JP2008148707A

JP2008148707A - 樹状細胞に特異的な抗体

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Publication number: JP2008148707A
Application number: JP2007340422A
Authority: JP
Inventors: Derek Nigel John Hart; ナイジェルジョンハートデレク
Original assignee: Canterbury Health Ltd
Current assignee: Canterbury Health Ltd
Priority date: 1996-10-09
Filing date: 2007-12-28
Publication date: 2008-07-03
Also published as: EP0956304B1; DE69731977T2; DE69731977D1; ATE284900T1; AU744637B2; WO1998015579A1; AU4639397A; US20020155510A1; JP2001502670A; EP0956304A1; EP0956304A4; US6479247B1

Abstract

【課題】ＤＣ上に見出される新しい活性化抗原のエプトープ（単数又は複数）を認識する免疫学的試薬を提供するか又は少なくとも公衆に有用な選択を提供する。
【解決手段】本発明は、活性化された樹状細胞に対する活性化抗原ＣＭＲＦ−56に特異的である抗体に関し、特にモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＣＭＲＦ−56に関し、さらにこのような抗体の治療および予防のための用途、ならびに、活性化された樹状細胞を精製するための免疫学ベースの方法に関する。
【選択図】なし

Description

本発明は一般的に、活性化された樹状細胞と結合し得る免疫学的試薬（抗体)、このような抗体を発現する細胞系及びこのような抗体を使用して血液から樹状細胞を同定しそして精製する方法に関する。

樹状細胞（ＤＣ）は、骨髄由来でありそして循環中並びにリンパ及び非リンパ組織内で痕跡量の集団として見出される強力な抗原提示細胞（ＡＰＣ）の１つの明らかに異なる群を構成する（非特許文献１〜３）。これら細胞が初期免疫応答開始に関与する最も有効な造血細胞として重要であることは十分に証明されている（非特許文献４〜７）が、ヒトＤＣ特異的系譜マーカーは同定されておらず、そしてこれら細胞の個体発生や他の白血球との関係に関する大部分の特徴は依然として明らかにされていない。

表現型としては、ヒトＤＣは高密度のＭＨＣクラスII抗原、広範囲の接着分子の存在及び或る範囲の系譜特異的細胞表面抗原（ＣＤ3、ＣＤ14、ＣＤ16、ＣＤ19、ＣＤ57）の不存在又は低発現を特徴（非特許文献１〜３、７〜１１）としている。ヒトＤＣでは、特に活性化後に、ＩＲＡＣ（非特許文献１２）、ＨＢ15（非特許文献１３）、4Ｆ2（非特許文献８）、ＩＬ-2Ｒ（非特許文献７、８）及びＢ7/ＢＢ-1（非特許文献７、１４）を含む多数の活性化抗原も報告されているが、抗-ＩＲＡＣ及びＨＢ15試薬が単離された新鮮な血中ＤＣを染色することは示されていない。このような表現型の特徴付けにも拘わらず、ＤＣの同定、そしてそれ故ＤＣの精製は、これら抗原の大部分が他の休止及び活性化された細胞型で発現されているので、依然として困難である。ＤＣの機能的及び表現型の特徴の多くはホジキン細胞（ＨＣ）とホジキン病（ＨＤ）由来細胞系の両方に共有されており、そして或る場合には、ＨＣがＤＣの悪性形態を表しているという仮説を支持する証拠が増加している（非特許文献１５〜１７）。

それ故、ＤＣを同定しそして精製する方法に使用される免疫学的試薬は明白な有用性を有している。このような試薬はＤＣに特異的なエピトープ又は抗原を認識することが必要であろう。今日までのところ、初期活性化抗原ＣＤ83（非特許文献１８、１９）及びＣＭＲＦ-44（非特許文献２０）に対する抗体が産生されている。しかしながら、ＣＤ83及びＣＭＲＦ-44以外のＤＣ上の種々のエプトープと結合し得る利用可能な抗体を取得する需要が依然として存在する。
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それ故、本発明の１つの目的は、ＤＣ上に見出される新しい活性化抗原のエプトープ（単数又は複数）を認識する免疫学的試薬を提供するか又は少なくとも公衆に有用な選択を提供することである。

第１の特徴において、本発明は、ＤＣ活性化抗原ＣＭＲＦ-56と特異的に結合する抗体又はその結合フラグメントを提供すると言うことができる。

好都合には、上記抗体はモノクローナル抗体、好ましくはモノクローナル抗体ＣＭＲＦ-56（ｍＡｂＣＭＲＦ-56）である。

更にそれ以上の特徴において、本発明はハイブリドーマ細胞系ＣＭＲＦ-56を提供する。

尚それ以上の特徴において、本発明は、活性化されたヒトＤＣのエプトープと特異的に結合するが活性化抗原ＣＭＲＦ-44及びＣＤ83とは結合しないハイブリドーマ細胞系ＣＭＲＦ-56によって分泌されるｍＡｂＣＭＲＦ-56を提供する。

更にそれ以上の特徴において、本発明は、ｍＡｂＣＭＲＦ-56が結合するヒトＤＣのエプトープに特異的な抗体又は抗体結合フラグメントを提供する。

尚それ以上の特徴において、本発明は活性化されたＤＣを含有する試料中でＤＣを同定する方法を提供し、そしてこの方法は上記試料を上記で特定したような抗体又は抗体結合フラグメントと接触させる段階を含んでいる。

尚それ以上の特徴において、本発明はＤＣを含有する試料からＤＣを精製及び／又は濃縮する方法を提供し、そしてこの方法は上記試料を上記で特定した抗体又は抗体結合フラグメントと接触させる段階を含んでいる。

これら方法の好ましい実施態様においては、同定又は精製すべき細胞は活性化されたヒトＤＣであり、そして抗体はｍＡｂＣＭＲＦ-56である。

更にそれ以上の特徴において、本発明は、上記で特定した抗体又は抗体結合フラグメントを含んでいるＤＣ含有試料からＤＣを精製又は濃縮する際に使用されるＤＣ精製系を提供する。

好都合には、上記精製系は活性化されたヒトＤＣを精製するように設計されており、そして上記抗体は任意に標識したｍＡｂＣＭＲＦ-56である。

更にそれ以上の特徴において、本発明は、上記で特定した方法によるか又は上記で特定した精製系を使用して回収される活性化されたＤＣにある。

尚それ以上の特徴において、本発明は、上記のようにして得られる活性化されたＤＣと、或る疾病に罹り易い動物においてこのような疾病に対する保護免疫学的応答を生じさせ得る少なくとも１つの抗原を含んでいる免疫強化組成物を提供する。

更にそれ以上の特徴において、本発明は、上記で特定した抗体と、或る疾病に罹り易い患者においてこのような疾病に対する保護免疫学的応答を生じさせ得る少なくとも１つの抗原を含んでいる免疫強化組成物を提供する。

更にそれ以上の特徴において、本発明は、上記のようにして得られる活性化されたＤＣ、上記で特定した抗体及び、或る疾病に罹り易い患者においてこのような疾病に対する保護免疫学的応答を生じさせ得る少なくとも１つの抗原を含んでいる免疫強化組成物を提供する。

更にそれ以上の特徴において、本発明は上記で特定した抗体を含んでいる免疫強化組成物を提供する。

更にそれ以上の実施態様において、本発明は或る疾病に関連した予防法及び／又は治療法を提供し、そしてこの方法はこのような疾病に罹り易い対象に上記で特定した免疫強化組成物を投与することを含んでいる。

尚それ以上の特徴において、本発明は、活性化されたＤＣの診断マーカーとして使用されるｍＡｂＣＭＲＦ-56を含んでいるアッセイキットを提供する。

（図面の要約）
本発明は上記で特定したように広範囲であるが、本発明はそれらに限定されるものではなく、実施例を提供して以下で説明されている実施態様も含むことが認められよう。加えて、本発明は以下に説明する添付図面を参照してより良く理解されよう：
（発明の説明）
上記で示したように、第１の特徴において、本発明は活性化されたＤＣと特異的に結合し得る免疫学的試薬（抗体）を提供する。これら抗体はＣＭＲＦ-56抗原と呼ばれているＤＣの新しい活性化抗原と結合する。

活性化抗原ＣＭＲＦ-56と結合する上記抗体はポリクローナル抗体を含有する抗血清の形態又は、好ましくは、ハイブリドーマ技術を使用して得られるモノクローナル抗体であることができるものと認められよう。更にそれ以上に、抗体又は結合フラグメントは生化学的又は組換えＤＮＡ技術を使用して産生させることができる。

本発明の免疫学的試薬はモノクローナル抗体又はこのような抗体の結合フラグメントであることが最も望ましい。それ故、コーラー（Kohler）及びミルスタイン（MIlstein)²¹の一般的な方法が使用される。一般的には、この方法は動物由来の抗体産生細胞を取得し、そしてこれらの抗体産生細胞を骨髄腫細胞株と融合させてハイブリドーマを産生させることに係わっている。これらのハイブリドーマは樹状細胞に特異的なモノクローナル抗体を産生させるために増殖又は培養される。

骨髄腫細胞系ＮＳ-１を使用する方法の１つの例を以下に示す。細胞系ＮＳ-１はシーミルスタイン教授、エムアールシーラボラトリーオブモレキュラーバイオロジー（MRC Laboratory of Molecular Biology)、英国ケンブリッジＣＢ2 2ＱＨヒルズロードから得ることができる。

他の骨髄腫細胞系は当該技術分野で知られており、そしてこれらには、例えば、次の細胞系: Ｘ63Ａg8 653、ＳＰ2/0、ＦＯ及びＮＳＯ/1が含まれる。免疫グロブリンのＨ又はＬ鎖を合成も分泌もしない細胞系（例えばＳＰ2/0）は、免疫グロブリン鎖を合成するが分泌しない細胞系より一般的に好ましい。

所望の場合、抗体フラグメントはツィセン（Tjissen)²²に記載されているような全免疫グロブリン分子の制御されたプロテアーゼ消化によって調製することができる。

或いは、抗体フラグメントは分子生物学的技術を使用して、ハイブリドーマ細胞からモノクローナル抗体のＨ鎖、Ｌ鎖又はこれら両鎖の可変領域をコードする遺伝子材料を単離し、そしてこれらを、モノクローナル抗体の組換え抗原結合フラグメント（Ｆv、ＳcＦv、Ｆab等）の産生に適する生物内で発現させることによって調製することができる²³。

本発明を説明するために、ヒト樹状細胞の活性化抗原ＣＭＲＦ-56のエピトープと結合し得るｍＡｂＣＭＲＦ-56と称されるモノクローナル抗体の産生及び特徴決定をここで記載する。この説明から、当該技術分野の熟練者は、ヒトＤＣ又は他の動物由来ＤＣの抽出に使用される活性化抗原ＣＭＲＦ-56と結合する他の抗体（又はこれらの結合フラグメント）がどのようにして取得されるのかについても了解するであろう。

（方法）
モノクローナル抗体及び免疫標識化
モノクローナル抗体ＣＭＲＦ-15（赤血球シアロ糖タンパク質、ＩgＭ)、ＣＭＲＦ-31（ＣＤ14、ＩgＧ2ａ）、ＣＭＲＦ-44（ＩgＭ）及びビオチン結合ＣＭＲＦ-44はこの実験室で産生された。ＨＢ15ａ（ＣＤ83、ＩgＧ2ｂ）はティテッダー（T Tedder）博士、デューク大学、ノースカロライナ州から贈与された。ＣＤ19 ｍＡｂＦＭＣ63（IgＧ2ａ）及びイソタイプ対照ｍＡｂＸ63（ＩgＧ1)、Ｓa14（ＩgＧ2ｂ）及びＳa15（ＩgＧ2ａ）はエイチゾラ（H Zola）教授（Flinders Medical Centre、オーストラリア国アデレイド）から贈与された。ＣＤ1a ｍＡｂＮaI/34はエイマックマイケル（A McMichael）教授（Institute of Molecular Medicine、英国オックスフォード）から贈与された。ＨuＮＫ-2（ＣＤ16、IgＧ2ａ）はアイマッケンジー（I McKenzie）教授（Austin Research Institute 、オーストラリア国メルボルン）から贈与された。ＯＫＴ3（ＣＤ3、ＩgＧ2ａ) 、ＨＮＫ-1（ＣＤ57、IgＭ）及びＯＫＭ1（ＣＤ11ｂ、ＩgＧ1）はＡＴＣＣから入手したハイブリドーマから産生された。ＣＤ3（leu4、IgＧ1)、ＣＤ14（leuＭ3、IgＧ2ｂ)、ＣＤ16（leu11c、IgＧ1)、ＣＤ19（leuＭ12、IgＧ1）及びＨＬＡ-ＤＲ（Ｌ243、IgＧ2ｂ）抗原に対するフィコエリトリン抱合抗体はベクトンディキンソン（Becton Dickinson)、カリフォルニア州マウンテンビューから購入した。イソチオシアン酸フルオレセイン抱合ヒツジ抗マウス（ＦＩＴＣ-ＳＡＭ）はシレナス（Silenus)、オーストラリア国ホーソーンから購入した。

標識化は、標準的な技術を使用して氷上で実施した。簡単に述べると、細胞を初期抗体と共にインキュベートし（30分)、洗浄し、次いでＦＩＴＣ-ＳＡＭと共にインキュベートした後、更に洗浄して分析した。ｍＡｂ／ＦＩＴＣ-ＳＡＭ標識細胞の二重標識化は、10％マウス血清中で５分間細胞を更にインキュベートし、続いて第２のＰＥ抱合又はビオチン結合抗体を添加して実施した。ビオチン結合抗体に関しては、更なる洗浄工程に続いてアビジン-ＰＥ（Becton Dickinson）と共にインキュベート（30分）した。細胞はＦＡＣＳバンテージ（Vantage）（Becton Dickinson）で分析するか又は分離した。直ちに分析できなかった試料は１％パラホルムアルデヒド中で固定して４℃で貯蔵した。

関連抗原のキャップ形成を試験するために、Ｌ428細胞をsal4か又はＨＢ15/ＰＥ-ＳＡＭのどちらかで標識し、その後37℃で60分間インキュベートした。次いで、細胞を４℃で洗浄し、その後ＣＭＲＦ-56-ＦＩＴＣ、Ｌ243-ＦＩＴＣ、Ｘ63-ＦＩＴＣ又はＦＩＴＣ-ＳＡＭのいずれかで（氷上で）標識した。

（ＣＭＲＦ-56 ｍＡｂの産生）
balb/ｃマウスをＨＤ由来細胞系Ｌ428で免疫感作し、そして骨髄腫系ＮＳ-１と融合した脾細胞で４日後に免疫感作した。ＣＭＲＦ-56ハイブリドーマを限界希釈で３回クローン化し、そしてこれを使用して腹水液を生じさせた。イソタイプ化は間接エリザキット（Sigma、ミズーリー州セントルイス）を使用して実施した。精製ＣＭＲＦ-56はタンパク質Ａクロマトグラフィーを利用して調製し、そしてビオチン-Ｘ-ＮＨＳ（Calbiochem、カリフォルニア州ラジョラ）を使用してビオチン化した。簡単に述べると、0.05ＭＮａＨＣＯ_３（ｐＨ 8.5）中２mg/mlのＣＭＲＦ-56をビオチン-Ｘ-ＮＨＳ（7.5μg/ml、Calbiochem、カリフォルニア州ラジョラ）と共に30分間（室温）インキュベートした後に透析した。

（細胞系）
Ｔ細胞系（ＨＳＢ-2、Ｍolt4及びＪurkat)、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系（ＷＴ49、Ｍann)、バーキットリンパ腫系（Ｒaji及びＤauｄi）、プレ-Ｂ（Ｎalm 6）、骨髄赤血球系（Ｋ562）及び単細胞系白血病（ＨＬ60、Ｕ937、ＫＧ1、ＫＧ1ａ、ＴＨＰ-1、ＨＥＬ）細胞系を培地（２mＭのグルタミン、0.06ｇ/ｌペニシリン及び0.1ｇ/ｌストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ-1640（Gibco、ニュージーランド国オークランド）中10％のＦＣＳ（Irvine Scientific、カリフォルニア州サンタアナ））中で増殖させた。ホジキン細胞系Ｌ428はヴィディール（V Diehl）博士（Clinik for Innere Medizine、ドイツ国ケルン）から入手して、ホジキン細胞系ＫＭ-Ｈ２及びＨＤＬＭ-２（20％の培地中で増殖させた）はエイチジードレクスラー（H G Drexler）博士（German Collection of Micro-organisms and Cell Cultures、ドイツ国ブラウンシュバイク）から入手した。

（リンパ球、顆粒球及び単球の調製）
血液は、倫理委員会の指針に従って適切なインフォームド・コンセントが得られた自発的提供者から入手した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は無菌フィコール／ハイパク（ｄ＝1.077ｇ/cm³、Pharmacia、スウェーデン国ウプサラ）勾配で遠心して調製した。Ｔリンパ球に富むフラクション（ＥＲ⁺）及び非Ｔフラクション（ＥＲ^-）は、以前に記載された³⁴ようにしてノイラミニダーゼ処理ヒツジ赤血球でロゼットを形成させてＰＢＭＣから調製した。顆粒球は、以前に記載された³⁴ようにしてＲＢＣのデキストラン沈降法に従って末梢血液から調製した。活性化されたＴリンパ球は、5μg/mlのＰＨＡ（Sigma）か又は500ng/mlのホルボールエステル、ホルボール 12-ミリステート 13-アセテート（ＰＭＡ、Sigma）25ng/ml＋カルシウムイオノホアＡ23187（Sigma）のどちらかを補充した培地中でＥＲ⁺ＰＢＭＣ（２×106個／ml）を培養して調製した。

ＥＲ^-ＰＢＭＣは濃厚な単球供給源として使用した。活性化された単球はＩＦＮγ（500Ｕ/ml、ドイツ国のBoehringer Ingelheimから贈与された)、細菌性ＬＰＳ（100ng/ml)、ＴＮＦα（20ng/ml）又はＧＭ-ＣＳＦ（500ｕ/ml、Novartis ）のいずれかを補充した培地中でＥＲ^-ＰＢＭＣ（２×106個/ml）を培養して得た。単球集団はＣＤ14-ＰＥで二重標識してモニターした。

インビトロ活性化の有効性は、活性化抗原ＣＤ25、ＣＤ71、ＨＬＡ-ＤＲ及びＣＭＲＦ-44の発現におけるフローサイトメトリーの変化をモニターすることによって決定した。

（樹状細胞の調製）
非常に濃厚なＤＣ集団は確立された次の実験室方法を使用して調製した：
ｉ）休止ＤＣは直接免疫枯渇法^33,34で調製した。簡単に述べると、ＥＲ^-ＰＢＭＣをＣＤ3、ＣＤ11ｂ、ＣＤ14、ＣＤ16及びＣＤ19 ｍＡｂの混合物で標識した。ＭＡＣＳ磁気ミクロスフェア（Miltenyl Biotech、ドイツ国）と共にインキュベートした後、標識された細胞を磁気免疫枯渇法で取り出し、そしてその後ｍＡｂ陰性細胞をＦＩＴＣ-ＳＡＭで標識し、そしてＦＡＣＳ分離で更に精製した。次いで、多数の実験では、休止ＤＣを培地中（２×106個/ml）で培養した（37℃、５％ＣＯ_２）後に分析した。

ii）培養された低密度血中ＤＣは、培養された（16時間、37℃、５％ＣＯ_２）ＥＲ^-ＰＢＭＣから調製した³⁶。次いで、ニコデンツ（Nycodenz）（Nycomed Pharma、ノルウエー国）勾配³⁶で遠心して低密度フラクションを単離し、そしてＤＣに富む（10〜30％）フラクションとして直接使用するか又は上記したようにして免疫枯渇法で更に精製して使用した。

iii）ＬＣ及び皮膚ＤＣは、ジスパーゼ（ＰＢＳ中0.25％、Boehringer-Mannheim）で一夜消化して（４℃）表皮シーツと真皮に分離した皮膚（同意を得て入手した）から単離した³³。表皮細胞（ＥＣ）懸濁物は、0.25％のトリプシン（Sigma）の存在下で細胞解離カップ（グレード40メッシュ、Sigma）で組織を分離させて得られた。新鮮なＬＣは、記載された³⁷リンホプレプ（lymphoprep）勾配によってこの段階で濃厚化された（2〜15％)。皮膚細胞懸濁物は、培地中でコラーゲナーゼＤ（Boehringer-Mannheim、１mg/ml）及びＤＮアーゼＩと共にインキュベートして（１時間、37℃）皮膚シーツから得た。ナイロンメッシュ（80μm）でろ過して単一細胞懸濁物を得、そしてリンホプレプ勾配（d=1.077g／cm³、10分、500×ｇ）で遠心した後、この低密度フラクションを濃厚（30〜50％）皮膚ＤＣ集団として使用した。

iｖ）滑液ＤＣ（ＳＦＤＣ）は以前に記載された³⁸ようにして単離した。インフォームド・コンセント後に、ＳＦを慢性関節炎患者から定型的な膝関節吸引によってＥＤＴＡ血液管中に集めた。ＥＲ^-細胞をＣＤ3、ＣＤ14、ＣＤ15、ＣＤ16及びＣＤ19に対するｍＡｂ混合物で標識し、そしてこれらの細胞を上記したようにして免疫磁気ＭＡＣＳビーズを使用して枯渇させて血中ＤＣを調製した。残存する標識細胞はＦＡＣＳを使用して更に枯渇させた。残っている非標識ＭＨＣクラスII陽性細胞でＳＦＤＣ集団は構成されていた。

ｖ）扁桃ＤＣは、インフォームド・コンセント後に定型的な扁桃摘出で得られた扁桃から調製した。これらを直ちに処理し、そして上記組織を微細に切断しそしてこれをワイヤーメッシュ篩に通して単一細胞懸濁物を調製した。単核細胞をＦ/Ｈ密度勾配で単離し、そしてＳＦＤＣについて上記したようにして扁桃ＤＣを単離した。

ｖi）インビトロ誘導ＤＣは、ファルコン（Falcon）６ウェルプレート（ＢＤ）中で２時間培養した（37℃）後に得られたＰＢＭＣの接着フラクションから産生された。接着細胞はＧＭ-ＣＳＦ（800Ｕ/ml）及びＩＬ-４（500Ｕ/ml）を補充した培地中で５日間培養し、ここでＴＮＦαを添加して最終濃度を20ng/mlにして、細胞を更に２日間培養した後に分析した。

（免疫組織学）
扁桃及びリンパ節（Canterbury Health Ethical Committeeによって承認される適切な倫理的許可を得て入手した）のクリオスタット切断表面露出切片（７μm）を一夜乾燥し、その後氷冷アセトン中で10分間固定し、そして30分間風乾した。切片を10％ヤギ血清と共にインキュベートした後、初期モノクローナル抗体（ｍＡｂ)、続いてビオチン結合ヤギ抗マウスＩg（DAKO）と共にインキュベートし、そしてその後ストレプトアビジン-ＨＲＰ（DAKO)を添加した。スライドは各30分のインキュベーション間にＴＢＳで３回洗浄した。酵素活性は３,３'-ジアミノベンジジン溶液で明らかになった。ＰＢＳ中での最終洗浄後、スライドを対比染色して（標準的なＨ＆Ｅ染色）載せた。

アセトン固定組織切片の免疫蛍光二重標識化は細胞懸濁物について上記したようにして実施した。

（機能アッセイ）
同種ＭＬＲ:105個のＴリンパ球を、単一の同種提供者から得られ分離されたＡＰＣサブセットの等級付けした３重複物を用いて、96ウェルプレート中５％ＣＯ_２中37℃で培養した。ウェルは、５日目の採集直前に0.5Ｃiの三重水素化チミジン（Amersham）と共に12時間振動させた。細胞をろ紙上に採集し、そして液体シンチレーションカウンターでチミジン取り込みを測定した。データは３重複ウェルのＣＰＭ平均値±ＳＤとして表す。Ｔ細胞又はＡＰＣ単独を含有する対照ウェルは全ての実験で三重水素化チミジン取り込みが＜500cpmであった。

（ＣＤ83トランスフェクション体の調製）
培地中で増殖させたＣＯＳ-７細胞をナンク（Nunc）ペトリ皿に播いて概ね50 ％の集密度とした。トランスフェクションはバイオラッドジーンパルサー（biorad Gene Pulser）中でＣＤ83プラスミド（Tedder博士の好意で提供されたＣＤＭ8-ＣＤ83）又は対照プラスミド２μgを用いて細胞（400μlの培地中４×106個）をエレクトロポレーション（300Ｖ、500μＦ）して実施した。次いで、細胞を培地中で72時間培養した後、ＨＢ15ａｍＡｂで免疫蛍光分析してＣＤ83発現を確認した。

（ＣＤ83融合タンパク質の発現）
ＣＤ83-Ｉgを真核細胞中で発現させた。ＣＤ83細胞外ドメインのＤＮＡフラグメント（シグナルペプチドを含有している）を、１対のプライマー（下線を引いた特有のＨindIII及びＥcoＲI部位を有するＭＫ001; ５'-ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧＴＣＧＣＧＣＧＧＣＣＴＣＣＡＧ-３'（前方向）及びＭＫ002; ５'-ＧＣＧＡＡＴＴＣＡＣＴＴＡＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＣＴＣＴＧＴＡＴＴＴＣＴＴ-３'（逆方向））を使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でＣＤ83 ｃＤＮＡから増幅させた。得られたフラグメントをＥcoＲI及びＨindIIIで消化し、そしてＥcoＲI及びＨindIII消化ｐＢluescriptと結合させて、ＤＮＡ配列決定用のｐＢＳ-ＣＤ83を得た。ＤＮＡ配列を確認した後、このフラグメントをＥcoＲI及びＨindIIIで切断し、そしてＥcoＲI及びＨindIII消化ｐＩＧベクターと結合させた。このベクターをエレクトロポレーションでＣＯＳ細胞にトランスフェクションさせ、そしてＣＤ83-Ｉgを、タンパク質Ａカラムクロマトグラフィーを使用してＣＯＳ細胞のならし培地から精製した。

ＣＤ83-ヒスタミン（ＣＤ83-Ｈist）を原核細胞中で発現させた。ＣＤ83細胞外ドメインのＤＮＡフラグメント（シグナルペプチドを除いている）を、１対のプライマー（特有のＢglII部位（下線を引いた）を有するＭＫ010; ５'-ＧＡＡＧＡＴＣＴＡＣＧＣＣＧＧＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧ-３'（前方向）及びＭＫ011; ５'-ＧＡＡＧＡＴＣＴＣＴＣＣＧＣＴＣＴＧＴＡＴＴＴＣＴＴ-３'（逆方向））を使用してＰＣＲでＣＤ83 ｃＤＮＡから増幅させた。得られたフラグメントをＢglIIで消化し、そしてＢglII消化ｐＱＥ12と結合させて、ｐＱＥ-ＣＤ83を得た。ＤＮＡ配列及びフレーム内状態を確認した後、このベクターを使用してＸＬ-ブルー細菌を形質転換し、そしてこの細菌培養物にＩＰＴＧを添加してＣＤ83-Ｈist融合タンパク質を誘導した。この融合タンパク質は、Ｎi-ＮＴＡ樹脂カラムクロマトグラフィーを使用して上記細菌溶解物から精製した。

（ＣＤ83エリザ法）
ＣＭＲＦ-56及びＨＢ15とＣＤ83構築物との結合はエリザ法で分析した。エリザプレート（Maxisorp、 Nunc）は10μg/mlの濃度のＣＤ83-Ｉg、ＣＤ83-Ｈ又はヒトＩg（hIg、塩析した）と共にインキュベートして(37℃、１時間）被覆した。停止させた（２％のＢＳＡ/ＰＢＳ）後、ウェルを、１％ＢＳＡ/ＰＢＳ中で希釈した培養上清液、腹水液又は精製ｍＡｂのいずれかと共にインキュベートした（１時間、37℃)。洗浄（0.1％トゥイーン 20/ＰＢＳ）後、プレートをＧＡＭ-ＨＲＰ（Dako、1：1500）と共にインキュベートした（１時間、37℃）後、洗浄しそしてｏ-フェニレンジアミン（ＯＰＤ）基質を使用して発色させた。次いで、プレートをＭＲＸ微量プレート読み取り器（Dynatech Laboratories）で分析した（492nm／650nm）。

（酵素及び阻止試験）
ＣＭＲＦ-56抗原の酵素感受性は、プロナーゼ（50μg/ml、Sigma）か又はノイラミニダーゼ（0.1Ｕ/ml、Behring、ドイツ国マールブルグ）のどちらかを含有するＰＢＳ中で細胞系Ｌ428をインキュベートする（30分、37℃）ことによって試験した。細胞は洗浄（３回）後、フローサイトメトリーで分析した。酵素で誘導されるｍＡｂ結合強度の変化は処理した細胞のＭＦＩをＰＢＳだけでインキュベートした細胞と比較して測定した。

糖タンパク質のＮ-結合グリコシル化は０か又は10μg/mlのツニカマイシン（Sigma）を含有する培地中でのインキュベーション（12時間、37℃）によって停止させた。ｍＡＢ結合に与える処理の効果はフローサイトメトリーで測定した。

（免疫沈降法）
細胞は、３つの方法、（ｉ）ビオチン-Ｘ-ＮＨＳ（Calbiochem）による細胞表面の標識化^20,39、（ii）ビオチンヒドラジド（Calbiochem）による細胞表面のシアル酸標識化⁴⁰、又は（iii）³⁵Ｓ（NEN、マサチューセッツ州ボストン）による生合成的標識化²⁰を使用して標識した。標識化後、0.5％のトリトンＸ-100か又は0.25％のＣＨＡＰＳを含有しそして酵素インヒビターコンプリート（Complete（商標））（Boehringer）を補充した溶解緩衝液（100mＭトリス、150mＭＮaＣl、0.02％ＮａＮ_３、ｐＨ 7.8）１ml中で細胞（４×107個）をインキュベートして（氷上で１時間)、細胞を可溶化した。遠心（10,000ｇ、10分）後、可溶化したタンパク質を（i）以前に記載された^20,39ようなＣＮＢrで活性化したセファロース４Ｂ（RAM-Sepharose）と共有結合したウサギ抗マウス免疫グロブリンを使用する免疫沈降又は（ii）マキシソルプ（Maxisorp）エリザプレート⁴¹上に捕捉されたｍＡｂによる抗原の免疫吸着のどちらかによって分析した。溶出したタンパク質は、オートラジオグラフィーか又は化学発光視覚化と組み合わせたウエスタンブロット法と組み合わせた勾配ＳＤＳ-ＰＡＧＥで分析した。

脂質抽出物は以前に記載された²⁰ようにしてＬ428から調製した。全細胞溶解物（上記したようにして調製された）又は脂質を抽出された物質のスロットブロット法及びそれに続く免疫染色法は以前に記載された20ようにして実施した。

（結果）
ＣＭＲＦ-56 ｍＡｂの産生
ハイブリドーマはＮＳ-１骨髄腫細胞とＨＤ由来細胞系Ｌ428で免疫感作したマウスから得られた脾細胞との融合によって産生された。Ｌ428と反応性であるがＰＢＭＣとは反応性でないｍＡｂを産生するハイブリドーマが同定され、その後培養した低密度ＤＣとの反応性を分析した。ｍＡｂＣＭＲＦ-56（ＩgＧ1）はこれらＤＣ調製物内の細胞集団を標識しており、そして以下のように特徴付けられた。

（ＣＭＲＦ-56と正常な造血非ＤＣ集団との反応性）
単離した血液及び扁桃白血球集団でのＣＭＲＦ-56抗原の細胞表面発現は、フローサイトメトリーと一緒にした単一標識及び二重標識の両方で分析した。ＣＭＲＦ-56 ｍＡｂは循環中のＰＢＭＣ（ｎ＝5)、末梢血顆粒球（ｎ＝3、図１Ａ)、ＥＲ^-ＰＢＭＣ調製物内のＣＤ3⁺集団（ｎ＝4、図１Ａ）又はＥＲ^-ＰＢＭＣ調製物内のＣＤ16⁺、ＣＤ14⁺及びＣＤ19⁺集団（ｎ＝6）（図１Ａ）とは反応しなかった。

培地又はＰＨＡ若しくはＰＭＡ＋ＣaI（ｎ＝3）を補充した培地中24時間及び72時間のＥＲ⁺ＰＢＭＣ（ｎ＝3）のインビトロ培養（16時間、37℃）はＣＤ3⁺集団でＣＭＲＦ-56抗原の発現を誘導しなかった。培地中でのＥＲ^-ＰＢＭＣの培養（16時間、37℃）はＣＤ19⁺集団のサブ集団でＣＭＲＦ-56、ＣＤ83及びＣＭＲＦ-44抗原の発現を誘導し、一方ＣＤ19^-集団（ＣＤ14⁺単球を含んでいる）はこれらの抗原を欠いていた（図１Ｂ)。ＥＲ^-及びＥＲ⁺調製物をＰＭＡ/ＣaIの存在下で培養すると存在するＣＤ19⁺細胞でＣＭＲＦ-56及びＣＤ83発現を誘導した。ＬＰＳ、ＩＦＮγ、ＧＭ-ＣＳＦ又はＴＮＦαを更に補充した培地中でＥＲ^-ＰＢＭＣを24時間及び72時間培養してもＣＤ14⁺単球集団でＣＭＲＦ-56の発現を誘導しなかったが、ＣＭＲＦ-44又はＭＨＣクラスII抗原発現の変化を誘導した（データは示していない、ｎ＝3)。単離した扁桃リンパ球のフローサイトメトリーによる分析によって、ＣＭＲＦ-56は扁桃Ｔリンパ球（ｎ＝4）を標識しなかったが、ＣＤ83やＣＭＲＦ-44と共通して、或る割合の扁桃Ｂリンパ球を中程度の強さで標識したことが確認された（図１Ｃ）。

分析した全ての扁桃リンパ球調製物（ｎ＝5）で、ｍＡｂによるＢリンパ球標識化の割合に明確な差が存在した; ＣＭＲＦ-44抗原はＣＭＲＦ-56抗原より高い割合の細胞で、そしてＣＤ83抗原はより低い割合の細胞で発現された。

（細胞系及びトランスフェクション体との反応性）
ヒト細胞系でのＣＭＲＦ-56の細胞表面発現はフローサイトメトリーで分析した。ＣＭＲＦ-56抗原は多数のＢ細胞系（Ｍann、Ｒaji）及びＨＤ由来細胞系（Ｌ428、ＫＭ-Ｈ2、ＨＤＬＭ-2）で検出可能な値で発現され、最も強い染色はＬ428（図２Ａ）及びＭann細胞系で認められた。検出可能な値でＣＭＲＦ-56抗原を発現しなかった細胞系には骨髄-赤血球系Ｋ562、Ｔリンパ球系ＨＳＢ2及びＭolt4、骨髄腫単球細胞系ＮＢ4、ＴＨＰ1、Ｕ937、ＫＧ1及びＫＧ1ａ並びにプレＢリンパ球系ＮＡＬＭ6が含まれていた。ＣＭＲＦ-56ｍＡｂはＣＤ83+Ｔリンパ細胞系Ｊurkatとは反応せず（図２Ａ）そして図２Ｂに示されているようにＣＤ83陽性ＣＯＳ細胞トランスフェクション体（ｎ＝3）を標識しなかった。

ＣＭＲＦ-56抗原は、ＣＭＲＦ-56 ｍＡｂＦＩＴＣ-ＳＡＭによって或る割合のＬ428細胞で顕著なキャップ形成を示した。ＣＤ83抗原もＨＢ15/ＰＥ-ＳＡＭによってキャップ形成されて、染色された細胞の60％で別々のパッチが形成された。ＣＭＲＦ-56でキャップ形成させそして続いてＣＤ83で染色した細胞のうち、或る割合の細胞は膜のＣＤ83染色が均等に分布して残っていることを示しており、これら２つの抗原が別々の膜分子に局在していることが示唆された。

（生化学的分析）
酵素消化又はｎ-結合グリコシル化の遮断に対するＣＭＲＦ-56抗原の感受性をフローサイトメトリーで試験した。ＣＭＲＦ-56 ｍＡｂとＬ428細胞との結合の増加は、この細胞をノイラミニダーゼ（1.5倍の増加、ｓｄ＝0.2、ｎ＝5）か又はプロナーゼ（1.4倍の増加、ｓｄ＝0.25、ｎ＝4）で処理した後に観察された。ツニカマイシンとのプレインキュベーションは観察される結合を顕著には変化させなかった。ＮＣ膜に適用されたＬ428界面活性剤溶解物の免疫染色によって、ＣＭＲＦ-56抗原が非イオン界面活性剤トリトンＸ-100及び双性イオン界面活性剤ＣＨＡＰＳで効果的に可溶化されることが証明された。Ｌ428細胞表面タンパク質（ビオチン)、細胞表面シアル酸（ビオチンヒドラジド）又は代謝（³⁵Ｓ）標識化後に調製した溶解物による多数の免疫沈降実験では、抗ＭＨＣクラスII及びＣＤ83試薬で適当な分子量の生成物が同時沈降した（データは示していない）が、ＣＭＲＦ-56抗原は同定されなかった。Ｌ428及びＭann細胞系溶解物のウエスタンブロット法でも同様にＣＭＲＦ-56抗原は同定されなかった。ニトロセルロース膜に適用されたＬ428脂質及び非脂質抽出物の免疫染色ではどのフラクションでもＣＭＲＦ-56抗原が検出されず（データは示していない)、ＣＭＲＦ-56抗原エピトープは有機溶媒に感受性であることが示唆された。ＣＭＲＦ-56とＣＤ83-Ｉg及びＣＤ83-hist構築物との反応性はエリザ法で分析した（図３)。ＣＤ83 ｍＡｂとは対照的に、ＣＭＲＦ-56はＣＤ83 Ｉg（ｎ＝3）又はＣＤ-83-hist 組換え物質（ｎ＝3）のどちらとも結合しなかった。

（ＣＭＲＦ-56と単離ＤＣの反応性）
ＣＭＲＦ-56と単離ＤＣ集団との反応性は間接免疫蛍光法及びフローサイトメトリーで試験した。

直接単離した新鮮なＤＣ（図５Ａ）は検出可能な値のＣＭＲＦ-56又はＣＤ83抗原のいずれも発現しなかった。しかしながら、インビトロ培養６時間以内に両抗原の発現は直接単離したＤＣで急速に誘導された。対照的に、ＣＭＲＦ-44抗原の発現は直接単離したＤＣのサブ集団で一定して検出され、そしてＣＭＲＦ-44抗原の更なる上方調節はＣＭＲＦ-56及びＣＤ83の両抗原に先行した。

培養したＥＲ^-ＰＢＭＣのＤＣに富む低密度フラクションを分析すると、ＣＤ83及びＣＭＲＦ-44で検出されるＤＣ集団と同一のＣＭＲＦ-56⁺細胞のサブ集団（10〜30％、ｎ＝20）が常に同定された（図４Ａ)。二重標識化（図４Ｂ）によって、ＣＭＲＦ-56の反応性はlin^-、ＣＭＲＦ-44⁺及びＣＤ83^＋のＤＣ集団に関係していることが確認された。ＣＭＲＦ-56発現に基づく低密度ＥＲ^-ＰＢＭＣのＦＡＣＳ分離によって、強力な同種刺激活性はＣＭＲＦ-56⁺集団に関係しておりそしてＣＭＲＦ-56^-集団は弱い刺激にすぎないことが明確に示された（ｎ＝3、図４Ｃ)。ｍＡｂの結合はＤＣ同種刺激活性に影響を与えなかった。

単離したＬＣ（ｎ＝3）のフローサイトメトリー分析によって、これらの細胞の概ね40％が高密度のＣＭＲＦ-56及びＣＭＲＦ-44抗原を発現し、ＣＤ83はかなりより低い割合の細胞で弱く発現されることが示された（図６Ａ)。皮膚ＤＣ（ｎ＝3）は、強いＣＭＲＦ-44及びＣＭＲＦ-56陽性であるが、ＣＤ83に関しては細胞のサブ集団の弱い染色が示されただけであった（図６Ｂ）。

直接単離したＳＦＤＣは、ＣＤ83抗原を欠いているが、ＣＭＲＦ-56⁺細胞のサブ集団を含有していた（ｎ＝5、図７Ａ)。これらＳＦＤＣ調製物のインビトロ培養後には、ＣＭＲＦ-56とＣＤ83の両抗原の更なる上方調節が観察された。

直接免疫枯渇法で調製した扁桃ＤＣは、新たに単離した血中ＤＣと共通して、ＣＤ83及びＣＭＲＦ-56陰性であったが、インビトロ培養期間後に高密度の両抗原を発現した（ｎ＝5、図７Ｂ)。

インビトロ産生Ｍo-ＤＣ集団も試験した（ｎ＝3)。ＧＭ-ＣＳＦ、ＩＬ-４及びＴＮＦαの存在下で単球を培養した後、得られたＭo-ＤＣは強いＣＭＲＦ-56⁺であった。ＣＭＲＦ-56⁺細胞の割合はＣＤ1ａ⁺陽性細胞の割合より顕著に少なかった（図６Ｃ）。

（ＣＭＲＦ-56発現の免疫組織学的分析）
リンパ節及び扁桃切片の免疫組織学的染色によって、胚中心リンパ球で弱いＣＭＲＦ-56抗原発現が検出され、そして散乱ろ胞間（Ｔ帯）細胞で強い発現が検出された。扁桃切片の免疫蛍光二重標識化によって、ＣＭＲＦ-56陽性のろ胞間細胞はＣＤ19及びＣＤ20を欠いているがＣＤ86を発現することが示された。ＣＭＲＦ-56とＣＤ83による二重標識化によって、ろ胞間領域内ではＣＭＲＦ-56抗原はＣＤ83より少ない細胞数で発現されそしてＣＭＲＦ-56陽性集団のサブ集団はＣＤ83を発現しないことが示された。

（考察）
ｍＡｂＣＭＲＦ-56の特徴付けによって、これがこれまで特定されなかった抗原性エピトープを認識し、ヒトＤＣ集団での発現が制限されていることが確立された。循環中の血中白血球はＣＭＲＦ-56抗原を発現せず、そして培養しただけか又はインビトロ活性化後に、ＣＭＲＦ-56抗原の発現は培養ＰＢＭＣの低密度（ＤＣに富む）フラクション内及びＣＤ19⁺リンパ球サブ集団内だけで検出された。培養ＰＢＭＣの低密度フラクションの免疫標識化及びＦＡＣＳ分離によって、ＣＭＲＦ-56はこれら調製物内のＤＣ集団を染色していたことが確認された。循環中の血中ＤＣはＣＭＲＦ-56^-であるが６時間以内の培養で高密度の抗原を発現するという知見によって、ＣＭＲＦ-56がＤＣ上の初期分化／活性化マーカーを認識することが確認された。ＣＭＲＦ-56抗原はまた、単離されたＬＣ及び皮膚ＤＣを含む他のＤＣ集団でも発現された。扁桃や滑液ＤＣ上のＣＭＲＦ-56抗原の急速な上方調節は短期間のインビトロ培養後に生じた。ＣＭＲＦ-56抗原は、ＣＭＲＦ-44⁺細胞、例えば、インビトロ培養しそしてＩＦＮγ活性化した単球並びに新たに単離した血中ＤＣにＣＭＲＦ-56が存在しないことに基づいて、ＣＭＲＦ-44と明白に識別することができる。同様に、ＣＭＲＦ-56がＣＤ83トランスフェクション体、ＣＤ83組換えタンパク質及びＣＤ83⁺細胞系Ｊurkatとの反応性が無いことによってこれら２つの抗原は明確に識別された。現在のところ、入手可能な選択的ＤＣ表面マーカーはＣＭＲＦ-44^31,20及びＣＤ83^18,19だけであり、そしてこれらはＤＣの初期活性化マーカーも認識する。ＣＤ83及びＣＭＲＦ-56抗原ではなくて、ＣＭＲＦ-44抗原が循環中のＤＣのサブ集団で発現される³¹。３つのマーカーは全てＤＣの培養によって急速に上方調節するが、本試験で示したように、単離した血中ＤＣでのＣＭＲＦ-44の上方調節は明らかにＣＭＲＦ-56及びＣＤ83抗原に先行する。単離した皮膚ＤＣ、ＬＣ、滑液ＤＣ及び扁桃ＤＣの分析によって、ＣＭＲＦ-56抗原の発現はこれらの集団でのＣＤ83発現に先行することが示唆される。

かくして、これら３つの明らかに異なるＤＣ分化／活性化抗原はＣＭＲＦ-44抗原、ＣＭＲＦ-56抗原そしてその後ＣＤ83の順序で上方調節するように思われる。しかしながら、この解釈は、単離ＤＣでのＣＭＲＦ-44及びＣＭＲＦ-56抗原の発現が短期間のインビトロ培養中に維持され、一方幾つかの実験で表面ＣＤ83抗原の標識化が24時間後に低下するという事実によって影響を受けよう。このＣＤ83抗原発現の下方調節は表面タンパク質の開裂と、活性化されたＢリンパ球で生じることが報告されている36可溶性ＣＤ83の放出によるものであろう。

ＣＭＲＦ-56とＣＤ83は扁桃切片におけるＩＤＣとの反応性に関してかなり異なっていた。二重標識化によって、ＣＭＲＦ-56抗原はろ胞間帯でＣＤ83よりかなり少ない数の細胞で発現されそしてＣＭＲＦ-56⁺/ＣＤ83⁺、ＣＭＲＦ-56^-/ＣＤ83⁺及びＣＭＲＦ-56⁺/ＣＤ83^-細胞集団が存在することが示された。以前の研究で、ＣＤ83は扁桃組織内のＩＤＣサブセットによって発現されることが示されている。ＣＤ83^-細胞集団を含んでいるろ胞間帯内のＣＤ19^-、ＣＤ20^-及びＨＬＡ-ＤＲ⁺集団でのＣＭＲＦ-56抗原の発現は、ＣＭＲＦ-56及びＣＤ83抗原がＤＣ分化／活性化の種々の段階で発現されるという更なる証拠を提供している。しかしながら、ＣＤ83⁺ ＩＤＣのサブ集団にＣＭＲＦ-56抗原が存在していないことは、単離した扁桃ＤＣ集団を使用して得られた結果と対照的である。かくして、ＣＤ83⁺及びＣＭＲＦ-56^-のＤＣ集団はインビトロ培養の前又は後に分析した調製物のいずれでも検出されなかった。これは、単離扁桃ＤＣの場合には、特に単離細胞をインビトロ酵素消化に暴露しないで組織から全ての細胞集団を単離する困難性を反映している。興味深いことに、インシトゥで分析したとき、胚中心Ｂ細胞は大部分が低密度ＣＭＲＦ-56及びＣＤ83抗原を発現したが、単離扁桃Ｂ細胞では１つのサブ集団しかこれらの抗原を発現せず、組織マトリックスからのＢ細胞放出が典型的でないことを示していた。

ヒト細胞系でのＣＭＲＦ-56発現はＣＭＲＦ-44及びＣＤ83抗原の発現に匹敵し、多くの点でＨＤ由来細胞系及びＢ細胞系に限定されており、一方骨髄腫起源の細胞系はこれらの抗原を欠いている。ＥＲ-ＰＢＭＣ又はＥＲ+ＰＢＭＣ集団の活性化後に同様なパターンが観察され、ＣＭＲＦ-56及びＣＤ83の発現はＢリンパ球で容易に誘導することができる。インビトロ活性化後に血中Ｂリンパ球は全てこれらの抗原を発現するが、これらの抗原は単離扁桃リンパ球で明らかに異なる発現値を有しており、ＣＤ83はＣＭＲＦ-56より顕著に低い割合のＢリンパ球で発現され、一方ＣＭＲＦ-44は顕著により高く発現された。

或る範囲の単一刺激を使用して観察されたＣＤ14⁺単球集団でのこれら抗原の発現は無視できるほどであった。それにも拘わらず、ＣＤ83発現及びＣＭＲＦ-44は、特別のサイトカイン組合せ物の存在下で長期間培養した後に骨髄腫起源の細胞で誘導することができる。これらの細胞は、機能及び表現型に関してＤＣに近似しており、そしてこのインビトロ試験で示されるように、これらのＭo-ＤＣもＣＭＲＦ-56抗原を発現する。

ＤＣ集団に対するＣＭＲＦ-56及びＣＤ83の特異性は絶対的ではないが、Ｂリンパ球マーカーと共同したこれら抗原の試験によって、インシトゥ及び単離白血球集団内の両方で、活性化の初期段階でＤＣ集団を同定する高度に選択的な手段が提供されることが明白である。これらの分子の上方調節はＤＣ機能の顕著な活性化相に関係している。かくして、これらのＤＣは同時刺激分子ＣＤ80、ＣＤ86^{30,32,19,14,43}、ＣＤ40³³及びＩＣＡＭ-１^7,44のような接着分子を上方調節する。

要約すると、ＣＭＲＦ-56抗原は、他の関連抗原ＣＭＲＦ-44及びＣＤ83と同様にＬ428細胞系で発現される。それにも拘わらず、提供された血清学的データによってＣＭＲＦ-56抗原のエピトープはＣＭＲＦ-44抗原と明確に識別される。血清学的値でＣＭＲＦ-56抗原に幾らか一致しているＣＤ83抗原は、細胞表面タンパク質がＣＭＲＦ-56抗原と関係なくキャップを形成するのでＣＭＲＦ-56と明確に識別される。ｍＡｂＣＭＲＦ-56がＣＤ83でトランスフェクションした細胞又は組換え物とは結合しないことを証明することによって、これら２つの抗原の明らかに異なる更なる性質の証拠が得られた。かくして、ｍＡｂＣＭＲＦ-56はＤＣに対する特異性を有している更なるｍＡｂとなる。

ＣＭＲＦ-56 ｍＡｂは、48時間の観察期間中サイトカイン又はＬＰＳで刺激した血中単球を標識しない。このためＣＭＲＦ-56 ｍＡｂは多分、拘束されたＤＣ前駆体から拘束された単球細胞を測定する試薬として特に有用なものとなる。ＣＭＲＦ-56抗原がＤＣ活性化／分化経路の１部として上方調節することは明白である。図５に示された上方調節の動力学によって、ＣＭＲＦ-56抗原はＣＤ83より後に発現されるが、48時間後に下方調節するように思われるＣＤ83より長く持続することが示唆される。

（産業上の適用）
本発明の抗体（該抗体は活性化抗原ＣＭＲＦ-56を認識しそしてこれと結合する）を使用できる多数の用途が存在する。このような用途には、（１）活性化されたＤＣの同定（診断目的）; 及び（２）活性化されたＤＣの精製／濃縮が含まれており、従ってこれらの用途は本発明の更なる特徴を表している。

本発明の代表的なｍＡｂＣＭＲＦ-56の診断適用には活性化されていない（ＣＭＲＦ-56陰性）ＤＣに対して活性化された（ＣＭＲＦ-56陽性）ＤＣを評価できることが含まれており、そしてこれは癌のような疾病の診断及び／又は治療における用途となろう。

このような適用では、当該技術分野で知られている任意の免疫学に基づくアッセイ方法は試料中の活性化されたＤＣ量を定量するために使用することができよう。このような方法はチーセン（Tijssen)²⁴に要約されており、例えば、なかんずくフローサイトメトリー、エリザ法、ＲＩＡ及び蛍光顕微鏡法である。

活性化されたＤＣの単離に関して、初期免疫学的試薬として抗体（又はそれらの結合フラグメント）を使用する任意の方法又は精製系をもう１度使用することができる。このような多数の方法が知られており、同様にこれらの方法を実施可能にする精製系も知られている。市販で入手できる精製系の１例は、米国ワシントン州のセルプロインク（CellPro, Inc.）から得られるアビジン・ビオチン免疫親和系²⁹である。米国特許5,215,927、5,225,353、5,262,334、5,240,856及び1992年4月30日に公開されたＰＣＴ/ＵＳ91/07646（これらは全て本明細書で参照する）も参照のこと。この系は標的細胞に向けたビオチン結合モノクローナル抗体及び固定化されたアビジンを含有するカラムを直接又は間接的に使用しており、そしてこの場合にはヒト末梢血液から、活性化されたヒト樹状細胞を抽出するように容易に適合させることができ、その際代表的なｍＡｂＣＭＲＦ-56を次のように使用する：
１．ヒト樹状細胞を含有するヒト末梢血液試料をビオチン結合ｍＡｂＣＭＲＦ-56と混合し、そしてインキュベートしてｍＡｂＣＭＲＦ-56/ヒトＤＣコンプレックスを形成させる。

２．インキュベーション後、アビジン被覆ビーズを充填したセルプロ連続流免疫吸着カラム中に上記混合物を導入し、ビオチンとアビジン間の強い親和性によってビオチン被覆ｍＡｂＣＭＲＦ-56を（これらが結合しているヒトＤＣと一緒に）アビジン被覆ビーズに接着させる。

３．上記混合物中に存在している望ましくない細胞を洗浄除去した後、捕獲され活性化されたヒトＤＣは静かに撹拌することによってカラムから取り出して使用するために入手できる。

初期抗体（活性化されたＤＣと結合する）としてのｍＡｂＣＭＲＦ-56とビオチン結合二次抗体（ｍＡｂＣＭＲＦ-56と結合する）を使用するというこの主題に関しては他の形態も使用することができる。

上記プロトコールに従ってｍＡｂＣＭＲＦ-56と混合する前にヒト末梢血液試料を処理して上記試料に含有されるＤＣが確実に活性化されるようにすべきであることが認められよう。これは、例えば、試料を一夜インキュベートして容易に達成することができる。

上記プロトコールでの使用においては、ｍＡｂＣＭＲＦ-56を多数の慣用の方法のうちの任意の方法でビオチン化することができる。例えば、ベレンソン（Berenson）等²⁹のビオチン結合法を使用することができる。

上記で概略した方法の考えられ且つ好ましい予備段階は勾配遠心法^25-27で試料中のＤＣを豊富化することである。この任意の豊富化段階では任意の適当な既知勾配媒体（例えば、アルブミン又はメトリザミド）を使用できるが、16時間培養したＴリンパ球欠失末梢血単核細胞に関連してニコデンツ培地（Nycomed Pharma、ノルウェー国オスロ）を使用することが好ましい^２８。本出願人は、この勾配を使用して、ＤＣに非常に富んだ低密度細胞集団が確実に得られることを見い出した。

アビジン・ビオチン免疫親和性クロマトグラフィーに加えて、樹状細胞の免疫選択に関する多数の他の手段があることは当該技術分野の熟練者に明白であろう。これらには、磁気ビーズ、フェロフルーイズ（ferrofluids)、ディップスティックス、ペトリ皿、及びｍＡｂＣＭＲＦ-56標識ＤＣと特異的に結合するように誘導し得る多種多様な他の固形相が含まれるが、これらに限定されない。

上記の方法又は他の任意の適当な方法でいったん精製／濃縮されると、この活性化されたＤＣは研究又は商業的適用で使用することができる。活性化されたＤＣの上記のような１つの潜在的な商業上の適用は、予防又は治療目的で疾病に対して保護的な抗原と一緒にされている免疫強化組成物の一部としてである。このような組成物は、保護的抗原に対して産生される免疫応答の速度と有効性の両方を高めると考えられる。

活性化されたＤＣの他の適用は当該技術分野の熟練者には勿論明白であろう。

ｍＡｂＣＭＲＦ-56のもう１つの意図された適用は、免疫抑制を誘導するために患者の活性化されたＤＣを標的化することにある。

上記の説明は代表例にすぎずそして本発明は上記説明に限定されないことが理解されよう。

（寄託）
ハイブリドーマＣＭＲＦ-56（骨髄腫細胞系ＮＳ-１を使用して産生された）は本発明の開示を補完するために寄託されている。寄託は米国菌培養収集所（ＡＴＣＣ)、米国 20852 メリーランド州ロックビルパークローンドライブ12301に1996年10月9日現在でなされた。ハイブリドーマＣＭＲＦ-56のＡＴＣＣ受理番号はＨＢ12202である。

ＡＴＣＣ寄託受領書の写しを添付する。

（参照文献）
１．Steinman, R.。M.1991年。樹状細胞系及びその免疫原性における役割。Ann. Rev. Immunol. 9:271。

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図１はｍＡｂＣＭＲＦ-56と血液及び扁桃白血球との反応性を示す。（Ａ）（ｉ）ｍＡｂＣＭＲＦ-56（黒）又はイソタイプ対照で染色した顆粒球の蛍光強度ヒストグラム。（ii）ＣＤ3、ＣＤ14、ＣＤ16及びＣＤ19-ＰＥに対してＣＭＲＦ-56で二重標識したＥＲ-ＰＢＭＣのドットプロット。（iii）ＣＤ3-ＰＥに対してＣＭＲＦ-56で二重標識したＥＲ⁺ＰＢＭＣのドットプロット。（Ｂ）ＣＤ19^- ＰＥに対してＣＭＲＦ-56、ＣＤ83又はＣＭＲＦ-44で二重標識して培養した（16時間、37℃）ＥＲ^-ＰＢＭＣのドットプロット。（Ｃ）ＣＤ19-ＰＥに対してＣＭＲＦ-56、ＣＤ83又はＣＭＲＦ-56で二重標識した扁桃ＥＲ-リンパ球のドットプロット。全ての場合において、示された陽性染色を表すゲートは陰性対照の染色に基づいて定められた。データは代表的な実験によるものである。図２は、ＣＭＲＦ-56及びＨＢ15（ＣＤ83）とヒト細胞系及びＣＤ83 Ｃos細胞トランスフェクション体との反応性を示す。（Ａ）ヒト細胞系Ｌ428及びＪurkatのデータは、イソタイプ対照（---）、ＣＭＲＦ-56又はＣＤ83（---）のどれかで標識した後に得られる免疫蛍光プロフィールとして示されており、そして６回実施した代表的な実験によるものである。陰性対照を超えるＣＭＲＦ-56及びＨＢ15標識化の強度（ＭＦI）はヒト細胞系の各ヒストグラムの右隅に示されている。（Ｂ）ＣＯＳ細胞トランスフェクション体のデータは対照トランスフェクション体（--）又はＣＤ83トランスフェクション体（---）のどちらかをＣＭＲＦ-56又はＣＤ83で標識した後に得られる免疫蛍光プロフィールとして示されている。データは３回実施した代表的な実験によるものである。図３はＣＭＲＦ-56抗原を特徴付けるものである。エリザ法で分析されるＣＭＲＦ-56、ＣＤ83及び陰性対照ｍＡｂとヒトＩg、ＣＤ83-Ig及びＣＤ83-ヒスチジンの結合。データはヒストグラムとして示され、そしてそれは３回実施した代表的な実験によるものである。図４は、直接単離したＤＣでのＣＭＲＦ-56の発現を示す。（Ａ）直接単離した血中ＤＣは培地中で０、３、６又は12時間培養し、その後ＤＲ-ＰＥに対してＣＭＲＦ-56、ＣＭＲＦ-44又はＣＤ83で二重標識して分析した。全ての場合において、示された陽性染色を表すゲートは陰性対照の染色に基づいて定められた。データは３回実施した代表的な実験によるものである。図５は、培養した低密度ＥＲ-ＰＢＭＣ調製物内でのＣＭＲＦ-56発現の分析を示す。（Ａ）ＰＥ抱合ＣＤ3、ＣＤ14、ＣＤ16及びＣＤ19 ｍＡｂの混合物に対してＣＭＲＦ-44、ＣＤ83又はＣＭＲＦ-56で二重標識した調製物のドットプロット。（Ｂ）ＣＭＲＦ-56 ビオチンに対してＣＤ83又はＣＭＲＦ-44で二重標識した調製物のドットプロット。全ての場合において、示された陽性染色を表すゲートは陰性対照の染色に基づいて定められた。（Ｃ）ＣＭＲＦ-56発現に基づいて低密度調製物を分離した後に実施した同種ＭＬＲ。非標識対照（◇）及び標識されたが分離されなかった対照と一緒にＣＭＲＦ-56陽性（△）及び陰性（▽）集団を同種Ｔリンパ球と共に５日間培養し、その後（3Ｈ）ＴdＲ取り込みを測定した。結果は３重複計数の平均値″ＳＥＭとして表されている。データは３回実施した代表的な実験によるものである。図６は、ＣＭＲＦ-56及びＣＤ83と（Ａ）単離ＬＣ（Ｂ）単離皮膚ＤＣ及び（Ｃ）インビトロ産生ＤＣとの反応性を示す。ＬＣ及び皮膚ＤＣ調製物は、ＨＬＡ-ＤＲに対してＣＭＲＦ-56、ＣＭＲＦ-44及びＣＤ83で二重標識した。インビトロで産生したＤＣはＣＤ14-ＰＥに対して抗-ＣＤlａ、ＣＭＲＦ-44及びＣＭＲＦ-56で二重標識した。全ての場合において、陽性染色を表すゲートは陰性対照の染色に基づいて定められた。各ドットプロットの右に示したパーセントは関連抗原を発現したＬＣ、皮膚ＤＣ又はインビトロ産生ＤＣのいずれかのパーセントを示す。データは各タイプの細胞調製物で３回実施した代表的な実験によるものである。図７は、インビトロ培養前後のＣＭＲＦ-56及びＣＤ83と単離ＳＦ-ＤＣ及び扁桃ＤＣとの反応性を示す。（Ａ）扁桃ＤＣと（Ｂ）ＳＦ-ＤＣの調製物は、培地での培養前及び培養16時間後にＨＬＡ-ＤＲ-ＰＥに対してＣＭＲＦ-56、ＣＤ83／ＦＩＴＣＳＡＭで二重標識した。全ての場合において、陽性染色を表すゲートは陰性対照の染色に基づいて定められた。データは各タイプのＤＣ調製物で３回実施した代表的な実験によるものである。

Claims

受理番号ＨＢ１２２０２で米国菌培養収集所（ＡＴＣＣ）に寄託されたハイブリドーマＣＭＲＦ−56によって産生された抗体または抗体結合フラグメントであって、活性化抗原ＣＭＲＦ−56のエピトープと結合する、抗体または抗体結合フラグメント。
モノクローナル抗体ＣＭＲＦ−56である、請求項１に記載の抗体。
抗原ＣＭＲＦ−44およびＣＤ83とは結合しない、請求項１または２に記載の抗体。
ハイブリドーマ細胞系ＣＭＲＦ−56（ＡＴＣＣＨＢ１２２０２）。
ハイブリドーマ細胞系ＣＭＲＦ-56（ＡＴＣＣＨＢ１２２０２）によって分泌されそして活性化されたヒト樹状細胞のエピトープと特異的に結合するが活性化抗原ＣＭＲＦ-44及びＣＤ83とは結合しないモノクローナル抗体ＣＭＲＦ-56。
活性化された樹状細胞を含有する試料からこのような樹状細胞を精製する方法であって、該方法は：
（ｉ）上記試料を請求項１〜３および５のいずれか１項に記載された抗体または抗体結合フラグメントと接触させ；そして
（ｉｉ）上記抗体または抗体結合フラグメントと結合している活性化された樹状細胞を回収する、
段階を含んでいる、方法。
試料中の活性化された樹状細胞を同定する方法であって、該方法は：
（ｉ）上記試料を請求項１〜３および５のいずれか１項に記載の抗体または抗体結合フラグメントと接触させて抗体／活性化樹状細胞コンプレックスを形成させ；そして
（ｉｉ）抗体／樹状細胞コンプレックスの存在を検出する、
段階を含んでいる、方法。
抗体ＣＭＲＦ−56がビオチン化されている請求項７に記載の方法。
活性化された樹状細胞を含有している試料からこのような樹状細胞を精製および／または濃縮する際に使用される精製システムであって、請求項１〜３および５のいずれか１項に記載の抗体または抗体結合フラグメントを含んでいる、精製システム。
抗体ＣＭＲＦ−56がビオチン化されている請求項９に記載の精製システム。
請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法によってそして／又は請求項９または１０に記載の精製システムを使用して精製及び／又は濃縮された活性化された樹状細胞。
活性化された樹状細胞の診断マーカーとして使用される請求項１〜３および５のいずれか１項に記載の抗体を含んでいるアッセイキット。
請求項１〜３および５のいずれか１項に記載の抗体または抗体結合フラグメントを含んでいる組成物。
抗原をさらに含んでいる請求項１３に記載の組成物。
活性化された樹状細胞をさらに含んでいる請求項１３または１４に記載の組成物。
請求項１１に記載の活性化された樹状細胞と、動物が罹り得る疾患に対する保護免疫学的応答を生じさせ得る少なくとも１つの抗原とを含んでいる組成物。
免疫を強化する際の使用のための、請求項１に記載の抗体を含んでいる薬剤。