JP2009008739A - 生体観察装置 - Google Patents

Abstract

【課題】低倍率での観察を可能とし、かつ、同一の試料からの戻り光を複数の撮像手段により撮影する。
【解決手段】試料Ａを搭載するステージ２と、該ステージ２に搭載された試料Ａに対して照射する照明光を発生する照明光源３と、試料Ａからの戻り光を集光する対物レンズ４と、該対物レンズ４により集光された戻り光を複数に分岐するビームスプリッタ５と、該ビームスプリッタ５により分岐された戻り光をそれぞれ結像させる複数の結像レンズ１６，１７と、各結像レンズ１６，１７により結像された試料の観察像を撮影する複数の撮像手段１０，１１とを備える生体観察装置１を提供する。
【選択図】 図１

Description

本発明は、生体観察装置に関するものである。

従来、複数の蛍光色素で染色した標本や複数の蛍光タンパク質を発現させた標本を観察する観察装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
この観察装置は、標本に複数の波長の光を同時に照射して、標本から戻る光を対物レンズにより集光し、かつ、結像レンズによって結像される途中でダイクロイックミラーにより波長毎に分岐し、複数の撮像手段によって撮像するようになっている。

特開２００４−１７７６６２号公報

しかしながら、特許文献１に開示された観察装置は、対物レンズにより集光した標本からの戻り光を結像レンズと撮像手段との間で分離しているが、生体観察装置のように低倍率の縮小光学系が必要な場合には、結像レンズと撮像手段との間のスペースを大きく確保することが困難であり、同様の機構を構成することができないという不都合がある。

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、低倍率での観察を可能とし、かつ、同一の試料からの戻り光を複数の撮像手段により撮影することができる生体観察装置を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、試料を搭載するステージと、該ステージに搭載された試料に対して照射する照明光を発生する照明光源と、試料からの戻り光を集光する対物レンズと、該対物レンズにより集光された戻り光を複数に分岐するビームスプリッタと、該ビームスプリッタにより分岐された戻り光をそれぞれ結像させる複数の結像レンズと、各結像レンズにより結像された試料の観察像を撮影する複数の撮像手段とを備える生体観察装置を提供する。

本発明によれば、照明光源から発せられた照明光がステージに搭載された試料に照射されると、試料からの戻り光が対物レンズにより集光され、集光された戻り光がビームスプリッタにより複数の光路の分岐される。分岐された各戻り光は、別個の結像レンズにより結像された後、複数の撮像手段により撮影される。これにより、複数の観察像を取得することができる。この場合において、結像レンズを分けて設けているので、倍率の異なる観察像を取得する場合に、結像レンズによる戻り光の結像に必要な距離を異ならせることができる。そして、結像レンズと撮像手段との間で分岐する従来の装置とは異なり、結像レンズの手前でビームスプリッタにより分岐するので、低倍率の観察像を取得する場合には、結像レンズと撮像手段との間隔を短く設定することができる。

上記発明においては、前記照明光源が、励起光を含む照明光を発生し、前記ビームスプリッタと前記複数の撮像手段との間に、試料における反射光、蛍光または発光のいずれかを透過するフィルタが配置されていることとしてもよい。
このようにすることで、フィルタによって試料における反射光、蛍光または発光のいずれかを選択して各撮像手段により撮影することができる。そして、別々に得られた反射光画像と蛍光画像または発光画像のいずれかとを重ねて表示することにより、試料のどの部位から蛍光または発光が出射されているのかを一目で確認することができる。また、撮像手段を切り替えることなく、リアルタイムに観察することができる。

また、上記発明においては、前記複数の撮像手段が、モノクロ画像を取得可能な撮像手段およびカラー画像を取得可能な撮像手段であることとしてもよい。
このようにすることで、用途に応じてカラー画像またはモノクロ画像を取得することができる。すなわち、カラー画像は観察像を視認し易い利点があり、モノクロ画像は輝度解析を容易にすることができるという利点があるので、両方備えることで、種々の用途に適用することができる。

また、上記発明においては、前記複数の結像レンズが異なる焦点距離を有していることとしてもよい。
このようにすることで、各結像レンズと各撮像手段との間の距離を異ならせ、異なる倍率の観察像を同時に観察することができる。

本発明によれば、低倍率での観察を可能とし、かつ、同一の試料からの戻り光を複数の撮像手段により撮影することができるという効果を奏する。

以下、本発明の一実施形態に係る生体観察装置１について、図１を参照して説明する。
本実施形態に係る生体観察装置１は、マウス等の実験小動物のような生体を試料Ａとして観察するための装置である。

本実施形態に係る生体観察装置１は、図１に示されるように、実験小動物等の試料Ａを搭載するステージ２と、該ステージ２に搭載された試料Ａに対して照射する照明光を発生する照明光源３と、該照明光源３からの照明光を試料Ａに照射する一方、試料Ａからの戻り光を集光する対物レンズ４と、該対物レンズ４により集光された戻り光を２つに分岐する第１のビームスプリッタ５と、該第１のビームスプリッタ５により分岐された戻り光をそれぞれ導光する２つの観察光学系６、７と、各観察光学系６，７により導光された戻り光の一部を選択的に透過させるフィルタ８，９と、該フィルタ８，９を透過した戻り光を撮影する２つの撮像手段１０，１１とを備えている。

また、各撮像手段１０，１１からの出力は、画像処理装置１２に接続され、画像処理装置１２はモニタ１３に接続されている。
図中、符号１４は、複数の対物レンズ４を切替可能に保持する対物ターレット、符号１９は、観察光学系６，７、第１のビームスプリッタ１５、対物レンズ４、フィルタ８，９および試料Ａを搭載したステージ２を取り囲み、外光の入射を遮断する暗箱装置である。

照明光源３は、試料Ａ内に含有される蛍光物質を励起することができる励起波長を含む比較的広い波長帯域の照明光を発生するようになっている。
前記照明光源３と対物レンズ４との間には第２のビームスプリッタ１５が配置され、照明光源３からの照明光の一部を反射して対物レンズ４側に指向させる一方、試料Ａからの戻り光をの一部を透過して第１のビームスプリッタ５に指向させるようになっている。
前記第１、第２のビームスプリッタ５，１５は、例えば、ハーフミラーである。

前記２つの観察光学系６，７は、図示しないレンズ等の光学系を備えているとともに、それぞれ戻り光を集光する結像レンズ１６，１７を備えている。各結像レンズ１６，１７は、集光した戻り光を、それぞれ、撮像手段１０，１１の撮像面に結像させるようになっている。図中、符号１８はミラーである。

前記フィルタ８，９は、試料Ａから戻る光の内、照明光と同一の波長帯域の光の通過を許容し、それ以外の光の通過を禁止するフィルタ８と、照明光と同一の波長帯域の光の通過を禁止し、それ以外の光の通過を許容するフィルタ９とが別々の光路に配置されている。

撮像手段１０，１１は、それぞれＣＣＤカメラである。
これにより、一方の撮像手段１０によっては、試料Ａからの戻り光としての反射光を撮影して反射光画像が取得され、他方の撮像手段１１によっては、試料Ａからの戻り光としての蛍光を撮影して蛍光画像が取得されるようになっている。

画像処理装置１２は、２つの撮像手段１０，１１により取得された反射光画像と蛍光画像とを重ね合わせ処理するようになっている。モニタ１３は、画像処理装置１２により重ね合わせられた反射光画像と蛍光画像とを同時に表示するようになっている。

このように構成された本実施形態に係る生体観察装置１の作用について、以下に説明する。
本実施形態に係る生体観察装置１を用いて、実験小動物等の試料Ａの観察を行うには、試料Ａに対して癌等の腫瘍組織に特異的に集積する蛍光薬剤を投与あるいは注射した状態で、麻酔によって睡眠状態とした試料Ａをステージ２に固定し、照明光源３を作動させて、照明光を出射させる。
照明光源３から出射された照明光は、ハーフミラーからなる第２のビームスプリッタ１５によってその一部が対物レンズ４に指向され、対物レンズ４によって集光されてステージ２上の試料Ａに照射される。

照明光には励起波長の光が含まれているので、照射された励起波長の光によって、試料Ａ内に含有されている蛍光薬剤が励起され、所定の波長の蛍光が発生する。また、照射された照明光の内の一部は、試料Ａの表面において反射される。
したがって、試料Ａから発生した蛍光および試料Ａの表面における反射光が、戻り光として対物レンズ４により集光され、その一部が第２のビームスプリッタ１５を透過して、第１のビームスプリッタ５に指向され、第１のビームスプリッタ５によって２つの光路に分岐される。

各光路には観察光学系６，７が配置され、該観察光学系６，７に含まれる結像レンズ１６，１７によって、それぞれの光が集光される。結像レンズ１６，１７によって集光された光は、それぞれフィルタ８，９を透過させられることにより、所定の波長成分のみの通過を許容され、他の波長成分の通過を禁止される。

一方の光路のフィルタ９は、蛍光のみを通過させ、他の波長帯域の光の通過を禁止するので、通過した蛍光が撮像手段１１の撮像面に結像されることにより、蛍光画像が取得される。他方の光路のフィルタ８は、蛍光の透過を禁止し、他の波長帯域の光の通過を許容するので、通過した反射光が撮像手段１０の撮像面に結像されることにより、反射光画像が取得される。

そして、各撮像手段１０，１１によって取得された蛍光画像および反射光画像は、画像処理装置１２において重ね合わせられた後に、モニタ１３に同時に表示される。
これにより、観察者は、蛍光画像と反射光画像との重ね合わせられた画像をモニタ１３上において同時に観察することができ、反射光画像によって表示される試料Ａの外観を見ながら、蛍光画像によって表示される腫瘍等の位置および大きさを容易に確認することができる。特に、蛍光画像と反射光画像とを重ね合わせて表示することにより、両画像をリアルタイムに同時に観察することができるという利点がある。

この場合において、本実施形態に係る生体観察装置１によれば、試料Ａからの戻り光を結像レンズ１６，１７の前段において分岐するので、観察光学系６，７として低倍率の縮小光学系を採用し、結像レンズ１６，１７と撮像手段１０，１１との間隔を大きくできない場合においても、蛍光画像と反射光画像とを別個に同時に観察することができる。

なお、本実施形態においては、ハーフミラーからなる第１のビームスプリッタ５により戻り光を分岐することとしたが、これに代えて、ダイクロイックミラーを採用してもよい。例えば、励起光の波長を４６０〜４９０ｎｍとし、発生する蛍光の波長が５１０ｎｍ以上である場合に、５０５ｎｍを境界として分岐するダイクロイックミラーを採用することにより、戻り光を無駄なく分岐して、明るい蛍光画像および反射光画像を取得することができる。

また、本実施形態においては、図２に示されるように、ハーフミラーからなるビームスプリッタ５を対物レンズ４により集光された戻り光の光路に挿脱可能に設けることとしてもよい。このようにすることで、全ての戻り光を一方の撮像手段１０によって撮影可能として、明るい蛍光画像を取得することができる。

また、本実施形態においては、２つの観察光学系６，７に備えられる結像レンズ１６，１７の焦点距離を異ならせることにしてもよい。このようにすることで、２つの撮像手段１０，１１により得られる蛍光画像および反射光画像の倍率を異ならせることができる。この場合には、画像処理装置１２は、２つの画像を重ね合わせることなく、モニタ１３上の別個のウィンドウで同時に表示するように画像処理することとすればよい。

また、結像レンズ１６，１７を光軸方向に沿って移動可能に設けることにしてもよい。このようにすることで、結像レンズ１６，１７による結像位置を光軸方向に調節して、焦点合わせを行うことができる。

また、複数の結像レンズ１６，１７を切替可能に保持するターレット（図示略）を有することにしてもよい。これにより、ターレットを回転させて結像レンズ１６，１７を入れ替えることにより観察倍率を容易に変更することができる。

また、撮像手段１０，１１として、カラー画像を取得するものと、モノクロ画像を取得するものとを採用することにしてもよい。カラー画像によれば、可視的に観察像を認識することが容易であり、モノクロ画像によれば輝度解析を容易に行うことができるという利点がある。

また、これまで述べた実施形態では、蛍光像と反射像を取得する場合について説明したが、ルシフェラーゼ等の発光遺伝子を用いて発光画像と反射画像とを別個に同時に観察することとしてもよい。また蛍光画像と発光画像とを別個に同時に観察してもよい。この場合、蛍光画像で局在性を確認し、発光画像で定量性を確認するのが好ましい。

本発明の一実施形態に係る生体観察装置を示す全体構成図である。 図１の生体観察装置の変形例を示す全体構成図である。

符号の説明

Ａ 試料
１ 生体観察装置
２ ステージ
３ 照明光源
４ 対物レンズ
５ 第１のビームスプリッタ（ビームスプリッタ）
８，９ フィルタ
１０，１１ 撮像手段
１６，１７ 結像レンズ

Claims (4)

1. 試料を搭載するステージと、
   該ステージに搭載された試料に対して照射する照明光を発生する照明光源と、
   試料からの戻り光を集光する対物レンズと、
   該対物レンズにより集光された戻り光を複数に分岐するビームスプリッタと、
   該ビームスプリッタにより分岐された戻り光をそれぞれ結像させる複数の結像レンズと、
   各結像レンズにより結像された試料の観察像を撮影する複数の撮像手段とを備える生体観察装置。
2. 前記照明光源が、励起光を含む照明光を発生し、
   前記ビームスプリッタと前記複数の撮像手段との間に、試料における反射光、蛍光または発光のいずれかを透過するフィルタが配置されている請求項１に記載の生体観察装置。
3. 前記複数の撮像手段が、モノクロ画像を取得可能な撮像手段およびカラー画像を取得可能な撮像手段である請求項１または請求項２に記載の生体観察装置。
4. 前記複数の結像レンズが異なる焦点距離を有している請求項１から請求項３のいずれかに記載の生体観察装置。

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