JP2006510886A - 試料の光学的検査および/または光学的加工のための方法および配置 - Google Patents
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Abstract
Description
パルス長拡大の補償に然るべき装置が提案された。
従来の蛍光顕微鏡検査では、生物学的プレパラートの特殊マーキングに様々な色素が使用されている。これらの色素は、続いての作業過程で様々な光波長によって励起される。そのようなプレパラートでは、多光子励起の利用により殆どの場合異なった色素の同時励起が行われる。これは、一方では、励起に光の1波長しか必要としないので長所になる。他方、個別色素の放出波長帯域がオーバラップする場合にはもはや色素をスペクトル分離することができないので、これは短所でもある。
それは、独立請求項に記載された手段および作業ステップにより行われる。
有利な実施態様は従属請求項の対象である。
本発明によれば、フーリエ平面における光パルスの振幅変調および/または位相変調を、対応の顕微鏡内測定量(例えば、2光子蛍光信号)が最適化されるように、フィードバック過程を通じて変更することが可能であり有利である。さらに、本発明に基づく配置によれば試料スポットで高いパルスピーク出力を得ることが可能な上、顕微鏡装置内においても、または測定量の励起が行われるべき焦点領域から外れた層においても損傷作用が発生することがない。この配置によれば、試料内にフォーカシングする光学系の設置最適化のために、ビーム横断面の可変的適合化も可能である。
それにより、光は(コリメートされて)再び平行に進むが、しかし空間的にスペクトル分解されたままで、ここではただX/YスキャナSCと対物レンズOだけで示されている、試料Tの光学走査のための装置を通り抜ける(図1)。この場合X/Yスキャナは、対物レンズO後方のひとみ近くに設置されている。このことは、対物レンズ焦点距離fの記入により図面上に暗に示されている。
形態の異なるこの種の位相板を複数枚使用することによって、光パルスの形態に影響を与えることができる。空間的に離れた成分の位相間における相互調整は、例えば、個別制御の可能な素子(マトリックス形態であれば有利)を持つ空間光変調器SLMを、光路内PPの近くに、それに代えて、またはそれに加えて配置することでフレキシブルに実施することもできる。
この場合、ノンデスキャン検出光の反射分離は、別なダイクロイックビームスプリッタMDB2を通じて行われる。検出光の複数検出チャネルへの追加的分割は、例えば2つのチャネルDE1およびDE2への分割はまた別なダイクロイックビームスプリッタMDB3を使用して行うことができる。検出器の前には、それも好ましくはMDBとDEとの間に、蛍光信号の測定のために然るべきフィルタが旋回挿入される。ここではPは顕微鏡対物レンズOのひとみを表わしている。この平面に共役な、顕微鏡装置の別なひとみ平面に試料走査のためのスキャナSCが設置されている。
湾曲度は、光学系の残余GVDが光源LQから試料Tまでの光路内で補償されるように、つまり光パルスの個別スペクトル成分を時間的にずらすことで、帯域幅の制限されたパルス長、換言すれば、できる限り短いパルス長が試料スポットに現われるように調整されている。
・ 顕微鏡内の光学素子を構成するガラス材の作用。この場合補償は恒常的に行うことができる。
・ プレパラート自体の作用。この場合パルスの延長はプレパラートへの浸透度に依存する。そのほか、パルスの拡大は高次分散によっても惹き起こされる。したがって、ここでの補償は個々のスペクトル成分ごとにリアルタイムで行わねばならない。
・ 波長変化による作用。
・ ガラス繊維内に自己位相変調など、追加的な非線形プロセスが現われた場合における平均出力の変化による作用。
以上より、SLMの使用が非常に有利であり、既に上述したように、空間的に離れた成分の位相間における相互調整は、個別制御の可能な素子(マトリックス形態であれば有利)によりフレキシブルに行うことができる。素子の制御は、上記ファクタ量の依存下で、好ましくはリアルタイムでの調整により行われる。その場合、例えば、試料T内で励起される2光子蛍光信号が測定量として機能する。殆どの場合では然るべき調整により、試料の相互作用スポットにおけるパルス長の最適化が達成される。
図3には2つのアキシコンA1、A2が描かれているが、そのうちA1の方が例えば頂点の方から照明される。両アキシコンは、第1アキシコンが角分散を取り込んで、第2アキシコンがそれを元どおりに補償して、その結果第2アキシコンの後方ではビームが再び平行になるというように、配置および構成されている。
図3c、4cにはそれぞれ第1素子前方のビーム分布が、図3b、4bには第2素子後方のビーム分布が描かれている。
プリズム使用の場合ではスペクトル成分l1、l2….は分割されて列状に相並ぶが、アキシコン使用の場合では複数の平面にリング状に現われる。その場合各スペクトル成分は一定のリングを形成する。
本発明によれば、説明したパルス形態の調整は、上記に加え顕微鏡の他の制御機能と、例えば、特定試料領域の撮像過程における照明のスペクトル組成および/または強度を変更するための制御機能(DE 19829981A1)と組合せて行うこともできる。その制御は顕微鏡の中央制御ユニットを通じて行われる。
この配置によるDISPの場合、高い透過率および機械的に安定な構造が極めて容易に実現できるところが長所である。
素子D1およびD2の典型的な構成には、図3〜6に示された配置のほか、原則的には、反射性格子などの反射性素子または角分散のほか、偏向をも誘導する素子(例えば、分散プリズム − 部分図Aまたは反射性格子 − 部分図B)も使用することができる(DE 19744302A1参照)。
ガラス繊維束から外れたスペクトル成分はL2によりコリメートされる。その場合、個々のスペクトル成分は平行な繊維束として相互に切り離される。角分散の継続がD2により改めて打ち切られるが、スペクトル成分はなお空間分離したままである。後続の光学系は、既に図2を手掛かりに説明したコンポーネントに相当するものである。光軸に沿う方向での移動S2によっても、試料内へフォーカシングする光学系の照明を調整することができる。
ガラス繊維束を上記のように配置することにより、光源、スペクトル分割器D1および繊維への結合器から成るモジュールおよび繊維束後方の第2分散素子D2付き顕微鏡モジュールを持つ新たな有利な配置が得られるが、これらはこのように互に独立していて、個別に取換可能なように形成することができる。
D1、D2 分散素子
SC X/Yスキャナ
O 対物レンズ
T 試料
f 焦点距離
OM ガラス材
PO ピンホール光学系
PH ピンホール
DE 検出器
MDB ダイクロイックビームスプリッタ
SO 走査光学系
ZB 中間像
DISP 光源
Claims (22)
- 短パルス照明光の生成、
照明光源のパルス長より大きなパルス長を持つ、空間分離されたスペクトル成分の生成のための照明光スペクトル分割、
伝送光学系によるスペクトル成分の試料方向への誘導、
スペクトル成分の重畳を伴う照明光の試料上または試料内へのフォーカシング、
および試料光の検出を含むことを特徴とする、
試料の光学的検査および/または光学的加工のための方法。 - 空間的に分離されたスペクトル成分が、平行な光線束に変換される、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 試料上または試料内にフォーカシングされたスペクトル成分のパルス長が、空間分離したスペクトル成分のパルス長より小さい、ことを特徴とする請求項1または2に記載の方法。
- 照明光の生成器、
その後方に配置された、空間分離スペクトル成分の生成のための照明光用スペクトル分割器、
分割された照明光の平行化調整器、
スペクトル成分の重畳を伴う試料上または試料内への照明光フォーカシング器、及び
試料光検出器を含む、
ことを特徴とする試料の光学的検査および/または光学的加工のための配置。 - 短パルス照明光の生成器、
その後方に配置された、照明光源のパルス長より大きなパルス長を持つ空間分離スペクトル成分の生成のための照明光用スペクトル分割器、
試料方向へのスペクトル成分伝送のための伝送光学系、
スペクトル成分の重畳を伴う試料上または試料内への照明光フォーカシング器、
及び試料光検出器を含む、
ことを特徴とする試料の光学的検査および/または光学的加工のための配置。 - 空間的に分離されたスペクトル成分を平行な光線束へ変換するための手段が配備されている、ことを特徴とする先行請求項のうちの少なくとも1つに記載の配置。
- 試料上または試料内にフォーカシングされたスペクトル成分のパルス長が、空間分離したスペクトル成分のパルス長より小さい、ことを特徴とする先行請求項のうちの少なくとも1つに記載の配置。
- 光源とスペクトル分割器の間に、好ましくは、調整可能な分散器が配備されている、ことを特徴とする先行請求項のうちの少なくとも1つに記載の配置。
- ガラス繊維束に対し平行光線束の連結および遮断が行われる、ことを特徴とする先行請求項のうちの少なくとも1つに記載の配置。
- スペクトル分割が、少なくとも1つのプリズムおよび/またはアキシコンおよび/または透過性格子および/または反射性格子によって行われる、ことを特徴とする先行請求項のうちの少なくとも1つに記載の配置。
- 平行光線束への変換が、別のプリズムまたは別のアキシコンまたは別の格子によって行われる、ことを特徴とする先行請求項のうちの少なくとも1つに記載の配置。
- 第1プリズムと第2プリズムまたはアキシコンとが、それらが共同でフラットプレート作用をするように構成されている、ことを特徴とする請求項11に記載の配置。
- 分割および平行化のために直視プリズムが配備されている、ことを特徴とする先行請求項のうちの少なくとも1つに記載の配置。
- 主として平行光路において、コンポーネントに影響を与えるための補償素子が配備されている、ことを特徴とする先行請求項のうちの少なくとも1つに記載の配置。
- コンポーネントに対する調整可能な影響が、異なった横断面構造を持つ取換可能な光学素子および/または空間光変調器(SLM)によって与えられる、ことを特徴とする請求項14に記載の配置。
- 蛍光顕微鏡に使用される先行請求項のうちの少なくとも1つに記載された配置。
- 多光子顕微鏡に使用される先行請求項のうちの少なくとも1つに記載された配置。
- レーザ走査型顕微鏡に使用される先行請求項のうちの少なくとも1つに記載された配置。
- 非線形レーザ走査型顕微鏡検査に使用される先行請求項のうちの少なくとも1つに記載された配置。
- 材料加工に使用される先行請求項のうちの少なくとも1つに記載された配置。
- 生物組織加工に使用される先行請求項のうちの少なくとも1つに記載された配置。
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