JP2006214880A - 平板型セル - Google Patents

Abstract

【課題】少量の細胞で分析が可能で、かつ平板型の基板上で基板に固定した抗体等の有機物質との相互作用によって結合した細胞の移動や剥離等が起きず、生細胞の表面抗原を迅速、簡便かつ再現性よくパラレルに分析することを可能とする平板型セルを提供する。
【解決手段】細胞と結合する有機物質が固定された基板と、前記基板の上部にスペーサーを介在して隔置されたプレートを備える平板型セルであって、有機物質が抗体、または細胞と結合する物資である。
【選択図】なし

Description

本発明は、細胞と基板に固定された例えば抗体等の有機物質との相互作用に関するパラメータを精確かつリアルタイムに測定するための平板型セルに関する。

生命科学は分子レベルの情報を得るための多くの分析手法や装置に支えられながら大きな発展を遂げてきた。他方、ノックアウト動物作製技術、また、ＭＲＩ（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ；磁気共鳴映像法）のような画像化装置が、生命現象の個体レベルでの理解に大きく貢献してきた。それらの中間の階層に位置し、複雑な生命システムの最小単位である細胞を対象とした分析手法は、その発展が大きく立ち遅れているといっても過言ではない。とくに再生医学や創薬の分野では、細胞レベルでの機能評価が研究開発の鍵を握るため問題は深刻である。一方、ヒトゲノム解読の完了に伴って、生命科学に関連する多くの分野では、膨大な数の試料やデータを如何に効果的に取り扱うかが研究開発の成功を大きく左右するようになってきた。

細胞表面に発現する膜抗原はタンパク質や糖タンパク質からなり、細胞の種類や分化の程度に応じてその発現プロファイルが変化する。膜抗原に関する情報は、細胞の同定にとって重要であり、細胞生物学、細胞工学、臨床検査等の幅広い分野において分析の対象とされる。このような状況の下、本発明者らは、膜抗原に対する多種類の抗体を２次元ディスプレイした基板（抗体アレイ）を作製し、その表面で生細胞の結合試験を行うことで、表面抗原を迅速かつ簡便にパラレル分析する方法を提案した。この方法は、抗体アレイで抗原−抗体反応を生起させ、試料に含まれる複数の抗原を同時に検出する点においては、従来の抗体アレイと同様の分析原理に基づくが、検出する抗原が生細胞膜上に存在することを特徴としている。この方法は、細胞そのものを検体とするため、両親媒性の膜抗原をその高次構造を損なうことなく取扱うことが可能であり、よって、それらの膜抗原を抗体アレイによってパラレルに分析することが可能となった（非特許文献１）。この方法に関連して、本発明者らは、基板（例えば、マイクロアレイ）に表面抗原に対する抗体を固定し、基板上での抗体と細胞との反応を観察することによって細胞の表面抗原を簡便に分析でき、かつ基板上で抗体に結合した細胞の状態に関連する複数のマーカーを検出し、そのマーカーと抗体とを相関付けることによって細胞の複数の情報を精確に把握することができる分析方法を提供した（特許文献１、特許文献２）。
上記方法は、細胞培養用シャーレ内等に設置した基板（例えば、抗体アレイ）に細胞浮遊液を滴下して細胞培養を行い、顕微鏡観察等を通じて例えば抗体アレイに固定された抗体と細胞の相互作用に関する情報を得ていた。しかし、このような試験方法では、多量の細胞分散液を必要とする上に、培養液の動揺に基づくせん断力によって、細胞の移動・剥離等が起きるため、相互作用に関する正確なデータの取得が難しく、また、その再現性に問題があった。さらに、これらの問題は、様々な顕微鏡を用いてリアルタイム分析を行いたい場合にとくに大きな問題となる。
特開２００４−２７１３３６号公報 特開２００４−２７１３３７号公報 コ・アイ・ケー（Ｋｏ，Ｉ．−Ｋ．）、カトウ・ケー（Ｋａｔｏ，Ｋ．）、イワタ・エイチ（Ｉｗａｔａ，Ｈ．）、バイオマテリアルス（Biomaterialｓ）、２００５年，第２６巻，ｐ．６８７−９６

本発明の課題は、少量の細胞分散液で分析が可能で、かつ平板型の基板上で基板に固定した抗体等の有機物質と結合した細胞の移動や剥離等が起こり難く、生細胞の表面抗原等を迅速、簡便、かつ再現性よくパラレルに分析することを可能とする、平板型セルを提供することである。

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究をおこなった。まず抗体等の有機物質を固定した基板にスペーサーを介在して微小な間隔を設けて隔置したプレートからなる平板型セルを作製した。前記平板型セルのスペーサーにより生じた基板とプレートとの間の微小な空隙に細胞分散液を注入し、平板型セルを水平に静置して基板上の抗体と細胞を反応させた。反応後、細胞の観察を行ったところ、平板型セル上で結合した細胞の移動や剥離等が無視できる程度であり、様々な顕微鏡を用いたリアルタイム観察を実施でき、上述の問題を解決できることを発見した。本発明者らは、さらに研究を進め、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、
（１） 細胞と結合する有機物質が固定された基板と、前記基板の上部にスペーサーを介在して隔置されたプレートを備えることを特徴とする平板型セル、
（２） 有機物質が抗体であることを特徴とする前記（１）に記載の平板型セル、
（３） 有機物質が細胞と結合する物質であることを特徴とする前記（１）に記載の平板型セル、
（４） 基板とプレートの間隔が２０μｍ〜１ｍｍであることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれかに記載の平板型セル、
（５） 固定された有機物質が２種以上であることを特徴とする前記（１）に記載の平板型セル、
（６） 基板とスペーサーを介在して隔置されたプレートとの間に、細胞の分散液が注入され、細胞が基板上の抗体と接触する前記（１）〜（５）のいずれかに記載の平板型セル、
（７）前記（６）記載の平板型セルの有機物質の固定された基板と結合した細胞を観察することを特徴とする細胞分析方法、
（８） 有機物質の固定された基板と結合した細胞の数を計数し、基板に固定された有機物質と結合する細胞の分散液中の細胞含有率に関する情報を得ることを特徴とする前項（７）に記載の分析方法、
（９） 観察が、表面プラズモン共鳴イメージング装置、共焦点レーザースキャン顕微鏡、蛍光顕微鏡及び光学顕微鏡から選択される少なくとも１種の装置を用いることを特徴とする前記（７）に記載の細胞分析方法、
（１０） 観察に先立ち平板型セルの上下を逆転させることを特徴とする前記（７）記載の細胞分析方法、
（１１） 観察が、目視によることを特徴とする前記（７）に記載の細胞分析方法、
（１２） 観察が、表面プラズモン共鳴イメージングによる結合細胞数又は結合細胞の形態であることを特徴とする前記（８）に記載の方法、
（１３） 観察が、共焦点レーザースキャン顕微鏡による３次元画像又は細胞横断面像の細胞形態であることを特徴とする前記（８）に記載の方法、及び
（１４） 以下の（Ａ）〜（Ｄ）の工程を有する平板型セルの製造方法；
（Ａ）アルカンチオール、シランカップリング剤又はＤｉｔｈｉｏｂｉｓ（Ｃ_２−ＮＴＡ）を基板表面と反応させて自己組織化単分子膜を有する基板を作製する工程；
（Ｂ）前記（Ａ）の基板の自己組織化単分子膜の表面を反応性官能基に変換する工程；
（Ｃ）反応性官能基をもつ自己組織化単分子膜に有機物質を接触させ、基板に有機物質を、パターニングして固定する工程；及び
（Ｄ） 前記（Ｃ）の基板の上部にスペーサーを介在してプレートを隔置する工程、
に関する。

本発明の平板型セルによると、例えば各種の抗体と細胞との結合等を、生細胞を用いて、しかもパラレルに計測することができる。
また、本発明の平板型セルによると、多種類の細胞について、例えば特定の抗体と細胞との結合等を定量的に求めることができる。
本発明の平板型セルによると、２枚の平板（基板とプレート）に仕切られた空隙に細胞分散液を注入して、平板を水平に静置することで、媒体の流動を大幅になくすことができる。したがって、媒体の移動に伴う媒体中に分散する細胞の移動を抑制することができ、基板上の抗体等の有機物質と結合または結合した細胞の様々な機能の観察にきわめて安定でかつ適した環境を提供できる。
本発明の平板型セルによると、基板とプレートの間に注入される細胞分散液は基板とプレートとの間の空隙部が満たされる量があれば充分であるので、細胞分散液の液量は、従来の方法に比較してきわめて少量で実施できる。

本発明は、細胞と結合する有機物質が固定された基板と、前記基板の上部にスペーサーを介在して隔置されたプレートを備えることを特徴とする平板型セルに関する。

本明細書において「基板」とは、抗体や細胞接着因子のようなタンパク質、ペプチド又は合成有機物質等の有機物質が固定され得る平面状の支持体をいう。
基板材料としては、平滑な表面をもつよう成型され得る固体材料であればいずれでもよく、例えば、ガラス、石英、シリカ、シリコーン、セラミック、サファイア、フォルステライト、二酸化珪素、平滑な表面をもつプラスチック〔例、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアクリロニトリル、ポリカーボネート、ポリ酢酸ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニルブチラート、ポリメタクリル酸メチル、ポリエチレンオキシド、ポリフェニレンオキシド、ポリエチレンテレフタレート又はこれらの組合せ等が挙げられるがそれらに限定されない。また、基板は前記材料の異なる材料からなる平面状のものが２枚以上積層された構造を有していてもよい。
基板は、使用される細胞の種類、細胞の機能の測定方法又は観察手段等にもよるが、透明性を有するものが好ましい。

本明細書において使用される「プレート」とは、好ましくは透明性を有する平面状の板状体をいう。プレートの材料としては、前記した基板の材料と同様のものが挙げられる。

本明細書において、アレイ又はチップ（以下、単にアレイという。）とは、１以上の抗体等の有機物質が整列されて配置されたパターンを有する基板をいう。アレイのうち特に抗体が固定されたアレイを「抗体アレイ」という。

本発明の平板型セルは、まず、基板を用いてアレイを作製する。アレイの作製には、マイクロコンタクトプリンティング法、光リソグラフィー法、蒸着重合法等の公知の方法を用いることができるが、自己組織化単分子膜（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；ＳＡＭ）を用いる方法が好ましい。ＳＡＭを用いる場合、まず、基板の片面に金等の金属薄膜を蒸着し、金属とメチル基、フルオロメチル基のような疎水性官能基をもつアルカンチオール〔例、１−ヘキサデシルメルカプタン、ＨＳ（ＣＨ₂ ）₅ ＣＨ₃ （Ｐｅｎｔａｎｔｈｉｏｌ）、ＨＳ（ＣＦ₂ ）₇ （ＣＨ₂ ）₂ ＣＦ₃ （１，１，１，４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，９，９，１０，１０−ｈｅｐｔａｄｅｃａｆｌｕｏｒｏｄｅｃａｎｔｈｉｏｌ）等〕を反応させ、配向性の高い単分子膜〔例えば最表面にメチル基を有するＳＡＭ（以下、ＣＨ_３−ＳＭＡと略記する。）など〕を形成させる。前記金属としては金のほか、例えば白金、銀、銅、アルミニウム等が挙げられる。
このＳＡＭ、例えばＣＨ_３−ＳＡＭに、直径数μｍから約１ｍｍ程度の多数の光透過性スポットを配列させたフォトマスクを重ね、紫外線を照射し、光パターニングを行なう。これによって、照射部のアルカンチオールをスポット状に分解除去することができる。次に、露出したスポット内にカルボキシル基、アミノ基又はヒドロキシル基等の反応性官能基をもつアルカンチオール〔例、ＨＳ（ＣＨ_２）_１０ＣＯＯＨ（１０−Ｃａｒｂｏｘｙ−１−ｄｅｃａｎｅｔｈｉｏｌ）、ＨＳ（ＣＨ_２）_８ＮＨ_２（８−Ａｍｉｎｏ−１−ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ）、ＨＳ（ＣＨ_２）_８ＯＨ（８−ｈｙｄｒｏｘｙ−１−ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ）、１１−メルカプトウンデカン酸等〕のＳＡＭ〔例えば最表面にカルボキシル基を有するＳＡＭ（以下、ＣＯＯＨ−ＳＭＡと略記する。）など〕を形成させる。

次いで、反応官能基をもつＳＡＭ、例えばＣＯＯＨ−ＳＡＭに抗体等の有機物質を固定する。有機物質の固定は、ＳＡＭの反応性官能基、例えばカルボキシル基を、例えばＮ，Ｎ’−ジシジクロヘキシルカルボジイミド及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド等を用いて活性エステル（ＮＨＳエステル）に変換した後、例えば、微量（約１０〜５００ｎＬ、好ましくは約５０〜２００ｎＬ）の有機物質（例えば抗体等）含有溶液を各スポットに接触、例えば滴下等することにより行なうことができる。これはＮＨＳエステルと抗体等の有機物質のアミノ基とが反応し、安定なアミド結合を形成することを利用したものである。このようなアレイとして、例えば抗体アレイの作製スキームを図２に示した。

ＳＡＭ表面への抗体等の有機物質の固定化は、高感度反射赤外分光分析法により確認できる。例えば図２における抗体の代わりにγ−グロブリンを用いてもよく、図３にγ−グロブリンを固定した基板のスペクトルを示す。γ−グロブリンを固定した基板上ではアミドＩ（１６００−１７００ｃｍ^−１）およびアミドＩＩ（１５００−１６００ｃｍ^−１）の吸収がみられる（図３ａ）。また、これらの吸収は、試料を界面活性剤（０．３％ドデシル硫酸ナトリウム）で洗浄した後にもみられる（図３ｂ）ことから、γ−グロブリンがＳＡＭに共有結合で固定されていることを示唆する。

抗体等の有機物質が固定されていない領域のＳＡＭは、細胞との非特異的な結合を抑えるため、ウシ血清アルブミンのような不活性タンパク質又はプルロニック（登録商標；ＢＡＳＦ Ｊａｐａｎ Ｌｔｄ．）のようなポリエチレングリコール含有高分子でブロッキングを行うことが好ましい（図２参照）。

ＳＡＭとしては、上記アルカンチオールのＳＡＭの外、例えばシランカップリング剤を用いた有機シランＳＡＭ（Ｏｒｇａｎｏｓｉｌａｎｅ ＳＡＭ）やＮＴＡ（Ｎ−５−ａｍｉｎｏ−１−ｃａｒｂｏｘｙｐｅｎｔｙｌ）ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）末端を持つジスルフィドＳＡＭ等も好ましく用いることができる。
シランカップリング剤としては、例えば３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−β−（アミノ）−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン、シラン オクタデシルジメチル（３−（トリメトキシシリル）プロピル）アンモニウムクロライド、カルボメトキシエチル−トリクロロシラン、長鎖フルオロアルキルシラン、３−クロロプロピルトリメトキシシラン又は３−メルカプトプロピルトリメキシシラン等が挙げられる。シランカップリング剤を用いて基板表面に作製されるＳＡＭのエステル基は、例えば塩酸等で加水分解することにより、例えばカルボキシル基等の反応性官能基に変換できる。
ＮＴＡ末端を持つジスルフィドとしては、Ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（Ｃ_２−ＮＴＡ）等が挙げられる。
ＮＴＡ末端を持つジスルフィドの場合、抗体等の有機物質の固定はＨｉｓ−ｔａｇ技術等を用いることにより実施できる。

有機物質としては、細胞と結合する物質、すなわち細胞表面の膜成分（例えば抗原、受容体、酵素、イオンチャンネル、脂質等）などと例えば特異的に結合等し、細胞の膜成分等と相互に作用する物質、例えば各種抗体、基質タンパク質、受容体結合タンパク質、細胞内のシグナル伝達に関与するタンパク質、細胞接着因子又はそれらの一部（例えばドメイン等）などのタンパク質、ペプチド、アミノ酸、糖、糖タンパク質、脂質、又は有機化合物、抗原等が挙げられる。具体的には、例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ７１、ＣＤ９９等の多種類の白血球表面抗原（ＣＤ抗原；ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＨＬＡ−ＤＲ（ｈｕｍａｎ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）等に対するモノクローナル抗体；例えばｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ（ＩｇＧ）、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ等の各種免疫グロブリン；例えばコラーゲンやエラスチン等の構造タンパク質；例えばフィブロネクチン等の細胞接着性糖タンパク質；グリコサミノグリカン等の複合糖質；例えば繊維芽細胞増殖因子、上皮細胞増殖因子等の細胞増殖因子；例えばＲＧＤＳ、ＩＫＶＡＶ等の細胞接着性ペプチド等が挙げられる。これら有機物質は、分析する細胞の性質、機能等から適宜選択することが好ましい。

上記「結合」とは、例えば抗原と抗体や、受容体と受容体タンパク質等が結びついて一つになること等のように、細胞と基板に固定された有機物質とが相互に結びつくことをいう。結合には、共有結合、水素結合、配位結合等の外、細胞接着因子と細胞が接触し、離れなくなる接着等も含まれる。

有機物質は一般的には生物材料由来のものであり、組織や細胞から抽出されるが、簡便には血清中のタンパク質を用いることもできる。また、特定の遺伝子に由来するタンパク質を組換えＤＮＡ技術を用いて宿主細胞で合成したものや化学合成したものを用いることができる。
有機物質試料は、固体でも液体でも良いが一般的には液体、特に水溶液の状態が好ましい。固体状のタンパク質は、タンパク質の種類に応じて知られている適当な溶媒に溶かして液状にすることができる。

本発明において「スペーサー」とは、基板とプレートの間に空隙を設けるためのものをいう。スペーサーの材質は、プレートと基板を一定の空隙を設けて固定でき、かつ細胞に影響を与えないものであれば特に制限はないが、それ自体が接着性を有し、スペーサーの接着面を介して基板及びプレートを固定できるものが好ましい。また、基板及びスペーサー部あるいはプレートとスペーサー部とが一体的に成形されていてもよい。

スペーサーとしては、例えばポリエステルフィルム、ポリプロピレンフィルム、ポリイミドフィルム、ガラス又は金属箔（例、アルミ箔等）などを支持体とする接着剤が両面についた両面テープ等が好ましく挙げられる。
スペーサーの厚さは、細胞の分散液が均一に基板とプレート間に拡散できる空隙ができる程度であればよく、通常約２０μｍ〜１ｍｍ、好ましく約３０〜５００μｍ、より好ましく約６０〜２４０μｍ程度である。スペーサーの厚さが約２０μｍ未満であると、細胞が基板とプレートの間の空隙部に入ることができない。また、間隔が大きすぎると細胞の分散液が基板とプレートの間の空隙部に均一に拡散できなかったり、細胞の動揺を招く恐れがある。
スペーサーの幅は、基板およびプレートの大きさにより異なるが、通常約０．５〜５ｍｍ、好ましくは約０．５〜３ｍｍ程度から適宜選択される。
またスペーサーとして両面テープを用いる場合、両面テープを２枚以上重ねて前記厚さとすることもできる。
スペーサーは、抗体などの有機物質が固定化されたＳＡＭの外部に、少なくとも平行する二辺に設けられ得る。また、他の平行する二辺には、スペーサーが設置されていないか、少なくとも一箇所に開口部を設けてスペーサーが設置される。開口部を設けることにより、一方の開口部は基板とプレートの間の空隙部へ細胞の分散液を注入する注入口となり得るし、他方の開口部は、前記細胞分散液が注入される際の基板とプレートの間の空隙部に存在する空気の排出口となり得る。このように、基板にスペーサーを設置することにより、基板とプレートの間の空隙に注入された細胞分散液の蒸発を防ぐことができる。

本発明の平板型セルは、例えば図１で示される。なお、図１は、本発明を理解するための例示であり、かつ概略図であり、本発明の平板型セルが本図に限定されるものではない。

本発明の平板型セルの使用態様につき説明する。
本発明の平板型セルは、例えば細胞表面に存在する抗原、受容体、酵素、イオンチャンネル又は脂質等の存在の有無や細胞の機能等を測定するために利用できる。
本発明において、細胞の分散液が、基板とスペーサーを介在して隔置されたプレートとの間の空隙部に注入される。図１では、スペーサーの開口部（図１の符号４）から細胞の分散液が注入される。注入された細胞分散液中の細胞は、平板型セルの基板に固定された有機物質と接触し、有機物質と結合し得る細胞は有機物質と結合する。有機物質と結合した細胞は、例えば光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、共焦点レーザー顕微鏡、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）イメージング装置又は目視等により細胞の形態等、種々の細胞のパラメータを観察できる。基板に固定された有機物質と結合しなかった細胞は、平板型セルの上下を逆転させることにより、プレート側に移動（落下）させることができるので、有機物質と結合した細胞数を容易に計測できる。
また、吸引又は／及び洗浄液（例えば培養液、緩衝液等）を注入、排出することによって、有機物質の固定された基板に結合しなかった細胞を除去、洗浄して、基板に結合した細胞数を計測したり、細胞の形態又はその他の種々の細胞のパラメータを観察してもよい。

本発明に用いられる好ましい細胞としては、哺乳動物（たとえば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト、マウス、ラット、イヌ等）由来の細胞、特にヒト由来の細胞が挙げられる。ヒト由来の細胞としては、例えばＴリンパ球、Ｂリンパ球、抹消血単核球、単球、顆粒球、ＮＫ細胞、血管内皮細胞、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（Ｔ細胞系急性リンパ腫細胞）、Ｒａｍｏｓ（バーキットリンパ腫）、Ｋ５６２（白血病細胞株）、Ｄａｕｄｉ（ヒトＢ細胞株）、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ（乳癌細胞）、ＨＬ−６０（ヒト前骨髄性白血病細胞）、ＤＵ５５３５、Ｊｕｒｋａｔ（ヒト急性白血病細胞株）、肝ガン細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｔ３Ｔ等が挙げられる。

本発明に用いられる細胞は、上記した哺乳動物由来の細胞に限定されず、他の生物由来の細胞［たとえば、任意の種類の単細胞生物（例えば、細菌、酵母）又は多細胞生物｛例えば、動物（たとえば、脊椎動物、無脊椎動物）、植物（たとえば、単子葉植物、双子葉植物等）等｝］でもよい。例えば、脊椎動物（たとえば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類等）由来の細胞が用いられ得る。

本発明の平板型セルにおける細胞分散液の注入量は、基板とスペーサーを介在して隔置されたプレートとの間の空隙部の容積との関係で決められ得るが、通常約５０〜２００μＬである。

本明細書において、細胞のパラメータとは、基板に固定された有機物質と細胞との相互作用又は生物学的相互作用によりもたらされる種々の要素をいう。そのようなパラメータとしては、例えば、細胞の大きさ、個数、密度、形状（球状、扁平、スピンドル等）、内部状態（分化状態等）、細胞表面の状態（マーカーの発現等）、細胞の接着面積、ＳＡＭに固定された有機物質と受容体との結合とその後の形状の変化、細胞接着因子を介した細胞の結合とその後の伸展、生体分子の作用に基づく細胞の増殖、分化又は細胞死等が挙げられるがそれらに限定されない。

光学顕微鏡とは、２枚以上のレンズの組み合わせで対象を拡大して観察する装置をいう。
光学顕微鏡により、主に細胞の大きさ、形態、密度等を観察できる。
光学顕微鏡には、全反射顕微鏡、位相差顕微鏡、干渉顕微鏡、偏光顕微鏡等も含まれる。

蛍光顕微鏡とは、顕微鏡下に置いて試料（細胞）に励起光を入射し、フィルター等により励起光を除き試料の発する蛍光を視野に収めるように工夫された装置をいう。例えばＳＡＭに固定した抗体と結合する蛍光標識細胞を蛍光顕微鏡下に検出できる。細胞を蛍光標識する色素としては、例えばフルオレセインイソチオシアネートやテトラメチルローダミンイソチオシアネート等が挙げられる。蛍光顕微鏡には、全反射蛍光顕微鏡等も含まれる。

共焦点レーザースキャン顕微鏡とは、レーザー光を対物レンズに通して試料（細胞）上の焦点に当てて蛍光を発生させ、焦点前後で生じた蛍光フレアをピンホールの作用で除き、焦点での発光だけをフォトマルで検出する装置をいう。共焦点レーザースキャン顕微鏡によると、試料（細胞）にレーザーを走査して試料（細胞）の微細構造の分かる蛍光画像を得ることができる。
共焦点レーザー顕微鏡としては、例えばオリンパス社製ＦＶ５００等が挙げられる。顕微鏡の観察ステージに平板型セルを設置し、セル内に細胞分散液を導入する。室温で約３０分間静置することで細胞を基板に結合させた後、共焦点レーザースキャン顕微鏡観察を行うのが好ましい。観察面をＺ軸方向にずらせながら複数の画像を撮像し、ソフトウエア（ＦＬＵＯＲＯＶＩＥＷ、オリンパス）を用いて３次元構築像を得るのが好ましい。
共焦点レーザースキャン顕微鏡により、主にＺ軸方向の解像度に優れた蛍光画像を取得でき、また３次元像或いは細胞の横断面像等を観察できる。

ＳＰＲイメージング装置は、光透過性媒体上に設けられた金属薄膜における光の全反射条件で生じる微小な屈折率変化を観測する装置である。その測定原理は例えば特開２００４−２７１３３６号広報（特許文献１）に詳細に記載されている。
ＳＰＲイメージング装置のプリズムに平板型セルを設置する。平板型セルに例えばリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を約４０μＬ注入して平衡化した後、流路の一方からＰＢＳを吸引しながら、他方から細胞分散液を注入するのが好ましい。これにより、細胞がアレイの全面に均一に導入される。
ＳＰＲイメージング装置により、例えば、細胞の形状等の二次的情報などが反射光強度から推定することができる。例えば、細胞の結合数あるいは形態（細胞の伸展、扁平化等）などの情報等が反射光強度から読み取ることができる。具体的には、例えば、細胞表面抗原に対する抗体等を基板の表面に固定したスポット上に細胞を結合させ、経時的にＳＰＲ反射光強度を計測する方法等が挙げられる。細胞の結合が進行するにつれて、細胞が伸展したり、扁平化したり、突起を伸ばすが、それによって個々の細胞の基板表面への接触面積が増大するため、細胞の伸展、扁平化、突起の延長等がＳＰＲ反射光強度の上昇として検出される。これによって、細胞結合過程の詳細なリアルタイム分析を行うことが可能となる。また、ＳＰＲイメージング装置により、細胞の剥離等を観察することもできる。

以下に本発明の実施例等について具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

（１）細胞
細胞として、（財）ヒューマンサイエンス財団より分譲を受けた造血器腫瘍細胞株であるＣＣＲＦ−ＣＥＭ（Ｔ細胞系急性リンパ腫）及びＨＬ−６０（骨髄芽球系白血病細胞）を用いた。

（２）抗体アレイの作製
片面に金薄膜（膜厚：４４ｎｍ）を蒸着したガラス基板（ＳＬＡＬ−１０）に、末端にメチル基をもつアルカンチオール［１−ヘキサデシルメルカプタン；東京化成工業（株）］の単分子膜を形成させた。この単分子膜に、直径２ｍｍのスポットを４×４のマトリックス状に配置したフォトマスクを重ね、紫外線を照射した。これにより、照射部のアルカンチオールをスポット状に分解除去した。次に、露出した金スポット内にカルボキシル基をもつアルカンチオール（１１−メルカプトウンデカン酸；Ｓｉｇｍａ）の単分子膜を形成させた。スポット表面のカルボキシルをＮ，Ｎ’−ジシジクロヘキシルカルボジイミド及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドを用いて活性エステルに変換した後、約１．５μＬの抗ヒトＣＤ５モノクローナル抗体溶液（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ， Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ， Ｆｒａｎｃｅ）及び非特異的ＩｇＧ（陰性コントロール；ニチレイ）溶液を各スポットに滴下することで、それらを独立のスポット上に固定化した。スポット周囲のバックグラウンド領域への細胞結合を抑えるため、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）によるブロッキングを行った。

（３）平板型セルの作製
上記（１）で作製した抗体アレイの外側に幅１ｍｍ、厚さ１２０μｍの両面テープ（ニチバン株式会社製）を貼付し、その両面テープの上にカバーガラス（１８ｍｍ×１８ｍｍ；松浪ガラス）を装着し、図１に示す平板型セルを作製した。

（４）観察と結果
上記（３）で作製した平板型セルを、自作のＳＰＲイメージング装置の三角プリズムに設置した。次に、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）（１０％血清及び抗生物質を含む）に分散させたＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞分散液（５×１０^６個／ｍＬ）の約５０μＬを平板型セルに注入し、細胞をアレイ全面に均一に導入した。抗体を固定したスポット以外の領域（バックグラウンド領域）の反射光強度が７０，０００となるように光の入射角及び反射光を受光するＣＣＤカメラの角度を調整した。その後、３０分間に亘って、各スポットからの反射光強度をパラレルに計測した。その結果を図４に示した。抗ＣＤ５抗体を固定したスポットにおいて反射光強度が時間とともに増大し、約１０分で反射光強度はほぼプラトーに達し、その後ほぼ一定した。一方、非特異的なＩｇＧを固定した２つのスポットでは、反射光強度の上昇は認められなかった（図４ａ）。これらの結果は、平板型セルを用いることで、細胞結合過程を、洗浄操作を経ることなく、リアルタイムに観測できることを示している。図４ｂは、細胞注入から０、１０、２０、３０分後のＳＰＲ像を示す。抗ＣＤ５抗体を固定したスポットにおいて細胞注入時には、いずれのスポット像も認められなかったが、細胞注入１０分後では、反射光強度が増大し、明確な２つの抗ＣＤ５抗体スポット像が認められた。しかし、２つのＩｇＧスポット像は認められなかった（図４ｂ）。図４ｃは、細胞注入から３０分後の倒立型位相差顕微鏡像を示す。倒立型位相差顕微鏡像では、非結合細胞存在下においては、非結合細胞と結合細胞とを区別することができないことが分かった（図４ｃ左）。図４ｃ右は非結合細胞を洗浄した後の倒立型位相差顕微鏡像を示す。

実施例１と同様にして平板型セルを作製し、ＳＰＲイメージング装置の三角プリズムに設置した。
ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞を、ＰＫＨ２６ Ｒｅｄ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）を用いて蛍光色素で標識した。この細胞を５×１０^６個／ｍＬとなるようＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）（１０％血清及び抗生物質を含む）に分散させた。前記細胞分散液を平板型セルに約５０μＬ注入し、スポットに固定した抗体に細胞を結合させた。次いで、平板型セルを裏返して抗体アレイに結合している細胞を観察した（以下、この観察方法を転倒法という。）。転倒法による抗体アレイの円形のスポットの抗体に結合した細胞に焦点を合わせた蛍光顕微鏡像を図５に示す。抗体に結合した細胞は、平板型セルを転倒させても基板表面に留まる一方、結合しなかった細胞はプレートの底（もとの上面；カバーガラス側）に落下した。抗体に結合した細胞に焦点を合わせて観察すると、落下した細胞は焦点面からはずれるため、結合細胞（図５ａ）と非結合細胞（図５ｂ）を容易に区別することができた。すなわち、洗浄の操作を経ることなく、抗体アレイ上に結合した細胞を判別でき、洗浄に伴うアーチファクトを回避することが可能であった。
抗体アレイ上へのＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞の結合試験に関して、平板型セルへ細胞を注入した３０分後のスポットのＳＰＲ反射光強度と、上記の転倒法によって求められた細胞結合数との関係を図６に示す。図６から、両者間には高い相関のあることがわかる。本結果は、ＳＰＲイメージング装置により求められる反射光強度が、結合細胞数と直接関係付けられることを示している。

実施例１と同様の方法を用いて、各種のヒト白血球表面抗原（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ７１、ＨＬＡ−ＤＲ）に対する抗体及び非特異的ＩｇＧを固定したアレイを作製し、実施例１（３）と同様に両面テープ及びカバーガラスを装着して平板型セルとした。表面抗原プロファイルの異なる２種類の細胞（ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＨＬ−６０）をそれぞれ５×１０^６個／ｍＬとなるようＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）（１０％血清及び抗生物質を含む）に分散させた溶液をそれぞれ独立に注入した。細胞注入３０分後のスポットのＳＰＲ反射光強度を計測した（図７）。

また、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞（赤色蛍光色素で標識）とＨＬ−６０細胞（緑色蛍光色素で標識）を様々な割合で混合した細胞分散液を用いて同様に測定した。細胞分散液注入３０分後の抗体アレイのスポット部のＳＰＲ反射光強度（スポット周囲の反射光強度との差）と細胞分散液中のＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞の割合、及び転倒法により計数した結合細胞数と細胞分散液中のＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞の割合を図８に示した。ＳＰＲ反射光強度と細胞数との間には相関関係があることがわかった。このことから、本手法は特定抗体に対する抗原の陽性細胞率を定量的に求める手法としても有用である。

さらに、平板型セルの基板とプレートの間にリン酸緩衝液を注入し、抗体アレイに結合しなかった細胞を除去することで、目視によって細胞結合の程度を以下に基づきスコアリングし評価した。その結果を表１に示した。
スコアリング：
−：細胞の結合が認められない。
＋：中等度の細胞の結合（結合細胞数：約１０００個／ｍｍ^２未満）。
＋＋：細胞結合の程度が高い（結合細胞数：約１０００個／ｍｍ^２以上）。

シランカップリング剤であるカルボメトキシエチル−トリクロロシラン（アズマックス）の０．５ｍＭトルエン溶液に、ガラス基板を浸漬し、シランカップリング剤とガラス表面とを４℃で１時間反応させ、基板表面にエステル基を導入した。このプレートを１Ｍ塩酸溶液に浸漬し、７０℃で３時間加水分解反応を行った。これにより、基板表面のエステルをカルボン酸に変換した。生成したカルボキシル基を、Ｎ，Ｎ’−ジシジクロヘキシルカルボジイミド（ナカライテスク）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ナカライテスク）を用いて活性エステルに変換した。この表面に、抗体溶液を滴下して反応させることで、抗体分子を共有結合で固定した。この基板に実施例１と同様にスペーサーとカバーガラスを装着し、平板型セルを作製した。本実施例では、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ及びＨＬ−６０細胞の片方（ＣＤ５、ＣＤ１３、ＣＤ３３）あるいは両方（ＣＤ４、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ７１）に発現する抗原、また、両方ともに発現しない抗原（ＣＤ１４、ＨＬＡ−ＤＲ）に対する抗体を固定したアレイを作製し、試験に供した。試験に先立ち、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞及びＨＬ−６０細胞を、それぞれ、ＰＫＨ２６ Ｒｅｄ及びＰＫＨ２６ Ｇｒｅｅｎ（Ｓｉｇｍａ社製）を用いて蛍光標識した。抗体を固定したアレイと細胞との結合を、共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ５００、オリンパス）を用いて観察した。その際、焦点面を１．３μｍずつＺ軸方向にずらしながら撮像し、それらの画像データを３次元構築することで、細胞の形態を横方向から評価した（図９）。また、このような観察の結果、抗体と結合した細胞においては、細胞の偏平化の起こることがわかった。

本発明の平板型セルは、細胞と基材表面との相互作用に関するパラメータを精確かつリアルタイムに測定するために役立つ分析支援装置であり、幅広い産業上の利用の可能性があるものと考える。その一つは、抗体アレイを用いた細胞表面マーカーの迅速プロファイリングである。細胞表面に発現する膜抗原は、細胞の分化に応じてその発現プロファイルが変化するため、その分析は再生医療における幹細胞の分離、同定、分析、加工にとって重要である。従来、膜抗原の分析にはフローサイトメトリー（ＦＣＭ）が多用されてきたが、同時に分析できる抗原の種類は限られていた。発明者らは以前から、抗体アレイを用いた新たな分析手法を提案し、多種類の膜抗原のパラレル分析が可能であることを報告してきたが、平板型セルを組み合わせることで、それらの分析の操作性、再現性、データーの信頼性を向上させ、さらには、実時間分析も可能となる。
上記の例に限らず、細胞−基材間相互作用の分析は、バイオマテリアルに関する研究分野で重要な対象である。また、基質表面に固相化されたリガンドと細胞表面レセプターとの生物学的相互作用の分析は、様々な生物学的現象を理解する上で基礎的な問題であり、病気の診断（例えば白血病タイピング等）、細胞の品質管理（再生医療における細胞分化の分析・管理）との関係も深い。平板型アレイは、これらの分析から有用な情報を得るためのツールとなるため、産業上の利用価値は高い。

平板型セルの概略図を示す。図中ａはプレート（スライドグラス）の幅を、ｂはスペーサーの幅を示す。Ａ：斜視図、Ｂ：側面図 抗体アレイの作製スキームを示す図である。 γ−グロブリンを固定したガラス基板の赤外吸収スペクトルを示す図である。図中ａは固定化表面を、ｂは固定化後、０．３％ＳＤＳで洗浄した表面を示す。 平板型セルを組み込んだ抗体アレイの各スポットからの反射光強度の経時的変化を示す図である。（ａ）は反射光強度と時間の関係を、（ｂ）は細胞注入から０、１０、２０、３０分後のＳＰＲ像を、（ｃ）は平板型セルに細胞分散液を注入した後、３０分後の倒立型位相差顕微鏡像を示す。 実施例２における転倒法により抗体アレイのスポットに結合した細胞に焦点を合わせた蛍光顕微鏡像を示す。スケールバー：５００μｍ。 様々な密度でＣＣＲＦ細胞を播種したときの抗体固定スポットへの結合細胞数とＳＰＲ反射光強度の関係を示す図である。（ａ）は抗ＣＤ５抗体スポットを、（ｂ）は抗ＣＤ３８抗体固定スポットを示す。 実施例３における各種ＣＤ抗体とＣＣＲＦ−ＣＥＭ及びＨＬ−６０の結合数の関係を反射光高度で示した図である。 ＣＣＲＦ−ＣＥＭ／ＨＬ−６０混合比とＣＤ抗体固定化スポットに結合する細胞の関係を示した図である。○は細胞分散液注入３０分後のＳＰＲ反射光強度を、●は転倒法により計数した結合細胞数を示す。それぞれ細胞混合比に対してプロットした。 実施例４における基板に結合した細胞の共焦点レーザー顕微鏡像を示す図である。

符号の説明

１ 基板
２ プレート
３ スペーサー
４ 開口部（細胞分散液注入口）
５ 開口部（空気排出口）

Claims (14)

1. 細胞と結合する有機物質が固定された基板と、前記基板の上部にスペーサーを介在して隔置されたプレートを備えることを特徴とする平板型セル。
2. 有機物質が抗体であることを特徴とする請求項１に記載の平板型セル。
3. 有機物質が細胞と結合する物質であることを特徴とする請求項１に記載の平板型セル。
4. 基板とプレートの間隔が２０μｍ〜１ｍｍであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の平板型セル。
5. 固定された有機物質が２種以上であることを特徴とする請求項１に記載の平板型セル。
6. 基板とスペーサーを介在して隔置されたプレートとの間に、細胞の分散液が注入され、細胞が基板上の抗体と接触する請求項１〜５のいずれかに記載の平板型セル。
7. 請求項６記載の平板型セルの有機物質の固定された基板と結合した細胞を観察することを特徴とする細胞分析方法。
8. 有機物質の固定された基板と結合した細胞の数を計数し、基板に固定された有機物質と結合する細胞の分散液中の細胞含有率に関する情報を得ることを特徴とする請求項７に記載の分析方法。
9. 観察が、表面プラズモン共鳴イメージング装置、共焦点レーザースキャン顕微鏡、蛍光顕微鏡及び光学顕微鏡から選択される少なくとも１種の装置を用いることを特徴とする請求項７に記載の細胞分析方法。
10. 観察に先立ち平板型セルの上下を逆転させることを特徴とする請求項７記載の細胞分析方法。
11. 観察が、目視によることを特徴とする請求項７に記載の細胞分析方法。
12. 観察が、表面プラズモン共鳴イメージングによる結合細胞数又は結合細胞の形態であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
13. 観察が、共焦点レーザースキャン顕微鏡による３次元画像又は細胞横断面像の細胞形態であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
14. 以下の（Ａ）〜（Ｄ）の工程を有する平板型セルの製造方法；
    （Ａ）アルカンチオール、シランカップリング剤又はＤｉｔｈｉｏｂｉｓ（Ｃ_２−ＮＴＡ）を基板表面と反応させて自己組織化単分子膜を有する基板を作製する工程；
    （Ｂ）前記（Ａ）の基板の自己組織化単分子膜の表面を反応性官能基に変換する工程；
    （Ｃ）反応性官能基をもつ自己組織化単分子膜に有機物質を接触させ、基板に有機物質を、パターニングして固定する工程；及び
    （Ｄ） 前記（Ｃ）の基板の上部にスペーサーを介在してプレートを隔置する工程。