JP2009263362A - Insecticide using double stranded rna - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、二本鎖ＲＮＡを有効成分とする害虫駆除剤、及び前記害虫駆除剤を用いた害虫駆除方法に関する。より詳細には、本発明は、害虫に存在する特定の標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉作用を有する二本鎖ＲＮＡを有効成分とする害虫駆除剤に関する。さらに本発明は、前記ＲＮＡ干渉作用を有する二本鎖ＲＮＡのスクリーニング方法に関する。 The present invention relates to a pest control agent comprising double-stranded RNA as an active ingredient, and a pest control method using the pest control agent. More specifically, the present invention relates to a pest control agent comprising, as an active ingredient, a double-stranded RNA having an RNA interference action against a specific target gene present in a pest. Furthermore, the present invention relates to a screening method for double-stranded RNA having the RNA interference action.
害虫は、人体、農作物、家畜及び家屋などの財産に対し様々な被害を及ぼすことが知られている。従来、害虫の駆除ないし害虫による被害を低減するために種々の対策が取られてきた。一般的には、昆虫の神経伝達系を阻害する物質などを有効成分とした害虫駆除剤が多く利用されている。しかし、このような従来の害虫駆除剤の場合、標的の害虫以外にも非特異的に作用するため、標的としない有益な昆虫まで殺虫することになるだけでなく、有益な微生物、植物、動物及び人体にまで悪影響を及ぼす可能性があるため問題となっている。実際に、今日では食品に含まれる残留農薬が社会的にも大きな問題となっており、標的の害虫に特異的に作用する害虫駆除剤が求められている。 Pests are known to cause various damages to property such as human bodies, agricultural products, livestock and houses. Conventionally, various measures have been taken to eliminate pests or reduce damage caused by pests. In general, many insecticides containing active substances such as substances that inhibit the neurotransmitter system of insects are used. However, in the case of such a conventional pest control agent, since it acts non-specifically besides the target pest, it not only kills beneficial insects that are not targeted, but also beneficial microorganisms, plants, animals In addition, there is a problem because it may adversely affect the human body. In fact, pesticide residues contained in foods have become a major social issue today, and there is a need for pest control agents that act specifically on target pests.
一方、ＲＮＡ干渉とは、１９９８年に初めて報告された、二本鎖ＲＮＡと相補的な塩基配列を有するｍＲＮＡが破壊される現象である（非特許文献１）。Ｆｉｒｅらの報告によると、この現象は、特定遺伝子の特定領域と相同な１００塩基対程度の２本鎖ＲＮＡを細胞内に導入すると、細胞質内でＤｉｃｅｒの働きによって導入された二本鎖ＲＮＡが２０〜２５塩基対程度の２本鎖ＲＮＡへと分解され、その後複数のタンパク質とＲＮＡ／タンパク質複合体を形成し（この複合体をＲＩＳＣ：ＲＮＡ‐ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ：ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体と呼ぶ）、標的遺伝子から産出されたｍＲＮＡの相同部位と結合し強力に遺伝子発現を抑制するというものである。ＲＮＡ干渉は、導入される二本鎖ＲＮＡと標的の遺伝子との相補性により特異的に起こるため、特定の遺伝子発現を特異的に抑制することができる。現在、このようなＲＮＡ干渉を利用した遺伝子医薬などの開発が盛んに行われている。 On the other hand, RNA interference is a phenomenon first reported in 1998, in which mRNA having a base sequence complementary to double-stranded RNA is destroyed (Non-patent Document 1). According to the report of Fire et al., When double-stranded RNA of about 100 base pairs homologous to a specific region of a specific gene is introduced into a cell, the double-stranded RNA introduced by the action of Dicer in the cytoplasm It is decomposed into double-stranded RNA of about 20-25 base pairs, and then forms RNA / protein complexes with a plurality of proteins (this complex is referred to as RISC: RNA-induced silencing complex: RNA-induced silencing complex) Called), which binds to the homologous region of mRNA produced from the target gene and strongly suppresses gene expression. Since RNA interference occurs specifically due to complementarity between the introduced double-stranded RNA and the target gene, specific gene expression can be specifically suppressed. Currently, development of gene medicines using such RNA interference is being actively conducted.
害虫駆除の分野においても、ＲＮＡ干渉を利用することで特定の害虫の特定の遺伝子発現を抑制し、目的とする害虫を特異的に制御することが提案されている（特許文献１、特許文献２）。しかし、実際に効果が示された害虫は限られたものであり、特にバッタ目、ゴキブリ目に属する昆虫を効果的に殺虫することができる二本鎖ＲＮＡは開示されておらず、更なる改善の余地があった。 Also in the field of pest control, it has been proposed to specifically control target pests by using RNA interference to suppress specific gene expression of specific pests (Patent Documents 1 and 2). ). However, the pests that have actually been shown to be effective are limited. In particular, no double-stranded RNA capable of effectively killing insects belonging to the locusts and cockroaches has been disclosed, and further improvements have been made. There was room for.
上述するような現状の下、本発明は、害虫を特異的に駆除することが可能な、ＲＮＡ干渉を利用した害虫駆除剤を提供することを目的とする。更に、本発明は、そのような害虫駆除剤の有効成分となり得る二本鎖ＲＮＡのスクリーニング方法を提供することを目的とする。 Under the present circumstances as described above, an object of the present invention is to provide a pest control agent using RNA interference capable of specifically controlling a pest. Furthermore, this invention aims at providing the screening method of double stranded RNA which can become an active ingredient of such a pest control agent.
上記のような課題を解決すべく発明者らは鋭意研究を重ねたところ、害虫が有する特定の遺伝子を標的遺伝子とし、それと相補的な二本鎖ＲＮＡを害虫に導入することによって、効果的な殺虫作用が得られることを見出した。本発明は、かかる知見に基づき、さらに改良を重ねた結果完成したものである。即ち、本発明は以下の害虫駆除剤及びスクリーニング法を提供する。
項１． 下記（ａ）〜（ｎ）から成る群から選択される少なくとも１つの標的遺伝子の全部又は一部と相補的な塩基配列を含むセンス鎖、及び前記センス鎖と相補的な配列からなるアンチセンス鎖からなる二本鎖ＲＮＡであり、前記標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉を起すことができる二本鎖ＲＮＡを含有し、前記標的遺伝子が害虫に含まれるものである、害虫駆除剤：
（ａ）Nucleosome assembly protein 1-like 1遺伝子
（ｂ）ポリＡ結合タンパク質遺伝子
（ｃ）HR3遺伝子
（ｄ）14‐3‐3 zeta遺伝子
（ｅ）アルギニンリン酸化酵素遺伝子
（ｆ）膜結合型アルカリホスファターゼ遺伝子
（ｇ）Cathepsin L1遺伝子
（ｈ）Sparc遺伝子
（ｉ）ヒートショックプロテイン 90遺伝子
（ｊ）cAMP-依存性タンパク質リン酸化酵素 R1遺伝子
（ｋ）Wnt inhibitory factor 1 遺伝子
（ｌ）Warts遺伝子
（ｍ）Yorkie遺伝子
（ｎ）Inhibitor-of-apoptosis protein遺伝子。
項２． 前記害虫が昆虫である、項１に記載の害虫駆除剤。
項３． 前記害虫がバッタ目又はゴキブリ目に属する昆虫である、項１又は２に記載の害虫駆除剤。
項４． 項１〜３のいずれかに記載の害虫駆除剤を害虫に接触させることを特徴とする、害虫駆除方法。
項５． 下記（ａ）〜（ｎ）から成る群から選択される少なくとも１つの害虫に含まれる標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉作用を有する二本鎖ＲＮＡを選抜する工程を含む、害虫駆除作用を有する二本鎖ＲＮＡのスクリーニング方法：
（ａ）Nucleosome assembly protein 1-like 1遺伝子
（ｂ）ポリＡ結合タンパク質遺伝子
（ｃ）HR3遺伝子
（ｄ）14‐3‐3 zeta遺伝子
（ｅ）アルギニンリン酸化酵素遺伝子
（ｆ）膜結合型アルカリホスファターゼ遺伝子
（ｇ）Cathepsin L1遺伝子
（ｈ）Sparc遺伝子
（ｉ）ヒートショックプロテイン 90遺伝子
（ｊ）cAMP-依存性タンパク質リン酸化酵素 R1遺伝子
（ｋ）Wnt inhibitory factor 1 遺伝子
（ｌ）Warts遺伝子
（ｍ）Yorkie遺伝子
（ｎ）Inhibitor-of-apoptosis protein遺伝子。
In order to solve the above-mentioned problems, the inventors have conducted intensive research and found that a specific gene possessed by a pest is a target gene and a double-stranded RNA complementary thereto is introduced into the pest. It was found that an insecticidal action can be obtained. The present invention has been completed as a result of further improvements based on this finding. That is, the present invention provides the following pest control agents and screening methods.
Item 1. A sense strand comprising a base sequence complementary to all or part of at least one target gene selected from the group consisting of the following (a) to (n), and an antisense strand comprising a sequence complementary to the sense strand An insect pest control agent comprising: a double-stranded RNA comprising a double-stranded RNA capable of causing RNA interference with the target gene, wherein the target gene is contained in a pest:
(A) Nucleosome assembly protein 1-like 1 gene (b) Poly A-binding protein gene (c) HR3 gene (d) 14-3-3 zeta gene (e) Arginine kinase gene (f) Membrane-bound alkaline phosphatase Gene (g) Catepsin L1 gene (h) Sparc gene (i) Heat shock protein 90 gene (j) cAMP-dependent protein kinase R1 gene (k) Wnt inhibitory factor 1 gene (l) Warts gene (m) Yorkie Gene (n) Inhibitor-of-apoptosis protein gene.
Item 2. Item 2. The pest control agent according to Item 1, wherein the pest is an insect.
Item 3. Item 3. The pest control agent according to Item 1 or 2, wherein the pest is an insect belonging to the locust order or cockroach order.
Item 4. Item 3. A method for controlling pests, which comprises bringing the pest control agent according to any one of Items 1 to 3 into contact with the pests.
Item 5. Two having a pest control action, including a step of selecting a double-stranded RNA having an RNA interference action against a target gene contained in at least one pest selected from the group consisting of the following (a) to (n) Strand RNA screening method:
(A) Nucleosome assembly protein 1-like 1 gene (b) Poly A-binding protein gene (c) HR3 gene (d) 14-3-3 zeta gene (e) Arginine kinase gene (f) Membrane-bound alkaline phosphatase Gene (g) Catepsin L1 gene (h) Sparc gene (i) Heat shock protein 90 gene (j) cAMP-dependent protein kinase R1 gene (k) Wnt inhibitory factor 1 gene (l) Warts gene (m) Yorkie Gene (n) Inhibitor-of-apoptosis protein gene.
本発明の害虫駆除剤を使用することにより、害虫、特にバッタ目、ゴキブリ目に属する昆虫を比較的短期間に特異的且つ効果的に駆除することが出来る。よって、本発明の害虫駆除剤を使用することにより、有益な昆虫、微生物、植物及び動物などに影響を及ぼすことなく、標的の害虫のみを駆除することが出来る。従って、本発明により、人体や家畜、植物に対してより安全な害虫駆除が可能となる。 By using the pest control agent of the present invention, pests, particularly insects belonging to the locusts and cockroaches, can be specifically and effectively controlled in a relatively short time. Therefore, by using the pest control agent of the present invention, it is possible to control only the target pests without affecting beneficial insects, microorganisms, plants and animals. Therefore, according to the present invention, safer pest control for human bodies, livestock, and plants becomes possible.
Ｉ．害虫駆除剤
本発明の害虫駆除剤は、二本鎖ＲＮＡを有効成分として含有する。前記二本鎖ＲＮＡは、害虫が有する標的遺伝子を構成する塩基配列の全部又はその一部と相補的な一本のＲＮＡ鎖（即ち、センス鎖）と前記センス鎖と相補的な配列からなるアンチセンス鎖から構成される。当該二本鎖ＲＮＡを害虫に導入すると、ＲＮＡ干渉作用によって害虫の標的遺伝子の発現が抑制され、結果として害虫を殺虫することができ、害虫駆除が達成される。
I. Pest Control Agent The pest control agent of the present invention contains double-stranded RNA as an active ingredient. The double-stranded RNA is an anti-RNA consisting of a single RNA strand (ie, sense strand) complementary to all or part of the base sequence constituting the target gene of the pest and a sequence complementary to the sense strand. Consists of a sense strand. When the double-stranded RNA is introduced into a pest, the expression of the target gene of the pest is suppressed by the RNA interference action. As a result, the pest can be killed, and pest control is achieved.
ここで、害虫駆除とは、害虫を殺すことだけでなく、害虫の発生、増殖及び繁殖を抑制、阻害又は低減すること、また害虫による汚染や害虫によって媒介される感染の拡大を抑制することを意味する。 Here, pest control not only kills pests, but also controls, inhibits or reduces the generation, growth and reproduction of pests, and controls the spread of pest contamination and pest-mediated infection. means.
本発明において、害虫とは、人、家畜などの動物及び農作物などの植物に対して害を与える節足動物に属する害虫であり、好ましくは昆虫に属する害虫である。農作物に対する被害や、人に対する不快感を緩和する必要性及び本発明の害虫駆除剤がより効果的に作用するという観点から、より好ましい害虫は、バッタ目又はゴキブリ目に属する昆虫であり、例えば、バッタ目では、キリギリス科、コオロギ科、カンタン科、カネタタキ科、ケラ科、オンブバッタ科、バッタ科、ヒシバッタ科、ノミバッタ科であり、ゴキブリ目では、ゴキブリ科、チャバネゴキブリ科に属する昆虫を挙げることができ、バッタ目の中ではコオロギ科が特に好ましい。 In the present invention, pests are pests belonging to arthropods that cause harm to plants such as humans, livestock, and crops, and preferably pests belonging to insects. From the viewpoint of alleviating damage to crops, discomfort to humans, and the action of the pest control agent of the present invention more effectively, a more preferable pest is an insect belonging to the order of the locust or cockroach, for example, The grasshoppers are the grasshoppers, crickets, succulents, scallops, keraceae, grasshoppers, grasshoppers, cypresses, fleas. Among the grasshoppers, the cricket family is particularly preferable.
本発明の標的遺伝子とは、ＲＮＡ干渉作用によって遺伝子発現の抑制対象となる遺伝子であり、具体的には害虫に存在する以下（ａ）〜（ｎ）で示される遺伝子である。
（ａ）Nucleosome assembly protein 1-like 1遺伝子
（ｂ）ポリＡ結合タンパク質遺伝子
（ｃ）HR3遺伝子
（ｄ）14‐3‐3 zeta遺伝子
（ｅ）アルギニンリン酸化酵素遺伝子
（ｆ）膜結合型アルカリホスファターゼ遺伝子
（ｇ）Cathepsin L1遺伝子
（ｈ）Sparc遺伝子
（ｉ）ヒートショックプロテイン 90遺伝子
（ｊ）cAMP-依存性タンパク質リン酸化酵素 R1遺伝子
（ｋ）Wnt inhibitory factor 1 遺伝子
（ｌ）Warts遺伝子
（ｍ）Yorkie遺伝子
（ｎ）Inhibitor-of-apoptosis protein遺伝子。
The target gene of the present invention is a gene that is subject to suppression of gene expression by RNA interference action, and specifically, is a gene represented by the following (a) to (n) present in a pest.
(A) Nucleosome assembly protein 1-like 1 gene (b) Poly A-binding protein gene (c) HR3 gene (d) 14-3-3 zeta gene (e) Arginine kinase gene (f) Membrane-bound alkaline phosphatase Gene (g) Catepsin L1 gene (h) Sparc gene (i) Heat shock protein 90 gene (j) cAMP-dependent protein kinase R1 gene (k) Wnt inhibitory factor 1 gene (l) Warts gene (m) Yorkie Gene (n) Inhibitor-of-apoptosis protein gene.
Nucleosome assembly protein 1-like 1遺伝子とは、染色体を構成するタンパク質であるヌクレオソームの結合タンパク質１に類似したタンパク質をコードしている遺伝子である。 Nucleosome assembly protein 1-like 1 gene is a gene encoding a protein similar to nucleosome binding protein 1 which is a protein constituting a chromosome.
ポリＡ結合タンパク質遺伝子とは、mRNAのポリAに結合するタンパク質をコードしている遺伝子である。 The poly A binding protein gene is a gene encoding a protein that binds to poly A of mRNA.
HR3遺伝子とは、脱皮ホルモンが結合し、標的遺伝子の転写調節を行う核内受容体の遺伝子である。 The HR3 gene is a nuclear receptor gene that binds molting hormone and regulates transcription of the target gene.
14‐3‐3 zeta遺伝子とは、細胞周期やアポトーシスに関与するタンパク質をコードしている遺伝子である。 14-3-3 zeta gene is a gene encoding a protein involved in cell cycle and apoptosis.
アルギニンリン酸化酵素遺伝子とは、エネルギー代謝に必要なタンパク質をコードしている遺伝子である。 The arginine phosphatase gene is a gene encoding a protein necessary for energy metabolism.
膜結合型アルカリホスファターゼ遺伝子とは、リン酸モノエステル結合を加水分解する膜結合型酵素の遺伝子である。 The membrane-bound alkaline phosphatase gene is a gene for a membrane-bound enzyme that hydrolyzes a phosphate monoester bond.
Cathepsin L1遺伝子とは、タンパク質分解酵素をコードしている遺伝子である。 The Cathepsin L1 gene is a gene encoding a proteolytic enzyme.
Sparc遺伝子とは、細胞外マトリックスタンパク質の１つをコードする遺伝子である。 The Sparc gene is a gene encoding one of extracellular matrix proteins.
ヒートショックプロテイン90遺伝子とは、熱ショックタンパク質の１つをコードする遺伝子である。 The heat shock protein 90 gene is a gene encoding one of heat shock proteins.
cAMP-依存性タンパク質リン酸化酵素R1遺伝子とは、cAMPに依存して、タンパク質をリン酸化する酵素R1をコードする遺伝子である。 The cAMP-dependent protein kinase R1 gene is a gene encoding an enzyme R1 that phosphorylates proteins depending on cAMP.
Wnt inhibitory factor 1 遺伝子とは、Wntシグナル経路を抑制するタンパク質をコードする遺伝子である。 The Wnt inhibitory factor 1 gene is a gene encoding a protein that suppresses the Wnt signal pathway.
Warts遺伝子とは、ヒッポシグナル経路に関与するYorkieと相互作用するタンパク質をコードする遺伝子である。 The Warts gene is a gene encoding a protein that interacts with Yorkie involved in the hippo signal pathway.
Yorkie遺伝子とは、ヒッポシグナル経路に関与するWartsタンパク質と相互作用するタンパク質をコードする遺伝子である。 The Yorkie gene is a gene encoding a protein that interacts with the Warts protein involved in the hippo signal pathway.
Inhibitor-of-apoptosis protein遺伝子とは、アポトーシスを抑制するタンパク質をコードする遺伝子である。 The inhibitor-of-apoptosis protein gene is a gene encoding a protein that suppresses apoptosis.
以上の本発明における標的遺伝子は公知であり、その配列情報も知られているため、当業者であれば公知の技術に従ってあらゆる害虫に存在する標的遺伝子に相補的な二本鎖ＲＮＡを作成することが可能である。 Since the target genes in the present invention are known and their sequence information is also known, those skilled in the art can create double-stranded RNAs complementary to the target genes present in all pests according to known techniques. Is possible.
上記１４種の遺伝子から任意の１つ以上の遺伝子を選択し、標的遺伝子とすることができる。中でも標的遺伝子として好ましい遺伝子は、Nucleosome assembly protein 1-like 1遺伝子、HR3遺伝子、14‐3‐3 zeta遺伝子、アルギニンリン酸化酵素遺伝子、Sparc遺伝子、ヒートショックプロテイン90遺伝子、cAMP-依存性タンパク質リン酸化酵素R1遺伝子、Warts遺伝子、Yorkie遺伝子、及びInhibitor-of-apoptosis protein遺伝子であり、より好ましくは、HR3遺伝子、ヒートショックプロテイン90遺伝子、Warts遺伝子、Yorkie遺伝子である。本発明の標的遺伝子には、前記１４種の遺伝子のホモログも含まれる。 Any one or more genes can be selected from the 14 genes described above and used as a target gene. Among them, preferable genes as target genes are Nucleosome assembly protein 1-like 1 gene, HR3 gene, 14-3-3 zeta gene, arginine kinase gene, Sparc gene, heat shock protein 90 gene, cAMP-dependent protein phosphorylation Enzyme R1 gene, Warts gene, Yorkie gene and Inhibitor-of-apoptosis protein gene, more preferably HR3 gene, heat shock protein 90 gene, Warts gene and Yorkie gene. The target genes of the present invention also include homologs of the 14 genes.
本発明の害虫駆除剤の有効成分である二本鎖ＲＮＡは、上記害虫に含まれる標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉作用を有するものであれば特に限定されない。 The double-stranded RNA that is an active ingredient of the pest control agent of the present invention is not particularly limited as long as it has an RNA interference action on the target gene contained in the pest.
例えば、本発明の害虫駆除剤の有効成分である二本鎖ＲＮＡは、上記標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉作用を有する限り、標的遺伝子の全部と相補的であっても良いし、標的遺伝子の一部と相補的であってもよい。また、相補性に関しても、標的遺伝子を認識することができ、それに対してＲＮＡ干渉作用を有する限り、１００％よりも低くてもよい。二本鎖ＲＮＡがＲＮＡ干渉作用を有するために必要な相補性は、例えば、二本鎖ＲＮＡの長さや標的遺伝子のどの部分に相補的であるかによって変化するが、本発明の害虫駆除剤の有効成分である二本鎖ＲＮＡは、通常９０％以上の相補性を有していることが好ましく、より好ましくは９５％以上の相補性を有しており、最も好ましくは１００％の相補性を有している。 For example, double-stranded RNA, which is an active ingredient of the pest control agent of the present invention, may be complementary to the entire target gene as long as it has an RNA interference effect on the target gene. It may be complementary to the part. Further, the complementarity may be lower than 100% as long as the target gene can be recognized and has an RNA interference effect on the target gene. The complementarity necessary for the double-stranded RNA to have an RNA interference action varies depending on, for example, the length of the double-stranded RNA and which part of the target gene is complementary, but the pest control agent of the present invention The double-stranded RNA that is the active ingredient preferably has 90% or more complementarity, more preferably 95% or more complementarity, and most preferably 100% complementarity. Have.
ここにおいて本発明の害虫駆除剤の有効成分である二本鎖ＲＮＡが標的遺伝子と相補的であるとは、二本鎖ＲＮＡを構成する一方のセンス鎖が有する塩基配列が標的遺伝子の塩基配列と相補的であることを意味する。 Here, the double-stranded RNA that is an active ingredient of the pest control agent of the present invention is complementary to the target gene. The base sequence of one sense strand constituting the double-stranded RNA is the base sequence of the target gene. Means complementary.
二本鎖ＲＮＡの長さについても、上記標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉作用を有し、その結果害虫を致死に至らしめる効果を有する限り特に限定されない。例えば、二本鎖ＲＮＡは、標的遺伝子全体と相補的な塩基配列、即ち、標的遺伝子と同じ長さの塩基配列を有していてもよく、標的遺伝子の全塩基配列の一部の塩基配列に相当する長さを有していてもよい。一実施形態においては、二本鎖ＲＮＡを構成するセンス鎖ＲＮＡが有する塩基配列は、好ましくは、２００塩基以上の連続する塩基配列にわたって標的遺伝子の塩基配列と相補的であり、より好ましくは４００塩基以上の連続する塩基配列にわたって相補的である。このように比較的大きな二本鎖ＲＮＡを用いる場合、細胞が有する輸送系を利用して二本鎖ＲＮＡを細胞内に取り込ませることができるため、好ましい。また、２１塩基以上２３塩基以下の塩基配列から成るｓｉＲＮＡがＲＮＡ干渉を誘導するために有効であることも当該技術分野において知られているが、昆虫の場合は、細胞内に能動的に取り込まれないため、それを利用する場合は、その担体（ナノパーティクル、植物組織）が必要である。よって、担体を用いる一実施形態において、二本鎖ＲＮＡは、２１〜２３塩基や６０〜７０塩基の長さを有することが好ましい。ここでいう塩基の数とは、標的遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列を構成するヌクレオチドの数を意味する。 The length of the double-stranded RNA is not particularly limited as long as it has an RNA interference action on the target gene and, as a result, has the effect of causing the insect pest to be lethal. For example, the double-stranded RNA may have a base sequence complementary to the entire target gene, that is, a base sequence having the same length as the target gene, and a partial base sequence of the entire base sequence of the target gene. It may have a corresponding length. In one embodiment, the base sequence of the sense strand RNA constituting the double-stranded RNA is preferably complementary to the base sequence of the target gene over a continuous base sequence of 200 bases or more, more preferably 400 bases. It is complementary over the above continuous base sequences. Thus, when using comparatively big double stranded RNA, since double stranded RNA can be taken in in a cell using the transport system which a cell has, it is preferable. In addition, it is known in the art that siRNAs having a base sequence of 21 bases or more and 23 bases or less are effective for inducing RNA interference, but in the case of insects, they are actively incorporated into cells. Therefore, when using it, the carrier (nanoparticle, plant tissue) is required. Therefore, in one embodiment using a carrier, the double-stranded RNA preferably has a length of 21 to 23 bases or 60 to 70 bases. The number of bases here means the number of nucleotides constituting a base sequence complementary to the base sequence of the target gene.
二本鎖ＲＮＡが標的遺伝子の一部と相補的である場合、二本鎖ＲＮＡのセンス鎖配列を標的遺伝子のどの配列に相補的であるように設計するかは、例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴサーチ等の公知の方法を用いて決定することができる。例えば、標的遺伝子の開始コドンから約５０〜１００塩基下流のエキソン領域に存在する“ＡＡ”から始まる約１９〜３０塩基の領域であって、ＧＣ含有量が５０％前後の領域を標的の配列部分としてもよい。これは、このような領域を標的配列とすることで、優れたＲＮＡ干渉作用を有する二本鎖ＲＮＡが得られることが、当業界で経験的に知られているので、担体と用いることで有効である可能性がある。 When the double-stranded RNA is complementary to a part of the target gene, the sequence of the sense strand of the double-stranded RNA designed to be complementary to which sequence of the target gene is, for example, NCBI BLAST search, etc. This can be determined using a known method. For example, a region of about 19 to 30 bases starting from “AA” existing in an exon region about 50 to 100 bases downstream from the start codon of the target gene and having a GC content of about 50% is a target sequence portion. It is good. This is because it is empirically known in the art that double-stranded RNA having excellent RNA interference can be obtained by using such a region as a target sequence. There is a possibility.
二本鎖ＲＮＡは、前記センス鎖及びセンス鎖が有する塩基配列と相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖から構成される。ここで、センス鎖とアンチセンス鎖は、完全に相補的であることが好ましいが、アンチセンス鎖はセンス鎖と１又は複数の塩基が非相補的であってもよい。 Double-stranded RNA is composed of the sense strand and an antisense strand having a base sequence complementary to the base sequence of the sense strand. Here, the sense strand and the antisense strand are preferably completely complementary, but the antisense strand may be non-complementary to the sense strand and one or more bases.
二本鎖ＲＮＡは、全体に亘って完全に二本鎖であってもよいが、標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉作用を示す限り、部分的に一本鎖であってもよい。例えば、二本鎖ＲＮＡの３’又は５’末端が数塩基分一本鎖になっていてもよい。 The double-stranded RNA may be completely double-stranded throughout, but may be partially single-stranded as long as it exhibits an RNA interference effect on the target gene. For example, the 3 'or 5' end of double-stranded RNA may be single-stranded for several bases.
本発明において二本鎖ＲＮＡがＲＮＡ干渉作用を有するとは、二本鎖ＲＮＡが害虫の体内に導入された結果、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の合成が阻害されることを意味する。理論によって拘束されるのではないが、二本鎖ＲＮＡが標的の害虫の体内に取り込まれると、Ｄｉｃｅｒと呼ばれるタンパク質と複合体を形成し、二本鎖ＲＮＡは２１〜２３塩基のｓｉＲＮＡに分解される。次いで、ｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣに取り込まれ、相同な塩基配列を有する標的遺伝子に対応するｍＲＮＡと結合し、分解することで標的遺伝子の発現を阻害すると考えられる。このような一連の反応の結果、本発明の害虫駆除剤を用いることにより、害虫を死に至らしめ、駆除することができる。従って、本発明によれば、標的の害虫に含まれる標的遺伝子の塩基配列情報を基に、その標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉作用を有する二本鎖ＲＮＡを設計し、それを有効成分として標的の害虫に対する害虫駆除剤を作成することができ、当該標的の害虫を駆除することができる。 In the present invention, double-stranded RNA having an RNA interference action means that the synthesis of a protein encoded by a target gene is inhibited as a result of the double-stranded RNA being introduced into a pest body. Without being bound by theory, when double-stranded RNA is incorporated into the target pest body, it forms a complex with a protein called Dicer, and the double-stranded RNA is degraded into siRNA of 21 to 23 bases. The Next, siRNA is taken up by RISC, and is considered to inhibit target gene expression by binding and degrading to mRNA corresponding to the target gene having a homologous base sequence. As a result of such a series of reactions, by using the pest control agent of the present invention, the pest can be killed and controlled. Therefore, according to the present invention, based on the base sequence information of the target gene contained in the target pest, a double-stranded RNA having an RNA interference action against the target gene is designed, and the target RNA is used as an active ingredient. A pest control agent for a pest can be created, and the target pest can be controlled.
本発明の害虫駆除剤に含有される二本鎖ＲＮＡは、単一の標的遺伝子のみに対してＲＮＡ干渉作用を及ぼすように設計されてもよいが、必要に応じて複数の標的遺伝子を一度にターゲットとするように設計されてもよい。即ち、二本鎖ＲＮＡは、単一の標的遺伝子が有する塩基配列のみに相補的な塩基配列を有していてもよいが、複数の標的遺伝子が有する塩基配列に対して相補的な複数の塩基配列を有していてもよい。例えば、一実施形態において、本発明の害虫駆除剤の有効成分である二本鎖ＲＮＡは、少なくとも２つ以上の標的遺伝子が有する塩基配列に対して相補的な塩基配列を有し、別の実施形態においては、少なくとも３つ以上の標的遺伝子が有する塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する。この場合、複数の標的遺伝子は任意に組み合せることができる。二本鎖ＲＮＡにおける、別個の標的遺伝子に対して相補的である複数の領域は、リンカー配列を介して結合されていてもよく、またリンカーを介さずに直接結合されていてもよい。 The double-stranded RNA contained in the pest control agent of the present invention may be designed so as to exert an RNA interference action on only a single target gene. It may be designed to be targeted. That is, the double-stranded RNA may have a base sequence complementary only to the base sequence of a single target gene, but a plurality of bases complementary to the base sequence of a plurality of target genes. It may have an array. For example, in one embodiment, the double-stranded RNA that is the active ingredient of the pest control agent of the present invention has a base sequence complementary to the base sequence of at least two or more target genes, In a form, it has a base sequence complementary to the base sequence which at least 3 or more target genes have. In this case, a plurality of target genes can be arbitrarily combined. A plurality of regions in a double-stranded RNA that are complementary to separate target genes may be linked via a linker sequence, or may be directly linked without a linker.
また二本鎖ＲＮＡは、単一の標的遺伝子が有する塩基配列と相補的な塩基配列を複数コピー有していても良い。一実施形態において、本発明の二本鎖ＲＮＡは、同一の標的遺伝子であるが、由来の異なる（即ち、標的とする害虫の種類が異なる）複数の遺伝子の塩基配列と相補的な複数の塩基配列を有していてもよい。このように、異なる標的遺伝子又は同一であるが標的とする害虫が異なる複数の標的遺伝子を任意に組み合せ、それに相補的な二本鎖ＲＮＡを使用することによって、複数の害虫を一度にターゲットとすることも可能である。 The double-stranded RNA may have a plurality of copies of a base sequence complementary to the base sequence of a single target gene. In one embodiment, the double-stranded RNA of the present invention is the same target gene, but a plurality of bases complementary to the base sequences of a plurality of genes having different origins (that is, different target pest types). It may have an array. In this way, multiple target genes can be targeted at once by arbitrarily combining multiple target genes with different target genes or the same but different target pests and using double-stranded RNA complementary thereto It is also possible.
本発明の害虫駆除剤が、特定の害虫又は害虫群だけの駆除を目的として使用される場合、本発明の二本鎖ＲＮＡは特定の害虫又は害虫群以外の生物に対してＲＮＡ干渉作用を起さないことが好ましい。従って、二本鎖ＲＮＡが有する塩基配列は特定の害虫又は害虫群以外の生物が有するＤＮＡの塩基配列と低い相同性を有することが好ましい。この場合、好ましくは、特定の害虫又は害虫群以外の生物が有するＤＮＡの塩基配列と３０％以下の相同性を有し、より好ましくは２０％以下の相同性を有し、更に好ましくは１０％以下の相同性を有する。 When the pest control agent of the present invention is used for the purpose of controlling only a specific pest or a group of pests, the double-stranded RNA of the present invention causes an RNA interference action on organisms other than the specific pest or the pest group. Preferably not. Therefore, it is preferable that the base sequence of the double-stranded RNA has a low homology with the base sequence of the DNA of the organism other than the specific pest or the pest group. In this case, preferably, it has a homology of 30% or less, more preferably 20% or less, more preferably 10%, with the DNA base sequence of a specific pest or organism other than the pest group. It has the following homology.
本発明の害虫駆除剤の有効成分である二本鎖ＲＮＡは、標的遺伝子の塩基配列情報及び公知のＲＮＡ合成技術に従って調製することができる。本発明の二本鎖ＲＮＡは、２つの一本鎖ＲＮＡを別個に合成し、これらをハイブリダイズさせる方法によって合成してもよい。また、二本鎖ＲＮＡは、発現ベクターを用いて微生物等に導入し、生物学的に合成してもよい。 Double-stranded RNA that is an active ingredient of the pest control agent of the present invention can be prepared according to the base sequence information of the target gene and known RNA synthesis techniques. The double-stranded RNA of the present invention may be synthesized by a method of synthesizing two single-stranded RNAs separately and hybridizing them. Alternatively, double-stranded RNA may be biologically synthesized by introducing it into a microorganism or the like using an expression vector.
本発明の害虫駆除剤を使用して害虫を駆除するためには、有効成分である二本鎖ＲＮＡを害虫の体内に導入させることが必要である。二本鎖ＲＮＡの導入は、当該技術分野において通常使用される任意の方法を適宜選択して行うことができる。例えば、本発明の二本鎖ＲＮＡを適切な溶液に溶解し、害虫に噴霧して体内に取り込ませてもよく、二本鎖ＲＮＡを含有する溶液を毛細管などで直接害虫に導入してもよい（インジェクション）。二本鎖ＲＮＡを昆虫の餌に混ぜ、餌状の害虫駆除剤として害虫に摂取させることもできる。本発明の二本鎖ＲＮＡを遺伝子組み換え技術を用いて害虫が摂取する微生物や植物中で合成させ、これを害虫に摂取させることによって二本鎖ＲＮＡを導入することもできる。害虫に特異的に感染するウイルスに本発明の二本鎖ＲＮＡを導入し、これを害虫駆除剤として用いて害虫に二本鎖ＲＮＡを導入してもよい。 In order to control pests using the pest control agent of the present invention, it is necessary to introduce double-stranded RNA, which is an active ingredient, into the pest body. Introduction of double-stranded RNA can be performed by appropriately selecting any method usually used in the art. For example, the double-stranded RNA of the present invention may be dissolved in an appropriate solution, sprayed onto the pest and taken into the body, or the solution containing the double-stranded RNA may be directly introduced into the pest through a capillary tube or the like. (injection). Double-stranded RNA can also be mixed with insect food and consumed by pests as a bait-like pest control agent. The double-stranded RNA of the present invention can also be introduced by synthesizing the double-stranded RNA of the present invention in a microorganism or plant ingested by a pest using genetic recombination technology, and ingesting this into the pest. The double-stranded RNA of the present invention may be introduced into a virus that specifically infects pests, and the double-stranded RNA may be introduced into the pests using this as a pest control agent.
本発明の害虫駆除剤は、二本鎖ＲＮＡの他に賦形剤や希釈剤などの更なる成分を含有していてもよい。本発明の害虫駆除剤は、用途に応じた剤形で用いることができ、液剤、固形剤、半固形剤、粉末剤など適宜選択することができる。 The pest control agent of the present invention may contain additional components such as excipients and diluents in addition to the double-stranded RNA. The pest control agent of the present invention can be used in a dosage form according to the application, and can be appropriately selected from a liquid agent, a solid agent, a semi-solid agent, a powder agent and the like.
本発明の害虫駆除剤を用いて標的の害虫を駆除する場合、害虫個体当りに少なくとも10フェムトモルの二本鎖ＲＮＡを害虫に導入することで害虫を駆除することができる。好ましくは、１００フェムトモル程度の二本鎖ＲＮＡを投与することが望ましく、より好ましくは１ピコモル程度の二本鎖ＲＮＡを害虫に導入することでより確実に駆除が可能となる。
ＩＩ．害虫駆除作用を有する二本鎖ＲＮＡのスクリーニング方法
本発明の一実施形態は、上記（ａ）〜（ｎ）の標的遺伝子から選択される少なくとも１つの害虫に含まれる標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉作用を有する二本鎖ＲＮＡを選抜する工程を含む、害虫駆除作用を有する二本鎖ＲＮＡのスクリーニング方法である。上述するように、害虫が有する上記標的遺伝子にＲＮＡ干渉作用を有する二本鎖ＲＮＡは、当該標的害虫を殺す効果を有するため、本発明に従って、そのような害虫駆除剤の有効成分となる二本鎖ＲＮＡをスクリーニングすることができる。
When a target pest is controlled using the pest control agent of the present invention, the pest can be controlled by introducing at least 10 femtomole of double-stranded RNA per pest individual. Preferably, it is desirable to administer about 100 femtomole of double-stranded RNA, and more preferably, about 1 picomole of double-stranded RNA is introduced into the pest, so that it can be controlled more reliably.
II. Method for screening double-stranded RNA having pest control action One embodiment of the present invention is an RNA interference action on a target gene contained in at least one pest selected from the target genes of (a) to (n) above. A method for screening double-stranded RNA having a pest control action, comprising a step of selecting double-stranded RNA having As described above, double-stranded RNA having an RNA interference action on the target gene possessed by the pest has an effect of killing the target pest. Therefore, according to the present invention, the double-stranded RNA that is an active ingredient of such a pest control agent is used. Strand RNA can be screened.
害虫に含まれる標的遺伝子（ａ）〜（ｎ）の塩基配列と相補的なセンス鎖と前記センス鎖と相補的なアンチセンス鎖とから成る二本鎖ＲＮＡは、上述するように、遺伝子データベースにある情報を基に、公知の遺伝子工学的手法により作製することができる。 Double-stranded RNA comprising a sense strand complementary to the base sequence of the target genes (a) to (n) contained in the pest and an antisense strand complementary to the sense strand is stored in the gene database as described above. Based on certain information, it can be prepared by a known genetic engineering technique.
害虫に対してＲＮＡ干渉作用を有する二本鎖ＲＮＡの選抜は、作製した二本鎖ＲＮＡを害虫に導入し、その後の致死率を二本鎖ＲＮＡを導入していないコントロール群の害虫と比較し、有意義な致死率を示す二本鎖ＲＮＡを選別することにより行うことができる。 For selection of double-stranded RNA having RNA interference action against pests, the prepared double-stranded RNA is introduced into the pests, and the subsequent lethality is compared with that of the control group pests into which the double-stranded RNA has not been introduced. It can be performed by selecting a double-stranded RNA showing a significant lethality.
実施例１
コオロギｍＲＮＡの精製及び二本鎖ＲＮＡの調製
フタホシコオロギ（供試昆虫１）を用い、その胚、幼虫、成虫脳をｍＲＮＡ精製用の溶液において、均一化し、フェノールクロロフォルム処理後、エタノール沈殿にて、ｍＲＮＡを沈殿させた。得られたｍＲＮＡが分解していないことを変性ゲルを用いて確認した。その後、オリゴｄＴカラムを利用して、ｍＲＮＡのみを単離した。次に、この単離されたｍＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡは、パイロシークエンス法により、塩基配列を決定した。決定された配列は、データベースとして収録し、現在は、ＤＤＢＪに登録して、一般に公開している。この得られた配列情報から、ＢＬＡＳＴサーチにより、昆虫の相同遺伝子を探し、アノテーションを行った。表１は、多数の候補遺伝子のうち実際に試験を行った一部を示す。表１のＮｏ．１２〜２２の遺伝子は、細胞増殖に必須の遺伝子である。
Example 1
Purification of cricket mRNA and preparation of double-stranded RNA Using phtalophyllum cricket (test insect 1), the embryo, larvae, and adult brain were homogenized in a solution for purifying mRNA, treated with phenol chloroform, and then subjected to ethanol precipitation. Precipitated. It was confirmed using a denaturing gel that the obtained mRNA was not degraded. Subsequently, only mRNA was isolated using an oligo dT column. Next, cDNA was synthesized by reverse transcriptase using the isolated mRNA as a template. The nucleotide sequence of the obtained cDNA was determined by the pyrosequencing method. The determined sequences are recorded as a database, and are currently registered in the DDBJ and open to the public. From the obtained sequence information, insect homologous genes were searched for by BLAST search and annotated. Table 1 shows some of the many candidate genes that were actually tested. No. in Table 1 The 12-22 genes are genes essential for cell growth.
上記表１に示される各遺伝子と相補的な二本鎖ＲＮＡは、MEGAscript（登録商標）High Yield Transcription Kit (Ambion社製)を使用し、製造者のプロトコールに従って調製した。得られたペレット状の二本鎖ＲＮＡを風乾し、ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｍＱに溶解した。吸光度測定により各溶液中の二本鎖ＲＮＡの濃度を確認した後、アガロースゲル電気泳動を用いて二本鎖ＲＮＡが精製されていることを確認した。このようにして、上記表１に示される各遺伝子の全配列と相補的な二本鎖ＲＮＡを得た。表１の遺伝子Ｎｏ．１〜１４を構成する塩基配列と相補的なＲＮＡ配列を各々配列番号１〜１４に示す。 Double-stranded RNA complementary to each gene shown in Table 1 above was prepared using MEGAscript (registered trademark) High Yield Transcription Kit (Ambion) according to the manufacturer's protocol. The obtained pellet-shaped double-stranded RNA was air-dried and dissolved in RNase free mQ. After confirming the concentration of double-stranded RNA in each solution by measuring absorbance, it was confirmed that the double-stranded RNA was purified using agarose gel electrophoresis. Thus, double-stranded RNA complementary to the entire sequence of each gene shown in Table 1 was obtained. The gene no. RNA sequences complementary to the base sequences constituting 1 to 14 are shown in SEQ ID NOs: 1 to 14, respectively.
実施例２
コオロギに対するＲＮＡ干渉作用の確認
実施例１で得られた各遺伝子をＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｍＱに溶解し、２０μＭの二本鎖ＲＮＡ導入用溶液を調製した。一方、ＦＬＡＭＩＮＧ／ＢＲＯＷＮＭＩＣＲＯＰＩＰＥＴＴＥ ＰＵＬＬＥＲ（ＳＵＴＴＥＲ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴ社製)のプログラム（１ ＨＥＡＴ＝７５０，ＰＵＬＬ＝ ，ＶＥＬ＝３０，ＴＩＭＥ＝２５０）で乾熱滅菌済みのキャピラリー（１ ｖｉａｌ ３．５” ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ ＤＲＵＭＭＯＮＤ ＃３‐０００−２０３‐Ｇ／Ｘ（ＤＲＵＭＭＯＮＤ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社））から針の原型を作成した。研磨器ＮＡＲＩＳＨＩＧＥ ＥＧ‐４を水で濡らしながら回転させて針先を削った。このようにして先端を尖らせたキャピラリーに前記二本鎖ＲＮＡ導入用溶液を吸引し、約３０分間氷上麻酔をかけたフタホシコオロギ（３齢）の腹部の第４節と第５節の間に二本鎖ＲＮＡを２００ｎｌインジェクションした。このようにして各標的遺伝子についての二本鎖ＲＮＡを導入したコオロギを３３℃、湿度３５％で飼育し、その後の生育状態を観察した。２０日間観察した結果を以下の表２に示す。なお、事前に空試験として行った対象区のフタホシコオロギ（ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｍＱ ２００ｎｌのみをインジェクション）には、２０日後も死亡個体は確認されなかった。
Example 2
Confirmation of RNA interference action on cricket Each gene obtained in Example 1 was dissolved in RNase free mQ to prepare a 20 μM double-stranded RNA introduction solution. On the other hand, capillaries that have been sterilized by dry heat using a program (1 HEAT = 750, PULL =, VEL = 30, TIME = 250) of FLAMING / BROWNMICROPIPETTE PULLER (manufactured by SUTTER INSTRUMENT) (1 vial 3.5 "capillaries DRUMDON # DRUMD # 3 The needle was made from 000-203-G / X (DRUMMOND SCIENTIFIC), and the tip of the needle was sharpened by rotating the polishing tool NARISHIGE EG-4 while wet with water. The double-stranded RNA introduction solution was aspirated into a capillary, and 200 nl of double-stranded RNA was injected between the 4th and 5th nodes of the abdomen of phtalophyllum cricket (3 years old) anesthetized on ice for about 30 minutes. Each way A cricket introduced with double-stranded RNA for the target gene was bred at 33 ° C. and 35% humidity, and the subsequent growth state was observed, and the results observed for 20 days are shown in Table 2 below. No dead individuals were confirmed even after 20 days in the target area phtalophyllum cricket (only RNase free mQ 200nl injected).
表２に示す通り、遺伝子Ｎｏ．１〜１４を標的遺伝子とした二本鎖ＲＮＡを導入した場合に、有意義な割合でコオロギが致死することが分かった。特に、ＨＲ３遺伝子、Ｓｐａｒｃ遺伝子、ヒートショックプロテイン９０遺伝子、ｃＡＭＰ−依存性タンパク質リン酸化酵素Ｒ１、Ｗａｒｔｓ遺伝子、Ｙｏｒｋｉｅ遺伝子及びＩｎｈｉｂｉｔｏｒ−ｏｆ−ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子をターゲットとすることで非常に高い致死率が得られることが分かった。 As shown in Table 2, gene no. It was found that when a double-stranded RNA targeting 1 to 14 was introduced, crickets were killed at a significant rate. In particular, by targeting HR3 gene, Sparc gene, heat shock protein 90 gene, cAMP-dependent protein kinase R1, Warts gene, Yorkie gene, and Inhibitor-of-apoptosis protein gene, a very high lethality can be obtained. I found out that
実施例３
ゴキブリｍＲＮＡの精製及び二本鎖ＲＮＡの調製
チャバネゴキブリ（供試昆虫２）を用い、その胚、幼虫、成虫をｍＲＮＡ精製用の溶液において、均一化し、フェノールクロロフォルム処理後、エタノール沈殿にて、ｍＲＮＡを沈殿させた。次に、この単離されたｍＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成した。実施例２の結果から有効性の確認された表２のＮｏ.1〜１４の遺伝子のうち、７遺伝子を任意に選択した。選択した遺伝子を表３に示す。表３の遺伝子をチャバネゴキブリ遺伝子から単離するため、コオロギや他の昆虫の配列情報から縮重プライマーを設計し、ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。
Example 3
Cockroach mRNA purification and double-stranded RNA preparation Using German cockroaches (test insect 2), the embryo, larvae, and adults were homogenized in a solution for purifying mRNA, treated with phenol chloroform, and then precipitated with ethanol. Precipitated. Next, cDNA was synthesized by reverse transcriptase using the isolated mRNA as a template. Of the genes No. 1 to 14 in Table 2 whose effectiveness was confirmed from the results of Example 2, 7 genes were arbitrarily selected. The selected genes are shown in Table 3. In order to isolate the genes in Table 3 from German cockroach genes, degenerate primers were designed from sequence information of crickets and other insects, and PCR was performed using cDNA as a template.
表１に示されるチャバネゴキブリ由来の各遺伝子と相補的な二本鎖ＲＮＡを、実施例１と同様にMEGAscript(登録商標)High Yield Tanscription Kit (Ambion社製)を使用して調製した。得られたペレット状の二本鎖ＲＮＡを風乾し、RNase free mQに溶解した。吸光度測定により各溶液中の二本鎖ＲＮＡの濃度を確認した後、アガロースゲル電気泳動を用いて二本鎖ＲＮＡが精製されていることを確認した。このようにして、表３に示されるチャバネゴキブリ由来の各遺伝子の全配列と相補的な二本鎖ＲＮＡを得た。表３の遺伝子Ｎｏ．２３〜２９を構成する塩基配列と相補的なＲＮＡ配列を各々配列番号１５〜２１に示す。 Double-stranded RNA complementary to each gene derived from German cockroaches shown in Table 1 was prepared using MEGAscript (registered trademark) High Yield Tanscription Kit (Ambion) as in Example 1. The obtained pellet-shaped double-stranded RNA was air-dried and dissolved in RNase free mQ. After confirming the concentration of double-stranded RNA in each solution by measuring absorbance, it was confirmed that the double-stranded RNA was purified using agarose gel electrophoresis. Thus, double-stranded RNA complementary to the entire sequence of each gene derived from German cockroaches shown in Table 3 was obtained. The gene no. The RNA sequences complementary to the base sequences constituting 23-29 are shown in SEQ ID NOs: 15-21, respectively.
実施例４
ゴキブリに対するＲＮＡ干渉作用の確認
実施例３で得られた各遺伝子をＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｍＱに溶解し、２０μＭの二本鎖ＲＮＡ導入用溶液を調製した。一方、ＦＬＡＭＩＮＧ／ＢＲＯＷＮ ＭＩＣＲＯＰＩＰＥＴＴＥ ＰＵＬＬＥＲ（ＳＵＴＴＥＲ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴ社製)のプログラム（１ ＨＥＡＴ＝７５０，ＰＵＬＬ＝ ，ＶＥＬ＝３０，ＴＩＭＥ＝２５０）で乾熱滅菌済みのキャピラリー（１ ｖｉａｌ ３．５” ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ ＤＲＵＭＭＯＮＤ ＃３‐０００−２０３‐Ｇ／Ｘ（ＤＲＵＭＭＯＮＤ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社））から針の原型を作成した。研磨器ＮＡＲＩＳＨＩＧＥ ＥＧ‐４を水で濡らしながら回転させて針先を削った。このようにして先端を尖らせたキャピラリーに、実施例３で調製した二本鎖ＲＮＡ導入用溶液を吸引し、約３０分間氷上麻酔をかけたチャバネゴキブリ（３〜４齢）の後脚基節部付近の胸部に二本鎖ＲＮＡを２００ｎｌインジェクションした。このようにして各標的遺伝子についての二本鎖ＲＮＡを導入したチャバネゴキブリを２４℃、湿度３５％で飼育し、その後の生育状態を観察した。３０日間観察した結果を以下の表４に示す。なお、事前に空試験として行った対象区のチャバネゴキブリ（ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｍＱ ２００ｎｌのみをインジェクション）には、３０日後も死亡個体は確認されなかった。
Example 4
Confirmation of RNA interference action on cockroach Each gene obtained in Example 3 was dissolved in RNase free mQ to prepare a 20 μM solution for introducing double-stranded RNA. On the other hand, capillaries that have been sterilized by dry heat with a program (1 HEAT = 750, PULL =, VELL = 30, TIME = 250) of FLAMING / BROWN MICROPIPETTE PULLER (manufactured by SUTTER INSTRUMENT) (1 vial 3.5 "capillaries DRUM # DRUMM -000-203-G / X (DRUMMMOND SCIENTIFIC)) The needle tip was sharpened by rotating the polishing tool NARISHIGE EG-4 while wetting it with water. The solution for introducing the double-stranded RNA prepared in Example 3 was sucked into the capillary, and double-stranded RNA was placed on the chest in the vicinity of the proximal part of the hind leg of the cockroach (3-4 years old) anesthetized on ice for about 30 minutes. Was injected at 200 nl. Thus, German cockroaches introduced with double-stranded RNA for each target gene were bred at 24 ° C. and 35% humidity, and the subsequent growth state was observed, and the results observed for 30 days are shown in Table 4 below. No dead individuals were confirmed even after 30 days in the German cockroach (only RNase free mQ 200nl injected) in the target area, which was previously tested as a blank test.
表４に示す通り、遺伝子Ｎｏ．２３〜２９を標的遺伝子とした二本鎖ＲＮＡを導入した場合に、有意義な割合でゴキブリが致死することが分かった。特に、ＨＲ３遺伝子、ヒートショックプロテイン９０遺伝子、Ｗａｒｔｓ遺伝子、Ｙｏｒｋｉｅ遺伝子をターゲットとすることで非常に高い致死率が得られることが分かった。 As shown in Table 4, gene no. It was found that when a double-stranded RNA having 23 to 29 as a target gene was introduced, cockroaches were killed at a significant rate. In particular, it was found that a very high lethality can be obtained by targeting the HR3 gene, the heat shock protein 90 gene, the Warts gene, and the Yorkie gene.
Claims (5)
（ａ）Nucleosome assembly protein 1-like 1遺伝子
（ｂ）ポリＡ結合タンパク質遺伝子
（ｃ）HR3遺伝子
（ｄ）14‐3‐3 zeta遺伝子
（ｅ）アルギニンリン酸化酵素遺伝子
（ｆ）膜結合型アルカリホスファターゼ遺伝子
（ｇ）Cathepsin L1遺伝子
（ｈ）Sparc遺伝子
（ｉ）ヒートショックプロテイン 90遺伝子
（ｊ）cAMP-依存性タンパク質リン酸化酵素 R1遺伝子
（ｋ）Wnt inhibitory factor 1 遺伝子
（ｌ）Warts遺伝子
（ｍ）Yorkie遺伝子
（ｎ）Inhibitor-of-apoptosis protein遺伝子。 A sense strand comprising a base sequence complementary to all or part of at least one target gene selected from the group consisting of the following (a) to (n), and an antisense strand comprising a sequence complementary to the sense strand A pest control agent, comprising a double-stranded RNA comprising a double-stranded RNA having an RNA interference action on the target gene, wherein the target gene is contained in a pest:
(A) Nucleosome assembly protein 1-like 1 gene (b) Poly A-binding protein gene (c) HR3 gene (d) 14-3-3 zeta gene (e) Arginine kinase gene (f) Membrane-bound alkaline phosphatase Gene (g) Catepsin L1 gene (h) Sparc gene (i) Heat shock protein 90 gene (j) cAMP-dependent protein kinase R1 gene (k) Wnt inhibitory factor 1 gene (l) Warts gene (m) Yorkie Gene (n) Inhibitor-of-apoptosis protein gene.
（ａ）Nucleosome assembly protein 1-like 1遺伝子
（ｂ）ポリＡ結合タンパク質遺伝子
（ｃ）HR3遺伝子
（ｄ）14‐3‐3 zeta遺伝子
（ｅ）アルギニンリン酸化酵素遺伝子
（ｆ）膜結合型アルカリホスファターゼ遺伝子
（ｇ）Cathepsin L1遺伝子
（ｈ）Sparc遺伝子
（ｉ）ヒートショックプロテイン 90遺伝子
（ｊ）cAMP-依存性タンパク質リン酸化酵素 R1遺伝子
（ｋ）Wnt inhibitory factor 1 遺伝子
（ｌ）Warts遺伝子
（ｍ）Yorkie遺伝子
（ｎ）Inhibitor-of-apoptosis protein遺伝子。 Two having a pest control action, including a step of selecting a double-stranded RNA having an RNA interference action against a target gene contained in at least one pest selected from the group consisting of the following (a) to (n) Strand RNA screening method:
(A) Nucleosome assembly protein 1-like 1 gene (b) Poly A-binding protein gene (c) HR3 gene (d) 14-3-3 zeta gene (e) Arginine kinase gene (f) Membrane-bound alkaline phosphatase Gene (g) Catepsin L1 gene (h) Sparc gene (i) Heat shock protein 90 gene (j) cAMP-dependent protein kinase R1 gene (k) Wnt inhibitory factor 1 gene (l) Warts gene (m) Yorkie Gene (n) Inhibitor-of-apoptosis protein gene.
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