JP2008048644A - 培養器具及び培養装置 - Google Patents

Abstract

【課題】コンタミを抑制することができる培養器具を提供する。
【解決手段】プレート３１上にほぼ密閉状態の培養容器４１とほぼ密閉状態の密閉容器５１，５２，５３，５４とを設ける。密閉容器５１，５２，５３，５４をチューブ９１，９２，９３，９４，９５を介して培養容器４１に接続する。チューブ９１，９２，９３，９４，９５に、チューブ９１，９２，９３，９４，９５内の流体の流通を制御する三方活栓７１，７２，７３を設ける。
【選択図】図１

Description

この発明は培養器具及び培養装置に関する。

従来、いわゆるコンタミ（contaminationの略語）を防止するために、培地交換、継代、回収等の作業を自動的に行う自動培養装置が知られている（下記特許文献１参照）。

この自動培養装置は、インキュベータとＸＹＺステージとロボットアームと分注ステージとを備える。

インキュベータはその内部の環境をほぼ一定に保つ。

ＸＹＺステージはインキュベータ内に配置され、ＸＹＺ方向へ移動可能である。ＸＹＺステージには培養容器が配置される。培養容器は培養容器本体と培養容器蓋とを有する。

ロボットアームはＸＹＺステージと分注ステージとの間で培養容器を搬送する。

分注ステージ上では、分注機構によって培地交換、継代、回収等の作業が自動的に行われる。
特開２００４−２２９６１９号公報

上述の自動培養装置では培地交換等のとき、培養容器本体から培養容器蓋を外す。このときに、微生物類が混入する虞があり、コンタミを避けられない。

この発明はこのような事情に鑑みてなされたもので、その課題はコンタミを抑制することができる培養器具及び培養装置を提供することである。

前述の課題を解決するため請求項１の発明の培養器具は、プレートと、前記プレート上に設けられ、培養液と培養細胞を収容する培養容器と、前記プレート上に設けられると共に前記培養容器にチューブを介して接続され、前記培養液の回収あるいは新しい培養液を供給する密閉容器と、前記チューブに設けられ、前記チューブ内の流体の流通を制御する弁とを備えていることを特徴とする。

請求項２の発明は、請求項１記載の培養器具において、前記密閉容器がその内部容積を変化させる伸縮部を有することを特徴とする。

請求項３の発明は、請求項２記載の培養器具において、前記密閉容器は、前記新しい培養液を供給する第１密閉容器と、古い前記培養液を回収する第２密閉容器とを有することを特徴とする。

請求項４の発明は、請求項１、２又は３記載の培養器具において、前記培養容器に注射針を挿抜可能な複数の栓を設けたことを特徴とする。

請求項５の発明の培養器具は、プレートと、前記プレート上に設けられ、培養液と培養細胞を収容する培養容器と、前記プレート上に設けられ、前記培養容器に通じた前記培養容器内の環境条件のうちの少なくとも１つの条件をほぼ一定に保つための薬剤を収容する薬剤用密閉容器とを備えたことを特徴とする。

請求項６の発明の培養器具は、培養容器と、この培養容器内の複数の環境条件のうちの少なくとも１つの条件をほぼ一定に保つための薬剤とを纏めて密封することを特徴とする。

請求項７の発明の培養装置は、チャンバと、このチャンバ内に配置された観察装置と、前記チャンバ内に設けられた棚と、前記観察装置と前記棚との間で請求項１〜５のいずれか１項記載の培養器具を搬送する搬送装置と、前記チャンバ内に設けられ、前記搬送装置により前記培養器具が動くことによって前記密閉容器の一部を押圧する押圧部と、前記チャンバ内に設けられ、前記搬送装置により前記培養器具が動くことによって前記密閉容器の一部を引っ掛けて前記密閉容器を伸長させる係合部とを備えていることを特徴とする。

この発明によれば、コンタミを抑制することができる。

また、コンタミを抑制しつつ、安価に培地交換、継代が可能な自動培養装置及びその容器を提供できる。

以下、この発明の第１〜第４実施の形態を図面に基づいて説明する。
（第１実施形態）
図１はこの発明の第１実施形態に係る培養器具を示し、同図（ａ）は平面図、同図（ｂ）は正面図、同図（ｃ）は側方から見た断面を示す概念図、同図（ｄ）は同図（ａ）に示す小分け用取出し口の下にシャーレを配置した状態を示す図、同図（ｅ）は同図（ａ）に小分け用取出し口をシャーレにセットした状態を示す図である。なお、同図（ｄ）、（ｅ）中に小分け用取出し口６１の断面が示されている。

図１に示すように、培養器具１はプレート３１と培養容器４１と第１〜第４密閉容器５１〜５４と小分け用取出し口６１と第１〜第３三方活栓（弁）７１〜７３とを備えている。培養器具１の大きさは大きくとも２５０ｍｍ角程度の大きさであり、後述する自動培養装置内に収容して搬送等が可能な大きさである。

プレート３１は透明な合成樹脂で形成され、剛性を有する。培養容器４１、第１〜４密閉容器５１〜５４等は後述のようにプレート３１上に配置されているので、プレート３１を搬送することは、培養器具１全体を搬送することになる。

培養容器４１はプレート３１上に配置され、少なくともその上下部分はポリスチレン等の透明な素材で形成されている。但し、培養容器４１内で細胞が呼吸活動を行うため、培養容器４１の一部に疎水性のポリ四弗化エチレンのメンブランフィルタ（図示せず）を付け、ガス交換を可能としている。また、培養容器４１内の底面には細胞が接着しやすいように、表面処理が施されている。

培養容器４１は接続口４１ａ，４１ｂを有する。また、培養容器４１は孔４１ｃを有する。孔４１ｃは栓４２で塞がれている。栓４２はシリコンゴム等のゴム素材で形成されている。

第１〜第４密閉容器５１〜５４はプレート３１上に配置されている。第１〜第４密閉容器５１〜５４は柔軟性を有する合成樹脂で形成され、それぞれ蛇腹部（伸縮部）５１ａ〜５４ａを有している。蛇腹部５１ａ〜５４ａが伸縮することによって第１〜第４密閉容器５１〜５４の容積が変化する。

第１密閉容器５１は新しい培地（培養液）を保管するための容器である。第１密閉容器５１は２つの接続口５１ｂ，５１ｃを有する。

第２密閉容器５２は廃液（古い培地）を回収又は保管するための容器である。第２密閉容器５２は１つの接続口５２ｂを有する。第２密閉容器５２の上面には取手５２ｃが取り付けられている。

第３密閉容器５３は薬剤、例えばＰＢＳ（リン酸緩衝液）を保管するための容器である。第３密閉容器５３は１つの接続口５３ｂを有する。

第４密閉容器５４は薬剤、例えばトリプシンを保管するための容器である。第４密閉容器５４は１つの接続口５４ｂを有する。

小分け取出し口６１はシャーレ受け６２と蓋６３とで構成されている。シャーレ受け６２はプレート３１に形成された凹部３１ａに配置されている。シャーレ受け６２はシャーレ２１を保持する。蓋６３はシャーレ受け６２の上方に配置されている。蓋６３は接続口６３ａ，６３ｂを有する。蓋６３はシリコンゴム等の弾性材料で形成され、接続口６３ａ，６３ｂは剛性のあるチューブで構成されている。蓋６３はシャーレ２１の開口を塞ぐ。

第１三方活栓７１は接続口７１ａ，７１ｂ，７１ｃを有する。第２三方活栓７２は接続口７２，７２ｂ，７２ｃを有する。第３三方活栓７３は７３ａ，７３ｂ，７３ｃを有する。

第１三方活栓７１の接続口７１ａはチューブ９１を介して第３三方活栓７３の接続口７３ａに接続されている。第１三方活栓７１の接続口７１ｂはチューブ９２を介して第１密閉容器５１の接続口５１ｂに接続されている。第１三方活栓７１の接続口７１ｃは培養容器４１の接続口４１ａに接続されている。

第２三方活栓７２の接続口７２ａはチューブ９３を介して第２密閉容器５２の接続口５２ｂに接続されている。第２三方活栓７２の接続口７２ｂは培養容器４１の接続口４１ｂに接続されている。第２三方活栓７２の接続口７２ｃはチューブ９４を介して蓋６３の接続口６３ａに接続されている。

第３三方活栓７３の接続口７３ｂはチューブ９５を介して第４密閉容器５４の接続口５４ｂに接続されている。

第３三方活栓７３の接続口７３ｃは、第３密閉容器５３の接続口５３ｂに接続される。

プレート３１上には弁８１が配置されている。弁８１は接続口８１ａ，８１ｂを有する。接続口８１ａは第１密閉容器５１の接続口５１ｃに接続され、接続口８１ｂは小分け取出し口６１の接続口６３ｂに接続されている。

細胞培養は、まず、培養容器４１に培養する細胞を入れるところから始まる。培養容器４１の孔４１ｃを塞ぐ栓４２に注射器針を突き刺して、培養細胞の入った培地を培養容器４１内に注入する。これにより、培養容器４１内にコンタミ源となる物質が混入するのを抑制できる。

培養容器４１内に撒かれた細胞は時間が経過すると培養容器４１内の底面に接着し、増殖を開始する。培養容器４１の少なくとも上下部は透明な素材で形成されているため、その内部の細胞の様子を位相差観察法やその他の観察方法で観察可能である。

培養器具１を自動培養装置内の適切な環境下で保管することにより、培養容器４１内の培養細胞は増殖する。その結果として培養容器４１内の培地（培養液）の栄養成分は減少し、また培養細胞から排出された老廃物が培地内に増加する。これを確認したとき、培地交換を行う。

培地交換においては、まず、第２三方活栓７２を切り替えて培養容器４１と第２密閉容器５２とを結ぶ通路を開放し、培養容器４１から古い培地（培養液）を第２密閉容器５２に排出する。第２密閉容器５２は蛇腹部５２ａを有するので、取手５２ｃを引き上げることで、蛇腹部５２ａが伸長して第２密閉容器５２内が陰圧となり、培養容器４１内の古い培地を吸い出すことが可能である。この際、培養容器４１内の古い培地を効率良く吸い出すために、培養器具１全体を第２密閉容器５２側へ傾けるとよい。

次に、第１三方活栓７１を切り替えて第１密閉容器５１と培養容器４１とを結ぶ通路を開放し、第１密閉容器５１から新しい培地を必要量だけ培養容器４１内に入れる。第１密閉容器５１も蛇腹部５１ａを有するので、外部より第１密閉容器５１の上面を押すことで、蛇腹部５１ａが収縮して第１密閉容器５１内が陽圧となり、培養容器４１内に培地を供給することが可能である。

以上の作業によって培地交換が行われる。

培養器具１によれば、培養容器４１から必要な量だけ細胞を取り出し、実験・凍結等の作業を行うことが可能である。

実験・凍結等のために培養容器４１から一定量の細胞を取り出して継代を行いたい場合、まず、第２三方活栓７２を切り替えて第２密閉容器５２と培養容器４１とを結ぶ通路を開放し、第２密閉容器５２を伸長させて培養容器４１内の古い培地を吸い出す。次に、第１三方活栓７１を切り替えて第３密閉容器５３と培養容器４１とを結ぶ通路を開放する。その後、第３密閉容器５３の上面を押し込んで第３密閉容器５３内を陽圧にし、ＰＢＳを培養容器４１内に注入し、培地内のたんぱく質を非動化する。

次に、培養容器４１内のＰＢＳを第２密閉容器５２で吸い出す。

その後、第３三方活栓７３を切り替えて第４密閉容器５４と培養容器４１とを結ぶ通路を開放にする。その後、第４密閉容器５４の上面を押し込んで、培養容器４１内にトリプシンを注入し、培養容器４１内全体をトリプシン処理する。その処理後、すぐにトリプシンを第２密閉容器５２で吸い出す。

トリプシン処理によって細胞が培養容器４１から剥がれるのを確認したら、第１三方活栓７１を切り替えて第１密閉容器５１と培養容器４１とを結ぶ通路を開放し、第１密閉容器５１の上面を押し込んで、培地を培養容器４１内に注入する。剥がれた細胞が培地中に浮遊したら、第２三方活栓７２を切り替えて培養容器４１と小分け用取出し口６３とを結ぶ通路を開放し、培養容器４１の上面を押圧し、小分け用取出し口６３に取り付けたシャーレ２１に細胞を含んだ培地を小分けする（培養容器４１を押圧する代わりに、第１密閉容器５１を押圧して新たな培地を供給するとともに、この培地によって細胞が浮遊した培地を小分け用取り出し口６３へ押し出すようにしてもよい。）。その後、弁８を開きシャーレ２１に培地を追加する。

この後、すぐにシャーレ２１を取り出し、改めて多くの他の容器に小分けし、それを冷凍してもよいし、そのままシャーレ２１に接着するのを待ってから実験に用いてもよい。

この実施形態では、第３密閉容器５３にＰＢＳを入れ、第４密閉容器５４にトリプシンを入れたが、もちろんこれらの第３、第４密閉容器５３，５４には細胞の薬効確認のためにさまざまな薬剤を入れ、自動投与させることも可能である。

上述の第１、第３、第４密閉容器５１，５３，５４の上面を押圧する作業や、第２密閉容器５２の取手５２ｃを引き上げる作業は次に説明する培養装置では自動的に実行される。

図２は図１に示す培養器具を用いる培養装置の概念図である。

この培養装置は恒温及び恒湿の雰囲気に維持されるチャンバ２１１を有している。

チャンバ２１１内には、スタッカー２１３、搬送装置２１５及び観察装置２１７が
配置されている。

スタッカー２１３は基台２１９上に配置され、棚２１３ａにより上下方向に仕切られている。棚２１３ａにはホルダ２２１が載置されている。各ホルダ２２１は同一の形状及び大きさである。各ホルダ２２１には、細胞を培養する第１実施形態の培養器具１が保持部材（図示せず）を介して保持されている。

搬送装置２１５は基台２１９上に配置されるフレーム２２５を有している。フレーム２２５の中心には上下方向へ延びる螺子軸２２７が配置されている。螺子軸２２７には移動部材２２９が螺合されており、第１のモータ２３１により螺子軸２２７を回転させると、移動部材２９９が上下方向へ移動する。移動部材２２９の下側には、移動部材２２９とともに上下方向へ移動する搬送アーム２３３が配置されている。この搬送アーム２３３は第２のモータ２３５により作動される駆動機構（図示せず）により水平方向へ移動可能である。

観察装置２１７は基台２３７上に配置される顕微鏡２３９を有している。この顕微鏡２３９は比較的倍率の低い簡易型の顕微鏡である。基台２３７上には搬送アーム２３３により搬送されたホルダ２２１を載置する試料台２４１が配置されている。この試料台２４１は水平方向（Ｘ及びＹ方向）へ移動できる。この試料台２４１に培養器具１をホルダ２２１とともに載置することにより、培養器具１の培養容器４１内の細胞を観察することができる。

チャンバ２１１の側面の顕微鏡２３９の上方となる位置には、搬出入口２４３が形成されている。この搬出入口２４３には第３のモータ２４５により開閉されるドア２４７が設けられている。搬出入口２４３にはホルダ２２１を載置する載置部２４９が設けられている。この載置部２４９にはホルダ２２１の有無を検出するセンサ２５１が設けられている。このセンサ２５１は載置部２４９にホルダ２１が載置されたとき検出信号を出力する。

チャンバ２１１の外部には、搬出入口２４３から搬入される培養容器の種類、培養容器で培養される細胞の種類、状態等を入力する情報入力部２５３が設置されている。この情報入力部２５３は液晶表示部２５５及びタッチセンサ（図示せず）を有している。また、情報入力部２５３には搬送アーム２３３の搬送速度等を制御する制御部２５７が接続されている。この制御部２５７は第１及び第２のモータ２３１，２３５の回転数を制御して搬送アーム２３３の搬送速度を制御する。また、第の３モータ２４５を駆動してドア２４７の開閉を行う。

搬送装置２１５のフレーム２２５には棒（押圧部）２６１と鉤（係合部）２６２とが設けられている。

上述のように、培養器具１の第１密閉容器５１の上面を押圧するには、まず、搬送アーム２３３により、第１密閉容器５１を棒２６１の下方に位置させる。その後、移動部材２２９を上方に移動させる。その結果、棒２６１は相対的に下方へ移動し、第１密閉容器５１の上面を押圧し、第１密閉容器５１の蛇腹部５１ａは収縮する。

第３、第４密閉容器５３，５４の上面も第１密閉容器５１と同様にして押圧することができる。

第２密閉容器５２を伸長させるには、搬送アーム２３３により、第２密閉容器５２の取手５２ｃを鉤２６２に引っ掛ける。その後、移動部材２２９を下方へ移動させる。その結果、鉤２６２は相対的に上方へ移動し、取手５２ｃが引き上げられ、第２密閉容器５２の蛇腹部５２ａが伸長する。

第１〜３三方活栓７１〜７３も棒２６１や鉤２６２の相対的な動きにより、切り替えることができる。

第１実施形態は、第１〜第４の密閉容器５１〜５４を一つのプレート３１上に全て配置した例であるが、必ずしも全ての密閉容器をプレート上に配置する必要はなく、必要に応じて少なくとも一つの密閉容器を配置すればよい。

第１実施形態によれば、培地交換や継代等のときに、培養容器４１が外界に曝されることがないので、コンタミを抑制することができる。

（第２実施形態）
図３はこの発明の第２実施形態に係る培養器具を示し、同図（ａ）は平面図、同図（ｂ）は正面図、同図（ｃ）は側方から見た断面を示す概念図である。

第１実施形態と共通する部分については同一符号を付してその説明を省略する。以下、主な相違部分についてだけ説明する。

第２実施形態では、培養容器２４１の上面にほぼ等間隔に栓２４１ｄを設けた。栓２４１ｄはシリコンゴムで形成されており、注射針（図示せず）を刺すことができ、また、注射針を抜けば、注射針によって開けられた孔は自然と閉じる。

第２実施形態によれば、第１実施形態と同様の効果を得ることができるとともに、継代のときに、任意の栓２４１ｄに注射針（図示せず）を刺し、この注射針を通じて培養容器２４１の特定の場所に接着した細胞（図示せず）に必要な量だけトリプシンを投与することができる。これにより、所望の細胞を必要な量だけ継代することができる。

（第３実施形態）
図４はこの発明の第３実施形態に係る培養器具を示し、同図（ａ）は平面図、同図（ｂ）は正面図、同図（ｃ）は側方から見た断面を示す概念図である。

第１実施形態と共通する部分については同一符号を付してその説明を省略する。以下、主な相違部分についてだけ説明する。

第３実施形態では、プレート３３１上に第５密閉容器（薬剤用密閉容器）３５５を配置した。第５密閉容器３５５は通路３５５ａを介して培養容器３４１に通じている。第５密閉容器３５５には二酸化炭素供給剤３２２が収容されている。

第３実施形態によれば、第１実施形態と同様の効果を得ることができるとともに、培養容器３４１内のＣｏ2の濃度をほぼ一定に保つことができる。

（第４実施形態）
図５はこの発明の第４実施形態に係る培養器具を示し、同図（ａ）は平面図、同図（ｂ）は正面から見た断面を示す概念図である。

培養器具４０１は筐体４２３と蓋４２４とを備える。筐体４２３内には仕切り４２３ａが設けられ、仕切り４２３ａにより筐体４２３の内部は培養容器収容室４２３ｂと薬剤収容室４２３ｃとに仕切られる。培養容器収容室４２３ｂ内には４つのシャーレ（培養容器）４２１が収容されている。薬剤収容室４２３ｃには二酸化炭素供給剤（図示せず）が収容されている。

蓋４２４は筐体４２３の開口を密閉する。

第４実施形態では、培地交換、継代等をできないが、細胞の生存に必要な環境を維持することができ、第１実施形態と同様に、コンタミを抑制することができる。

なお、上述の各実施形態では、第３密閉容器５３にＰＢＳを収容し、第４密閉容器５４にトリプシンを収容したが、これらの密閉容器５３，５４には他の薬剤を収容してもよい。

図１はこの発明の第１実施形態に係る培養器具を示す図である。 図２は図１に示す培養器具を用いる培養装置の概念図である。 図３はこの発明の第２実施形態に係る培養器具を示す図である。 図４はこの発明の第３実施形態に係る培養器具を示す図である。 図５はこの発明の第４実施形態に係る培養器具を示す図である。

符号の説明

１，２０１，３０１，４０１：培養器具、３１，３３１：プレート、４１：培養容器、５１，５２，５３，５４：密閉容器、７１，７２，７３：三方活栓（弁）、９１，９２，９３，９４，９５：チューブ、３５５：第１密閉容器（薬剤用密閉容器）、４２３：筐体、４２３ｂ：培養容器収容室、４２３ｃ：薬剤収容室、４２１：シャーレ（培養容器）、２１１：チャンバ、２１７：観察装置、２１３ａ：棚、２１５：搬送装置、２６１：棒（押圧部）、２６２：鉤（係合部）。

Claims (7)

1. プレートと、
   前記プレート上に設けられ、培養液と培養細胞を収容する培養容器と、
   前記プレート上に設けられると共に前記培養容器にチューブを介して接続され、前記培養液の回収あるいは新しい培養液を供給する密閉容器と、
   前記チューブに設けられ、前記チューブ内の流体の流通を制御する弁と
   を備えていることを特徴とする培養器具。
2. 前記密閉容器がその内部容積を変化させる伸縮部を有することを特徴とする請求項１記載の培養器具。
3. 前記密閉容器は、前記新しい培養液を供給する第１密閉容器と、古い前記培養液を回収する第２密閉容器とを有することを特徴とする請求項２記載の培養器具。
4. 前記培養容器に注射針を挿抜可能な複数の栓を設けたことを特徴とする請求項１、２又は３記載の培養器具。
5. プレートと、
   前記プレート上に設けられ、培養液と培養細胞を収容する培養容器と、
   前記プレート上に設けられ、前記培養容器に通じた前記培養容器内の環境条件のうちの少なくとも１つの条件をほぼ一定に保つための薬剤を収容する薬剤用密閉容器と
   を備えたことを特徴とする培養器具。
6. 培養容器と、この培養容器内の複数の環境条件のうちの少なくとも１つの条件をほぼ一定に保つための薬剤とを纏めて密封することを特徴とする培養器具。
7. チャンバと、
   このチャンバ内に配置された観察装置と、
   前記チャンバ内に設けられた棚と、
   前記観察装置と前記棚との間で請求項１〜５のいずれか１項記載の培養器具を搬送する搬送装置と、
   前記チャンバ内に設けられ、前記搬送装置により前記培養器具が動くことによって前記密閉容器の一部を押圧する押圧部と、
   前記チャンバ内に設けられ、前記搬送装置により前記培養器具が動くことによって前記密閉容器の一部を引っ掛けて前記密閉容器を伸長させる係合部と
   を備えていることを特徴とする培養装置。

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