JP2006288407A - 造血細胞培養栄養補充成分 - Google Patents

Abstract

【課題】CD34^＋造血細胞、培養物中でのCD34^＋造血細胞の培養、CD34^＋造血細胞の拡大、CD34^＋造血細胞の分化の制御、およびCD34^＋造血細胞の外移植に関する研究は、血清の必要性によって妨げられる。さらに、これまでに利用可能な無血清培地に関連する主要な問題は、短い保存期間である。無血清培地のビタミンおよび脂質成分の酸化は、保存の間に生じる。CD34^＋造血細胞の増殖および拡大は、酸化された成分を含む無血清培地中では維持され得ない。従って、無血清培地補充成分、ならびにCD34^＋造血細胞の増殖および拡大を支持しそして長期間にわたり貯蔵され得る無血清培地についての必要性が残っている。
【解決手段】無血清の真核生物細胞培養培地補充成分であって、ここで、該補充成分を補充した基本細胞培養培地が、CD34^＋造血細胞の拡大を支持し得る、無血清の真核
生物細胞培養培地補充成分が提供される。
【選択図】なし

Description

本発明は、CD34^＋造血細胞および骨髄系の細胞のエクスビボ拡大に通常必要とされる血清補充のための置換物に関する。

哺乳動物における血液細胞は、３つの主なカテゴリーまたはファミリーに分けられ得る：赤血球、骨髄系の白血球、およびリンパ球系の白血球。赤血球は、肺から体の組織および細胞へ酸素を運搬し、そして組織および細胞から肺へ排出のためにCO_２を輸送する。骨髄系の白血球として、好中球、好塩基球、好酸球、巨核球、単球／マクロファージ、および樹状細胞が挙げられる。これらの細胞は、外来生物（例えば、細菌）、または損傷した組織、細胞、および物質の、同定および体からの排出における役割を果たす。リンパ球系の白血球は、２つの主な亜群に分けられる：Ｔリンパ球（ヘルパー細胞、キラー細胞、サプレッサー細胞）、これらは、ウイルス、腫瘍細胞、および外来組織移植物に対する細胞媒介応答に関連する；および、Ｂリンパ球、これは、血液中を循環しそして外来物質（例えば、細菌、外来タンパク質）に化学的に特異的な様式で反応する抗体の産生に関連する。

発生学的には、血液細胞は、内蔵中胚葉の細胞からの発生の第３週に形成される（非特許文献１）。卵黄嚢では、造血（すなわち、血液細胞形成）は、最初に、内蔵中胚葉細胞のクラスターまたは島（血島）で生じる。次いで、血液島は、胎児発生中に肝臓へ移動する。実妊娠時および送達直後に、これらの細胞は、長骨、肋骨、および股の幹における骨髄に移動する。生命の残りを通じて、骨髄は、血液細胞形成の正常部位として作用し、循環中に成熟細胞を放出する（非特許文献２）。

造血は、種々の血液細胞が１日当たり4000億個の割合で産生される整然としたプロセスである（非特許文献３）。1960年代初期以来、研究者らは、種々の血液細胞型のそれぞれが、マウスにおいて普通の「多能性」幹細胞から分けられる仮説についての実験的証拠を獲得してきた（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。実験的証拠はまた、ヒトにおける多能性幹細胞の存在を支持する（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。

造血細胞分化は、除々に生じる（非特許文献１０）。第１期は、造血幹細胞によって表される。次いで、発生は、リンパ系および骨髄系に沿ってリンパ系前駆体細胞として分岐し、そして骨髄性／赤血球系前駆細胞が形成される。発生は、これらの系のそれぞれの中でさらに分岐する。リンパ前駆細胞は、プレＢおよびプレＴ前駆細胞を形成し、これらは、後にそれぞれＢリンパ球およびＴリンパ球に発達する。骨髄性／赤血球系前駆細胞は、(1)赤血球系芽球形成単位（BFU-E）細胞、これは最終的に赤血球に発達する；(2)巨核球コロニー形成単位（CFU-MEG）細胞、これは最終的に巨核球および血小板に発達する；(3)顆粒球／マクロファージコロニー形成単位（CFU-GM）、これは最終的に単球、マクロファージ、および好中球に発達する；(4)好酸球；および(5)好塩基球を形成する。

実験的血液学の分野における主な焦点は、最も初期の多能性幹細胞の同定であり続ける。１つのアプローチは、前駆細胞の表面上の細胞表面マーカー（例えばCD抗原）を同定すること、およびこれらのマーカーを、メチルセルロース培養系で分化した細胞のコロニーを形成する細胞の能力による発生または分化の時期と関連づけることである。CD抗原発現は、細胞分化中に調節されることが示されている（非特許文献１１）。造血幹細胞はCD34^＋細胞である。すなわち、これは、CD34表面マーカーを発現する。CD34^＋/CD33⁻/CD38⁻として特徴づけられている、最も初期の公知のヒト前駆細胞は、すべての骨髄細胞の１〜２％のみを示す（非特許文献１２）。

1960年代中期には、正常および異常な造血のメカニズムをよりよく理解するために、研究者らは、懸濁液および半固体の両方の組織培養系を使用してエクスビボで骨髄細胞を培養することを試し始めた。BradleyおよびMetcalf（非特許文献１３）の初期の研究、ならびにPluznikおよびSachs（非特許文献１４）の初期の研究は、血清単独が培養物中で骨髄性前駆細胞の増殖を支持するには十分でなかったことを示した。細胞増殖は、他の細胞（すなわち、フィーダー細胞）によって分泌されそしてこれらの細胞の培養物由来の馴化培地に見いだされる１つまたは複数の因子の存在を必要とする。エクスビボでの造血組織の培養がいくつかのサイトカインまたは造血増殖因子の存在を必要とすることが、現在明らかである。

いくつかの異なる因子が同定されクローニングされており、そして現在では研究および／または臨床的な使用の両方のための組換え分子として日常的に製造されている。これらには、エリスロポエチン（非特許文献１５；非特許文献１６）、インターロイキン３（IL-3）（非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）（非特許文献２０；非特許文献２１）；顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）（非特許文献２２）；幹細胞因子（SCF）（非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５；非特許文献２６；非特許文献２７；非特許文献２８）、およびインターロイキン11（Il-11）（非特許文献２９）が含まれ、これらの２、３のみが引用される。

1977年には、Dexterおよびその同僚らは、長期骨髄培養物（LTBMC）プロトコルを開発した（非特許文献３０）。「Dexter」培養物として知られるように、この型の細胞培養系は、馴化培地の使用を必要とせず、そしてインビトロで造血環境を樹立および模倣するようである。長期培養物は、ヒト骨髄（非特許文献３１；非特許文献３２）ならびに他の動物種由来の骨髄を使用して樹立されている（非特許文献３３）。

長期培養系では、幹細胞および初期前駆細胞の増殖および分化は、直接的な細胞と細胞との接触、または発生中の造血細胞と間質細胞との間の非常な密接のいずれかを必要とするようである（非特許文献３４）。

上記の細胞培養系（例えば、液体静的培養物、半固体培養物、および長期骨髄培養物）のそれぞれは、ヒトまたは他の哺乳動物種の造血細胞を培養し得る前に満たされなければならない、それ自体に独特の重要な要求性を有するようである。しかし、今日まで、細胞培養系の通常の要求性および主要な不都合は、動物血清（例えば、ウシ胎児血清またはウマ胎児血清）または最適増殖のための「馴化細胞培養培地」に含まれる不確定成分について必要性を有している。

造血細胞の培養における血清の使用は、いくつかの理由のために不都合である。血清は、不確定分化因子の主要な供給源であり、従って拡散よりもむしろ造血細胞の分化を促進する傾向がある。血清の効率は血清のロット間で異なる。いくつかのロットの血清は、細胞に対して毒性であることが見いだされている。さらに、血清は、マイコプラズマ、バクテリオファージ、およびウイルスのような感染性因子と夾雑され得る。最後に、血清は、血清が加えられる培地の不確定および可変成分であるので、血清の使用は、培養した細胞の栄養およびホルモンの要求性の真の定義および解明を妨げる。

CD34^＋造血細胞の増殖における血清の使用に関連する多くの問題を考慮して、CD34^＋造血細胞に関する研究を行っている研究室は、購入する前に血清を予備スクリーニングを行わなければならない。しかし、予備スクリーニングプロセスは、多くの時間を要しそして解釈を受ける。満足なロットが同定された後でさえも、−20℃およびそれ以下での予備スクリーニングした血清のロットの大量の貯蔵は疑問である。

結果として、研究者は、動物の血清または馴化培地を、化学的定義の種々の程度の無血清培養培地と置換することを試みた。これらの試みは、拡大しようとしている細胞型の同一性に依存して、種々の程度の成功に遭遇した。無血清培地の開発は、最近総説が書かれた（非特許文献３５;非特許文献３６；非特許文献３７）。

特許文献１は、ヒト間葉前駆細胞を培養するための無血清培地を開示する。特許文献２は、造血細胞および骨髄間質細胞を培養するための無血清または血清涸渇培地を開示する。特許文献３は、ハイブリドーマおよびリンパ球を増殖させるために、ペニシリンおよびN-アセチルシステインを含む無血清培地を開示する。
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CD34^＋造血細胞、培養物中でのCD34^＋造血細胞の培養、CD34^＋造血細胞の拡大、CD34^＋造血細胞の分化の制御、およびCD34^＋造血細胞の外移植に関する研究は、血清の必要性によって妨げられる。さらに、これまでに利用可能な無血清培地に関連する主要な問題は、短い保存期間である。無血清培地のビタミンおよび脂質成分の酸化は、保存の間に生じる。CD34^＋造血細胞の増殖および拡大は、酸化された成分を含む無血清培地中では維持され得ない。従って、無血清培地補充成分、ならびにCD34^＋造血細胞の増殖および拡大を支持しそして長期間にわたり貯蔵され得る無血清培地についての必要性が残っている。

（発明の要旨）
（項目１）
１つ以上の抗酸化剤、１つ以上のアルブミンまたはアルブミン代替物、１つ以上の脂質薬剤、１つ以上のインスリンまたはインスリン代替物、１つ以上のトランスフェリンまたはトランスフェリン代替物、１つ以上の微量元素、および１つ以上のグルココルチコイドからなる群より選択される１つ以上の成分を含む、無血清の真核生物細胞培養培地補充成分であって、
ここで、該補充成分を補充した基本細胞培養培地が、CD34^＋造血細胞の拡大を支持し得る、
無血清の真核生物細胞培養培地補充成分。

（項目２）
１つ以上の抗酸化剤、ならびに、１つ以上のアルブミンまたはアルブミン代替物、１つ以上の脂質薬剤、１つ以上のインスリンまたはインスリン代替物、１つ以上のトランスフェリンまたはトランスフェリン代替物、１つ以上の微量元素、および１つ以上のグルココルチコイドからなる群より選択される１つ以上の成分を含む、無血清の真核生物細胞培養培地補充成分であって、
ここで、該補充成分を補充した基本細胞培養培地が、CD34^＋造血細胞の拡大を支持し得る、
無血清の真核生物細胞培養培地補充成分。

（項目３）
前記抗酸化剤が、N-アセチル-L-システイン、2-メルカプトエタノール、およびD,L-酢酸トコフェロール、あるいはその誘導体または混合物からなる群より選択される、項目１に記載の無血清の真核生物細胞培養培地補充成分。

（項目４）
前記アルブミンが、ヒト血清アルブミンである、項目１に記載の無血清の真核生物細胞培養培地補充成分。

（項目５）
前記脂質薬剤が、HumanEx-Cyte^(R)ならびにエタノールアミンまたはその誘導体および混合物からなる群より選択される、項目１に記載の無血清の真核生物細胞培養培地補充成分。

（項目６）
前記インスリンが、ヒト亜鉛インスリンである、項目１に記載の無血清の真核生物細胞培養培地補充成分。

（項目７）
前記トランスフェリンが、ヒト鉄飽和トランスフェリンである、項目１に記載の無血清の真核生物細胞培養培地補充成分。

（項目８）
前記微量元素が、Se^４＋である、項目１に記載の無血清の真核生物細胞培養培地補充成分。

（項目９）
前記グルココルチコイドが、ヒドロコルチゾンである、項目１に記載の無血清の真核生物細胞培養培地補充成分。

（項目１０）
前記補充成分が濃縮される、項目１に記載の無血清の真核生物細胞培養培地補充成分。

（項目１１）
前記補充成分が、約２倍から約100倍に濃縮される、項目１０に記載の無血清の真核生物細胞培養培地補充成分。

（項目１２）
前記補充成分が、約40×処方物である、項目１１に記載の無血清の真核生物細胞培養培地補充成分。

（項目１３）
項目１に記載の１つ以上の成分を組み合わせることによって得られる、無血清の真核生物細胞培養培地補充成分。

（項目１４）
前記成分が、N-アセチル-L-システイン、ヒト血清アルブミン、HumanEx-Cyte^(R)、エタノールアミン、ヒト亜鉛インスリン、ヒト鉄飽和トランスフェリン、Se^４＋、ヒドロコルチゾン、D,L-酢酸トコフェロール、および2-メルカプトエタノールからなる群より選択される、項目１３に記載の無血清の真核生物細胞培養培地補充成分。

（項目１５）
無血清の真核生物細胞培養培地補充成分を製造する方法であって、水を項目１に記載の１つ以上の成分と混合する工程を包含する、方法。

（項目１６）
前記成分が、水、N-アセチル-L-システイン、ヒト血清アルブミン、HumanEx-Cyte^(R)、エタノールアミンHCl、ヒト亜鉛インスリン、ヒト鉄飽和トランスフェリン、Se^４＋塩、ヒドロコルチゾン、D,L-酢酸トコフェロール、および2-メルカプトエタノールを含む、項目１５に記載の方法。

（項目１７）
キャリア手段を含むキットであって、該キャリア手段が、その中に１つ以上の容器手段を密接した制限で受けるために仕切られれており、ここで、第１の容器手段が項目１に記載の補充成分を含み、そして必要に応じて第２の容器手段は基本培地を含む、キット。

（項目１８）
項目１に記載の無血清培養補充成分を補充した基本細胞培養培地を含む無血清の真核生物細胞培養培地であって、
ここで、該補充された培養培地が、CD34^＋造血細胞の拡大を支持し得る、
無血清の真核生物細胞培養培地。

（項目１９）
前記基本培地が、Iscove'sModified Dulbecco's Medium、RPMI-1640、α-MEMからなる群より選択される、項目１８に記載の無血清の真核生物細胞培養培地。

（項目２０）
基本細胞培養培地を項目１に記載の無血清補充成分と組み合わせることによって得られる無血清の真核生物細胞培養培地であって、
ここで、該培地が、CD34^＋造血細胞の拡大を支持し得る、
無血清の真核生物細胞培養培地。

（項目２１）
前記培地が１×培地である、項目２０に記載の無血清の真核生物細胞培養培地。

（項目２２）
前記培地が、濃縮された培地処方物である、項目２０に記載の無血清の真核生物細胞培養培地。

（項目２３）
前記培地が、約２×から約100×まで濃縮される、項目２２に記載の無血清の真核生物細胞培養培地。

（項目２４）
前記濃縮された培地処方物が、約10×処方物である、項目２３に記載の無血清の真核生物細胞培養培地。

（項目２５）
前記濃縮された培地処方物が、10×より高く濃縮される、項目２３に記載の無血清の真核生物細胞培養培地。

（項目２６）
無血清の真核生物細胞培地を製造する方法であって、基本細胞培養培地を項目１に記載の無血清補充成分と混合する工程を包含し、
ここで、該培地が、CD34^＋造血細胞の細胞の拡大を支持し得る、
方法。

（項目２７）
１つ以上の抗酸化剤、１つ以上のアルブミンまたはアルブミン代替物、１つ以上の脂質薬剤、１つ以上のインスリンまたはインスリン代替物、１つ以上のトランスフェリンまたはトランスフェリン代替物、１つ以上の微量元素、１つ以上のグルココルチコイド、１つ以上の無機塩、１つ以上のエネルギー供給源、１つ以上の緩衝化剤、１つ以上のピルビン酸塩、１つ以上のpH指示薬、１つ以上のアミノ酸、および１つ以上のビタミンからなる群より選択される１つ以上の成分を含む、無血清の真核生物細胞培養培地であって、
ここで、該培地が、CD34^＋造血細胞の拡大を支持し得る、
無血清の真核生物細胞培養培地。

（項目２８）
前記抗酸化剤が、N-アセチル-L-システイン、2-メルカプトエタノール、およびD,L-酢酸トコフェロール、あるいはその誘導体または混合物からなる群より選択される、項目２７に記載の無血清の真核生物細胞培養培地。

（項目２９）
前記アルブミンが、ヒト血清アルブミンである、項目２７に記載の無血清の真核生物細胞培養培地。

（項目３０）
前記脂質薬剤が、HumanEx-Cyte^(R)およびエタノールアミンである、項目２７に記載の無血清の真核生物細胞培養培地。

（項目３１）
前記インスリンが、ヒト亜鉛インスリンである、項目２７に記載の無血清の真核生物細胞培養培地。

（項目３２）
前記トランスフェリンが、ヒト鉄飽和トランスフェリンである、項目２７に記載の無血清の真核生物細胞培養培地。

（項目３３）
前記グルココルチコイドが、ヒドロコルチゾンである、項目２７に記載の無血清の真核生物細胞培養培地。

（項目３４）
前記無機塩成分が、１つ以上のカルシウム塩、１つ以上のカリウム塩、１つ以上のマグネシウム塩、１つ以上のナトリウム塩、１つ以上の炭酸塩、および１つ以上のリン酸塩からなる群より選択される１つ以上の無機塩を含む、項目２７に記載の無血清の真核生物細胞培養培地。

（項目３５）
前記エネルギー供給源が、D-グルコースである、項目２７に記載の無血清の真核生物細胞培養培地。

（項目３６）
前記緩衝化剤が、HEPESである、項目２７に記載の無血清の真核生物細胞培養培地。

（項目３７）
前記ピルビン酸塩が、ピルビン酸ナトリウムである、項目２７に記載の無血清の真核生物細胞培養培地。

（項目３８）
前記pH指示薬が、フェノールレッドである、項目２７に記載の無血清の真核生物細胞培養培地。

（項目３９）
前記アミノ酸成分が、グリシン、L-アラニン、L-アスパラギン、L-システイン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、L-フェニルアラニン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-リジン、L-ロイシン、L-グルタミン、L-アルギニンHCL、L-メチオニン、L-プロリン、L-ヒドロキシプロリン、L-セリン、L-トレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、およびL-バリン、ならびにその塩および誘導体からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸を含む、項目２７に記載の無血清の真核生物細胞培養培地。

（項目４０）
前記ビタミン成分が、ビオチン、D-パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、i-イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサールHCl、リボフラビン、チアミンHCl、およびビタミンB_１２、ならびにその誘導体からなる群より選択される１つ以上のビタミンを含む、項目２７に記載の無血清の真核生物細胞培養培地。

（項目４１）
前記成分が、N-アセチル-L-システイン、2-メルカプトエタノール、ヒト血清アルブミン、D,L-酢酸トコフェロール、HumanEx-Cyte^(R)、エタノールアミン、ヒト亜鉛インスリン、鉄飽和トランスフェリン、Se^４＋、ヒドロコルチゾン、Ca^２＋、K^＋、Mg^２＋、Na^＋、CO_３ ^２−、PO_４ ^３−、D-グルコース、HEPES、ピルビン酸ナトリウム、フェノールレッド、グリシン、L-アラニン、L-アスパラギン、L-システイン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、L-フェニルアラニン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-リジン、L-ロイシン、L-グルタミン、L-アルギニンHCL、L-メチオニン、L-プロリン、L-ヒドロキシプロリン、L-セリン、L-トレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、およびL-バリン、ビオチン、D-パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、i-イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサールHCl、リボフラビン、チアミンHCl、およびビタミンB_１２を含む、項目２７に記載の無血清の真核生物細胞培養培地。

（項目４２）
前記培地が、水および項目４６に記載の成分を組み合わせることによって得られる、項目４１に記載の無血清の真核生物細胞培養培地。

（項目４３）
項目４１に記載の成分を混合する工程を包含する、無血清の真核生物細胞培養培地を製造する方法。

（項目４４）
項目２７に記載の無血清培地中にCD34^＋造血幹細胞を含む組成物。

（項目４５）
前記CD34^＋造血幹細胞が、ヒト、サル、類人猿、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、モルモット、ウシ、ブタ、イヌ、ウマ、ネコ、ヤギ、およびヒツジからなる群より選択される動物から得られる、項目４４に記載の組成物。

（項目４６）
CD34^＋造血細胞を拡大する方法であって、
(a) 該細胞を項目２７に記載の培地と接触させる工程；および
(b) 該細胞の拡大を容易にするために適切な条件下で該細胞を培養する工程、
を包含する、方法。

（項目４７）
前記培養する工程が、前記培地に造血細胞増殖因子を添加する工程をさらに包含する、項目４６に記載の方法。

（項目４８）
前記増殖因子が、エリスロポエチン、顆粒球−コロニー刺激因子、幹細胞因子、インターロイキン３、および顆粒球／マクロファージ−コロニー刺激因子からなる群より選択される１つ以上の増殖因子である、項目４７に記載の方法。

（項目４９）
無血清培養物中のCD34^＋造血細胞を哺乳動物に提供する方法であって、
(a) 該CD34^＋造血細胞を項目２７に記載の培地と接触させる工程；
(b) 無血清培養物中で該CD34^＋造血細胞の拡大を容易にするために適切な条件下で該細胞を培養する工程；および
(c) 該拡大した細胞を哺乳動物に導入する工程、
を包含する、方法。

（項目５０）
前記培養する工程が、造血細胞増殖因子を前記培地に添加する工程をさらに包含する、項目４９に記載の方法。

（項目５１）
CD34^＋造血細胞を無血清培養物中で特定の型の細胞に分化させる方法であって、
(a) 該CD34^＋造血細胞を項目２７に記載の培地と接触させる工程；
(b) 無血清培養物中で該細胞の拡大を容易にするために適切な条件下で該細胞を培養する工程；および
(c) １つ以上の分化因子を添加する工程あるいは異なる型の造血細胞を形成するように細胞の分化を誘導するために培養条件を変化させる工程、
を包含する、方法。

（項目５２）
無血清培養物中で分化した造血細胞を哺乳動物に提供する方法であって、
(a) 該CD34^＋造血細胞を項目２７に記載の培地と接触させる工程；
(b) 無血清培養物中で該細胞の拡大を容易にするために適切な条件下で該細胞を培養する工程；
(c) １つ以上の分化因子を添加する工程あるいは異なる型の造血細胞を形成するように細胞の分化を誘導するために培養条件を変化させる工程；および
(d) 該分化した細胞を哺乳動物に導入する工程、
を包含する、方法。

（項目５３）
組換えCD34^＋造血細胞を拡大する方法であって、
(a) 目的のタンパク質をコードする核酸分子を含む組換えCD34^＋造血細胞を得る工程；および
(b) 組換え細胞の集団を形成するために項目２７に記載の培地中で該細胞を培養する工程、
を包含する、方法。

（項目５４）
組換えCD34^＋造血細胞を哺乳動物に提供する方法であって、
(a) 目的のタンパク質をコードする核酸分子を含む組換えCD34^＋造血細胞を得る工程；
(b) 組換えCD34^＋造血幹細胞の集団を形成するために項目２７に記載の培地中で該細胞を培養する工程；および
(c) 該組換え細胞を哺乳動物に導入する工程、
を包含する、方法。

本発明は、１つ以上の抗酸化剤、１つ以上のアルブミンまたはアルブミン代替物、１つ以上の脂質薬剤、１つ以上のインスリンまたはインスリン代替物、１つ以上のトランスフェリンまたはトランスフェリン代替物、１つ以上の微量元素、および１つ以上のグルココルチコイドからなる群より選択される１つ以上の成分を含むかまたはそれらを組み合わせることによって得られる、無血清の真核生物細胞培養培地補充成分を提供する。ここで、この補充成分を補充した基本細胞培養培地は、無血清培養において、CD34^＋造血細胞および骨髄系の細胞の拡大を支持し得る。

本発明はまた、１つ以上の抗酸化剤、ならびに、１つ以上のアルブミンまたはアルブミン代替物、１つ以上の脂質薬剤、１つ以上のインスリンまたはインスリン代替物、１つ以上のトランスフェリンまたはトランスフェリン代替物、１つ以上の微量元素、および１つ以上のグルココルチコイドからなる群より選択される１つ以上の成分を含むかまたはそれらを組み合わせることによって得られる、無血清の真核生物細胞培養培地補充成分を提供する。ここで、この補充成分を補充した基本細胞培養培地は、無血清培養において、CD34^＋造血細胞および骨髄系の細胞の拡大を支持し得る。

本発明はまた、N-アセチル-L-システイン、ヒト血清アルブミン、HumanEx-Cyte^(R)、エタノールアミンHCl、ヒト亜鉛インスリン、ヒト鉄飽和トランスフェリン、Se^４＋、ヒドロコルチゾン、D,L-酢酸トコフェロール、および2-メルカプトエタノールからなる群より選択される１つ以上の成分を含むかまたはそれらを組み合わせることによって得られる、無血清の真核生物細胞培養培地補充成分を特異的に提供する。ここで、この成分は、補充成分が基本細胞培地に添加される場合に、無血清培地中で、CD34^＋造血細胞および骨髄系の細胞の拡大を支持する量で存在する。

本発明はまた、無血清の真核生物細胞培養培地補充成分を製造する方法を提供し、この方法は、任意の順で本発明の補充成分の成分を混合する工程を包含する。本発明は、水、N-アセチル-L-システイン、ヒト血清アルブミン、Human Ex-Cyte^(R)、エタノールアミンHCl、亜鉛インスリン、ヒト鉄飽和トランスフェリン、Se^４＋塩、ヒドロコルチゾン、D,L-酢酸トコフェロール、および2-メルカプトエタノールを混合する工程を特異的に包含する。

本発明はまた、無血清の真核生物細胞培養培地補充成分を製造する方法を提供し、この方法は、水、N-アセチル-L-システイン、ヒト血清アルブミン、Human Ex-Cyte^(R)、エタノールアミンHCl、ヒト亜鉛インスリン、ヒト鉄飽和トランスフェリン、Se^４＋塩、ヒドロコルチゾン、D,L-酢酸トコフェロール、および2-メルカプトエタノールを混合する工程を包含する。ここで、各成分は、基本培地に添加される場合、無血清培養において、CD34^＋造血細胞および骨髄系の細胞の拡大を支持する量で存在する。

本発明はまた、キャリア手段を含むキットを提供し、このキャリア手段は、その中に１つ以上の容器手段を密接した制限で受けるために仕切られている。ここで、第１の容器手段は本発明の補充成分を含み、そして必要に応じて第２の容器手段は基本培地を含む。

本発明はまた、本発明の無血清培養補充成分を補充した基本細胞培養培地を含む無血清の真核生物細胞培養培地を提供する。ここで、この補充した培養培地は、無血清培地中で、CD34^＋造血細胞および骨髄系の細胞の拡大を支持し得る。

本発明はまた、基本細胞培養培地を本発明の無血清補充成分と組み合わせることによって得られる無血清の真核生物細胞培養培地を提供する。ここで、この培地は、無血清培養において、CD34^＋造血細胞および骨髄系の細胞の拡大を支持し得る。

本発明はまた、無血清の真核生物細胞培地を製造する方法を提供し、この方法は、基本細胞培養培地を本発明の無血清補充成分と混合する工程を包含する。ここで、この培地は、無血清培養において、CD34^＋造血細胞および骨髄系の細胞の拡大を支持し得る。

本発明はまた、１つ以上の抗酸化剤、１つ以上のアルブミンまたはアルブミン代替物、１つ以上の脂質薬剤、１つ以上のインスリンまたはインスリン代替物、１つ以上のトランスフェリンまたはトランスフェリン代替物、１つ以上の微量元素、１つ以上のグルココルチコイド、１つ以上の無機塩、１つ以上のエネルギー供給源、１つ以上の緩衝化剤、１つ以上のピルビン酸塩、１つ以上のpH指示薬、１つ以上のアミノ酸、および１つ以上のビタミンからなる群より選択される１つ以上の成分を含む無血清の真核生物細胞培養培地を提供する。ここで、この培地は、無血清培養において、CD34^＋造血細胞および骨髄系の細胞の拡大を支持し得る。

本発明は、成分のN-アセチル-L-システイン、2-メルカプトエタノール、ヒト血清アルブミン、D,L-酢酸トコフェロール、HumanEx-Cyte^(R)、エタノールアミン、ヒト亜鉛インスリン、鉄飽和トランスフェリン、Se^４＋、ヒドロコルチゾン、Ca^２＋、K^＋、Mg^２＋、Na^＋、CO_３ ^２−、PO_４ ^３−、D-グルコース、HEPES緩衝剤、ピルビン酸ナトリウム、フェノールレッド、グリシン、L-アラニン、L-アスパラギン、L-システイン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、L-フェニルアラニン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-リジン、L-ロイシン、L-グルタミン、L-アルギニンHCL、L-メチオニン、L-プロリン、L-ヒドロキシプロリン、L-セリン、L-トレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、およびL-バリン、ビオチン、D-パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、i-イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサールHCl、リボフラビン、チアミンHCl、およびビタミンB_１２を含む無血清の真核生物細胞培養培地を特異的に提供する。本発明はまた、本発明の培地を製造する方法を提供し、この方法は、この培地の成分を混合する工程を包含する。

本発明はまた、成分の水、N-アセチル-L-システイン、2-メルカプトエタノール、ヒト血清アルブミン、D,L-酢酸トコフェロール、Human Ex-Cyte^(R)、エタノールアミン、ヒト亜鉛インスリン、鉄飽和トランスフェリン、Se^４＋塩、ヒドロコルチゾン、カルシウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、炭酸塩、リン酸塩、D-グルコース、HEPES、ピルビン酸塩、フェノールレッド、グリシン、L-アラニン、L-アスパラギン、L-システイン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、L-フェニルアラニン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-リジン、L-ロイシン、L-グルタミン、L-アルギニンHCL、L-メチオニン、L-プロリン、L-ヒドロキシプロリン、L-セリン、L-トレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、およびL-バリン、ビオチン、D-パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、i-イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサールHCl、リボフラビン、チアミンHCl、およびビタミンB_１２を組み合わせることによって得られる無血清の真核生物細胞培養培地を提供する。ここで、成分は、CD34^＋造血細胞および骨髄系の細胞の拡大を支持する量で存在する。

本発明は、無血清の真核生物細胞培養培地を製造する方法を提供し、この方法は、成分の水、N-アセチル-L-システイン、2-メルカプトエタノール、ヒト血清アルブミン、D,L-酢酸トコフェロール、Human Ex-Cyte^(R)、エタノールアミン、ヒト亜鉛インスリン、鉄飽和トランスフェリン、Se^４＋塩、ヒドロコルチゾン、カルシウム塩、CaCl_２、１つ以上のカリウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、炭酸塩、リン酸塩、D-グルコース、HEPES、ピルビン酸塩、フェノールレッド、グリシン、L-アラニン、L-アスパラギン、L-システイン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、L-フェニルアラニン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-リジン、L-ロイシン、L-グルタミン、L-アルギニンHCL、L-メチオニン、L-プロリン、L-ヒドロキシプロリン、L-セリン、L-トレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、およびL-バリン、ビオチン、D-パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、i-イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサールHCl、リボフラビン、チアミンHCl、およびビタミンB_１２を混合する工程を包含する。ここで、成分は、CD34^＋造血細胞および骨髄系の細胞の拡大を支持する量で存在する。

本発明はまた、CD34^＋造血細胞および本発明の無血清培地を含む組成物を提供する。ここで、無血清培地は、無血清培養において、CD34^＋造血細胞および骨髄系の細胞の拡大を支持し得る。

本発明はまた、CD34^＋造血細胞および骨髄系の細胞を拡大する方法を提供し、この方法は、細胞を本発明の培地と接触させる工程、および細胞の拡大を容易にするために適切な無血清条件下で細胞を培養する工程を包含する。

本発明はまた、CD34^＋造血細胞を哺乳動物に提供する方法を提供し、この方法は、CD34^＋造血細胞を本発明の培地と接触させる工程、無血清培養において細胞の拡大を容易にするために適切な条件下で細胞を培養する工程、およびこの拡大した細胞を哺乳動物に導入する工程を包含する。

本発明はまた、CD34^＋造血細胞を、無血清培養において特定の型の細胞へ分化させる方法を提供し、この方法は、CD34^＋造血細胞を本発明の培地と接触させる工程、無血清培養において細胞の拡大を容易にするために適切な条件下でこの細胞を培養する工程、および１つ以上の分化因子を添加する工程あるいは異なる型の造血細胞を形成するように細胞の分化を誘導するために培養条件を変化させる工程を包含する。

本発明は、分化した造血細胞を哺乳動物に提供する方法を提供し、この方法は、CD34^＋造血細胞を本発明の培地と接触させる工程、無血清培養において細胞の拡大を容易にするために適切な条件下でこの細胞を培養する工程、１つ以上の分化因子を添加する工程あるいは異なる型の造血細胞を形成するように細胞の分化を誘導するために培養条件を変化させる工程、および分化した細胞を哺乳動物に導入する工程を包含する。

本発明はまた、組換えCD34^＋造血細胞を拡大する方法を提供し、この方法は、目的のタンパク質をコードする核酸分子を含む組換えCD34^＋造血細胞を得る工程、および組換え細胞の集団を形成するために本発明の培地中で細胞を培養する工程を包含する。

本発明はまた、組換えCD34^＋造血細胞を哺乳動物に提供する方法を提供し、この方法は、目的のタンパク質をコードする核酸分子を含む組換えCD34^＋造血細胞を得る工程、組換えCD34^＋造血幹細胞の集団を形成するために本発明の培地中で細胞を培養する工程、および組換え細胞を哺乳動物に導入する工程を包含する。

本発明はまた、培地を生成するために十分な量の抗酸化剤（好ましくはN-アセチル-L-システインまたはその誘導体）を混合する工程を包含する、真核生物細胞培養培地（好ましくは無血清培地）の再生方法に関する。再生後、培地は、任意の真核生物細胞、特にCD34^＋造血細胞の増殖を支持するために使用され得る。

本発明はまた、培地の保存期間を増加または増大させるために十分な量の抗酸化剤（好ましくはN-アセチル-L-システインまたはその誘導体）を培地と混合する工程を包含する、真核生物細胞培養培地（好ましくは無血清培地）の保存期間を増加または増大させることに関する。

本発明は、造血系の幹細胞および前駆細胞について特異的に開発されている化学的に確定された細胞培養補充成分および培地を提供する。この処方物は、現在、骨髄、末梢血、または新生児臍帯血で同定可能な最も初期の造血幹細胞として定義されるCD34^＋細胞の拡大を支持する能力において独特である。本発明の補充成分および培地は、CD34^＋細胞および骨髄系の細胞の拡大を支持するために特に適切であり、これらの細胞には、BFU-E細胞、赤血球、CFU-MEG細胞、巨核球、CFU-GM細胞、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、および好塩基球が含まれる。発生のより早い時期では、骨髄系の細胞は、CD34^＋マーカータンパク質を発現する。発生のより遅い時期では、骨髄系の細胞は、検出可能なレベルのCD34^＋マーカータンパク質を発現しない。骨髄系の細胞がCD34^＋マーカータンパク質を発現するかどうかは、蛍光活性化細胞ソーティングのような周知の技法を使用して当業者によって決定され得る。

本発明の補充成分および培地はまた、間葉起源の細胞を培養または拡大するために使用され得る。このような細胞には、軟骨細胞、破骨細胞、骨芽細胞、ならびに皮膚および血管組織の上皮細胞が含まれるが、これらに限定されない。本発明の補充成分および培地はまた、ほとんどまたはすべての胚起源（例えば、外胚葉誘導物、中胚葉誘導物、および内胚葉誘導物）の初代細胞および不死化細胞の両方を培養するために使用され得る。これらの細胞は、中枢および末梢神経系の細胞（ニューロン、グリア細胞、および星状細胞）、上皮細胞（感覚上皮細胞、表皮細胞（皮膚、乳腺、髪、爪、下垂体、皮脂腺））、結合組織細胞（軟骨、骨、横紋および平滑筋、造血細胞、リンパ球、腎臓、生殖細胞、副腎細胞）、および肝臓、膵臓、甲状腺、胸腺の実質細胞、ならびに膀胱、尿道、鼓室、および耳管の上皮内層を含む。これらの細胞は、ヒトまたは他の哺乳動物または真核生物起源であり得る。

本発明の無血清補充成分または培地を使用して、造血細胞の増殖、拡大、および分化は、所定の増殖因子または他のサイトカインの添加によって調節され得る。培養物中の造血細胞へのこのような影響は、細胞が血清を補充した培地で培養される場合には可能ではない。血清中の不確定成分は、所定の因子に対する細胞の応答をあいまいにする。本発明の補充成分または培地を使用して、CD34^＋造血細胞（造血幹細胞を含む）、および骨髄系の細胞は、懸濁培養物中、および間質細胞、コラーゲン、または支持マトリクスの非存在下で、拡大および分化され得る。

間質細胞は、インビボおよびインビトロで造血細胞についての支持ネットワークを形成する骨髄細胞である。間質細胞は、造血細胞に対する付着の部位として作用する。さらに、間質細胞は、造血細胞が拡大および増殖に必要とするサイトカインおよび他の増殖因子を分泌する。培養物中では、間質細胞は、接着層を形成し、そして内皮細胞、マクロファージ、線維芽細胞、および脂肪細胞を含む。本発明の補充成分または培地を使用すると、造血細胞集団を拡大するために、造血細胞を間質細胞と同時培養する必要はない。

本発明の無血清補充成分および培地は、本発明の補充成分および培地が、推定の多能性幹細胞集団（すなわち、骨髄、末梢血、および新生児臍帯血由来のCD34^＋細胞）および分化した子孫の両方の増殖および拡大を提供する点で、これまでに利用可能な無血清培地とは異なる。

本発明の無血清補充成分および培地は、ヒト、サル（monkey）、類人猿（ape）、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、モルモット、ウシ、ブタ、イヌ、ウマ、ネコ、ヤギ、およびヒツジを含む多くの動物に由来する造血細胞を培養するために使用され得る。好ましくは、ヒト造血細胞が培養される。

本発明の補充成分および培地は、造血幹細胞およびその子孫を、ヒト組換え増殖因子または他のサイトカインに十分に応答させる。今日まで、所定の増殖因子への細胞応答は、血清中の不確定成分および培地化学の造血細胞特異的最適化の欠如によって妨げられてきた。他の無血清培地とは異なり、本発明の補充成分および培地は、複数のフリーラジカル種および細胞培養環境中で生成されることが公知の他の毒性部分の有害な（およびしばしば致死的な）効果から造血細胞を保護する抗酸化剤、または抗酸化剤の組み合わせを含む。従って、本発明による抗酸化剤の添加によって、培地の保存期間は増加または増大され得る。さらに、このような有害産物が培地の保存中に形成されるという点で、本発明による抗酸化剤の添加は、培地の再生を提供し、それによって細胞を拡大する培地のキャパシティーまたは能力を増大または増加させる。このような有益な結果を達成するための抗酸化剤の添加は、任意の細胞培養培地、特に無血清培地に適用され得る。使用され得る培地の例としては、ほとんどまたはすべての胚起源の初代細胞および不死化細胞の両方の拡大のための培地が挙げられる（以下を参照のこと）。このような培地には、DMEM、Ham's F-10、Ham's F-12、MCDBシリーズ、AIM-5、Keratinocyte SFM、化学的に確定されたケラチノサイト培地、AmninoMax、ヒト軟骨細胞培地、ヒト皮層線維芽細胞培地、CHOII、CHO III (GibcoBRL) が含まれるが、これらに限定されない。

以下の説明では、細胞培養培地の分野でおよび真核生物細胞の増殖のために便宜上使用される多くの用語は、広く利用される。明細書および請求の範囲、ならびにこのような用語を与えられる範囲の、明確なおよび一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される。

用語「再生」とは、培地が真核生物細胞を拡大する能力またはキャパシティーを増加させることをいう。代表的には、真核生物細胞培養培地、特に無血清培地は、保存時に、細胞の増殖または拡大を支持する能力またはキャパシティーを喪失するかまたは減少する。培地が細胞を増殖または拡大するキャパシティーまたは能力が増加していることを決定することにおいて、抗酸化剤を補充した培地と抗酸化剤を欠くコントロールとの間で比較が行われ得る。本発明によれば、抗酸化剤を含む培地が抗酸化剤を含まない培地よりも大きなレベルの増殖または拡大を容易にする場合、培地が細胞の増殖または拡大を容易にするキャパシティーまたは能力は、増大または増加する。

用語「保存期間」とは、培地の保存中の時間をいう。代表的には、培地は、４℃から25℃で保存されるが、他の保存温度が使用され得る。保存期間が増大または増加するかどうかを決定するにことおいて、特定の培地が細胞増殖または拡大を支持するキャパシティーまたは能力について保存の効果を評価する比較が行われ得る。本発明によれば、保存期間は、抗酸化剤を含む保存した培地が、抗酸化剤を含まずそして抗酸化剤を含む培地と同じ期間保存されるコントロール培地より性能が優れている場合、増大または増加するといわれる。性能は、細胞増殖または拡大のレベルを、抗酸化剤を含む培地およびコントロール培地中のレベルと比較することによって決定される。

用語「アルブミン代替物」とは、アルブミンと実質的に同様の結果を得るために本発明の補充成分においてヒト血清アルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン（BSA）またはAlbuMAX^(R) I）の代わりに使用され得る任意の化合物をいう。アルブミン代替物は、任意のタンパク質またはポリペプチド供給源であり得る。このようなタンパク質またはポリペプチド試料の例は、ウシ下垂体抽出物、植物加水分解物（例えば、イネ加水分解物）、ウシ胎児アルブミン（fetuin）、卵アルブミン、ヒト血清アルブミン（HSA）、または他の動物由来のアルブミン、ヒナ抽出物、ウシ胚抽出物、AlbuMAX^(R)I、およびAlbuMAX^(R) IIを含むが、これらに限定されない。

好ましくは、アルブミンはヒト起源である。最も好ましくは、アルブミンは、ヒト血清アルブミンである。本発明の補充成分および培地では、培養物中で細胞の増殖、拡大、および分化を容易にするアルブミンまたはアルブミン代替物の濃度は、日常的な実験のみを使用して決定され得る。

用語「トランスフェリン代替物」とは、トランスフェリンと実質的に同様の結果を得るために本発明の補充成分においてトランスフェリンに代わり得る任意の化合物をいう。トランスフェリン代替物の例は、任意の鉄キレート化合物を含むがこれに限定されない。使用され得る鉄キレート化合物は、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、エチレングリコール-ビス(β-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸（EGTA）、デフェロキサミンメシレート、ジメルカプトプロパノール、ジエチレントリアミン五酢酸（DPTA）、およびトランス-1,2-ジアミノシクロヘキサン-N,N,N',N'-四酢酸（CDTA）の鉄キレート、ならびにクエン酸第二鉄キレートおよび硫化第一鉄キレートを含むが、これらに限定されない。

好ましくは、トランスフェリンは、鉄飽和トランスフェリンである。最も好ましくは、トランスフェリンは、鉄飽和ヒトトランスフェリンである。本発明の補充成分および培地では、培養物中で細胞の増殖、拡大、および分化を容易にするトランスフェリンまたはトランスフェリン代替物の濃度は、日常的な実験のみを使用して決定され得る。

用語「インスリン代替物」とは、インスリンと実質的に同様の結果を得るために本発明の補充成分においてインスリンの代わりに使用され得る任意の亜鉛含有化合物をいう。インスリン代替物の例は、塩化亜鉛、硝酸亜鉛、臭化亜鉛、および硫酸亜鉛が含まれるが、これらに限定されない。

多くのインスリンが当業者に公知である。Gilman, A.G.ら編, The Pharmacological Basis of Therapeutics, PergamonPress, New York, 1990, 1463-1495頁を参照のこと。好ましくは、インスリン代替物よりもむしろインスリンが、本発明の補充成分および培地に使用される。より好ましくは、インスリンは、亜鉛インスリンである。最も好ましくは、インスリンは、ヒト亜鉛インスリンである。本発明の補充成分および培地では、培養物中で細胞の増殖、拡大、および分化を容易にするインスリン代替物の濃度は、日常的な実験のみを使用して決定され得る。

用語「拡大する」とは、培養物中での造血細胞の増殖および分裂をいい、そして分化をいうのではない。用語「分化」とは、特定の型の細胞の別の型の細胞への発達をいう。多能性造血幹細胞の骨髄前駆体への発達は、分化の一例である。同様に、前駆体細胞の他の型の細胞への発達は、分化の一例である。

用語「抗酸化剤」とは、酸素または過酸化物によって促進される反応を阻害する分子をいう。本発明の補充成分または培地で使用され得る抗酸化剤は、N-アセチル-L-システインまたはその誘導体（国際特許出願WO 95/00136を参照のこと）、2-メルカプトエタノールまたはその誘導体、D,L-酢酸トコフェロールまたはその誘導体、アスコルビン酸またはその誘導体、チオール化合物（例えば、ジチオトレイトールおよびグルタチオン）またはチオール化合物の誘導体、カタラーゼまたはその誘導体、システインまたはその誘導体、チオ乳酸またはその誘導体、ペニシルアミンまたはその誘導体、メルカプトエタンスルホン酸またはその誘導体、およびメルカプトプロピオン酸またはその誘導体を含むが、これらに限定されない。好ましくは、本発明の補充成分および培地で使用される抗酸化剤は、N-アセチル-L-システイン、2-メルカプトエタノール、およびD,L-酢酸トコフェロールあるいはそれらの混合物または誘導体である。

用語「グルココルチコイド」とは、コルチコステロイドのクラスであるミネラルコルチコイドとは反対に、グルココルチコイドにはいるステロイド化合物をいう。この用語は、ヒドロコルチゾン、コルチゾル、デキサメタゾン、およびこれらの化合物の誘導体を含むが、これらに限定されない。Gilman, A.G.ら編, The Pharmacological Basis of Therapeutics, PergamonPress, New York, 1990, 1440-1462頁を参照のこと。好ましくは、本発明のグルココルチコイドは、ヒドロコルチゾンである。

用語「微量元素」とは、微小量のみで細胞培養培地中に存在する成分をいう。本発明では、この用語は、Se^４＋、Ag^＋、Al^３＋、Ba^２＋、Cd^２＋、Co^２＋、Cr^３＋、Ge^４＋、Se^４＋、Br⁻、I⁻、Mn^２＋、F⁻、Si^４＋、V^５＋、Mo^６＋、Ni^２＋、Rb^＋、Sn^２＋、およびZr^４＋、ならびにそれらの塩を含む。好ましくは、微量元素は、本発明の補充成分および培地で使用される。所定の微量元素の任意の塩は、本発明の補充成分または培地を作成するために使用され得る。例えば、酸化セレンのナトリウム塩（亜セレン酸ナトリウム、Na_２SeO_３）は、好ましくは、セレンを提供するために使用される。微量元素含有化合物の適切な濃度は、当業者によって決定され得る。例えば、本発明の培地では、SeO_３ ^２−の濃度は、約0.007〜約0.07mg/Lであり得る。本発明の培地の好ましい実施態様では、SeO_３ ^２−の濃度は、約0.01mg/Lである。

用語「脂質薬剤」とは、脂質の供給源を提供するまたは脂質形成の原因となる薬剤をいう。本発明の補充成分および培地に使用され得る適切な脂質薬剤は、Human Ex-Cyte^(R)（Bayer）、エタノールアミン（またはその塩）、シトステロール（植物ステロイド）、イネ加水分解物（タンパク質および脂質の混合物）、LTIDefined Lipid Mixture、アラキドン酸の混合物、コレステロール、DL-α-酢酸トコフェロール、エチルアルコール、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミトリル酸（palmitricacid）、パルミチン酸、Pluronic^(R) F-68、ステアリン酸、およびTween^(R) 80を含むが、これらに限定されない。好ましくは、HumanEx-Cyte^(R)およびエタノールアミンが、本発明の補充成分および培地に使用される。脂質薬剤成分の適切な濃度は、当業者によって決定され得る。

用語「成分（ingredient）」とは、細胞の成長または増殖を維持または促進するために細胞培養培地で使用され得る、化学的または生物学的起源のいずれかの、任意の化合物をいう。用語「成分（component）」、「栄養」、および「成分（ingredient）」は、交換可能に使用され得、そしてこれらはすべて、このような化合物をいうことを意味する。細胞培養培地中で使用される代表的な成分には、アミノ酸、塩、金属、糖、脂質、核酸、ホルモン、ビタミン、脂肪酸、タンパク質などを含む。エクスビボで細胞の増殖を促進または維持する他の成分は、特定の必要に従って、当業者によって選択され得る。

「細胞培養物」とは、人工的なインビトロ環境で維持、培養、または増殖される細胞または組織を意味する。

「培養容器」とは、ガラス容器、プラスチック容器、または細胞を増殖させるための無菌環境を提供し得る種々のサイズの他の容器を意味する。例えば、フラスコ、シングルまたはマルチウェルプレート、シングルまたはマルチウェルディッシュ、またはマルチウェルマイクロプレートが使用され得る。さらに、バイオリアクターが、細胞を培養するために使用され得る。

用語「細胞培養培地」、「培養培地」、および「培地処方物」とは、細胞を培養または増殖させるための栄養溶液をいう。

用語「培養する（cultivating）」および「培養する（culturing）」は同義である。

用語「容器手段」は、培養容器、ジャー、ボトル、バイアル、ストロー、アンプル、およびクリオチューブを含む。

用語「給養」または「液体交換」とは、細胞が培養される培地を置き換えることをいう。

用語「組み合わせる」とは、細胞培養培地処方物中の成分を混合（mixing）または混合（admixing）することをいう。

用語「接触すること」とは、１つ以上の細胞の１つ以上の化合物、溶液、培地などとの混合、添加、播種、または撹拌をいう。

「無血清」培地は、血清（例えば、ウシ胎児血清（FBS）、ウマ血清、ヤギ血清など）を含まない培地である。

「適合可能な成分」とは、溶液中に維持され得そして「安定な」組み合わせを形成する培地栄養物を意味する。「適合可能な成分」を含む溶液は、成分が、毒性化合物に実質的に減成または分解しない、あるいは培養物中で細胞によって利用または異化代謝され得ない化合物に実質的に減成または分解しない場合、「安定である」という。成分はまた、減成が検出され得ない場合、または１×細胞培養培地処方物中の同じ成分の分解と比較したときにより遅い速度で減成が生じる場合、「安定である」とみなされる。例えば、１×培地処方物中のグルタミンは、ピロリドンカルボン酸およびアンモニアに減成することが公知である。二価カチオンと組み合わせたグルタミンは、分解がある時間にわたりほとんどまたは全く検出され得ないので、「適合可能な成分」であるとみなされる。米国特許第5,474,931号を参照のこと。

細胞培養培地は、多くの成分から構成され、そしてこれらの成分は、培地により変化する。細胞培養培地で使用される各成分は、独特の物理的および化学的特徴を有する。成分の適合性および安定性は、溶液中の成分の「安定性」によって決定される。用語「可溶性」および「可溶な」は、成分が他の成分とともに溶液を形成する能力をいう。従って、成分は、測定可能または検出可能な沈殿を形成することなく溶液中に維持され得る場合に適合可能である。従って、本明細書で使用される用語「適合可能な成分」とは、濃縮されたまたは１×処方物としてのいずれかで溶液に混合された場合に「安定」および「可溶」である、特定の培養培地成分の組み合わせをいう。

「１×処方物」とは、細胞培養培地中に見いだされるいくつかまたはすべての成分を含む任意の水性溶液をいうことを意味する。例えば、「１×処方物」は、その培地のための任意の亜群の成分の細胞培養培地をいい得る。１×溶液中の成分の濃度は、細胞を維持または増殖するために使用される細胞培養処方物中に見いだされる成分の濃度とほぼ同様である。簡単にいうと、細胞を増殖するために使用される培養培地は、定義によって、１×処方物である。多くの成分が存在する場合（適合可能な成分の亜群における場合）、１×処方物中の各成分は、細胞培養培地中の成分の濃度にほぼ等しい濃度を有する。例えば、RPMI 1640培養培地は、他の成分の中に、0.2g/L L-アルギニン、0.05g/L L-アスパラギン、および0.02g/L L-アスパラギン酸を含む。本発明による適合可能な成分である、これらのアミノ酸の「１×処方物」は、溶液中のこれらの成分のほぼ同じ濃度を含む。従って、「１×処方物」という場合、溶液中の各成分が、記載される細胞培養培地に見いだされるのと同じまたはほぼ同じ濃度を有することが意図される。１×処方物中の培地成分の濃度は、当業者に周知である。MethodsFor Preparation of Media, Supplements and Substrate For Serum-Free Animal CellCulture, Allen R. Liss, N.Y. (1984)を参照のこと。

10×処方物とは、溶液中の各成分が細胞培養培地中の同じ成分よりも約10倍濃縮されている溶液をいう。例えば、RPMI1640培地は、数ある中で、0.3g/L L-グルタミンを含む。「10×処方物」は、１×培養培地中で見いだされる約10倍の濃度で多くさらなる成分を含み得る。明らかなように、「25×処方物」、「50×処方物」、および「100×処方物」は、１×細胞培養培地と比較して、それぞれ約25、約50、または約100倍の濃度で成分を含む溶液をいう。

用語「無機塩」とは、Ca^２＋、K^＋、Mg^２＋、Na^＋、CO_３ ^２−、PO_４ ^３−の塩をいう。これらの成分のそれぞれの任意の塩は、本発明の培地を製造するために使用され得る。例えば、以下の塩は、CaCl_２、KCL、KNO_３、MgSO_４、NaCl、NaHCO_３、およびNaH_２PO_４・水が使用され得る。

Ca^２＋、K^＋、Mg^２＋、Na^＋、CO_３ ^２−、およびPO_４ ^３−を含む化合物の濃度の例は、以下のとおりである。本発明の１×培地では、Ca^２＋の濃度は約0.3〜約140mg/Lであり、K^＋の濃度は約0.5〜約250mg/Lであり、Mg^２＋の濃度は約10〜約100mg/Lであり、Na^＋の濃度は約1200〜約3700mg/Lであり、CO_３ ^２−の濃度は約70〜約2900mg/Lであり、そしてPO_４ ^３−の濃度は約７〜約500mg/Lである。好ましい実施態様では、Ca^２＋の濃度は約45mg/Lであり、K^＋の濃度は約170mg/Lであり、Mg^２＋の濃度は約20mg/Lであり、Na^＋の濃度は約1900mg/Lであり、CO_３ ^２−の濃度は約2100mg/Lであり、そしてPO_４ ^３−の濃度は約90mg/Lである。

用語「エネルギー供給源」とは、炭水化物供給源をいう。本発明の補充成分および培地に使用され得る適切なエネルギー供給源には、D-フルクトース、D-マンノース、およびD-ガラクトースが含まれる。好ましくは、使用されるエネルギー供給源はD-グルコースである。

用語「緩衝化剤」とは、水素イオン濃度ならびにこれによって酸および塩基の両方を適度に中和することによって溶液のpHを安定化するために作用する薬剤をいう。本発明の補充成分および培地に使用され得る適切な緩衝化剤には、N-[2-ヒドロキシエチル]ピペラジン-N'-[2-エタンスルホン酸]（HEPES）、β-グリセロールホスフェート、および重炭酸緩衝液が含まれる。好ましくは、本発明の補充成分および培地には、HEPESが使用される。

用語「アミノ酸」とは、アミノ酸またはその誘導体（例えば、アミノ酸アナログ）、ならびにそのD-およびL-形態をいう。このようなアミノ酸の例は、グリシン、L-アラニン、L-アスパラギン、L-システイン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、L-フェニルアラニン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-リジン、L-ロイシン、L-グルタミン、L-アルギニン、L-メチオニン、L-プロリン、L-ヒドロキシプロリン、L-セリン、L-トレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、およびL-バリンを含む。

「CD34^＋造血細胞」または「CD34^＋細胞」は、CD34^＋表面マーカータンパク質を発現する造血細胞である。このような細胞には、造血幹細胞、骨髄前駆または前駆細胞、赤血球系前駆または前駆細胞、およびリンパ前駆または前駆細胞が含まれるが、これらに限定されない。

CD34^＋細胞の富化細胞の調製物は、当業者に周知の方法を使用して、骨髄、末梢血、および新生児臍帯血から得られ得る。種々のシステムが当業者に利用可能である。例えば、MicroCELLectorSystem^(R) (Applied Immune Sciences)、MiniMacs System (Miltenvi Biotec)、StemSep^ＴＭシステム (StemCell Technologies)は、CD34^＋細胞を単離するために使用され得る。より大きなスケールでCD34^＋細胞の豊富な細胞の調製物を調製するために、BaxterHealthcareおよびCellProによって市販されているシステムは、当業者に利用可能である。

用語「造血幹細胞」および「多能性造血幹細胞」とは、骨髄前駆または前駆細胞、赤血球系前駆または前駆細胞、およびリンパ前駆または前駆細胞を含む、造血前駆または前駆細胞の任意の型を生じ得る細胞をいう。造血幹細胞は、CD34^＋/CD33/CD38表現型またはCD34^＋/HLD-DR^＋/CD38^＋表現型を提示する（Daley,J.P.ら, Focus 18:62-67 (1996)；Pimentel, E.編, Handbook of Growth Factors Vol.III: Hematopoietic Growth Factors and Cytokines, 1〜2頁, CRC Press, Boca Raton,FL, 1994）。

細胞の「集団」とは、１つより多くの任意の数の細胞をいう。

用語「組換えCD34^＋造血細胞」とは、核酸分子が導入されそして安定に維持されるようになるCD34^＋造血細胞をいう。核酸分子は、組換えCD34^＋造血細胞の選択の助けになる薬物耐性遺伝子を含み得る。核酸分子およびクローン薬物選択の導入の後、ESクローンは、正確な遺伝子ターゲティングを確かめるためにPCRまたはサザンブロッティング方法のいずれかによって分析される。

用語「核酸構築物」とは、目的のタンパク質をコードする配列を含む核酸分子をいう。好ましくは、核酸構築物は、発現制御配列（すなわち、プロモーターおよび／またはエンハンサー、遺伝子調節タンパク質が結合しそして遺伝子転写への制御を及ぼす調節配列）に作動可能に連結した目的のタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターである。使用され得る発現ベクターは、当業者に周知である。

用語「基本培地」とは、血清または本発明の無血清補充成分のいずれかを補充した場合、CD34^＋造血細胞または他の細胞の増殖を支持し得る任意の培地をいう。基本培地は、標準的無機塩（例えば、亜鉛、鉄、マグネシウム、カルシウム、およびカリウム）、ならびに微量元素、ビタミン、エネルギー供給源、緩衝系、および必須アミノ酸を供給する。本発明で使用され得る基本培地には、Iscove改変Dulbecco培地、RPMI1640、Minimal Essential Medium-α（MEM-α）、および以下に開示される他の培地が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施態様では、基本培地は、Iscove改変Dulbecco培地である。

用語「無血清培養条件」および「無血清条件」とは、任意の血清を除外する細胞培養条件をいう。

本発明は、１つ以上の抗酸化剤、１つ以上のアルブミンまたはアルブミン代替物、１つ以上の脂質薬剤、１つ以上のインスリンまたはインスリン代替物、１つ以上のトランスフェリンまたはトランスフェリン代替物、１つ以上の微量元素、および１つ以上のグルココルチコイドからなる群より選択される１つ以上の成分を含む、無血清の真核生物細胞培養培地補充成分を提供し、ここで、この補充成分を補充した細胞培養基本培地は、無血清培地中で、CD34^＋造血細胞の拡大を支持し得る。

本発明はまた、N-アセチル-L-システイン、ヒト血清アルブミン、HumanEx-Cyte^(R)、エタノールアミンHCl、ヒト亜鉛インスリン、ヒト鉄飽和トランスフェリン、Se^４＋、ヒドロコルチゾン、D,L-酢酸トコフェロール、および2-メルカプトエタノールからなる群より選択される１つ以上の成分を含む、無血清の真核生物細胞培養培地補充成分を特異的に提供する。

成分がCD34^＋造血細胞の増殖を支持すると考えられる濃度範囲は、表１〜３に挙げられる。これらの成分は、本発明の細胞培養培地補充成分を形成するために合わされ得る。当業者に容易に理解されるように、所定の成分の濃度は、開示された範囲の他では増加または減少され得、そして増加または減少した濃度の効果は日常的な実験のみを使用して決定され得る。

本発明の補充成分は、StemPro-34^ＴＭ Nutrient Supplementである。成分の最終濃度を含むこの処方物の定量的説明を表１に示す。本発明の補充成分は濃縮され得る（以下）。好ましくは、本発明の補充成分は、約40×処方物である（表２を参照のこと）。本発明の好ましい実施態様では、濃縮した栄養補充成分は、１×基本培地（例えば、Iscove改変Dulbecco培地）と混合される。

Stempro-34^ＴＭNutrient補充成分の40×処方物を作成するために、Human Ex-Cyte^(R)（Bayer Corp., Kankakee, IL）を、25％ヒトアルブミンに１滴ずつの様式で添加する。この混合物にエタノールアミンHClを、次いで亜セレン酸ナトリウム、ヒドロコルチゾン、およびD,L-酢酸トコフェロールを添加する。次いで、インスリンを0.05MHClに溶解する。次いで、インスリン溶液のpHを9.0に調節し、そして混合物に添加する。次に、ヒトトランスフェリンを、次いで2-メルカプトエタノールを添加する。

N-アセチル-L-システインを２回蒸留した水に溶解する。この時点でのN-アセチル-L-システインのpHは約2.0である。タンパク質変性を防ぐために、N-アセチル-L-システインのpHを、５N水酸化ナトリウムで7.0に調整し、そして混合物に添加する。次いで、混合物全体を、0.2ミクロン低タンパク質結合フィルターを通して濾過する。

本発明の培地は、StemPro^ＴＭ-34無血清培地（SFM）である。１×処方物を形成するための基本培地への添加の後の成分の最終濃度を含むこの処方物の定量的説明を、表３に示す。

好ましくは、本発明の補充成分は約４℃で保存され、そして最も好ましくは、約−20℃で保存されるが、補充成分はより低い温度（例えば、約−80℃）で保存され得る。好ましくは、本発明の培地は約４℃で保存される。本発明の培地が成分N-アセチル-L-システインを含む場合、培地は４℃で18カ月以上保存された後に安定であった。従って、18カ月以上の保存後でさえも、本発明の培地はCD34^＋造血細胞の拡大を支持する。

当業者に明らかなように、成分は溶液中で反応し得る。従って、本発明は、表１〜３のいずれかに開示された処方物、ならびに表１〜３のいずれか１つの成分が合わされた後に形成する任意の反応混合物を包含する。

表３中の補充成分の成分の濃度は、24.8mLの40×補充成分処方物（表２）が１リットルの基本培地で希釈される場合に得られる。あるいは、表３に示す補充成分の成分の濃度は、（基本培地に補充成分を添加することによってよりもむしろ）完全処方物として本発明の培地を作成することによって得られ得る。

本発明の培地の補充成分は、液体形態であり得るかまたは乾燥形態で維持され得る。液体キャリアの型および成分を溶液に溶解するために使用される方法は多様であり、そして日常的な実験のみで当業者によって決定され得る。一般的に、液体キャリアは水である。

本発明の培地の補充成分は、濃縮した処方物（１×〜1000×）としてまたは１×処方物として作成され得る。好ましくは、成分を含む溶液は、１×培地処方物中に同じ成分の濃度よりも濃縮される。例えば、成分は、10倍濃縮（10×処方物）、25倍濃縮（25×処方物）、50倍濃縮（50×濃度）、または100倍濃縮（100×処方物）され得る。特に、本発明の培地の補充成分は、成分を適合可能な濃縮された亜群に分割することによって作成され得る。米国特許第5,474,931号を参照のこと。

補充成分または培地の成分が別々の濃縮された溶液として調製される場合、適切な（十分な）量の各濃縮物は、低濃縮処方物または１×処方物を生じるために希釈物と合わされる。代表的には、使用される亜群についての希釈物は水であるが、水性緩衝液、水性生理食塩溶液、または他の水性溶液を含む他の溶液は、本発明に従って使用され得る。

本発明の補充成分または培地または濃縮した処方物（水性および乾燥の両方の形態）は、代表的には、望ましくない夾雑を防ぐために滅菌される。滅菌は、例えば、紫外線、濾過、または加熱によって行われ得る。

ヒト起源（例えば、ヒト血清アルブミン、トランスフェリン、およびEx-Cyte^(R)）である本発明の補充成分の成分のすべては、使用前に、60℃で10時間加熱することによって熱処理される。

本発明の40×補充成分の浸透圧は、約200〜約400mOsmの範囲であり得、そして好ましくは約250〜約350mOsmである。40×補充成分のpHは、約６〜約８の範囲であり得、好ましくは約6.4〜約7.4である。本発明の培地の浸透圧は、約200〜約400の範囲であり得、そして好ましくは約270〜約310mOsmである。本発明の培地のpHは、約６〜約８の範囲であり得、そして好ましくは約6.8〜約7.3である。

当業者は、造血細胞を培養する方法に精通している。例えば、造血細胞培養についての指針は、Freshney, R.I.ら編, Culture of Hematopoietic Cells, Wiley-Liss, NewYork, 1994, 81〜98頁に概説される。

本発明はまた、１つ以上の容器手段（例えば、バイアル、チューブ、アンプル、ジャーなど）をそこに密接した制限で受けるために仕切られているキャリア手段（例えば、ボックスまたはカートン）を含むキットを提供し、ここで、第１の容器手段は本発明の補充成分を含む。必要に応じて、第２の容器手段は基本培地を含む。好ましくは、本発明の補充成分を含む容器は、約−135℃〜約４℃、好ましくは約−５℃〜−80℃、最も好ましくは約−５℃〜−20℃、およびさらにより好ましくは約−20℃で保存され得る。本発明の培地を含む容器は、好ましくは、約２℃〜約８℃で、および最も好ましくは約４℃で保存される。

本発明はまた、無血清培地中のCD34^＋造血細胞を含む組成物を提供し、ここで、本発明の無血清補充成分が補充される無血清培地は、無血清培養物中にCD34^＋造血細胞の増殖を支持し得る。この組成物のアリコートは、約−80℃およびそれ以下で凍結され得る。この組成物のアリコートは、約−135℃以下で無限に保存され得る。組成物のアリコートが融解および開封された後、滅菌細胞培養技法を使用して、CD34^＋造血細胞は無血清培養物中で培養され得る。CD34^＋または等価の造血細胞が得られ得る動物は、ヒト、サル、類人猿、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、モルモット、ウシ、ブタ、イヌ、ウマ、ネコ、ヤギ、およびヒツジを含む。等価な造血細胞は、表面マーカータンパク質の発現に基づいて、当業者に造血幹細胞とみなされる非ヒト種からの細胞である。

後日の使用のために造血細胞を凍結することもまた日常的である。一般的に、凍結させる培地は、５〜10％DMSO、10〜90％FBS、および55〜85％真核生物細胞培養培地からなる。本発明の補充成分は、低温保存および再構成の目的のための血清代替物として使用され得る。本発明の補充成分でのこのような細胞の低温保存のための条件は、0.5〜95％補充成分、１〜10％の低温保護剤（例えば、ジメチルスルホキシド（DMSO））、および１〜90％の基本培地を含む。CD34^＋造血細胞は、約−80℃以下でこのような条件下で凍結され得る。CD34^＋造血細胞は、約−135℃以下の温度で無限に凍結したままであり得る。

本発明の培地は、CD34^＋造血細胞の拡大および／または分化を容易にするために、増殖因子または他のサイトカインが補充され得る。CD34^＋造血細胞は、CD34^＋造血細胞の拡大を容易にするためまたは特定の型の細胞への分化を誘導するために、特異的因子とともにインキュベートされ得る。このような因子は、当業者に周知である。このような因子には、インターロイキン、サイトカイン、コロニー刺激因子、増殖因子、およびインターフェロンが含まれるが、これらに限定されない。このような因子の例には、幹細胞因子、インターロイキン（IL）（例えば、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、CSF、G-CSF、トロンボポエチン（TPO）、GM-CSF、エリスロポエチン（EPO）、Flt3、Flt2、PIXY321、および白血病阻害因子（LIF）が含まれるが、これらに限定されない。このような因子は、CD34^＋幹細胞を拡大するために、または幹細胞を異なる細胞型に分化させるための分化因子として使用され得る。

本発明はまた、CD34^＋造血細胞を哺乳動物に提供する方法を提供し、この方法は、CD34^＋造血細胞を本発明の培地と接触させる工程、無血清培養物中で細胞の拡大を容易にするために適切な条件下で細胞を培養する工程、およびこの拡大した細胞を哺乳動物に導入する工程を包含する。

本発明の無血清補充成分はまた、哺乳動物への外移植のための目的の造血細胞型を調製するために使用され得る。この実施態様では、分化を引き起こしている細胞（前出）は、哺乳動物に導入される。例えば、造血幹、前駆体（precursor）、または前駆体細胞への分化を引き起こしているCD34^＋造血細胞は、哺乳動物の骨髄または血流に導入され得る。CD34^＋または分化した細胞は、例えば、周知の技法によって、哺乳動物の骨髄または血流に導入され得る。

ここで本発明を十分に説明したので、本発明は、例示のみの目的で本明細書に含まれるある特定の実施例への参照によってより明らかに理解され、そして本発明の限定を意図しない。

（実施例１）
（実験方法）
以下の実施例において、他に指示がなければ、骨髄細胞を得る方法、CD34^＋細胞を選択する方法、細胞増殖をアッセイする方法、およびフローサイトメトリーアッセイの方法を、この実施例に記載のように行った。

（骨髄細胞）
骨髄を、スクリーニングした正常ドナーの群から得た（Roswell Park Cancer Instituteの好意）。髄質を、後部腸骨稜から吸引し、そして滅菌ヘパリン化チューブに入れた。研究室では、約25mLのヘパリン化骨髄を、等量のハンクス平衡塩溶液（カルシウムまたはマグネシウムを含まない）（LifeTechnologies, Gaithersburg, MD）で希釈し、そして50mLチューブ中のNycoprep^ＴＭ 1.077（LifeTechnologies）上に注意深く積層した。次いで、サンプルを室温で30分間、800×gにて遠心分離した。遠心分離後、界面での骨髄単球細胞（BMMC）のバンドをピペッティングによって取り出した。細胞を、ハンクス平衡塩溶液（カルシウムまたはマグネシウムを含まない）で１回洗浄し、そしてヘモサイトメーター（細胞生存性を測定するためにトリパンブルー染料排除を使用する）を使用して計数した。

（CD34^＋細胞選択）
いくつかの実験については、CD34^＋細胞を、製造者の指示に従ってMicroCELLector^(R) Systemを使用して分離した。簡単にいえば、BMMCの非接着画分を、SoybeanAgglutinin MicroCELLector^(R)フラスコでのインキュベーション後に集めた。細胞を、Iscove改変Dulbecco培地（IMDM）で洗浄した。

いくつかの実験については、CD34^＋細胞を、製造者の指示に従ってMiniMACSシステムを使用して分離した。簡単にいえば、単核になった細胞を、300μlの緩衝液（PBS／0.5％ヒト血清アルブミン／ACD溶液1:10）中に10^８細胞の濃度で懸濁した。CD34 Isolation Kitからのブロッキング試薬および抗体試薬を、懸濁液に同時に添加した。懸濁液を十分に混合し、そして６〜12℃で15分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を、1200RPMで10分間の遠心分離によって緩衝液中で洗浄した。上清を除去し、そして細胞ペレットを400μlの緩衝液に再懸濁した。超顕微鏡的磁性ビーズのコロイド状懸濁液を細胞に添加した。細胞を混合し、そして６〜12℃で15分間インキュベートした。細胞を、遠心分離によって再度洗浄し、上清を除去し、そして細胞を500μlの緩衝液に再懸濁した。分離カラムを、２mLの緩衝液でリンスすることによって調製し、そして磁界中に置いた。細胞をカラムにアプライし、そして重力によって溶出した。CD34^＋細胞をカラムに保持した。カラムを２mLの緩衝液でリンスした。CD34^＋細胞を、カラムを磁界から取り出し、そしてカラムを２mLの緩衝液で洗い流すことによって溶出した。

（CD34^＋細胞培養）
所定の実験については、使用されるCD34^＋細胞は、上記の方法の１つのみによって単離されている細胞であった。他に指示がなければ、CD34^＋細胞を、５％CO_２／95％空気雰囲気中37℃にてインキュベートした。細胞を、ヘモサイトメーターを使用して計数した。細胞生存性を、細胞がトリパンブルー染料を排除する能力によって評価した。

（細胞増殖アッセイ）
CD34^＋細胞を、組換え増殖因子を補充したStemPro-34^ＴＭSFM（Life Technologies）または20％ウシ胎児血清および組換え増殖因子を補充したIMDMのいずれか中で６〜８日間培養した。他に指示がなければ、組換え増殖因子を、細胞培養実験のセットアップの最初に添加した。

細胞を、24ウェル培養プレート中に２×10^４細胞／mL（１×10^４細胞／cm^２）の初期密度で、栄養を追加せずに播種した。インキュベーション期間の最後に、細胞を採取し、そして細胞拡大をヘモサイトメーター計数によって決定した。採取した細胞のアリコートを、コロニー形成単位アッセイおよび蛍光活性化セルソーティングによる表現型分析におけるさらなる分析のために取り出した。

新たに選択したまたは培養した細胞集団を、以下のように蛍光色素標識したモ （フローサイトメトリー）
ノクローナル抗体で染色した。細胞のアリコートを、マウスIgGとともに15分間氷上でインキュベートして、非特異的結合部位をブロックした。次いで、細胞を、FITC-またはPE-のいずれかを結合したモノクローナル抗体を含む12×75mmポリスチレンチューブに添加した。これらのチューブを混合し、そして30〜45分間氷上でインキュベートした。次いで、染色した細胞を、Dulbeccoリン酸緩衝生理的食塩水(DPBS)で１回洗浄し、そして２％ホルマリン／DPBSで固定した。分析を、FACSort装置（Becton Dickinson (BD)）を使用して行った。蛍光色素結合した抗体の標準パネルは、抗CD34/HPCA-2(BD)、抗CD14/Mφp9(BD)、抗CD38/T16(Immunotech,Inc.)、抗CD13/366(Coulter Corp.)、および抗CD33/906(Coulter)である。

（実施例２）
（無血清培養条件下でのCD34^＋選択した細胞の増殖）
CD34^＋細胞が種々の培養条件下で拡大および分化する能力を研究するために、CD34^＋細胞を、正常ドナー骨髄から選択した。最初に、1.3％の総骨髄細胞が、報告された値（Cinin,C.I.ら, J. Immunol. 133:157 (1984)）と一致してCD34^＋であった（表４）。選択プロセスは、新たに吸引した正常骨髄細胞で１％から64％までCD34^＋細胞を富化した。

血清の不在は、細胞拡大における初期作用または後期作用造血増殖因子の効果の研究を可能にする。ヒト組換えサイトカインの種々の組み合わせを、増殖を支持する能力について検査した（表５）。StemPro-34^ＴＭ SFMを使用すると、混同する血清の効果の不在において、用いられる増殖因子の組み合わせを変更することによって、種々の程度の細胞増殖を刺激することが可能であった。

予備研究では、幹細胞因子単独は、無血清条件下で拡大に影響を与えなかった（データを示さず）。初期作用（例えば、SCF、IL-1、IL-3）および中期作用（例えば、IL-6）多面的サイトカインの組み合わせの添加は、無血清条件下で僅かな増殖促進効果を有した（表５）。細胞拡大の刺激は、造血で役割を演じる初期（SCF、IL-3）、中期（IL-6）、および後期（GM-CSF、EPO）作用分化因子の組み合わせを必要とした。

データは平均±S.E.M.である。
選択したCD34^＋細胞の純度％を、FACS分析によって決定した。

種々のサイトカインでのStemPro-34^ＴＭ SFM中の拡大指標を、20％FBS、SCF、IL-3、およびGM-CSFを補充したIMDM中で培養した細胞の拡大指標と比較した（表５）。この増殖因子カクテル（SCF、IL-3、およびGM-CSF）は、血清補充培地中で造血細胞を培養する場合に普通に使用される（Haycock,D.N.ら, Blood 80:1405 (1992)）。

データは代表的研究である。
^１ 拡大指標は、等式：７日目の細胞÷２×10^４によって決定される細胞集団の増幅のレベルを示す。
^２ ％FBS＝７日目の実験群細胞÷７日目のFBSコントロール群の細胞×100％（FBSコントロールはIMDM＋20％FBS＋SCF＋IL-3＋GM-CSF中で培養された細胞である）
（実施例３）
（CD34^＋細胞拡大の動態）
StemPro-34^ＴＭSFM中での細胞拡大の動態を、血清含有培地中での細胞拡大の動態と比較した。CD34^＋骨髄細胞を、24ウェルプレートに２×10^４細胞／ウェルの初期濃度で播種した。ヒト組換え因子SCF（100ng/mL）、IL-3（50ng/mL）、およびGM-CSF（25ng/mL）の最終濃度を、セットアップ時にStemPro^ＴＭ-34SFMまたはIMDM／20％FBSのいずれかに添加した。示した日に、ウェルを採取し、そして細胞を、ヘモサイトメーターおよびトリパンブルー染料排除を使用して計数した。結果を図１に示す。

StemPro-34^ＴＭSFMおよび血清を補充した培養物の両方において、初期誘導期（約３日）を、細胞拡大に先立って観察した。この初期誘導期は、大多数の造血幹細胞（すなわち、CD34^＋/CD33⁻/CD38⁻）が、静止Ｇ_０期にありそして拡大およびその後の分化のための刺激シグナルを必要とするという実験的観察を反映し得る（Traycoff,C.M.ら, Exp. Hematol. 22:1264 (1994)）。10日後、血清を補充した培養物と比較して、StemPro-34^ＴＭSFMでは約３倍多い細胞があった。

細胞倍加時間を、図１の曲線の対数増殖期の回帰直線から算出した。StemPro-34^ＴＭ SFMでは、細胞は、43時間の倍加時間を示した。血清を補充した培地では、倍加時間は72時間であった。これらの倍加時間は、総集団動態を反映する。細胞集団は、細胞が増殖するだけでなく分化シグナルに応答しているので、対数増殖の間は不均一である。

本発明の補充成分または培地が、適切な増殖因子と組み合わせて、増殖因子の同じ組み合わせが血清を補充した培地に添加される場合に得られるレベルよりも約3.5倍高いレベルへの造血前駆細胞（すなわち、CD34^＋細胞）の拡大を容易にすることは、当業者に容易に理解される。従って、血清に存在する見かけのおよび不確定な成分の不在下で、組み換えサイトカインの組み合わせに対する真の増殖応答を測定し得る。

（実施例４）
（CD34^＋細胞の拡大）
細胞拡大中のCD34^＋細胞集団の変化を検査した。CD34^＋骨髄細胞を、24ウェル平底プレートに１mL当たり２×10^４細胞で播種し、そしてStemPro^ＴＭ-34SFMまたはIMDM＋20％FBSのいずれか中で６〜８日間培養した。すべての培養物に、セットアップ時にヒト組換え増殖因子SCF（100ng/mL）、IL-3（50ng/mL）、およびGM-CSF（25ng/mL）の最終濃度を補充した。総細胞計数を、ヘモサイトメーターおよびトリパンブルー染料排除によって決定した。CD34^＋細胞をFACSによって計数した。

図２に示すように、StemPro-34^ＴＭ SFMでは、細胞のCD34^＋集団は３倍増加し、そして細胞の総集団は約22倍増加する。逆に、血清を補充した培地では、細胞のCD34^＋集団は、実際に３％減少したが、総細胞集団は約13倍増加した。従って、本発明の補充成分および培地は、培養物中でのCD34^＋細胞の拡大を支持する。これらの結果は、今日までのところ、培養物中でのCD34^＋細胞の拡大を示す最初のものである。

StemPro-34^ＴＭSFMでのCD34^＋細胞集団を、いくつかの細胞表面マーカーについて分析した（表６）。使用したサイトカインのカクテルは、初期骨髄前駆細胞によって発現されるタンパク質であるCD13抗原の増加によって示されるように、骨髄細胞の拡大を刺激する。

^１ データは、陽性細胞のパーセントである。データは、Ｎ＝10についての平均±S.E.M.として示される。

StemPro-34^ＴＭSFMでの増殖の６日後に存在するCD34^＋細胞の形態学的特徴は、細胞の骨髄性質を反映する。Wright-Giemsa染色した細胞の細胞質は、強い好塩基性特性、大きな核対細胞質比、微妙なクロマチンパターン、および明確に見える核小体を提示する（Daley,J.P.ら, Focus 18:62-67 (1996)）。

（実施例５）
（拡大における増殖因子添加の効果）
本発明の補充成分および培地の有利な効果を、図３にさらに示す。正常骨髄からのCD34^＋選択した細胞を、StemPro^ＴＭ-34中に１mL当たり２×10^４細胞の密度でプレーティングした。ヒト組換え増殖因子を、示した日（d）の100ng/mLSCF、50ng/mL IL-3、および25ng/mL GM-CSFの最終濃度まで添加し、そして細胞を７日間インキュベートした。拡大指標を、（７日目の細胞密度÷初期播種密度）として算出した。拡大指標は、20％FBSを補充したIMDMと比較して、StemPro-34^ＴＭSFMで約４倍であった。

（実施例６）
（拡大における増殖因子添加の効果）
図３の結果は、StemPro-34^ＴＭが細胞拡大に関して非常に大きな制御を可能にすることを示す。同様の結果を図４に示す。新たに採取された正常骨髄からのCD34^＋選択した細胞を、StemPro^ＴＭ-34またはIMDM＋20％FBS中で１mL当たり２×10^４細胞の播種密度で培養した。示すように、ヒト組換え増殖因子を、培養セットアップ時またはセットアップの３日後のいずれかに、100ng/mLSCF、50ng/mL IL-3、25ng/mL GM-CSF、および12ユニット/mL EPOの最終濃度まで添加した。培養の７日後、細胞を採取し、計数し、そして細胞のアリコートをFACS分析のために染色した。図４では、CD34⁻細胞は、本発明の補充成分および培地によって支持される分化された細胞である。このような細胞は、赤血球前駆体（例えば、BFU-E細胞）および骨髄前駆体（例えば、CFU-GMおよびCFU-G細胞）である。

（実施例７）
（BFU-E細胞発生における増殖因子の効果）
エリスロポエチン（EPO）およびインターロイキン６（IL-6）は、CD34^＋造血細胞のBFU-E細胞への分化を刺激する。CD34^＋細胞の分化を、StemPro-34^ＴＭSFMを使用して評価した。正常骨髄からのCD34^＋選択した細胞を、ヒト組換えサイトカイン（SCF（100ng/mL）、IL-3（50ng/mL）、GM-CSF（25ng/mL）、IL-6（20ng/mL）（最終濃度））および図５の挿入図に示すEPOの濃度の組み合わせを使用して、指示された培地中で２×10^４細胞/mLの密度で（３連で）プレーティングした。

培養の７日後、拡大した細胞集団のアリコートを、次いでメチルセルロースCFUアッセイでプレーティングした。簡単にいえば、コロニー形成単位機能についてアッセイされる細胞を、プレーティングの前にIMDMに希釈した。新たに選択したCD34^＋細胞を、１×10^３細胞／ウェルの播種密度でプレーティングした。６〜８日間の培養後、細胞を、２×10^４細胞／ウェルの播種密度でプレーティングした。コロニーを、標準メチルセルロースシステム（StemProComplete Methylcellulose Medium, Life Technologies）を使用するBFU-EおよびCFU-GMコロニーについて、培養の14日目に計数した。図５に示すデータはBFU-E細胞についてである。

血清は、BFU-Eコロニー発生を促進する不確定成分を含む（Migliaccio,G.ら, Expl. Hematol. 18:1049 (1990)）。従って、EPOおよびIL-6の効果は、不可能でない場合、血清を補充した培地を使用して解釈することは困難である。従って、本発明の補充成分および培地が、造血細胞分化の制御した研究を容易にすることは、当業者には明らかである。

（実施例８）
（種々の補充成分の成分の最適化）
処方物の補充成分および培地のいくつかの成分は、種々の濃度の範囲にわたって機能的活性を有することを示した。これらの成分には、トランスフェリン、ヒト血清アルブミン、Human Ex-Cyte^(R)、2-メルカプトエタノール、およびN-アセチル-L-システインが含まれた。

Ａ．トランスフェリン
正常ヒト骨髄細胞を、StemPro-34^ＴＭ SMF培地中で培養し、これにトランスフェリンを図６に示す最終濃度まで添加した。培養の６日後に、細胞を採取しそして計数した。100μg/mLヒトトランスフェリンの濃度が最適となった。しかし、示したように、他の濃度のヒトトランスフェリンは細胞増殖を支持する。

Ｂ．HumanEx-Cyte^(R)
CD34^＋細胞を、Stem-Pro-34^ＴＭSFM中で培養し、これに種々の脂質／脂肪酸混合物を図７に示す最終濃度まで添加した。培養の６〜７日後に、細胞を採取しそして計数した。

HumanEx-Cyte^(R)によって供給されるような、脂質および脂肪酸の組み合わせは、Human Ex-Cyte^(R)が図７に示すように５mg/L（５μg/mL）の範囲で存在した場合、最適に作用した。HumanEx-Cyte^(R)は、Kabi Pharmaceuticalsによって「Intralipids」として供給される、LDLおよび脂質の組み合わせと同様に作用した。

Ｃ．2-メルカプトエタノール
CD34^＋細胞を、0.05mM2-メルカプトエタノール（最終濃度）を含むまたは含まないStemPro-34^ＴＭ SFM中で培養した。培養の６〜７日後、細胞を採取および計数した。結果を図８に示す。4.34mg/Lの最終濃度で使用した抗酸化剤の2-メルカプトエタノールは、性能を約２倍増大した。

Ｄ．ヒト血清アルブミン濃度
CD34^＋細胞を、StemPro-34^ＴＭSFM中で培養し、これに図９に示すヒト血清アルブミンおよびHuman Ex-Cyteの最終濃度を添加した。培養の６〜７日後、細胞を採取および計数した。本発明の好ましい実施態様では、HumanEx-Cyte^(R)が５mg/Lの濃度で使用される場合、ヒト血清アルブミンは５mg/Lの最終濃度で用いられる。

（実施例９）
（長期性能についてのN-アセチル-L-システインの必要性の同定）
アンモニアは、造血細胞に毒性である成分である。培養物中で、アンモニアは、アンモニウムイオン（NH_４ ^＋）の形態をとる。図10に示すように、アンモニウムイオンは、液体処方物中で自発的に破壊される。細胞拡大におけるアンモニウムイオン濃度の効果を評価した。CD34^＋細胞を、24ウェル平底プレートに、２×10^４細胞／ウェルの初期濃度で２連で播種した。これらの実験に使用した培地を新たに作成し、そしてアンモニウムを示した濃度で培地中に滴定した。次いで、すべてのウェルに、ヒト組換えSCF100ng/mL、IL-3 50ng/mL、およびGM-CSF 25ng/mL（最終濃度）を補充した。培養の６日後、細胞を採取し、そしてアンモニウム濃度を、較正アンモニウムプローブを使用して決定した。

さらに、図11に示すように、細胞自体は、ある時間にわたりさらに多くのアンモニウムを生成する。CD34^＋細胞を、24ウェル平底プレートに、２×10^４細胞／ウェルの初期濃度で２連で播種した。示した時間間隔で、培地のアリコートを、較正したアンモニウムプローブを使用してアンモニウムについて分析した。培地のアリコートはまた、ヘモサイトメーターによる細胞計数を行った。

さらに、酸化種は、光と光感受性ビタミンとの相互作用によって生成される。さらに、反応性脂質および脂肪酸の酸化は、無血清培地が培養物中で造血細胞の増殖および拡大を支持する能力における時間依存的衰弱を導く。従って、任意の培地の保存期間は厳しく限定される。本発明によって提供される有利点は、本発明の補充成分および培地の長い保存期間である。発明者らは、本発明の補充成分または培地への抗酸化剤（好ましくは、N-アセチル-L-システインまたはその誘導体）の添加により劇的に長くなった保存期間を生じることを見出した。

N-アセチル-L-システインを含まずに処方された培地は、その製造の約12〜16週後の性能に顕著な衰退を示す。図12からわかり得るように、「古くなった」不活性化培地へのN-アセチル-L-システインの添加は、培地の性能を改善する。正常骨髄からのCD34^＋選択した細胞を、図12に示した時間に、N-アセチル-L-システインを含むまたは含まずに処方したStemPro-34^ＴＭSFM中に２×10^４細胞／mLの密度でプレーティングした。すべての培養物に、組換えヒト増殖因子SCF（100ng/mL）、IL-3（50ng/mL）、およびGM-CSF（25ng/mL）（最終濃度）を補充した。

本発明の好ましい実施態様では、1.0mM（164mg/L）N-アセチル-L-システインの添加の最終濃度を使用する。しかし、図13の結果は、N-アセチル-L-システインが濃度の範囲で培地の性能を増加させることを示す。補充成分または培地が処方される時の本発明の補充成分または培地へのN-アセチル-L-システインの包含は、補充成分および培地の保存期間を増加させる。

（実施例１０）
本発明の補充成分は、造血細胞を培養するための多くの異なる基本培地のいずれかと使用され得る。正常骨髄からのCD34^＋選択した細胞を、RPMI 1640、MEM-α、IMDM、Medium 199、NCTC 109、またはHam'sF10培地中に２×10^４細胞／mLの密度でプレーティングした。これらの培地のそれぞれは、Life Technologies, Inc.から購入され得る。すべての培養物に、組換えヒト増殖因子SCF（100ng/mL）、IL-3（50ng/mL）、およびGM-CSF（25ng/mL）（最終濃度）を補充した。図14に示すように、多くの培地処方物は、CD34⁻細胞の増殖および拡大を支持するために本発明の補充成分とともに使用され得る。

すべての刊行物、特許出願、および特許は、個々の刊行物、特許出願、または特許が、参考として援用されることが特におよび個々に指示された場合と同様の範囲まで参考として本明細書に援用される。

上記の発明が、理解の明確さの目的のために説明および実施例によって詳細に記載されているが、ある変化および改変が添付の請求の範囲の範囲内で実施され得ることが明らかである。

図１は、血清の効果と比較した、CD34^＋造血細胞が富化された集団の増殖因子誘導性拡大の動態における無血清StemPro-34^ＴＭ培地の効果を示す。 図２は、血清の効果と比較した、CD34^＋細胞が富化された集団由来のCD34^＋細胞の優先的拡大における無血清StemPro-34^ＴＭ培地の効果を示す。 図３は、血清の効果と比較した、骨髄細胞の拡大指標における無血清StemPro-34^ＴＭ培地の効果を示す。 図４Ａは、無血清および血清を補充した培養条件下での総細胞拡大およびCD34^＋細胞拡大の両方における増殖因子添加の効果を示す。 図４Ｂは、無血清および血清を補充した培養条件下での総細胞拡大およびCD34^＋細胞拡大の両方における増殖因子添加の効果を示す。 図５は、無血清および血清を補充した培地での赤血球系芽球形成単位（BFU-E）細胞の発生における組換え増殖因子の効果を示す。 図６は、トランスフェリンの濃度が最適化された実験の結果を示す。 図７は、HumanEx-Cyte^(R)の脂質および脂肪酸に対する最適化および等価性を示す実験結果を示す。 図８は、無血清培養におけるヒト骨髄細胞の拡大について、2-メルカプトエタノールの効果を示す。 図９は、CD34^＋細胞の拡大におけるヒト血清アルブミン濃度の効果を示す。 図１０は、CD34^＋選択された細胞の増殖におけるアンモニウムイオン濃度の効果を示す。 図１１は、細胞拡大の関数としてのアンモニアの生成の相関関係を示す。 図１２は、本発明の無血清培地の最適長期性能に対するN-アセチル-L-システインの必要性を反映する。 図１３は、本発明の無血清補充成分の性能におけるN-アセチル-L-システイン濃度の効果を示す。 図１４は、本発明の無血清補充成分を使用するヒト骨髄細胞の拡大における基本培地処方物の効果を示す。

Claims (1)

1. 無血清の真核生物細胞培養培地補充成分であって、ここで、該補充成分を補充した基本細胞培養培地が、CD34^＋造血細胞の拡大を支持し得る、無血清の真核
   生物細胞培養培地補充成分。

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