explanation of symbols

1 光源
2 NDフィルター
3 偏光子
4 位相差板
5 ミラー
6 ダイクロイックミラー
7 ガルバノミラー
8 対物レンズ
9 ピエゾステージ
10 被検体
11 ステージ
12 SHG光透過フィルター
13 光検出器
14 コンピューター
121 第1レンズ
122 第2レンズ
X 入射レーザー光
Y SHG光
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Light source 2 ND filter 3 Polarizer 4 Phase difference plate 5 Mirror 6 Dichroic mirror 7 Galvano mirror 8 Objective lens 9 Piezo stage 10 Subject 11 Stage 12 SHG light transmission filter 13 Photo detector 14 Computer 121 First lens 122 Second lens X Incident laser beam Y SHG beam

Claims (9)

皮膚内部のコラーゲンの配向に基づいて、皮膚におけるしわの状態を評価する工程を含んでなる、皮膚しわの評価方法。   A method for evaluating skin wrinkles, comprising a step of evaluating the state of wrinkles in the skin based on the orientation of collagen in the skin. 前記の皮膚内部のコラーゲンの配向が、真皮層のコラーゲンの配向である、請求項1記載の評価方法。   The evaluation method according to claim 1, wherein the orientation of collagen in the skin is the orientation of collagen in the dermis layer. 前記の皮膚におけるしわの状態が、皮膚の伸縮によって生じるしわの形成である、請求項1又は請求項2に記載の評価方法。   The evaluation method according to claim 1, wherein the wrinkle state in the skin is formation of wrinkles caused by expansion and contraction of the skin. 前記の皮膚におけるしわの状態が、光老化によって生じるしわの形成である、請求項1〜3の何れか一項に記載の評価方法。   The evaluation method according to any one of claims 1 to 3, wherein the wrinkle state in the skin is wrinkle formation caused by photoaging. 前記評価が、皮膚内部のコラーゲンの配向状態に基づく、皮膚にしわが形成される可能性及び/又はその方向の予測である、請求項1又は請求項2に記載の評価方法。   The evaluation method according to claim 1 or 2, wherein the evaluation is a prediction of a possibility that the skin is wrinkled and / or a direction thereof based on an orientation state of collagen in the skin. 皮膚内部に超短パルス光を照射し、発生した第2高調波発生光(SHG光)を検出し、その検出結果に基づいて皮膚内部のコラーゲンの配向を測定する工程を更に含んでなる、請求項1〜5の何れか一項に記載の評価方法。   The method further comprises a step of irradiating the inside of the skin with ultrashort pulse light, detecting the generated second harmonic generation light (SHG light), and measuring the orientation of collagen inside the skin based on the detection result. The evaluation method according to any one of Items 1 to 5. 検出されたSHG光の偏光異方性に基づいて皮膚内部のコラーゲンの配向を測定する、請求項6記載の評価方法。   The evaluation method according to claim 6, wherein the orientation of collagen in the skin is measured based on the polarization anisotropy of the detected SHG light. 超短パルス光がフェムト秒モード同期レーザー光である、請求項6又は請求項7に記載の評価方法。   The evaluation method according to claim 6 or 7, wherein the ultrashort pulse light is femtosecond mode-locked laser light. 超短パルス光が、クロム・フォルステライトレーザー光、チタン・サファイアレーザー光、ファイバーレーザー光、又はネオジウム・ガラスレーザー光である、請求項6〜8の何れか一項に記載の評価方法。   The evaluation method according to any one of claims 6 to 8, wherein the ultrashort pulsed light is chromium forsterite laser light, titanium / sapphire laser light, fiber laser light, or neodymium glass laser light.
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