JP2006028047A - インターロイキン１２産生促進剤およびその製造法 - Google Patents

Abstract

【課題】
インターロイキン１２産生促進剤およびその製造法の提供
【解決手段】（１）テトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属もしくはロイコノストック属に属する乳酸菌の培養物、菌体または菌体成分を有効成分とするインターロイキン１２産生促進剤。（２）前記の剤を含む、飲食品、医薬品または化粧品。（３）テトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属もしくはロイコノストック属に属する乳酸菌を塩分０％〜２５％好ましくは５％〜１５％の乳酸菌用培地で培養し、得られた培養物、菌体または菌体成分を有効成分とすることを特徴とするインターロイキン１２産生促進剤の製造法。

Description

本発明は、乳酸菌に属するテトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属もしくはロイコノストック属の菌体またはその処理物を含んでなるインターロイキン１２産生促進剤およびその製造法に関する。

生体内の免疫系は、細菌、酵母、カビ、ウイルスなどの微生物による感染や、腫瘍に対する防御、アレルギーの発症に重要な役割を果たしており、その防御機構の中心はリンパ球とマクロファージである。リンパ球とマクロファージは抗原特異的、また、抗原非特異的に活性化され、異物を排除する能力を高める。リンパ球やマクロファージの活性化において、インターロイキン１２は、ＮＫ細胞やＴ細胞に作用してインターフェロンγや腫瘍壊死因子αの産生を誘導し、マクロファージを活性化すること、ＮＫ細胞およびＣＤ８⁺Ｔ細胞の細胞障害活性を増強すること、インターロイキン２と相乗的に作用して細胞障害性リンパ球を活性化するとともにリンホカイン活性化キラー細胞を誘導すること、細胞性免疫を補助するヘルパーＴ細胞（Ｔｈ０）のＴｈ１タイプへの分化や、そのバランス（Ｔｈ１／Ｔｈ２）の制御にも関与していることが知られている。このようにインターロイキン１２は自然免疫ならびに細胞性免疫の強化による感染防御、抗腫瘍活性、また、アレルギー予防など免疫賦活活性増強において重要な役割を担っている。免疫賦活能を有するプロバイオティクス乳酸菌として市販されている乳酸菌には、ストレプトコッカス（Streptococcus ）属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する乳酸菌等が挙げられる。これらの乳酸菌は乳製品（ヨーグルト、ヨーグルト飲料等）の発酵に用いられている。従来、乳酸菌を有効成分とする免疫賦活剤や抗アレルギー剤は公知である（特許文献１〜１２参照。）。しかしながら、現在用いられている免疫賦活剤は、微生物感染、腫瘍等に対する生体の防御機構、アレルギー予防効果を高めるものであるが、有効性において必ずしも満足しうるものではない。

特開平６−８０５７５号公報「経口免疫賦活剤」 特開平９−２２７３９２号公報「抗腫瘍剤及びその製造法」 特開平７−２２８５３６号公報「乳酸菌を用いた免疫賦活剤」 特開平１０−１６７９７２号公報「免疫賦活剤」 特開平８−９９８８７号公報「免疫賦活剤」 特開平５−２５２９００号公報「免疫賦活組成物」 特開２００３−１１３１１４号公報「免疫賦活素材」 特開２００４−２６７２９号公報「抗アレルギー剤」 特開２００４−１８４６９号公報「抗アレルギー剤」 特開２０００−９５６９７号公報「抗アレルギー剤」 特開平１０−３０９１７８号公報「ビフィズス菌を有効成分とする抗アレルギー 剤および醗酵食品」 特願平７−１７２９４９号公報「ＩｇＥ抗体産生抑制剤および抗アレルギー 剤」

本発明の課題は、乳酸菌を利用するインターロイキン１２産生促進剤およびその製造法を提供することにある。Ｔｈ１細胞応答を誘導して、Ｔｈ２細胞応答を抑制することでＴｈ１／Ｔｈ２細胞のバランスを正常に戻すことが可能な、新規インターロイキン１２産生促進剤を提供する。

乳酸菌には乳原料に依存して生育するものだけでなく穀物、野菜や果実等植物素材を生育素材として発酵させるものが知られている。植物素材を生育素材にする乳酸菌発酵には、味噌や醤油のように蒸煮大豆、小麦を比較的高塩濃度の食塩とともに発酵させるものなどがあげられる。

本発明者らは、前記課題を解決するためインターロイキン１２産生促進剤に関する研究を重ねたところ、乳酸菌の１種であるテトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属もしくはロイコノストック属の菌体がマクロファージのインターロイキン１２の産生を促進する作用を有していることを明らかにした。すなわち、テトラジェノコッカス属の菌体は、腫瘍細胞傷害性を有するナチュラルキラー細胞を活性化するサイトカインであるインターロイキン１２のマクロファージからの産生を高める結果、細菌、酵母、カビ、ウイルスなどの微生物による感染、腫瘍に対する防御能や、アレルギーの防御活性を特に高める。テトラジェノコッカス・ハロフィラＫＫ２２１株菌体、ペディオコッカス・ペントサセウス ＴＵＡ０１２２株菌体、ペディオコッカス・アシデラクテシィ ＴＵＡ０１２４株菌体、ロイコノストック・メセントロイデス ＮＩＳＬ７２０１株菌体、もしくは、ロイコノストック・メセントロイデス ＮＩＳＬ７２１９株菌体は副作用がなく常用に適したインターロイキン１２産生促進剤であり、またマクロファージによるインターロイキン１２の産生を促進するので他の免疫賦活剤や抗アレルギー剤との併用も有効であることを見いだし、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、（１）テトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属もしくはロイコノストック属に属する乳酸菌の培養物、菌体または菌体成分を有効成分とするインターロイキン１２産生促進剤、（２）テトラジェノコッカス・ハロフィラ、ペディオコッカス・ペントサセウス、ペディオコッカス・アシデラクテシィもしくはロイコノストック・メセントロイデスに属する乳酸菌の培養物、菌体または菌体成分を有効成分とするインターロイキン１２産生促進剤、（３）乳酸菌がテトラジェノコッカス・ハロフィラＫＫ２２１株、ペディオコッカス・ペントサセウス ＴＵＡ０１２２株、ペディオコッカス・アシデラクテシィ ＴＵＡ０１２４株、ロイコノストック・メセントロイデス ＮＩＳＬ７２０１株、もしくは、ロイコノストック・メセントロイデス ＮＩＳＬ７２１９株である前記のインターロイキン１２産生促進剤、（４）培養物が、トマト果汁、パイナップル果汁等の果汁飲料、豆乳飲料、または野菜飲料を含む培地でテトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属もしくはロイコノストック属に属する乳酸菌を培養し得られたもの、もしくは添加したものである、前記のインターロイキン１２産生促進剤、（５）前記の剤を含む、飲食品、医薬品または化粧品、（６）テトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属もしくはロイコノストック属に属する乳酸菌を塩分０％〜２５％好ましくは５％〜１５％の乳酸菌用培地で培養し、得られた培養物、菌体または菌体成分を有効成分とするインターロイキン１２産生促進剤の製造法。

本発明のインターロイキン１２産生促進剤は、他の乳酸菌より、インターロイキン１２の産生を促進する作用が高く医薬品、化粧品、食品の分野において有用である。
また、本発明のインターロイキン１２産生促進剤は、有効成分の生産性が容易で且つ高く、また得られたインターロイキン１２産生促進剤は人体に投与した場合安全性が高く且つ、単独または他の免疫賦活剤や抗アレルギー剤と併用して、ウイルス、バクテリア等による感染症、悪性腫瘍等の予防・治療、もしくはアレルギーの予防・治療に用いることができる。

また、本発明の製造法は、上記インターロイキン１２産生促進剤を効率的に得る方法として有用である。

本発明に用いられる菌は、テトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属もしくはロイコノストック属に属し、マクロファージのインターロイキン１２産生を促進する作用を有するものであればどのような菌でもよい。菌のマクロファージのインターロイキン１２産生促進作用は、たとえばチオグリコレート刺激マウス腹腔滲出マクロファージを組織培養プレートで培養し、テトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属もしくはロイコノストック属に属する菌を添加し一定期間培養して培地中のインターロイキン１２濃度をエンザイムイムノアッセイで測定することにより容易に判定することができる。

本発明のインターロイキン１２産生促進剤は、テトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属もしくはロイコノストック属に属し、インターロイキン１２産生増強作用を有する菌を天然培地、合成培地、半合成培地などの培地に培養することにより得ることができる。培地としては、窒素源および炭素源を含有するものが用いられる。窒素源としてはたとえば、肉エキス、ペプトン、グルテン、カゼイン、酵母エキス、アミノ酸等であり、炭素源としては、たとえば、グルコース、キシロース、フラクトース、イノシトール、水アメ、麹汁、澱粉、バカス、フスマ、糖蜜、グリセリン等が用いられる。このほか、無機質として、たとえば硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、塩化マグネシウム、食塩、鉄、マンガン、モリブデン更に各種ビタミン類その他を添加することができる。

培養温度は２５〜４０℃、好ましくは２７〜３５℃であり、培養時間は１２〜１２０時間程度であり、通気振盪してもよい。培地のｐＨは５〜９、好ましくは６〜７である。培養終了後菌体を採取し蒸留水を加え、遠心分離などの手段により上清を除き、必要によりその操作を繰り返し、遠心分離や濾過等により菌体を採取する。採取された菌体は生菌のまま、またはたとえば過熱、紫外線照射、ホルマリン処理などにより不活性化して投与に適した剤形にすることもできる。分離された生菌体、死菌体はさらに摩砕や破砕処理をし、得られた処理物を必要により加熱滅菌、無菌濾過し、濾液を凍結乾燥して製品とすることもできる。菌体の処理物にはたとえば、上記摩砕物、破砕物、それらからの抽出液、凍結乾燥品が含まれる。また、本発明に用いられる乳酸菌の一種、テトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属もしくはロイコノストック属に属する菌は、元々発酵食品である醤油の諸味や漬物から分離されたものであり、食品、たとえば果菜類、穀類から選択された少なくとも１種または、果菜類や穀類を発酵可能な形態に処理したもの、たとえば切断物、粉砕物、摩砕物、搾汁、搾汁濃縮物を本発明において用いられる菌により発酵させた菌を含む発酵物をそのまま用いることができ、これも本発明の好ましい態様の１つである。乳成分を添加しなくてもよく、乳酸菌を多量に含み味覚的にも極めて優れた発酵物を得ることができる。また、被発酵処理物が臭いのきつい果菜類や穀類を含んでいても、野菜類などの特有の不快臭や加熱による不快臭を顕著に低減できるとともに、風味を改善でき、極めて容易に食することができる発酵食品が得られる。しかも、サイレージと異なり発酵食品から分離された食習慣のある乳酸菌であるため、本発明の微生物は安全性も高い。

上述の乳酸菌発酵物は、果菜類及び穀類から選択された少なくとも一種の処理物を前記乳酸菌により発酵させることにより得られる。前記果菜類には、種々の可食性植物、例えば、野菜類（例えば、ニンジン、トマト、ホウレン草、パセリ、シソ葉、大葉、芽キャベツ、小松菜、カボチャ、大根葉、ピーマン、ケール、カンショ葉、春菊、セリなどの緑黄色野菜類、セロリ、キャベツ、アスパラガス、キュウリ、スイカなどの他の野菜類）、リンゴ、バナナ、パパイヤ、アボガド、ミカン、グレープフルーツ、レモン、パイナップル、モモ、柿、イチゴ、ブドウ、メロン、ココナッツなどの果物類などが含まれる。穀類には、米、トウモロコシ、大豆、小麦、ライ麦、ふすま、ゴマなどが含まれる。これらの果菜類などは単独で又は二種以上組み合わせて使用でき、必要に応じて、これらの果菜類などは、ジャガイモ、サツマイモなどのイモデンプン類と併用してもよい。好ましい果菜類には、トマトなどの緑黄色野菜類、バナナなどの果物類、米などの穀類などが含まれる。また、処理物としては、切断物、粉砕物、摩砕物、搾汁、搾汁濃縮物などが単独又は二種以上組み合わせて使用できる。好ましい処理物には、野菜汁、果汁などの搾汁や搾汁濃縮物などの搾汁類が含まれる。この搾汁類において、トマトを用いる場合、トマト汁の濃度はBrix２〜３０程度の範囲から選択できる。また、５０重量％以上のトマト処理物を含む処理物は、発酵飲料などの風味を改善する上で有用である。

前記果菜類などの処理物は、通常、ブランチング処理及び／又は殺菌処理に供された後、前記乳酸菌による発酵に供される。ブランチング処理は、前記果菜類などやその処理物、特に果菜類やその切断物を加熱処理し、酵素活性を失活させることにより行うことができ、ブランチング処理の後、遠心分離やフィルタープレスなどの方法で搾汁し、ジュースを得る場合が多い。また、殺菌処理は、ブランチング処理された前記果菜類などやその処理物、特に搾汁類について行う場合が多い。なお、ブランチング処理および殺菌処理は、風味を損なわない範囲で選択でき、ブランチング処理は、慣用の方法、例えば、必要に応じてオートクレーブを用い、７０〜１００℃で短時間処理することにより行うことができる。殺菌処理は、慣用の方法、例えば、７０〜１２５℃程度の温度又は高温短時間で加熱殺菌する方法、紫外線などの光線を照射する方法などが採用できる。前記微生物による発酵は、前記乳酸菌を搾汁類などの処理物に直接接種して行ってもよいが、通常、適当な培地や前記処理物を用いて馴化培養した前記乳酸菌をスターターとして搾汁類などの処理物に接種して行う場合が多い。発酵は、慣用の方法、例えば、処理物に対して０.５〜３重量％程度のスターターを接種し、２５〜４０℃（例えば、２５〜３８℃）、好ましくは２７〜３８℃（例えば、２７〜３５℃）程度で行うことができる。発酵時間は、果菜類などの処理物の種類などに応じて、例えば、数時間〜数日間程度の範囲から選択できる。本発明の好ましい態様には、トマトなどの緑黄色野菜、果物及び穀類のうちの少なくとも一種の処理物（特に野菜、穀物および果物のうち少なくとも一種から得られた搾汁類）を前記乳酸菌で発酵させ、乳酸菌発酵飲料（緑黄色野菜ジュース、果物ジュースなど）やその加工品（緑黄色野菜ゼリー，スプレット、豆乳ヨーグルトなど）として得る方法が含まれる。

なお、発酵に際しては、必要に応じて、他の微生物、例えば、乳酸菌（ラクトバチルス・カゼイなど）やエンテロコッカス属微生物（エンテロコッカス・フェカーリスなど）、酵母などを併用してもよい。さらに、必要に応じて、前記処理物に、種々の添加剤、例えば、ビタミン、アミノ酸、ミネラル、植物繊維、糖類、蜂蜜などの甘味料、香料、牛乳、脱脂粉乳などの乳成分、果汁などを添加して発酵させてもよく、得られた乳酸菌発酵物に前記添加剤を添加してもよい。このようにして、果菜類などの処理物を前記乳酸菌により発酵させると、得られる乳酸菌発酵物の風味を改善できる。この方法により得られた乳酸菌発酵物は、被発酵処理物が臭いのきつい果菜類や穀類を含んでいても、不快臭を顕著に低減できるとともに、加熱による不快臭も抑制できる。また、乳酸菌の発酵により適度な酸味を呈するとともに、官能的に優れた風味を有しており、極めて容易に食することができる。

本発明のインターロイキン１２産生促進剤は、自体公知の食品あるいは、食品成分、医薬担体または賦形剤と自体公知の方法で合して、免疫力を高める食品や医薬剤としても利用可能である。用いる食品あるいは、食品成分、医薬担体または賦形剤は特に限定するものではなく、当該インターロイキン１２産生促進剤の具体的用途に応じて当業者が適宜選択できる。またインターロイキン１２産生促進剤の形態も特に限定する物ではなく、具体的用途に応じて種々の固体や液体の形態とすることができる。本発明のインターロイキン１２産生促進剤は、医薬として用いる場合、経口投与あるいは、非経口投与が考えられるが、一般的に請求項１に記載の有効成分のいずれか、あるいは組み合わせて用いることが可能であり、その投与量は、投与形態にもよるが、経口投与の場合有効成分として成人１日当たり４０ｍｇ〜４０ｇであり、静注の場合は０.１ｍｇ〜１ｇである。本発明のインターロイキン１２産生促進剤を食品として用いる場合、調味料、畜肉加工品、水産加工品、農産加工品、ステープル、調味食品、調味済食品、デザート類、乳油製品、菓子、スナック菓子等の形態で提供することも可能である。本発明のインターロイキン１２産生促進剤は、たとえば、ウイルス、バクテリア等の微生物による感染症、各種悪性腫瘍などの予防・治療やアレルギーの予防・治療に有効である。

以下に試験例および実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれらによって限定されるものではない。

〔試験例１〕
本試験例では、乳酸菌培養培地であるＭＲＳ培地５ｍｌに各種乳酸菌を接種し、３０℃で２４時間前培養を行った。その後、５ｍｌのＭＲＳ培地にその前培養した培養液をスターターとして０．１重量％接種し、３０℃にて７２時間静地培養した。好塩性の乳酸菌については、食塩濃度が１５％になるように食塩を添加して、培養を行った。培養終了後、１００℃で１０分間の殺菌を行った。乳酸菌菌体数については事前に予備実験を行い、菌による生育の違いについては菌体濁度と、プレートに培養液の一部をまき、コロニー数を把握しておいた。５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。そして、上清を除き、菌体を集めた。さらに、集めた菌体ペーストを生理食塩水に良く分散し、５０００ｒｐｍで１０分遠心分離したのち、上清を除き、菌体を集めた。これを３回繰り返したのち、ＲＰＭＩ １６４０培地に乳酸菌菌体がおおよそ１×１０⁸個／ｍｌの濃度になるように分散させた。

以上のように得た各種乳酸菌菌体を用いて、マウス腹腔滲出マクロファージのインターロイキン１２産生反応に対する乳酸菌菌体の増強効果を検証した。チオグリコレート１ｍｌを腹腔内に投与し、刺激したマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、雄、7週齢）から無菌的に腹腔滲出マクロファージを調製した。腹腔滲出マクロファージ細胞浮遊液の細胞数を測定した後、細胞数を２×１０⁶／ｍｌの濃度にＲＰＭＩ １６４０培地で調製し、９６穴組織培養プレートに１穴当たり１００μｌを播種した。これにＲＰＭＩ １６４０培地（対照）あるいは乳酸菌菌体を１×１０⁸個／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ １６４０培地に溶解した液をそれぞれ１穴当たり１００μｌ加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で１日間培養し、培養後の培養上清のインターロイキン１２をエンザイムイムノアッセイで測定した。エンザイムイムノアッセイは、ラット抗マウスインターロイキン１２抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ 社製）を０．２M、ｐH６．０のリン酸緩衝液で２μｇ／ｍｌに調製した溶液を、９６穴組織培養プレート１穴当たり１００μｌ加え、室温で一晩放置しラット抗マウスインターロイキン１２抗体を各穴に付着させたプレートを用いて行った。培養上清を１穴当たり１００μl加え室温で９０分間放置し、培養上清のマウスインターロイキン１２をプレートに付着したラット抗マウスインターロイキン１２抗体と結合させた。洗浄後ラットビオチン化抗マウスインターロイキン１２抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ 社製）を加え、プレートに結合させたマウスインターロイキン１２に結合させた。洗浄後ストレプトアビジンで標識したペルオキシダーゼ酵素（Ｖｅｃｔｏｒ 社製）を加え、ビオチンと結合させた。ＴＭＢ基質溶液（Ｍｏｓｓ／コスモバイオ 社製）を１穴当たり１００μｌ加え、室温で２０分間反応させ、反応を０．５Ｎ塩酸で停止し、マイクロプレートリーダーで吸光度４５０ｎｍを測定し、リコンビナントマウスインターロイキン１２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ 社製）で作成した標識曲線から、培養上清中のインターロイキン１２の濃度を求めた。図１にその結果を示す。コントロールは市販のビフィズス菌菌体を用いた。

図１から明らかなごとくテトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属もしくはロイコノストック属の菌体はインターロイキン１２の産生を大幅に上昇させた。

〔試験例２〕
本試験例では、乳酸菌培養培地であるＭＲＳ培地５ｍｌに試験例１で活性の高かったテトラジェノコッカス属の乳酸菌であるテトラジェノコッカス・ハロフィラＫＫ２２１菌体を接種し、３０℃で７２時間前培養を行った。その後、各種の塩濃度（１．５％、５％、１０％、１５％ＮａＣｌ）に調製した５ｍｌのＭＲＳ培地にその前培養した培養液をスターターとして０．１重量％接種し、３０℃にて７２時間静地培養した。培養終了後、１００℃で１０分間の殺菌を行った。５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。そして、上清を除き、菌体を集めた。さらに、集めた菌体ペーストを生理食塩水で良く分散し、５０００ｒｐｍで１０分遠心分離したのち、上清を除き、菌体を集めた。これを３回繰り返したのち、ＲＰＭＩ １６４０培地に乳酸菌菌体が１×１０⁸個／ｍｌの濃度になるように分散させた。
結果を図２に示す。図２から明らかなごとく低塩濃度（１．５％、５％、ＮａＣｌ）で培養したテトラジェノコッカス属の菌体よりも高塩濃度（１０％、１５％ＮａＣｌ）で培養したテトラジェノコッカス属の菌体ほど、インターロイキン１２の産生を大幅に上昇させた。

〔試験例３〕 マウスの遅延型過敏反応に及ぼすテトラジェノコッカス・ハロフィラＫＫ２２１菌体経口投与の影響：
塩濃度１５％ＮａＣｌの濃度に調製したＭＲＳ培地５０ ｍＬに試験例１で活性の高かったテトラジェノコッカス属の乳酸菌であるテトラジェノコッカス・ハロフィラＫＫ２２１菌体を接種し、３０℃で７２時間前培養を行った。その後、塩濃度１５％ＮａＣｌの濃度に調製した５ＬのＭＲＳ培地にその前培養した培養液をスターターとして１重量％接種し、３０℃にて７２時間静地培養した。培養終了後、１００℃で１０分間の殺菌を行った。５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。そして、上清を除き、菌体を集めた。さらに、集めた菌体ペーストを生理食塩水で良く分散し、５０００ｒｐｍで１０分遠心分離したのち、上清を除き、菌体を集めた。これを３回繰り返したのち、ＲＰＭＩ １６４０培地に乳酸菌菌体が１×１０^９個／ｍｌの濃度になるように分散させた。

マウス（ＣＢＡ／Ｊ雄 5週齢 日本チャールズリバー）に、上記で調製したテトラジェノコッカス・ハロフィラＫＫ２２１菌体（１×１０^９個／ｍｌ）をあらかじめ2週間の期間、１００μｌ連続経口投与した後、マウス腹部を悌毛し、アセトン：エタノール＝１：１溶液に溶解させた５％塩化ピクリル溶液１００μｌを塗布し、塩化ピクリル抗原に感作させた。3日後、マウス耳介に１％塩化ピクリル溶液１０μｌを塗布し、遅延型過敏反応を誘導させた。さらに1日後、マウス耳介の厚さを測定し、テトラジェノコッカス・ハロフィラＫＫ２２１菌体を経口投与したときの遅延型過敏反応増強効果に与える影響を調べた（ｎ＝６）。その結果を図３に示す。図３において、テトラジェノコッカス・ハロフィラＫＫ２２１菌体強制経口投与群は、生理食塩水に懸濁させたテトラジェノコッカス・ハロフィラＫＫ２２１菌体１×１０^９個を１４日間連続強制経口投与した群、コントロール群は、生理食塩水を経口投与した群である。
テトラジェノコッカス・ハロフィラＫＫ２２１菌体を強制経口摂取させることによって、遅延型過敏反応は、コントロール群と比較して有意に（ｐ＜０．０５）増加した。マウスに１×１０^９個を含有する飼料を強制経口摂取させた際の体重の増加に異常は見られず、飼料の摂食量には大きな差はなかった。
結果を図３に示す。図３から明らかなごとくテトラジェノコッカス属の菌体は遅延型過敏反応の増強効果を示し、細胞性免疫の増強を示した。

〔試験例４〕脾臓細胞からのＩＦＮ−γ産生に及ぼすテトラジェノコッカス・ハロフィラＫＫ２２１菌体経口投与の影響（図４）：
試験例３で用いた１４日間テトラジェノコッカス・ハロフィラＫＫ２２１菌体を摂取させたマウスから脾臓を取り出し、脾臓懸濁細胞を調製した。脾臓懸濁細胞の調製は、マウスから無菌的に脾臓を取り出し、脾臓細胞浮遊液の細胞数を測定した後、細胞数を1×１０⁷／ｍｌの濃度にＲＰＭＩ １６４０培地で調製し、９６穴組織培養プレートに１穴当たり１００μｌを播種した。一方、抗原特異的な刺激には無処置のマウスからマウス脾臓細胞を調製し、ＴＮＢＳ試薬で処理し、抗原を提示させた細胞（ＴＮＰ−ＡＰＣ（２×１０^６個/ｍｌ））を用いた。このＴＮＰ−ＡＰＣ懸濁細胞液を１×１０⁸個／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ １６４０培地に溶解した液をそれぞれ１穴当たり１００μｌを上記の脾臓懸濁細胞液に加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で２日間培養し、培養後の培養上清のインターフェロンγをエンザイムイムノアッセイで測定した。エンザイムイムノアッセイは、ラット抗マウスインターフェロンγ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ 社製）を０．２M、ｐH６．０のリン酸緩衝液で２μｇ／ｍｌに調製した溶液を、９６穴組織培養プレート１穴当たり１００μｌ加え、室温で一晩放置しラット抗マウスインターフェロンγ抗体を各穴に付着させたプレートを用いて行った。培養上清を１穴当たり１００μｌ加え室温で９０分間放置し、培養上清のマウスインターフェロンγプレートに付着したラット抗マウスインターフェロンγ抗体と結合させた。洗浄後ラットビオチン化抗マウスインターフェロンγ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ 社製）を加え、プレートに結合させたマウスインターフェロンγに結合させた。洗浄後ストレプトアビジンで標識したペルオキシダーゼ酵素（Ｖｅｃｔｏｒ 社製）を加え、ビオチンと結合させた。ＴＭＢ基質溶液（Ｍｏｓｓ／コスモバイオ 社製）を１穴当たり１００μｌ加え、室温で２０分間反応させ、反応を０．５Ｎ塩酸で停止し、マイクロプレートリーダーで吸光度４５０ｎｍを測定し、リコンビナントマウスインターフェロンγ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ 社製）で作成した標識曲線から、培養上清中のインターフェロンγの濃度を求めた。図４にその結果を示す。

テトラジェノコッカス・ハロフィラＫＫ２２１菌体摂取群マウスの脾臓由来の細胞は抗原特異的な刺激をおこなったときに、コントロール群のマウスの脾臓細胞と比較してインターフェロンγ産生が有意に（ｐ＜０．０５）増加した。

〔試験例５〕 抗原特異的ＩｇＥ産生に及ぼすテトラジェノコッカス・ハロフィラＫＫ２２１菌体経口投与の影響（図５）：
ＢＡＬＢ／ｃ系５週齢の雄マウスを日本チャールズリバー社から購入し、飼料としてＣＥ−２（日本クレア社製）を自由摂取させ飼育した。上記で調製したテトラジェノコッカス・ハロフィラＫＫ２２１菌体（１×１０^９個／ｍｌ）を試験期間中、１日１回１００μｌ、胃ゾンデで連続経口投与した。一方、卵白アルブミン（以下、ＯＶＡと略す。シグマ社製）５０μｇ及びアジュバントとして水酸化アルミニウム（和光純薬株式会社製）３ｍｇを生理食塩水１００μｌに懸濁した。この懸濁液を、５週齢の上記マウス６匹のそれぞれに、感作開始日及び９日目、１９日目に腹腔内投与し、感作を行った。

このＯＶＡで感作させたマウスの眼底静脈より、感作開始日及び１０日目及び２０日目に部分採血し、採取した血液より血清サンプルを得た。この血清サンプル中の、ＯＶＡ特異的ＩｇＥ抗体（以下、ＯＶＡ−ＩｇＥと略す。）量を、下記の測定方法により測定した。

血中ＯＶＡ−ＩｇＥの測定はＥＬＩＳＡ法によって行った。９６穴イムノプレート（コーニング社製）の各ウェルにＯＶＡ１０μｇ／ｍｌを含む生理食塩水溶液を１００μｌ加えて、４℃で一晩インキュベートした。プレートをリン酸緩衝液（１３７ｍＭ ＮａＣｌ， ２．７ｍＭ ＫＣｌ， ８．１ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４及び１．５ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４を含む。以下ＰＢＳと略す。）で３回洗浄した後、１％牛血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略す。大日本製薬社製）含有ＰＢＳを２００μｌ加えて、室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄した。１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１／５０に希釈した血清サンプル１００μｌを各ウェルに加え、４℃で一晩反応させた。ＰＢＳで４回洗浄し、ビオチン化した抗ＩｇＥ抗体を含む１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液を各ウェルに１００μｌ加えて室温で２時間反応後、ＰＢＳで５回洗浄した洗浄後ストレプトアビジンで標識したペルオキシダーゼ酵素（Ｖｅｃｔｏｒ 社製）を加え、ビオチンと結合させた。ＴＭＢ基質溶液（Ｍｏｓｓ／コスモバイオ 社製）を１穴当たり１００μｌ加え、室温で２０分間反応させ、反応を０．５Ｎ塩酸で停止し、マイクロプレートリーダーで吸光度４５０ｎｍを測定し、血清中のＯＶＡ−ＩｇＥの濃度を求めた。図５にその結果を示す。

また、ＯＶＡ抗原による刺激を与えたときのマウス脾臓懸濁細胞のインターロイキン４産生反応についての検証を行った。上記ＯＶＡ刺激を行ったマウスから無菌的に脾臓を調製し、脾臓細胞懸濁液の細胞数を測定した後、細胞数を１×１０^７／ｍｌの濃度にＲＰＭＩ １６４０培地で調製し、９６穴組織培養プレートに１穴当たり１００μｌを播種した。これにＯＶＡを１０ｍｇ／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ １６４０培地に溶解した液をそれぞれ１穴当たり１００μｌ加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で２日間培養し、培養後の培養上清のインターロイキン４をエンザイムイムノアッセイで測定した。エンザイムイムノアッセイは、ラット抗マウスインターロイキン４抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ 社製）を０．２M、ｐH６．０のリン酸緩衝液で２μｇ／ｍｌに調製した溶液を、９６穴組織培養プレート１穴当たり１００μｌ加え、室温で一晩放置しラット抗マウスインターロイキン４抗体を各穴に付着させたプレートを用いて行った。培養上清を１穴当たり１００μｌ加え室温で９０分間放置し、培養上清のマウスインターロイキン４をプレートに付着したラット抗マウスインターロイキン４抗体と結合させた。洗浄後ラットビオチン化抗マウスインターロイキン４抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ 社製）を加え、プレートに結合させたマウスインターロイキン４に結合させた。洗浄後ストレプトアビジンで標識したペルオキシダーゼ酵素（Ｖｅｃｔｏｒ 社製）を加え、ビオチンと結合させた。ＴＭＢ基質溶液（Ｍｏｓｓ／コスモバイオ 社製）を１穴当たり１００μｌ加え、室温で２０分間反応させ、反応を０．５Ｎ塩酸で停止し、マイクロプレートリーダーで吸光度４５０ｎｍを測定し、リコンビナントマウスインターロイキン４（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ 社製）で作成した標識曲線から、培養上清中のインターロイキン４の濃度を求めた。図６にその結果を示す。

テトラジェノコッカス・ハロフィラＫＫ２２１乾燥菌体の製造方法：
乳酸菌培養培地である、塩濃度１５％に調整したＭＲＳ培地２００ｍｌにテトラジェノコッカス・ハロフィラＫＫ２２１をスターターとして０．１重量％接種し、３０℃で２４時間前培養を行った。その後、１０ＬのＭＲＳ培地にその前培養した培養液をスターターとして１重量％接種し、３２℃にて２４時間静地培養した。培養後、５０００ｒｐｍで３５分間遠心分離した。そして、上清を除き、菌体を集めた。さらに、集めた菌体ペーストを生理食塩水に良く分散し、５０００ｒｐｍで３５分遠心分離したのち、上清を除き、菌体を集めた。これを３回繰り返したのち、蒸留水に分散した。そして１００℃で１０分間殺菌した。これを凍結乾燥し、乾燥菌体を得た。

トマト汁のテトラジェノコッカス・ハロフィラＫＫ２２１発酵物の製造方法：
ＫＫ２２１乾燥菌体の作成方法と同様の方法で６リットルの、塩濃度１５％に調整したＭＲＳ培地で３２℃、２４時間培養したのち生理食塩水中に分散、遠心分離することにより集めた菌体ペーストをトマト汁３００ｍｌに添加し、３０℃で２４時間培養した。そして７０℃で１０分間殺菌し、トマト発酵液を得た。

パイナップル汁のテトラジェノコッカス・ハロフィラＫＫ２２１発酵物の製造方法：
ＫＫ２２１乾燥菌体の作成方法と同様の方法で６リットルの、塩濃度１５％に調整したＭＲＳ培地で３２℃、２４時間培養したのち生理食塩水中に分散、遠心分離することにより集めた菌体ペーストをパイナップル汁３００ｍｌに添加し、３０℃で２４時間培養した。そして７０℃で１０分間殺菌し、パイナップル発酵液を得た。

豆乳のテトラジェノコッカス・ハロフィラＫＫ２２１発酵物の製造方法：
ＫＫ２２１乾燥菌体の作成方法と同様の方法で６リットルの、塩濃度１５％に調整したＭＲＳ培地で３２℃、２４時間培養したのち生理食塩水中に分散、遠心分離することにより集めた菌体ペーストを豆乳３００ｍｌに添加し、３０℃で２４時間培養した。そして７０℃で１０分間殺菌し、豆乳発酵液を得た。

試験例１：各種乳酸菌の培養上清中のインターロイキン１２の濃度を示す。 試験例２：各種塩濃度で培養したテトラジェノコッカス属のインターロイキン１２産生能を示す。 試験例３：テトラジェノコッカス属の乳酸菌の遅延型過敏反応の増強効果を示す。 試験例４：脾臓細胞からのＩＦＮ−γ産生に及ぼすテトラジェノコッカス・ハロフィラＫＫ２２１菌体経口投与の影響を示す。 試験例５：抗原特異的ＩｇＥ産生に及ぼすテトラジェノコッカス・ハロフィラＫＫ２２１菌体経口投与の影響を示す。 試験例５：ＯＶＡ抗原による刺激を与えたときのマウス脾臓懸濁細胞のインターロイキン４産生反応を示す。

Claims (6)

1. テトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属もしくはロイコノストック属に属する乳酸菌の培養物、菌体または菌体成分を有効成分とするインターロイキン１２産生促進剤。
2. テトラジェノコッカス・ハロフィラ、ペディオコッカス・ペントサセウス、ペディオコッカス・アシデラクテシィもしくはロイコノストック・メセントロイデスに属する乳酸菌の培養物、菌体または菌体成分を有効成分とするインターロイキン１２産生促進剤。
3. 乳酸菌がテトラジェノコッカス・ハロフィラＫＫ２２１株、ペディオコッカス・ペントサセウス ＴＵＡ０１２２株、ペディオコッカス・アシデラクテシィ ＴＵＡ０１２４株、ロイコノストック・メセントロイデス ＮＩＳＬ７２０１株、もしくは、ロイコノストック・メセントロイデス ＮＩＳＬ７２１９株である、請求項１または２記載のインターロイキン１２産生促進剤。
4. 培養物が、トマト果汁、パイナップル果汁等の果汁飲料、豆乳飲料、または野菜飲料を含む培地でテトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属もしくはロイコノストック属に属する乳酸菌を培養し得られたもの、もしくは添加したものである、請求項１または２記載のインターロイキン１２産生促進剤。
5. 請求項１〜４のいずれか１項記載の剤を含む、飲食品、医薬品または化粧品。
6. テトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属もしくはロイコノストック属に属する乳酸菌を塩分０％〜２５％好ましくは５％〜１５％の乳酸菌用培地で培養し、得られた培養物、菌体または菌体成分を有効成分とすることを特徴とするインターロイキン１２産生促進剤の製造法。
   
   

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