JP2006305313A - Material for removing albumin-uncombined and glucuronic acid non-conjugation bilirubin - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、体液中に過剰に存在するアルブミン非結合かつグルクロン酸非包合ビリルビンを除去し、かつ凝固活性を抑え、ヘパリンおよびアルブミンの吸着を抑えた除去材料に関するものである。 The present invention relates to a removal material that removes albumin non-binding and glucuronic acid non-encapsulated bilirubin excessively present in a body fluid, suppresses coagulation activity, and suppresses adsorption of heparin and albumin.
生体内では赤血球は肝臓および脾臓の網内系で代謝され、赤血球内のヘモグロビンはビリルビンへと変化する。一般に、生成されたビリルビンは非水溶性(脂溶性)であるため、血液中ではアルブミンと結合して肝臓に取り込まれ、肝臓ではグルクロニルトランスフェラーゼによって、グルクロン酸抱合をされてはじめて水溶性になり胆汁中に排出される。しかし、新生児や低出生体重児などの臓器機能が未発達状態では代謝は遅く、また、母体と胎児の血液型(特にRh型)が異なる場合には、血液型不適合により母体の抗体により胎児赤血球が攻撃されて溶血反応が生じ、大量のヘモグロビンが存在すると、その結果として、その代謝産物であるビリルビン濃度が急速に上昇するため、代謝および排泄が追いつかず、血液中にビリルビンが蓄積する高ビリルビン血症となる。ビリルビンの中でもアルブミン非結合かつグルクロン酸非抱合のビリルビンは、脂溶性であるため血液脳関門を通過し、脳に移行することにより大脳基底核を中心にビリルビン色素が沈着し、脳神経細胞が障害を受け、痙攣、後弓反張、脳性麻痺などの中枢神経障害を呈する。特に新生児では、新生児黄疸において脳症を引き起こす原因物質が、アルブミン非結合かつグルクロン酸非抱合のビリルビンであることが明らかとなった。よって、アルブミン非結合かつグルクロン酸非抱合のビリルビンを除去する材料が脳神経障害の治療に有効な材料であると考えられる。 In vivo, erythrocytes are metabolized in the reticuloendothelial system of the liver and spleen, and hemoglobin in the erythrocytes changes into bilirubin. In general, the bilirubin produced is water-insoluble (lipid-soluble), so it binds to albumin in the blood and is taken into the liver. In the liver, it becomes water-soluble only after being conjugated with glucuronyltransferase. It is discharged into bile. However, metabolism is slow when the organ function is undeveloped, such as a newborn baby or a low birth weight infant, and when the maternal and fetal blood types (particularly Rh type) are different, fetal erythrocytes due to maternal antibodies due to blood type mismatch When a large amount of hemoglobin is present due to an attack on the liver, the concentration of its metabolite, bilirubin, increases rapidly, resulting in a high bilirubin that cannot keep up with metabolism and excretion and accumulates bilirubin in the blood. Become bloody. Among bilirubin, bilirubin that is not albumin-bound and non-glucuronidated crosses the blood-brain barrier because it is fat-soluble, and when it moves to the brain, bilirubin pigments are deposited mainly in the basal ganglia, and brain neurons are damaged. CNS disorders such as reception, convulsions, posterior bowing tension, and cerebral palsy. Especially in newborns, the causative agent that causes encephalopathy in newborn jaundice was revealed to be albumin-unbound and glucuronide-unconjugated bilirubin. Therefore, it is considered that a material that removes albumin non-binding and glucuronic acid non-conjugated bilirubin is an effective material for treating cranial nerve disorders.
しかし、現在市販されているビリルビン除去材料の中には、アルブミン非結合かつグルクロン酸非抱合のビリルビンを選択的に除去できる材料は報告されておらず、総ビリルビンあるいはグルクロン酸非抱合ビリルビン(間接ビリルビン)やグルクロン酸抱合ビリルビン(直接ビリルビン)を除去する材料のみが既知となっている(例えば特許文献1、特許文献2、特許文献3)。また、市販されている除去材料はアニオン性イオン交換樹脂を血液適合性高分子物質でコーティングしたものであり、この樹脂は4級のアンモニウムイオンを有しているために血液中の凝固因子の除去あるいは体外循環に用いられる抗凝固剤のヘパリンを除去してしまう欠点を有するため、生体適合性の観点からも好ましくない。ヘパリンは陰性電荷なので4級アンモニウムに吸着されることは当然考えられることであり、抗凝固剤の吸着を抑制したビリルビン除去材料の開発が望まれている。そこで、ヘパリン吸着を70%以下に抑えたビリルビン吸着体(特許文献4)が提案されているが、実際にはヘパリン吸着率は36%程度にとどまっており、その性能では不十分である。さらに、血液浄化材料を提供する上で血液凝固系因子の吸着を抑えることも課題である。また、体液中に存在するアルブミンは生体に重要なタンパクでありこれが吸着除去されすぎると、低アルブミン血症を発症し生体に悪影響を及ぼすことが考えられる。よって、血液凝固因子やアルブミンの吸着を抑えた除去材料の開発が望まれる。これまで、アルブミン非結合かつグルクロン酸非抱合のビリルビンを除去でき、さらには、アルブミンの吸着を抑え、凝固活性の指標であるプロトロンビン時間(以下PTと略す)、部分活性化トロンボプラスチン時間(以下APTTと略す)、の変化量が少ない血液浄化材料の報告はない。 However, none of the currently available bilirubin-removing materials have been reported to selectively remove albumin-unbound and non-glucuronidated bilirubin, and total bilirubin or non-glucuronidated bilirubin (indirect bilirubin) ) And glucuronic acid-conjugated bilirubin (direct bilirubin) are known only (for example, Patent Document 1, Patent Document 2, and Patent Document 3). A commercially available removal material is an anionic ion exchange resin coated with a blood compatible polymer substance. Since this resin has quaternary ammonium ions, it removes coagulation factors in the blood. Or it has the fault which removes the heparin of the anticoagulant used for extracorporeal circulation, and it is not preferable also from a viewpoint of biocompatibility. Since heparin is negatively charged, it is naturally considered to be adsorbed on quaternary ammonium, and development of a bilirubin removing material that suppresses adsorption of an anticoagulant is desired. Thus, a bilirubin adsorbent (Patent Document 4) in which heparin adsorption is suppressed to 70% or less has been proposed, but actually the heparin adsorption rate is only about 36%, and its performance is insufficient. Furthermore, it is a problem to suppress adsorption of blood coagulation factors in providing a blood purification material. In addition, albumin present in body fluids is an important protein for the living body, and if it is excessively adsorbed and removed, hypoalbuminemia may occur and adversely affect the living body. Therefore, it is desired to develop a removal material that suppresses adsorption of blood coagulation factors and albumin. Up to now, albumin-unbound and glucuronic acid-unconjugated bilirubin can be removed, and further, the adsorption of albumin is suppressed, and the prothrombin time (hereinafter abbreviated as PT), the partially activated thromboplastin time (hereinafter referred to as APTT), which is an indicator of coagulation activity. There are no reports of blood purification materials with a small amount of change.
また、活性炭による血液浄化法も知られているが、活性炭は選択性が低く、有効な医薬品や体内成分等の吸着も起きることなどによる不利益も生じると考えられている。さらに、新生児においては交換輸血が行われているが、他人の血液を輸血することにより、発熱や発疹あるいはウイルス感染が起きる可能性があり、選択性のある吸着材料によりビリルビンのみを特異的に血液中から除去することが可能になることが望まれている。 A blood purification method using activated carbon is also known, but activated carbon has low selectivity, and it is considered that there are disadvantages due to the adsorption of effective medicines and internal components. Furthermore, exchange blood transfusions are carried out in newborns, but there is a possibility that fever, rash, or viral infection may occur by transfusion of the blood of another person, and only bilirubin is specifically blood with a selective adsorbent material. It would be desirable to be able to remove it from inside.
また、アルブミン結合ビリルビンの除去装置として、血液中にあらかじめ安息香酸などのアルブミンからビリルビンを遊離させる解離剤を用いて、アルブミンから遊離したビリルビンを効率的に除去する装置が報告されているが(特許文献3)、血液を体内に戻す際にさらに解離剤を吸着させる必要があり、解離剤の毒性を考慮する必要があると共に新生児などの血液容量の少ない患者では血液容量が多くなることの欠点を有す。
脳神経障害の起因物質であるアルブミン非結合かつグルクロン酸非抱合のビリルビンを除去でき、かつ血液凝固活性を抑え、抗凝固剤であるヘパリンや生体の有用物質であるアルブミンの吸着を抑えた除去材料を提供する。 Removal material that can remove albumin non-binding and glucuronic acid non-conjugated bilirubin which is a causative agent of cranial nerve injury, suppresses blood coagulation activity, and suppresses adsorption of heparin as an anticoagulant and albumin as a useful substance in living body provide.
本発明では該水素結合形成可能な官能基を含むことを特徴とするアルブミン非結合かつグルクロン酸非抱合ビリルビンを除去する除去材料であり、血液凝固因子や抗凝固剤、生体の有用物質であるアルブミンの吸着を抑えた材料である。また上述した材料を用いた体液浄化カラムである。 In the present invention, albumin which is a removal material for removing non-albumin and glucuronide-conjugated bilirubin, which contains the functional group capable of forming a hydrogen bond, is a blood coagulation factor, an anticoagulant, and a biologically useful substance It is a material that suppresses the adsorption of. Moreover, it is a body fluid purification column using the material mentioned above.
本発明により、体液中に過剰に存在するアルブミン非結合かつグルクロン酸非包合ビリルビン除去でき、さらに血液凝固活性を抑え、抗凝固剤であるヘパリンおよび生体の有用物質であるアルブミンの吸着を抑えた材料を提供する。これにより高ビリルビン血症からもたらされる脳神経障害を早期に治療または予防することが可能になる。 According to the present invention, it is possible to remove the albumin non-binding and glucuronic acid non-encapsulated bilirubin which are excessively present in the body fluid, further suppress the blood coagulation activity, and suppress the adsorption of heparin which is an anticoagulant and albumin which is a useful substance of living body. Provide material. This makes it possible to early treat or prevent cranial nerve damage resulting from hyperbilirubinemia.
本発明は、少なくとも一種の水素結合形成可能な官能基を有するアルブミン非結合かつグルクロン酸非包合ビリルビン除去用の材料を実現できた。本発明の材料は、好ましくは凝固活性の指標であるPT、APTTの変化量が体液接触前後で20%以下であり、かつヘパリンに対する吸着率が30%以下であり、かつアルブミンに対する吸着率が20%以下である。体液とは、血液、血漿、血清、脳脊髄液、羊水、腹水、胸水などを示す。 The present invention has realized a material for removing albumin non-binding and glucuronic acid non-encapsulating bilirubin having at least one functional group capable of forming a hydrogen bond. The material of the present invention preferably has a change amount of PT, APTT, which is an index of coagulation activity, of 20% or less before and after contact with body fluid, an adsorption rate to heparin of 30% or less, and an adsorption rate to albumin of 20 % Or less. The body fluid refers to blood, plasma, serum, cerebrospinal fluid, amniotic fluid, ascites, pleural effusion and the like.
本発明の基本的な態様としては、基材(基材表面)に一種以上の水素結合形成可能な官能基を結合(固定化)したものである。 As a basic aspect of the present invention, one or more functional groups capable of forming hydrogen bonds are bonded (immobilized) to a substrate (substrate surface).
なお、本発明において、アルブミン非結合性かつグルクロン酸非抱合ビリルビンとは、血液中でアルブミンと結合しておらず、肝臓でのグルクロン酸抱合をされずに、遊離している脂溶性のビリルビンである。また、アルブミン非結合かつグルクロン酸非抱合ビリルビンを除去するとは、アルブミン非結合かつグルクロン酸非抱合ビリルビンを吸着して体液中から除去することの他に、分解したり、他物質を結合させたりする等によりその活性を失わせる(不活化)ことをも含むものである。また、本発明におけるアルブミン非結合性かつグルクロン酸非抱合ビリルビンの測定においては、グルクロン酸非抱合ビリルビンを用い、in vitroの系で評価することで肝臓のグルクロン酸抱合を受けないグルクロン酸非抱合のビリルビンを評価した。さらにアルブミン結合かつグルクロン酸非抱合ビリルビンと、アルブミン非結合かつグルクロン酸非抱合ビリルビンとの分離には、分子量5万の限外濾過膜を用いた。つまり、ヒト血清アルブミンの分子量は66300〜69000と言われており、かかる限外濾過膜により、アルブミン結合かつグルクロン酸非抱合ビリルビンとアルブミン非結合かつグルクロン酸非抱合ビリルビンを分離することを可能とした。このようにしてアルブミン結合かつグルクロン酸非抱合ビリルビンと分離したアルブミン非結合かつグルクロン酸非抱合ビリルビンの定量は、ジアゾ化反応により、富士ドライケム(富士写真フィルム(株)製)を使用して行った。
これまで、従来のビリルビン吸着材はヘパリンや凝固因子を吸着してしまう欠点を有していた。この現象を詳細に検討した結果、従来のビリルビン吸着剤はカチオン性であるために、その電気的特性により陽性の電荷を有するヘパリンや凝固因子を吸着してしまうことが判明した。そこで、鋭意検討した結果、ヘパリンの吸着能が低く、凝固活性が低く、有毒なアルブミン非結合かつグルクロン酸非抱合ビリルビンを選択的に吸着する材料として、非イオン結合で水素結合形成可能な官能基を有する材料を見いだした。また、生体の有用物質であるアルブミン等のタンパクの吸着能を抑制させるためには疎水性を低下させることが有効であると考えられ、そのためにはアミノ基や尿素結合などの親水性基が有効であると考え発明に至った。なお、含窒素複素環化合物がビリルビンを吸着するとの報告があるが、この化合物のビリルビンとの相互作用はπ電子間の相互作用による結合と考えられているが、結合力は十分ではなく、親水性も低い。そのために、ビリルビンの結合とアルブミンの排除の機能分離が十分ではないという欠点があった。そこで検討した結果、水素結合が強い官能基が、アルブミン非結合かつグルクロン酸非包合ビリルビンの結合が高く、さらに凝固活性が低く、ヘパリンおよびアルブミンの吸着が抑えられることが明らかとなった。
In the present invention, albumin non-binding and non-glucuronic acid-conjugated bilirubin is a fat-soluble bilirubin that is not bound to albumin in blood and is not glucuronidated in the liver and is free. is there. The removal of non-albumin-bound and glucuronic acid-unconjugated bilirubin refers to the removal of adsorbed and removed albumin-unbound and non-glucuronidated bilirubin from body fluids, and binding of other substances. It also includes losing its activity (inactivation) by, for example. In the measurement of non-albumin-binding and non-glucuronidated bilirubin in the present invention, non-glucuronidated non-glucuronidated which is not subjected to glucuronidation of the liver by using an in vitro system using glucuronid-unconjugated bilirubin. Bilirubin was evaluated. Further, an ultrafiltration membrane having a molecular weight of 50,000 was used for separating albumin-bound and glucuronic acid-unconjugated bilirubin from albumin-unbound and glucuronic acid-unconjugated bilirubin. That is, the molecular weight of human serum albumin is said to be 66300 to 69000, and it was possible to separate albumin-bound and glucuronide-unconjugated bilirubin from albumin-bound and glucuronide-unconjugated bilirubin by such an ultrafiltration membrane. . The quantification of albumin-unbound and glucuronide-unconjugated bilirubin separated from albumin-bound and glucuronide-unconjugated bilirubin was performed using Fuji Dry Chem (Fuji Photo Film Co., Ltd.) by diazotization reaction. .
Until now, conventional bilirubin adsorbents have had the disadvantage of adsorbing heparin and coagulation factors. As a result of examining this phenomenon in detail, it has been found that the conventional bilirubin adsorbent is cationic and therefore adsorbs heparin or coagulation factor having a positive charge due to its electrical characteristics. Therefore, as a result of diligent studies, functional groups capable of forming hydrogen bonds with nonionic bonds as materials that selectively adsorb toxic non-albumin and glucuronate unconjugated bilirubin with low heparin adsorption ability and low coagulation activity. I have found a material with In addition, it is considered effective to reduce hydrophobicity in order to suppress the adsorption ability of proteins such as albumin, which is a useful substance in living organisms. For this purpose, hydrophilic groups such as amino groups and urea bonds are effective. This led to the invention. Although it has been reported that nitrogen-containing heterocyclic compounds adsorb bilirubin, the interaction of this compound with bilirubin is considered to be a bond due to the interaction between π electrons, but the binding force is not sufficient and hydrophilic The nature is also low. For this reason, there is a drawback that the functional separation of bilirubin binding and albumin exclusion is not sufficient. As a result, it was found that a functional group with strong hydrogen bonding has high binding of albumin non-binding and non-glucuronic acid non-encapsulated bilirubin, and further has low coagulation activity, thereby suppressing adsorption of heparin and albumin.
本発明の材料においては、凝固系への影響の指標として、外因性凝固因子の指標となるPTと内因性凝固因子の指標となるAPTTの体液接触前後の変化量が20%以下であることが好ましい。血液浄化材料を提供する上で血液凝固系因子の吸着を抑えることは必須条件であり、上記の変化量が低いことが望まれる。それぞれ、PTの基準値は10〜13秒、APTTの基準値は30〜45秒であり、20%以上の延長は好ましくないと考えられている。本発明では、種々の検討を重ねた結果、PTおよびAPTTの変化量を20%以下にすることが可能となった。かかる変化量は次式によって算出する。 In the material of the present invention, as an index of the influence on the coagulation system, the amount of change before and after body fluid contact between PT serving as an index of exogenous coagulation factor and APTT serving as an index of endogenous coagulation factor is 20% or less. preferable. In order to provide a blood purification material, it is an essential condition to suppress adsorption of blood coagulation factors, and it is desired that the amount of change is low. The reference value of PT is 10 to 13 seconds and the reference value of APTT is 30 to 45 seconds, respectively, and an extension of 20% or more is considered undesirable. In the present invention, as a result of various investigations, it has become possible to reduce the amount of change in PT and APTT to 20% or less. Such a change amount is calculated by the following equation.
変化量(%)=((体液接触前のPTまたはAPTT値(秒)−体液接触後のPTまたはAPPT値(秒))/体液接触前のPTまたはAPTT値(秒))×100
本発明における水素結合形成可能な官能基とは水素結合が形成可能な官能基であれば特に限定はなく、例えば、尿素結合、チオ尿素結合、アミド基、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、アルデヒド基、メルカプト基などが挙げられるが、含窒素官能基が好ましく、尿素結合、チオ尿素結合あるいはアミド結合、アミノ基、ピリジル基、ピリミジル基、イミダゾール基のうちの少なくとも一種であることが好ましい。なお、前記の水素結合形成可能な官能基には、それに続いた構造を有していても良い。水素結合形成可能な官能基に続く構造としては特に限定はなく、プロパン、ヘキサン、オクタン、ドデカンなどの脂肪族化合物やシクロヘキサン、シクロペンタンのような脂環族化合物を用いることができるが、親和性の高さを考慮するとベンゼン、ナフタレン、アントラセン等の芳香族化合物がより好ましく用いられる。ブロモヘプタン、クロロシクロヘキサン、メチルベンゼン、クロロベンゼン、ニトロベンゼン、ジフェニルメタン、クロロナフタレン等の誘導体も好適に用いられる。
Amount of change (%) = ((PT or APTT value before body fluid contact (seconds) −PT or APPT value (seconds) after body fluid contact) / PT or APTT value (seconds) before body fluid contact) × 100
The functional group capable of forming a hydrogen bond in the present invention is not particularly limited as long as it is a functional group capable of forming a hydrogen bond. For example, a urea bond, a thiourea bond, an amide group, an amino group, a hydroxyl group, a carboxyl group, an aldehyde group A nitrogen-containing functional group, preferably at least one of a urea bond, a thiourea bond or an amide bond, an amino group, a pyridyl group, a pyrimidyl group, and an imidazole group. The functional group capable of forming a hydrogen bond may have a subsequent structure. The structure following the functional group capable of forming a hydrogen bond is not particularly limited, and aliphatic compounds such as propane, hexane, octane and dodecane, and alicyclic compounds such as cyclohexane and cyclopentane can be used. In view of the height, aromatic compounds such as benzene, naphthalene and anthracene are more preferably used. Derivatives such as bromoheptane, chlorocyclohexane, methylbenzene, chlorobenzene, nitrobenzene, diphenylmethane, chloronaphthalene and the like are also preferably used.
また、本発明においては、水素結合形成可能な官能基を二種以上有することがより好ましく、そのうち少なくとも一種が上述の含窒素官能基であることが好ましい。特に、含窒素官能基のうち少なくとも一種が尿素結合、チオ尿素結合あるいはアミド結合を複数有する官能基から選ばれることが好ましい。この場合、基材に異なる水素結合形成可能な官能基をそれぞれ結合させてもよいし、ある水素結合形成可能な官能基に、それに続く構造として別の種類の水素結合形成可能な官能基を結合させた態様でもよい。特に尿素結合、チオ尿素結合あるいはアミド結合に続く構造として例えば、アミノ基、水酸基、カルボキシル基等の水素結合形成可能な官能基をさらに有する構造が好ましく用いられる。例えばアミノ基を有する構造としては、アミノヘキサン、モノメチルアミノヘキサン、ジメチルアミノヘキサン、アミノオクタン、アミノドデカン、アミノジフェニルメタン、1−(3−アミノプロピル)イミダゾール、3−アミノ−1−プロペン、アミノピリジン、アミノベンゼンスルホン酸、トリス(2−アミノエチル)アミン等や、より好ましくは、ジアミノエタン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ジプロピレントリアミン、ポリエチレンイミン、N−メチル−2,2’−ジアミノジエチルアミン、N−アセチルエチレンジアミン、1,2−ビス(2−アミノエトキシエタン)等のようなアミノ基を複数有する化合物(ポリアミン)が用いられる。また、水酸基を有する構造としては、ヒドロキシプロパン、2−エタノールアミン、1,3−ジアミノ−2−ヒドロキシプロパン、ヒドロキシブタノン、ヒドロキシ酪酸、ヒドロキシピリジン等や、グルコース、グルコサミン、ガラクトサミン、マルトース、セルビオース、スクロース、アガロース、セルロース、キチン、キトサン等の単糖、オリゴ糖、多糖等の糖質あるいはそれらの誘導体を用いることができる。さらに、カルボキシル基を有する構造としては例えば、β−アラニン、n−カプロン酸、イソ酪酸、γ−アミノ−β−ヒドロキシ酪酸等を用いることができる。本発明の最も好ましい態様は、尿素、チオ尿素あるいはアミド基に続く構造として芳香族化合物と水素結合形成可能な化合物の両方を有するものである。 Moreover, in this invention, it is more preferable to have 2 or more types of functional groups which can form a hydrogen bond, and it is preferable that at least 1 type is the above-mentioned nitrogen-containing functional group. In particular, at least one of the nitrogen-containing functional groups is preferably selected from functional groups having a plurality of urea bonds, thiourea bonds, or amide bonds. In this case, different functional groups capable of forming hydrogen bonds may be bonded to the substrate, or another type of functional group capable of forming hydrogen bonds may be bonded to a certain functional group capable of forming hydrogen bonds as a subsequent structure. It is also possible to use such a mode. In particular, as a structure following a urea bond, a thiourea bond or an amide bond, for example, a structure further having a functional group capable of forming a hydrogen bond such as an amino group, a hydroxyl group and a carboxyl group is preferably used. For example, as a structure having an amino group, aminohexane, monomethylaminohexane, dimethylaminohexane, aminooctane, aminododecane, aminodiphenylmethane, 1- (3-aminopropyl) imidazole, 3-amino-1-propene, aminopyridine, Aminobenzenesulfonic acid, tris (2-aminoethyl) amine and the like, and more preferably diaminoethane, diethylenetriamine, triethylenetetramine, tetraethylenepentamine, dipropylenetriamine, polyethyleneimine, N-methyl-2,2′- A compound (polyamine) having a plurality of amino groups such as diaminodiethylamine, N-acetylethylenediamine, 1,2-bis (2-aminoethoxyethane) and the like is used. In addition, examples of the structure having a hydroxyl group include hydroxypropane, 2-ethanolamine, 1,3-diamino-2-hydroxypropane, hydroxybutanone, hydroxybutyric acid, hydroxypyridine, glucose, glucosamine, galactosamine, maltose, cellobiose, sucrose. Monosaccharides such as agarose, cellulose, chitin and chitosan, carbohydrates such as oligosaccharides and polysaccharides, or derivatives thereof can be used. Furthermore, as the structure having a carboxyl group, for example, β-alanine, n-caproic acid, isobutyric acid, γ-amino-β-hydroxybutyric acid and the like can be used. The most preferred embodiment of the present invention is one having both an aromatic compound and a compound capable of forming a hydrogen bond as a structure following a urea, thiourea or amide group.
さらに、尿素結合、チオ尿素結合、アミド結合を分子構造内に複数個有するような、ポリ尿素、ポリチオ尿素、ポリアミドも本発明材料の基材あるいは担体として用いることができる。これらの場合にも、尿素結合、チオ尿素結合、アミド結合に続く構造として上記構造のいずれをも用いることができるが、最も好ましくは、水酸基、アミノ基、カルボキシル基を有する化合物(糖質あるいはその誘導体を含む)、あるいは芳香族化合物が用いられる。 Furthermore, polyurea, polythiourea, and polyamide having a plurality of urea bonds, thiourea bonds, and amide bonds in the molecular structure can also be used as the base material or carrier of the material of the present invention. In these cases, any of the above structures can be used as a structure following a urea bond, a thiourea bond, or an amide bond, but most preferably a compound having a hydroxyl group, an amino group, or a carboxyl group (a saccharide or its saccharide). Derivatives), or aromatic compounds.
また、本発明における基材あるいは担体としては、モノマ、オリゴマ、ポリマのいずれでも良く、ポリアミド、ポリメチルメタクリレート、ポリスルホン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリビニルアルコール、ポリテトラフルオロエチレンなどの合成高分子や、セルロース、コラーゲン、キチン、キトサンおよびそれらの誘導体を含む天然高分子などが好適に用いられる。つまり、単独重合、共重合あるいはブレンドされたこれら合成高分子や天然高分子などに、水素結合形成可能な官能基を導入することが好適に行われる。さらに、金属、セラミック、ガラスなどの無機材料を基材として適当な高分子で被覆したり、表面を直接修飾したものも好適に用いられる。特にポリスチレン、ポリスルホン、ポリメチルメタクリレート等は、表面修飾が容易に行えるため、好ましく用いられる。 Further, the substrate or carrier in the present invention may be any of a monomer, an oligomer, and a polymer, such as polyamide, polymethyl methacrylate, polysulfone, polystyrene, polyethylene, polyvinyl alcohol, and polytetrafluoroethylene, cellulose, Natural polymers including collagen, chitin, chitosan and derivatives thereof are preferably used. That is, it is preferable to introduce a functional group capable of forming a hydrogen bond into these synthetic polymers, natural polymers, and the like that are homopolymerized, copolymerized, or blended. Furthermore, a material in which an inorganic material such as metal, ceramic, or glass is coated with an appropriate polymer as a base material or the surface is directly modified is preferably used. In particular, polystyrene, polysulfone, polymethyl methacrylate, and the like are preferably used because surface modification can be easily performed.
本発明の材料は一般に公知の方法で合成することができる。例えば脂肪族化合物や芳香族化合物に尿素結合あるいはチオ尿素結合を導入する場合には、イソシアネート誘導体あるいはイソチオシアネート誘導体とアミノ化合物とを反応させる方法を用いることができる。また、脂肪族化合物や芳香族化合物にアミド基を導入する場合には、例えば酸、酸塩化物あるいは酸無水物とアミノ化合物とを反応させる方法を用いることができる。アミノ化合物とイソシアネート、イソチオシアネート、酸、酸塩化物あるいは酸無水物の混合比は任意に選択でき、通常、イソシアネート、イソチオシアネート、酸、酸塩化物あるいは酸無水物1モルに対して0.1〜5モルのアミノ化合物が好ましく用いられる。イソシアネートあるいはイソチオシアネートとしては例えば、エチルイソシアネート、ステアリルイソシアネート、n−ブチルイソシアネート、iso−ブチルイソシアネート、n−プロピルイソシアネート、メチルイソチオシアネート、エチルイソチオシアネート、n−ブチルイソチオシアネート、ベンジルイソチオシアネート、ヘキサメチレンジイソシアネート、シクロヘキシルイソシアネート、シクロヘキシルイソチオシアネート、シクロヘキシルジイソシアネート等の脂肪族イソシアネートあるいはイソチオシアネートのいずれをも用いることができるが、より好ましくはフェニルイソシアネート、クロロフェニルイソシアネート、フルオロフェニルイソシアネート、ブロモフェニルイソシアネート、ニトロフェニルイソシアネート、トリルイソシアネート、メトキシフェニルイソシアネート、1−ナフチルイソシアネート、4,4’−ジフェニルメタンジイソシアネート、3,3’,5,5’−テトラエチル−4,4’−ジイソシアナトジフェニルメタン、フェニルイソチオシアネート、クロロフェニルイソチオシアネート、フルオロフェニルイソチオシアネート、ニトロフェニルイソチオシアネート、トリルイソチオシアネート、メトキシフェニルイソチオシアネート、1−ナフチルイソチオシアネート等の芳香族イソシアネートあるいはイソチオシアネートが用いられる。酸塩化物としては例えば、塩化イソバレリル、塩化ステアロイル、シクロヘキサンクロライド、6−クロロニコチニルクロライド等の脂肪族酸塩化物のいずれをも用いることができるが、より好ましくは塩化ベンゾイル、塩化3,4−ジクロロベンゾイル、ニトロベンゾイル、塩化−4−クロロベンゾイル、塩化−4−トリオイル、ベンゾ−[b]チオフェン−2−カルボニルクロライド等の芳香族酸塩化物を用いることができる。また、酸無水物としては例えば、無水酢酸、無水コハク酸、無水フタル酸、無水安息香酸等を好ましく用いることができる。また、上述に挙げた材料に限ることなくポリ尿素あるいはポリチオ尿素の場合でも、例えばポリイソシアネート誘導体あるいはポリイソチオシアネート誘導体とポリアミノ化合物とを反応させる方法を用いることができる。 The material of the present invention can be synthesized by generally known methods. For example, when a urea bond or a thiourea bond is introduced into an aliphatic compound or an aromatic compound, a method of reacting an isocyanate compound or an isothiocyanate derivative with an amino compound can be used. Moreover, when introducing an amide group into an aliphatic compound or an aromatic compound, for example, a method of reacting an acid, acid chloride or acid anhydride with an amino compound can be used. The mixing ratio of the amino compound and the isocyanate, isothiocyanate, acid, acid chloride or acid anhydride can be arbitrarily selected, and is usually 0.1 per mole of isocyanate, isothiocyanate, acid, acid chloride or acid anhydride. ˜5 mol of amino compound is preferably used. Examples of isocyanate or isothiocyanate include ethyl isocyanate, stearyl isocyanate, n-butyl isocyanate, iso-butyl isocyanate, n-propyl isocyanate, methyl isothiocyanate, ethyl isothiocyanate, n-butyl isothiocyanate, benzyl isothiocyanate, hexamethylene diisocyanate. Any of aliphatic isocyanates and isothiocyanates such as cyclohexyl isocyanate, cyclohexyl isothiocyanate and cyclohexyl diisocyanate can be used, but more preferred are phenyl isocyanate, chlorophenyl isocyanate, fluorophenyl isocyanate, bromophenyl isocyanate, nitrophenyl isocyanate. Tolyl isocyanate, methoxyphenyl isocyanate, 1-naphthyl isocyanate, 4,4′-diphenylmethane diisocyanate, 3,3 ′, 5,5′-tetraethyl-4,4′-diisocyanatodiphenylmethane, phenyl isothiocyanate, chlorophenyl isothiocyanate, Aromatic isocyanates or isothiocyanates such as fluorophenyl isothiocyanate, nitrophenyl isothiocyanate, tolyl isothiocyanate, methoxyphenyl isothiocyanate and 1-naphthyl isothiocyanate are used. As the acid chloride, for example, any of aliphatic acid chlorides such as isovaleryl chloride, stearoyl chloride, cyclohexane chloride, 6-chloronicotinyl chloride, etc. can be used, but benzoyl chloride, 3,4-chloride are more preferable. Aromatic acid chlorides such as dichlorobenzoyl, nitrobenzoyl, -4-chlorobenzoyl chloride, -4-trioyl chloride, and benzo- [b] thiophene-2-carbonyl chloride can be used. As the acid anhydride, for example, acetic anhydride, succinic anhydride, phthalic anhydride, benzoic anhydride and the like can be preferably used. Further, the present invention is not limited to the above-described materials, and even in the case of polyurea or polythiourea, for example, a method of reacting a polyisocyanate derivative or polyisothiocyanate derivative with a polyamino compound can be used.
本発明に用いるアミノ化合物のアミノ基としては1級アミノ基、2級アミノ基、3級アミノ基のいずれでも良く、アミノ化合物としては例えば、アンモニア、sec−オクチルアミン、1−(3−アミノプロピル)イミダゾール、3−アミノ−1−プロペン、アミノピリジン、アミノベンゼンスルホン酸、トリス(2−アミノエチル)アミン等を好ましく用いることができる。また、尿素結合、チオ尿素結合あるいはアミド結合に加えて水素結合形成可能な基を導入できるような、ポリアミノ化合物や水酸基あるいはカルボキシル基を有するアミノ化合物も好ましく用いることができる。ポリアミノ化合物としては例えば、ジアミノエタン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ジプロピレントリアミン、N−メチル−2,2’−ジアミノジエチルアミン、ポリエチレンイミン、N−アセチルエチレンジアミン、1,2−ビス(2−アミノエトキシ)エタン等のいずれをも用いることができる。水酸基を有するアミノ化合物としては、2−エタノールアミン、3−プロパノールアミン、6−ヘキサノールアミン、1,3−ジアミノ−2−ヒドロキシプロパン、2−(2−アミノエトキシ)エタノール、2−(2−アミノエチルアミノ)エタノール、グルカミン、N−メチル−1,3−ジアミノプロパノール等の脂肪族アミン、あるいは、4−アミノフェノール、ジアミノフェノール、アミノヒドロキシピリミジン、ジアミノヒドロキシピリミジン、ジアミノヒドロキシピラゾール等の芳香族アミン、あるいはセリン、チロシン等のアミノ酸類が用いられる。また、エピクロロヒドリンおよびアミノ化合物、あるいは1,3−ジブロモ−2−ヒドロキシプロパンを反応させることによって水酸基のみを有する化合物あるいはアミノ基のみを有する化合物から水酸基を有するアミノ化合物を合成することも可能である。 The amino group of the amino compound used in the present invention may be any of primary amino group, secondary amino group, and tertiary amino group. Examples of the amino compound include ammonia, sec-octylamine, 1- (3-aminopropyl). ) Imidazole, 3-amino-1-propene, aminopyridine, aminobenzenesulfonic acid, tris (2-aminoethyl) amine and the like can be preferably used. Further, polyamino compounds and amino compounds having a hydroxyl group or a carboxyl group that can introduce a group capable of forming a hydrogen bond in addition to a urea bond, a thiourea bond or an amide bond can also be preferably used. Examples of the polyamino compound include diaminoethane, diethylenetriamine, triethylenetetramine, tetraethylenepentamine, dipropylenetriamine, N-methyl-2,2′-diaminodiethylamine, polyethyleneimine, N-acetylethylenediamine, 1,2-bis ( Any of 2-aminoethoxy) ethane and the like can be used. Examples of amino compounds having a hydroxyl group include 2-ethanolamine, 3-propanolamine, 6-hexanolamine, 1,3-diamino-2-hydroxypropane, 2- (2-aminoethoxy) ethanol, 2- (2-amino Ethylamino) aliphatic amines such as ethanol, glucamine, N-methyl-1,3-diaminopropanol, or aromatic amines such as 4-aminophenol, diaminophenol, aminohydroxypyrimidine, diaminohydroxypyrimidine, diaminohydroxypyrazole, Alternatively, amino acids such as serine and tyrosine are used. It is also possible to synthesize an amino compound having a hydroxyl group from a compound having only a hydroxyl group or a compound having only an amino group by reacting epichlorohydrin and an amino compound, or 1,3-dibromo-2-hydroxypropane. It is.
また、糖質を基材として、糖質に水素結合形成可能な基を導入する場合も上記と同様な方法を用いることができる。すなわち、キトサンやグルコサミンのようなアミノ基を有する糖質の場合には、上述したようなイソシアネート、イソチオシアネート、酸、酸塩化物あるいは酸無水物を反応させることができる。セルロースのようなアミノ基を有さない糖質の場合には、糖質の水酸基をエピクロルヒドリン、トレシルクロライドなどを用いて活性化させた後に、アンモニアやジアミノエタンなどと反応させてアミノ基を導入し、このアミノ基を利用して、糖質に尿素結合、チオ尿素結合、アミド結合等の水素結合形成可能な基を導入することができる。カルボキシル基を有するアミノ化合物としては例えば、β−アラニン、4−アミノ−n−酪酸、γ−アミノ−β−ヒドロキシ−n−酪酸、6−アミノ−n−カプロン酸等を用いることができる。 The same method as described above can also be used when a group capable of forming a hydrogen bond is introduced into a saccharide using a saccharide as a base material. That is, in the case of a carbohydrate having an amino group such as chitosan or glucosamine, the above-described isocyanate, isothiocyanate, acid, acid chloride or acid anhydride can be reacted. In the case of carbohydrates such as cellulose that do not have an amino group, the hydroxyl group of the carbohydrate is activated using epichlorohydrin, tresyl chloride, etc., and then reacted with ammonia or diaminoethane to introduce the amino group. By using this amino group, a group capable of forming a hydrogen bond such as a urea bond, a thiourea bond, and an amide bond can be introduced into the carbohydrate. Examples of amino compounds having a carboxyl group include β-alanine, 4-amino-n-butyric acid, γ-amino-β-hydroxy-n-butyric acid, 6-amino-n-caproic acid, and the like.
さらに、本発明の材料がポリアミドの場合には、例えばポリカルボン酸とポリアミンを重縮合させる方法を用いることができる。また、ポリ尿素、ポリチオ尿素、ポリアミドのいずれにおいても、ポリイソシアネート、ポリイソチオシアネート、ポリカルボン酸などを用いずに、各々の官能基を一つずつ順次導入することによって最終的にポリ尿素、ポリチオ尿素、ポリアミドを得る方法も好ましく行われる。 Furthermore, when the material of the present invention is polyamide, for example, a method of polycondensation of polycarboxylic acid and polyamine can be used. In addition, in any of polyurea, polythiourea, and polyamide, the polyurea, polythiothiocyanate, and polythiol are finally introduced by sequentially introducing each functional group without using polyisocyanate, polyisothiocyanate, polycarboxylic acid, or the like. A method of obtaining urea or polyamide is also preferably performed.
本発明において基材がオリゴマあるいはポリマの場合には、例えば、イソシアネート基、カルボキシル基あるいはスクシンイミド基等のカルボン酸の活性エステル基を有するオリゴマあるいはポリマに、水素結合形成可能な基を有する化合物のアミノ基を反応させる方法が好ましく用いられる。また、アミノ基を有するオリゴマ、ポリマ、あるいはアンモニア、ジアミノエタン、1,3−ジアミノプロパン、1,3−ジアミノ−2−ヒドロキシプロパン、1,2−ビス(2−アミノエトキシ)エタン、トリス(2−アミノエチル)アミン、2−(2−アミノエチルアミノ)エタノールなどによりアミノ基を導入したオリゴマ、ポリマに上述したようなイソシアネート誘導体、イソチオシアネート誘導体、酸、酸塩化物あるいは酸無水物を反応させることも好ましい方法である。また、酸塩化物やイソシアネート誘導体がアミノ基以外の水素結合形成可能な基に反応しないように、反応時間や反応温度を制御したり、保護基を用いることが好ましい。アミノ基、イソシアネート基、カルボキシル基あるいはスクシンイミド基等のカルボン酸の活性エステル基、酸塩化物基、酸無水物基などの官能基は、必要に応じてオリゴマ、ポリマに導入することができる。
本発明の材料は、好ましくは血液凝固活性の指標となるPT、APTTの変化量が体液接触前後で20%以下であり、かつヘパリンに対する吸着率が30%以下であり、かつアルブミンに対する吸着率が20%以下である、アルブミン非結合かつグルクロン酸非抱合のビリルビンを除去する材料である。これらの、PT、APTTの変化量やヘパリン、アルブミンに対する吸着率は、例えば、水素結合形成可能な官能基の種類や導入数、それに続く構造の種類等によってコントロールすることができる。ヘパリン、アルブミンに対する吸着率は以下のようにして求める。即ち、ヘパリンまたはアルブミンを含む体液を材料と接触させ、接触前後の濃度を測定することにより求める。ヘパリンの濃度の測定は、ベーリングコアグレーションシステム(デイドベーリング(株)製)を使用して、測定原理としてはファクターXa残存量から求める発色性合成基質法を用いて行う。アルブミン濃度の測定は、富士ドライケム(富士写真フィルム(株)製)を使用し、測定原理としてはブロムクレゾールグリーン法を用いて行う。また、ヘパリン、アルブミンに対するそれぞれの吸着率を以下の式にて算出する。
In the present invention, when the substrate is an oligomer or polymer, for example, an amino group of a compound having a group capable of forming a hydrogen bond with an oligomer or polymer having an active ester group of a carboxylic acid such as an isocyanate group, a carboxyl group or a succinimide group. A method of reacting a group is preferably used. Further, oligomers or polymers having amino groups, or ammonia, diaminoethane, 1,3-diaminopropane, 1,3-diamino-2-hydroxypropane, 1,2-bis (2-aminoethoxy) ethane, tris (2 -Aminoethyl) amine, oligomers introduced with amino groups by 2- (2-aminoethylamino) ethanol, etc., polymers are reacted with isocyanate derivatives, isothiocyanate derivatives, acids, acid chlorides or acid anhydrides as described above. This is also a preferred method. Moreover, it is preferable to control reaction time and reaction temperature, or to use a protecting group so that an acid chloride or an isocyanate derivative does not react with a group capable of forming a hydrogen bond other than an amino group. Functional groups such as active ester groups of carboxylic acids such as amino groups, isocyanate groups, carboxyl groups or succinimide groups, acid chloride groups and acid anhydride groups can be introduced into the oligomers and polymers as required.
The material of the present invention preferably has a change amount of PT, APTT, which is an index of blood coagulation activity, of 20% or less before and after contact with body fluid, an adsorption rate to heparin of 30% or less, and an adsorption rate to albumin. It is a material for removing albumin non-binding and glucuronic acid non-conjugated bilirubin that is 20% or less. The amount of change in PT and APTT, the adsorption rate for heparin, and albumin can be controlled by, for example, the type and number of functional groups capable of forming hydrogen bonds, the type of subsequent structure, and the like. The adsorption rate for heparin and albumin is determined as follows. That is, it is obtained by contacting a body fluid containing heparin or albumin with a material and measuring the concentration before and after the contact. The concentration of heparin is measured by using a chromogenic synthetic substrate method obtained from a residual factor Xa as a measurement principle using a Behring coagulation system (manufactured by Dade Behring Co., Ltd.). The measurement of albumin concentration is performed using Fuji Dry Chem (Fuji Photo Film Co., Ltd.), and the measurement principle is the bromcresol green method. Further, the respective adsorption rates for heparin and albumin are calculated by the following formulas.
吸着率(%)=((体液接触前の濃度−体液接触後の濃度)/体液接触前の濃度)×100
該水素結合形成可能な官能基としては、少なすぎるとアルブミン非結合かつグルクロン酸非抱合のビリルビンの吸着性能が得られにくくなり、PT、APTTの変化量、ヘパリン、アルブミンに対する吸着率については基材あるいは担体の影響を受けるため、性能を満足することができない可能性がでてくる。また、多すぎると当該水素形成可能な官能基によりPT、APTTの変化が起こり、かつ、ヘパリン、アルブミンが吸着されてしまう。例えば、アミン化合物としてポリエチレンイミンを用い、さらにイソシアネートを反応させてアミノ基と尿素結合の両方を有する官能基を用いる場合、該ポリエチレンイミンの窒素数としては2から10が好ましい。
Adsorption rate (%) = ((concentration before body fluid contact−concentration after body fluid contact) / concentration before body fluid contact) × 100
If there are too few functional groups capable of forming hydrogen bonds, it will be difficult to obtain the adsorption performance of bilirubin that is not bound to albumin and unconjugated to glucuronic acid, and the amount of change in PT and APTT, the adsorption rate to heparin, and albumin are the base materials. Or since it is influenced by the carrier, there is a possibility that the performance cannot be satisfied. On the other hand, when the amount is too large, PT and APTT are changed by the functional group capable of forming hydrogen, and heparin and albumin are adsorbed. For example, when polyethyleneimine is used as an amine compound and a functional group having both an amino group and a urea bond is used by further reacting isocyanate, the nitrogen number of the polyethyleneimine is preferably 2 to 10.
また、本発明において、該水素結合形成可能な官能基の量としては、少なすぎるとアルブミン非結合かつグルクロン酸非抱合のビリルビンの吸着性能が得られにくく、かつ、PT、APTTの変化量、ヘパリン、アルブミンに対する吸着率については基材あるいは担体の影響を受けるため、性能を満足することができない可能性がでてくる。また、多すぎると該水素形成可能な官能基によりPT、APTTの変化が起こり、かつ、ヘパリン、アルブミンが吸着されてしまう。例えば、反応性官能基としてクロルアセトアミドメチルを有するポリスチレンにテトラエチレンペンタミンおよびクロロフェニルイソシアネートを反応させて水素結合形成可能な官能基を固定化する場合、仕込量としてはポリスチレン繰り返し単位あたりテトラエチレンペンタミン0.005〜100.0モル、クロロフェニルイソシアネート0.005〜100.0モルが好ましく、テトラエチレンペンタミン0.01〜20.0モル、クロロフェニルイソシアネート0.01〜20.0モルがより好ましい。 In the present invention, if the amount of the functional group capable of forming a hydrogen bond is too small, it is difficult to obtain the ability to adsorb bilirubin which is not bound to albumin and unconjugated to glucuronic acid, and the amount of change in PT, APTT, heparin Since the adsorption rate for albumin is influenced by the base material or the carrier, there is a possibility that the performance cannot be satisfied. On the other hand, if the amount is too large, PT and APTT are changed by the functional group capable of forming hydrogen, and heparin and albumin are adsorbed. For example, when a functional group capable of forming a hydrogen bond is immobilized by reacting polystyrene having chloroacetamidomethyl as a reactive functional group with tetraethylenepentamine and chlorophenyl isocyanate, the charged amount is tetraethylenepentamine per polystyrene repeating unit. 0.005 to 100.0 mol, chlorophenyl isocyanate 0.005 to 100.0 mol are preferable, tetraethylenepentamine 0.01 to 20.0 mol, and chlorophenyl isocyanate 0.01 to 20.0 mol are more preferable.
本発明の材料を作製するにあたって、上記すべての反応条件は限定されるものではないが、標準的には、反応温度は例えば0〜150℃、反応時間は例えば0.1〜24時間で行われる。また、反応溶媒は必ずしも必要ではないが、一般的には溶媒の存在下に行われる。使用しうる溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、n−ブタノール、ヘキサン、アセトン、N,N−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の脂肪族炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ジクロロメタン、クロロホルム、クロロベンゼン等のハロゲン化炭化水素類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル類等が挙げられる。反応終了後の反応液は、必要に応じ、ろ過、濃縮などの通常の後処理の後、カラムクロマトグラフィー、再結晶などの操作により、精製することができる。また、水不溶性の材料の場合、ガラスフィルター等を用いて洗浄することも好ましい方法である。 In preparing the material of the present invention, all of the above reaction conditions are not limited, but typically, the reaction temperature is, for example, 0 to 150 ° C., and the reaction time is, for example, 0.1 to 24 hours. . In addition, a reaction solvent is not necessarily required, but it is generally performed in the presence of a solvent. Solvents that can be used include aliphatic hydrocarbons such as methanol, ethanol, isopropyl alcohol, n-butanol, hexane, acetone, N, N-dimethylformamide, and dimethyl sulfoxide, and aromatic hydrocarbons such as benzene, toluene, and xylene. And halogenated hydrocarbons such as dichloromethane, chloroform and chlorobenzene, and ethers such as diethyl ether, tetrahydrofuran and dioxane. The reaction solution after completion of the reaction can be purified by operations such as column chromatography and recrystallization after usual post-treatment such as filtration and concentration, if necessary. In the case of a water-insoluble material, washing with a glass filter or the like is also a preferable method.
また、本発明の材料は単独での使用のみならず、適当な他の基材にさらに固定化したり、他の材料と混合して一つのカラムあるいは被覆材料として用いることもできる。固定化あるいは混合などの操作は、基材あるいは担体を後述する形状に加工する前に行っても良いし、加工した後に行っても良い。 Further, the material of the present invention can be used not only alone, but also can be further fixed to another appropriate base material, or mixed with other materials and used as one column or coating material. The operation such as immobilization or mixing may be performed before the substrate or the carrier is processed into a shape described later, or may be performed after the processing.
本発明における基材あるいは担体の形状としては特に限定はないが、体液浄化カラムとして用いる場合には、ビーズ状、繊維(複合繊維、中空繊維、糸束、ヤーン等)、スポンジ状、ネット状、編地、織物等として用いられるが、表面積が大きく、流路抵抗が小さいことを考慮すると、繊維(特に中空繊維や複合繊維)、編地、織物が好ましく用いられる。基材あるいは担体がポリマであれば、その多くは繊維形成能を有するため容易に繊維状とすることができるが、カラム充填材として使用するには強度不足の場合には、他のポリマとの複合繊維とすることや、他の繊維と混繊、混編、混織する等により改良が可能である。例えば、ポリスチレン/ポリプロピレン海島繊維は、ポリスチレンの修飾のしやすさと、ポリプロピレンによる強度補強による扱い易さを持つためより好ましい態様である。被覆材料の場合は、編織物あるいはフィルム等の形状が好ましい。 The shape of the substrate or carrier in the present invention is not particularly limited, but when used as a body fluid purification column, beads, fibers (composite fibers, hollow fibers, yarn bundles, yarns, etc.), sponges, nets, Although used as knitted fabric, woven fabric, etc., considering that the surface area is large and the flow resistance is small, fibers (particularly hollow fibers and composite fibers), knitted fabrics, and woven fabrics are preferably used. If the substrate or carrier is a polymer, many of them have fiber-forming ability and can easily be made fibrous. However, if the strength is insufficient for use as a column packing material, Improvements can be made by using a composite fiber, blending with other fibers, blending, weaving, or the like. For example, polystyrene / polypropylene sea-island fiber is a more preferable embodiment because it has easy modification of polystyrene and is easy to handle due to strength reinforcement by polypropylene. In the case of a coating material, a shape such as a knitted fabric or a film is preferable.
本発明の材料を充填したカラムは体外循環用カラムとして用いることができる。体外循環用カラムとしては、公知の体外循環用カラムと同様のモジュールを使用することができるが、特に新生児などの低体重児の体液浄化を実施する場合には、カラムのプライミング容積が50mL以下であることが望ましい。このようなことが実現できたのは本発明の除去材料がアルブミン非結合かつグルクロン酸非包合ビリルビンの吸着性能に優れているためである。本発明の除去材料を用いることにより、初めてプライミング容積が50mL以下で実用的な、アルブミン非結合かつグルクロン酸非包合ビリルビン除去のための体外循環用カラムが得られたのである。 The column filled with the material of the present invention can be used as an extracorporeal circulation column. As the extracorporeal circulation column, the same module as the known extracorporeal circulation column can be used. However, when purifying body fluid of a low-weight infant such as a newborn infant, the priming volume of the column is 50 mL or less. It is desirable to be. This is because the removal material of the present invention is excellent in the adsorption performance of albumin non-binding and glucuronic acid non-encapsulating bilirubin. By using the removal material of the present invention, an extracorporeal circulation column for removing albumin non-binding and glucuronic acid non-encapsulated bilirubin having a priming volume of 50 mL or less was obtained for the first time.
なお、体外循環の方法は、体外に導出した血液を直接カラムに通しても良いし、血漿分離膜などと組み合わせて使用しても良い。 As a method for extracorporeal circulation, blood derived outside the body may be directly passed through a column, or may be used in combination with a plasma separation membrane or the like.
以下に実施例を用いて詳細に説明を加えるが、発明の内容は実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in detail using examples, but the content of the invention is not limited to the examples.
<実施例1>
in vitroアルブミン非結合かつグルクロン酸非抱合のビリルビン除去試験(1)を行った。
65重量比の海成分(ポリスチレン)と35重量比の島成分(ポリプロピレン)とからなる海島型複合繊維(強度:1.0g/d、伸度:47.7%、太さ:132デニール、島の数:16)30gを、60gのN−メチロール−α−クロロアセトアミド、400gのニトロベンゼン、400gの98質量%硫酸、0.86gのパラホルムアルデヒドの混合溶液と20℃で1時間反応させた。その後、繊維をニトロベンゼンで洗浄し、その後メタノールにより反応を停止させた後、さらにメタノールで洗浄することによりα−クロロアセトアミドメチル化架橋ポリスチレン繊維(以下AMPSt繊維と略す)を得た。
<Example 1>
An in vitro albumin non-binding and glucuronic acid non-conjugated bilirubin removal test (1) was performed.
Sea-island type composite fiber (strength: 1.0 g / d, elongation: 47.7%, thickness: 132 denier, island) consisting of 65 parts by weight sea component (polystyrene) and 35 parts by weight island component (polypropylene) 16) 30 g was reacted with a mixed solution of 60 g of N-methylol-α-chloroacetamide, 400 g of nitrobenzene, 400 g of 98% by mass sulfuric acid and 0.86 g of paraformaldehyde at 20 ° C. for 1 hour. Thereafter, the fiber was washed with nitrobenzene, then the reaction was stopped with methanol, and further washed with methanol to obtain α-chloroacetamidomethylated crosslinked polystyrene fiber (hereinafter abbreviated as AMPSt fiber).
次に、AMPSt繊維を、テトラエチレンペンタミン5.0gを溶解したジメチルスルホキシド(以下DMSOと略す)500mlに添加し、反応を30℃で3時間行った。さらにその繊維を1.9gの4−クロロフェニルイソシアネートを溶解したDMSO1000mlの溶液に添加し、反応を30℃で1時間行った。その後、ガラスフィルター上でDMSO1000mlを用いて洗浄し、さらに蒸留水1000mlを用いて洗浄し、尿素結合を導入したAMPSt繊維(UAMP繊維と略す)を得た。
作製したUAMP繊維を用いて、アルブミン非結合かつグルクロン酸非抱合のビリルビン除去試験を行った。ビリルビンはグルクロン酸非抱合のビリルビンを用いた。ビリルビン溶液調製方法は、ビリルビンが水に不溶性のため、まず100mM水酸化ナトリウムに溶解させ、さらに、ヒト体液中ではアルブミンが存在しているため、4%ヒト血清アルブミン溶液で溶解した。被吸着溶液のビリルビンの濃度は300mg/mLとした。次にUAMP繊維30mgをこの被吸着溶液1mL中に添加し、37℃で2時間旋回攪拌しつつ吸着反応を行った。次に吸着前後のビリルビン溶液を分子量5万の限外濾過膜で分離し、アルブミン非結合かつグルクロン酸非抱合のビリルビン溶液とアルブミン結合かつグルクロン酸非抱合のビリルビン溶液とに分けて吸着率を算出した。また、吸着率は次式の通り算出した。
Next, the AMPSt fiber was added to 500 ml of dimethyl sulfoxide (hereinafter abbreviated as DMSO) in which 5.0 g of tetraethylenepentamine was dissolved, and the reaction was carried out at 30 ° C. for 3 hours. Further, the fiber was added to a solution of 1000 ml of DMSO in which 1.9 g of 4-chlorophenyl isocyanate was dissolved, and the reaction was carried out at 30 ° C. for 1 hour. Thereafter, the glass filter was washed with 1000 ml of DMSO and further with 1000 ml of distilled water to obtain AMPSt fibers (abbreviated as UAMP fibers) into which urea bonds were introduced.
Using the prepared UAMP fiber, a test for removing bilirubin that was not bound to albumin and unconjugated to glucuronic acid was performed. As the bilirubin, bilirubin unconjugated with glucuronic acid was used. In the bilirubin solution preparation method, since bilirubin is insoluble in water, it was first dissolved in 100 mM sodium hydroxide. Furthermore, since albumin is present in human body fluid, it was dissolved in a 4% human serum albumin solution. The concentration of bilirubin in the adsorbed solution was 300 mg / mL. Next, 30 mg of UAMP fiber was added to 1 mL of this adsorbed solution, and an adsorption reaction was performed while swirling at 37 ° C. for 2 hours. Next, the bilirubin solution before and after the adsorption is separated by an ultrafiltration membrane having a molecular weight of 50,000, and the adsorption rate is calculated by separating it into an albumin-unbound and glucuronic acid-unconjugated bilirubin solution and an albumin-bound and glucuronic acid unconjugated bilirubin solution. did. Further, the adsorption rate was calculated as follows.
吸着率(%)=((体液接触前の濃度−体液接触後の濃度)/体液接触前の濃度)×100
ビリルビン濃度の測定はジアゾ化反応により、富士ドライケム(富士写真フィルム(株)製)を使用して行った。また、それぞれの溶液のアルブミン含有量は、ブロムクレゾールグリーン法により富士ドライケム(富士写真フィルム(株)製)を使用して行った。その結果を表1に示す。
Adsorption rate (%) = ((concentration before body fluid contact−concentration after body fluid contact) / concentration before body fluid contact) × 100
The measurement of the bilirubin concentration was performed by using a Fuji Dry Chem (Fuji Photo Film Co., Ltd.) by a diazotization reaction. Moreover, the albumin content of each solution was determined using Fuji Dry Chem (Fuji Photo Film Co., Ltd.) by the bromcresol green method. The results are shown in Table 1.
以上の結果より、尿素結合を有するUAMP繊維はアルブミン非結合かつグルクロン酸非抱合ビリルビンを、選択的に高率に吸着除去することが示された。 From the above results, it was shown that UAMP fibers having a urea bond selectively adsorbed and removed albumin-unbound and glucuronide-unconjugated bilirubin at a high rate.
<実施例2>
in vitroアルブミン非結合かつグルクロン酸非抱合のビリルビン除去試験(2)を行った。
65重量比の海成分(ポリスチレン)と35重量比の島成分(ポリプロピレン)とからなる海島型複合繊維(強度:1.0g/d、伸度:47.7%、太さ:132デニール、島の数:16)30gを、60gのN−メチロール−α−クロロアセトアミド、400gのニトロベンゼン、400gの98質量%硫酸、0.86gのパラホルムアルデヒドの混合溶液と20℃で1時間反応させた。その後、繊維をニトロベンゼンで洗浄し、その後メタノールにより反応を停止させた後、さらにメタノールで洗浄することによりα−クロロアセトアミドメチル化架橋ポリスチレン繊維(以下AMPSt繊維と略す)を得た。
<Example 2>
An in vitro albumin non-binding and glucuronic acid non-conjugated bilirubin removal test (2) was performed.
Sea-island type composite fiber (strength: 1.0 g / d, elongation: 47.7%, thickness: 132 denier, island) consisting of 65 parts by weight sea component (polystyrene) and 35 parts by weight island component (polypropylene) 16) 30 g was reacted with a mixed solution of 60 g of N-methylol-α-chloroacetamide, 400 g of nitrobenzene, 400 g of 98% by mass sulfuric acid and 0.86 g of paraformaldehyde at 20 ° C. for 1 hour. Thereafter, the fiber was washed with nitrobenzene, then the reaction was stopped with methanol, and further washed with methanol to obtain α-chloroacetamidomethylated crosslinked polystyrene fiber (hereinafter abbreviated as AMPSt fiber).
次に、AMPSt繊維を、2−アミノ−ピリミジン9.6gを溶解したジメチルスルホキシド(以下DMSOと略す)500mlに添加し、反応を30℃で3時間行った。その後、ガラスフィルター上でDMSO1000mlを用いて洗浄し、さらに蒸留水1000mlを用いて洗浄し、アミノピリミジンを導入したAMPSt繊維(APAMP繊維と略す)を得た。作製したAPAMP繊維を用いて、アルブミン非結合かつグルクロン酸非抱合のビリルビン除去試験を行った。試験の方法は実施例1の方法と同様とした。その結果を表2に示す。以上の結果より、アミノピリミジン基を有するAPAMP繊維はアルブミン非結合かつグルクロン酸非抱合ビリルビンを、選択的に高率に吸着除去することが示された。 Next, the AMPSt fiber was added to 500 ml of dimethyl sulfoxide (hereinafter abbreviated as DMSO) in which 9.6 g of 2-amino-pyrimidine was dissolved, and the reaction was performed at 30 ° C. for 3 hours. Thereafter, the plate was washed with 1000 ml of DMSO on a glass filter, and further washed with 1000 ml of distilled water to obtain AMPSt fibers (abbreviated as APAMP fibers) into which aminopyrimidine was introduced. Using the prepared APAMP fiber, a test for removing bilirubin that was not bound to albumin and unconjugated to glucuronic acid was performed. The test method was the same as the method of Example 1. The results are shown in Table 2. From the above results, it was shown that the APAMP fiber having an aminopyrimidine group selectively adsorbs and removes albumin-unbound and glucuronic acid-unconjugated bilirubin at a high rate.
<実施例3>
in vitro PT、APTTの変化量測定試験ならびにヘパリン、アルブミンの吸着試験を行った。実施例1および2で作製したUAMP繊維ならびにAPAMP繊維を用いて、血液凝固活性の指標となるPTおよびAPTTの変化量測定試験、ヘパリン(抗凝固剤)およびアルブミンの吸着試験を行った。PT、APTT変化量測定試験およびアルブミン吸着試験はUAMP繊維30mgを3.8質量%クエン酸ナトリウムで処理した正常ヒト血漿1mLに、ヘパリン吸着試験は正常ヒト全血1mL中にUAMP繊維ならびにAPAMP繊維30mgをそれぞれ添加し、37℃で1時間旋回攪拌しつつ吸着実験を行った。PTおよびAPTTについては吸着前後の時間より変化率を、ヘパリンおよびアルブミンについては吸着前後の濃度より吸着率を求めた。変化率および吸着率は次式の通り算出した。
<Example 3>
In vitro PT and APTT variation measurement tests and heparin and albumin adsorption tests were performed. Using the UAMP fiber and APAMP fiber produced in Examples 1 and 2, a test for measuring changes in PT and APTT, which are indicators of blood coagulation activity, and an adsorption test for heparin (anticoagulant) and albumin were performed. PT, APTT variation measurement test and albumin adsorption test were performed on 1 mL of normal human plasma treated with 30 mg of UAMP fiber with 3.8 mass% sodium citrate, and heparin adsorption test was performed on 30 mg of UAMP fiber and APAMP fiber in 1 mL of normal human whole blood. Were added, and an adsorption experiment was conducted while swirling and stirring at 37 ° C. for 1 hour. For PT and APTT, the rate of change was determined from the time before and after adsorption, and for heparin and albumin, the rate of adsorption was determined from the concentration before and after adsorption. The rate of change and the adsorption rate were calculated as follows.
変化率または吸着率(%)=((体液接触前の濃度−体液接触後の濃度)/体液接触前の濃度)×100
測定については、PTはQuick一段法(散乱光度法)、APTTはLangdell法(散乱光度法)、ヘパリンはベーリングコアグレーションシステム(デイドベーリング(株)製)を使用して、測定原理としてはファクターXa残存量から求める発色性合成基質法で、アルブミンは富士ドライケム(富士写真フィルム(株)製)を使用し、ブロムクレゾールグリーン法で行った。その結果を表3(UAMP繊維)および表4(APAMP繊維)に示す。以上の結果より、UAMP繊維ならびにAPAMP繊維による吸着材料はPTおよびAPTTの延長率が接触前後で20%以下であり、かつヘパリンに対する吸着率が30%以下であり、かつアルブミンに対する吸着率が20%以下であることが示された。
Change rate or adsorption rate (%) = ((concentration before body fluid contact−concentration after body fluid contact) / concentration before body fluid contact) × 100
For the measurement, PT is a quick one-step method (scattering photometry), APTT is a Langdell method (scattering photometry), and heparin is a Behring coagulation system (manufactured by Dade Bering Co., Ltd.). In the chromogenic synthetic substrate method determined from the residual amount of Xa, albumin was measured by bromcresol green method using Fuji Dry Chem (manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.). The results are shown in Table 3 (UAMP fiber) and Table 4 (APAMP fiber). From the above results, the adsorbed material by UAMP fiber and APAMP fiber has an extension rate of PT and APTT of 20% or less before and after contact, an adsorption rate to heparin of 30% or less, and an adsorption rate to albumin of 20%. It was shown that:
<実施例4>
in vitroアルブミン非結合かつグルクロン酸非抱合のビリルビン灌流除去試験を行った。
実施例1に示すUAMP繊維をプライミングボリウム10mLの血液浄化カラムに充填し、RO水(逆浸透膜濾過水)で洗浄後、生理食塩液を充填し、カラム内の繊維のγ線滅菌を実施した。次に、そのカラムにプライミングボリウム10mLの回路を接続し、ペリスターリックポンプを用いて生理食塩液500mLを流し、洗浄した。その後、アルブミン非結合かつグルクロン酸非抱合のビリルビン溶液を用いて灌流除去試験を行った。ビリルビンはグルクロン酸非抱合のビリルビンを用い、アルブミン非結合かつグルクロン酸非抱合のビリルビン溶液の調製方法は実施例1に示す通りとした。灌流時の温度、時間についての条件は37℃、5時間とし、サンプリング時間は灌流開始前、灌流開始1時間後、2時間後、3時間後、4時間後および5時間後とした。サンプリングした溶液を分子量5万の限外濾過膜で分離することでアルブミン非結合かつグルクロン酸非抱合のビリルビン溶液とアルブミン結合かつグルクロン酸非抱合のビリルビン溶液とに分け、吸着率を算出した。
<Example 4>
An in vitro albumin non-binding and glucuronic acid non-conjugated bilirubin perfusion removal test was performed.
The UAMP fiber shown in Example 1 was filled in a 10 mL priming volume blood purification column, washed with RO water (reverse osmosis membrane filtered water), then filled with physiological saline, and γ-ray sterilization of the fiber in the column was performed. . Next, a circuit of 10 mL of priming volume was connected to the column, and 500 mL of physiological saline was poured using a peristaltic pump to wash the column. Thereafter, a perfusion removal test was performed using a bilirubin solution not bound to albumin and unconjugated to glucuronic acid. The bilirubin used was a bilirubin that was not conjugated with glucuronic acid, and the method for preparing a bilirubin solution that was not bound to albumin and that was not conjugated to glucuronic acid was as shown in Example 1. The temperature and time conditions during perfusion were 37 ° C. and 5 hours, and the sampling time was before the start of perfusion, 1 hour, 2 hours, 3 hours, 4 hours and 5 hours after the start of perfusion. The sampled solution was separated with an ultrafiltration membrane having a molecular weight of 50,000, and divided into an albumin-unbound and glucuronic acid-unconjugated bilirubin solution and an albumin-bound and glucuronic acid-unconjugated bilirubin solution, and the adsorption rate was calculated.
ビリルビン濃度の測定については、富士ドライケム(富士写真フィルム(株)製)を使用して総ビリルビン濃度を測定した。その結果を表6および7に示す。 For the measurement of the bilirubin concentration, the total bilirubin concentration was measured using Fuji Dry Chem (Fuji Photo Film Co., Ltd.). The results are shown in Tables 6 and 7.
以上の結果より、尿素結合を有するUAMP繊維を血液浄化用カラムに充填し灌流することで、アルブミン非結合かつグルクロン酸非抱合ビリルビンを高率に吸着除去可能であることが示された。 From the above results, it was shown that albumin-unbound and glucuronic acid-unconjugated bilirubin can be adsorbed and removed at a high rate by filling a blood purification column with UAMP fiber having urea bond and perfusing.
<比較例1>
in vitroアルブミン非結合かつグルクロン酸非抱合のビリルビン除去試験(3)を行った。
65重量比の海成分(ポリスチレン)と35重量比の島成分(ポリプロピレン)とからなる海島型複合繊維(強度:1.0g/d、伸度:47.7%、太さ:132デニール、島の数:16)でアルブミン非結合かつグルクロン酸非抱合のビリルビン除去試験を行った。ビリルビンはグルクロン酸非抱合のビリルビンを用いた。なお、ヒト体液中ではアルブミンが存在しているため、4%ヒト血清アルブミン溶液でビリルビンを溶解した。試験の方法は、実施例1の方法と同様とした。その結果を表5に示す。
以上の結果より、ポリスチレン及びポリプロピレンの海島型複合繊維にアミドメチル化、TEPA化を経て尿素結合を導入したUAMP繊維はアルブミン非結合かつグルクロン酸非抱合ビリルビンを高率に吸着除去することが示された。
<Comparative Example 1>
An in vitro albumin non-binding and glucuronic acid non-conjugated bilirubin removal test (3) was performed.
Sea-island type composite fiber (strength: 1.0 g / d, elongation: 47.7%, thickness: 132 denier, island) consisting of 65 parts by weight sea component (polystyrene) and 35 parts by weight island component (polypropylene) 16), an albumin non-binding and glucuronic acid non-conjugated bilirubin removal test was conducted. As the bilirubin, bilirubin unconjugated with glucuronic acid was used. Since albumin is present in human body fluids, bilirubin was dissolved with a 4% human serum albumin solution. The test method was the same as that of Example 1. The results are shown in Table 5.
From the above results, it was shown that UAMP fibers in which urea bonds were introduced via polystyrene and polypropylene sea-island type composite fibers via amidomethylation and TEPA formation were able to adsorb and remove albumin-unbound and glucuronide-unconjugated bilirubin at a high rate. .
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