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JP2008545399A - 白血病疾患遺伝子およびその使用 - Google Patents

白血病疾患遺伝子およびその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、白血病の診断、または進行もしくは治療を評価するための、全血試料または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む試料の使用を特徴とする。疾患でないヒトまたは異なる種類の白血病である患者と比較して、白血病患者の未分画のＰＢＭＣで示差的に発現される遺伝子は、本発明に従って同定できる。これらの遺伝子は、白血病疾患遺伝子であり、目的の被験体における白血病の存在または進行を検出するために用いることができる。本発明の対象となる白血病は、限定されないが、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を含む。ＡＭＬまたはＭＤＳ疾患遺伝子の限定しない例は、表２、４および６に示す。

Description

（技術分野）
本発明は、白血病疾患遺伝子ならびに白血病の診断および治療のためにそれを使用する方法に関する。
（背景）
骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）は、種々の臨床的な経過および結果を特徴とする骨髄細胞前駆体のクローン疾患の不均質な群である。ＭＤＳの患者の約３０％は、結局、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に進行し、患者のこの部分集合の早期の同定に特に適する臨床的診断アッセイは、これらの個体で治療の選択項目に焦点を当てる助けになるだろう。
最近の発現プロファイリング研究により、ＭＤＳの患者からのＡＣ１３３＋造血幹細胞画分におけるＡＭＬに対する違いが明らかになっている（非特許文献１）。同様の結果が、ＭＤＳの患者の骨髄から精製されたＣＤ３４＋細胞の転写プロファイルで観察されており、これは、疾患でない患者からのＣＤ３４＋細胞の転写プロファイルとは完全に異なる（非特許文献２）。しかし、これらの研究は、特定の細胞サブタイプのポジティブ選択を含み、これは困難で時間がかかる。
Ｍｉｙａｚａｔｏら、Ｂｌｏｏｄ（２００１年）９８：４２２〜４２７頁 Ｈｏｆｍａｎｎら、Ｂｌｏｏｄ（２００２年）１００：３５５３〜３５６０頁
（発明の要旨）
本発明は、ＡＭＬおよびＭＤＳの診断または進行もしくは治療の評価のための、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含有する末梢血試料の使用を特徴とする。本発明は、血液試料からの特定の細胞サブタイプのポジティブ選択を必要としないので、白血病の迅速な診断および評価が可能になる。よって、本発明に適する末梢血試料は、限定されないが、全血試料または未分画のＰＢＭＣを含む試料を含む。多くの場合、用いられる末梢血試料は、濃縮された未分画のＰＢＭＣを含む。「濃縮された」とは、試料中のＰＢＭＣの百分率が、全血中のものよりも高いことを意味する。多くの場合、濃縮された試料中の細胞の少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％がＰＢＭＣである。濃縮された未分画のＰＢＭＣは、フィコール勾配遠心分離、または細胞精製チューブ（ＣＰＴ）を用いることにより全血から調製できる。その他の従来の方法を用いて、濃縮された未分画のＰＢＭＣを調製することもできる。
本発明は、その発現プロファイルが白血病の存在、状態、進行または治療を示す遺伝子を提供する。本発明が対象とする白血病は、限定されないが、ＡＭＬおよびＭＤＳを含む。例えば、表４は、疾患でない被験体からのＰＢＭＣに対して、ＭＤＳ患者からのＰＢＭＣで示差的に発現される遺伝子を示す。表６は、ＭＤＳ患者からのＰＢＭＣに対して、ＡＭＬ患者からのＰＢＭＣで示差的に発現される遺伝子を示す。表８は、その発現レベルがＡＭＬのヒトをＭＤＳのヒトから、ＡＭＬのヒトを疾患でないヒトから、そしてＭＤＳのヒトを疾患でないヒトから区別するために有用な遺伝子を示す。急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病またはヘアリーセル白血病も、本発明によると分析できるだろう。
よって、ある態様において、本発明は、表４または表６からの遺伝子を用いて、被験体における白血病（例えばＡＭＬまたはＭＤＳのような）の診断、または発生、発達、進行もしくは治療をモニタリングするための方法を提供する。上記の方法は、被験体からの末梢血試料から遺伝子発現プロファイルを作成し、そして遺伝子発現プロファイルを１つまたは複数の参照発現プロファイル（例えば、疾患でないヒトを表す発現プロファイル、白血病のヒトを表す発現プロファイル、または境界と診断されるヒトを表す発現プロファイル）と比較することを含む。遺伝子発現プロファイルおよび参照発現プロファイルは、ＰＢＭＣ中の表４または６から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現パターンを含む。ある実施形態においては、表２に示す遺伝子を付加的に含むことはできるが、表２に示すものとは異なる遺伝子を、表４または６から選択する。ある実施形態においては、表４または６から選択される遺伝子は、表８に記載するものである。遺伝子発現プロファイルと１つまたは複数の参照発現プロファイルとの間の差異または類似性は、被験体における白血病の存在、不在、発生、発達、進行または治療の有効性を示す。遺伝子発現プロファイルおよび参照発現プロファイルは、１つの遺伝子のみまたは２つ以上（例えば３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、８つ以上、１０以上、１５以上、２０以上、４０以上、６０以上、１００以上、２００以上、３００以上、または４００以上）の遺伝子の発現パターンを含み得る。ある実施形態においては、より少ない数の遺伝子（例えば２つ、３つまで、４つまで、５つまで、６つまで、８つまで、１０まで、１５まで、２０まで、４０まで、６０まで、１００まで、または２００まで）を用いる。
目的の被験体における白血病疾患遺伝子の発現プロファイルは、被験体の末梢血試料中の各遺伝子のＲＮＡ転写産物レベルを測定することにより決定できる。この目的のために適する方法は、限定されないが、定量ＲＴ−ＰＣＲ、核酸アレイ、ノーザンブロット、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、スロットブロッティング、およびヌクレアーゼ保護アッセイを含む。白血病疾患遺伝子の発現プロファイルは、被験体の末梢血試料中の各遺伝子のタンパク質産物レベルを測定することによっても決定できる。この目的のために適する方法は、限定されないが、イムノアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＡＣＳまたはウェスタンブロット）、タンパク質アレイ、二次元ゲル電気泳動、および質量分析を含む。
本発明において用いられる典型的な参照発現プロファイルは、疾患でないヒトまたは既知の白血病の患者の末梢血試料中の白血病疾患遺伝子の発現パターンを示唆する値または範囲を含む。ある例において、参照発現プロファイルは、疾患でないヒトの末梢血試料中の各白血病疾患遺伝子の平均発現レベルを含む。別の例において、参照発現プロファイルは、既知の白血病の患者の末梢血試料中の各白血病疾患遺伝子の平均発現レベルを含む。さらに別の実施形態において、参照発現プロファイルは、それぞれが異なる白血病患者または疾患でないヒトの末梢血試料中の白血病疾患遺伝子の発現プロファイルである、２つ以上の個別の発現プロファイルを含む。さらなる実施形態において、参照発現プロファイルは、疾患でないヒトまたは既知の白血病の患者の末梢血試料中の各白血病疾患遺伝子の発現レベルにおける変化量を反映する範囲を含む。
本発明において用いられる参照発現プロファイルは、目的の被験体の末梢血試料と同じ種類の末梢血試料を用い、同じ作成手順および方法に従って作成できる。参照発現プロファイルは、予め決定または予め記録できる。また、これは、目的の被験体の発現プロファイルの測定と同時にまたはその後に決定することもできる。
参照発現プロファイルとの目的の被験体の発現プロファイルの比較は、手作業でまたは電子工学的に行うことができる。目的の被験体の発現プロファイルと参照発現プロファイルとの間の差異または類似性は、被験体における白血病の存在もしくは不在、または進行もしくは非進行を示す。
ある実施形態において、比較に用いられる各白血病疾患遺伝子の発現レベルは、マイクロアレイの最近傍分析または有意性分析の下でのクラス区分に関連づけられる。クラス区分は、疾患でないヒトおよび特定された白血病の患者の未分画のＰＢＭＣ中の遺伝子の理想的発現パターンを表す（例えば疾患でないヒトのＰＢＭＣ中で均一に高く、かつ白血病患者のＰＢＭＣ中で均一に低い、またはその逆）。目的の被験体の疾患の状態（疾患なしに対して白血病）は、目的の被験体における白血病疾患遺伝子の発現プロファイルを、同じ遺伝子の参照発現プロファイルと、ｋ最近傍アルゴリズムまたは重みつき多数決アルゴリズム（ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｖｏｔｉｎｇ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を用いて比較することにより予測できる。比較に基づいて、試料を採取した被験体が白血病であると診断できるかまたは疾患でないと診断できるか、あるいは既存の白血病を、進行または治療に関連することのような変化について評価できる。
本発明は、ＭＤＳの診断または発生、発達、進行もしくは治療のモニタリングのための一般的な方法も提供する。上記の方法は、被験体からの末梢血試料から遺伝子発現プロファイルを作成し、そして遺伝子発現プロファイルを１つまたは複数の参照発現プロファイル（例えば、疾患でないヒトを表す発現プロファイル、ＭＤＳのヒトを表す発現プロファイル、ＡＭＬのような非ＭＤＳ白血病のヒトを表す発現プロファイル、または境界と診断されるヒトを表す発現プロファイル）と比較することを含む。遺伝子発現プロファイルおよび１つまたは複数の参照発現プロファイルは、ＰＢＭＣ中の１つまたは複数のＭＤＳ疾患遺伝子の発現パターンを含む。遺伝子発現プロファイルと１つまたは複数の参照発現プロファイルとの間の差異または類似性は、被験体におけるＭＤＳの存在、不在、発生、発達、進行または治療の有効性を示す。ＭＤＳ疾患遺伝子は、表４、６または８から選択される１つまたは複数の遺伝子を任意に含み得る。遺伝子発現プロファイルおよび参照発現プロファイルは、１つの遺伝子のみまたは２つ以上（例えば３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、８つ以上、１０以上、１５以上、２０以上、４０以上、６０以上、１００以上、２００以上、３００以上、または４００以上）の遺伝子の発現パターンを含み得る。ある実施形態においては、より少ない数の遺伝子（例えば２つ、３つまで、４つまで、５つまで、６つまで、８つまで、１０まで、１５まで、２０まで、４０まで、６０まで、１００まで、または２００まで）を用いる。参照発現プロファイルとの遺伝子発現プロファイルの比較は、例えばｋ最近傍分析または重みつき多数決アルゴリズムにより行うことができる。比較に基づいて、試料を採取した被験体がＭＤＳであると診断できるか、またはＭＤＳでないかもしくは疾患でないと診断できるか、あるいは既存のＭＤＳを、進行または治療に関連することのような変化について評価できる。
本発明は、表６からの１つまたは複数の遺伝子を用いて、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に進行する可能性があるＭＤＳ患者を同定する方法も提供する。上記の方法は、ＭＤＳ患者からの末梢血試料から遺伝子発現プロファイルを作成し、そして遺伝子発現プロファイルを１つまたは複数の参照発現プロファイル（例えば、ＡＭＬのヒトを表す発現プロファイル、ＡＭＬに進行することが知られているＭＤＳのヒトを表す発現プロファイル、またはＡＭＬに進行しないことが知られているＭＤＳのヒトを表す発現プロファイル）と比較することを含む。遺伝子発現プロファイルおよび１つまたは複数の参照発現プロファイルは、表６から選択される１つまたは複数の白血病疾患遺伝子のＰＢＭＣ中の発現パターンを含む。遺伝子発現プロファイルと１つまたは複数の参照発現プロファイルとの間の差異または類似性は、そのＭＤＳ患者がＡＭＬに進行する可能性があることを示す。表６から選択される白血病疾患遺伝子は、表２からの遺伝子も含み得るが、表２に示すものとは任意に異なってもよい。表６から選択される白血病疾患遺伝子は、任意に、表８にも記載されるものであってもよい。
別の態様において、本発明は、興味のある患者における白血病の治療の有効性を評価するための方法を特徴とする。これらの方法は、興味のある患者の末梢血試料中の少なくとも１つの白血病疾患遺伝子の発現プロファイルを、同じ遺伝子の参照発現プロファイルと比較することを含み、該末梢血試料が治療の開始後に患者から単離されたものであり、かつ用いられる白血病疾患遺伝子のそれぞれが、疾患でないヒトの未分画のＰＢＭＣと比較して、評価される白血病である患者の未分画のＰＢＭＣで示差的に発現されている。ある例において、評価される白血病はＭＤＳであり、用いられる白血病疾患遺伝子は、表４から選択される１つまたは複数の遺伝子を含む。興味のある患者における白血病疾患遺伝子の発現プロファイルと、疾患でないヒトにおける対応する発現プロファイルとの間の差異が治療経過の間に消滅または減少することは、興味のある患者についての治療の有効性を示す。従来の方法と比較すると、遺伝子発現プロファイリングに基づく方法は、疾患の進行または寛解の検出のための感度が改善されているだろう。
別の態様において、本発明は、興味のある患者におけるＭＤＳのＡＭＬへの進行の予防における治療の有効性を評価する方法を特徴とする。これらの方法は、興味のある患者の末梢血試料中の少なくとも１つの白血病疾患遺伝子の発現プロファイルを、同じ遺伝子の参照発現プロファイルと比較することを含み、該末梢血試料が治療の開始後に患者から単離されたものであり、かつ用いられる白血病疾患遺伝子のそれぞれが、ＡＭＬ患者と比較して、ＭＤＳ患者の未分画のＰＢＭＣで示差的に発現されている。この目的のために適する白血病疾患遺伝子の例は、限定されないが、表６に示すものである。治療経過の間の興味のある患者における白血病疾患遺伝子の発現プロファイルは、患者におけるＭＤＳのＡＭＬへの進行の予防における治療の有効性を示す。
本発明は、例えばＭＤＳまたはその他の白血病を診断するために有用なアレイも提供する。上記のアレイは、いくつかのアドレスを有する基板を含み、別個の核酸配列または別個の抗体可変領域のような別個のプローブが各アドレスの上に配置されている。ある実施形態において、アドレスの少なくとも１５％（または少なくとも３０％または少なくとも５０％）は、ＰＢＭＣ中のＭＤＳ疾患遺伝子を特異的に検出できるプローブを有し、該ＭＤＳ疾患遺伝子は、表４から任意に選択してよい。別の実施形態において、アドレスの少なくとも１５％（または少なくとも３０％または少なくとも５０％）は、表４または６から選択される遺伝子を特異的に検出できるプローブを有し、該選択される遺伝子は、表２からの遺伝子も含み得るが、表２に記載するものとは異なる。
本発明は、例えば末梢血試料から遺伝子発現プロファイルを評価する参照発現プロファイルとして有用な、コンピュータ読み取り可能な媒体にコードされていてもよいデジタルコード化された発現プロファイルも提供する。各発現プロファイルは、表４または６から選択される遺伝子の発現を表す値を含む、１つまたは複数のデジタルコード化された発現信号を含み、表２からの遺伝子の発現を表す値を含むデジタルコード化された発現信号を発現プロファイルに付加的に含み得るが、選択される遺伝子は、表２に記載するものとは異なる。デジタルコード化された発現信号における値は、例えば、ＭＤＳのヒトまたはＡＭＬのヒトのＰＢＭＣにおける遺伝子の発現を表し得る。各発現プロファイルは、単独のデジタルコード化された発現信号を含み得るか、または２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つもしくはそれより多く、例えば少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、または少なくとも２００のデジタルコード化された発現信号を含み得る。
別の態様において、本発明は、白血病に診断のために有用なキットを提供する。ある実施形態において、キットは、ＰＢＭＣ中のＭＤＳ疾患遺伝子（任意に表４から選択される）を特異的に検出できる１つまたは複数のプローブを含む。プローブは、任意に、ストリンジェントまたはＲＮＡ転写産物に対する核酸アレイハイブリダイゼーション条件の下でハイブリダイズするＭＤＳ疾患遺伝子のポリヌクレオチド、またはその相補鎖であるか、あるいは任意にＭＤＳ疾患遺伝子の産物に結合する抗体可変領域である。別の実施形態において、キットは、表４および６から選択される遺伝子を特異的に検出できる１つまたは複数のプローブを含み、選択される遺伝子は、表２からの遺伝子のプローブも付加的に含むことができるが、表２に記載するものとは異なる。表４および６から選択される遺伝子は、任意に、表８にも記載されるものからでもあり得る。キットは、それぞれがプローブにより検出可能な遺伝子の参照発現レベルを示す１つまたは複数の対照も含む。
別の態様において、本発明は、ＡＭＬまたはＭＤＳのような白血病のための治療の経過についての支払いクラスの選択のような決定を行う方法を特徴とする。上記の方法は、個体からの末梢血試料中の１つまたは複数の遺伝子の発現の関数である値に基づいて個体をクラスに割り当てることにより、該個体に関する決定を行うことを含む。遺伝子は、表４および６に記載するものからの１つまたは複数の遺伝子を含み、表２に記載するものは含まないが、表２に記載する遺伝子の発現も考慮できる。ある実施形態において、１つまたは複数の遺伝子は、表８に記載するものからも選択される。決定は、個体のクラスへの割り当てに基づく、例えば、ＡＭＬ治療、ＭＤＳ治療、その他の白血病の治療、または治療を行わないことのような治療の選択を含み得る。決定は、割り当てに基づく、治療の執行もしくは治療の執行の低減；処方箋の発行、伝送もしくは受領；または治療の承認、治療のための支払いもしくは治療の支払いのための資金の移送を行うことも含み得る。本明細書で用いる場合、「治療」とは、疾患または状態に対処するための任意の行動のことであり、この行動が、例えば予防のため、治癒のためまたは緩和のため；または疾患もしくは状態の原因または症状に対処するため；または例えば第２の治療の有効性を改善するかもしくは副作用に対処することにより第２の治療を改善するためを意図するかを問わない。決定は、例えばコンピュータ読み取り可能な媒体に記録してよい。
本発明は、それに対して個体に関する決定を行う情報を提供する方法も特徴とする。上記の方法は、被験体の評価を（例えば受領することにより）提供することを含み、ここで該評価は、例えば被験体の末梢血試料中の１つまたは複数の遺伝子の発現レベルを決定することにより値を提供することのような本明細書に記載される方法により行われる。遺伝子は、表４および６に記載するものからの１つまたは複数の遺伝子を含み、表２に記載するものは含まないが、表２に記載する遺伝子の発現も考慮できる。上記の方法は、参照値の値の比較を提供することにより、それに対して被験体についての決定を行う情報を提供することも含む。上記の方法は、決定を行うこと、または例えばコンピュータ、コンパクトディスク、電話、ファクシミリもしくは手紙により、第３の関係者に情報を伝達することも含み得る。決定は、支払いのための被験体を選択すること、あるいは被験体が白血病（例えばＡＭＬまたはＭＤＳ）において観察される遺伝子発現レベル、パターンまたはプロファイルを示すならば第１の行動方針を、また被験体が別の白血病（例えばＭＤＳまたはＡＭＬ）もしくは白血病でないヒトにおいて観察される遺伝子発現レベル、パターンまたはプロファイルを示すならば第２の行動方針を行うかまたはそのための支払いを承認することを含み得る。支払いは、第１の関係者から第２の関係者に行うことができる。第１の関係者は、例えば第３の関係の支払者、保険会社、雇用主、雇用主が後援する保健計画、ＨＭＯまたは政府主体のような患者以外の関係者であり得る。ある実施形態において、第２の関係者は、被験体、健康管理提供者、治療する医師、ＨＭＯ、病院、政府主体、または薬剤を販売もしくは供給する主体から選択される。
ある態様において、本発明は、データ記録を作製する方法を特徴とする。上記の方法は、本明細書に記載される方法の結果を、例えばコンピュータ読み取り可能記録のような記録に入力することを含む。ある実施形態において、上記の記録は、第３の関係の支払者、保険会社、雇用主、雇用主が後援する保健計画、ＨＭＯ、または政府主体、あるいは健康管理提供者、治療する医師、ＨＭＯ、病院、政府主体、または薬剤を販売もしくは供給する主体に評価されるかおよび／または伝送される。
ある態様において、本開示は、データを提供する方法を特徴とする。上記の方法は、支払いが提供されるかを決定するために、例えば本明細書に記載される方法により作成した、本明細書に記載されるデータを提供して、例えば本明細書に記載される記録のような記録を提供することを含む。ある実施形態において、上記のデータは、コンピュータ、コンパクトディスク、電話、ファクシミリ、ｅメールまたは手紙により提供される。ある実施形態において、データは、第１の関係者により第２の関係者に提供される。ある実施形態において、第１の関係者は、被験体、健康管理提供者、治療する医師、ＨＭＯ、病院、政府主体、または薬剤を販売もしくは供給する主体から選択される。ある実施形態において、第２の関係者は、第３の関係の支払者、保険会社、雇用主、雇用主が後援する保健計画、ＨＭＯ、または政府主体である。ある実施形態において、第１の関係者は、被験体、健康管理提供者、治療する医師、ＨＭＯ、病院、保険会社、または薬剤を販売もしくは供給する主体から選択され、第２の関係者は政府主体である。ある実施形態において、第１の関係者は、被験体、健康管理提供者、治療する医師、ＨＭＯ、病院、保険会社、または薬剤を販売もしくは供給する主体から選択され、第２の関係者は保険会社である。
ある態様において、本開示は、本明細書に記載される記録を伝送する方法を特徴とする。上記の方法は、記録を第２の関係者に、例えばコンピュータ、コンパクトディスク、電話、ファクシミリ、ｅメール、または手紙により伝送する第１の関係者を含む。ある実施形態において、第２の関係者は、被験体、健康管理提供者、治療する医師、ＨＭＯ、病院、政府主体、または薬剤を販売もしくは供給する主体から選択される。ある実施形態において、第１の関係者は、保険会社または政府主体であり、第２の関係者は、被験体、健康管理提供者、治療する医師、ＨＭＯ、病院、政府主体、または薬剤を販売もしくは供給する主体から選択される。ある実施形態において、第１の関係者は、政府主体または保険会社であり、第２の関係者は、被験体、健康管理提供者、治療する医師、ＨＭＯ、病院、保険会社、または薬剤を販売もしくは供給する主体から選択される。
本発明のその他の特徴、目的および利点は、以下に続く詳細な説明から明らかである。しかし、本発明の好ましい実施形態について示す詳細な説明は、説明のためにのみそのようにするのであり、限定のためではない。本発明の範囲内での種々の変更および改変は、詳細な説明から、当業者に明らかになる。
（詳細な説明）
本発明は、ＡＭＬおよびＭＤＳを診断または、進行もしくは治療をモニタリングするための、全血試料または未分画のＰＢＭＣを含む試料の使用を特徴とする。疾患でないヒトにおけるものと比較して、ＡＭＬ（またはＭＤＳ）患者の未分画のＰＢＭＣで示差的に発現される遺伝子は、同定できる。これらの遺伝子は、目的の被験体におけるＡＭＬ（またはＭＤＳ）の診断または治療の評価のための代用マーカーとして用いることができる。ＭＤＳ患者におけるものと比較して、ＡＭＬ患者の未分画のＰＢＭＣで示差的に発現される遺伝子も同定できる。これらの遺伝子は、興味のある患者におけるＭＤＳの進行をモニタリングするために用いることができる。本発明は、特定の細胞サブタイプ（例えばＣＤ３４＋またはＡＣ１３３＋）のポジティブ選択を必要とせず、それによりＡＭＬおよびＭＤＳの迅速な診断および評価を可能にする。急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病またはヘアリーセル白血病のようなその他の白血病は、本発明により同様に評価できる。
本発明の種々の態様を、以下の小段落でさらに詳細に説明する。小段落の使用は、本発明を限定することを意味しない。各小段落は、本発明の任意の態様に適用してよい。本出願において、「または」の使用は、特に記載しない限り「および／または」を意味する。
Ａ．白血病疾患遺伝子の同定のための一般的な方法
本発明は、疾患でないヒトまたは異なる種類の白血病の患者におけるものと比較して、白血病患者の未分画のＰＢＭＣで示差的に発現される遺伝子の同定のための、核酸アレイの使用を特徴とする。核酸アレイは、一度に、多数の遺伝子の発現プロファイルの定量的検出を可能にする。この目的のために適切な核酸アレイの限定しない例は、Ｇｅｎｅｃｈｉｐ（登録商標）マイクロアレイ（カリフォルニア州、サンタ クララ、アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ））、ｃＤＮＡマイクロアレイ（カリフォルニア州、パロ アルト、アギレントテクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））およびビーズアレイ（米国特許第６２８８２２０号および第６３９１５６２号）を含む。
核酸アレイとハイブリダイズされるポリヌクレオチドは、１つまたは複数の標識成分で標識して、ハイブリダイズしたポリヌクレオチド複合体の検出を可能にできる。標識成分は、分光的、光化学的、生化学的、生物電子工学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的な手段により検出可能な組成物を含み得る。標識成分の例は、限定されないが、放射性同位体、化学発光化合物、標識結合タンパク質、重金属原子、分光的マーカー（例えば蛍光マーカーまたは色素）、磁気標識、結合した酵素、質量分析タグ、スピン標識、電子伝達供与体および受容体などを含む。核酸アレイにハイブリダイズされるポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡまたはその他の種類の核酸分子であり得る。
ハイブリダイゼーション反応は、絶対的またはディファレンシャルハイブリダイゼーションフォーマットにおいて行うことができる。絶対的ハイブリダイゼーションフォーマットにおいて、ＡＭＬもしくはＭＤＳ患者または疾患でないヒトからの未分画ＰＢＭＣのようなある試料に由来するポリヌクレオチドは、核酸アレイ上のプローブにハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション複合体の形成後に検出される信号は、試料中のポリヌクレオチドのレベルと相互関係がある。ディファレンシャルハイブリダイゼーションフォーマットにおいて、一方はＡＭＬまたはＭＤＳ患者からおよび他方は疾患でないヒトからのような２つの生体試料に由来するポリヌクレオチドは、異なる標識成分（例えばそれぞれＣｙ３およびＣｙ５）で標識される。これらの異なって標識されたポリヌクレオチドの混合物は、核酸アレイとハイブリダイズする。次いで、２つの異なる標識からの放射を別個に検出可能な条件下で、核酸アレイを調べる。
核酸アレイから集められた信号は、例えばアフィメトリクスまたはアギレントテクノロジーズより提供されるソフトウェアのような市販で入手可能なソフトウェアを用いて分析できる。スキャン感度、プローブの標識またはｃＤＮＡ定量のためのような対照を、ハイブリダイゼーション実験に含むことができる。多くの実施形態において、核酸アレイからの信号は、さらに分析する前にスケール変更または標準化される。複数のアレイを類似の試験条件下で用いる場合に、遺伝子の発現信号を標準化して、ハイブリダイゼーション強度における変化量を考慮に入れることができる。別個のポリヌクレオチド複合体ハイブリダイゼーションについての信号も、各アレイに含まれる内部標準化対照に由来する強度を用いて標準化できる。さらに、試料間で比較的一定の発現レベルである遺伝子を用いて、その他の遺伝子の発現レベルを標準化できる。ある実施形態において、発現レベルは、試料間で、平均が０で標準偏差が１であるように標準化される。別の実施形態において、核酸アレイからの発現信号は、異なるクラスの試料間で最小限または小さい変化量を示す遺伝子を除く変化量フィルタの支配下にある。
白血病患者の未分画のＰＢＭＣにおける発現プロファイルは、疾患でないヒトにおける対応する発現プロファイルと比較される。疾患でないヒトの未分画のＰＢＭＣにおけるものと比較して、白血病患者の未分画のＰＢＭＣで示差的に発現される遺伝子を同定できる。これらの遺伝子は、以下、白血病疾患遺伝子という。「示差的に発現される」とは、白血病患者の未分画のＰＢＭＣにおける白血病疾患遺伝子の平均発現レベルが、疾患でないヒトの未分画のＰＢＭＣにおけるものと統計学的に有意に異なることを意味する。多くの場合、観察される差分のスチューデントのｔ検定のｐ値（例えば両側分布、２標本不等分散性）は、０．０５以下、０．０１以下、０．００５以下、０．００１以下、０．０００５以下、０．０００１以下またはそれ未満である。白血病患者の未分画のＰＢＭＣにおける白血病疾患遺伝子の平均発現レベルは、疾患でないＰＢＭＣにおけるものよりも実質的により高いかまたは低いことが可能である。例えば、白血病患者のＰＢＭＣにおける白血病疾患遺伝子の平均発現レベルは、疾患でないヒトのＰＢＭＣにおけるものよりも少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０またはそれより多い倍数でより高いかまたは低いことが可能である。異なる白血病（例えばＭＤＳに対してＡＭＬ）を有する患者において示差的に発現される白血病疾患遺伝子は、同様に同定できる。
白血病疾患遺伝子は、教師ありまたは教師なしのクラスタリングアルゴリズムを用いても同定できる。教師ありのクラスタリングアルゴリズムの限定しない例は、最近傍分析、サポートベクターマシン、ＳＡＭ（マイクロアレイの有意性分析）法、人工ニューラルネットワーク、およびＳＰＬＡＳＨを含む。教師なしのクラスタリングアルゴリズムの限定しない例は、自己組織化マップ（ＳＯＭ）、ｋ平均、主成分分析および階層的クラスタリングを含む。
近傍分析としても知られる最近傍分析は、その全てが本明細書に参照として組み込まれるＧｏｌｕｂら、（１９９９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８６：５３１〜５３７頁；Ｓｌｏｎｉｍら、（２０００年）Ｐｒｏｃｓ．ｏｆ ｔｈｅ Ｆｏｕｒｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、日本、東京、４月８日〜１１日、２６３〜２７２頁；および米国特許第６６４７３４１号に記載されている。この分析において、各遺伝子の発現プロファイルは、発現ベクトルｇ＝（ｅ１，ｅ２，ｅ３，・・・，ｅｎ）（ここで、ｅｉは、第ｉ番目の試料中の遺伝子「ｇ」の発現レベルに相当する）により表される。クラス区分は、理想化された発現パターンｃ＝（ｃ１，ｃ２，ｃ３，・・・，ｃｎ）（ここで、第ｉ番目の試料がクラス０またはクラス１から単離されたかに依存してｃｉ＝１または−１）により表すことができる。クラス０は、第１の疾患状態（例えば疾患でない）を有する被験体を含み、クラス１は第２の疾患状態（例えばＡＭＬまたはＭＤＳ）を有する被験体を含む。その他の形のクラス区分も用いることができる。典型的には、クラス区分は、理想化された発現パターンを表し、ここで遺伝子の発現レベルは、一方のクラスにおける試料について均一に高く、他方のクラスにおける試料について均一に低い。
遺伝子「ｇ」とクラス区分との相関関係は、信号対雑音スコア：
Ｐ（ｇ，ｃ）＝［μ１（ｇ）−μ２（ｇ）］／［σ１（ｇ）＋σ２（ｇ）］
（式中、μ１（ｇ）およびμ２（ｇ）は、それぞれクラス０およびクラス１における遺伝子「ｇ」のｌｏｇ変換された発現レベルの平均を表し、σ１（ｇ）およびσ２（ｇ）は、それぞれクラス０およびクラス１における遺伝子「ｇ」のｌｏｇ変換された発現レベルの標準偏差を表す）により測定できる。信号対雑音スコアのより高い絶対値は、遺伝子が一方のクラスにおいて他方よりも高く発現していることを示す。ある例において、信号対雑音スコアを導き出すのに用いられる試料は、濃縮されたかまたは精製された未分画のＰＢＭＣを含み、よって、信号対雑音スコアＰ（ｇ，ｃ）は、クラス区分と未分画のＰＢＭＣにおける遺伝子「ｇ」の発現レベルとの間の相関関係を表す。遺伝子「ｇ」とクラス区分との相関関係は、当業者により認識されるように、ピアソンの相関係数またはユークリッド距離のようなその他の方法により測定することもできる。
未分画のＰＢＭＣにおける遺伝子発現プロファイルとクラス区分との相関関係の有意性は、ランダム順列検定を用いて評価できる。ランダムパターンと比較して、クラス区分の近傍内の遺伝子の著しく高い密度は、これらの遺伝子の多くがクラス区分と著しく相関関係がある発現パターンを有することを示唆する。遺伝子とクラス区分との間の相関関係は、近傍分析プロットを通じて図で見ることができ、ここでｙ軸はクラス区分の周囲の種々の近傍内の遺伝子の数を表し、ｘ軸は近傍のサイズ（すなわちＰ（ｇ，ｃ））を示す。ランダムに並べ替えたクラス区分の対応する近傍内の遺伝子の数についての異なる有意水準を示す曲線も、プロットに含み得る。
多くの実施形態において、本発明により同定される白血病疾患遺伝子は、近傍分析プロットにおける平均の有意水準を超える。このことは、これらの白血病疾患遺伝子のそれぞれについての相関関係の尺度Ｐ（ｇ，ｃ）は、Ｐ（ｇ，ｃ）のサイズであるクラス区分の範囲内の遺伝子の数の平均の有意水準にてランダムに並べ替えたクラス区分の対応する近傍内の遺伝子の数より大きい。本発明により同定される白血病疾患遺伝子は、有意水準の４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％または１％を超えることもできる。本明細書で用いる場合、ｘ％の有意水準は、ランダム近傍のｘ％がクラス区分の周囲の真の近傍と同様に多くの遺伝子を含むことを意味する。
最近傍分析により同定される白血病疾患遺伝子は、クラス予測因子を構築するのに用いることができる。各クラス予測因子は、２つ以上の白血病疾患遺伝子を含み、目的の被験体を疾患状態（例えばＡＭＬ，ＭＤＳ、または疾患でない）に割り当てるために用いることができる。ある実施形態において、クラス予測因子は、順列検定によりクラス区分と著しく相関関係がある（例えば、１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％または５０％有意水準を超える遺伝子）白血病疾患遺伝子を含むかまたは該遺伝子からなる。別の実施形態においては、クラス予測因子は、Ｐ（ｇ，ｃ）の上位の絶対値を有する白血病疾患遺伝子を含むかまたは該遺伝子からなる。
ＳＡＭ法を用いて、未分画のＰＢＭＣ中の遺伝子発現プロファイルと疾患状態を関連させることができる。マイクロアレイの予測分析（ＰＡＭ）法を用いて、定義済みの疾患または疾患でないクラスを最もよく特徴付けることができるクラス予測因子を同定し、新しい試料のクラスのメンバーであるかを予測することができる。例えば、Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉら、（２００２年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９９：６５６７〜６５７２頁を参照されたい。
本発明のクラス予測因子の予測精度は、１０分割交差検証法、４分割交差検証法のようなｋ分割交差検証法、またはリーブ−ワン−アウト交差検証法により評価できる。典型的なｋ分割交差検証法において、データはほぼ等しいサイズのｋ個の部分集合に分割される。モデルはｋ回学習し、各回に１つの部分集合を学習せずに残し、省いた部分集合を試験試料として用いて予測誤差を算出する。ｋが試料サイズに等しい場合に、これはリーブ−ワン−アウト交差検証法になる。
その他の方法を用いて白血病疾患遺伝子を同定することもできる。これらの方法は、限定されないが、定量ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、タンパク質アレイ、イムノアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡまたはウェスタンブロット）、ディファレンシャルディスプレイ、遺伝子発現の連続解析（ＳＡＧＥ）、提示ディファレンシャル解析（ＲＤＡ）、サブトラクティブハイブリダイゼーション、ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇ（登録商標）（コネチカット州、ニューヘブン、キュラゲン（ＣｕｒａＧｅｎ））および全遺伝子発現解析（ＴＯＧＡ）を含む。このようにして同定された遺伝子は、被験体のあるクラスの未分画のＰＢＭＣで、被験体の別のクラスと比較して示差的に発現され、被験体の各クラスは異なる疾患状態（例えばＡＭＬ、ＭＤＳまたは疾患でない）を有する。
上記の方法を用いて、未分画のＰＢＭＣ中でのその発現プロファイルが白血病進行の異なる段階、または治療に対する白血病患者の異なる臨床応答の予測となる遺伝子を同定することもできる。例えば、結局はＡＭＬに進行するＭＤＳ患者のＰＢＭＣにおける遺伝子発現プロファイルは、ＡＭＬに進行しないＭＤＳ患者における対応する遺伝子発現プロファイルと比較できる。患者のこれらの２つのクラスで示差的に発現する遺伝子を同定でき、ＭＤＳからＡＭＬへの進行の予測のために用いることができる。別の場合、白血病の患者は、治療に対するそれらの応答に基づいて群に分けることができる。次いで、全体的な遺伝子発現解析を用いて、患者の別の群に対してある群のＰＢＭＣで示差的に発現される遺伝子を同定する。このようにして同定された遺伝子は、治療に対する白血病患者の臨床的成果の予測となる。
Ｂ．ＡＭＬおよびＭＤＳ疾患遺伝子の同定
ＨＧ−Ｕ１３３Ａ Ｇｅｎｅｃｈｉｐ（登録商標）（アフィメトリクス、インコーポレーテッド）を用いて、ＡＭＬまたはＭＤＳ疾患遺伝子を同定した。疾患でないヒトにおけるものと比較して、ＡＭＬ（またはＭＤＳ）患者の未分画のＰＢＭＣで示差的に発現された遺伝子も同定した。ＭＤＳ患者におけるものと比較してＡＭＬ患者の未分画のＰＢＭＣで示差的に発現された遺伝子も同定した。
表１は、ＡＭＬ試料にハイブリダイズさせたときに、疾患なしの試料と比較して上昇または減少した信号を示すＨＧ−Ｕ１３３Ａ Ｇｅｎｅｃｈｉｐ（登録商標）についての識別子を列挙する。表１における各識別子は、疾患でないヒトにおけるものと比較して、ＡＭＬ患者の未分画のＰＢＭＣで示差的に発現されるＡＭＬ疾患遺伝子に相当する。各識別子でのハイブリダイゼーション信号は、未分画のＰＢＭＣにおける対応する遺伝子の発現レベルを表す。
表１は、ＡＭＬ試料（「ＡＭＬ平均」）または疾患なしの試料（「疾患なし平均」）についての各識別子での平均ハイブリダイゼーション信号も示す。これらの信号の標準偏差（それぞれ「ＡＭＬ ＳｔＤｅｖ」および「疾患なしＳｔＤｅｖ」）も提供される。さらに、ＡＭＬと疾患なしのハイブリダイゼーション信号との比（「ＡＭＬ／疾患なし」）、および観察される差分についてのスチューデントのｔ検定のｐ値（両側分布、２試料不等分散）が提供される。
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 ＨＧ−Ｕ１３３Ａ Ｇｅｎｅｃｈｉｐ（登録商標）上の各識別子は、Ｇｅｎｅｃｈｉｐ（登録商標）上のそれぞれの領域に安定に付着している一連のオリゴヌクレオチドプローブ（ＰＭまたは完全一致プローブ）を表す。識別子により同定される遺伝子のＲＮＡ転写産物（またはその相補鎖）は、核酸アレイハイブリダイゼーション条件下で、識別子の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズできる。好ましくは、遺伝子のＲＮＡ転写産物（またはその相補鎖）は、核酸アレイハイブリダイゼーション条件下で、識別子のミスマッチ（ＭＭ）プローブにハイブリダイズしない。ミスマッチプローブは、ミスマッチプローブの中央またはその近くでの単一の同価置換以外は対応するＰＭプローブと同一である。例えば、２５マーのＰＭプローブのＭＭプローブは、１３番目の位置が同価塩基に変更される。
ある実施形態において、識別子により同定される遺伝子のＲＮＡ転写産物（またはその相補鎖）は、核酸アレイハイブリダイゼーション条件下で、識別子のＰＭプローブの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％にハイブリダイズできるが、対応するミスマッチプローブにはハイブリダイズできない。全体のハイブリダイゼーション強度（すなわちＰＭ＋ＭＭ）に対する対応するプローブ対のハイブリダイゼーション強度の差（すなわちＰＭ−ＭＭ）の比として測定される、これらのＰＭプローブのそれぞれの識別スコア（Ｒ）は、０．０１５、０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５またはそれより大きいもの以上であり得る。別の実施形態において、遺伝子のＲＮＡ転写産物（またはその相補鎖）は、製造者の指示に従ってＨＧ−Ｕ１３３Ａ Ｇｅｎｅｃｈｉｐ（登録商標）にハイブリダイズさせたときに、デフォルト設定の下で、対応する識別子にて「存在」の合図を生み出す（すなわち、閾値Ｔａｕは０．０１５であり、有意水準α１は０．４である）。その全体の内容が本明細書に参照として組み込まれるＧｅｎｅｃｈｉｐ（登録商標）のＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ − Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ（Ｐａｒｔ Ｎｏ．７０１１９０ Ｒｅｖ．２、アフィメトリクス インコーポレーテッド、２００２年）を参照されたい。
ＨＧ−Ｕ１３３Ａ Ｇｅｎｅｃｈｉｐ（登録商標）上の各ＰＭプローブの配列、およびＰＭプローブを導き出した標的配列は、アフィメトリクスウェブサイトにてアフィメトリクスの配列データベースから容易に得ることができる。例えば、その全体の内容が本明細書に参照として組み込まれるＨＧ−Ｕ１３３Ａ＿ｐｒｏｂｅ＿ｔａｂ．ｚｉｐを参照されたい。
表２は、表１の識別子により表される遺伝子を列挙する。これらの遺伝子、およびそれらの対応するｕｎｉｇｅｎｅのＩＤおよびＥｎｔｒｅｚアクセッション番号は、アフィメトリクスＧｅｎｅｃｈｉｐ（登録商標）アノテーションにより同定できる。ｕｎｉｇｅｎｅは、遺伝子指向型クラスタの重複しない組により構成される。各ｕｎｉｇｅｎｅクラスタは、独特の遺伝子を表す配列を含むと考えられる。Ｅｎｔｒｅｚデータベースは、ＧｅｎＢａｎｋ、ＲｅｆＳｅｑおよびＰＤＢのような種々の出典からの配列を集めている。各識別子のオリゴヌクレオチドプローブは、その対応するＥｎｔｒｅｚ配列から導き出すことができる。
表３は、ＭＤＳ試料にハイブリダイズさせたときに、疾患なしの試料と比較して上昇または減少した信号を示す識別子を示す。ＭＤＳ（「ＭＤＳ平均」）または疾患なし（「疾患なし平均」）の試料についての各識別子での平均ハイブリダイゼーション信号を、それらの対応する標準偏差（それぞれ「ＭＤＳ ＳｔＤｅｖ」および「疾患なしＳｔＤｅｖ」）とともに示す。さらに、平均ハイブリダイゼーション信号間の比（「ＭＤＳ／疾患なし」）、および観察された差分についてのスチューデント検定のｐ値（両側分布、２標本不等分散性）も示す。表４は、表３の識別子により表される遺伝子をさらに記載する。
表５は、ＡＭＬ試料にハイブリダイズさせたときに、ＭＤＳ試料と比較して上昇または減少した信号を示す識別子を示す。表１および３と同様に、ＡＭＬまたはＭＤＳ試料についての各識別子での平均ハイブリダイゼーション信号（それぞれ「ＡＭＬ平均」および「ＭＤＳ平均」）、対応する標準偏差（それぞれ「ＡＭＬ ＳｔＤｅｖ」および「ＭＤＳ ＳｔＤｅｖ」）、ハイブリダイズした信号間の比（「ＡＭＬ／ＭＤＳ」）、ならびに観察された差分についてのｐ値を表５に示す。表５の識別子により表される遺伝子は、表６にさらに記載する。
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 表２、４および６に記載の遺伝子は、アフィメトリクスアノテーションに従って同定した。表１、３および５の識別子に相当する遺伝子は、ＢＬＡＳＴにより、これらの識別子の標的配列をヒトゲノム配列データベースに対して検索することによっても同定できる。この目的のために適するデータベースは、限定されないが、メリーランド州、ベテスダの国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のヒトゲノムデータベースを含む。ＮＣＢＩは、その配列データベースを検索するための「ｂｌａｓｔｎ」のようなＢＬＡＳＴプログラムも提供する。識別子に相当する遺伝子のＢＬＡＳＴ検索は、識別子の標的配列の明確なセグメント（すなわち、未知のヌクレオチド残基を全く含まない配列セグメント）を用いて行うことができる。そのタンパク質コーディング配列が、明確なセグメントと著しい配列同一性（例えば少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより多い配列同一性）を有する遺伝子を同定できる。このようにして同定される遺伝子のＲＮＡ転写産物（またはその相補鎖）は、ストリンジェントなまたは核酸アレイハイブリダイゼーションの条件下で、識別子のＰＭプローブにハイブリダイズできる。したがって、表１、３および５の識別子は、表に明示的に記載される遺伝子を表すだけでなく、列挙されていないにもかかわらずストリンジェントなまたは核酸アレイハイブリダイゼーションの条件下で識別子のＰＭプローブにハイブリダイズできる遺伝子も表す。
本明細書で用いる場合、「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも表７のＧ〜Ｌ条件と同様にストリンジェントである。「高度にストリンジェントな条件」とは、少なくとも表７のＡ〜Ｆ条件と同様にストリンジェントである。各条件について、ハイブリダイゼーションは、対応するハイブリダイゼーション条件（ハイブリダイゼーション温度および緩衝液）の下で約４時間、続いて、対応する洗浄条件（洗浄温度および緩衝液）の下で２０分間の洗浄を２回行うことにより行われる。
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 １：ハイブリッドの長さは、ハイブリダイズするポリヌクレオチドのハイブリダイズした領域について予想されるものである。ポリヌクレオチドを未知配列の標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる場合、ハイブリッドの長さは、ハイブリダイズするポリヌクレオチドの長さであるとみなす。既知配列のポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる場合、ハイブリッドの長さは、ポリヌクレオチドの配列を整列させ、最適配列相補性の領域を同定することにより決定できる。
Ｈ：ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４および１．２５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄緩衝液において、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）を置き換えることができる。
ＴＢ ＊−ＴＲ ＊：長さ５０塩基対未満と予想されるハイブリッドについてのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）（ここで、Ｔｍは以下の等式に従って決定される）より５〜１０℃低いはずである。長さ１８塩基対未満のハイブリッドについて、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の＃）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の＃）。長さ１８〜４９塩基対のハイブリッドについて、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｎａ＋）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）、ここで、Ｎはハイブリッド中の塩基の数であり、Ｎａ＋はハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンのモル濃度である（１×ＳＳＣについてのＮａ＋＝０．１６５Ｍ）。
Ｃ．ＭＤＳ、ＡＭＬまたはその他の白血病の予後、診断および治療の選択
本発明の白血病疾患遺伝子は、ＭＤＳ、ＡＭＬまたはその他の白血病の診断および予後のために用いることができる。例えば、疾患遺伝子は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に進行する可能性があるＭＤＳ患者を同定するために用いることができる。白血病疾患遺伝子は、興味のある患者における白血病の進行または治療の有効性を評価するために用いることもできる。任意の種類の白血病を本発明に従って評価できる。これらの白血病の例は、限定されないが、ＡＭＬ、ＭＤＳ、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病およびヘアリーセル白血病を含む。診断および予後は、典型的には、興味のある白血病患者における１つまたは複数の疾患遺伝子の末梢血発現プロファイルの、少なくとも１つの参照発現プロファイルとの比較を含む。
ある実施形態において、診断および予後に用いられる疾患遺伝子は、各疾患遺伝子の末梢血発現プロファイルがクラスに基づく相関分析（例えば最近傍分析）の下でクラス区分と相関するように選択され、ここで、クラス区分は、異なる臨床結果を有する白血病患者の末梢血試料中の選択された遺伝子の理想化された発現パターンを表す。多くの場合、選択された疾患遺伝子は、ランダム順列検定の下で５０％、２５％、１０％、５％または１％を超える有意水準でクラス区分と相関する。
疾患遺伝子は、あるクラスの白血病患者の末梢血試料中の各疾患遺伝子の平均発現プロファイルが別のクラスの白血病患者または疾患でないヒトにおけるものから統計的に異なるように選択することもできる。例えば、観察される差分についてのスチューデントのｔ検定の下でのｐ値は、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１またはそれより低いもの以下であり得る。さらに、疾患遺伝子は、あるクラスの患者の各疾患遺伝子の平均末梢血発現レベルが、別のクラスの患者または疾患でないヒトにおけるものから少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍または２０倍異なるように選択することができる。
目的の被験体の末梢血試料中の白血病疾患遺伝子の発現プロファイルは、目的の被験体における白血病の進行または治療を診断または評価するために、同じ遺伝子の参照発現プロファイルと比較できる。参照発現プロファイルは、目的の被験体の末梢血試料と同じ種類の末梢血試料（例えば全血試料または濃縮された未分画のＰＢＭＣを含む血液試料）を用いて作成できる。両方の発現プロファイルは、同じ作成手順または方法論を用いて作成できる。よって、目的の被験体の発現プロファイルにおける各成分について、参照発現プロファイルには少なくとも１つの対応する成分が存在する。参照発現プロファイルは、予め決定できるかまたは予め記録できる。これは、目的の被験体の発現プロファイルの決定と同時に、またはその後に作成することもできる。本発明において用いられる各発現プロファイルは、任意の形式、例えば表形式、図形式または電子的もしくはデジタルの形式であり得る。
本発明において用いられる参照発現プロファイルは、典型的には、疾患でないヒトまたは既知の白血病の患者の末梢血試料中の白血病疾患遺伝子の発現パターンを示唆する値もしくは範囲を含むかまたはそれからなる。ある実施形態において、参照発現プロファイルは、疾患でないヒトの末梢血試料中の各白血病疾患遺伝子の平均発現レベルを含む。別の例においては、参照発現プロファイルは、調べられる白血病の患者の末梢血試料中の各白血病疾患遺伝子の平均発現レベルを含む。限定されないが、相加平均、調和平均、絶対値の平均、ｌｏｇ変換値の平均および加重平均を含む任意の平均値算出方法を用いることができる。
参照発現プロファイルは、複数の発現プロファイルを含んでよく、そのそれぞれは、臨床結果が既知または決定可能な特定の白血病患者における疾患遺伝子の末梢血発現パターンを表す。例えば、参照発現プロファイルは、２つ以上の個別の発現プロファイルを含んでよく、そのそれぞれは、異なる白血病患者または疾患でないボランティアの末梢血試料中の白血病疾患遺伝子の発現プロファイルを表す。目的の被験体の発現プロファイルは、重みつき多数決、ｋ最近傍またはサポートベクターマシンのようなパターン認識アルゴリズムを用いてこれらの個別の参照発現プロファイルと比較できる。
本発明に適する参照発現プロファイルは、用いられる各白血病疾患遺伝子の発現レベルについての範囲を含んでよい。各範囲は、疾患でないヒトまたは既知の白血病の患者の末梢血試料中の対応する遺伝子の発現レベルにおける変動を反映するように選択できる。例えば、範囲は、疾患でないヒト（または既知の白血病の患者）の末梢血試料中の対応する遺伝子の平均発現レベルからの１つの標準偏差（またはその倍数もしくは分数）であるように選択できる。目的の被験体の遺伝子の発現レベルがその範囲内になる場合に、その遺伝子に関して「類似」との合図をすることができる。
その他の種類の参照発現プロファイルも、本発明において用いることができる。例えば、数値的な閾値を参照として用いることができる。
興味のある患者の発現プロファイルおよび参照発現プロファイルは、任意の形で構築できる。ある実施形態において、発現プロファイルは、結果予測において用いる各疾患遺伝子の発現レベルを含む。発現レベルは、絶対レベル、標準化レベルまたは相対レベルであり得る。適切な標準化手順は、限定されないが、核酸アレイ遺伝子発現分析において用いられるもの、またはＨｉｌｌら、（２００１年）Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．、２：ｒｅｓｅａｒｃｈ００５５．１−００５５．１３に記載されるものを含む。ある例において、発現レベルは、平均がゼロであり標準偏差が１であるように標準化される。別の例において、発現レベルは、当業者に認識されるように、内部または外部の対照に基づいて標準化される。さらに別の例において、発現レベルは、血液試料中の発生量が既知である１つまたは複数の対照転写産物に対して標準化される。多くの場合、興味のある患者の発現プロファイルおよび参照発現プロファイルは、同じまたは匹敵する方法論を用いて構築される。
別の実施形態において、比較される各発現プロファイルは、異なる疾患遺伝子の発現レベル間の１つまたは複数の比を含む。発現プロファイルは、遺伝子発現パターンを表すことができるその他の尺度も含み得る。
本発明に適する末梢血試料は、限定されないが、全血試料または未分画のＰＢＭＣを含む試料を含む。多くの実施形態において、濃縮された未分画のＰＢＭＣを含む末梢血試料が用いられる。「濃縮された」により、これは、試料中のＰＢＭＣの百分率が全血中のそれよりも高いことを意味する。多くの場合、濃縮された試料中の細胞の少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％がＰＢＭＣである。濃縮された未分画のＰＢＭＣを調製するために適する方法は、限定されないが、フィコール勾配遠心分離または細胞精製チューブ（ＣＰＴ）を含む。その他の通常の方法を用いて、濃縮された未分画のＰＢＭＣを調製することもできる。
発現プロファイルの構築は、典型的には、診断または予後に用いられる各疾患遺伝子の発現レベルの検出を含む。多数の方法が、この目的のために利用可能である。例えば、遺伝子の発現レベルは、遺伝子のＲＮＡ転写産物のレベルを測定することにより決定できる。適切な方法は、限定されないが、定量ＲＴ−ＰＣＴ、ノーザンブロット、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、スロットブロッティング、ヌクレアーゼ保護アッセイ、および核酸アレイ（ビーズアレイを含む）を含む。遺伝子の発現レベルは、遺伝子によりコードされるポリペプチドのレベルを測定することによっても決定できる。適切な方法は、限定されないが、イムノアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＡＣＳまたはウェスタンブロット）、２次元ゲル電気泳動、質量分析またはタンパク質アレイを含む。
目的の被験体における白血病疾患遺伝子の発現プロファイルは、被験体の末梢血試料中の各遺伝子のＲＮＡ転写産物レベルを測定することにより決定できる。この目的のために適する方法は、限定されないが、定量ＲＴ−ＰＣＴ、競合ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、ディファレンシャルディスプレイＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、スロットブロッティング、ヌクレアーゼ保護アッセイ、および核酸アレイ（ビーズアレイを含む）を含む。白血病疾患遺伝子の発現プロファイルは、目的の被験体の末梢血試料中の各遺伝子のタンパク質産物レベルを測定することによっても決定できる。この目的のために適する方法は、限定されないが、イムノアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ＦＡＣＳ（蛍光発色セルソーター）、ウェスタンブロット、ドットブロット、免疫組織化学、または抗体ベースの放射性イメージング）、タンパク質アレイ、ハイスループットタンパク質配列決定、２次元ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、および質量分析を含む。さらに、白血病疾患遺伝子によりコードされるタンパク質産物の生物学的活性（例えば酵素活性またはタンパク質／ＤＮＡ結合活性）を用いて、興味のある末梢血試料中の遺伝子の発現レベルを測定することもできる。
白血病疾患遺伝子の発現プロファイルは、任意の形であり得る。ある実施形態において、発現プロファイルは、用いられる各白血病疾患遺伝子の発現レベルを含む。各発現レベルは、絶対的発現レベル、または標準化されたかもしくは相対的な発現レベルであり得る。異なる遺伝子の発現レベルを標準化するために適する方法は、限定されないが、ともにそれらの全体が参照として本明細書に組み込まれるＨｉｌｌら、（２００１年）Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．、２：ｒｅｓｅａｒｃｈ００５５．１−００５５．１３、およびＧｅｎｅｃｈｉｐ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ − Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ（Ｐａｒｔ Ｎｏ．７０１１９０ Ｒｅｖ．２、アフィメトリクス、インコーポレーテッド、２００２年）に記載されるものを含む。ある例において、各白血病疾患遺伝子の発現レベルは、内部または外部の対照に基づいて標準化される。各白血病疾患遺伝子の発現レベルも、用いる試料中の発生量が既知である１つまたは複数の対照転写産物に対して標準化できる。
白血病疾患遺伝子の発現プロファイルは、異なる白血病疾患遺伝子の発現レベル間の比（例えば、ダウンレギュレートされる遺伝子に対する白血病患者のＰＢＭＣにおいてアップレギュレートされる遺伝子の発現レベル間の比）も含み得る。非白血病疾患遺伝子に対する白血病疾患遺伝子の発現レベル間の比を用いて、白血病疾患遺伝子の発現プロファイルを構築することもできる。遺伝子発現パターンを示すその他の尺度を用いて、遺伝子発現プロファイルを作成することもできる。
目的の被験体の発現プロファイルと参照発現プロファイルとの間の差分または類似性は、２つのプロファイルにおける対応する成分間の差分または類似性を評価することにより決定できる。この目的のために適する方法は、限定されないが、倍数変化または絶対差分を含む。ある例において、目的の被験体における白血病疾患遺伝子の発現レベルは、２つのレベル間の差分が参照レベルの５０％、４０％、３０％、２０％または１０％未満であれば、参照発現プロファイルにおける対応する参照レベルに類似であるとみなす。別の例においては、目的の被験体における白血病疾患遺伝子の発現レベルは、該レベルが参照レベルの標準偏差（またはその倍数もしくは分数）の範囲内であれば、参照発現プロファイルにおける対応する参照レベルに類似であるとみなす。
目的の被験体の発現プロファイルと参照発現プロファイルとの間の全体的な類似性についての基準は、白血病診断または評価についての精度（正確な合図と不正確な合図との合計に対する正確な合図の比）が比較的高くなるように選択できる。例えば、類似性の基準は、白血病診断または評価の精度が少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれより大きくなるように選択できる。ある例においては、目的の被験体の発現プロファイルの要素の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれより多くが参照発現プロファイルの対応する要素に類似であるとみなされる場合に、全体的に類似の合図が行われる。発現プロファイル中の異なる要素は、比較において同じまたは異なる重みを有してよい。遺伝子発現に基づく方法を他の臨床試験と組み合わせて、白血病診断または評価の精度を向上させることもできる。
重みつき多数決アルゴリズムは、目的の被験体にクラスへの帰属を割り当てることができる。上記のＧｏｌｕｂら、および上記のＳｌｏｎｉｍらを参照されたい。この目的のために適するソフトウェアプログラムは、限定されないが、ＧｅｎｅＣｌｕｓｔｅｒ ２ソフトウェア（マサチューセッツ州、ケンブリッジ、ブロードインスティテュート（Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））を含む。
重みつき多数決分析のある形の下では、目的の被験体は、２つ（すなわちクラス０およびクラス１）のクラスのうちの１つに割り当てられ、各クラスは異なる疾患状態（すなわちＡＭＬ、ＭＤＳまたは疾患なし）を表す。例えば、クラス０は、疾患でないヒトを含むことができ、クラス１はＭＤＳ（またはＡＭＬ）の患者を含む。別の例においては、クラス０はＡＭＬ患者を含むことができ、クラス１はＭＤＳ患者を含む。一連のＡＭＬまたはＭＤＳ疾患遺伝子を、表２、４または６から選択して分類指標（すなわちクラス予測因子）を形成することができる。分類指標中の各遺伝子は、２つ（すなわちクラス０およびクラス１）のクラスのうちの１つについての重みつき投票を計算する。遺伝子「ｇ」の投票は、ｖｇ＝ａｇ（ｘｇ−ｂｇ）として定義でき、ここで、ａｇはＰ（ｇ，ｃ）に等しく、かつ遺伝子「ｇ」の発現レベルとクラス０およびクラス１の間のクラス区分との相関関係を反映する。ｂｇは、［ｘ０（ｇ）＋ｘ１（ｇ）］／２であり、これはクラス０およびクラス１における遺伝子「ｇ」の発現レベルの中間ｌｏｇの平均である。ｘｇは、興味のある試料中の遺伝子「ｇ」の発現レベルの標準化されたｌｏｇを表す。正のｖｇはクラス０についての投票を示し、負のｖｇはクラス１についての投票を示す。Ｖ０とは、全ての正の投票の合計を意味し、Ｖ１は全ての負の投票の合計の絶対値を意味する。予測強度ＰＳは、ＰＳ＝（Ｖ０−Ｖ１）／（Ｖ０＋Ｖ１）と定義される。
クロス確認は、重みつき多数決アルゴリズムの下で作られたクラス予測因子の精度を評価するために用いることができる。ある実施形態において、クロス確認は、疾患遺伝子の同定のための近傍分析で用いられた試料を保留することを含む。クラス予測因子は、残りの試料に基づいて作られ、次いで、保留された試料のクラスを予測するために用いられる。この手順を、近傍分析において用いられた各試料について反復する。異なる白血病疾患遺伝子のクラス予測因子は、クロス確認により評価され、最も正確な叙述の最良のクラス予測因子を同定できる。
任意の数の白血病疾患遺伝子を、本発明において用いることができる。ある実施形態において、表２から選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０またはそれより多い遺伝子を、目的の被験体におけるＡＭＬの診断または治療の有効性の評価のために用いる。別の実施形態においては、表４からから選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０またはそれより多い遺伝子を、目的の被験体におけるＭＤＳの診断または治療の有効性の評価のために用いる。さらに別の実施形態においては、表６から選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０またはそれより多い遺伝子を、目的の被験体におけるＭＤＳの診断または進行もしくは治療の評価のために用いる。さらなる実施形態において、表２、４または６から選択される遺伝子の組合せを、目的の被験体におけるＡＭＬまたはＭＤＳの診断または進行もしくは治療の評価のために用いる。
本発明において用いられる白血病疾患遺伝子は、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１またはそれ未満を超えないｐ値を有するように選択できる。白血病疾患遺伝子は、疾患でないヒトに比べて白血病患者においてアップレギュレートされている遺伝子、および疾患でないヒトに比べて白血病患者においてダウンレギュレートされている遺伝子を含むように選択することもできる。白血病の診断または評価の精度を改善するために、白血病疾患遺伝子は、米国特許出願第２００４０２１４１７９号に記載されるような平均分散アルゴリズムのような最適化アルゴリズムを用いることにより選択することもできる。
重みつき多数決またはｋ最近傍アルゴリズムを用いる場合、クラス予測因子の中の白血病疾患遺伝子は、それらが近傍分析におけるクラス区分と著しく関連づけられるように選択できる。例えば、近傍分析において１％、５％または１０％有意水準を超える白血病疾患遺伝子を選択できる。上記のＧｏｌｕｂら、および上記のＳｌｏｎｉｍらを参照されたい。クラス予測因子の中の白血病疾患遺伝子は、最上位のアップレギュレートされる白血病疾患遺伝子、および最上位のダウンレギュレートされる白血病疾患遺伝子も含むことができる。
ある例において、本発明において用いられるクラス予測因子は、表２または表４から選択される少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、４０もしくはそれより多い遺伝子を含むかまたはそれらからなる。クラス予測因子は、遺伝子の少なくとも２つの群を含み得る。第１の群は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより大きいＡＭＬ／疾患なしの比（またはＭＤＳ／疾患なしの比）を有する遺伝子を含み、第２の群は、０．５、０．３３３、０．２５、０．２、０．１またはそれ未満を超えないＡＭＬ／疾患なしの比（またはＭＤＳ／疾患なしの比）を有する遺伝子を含む。
別の例において、本発明において用いられるクラス予測因子は、表６から選択される少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、４０もしくはそれより多い遺伝子を含むかまたはそれらからなる。クラス予測因子は、遺伝子の少なくとも２つの群を含むこともできる。第１の群は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより大きいＡＭＬ／ＭＤＳの比を有する遺伝子を含み、第２の群は、０．５、０．３３３、０．２５、０．２、０．１またはそれ未満を超えないＡＭＬ／ＭＤＳの比を有する遺伝子を含む。
表２、４および６に示す遺伝子に加えて、本発明は、目的の被験体における白血病の診断または進行もしくは治療の評価のためのその他の白血病疾患遺伝子の使用も意図する。これらの遺伝子は、ストリンジェントなまたは核酸アレイハイブリダイゼーション条件の下で、表２、４および６から選択される識別子にハイブリダイズできる。本明細書で用いる場合、遺伝子は、遺伝子のＲＮＡ転写産物（または識別子のオリゴヌクレオチドプローブの鎖の数に応じてその相補鎖）が識別子の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズできる場合に、識別子にハイブリダイズできる。多くの場合、遺伝子のＲＮＡ転写産物（またはその相補鎖）は、ストリンジェントなまたは核酸アレイハイブリダイゼーションの条件の下で、識別子のオリゴヌクレオチドプローブの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％にハイブリダイズでき、デフォルト設定（すなわち閾値Ｔａｕが０．０１５であり、有意水準α１が０．４である）の下でアフィメトリクスＧｅｎｅｃｈｉｐ（登録商標）上の識別子において「存在」の合図を生み出す。Ｇｅｎｅｃｈｉｐ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ − Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ（Ｐａｒｔ Ｎｏ．７０１１９０ Ｒｅｖ．２、アフィメトリクス、インコーポレーテッド、２００２年）を参照されたい。
Ｄ．その他の使用
ＡＭＬ、ＭＤＳおよびその他の血液または骨髄の疾患に関する臨床上の課題は、治療に対する患者の非常に多様な応答である。薬理ゲノム学の基本的な概念は、利用可能な治療のオプションに関する患者の遺伝子型を理解し、次に、患者についての最も適切なオプションを個別に考慮することである。本発明によると、患者の異なるクラスを、所定の治療に対するそれらの異なる応答に基づいて作ることができる。ある応答のクラスの未分画のＰＢＭＣで、別の応答クラスに比べて示差的に発現される遺伝子を、全体の遺伝子発現分析を用いて同定できる。これらの遺伝子は、興味のある患者が治療に対して多少は反応を示すか否かを予測するための分子マーカーである。好ましい結果を示すと予測される患者について、治療の毒性を最小限にする努力を考慮してよく、一方、治療に応答しないことが予測される患者については、その他の方法による治療または実験的養生法を用いる治療を探すことができる。
ある実施形態において、患者は、少なくとも２つのクラス（クラス０およびクラス１）にグループ分けされる。クラス０は、治療の開始後のある特定の期間（例えば１年）の間に死亡する患者を含む。クラス１は、治療の開始後のある特定の期間を超えて生存する患者を含む。クラス１患者の未分画のＰＢＭＣに比べてクラス０患者の未分画のＰＢＭＣで示差的に発現される遺伝子を同定できる。これらの遺伝子は、患者の臨床的結果の予後マーカーである。寛解／非寛解、進行する時間、完全な応答、部分的な応答、安定な疾患または進行する疾患のようなその他の臨床的結果の基準を用いて、白血病患者をグループ分けして対応する予後遺伝子を同定することもできる。
本発明の白血病疾患遺伝子は、ＡＭＬまたはＭＤＳの治療のための薬剤を同定または試験するために用いることもできる。未分画のＰＢＭＣ中でのＡＭＬまたはＭＤＳ疾患遺伝子の異常な発現を低減または停止する薬剤候補の能力は、ＡＭＬまたはＭＤＳの治療における薬剤候補の有効性を示唆する。薬剤候補をスクリーニングまたは評価する方法は、当該技術において公知である。これらの方法は、動物モデルにおいて、またはヒトの臨床試験の間のいずれかに行うことができる。
本発明は、ＡＭＬまたはＭＤＳ疾患遺伝子をコードする発現ベクターも意図する。これらのＡＭＬまたはＭＤＳ疾患遺伝子は、ＡＭＬまたはＭＤＳの腫瘍細胞において過少発現してよい。必要がある患者に発現ベクターを導入することにより、これらの遺伝子の異常発現を修正できる。この目的のために適切な発現ベクターおよび遺伝子送達技術は、当該技術において公知である。
さらに、本発明は、ＡＭＬもしくはＭＤＳ疾患遺伝子に対してアンチセンスな配列またはそれをコードする発現ベクターを意図する。ＡＭＬまたはＭＤＳ疾患遺伝子は、ＡＭＬまたはＭＤＳ腫瘍細胞において過剰発現してよい。アンチセンス配列またはそれをコードする発現ベクターを導入することにより、これらの疾患遺伝子の異常発現を修正できる。
ＡＭＬまたはＭＤＳ疾患遺伝子の発現は、ＲＮＡ干渉（「ＲＮＡｉ」）により阻害することもできる。ＲＮＡｉは、標的遺伝子活性を特異的に停止する転写後遺伝子サイレンシング（「ＰＴＧＳ」）において用いられる技術である。ＲＮＡｉは、植物におけるＰＴＧＳと多くの観点で類似しており、トリパノソーマ類、ヒドラ、プラナリア、線虫およびショウジョウバエ（キイロショウジョウバエ）を含む多くの無脊椎動物において検出されている。これは、転位因子可動化および抗ウイルス状態形成の調節に関与するだろう。哺乳動物系におけるＲＮＡｉは、ＰＣＴ出願ＷＯ００／６３３６４号に開示される。ある実施形態において、少なくとも約２１ヌクレオチドのｄｓＲＮＡが細胞に導入されて、標的遺伝子の発現のサイレンシングを行う。
さらに、本発明は、ＡＭＬまたはＭＤＳ疾患遺伝子によりコードされるポリペプチドを特異的に認識する抗体を特徴とする。これらの抗体は、必要とする患者に投与できる。ある実施形態において、本発明の抗体は、疾患遺伝子の活性を実質的に低減または阻害できる。例えば、抗体は、疾患遺伝子の活性を、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれより多く低減できる。本発明に適する抗体は、限定されないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、ＦａｂフラグメントまたはＦａｂ発現ライブラリーにより産生されるフラグメントを含む。多くの実施形態において、本発明の抗体は、各ＡＭＬもしくはＭＤＳ疾患遺伝子産物またはその他の所望の抗原に、少なくとも１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１またはそれより大きい結合親和定数Ｋａで結合できる。
本発明の抗体またはポリヌクレオチドを含む医薬組成物を、製造できる。医薬組成物は、その意図する投与経路に適合するように処方できる。投与経路の例は、限定されないが、非経口、静脈内、皮内、皮下、経口、吸入、経皮、局所、経粘膜、および直腸での投与を含む。所望の医薬組成物を製造する方法は、当該技術において公知である。
本発明は、ＡＭＬもしくはＭＤＳの診断または進行もしくは治療のモニタリングのためのキットまたは装置をさらに特徴とする。ある実施形態において、本発明のキットまたは装置は、そのそれぞれがストリンジェントな条件下で表２、４または６から選択される遺伝子にハイブリダイズできる１つまたは複数のポリヌクレオチドを含むかまたはそれらから実質的になる。ポリヌクレオチドは、蛍光、放射活性またはその他の検出可能な成分で標識され得る。ポリヌクレオチドは、未標識でもあり得る。任意の数のポリヌクレオチドが、キットまたは装置に含まれ得る。例えば、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０またはそれより多いポリヌクレオチドが、キットまたは装置に含まれることができ、各ポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で表２、４または６から選択される異なる遺伝子のそれぞれにハイブリダイズできる。ある例において、キットまたは装置に含まれるポリヌクレオチドは、バイアル、チューブ、瓶、または別の含有手段に封入される。別の例において、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の基板に安定的に連結される。核酸ハイブリダイゼーションは、基板上で直接行うことができる。ハイブリダイゼーション試薬も、本発明のキットまたは装置に含まれ得る。
別の実施形態において、本発明のキットまたは装置は、表２、４または６から選択される遺伝子によりコードされるポリペプチドに特異的な１つまたは複数の抗体を含むかまたはそれから実質的になる。抗体は、１つまたは複数の検出可能な成分で標識されて、抗体−抗原複合体の検出を可能にできる。抗体は、未標識でもあり得る。
任意の数の抗体が、キットまたは装置に含まれ得る。例えば、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０またはそれより多い抗体が、キットまたは装置に含まれることができ、これらの各抗体は異なるそれぞれのＡＭＬまたはＭＤＳ疾患遺伝子産物を特異的に認識できる。免疫検出試薬（例えば二次抗体、対照または酵素基質）も、本発明のキットまたは装置に含まれ得る。ある例において、本発明のキットは、抗体を封入した１つまたは複数の容器を含む。別の例において、本発明の装置内の抗体は、１つまたは複数の基板に安定的に連結される。この目的のために適する基板は、限定されないが、フィルム、メンブレン、円柱のマトリクス、またはマイクロタイタープレートのウェルを含む。イムノアッセイは、基板上で直接行うことができる。
さらに、本発明は、興味のある発現プロファイルを、少なくとも１つの参照発現プロファイルと比較できるシステムを特徴とする。多くの実施形態において、参照発現プロファイルは、データベースに保存される。興味のある発現プロファイルと参照発現プロファイルとの比較は、コンピュータシステムを用いることによるような電子工学的に行うことができる。コンピュータシステムは、典型的には、比較される発現プロファイルを表すデータを保存するメモリに連結されたプロセッサを含む。ある実施形態において、メモリは、読み取り可能でありかつ再書き込み可能である。発現プロファイルは、引き出すかまたは修飾できる。コンピュータシステムは、プロセッサに発現プロファイルを比較させることができる１つまたは複数のプログラムを含む。ある実施形態において、コンピュータシステムは、重みつき多数決またはｋ最近傍アルゴリズムを実行可能なプログラムを含む。別の実施形態において、コンピュータシステムは、そこからハイブリダイゼーション信号をシステムに直接供給できる核酸アレイに連結している。
ＭＤＳ、ＡＭＬおよびその他の白血病の予後、診断または治療の選択のためのキット
さらに、本発明は、ＭＤＳ、ＡＭＬもしくはその他の白血病の予後、診断または治療の選択のために有用なキットを特徴とする。各キットは、白血病疾患遺伝子（例えば表２、４または６から選択される遺伝子）のための少なくとも１つのプローブを含むかまたはそれから本質的になる。キットの使用を促進する試薬または緩衝液も含むことができる。ハイブリダイゼーションプローブ、増幅プライマーまたは抗体のような任意の種類のプローブを本発明において用いることができる。
ある実施形態において、本発明のキットは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多くのポリヌクレオチドプローブもしくはプライマーを含むかまたはそれらから本質的になる。各プローブ／プライマーは、ストリンジェントな条件または核酸アレイハイブリダイゼーション条件の下で、異なるそれぞれの白血病疾患遺伝子にハイブリダイズできる。本明細書において用いる場合、ポリヌクレオチドが遺伝子のＲＮＡ転写産物またはその相補鎖にハイブリダイズできるのであれば、該ポリヌクレオチドは遺伝子にハイブリダイズできる。別の実施形態において、本発明のキットは、それぞれが異なるそれぞれの白血病疾患遺伝子によりコードされるポリペプチドに結合可能な１つまたは複数の抗体を含む。
ある例において、本発明のキットは、表２、４または６から選択される少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５またはそれより多くの遺伝子についてのプローブ（例えばハイブリダイゼーションもしくはＰＣＲ増幅プローブまたは抗体）を含むかまたはそれらから本質的になる。
本発明において用いられるプローブは、標識されるかまたは未標識であるかのいずれかであり得る。標識プローブは、分光的、光化学的、生化学的、生物電子工学的、免疫化学的、電気的、光学的、化学的またはその他の適切な手段により検出できる。プローブについての標識成分の例は、放射性同位体、化学発光化合物、標識結合タンパク質、重金属原子、蛍光マーカーおよび色素のような分光的マーカー、磁気標識、結合酵素、質量分析タグ、スピンラベル、電子伝達供与体および受容体などを含む。
本発明のキットは、緩衝液またはレポーター手段を含む容器も有することができる。さらに、キットは、陽性または陰性の対照となる試薬を含むことができる。ある実施形態において、本発明において用いられるプローブは、１つまたは複数の基板支持体に安定的に連結される。核酸ハイブリダイゼーションまたはイムノアッセイは、基板支持体上で直接行うことができる。この目的のために適切な基板支持体は、限定されないが、ガラス、シリカ、セラミクス、ナイロン、石英ウェーハ、ゲル、金属、紙、ビーズ、チューブ、繊維、フィルム、メンブレン、円柱のマトリクス、またはマイクロタイタープレートのウェルを含む。本発明のキットは、それぞれがキットに含まれる１つまたは複数のプローブにより検出可能な疾患遺伝子の参照発現レベルを表す１つまたは複数の対照も含んでよい。
上記の実施形態および以下に続く実施例は、説明のために与えられ、限定のためではないことが理解されるべきである。本発明の範囲内での種々の変更および改変は、本明細書の記載から当業者には明らかになるであろう。
（実施例１）ＰＢＭＣおよびＲＮＡの精製
全血を、疾患でないボランティア、ＭＤＳの患者およびＡＭＬの患者から採取した。これらの臨床研究の薬理ゲノム学的部分についての告知に基づく同意が得られ、計画は、参加する臨床現場での施設再調査委員会により認証された。ＭＤＳ患者は、主に白人家系であり、平均年齢６６歳（５２〜８４歳の範囲）であった。ＡＭＬ患者は、白人家系のみであり、平均年齢４５歳（１９〜６５歳の範囲）であった。疾患でないボランティアは、平均年齢２３歳（１８〜３２歳の範囲）の白人家系のみであった。
ＡＭＬ患者についての参加基準は、骨髄中に２０％を超える芽球、ＦＡＢ分類システムによるＡＭＬの形態学的診断、およびＣＤ３３＋状態を示すフローサイトメトリー分析を含んだ。ＭＤＳ患者についての参加基準は、ＭＤＳの形態学的診断および不応性貧血、環状鉄芽球を伴う不応性貧血、芽球増加を伴う不応性貧血、または変換芽球増加を伴う不応性貧血としてのＦＡＢ分類（疾患安定性が最低２ヶ月証明されていた）を含んだ。
血液試料を、ＣＰＴ細胞調製ヴァキューテイナーチューブ（ベクトンディッキンソン）に入れた。ＰＢＭＣを、製造者の計画（ベクトンディッキンソン）に従って、フィコール勾配で単離した。トータルＲＮＡを、未分画のＰＢＭＣペレットから、キアゲンＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニキット（キアゲン、カリフォルニア州、バレンシア）を用いて単離した。
（実施例２）ＲＮＡ増幅およびＧｅｎｅｃｈｉｐ（登録商標）ハイブリダイゼーションプローブの作製
オリゴヌクレオチドアレイについての標識された標的を、Ｌｏｃｋｈａｒｔら、（１９９６年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：１６７５〜１６８０頁に記載される手順の変法を用いて調製した。２μｇのトータルＲＮＡを、５’末端にＴ７ ＤＮＡポリメラーゼプロモーターを含むオリゴ−ｄ（Ｔ）２４プライマーを用いてｃＤＮＡに変換した。ｃＤＮＡを、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼキット（アンビオン、米国、テキサス州、ウッドランド）ならびにビオチン標識ＣＴＰおよびＵＴＰ（エンゾ（Ｅｎｚｏ）、米国、ニューヨーク州、ファーミングデイル）を用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のための鋳型として用いた。標識ｃＲＮＡは、最終容量４０μｌの４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸 ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＫＯＡｃ、３０ｍＭ ＭｇＯＡｃ中で、９４℃にて３５分間断片化した。
（実施例３）アフィメトリクスマイクロアレイへのハイブリダイゼーションおよび蛍光の検出
それぞれの疾患または疾患なしの試料を、ＨＧ−Ｕ１３３Ａ Ｇｅｎｅｃｈｉｐ（登録商標）（アフィメトリクス）とハイブリダイズさせる。試料はプールしない。１０μｇの標識された標的を、１００μｇ／ｍｌのニシン精子ＤＮＡおよび５０μｇ／ｍｌのアセチル化ＢＳＡを含む１×ＭＥＳ緩衝液で希釈する。Ｈｉｌｌら（２０００年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９０：８０９〜８１２頁に記載されるように、アレイをそれぞれ互いに標準化し、オリゴヌクレオチドアレイの感度を見積もるために、１１の細菌遺伝子のｉｎ ｖｉｔｒｏで合成された転写産物を各ハイブリダイゼーション反応に含める。これらの転写産物の存在量は、合計転写産物当たりの対照転写産物の数に関して示すと１：３００，０００（３ｐｐｍ）〜１：１０００（１０００ｐｐｍ）の範囲である。これらの対照転写産物からの信号応答により決定されるように、アレイの検出感度は、約１：３００，０００と１：１００，０００コピー／百万の間の範囲であり得る。
標識プローブは、９９℃にて５分間、次いで４５℃にて５分間変性させ、１２，５００を超えるヒト遺伝子を含むオリゴヌクレオチドアレイ（ＨＧ−Ｕｌ ３３Ａ、アフィメトリクス）とハイブリダイズさせる。アレイは、４５℃にて１６時間ハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション緩衝液は、１００ｍＭ ＭＥＳ、１Ｍ［Ｎａ＋］、２０ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む。ハイブリダイゼーションの後に、洗浄緩衝液６×ＳＳＰＥＴを用いてカートリッジを十分に洗浄する（例えば、各回少なくとも１０分間、室温にて３回）。これらのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、ひとまとめにして「核酸アレイハイブリダイゼーション条件」という。洗浄したカートリッジは、続いて、ストレプトアビジンに結合したフィコエリスリンで染色する。
１２×ＭＥＳストックは、１．２２Ｍ ＭＥＳおよび０．８９Ｍ［Ｎａ＋］を含む。１０００ｍｌについて、ストックは、７０．４ｇのＭＥＳ酸非含有一水和物、１９３．３ｇのＭＥＳナトリウム塩および８００ｍｌの分子生物学グレードの水を混合し、容量を１０００ｍｌに調整することにより調製できる。ｐＨは、６．５と６．７の間であるはずである。２×ハイブリダイゼーション緩衝液は、８．３ｍｌの１２×ＭＥＳストック、１７．７ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌ、４．０ｍｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、０．１ｍｌの１０％ Ｔｗｅｅｎ２０および１９．９ｍｌの水を混合することにより調製できる。６×ＳＳＰＥＴは、０．９Ｍ ＮａＣｌ、６０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、６ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４および０．００５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む。洗浄緩衝液を、よりストリンジェントな洗浄緩衝液に置き換える場合がある。１０００ｍｌのストリンジェントな洗浄緩衝液は、８３．３ｍｌの１２×ＭＥＳストック、５．２ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌ、１．０ｍｌの１０％ Ｔｗｅｅｎ２０および９１０．５ｍｌの水を混合することにより調製できる。
（実施例４）遺伝子発現データ分析
データ分析および不在／存在の合図の決定は、Ｇｅｎｅｃｈｉｐ（登録商標）３．２ソフトウェア（アフィメトリクス）を用いて、生の蛍光強度値に対して行う。各転写産物についての「平均の差異」の値は、各ハイブリダイゼーション溶液に加えた既知の発生量の１１のコントロールｃＲＮＡの平均の差異を用いて全体の検量線を作成する縮尺頻度標準化法を用いて「頻度」の値に標準化する。その全体の内容が本明細書に参照として組み込まれるＨｉｌｌら（２００１年）Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．、２（１２）：ｒｅｓｅａｒｃｈ００５５．１−００５５．１３を参照されたい。次いで、この検量線を用いて、全ての転写産物についての平均の差異の値を、１：３００，０００（３百万分率（ｐｐｍ））〜１：１０００（１０００ｐｐｍ）の範囲の百万分率の単位で示される頻度の概算に変換する。
Ｇｅｎｅｃｈｉｐ（登録商標）３．２ソフトウェアは、アルゴリズムを用いて、遺伝子が「不在」または「存在」するかについての可能性とともに、アレイ上に示される各転写産物についての具体的なハイブリダイゼーション強度の値または「平均の差異」を算出する。これらの計算に用いられるアルゴリズムは、アフィメトリクスＧｅｎｅｃｈｉｐ（登録商標）Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｕｉｔｅ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅに記載される。
具体的な転写産物は、それらが以下の基準を満たすならば、さらに評価できる。第１に、全ての試料中でＧｅｎｅｃｈｉｐ（登録商標）３．２ソフトウェアにより「不在」と示された遺伝子を、分析から除外する。第２に、アレイ同士の間での転写産物のレベルの比較において、遺伝子は、アレイの少なくとも１つに存在することが要求される。第３に、群の間での転写産物のレベルの比較について、スチューデントのｔ検定を適用して、頻度の値において有意な差異（ｐ＜０．０５）を有する転写産物の部分集合を同定する。多くの場合、遺伝子の統計的に有意な部分集合の間での頻度の値の平均倍数変化が２倍またはそれより大きいことが必要とされる第４の基準も用いる。
それらの発現プロファイルの類似性に基づく遺伝子および／またはアレイの教師なし階層的クラスタリングは、Ｅｉｓｅｎら、（１９９８年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９５：１４８６３〜１４８６８頁に記載される手順を用いて行うことができる。最近傍予測分析および教師ありクラスタ分析は、上記のＧｏｌｕｂらに説明される測定基準を用いて行うことができる。階層的クラスタリングおよび最近傍予測分析のために、データは、まず、ｌｏｇに変換され、次いで、標準化されて０の平均値および１の分散を持つ。スチューデントのｔ検定を用いて、疾患なし、ＡＭＬおよびＭＤＳのＰＢＭＣ発現プロファイルを比較できる。０．０５以下のｐ値（例えば０．０１、０．００１、またはそれ未満以下）を用いて、統計的有意性を示すことができる。
ｋ最近傍のアプローチは、相関関係測定基準［Ｐ（ｇ，ｃ）＝（μ１−μ２）／（σ１＋σ２）］（式中、ｇは遺伝子ｇの発現ベクトルであり、ｃはクラスのベクトルであり、μ１およびσ１は、それぞれ、クラス１における遺伝子ｇの平均発現レベルおよび標準偏差を定義し、μ２およびσ２は、それぞれ、クラス２における遺伝子ｇの平均発現レベルおよび標準偏差を定義する）を用いて、実際のおよびランダムに並べ替えたデータの近傍分析を行うことができる。実際のクラス区分（ＡＭＬ対疾患なし、ＭＤＳ対疾患なし、またはＡＭＬ対ＭＤＳ）において観察された最も統計的に有意な遺伝子についての相関関係の尺度は、ランダムに並べ替えたクラス区分において観察される相関関係の最も統計的に有意な尺度と比較できる。ＡＭＬ対疾患なし、ＭＤＳ対疾患なし、またはＡＭＬ対ＭＤＳについての観察された距離測定と比較した１００のランダムに並べ替えたクラスの上位の１％、５％および中間距離測定をプロットして、本発明により同定される白血病疾患遺伝子の統計的確認を示すことができる。
（実施例５）疾患なし対ＭＤＳ対ＡＭＬの予測についての遺伝子分類子
２４の分類子のサイン（ＡＭＬを定義する７つの遺伝子を示す８つのｃＤＮＡ、ＭＤＳを定義する７つの遺伝子を示す８つのｃＤＮＡ、および疾患なしを定義する８つの遺伝子を示す８つのｃＤＮＡ）を同定した。このサインは、疾患なしの個体、ＭＤＳ患者またはＡＭＬ患者のＰＢＭＣ試料を正確に予測し、かつ分類できる。このサインは、ＭＤＳ患者におけるＡＭＬ進行の早期検出のための意味を有し、迅速なＭＤＳ進行者を「ＡＭＬ」と同定もする。
２４識別子サインにおける識別子を、以下の表８に列挙する。各識別子について、識別子に関連する信号対雑音の値は、「スコア」と表示する欄に示す。各信号対雑音の値は、隣の「Ｐｅｒｍ １％」欄の値より大きく、プロファイルのラベルをかき混ぜ、次いで同じクラスサイズを用いて比較したときにランダム順列の上位１％について観察される信号対雑音の値を表す。よって、識別子についての実際の信号対雑音の値は、ランダム順列の上位１％におけるものを超えていた。対応するヒト遺伝子は、名称、記号、染色体位置（「Ｃｙｔｏ Ｂａｎｄ」）、Ｕｎｉｇｅｎｅ番号、およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号により同定される。ＡＭＬを同定するために用いられるヒト遺伝子は、ヒトｍｙｂ；ヒトニューロンタンパク質３．１；ヒトミエロペルオキシダーゼ；ヒトカタラーゼ；ヒトＣＧＩ−４９；ヒト幹細胞成長因子；およびヒトセリンペプチダーゼインヒビター、Ｋａｚａｌ２型（アクロシン−トリプシンインヒビター）を含む。ＭＤＳを同定するために用いられるヒト遺伝子は、ヒトＮＥＤＤ４Ｌ；ヒトグルタチオンペルオキシダーゼ３；ヒトＸ結合Ｋｘ血液型群；ヒトシヌクレイン、アルファ；ヒト第８染色体オープンリーディングフレーム５１／機能未知タンパク質ＭＧＣ３１１３；ヒトインターフェロン、アルファ誘導タンパク質２７；およびヒトトランスグルタミナーゼ３を含む。疾患でない個体からのＰＢＭＣを同定するために用いられるヒト遺伝子は、ヒト第２１染色体オープンリーディングフレーム７；ヒトアミロイドベータＡ４前駆体タンパク質結合ファミリーＡメンバー２；ヒトＫＩＡＡ０４４９；ヒトＦボックスのみのタンパク質２１；ヒト死エフェクターフィラメント形成ｃｅｄ−４様アポトーシスタンパク質；ヒトジンクフィンガータンパク質１４；ヒト血管作用性小腸ペプチド受容体１；およびヒトＫＩＡＡ０４４３を含む。
末梢血単核細胞における遺伝子発現パターンは、４５人の疾患でない被験体、３６人のＡＭＬと診断された患者、および２０人のＭＤＳとの初期診断を受けた患者についてのオリゴヌクレオチドアレイにより測定した。これらの群の比較は、ＡＭＬおよびＭＤＳを健康なボランティアと容易に区別する転写の差異を同定し、アノテーションは、これらの患者の血流中のＣＤ３４＋芽球の増殖により差異の多くが現れたことを明らかにした。末梢血中の転写のプロファイルに基づいてＭＤＳ患者とＡＭＬ患者とを区別する可能性を、次に調べた。ＭＤＳとの初期診断を受けた２０人の患者のうち、６人の患者の試料は、１）現場の病理医と中央の病理医との間で診断が矛盾するＭＤＳ患者（ｎ＝３）または２）血液採取の後に迅速に進行したＭＤＳ患者（＜３ヶ月、ｎ＝３）のいずれかからであると決定された。健康、ＡＭＬおよび非進行者ＭＤＳの試料の学習の組についての教師ありアプローチを用いて、健康な個体、安定なＭＤＳ患者およびＡＭＬ患者のプロファイルと関連する遺伝子分類子を同定した。８遺伝子分類子は最適に予測可能であり、学習の組において９４％の全体的な精度を示した（６２／６６の被験体が１点除外交差検証法により正しく割り当てられた）。学習の組において間違って分類された４つの試料のうちの１つは、交差検証法によりＡＭＬと「間違って分類された」診断が矛盾したＭＤＳ患者からであった。８遺伝子分類子を試験の組の残りの試料に適用したときに、この分類子は、試験の組の中のあいまいでない残りの試料を同様の精度で同定した（クラス割り当ての８７％の全体的な精度）。この８遺伝子予測因子は、診断が矛盾する患者からの両方の試料、および疾患進行の時間が早いＭＤＳ患者からの３つの試料すべてを、ＡＭＬ患者由来に割り当てた。これらの予備的な結果は、ＭＤＳと診断された患者のＡＭＬ様の転写プロファイルは、ＡＭＬ進行（例えば芽球過剰増殖）の標準的な臨床的証拠よりも優先し得ることを意味する。これらの研究からの結果は、末梢血中の選択された転写産物の発現パターンが、ＭＤＳの診断と通常は関連している芽球百分率を有する白血病患者においてＡＭＬ進行の早期の指標を提供できることを示す。
Figure 2008545399
 本発明の上記の記載は、説明および記述を提供するが、網羅的または開示される１つのみに本発明が限定されることを意図しない。改変および変動は、上記の教示にかんがみて可能であるか、または本発明の実施から獲得されるであろう。よって、本発明の範囲は、請求の範囲およびそれらの均等物により定義されることが注目される。

Claims (49)

  1. 骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を診断、または発生、発達、進行もしくは治療をモニタリングするための方法であって、
    （１）被験体の末梢血試料から遺伝子発現プロファイルを作成する工程と、
    （２）該遺伝子発現プロファイルを１つまたは複数の参照発現プロファイルと比較する工程と
    を含み、
    該遺伝子発現プロファイルおよび該１つまたは複数の参照発現プロファイルが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中の１つまたは複数のＭＤＳ疾患遺伝子の発現パターンを含み、該遺伝子発現プロファイルと該１つまたは複数の参照発現プロファイルとの間の差異または類似性が、該被験体におけるＭＤＳの存在、不在、発生、発達、進行または治療の有効性を示す、方法。
  2. 前記末梢血試料が、全血または濃縮された未分画のＰＢＭＣを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記１つまたは複数のＭＤＳ疾患遺伝子が、表４または６から選択される１つまたは複数の遺伝子を含む、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
  4. 前記１つまたは複数のＭＤＳ疾患遺伝子が、表４または６から選択される１０以上の遺伝子を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記１つまたは複数のＭＤＳ疾患遺伝子が、表８から選択される１つまたは複数のＭＤＳ疾患遺伝子を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記１つまたは複数の参照発現プロファイルが、疾患でないヒトを表す参照発現プロファイルを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 工程（２）が、前記遺伝子発現プロファイルを、前記１つまたは複数の参照発現プロファイルと、ｋ最近傍分析または重みつき多数決アルゴリズムにより比較することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 工程（２）の比較に基づいて前記被験体のＭＤＳを診断または評価する工程をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 被験体の白血病を診断、または発生、発達、進行もしくは治療をモニタリングするための方法であって、
    （１）該被験体の末梢血試料から遺伝子発現プロファイルを作成する工程と、
    （２）該遺伝子発現プロファイルを１つまたは複数の参照発現プロファイルと比較する工程と
    を含み、
    該遺伝子発現プロファイルおよび該１つまたは複数の参照発現プロファイルが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中の表４または６から選択される１つまたは複数の白血病疾患遺伝子の発現パターンを含み、該遺伝子発現プロファイルと該１つまたは複数の参照発現プロファイルとの間の差異または類似性が、該被験体における白血病の存在、不在、発生、発達、進行または治療の有効性を示し、該１つまたは複数の白血病疾患遺伝子が、表２に記載されていない、方法。
  10. 前記末梢血試料が、全血または濃縮された未分画のＰＢＭＣを含む、請求項９に記載の方法。
  11. 前記１つまたは複数の白血病疾患遺伝子が、表４または６から選択される１０以上の遺伝子を含む、請求項９または１０に記載の方法。
  12. 表４または６から選択される１つまたは複数の白血病疾患遺伝子が、表８に記載される１つまたは複数の遺伝子も含む、請求項９から１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記１つまたは複数の参照発現プロファイルが、疾患でないヒトを表す参照発現プロファイルを含む、請求項９から１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 工程（２）が、前記遺伝子発現プロファイルを、前記１つまたは複数の参照発現プロファイルと、ｋ最近傍分析または重みつき多数決アルゴリズムにより比較することを含む、請求項９から１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記白血病が、急性骨髄性白血病である、請求項９から１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記白血病が、骨髄異形成症候群である、請求項９から１４のいずれか一項に記載の方法。
  17. 工程（２）の比較に基づいて前記被験体の白血病を診断または評価する工程をさらに含む、請求項９から１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に進行する可能性があるＭＤＳ患者を同定するための方法であって、
    （１）ＭＤＳ患者の末梢血試料から遺伝子発現プロファイルを作成する工程と、
    （２）該遺伝子発現プロファイルを１つまたは複数の参照発現プロファイルと比較する工程と
    を含み、
    該遺伝子発現プロファイルおよび該１つまたは複数の参照発現プロファイルが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中の表６から選択される１つまたは複数の白血病疾患遺伝子の発現パターンを含み、該遺伝子発現プロファイルと該１つまたは複数の参照発現プロファイルとの間の差異または類似性が、該ＭＤＳ患者がＡＭＬに進行する可能性があることを示す、方法。
  19. 前記１つまたは複数の参照発現プロファイルが、ＡＭＬ患者を表す参照発現プロファイルを含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記末梢血試料が、全血または濃縮された未分画のＰＢＭＣを含む、請求項１８または１９に記載の方法。
  21. 表６から選択される１つまたは複数の白血病疾患遺伝子が、表８にも記載される、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 複数のアドレスを有する基板を含む、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を診断する方法に使用するためのアレイであって、各アドレスがその上に配置される別個のプローブを含み、該複数のアドレスの少なくとも１５％の上に、末梢血単核細胞中のＭＤＳ疾患遺伝子を特異的に検出できるプローブが配置されている、アレイ。
  23. 前記複数のアドレスの少なくとも３０％の上に、末梢血単核細胞中のＭＤＳ疾患遺伝子を特異的に検出できるプローブが配置されている、請求項２２に記載のアレイ。
  24. 前記複数のアドレスの少なくとも５０％の上に、末梢血単核細胞中のＭＤＳ疾患遺伝子を特異的に検出できるプローブが配置されている、請求項２２に記載のアレイ。
  25. 前記ＭＤＳ疾患遺伝子が、表４から選択される、請求項２２から２４のいずれか一項に記載のアレイ。
  26. 前記プローブが、核酸プローブである、請求項２２から２５のいずれか一項に記載のアレイ。
  27. 前記プローブが、抗体プローブである、請求項２２から２５のいずれか一項に記載のアレイ。
  28. 複数のアドレスを有する基板を含む、白血病を診断する方法に使用するためのアレイであって、各アドレスがその上に配置される別個のプローブを含み、該複数のアドレスの少なくとも１５％の上に、表４または６から選択される遺伝子を特異的に検出できるプローブが配置され、該遺伝子が表２に記載されていない、アレイ。
  29. 前記複数のアドレスの少なくとも３０％の上に、表４または６から選択される遺伝子を特異的に検出できるプローブが配置され、該遺伝子が表２に記載されていない、請求項２８に記載のアレイ。
  30. 前記複数のアドレスの少なくとも５０％の上に、表４または６から選択される遺伝子を特異的に検出できるプローブが配置され、該遺伝子が表２に記載されていない、請求項２８に記載のアレイ。
  31. 前記プローブが、核酸プローブである、請求項２８から３０のいずれか一項に記載のアレイ。
  32. 前記プローブが、抗体プローブである、請求項２８から３０のいずれか一項に記載のアレイ。
  33. 複数のデジタルコード化された発現信号を含むデジタルコード化された発現プロファイルを含むコンピュータ読み取り可能な媒体であって、該複数のデジタルコード化された発現信号のそれぞれが、表４または６から選択される遺伝子の発現を表す値を含み、該遺伝子が表２に記載されていない、コンピュータ読み取り可能な媒体。
  34. 前記値が、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の患者の末梢血単核細胞中の遺伝子の発現を表す、請求項３３に記載のコンピュータ読み取り可能な媒体。
  35. 前記値が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の患者の末梢血単核細胞中の遺伝子の発現を表す、請求項３３に記載のコンピュータ読み取り可能な媒体。
  36. 前記デジタルコード化された発現プロファイルが、少なくとも１０のデジタルコード化された発現信号を含む、請求項３３に記載のコンピュータ読み取り可能な媒体。
  37. 骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の診断用のキットであって、
    ａ）末梢血単核細胞中のＭＤＳ疾患遺伝子を特異的に検出できる１つまたは複数のプローブと、
    ｂ）それぞれが、該１つまたは複数のプローブにより検出可能なＭＤＳ疾患遺伝子の参照発現レベルを表す１つまたは複数の対照と
    を含むキット。
  38. 前記ＭＤＳ疾患遺伝子が、表４から選択される、請求項３７に記載のキット。
  39. 表４から選択される前記ＭＤＳ疾患遺伝子が、表８にも記載される、請求項３８に記載のキット。
  40. 白血病の診断用のキットであって、
    ａ）表４または６から選択される遺伝子を特異的に検出できる１つまたは複数のプローブであって、該遺伝子は表２に記載されない、プローブと、
    ｂ）それぞれが、該１つまたは複数のプローブにより検出可能な疾患遺伝子の参照発現レベルを表す１つまたは複数の対照と
    を含むキット。
  41. 表４または６から選択される前記遺伝子が、表８にも記載される、請求項４０に記載のキット。
  42. 個体に関する決定を行うための方法であって、
    該個体の末梢血試料中の表４または６から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現の関数である値に基づいて、該個体をクラスに割り当てることにより、該個体に関する決定を行う工程を含み、該遺伝子は表２に記載されない、方法。
  43. 表４または６から選択される前記１つまたは複数の遺伝子が、表８にも記載される請求項４２に記載の方法。
  44. 前記決定が記録される、請求項４２または４３に記載の方法。
  45. 前記決定が、コンピュータ読み取り可能な媒体に記録される請求項４４に記載の方法。
  46. 前記方法が、前記割り当てに基づいて白血病治療を選択する工程をさらに含む、請求項４２から４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記方法が、前記割り当てに基づいて白血病治療を施す工程をさらに含む、請求項４２から４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記方法が、前記割り当てに基づいて白血病治療のための処方箋を発行、伝送または受領する工程をさらに含む、請求項４２から４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記方法が、前記割り当てに基づいて白血病治療の承認、白血病治療のための支払いまたは白血病治療への支払いのための資金の移送を行う工程をさらに含む、請求項４２から４８のいずれか一項に記載の方法。
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