JP2006524489A - Ｓｐｅｘ組成物および使用方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、脾臓組織で発現されるものとして同定され、リンパ球活性および免疫応答に関連した新規ポリペプチドおよび他の因子を提供する。これらの化合物を、本明細書ではＳＰＥＸ化合物と称す。ＳＰＥＸポリペプチドおよびポリヌクレオチドのヒトおよびマウス相同体が、２種のマウス対立遺伝子を含めて提供される。さらに本発明は、ポリペプチドコード化するポリヌクレオチドおよびその相補的核酸配列をを提供する。また、ＳＰＥＸポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する免疫原、発現ベクターおよび抗体も提供される。本発明は、リンパ球活性の調節および免疫応答の調節における抗ＳＰＥＸ抗体の使用を開示している。

Description

発明の詳細な説明

本発明は、細胞コミュニケーション（情報伝達）およびシグナル変換の分野に関するものである。特に、本発明は、リンパ球発生、増殖および細胞分化決定に関連した新規ポリペプチドおよびポリヌクレオチド、免疫原、抗体、ベクター、宿主細胞、および他の組成物を提供し、またリンパ球活性化および免疫応答のモジュレーションという目的を含むそれらの使用方法を提供する。

ある種の細胞表面タンパク質は、細胞間接触を通して、また可溶性メディエーターについての受容体としての場合を含め、免疫応答のモジュレーションにおいて重大な役割を演じることが知られている。追加的免疫モジュレーション性タンパク質の同定および特性確認およびリンパ球発生および活性のモジュレーション方法は、自己免疫、癌、移植拒絶および炎症を含む広く多様な状態についての標的治療の開発にとって依然として重要なものである。

以下のポリヌクレオチドは、メリーランド２０８９４、ベセスダ、ロックビル・パイク、国立医学図書館（ＮＬＭ）の国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）により維持されているＧｅｎＢａｎｋデータベースに列挙されている：発現された配列標識ＡＡ１８４１８９およびＡＡ１７７３０２および細菌性人工染色体（ＢＡＣ）ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１（インサイト・ゲノミクス、パロアルト、カリフォルニア）、ＰＢｅｌｏＢＡＣ.２６０５６（インサイト）、およびＰＢｅｌｏＢＡＣ.２６０５７（インサイト）。

本発明は、一つには、本明細書でＳＰＥＸと称される細胞表面タンパク質をコード化する新規遺伝子を提供する。「ＳＰＥＸ」の名称は、脾臓組織で検出される高レベルのＳＰＥＸ発現を示す「脾臓発現（された）（ｓｐｌｅｅｎ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）」という句における各語の最初の２文字を短縮したものである。ある種の実施態様では、実質的完全長のＳＰＥＸポリペプチドは、リンパ球で発現される、シグナル変換受容体として特性確認されており、リンパ球増殖、分化、発生および／または細胞分化決定をモジュレーションし得る。好ましい実施態様では、ＳＰＥＸは、免疫応答の負の調節因子を含む。一例では、ＳＰＥＸ受容体の活性化により、リンパ球の代謝が阻害されるかまたは免疫応答が阻害される。別の例では、ＳＰＥＸ受容体の拮抗作用により、リンパ球の代謝が促進されるかまたは免疫応答が延長される。本明細書におけるある種の実施態様は、ＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応する抗体およびＳＰＥＸ受容体に拮抗することにより、ＳＰＥＸ受容体を発現するリンパ球に刺激を加える方法を提供する。

一実施態様において、本発明は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む多重ドメインポリペプチドを含むＳＰＥＸポリペプチドを提供する。細胞外ドメインは、好ましくはＳＰＥＸ免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインを含む。膜貫通ドメインは、好ましくは、細胞の脂質二重層、好ましくは細胞質膜および別法としてリポソームにＳＰＥＸポリペプチドを固定させている。ＳＰＥＸ細胞内ドメインは、好ましくは１個またはそれ以上、さらに好ましくは３個のチロシンベースドメインを含む。

一部、開示されたドメイン構造に基いて、一実施態様は、免疫グロブリンスーパーファミリーのＩ型細胞表面シグナル変換リンタンパク質を含むＳＰＥＸポリペプチドを提供する。

免疫グロブリンスーパーファミリーは、分子認識および接着に関与する多くの細胞表面タンパク質を含む多重遺伝子族である。Ｉｇ様ドメインは、保存されたコア構造を有する。配列解析を通して、本発明者らは、ＳＰＥＸ受容体分子の細胞外部分におけるＩｇ様ドメインを同定した。好ましいＳＰＥＸポリペプチドの例は、ヒトＳＰＥＸ（ｈＳＰＥＸ）の配列番号３、マウスＳＰＥＸ（ｍＳＰＥＸ）の配列番号４５、またはｍＳＰＥＸの第二対立遺伝子（本明細書ではｍＳＰＥＸｂと称す）の配列番号８８に示された配列を有するＩｇ様ドメインを含む。一実施態様において、ＳＰＥＸ Ｉｇ様ドメインは樹状細胞と特異的に結合する（例、樹状細胞における受容体／リガンドへのＳＰＥＸポリペプチドの特異的結合を通じて）。

リンタンパク質は別の多重遺伝子族である。リンタンパク質族は、分子認識および／またはシグナル変換に関与する多くの細胞表面タンパク質を包含する。リンタンパク質は、典型的には分子認識、リン酸化、脱リン酸化、およびシグナル変換に不可欠なシグナリングドメインを含む。ある種のＳＰＥＸポリペプチドは、１個またはそれ以上のチロシンベースドメインを含む。好ましい実施態様において、ＳＰＥＸチロシンベースドメインは、分子認識、リン酸化、脱リン酸化、および／またはシグナル変換活性を含む。例えば、一実施態様において、チロシンベースドメインを含むＳＰＥＸポリペプチドは、リン酸化および脱リン酸化され得るチロシン残基を含む。好ましいＳＰＥＸチロシンベースドメインの例には、配列番号７、配列番号９および配列番号１１が含まれる。

一部、ＳＰＥＸポリペプチドで同定されたＩｇ様およびリンタンパク質構造および／または本明細書で開示されているデータに基き、ある種の実施態様では、ＳＰＥＸ受容体がリンパ球機能をモジュレーションするものとする。ある種の実施態様は、ＳＰＥＸ受容体を含むリンパ球の代謝のモジュレーション方法であって、ＳＰＥＸ受容体の活性のモジュレーションを含む方法を提供する。一実施態様は、ＳＰＥＸ受容体を含むリンパ球の増殖のモジュレーション方法であって、ＳＰＥＸ受容体の細胞外ドメインと免疫反応する抗ＳＰＥＸ抗体とリンパ球を接触させることを含む方法を提供する。リンパ球の増殖、または増殖速度を増加させるのが好ましい。

ある種の実施態様では、ＳＰＥＸポリペプチドを含むリンパ球においてＳＰＥＸ活性を刺激することにより、リンパ球の増殖が阻害される（例、リンパ球に含まれるＳＰＥＸ受容体のリガンド結合）と考えられる。

本質的に完全長のＳＰＥＸアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドに加えて、その様々なドメインは、ＳＰＥＸ活性をモジュレーションする分子の製造方法において有用である。例えば、ＳＰＥＸ細胞外ドメインは、抗体産生に有用であり、またＳＰＥＸ活性およびリンパ球代謝をモジュレーションするのに有用である。またＳＰＥＸ細胞内ドメインは、結合パートナーを同定するのに有用であり、またＳＰＥＸリンタンパク質活性およびリンパ球代謝をモジュレーションするのに有用である。

本発明の一実施態様は、ＳＰＥＸポリペプチドをコード化する核酸配列、または核酸配列の相補体を含むＳＰＥＸポリヌクレオチドを提供する。さらなる実施態様は、ＳＰＥＸポリペプチドを同定するための核酸、ＳＰＥＸポリヌクレオチドを増幅するための核酸、およびベクター配列と機能し得るように結合されたＳＰＥＸポリヌクレオチドを提供する。ＳＰＥＸポリヌクレオチドは、例えば、インビトロおよびインビボを含むＳＰＥＸポリペプチドの製造方法において有用である。ＳＰＥＸポリヌクレオチドの発現に好ましい細胞は、Ｂ細胞およびＴ細胞を含むリンパ球を包含する。

一実施態様は、ＳＰＥＸポリペプチドをコード化する核酸、または核酸の相補体（ＳＰＥＸポリヌクレオチド）を含むＳＰＥＸベクターを提供し、その核酸はベクター配列に機能し得るように結合されている。ベクター配列は、ＳＰＥＸポリヌクレオチドの代謝を調節するのが好ましく、そしてベクター配列がＳＰＥＸポリヌクレオチドの発現を調節することが最も好ましい。

一実施態様は、異種配列に機能し得るように結合されたＳＰＥＸ配列を含むＳＰＥＸ融合配列を提供する。ある種の有用な異種配列の例には、検出標識、溶解度強化因子、および生物活性因子があるが、これらに限定はされない。

一実施態様は、ＳＰＥＸポリペプチドまたはＳＰＥＸポリヌクレオチドを含むＳＰＥＸ変異型配列を提供し、そのＳＰＥＸ配列は、本明細書で開示されている通り修飾または変異型を含む。ＳＰＥＸ変異型配列は、非修飾ＳＰＥＸ配列の構造的および／または機能的特性（すなわち活性）を含むのが好ましい。

一実施態様は、ＳＰＥＸ突然変異体配列（ポリペプチドまたはエンコーディングポリヌクレオチド）を提供する。好ましい実施態様は、チロシンベースドメインの突然変異（例、置換、欠失、先端切除）、さらに好ましくは、チロシンベースドメインのチロシンアミノ酸残基の突然変異を含むＳＰＥＸアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。チロシンベースドメインにおける突然変異は、ＳＰＥＸシグナル変換を阻害するのが好ましい。

別の実施態様は、ＳＰＥＸベクターを含む宿主細胞（ＳＰＥＸ宿主細胞）を提供する。ＳＰＥＸ宿主細胞は、例えば、ＳＰＥＸポリペプチドの製造方法において有用である。別の例では、ＳＰＥＸ宿主細胞は、リンパ球代謝およびＳＰＥＸ活性化および／または阻害のモジュレーションによる場合を含むそのモジュレーションの試験において有用である。

一実施態様は、本発明のＳＰＥＸポリペプチドと免疫反応する単離抗体またはそのフラグメントを提供する。一実施態様において、抗ＳＰＥＸ抗体は、ＳＰＥＸポリペプチドを発現する免疫細胞の活性をモジュレーションする。好ましい実施態様において、抗ＳＰＥＸ抗体は、ＳＰＥＸポリペプチドを発現する哺乳類細胞、好ましくはリンパ球、および最も好ましくはＴ細胞、Ｂ細胞および／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）の増殖および／または分化を阻害する。

一実施態様は、ＳＰＥＸ結合パートナーを同定するための候補分子のスクリーニング方法であって、候補分子をＳＰＥＸポリペプチドと接触させ、候補分子およびＳＰＥＸポリペプチドが結合複合体を形成しているか否かを測定し、その際結合複合体の形成は、候補分子がＳＰＥＸ結合パートナーであることを示すものであり、そしてＳＰＥＸ結合パートナーが同定されるまでスクリーニング段階を続行することを含む方法を提供する。好ましい候補結合パートナー分子は、小分子有機化合物およびポリペプチドを包含する。スクリーニング検定法に好ましい標的には、ＳＰＥＸポリペプチド、およびさらに好ましくはＳＰＥＸ細胞外ドメイン、ＳＰＥＸ細胞内ドメイン、ＳＰＥＸ Ｉｇ様ドメイン、またはＳＰＥＸチロシンベースドメインがあるが、これらに限定はされない。一実施態様では、ＳＰＥＸポリペプチドまたはＳＰＥＸドメインのアンタゴニストが、ＳＰＥＸ受容体を含むリンパ球を活性化するものとする。別の実施態様では、ＳＰＥＸポリペプチドまたはＳＰＥＸドメインのアゴニストが、ＳＰＥＸ受容体を含むリンパ球の活性化を阻害するものとする。

一実施態様は、ＳＰＥＸポリペプチドを含む生物学的試料からのＳＰＥＸポリペプチドの精製方法であって、抗ＳＰＥＸ抗体をマトリックスに結合させたアフィニティーマトリックスと生物学的試料を接触させることにより、ＳＰＥＸポリペプチドおよびマトリックスに結合した抗体を含む免疫複合体を生成させ、マトリックスから生物学的試料の残りを分離し、抗ＳＰＥＸ抗体からＳＰＥＸポリペプチドを分離し、ＳＰＥＸポリペプチドを集める段階を含む方法を提供する。

一実施態様は、ＳＰＥＸ受容体ポリペプチドを発現するリンパ球の代謝、好ましくは増殖のモジュレーション方法であって、ＳＰＥＸ受容体ポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応する抗ＳＰＥＸ抗体とＳＰＥＸ受容体ポリペプチドを発現するリンパ球とを接触させることにより、リンパ球の代謝をモジュレーションする方法を提供する。好ましいリンパ球にはＢ細胞およびＴ細胞がある。

図面は、本発明の明細書の一部分を構成する。
図１は、細胞外、膜貫通（斜線部）および細胞内ドメイン（標識通り）を有する実質的に完全長のマウスおよびヒトＳＰＥＸポリペプチド（それぞれ、ｍＳＰＥＸおよびｈＳＰＥＸ）の図である。細胞外ドメインは各々、免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン（水平線）を含み、所望により開裂可能なシグナル配列（ダッシュ領域）を有していてもよく、矢印は開裂部位を指す。シグナル配列は、翻訳後プロセシング中に開裂され、成熟ＳＰＥＸポリペプチドを生じさせる。細胞内ドメインは各々、３個のチロシンに基くモチーフを含む（垂直線）。また、チロシンに基く各ドメインは、チロシンアミノ酸残基を含む（Ｙは、チロシンについての１文字コードである）。示された実施態様は、チロシンが所望によりリン酸化され得ることを描いている（円で囲んだＰ）。生体膜におけるＳＰＥＸポリペプチドの相対位置が示されている。点描領域は、ある種の機能性ドメイン間における各ポリペプチドの部分を示す。

図２Ａは、選択されたｈＳＰＥＸポリペプチドおよび選択された各ポリペプチドに関するそれぞれの配列間の対応関係の実例を示す図である。

図２Ｂは、選択されたｈＳＰＥＸポリヌクレオチドおよび選択された各ポリヌクレオチドに関するそれぞれの配列間の対応関係の実例を示す図である。

図２Ｃは、選択されたｍＳＰＥＸポリペプチドおよび選択された各ポリペプチドに関するそれぞれの配列間の対応関係のある種の実例を示す図である。

図２Ｄは、選択されたｍＳＰＥＸポリヌクレオチドおよび選択された各ポリヌクレオチドに関するそれぞれの配列間の対応関係のある種の実例を示す図である。

図３は、モノクローナル抗体ＰＫ１８がＴ細胞活性化を阻害することを立証する４つのグラフ（パネル１〜４）を示す。ＬＮ Ｔ細胞を、Ｂ１０.ＢＲおよびＢＡＬＢ.Ｋマウスから精製し、抗ＣＤ３およびラットＩｇ（白抜き記号）または抗ＣＤ３およびＰＫ１８（黒塗り記号）の混合物でコーティングした９６ウェルプレートにおいて培養した。データを、トリプリケイト培養物の平均３Ｈ−ＴｄＲ（トリチウム化チミジン）取り込み（＋／−標準偏差）マイナスＴ細胞単独培養物の取り込みの１分間当たりの放射能カウント数（ｃｐｍ）として表す（１５００ｃｐｍ未満）。Ｔ細胞のＤＮＡへの３Ｈ−ＴｄＲの組込みは、Ｔ細胞の増殖およびＴ細胞活性化の両方と相関関係を示す。

ＳＰＥＸ
本発明者らは、一つには、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を同定しており、その発現は、インビボ胸腺細胞発生プログラムのモデリングに使用される薬理学的活性化因子で胸腺細胞を刺激することにより実質的に高められる（すなわち、胸腺細胞に刺激を加えることにより増殖および／または分化させる、実施例１参照）。このｍＲＮＡを本明細書では「ＳＰＥＸ ｍＲＮＡ」と称す。さらに本発明者らは、ＳＰＥＸ ｍＲＮＡに対応するかまたはそれによりコード化される遺伝子、ｃＤＮＡおよびポリペプチドを同定した。従って、上記ＳＰＥＸポリヌクレオチドおよびそのＳＰＥＸ発現産物は、本明細書では例えばＳＰＥＸ遺伝子、ＳＰＥＸ ｃＤＮＡ、ＳＰＥＸ ｍＲＮＡ、ＳＰＥＸアンチセンス核酸、およびＳＰＥＸポリペプチドとして称される。

本発明の開示によると、ＳＰＥＸはＴおよびＢ細胞の両方により発現され、典型的にはＢ細胞での発現の方がＴ細胞での発現よりも多大である。ＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞の活性化により、Ｔ細胞でのＳＰＥＸ発現はアップレギュレーションされる。Ｂ細胞の活性化により、Ｂ細胞におけるＳＰＥＸ発現はダウンレギュレーションされる。ＳＰＥＸは、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞、γδＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）を発現するＴ細胞、およびＣＤ２５＋ＣＤ４＋調節Ｔ細胞により発現される。ＳＰＥＸは、ダブルポジティブからシングルポジティブ段階への移行中に胸腺で誘導される。ＳＰＥＸは、骨髄におけるプロＢ細胞からプレＢ細胞へのトランジション中にアップレギュレーションされ、次いで未熟および成熟Ｂ細胞発達段階中にさらにアップレギュレーションされる。ＳＰＥＸは、成熟骨髄由来の樹状細胞で発現される。ＳＰＥＸ発現は、未熟骨髄由来の樹状細胞では低レベルないし非存在状態である。ＳＰＥＸ発現は、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞では低レベルないし非存在状態である。そしてＳＰＥＸは、脾臓における抗原提示細胞（マクロファージおよび樹状細胞を含む）で発現される。

一つには、本発明は、さらに組成物、例えばＳＰＥＸポリペプチドおよびＳＰＥＸポリヌクレオチド（ＳＰＥＸ発現ベクターを含む）、ＳＰＥＸポリペプチドと免疫反応する抗体、免疫原およびＳＰＥＸ宿主細胞を提供する。本発明はまた、ＳＰＥＸ組成物を用いることにより、例えばＳＰＥＸタンパク質結合パートナーを同定し、天然または組換え供給源からＳＰＥＸを単離し、リンパ球代謝をモジュレーションし、および／またはマーカーまたは単離標識としてＳＰＥＸを発現するリンパ球を識別、同定および／または精製する方法を提供する。

精製（された）の定義
本明細書で使用されている「単離された」および「精製された」の語は、互換的に使用され、興味の対象である特定化合物を他の汚染物質から分離することにより、毒性物質、例えば内毒素（所望により、必ずしも汚染物質とは限らない溶質、賦形剤、安定剤、緩衝液、塩類、医薬上許容される担体などを度外視してもよい）を含む不純物について不含有（すなわち、純粋）または本質的に不含有とすることを意味する。従って、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、免疫原、変異型、突然変異体、融合体（ポリペプチドまたはポリヌクレオチド融合体）、ベクター、宿主細胞、抗体などが精製形態であるのが好ましい。

本明細書で使用されているところによると、本発明の精製化合物を第二の精製化合物または物質と混合または組合わせたとき、生成した組成物は、「精製された」組成物（すなわち特定された成分を有する）とみなされる。

本発明を考慮に入れると、当業者であれば、タンパク質単離および精製についての標準技術を用いて本発明のポリペプチド（そのフラグメントを含む）を精製できるはずである。一般的に純粋なポリペプチドは、被る変化が限られている、非還元的ポリアクリルアミドゲルでは単一主要バンドを生じる。例えば、電気泳動ゲルにおいて空間的に近接した多重バンド（例、二重線または三重線のバンド）は、所定のアミノ酸配列を有するポリペプチドの翻訳後修飾（または他の）変異型の混合集団（例、ポリペプチドの集団の一部分は、リン酸化されているかまたは他の形で修飾されており、集団の別の部分は修飾を含まない）の存在から生じることが多い。その他、一遺伝子の対立遺伝子のポリペプチド遺伝子産物は、アミノ酸配列が異なり得る（例、遺伝子突然変異に起因）。本ポリペプチド遺伝子産物は、電気泳動中に差次的に移動し得、典型的には染色体遺伝子座の正常な相補体を伴う細胞で見出される２対立遺伝子に対応する２つのバンドを生じる。また、追加のバンドも考えられる（例、リン酸化状態の差異および／または翻訳後修飾タンパク質修飾、例えばグリコシル化に起因）。ゲルバンドを調べることにより、本発明を考慮に入れ、当業界でよく知られている一般的ポリペプチド配列決定技術、例えば配列決定（ペプチドまたはヌクレオチド）またはマススペクトル分析によってＳＰＥＸポリペプチドの内容物が決定され得る。

ポリペプチドの上記混合集団は、さらに、所望ならば（例、電荷、サイズ、親和力または当業界で公知の他の方法に基き）、等質に精製され得る（例、それにより純粋ポリペプチドを提供する）。また、上記集団は、集団におけるポリペプチドに修飾を加えるかまたは／同ポリペプチドから修飾を除去すべく処理され得る（例、リン酸化は、キナーゼにより付加されるかまたはホスファターゼを用いて除去され得、グリコシル化は、グリコシダーゼにより除去されるかまたはグリコシルトランスフェラーゼにより付加され得る）。ポリペプチドの純度はまた、例えばアミノ酸配列解析および／またはマススペクトル分析により測定され得る。

本発明を考慮に入れると、当業者であれば、核酸単離および精製についての標準技術を用いて本発明のポリヌクレオチドを精製し得るはずである。例えば、核酸は、標準核酸調製技術を用いてタンパク質、脂質、および他の化合物から除去され得る。核酸配列の混合集団は、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分解され得、興味の対象である特異的バンドが集められる。核酸は、配列特異的プローブを用いて同定および／または精製され得る。配列特異的プローブをマトリックスに付着させることにより、アフィニティークロマトグラフィーを通して興味の対象であるポリヌクレオチドが好都合に単離され得る。ポリヌクレオチドはまたクローニング技術を用いて精製され得、単一ポリヌクレオチドクローンを含む単一コロニーの選択後、標準技術を用いて宿主細胞から興味の対象である核酸が単離され得る。

本発明を考慮に入れると、当業者であれば、標準技術を用いて本発明抗体を精製できるはずである。ある種の方法には、抗原結合マトリックス（例、ＳＰＥＸポリペプチド結合マトリックス）に対するアフィニティー精製またはプロテインＡマトリックスに対する一般的抗体精製が含まれる。

本発明を考慮に入れると、当業者であれば、標準技術を用いて本発明の宿主細胞を精製できるはずである。ある種の方法には、宿主細胞に含まれる選択可能なマーカー遺伝子の使用を含む場合も含まない場合もあり得る希釈平板培養技術が含まれる。

ある種の実施態様において、本発明の精製ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、宿主細胞、または他の化合物を含む組成物は、さらに緩衝液、水、塩、医薬上許容される担体、アジュバント、融合体、標識、タッグ、マーカー、安定剤、アルブミンなど、および／またはタンパク質修飾（例、リン酸化またはグリコシル化）を含み得る。本発明の精製化合物はまた、上記薬剤の１種またはそれ以上を含み得るかまたは上記薬剤と共にパッケージされ、それでも依然として本明細書で使用されているところの「精製された」とみなされ得る（すなわち、これらの薬剤は、必ずしも汚染物質であるとは限らない）。本組成物は、精製された滅菌組成物であるのが好ましい。例えば、滅菌組成物は、滅菌条件下で本発明の精製された滅菌化合物を１種またはそれ以上の滅菌緩衝液、コンディショナー、担体、バルク、結合剤または安定剤と組合わせ、および／またはＳＰＥＸ化合物および薬剤を合わせた後に組成物を滅菌することにより製造され得る。

本発明の精製および／または滅菌ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体または組成物は、ヒトまたは他の哺乳類への投与時に有害な反応を誘導し得る内毒素または他の発熱物質および望ましくない刺激物を実質的に含まないのが好ましい。本ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体または組成物は乾燥（例、凍結乾燥）形態で提供され得、上記形態は塩、安定剤などを所望に応じて含み得る。乾燥形態実施態様は、無菌性および純度を維持し得、そして所望により、ヒトまたは他の哺乳類への投与前の再構成薬剤（上記参照）による再構成に適切である容器、器またはバイアルで提供されるのが好ましい。ＳＰＥＸ化合物は、第二容器における再構成薬剤と一緒にパッケージされたキットにおける第一容器で提供され得る。

ＳＰＥＸ受容体
本明細書で使用されている「実質的完全長のＳＰＥＸポリペプチド」は、「ＳＰＥＸ受容体」として称され得る。「ＳＰＥＸ受容体」は、限定されるわけではないが、リンパ球代謝のモジュレーション（例、活性化、不活化または増殖）、細胞接着、リン酸化、脱リン酸化（細胞質ドメインの）を含め、本明細書で開示されている活性を含むのが好ましい。好ましいＳＰＥＸ受容体は、Ｉｇ様ドメイン、膜貫通ドメイン、およびチロシンベースドメイン（好ましくは細胞内ドメイン）を含む。非常に好ましいＳＰＥＸ受容体は、配列番号２０、配列番号２１、配列番号６２または配列番号６３を含むが、これらに限定されるわけではない。代替的ＳＰＥＸ受容体は、配列番号１９または配列番号６１を含むが、これらに限定されるわけではない。追加の代替的ＳＰＥＸ受容体は、ＳＰＥＸ膜貫通ドメインおよびＳＰＥＸ細胞内ドメインに機能し得るように結合された配列番号８５または配列番号８６を含む。

ポリペプチド
本発明のある種の実施態様は、マウス、ヒト（好ましい）または他の哺乳類由来のＳＰＥＸポリペプチドを提供する。ヒトＳＰＥＸ（ｈＳＰＥＸ）ポリペプチドの一例は、配列番号２０に示されたアミノ酸配列を含む。マウスＳＰＥＸ（ｍＳＰＥＸ）ポリペプチドの一例は、配列番号６２に示されたアミノ酸配列を含む。一実施態様は、本明細書ではｍＳＰＥＸｂと称される、マウスＳＰＥＸの対立遺伝子を提供する。ｍＳＰＥＸｂポリペプチドの配列の一例は、配列番号８６に示されたアミノ酸配列を含む。

本明細書で使用されている「ＳＰＥＸポリペプチド」の語は、本明細書で記載されている通り、実質的完全長のＳＰＥＸポリペプチド、並びにそのドメイン、フラグメント、セグメント、融合体、突然変異体、および／または変異型を含む（所望により、本質的にこれらで構成されていてもよい）アミノ酸配列を含むものとする。本発明ポリペプチドは精製形態で存在するのが好ましい。

ＳＰＥＸ免疫グロブリン様ドメインを含むポリペプチド
本発明の一実施態様は、ＳＰＥＸ免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインを含むアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。ある種の実施態様では、ＳＰＥＸ Ｉｇ様ドメインは、配列番号３、配列番号４５または配列番号８８に示されている。

一実施態様において、好ましいＳＰＥＸ Ｉｇ様ドメインは、二次および／または三次構造、例えばＩｇ折りたたみまたはベータサンドイッチを含む。別の実施態様では、ＳＰＥＸ Ｉｇ様ドメインが、通常はＳＰＥＸ Ｉｇ様ドメインを含むポリペプチド配列から単離または分離されたとき、ＳＰＥＸ Ｉｇ様ドメインは、二次および／または三次構造、例えばＩｇ折りたたみまたはベータサンドイッチを維持している。

ＳＰＥＸ Ｉｇ様ドメインは、例えばＳＰＥＸと特異的に結合し、シグナル変換、リンパ球活性化、リンパ球発達、または免疫応答をモジュレーションする抗体の製造において有用である。別の一例では、ＳＰＥＸ Ｉｇ様ドメイン、所望によりＳＰＥＸ細胞外ドメインは、リンパ球機能のモジュレーション、免疫応答のモジュレーション、またはＳＰＥＸ結合タンパク質についてのスクリーニングに有用である。さらに別の例では、ＳＰＥＸ Ｉｇ様ドメインは、リンパ球および／またはＳＰＥＸ活性のアゴニストおよびアンタゴニストの同定方法において有用である。

ＳＰＥＸ Ｉｇ様ドメインを含むポリペプチドのある種の実施態様は、下表１における配列番号により示されている。必ずしも連続しているわけではない複数のアミノ酸配列を含む実施態様では、配列は、（例えばペプチド結合またはアミノ酸配列リンカーにより）機能し得るように結合されているのが好ましい。

表１
Ｉｇ様ドメインを含むポリペプチドのある種の実施態様

ある種の実施態様は、上記表１に示されたアミノ酸配列を含む（別法として、本質的にそれにより構成される）ポリペプチドを提供する。

興味の対象であるポリペプチドがＩｇ様ドメインを含むか否かの測定方法では、ＲＰＳ−ＢＬＡＳＴを用い、検索クエリーとして興味の対象であるアミノ酸配列を入力することにより、保存ドメインデータベースを検索する。ポリペプチドがＩｇ様ドメイン構造を含む場合、Ｉｇ様ドメインの位置および配列は、他のポリペプチドからのＩｇ様ドメインのアラインメントと一緒に検索プログラムにより特定される。好ましい検索パラメーターは、検索データベース、全部；期待０.０１；フィルター、低コンプレキシティー；検索モード、多重ヒット１−パスである。保存ドメインデータベースおよび検索サービスｖ１.５４ツールは、メリーランド２０８９４、ベセスダ、ロックビル・パイク、国立医学図書館（ＮＬＭ）の国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）、コンピューター生物学部門により提供される。配列番号３または配列番号４５との候補ポリペプチドの比較（例、配列アラインメントによる）は、候補ポリペプチドが、本明細書に開示されているＳＰＥＸポリペプチド、フラグメントまたは変異型であるか否かを測定するのに有用である。

ＳＰＥＸチロシンベースドメインを含むポリペプチド
本発明の別の局面は、ＳＰＥＸアミノ酸配列のチロシンベースドメインを含むポリペプチドを提供する。一実施態様において、チロシンベースドメインは、配列番号７、配列番号９または配列番号１１を含む。チロシンベースドメインは、チロシンアミノ酸残基を含む。チロシンベースドメインは、リン酸化部位を含むのが好ましい。また、ＳＰＥＸチロシンベースドメインは、リン酸化および脱リン酸化され得るのが好ましい。

ＳＰＥＸチロシンベースドメインは、例えば、ＳＰＥＸシグナリング活性またはリンパ球活性化のモジュレーターの同定方法において有用である。例えば、好ましくはチロシンベースドメインモチーフまたはその付近で、ＳＰＥＸポリペプチドの細胞内ドメインと特異的に結合するＳＰＥＸ結合パートナーは、チロシンベースドメインのリン酸化および／または脱リン酸化に干渉することにより、それを阻害すると考えられる。チロシンベースドメインのリン酸化／脱リン酸化によりＳＰＥＸシグナル変換経路が提供されると考えられるため、これがＳＰＥＸ活性をモジュレーションすると予測される。従って、一実施態様は、リンパ球代謝（他にＳＰＥＸシグナル変換）のモジュレーション方法であって、ＳＰＥＸ結合パートナーをコード化するベクターをリンパ球に処置し、そこで結合パートナーをＳＰＥＸポリペプチドの細胞内ドメイン、好ましくはチロシンベースドメインと結合させることを含む方法を提供する。結合パートナーベクターはリンパ球においてポリペプチドを発現し、次いでポリペプチドは、ＳＰＥＸポリペプチドと特異的に結合し、リンパ球代謝および／またはＳＰＥＸシグナル変換をモジュレーションする。

１つまたはそれ以上のＳＰＥＸチロシンベースドメインを含むポリペプチドのある種の実施態様は、下記表２に提供されている。表２はまた、代替的実施態様を提供しており、それらのポリペプチドは、１つまたはそれ以上のＳＰＥＸチロシンベースドメイン（左欄）を含むが、第二のＳＰＥＸ配列またはドメインについては含まない（右欄）。

表２
ＳＰＥＸポリペプチドのある種の実施態様

ある種の実施態様は、上記表２に示されたアミノ酸配列を含む（別法として、本質的にそれにより構成される）ポリペプチドを提供する。

免疫受容体チロシンベース抑制型モチーフ（ＩＴＩＭ）は、ある種の免疫細胞シグナリングタンパク質、特に免疫細胞膜受容体に含まれることが当業界では知られているモチーフである。ＩＴＩＭは、免疫応答、細胞増殖、クローン性増殖、サイトカイン産生、細胞接着、および他の生物学的活性の調節に関与する。ＩＴＩＭは、ＩＸＹＸＸＬ（配列番号９３）により示され、「Ｘ」は任意のアミノ酸を表す。

本発明の一実施態様は、配列ＩＶＹＡＳＬ（配列番号９４）を含むＩＴＩＭを提供する。一実施態様において、ＧＩＶＹＡＳＬＮＨ（配列番号９）を含むチロシンベースドメインは、配列番号９４に示されたＩＴＩＭを含む。別の実施態様は、ＩＶＹＡＳＬ（配列番号９４）を含むＳＰＥＸポリペプチドを提供する。

シグナリングリンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）関連アダプタータンパク質（ＳＡＰ）は、ある種の免疫細胞シグナリングタンパク質に含まれることが当業界では知られている別のモチーフである。ＳＡＰモチーフは、免疫応答、細胞増殖、クローン性増殖、サイトカインの産生、細胞接着および他の生物学的活性の調節に関与する。一例において、ＳＡＰポリペプチド、ＳＨ２Ｄ１Ａは、ＳＬＡＭによるシグナル変換を阻害することが当業界では知られており、その結果、リンパ球、例えばＴ細胞およびナチュラルキラー細胞の増殖が抑制されずに続行されることはない。Ｘｑ２５でのＳＡＰ遺伝子における欠損は、Ｘ連鎖リンパ増殖性疾患に伴う（例、Buckley,R.（２０００）ＮＥＪＭ ３４３：１３１３−１３２４およびSayos J et al.（１９９８）Nature ３９５：４６２−４６９参照、各文献については出典明示により援用する）。

本発明の一実施態様は、配列ＴＥＹＡＳＩ（配列番号９６）を含むＳＡＰ結合部位を提供する。一実施態様において、ＥＡＰＴＥＹＡＳＩＣＶＲＳ（配列番号１１）を含むチロシンベースドメインは、配列番号９６に示されたＳＡＰを含む。別の実施態様は、ＴＥＹＡＳＩ（配列番号９６）を含むＳＰＥＸポリペプチドを提供する。

ＳＰＥＸ細胞外ドメイン
本発明の一実施態様は、ＳＰＥＸ細胞外ドメインを含むポリペプチドまたはそのフラグメントを提供する。ある種の実施態様において、細胞外ドメインは、配列番号３、配列番号４５、配列番号１２、配列番号１３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号８５、配列番号８５、配列番号８６、または配列番号８８を含む。一実施態様において、細胞外ドメインは、さらに膜貫通ドメイン（例、配列番号５または配列番号４７）を含む。別法として、当業界で公知の他の膜アンカー型配列も使用され得る。原形質膜、細胞壁、細胞オルガネラ、小胞、リポソーム、脂質ラフトなどにポリペプチドを固定する非常に多くの膜貫通配列が知られている。一般的な当業者であれば、膜貫通配列を用いることにより、本発明のポリペプチドを、上述の脂質に基く構造の一つ、好ましくは細胞原形質膜に合わせるか、固定するかまたは他の形で機能し得るように結合させ得るはずである。

ＳＰＥＸ細胞内ドメイン
本発明の一実施態様は、ＳＰＥＸ細胞内ドメインを含むポリペプチドまたはそのフラグメントを提供する。ある種の実施態様において、ポリペプチドは、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１６、配列番号１７、配列番号５８、または配列番号５９を含む。ある種の実施態様では、細胞内ドメインは、さらに膜貫通ドメイン（例、配列番号５または配列番号４７）を含む。一般に、他の膜アンカー型配列も所望ならば使用され得る。

免疫原
本発明のある種の実施態様は、ＳＰＥＸ免疫原を提供する。本明細書で使用されている「ＳＰＥＸ免疫原」は、免疫反応を誘導することができるＳＰＥＸポリペプチドまたはそのフラグメントである。一実施態様において、ＳＰＥＸポリペプチドまたはそのフラグメントは、ＳＰＥＸポリペプチドまたはそのフラグメントと免疫反応する抗体の製造に有用である（上記参照）。ＳＰＥＸ免疫原はまた、診断および実験的検定法またはキットにおいても有用である。例えば、ある種の診断法およびキットでは、リンパ球の発達段階のマーカー、胸腺細胞発達のＤＰからＳＰ段階への移行中におけるＭＡＰＫシグナリング経路活性化のマーカー、細胞型（ＳＰＥＸを発現する細胞は上記で検討されている）のマーカー、または少なくとも一部はＳＰＥＸ発現に基いた細胞型の精製および／または選別用マーカーまたは標識として有用な組成物および方法が提供される。

一般に、６個またはそれ以上の連続アミノ酸残基を含むＳＰＥＸポリペプチドであれば、免疫応答を誘導することができる。典型的には、ＳＰＥＸポリペプチドにおけるアミノ酸残基の数が増すと、ペプチドに対する免疫原応答は高められる。すなわち、ある種の実施態様は、優先度の増す順で、ＳＰＥＸポリペプチドの６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０連続アミノ酸を含むＳＰＥＸ免疫原を提供する。別法として、ＳＰＥＸ免疫原は、ＳＰＥＸポリペプチドの６〜９、１０〜１９、２０〜２９、３０〜３９または４０〜５０連続アミノ酸を含む。

ある種の好ましい実施態様では、ＳＰＥＸ免疫原は、ＳＰＥＸポリペプチドドメイン、例えば外部ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメイン、Ｉｇ様ドメイン、チロシンベースドメイン、またはシグナル配列を含む。表１および表２に開示された各ＳＰＥＸポリペプチドは、ＳＰＥＸ免疫原として有用である。

好ましい実施態様では、ＳＰＥＸ免疫原は精製されている。例えば、ペプチダーゼ（例、トリプシンおよびキモトリプシン）または他のポリペプチド開裂剤（例、ピペリジン）を用いて長いＳＰＥＸポリペプチドからフラグメントを解離させるとき、長いＳＰＥＸポリペプチドからＳＰＥＸ免疫原を精製するのが好ましい。ＳＰＥＸ免疫原の一製造方法では、当業界でよく知られている一般的技術である固相ポリペプチド合成を行う。別法では、ＳＰＥＸ免疫原の細胞性発現および精製が含まれる。

精製ＳＰＥＸ免疫原は、任意の担体と組合わされるかまたは結合され、および／または当業界で公知のアジュバントと混合され得る。かくして製造されたＳＰＥＸ免疫原性組成物についても、本明細書ではＳＰＥＸ免疫原と称す。精製ＳＰＥＸ免疫原に関して、アジュバントまたは担体は、必ずしも汚染物質とはみなされない。上記担体およびアジュバントは、免疫原応答を高めるのに有用である。免疫原増強剤およびポリペプチドとのそれらの組合わせは、当業界ではよく知られている。例えば、フロイント完全アジュバント、または担体粒子、例えばキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）またはコロイド状金属（例、コロイド状金）がある。

変異型
本明細書におけるある種の実施態様は、ＳＰＥＸレファレンスポリペプチドと９５％またはそれより高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド（本明細書ではＳＰＥＸポリペプチド変異型と称す）を提供する。本明細書で使用されている「ＳＰＥＸレファレンスポリペプチド」は、表１または表２における配列番号により示されたポリペプチドである。本ＳＰＥＸ変異型ポリペプチドは、精製ＳＰＥＸ変異型ポリペプチドを含むのが好ましい。一般に、ＳＰＥＸポリペプチドと比べてＳＰＥＸ変異型ポリペプチドの配列同一性が大きい場合、変異型ポリペプチドはより好ましいものとなる。従って、ある種の実施態様は、優先度増加順で、ＳＰＥＸポリペプチドと９６％、９７％、９８％または９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。本明細書におけるＳＰＥＸ変異型ポリペプチドは、ＳＰＥＸレファレンスポリペプチドと比べて、少なくとも１つのアミノ酸置換、修飾、付加、欠失、ギャップおよび／または挿入を含む。好ましい変異型は、ＳＰＥＸレファレンスポリペプチドと比べてかなりの生物活性を保持している。従って、ＳＰＥＸ変異型ポリペプチドは、一般に、ＳＰＥＸレファレンスポリペプチドが有用であるほとんど実施態様においても有用である。しかしながら、ＳＰＥＸ変異型ポリペプチドは、本明細書では一般にＳＰＥＸレファレンスポリペプチドに代わる実施態様としてみなされている。

配列アラインメントおよび同一性パーセントは、本発明ではラボヴェロシティー（ラボヴェロシティー・インコーポレイテッド、サンフランシスコ、カリフォルニア）によるＪＥＬＬＹＦＩＳＨバージョン１.５ソフトウェアを用いて決定され、以下のパラメーターが使用される：ｋｔｕｐｌｅサイズ（１）、ｔｏｐ ｄｉａｇｏｎａｌｓの数（５）、ウインドウサイズ（５）、ギャップペナルティ（３）、スコアリング方法（パーセント）、ウエイトマトリックス（Ｇｏｎｎｅｔ）、ギャップ開始ペナルティ（１０）、ギャップ延長ペナルティ（０.２）、残基特異的ギャップペナルティ（イエス）、親水性ギャップベネフィット（イエス）、ギャップ間隔（８）、遅延についての同一性のパーセント（３０.０）、出力オーダー（アラインメントされた順）。合成修飾アミノ酸残基（例、非天然アミノ酸）の置換、欠失、挿入、付加、ギャップおよび包含のいずれかまたは全部は、２配列間の同一性パーセントの計算に含まれるものとする。例えば、一配列においてイソロイシンまたは他のアミノ酸残基をアロ‐イソロイシンで置換することにより、アラインメントされたときの配列間の同一性パーセントは低下する。対応物質がＬ−アミノ酸である、配列にＤ−アミノ酸が含まれる場合も、配列間の同一性パーセントは低下する。

配列番号３（別法として配列番号４８または配列番号８８）を含むＳＰＥＸ変異型ポリペプチドについては、ポリペプチドは、Ｉｇ様ドメイン構造を含むのが好ましい。例えば、一実施態様は、配列番号３（別法として配列番号４５または配列番号８８）と９５％またはそれ以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、免疫グロブリン様ドメイン構造を含む変異型ポリペプチドを提供する。

置換、欠失、挿入、付加、修飾残基、ギャップなどを伴うポリペプチドの製造は、当業界における常用の手順によるものであり、本開示を考慮に入れて本ポリペプチドおよび変異型に適用され得る。一方法は、上記変化をコード化するポリヌクレオチドからのポリペプチドの発現（例、位置指定突然変異導入を用いてポリヌクレオチドを修飾する）を含み、好ましくは発現されたポリペプチドを精製する。変異型ポリペプチドの好ましい製造方法は、ＳＰＥＸ変異型ポリペプチドの新たな合成を含み、その場合所望の改変（複数も可）は合成中に行なわれる。

ある種の実施態様では、アミノ酸置換は同類置換であるのが好ましい。一般に、野生型配列における所定のアミノ酸を、特性が類似した側鎖を有するアミノ酸と置換すると、生成された同類置換変異型ポリペプチドの構造および機能に対する影響は低減化される。従って、ある種の実施態様は、１０個またはそれより少ないアミノ酸変化（択一的には、１０個のみのアミノ酸変化）を含む同類修飾ＳＰＥＸポリペプチドを提供し、その場合アミノ酸変化は同類置換、付加または欠失である（好ましくは同類アミノ酸置換）。１０より少ないアミノ酸変化が好ましい。従って、優先度の増す順で、同類修飾ＳＰＥＸポリペプチドは、９またはそれ未満、８またはそれ未満、７またはそれ未満、６またはそれ未満、５またはそれ未満、４またはそれ未満、３またはそれ未満、２またはそれ未満、または１つの同類アミノ酸変化を含む。ある種の非常に好ましい同類修飾ＳＰＥＸ変異型は、配列番号３、配列番号４５または配列番号８８を含む。

配列番号７、配列番号９または配列番号１１を含むＳＰＥＸポリペプチドは、配列番号７、配列番号９または配列番号１１においてそれぞれ１つのみの同類アミノ酸置換（別法として、付加または欠失）を有するのが好ましい。

本明細書で使用されている天然（に存する）アミノ酸は、次の要領で同類置換についての側鎖特性によりグループ分けされる：脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｌ、Ｖ、Ｉ）；第二アミノ基を伴う脂肪族側鎖（Ｐ）；芳香族側鎖（Ｆ、Ｙ、Ｗ）；硫黄含有側鎖（ＣおよびＭ、メチオニンがポリペプチドの第一アミノ酸である場合を除く）；脂肪族ヒドロキシル側鎖（Ｓ、Ｔ）；塩基性側鎖（Ｋ、Ｒ、Ｈ）；酸性側鎖（Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ）。例えば、アラニンは、非変異型（または野生型）ポリペプチド（ＳＰＥＸレファレンスポリペプチド）に存在するバリンに関して同類置換され得る。別法として、バリンは、非変異型ポリペプチドに存在するアラニンに関して同類置換され得る。別の例では、プロリンは同類置換をもたない。システインおよびメチオニンは硫黄含有アミノ酸のグループに属するが、システインおよびメチオニン残基は、ＳＰＥＸ Ｉｇ様ドメイン変異型ポリペプチドにおいて置換（または欠失）されていないのが好ましい。また、ＳＰＥＸ免疫グロブリン様ドメインを含む変異型ポリペプチドが、Ｉｇ様ドメイン内にシステイン残基の野生型相補体を有することによりドメインのジスルフィド形成および／または構造的立体配座を維持するのも好ましい。

ＳＰＥＸ突然変異体ポリペプチド
ある種の実施態様は、突然変異（置換、欠失、先端切除など）を含むＳＰＥＸポリペプチドを提供し、その場合突然変異によりＳＰＥＸシグナル変換および／またはリンパ球代謝のモジュレーションが阻害される。本ＳＰＥＸポリペプチドを本明細書では「ＳＰＥＸ突然変異体ポリペプチド」と称す。ＳＰＥＸ突然変異体ポリペプチドは、ＳＰＥＸポリペプチド変異型とは、例えば、突然変異体は低活性が好ましく、変異型は実質的な活性を有するのが好ましいという点で異なる。この「低活性」は、好ましくはレファレンスＳＰＥＸポリペプチドと比べて２０％またはそれ未満の活性レベルである（好ましくは、１０％またはそれ未満およびさらに好ましくは５％またはそれ未満の活性）。ＳＰＥＸ突然変異体ポリペプチドは、好ましくは精製されている。

非常に好ましいＳＰＥＸ突然変異体ポリペプチドは、ＳＰＥＸチロシンベースドメインにおいて突然変異を含み、さらに好ましくは、突然変異は、チロシンベースドメインのチロシン残基の置換または欠失突然変異を含む。好ましくは、チロシンベースドメイン突然変異体を含むＳＰＥＸポリペプチドは、阻害されたＳＰＥＸシグナル変換および／またはリンパ球代謝のモジュレーションを特徴とする。好ましくは配列番号７、配列番号９および配列番号１１に示されている、チロシンベースドメインに突然変異が存在しない（すなわち、野生型）ＳＰＥＸポリペプチドは、活性などの比較に使用され得る。

ＳＰＥＸ突然変異体ポリペプチドのある種の実施態様は、下表３に示されている。興味の対象であるチロシン残基の番号付けは、具体例としてのｈＳＰＥＸおよびｍＳＰＥＸ配列についてそれぞれ提供されている。

表３
具体例としてのＳＰＥＸチロシンベースドメイン突然変異体

ある種の好ましいＳＰＥＸ突然変異体ポリペプチドは、優性ネガティブ（抑制型）ＳＰＥＸ突然変異体ポリペプチドを含み、前記ポリペプチドは野生型ＳＰＥＸポリペプチドの活性を阻害する（例、直接的相互作用、例えば欠損多量体をもたらす多量体形成、または間接的相互作用、例えばリガンドについての阻害剤または野生型ＳＰＥＸポリペプチドの活性化因子として作用することによる）。上記表３における＃１〜＃７の各突然変異体は、優性抑制型ＳＰＥＸ突然変異体ポリペプチドを含むと考えられる。ＳＰＥＸ突然変異体ポリペプチドは、例えば、リンパ球代謝または免疫応答のＳＰＥＸシグナリングのモジュレーション方法において有用である。例えば、突然変異体は、ＳＰＥＸ受容体のリガンドについて競合するかまたはＳＰＥＸ活性の優性抑制型阻害剤として作用し得る。

非天然ポリペプチド
所望により、実施態様によっては、本発明のポリペプチドが非天然ポリペプチドを含む場合もある。非天然ポリペプチドの例には、（ａ）自然の状態または興味の対象である生物体からは見出されないアミノ酸、例えば合成アミノ酸またはアミノ酸擬似物質を含むポリペプチド、（ｂ）自然の状態ではポリペプチドとは会合しないポリペプチドに結合した化学部分、例えば放射性同位元素または蛍光マーカーを含むポリペプチド、（ｃ）完全な配列が天然に存在する精製アミノ酸配列、例えば精製先端切除配列を含むポリペプチド、（ｄ）天然ポリペプチドの一部分を含まないポリペプチド、例えば内部欠失体、（ｅ）２またはそれ以上のアミノ酸配列（同一または異なる配列）を一緒に連結させた形で含む融合ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が天然には一緒に連結された形では見出されないものである、融合ポリペプチド、（ｆ）または自然の状態ではポリペプチドに通常随伴する天然に存する物質の環境から除去された精製ポリペプチドがある。ＳＰＥＸポリペプチドは、例えば、宿主細胞における組換えクローニングおよびそこからの精製を含む、当業界で公知の技術を用いて哺乳類細胞または他の細胞型（例、細菌、酵母、昆虫、植物）から精製され得る。ポリペプチドは化学合成され得、その技術は当業界ではよく知られている。

ポリペプチド融合体
一実施態様では、少なくとも、第１ＳＰＥＸアミノ酸配列を第２ポリペプチドに機能し得るように結合させた形で含むポリペプチドが提供され、その場合第１および第２ポリペプチドが、天然の状態で結合した形で見出されることはないものとする（本明細書では「ＳＰＥＸポリペプチド融合体」と称す）。ＳＰＥＸ融合体の製造に有用なＳＰＥＸアミノ酸配列は、本明細書に開示されている（例、表１および表２に開示されているポリペプチド、本明細書に開示されているＳＰＥＸ変異型、および本明細書に開示されているＳＰＥＸ突然変異体）。「ＳＰＥＸ融合体」および「ＳＰＥＸ融合配列」の語は、包括的にＳＰＥＸ融合ポリペプチドおよびＳＰＥＸ融合ポリヌクレオチドと称す。本発明のＳＰＥＸ融合ポリペプチドは、単離され、好ましくは精製される。一般に、ＳＰＥＸ融合体を含むポリペプチド成分は、所望の順序で連鎖され得る。ＳＰＥＸ融合ポリペプチドは、例えば、興味の対象であるＳＰＥＸポリペプチドの溶解度、精製、発現、検出、選択および抗原性を促進する（強化または増加させる）のに有用である。

一実施態様では、異種ポリペプチドに機能し得るように結合された第１ＳＰＥＸポリペプチドを含むポリペプチドが提供され、その場合、異種ポリペプチドは、第１ＳＰＥＸポリペプチドとは異なるもので、異種ポリペプチドおよび第１ＳＰＥＸポリペプチドは、天然には機能し得るように結合された形では通常見出されないものとする。例えば、「異種ポリペプチド」は、ＳＰＥＸおよび非ＳＰＥＸ配列および同一または異なる種由来の配列を包含する。

ある種の実施態様では、機能し得る結合は開裂可能である。例えば、ＳＰＥＸ融合ポリペプチドは、ＳＰＥＸポリペプチドおよび異種ポリペプチドを分離するためのペプチダーゼ開裂部位を含む。開裂可能なペプチド配列は当業界ではよく知られており、本開示に照らすことにより、ＳＰＥＸ融合ポリペプチドの機能し得る連鎖へ（例、所望のアミノ酸配列のクローニングまたは新たな合成により）組込まれ得る。上記開裂についての酵素には、トリプシン（tyrpsin）、エンテロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、因子Ｘａ、フリンなどがある。

ＳＰＥＸ融合ポリペプチドの好ましい機能し得る連鎖は、融合体の各ポリペプチドを１またはそれ以上の他のポリペプチドに連結するポリペプチド結合（アミド結合）を含む。好ましくは、融合体の各ポリペプチドは、単一ポリペプチド結合により融合体の別のポリペプチドに結合されている。

ＳＰＥＸ融合ポリペプチドの好ましい製造方法では、遺伝子工学技術を用いて連続ポリペプチドを製造する（すなわち、ペプチド結合またはアミノ酸結合配列により各ポリペプチドについてのコーディング領域を組合わせるように遺伝子操作を加えたポリヌクレオチドの発現）。ＳＰＥＸ融合ポリペプチドはまた、新たな化学合成（例、固相ポリペプチド合成）により製造され得る。所望により、融合体のポリペプチドは、アミノ酸スペーサー配列により機能し得るように結合され得る。スペーサー配列は、例えば融合ポリペプチドにおいて機能性ドメインを分離する（例、立体障害を回避するため）のに有用である。上記スペーサー配列は、当業界では公知であり、典型的には多数のグリシン、アラニン、および／またはプロリン残基を含む。

別法として、化学架橋剤もまた、ポリペプチドを機能し得るように結合させるのに有用である。ポリペプチドの化学的架橋は、当業界では公知であり、本発明を考慮に入れたＳＰＥＸ融合ポリペプチドの製造に適用され得る。化学架橋試薬における一般的な反応性または官能性基には、スクシンイミジルエステル、マレイミド、およびヨードアセトアミドがある（化学的架橋用キットは、例えば、オレゴン、ユージーン、モレキュラー・プローブズから市販されている）。ポリペプチドの一般的反応基には、アミノ、カルボキシル、スルフヒドリル、アリール、ヒドロキシルおよび炭水化物がある。ある種の特異的な化学的架橋試薬には、ＤＳＰ（ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート））、ＤＴＳＳＰ ３,３'−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）、ＤＳＳ（ジスクシンイミジルスベレート）、ＢＳ^３（ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート）、ＤＳＴ（ジスクシンイミジルタートレート）、スルホ−ＤＳＴ（ジスルホスクシンイミジルタートレート）、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）、ＤＴＭＥ：ジチオ−ビス−マレイミドエタン、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）がある。

他の有用な化学的架橋剤には、２個またはそれ以上の異なる反応基を含み、典型的にはタンパク質の特定基との逐次コンジュゲーションにより、望ましくない重合または自己コンジュゲーションを最小限にさせ得るヘテロ二官能（heterodifinctional）架橋剤がある。第１級または第２級アミンと反応するヘテロ二官能架橋剤には、イミドエステルおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）−エステル、例えばスクシミジル・４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）およびスクシミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート（ＳＭＰＢ）がある。スルフヒドリル基と反応する架橋試薬には、マレイミド、ハロアセチルおよびピリジルジスルフィドがある。カルボジイミド架橋試薬は、カルボキシルを第１級アミンまたはヒドラジドにカップリングすることにより、アミドまたはヒドラゾン結合を形成させる。広範に使用されている一カルボジイミド（carbodiiumide）架橋試薬は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ）であり、これはカルボン酸をアミンにカップリングするのに常用されるもので、ゼロ長架橋試薬の一例である。これらの架橋試薬は、例えば、ピアス・ケミカル・カンパニー（ロックフォード、イリノイ）およびシグマ（セントルイス、ミズーリ）から入手され得る。光化学反応性架橋試薬はまた、典型的にはヘテロ二官能架橋試薬である。ＵＶ照射時、これらの試薬は求核基と反応するかまたはＣ−Ｈ挿入生成物を形成する。ポリペプチド間における可逆性、実質的不可逆性および開裂可能な化学的架橋剤の様々な導入方法は、当業界ではよく知られており、本開示に照らしてＳＰＥＸ融合ポリペプチドを製造するのに使用され得る。

解離速度が非常に遅い２分子間の非共有結合相互作用はまた、操作可能な連鎖として機能し得る。例えば、アビジン、ストレプトアビジン、「ニュートラアビジン」ビオチン結合タンパク質および「キャプタアビジン」ビオチン結合タンパク質は、非共有結合ではなく、高い親和力を通してビオチニル化標的の４個以下の分子と機能し得るように結合し得る。

さらに異種配列は、所望により望ましい生物活性因子、例えば抗体、サイトカイン（例、インターロイキン、インターフェロン、ＮＦ−κＢ、ＩＬ−２Ｒ鎖（Ｔａｃ抗原））、ペプチドホルモン（例、ＥＧＦ、ＴＧＦα、ＴＧＦβ）、ケモカイン、キナーゼ、ホスファターゼ、膜移行配列または因子、核移行配列、膜アンカー、毒素（例、リシン、ジフテリア毒素の活性部分）、マーカーまたは識別標識などを含んでいてもよい。

一実施態様は、異種ポリペプチドに機能し得るように結合されたＳＰＥＸポリペプチドを含むポリペプチドを提供しており、上記異種ポリペプチドは、水溶液に実質的に可溶性であり、好ましくはＳＰＥＸポリペプチドよりも水溶液に高い可溶性を示すものとする。ＳＰＥＸポリペプチドを可溶性の高い異種ポリペプチドと機能し得るように結合することは、例えば、発現、結合試験および抗体産生の助けとなるため望ましいことである。好ましい実質的に可溶性の異種ポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１の定常域、さらに好ましくはヒトＩｇＧ１ヒンジＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含む。一実施態様において、溶解性促進異種ポリペプチドは、配列番号９７を含む。別の実施態様は、ヒトＩｇＧ１の定常域、好ましくはヒトＩｇＧ１ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む異種ポリペプチドに機能し得るように結合された配列番号３、配列番号４５、配列番号８８、配列番号１２、配列番号５４または配列番号８６に示されたＳＰＥＸポリペプチドを含むポリペプチドを提供する。プロテインＡは、高い親和力でＩｇＧ１の定常域と結合する。従って、ＳＰＥＸ−ヒトＩｇＧ１融合体は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製され得る。

他に考えられる溶解性促進ポリペプチドの例には、チオレドキシン（ＴＲＸ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、プロテインＡ、ＤｓｂＡおよびエシェリキア・コリ・マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）またはその可溶性フラグメントがある。別の例には、ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼタンパク質（ＢＤバイオサイエンシーズ・クロンテック、パロアルト、カリフォルニア）からの１９−アミノ酸配列であるＨＡＴエピトープがある。非隣接ヒスチジン残基のＨＡＴ配列は、連続Ｈｉｓ残基を伴う標識、例えば６ｘＨｉｓ標識よりも低い全電荷を有する。その結果、ＨＡＴポリペプチド融合体は、６ｘＨｉｓ標識融合体と比べて高い溶解度を呈するが、依然として固定された金属イオンについて強い親和力を有する。ＨＡＴ配列の結合特性により、自然条件下（例、ほぼ中性ｐＨ（ｐＨ７））および変性条件下におけるタンパク質のイミダゾール勾配およびｐＨ勾配精製の両方が可能となる。別の実施態様では、非ペプチド有機溶解性因子と機能し得るように結合されたＳＰＥＸポリペプチドが提供され、好ましくは共有結合によりＳＰＥＸポリペプチドに結合されている。

考えられる検出可能な標識またはマーカーの例には、抗体認識部分、例えばＦＬＡＧエピトープ、ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１０１）、ｃ−ｍｙｃエピトープ、ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号１０２）、明視化マーカー（例、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、ビオチン／アビジン）、酵素マーカー（例、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、放射性標識（例、^１２５Ｉ、^１４Ｃ、^３Ｈ、^３３Ｐ、^３５Ｓおよび^３２Ｐ）、およびその組合わせ（例、放射性標識および酵素標識抗体）がある。

考えられる精製標識または補助物質の例には、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ＴＲＸ、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＣ）、６−Ｈｉｓ標識（またはポリ−Ｈｉｓ）、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ標識、放射性標識、蛍光マーカーおよび血球凝集素（ＨＡ）がある。これらおよび他の部分により、それぞれ固定されたグルタチオン、マルトース、フェニルアルシンオキシド、カルモジュリン、および金属キレート樹脂において対応するＳＰＥＸ融合体が好都合に精製される。上記部分は、市販されている精製システムで常用されている。また、融合タンパク質には、ＳＰＥＸポリペプチド配列および異種ポリペプチド配列間に位置するタンパク質加水分解開裂部位を含むように遺伝子操作が加えられ得るため、ＳＰＥＸポリペプチドは、精製後に異種部分から開裂され得る。所望の挿入体を含む融合ポリヌクレオチドを作製し、挿入体から生成物を発現させ、生成物を精製するのを容易にするための様々な市販のキットが利用可能である。これらのキットは、融合生成物の部分が開裂および精製され得るように興味の対象である生成物および融合体の異種ポリペプチド間に開裂可能なリンカーを配置したベクターを提供し得る（例、ＣＲＥＡＴＯＲ適合発現系、クロンテク）。本開示を考慮に入れることにより、これらのキットを用いて、ＳＰＥＸ融合配列（ポリヌクレオチドおよびポリペプチド）が作製され得る。

ポリペプチド製造
本開示を考慮に入れることにより、本発明ＳＰＥＸポリペプチドは、ポリペプチドの製造または作製について当業界でよく知られている様々な技術を用いて生成され得る。例えば、天然供給源（例、リンパ球または脾臓または胸腺組織）からの精製による技術がある。別の例では、ＳＰＥＸポリペプチドは、細菌性（例、Ｋ１２）、真核生物、酵母、昆虫、植物、哺乳類、チャイニーズ・ハムスター（例、ＣＨＯ）、マウス、およびヒト細胞を含む宿主細胞での製造を通して生成され得る（例、組換えＳＰＥＸ発現系の導入を用いる）。さらに別の例では、ＳＰＥＸポリペプチドは、新たな合成方法を用いて生成される。好ましい実施態様では、ＳＰＥＸポリペプチドは、タンパク質分離および精製について当業界で公知の方法であって、本発明を考慮に入れたＳＰＥＸポリペプチドの単離または精製に可能な方法を用いて精製される。例えば、本発明を考慮に入れることにより、当業者であれば、本明細書で開示されている抗ＳＰＥＸ抗体を用いて、アフィニティー分離法によりその特異的フラグメントおよびドメインを含むＳＰＥＸポリペプチドを単離または精製することができるはずである。

有用なアミノ酸（およびヌクレオチド）の例は、World Intellectual Property Organization（ＷＩＰＯ）Handbook on Industrial Property Information and Documentation,Standard ST.25: Standard for the Presentation of Nucleotide and Amino Acid Sequence Listing in Patent Applications（１９９８）（添付書類２における表１〜６を含む、以後「WIPO Standard ST.25 of １９９８」と称す）に提供されており、出典明示により援用する。

ポリヌクレオチド
本発明の一実施態様は、ＳＰＥＸポリペプチドをコード化する核酸配列、または核酸配列の相補体を含む、ポリヌクレオチド（本明細書では「ＳＰＥＸポリヌクレオチド」と称す）を提供する。核酸配列の相補体は、エンコーディング核酸配列とハイブリダイゼーションすることができる。ＳＰＥＸポリヌクレオチドは、精製ポリヌクレオチドを含むのが好ましい。

ＳＰＥＸポリヌクレオチドは、例えば、ＳＰＥＸポリペプチドの製造（例、インビトロまたは細胞ポリペプチド発現、この場合ＳＰＥＸポリペプチドは、好ましくは精製されている）において有用である。ＳＰＥＸポリヌクレオチドはまた、細胞にＳＰＥＸ発現産物を処置することを含む方法において有用であり、上記ＳＰＥＸポリヌクレオチドは発現用エレメントを含むものとする。ＳＰＥＸポリペプチドをコード化する核酸配列の相補体（「ＳＰＥＸ相補体」）は、例えばＳＰＥＸ発現産物を検出するのに適切な検定法または診断キットにおいて有用である。また、本診断キットは、リンパ球型の検出または細胞精製または選別方法において有用である。

一実施態様において、ＳＰＥＸポリヌクレオチドは、哺乳類ＳＰＥＸポリヌクレオチド、好ましくはマウスＳＰＥＸ（ｍＳＰＥＸ）ポリヌクレオチドおよびさらに好ましくはヒトＳＰＥＸ（ｈＳＰＥＸ）ポリヌクレオチドを含む。一実施態様は、表１または表２に示されたポリペプチド（または別法として、上記で開示されているＳＰＥＸ変異型ポリペプチド）をコード化する核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。

本発明ポリヌクレオチドは、精製ポリヌクレオチドを含むのが好ましく、上記精製形態は、実質的に汚染物質（溶質、賦形剤、安定剤、緩衝液などを度外視してよい）不含有であり、ＳＰＥＸが天然で共存する物質の環境から除去される。精製ＳＰＥＸポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅および／または配列決定に使用される１本鎖オリゴヌクレオチド配列を実質的に含まないのが好ましい。

表４は、ＳＰＥＸドメインおよびある種の好ましいポリヌクレオチド間の対応例をポリヌクレオチドによりコード化されるポリペプチドと一緒に提供している。それぞれの配列は、配列番号により示されている。

表４
ＳＰＥＸポリヌクレオチドのある種の実施態様

複数の配列番号を有する（例、マウスＳＰＥＸ Ｉｇ様ドメインについて列挙されている「４５／８８」）、上記表４における実施態様は、特定生物体で同定された明確な特異的対立遺伝子をいう。

本明細書における記載によると、ＳＰＥＸ遺伝子が天然の状態で通常随伴する隣接ゲノム５'および３'領域を含むＳＰＥＸポリヌクレオチドの最大長は、４００００塩基対である（度外視してよいベクター配列、下記参照）。本発明の範囲内におさまるためには、ＳＰＥＸポリヌクレオチド配列のゲノムクローンは、必ずや４００００塩基対以下（１本鎖核酸についての塩基）でなくてはならない。４００００またはそれより少ない数の塩基対を有するゲノムクローンが、天然で見出されるＳＰＥＸ遺伝子に通常随伴する他の隣接ゲノム配列から分離されるのが好ましい。さらに本明細書における記載によると、ＳＰＥＸポリヌクレオチドの最小の長さは１８残基である（例、本質的に配列番号９４または配列番号９６に示されたポリペプチドをコード化する核酸から成るポリヌクレオチド）。

好ましい実施態様において、ＳＰＥＸポリヌクレオチドは、好ましい長さの範囲を特徴とする。例えば、当業者であれば、ポリヌクレオチドを用いる各適用例または系について、適用例におけるポリヌクレオチドの使用を有効なものにする典型的な長さまたは長さ範囲があることは認識しているはずである。従って、当業者であれば、本発明を考慮に入れることにより、選ばれた適用例に最適な核酸長を選択できるはずである。下記表５は、ＳＰＥＸポリヌクレオチドを用いた実施態様および選択された適用例または系についてのＳＰＥＸポリヌクレオチドの好ましい長さの実例を提供している。

表５
ＳＰＥＸポリヌクレオチドの長さの範囲の実例

上記表５については、長さの範囲は、１本鎖ポリヌクレオチドについての場合にはヌクレオチドおよび２本鎖ヌクレオチドについての場合には塩基対で示されている。表５に開示されている好ましいＳＰＥＸポリヌクレオチド長の範囲は、各組成物または適用例に対して有効性が高められることを示唆されているが、必ずしも絶対的なものではない。一般に、ベクターで使用されている挿入体のサイズが増すと、所定のベクター系の形質転換効率は減少する。

一実施態様は、少なくとも第２ポリペプチドに機能し得るように結合された第１ＳＰＥＸアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード化する核酸配列を含む、本明細書では「ＳＰＥＸ融合ポリヌクレオチド」と称されるポリヌクレオチドを提供するもので、上記の第１および第２ポリペプチドは、天然では結合した形で見出されないものである。例えば、ＳＰＥＸ融合ポリペプチドをコード化する核酸配列を含むポリヌクレオチドがある。本実施態様は、ＳＰＥＸ融合ポリペプチドの大量生産に特に有用である。

ある種の好ましいＳＰＥＸ融合ポリヌクレオチドは、配列番号９７に示されたポリペプチドに機能し得るように結合された、配列番号３、配列番号４５、配列番号８８、配列番号１２、配列番号１３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号８５、または配列番号８６に示された第一アミノ酸配列の１個またはそれ以上をコード化する核酸配列を含む。本融合ポリヌクレオチドは、ＳＰＥＸポリペプチドの外部ドメインの生産に有用であり、上記融合体は、実質的に水溶液に可溶性であり、好ましくはＳＰＥＸポリペプチド単独よりも可溶性が高い。

ポリヌクレオチド配列の開裂、ハイブリダイゼーションおよびセグメントのライゲーションについての組成物および方法は、当業界ではよく知られており、上記組成物および方法は、本発明に照らしてＳＰＥＸ融合ポリヌクレオチドを製造するのに有用である。所望ならば、ＳＰＥＸ融合ポリヌクレオチドは、ＳＰＥＸ融合ポリヌクレオチドのセグメントを分離するための制限部位を含み得る。

介在配列
一実施態様において、ポリヌクレオチドは、さらにＳＰＥＸ核酸配列と機能し得るように結合された介在配列（例、イントロン）を含む。ＳＰＥＸポリヌクレオチドと機能し得るように結合されたイントロンは、例えば、特に哺乳類発現系において、転写を促進し、ｍＲＮＡ発現産物の安定性を高めるのに望ましいものであり得る。典型的には、イントロンは、ＳＰＥＸ核酸配列の第一および第二セグメント間で機能し得るように結合されている。従って、本発明の一実施態様は、ＳＰＥＸポリヌクレオチドおよびイントロン配列を含むポリヌクレオチドを提供するもので、イントロンは、核酸配列上流の核酸に機能し得るように結合されている。好ましいイントロン配列は、一つまたはそれ以上のＳＰＥＸゲノムイントロン配列から選択される。所望により、イントロン配列は、一つまたはそれ以上の異種イントロン配列またはＳＰＥＸイントロンおよび異種イントロンの組合わせから選択される。

有用なイントロン配列の例には、ＳＶ４０小型−ｔ抗原イントロンおよびＣＭＶ ＩＥ遺伝子からのイントロンＡがある。これらのイントロン配列は、プロメガ（マディソン、ウィスコンシン）およびインビボゲン（サンディエゴ、カリフォルニア）からそれぞれ購入できる。コーディング配列およびイントロン配列間の接合部（すなわち、スプライス接合部）は、プロセシング中（例、スプライシング反応、例えばｈｎＲＮＡからｍＲＮＡへのプロセシング中）におけるイントロン配列の除去に適切なスプライス部位を含むのが好ましい。ある種の実施態様において、ＳＰＥＸポリヌクレオチドは、適切なスプライス接合部を有するイントロンを含む。

縮重遺伝コード変異型
当業者であれば、遺伝コードの縮重については認識しており、そのため、本発明を考慮に入れることにより、縮重コドンを用いて同じＳＰＥＸポリペプチドをコード化する多重核酸配列を製造できるはずである。標準遺伝コードおよびその使用、並びに共通アミノ酸についての記号およびその省略形またはコードの表については、Biochemistry、第３版、Stryer編、フリーマン・パブリッシャー（１９８８）９１〜１１５頁および裏表紙内側参照、これについては出典明示により援用する。適切なＳＰＥＸポリヌクレオチドは、本発明を考慮に入れることにより、発現させる所望のＳＰＥＸポリペプチド配列および標準遺伝コードの情報に基いて編成され得る。

配列修飾技術
ＳＰＥＸ配列への修飾は、例えば、ポリマーの化学合成（ポリヌクレオチドおよびポリペプチド合成を含む）中に、またはポリヌクレオチドの突然変異誘発（斑入り）および所望による、コード化ポリペプチド変異型の発現を通して加えられ得る。ポリヌクレオチド配列の好ましい改変方法は、位置指定突然変異導入によるものである。化学合成、突然変異誘発、位置指定突然変異導入およびポリヌクレオチド発現の方法は、当業界ではよく知られている。所望のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列の生産を確認する方法についても、当業界では公知である。これらの方法は、本開示および当業界での情報を考慮に入れることにより、ＳＰＥＸ配列変異型の作製および確認に適用され得る。

ベクター
ある種の実施態様において、ＳＰＥＸポリヌクレオチドは、さらにベクター配列を含むことが望ましい。従って、本発明は、ＳＰＥＸポリペプチドをコード化する核酸配列、またはその相補配列に機能し得るように結合されたベクター配列を含む、精製ポリヌクレオチドを提供する。ＳＰＥＸポリペプチドをコード化する核酸、またはその相補体を、本明細書では「ＳＰＥＸ挿入体」と称す。本明細書で使用されている「ＳＰＥＸベクター」は、「ＳＰＥＸ挿入体」と機能し得るように結合された「ベクター配列」を含む。ＳＰＥＸベクター配列は、例えば、ＳＰＥＸ ｍＲＮＡ、ＳＰＥＸポリペプチド、またはＳＰＥＸハイブリダイゼーション配列（例、「アンチセンス」核酸）を発現させるのに有用である。ＳＰＥＸ発現産物は、所望ならば検出可能な標識により標識され得る。例えば、検出可能な標識は、合成中に組込まれ得る。ＳＰＥＸベクターはまた、好都合なクローニングツール（例、シャトルベクター）として、または市販量でのＳＰＥＸ核酸の製造に有用である。適切なＳＰＥＸ挿入体は、表および本項に列挙されているＳＰＥＸポリヌクレオチド、その相補体を含むか、または本明細書に開示されているＳＰＥＸポリペプチドをコード化する（例、上記表１および表２に開示されているＳＰＥＸポリペプチド）。

ＳＰＥＸベクターについての好ましい使用は、細胞へのＳＰＥＸ発現産物の処置における場合である。例えば、ＳＰＥＸポリペプチドは、細胞へＳＰＥＸベクターを導入することにより細胞に処置され得、次いで細胞は、細胞機構を用いてＳＰＥＸ発現産物を合成する。ＳＰＥＸポリペプチドの発現は、例えば、リンパ球の代謝、免疫応答、および／またはＳＰＥＸシグナル変換をモジュレーションするのに有用である。

本明細書で使用されているＳＰＥＸ挿入体は、エンコーディング領域に加えて非翻訳領域、クローニング配列、介在配列、スプライシング配列または他の配列（上記開示により限定）を含み得る。ＳＰＥＸベクターは精製されているのが好ましい。ＳＰＥＸベクターは、環状および線状核酸を含む。

ＳＰＥＸベクター配列は、好ましくはベクターおよび／またはＳＰＥＸ挿入体の発現、複製または他の活性をモジュレーションするための１個またはそれ以上の制御エレメントを含む。制御エレメントは、１個またはそれ以上のアフィニティー標識、分枝点、細胞局在性シグナル、エンハンサー、インデューサー、リボソーム内部侵入部位（ＩＲＥＳ）、イントロン、コザック配列、ポリアデニル化部位（ポリＡ部位）、プロモーター、精製標識、リプレッサー、選択可能マーカー、シグナル配列、サイレンサー、スプライス受容体、スプライス供与体、開始コドン（イニシエーターコドン、翻訳開始部位、ＡＴＧ）、停止コドン、ＴＡＴＡボックス、ターミネーター、および転写開始部位（例、シャイン‐ダルガルノ配列）を含む。制御エレメントは、ベクター配列および／またはＳＰＥＸ挿入体に含まれ得る（所望により、１つまたはそれ以上の制御エレメントは、別の独立ベクターに配置され、シスで作用し得る場合がある）。多様なベクター系は、商業的、学究的および他の供給源から入手可能であり、本開示に照らして、当業界でよく知られている技術を用いることにより容易にＳＰＥＸ挿入体と機能し得るように結合され得る。

ある種の好ましい実施態様では、ＳＰＥＸベクターは発現されることが可能である。ＳＰＥＸポリヌクレオチド、好ましくはＳＰＥＸベクターからのＳＰＥＸ産物の発現には、ＤＮＡからＲＮＡへの転写、ＲＮＡからポリペプチドへの翻訳または転写および翻訳の両方が含まれる。一実施態様において、発現は、ＳＰＥＸ ｍＲＮＡを形成するＳＰＥＸポリペプチドをコード化するＳＰＥＸ核酸配列の転写を含む。ＳＰＥＸポリペプチドをコード化する核酸配列は、ベクターに含まれるものとして「枠内」にあるのが好ましい。ほとんどの発現ベクターは、または所望のポリペプチドの合成に適切な読み枠に挿入体が組込まれるように利用可能であるか、容易に適合化される。縮重コドンの表は、アミノ酸残基およびポリペプチド合成中に各アミノ酸残基を特定するヌクレオチドコドン（複数も可）間の好ましい対応を提供しており、ＳＰＥＸ挿入体が望ましい読み枠内にあることを配列決定解析で予測または確認するのに有用である。

プロモーターおよびエンハンサー
ＳＰＥＸベクターは、ＳＰＥＸ挿入体の発現を増加させるためのプロモーターおよび／またはエンハンサーを含むのが好ましい。一般に、プロモーターおよびエンハンサーは、鋳型ヌクレオチドからの転写物の発現をモジュレーションする制御エレメントである。エンハンサーおよびプロモーター間の基本的な区別は、操作的なものであって、絶対的ではない。典型的には、プロモーターエレメントは、ＲＮＡポリメラーゼII（または他のポリメラーゼ）についての開始部位の周囲に位置し、転写方向に指向する。プロモーターエレメントは、通常７〜２０塩基の核酸を含み、転写アクチベーターおよび／またはリプレッサーについての１つまたはそれ以上の認識部位を含み得る。典型的には、各プロモーターにおけるモジュールは、ＲＮＡ合成についての開始部位の位置を定めるべく機能する。これのよく知られている例は、ＴＡＴＡボックスである。一般に、エンハンサーエレメントは、転写開始部位から一定の距離をおいて転写をモジュレーション（典型的には刺激）することができる。エンハンサーは、転写開始部位と同じ核酸（シス）または別の核酸（トランス）に配置され得る。プロモーターを含む実施態様では、「機能し得るように結合された」の語は、プロモーターが挿入体に関してＲＮＡポリメラーゼ開始および転写物の発現を制御する位置および／または配向にあることを意味すると理解される。

プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントは、転写開始頻度を調節し得る。典型的には、これらは、転写開始部位の上流の領域３０〜１１０ｂｐに位置するが、若干のプロモーターは、同じく開始部位の下流に（例、転写された核酸内に）機能性エレメントを含むことが知られている。プロモーターエレメント間のスペーシングは、普通は融通がきくため、エレメントが互いに逆方向にされるかまたは動かされたときでもプロモーター機能は保存される。例えば、ｔｋプロモーター（単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ遺伝子から）では、プロモーターエレメント間のスペーシングは、活性が下降し始める前に５０ｂｐまで間隔を増やすことができる。別の例は、ｌａｃオペロンを含む。プロモーターによっては、個々のエレメントが転写を活性化するように協同的または独立的に機能し得ると思われる。

ある種の実施態様において、ＳＰＥＸ挿入体の発現を制御するのに使用される特定プロモーター（複数も可）は、それが標的環境において意図した実施態様にとって望ましいかまたは充分なレベルで（例、検出可能レベルで、または天然に生成されたＳＰＥＸと比べて過剰発現された状態で）ポリヌクレオチドを発現させ得るものでありさえすれば、厳密なものではないと考えられる。すなわち、例えば、ヒト細胞での発現については、ヒト細胞で発現され得るプロモーターに隣接し、その制御下においてポリヌクレオチドコーディング領域を配置させるのが好ましい。概して、かかるプロモーターは、ヒトまたはウイルスプロモーターを含み得る。有用なウイルスプロモーターには、ＨＳＶ ｔｋ、ＳＶ４０初期転写ユニット、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、マウス乳癌ウイルス−長末端反復（ＭＭＴＶ−ＬＴＲ）、マウス肉腫ウイルス（ＭＳＶ−ＬＴＲ）、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ−ＬＴＲ）由来のものがある。ヒトまたは他の哺乳類遺伝子由来の有用なプロモーターには、β−アクチンおよび延長因子１−α（ＥＦ−１α）由来のものがある。様々な環境における発現またはモジュレーションされた発現に適切なプロモーターおよびエンハンサーエレメントを有する多様なベクターが利用可能である。ある種の好ましい環境には、ヒト細胞、好ましくはリンパ球、およびさらに好ましくはＴ細胞またはＢ細胞がある。

熟知された特性をもつプロモーターを用いることにより、ＳＰＥＸポリヌクレオチドの発現のレベルおよびパターンがは最適化され得る。例えば、特異的細胞において実質的に高い活性を示すプロモーター、例えばチロシナーゼ（黒色腫）、アルファ−フェトプロテインおよびアルブミン（肝癌）、ＣＣ１０（肺癌）および前立腺特異的抗原（前立腺癌）の選択により、ＳＰＥＸポリヌクレオチドの組織特異的発現が可能となる。従って、好ましい実施態様において、プロモーターおよび／またはベクターは、特定の望ましい環境において最適である転写を駆動するように選択される。

非細胞性発現環境
通常「インビトロ発現（系）」として知られている非細胞性発現環境は、典型的には反応容器に含まれる鋳型ポリヌクレオチドを転写および／または翻訳するための細胞ライゼートまたは因子を包含する。好ましくは、インビトロ発現系を、少なくとも部分精製することにより、阻害剤を除去および／または試薬濃度を高め、さらに好ましくは、実質的に精製する。インビトロ発現系は市販されている（例、ＳＰ６転写キット、Ｔ７転写キット、シングル・チューブ・プロテイン・システム３、およびレッド・ノヴァ・ライゼート・キット、これらは各々ノヴァゲン（マディソン、ウィスコンシン）から入手可能、およびラピッド・トランスレーション・システム（ＲＴＳ）、ロシュ（インディアナポリス、インディアナ）から入手可能）。非細胞性発現系は、興味の対象であるＳＰＥＸ発現産物が細胞性発現環境における宿主細胞にとって有毒である事象において好ましい。一実施態様は、インビトロ発現系での使用に適合化されたＳＰＥＸ発現ベクターを提供する。

ＳＰＥＸ宿主細胞
有用な細胞性発現環境には、原核生物および真核生物宿主細胞がある。「宿主細胞」の語は、ＳＰＥＸポリヌクレオチド、好ましくはＳＰＥＸベクター含む細胞をいい、上記ＳＰＥＸポリヌクレオチドは、人為的操作により細胞へ導入され、ＳＰＥＸ宿主細胞を形成する（例、組換え非天然ＳＰＥＸポリヌクレオチドが、発現目的で細胞へ導入される）。従って、一実施態様は、ＳＰＥＸベクターを含む宿主細胞を提供する。上記「宿主細胞」は、本明細書では「ＳＰＥＸ宿主細胞」と称される。好ましくは、ＳＰＥＸベクターは、ＳＰＥＸ発現ベクターを含み、好ましくはＳＰＥＸ発現産物を生産し得る。

好ましい実施態様では、ＳＰＥＸ宿主細胞は、発現に適切な形質転換ＳＰＥＸポリヌクレオチド（例、組換えＳＰＥＸ発現ベクター）が存在しない場合にはＳＰＥＸ発現性を有しない。人為的操作によるＳＰＥＸポリヌクレオチドの導入を伴わずにＳＰＥＸを発現する細胞は、本明細書で使用されているところの「天然ＳＰＥＸ発現」を有する。人為的操作により細胞へ形質転換されたＳＰＥＸポリヌクレオチドからのＳＰＥＸ発現を、本明細書では「外因性ＳＰＥＸ発現」または「組換えＳＰＥＸ発現」という。外因性ＳＰＥＸ発現は、人為的に指令されたプロセスでの宿主細胞のゲノムへ組込まれたＳＰＥＸポリヌクレオチドからのＳＰＥＸ発現を包含するものとする。実施態様によっては、所望によりＳＰＥＸ宿主細胞が、天然ＳＰＥＸ発現性を有し得る場合もある。しかしながら、外因性ＳＰＥＸポリヌクレオチドの発現産物は、天然ＳＰＥＸ生成物よりも多大な存在量であるのが好ましい（すなわち、組換えＳＰＥＸポリヌクレオチドは過剰発現されるのが好ましい）。

ある種の実施態様は、ＳＰＥＸ挿入体と機能し得るように結合されたベクター配列を含むポリヌクレオチドを提供し、上記ベクター配列は、宿主細胞、好ましくは細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞または哺乳類細胞の一つまたはそれ以上においてＳＰＥＸ挿入体を発現させるための一つまたはそれ以上の制御エレメントを含むものとする。本発明に照らしてＳＰＥＸ挿入体を発現させるのに有用である多様なベクターおよび宿主細胞は、学究的、商業的および他の供給源から入手可能である。有用な宿主細胞のある種の追加例には、エシェリキア・コリ（E.coli）およびエシェリキア・コリのＫ１２株（細菌細胞）、酵母細胞シゾサッカロマイシス・セレヴィシエ（S.cerevisiae）、シゾサッカロマイシス・ポンベ（S.pombe）、およびピキア・パストリス（P.pastoris）；昆虫細胞スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）９（Ｓｆ９）、Ｓｆ２１、トリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni）（一般にはＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞と称される）、およびＳ２（ショウジョウバエ、drosophilae）がある。そして哺乳類細胞には、ＨＥＫ−２９３（ヒト腎臓）、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ボーズ(Bowes)黒色腫（ヒト黒色腫）、ヒーラ（卵巣癌）、ＣＨＵ２（ヒト口腔腫瘍）、およびＨＢＥＣ−９０（ヒト脳内皮）、３３.１.１（マウスプレ−Ｂ細胞）、Ｋ４６（マウスＢリンパ腫）、ＴＲ２（マウス稀突起膠細胞）がある。ある種の好ましい哺乳類細胞には、リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、未熟Ｔ細胞、未熟Ｂ細胞、分化Ｔ細胞、分化Ｂ細胞、およびナチュラルキラー細胞がある。これらの細胞およびその他のものは、例えばインビトロゲン、ノヴァゲン、クロンテック、およびアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、マナッサス、バージニア）から入手可能である。

ある種の実施態様では、複数の宿主細胞でＳＰＥＸ挿入体を発現させるのが望ましい。従って、ある種の実施態様では、多宿主細胞型でのＳＰＥＸ挿入体の発現に適切な制御エレメントを有するベクター系を使用するのが好ましい。例えば、ＴＲＩＥＸ ＭＵＬＴＩＳＹＳＴＥＭ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＶＥＣＴＯＲＳ（カルビオケム、ラジョラ、カリフォルニア）は、エシェリキア・コリ（E.coli）、バクロウイルスおよび哺乳類細胞型での発現について最適化された転写および翻訳シグナルを含む。

細菌における発現
ＳＰＥＸ挿入体によるクローニングに有用な細菌細胞クローニングベクターには、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２９、ｐＢＣ−ＳＫ、ｐＢＣ−ＫＳ、ＬＡＭＢＤＡ ＺＡＰ II（学究的供給源、プロメガ（マディソン、ウィスコンシン）またはストラタジーン（ラジョラ、カリフォルニア）から入手可能）がある。宿主細胞は、所定の細胞環境で機能し得る複製起点を含むのが好ましい。例えば、細菌性ベクターは、エシェリキア・コリ（E.coli）複製起点（ｏｒｉ）を含み得る。

ｐＥＴベクターシリーズ（ノヴァゲン（マディソン、ウィスコンシン）、プロメガ、ストラタジーン）は、Ｔ７因子を含む細菌細胞においてＳＰＥＸ挿入体の高レベル発現を駆動するのに有用なＴ７プロモーターおよびＴ７遺伝子１０翻訳開始シグナルを含む。ｐＥＴベクター系は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを欠く細菌細胞、例えばＢＬ２１（ＤＥ３）へのトランスフェクションにより誘導性にされる。発現は、欠けているＴ７ポリメラーゼを発現させるためのベクターによるトランスフェクションにより、または天然Ｔ７発現の抑制を除去することにより誘導される。

ｐＬ発現系（インビトロゲン、カールスバッド、カリフォルニア）はまた、細菌発現系の厳しい誘導可能な転写制御をもたらす。ｐＬベクターは、強力なｐＬプロモーターを含み、ＳＰＥＸ挿入体の発現を駆動し得る。ｐＬプロモーターは、エシェリキア・コリ（E.coli）宿主で発現されるラムダｃｌリプレッサータンパク質により制御される。ｃｌリプレッサー遺伝子は、厳しく調節されたｔｒｐプロモーターの制御下において細菌染色体へ遺伝子操作により導入される。ＳＰＥＸポリヌクレオチドの発現は、トリプトファンを加えることにより誘導され得る。

ｐＢＡＤベクター（インビトロゲン）は、培養培地へアラビノースまたはグルコースをそれぞれ加えることによりＳＰＥＸ挿入体の転写を刺激または抑制するようにモジュレーションされ得るａｒａＢＡＤプロモーターから駆動される、機能し得るように結合されたＳＰＥＸ挿入体の誘導性発現に有用である。細菌系での発現を駆動する一つまたはそれ以上の制御エレメントを含む追加のベクターには、Ｔｒｃ／Ｔａｃプロモーターベクター（クロンテック、パロアルト、カリフォルニア）、ラムダＲＰプロモーターベクター（ファルマシア、ピーパック、ニュージャージー）、およびファージＴ５プロモーターに基くベクター（キアゲン、バレンシア、カリフォルニア）がある。実施態様により、一般に、細菌細胞においてＳＰＥＸ挿入体の生成物を発現させるための一つまたはそれ以上の制御エレメントを含む各ベクターまたはいずれかのベクターと機能し得るように結合されたＳＰＥＸ挿入体が提供される。

酵母での発現
ある種の実施態様では、ＳＰＥＸ挿入体と機能し得るように結合されたベクター配列を含むポリヌクレオチドが提供され、上記ベクター配列は、酵母細胞においてＳＰＥＸ挿入体を発現させるための一つまたはそれ以上の制御エレメントを含んでいる。酵母での発現が可能なＳＰＥＸ発現ベクターは、酵母複製起点（例、ＣｏｌＥ１）を含むのが好ましい。

ｐＥＳＣベクター（ストラタジーン）は、酵母細胞、好ましくはシゾサッカロマイシス・セレヴィシエ（S.cerevisiae）で発現させるためのＧＡＬ１およびＧＡＬ１０制御エレメントを含む。ｐＥＳＣベクターセットは、ＦＬＡＧエピトープ、ｃ−ｍｙｃエピトープ（標識）、およびＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２またはＵＲＡ３選択可能マーカーを含む選択可能な特徴を用いることにより１種またはそれ以上の異なる発現産物（の発現）をもたらす。

ｐＹＥＳベクターセット（インビトロゲン）は、ＧＡＬ１プロモーターを含み、酵母細胞、好ましくはシゾサッカロマイシス・セレヴィシエ（S.cerevisiae）におけるＳＰＥＸ挿入体の発現に有用である。ＥＳＰ酵母タンパク質発現および精製システム（インビトロゲン）は、シゾサッカロマイシス・ポンベ（S.pombe）のｎｍｔ１プロモーターを含み、酵母細胞、好ましくはシゾサッカロマイシス・ポンベ（S.pombe）におけるＳＰＥＸ挿入体の発現に有用である。ＥＳＰベクターセットは、ＦＬＡＧエピトープ、ｃ−ｍｙｃエピトープ（標識）、およびＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２またはＵＲＡ３選択可能マーカーを含む選択可能な特徴を用いることにより１種またはそれ以上の異なる発現産物（の発現）をもたらす。ある種のＥＳＰベクターは、さらにＧＳＴアフィニティークロマトグラフィーによる酵母発現ＳＰＥＸ−ＧＳＴ融合ポリペプチドの好都合な精製のためのグルタチオンｓトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ペプチド標識を含む。ＳｐＥＣＴＲＡシゾサッカロマイシス・ポンベ（S.pombe）発現系（インビトロゲン）は、酵母での発現が可能なＳＰＥＸベクターの構築に有用な追加ベクターを含む。ピキア・パストリス（Pichia pastoris）発現系（インビトロゲン）は、酵母、好ましくはピキア・パストリス（Pichia pastoris）、および細菌、好ましくはエシェリキア・コリ（E.coli）での発現が可能なＳＰＥＸ発現ベクターの構築に有用なベクターを含む。

昆虫細胞での発現
ある種の実施態様では、ＳＰＥＸ挿入体と機能し得るように結合されたベクター配列を含むポリヌクレオチドが提供され、上記ベクター配列は、昆虫細胞でＳＰＥＸ挿入体を発現させるための一つまたはそれ以上の制御エレメントを含んでいる。

ＤＥＳ（ショウジョウバエ（ドロソフィラ、Drosophila）発現系、インビトロゲン）は、ショウジョウバエ（ドロソフィラ、Drosophila）細胞、好ましくはＳ２細胞でのＳＰＥＸ挿入体発現用に最適化される。ＤＥＳベクターｐＡｃ５.１／Ｖ５−ＨｉｓおよびｐＭＴ／Ｖ５−Ｈｉｓは、Ａｃ５.１またはＶ５プロモーターによりそれぞれ促進される発現をもたらし、検出および／または精製を目的とするＨｉｓ標識を含む。ｐＭＴ／ＢｉＰ／Ｖ５−Ｈｉｓベクターは、さらに発現されたポリペプチドの分泌を目的とするＢｉＰショウジョウバエ（ドロソフィラ、Drosophila）分泌シグナル配列を提供する。

ＩＮＳＥＣＴＳＥＬＥＣＴシステム（インビトロゲン）は、好ましくは分泌タンパク質の発現を目的とする、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、ＨＩＧＨ ＦＩＶＥおよびＳ２を含む広範囲の昆虫セルラインにおけるＳＰＥＸ挿入体の発現に有用である。

哺乳類細胞における発現
ある種の実施態様では、ＳＰＥＸ挿入体と機能し得るように結合されたベクター配列を含むポリヌクレオチドが提供され、上記ベクター配列は、哺乳類細胞、好ましくはヒト細胞においてＳＰＥＸ挿入体を発現させるための一つまたはそれ以上の制御エレメントを含んでいる。

アデノウイルスおよびレトロウイルスベクターは、哺乳類細胞におけるＳＰＥＸ挿入体の発現に有用である。例えば、ＶｉｒａＰｏｗｅｒアデノウイルス発現系は、選択されたプロモーターを好都合に挿入させるヒトＣＭＶ発現プロモーターを有するかまたはプロモーターを随伴しないＥ１およびＥ３欠失ｐＡｄ−ＤＥＳＴアデノウイルスベースのベクターを含む。アデノウイルス粒子のパッケージングは、製造会社の文献（インビトロゲン）に記載されている。別の例において、ＶｉｒａＰｏｗｅｒレンチウイルス発現系は、分裂中および非分裂細胞（インビトロゲン）の安定した形質導入用に最適化されている。

ｐＳｈｏｏｔｅｒベクター（インビトロゲン）は、ＥＦ−１αまたはＣＭＶプロモーターを含み、さらにＳＰＥＸポリペプチドを発現させ、発現されたＳＰＥＸポリペプチドを特異的細胞区画へ指向させ得るシグナル配列を含み得る。例えば、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏベクターは、ＥＦ−１αプロモーターおよびｃ−ｍｙｃ標識を含む。シグナル配列は、細胞質発現を目的とする本ベクターには含まれない。ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｎｕｃベクターは、ＥＦ−１αプロモーター、ｃ−ｍｙｃ標識、および発現されたＳＰＥＸポリペプチドを哺乳類細胞の核へ指向させ得る核局在化配列（ＳＶ４０から）を含む。ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｍｉｔｏベクターは、ＥＦ−１αプロモーター、ｃ−ｍｙｃ標識、および発現されたＳＰＥＸポリペプチドを哺乳類細胞の核へ指向させ得るミトコンドリア局在化配列（ＣＯＸ VIII ｃＤＮＡから）を含む。ｐＳｈｏｏｔｅｒベクターの別のセットは、ＥＦ−１αプロモーターに取って代わるＣＭＶプロモーターを含む。ｐＳｈｏｏｔｅｒベクターは、ほとんどのヒト細胞および組織を含む広範囲の哺乳類細胞型における発現を駆動し得る。

ｐＳＧ５ベクター（ストラタジーン）は、哺乳類（ヒトを含む）および細菌細胞型を含む広範囲の細胞型においてＳＰＥＸ挿入体の発現を駆動し得る。哺乳類発現は、ＳＶ４０初期プロモーターにより駆動され、細菌性発現はＴ７プロモーターにより駆動される。ｐＳＧ５ベクターは、好ましくはさらにｏｒｉ、アンピシリン耐性遺伝子およびファージｆ１起点（例、突然変異誘発および配列決定で使用されるｓｓＤＮＡを回収(rescue)させ得る）を含む。

ｐＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ−１ベクター（ストラタジーン）は、ＣＭＶプロモーターを用いることによりＳＰＥＸ挿入体およびマーカー遺伝子（この例では、ヒト化緑色蛍光タンパク質（ｈｒＧＦＰ））を発現し得る。このベクターは、単一発現ｍＲＮＡ種からＳＰＥＸ挿入体およびマーカー遺伝子の両方を発現させるリボソーム内部侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む。すなわち、ＳＰＥＸおよびマーカー遺伝子は、融合ｍＲＮＡとして発現され、また独立ポリペプチドとして発現される。他のＳＰＥＸ発現ベクターは、所望ならば、さらにＩＲＥＳを含み得る。

ある種の実施態様において、ＳＰＥＸベクター構築物は、さらに別の発現産物をコード化するセグメントを含む。例えば、このベクターは、選択可能マーカー、検出可能標識、および／または精製標識を含み得る。例としては、ａｍｐ、ｎｅｏ、ｈｙｇｒｏ、ｚｅｏ、ｐｕｒｏ、ミコフェノーリック、ｋａｎ、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、強化シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）、強化黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、ＤｓＲｅｄ２、ＨｃＲｅｄ１、ｍｙｃ標識、ＦＬＡＧ標識、およびＧＳＴ標識をコード化するセグメントがある。ある種の実施態様において、ベクターは、ＳＰＥＸ挿入体と機能し得るように結合された融合体を形成するように配置された標識を提供するように選択される。ある種のベクターは、さらにリボソーム内部侵入部位（ＩＲＥＳ）を提供する。例えば、Palmenberg et al.による米国特許第４９３７１９０号参照、これについては出典明示により援用する。一実施態様において、ＩＲＥＳは、単転写物ベクター（ＳＴＶ）を用いることにより動物細胞における２種のタンパク質（少なくとも一方はＳＰＥＸポリペプチドを含む）の発現を容易にする。

ＳＰＥＸの細胞性発現は、典型的には選択された細胞へのＳＰＥＸ発現構築物の導入を伴い、そこで細胞性因子は発現を駆動する。細胞への発現ベクターの導入方法は、当業界では公知である（例、リン酸カルシウム沈澱、脂質ベースのトランスフェクション、ペプチドベースの膜転位、電気穿孔など）。Laneによる米国特許第６３１２９５６号およびFelgner et al.による米国特許第６１６５７２０号参照、各特許については出典明示により援用する。

下記表７は、ＳＰＥＸベクターの好ましい実施態様を提供し、表６は、これらのＳＰＥＸベクター構築物の好ましい特徴および使用について記載している。

表６
好ましいＳＰＥＸ発現ベクター

上記表６におけるベクターは各々、当業者には公知の標準クローニング方法を用いて製造される。「バックボーン名称」は、「ベクター配列」を指す。

表７
ある種のＳＰＥＸベクターの好ましい使用

抗体
本発明の一実施態様は、ＳＰＥＸポリペプチドと免疫反応する抗体を提供する。「抗体」の語は、無傷抗体分子および／または抗体分子の免疫学的活性部分を含む、抗体のあらゆる形態を包含するものとする。抗体およびその活性フラグメントは、当業界ではよく知られており、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ポリクローナル、モノクローナル、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')_２、Ｆ(ｖ)、１本鎖抗体（ＳＣＡ）、１本鎖Ｆａｂ、ヒト化、ハイブリッドなどがある。本発明で提供される抗体は、ＳＰＥＸポリペプチドの一つまたはそれ以上の部分と免疫反応する。抗体は単離されているのが好ましい。抗体は、組換え体、キメラ、またはそれ以外の非天然抗体を含むのがさらに好ましい。

抗ＳＰＥＸ抗体は、例えば、ＳＰＥＸシグナル変換活性、リンパ球活性化または代謝、および免疫応答をモジュレーションするのに有用である。抗ＳＰＥＸ抗体はまた、診断における検出剤として有用であり、リンパ球集団を発現するＳＰＥＸの検出、精製および／または選別に有用なキットである。

好ましい抗体は、抗ＳＰＥＸモノクローナル抗体、好ましくはヒトまたはヒト化抗ＳＰＥＸモノクローナル抗体である。他の好ましい抗ＳＰＥＸ抗体は、ｈＳＰＥＸポリペプチド、ｍＳＰＥＸポリペプチド、またはｍＳＰＥＸｂポリペプチド（上記で開示されているマウスＳＰＥＸの対立遺伝子）の一つと特異的に免疫反応する。配列番号７、配列番号９および／または配列番号１１と免疫反応する抗ＳＰＥＸ抗体は、ＳＰＥＸチロシンベースドメインを含む全てのマウスおよびヒトＳＰＥＸポリペプチドと（別法として、ＳＰＥＸチロシンベースドメインまたは細胞内ドメインを有する哺乳類ＳＰＥＸポリペプチドと）免疫反応すると考えられる。他の例としての抗ＳＰＥＸ抗体は、表１および表２、表３および表４に示されたＳＰＥＸポリペプチドと免疫反応する。ある種の実施態様では、抗ＳＰＥＸ抗体は、第１ＳＰＥＸポリペプチドと免疫反応するが、第２ＳＰＥＸポリペプチドとは免疫反応しない。例えば、抗ＳＰＥＸ抗体は、表１の１欄および／または２欄に示されたＳＰＥＸポリペプチドと免疫反応するが、表１の３欄に示されたＳＰＥＸポリペプチドとは免疫反応しない。別の例では、抗ＳＰＥＸ抗体は、表２の１欄に示されたＳＰＥＸポリペプチドと免疫反応するが、表２の２欄に示された第２ＳＰＥＸポリペプチドとは免疫反応しない。

ある種の好ましい抗ＳＰＥＸ抗体の抗原性免疫反応性を、配列番号で示された配列の例と一緒に下記表８に示す。

表８
以下の抗原と免疫反応する好ましい抗ＳＰＥＸ抗体

一実施態様は、ＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応し、リンパ球の増殖または他の代謝をモジュレーションし得る抗体、好ましくはモノクローナル抗体を提供する。さらに好ましくは、抗体は、ヒト化モノクローナル抗体を含む。一実施態様において、発現されたＳＰＥＸポリペプチドを含むリンパ球に、ＳＰＥＸ細胞外ドメイン、好ましくはＩｇ様ドメインと免疫反応する抗体を処置することにより、リンパ球の増殖および／または分化が阻害される。

所望により、抗ＳＰＥＸ抗体は、第２エピトープ、例えば異なるＳＰＥＸエピトープまたは非ＳＰＥＸエピトープについての結合ドメインを含み得る（例、１種またはそれ以上の異なるエピトープと結合し得る多価抗体）。

一実施態様において、抗ＳＰＥＸ抗体は、ヒトＳＰＥＸポリペプチドと免疫反応するが、マウスＳＰＥＸポリペプチドとは実質的に免疫反応しない。所望により、抗ＳＰＥＸ抗体は、マウスＳＰＥＸポリペプチドと免疫反応するが、ヒトＳＰＥＸポリペプチドとは実質的に免疫反応しない。上記抗体は、例えば、ヒトおよびマウスＳＰＥＸポリペプチド配列を区別するのに有用である。

特異的抗原を想定した抗体の製造方法は、当業界ではよく知られている。本発明は、抗ＳＰＥＸ抗体の製造に有用なＳＰＥＸ抗原（すなわち免疫原）を提供する。すなわち、本開示を考慮に入れることにより、当業者であれば、本発明の抗ＳＰＥＸ抗体を製造できるはずである。抗体は、一般的に例えば動物（例、ウサギ、マウス、ハムスター、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウシ）、細胞、主として細胞培養物（例、細菌、植物、藻類、昆虫、哺乳類、マウス、ハイブリドーマおよびヒト細胞）において、ファージディスプレーにより、そして抗体スカホールドベクターへのエピトープクローニングおよび様々な細胞型（例、細菌、植物、藻類、昆虫、哺乳類、マウス、およびヒト）のいずれかへの遺伝子導入により製造される。従って、本発明はまた、抗ＳＰＥＸ抗体を生産し得る細胞を提供する。

ある種の実施態様において、抗ＳＰＥＸ抗体は、検出可能な標識を含む。検出可能な標識の例には、放射性同位元素（例、^１２５Ｉ）、蛍光分子（例、ＳＭＣＣ−活性化ＢＳＡ−フルオレセイン、プロザイム、サンレアンドロ、カリフォルニア）、ビオチニル化、ｍｙｃ標識、ＦＬＡＧ標識、および酵素（例、ペルオキシダーゼ）がある。検出可能な標識および望ましい検出可能標識による抗体の標識またはコンジュゲーションについては、当業界ではよく知られている。典型的には、検出可能標識を、共有結合により抗体と組合わせる。抗体の検出可能な形での標識については多様な市販製品が利用可能である。標識は、抗体の可変部分の構造および／または機能に干渉しないのが好ましい。抗体分子またはその活性フラグメントの代替的領域における標識も当業界ではよく知られている。

ある種の実施態様において、抗ＳＰＥＸ抗体は、第１ＳＰＥＸポリペプチドと免疫反応し、第２ＳＰＥＸポリペプチドとは免疫反応しないのが望ましい。上記特性を有するモノクローナルおよびポリクローナル抗ＳＰＥＸ抗体は、例えば、抗ＳＰＥＸ抗体の製造においてエピトープ特異的ＳＰＥＸ抗原を用いることにより製造され得る。所望ならば、抗体集団をスクリーニングにかけることにより、望ましくない免疫反応性を有する集団の分子が控除または他の形で除去され得る（すなわち、望ましくない抗原を含むマトリックスでのサブトラクションスクリーニングによる）。

ＳＰＥＸ結合パートナーについてのスクリーニング方法
一実施態様は、一つまたはそれ以上のＳＰＥＸ結合パートナーを同定するための候補分子のスクリーニング方法であって、１）候補分子をＳＰＥＸポリペプチドと接触させ、２）候補分子およびＳＰＥＸポリペプチドが結合複合体を形成するか否かを測定し、その場合結合複合体の形成は、候補分子がＳＰＥＸ結合パートナーであることを示すものとし、そして３）ＳＰＥＸ結合パートナーが同定されるまで段階１）および２）を反復することを含む方法を提供する。好ましい候補結合パートナー分子は、小分子有機化合物およびポリペプチドを含む。好ましいＳＰＥＸポリペプチド結合標的は、ＳＰＥＸチロシンベースドメイン（例、配列番号７、配列番号９または配列番号１１）またはＳＰＥＸ Ｉｇ様ドメイン（例、配列番号３、配列番号４５または配列番号８８）を含む。

本発明および当業界での情報を考慮に入れながら、候補分子およびＳＰＥＸポリペプチドが結合複合体を形成しているか否かの測定は、当業界でよく知られている様々な結合検定法を用いて行われ得、そのため本発明は特定の結合検定法により限定はされない。例えば、結合複合体は、抗ＳＰＥＸ抗体を用いた結合複合体の捕捉によって、ＳＰＥＸポリペプチド単独と比べた場合の分子量増加により検出され得る。結合複合体が分子量の変化またはゲルでの移動を通じて、または複合体からのＳＰＥＸポリペプチドの直接検出によって同定され得るように、ＳＰＥＸポリペプチドは、アフィニティー標識または検出可能標識を含むように遺伝子操作され得る。ある種の候補分子は、候補分子がＳＰＥＸポリペプチドとの結合複合体から直接検出され得るように、既知の検出可能特性、例えば抗体免疫反応性部位（エピトープ）、蛍光特性、またはアフィニティー標識（天然または遺伝子操作された）を有し得る。

ＳＰＥＸポリペプチドの単離方法
一実施態様は、ＳＰＥＸポリペプチドを含む生物学的試料からのＳＰＥＸポリペプチドの精製方法であって、抗ＳＰＥＸ抗体をマトリックスに結合させたアフィニティーマトリックスと生物学的試料を接触させることにより、ＳＰＥＸポリペプチドおよびマトリックスに結合した抗体を含む免疫複合体を生成させ、マトリックスから生物学的試料の残りを分離し、抗ＳＰＥＸ抗体からＳＰＥＸポリペプチドを分離し、そしてＳＰＥＸポリペプチドを集めることにより、精製ＳＰＥＸポリペプチドを得ること含む方法を提供する。

リンパ球の活性の調節方法
一実施態様は、ＳＰＥＸ受容体を発現するリンパ球の代謝（好ましくは増殖または活性化）のモジュレーション方法であって、ＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応する抗ＳＰＥＸ抗体（好ましくはモノクローナル抗体）とリンパ球を接触させることを含む方法を提供する。ある種の実施態様は、ＳＰＥＸ受容体活性が、ＳＰＥＸ受容体を発現するリンパ球の代謝をモジュレーション、好ましくは阻害し、さらに好ましくは増殖を阻害することを開示している。ＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメイン、好ましくはＩｇ様ドメインと免疫反応する抗体は、本明細書におけるある種の実施態様で、ＳＰＥＸ活性を阻害することにより、ＳＰＥＸが誘導する代謝の抑制を解く、すなわち、抗体は、ＳＰＥＸ発現性リンパ球の代謝の相応する増加をもたらすことが開示されている。有用な抗体には、ラット抗ＳＰＥＸ抗体ＰＫ３、ＰＫ１８およびＰＫ２３（またはその免疫反応性フラグメント）がある。好ましい抗体には、ＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応するヒト化またはヒト抗体がある。好ましいリンパ球には、Ｂ細胞およびＴ細胞がある。ある種の好ましい実施態様では、抗体は、配列番号１３、配列番号５５、または配列番号８５に示されたアミノ酸配列と免疫反応する。リンパ球は、インビトロ培養またはインビボに存在し得る。例えば、抗体またはその免疫反応性フラグメントを（例、注射により）ヒトまたはヒト以外の哺乳類へ投与することにより、リンパ球をインビボで抗体と接触させる。

ｍＳＰＥＸ ｃＤＮＡの同定およびクローニング
正の選択は、未熟な胸腺細胞が、胸腺間質により発現されるＭＨＣ／自己ペプチド複合体のＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）認識の結果として成熟シグナルを受容する発達プロセスである。低濃度の薬理学的活性化因子ホルボールエステル（例、ＰＭＡ）および／またはイオノマイシンに未熟胸腺細胞を暴露することにより、インビトロでダブルポジティブ（ＤＰ）胸腺細胞の生存および分化が誘導され、インビボ胸腺細胞の容認された正の選択のモデル系が提供される。

核酸マイクロアレイを用いることにより、本発明者らは、非刺激胸腺細胞に対する胸腺細胞の正の選択中における核酸発現の変化を確認した。ＴＣＲα−鎖欠損胸腺細胞（マウス）を、活性化および非活性化胸腺細胞をそれぞれもたらす０.２ｎｇ／ｍｌのＰＭＡおよび０.２ｍｇ／ｍｌのイオノマイシンの存在または非存在下における培地で培養した。ＴＣＲα−鎖欠損胸腺細胞は、遺伝子突然変異故にＤＰ発達段階で遮断される。刺激を加えた後のこれらの細胞における遺伝子発現は、胸腺細胞の発生を特徴とする。細胞を６時間インキュベーション後、ＲＮｅａｓｙ ＲＮＡおよびオリゴテックスｍＲＮＡキット（キアゲン）を用いてポリ−Ａ＋ＲＮＡを単離した。ポリ−Ａ＋ＲＮＡを、製造業者の使用説明書（インサイト・ゲノミクス）に従ってマウス１.０２アレイを用いる比較ｃＤＮＡアレイ分析にかけた。ＧＥＭＴｏｏｌｓ解析ソフトウェア（インサイト・ゲノミクス）を用いて、マイクロアレイのシグナル解析を実施した。

本発明者らは、非刺激胸腺細胞に対する刺激胸腺細胞における配列の発現比に基くさらなる試験用に２つの配列を選択した。発現比を、マウスアレイに含まれるＥＳＴである、ＥＳＴ ＡＡ１８４１８９およびＡＡ１７７３０２のそれぞれと各標識ｃＤＮＡのハイブリダイゼーションの正規化シグナルから測定した。各配列の発現は、ＥＳＴ ＡＡ１８４１８９およびＡＡ１７７３０２とハイブリダイゼーションする配列についてそれぞれ９.１倍および６.６倍に増加していた。マウス１.０２アレイにおけるこれらのＥＳＴは、４週令Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの脾臓から誘導されたソアレスマウス３ＮｂＭＳラブラリーと呼ばれるマウスライブラリーに由来するものであった。

本発明者らは、ＥＳＴ ＡＡ１８４１８９およびＡＡ１７７３０２を、ＢＬＡＳＴソフトウェア（ＮＣＢＩ）を用いてリンクし、マウス核酸配列のデータベースとＥＳＴの配列を比較することを決定した（各ＥＳＴは、マウス配列データベースにおける共通配列に対応する）。すなわち、ＥＳＴ ＡＡ１８４１８９およびＡＡ１７７３０２は、より完全な核酸の一部であることが決定されている。５'完全(most)ＥＳＴ（ＡＡ１７７３０２）を用いることにより、本発明者らは、反応における鋳型として刺激胸腺細胞から調製されたｃＤＮＡを用いて、ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅（ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅キット、クロンテック）により完全長遺伝子をクローン化した。

上記遺伝子を、本明細書ではマウス脾臓発現（mouse spleen expressed）遺伝子（ｍＳＰＥＸ遺伝子）と称す。一例としてのｍＳＰＥＸ核酸は、配列番号１０５に示されており、配列番号８４に示されたコーディング領域を含む。ＧｅｎＢａｎｋのＢＬＡＳＴ検索は、ＳＰＥＸ ｃＤＮＡが新規タンパク質をコード化することを明らかにしている。ｍＳＰＥＸ核酸によりコード化される具体例としてのｍＳＰＥＸポリペプチドは、配列番号６３に示されている。シグナル配列（例、配列番号４３）は、典型的には細胞プロセシング中に開裂され、一例として配列番号６２に示された成熟ｍＳＰＥＸポリペプチドが形成される。ｍＳＰＥＸポリペプチドおよびタンパク質データベース（ＮＣＢＩ）のＰｆａｍファミリー間の配列比較を用いることにより、発明者らはポリペプチドの予測される細胞外部分において免疫グロブリン様ドメインを同定した。しかしながら、発明者らは、ＳＰＥＸが、特定免疫グロブリン含有スーパーファミリー構成員との密接な相同性を欠くことを観察した。

ｈＳＰＥＸ ｃＤＮＡの同定およびクローニング
ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおけるヒト配列とｍＳＰＥＸ配列の配列比較を用いることにより、本発明者らは、ヒトＥＳＴ ＡＩ７９２９５２およびＡＡ９３１１２２がｍＳＰＥＸポリヌクレオチドと平行整列すること、そしてヒトＥＳＴが、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおける単一ヒトクローンと対応することを測定した。ヒトクローン、および多くの汚染性クローンを含む細菌穿刺培養物（ＡＩ７９２９５２）を、ＩＭＡＧＥコンソーシアム（ローレンス・リバーモア・ナショナル・ラボラトリー、リバーモア、カリフォルニア）から購入した。ｍＳＰＥＸと相同的なヒト遺伝子配列を、穿刺培養物から精製し、サブクローニングし、配列決定する。一例としてのｈＳＰＥＸ核酸配列は配列番号１０４に示されており、配列番号４２に示されたコーディング領域を含む。ｈＳＰＥＸ核酸配列によりコード化される一例としてのｈＳＰＥＸポリペプチドは、配列番号２１に示されている。シグナル配列（例、配列番号１）は、典型的にはｈＳＰＥＸタンパク質の細胞プロセシング中に開裂され、一例として配列番号２０に示された成熟ｈＳＰＥＸポリペプチドを形成する。

抗ｍＳＰＥＸモノクローナル抗体
融合タンパク質、ｍＳＰＥＸ細胞外ドメイン（ＳＰＥＸシグナル配列を含む）およびヒンジ、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを有する融合体をコード化するコーディング領域を含む単離された発現ベクター構築物（本明細書ではｐ−ｍＳＰＥＸ−Ｉｇと称す）を調製する。ｐ−ｍＳＰＥＸ−Ｉｇベクターを、培養中の２９３細胞へトランスフェクションする。抗ヒトＩｇＧ１抗体でプローブしたウエスタンブロットにより評価したところによると、ｐ−ｍＳＰＥＸ−Ｉｇトランスフェクション２９３細胞は、ｍＳＰＥＸ−Ｉｇ融合タンパク質を発現および分泌する。トランスフェクション２９３細胞の上清から、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより、ｍＳＰＥＸ−Ｉｇ融合タンパク質を精製する。

ＣＦＡで乳化した精製組換えｍＳＰＥＸ−Ｉｇにより、ラットを尾の付け根のところで免疫化することにより、モノクローナル抗体を産生させる。所定の抗原に対してモノクローナル抗体を含む抗体を産生させる手順および技術は、当業界ではよく知られている。２週間後内側腸骨リンパ節を採取し、標準方法によりＹＢ２／０細胞と融合させる。かくして製造された抗体を、細胞表面ｍＳＰＥＸ−ＹＦＰ融合タンパク質（ＹＦＰは、黄色蛍光タンパク質の略語である）を発現するようにトランスフェクションされたＤＰＫおよび２９３細胞を用いたＦＡＣＳによりｍＳＰＥＸとの特異的免疫反応性についてスクリーニングする。１種またはそれ以上の抗ｍＳＰＥＸモノクローナル抗体がスクリーニング過程で同定されるまで、スクリーニングを続行する。ＹＦＰ標識により、トランスフェクションされた細胞が、細胞表面でｍＳＰＥＸ−ＹＦＰ融合タンパク質を発現することが証明され得、ｍＳＰＥＸ−ＹＦＰ融合タンパク質発現に対する細胞性抗体結合の相対レベルの相関関係が示され得る。具体的には、スクリーニング手順に使用されるＤＰＫおよび２９３細胞を、ｐＥＹＥＰ−Ｎ１ベクター（クロンテック）へのｍＳＰＥＸ遺伝子挿入体のクローニングから作製された単離発現ベクター構築物でトランスフェクションする。ｐＥＹＥＰ−Ｎ１ベクターは、ＹＦＰ標識を供給し、ｐＥＹＥＰ−Ｎ１からのｍＳＰＥＸ挿入体の発現により、ＹＦＰ標識と機能し得るように結合されたｍＳＰＥＸポリペプチドを含む融合タンパク質の発現が誘導される。３種のハイブリドーマＰＫ３、ＰＫ１８およびＰＫ２３がこのスクリーンから得られる。所望により、標準方法を用いてハイブリドーマを再クローニングし、抗体を精製してもよい。

かくして製造されたモノクローナル抗体は、ｍＳＰＥＸの細胞外ドメインと特異的に免疫反応する。ｍＳＰＥＸの細胞外ドメインと免疫反応する３種のモノクローナル抗体を本明細書ではＰＫ３、ＰＫ１８およびＰＫ２３と称す。

抗ｈＳＰＥＸモノクローナル抗体
実施例３に開示した方法を用いて、ｈＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインと特異的に反応するモノクローナル抗体を製造するが、ただし、１）融合タンパク質、ｍＳＰＥＸ細胞外ドメイン（ＳＰＥＸシグナル配列を含む）およびヒンジ、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを有する融合体をコード化するコーディング領域を含むｐ−ｈＳＰＥＸ−Ｉｇ発現ベクターを製造し、これを用いてラットにおいてモノクローナル抗体を製造する、および２）ｈＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインをコード化するｈＳＰＥＸポリヌクレオチドを、ｐＥＹＥＰ−Ｎ１ベクターへクローン化し、ＤＰＫおよび２９３細胞で発現させ、上記で開示したＦＡＣＳ−ＹＦＰ手順を用いてモノクローナル抗体についてスクリーニングすることを除く。製造されたモノクローナル抗体は、ｈＳＰＥＸの細胞外ドメインと特異的に免疫反応する。

ＭＡＰキナーゼシグナリングは、ＳＰＥＸ発現を刺激する
ｍＳＰＥＸおよびｈＳＰＥＸ ｍＲＮＡの発現を、ＰＭＡおよびイオノマイシンによる刺激の存在または非存在下およびＭＥＫ阻害剤（１０μＭ Ｕ０１２６）の存在または非存在下における培養ＤＰ胸腺細胞で比較する。ＰＭＡおよびイオノマイシン刺激による観察されたＳＰＥＸ ｍＲＮＡ発現（マウスおよびヒト細胞の両方で）の増加は、一実験では約７０％までＭＥＫ阻害剤により阻害される。これらのデータは、ＳＰＥＸ ｍＲＮＡ発現の刺激をまねくＭＡＰキナーゼシグナリングと一致する。

細胞性ｍＳＰＥＸの単離
マトリックス結合抗ｍＳＰＥＸモノクローナル抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、還元的および非還元的条件下でマウス脾臓細胞全細胞ライゼートからｍＳＰＥＸタンパク質を単離する。マトリックス結合抗体を、ライゼート中のｍＳＰＥＸポリペプチドが抗体と結合するのに充分な条件下で細胞ライゼートと接触させ、それによってマトリックス、抗ｈＳＰＥＸ抗体、およびｈＳＰＥＸポリペプチドを含む反応複合体を形成させる（免疫反応緩衝液および他の条件、例えばインキュベーション時間および温度は、当業界では熟知されており、この場合に適用可能である）。マトリックスを洗浄することにより、非ｍＳＰＥＸ汚染物質を除去する。ｍＳＰＥＸポリペプチドは、マトリックス−抗体−ｍＳＰＥＸ複合体から放出され、ｍＳＰＥＸポリペプチドは精製形態で集められる。精製ｍＳＰＥＸポリペプチドの存在を、銀染色を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでの電気泳動によって確認することにより、試料の生物学的内容物を検出する。ｍＳＰＥＸポリペプチドは、本質的に試料中に存在する唯一の物質であり、銀染色により検出されたところによると３５ｋＤａおよび３７ｋＤａ二重線として現われる。二重線の各バンドの正体は、トランスフェクション細胞のエピトープ標識および抗ｍＳＰＥＸモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングによりｍＳＰＥＸであることが確認される。

細胞性ｈＳＰＥＸの単離
ｈＳＰＥＸタンパク質を、マトリックス結合抗ｈＳＰＥＸモノクローナル抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、還元的および非還元的条件下でヒト脾臓細胞の細胞培養ライゼートから単離する。マトリックス結合抗体を、ライゼート中のｈＳＰＥＸポリペプチドが抗体と結合するのに充分な条件下で細胞ライゼートと接触させ、それによってマトリックス、抗ｈＳＰＥＸ抗体、およびｈＳＰＥＸポリペプチドを含む反応複合体を形成させる。マトリックスを洗浄することにより、非ｈＳＰＥＸ汚染物質を除去する。ｈＳＰＥＸポリペプチドは、マトリックス−抗体−ｈＳＰＥＸ複合体から放出され、ｈＳＰＥＸポリペプチドは精製形態で集められる。試料中の精製ｈＳＰＥＸポリペプチドの存在を、銀染色を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでの電気泳動によって確認することにより、試料の生物学的内容物を検出する。ｈＳＰＥＸポリペプチドは、銀染色により検出されたところによると本質的に試料中に存在する唯一の物質である。ｈＳＰＥＸポリペプチドであることは、抗ｈＳＰＥＸモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングにより確認される。

ＳＰＥＸタンパク質の組織分布
ＳＰＥＸ遺伝子発現の組織分布を、細胞性ｍＲＮＡのノーザンブロット分析によりマウスの脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、皮膚、小腸、脾臓、胃、精巣および胸腺組織で調べる。本質的にＳＰＥＸ ｍＲＮＡは、ノーザン分析によりマウスの脳または精巣からは検出されない。ＳＰＥＸの低レベル発現は、心臓、腎臓、筋肉および皮膚組織で観察される。ＳＰＥＸの中レベル発現は、肝臓、肺、小腸および胃組織で観察される。ＳＰＥＸの高レベル発現は胸腺および脾臓組織で観察され、脾臓組織での発現は胸腺組織と比べて約２倍の大きさである。

リンパ球におけるＳＰＥＸ ｍＲＮＡ発現の分布を、マウスＢ−リンパ球、ＣＤ４＋胸腺細胞およびＣＤ８＋胸腺細胞で評価する。胸腺細胞におけるＳＰＥＸの発現について、ＣＤ４、ＣＤ８について胸腺細胞を３色染色し、フローサイトメトリーにより発現パターンを分析することにより測定する。ＳＰＥＸ ｍＲＮＡ発現は、ＣＤ８ Ｔ細胞と比べてＣＤ４ Ｔ細胞における方が高い。一実験において、ＣＤ８ Ｔ細胞ＳＰＥＸ ｍＲＮＡ発現に対するＣＤ４ Ｔ細胞ＳＰＥＸ ｍＲＮＡ発現は、約２：１であった。両細胞集団ともタンパク質を発現するが、ＳＰＥＸタンパク質の発現もまた、ＣＤ４Ｔ細胞での方がＣＤ８系列の場合と比べて高い。これらのデータは、Ｔ細胞の系列運命決定に関与するＳＰＥＸシグナリングと一致している。

Ｂ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞におけるＳＰＥＸ ｍＲＮＡの発現について、マウス脾臓細胞を３色染色し、ＦＡＣＳにより発現パターンを分析することにより評価する。また、ＳＰＥＸはＢおよびＴ細胞で発現され、最高から最低までの発現レベルの順序は、典型的にはＢ細胞、次いでＣＤ４ Ｔ細胞、そして次にＣＤ８細胞である。

抗ＳＰＥＸ抗体によるＴ細胞応答の調節
この実施例では、Ｔ細胞を抗ｍＳＰＥＸ抗体と接触させることによりＴ細胞代謝のモジュレーションを検出する。ＡＮＤ ＴＣＲトランスジェニックマウスのリンパ節からの磁気ビーズ枯渇によりＣＤ４Ｔ細胞を精製する。これらのＴ細胞は、ＣＤ４およびＣＤ８発現に関して充分に特性確認された抗原特異性を有する。本検定法では、ＣＤ４ Ｔ細胞を、ＳＰＥＸ特異的モノクローナル抗体の存在または非存在下で抗原提示細胞（ＡＰＣ）および抗原と混合する。各混合物の培養物を、それぞれ異なる選択された期間インキュベーションし、Ｔ細胞応答を検出または測定する。抗体不含有混合物と比べた場合の抗体処理混合物におけるＴ細胞増殖速度の変化は、ＳＰＥＸの細胞外ドメインと免疫反応する抗体の処置から生じるＴ細胞代謝のモジュレーションの証拠である。

上記検定法におけるＡＰＣは、当業界で公知の標準技術に従ってＢＡＬＢ.Ｋマウスの放射線照射脾臓細胞から調製される。ＡＰＣは、ＡＮＤ Ｔ細胞に抗原を提示するのに適切なＭＨＣ分子を有し、ｍＳＰＥＸｂ対立遺伝子を有し、ｍＳＰＥＸｂポリペプチドを発現するが、ｍＳＰＥＸｂ以外にＳＰＥＸ対立遺伝子を有することも、ｍＳＰＥＸポリペプチドを発現することもない。使用抗体は、ｍＳＰＥＸｂポリペプチドとは免疫反応しない抗ｍＳＰＥＸ抗体であるＰＫ１８である。ＰＫ１８抗体は、ｍＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応する。すなわち、ＢＡＬＢ.Ｋマウスから製造されたＡＰＣは、ＰＫ１８抗体とは免疫反応しない。Ｔ細胞およびＡＰＣを、ＰＫ１８抗ＳＰＥＸモノクローナル抗体の存在または非存在下において、様々な濃度の抗原、この実施例ではハトシトクロムｃから誘導されたペプチドの存在下で混合し、様々な期間培養する。増殖を、培養開始後様々な期間での^３Ｈチミジン取込により測定する。

抗ＳＰＥＸ抗体によるＴ細胞活性化の阻害
この実施例は、ＳＰＥＸポリペプチドと免疫反応する抗体とＳＰＥＸポリペプチドを含むＴ細胞とを接触させることによるＴ細胞活性化の阻害方法を証明する。ＬＮ Ｔ細胞を、Ｂ１０.ＢＲ（ｍＳＰＥＸポリペプチドを有する）およびＢＡＬＢ.Ｋマウス（ｍＳＰＥＸｂポリペプチドを有する）から別々に精製する。等量の抗ＣＤ３およびラットＩｇまたは等量の抗ＣＤ３およびモノクローナル抗体ＰＫ１８でコーティングした９６ウェルプレートにおいて３Ｈ−ＴｄＲ（トリチウム化されたチミジン）の存在下でＴ細胞を培養する。抗ＣＤ３抗体は、Ｔ細胞活性化の既知刺激因子である。ＰＫ１８抗体は、Ｂ１０.ＢＲ Ｔ細胞のｍＳＰＥＸポリペプチドと免疫反応するが、ＢＡＬＢ.Ｋ Ｔ細胞のｍＳＰＥＸｂポリペプチドとは免疫反応しない。

結果を図３に示す。抗ＣＤ３およびラットＩｇと反応したＴ細胞への３Ｈ−ＴｄＲ組込みは、図３において白抜き記号として描かれている。抗ＣＤ３およびＰＫ１８と反応したＴ細胞への３Ｈ−ＴｄＲ組込みは、図３において黒塗り記号として描かれている。データは、トリプリケイト培養物についての平均３Ｈ−ＴｄＲ組込み（＋／−標準偏差（ＳＤ））−Ｔ細胞単独培養物の３Ｈ−ＴｄＲ組込みのｃｐｍ（１５００ｃｐｍ未満であった）として表されている。Ｔ細胞への３Ｈ−ＴｄＲの組込みは、Ｔ細胞の増殖およびＴ細胞活性化の両方と相関関係を示す。

図３のパネル１および２（異なる２実験）は、Ｂ１０マウスＴ細胞のｍＳＰＥＸと免疫反応する抗体ＰＫ１８とＴ細胞とを接触させたとき、Ｂ１０マウスからのＴ細胞の活性化が阻害されることを証明している。図３のパネル３および４（異なる２実験）は、ＢＡＬＢ.ＫマウスＴ細胞のｍＳＰＥＸｂとは免疫反応しない抗体ＰＫ１８とＴ細胞とを接触させても、ＢＡＬＢ.ＫマウスからのＴ細胞の活性化は、あまりモジュレーションされないことを証明している。

ＰＫ１８抗体は、ｍＳＰＥＸｂポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応する。すなわち、図３に描かれたデータは、ＳＰＥＸポリペプチド、好ましくはＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメイン、さらに好ましくはＳＰＥＸポリペプチドのＩｇ様ドメインと免疫反応する抗体とＳＰＥＸポリペプチドを含むＴ細胞とを接触させることによるＴ細胞活性化の阻害方法を証明している。

抗ＳＰＥＸ抗体によるＢ細胞活性化の阻害
この実施例は、ＳＰＥＸポリペプチドと免疫反応する抗体とＳＰＥＸポリペプチドを含むＢ細胞とを接触させることによるＢ細胞活性化の阻害方法を証明する。Ｂ細胞をＢ１０.ＢＲおよびＢＡＬＢ.Ｋマウスから精製することを除き、実施例１０を反復する。ＢＡＬＢマウスではなく、Ｂ１０のＢ細胞をＰＫ１８抗体と接触させることにより、Ｂ細胞活性化は阻害されることが見出された。すなわち、データは、ＳＰＥＸポリペプチド、好ましくはＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメイン、さらに好ましくはＳＰＥＸポリペプチドのＩｇ様ドメインと免疫反応する抗体とＳＰＥＸポリペプチドを含むＢ細胞とを接触させることによるＢ細胞活性化の阻害方法を証明している。

マウス抗ｍＳＰＥＸモノクローナル抗体
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、免疫化（５０μｇ、ＣＦＡ中）し、組換え可溶性ＳＰＥＸ−Ｉｇ融合タンパク質（上記で検討されているＳＰＥＸの細胞外ドメインを含む）でブースト（３〜５回、ＩＦＡ中５０μｇ）した。免疫原は、Ｂ６マウスに由来するものであるため（ｍＳＰＥＸｂ対立遺伝子ではなく、ｍＳＰＥＸ対立遺伝子を含む）、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて対立遺伝子特異的抗体を産生する。標準的手段によりハイブリドーマを免疫化動物の脾臓細胞から製造する。ＳＰＥＸ−ＹＦＰ融合タンパク質を発現するトランスフェクションおよび親細胞への差次的結合により、モノクローナル抗体をスクリーニングにかける。３種のモノクローナル抗体、ＰＪ１６、ＰＪ１９およびＰＪ１９６を、追加分析用に選択する。各抗体のイソ型はＩｇＧ１κである。ＰＪ１９、ＰＪ１６およびＰＪ１９６抗体は、ＢＡＬＢ／ｃ由来の細胞（ｍＳＰＥＸではなく、ｍＳＰＥＸｂを発現する）ではなく、Ｂ６細胞により発現されたｍＳＰＥＸ（ｍＳＰＥＸｂではない）と特異的に免疫反応することを含む、ラットモノクローナル抗体のＰＫ系列（上記参照）と同一の染色パターンを有する。

本明細書に記載した実施態様に加えて、本発明の様々な修飾も当業者であれば、前述の記載内容から容易に理解できるはずであり、それらも本発明の範囲内に包含されるものとする。

図１は、細胞外、膜貫通（斜線部）および細胞内ドメイン（標識通り）を有する実質的に完全長のマウスおよびヒトＳＰＥＸポリペプチド（それぞれ、ｍＳＰＥＸおよびｈＳＰＥＸ）の図である。細胞外ドメインは各々、免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン（水平線）を含み、所望により開裂可能なシグナル配列（ダッシュ領域）を有していてもよく、矢印は開裂部位を指す。シグナル配列は、翻訳後プロセシング中に開裂され、成熟ＳＰＥＸポリペプチドを生じさせる。細胞内ドメインは各々、３個のチロシンに基くモチーフを含む（垂直線）。また、チロシンに基く各ドメインは、チロシンアミノ酸残基を含む（Ｙは、チロシンについての１文字コードである）。示された実施態様は、チロシンが所望によりリン酸化され得ることを描いている（円で囲んだＰ）。生体膜におけるＳＰＥＸポリペプチドの相対位置が示されている。点描領域は、ある種の機能性ドメイン間における各ポリペプチドの部分を示す。 図２Ａは、選択されたｈＳＰＥＸポリペプチドおよび選択された各ポリペプチドに関するそれぞれの配列間の対応関係の実例を示す図である。 図２Ｂは、選択されたｈＳＰＥＸポリヌクレオチドおよび選択された各ポリヌクレオチドに関するそれぞれの配列間の対応関係の実例を示す図である。 図２Ｃは、選択されたｍＳＰＥＸポリペプチドおよび選択された各ポリペプチドに関するそれぞれの配列間の対応関係のある種の実例を示す図である。 図２Ｄは、選択されたｍＳＰＥＸポリヌクレオチドおよび選択された各ポリヌクレオチドに関するそれぞれの配列間の対応関係のある種の実例を示す図である。 図３は、モノクローナル抗体ＰＫ１８がＴ細胞活性化を阻害することを立証する４つのグラフ（パネル１〜４）を示す。ＬＮ Ｔ細胞を、Ｂ１０.ＢＲおよびＢＡＬＢ.Ｋマウスから精製し、抗ＣＤ３およびラットＩｇ（白抜き記号）または抗ＣＤ３およびＰＫ１８（黒塗り記号）の混合物でコーティングした９６ウェルプレートにおいて培養した。データを、トリプリケイト培養物の平均３Ｈ−ＴｄＲ（トリチウム化チミジン）取り込み（＋／−標準偏差）マイナスＴ細胞単独培養物の組込みの１分間当たりの放射能カウント数（ｃｐｍ）として表す（１５００ｃｐｍ未満）。Ｔ細胞のＤＮＡへの３Ｈ−ＴｄＲの取り込みは、Ｔ細胞の増殖およびＴ細胞活性化の両方と相関関係を示す。

【配列表】

Claims (12)

1. （ａ）配列番号３、７、９、１１、４５または８８のいずれか一つに示されたアミノ酸配列、または
   （ｂ）配列番号３、７、９、１１、４５または８８のいずれか一つとの同一性が９５％またはそれより大であり、免疫グロブリン様ドメイン構造を含むアミノ酸配列
   を含む精製ポリペプチド。
2. 本質的に配列番号３、７、９、１１、４５または８８のいずれか一つの８〜４０連続アミノ酸残基により構成される、精製免疫原性ポリペプチド。
3. ＳＰＥＸポリペプチドをコード化する核酸配列、またはその核酸配列の相補体を含む、精製ポリヌクレオチド。
4. 配列番号３、７、９、１１、４５または８８のいずれか一つに示されたポリペプチド配列をコード化する核酸配列、またはその核酸配列の相補体を含む、精製ポリヌクレオチド。
5. ＳＰＥＸチロシンベースドメインをコード化する核酸配列、またはその核酸配列の相補体を含む、精製ポリヌクレオチド。
6. ａ）ＳＰＥＸポリペプチドをコード化する核酸配列、またはその相補体、および
   ｂ）その核酸配列に機能し得るように結合されたベクター配列
   を含む精製ポリヌクレオチド。
7. ＳＰＥＸポリペプチドを発現させるための１つまたはそれ以上の制御エレメントを有するベクター配列に機能し得るように結合されたＳＰＥＸポリペプチドをコード化する核酸配列を含む、精製ＳＰＥＸ発現ベクター。
8. ＳＰＥＸ発現産物を発現させるための一つまたはそれ以上の制御エレメントを有するベクター配列と機能し得るように結合されたＳＰＥＸ発現産物をコード化する核酸配列を含むＳＰＥＸ発現ベクターを含む、精製宿主細胞。
9. ＳＰＥＸポリペプチドと免疫反応する単離抗体。
10. ａ）候補結合パートナーとＳＰＥＸポリペプチドを接触させ、
    ｂ）ＳＰＥＸポリペプチドを含む結合複合体が形成されているか否かを検出し、
    ｃ）結合複合体形成時におけるＳＰＥＸ結合パートナーとしての候補結合パートナーを選択する
    ことを含む、ＳＰＥＸ結合パートナーの同定方法。
11. ａ）抗ＳＰＥＸ抗体をマトリックスに結合させたアフィニティーマトリックスと生物学的試料を接触させることにより、ＳＰＥＸポリペプチドおよびマトリックスに結合させた抗ＳＰＥＸ抗体を含む複合体を生成させ、
    ｂ）マトリックスおよび生物学的試料の残りを分離し、
    ｃ）ＳＰＥＸポリペプチドおよび抗ＳＰＥＸ抗体を分離し、そして
    ｄ）単離されたＳＰＥＸポリペプチドを集める
    ことを含む、ＳＰＥＸポリペプチドを含む生物学的試料からのＳＰＥＸポリペプチドの単離方法。
12. ＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応する抗ＳＰＥＸ抗体とリンパ球を接触させることを含む、ＳＰＥＸポリペプチドを発現するリンパ球の代謝のモジュレーション方法。
    

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