JP2008285487A - ワクチン - Google Patents

Abstract

【課題】癌抗原と共に使用するための新規なアジュバント製剤の提供。
【解決手段】異種融合パートナーに結合したＭＡＧＥ抗原、異種融合パートナーに結合したプロスターゼ抗原、プロスターゼの少なくとも２０個の連続したアミノ酸を含むプロスターゼ断片、突然変異プロスターゼ、Ｐ５０１Ｓ、クリプト（Ｃｒｉｐｔｏ）、Ｈｅｒ ２ ｎｅｕ膜貫通ドメインの実質的部分を欠くＨｅｒ ２ ｎｅｕ誘導体よりなる群から選ばれる癌抗原と、サポニンを含むアジュバント組成物とを、免疫刺激性オリゴヌクレオチドと共に含んでなる免疫原性組成物。
【選択図】なし

Description

本発明は、癌抗原またはその誘導体と、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびサポニンを含む組合せアジュバント組成物との組合せを含む新規製剤に関する。
該抗原は、好ましくは、Ｈｅｒ ２ ｎｅｕ誘導体または前立腺抗原であり、したがって、本発明の製剤は、そのような抗原を発現するヒトの治療および予防において有用である。好ましい実施形態においては、該アジュバント組成物は更にリポ多糖を含む。

財政的および人的資源の莫大な投資にもかかわらず、癌は依然として主要死亡原因の１つである。例えば、癌は、３５歳〜７４歳の女性における主要死亡原因である。乳癌は、女性において最も多い悪性疾患であり、乳癌の発生頻度は増加しつつある。９人中１人の女性が該疾患と診断されると見積もられている。乳癌を治療するための標準的なアプローチは、手術、放射線および化学療法の組合せに集中している。これらのアプローチは、ある悪性疾患においては幾つかの劇的な成功を収めている。しかし、乳癌は、ある病期以降に診断された場合には、治療不能であることがほとんどである。早期診断および治療のための代替的アプローチが必要とされている。

非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド（「ＣｐＧ」）を含有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、全身経路および粘膜経路の両方で投与する場合のアジュバントとして当技術分野において公知である（ＷＯ９６／０２５５５，ＥＰ ４６８５２０，Ｄａｖｉｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９８，１６０（２）：８７０−８７６；ＭｃＣｌｕｓｋｉｅおよびＤａｖｉｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９８，１６１（９）：４４６３−６）。ＣｐＧは、ＤＮＡ中に存在するシトシン−グアノシンジヌクレオチドモチーフの略語である。歴史的には、ＢＣＧのＤＮＡ画分が抗腫瘍効果を奏しうることが観察されている。更なる研究において、ＢＣＧ遺伝子配列に由来する合成オリゴヌクレオチドが（ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方において）免疫刺激効果を誘導しうることが示された。これらの研究の著者らは、中心的ＣＧモチーフを含む特定のパリンドローム配列がこの活性を担うと結論づけた。その後、Ｋｒｉｅｇによる刊行物（Ｎａｔｕｒｅ ３７４，ｐ５４６ １９９５）において、免疫刺激におけるＣＧモチーフの中心的役割が明らかにされた。ＣＧモチーフは特定の配列環境中になければならないこと、およびそのような配列は細菌ＤＮＡにおいては一般的であるが脊椎動物ＤＮＡにおいては稀であることを、詳細な分析が示している。免疫刺激性配列は、しばしば、プリン、プリン、Ｃ、Ｇ、ピリミジン、ピリミジンであるが（ここで、該ジヌクレオチドＣＧモチーフはメチル化されていない）、他の非メチル化ＣｐＧ配列も免疫刺激性であることが公知であり、本発明で使用することが可能である。

それらの６ヌクレオチドの特定の組合せには、パリンドローム配列が存在する。これらのモチーフのいくつかは、１つのモチーフの反復または異なるモチーフの組合せのいずれかとして、同じオリゴヌクレオチド中に存在しうる。これらの免疫刺激性配列を含有するオリゴヌクレオチドの１以上の存在は、ナチュラルキラー細胞（これはインターフェロンγを産生し、細胞溶解活性を有する）およびマクロファージを含む種々の免疫サブセットを刺激しうる（Ｗｏｏｌｄｒｉｇｅら Ｖｏｌ ８９（ｎｏ．８），１９７７）。しかし、現在、このコンセンサス配列を含まない他の非メチル化ＣｐＧ含有配列も免疫調節性であることが示されている。

ＣｐＧは、ワクチン中に製剤化された場合には、一般には、遊離抗原と共に遊離溶解状態で投与されるか（ＷＯ９６／０２５５５；ＭｃＣｌｕｓｋｉｅおよびＤａｖｉｓ，前掲）、または共有結合で抗原にコンジュゲートされるか（ＷＯ９８／１６２４７）、または水酸化アルミニウムのような担体と共に製剤化される（（肝炎表面抗原）Ｄａｖｉｓら，前掲；Ｂｒａｚｏｌｏｔ−Ｍｉｌｌａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８，９５（２６），１５５５３−８）。
ＷＯ９６／０２５５５ ＥＰ ４６８５２０ ＷＯ９８／１６２４７ Ｄａｖｉｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９８，１６０（２）：８７０−８７６ ＭｃＣｌｕｓｋｉｅおよびＤａｖｉｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９８，１６１（９）：４４６３−６ Ｎａｔｕｒｅ ３７４，ｐ５４６ １９９５ Ｗｏｏｌｄｒｉｇｅら Ｖｏｌ ８９（ｎｏ．８），１９７７ Ｂｒａｚｏｌｏｔ−Ｍｉｌｌａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８，９５（２６），１５５５３−８

本発明のアジュバント組合せ物は、好ましい実施形態において、腸内細菌リポ多糖由来のアジュバントを少なくとも１種含む。

腸内細菌ＬＰＳは免疫系の強力な刺激物質であるが、アジュバントにおけるＬＰＳの使用はその毒性作用により制限されることが古くから知られている。コア炭水化物基および還元末端グルコサミンからのホスフェートを除去することにより得られるＬＰＳの無毒性誘導体であるモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）が、Ｒｉｂｉら（１９８６，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌ．Ｃｏｒｐ．，ＮＹ，ｐ４０７−４１９）により記載されており、これは以下の構造を有する。

ＭＰＬの更なる解毒形態が、二糖骨格の３位からアシル鎖を除去することにより得られ、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）と称される。それは、ＧＢ ２１２２２０４Ｂに教示されている方法により精製し製造することが可能であり、その文献はジホスホリルリピドＡおよびその３−Ｏ−脱アシル化形態の製造も開示している。３Ｄ−ＭＰＬの好ましい形態は、直径０．２μｍ未満の小さな粒径を有する乳剤の形態をしており、その製造方法はＷＯ９４／２１２９２に開示されている。モノホスホリルリピドＡと界面活性剤とを含む水性製剤がＷＯ９８／４３６７０Ａ２に記載されている。

本発明のアジュバント組合せ物中に配合される細菌リポ多糖由来のアジュバントは、細菌源から精製し加工することが可能であり、あるいはそれは合成物であってもよい。例えば、精製されたモノホスホリルリピドＡはＲｉｂｉら １９８６（前掲）に記載されており、サルモネラ種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ．）由来の３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルまたはジホスホリルリピドＡはＧＢ ２２２０２１１および米国特許第４９１２０９４号に記載されている。他の精製および合成リポ多糖も、ＷＯ９８／０１１３９；米国特許第６，００５，０９９号およびＥＰ ０７２９４７３ Ｂ１；Ｈｉｌｇｅｒｓら，１９８６，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７９（４）：３９２−６；Ｈｉｌｇｅｒｓら，１９８７，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６０（１）：１４１−６；およびＥＰ ０５４９０７４ Ｂ１に記載されている。特に好ましい細菌リポ多糖アジュバントは、米国特許第６，００５，０９９号およびＥＰ ０７２９４７３ Ｂ１に記載の３Ｄ−ＭＰＬおよびβ（１−６）グルコサミン二糖である。

したがって、本発明で使用しうるＬＰＳ誘導体は、ＬＰＳまたはＭＰＬまたは３Ｄ−ＭＰＬと構造において類似した免疫刺激物質である。本発明のもう１つの態様においては、該ＬＰＳ誘導体は、ＭＰＬの前記構造の副次的部分であるアシル化単糖でありうる。

好ましい二糖アジュバントは、以下の式で表される精製されたまたは合成のリピドＡである。
上記式中、Ｒ^２は、ＨまたはＰＯ_３Ｈ_２でありうる；Ｒ^３はアシル鎖またはβ−ヒドロキシミリストイル、または式：
を有する３−アシルオキシアシル残基でありうる。

３Ｄ−ＭＰＬとバラ科キラヤ（Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｍｏｌｉｎａ）の樹皮に由来するサポニンアジュバントとの組合せが、ＥＰ ０７６１２３１ Ｂに記載されている。ＷＯ９５／１７２１０は、免疫刺激物質ＱＳ２１と共に、場合により３Ｄ−ＭＰＬと共に、配合されたスクアレン、α−トコフェロールおよびポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ＴＷＥＥＮ８０）に基づくアジュバント乳剤系を開示している。

サポニンは全身投与用のワクチン中のアジュバントとして公知である。個々のサポニンのアジュバント活性および溶血活性が、当技術分野において詳細に研究されている（Ｌａｃａｉｌｌｅ−ＤｕｂｏｉｓおよびＷａｇｎｅｒ，前掲）。例えば、Ｑｕｉｌ Ａ（南米産樹木バラ科キラヤの樹皮に由来する）およびその画分が、米国特許第５，０５７，５４０号および「ワクチンアジュバントとしてのサポニン（Ｓａｐｏｎｉｎｓ ａｓ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔｓ）」，Ｋｅｎｓｉｌ，Ｃ．Ｒ．，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ，１９９６，１２（１−２）；１−５５およびＥＰ ０３６２２７９ Ｂ１に記載されている。

Ｑｕｉｌ Ａの画分を含む免疫刺激性複合体（Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ：ＩＳＣＯＭｓ）と称される粒状構造物は溶血性であり、ワクチンの製造において使用されている（Ｍｏｒｅｉｎ，Ｂ．，ＥＰ ０１０９９４２ Ｂ１）。これらの構造物はアジュバント活性を有することが報告されている（ＥＰ ０１０９９４２ Ｂ１；ＷＯ９６／１１７１１）。

溶血性サポニンＱＳ２１およびＱＳ１７（Ｑｕｉｌ ＡのＨＰＬＣ精製画分）は強力な全身性アジュバントとして記載されており、それらの製造方法は米国特許第５，０５７，５４０号およびＥＰ ０３６２２７９ Ｂ１に開示されている。また、これらの文献には、全身性ワクチン用の強力なアジュバントとして作用するＱＳ７（Ｑｕｉｌ Ａの非溶血性画分）の使用が記載されている。さらに、ＱＳ２１の使用がＫｅｎｓｉｌら（１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌ １４６，４３１−４３７）に記載されている。ＱＳ２１とポリソルベートまたはシクロデキストリンとの組合せも公知である（ＷＯ９９／１０００８）。ＱＳ２１およびＱＳ７のようなＱｕｉｌ Ａ画分を含む粒状アジュバント系がＷＯ９６／３３７３９およびＷＯ９６／１１７１１に記載されている。

全身ワクチン接種の研究において使用されている他のサポニンには、ジプソフィラ（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ）およびサポナリア（Ｓａｐｏｎａｒｉａ）のような他の植物種に由来するものが含まれる（Ｂｏｍｆｏｒｄら，Ｖａｃｃｉｎｅ，１０（９）：５７２−５７７，１９９２）。

また、サポニンは、粘膜適用ワクチンの研究において使用されていることが公知であり、これは、免疫応答の誘導において、ばらつきのある成功を収めている。Ｑｕｉｌ−Ａサポニンは、抗原が鼻腔内投与された場合には、免疫応答の誘導に対して効果を示さないことが既に示されている（Ｇｉｚｕｒａｒｓｏｎら １９９４，Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３，２３−２９）。一方、他の著者はこのアジュバントを成功裏に使用している（Ｍａｈａｒａｊら，Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９８６，３２（５）：４１４−２０；ＣｈａｖａｌｉおよびＣａｍｐｂｅｌｌ，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，１７４（３）：３４７−５９）。Ｑｕｉｌ Ａサポニンを含むＩＳＣＯＭｓは、胃内および鼻腔内ワクチン製剤において使用されており、アジュバント活性を示している（ＭｃＩ Ｍｏｗａｔら，１９９１，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７２，３１７−３２２；ＭｃＩ ＭｏｗａｔおよびＤｏｎａｃｈｉｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，１２，３８３−３８５）。

また、ＱｕｉｌＡの無毒性画分であるＱＳ２１が経口または鼻腔内アジュバントとして記載されている（Ｓｕｍｉｎｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９８，７２（６）：４９３１−９；ＷＯ９８／５６４１５）。

サポニンは、Ｌａｃａｉｌｌｅ−Ｄｕｂｏｉｓ，ＭおよびＷａｇｎｅｒ Ｈ．１９９６，Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｓａｐｏｎｉｎｓ．Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ｖｏｌ ２ ｐｐ ３６３−３８６に教示されている。サポニンは、植物および海洋動物界に広く分布するステロイドまたはトリテルペン配糖体である。サポニンは、振とうすると泡を発生する水中コロイド溶液を形成する点およびコレステロールを沈殿させる点で注目される。サポニンが細胞膜付近に存在する場合には、それは該膜中に孔様構造体を形成し、この構造体が該膜を破裂させる。赤血球の溶血がこの現象の一例であるが、これは、すべてではないにしても、ある種のサポニンの特性の１つである。

本発明は、免疫刺激性オリゴヌクレオチド（ＣｐＧ）とサポニンと場合により使用しうるリポ多糖の組合せが非常に強力なアジュバントであるという驚くべき知見に関する。したがって、サポニンと免疫刺激性オリゴヌクレオチドと場合により使用しうるリポ多糖を、癌抗原またはその誘導体と組み合わせて含むワクチン組合せ物を提供する。好ましい実施形態においては、アジュバント製剤は、サポニン（好ましくはＱＳ２１）、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび３Ｄ−ＭＰＬを含む。

好ましくは、本発明のワクチンは更に担体を含みうる。本発明の好ましい形態においては、該アジュバントおよびワクチン組成物中のオリゴヌクレオチドは、抗原特異的免疫応答の誘導において、組み合わされたサポニン／リポ多糖と相乗的に作用して、腫瘍退縮の増強をもたらすものである。該製剤は、通常はＴｈ１タイプの免疫系に関連した免疫応答の誘導において効力がある。したがって、該アジュバント組合せ物は、疾患の免疫予防だけでなく、癌のような疾患の免疫療法にも適している。

前記製剤は抗腫瘍抗原を含有し、癌の免疫療法的治療に有用である。例えば、該アジュバント製剤は、例えば前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、腎臓癌または悪性黒色腫などに対する腫瘍拒絶抗原とともに使用される。かかる抗原の例として、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ３およびＭＡＧＥ４または他のＭＡＧＥ抗原、例えば、ＷＯ９９／４０１８８に開示されているもの、ＰＲＡＭＥ、ＢＡＧＥ、Ｌａｇｅ（ＮＹ Ｅｏｓ １としても公知である）ＳＡＧＥおよびＨＡＧＥ（ＷＯ９９／５３０６１）またはＧＡＧＥ（ＲｏｂｂｉｎｓおよびＫａｗａｋａｍｉ，１９９６，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８，ｐｐ ６２８−６３６；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｙｎｄｅら，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ＆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９７年に提出）；Ｃｏｒｒｅａｌｅら（１９９７），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ８９，ｐ２９３）が挙げられる。実際のところ、これらの抗原は、黒色腫、肺癌、肉腫および膀胱癌のような広範な腫瘍型において発現される。

本発明で使用するＭＡＧＥ抗原は、発現エンハンサーまたは免疫学的融合パートナーとの融合タンパク質として発現されうる。本発明の１つの実施形態においては、該誘導体は、異種のパートナー（好ましくはＭＡＧＥ３）に結合したＭＡＧＥタンパク質ファミリーからの抗原を含む融合タンパク質である。該タンパク質は、化学的にコンジュゲートされうるが、好ましくは、発現系において非融合タンパク質と比較して増加したレベルの産生を可能にする組換え融合タンパク質として発現される。したがって、融合パートナーは、Ｔヘルパーエピトープ、好ましくは、ヒトにより認識されるＴヘルパーエピトープを提供するのを補助したり（免疫学的融合パートナー）、あるいは天然組換えタンパク質より高い収率で該タンパク質を発現するのを補助しうる（発現エンハンサー（発現増強体））。好ましくは、融合パートナーは、免疫学的融合パートナーと発現増強パートナーの両方とする。

本発明の好ましい形態においては、免疫学的融合パートナーは、グラム陰性菌ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）Ｂの表面タンパク質であるプロテインＤに由来する（ＷＯ９１／１８９２６）。好ましくは、プロテインＤ誘導体は、該タンパク質の最初の約１／３、特に、最初のＮ末端の約１００〜１１０アミノ酸を含む。好ましくは、プロテインＤ誘導体はリピド化される。好ましくは、リポプロテインＤ融合パートナーの最初の１０９残基をＮ末端側に付加して、該ワクチン候補抗原に追加の外因性Ｔ細胞エピトープを提供し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内での発現レベルを高めるようにする（したがって、発現エンハンサーとしても機能する）。リピド尾部は、抗原提示細胞への抗原の最適な提示を保証する。

他の融合パートナーには、インフルエンザウイルス由来の非構造タンパク質ＮＳ１（赤血球凝集素）が含まれる。典型的には、Ｎ末端の８１アミノ酸が使用されるが、Ｔヘルパーエピトープを含む限り、異なる断片も使用することが可能である。

もう１つの実施形態においては、免疫学的融合パートナーはＬＹＴＡとして公知のタンパク質である。好ましくは、この分子のＣ末端部分を使用する。Ｌｙｔａは、Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニンアミダーゼ、アミダーゼＬＹＴＡ（ｌｙｔＡ遺伝子によりコードされる）（Ｇｅｎｅ，４３（１９８６） ｐ．２６５−２７２）（ペプチドグリカン骨格中の特定の結合を特異的に分解する自己分解酵素）を合成する肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来する。ＬＹＴＡタンパク質のＣ末端ドメインは、コリンまたは幾つかのコリン類似体（例えば、ＤＥＡＥ）に対する親和性に寄与する。この特性は、融合タンパク質の発現に有用な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ−ＬＹＴＡ発現プラスミドの開発に利用されている。アミノ末端にＣ−ＬＹＴＡ断片を含有するハイブリッドタンパク質の精製が既に記載されている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：１０，（１９９２） ｐ．７９５−７９８）。本発明で用いるとおり、好ましい実施形態では、残基１７８から始まるＣ末端に見出されるＬｙｔａ分子の反復部分を利用する。特に好ましい形態は、残基１８８〜３０５を組み入れるものである。

前記の免疫学的融合パートナーは、発現を補助する点でも有利である。特に、そのような融合体は、天然組換えＭＡＧＥタンパク質より高い収率で発現される。そのような構築物はＷＯ９９／４０１８８に開示されている。

他の腫瘍特異的抗原も、本発明のアジュバントと共に使用するのに適しており、それらには、腫瘍特異的ガングリオシド、例えばＧＭ２およびＧＭ３、または担体タンパク質とのそれらのコンジュゲートが含まれるが、これらに限定されるものではない。あるいは該抗原は、自己ペプチドホルモン、例えば、多数の癌の治療または免疫抑制において有用である短い１０アミノ酸長のペプチドである全長性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ，ＷＯ９５／２０６００）でありうる。

更なる好ましい実施形態においては、他の前立腺抗原、例えば、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＰＳＣＡ（ＰＮＡＳ ９５（４） １７３５−１７４０ １９９８）、ＰＳＭＡが使用され、また、好ましい実施形態ではプロスターゼ（Ｐｒｏｓｔａｓｅ）として公知の抗原が使用される。

プロスターゼは、保存されたセリンプロテアーゼ触媒三つ組残基Ｈ−Ｄ−Ｓと潜在的な分泌機能を示すアミノ末端のプレプロペプチド配列とを有する、２５４アミノ酸長の前立腺特異的セリンプロテアーゼ（トリプシン様）である（Ｐ．Ｎｅｌｓｏｎ，Ｌｕ Ｇａｎ，Ｃ．Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｐ．Ｍｏｓｓ，Ｒ．Ｇｅｌｉｎａｓ，Ｌ．Ｈｏｏｄ ＆ Ｋ．Ｗａｎｄ，「発現が前立腺に限定されているアンドロゲン調節セリンプロテアーゼであるプロスターゼの分子クローニングおよび特性決定（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｓｅ， ａｎ ａｎｄｒｏｇｅｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｗｉｔｈ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９９）９６，３１１４−３１１９）。推定グリコシル化部位が記載されている。推定される構造は他の公知のセリンプロテアーゼに酷似しており、このことは、成熟ポリペプチドが単一ドメインにフォールディングされることを示している。成熟タンパク質は２２４アミノ酸長であり、１つのＡ２エピトープが天然でプロセシングされることが示されている。

プロスターゼのヌクレオチド配列および推定ポリペプチド配列およびホモログは、Ｆｅｒｇｕｓｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９９，９６，３１１４−３１１９）および国際特許出願番号ＷＯ９８／１２３０２（そしてまた、特許が付与された対応する米国特許第５，９５５，３０６号）、ＷＯ９８／２０１１７（そしてまた、特許が付与された対応する米国特許第５，８４０，８７１号および米国特許第５，７８６，１４８号）（前立腺特異的カリクレイン）およびＷＯ００／０４１４９（Ｐ７０３Ｐ）に開示されている。

本発明は、プロスターゼタンパク質ならびにその断片およびホモログに基づくプロスターゼタンパク質融合体（「誘導体」）を含む製剤を提供する。そのような誘導体は、前立腺癌の治療に適した治療用ワクチン製剤中での使用に適している。典型的には、該断片は、前記の特許および特許出願に開示されている少なくとも２０、好ましくは５０、より好ましくは１００個の連続したアミノ酸を含有する。

１つの実施形態においては、突然変異プロスターゼ抗原を提供し、ここで、該突然変異は該タンパク質の活性部位中に存在する。該プロスターゼ抗原誘導体またはその断片およびホモログは、そのプロテアーゼ生物活性を実質的に減少させるよう又は好ましくは除去するよう、該タンパク質の活性部位中に突然変異を有する。好ましい突然変異は、該セリンプロテアーゼのヒスチジンおよびアスパラギン酸触媒残基の置換を含む。好ましい実施形態においては、プロスターゼは、プロスターゼ配列の活性部位中、例えば残基７１にヒスチジン−アラニン突然変異を含有する（Ｆｅｒｇｕｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９９，９６，３１１４−３１１９）。例えばＷＯ００／０４１９４９に開示されている相同タンパク質中の対応する突然変異が特に意図される。例えば、この突然変異はＰ７０３Ｐでは４３位に対応する。この突然変異は、該タンパク質の触媒効率（酵素比活性で表される）の著しい低下を招きうる。好ましくは、触媒効率が少なくとも１０^３分の１、より好ましくは少なくとも１０^６分の１に低下する。ヒスチジン−アラニン突然変異を受けたタンパク質を以後＊（星印）で示すこととする。

１つの実施形態においては、プロスターゼは、突然変異型であろうとなかろうと、腫瘍関連プロスターゼまたはその断片もしくはホモログと、融合パートナーとして作用するタンパク質の一部または異種タンパク質とを含む融合タンパク質の一部である。該タンパク質および該融合パートナーは化学的にコンジュゲートされうるが、好ましくは、異種発現系内で組換え融合タンパク質として発現される。

本発明の好ましい実施形態においては、Ｔヘルパーエピトープの提供を補助しうる免疫学的融合パートナーに結合したプロスターゼ融合タンパク質またはその断片もしくはホモログを提供する。したがって、融合パートナーは、外来タンパク質またはペプチドに特異的な多数のＴ細胞による活性化シグナルの分泌と関連したバイスタンダー（第三者）ヘルパー効果を介して作用し、それにより、非融合タンパク質と比較して、プロスターゼ成分に対する免疫の誘導を増強しうる。
好ましくは、異種パートナーは、大多数のヒトのＴ細胞によって認識されるように選択される。

もう１つの実施形態においては、本発明は、発現エンハンサーとして作用する融合パートナーに結合したプロスターゼタンパク質またはその断片もしくはホモログを提供する。したがって、融合パートナーは、異種系内でのプロスターゼの発現を補助して、発現系において天然組換えタンパク質と比較して増加したレベルの産生を可能にしうる。

好ましくは、融合パートナーは、免疫学的融合パートナーおよび発現エンハンサーパートナー（発現増強パートナー）の両方である。したがって、本発明は、融合パートナーに結合した突然変異腫瘍特異的プロスターゼまたはその断片を含む融合タンパク質を提供する。好ましくは、融合パートナーは、免疫学的融合パートナーおよび発現エンハンサーパートナーの両方として作用する。したがって、本発明の好ましい形態においては、融合パートナーは、インフルエンザウイルス由来の非構造タンパク質ＮＳ１（赤血球凝集素）またはその断片である。典型的には、Ｎ末端の８１アミノ酸が使用されるが、Ｔヘルパーエピトープを含む限り、異なる断片も使用することが可能である（Ｃ．Ｈａｃｋｅｔｔ，Ｄ．Ｈｏｒｏｗｉｔｚ，Ｍ．Ｗｙｓｏｃｋａ ＆ Ｓ．Ｄｉｌｌｏｎ，１９９２，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７３，１３３９−１３４３）。ＮＳ１が免疫学的融合パートナーである場合には、それは、より高い発現率の達成をそれが可能にするという追加的な利点を有する。特に、そのような融合体は、天然組換えプロスターゼタンパク質より高い収率で発現される。

最も好ましい実施形態においては、融合タンパク質は、カルボキシ末端５−２２６アミノ酸に融合したＮＳ１非構造タンパク質のＮ末端８１アミノ酸を含む。別の発現パートナーには、例えば、プロテインＤおよびその断片、ならびにＣ−Ｌｙｔａ（ＭＡＧＥ抗原とともに利用されるもの）が含まれる。

もう１つの好ましい前立腺抗原は、Ｐ５０１Ｓ（ＷＯ９８／３７８１４の配列番号１１３）として公知である。その免疫原性断片および部分は、前記の特許出願に開示されている少なくとも２０、好ましくは５０、より好ましくは１００個の連続したアミノ酸を含む。例えば、ＰＳ１０８（ＷＯ９８／５０５６７）を参照されたい。

他の前立腺特異的抗原は、ＷＯ９８／３７４１８およびＷＯ／００４１４９から公知である。もう１つは、ＳＴＥＡＰ（ＰＮＡＳ ９６ １４５２３ １４５２８７−１２ １９９９）である。

本発明において有用な他の腫瘍関連抗原には、Ｐｌｕ−１（Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７４（２２）１５６３３−１５６４５，１９９９）、ＨＡＳＨ−１、ＨａｓＨ−２、クリプト（Ｃｒｉｐｔｏ）（Ｓａｌｏｍｏｎら Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ １９９，２１ ６１−７０，米国特許第５６５４１４０号）、クリプチン（Ｃｒｉｐｔｉｎ）（米国特許第５９８１２１５号）が含まれる。さらに、癌治療用のワクチンに特に適した抗原には、チロシナーゼおよびサービビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）も含まれる。

Ｍｕｃ１のようなムチン由来ペプチドに関しては、例えば、米国特許第５７４４，１４４号、米国特許第５８２７，６６６号、ＷＯ８８０５０５４、米国特許４，９６３，４８４号を参照されたい。特に、ＳＭ３抗体（米国特許第６０５４４３８号）により認識される、Ｍｕｃ１ペプチドの少なくとも１つの反復単位、好ましくは少なくとも２つのそのような反復単位を含むＭｕｃ１由来ペプチドが意図される。他のムチン由来ペプチドには、Ｍｕｃ５由来のペプチドが含まれる。

本発明は、乳癌抗原、例えばＨｅｒ ２ ｎｅｕ、マンマグロビン（ｍａｍｍａｇｌｏｂｉｎ）（米国特許第５６６８２６７号）またはＷＯ／００５２１６５、ＷＯ９９／３３８６９、ＷＯ９９／１９４７９、ＷＯ９８／４５３２８に開示されているものとの組合せにおいても有用である。Ｈｅｒ ２ ｎｅｕ抗原は、とりわけ、米国特許第５，８０１，００５号に開示されている。好ましくは、Ｈｅｒ ２ ｎｅｕは、全細胞外ドメイン（およそアミノ酸１−６４５を含む）またはその断片、および全細胞内ドメイン（Ｃ末端のおよそ５８０アミノ酸）の少なくとも免疫原性部分を含む。特に、該細胞内部分はリン酸化ドメインまたはその断片を含むべきである。そのような構築物はＷＯ００／４４８９９に開示されている。特に好ましい構築物はＥＣＤ ＰＤとして公知であり、もう１つはＥＣＤ ΔＰＤとして公知である。ＷＯ００／４４８９９を参照されたい。

本発明で用いるＨｅｒ ２ ｎｅｕは、ラット、マウスまたはヒトに由来するものでありうる。

Ｈｅｒ ２ ｎｅｕ抗原は、機能性膜貫通ドメインを欠く全Ｈｅｒ ２ ｎｅｕ抗原またはその一部でありうる。好ましい部分は細胞外ドメインを含む。より好ましい実施形態においては、ＷＯ００／４４８９９（これを参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されているような、細胞内ドメインの一部に結合した細胞外ドメインを含む融合タンパク質を提供する。

本発明は、Ｈｅｒ ２ ｎｅｕ癌遺伝子発現のタンパク質産物に対する免疫をモジュレートする、好ましくは誘起または増強しうる、温血動物における悪性疾患などに対する製剤に関する。この場合、悪性疾患を伴う増幅されたＨｅｒ ２ ｎｅｕ遺伝子は、該遺伝子のタンパク質発現産物が該腫瘍上に存在することを必要としない。例えば、該遺伝子の過剰発現は腫瘍形成の開始および初期段階に関与しうるが、その後、該タンパク質発現は減弱されるか又は存在しないことがある。本発明は、Ｈｅｒ ２ ｎｅｕ陽性腫瘍の定着を予防したり、既存のＨｅｒ ２ ｎｅｕ陽性腫瘍の退縮を誘発することに加えて、Ｈｅｒ ２ ｎｅｕ陽性腫瘍からＨｅｒ ２ ｎｅｕ陰性腫瘍へ変換するのに有効な免疫応答を惹起または増強するために使用することができる。

本明細書の全体にわたり以下の略語を使用する。「ＥＣＤ」は細胞外ドメインを意味し、「ＩＣＤ」は細胞内ドメインを意味し、「ＰＤ」は細胞内ドメイン内に存在するリン酸化ドメイン（すなわち、リン酸化されるドメイン）を意味し、「ΔＰＤ」はリン酸化ドメイン内に存在するリン酸化ドメインの断片を意味し、「ＫＤ」は細胞内ドメイン内に存在するキナーゼドメインを意味する。Ｈｅｒ ２ ｎｅｕ遺伝子の発現産物は、本明細書では、「Ｈｅｒ ２ ｎｅｕタンパク質」と称されるが、「ｐ１８５」または「ｃ−ｅｒｂＢ２」としても知られており、そのようにも称される。

「Ｈｅｒ ２ ｎｅｕ ＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質」は、本明細書では「ＥＣＤ−ＩＣＤ」または「ＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質」とも称され、Ｈｅｒ ２ ｎｅｕタンパク質の細胞外ドメイン（またはその断片）と細胞内ドメイン（またはその断片）とを含む融合タンパク質（またはその断片）を意味する。これらは、本発明において使用する好ましい抗原に相当する。本明細書で用いるＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質は、Ｈｅｒ ２ ｎｅｕ膜貫通ドメインの実質的部分を含まず、好ましくは、Ｈｅｒ ２ ｎｅｕ膜貫通ドメインのいずれをも含まない。

「Ｈｅｒ ２ ｎｅｕ ＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質」および「Ｈｅｒ ２ ｎｅｕ ＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質」なる用語、ならびにそれらの関連用語はまた、以下のものを意味すると理解される：そられの断片、それらのホモログおよびそれらの機能的等価体（「変異体」と総称される）、例えば、本発明の好ましい実施形態においては、それらの１以上のアミノ酸が、（ｉ）Ｈｅｒ ２ ｎｅｕタンパク質と比較して免疫応答の惹起または増強を高めるか、あるいは（ｉｉ）Ｈｅｒ ２ ｎｅｕタンパク質と比較して免疫応答の惹起または増強に実質的に影響を及ぼさないか、のいずれかであるもの（例えば、変異体は、ヘルパーＴ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞による応答を促進するか、あるいは抗体産生を促進する）。Ｈｅｒ ２ ｎｅｕ ＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質およびＨｅｒ ２ ｎｅｕ ＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質の典型的な断片、ホモログおよび機能的等価体を含めて、変異体の非限定的な具体例は、本明細書により詳しく記載されている。変異体は、天然ポリペプチド成分を含む融合タンパク質と「実質的に同一」または「実質的に類似」していることがあるが、免疫応答を促進する能力を保有するものである。

Ｈｅｒ ２ ｎｅｕ ＰＤは、２６８アミノ酸長であり、細胞内に存在し、タンパク質チロシンキナーゼによりリン酸化されうる。この領域は、他のチロシンキナーゼ受容体の対応部分と同一性を全く共有しない。したがって、このドメインの特異性および独自性は、それを、腫瘍ワクチンとしての使用に特に好ましいものとする。しかし、細菌細胞および哺乳類細胞内でのこのドメインのみの発現は問題がある。例えば、生じるＰＤタンパク質は非常に不安定であり、大規模生産には適さない。したがって、１つの実施形態においては、本発明は、好ましくは、Ｈｅｒ ２ ｎｅｕ細胞外ドメインの全部または一部と細胞内ドメインまたはリン酸化ドメインの全部または一部とを含む融合体を使用する。本発明のＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質およびＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質は可溶性であり、分泌され、培地中で安定である。

本発明のワクチンは、腫瘍関連抗原の発現（例えば、Ｈｅｒ ２ ｎｅｕの発現）により特徴づけられる、あらゆる癌に対して有用であろう。細胞外ドメインまたはその変異体との融合タンパク質として、細胞内ドメインもしくはリン酸化ドメインまたはそれらの変異体の発現の増強を可能にすることに加えて、ＥＣＤ−ＩＣＤおよびＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質は、改良されたワクチン製剤を提供する。

したがって、本発明は、アジュバント組成物（該アジュバントはサポニンと免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む）および膜貫通ドメインを欠くＨｅｒ ２ ｎｅｕ抗原を含むワクチン製剤を提供する。Ｈｅｒ ２ ｎｅｕ分子は、ラット、マウス、ヒトのもの又はそれらのハイブリッドでありうる。好ましくは、該ｈｅｒ ２分子は、該細胞外ドメインの実質的全部を含む。実質的全部とは、１００アミノ酸以下、好ましくは７５アミノ酸未満、より好ましくは５０アミノ酸未満が該細胞外ドメインから欠失していることを意味する。全細胞外ドメインが存在することが好ましい。本発明のヒトＨｅｒ ２ ｎｅｕ構築物における細胞外ドメインは、好ましくは、Ｎ末端の６００アミノ酸、より好ましくはＮ末端の６３０アミノ酸、より好ましくは約６５０アミノ酸の実質的全部を含む。ヒトＩＣＤはアミノ酸６７６からＶａｌ １２５５まで伸長する。リン酸化ドメインはＩＣＤのＮ末端部分に位置する。本発明で使用する構築物は、リン酸化ドメインを含むが機能性膜貫通ドメインを含まないことが好ましい。好ましくは、膜貫通ドメインは完全に欠失されている。

本発明での使用に特に適した構築物はＷＯ／００４４８９９に開示されている。

Ｈｅｒ ２ ｎｅｕ抗原は、リポソームまたは水中油型乳剤担体と一緒に３Ｄ−ＭＰＣ、ＱＳ２１およびＣｐＧオリゴヌクレオチドにより製剤化されていることが、好ましい実施形態である。そのような製剤は、体液性応答および細胞性応答の両方を引き出す。ＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬのみを含むアジュバント製剤と比較して、本発明の製剤は、好都合なことに、マウスにおいてより強力なＴＨ１応答を示した。ＣｐＧのみの製剤は顕著な細胞性免疫応答を引き出さなかった。

前記製剤は、腫瘍を支持する機構（例えば、血管新生、腫瘍侵襲）に関連した抗原、例えば、ｔｉｅ２、ＶＥＧＦを含有していてもよい。

本発明のアジュバントまたはワクチンで使用するのに好ましいオリゴヌクレオチドは、好ましくは３個以上、より好ましくは６個以上のヌクレオチドにより分離された２つ以上のジヌクレオチドＣｐＧモチーフを含有する。本発明のオリゴヌクレオチドは、典型的にはデオキシヌクレオチドである。好ましい実施形態においては、該オリゴヌクレオチド中のヌクレオチド間は、ホスホロジチオエート、より好ましくはホスホロチオエート結合であるが、ホスホジエステルや他のヌクレオチド間結合も本発明の範囲内であり、混合ヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドも含まれる。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドまたはホスホロジチオエートの製造方法は、米国特許第５，６６６，１５３号、米国特許第５，２７８，３０２号およびＷＯ９５／２６２０４に記載されている。

好ましいオリゴヌクレオチドの具体例は以下の配列を有する。これらの配列は、好ましくは、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチド間結合を含有する。
オリゴ１（配列番号１）：ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＣＧ ＴＴＣ ＣＴＧ ＡＣＧ ＴＴ（ＣｐＧ １８２６）、
オリゴ２（配列番号２）：ＴＣＴ ＣＣＣ ＡＧＣ ＧＴＧ ＣＧＣ ＣＡＴ （ＣｐＧ １７５８）、
オリゴ３（配列番号３）：ＡＣＣ ＧＡＴ ＧＡＣ ＧＴＣ ＧＣＣ ＧＧＴ ＧＡＣ ＧＧＣ ＡＣＣ ＡＣＧ、
オリゴ４（配列番号４）：ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＴＴ ＴＧＴ ＣＧＴ ＴＴＴ ＧＴＣ ＧＴＴ （ＣｐＧ ２００６）、
オリゴ５（配列番号５）： ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＣＧ ＴＴＣ ＣＴＧ ＡＴＧ ＣＴ （ＣｐＧ １６６８）。

別のＣｐＧオリゴヌクレオチドは上記の好ましい配列を含みうるが、ただし、それらは重要でない欠失または付加を有するものである。本発明で使用するＣｐＧオリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知の方法（例えば、ＥＰ ４６８５２０）により合成することができる。簡便には、そのようなオリゴヌクレオチドは、自動シンセサイザーを使用して合成することが可能である。それらは、典型的には、１０〜５０塩基長である。

本発明で使用するオリゴヌクレオチドは、典型的には、デオキシヌクレオチドである。好ましい実施形態においては、該オリゴヌクレオチド中のヌクレオチド間結合はホスホロジチオエート、より好ましくはホスホロチオエート結合であるが、ホスホジエステルも本発明の範囲内である。種々のヌクレオチド間結合（例えば、混合ホスホロチオエート、ホスホジエステル）を含むオリゴヌクレオチドも意図される。該オリゴヌクレオチドを安定化する他のヌクレオチド間結合を使用することが可能である。

本発明のアジュバント組合せ物中で使用しうるサポニンには、米国特許第５，０５７，５４０号および「ワクチンアジュバントとしてのサポニン（Ｓａｐｏｎｉｎｓ ａｓ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔｓ）」，Ｋｅｎｓｉｌ，Ｃ．Ｒ．，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ，１９９６，１２（１−２）；１−５５およびＥＰ ０３６２２７９ Ｂ１に記載されているＱｕｉｌ Ａと称されるバラ科キラヤ（Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ）の樹皮に由来するもの及びその画分が含まれる。Ｑｕｉｌ Ａの特に好ましい画分は、ＱＳ２１、ＱＳ７およびＱＳ１７である。

β−エスシン（β-escin）は、本発明のアジュバント組成物において使用するのに好適なもう１つの溶血性サポニンである。エスシンは、樹木マロニエ（Ｌａｔ：Ａｅｓｃｕｌｕｓ ｈｉｐｐｏｃａｓｔａｎｕｍ）の種子中に見出されるサポニンの混合物としてＭｅｒｃｋインデックス（第１２版、エントリー３７３７）に記載されている。その単離は、クロマトグラフィーおよび精製によるもの（Ｆｉｅｄｌｅｒ，Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ−Ｆｏｒｓｃｈ．４，２１３（１９５３））並びにイオン交換樹脂によるもの（Ｅｒｂｒｉｎｇら，米国特許第３，２３８，１９０号）が記載されている。エスシンの画分が精製されており、生物学的に活性であることが示されている（Ｙｏｓｈｉｋａｗａ Ｍら（Ｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ（Ｔｏｋｙｏ）１９９６ Ａｕｇ；４４（８）：１４５４−１４６４））。β−エスシンはエスシン（ａｅｓｃｉｎ）としても知られている。

本発明において使用するもう１つの好ましい溶血性サポニンはジギトニンである。ジギトニンは、キツネノテブクロ（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｐｕｒｐｕｒｅａ）の種子に由来するサポニンとしてＭｅｒｃｋインデックス（第１２版、エントリー３２０４）に記載されており、Ｇｉｓｖｏｌｄら，Ｊ．Ａｍ．Ｐｈａｒｍ．Ａｓｓｏｃ．，１９３４，２３，６６４およびＲｕｈｅｎｓｔｒｏｔｈ−Ｂａｕｅｒ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９５５，３０１，６２１に記載の方法に従い精製される。その用途は、コレステロール測定のための臨床用試薬として記載されている。

本発明のアジュバント組合せ物は更に担体を含むことが可能であり、サポニンまたはＣｐＧまたはリポ多糖は、該組合せ物のアジュバント活性を増強する粒状担体と会合しうる。特に好ましい全身性ワクチンは、例えば、担体分子を含む。

本発明のアジュバント組合せ物において使用するＣｐＧは遊離溶解状態にあることが可能であり、また、粒状担体、例えば無機塩（アルミニウムまたはカルシウム塩が挙げられるが、これらに限定されるものではない）、リポソーム、ＩＳＣＯＭｓ、乳剤（水中油型、油中水型、水中油中水型）、重合体（例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリホスファジン、ポリアミノ酸、アルギネート、キトサン）または微粒子と複合体を形成させることが可能である。好ましくは、該担体は陽イオン性である。本発明のワクチンは更に、ＣｐＧ−担体複合体と会合しうる又はＣｐＧ−担体複合体と会合し得ない抗原を含む。この場合、該抗原は遊離懸濁状態にあっても、また、別の担体と会合していてもよい。

本発明のサポニン形成部分は、ミセルの形態で分離していることが可能であり、あるいはコレステロールおよび脂質と共に製剤化される場合にはＩＳＣＯＭｓ（ＥＰ ０１０９９４２ Ｂ１）またはリポソーム（ＷＯ９６／３３７３９）のような大きな秩序だった構造体の形態をとることが可能であり、あるいは水中油型乳剤（ＷＯ９５／１７２１０）の形態をとることも可能である。サポニンは、好ましくは、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムのような金属塩と会合することが可能である（ＷＯ９８／１５２８７）。あるいは、サポニンはキトサンのような粒状担体と会合していてもよい。サポニンは粉末のような乾燥状態にあってもよい。ワクチン接種を受ける者の粘膜表面に投与される形態の最終製剤は、溶血性の性質を有することが好ましい。サポニンは、直接的結合により又は同じ粒状担体分子との同時相互作用により、該抗原と物理的に会合することも会合しないことも可能である（ＧＢ９８２２７１２．７；ＷＯ９８／１６２４７）。

本発明のアジュバントまたはワクチン中のＣｐＧおよびサポニンおよびリポ多糖は、それら自体が分離していること又は会合していることが可能である。例えば、ＣｐＧおよびサポニンは遊離懸濁状態にあってもよいし、あるいは担体、より好ましくは粒状担体（例えば水酸化アルミニウム）を介して、又は陽イオン性リポソームもしくはＩＳＣＯＭｓにより会合していてもよい。

本発明の好ましいアジュバント組合せ物は、水中油型乳剤またはＤＱを含む群から選ばれる粒状担体およびＱＳ２１と共に、２つの隣接ＣＧモチーフ間に少なくとも３個、好ましくは少なくとも６個のヌクレオチドを含有する１以上のＣｐＧオリゴヌクレオチドを含んでなる。リポ多糖はジまたはモノホスホリル脂質誘導体、好ましくは３脱−Ｏ−アシル化されたもの、特に３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡであることが好ましい。最も好ましくは、アジュバント組合せ物は、水中油型乳剤またはＤＱを含む群から選ばれる粒状担体およびＱＳ２１と混合されたＣｐＧ２００６（配列番号４）またはＣｐＧ１７５８（配列番号２）またはＣｐＧ１８２６（配列番号１）を含む。したがって、特に好ましいワクチンは、例えば、そのようなアジュバント組合せ物および抗原を含む。本発明の好ましいワクチンは、全身経路で個体に投与した後に全身性免疫応答を生起させるために使用される。

本発明のアジュバント組合せ物は、油を基剤とする乳剤を含みうる。油乳剤アジュバントは、例えば、フロイント完全および不完全鉱油乳剤アジュバントに関する研究を含めて、久しく知られている。それ以来、これらの強力ではあるが反応原性（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ）であるアジュバント製剤に代わる安定でかつ十分許容される製剤を設計するために多大な研究が行われてきた。

多数の単相または多相乳剤系が記載されている。水中油型乳剤アジュバント自体がアジュバント組成物として有用であると提起されており（ＥＰ ０３９９８４３Ｂ）、水中油型乳剤と他の活性薬剤との組合せも、ワクチン用のアジュバントとして記載されている（ＷＯ９５／１７２１０；ＷＯ９８／５６４１４；ＷＯ９９／１２５６５；ＷＯ９９／１１２４１）。他の油乳剤アジュバント、例えば、油中水型乳剤（米国特許第５，４２２，１０９号；ＥＰ ０４８０９８２ Ｂ２）および水中油中水型乳剤（米国特許第５，４２４，０６７号；ＥＰ ０４８０９８１ Ｂ）も記載されている。

本発明において使用する油乳剤アジュバントは天然物または合成物であってよく、無機物または有機物であってもよい。無機および有機の油の例は当業者には容易に理解されるであろう。

水中油型組成物がヒトへの投与に適したものとなるためには、該乳剤系の油相が代謝可能な油を含むことが好ましい。代謝可能な油なる用語の定義は当技術分野でよく知られている。代謝可能は、「代謝により変換されうること」と定義することができる（Ｄｏｒｌａｎｄ’ｓ Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，第２５版（１９７４））。油は、レシピエントにとって毒性でなく代謝により変換されうるどのような植物油、魚油、動物油または合成油であってもよい。堅果（例えば、ラッカセイ油）、種子および穀物が、一般的な植物油の供給源である。合成油も本発明の一部であり、それらにはＮＥＯＢＥＥ（登録商標）のような市販の油が含まれうる。スクアレン（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン）は、鮫肝油中に大量に、そしてオリーブ油、小麦胚芽油、米糠油および酵母中により少量で存在する不飽和油であり、本発明で使用するのに特に好ましい油である。スクアレンは、コレステロールの生合成における中間体であるため、代謝可能な油である（Ｍｅｒｃｋインデックス，第１０版、エントリー番号８６１９）。

特に好ましい油乳剤は水中油型乳剤、特に水中スクアレン型乳剤である。

また、本発明の最も好ましい油乳剤アジュバントは、酸化防止剤を含み、それは、好ましくは、油状のα−トコフェロール（ビタミンＥ、ＥＰ ０３８２２７１ Ｂ１）である。

ＷＯ９５／１７２１０およびＷＯ９９／１１２４１は、所望により免疫刺激剤ＱＳ２１および／または３Ｄ−ＭＰＬにより製剤化されうる、スクアレン、α−トコフェロールおよびＴＷＥＥＮ ８０に基づく乳剤アジュバントを開示している。ＷＯ９９／１２５６５は、油相中へのステロールの添加によるこれらのスクアレン乳剤に対する改良を開示している。また、乳剤を安定化するために、トリカプリリン（Ｃ２７Ｈ５０Ｏ６）のようなトリグリセリドを油相に加えることが可能である（ＷＯ９８／５６４１４）。

安定な水中油型乳剤中に存在する油滴のサイズは、光子相関分光法により測定して、好ましくは１ミクロン未満であり、実質的に直径３０〜６００ｎｍ、好ましくは実質的に直径約３０〜５００ｎｍ、最も好ましくは実質的に直径１５０〜５００ｎｍの範囲内、特に直径約１５０ｎｍでありうる。これに関しては、油滴数の８０％が、それらの好ましい範囲内にあるべきであり、より好ましくは、油滴数の９０％以上、最も好ましくは９５％以上が、その定められたサイズ範囲内にある。本発明の油乳剤中に存在する成分の量は、通常は、２〜１０％の油（例えば、スクアレン）、存在する場合には２〜１０％のα−トコフェロールおよび０．３〜３％の界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）の範囲内である。好ましくは、油：α−トコフェロールの比は１以下である。なぜなら、これがより安定した乳剤を与えるからである。また、Ｓｐａｎ ８５を約１％のレベルで存在させることも可能である。いくつかの場合には、本発明のワクチンは安定化剤を更に含有することが有利でありうる。

水中油型乳剤の製造方法は当業者によく知られている。一般には、該方法は、油相をＰＢＳ／ＴＷＥＥＮ８０（商標）溶液のような界面活性剤と混合し、次いでホモジナイザーを使用してホモジナイズすることを含むが、当業者には、該混合物を注射針に２回通過させる方法が小容量の液体をホモジナイズするのに適していることが明らかであろう。同様に、マイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅｒ）（Ｍ１１０Ｓマイクロフルイディクス装置、６バールの最大入力圧（約８５０バールの出力圧）で２分間にわたり最大で５０回の通過）内での乳化方法が、より小さい又はより大きな容積の乳剤を製造するために、当業者により応用されうるであろう。この応用は、必要とされる大きさの油滴の調製物が得られるまで、生じた乳剤の測定を含むルーチンの実験操作を行うことにより達成されるであろう。

本発明のアジュバント組合せ物は、全身性アジュバントまたは粘膜アジュバントの両方として使用することができる。本発明の特定の形態においては、全身または非経口経路（例えば、筋肉内、皮内、経皮、皮下、腹腔内または静脈内投与）により投与される全身性ワクチンを提供する。好ましい投与経路は、経皮経路、例えば皮膚パッチによるものである。

本発明の全身性ワクチン製剤は、筋肉内、腹腔内、皮内、経皮、静脈内または皮下投与により該ワクチンを投与することにより、疾患に罹患しやすい又は罹患した哺乳動物を防御または治療するために使用することができる。ワクチン製剤の全身投与の方法は、通常のシリンジおよび針、または固形ワクチンのバリスティック（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）送達のために設計された装置（ＷＯ９９／２７９６１）、または無針加圧液噴射装置（米国特許第４，５９６，５５６号；米国特許第５，９９３，４１２号）、または経皮パッチ（ＷＯ９７／４８４４０；ＷＯ９８／２８０３７）を含みうる。また、本発明は、皮膚に適用される抗原（経皮送達、ＷＯ９８／２０７３４；ＷＯ９８／２８０３７）の免疫原性を増強するために使用することができる。それゆえに、本発明は、本発明のワクチンまたはアジュバント組成物を予め充填した全身投与用の送達装置を提供する。したがって、個体における免疫応答の誘導方法であって、抗原および免疫刺激性オリゴヌクレオチド、サポニンおよび担体を含むワクチンを個体に投与することを含んでなり、該ワクチンを非経口または全身経路により投与することを特徴とする方法を提供する。免疫応答の好ましい誘導方法は、Ｑｕｉｌ Ａ由来のサポニン（例えばＱＳ２１）および担体（例えば、水中油型乳剤、コレステロール含有リポソームまたはミョウバン）と共にワクチン（例えば、Ｈｅｒ ２ ｎｅｕ誘導体に対するもの
）を投与することを含む。

あるいは、本発明のワクチン製剤は、該ワクチンを粘膜経路、例えば経口／食事性または鼻腔内経路により投与することにより、疾患に罹患しやすい又は罹患した哺乳動物を防御または治療するために使用することができる。その他の粘膜経路としては、膣内および直腸内経路が挙げられる。好ましい粘膜投与経路は、鼻腔内ワクチン接種と称される鼻経路によるものである。鼻腔内ワクチン接種の方法は当技術分野でよく知られており、それらには、免疫しようとする個体の鼻咽腔内への該ワクチンの液滴、スプレーまたは乾燥粉末形態の投与が含まれる。
噴霧化またはエーロゾル化ワクチン製剤も本発明の一部を形成する。腸内製剤、例えば、経口投与用の胃抵抗性カプセルおよび顆粒、直腸または膣投与用の坐剤も、本発明の一部を形成する。

本発明のアジュバント組合せ物は、全身ワクチン接種の代わりに粘膜ワクチン接種を用いるための、ヒトへの適用に適した種類の粘膜アジュバントに相当する。本発明の好ましい形態においては、免疫刺激性オリゴヌクレオチドと組み合わせた純粋なサポニン、例えばＱｕｉｌ Ａまたはその誘導体（ＱＳ２１を含む）、エスシン、ジギトニンまたはジプソフィラ（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ）もしくはキノア（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ｑｕｉｎｏａ）サポニンを、全身免疫応答を得るために抗原の粘膜投与用のアジュバントとして使用することができる。

本発明のアジュバント組合せ物はワクチン製剤中で使用され、ワクチンは全身または粘膜経路により投与されうる。好ましくは、ワクチンを粘膜投与に使用する場合には、該アジュバント組合せ物は溶血性サポニンを含む。

粘膜投与の場合、好ましくは、本発明の組成物は溶血性サポニンを含む。本発明の定義の範囲内の溶血性サポニンまたはサポニン調製物は、以下のアッセイを参考にして判定されうる。
１．モルモットからの新鮮な血液を卓上遠心機中でリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄する。もとの容積に再懸濁させた後、該血液をＰＢＳで更に１０倍希釈する。
２．５０μｌのこの血液懸濁液を、界面活性剤またはサポニンの２倍希釈物を含有する８００μｌのＰＢＳに加える。
３．８時間後、溶血を視覚的に又は上清の光学濃度の測定により評価する。５７０ｎｍで光を吸収する赤色上清の存在は溶血の存在を示す。
４．結果は、溶血がもはや生じなくなった最初のサポニン希釈濃度として表される。

本発明の目的において、サポニンアジュバント製剤は、それが０．１％未満の濃度で赤血球を溶解すれば、溶血性である。評価基準の手段として、ＱｕｉｌＡ、ＱＳ２１、ＱＳ７、ジギトニンおよびβ−エスシンの実質的に純粋なサンプルはすべて、このアッセイにおける定義では溶血性サポニンといえる。そのような生物学的アッセイにもともと見られる実験的ばらつきの範囲内で、本発明のサポニンは、好ましくは、約０．５〜０．００００１％、より好ましくは０．０５〜０．００００１％、より一層好ましくは０．００５〜０．００００１％、最も好ましくは０．００１〜０．０００４％の溶血活性を有する。理想的には、該サポニンはＱＳ２１に類似した溶血活性（すなわち、１０倍の差異内）をもつべきである。

本発明のワクチンは経口経路によっても投与することができる。そのような場合、医薬上許容される賦形剤はアルカリ性バッファー、または腸溶カプセルもしくは微小顆粒を含みうる。本発明のワクチンは膣内経路によっても投与することができる。そのような場合、医薬上許容される賦形剤はまた、乳化剤、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）のような重合体、および膣内クリーム剤や坐剤の他の公知安定剤を含みうる。本発明のワクチンは直腸内経路によっても投与することができる。そのような場合、該賦形剤はまた、直腸内坐剤を形成するための当技術分野で公知のロウおよび重合体を含みうる。

本発明のアジュバント組合せ物中に２つ以上のサポニン（例えば、ＱＳ２１、ＱＳ７、ＱｕｉｌＡ、β−エスシンまたはジギトニンを含む群の少なくとも２つの組合せ）を含む製剤も、本発明の一部を形成する。また、本発明の組成物は、２つ以上の免疫刺激性オリゴヌクレオチドの組合せを含みうる。

あるいは、該製剤は、キトサンまたは他のポリ陽イオン性重合体、ポリ乳酸およびポリ乳酸−コ−グリコリド粒子、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン系重合体マトリックス、多糖または化学修飾多糖から構成される粒子、リポソームおよび脂質ベースの粒子、グリセロールモノエステルから構成される粒子などから構成されるワクチンビヒクルと組み合わせることが可能である。サポニンはまた、リポソームまたはＩＳＣＯＭｓのような粒状構造体を形成するためにコレステロールの存在下で製剤化することができる。さらに、サポニンは、非粒状溶液または懸濁液において、あるいは小ラメラリポソームまたはＩＳＣＯＭのような粒状構造体において、ポリオキシエチレンエーテルまたはエステルと共に製剤化することができる。サポニンはまた、粘度を増加させるためのＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）のような添加剤と共に製剤化することが可能であり、また、ラクトースのような粉末賦形剤と共に乾燥粉末形態として製剤化することも可能である。

特に好ましいアジュバントは、本明細書に記載のＣｐＧオリゴヌクレオチドと組み合わせた、３Ｄ−ＭＰＬとＱＳ２１との組合せ（ＥＰ ０６７１９４８ Ｂ１）、３Ｄ−ＭＰＬとＱＳ２１とを含む水中油型乳剤（ＷＯ９５／１７２１０、ＷＯ９８／５６４１４）、または他の担体と共に製剤化された３Ｄ−ＭＰＬ（ＥＰ ０６８９４５４ Ｂ１）である。本発明のアジュバントまたはワクチン中のＣｐＧまたは免疫刺激性オリゴヌクレオチドの量は、一般には少量であるが、ワクチン製剤に応じて、１〜１０００μｇ／１回量、好ましくは１〜５００μｇ／１回量、より好ましくは１〜１００μｇ／１回量の範囲内でありうる。

本発明のアジュバント中で使用するサポニンの量は、１〜１０００μｇ／１回量、好ましくは１〜５００μｇ／１回量、より好ましくは１〜２５０μｇ／１回量、最も好ましくは１〜１００μｇ／１回量の範囲内でありうる。したがって、ＣｐＧ：サポニン（ｗ／ｗ）の比は１：１０００〜１０００：１の範囲内であり、典型的には１：１００〜１００：１の範囲内、好ましくは１：１０〜１：１または１：１〜１０：１の範囲内、最も好ましくは１：１、４：１または１０：１となろう。

本発明の製剤は、予防目的および治療目的の両方に使用することができる。したがって、癌、特に乳癌および前立腺癌の予防および治療用のワクチンの製造における、サポニン、リポ多糖およびＣｐＧ分子の組合せ物の使用を提供する。したがって、本発明は、感染症または癌、またはアレルギー、または自己免疫疾患に罹患しやすい又は罹患した哺乳動物の治療方法を提供する。本発明のもう１つの態様においては、医薬として使用するための、本明細書に記載のリポ多糖、サポニンおよびＣｐＧを含むワクチンまたはアジュバント組合せ物を提供する。ワクチン製剤は、一般には、Ｎｅｗ Ｔｒｅｎｄｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｖｏｌｌｅｒら編，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｒｋ Ｐｒｅｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ．１９７８に記載されている。

したがって、本発明は、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、腎臓癌、卵巣癌または黒色腫を含む群から選ばれる疾患に罹患することから個体を予防するための方法であって、実質的に本明細書に記載のとおりの組成物を該個体に全身経路により投与することを含む方法を提供する。

あるいは、本発明は、抗原と溶血性サポニンとを含む粘膜ワクチン組成物を提供する。したがって、疾患に罹患しやすい又は罹患した個体の治療方法であって、実質的に本明細書に記載のとおりの組成物を該個体の粘膜表面に投与することを含む方法を提供する。

さらに、哺乳動物において全身性の抗原特異的な免疫応答を引き出す方法であって、抗原と溶血性サポニンとを含む組成物を哺乳動物の粘膜表面に投与することを含む方法を記載する。さらに、サポニンを選択し、ＣｐＧ分子を選択し、それらを抗原と共に混合することを含む、ワクチンまたはアジュバントの製造方法を提供する。

本発明の組合せ物に使用するのに適した医薬上許容される賦形剤の例として、水、リン酸緩衝食塩水、等張緩衝溶液が挙げられる。

実施例１
・ＥＣＤ−ＰＤは、ＷＯ００／４４８９９に記載の方法に従いＣＨＯ細胞において産生させた。この製剤はマウスおよびウサギにおいて試験した。
・製剤をいくつかの対照と比較した。

ＳＢＡＳ１＋ＳＢＡＳ７：
ＥＣＤ−ＰＤは、ＣｐＧオリゴヌクレオチド２００６、３Ｄ−ＭＰＬ、ＱＳ２１（リポソーム中）と共に製剤化した。

ＳＢＡＳ１製剤
リポソーム中のＱＳ２１および該リポソームに会合した３Ｄ−ＭＰＬを含み、ＥＰ ０８２２８３１に記載の方法に従い製造した。

ＳＢＡＳ１＋ＳＢＡＳ７製剤
前記の製剤に、ＣｐＧオリゴヌクレオチド２００６を加えた。使用前に、抗原を該アジュバント製剤に混合した。

ＳＢＡＳ７＋ＳＢＡＳ２に基づく製剤（マウス）
１回量５０μｌのワクチンの場合には、ＥＣＤ−ＰＤタンパク質（２５μｇ）を１０倍濃縮ＰＢＳ（ｐＨ６．８）およびＨ_２Ｏ中で希釈した後、ＳＢ６２を含む水中油型乳剤（この乳剤は５％スクアレン、５％トコフェロール、２．０％ｔｗｅｅｎ８０を含み、粒径が１８０ｎｍであった）を連続的に加えた。

乳剤ＳＢ６２（２倍濃縮物）の調製
Ｔｗｅｅｎ８０をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解して、ＰＢＳ中の２％溶液を得る。１００ｍｌの２倍濃縮乳剤を得るために、５ｇのＤＬαトコフェロールおよび５ｍｌのスクアレンをボルテックスして十分に混合する。９０ｍｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ溶液を加え、十分に混合する。ついで、得られた乳剤をシリンジに通し、最後に、Ｍ１１ＯＳマイクロフルイディクス装置を使用することによりマイクロフルイダイズする。得られた油滴は約１８０ｎｍのサイズを有する。
次いで３Ｄ−ＭＰＬ（１０μｇ）、ＱＳ２１（１０μｇ）、５０μｇのＣｐＧ ＯＤＮ２００６を加え、３０分後、保存剤として５０μｇ／ｍｌのチメロサールを加えた。すべてのインキュベーションは、攪拌しながら室温で行った。

ＣｐＧオリゴヌクレオチドを添加しないこと以外は前記のとおりに、ＳＢＡＳ２製剤を調製した。

ＳＢＡＳ７はＣｐＧオリゴヌクレオチド２００６である。

ＳＢＡＳ７＋ＳＢＡＳ２に基づく製剤（ウサギ）
１回量５００μｌのワクチンの場合には、ＥＣＤ−ＰＤタンパク質（１００μｇ）を１０倍濃縮ＰＢＳ（ｐＨ６．８）およびＨ_２Ｏ中で希釈した後、ＳＢ６２（２５０μｌ）、３Ｄ−ＭＰＬ（１００μｇ）、ＱＳ２１（１００μｇ）および５００μｇのＣｐＧ ＯＤＮ２００６を連続的に加え、３０分後に、保存剤として５０μｇ／ｍｌｋチメロサールを加えた。すべてのインキュベーションは、攪拌しながら室温で行った。

実施例２： 腫瘍チャレンジ実験
Ｆ１（Ｃ５７×Ｂａｌｂ ｃ）マウスの群（１群につき８匹）に、０−１４−２８−４２日目に、ヒト用量の１０分の１（２５μｇ）の抗原を注射し、５６日目にＨｅｒ２を発現するＴＣ１細胞（皮下投与される約２ １０ｅ６ ＴＣｌ Ｈｅｒ２細胞／動物）で該マウスをチャレンジした。

該動物脾臓の１／２のＴＣｌ細胞を５６日目に集め、該動物から採血した。

図１に示すとおり、３Ｄ−ＭＰＬ／ＱＳ２１製剤へのＣｐＧオリゴヌクレオチドの添加は腫瘍退縮を相乗的に増強し、これらの製剤のみがマウスにおいて完全な腫瘍退縮を引き起こした。

実施例３： ウサギにおける種々のアジュバント中のＥＣＤ−ＰＤの免疫原性
１群４匹のウサギ６群を、ＡＳ０２、ＡＳ０１、ＡＳ０５、ＡＳ０６（ミョウバン上に吸収されたＣｐＧ２００６）、ＡＳ０７およびＡＳ０２Ｂ＋ＡＳ０７中の１００μｇのＥＣＤ−ＰＤでそれぞれ０、２１および４２日目に免疫した。

３回目の投与から１４日後（「１４ｐｏｓｔＩＩＩ」）、血清学を分析した。
表１は、高力価抗体応答の生起において、本発明の製剤が試験した他の製剤より優れていたことを示している。

実施例４： 成体アカゲザルにおけるＨｅｒ ２ ｎｅｕ，ＥＣＤ−ＰＤの免疫原性
成体アカゲザルを、以下の種々のアジュバント製剤中のＥＣＤ−ＰＤで免疫した。
ＡＳ０２ Ｂ 水中油型乳剤中のＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬ
ＡＳ０１ リポソーム中のＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬ
ＡＳ０５ リポソーム中のＱＳ２１
ＡＳ０６ ＣｐＧ２００６ミョウバン
ＡＳ０７ ＣｐＧ２００６
ＡＳ０２Ｂ＋ ＡＳ０７ 詳細は実施例１を参照。

ワクチン接種は、本発明の製剤（ＡＳ０２＋ＡＳ０７）においては、より高い抗体応答を惹起した。図２を参照されたい。

更なる分析は、抗体応答がポリクローナル性であることを示し、Ｉｔｅｒ ２ ｎｅｕ分子を過剰発現するヒト乳癌細胞系（ＳＫＢＲ３）のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖に対して抑制活性を示している。Ｈｅｒ ２ ｎｅｕを発現する腫瘍を治療するためのモノクローナル抗体であるヘルセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）は、この細胞系の増殖を抑制することができる。

このように、該製剤での能動的ワクチン接種の後に産生された抗体は機能的であることが認められた。

実施例５： ＥＣＤ−ＰＤ抗原でのマウスの免疫感作
この実験は、リン酸化ドメインに結合したＨｅｒ ２ ｎｅｕの細胞外ドメインの融合体（ＥＣＤ−ＰＤ）である抗原（ＷＯ００／４４８９９に記載の方法に従いＣＨＯ細胞において産生させたもの）を用いて、ある範囲のアジュバント製剤を検討するために計画したものである。

上記グループにおいて使用したトコール含有水中油型乳剤においては、Ｄ，Ｌ−トコフェロール（ＣＡＳ番号１０１９１−４１−０；化学名：（２ＲＳ，４’ＲＳ，８’ＲＳ）−２，５，７，８−テトラメチル−２−（４’，８’，１２’−トリメチル−トリデシル）−６−クロマノール））（これはＲＯＣＨＥ（商標）から市販されている）を使用した。トコールは、存在する場合には、２．５容量％のスクアレンと共にそれを２．５容量％含む水中油型乳剤中に存在した。両方の油を混合し、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０（商標））を加えた後、マイクロフルイダイゼーション（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓａｔｉｏｎ）（Ｍ１１０Ｓマイクロフルイディクス装置、６バールの最大入力圧（約８５０バールの出力圧）で２分間にわたり最大で５０回の通過（ＷＯ９５／１７２１０に記載））を行った。したがって、グループ３、６および９は、水性ＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬまたはＣｐＧを添加した前記トコール乳剤に基づいていた。

ＱＳ２１および３Ｄ−ＭＰＬは、前記ワクチングループのいずれかに存在する場合には、５μｇ／１回量で加え、ＣｐＧ（オリゴ４（配列番号４）：ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＴＴ ＴＧＴ ＣＧＴ ＴＴＴ ＧＴＣ ＧＴＴ）は５０μｇの用量で加えた。

グループ２、５、１０で使用したアジュバントは、ＥＰ ０８２２８３１ Ｂ１（その内容を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載の技法に従い調製した。グループ１１は、リポソームの膜中に３Ｄ−ＭＰＬを含んでいた。
簡単に説明すると、３Ｄ−ＭＰＬ、ジオレオイルホスファチジルコリンおよびコレステロールを一緒に混合し、単ラメラリポソームにマイクロフルイダイズした（ＥＰ ０８２２８３１ Ｂ１に記載のとおり−ＱＳ２１を省いた）。

グループ４、７および８で使用したアジュバントは、水性懸濁液または溶液の形態であった。

ワクチン接種方法
Ｂ６Ｆ１マウスの群に、１４日間隔で４回（５０μｌずつの容量）筋肉内にワクチン接種した。４回目のワクチン接種から１４日後、Ｈｅｒ ２ ｎｅｕを発現する２×１０^６個のＴＣｌ腫瘍細胞で該マウスを皮下チャレンジした。

Ｈｅｒ ２ ｎｅｕ−ＴＣｌ腫瘍細胞系は、Ｈｅｒ ２ ｎｅｕをコードするレトロウイルスベクターによるＴＣｌ細胞のトランスダクションにより作製した。ブラストシジンによる選択期間の後、耐性クローンを単離し、Ｈｅｒ ２ ｎｅｕの発現に関してＦＡＣＳによりスクリーニングした。最高のＨｅｒ ２ ｎｅｕ発現を示すクローンを選択し、２×１０^６個のチャレンジ量が、野生型ＴＣｌ細胞と類似した増殖速度を有し、しかも対照動物に対して１００％の比率で腫瘍を発生させることを確認した。

個々の腫瘍のサイズを週２回測定し、グループの平均として表した。

結果
図３は、グループ１、２、４、５および６に関する腫瘍増殖の結果を示す。図４は、グループ１、５、６、７および１１に関する腫瘍増殖の結果を示す。図５は、グループ１、５、６、８、９および１０に関する腫瘍増殖の結果を示す。腫瘍の完全な退縮を引き起こした唯一のワクチンは、免疫刺激性オリゴヌクレオチドとサポニンとの両方を含有するワクチンであった。

図６および７は、５μｇ／ｍｌの免疫原（ＥＣＤ−ＰＤ）または細胞外ドメイン（ＥＣＤ）または細胞内ドメイン（ＩＣＤ）またはＨｅｒ ２ ｎｅｕと共にインキュベートした後のｉｎ ｖｉｔｒｏでの脾細胞のリンパ増殖を示す。

図８および９は、ＥＬＩＳＡで測定した総Ｉｇにより表される免疫原（ＥＣＤ−ＰＤ）に対する体液性免疫応答（図８）、またはこれらの応答におけるＩｇＧアイソタイプ分布（図９）を示す。

結論
３回の注射の後、抗体の誘導は以下のとおりであった。
ＡＳ０２Ｂ＋ＡＳ０７Ａ ＞ ＡＳ０１Ｂ ＞ ＡＳ０２Ｂ ＝ ＡＳ０６ ＝ ＡＳ０５ ＞ ＡＳ０７Ａ。

総括
試験したアジュバント（ＡＳ１、ＡＳ２、ＡＳ７）は、同様の効果を有する。
しかし、ＡＳ１とＡＳ２またはＡＳ２とＡＳ７の組合せが、より有効なアジュバントである。全分子ＥＣＤ−ＰＤに対してだけでなく、各部分（ＥＣＤおよびＩＣＤ）に対しても組合せアジュバントを投与した動物において、４回のワクチン接種後に、ＣＭＩが明らかに示されている。本発明の製剤は、腫瘍の退縮を引き起こすのに非常に有効である。

実施例６： Ｐ７０３Ｐ抗原でのマウスの免疫感作
この実験は、抗原プロスターゼ（Ｆｅｒｇｕｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９９，９６，３１１４−３１１９）とインフルエンザウイルス由来のＮＳ１のＮ末端１−８１断片との融合体（Ｐ７０３Ｐ−ＮＳ１）である抗原を用いて、ある範囲のアジュバント製剤を検討するために計画したものである。

上記グループにおいて使用したトコール含有水中油型乳剤においては、Ｄ，Ｌ，α−トコフェロール（ＣＡＳ番号１０１９１−４１−０；化学名：（２ＲＳ，４’ＲＳ，８’ＲＳ）−２，５，７，８−テトラメチル−２−（４’，８’，１２’−トリメチル−トリデシル）−６−クロマノール））（これはＲＯＣＨＥ（商標）から市販されている）を使用した。トコールは、存在する場合には、２．５容量％のスクアレンと共にそれを２．５容量％含む水中油型乳剤中に存在した。両方の油を混合し、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０（商標））を加えた後、マイクロフルイダイゼーション（Ｍ１１０Ｓマイクロフルイディクス、６バールの最大入力圧（約８５０バールの出力圧）で２分間にわたり最大で５０回の通過（ＷＯ９５／１７２１０に記載））を行った。したがって、グループ５および６は、水性ＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬおよび／またはＣｐＧを添加した前記トコール乳剤に基づいていた。

ＱＳ２１および３Ｄ−ＭＰＬは、前記ワクチングループのいずれかに存在する場合には５μｇ／１回量で加え、ＣｐＧ（オリゴ４（配列番号４）：ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＴＴ ＴＧＴ ＣＧＴ ＴＴＴ ＧＴＣ ＧＴＴ）は５０μｇの用量で加えた。

グループ３および４で使用したアジュバントは、ＥＰ ０８２２８３１ Ｂ１（その内容を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載の技法に従い調製した。

ワクチン接種方法
Ｂ６Ｆ１マウスのグループに、１４日間隔で４回（５０μｌずつの容量）筋肉内にワクチン接種した。

結果
図１０および１１は、３μｇ／ｍｌの免疫原（ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ）またはピキア発現Ｐ７０３Ｐ（１５μｇ／ｍｌ）または非特異的ＮＳ１−ＯｓｐＡ融合タンパク質と共にｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートした後の、２回目のワクチン接種の後および４回目のワクチン接種から１４日後の脾細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏリンパ増殖を示す。

図１２および１３は、中点力価ＥＬＩＳＡで測定したときの総Ｉｇで表される免疫原（ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ）に対する体液性免疫応答（図１２）、またはこれらの応答におけるＩｇＧアイソタイプ分布（図１３）を示す。

３Ｄ−ＭＰＬ／ＱＳ２１製剤へのＣｐＧオリゴヌクレオチドの添加が腫瘍退縮を相乗的に増強することを示した図である。 アカゲザルを種々のアジュバント製剤中のＥＣＤ−ＰＤで免疫したときの抗体応答を示した図である。 ＥＣＤ−ＰＤ抗原でマウスを免疫したときの、グループ１、２、４、５および６で使用したアジュバントに関する腫瘍増殖の結果を示した図である。 ＥＣＤ−ＰＤ抗原でマウスを免疫したときの、グループ１、５、６、７および１１で使用したアジュバントに関する腫瘍増殖の結果を示した図である。 ＥＣＤ−ＰＤ抗原でマウスを免疫したときの、グループ１、５、６、８、９および１０で使用したアジュバントに関する腫瘍増殖の結果を示した図である。 免疫原（ＥＣＤ−ＰＤ）または細胞外ドメイン（ＥＣＤ）または細胞内ドメイン（ＩＣＤ）と共にインキュベートした後で腫瘍チャレンジ前のｉｎ ｖｉｔｒｏでの脾細胞のリンパ増殖を示す。 免疫原（ＥＣＤ−ＰＤ）または細胞外ドメイン（ＥＣＤ）または細胞内ドメイン（ＩＣＤ）と共にインキュベートした後で腫瘍チャレンジ後のｉｎ ｖｉｔｒｏでの脾細胞のリンパ増殖を示す。 ＥＬＩＳＡで測定したときの総Ｉｇで表される免疫原（ＥＣＤ−ＰＤ）に対する体液性免疫応答を示した図である。 図８に示す免疫応答におけるＩｇＧアイソタイプ分布を示した図である。 免疫原（ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ）またはピキア発現Ｐ７０３Ｐ（１５μｇ／ｍｌ）または非特異的ＮＳ１−ＯｓｐＡ融合タンパク質と共にｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートした後の、２回目のワクチン接種後の脾細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏリンパ増殖を示す。 免疫原（ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ）またはピキア発現Ｐ７０３Ｐ（１５μｇ／ｍｌ）または非特異的ＮＳ１−ＯｓｐＡ融合タンパク質と共にｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートした後の、４回目のワクチン接種の１４日後の脾細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏリンパ増殖を示す。 中点力価ＥＬＩＳＡで測定したときの総Ｉｇで表される免疫原（ピキア発現Ｐ７０３Ｐ）に対する体液性免疫応答を示した図である。 中点力価ＥＬＩＳＡで測定したときの総Ｉｇで表される免疫原（ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ）に対する体液性免疫応答を示した図である。 図１３に示す免疫応答におけるＩｇＧアイソタイプ分布を示した図である。

Claims (14)

1. 異種融合パートナーに結合したＭＡＧＥ抗原、異種融合パートナーに結合したプロスターゼ抗原、プロスターゼの少なくとも２０個の連続したアミノ酸を含むプロスターゼ断片、突然変異プロスターゼ、
   Ｐ５０１Ｓ、
   クリプト（Ｃｒｉｐｔｏ）、
   Ｈｅｒ ２ ｎｅｕ膜貫通ドメインの実質的部分を欠くＨｅｒ ２ ｎｅｕ誘導体よりなる群から選ばれる癌抗原と、サポニンを含むアジュバント組成物とを、免疫刺激性オリゴヌクレオチドと共に含んでなる免疫原性組成物。
2. リポ多糖を更に含む、請求項１記載の組成物。
3. サポニンがＱＳ２１である、請求項１記載の組成物。
4. リポ多糖が、
   ｉ モノホスホリルリピドＡ
   ｉｉ ３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ
   ｉｉｉ ジホスホリルリピドＡ
   よりなる群から選ばれる、請求項２または３記載の組成物。
5. 免疫刺激性オリゴヌクレオチドが少なくとも２つのＣｐＧモチーフを含有する、請求項１〜４のいずれか１項記載の免疫原性組成物。
6. 免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、
   配列番号１ − ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＣＧ ＴＴＣ ＣＴＧ ＡＣＧ ＴＴ（ＣｐＧ １８２６）、
   配列番号２ − ＴＣＴ ＣＣＣ ＡＧＣ ＧＴＧ ＣＧＣ ＣＡＴ（ＣｐＧ １７５８）、
   配列番号３ − ＡＣＣ ＧＡＴ ＧＡＣ ＧＴＣ ＧＣＣ ＧＧＴ ＧＡＣ ＧＧＣ ＡＣＣ ＡＣＧ、
   配列番号４ − ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＴＴ ＴＧＴ ＣＧＴ ＴＴＴ ＧＴＣ ＧＴＴ（ＣｐＧ ２００６）、
   配列番号５ − ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＣＧ ＴＴＣ ＣＴＧ ＡＴＧ ＣＴ（ＣｐＧ １６６８）
   よりなる群から選ばれる、請求項１〜５のいずれか１項記載の免疫原性組成物。
7. サポニンがＩＳＣＯＭｓまたはリポソームを形成するように製剤化されている、請求項１〜６のいずれか１項記載の組成物。
8. サポニンが水中油型乳剤中に存在する、請求項１〜６のいずれか１項記載の組成物。
9. Ｈｅｒ ２ ｎｅｕの細胞外ドメインの実質的に全部を含む、請求項１〜８のいずれか１項記載の組成物。
10. Ｈｅｒ ２ ｎｅｕ分子が機能的な膜貫通ドメインを欠く、請求項８記載の組成物。
11. Ｈｅｒ ２ ｎｅｕのリン酸化ドメインを更に含む、請求項１〜１０のいずれか１項記載の組成物。
12. 請求項１〜１１のいずれか１項記載の組成物の安全かつ有効な量を投与することを含んでなる、Ｈｅｒ ２ ｎｅｕまたは前立腺特異的／腫瘍抗原を発現する癌に罹患した又は罹患しやすい患者の治療方法。
13. 請求項１〜１１のいずれか１項記載の組成物の安全かつ有効な量を投与することを含んでなる、ＭＡＧＥ、プロスターゼ、Ｐ５０１Ｓまたはクリプト（Ｃｒｉｐｔｏ）のいずれかを発現する癌に罹患した又は罹患しやすい患者の治療方法。
14. サポニンと、免疫刺激性オリゴヌクレオチドと、
    異種融合パートナーに結合したＭＡＧＥ抗原、
    異種融合パートナーに結合したプロスターゼ抗原、プロスターゼの少なくとも２０個の連続したアミノ酸を含むプロスターゼ断片、突然変異プロスターゼ、
    Ｐ５０１Ｓ、
    クリプト（Ｃｒｉｐｔｏ）、
    Ｈｅｒ ２ ｎｅｕ膜貫通ドメインの実質的部分を欠くＨｅｒ ２ ｎｅｕ誘導体よりなる群から選ばれる抗原と、の組合せ物の、腫瘍の治療または予防用の医薬の製造における使用。