JP2005532051A - ヒト化抗リンホトキシンβレセプター抗体 - Google Patents

Abstract

本発明は、リンホトキシンβレセプター（ＬＴ−β−Ｒ）に特異的なヒト化抗体、これらの抗体を産生する細胞株、これらの抗体により作製される免疫化学物質、および、これらの抗体を使用する診断方法に関する。本発明はまた、治療方法において、抗体単独、または、化学療法剤と組み合わせての抗体の使用に関する。別の実施形態において、本発明は、上記に列挙される抗体のように、ＬＴ−β−Ｒと同じエピトープに結合する抗体を含む。

Description

（関連出願）
本願は、以前の出願である、２００２年７月１日に出願された米国仮特許番号６０／３９２９９３および２００２年１０月９日に出願された米国仮特許番号６０／４１７３７２に対する優先権を主張する。上記の関連出願の全内容は、本明細書中に参考として援用される。

（発明の分野）
本発明は、免疫ならびに癌の診断および治療の分野に属する。より具体的には、本発明は、リンホトキシンβレセプター（ＬＴ−β−Ｒ）に特異的なヒト化抗体、これらの抗体を産生する細胞株、この抗体から作製される免疫化学物質、および、この抗体を使用する診断方法に関する。本発明はまた、治療方法における、抗体の単独、または化学療法剤との組み合わせでの使用に関する。

リンホトキシンβレセプター（本明細書中ではＬＴ−β−Ｒと呼ばれる）は、腫瘍壊死因子ファミリーのメンバーであり、これは、免疫系の発生、ならびに、濾胞樹状細胞および多数の間質性細胞型を含む、免疫系における多数の細胞の機能的な維持の両方において、十分に記載された役割を有する（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１５６：１３７（１９９７））。ＬＴ−β−Ｒに対する公知のリガンドとしては、ＬＴα１／β２およびＬＩＧＨＴと呼ばれる第２のリガンドが挙げられる（Ｍａｕｒｉら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８：２１（１９９８））。ＬＴ−β−Ｒの活性化は、インビボにおいて、特定の癌細胞株のアポトーシス性の死を誘導することが示されている（ＰＣＴ／ＵＳ９６／０１３８６）。従って、ＬＴ−β−Ｒに結合し、かつ、その被験体に対して最小限の免疫原性を有する特異的ヒト化抗ＬＴ−β−Ｒ抗体を用いる処置は、被験体（例えば、ヒト）における新生物形成の進行、重篤度または作用を処置または軽減するのに有用である。

（発明の要旨）
本発明は、リンホトキシンβレセプター（ＬＴ−β−Ｒ）に特異的なヒト化抗体、これらの抗体を産生する細胞株、これらの抗体から作製される免疫化学物質および、これらの抗体を使用する診断方法を提供する。本発明はまた、治療方法において、抗体単独、または、化学療法剤と組み合わせての抗体の使用に関する。具体的には、本発明は、ＬＴ−β−Ｒ（例えば、ヒトＬＴ−β−Ｒ）に特異的に結合するヒト化抗体を包含する。この抗体は、配列番号１のアミノ酸残基２４〜３４、５０〜５６および８９〜９７により規定される軽鎖相補性決定領域、および／または、配列番号２のアミノ酸残基３１〜３５、５０〜６５および９５〜１０２により規定される重鎖相補性決定領域を含み、さらに、その軽鎖中に、Ｙ３６、Ｓ４９、Ｔ６３およびＦ８７のうちの少なくとも１つ（例えば、１、２、３または４）を含むか、または、その重鎖中に、Ｙ２７、Ｔ３０、Ａ６７、Ｌ６９およびＦ９１（Ｋａｂａｔ番号付け慣例）のうちの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５または６）を含む。別の実施形態において、本発明は、上記に列挙される抗体のように、ＬＴ−β−Ｒと同じエピトープに結合する抗体を含む。

１つの実施形態において、本発明のヒト化抗体は、配列番号６のアミノ酸残基１〜１０７により規定される軽鎖可変ドメイン配列、および／または配列番号１４のアミノ酸残基１〜１１３により規定される重鎖可変ドメイン配列を含む。ヒト化抗体はまた、実施例７に記載されるような、４型のｈｕＢＨＡ１０を発現するＣＨＯ細胞株である「クローン３Ｄ９」（２００２年９月２７日に寄託された、ＡＴＣＣ特許寄託物名ＰＴＡ−４７２６）により産生される抗体と同じ重鎖および／軽鎖ポリペプチド配列を含み得る。４型のｈｕＢＨＡ１０を含むクローン３Ｄ９は、２００２年９月２７日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９に寄託され、ＰＴＡ−４７２６の登録番号を割り当てられた。この寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条件の下で維持される。この寄託は、単に、当業者のための便宜としてなされた。

別の実施形態において、本発明のヒト化抗体は、親抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体ＢＨＡ１０（ＷＯ９６／２２７８８に記載される）の結合特性を実質的に保持する。１つの実施形態において、本発明のヒト化抗体は、例えば、約１μＭ〜約１０μＭ、あるいは、約１０μＭ〜約２０μＭ、あるいは、約２０μＭ〜約３０μＭ、あるいは、約３０μＭ〜約４０μＭ、あるいは、約４０μＭ〜約５０μＭ、あるいは、約５０μＭ〜約６０μＭ、あるいは、約６０μＭ〜約７０μＭ、あるいは、約７０μＭ〜約８０μＭ、そして、あるいは、約８０μＭ〜約９０μＭの官能基親和性でＬＴ−β−Ｒと結合し、官能性親和性は、ＢＩＡＣＯＲＥ（すなわち、未標識の試薬を使用する表面プラズモン共鳴）により測定されるか、または、競合的結合アッセイにより測定される。

別の実施形態において、本発明のヒト化抗体は、免疫毒素の形態の、細胞傷害性部分または毒素（例えば、リシンＡ鎖またはシュードモナス毒素に連結されている。本発明のヒト化抗体はまた、化学療法薬物（例えば、アドリアマイシン、５−ＦＵ、ビンブラスチン、アクチノマイシンＤ、エトポシド、シスプラチン、メトトレキサートおよびドキソルビシン）に連結され得る。あるいは、本発明の抗体は、検出可能に標識され得る（例えば、放射性同位体のような検出可能な部分に連結される）。本発明はまた、併用療法を包含し、ここでは、例えば、細胞傷害性部分または毒素に連結されている本発明のヒト化抗体は、化学療法薬物に連結されている本発明のヒト化抗体と組み合わせて使用される。本発明はさらに、ＬＴ−β−Ｒを発現する腫瘍を有する哺乳動物（例えば、ヒト）への投与に適した組成物を包含し、この組成物は、哺乳動物への投与の際に腫瘍体積を減少するのに有効な量で各々存在する、ａ）ヒト化抗ＬＴ−β−Ｒ抗体単独、または、免疫毒素もしくは化学療法薬物の形態、およびｂ）細胞傷害性因子を含む。この細胞傷害性因子は、例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＬ−１、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２が挙げられ得る。あるいは、この細胞傷害性因子は、化学療法薬物であり得る。化学療法薬物としては、例えば、アドリアマイシン、５−ＦＵ、ビンブラスチン、アクチノマイシンＤ、エトポシド、シスプラチン、メトトレキサートおよびドキソルビシンが挙げられ得る。

本発明の抗体は、１つの実施形態において、任意のアイソタイプおよびサブタイプ（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）の完全抗体（例えば、２つの全長軽鎖および２つの全長重鎖を有する）であり得、あるいは、本発明の抗体は、完全抗体の抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２およびＦｖ）であり得る。

薬学的に受容可能なキャリア、配列番号５についてのコード配列を含む単離された核酸；配列番号１３についてのコード配列を含む単離された核酸；細胞株クローン３Ｄ９（２００２年９月２７日に寄託された、ＡＴＣＣ特許寄託物名ＰＴＡ−４７２６）により産生された抗体の軽鎖についてのコード配列を含む単離された核酸；配列番号５の残基１〜１０７についてのコード配列を含む単離された核酸；細胞株クローン３Ｄ９（２００２年９月２７日に寄託された、ＡＴＣＣ特許寄託物名ＰＴＡ−４７２６）により産生された抗体の重鎖についてのコード配列を含む単離された核酸；配列番号５の残基１〜１０７についてのコード配列を含む単離された核酸；および配列番号１３の残基１〜１２０についてのコード配列を含む単離された核酸を含む組成物もまた、本発明に包含される。

ヒト化抗ＬＴβＲ抗体を産生する細胞株（例えば、細胞株クローン３Ｄ９（ＡＴＣＣ特許寄託物名ＰＴＡ−４７２６）が挙げられる）由来の細胞もまた、本発明に包含される。１つの実施形態において、この細胞株は、約２５０ｍｇ／Ｌ〜約３００ｍｇ／Ｌの上記抗体を産生するか、あるいは、この細胞株は、約３００ｍｇ／Ｌ〜約３５０ｍｇ／Ｌの上記抗体を産生するか、あるいは、この細胞株は、約３５０ｍｇ／Ｌ〜約４００ｍｇ／Ｌの上記抗体を産生するか、あるいは、この細胞株は、約４００ｍｇ／Ｌ〜約４５０ｍｇ／Ｌの上記抗体を産生するか、あるいは、この細胞株は、約４５０ｍｇ／Ｌ〜約５００ｍｇ／Ｌの上記抗体を産生するか、あるいは、この細胞株は、約５００ｍｇ／Ｌ〜約５５０ ｍｇ／Ｌの上記抗体を産生するか、この細胞株は、約５５０ｍｇ／Ｌ〜約６００ｍｇ／Ｌの上記抗体を産生する。これらに細胞株により産生される抗体の濃度は、１０日間の流加培養法からの回収力価として測定される。

本発明はまた、被験体（例えば、ヒト）における新生物形成の進行、重篤度または作用を処置または軽減する方法を提供し、この方法は、被験体に、本発明の抗体の有効量を投与する工程を包含する。有効量の組成物は、１回以上の投薬で投与され得る。別の実施形態において、本発明は、被験体（例えば、ヒト）における新生物形成の進行、重篤度または作用を処置または軽減する方法を提供し、この方法は、被験体に、本発明の抗体および細胞傷害性因子の有効量を投与する工程を包含する。この細胞傷害性因子としては、例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＬ−１、ＩＮＦ−γ、ＩＬ−２が挙げられ得る。あるいは、この細胞傷害性因子は、化学療法薬物であり得る。この化学療法薬物としては、例えば、アドリアマイシン、５−ＦＵ、ビンブラスチン、アクチノマイシンＤ、エトポシド、シスプラチン、メトトレキサート、ＤＭ１およびドキソルビシンが挙げられる。

本発明はまた、本明細書中に記載される抗体の抗原結合フラグメントも記載する。本発明の１つの実施形態において、このフラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）_２フラグメントおよびＦｖフラグメントからなる群から選択される。

別の実施形態において、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、ポリエチレングリコールまたはアルブミン（ａｌｂｕｍｅｎ）と結合体化される。なお別の実施形態において、本発明の抗体の定常領域は、改変されていない抗体と比較して、少なくとも１つの定常領域媒介性の生物学的エフェクター機能が減少するように改変されている。なお別の実施形態において、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、変更されたエフェクター機能を有するＦｃ領域を含む。

本発明はまた、３Ｄ９（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−４７２６）からなるハイブリドーマ細胞を記載する。１つの実施形態において、本発明のハイブリドーマ細胞は、ヒト化抗体、または、その抗原結合部分を産生する。

別の実施形態において、本発明は、モノクローナル抗体ＢＨＡ１０由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）および可変領域フレームワークのアミノ酸残基Ｙ３６、Ｓ４９およびＦ８７（Ｋａｂａｔ番号付けシステム）を含む軽鎖を提供し、この軽鎖の残りは、ヒト抗体由来である。なお別の実施形態において、本発明は、モノクローナル抗体ＢＨＡ１０由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）および可変領域フレームワークのアミノ酸残基Ｙ２７およびＴ３０（Ｋａｂａｔ番号付けシステム）を含む重鎖を提供し、この重鎖の残りは、ヒト抗体由来である。なお別の実施形態において、本発明のヒト化抗体は、上記重鎖および軽鎖を含む。

１つの実施形態において、本発明のヒト化抗体は、リンホトキシン−βレセプター（ＬＴ−β−Ｒ）に結合する。

本発明はまた、配列番号１に示されるＢＨＡ１０の可変軽鎖配列のＣＤＲを含むヒト化抗体を提供する。別の実施形態において、本発明は、配列番号２に示されるＢＨＡ１０可変重鎖配列のＣＤＲを含むヒト化抗体を提供する。

本発明は、ＬＴ−β−Ｒに特異的に結合し、マウスＢＨＡ１０抗体由来のＣＤＲに対応するＣＤＲを含む可変領域を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントを記載する。１つの実施形態において、このフラグメントは、Ｆａｂフラグメントである。

なお別の実施形態において、本発明は、患者における癌を処置または軽減する方法を記載し、この方法は、この患者に、本発明のヒト化抗体の有効投薬量を投与する工程を包含する。本発明はまた、患者における固形腫瘍を処置または減少する方法を記載し、この方法は、この患者に、本発明のヒト化抗体の有効投薬量を投与する工程を包含する。本発明の１つの実施形態において、この固形腫瘍は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、直腸結腸癌（ＣＲＣ）、乳癌、前立腺癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、皮膚癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、食道癌および膀胱癌からなる群から選択される。

（詳細な説明）
（配列同定番号）
明細書中にて言及されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、以下の配列同定番号が与えられている。

配列番号１−マウスＢＨＡ１０軽鎖可変（ＶＬ）ドメインのアミノ酸配列。

配列番号２−マウスＢＨＡ１０重鎖可変（ＶＨ）ドメインのアミノ酸配列。

配列番号３−ヒト化ＢＨＡ１０軽鎖可変ドメイン（１型−ＶＬ＃１）の核酸配列。

配列番号４−ヒト化ＢＨＡ１０軽鎖可変ドメイン（１型−ＶＬ＃１）のアミノ酸配列。

配列番号５−ヒト化ＢＨＡ１０軽鎖可変ドメイン（２型−ＶＬ＃２）の核酸配列。

配列番号６−ヒト化ＢＨＡ１０軽鎖可変ドメイン（２型−ＶＬ＃２）のアミノ酸配列。

配列番号７−ヒト化ＢＨＡ１０軽鎖可変ドメイン（３型−ＶＬ＃３）の核酸配列。

配列番号８−ヒト化ＢＨＡ１０軽鎖可変ドメイン（３型−ＶＬ＃３）のアミノ酸配列。

配列番号９−ヒト化ＢＨＡ１０重鎖可変ドメイン（１型−ＶＨ＃１）の核酸配列。

配列番号１０−ヒト化ＢＨＡ１０重鎖可変ドメイン（１型−ＶＨ＃１）のアミノ酸配列。

配列番号１１−ヒト化ＢＨＡ１０重鎖可変ドメイン（２型−ＶＨ＃２）の核酸配列。

配列番号１２−ヒト化ＢＨＡ１０重鎖可変ドメイン（２型−ＶＨ＃２）のアミノ酸配列。

配列番号１３−ヒト化ＢＨＡ１０重鎖可変ドメイン（３型−ＶＨ＃３）の核酸配列。

配列番号１４−ヒト化ＢＨＡ１０重鎖可変ドメイン（３型−ＶＨ＃３）のアミノ酸配列。

配列番号１５−軽鎖＃２（ＶＬ＃２＋軽鎖定常ドメインヒトκを含む）のアミノ酸配列。

配列番号１６−重鎖＃３（ＶＨ＃３＋重鎖定常ドメインヒトＩｇＧ１を含む）のアミノ酸配列。

配列番号１７〜配列番号５８−種々のプライマー。

配列番号５９−軽鎖＃２（ＶＬ＃２＋軽鎖定常ドメインヒトκを含む）＋開始コドン＋シグナル配列の核酸配列。

配列番号６０−軽鎖＃２（ＶＬ＃２＋軽鎖定常ドメインヒトκを含む）＋開始コドン＋シグナル配列のアミノ酸配列。

配列番号６１−重鎖＃３（ＶＨ＃３＋重鎖定常ドメインヒトＩｇＧ１を含む）＋開始コドン＋シグナル配列の核酸配列。

配列番号６２−重鎖＃３（ＶＨ＃３＋重鎖定常ドメインヒトＩｇＧ１を含む）＋開始コドン＋シグナル配列のアミノ酸配列。

（定義）
用語「ヒト化抗体」または「新形態化抗体（ｒｅｓｈａｐｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」（本明細書中で交換可能に使用される）は、親抗体の抗原結合特性は保持するか、または、実質的に保持するが、好ましくは、ヒトにおいて免疫原性が少ない、非ヒト親抗体（代表的にはマウス）由来の少なくとも１種のヒト化免疫グロブリン鎖または抗体鎖（すなわち、少なくとも１種のヒト化軽鎖または重鎖）を含む抗体を指す。用語「ヒト化免疫グロブリン鎖」または「ヒト化抗体鎖」（すなわち、「ヒト化免疫グロブリン軽鎖」または「ヒト化免疫グロブリン重鎖」）は、実質的にヒト免疫グロブリンまたは抗体由来の可変フレームワーク領域、および実質的に非ヒト免疫グロブリンまたは抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）（例えば、少なくとも１つのＣＤＲ、好ましくは、２つのＣＤＲ、より好ましくは、３つのＣＤＲ）を含み、かつ、さらに、定常領域（例えば、軽鎖の場合は、少なくとも１つの定常領域またはその部分、そして、重鎖の場合は、好ましくは、３つの定常領域）を含む可変領域を有する、免疫グロブリン鎖または抗体鎖（すなわち、それぞれ、軽鎖または重鎖）を指す。

用語「領域」は、抗体鎖または抗体鎖ドメインの一部または部分（例えば、本明細書中に規定されるような、重鎖もしくは軽鎖の一部もしくは部分、または、定常ドメインもしくは可変ドメインの一部もしくは部分）、ならびに、上記鎖またはドメインのより分離した一部もしくは部分を指し得る。例えば、軽鎖および重鎖または、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインは、本明細書中で規定されるような、「フレームワーク領域」すなわち、「ＦＲ」の間に点在している、「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」を含む。

用語「相補性決定領域（ＣＤＲ）」は、本明細書中で使用される場合、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｏｆｆｉｃｅ，１９９１により描写されたような、ネイティブな免疫グロブリン結合部位の天然のＦｖ領域の結合親和性および結合特異性を一緒に規定するアミノ酸配列をいう。

用語「フレームワーク領域（ＦＲ）」は、本明細書中で使用される場合、ＣＤＲ間に点在するアミノ酸配列をいう。抗体のこれらの部分は、ＣＤＲを適切な方向（ＣＤＲが抗原に結合することを可能にする）に保持するように機能する。

本明細書中で使用される場合、用語「定常領域（ＣＲ）」は、エフェクター機能を与える抗体分子の部分をいう。代表的には、非ヒト（例えば、マウス）の定常領域が、ヒトの定常領域により置換される。本発明のキメラ抗体またはヒト化抗体の定常領域は、代表的には、ヒト免疫グロブリン由来である。重鎖定常領域は、５つのアイソタイプ：α、δ、ε、γまたはμのうちのいずれかから選択され得る。さらに、種々のサブクラスの重鎖（例えば、重鎖のＩｇＧサブクラス）は、異なるエフェクター機能を担い、従って、所望の重鎖定常領域を選択することにより、所望のエフェクター機能を有する抗体が産生され得る。好ましい定常領域は、γ１（ＩｇＧ１）、γ３（ＩｇＧ３）およびγ４（ＩｇＧ４）である。γ１（ＩｇＧ１）アイソタイプのＦｃ領域がより好ましい。軽鎖定常領域は、κ型またはλ型であり得、好ましくは、κ型であり得る。１つの実施形態において、軽鎖定常領域は、ヒトκ定常領域であり（Ｈｅｉｔｅｒら（１９８０）Ｃｅｌｌ ２２：１９７−２０７）、そして、重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１定常鎖である（Ｅｌｌｉｓｏｎら（１９８２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：４０７６−４０７９）。

用語「キメラ抗体」は、本明細書中で使用される場合、第１種由来の可変領域を含み、かつ、第２種由来の定常領域を含む抗体をいう。代表的には、キメラ抗体は、ヒト抗体フラグメントおよびマウス抗体フラグメントを含み、一般には、ヒト定常領域およびマウス可変領域を含む。

免疫グロブリンまたは抗体は、単量体形態または多量体形態で存在し得る（例えば、五量体形態で存在するＩｇＭ抗体および／または単量体、二量体または多量体の形態で存在するＩｇＡ抗体）。用語「フラグメント」は、インタクトもしくは完全な抗体または抗体鎖よりも少ないアミノ酸残基を含む抗体または抗体鎖の一部もしくは部分をいう。フラグメントは、インタクトもしくは完全な抗体または抗体鎖の化学処理もしくは酵素的処理により得られ得る。フラグメントはまた、組換え的手段により得られ得る。例示的なフラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂｃおよび／またはＦｖフラグメントが挙げられる。用語「抗原結合フラグメント」は、抗原に結合するか、または、抗原結合（すなわち、特異的結合）についてインタクトな抗体（すなわち、その抗体が由来するインタクトな抗体）と競合する免疫グロブリンまたは抗体のポリペプチドフラグメントをいう。

結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術によってか、または、インタクトな免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的切断により産生される。結合フラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂｃ、Ｆｖ、単鎖および単鎖抗体が挙げられる。「二特異的」すなわち「二機能的」免疫グロブリンまたは抗体を除くと、免疫グロブリンまたは抗体は、各々が同一の結合部位を有すると理解される。「二特異的抗体」すなわち「二機能的抗体」は、２つの異なる重鎖／軽鎖対と、２つの異なる結合部位とを有する人工的なハイブリッド抗体である。二機能的抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの連結を含む種々の方法により産生され得る。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ＆ Ｌａｃｈｍａｎｍ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１（１９９０）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと。

用語「免疫原性」は、本明細書中で使用される場合、標的タンパク質または治療部分が、レシピエントに投与される場合に、免疫応答（体液性または細胞性）を惹起する能力の指標をいう。本発明は、本発明のヒト化抗体の免疫原性に関する。

免疫原性が減少されたヒト化抗体は、親抗体（例えば、マウス抗体）と比較して、減少された免疫原性を示すヒト化抗体をいう。

親抗体の結合特性を実質的に保持するヒト化抗体は、このようなヒト化抗体を産生するために使用される親抗体により認識される抗原に特異的に結合する能力を保持するヒト化抗体をいう。好ましくは、ヒト化抗体は、親抗体と同じまたは実質的に同じ抗原結合親和性および抗原結合能力を示す。理想的には、この抗体の親和性は、親抗体の親和性の１０％未満ではなく、より好ましくは、約３０％未満ではなく、そして、最も好ましくは、親和性は、親抗体の５０％未満でない。抗原結合親和性をアッセイするための方法は当該分野で周知であり、これらとしては、半−最大結合アッセイ、競合アッセイおよびスキャッチャード分析が挙げられる。適切な抗原結合アッセイは、本願に記載される。

「復帰変異（ｂａｃｋ ｍｕｔａｔｉｏｎ）」は、ヒト化抗体をコードするヌクレオチド配列中に導入される変異であり、この変異は、親抗体（例えば、ドナー抗体（例えば、マウス抗体））中のアミノ酸に対応するアミノ酸を生じる。親抗体由来の特定のフレームワーク残基は、親抗体の結合特性を実質的に保持するために、本発明の抗体のヒト化の間に保持され得、一方で、同時に、得られる抗体の潜在的な免疫原性を最小限にする。本発明の１つの実施形態において、親抗体はマウス起源である。例えば、復帰変異は、ヒトのフレームワーク残基を親のマウス残基に変える。復帰変異され得るフレームワーク残基の例としては、正準残基、インターフェース詰め込み残基、結合部位に隣接する異常な親残基、「ベルニエゾーン」（これは、ＣＤＲが存在するプラットフォームを形成する）（Ｆｏｏｔｅ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４，４８７−４９９）の残基、ならびに、ＣＤＲ Ｈ３に隣接する残基が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書中で使用される場合、「保存的変化」は、実質的に立体配置的または抗原性的にニュートラルであり、ネイティブなタンパク質と比較した場合に、それぞれ、変異体ポリペプチドの三次構造に最小限の変化を生じるか、または、変異体ポリペプチドの抗原性決定基に最小限の変化を生じる、変更をいう。本発明の抗体および抗体フラグメントを参照する場合、保存的変化とは、目的のレセプターに結合し得ない抗体を与えないアミノ酸置換を意味する。当業者は、立体配置的かつ抗原性的にニュートラルである高い可能性を維持しつつ、どのアミノ酸置換がなされ得るかを予測し得る。このようなガイダンスは、例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：９３２−９４０およびＢｏｗｉｅら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０に提供される。立体配置的および抗原性的にニュートラリティを維持する可能性に影響を及ぼすと考えられている因子としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：（ａ）疎水性アミノ酸の置換が、抗原性にあまり影響を及ぼさない傾向にあること（なぜならば、疎水性残基が、よりタンパク質の内側に配置される傾向にあるからである）；（ｂ）生理化学的に類似するアミノ酸の置換が、立体配置にあまり影響を及ぼさない傾向にあること（なぜならば、置換されたアミノ酸が、ネイティブなアミノ酸を構造的に模倣するからである）；および（ｃ）進化的に保存された配列の変更が、立体配置に悪影響を及ぼす傾向があり、このような保存は、このアミノ酸配列が、機能的な重要性を有し得るということを示唆すること。当業者は、周知のアッセイ（例えば、微量構成成分固定法（Ｗａｓｓｅｒｍａｎら（１９６１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８７：２９０−２９５；Ｌｅｖｉｎｅら（１９６７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１１．９２８−９３６）および立体配置依存性のモノクローナル抗体を用いるスルー結合研究（ｔｈｒｏｕｇｈ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｔｕｄｙ）（Ｌｅｗｉｓら（１９８３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２：９４８−９５４）であるがこれらに限定されない）を使用して、タンパク質の立体配置の変更を評価し得る。

本明細書中で使用される場合、「治療組成物」は、疾患状態を直接または間接的に改善する組成物をいう。すなわち、この組成物の投与は、疾患または障害の少なくとも１つの症状を緩和する。

用語「〜に特異的」は、本発明の抗体を記載するために使用される場合、本発明の抗体の可変領域が、１つ以上のレセプターのセットを認識し、そして結合する（すなわち、ＬＴ−β−Ｒとこのようなポリペプチドとの間の局所的な配列同一性、相同性または類似性の存在可能性にも関わらず、結合親和性の測定可能な差異により他のポリペプチドからＬＴ−β−Ｒを区別し得る）ことを示唆する。特異的な抗体がまた、抗体の可変領域の外側、および、特に、分子の定常領域の配列との相互作用を介して他のタンパク質（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓプロテインＡまたはＥＬＩＳＡ技術における他の抗体）と相互作用し得ることが理解される。本発明の抗体の結合特異性を決定するためのスクリーニングアッセイは、当該分野で周知であり、当該分野で慣習的に実施される。このようなアッセイの包括的な議論については、Ｈａｒｌｏｗら（編），ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，第６編を参照のこと。この抗体が、ＬＴ−β−Ｒに特異的である場合、ＬＴ−β−Ｒのフラグメントを認識し、そして結合する抗体がまた企図される。本発明の抗体は、当該分野で周知かつ慣習的に実施される任意の方法を使用して産生され得る。

用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、本明細書中で使用される場合、ＬＴ−β−Ｒの特定のエピトープと免疫反応し得るか、または、結合し得る抗原結合部位の１種のみを含む抗体分子の集団をいう。従って、モノクローナル抗体組成物は、代表的には、この抗体が免疫反応するＬＴ−β−Ｒの特定のエピトープに対する単一の結合親和性を示す。ＬＴ−β−Ｒ、または、その誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに対するモノクローナル抗体の調製のために、継代細胞株培養による抗体分子の産生を提供する任意の技術が利用され得る。このような技術としては、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７を参照のこと）；トリオーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｎｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ４：７２を参照のこと）、および、ヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９８５：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定さない。ヒトモノクローナル抗体は、本発明の実施に利用され得、そして、ヒトハイブリドーマ（Ｃｏｔｅら（１９８３）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０．２０２６−２０３０を参照のこと）を使用するか、または、インビトロでエプスタイン・バーウイルスを用いてヒトＢ細胞を形質転換する（Ｃｏｌｅら（１９８５）：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６）ことによって産生され得る。本発明のキメラモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体は、例えば、ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；欧州特許出願番号１８４，１８７；欧州特許出願番号１７１，４９６；欧州特許出願番号１７３，４９４；ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ ８６／０１５３３；米国特許第４，８１６，５６７号；欧州特許出願番号１２５，０２３；Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６−４４９；Ｓｈａｗら（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉら（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４；米国特許第５．２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４；およびＢｅｉｄｌｅｒら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｎｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０に記載される方法を用いて、当該分野で公知の組換えＤＮＡ技術により産生され得る。

本発明は、ヒトＬＴ−β−Ｒに結合するヒト化モノクローナル抗体、および、この抗体を使用する診断方法、ならびに、治療剤としてのその使用に関する。本発明はさらに、上記ヒト化抗体をコードする核酸配列、および、組換え宿主細胞におけるその発現にも関する。より具体的には、本発明は、ヒトＬＴ−β−Ｒに特異的に結合するマウスＢＨＡ１０由来のヒト化抗体に関する。

マウスＢＨＡ１０（ｍＢＨＡ１０）は、ヒトＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質（Ｂｒｏｗｎｉｎｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４．３３（１９９５））で免疫されたマウスから単離されたマウスＩｇＧ１、κの抗体である。その単離および抗腫瘍特性が記載されている（Ｂｒｏｗｎｉｎｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：８６７（１９９６））。ｍＢＨＡ１０を産生するハイブリドーマ細胞株は、本発明の出願によりブダペスト条約の条件に従って、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に予め寄託され、ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ １１７９５が割り当てられた（ＰＣＴ／ＵＳ９６／０１３８６）。出願人はまた、種々のアゴニストである抗ＬＴ−β−Ｒ抗体と架橋しているＬＴ−βレセプターが、ＬＴ−βレセプターを活性化する（すなわち、ニュートラルなリガンドの作用を模倣し得る）ことを示している（ＰＣＴ／ＵＳ９６／０１３８６）。レセプターの活性化は、次いで、ＬＴ−βレセプターが発現している種々のインビボ腫瘍モデルにおいて、腫瘍の増殖を阻害することを示している。ＬＴ−βレセプターは、多数の癌細胞（例えば、非小細胞肺癌細胞（ＮＳＣＬＣ）、結腸直腸癌細胞（ＣＲＣ）、乳癌細胞、ならびに前立腺、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）、皮膚、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）、食道および膀胱の癌細胞が挙げられる）について発現されることが示されている。アゴニストであるＬＴ−β−Ｒ抗体が阻害する腫瘍の非限定的な例としては、以下の固形腫瘍が挙げられる：ＨＴ２９結腸腺癌、ＨＴ３子宮頸癌腫、Ａ３７５黒色腫、ＭＤＡ−２３１乳癌腫および原発性結腸腫瘍。従って、アゴニストであるＬＴ−β−Ｒ抗体（特に、本明細書中に記載されるヒト化抗体）は、これらに抗体を、疾患の処置に対して有用にする特性を保持し、この疾患において、ＬＴ−β−Ｒの活性化および／またはＬＴ−β−Ｒ／ＬＴ−β−Ｒリガンド相互作用の調節（例えば、被験体（例えば、ヒト）における新生物形成の進行、重篤度または作用の処置または減少を含む）が、望ましい。

モデリング分析および、ｍＢＨＡ１０モノクローナル抗体の結合特性を実質的に保持することを必要とする復帰変異を含む、ｍＢＨＡ１０モノクローナル抗体のヒト化が本明細書中に記載される。

（マウス可変領域のモデリング分析）
ＣＤＲは、抗原に最も結合する可能性のある残基を含み、新形態化抗体において保持されていなければならない。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｎｉｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｏｆｆｉｃｅ，１９９１に従う配列により規定される。ＣＤＲは、正準クラス（Ｃｈｏｔｈｉａら，１９８９ Ｎａｔｕｒｅ，３４２，８７７−８８３）に分類され、このクラスでは、重要な残基が、ＣＤＲループの構造的立体配置を大部分決定する。これらの残基は、大抵いつも、新形態化抗体において保持される。ｍＢＨＡ１０の軽鎖可変ドメインのポリペプチド配列を、ＣＤＲに下線を付して以下に示す。残基位置の数は、Ｋａｂａｔの番号付けシステムに従って指定する：

ｍＢＨＡ１０の重鎖可変ドメインのポリペプチド配列を、ＣＤＲに下線を付して以下に示す。残基位置の数は、Ｋａｂａｔの番号付けシステムに従って指定する（これは、太字のアミノ酸５２ａ（ｐｒｏ）、８２ａ（ｓｅｒ）、８２ｂ（ｓｅｒ）、８２ｃ（ｌｅｕ）よび１００位のアミノ酸なしを含む）：

ｍＢＨＡ１０の可変軽鎖および可変重鎖を、ＦＡＳＴＡプログラムを使用して、マウスおよびヒトのサブグループについてのコンセンサス配列と比較した（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇ．，Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．Ｋａｂａｔ Ｄａｔａｂａｓｅ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：ｆｕｔｕｒｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２９，２０５−２０６，２００１；ＷｕおよびＫａｂａｔ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３２：２１１−２５０（１９７０））。ｍＢＨＡ１０可変軽鎖は、１１３アミノ酸にわたって６３．７％の同一性を有するマウスκＩのメンバーであり、ｍＢＨＡ１０可変重鎖は、１２７アミノ酸にわたって７３．２％同一なマウスサブグループＩＩｂのメンバーである。可変軽鎖は、１１３アミノ酸にわたって６１．１％同一なヒトκＩに対応する。可変重鎖は、１２９アミノ酸にわたって６２％同一なヒトサブグループＩに対応する。

本発明の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、正準クラスに分類された。Ｌ１ループは、正準クラス２（１１残基のループ）に分類され、Ｌ２はクラス１（７残基）に、そして、Ｌ３はクラス１（９残基）に分類された。Ｈ１ループは、Ｌｅｕ３４を許容するクラス１（５残基）に分類された。Ｈ２およびＨ３のループは、正準クラスには属さなかった。これらのクラスについて重要な正準残基は、以下の表１に示す。

可変軽鎖と可変重鎖との間の界面にある残基が定義されている（Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８５ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８６，６５１−６６３）。これらは通常、新形態化抗体において保持されている。ｍＢＨＡ１０において、これらの残基のいくつかが、界面において異常である（すなわち、可変軽鎖におけるチロシン３６およびフェニルアラニン８７と可変重鎖におけるフェニルアラニン９１）。

異常なフレームワーク残基は、１９９９年９月バージョンのＫａｂａｔデータベース［ＮＣＢＩ，ＮＩＨ］における、全てのマウスおよびヒトの可変鎖配列を分析することにより決定された。これらの差が、結合部位に近接する場合、ｍＢＨＡ１０特有の差は、結合活性を増強する体細胞変異を示唆し得ることが考えられる。見出される異常なフレームワーク残基は、軽鎖におけるＹ３６、Ｓ４９、Ｔ６３およびＦ８７；ならびに、重鎖におけるＹ２７、Ｔ３０、Ｉ４８、Ａ６７、Ｌ６９およびＦ９１であった。

（可変領域の構造のモデリング）
本発明の軽鎖および重鎖を重複なしのデータベースに対して整列して、軽鎖および重鎖の三次元モデルを構築するのに使用される構造フレームを決定した。ＢＬＡＳＴを使用して、軽鎖は、マウスＦａｂフラグメント（１２Ｅ８）と８５％の配列同一性を有すことが見出され、重鎖は、マウスＩＧＧＡ２ Ｆａｂフラグメント（１ＰＬＧＨ）に対して８１％の配列同一性を有することが見出された。分子モデリングパッケージＳｙｂｙｌ（Ｔｒｉｐｏｓ Ｉｎｃ．）を使用して、それぞれ、１２Ｅ８の軽鎖および１ＰＬＧＨの重鎖を用いる軽鎖および重鎖の三次元構造を構築した。このモデルの構造統合性を、コンソールにて評価し、妥当であることを見出した。

（新形態化可変領域の設計）
生殖系列マッチングを使用して、ｍＢＨＡ１０ＣＤＲを「受け取る」ヒトアクセプターフレームワークを選択した（Ｒｏｓｏｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ（１９９６）２７１：２２６１１−２２６１８）。ＮＣＢＩ、ＥＮＴＲＺ（Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）からの生殖系列データベースおよび重複なしのデータベースの両方を、ソフトウェアプログラムＩｇＢＬＡＳＴを用いて検索した。ヒトアクセプターフレームワークの選択は、配列同一性および可能な復帰変異に基づいてなされた。

ヒトフレームワークの最終的な選択は、可変軽（ＶＬ）鎖について生殖系列配列Ｌ１／Ｌ１５およびＪ１由来であり（Ｂｅｎｔｌｅｙら（１９８３）Ｃｅｌｌ ３２：１８１−１８９；Ｃｏｘら（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４：８２７−８３６およびＨｅｉｔｅｒら（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１５１６−１５２２））、可変重（ＶＨ）鎖については、生殖系列配列１−６９／Ｊ６由来であった（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：７７６−７９８およびＭａｔｔｉｌａら（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２５：２５７８−２５８２）。ヒトＶＬフレームワークおよびＶＨフレームワークは、マウスの配列と比較して、各々２１残基の差を有する。

（ヒトフレームワークの復帰変異）
モノクローナル抗体のヒト化における最も予測不可能な手順は、親抗体の結合特性を実質的に保持し、一方で、同時に、生じる抗体の潜在的な免疫原性を最小限にするために、保持される必要がある、親抗体（すなわち、本願の場合は、親抗体は、マウス起源である）由来の重大な意味を持つフレームワーク残基の同定である。正準残基、残基をパックする界面、および結合部位に隣接する異常なマウス残基を保持することが特に重要である。さらに、「ベルニエゾーン」の残基（これは、ＣＤＲが存在するプラットフォームを形成する）（Ｆｏｏｔｅ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ，１９９２ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４．４８７−４９９）およびＣＤＲ Ｈ３に隣接する残基が考えられる。親抗体に戻る変異（すなわち、ヒトフレームワーク残基からマウスへの復帰変異）は、本明細書中において、復帰変異と呼ばれる。

新形態化可変軽鎖（ＶＬ＃）の３つの型および新形態化可変重鎖（ＶＨ＃）の３つの型が作製された。一般に、第１の型は、最も復帰している変異を含み、そして、第３の型は、最も少ない復帰変異を含む（すなわち最も「ヒト化」されている）。本発明は、任意の組み合せの、以下に記載される可変軽鎖（すなわち、ＶＬ＃１、ＶＬ＃２またはＶＬ＃３）から選択される可変軽鎖、および、以下に記載される可変重鎖（すなわち、ＶＨ＃１、ＶＨ＃２またはＶＨ＃３）から選択される可変重鎖を含むｍＢＨＡ１０由来のヒト化抗体を企図する。

（新形態化可変軽鎖における復帰変異）
３６Ｆ（フェニルアラニン）−＞Ｙ（チロシン）。これは、パッキング残基である。これは、可変軽鎖構築物のＶＬ＃１およびＶＬ＃２においてフェニルアラニンからチロシンへと復帰変異したが、可変軽鎖構築物のＶＬ＃３においては、フェニルアラニンとして保持された。

４９Ｙ（チロシン）−＞Ｓ（セリン）。この位置は、ＣＤＲに隣接し、マウスおよびヒトのフレームワークの両方において異常である。これは、可変軽鎖構築物の３つ全ての型においてチロシンからセリンへと復帰変異した。

６３Ｓ（セリン）−＞Ｔ（スレオニン）。この位置は、ＣＤＲに隣接する。これは、可変軽鎖構築物のＶＬ＃１においてのみ、セリンからスレオニンへと復帰変異した。

８７Ｙ（チロシン）−＞Ｆ（フェニルアラニン）。これは、パッキング残基であり、ヒトフレームワークにおいて異常である。これは、可変軽鎖構築物のＶＬ＃１およびＶＬ＃２においてチロシンからフェニルアラニンへと復帰変異したが、ＶＬ＃３においてはチロシンとして保持された。

（新形態化可変重鎖における復帰変異）
２７Ｇ（グリシン）−＞Ｙ（チロシン）。これは３つ全ての型においてマウス残基へと復帰変異する正準残基である。

３０Ｓ（セリン）−＞Ｔ（スレオニン）。この位置は、ＣＤＲに隣接し、そして、立体配置に影響を及ぼし得る。これは、可変重鎖構築物の３つ全ての型においてセリンからスレオニンへと復帰変異した。

４８Ｍ（メチオニン）−＞Ｉ（イソロイシン）。この位置は、ＣＤＲに隣接する。これは、可変重鎖構築物のＶＨ＃１およびＶＨ＃２においてメチオニンからイソロイシンへと復帰変異したが、ＶＨ＃３においては復帰変異しなかった。

６７Ｖ（バリン）−＞Ａ（アラニン）。この位置はＣＤＲに隣接し、ヒトフレームワークにおいて異常である。これは、可変重鎖構築物のＶＨ＃１およびＶＨ＃２においてバリンからアラニンへと復帰変異したが、ＶＨ＃３においては復帰変異しなかった。

６９Ｉ（イソロイシン）−＞Ｌ（ロイシン）。この位置はＣＤＲに隣接し、ヒトフレームワークにおいて異常である。これは、可変重鎖構築物のＶＨ＃１においてイソロイシンからロイシンへと復帰変異したが、ＶＨ＃２およびＶＨ＃３においては復帰変異しなかった。

９１Ｙ（チロシン）−＞Ｆ（フェニルアラニン）。これは、パッキング残基である。これは、可変重鎖構築物のＶＨ＃１においてはチロシンからフェニルアラニンへと復帰変異したが、ＶＨ＃２およびＶＨ＃３においては復帰変異しなかった。

可変軽鎖および重鎖の異なる型の各々のアミノ酸配列および核酸配列は、以下の通りである：
（新形態化可変軽鎖）
ＢＨＡ１０新形態化可変軽鎖−可変軽鎖−１型（ＶＬ＃１）：

配列番号３は、上記新形態化ＶＬ＃１の核酸配列を表す。

配列番号４は、上記新形態化ＶＬ＃１のアミノ酸配列を表す。

ＢＨＡ１０の新形態化可変軽鎖−可変軽鎖−２型（ＶＬ＃２）：

配列番号５は、上記新形態化ＶＬ＃２の核酸配列を表す。

配列番号６は、上記新形態化ＶＬ＃２のアミノ酸配列を表す。

ＢＨＡ１０の新形態化可変軽鎖−可変軽鎖−３型（ＶＬ＃３）：

配列番号７は、上記新形態化ＶＬ＃３の核酸配列を表す。

配列番号８は、上記新形態化ＶＬ＃３のアミノ酸配列を表す。

（新形態化可変重鎖）
ＢＨＡ１０の新形態化可変重鎖−可変重鎖−１型（ＶＨ＃１）：

配列番号９は、上記新形態化ＶＨ＃１の核酸配列を表す。

配列番号１０は、上記新形態化ＶＨ＃１のアミノ酸配列を表す（５２ａ位のプロリン、８２ａ位のセリン、８２ｂ位のセリン、８２ｃ位のロイシン、および１００位のアミノ酸欠失を含む、Ｋａｂａｔ番号付けシステム）。

ＢＨＡ１０の新形態化可変重鎖−可変重鎖−２型（ＶＨ２＃）：

配列番号１１は、上記新形態化ＶＨ＃２の核酸配列を表す。

配列番号１２は、上記新形態化ＶＨ＃２のアミノ酸配列を表す（５２ａ位のプロリン、８２ａ位のセリン、８２ｂ位のセリン、８２ｃ位のロイシン、および１００位のアミノ酸欠失を含む、Ｋａｂａｔ番号付けシステム）。

ＢＨＡ１０の新形態化可変重鎖−可変重鎖−３型（ＶＨ＃３）：

配列番号１３は、上記新形態化ＶＨ＃３の核酸配列を表す。

配列番号１４は、上記新形態化ＶＨ＃３のアミノ酸配列を表す（５２ａ位のプロリン、８２ａ位のセリン、８２ｂ位のセリン、８２ｃ位のロイシン、および１００位のアミノ酸欠失を含む、Ｋａｂａｔ番号付けシステム）。

上記および実施例４にさらに記載される新形態化可変軽鎖および重鎖を使用して、ヒト化ＢＨＡ１０抗体を構築した。例えば、ヒト化ＢＨＡ１０抗体４型（「４型ｈｕＢＨＡ１０」）を、軽鎖＃２を含む発現ベクターｐＫＪＳ４９を、重鎖＃３を含む発現ベクターｐＫＪＳ４６と組み合せて使用して、実施例４に記載されるように構築した。４型ｈｕＢＨＡ１０の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列および核酸配列を以下に列挙する：

上記配列番号１５は、４型ｈｕＢＨＡ１０の軽鎖のアミノ酸配列を表す。ＣＤＲに下線を付す；復帰変異Ｙ３６、Ｓ４９およびＦ８７は太字である；ヒトκ定常ドメインを括弧でくくる（ｋａｔａｔ番号付けシステム）。

上記配列番号１６は、４型ｈｕＢＨＡ１０の重鎖のアミノ酸配列を表す。ＣＤＲに下線を付す；復帰変異Ｙ２７およびＴ３０は太字である；ヒトＩｇＧ１定常ドメインを括弧でくくる（ｋａｂａｔ番号付けシステム）。

本明細書中に記載される種々の型の新形態化可変軽鎖および新形態化可変重鎖を含む他のヒト化抗体が作製され得る。例えば、ヒト定常軽鎖（非限定的な例としては、ヒトκ定常ドメインが挙げられる）およびヒト定常重鎖（非限定的な例としては、ヒトＩｇＧ１定常ドメイン）を、新形態化可変軽鎖（ＶＬ＃１、ＶＬ＃２またはＶＬ＃３）および新形態化可変重鎖（ＶＨ＃１、ＶＨ＃２またはＶＨ＃３）と組み合せて含む抗体を作製し得る。

本発明はさらに、新形態化ＶＨ配列およびＶＬ配列の等価物および改変体（例えば、ＬＴ−β−Ｒ結合に実質的に影響を及ぼさない１つ以上の保存的アミノ酸置換を有する配列）を意図する。これらのヒト化可変重鎖配列およびヒト化可変軽鎖配列を含むヒト化ＬＴ−β−Ｒ抗体は、実施例に記載されるような組換え法により得られ得る。

別の実施形態において、本発明の抗体の免疫化学的誘導体は、例えば、１）免疫毒素（抗体と細胞傷害性部分との結合体）および２）標識された誘導体（すなわち、放射標識されたか、酵素標識されたか、または、蛍光色素標識された）を含むことが意図され、ここで、この標識は、標識抗体を含む免疫複合体を同定するための手段を提供する。

細胞傷害性部分は、細胞傷害性薬物、または、細菌起源もしくは植物起源の酵素的に活性な毒素、または、このような毒素の酵素的に活性なフラグメントであり得る。使用される酵素的に活性な毒素およびそのフラグメントは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性化フラグメント、エキソトキシンＡ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒａｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａインヒビター、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓインヒビター、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）およびエノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）である。あるいは、これらの抗体は、低分子抗癌剤に結合体化される。

モノクローナル抗体の結合体が、種々の二機能性タンパク質結合剤を使用して作製される。このような試薬の例は、ＳＰＤＰ、ＩＴ、イミドエステルの二機能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アゾ化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリレン２，６−ジイソシアネート）およびビス活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）である。毒素の溶解部分は、抗体のＦａｂフラグメントに接続され得る。

癌を処置するための細胞傷害性放射性薬剤が、放射活性アイソトープ（例えば、Ｉ、Ｙ、Ｐｒ）を抗体に結合体化させることによって作製され得る。用語「細胞傷害性部分」は、本明細書中で使用される場合、このようなアイソトープを含むことを意図する。別の実施形態において、リポソームが細胞傷害性薬物で充填され、このリポソームは、増殖因子レセプターに特異的に結合する抗体でコーティングされる。多くのレセプター部位が存在するので、この方法は、大量の薬物の正しい細胞型への送達を可能にする。

（化学的修飾）
いくつかの実施形態において、本発明の抗体および抗体フラグメントは、化学的に修飾されて、所望の作用を提供し得る。例えば、本発明の抗体および抗体フラグメントのペグ化は、例えば、以下の参考文献に記載されるような、当該分野で公知のペグ化反応のいずれかにより実施され得る：Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ３：４−１０（１９９２）；ＥＰ ０ １５４ ３１６；およびＥＰ ０ ４０１ ３８４（これらの各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される）。好ましくは、ペグ化は、反応性ポリエチレングリコール分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）を用いて、アシル化反応またはアルキル化反応を介して実施される。本発明の抗体および抗体フラグメントのペグ化に好ましい水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。本明細書中で使用される場合、「ポリエチレングリコール」は、他のタンパク質を誘導体化させるのに使用されている、任意のＰＥＧの形態（例えば、モノ（Ｃｌ−ＣｌＯ）アルコキシ−ポリエチレングリコールまたはアリールオキシ−ポリエチレングリコール）を包含することを意味する。

本発明のペグ化抗体および抗体フラグメントを調製するための方法は、一般に、（ａ）抗体または抗体フラグメントが、１つ以上のＰＥＧ基に接続されるようになる条件下で、抗体または抗体フラグメントをポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）と反応させる工程；ならびに（ｂ）反応性生物を得る工程を包含する。公知のパラメータおよび所望の結果に基づいて、最適な反応条件またはアシル化反応を選択することが、当業者に明らかである。

ペグ化抗体および抗体フラグメントは、一般に、本明細書中に記載される抗体および抗体フラグメントの投与により緩和または変調され得る状態を処置するために使用され得る。一般に、ペグ化抗体および抗体フラグメントは、非ペグ化抗体および抗体フラグメントと比較した場合、増加した半減期を有する。ペグ化抗体および抗体フラグメントは、単独で、他の薬学的組成物と一緒に、または、他の薬学的組成物と組み合せて使用され得る。

本発明の他の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、当該分野で認識される技術を使用してアルブミンに結合体化される。

本発明の別の実施形態において、抗体またはそのフラグメントは、潜在的なグリコシル化部位を減少または除外するように修飾される。このような修飾抗体は、しばしば、「非グリコシル化」抗体と呼ばれる。抗体またはその抗原結合フラグメントの結合親和性を改善するために、抗体のグリコシル化部位が、例えば、突然変異誘発（例えば、部位指向性突然変異誘発）により変更され得る。「グリコシル化部位」は、真核細胞によって、糖残基の結合のための位置として認識されるアミノ酸残基をいう。炭化水素（例えば、オリゴ糖）が結合しているアミノ酸は、代表的には、アスパラギン（Ｎ−結合）、セリン（Ｏ−結合）およびスレオニン（Ｏ−結合）残基である。抗体または抗原結合フラグメント内の潜在的なグリコシル化部位を同定するために、抗体の配列が、例えば、公的に利用可能なデータベース（例えば、Ｎ連結グリコシル化部位の予測についてはｔｈｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓにより提供されるウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＮＧｌｙｃ／を参照のこと）、および、Ｏ連結グリコシル化部位の予測については、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＯＧｌｙｃ／）を使用して、試験される。抗体のグリコシル化部位を変更するためのさらなる方法は、米国特許第６，３５０，８６１号および同第５，７１４，３５０号に記載される。

本発明のなお別の実施形態において、抗体またはそのフラグメントが、変更され得、ここで、この抗体の定常領域が、修飾されていない抗体と比較して、少なくとも１つの定常領域媒介性の生物学的エフェクター機能を減少するように修飾される。本発明の抗体が、Ｆｃレセプターに対する減少した結合を示すように修飾するために、この抗体の免疫グロブリン定常領域セグメントを、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）相互作用に必要とされる特定の領域において変異され得る（例えば、Ｃａｎｆｉｅｌｄ，Ｓ．Ｍ．およびＳ．Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１４８３−１４９１；ならびにＬｕｎｄ，Ｊ．ら（１９９１）Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：２６５７−２６６２を参照のこと）。抗体のＦｃＲ結合能の減少はまた、ＦｃＲ相互作用に依存する他のエフェクター機能（例えば、オプソニン作用およびファゴサイトーシスおよび抗原依存性の細胞傷害性）も減少する。

（使用）
本発明の抗体および標識された抗体は、種々の免疫画像化または免疫アッセイ手順において使用され、患者における癌の存在を検出するか、または、癌を有すると既に診断されている患者におけるこのような癌の状態をモニタリングし得る。癌の状態をモニタリングするために使用される場合、定量的な免疫アッセイ手順が使用されなければならない。このようなモニタリングアッセイが定期的に行われ、結果が比較される場合、患者の腫瘍負荷が増加したか減少したかに関しての決定がなされ得る。使用され得る一般的なアッセイ技術としては、直接アッセイおよび間接アッセイが挙げられる。サンプルが癌細胞を含む場合、標識された抗体はこれらの細胞に結合する。組織または細胞を洗浄して未結合の標識化抗体を除去した後、組織サンプルを、標識化免疫複合体の存在について読む。間接アッセイにおいて、組織サンプルまたは細胞サンプルは、未標識のモノクローナル抗体と共にインキュベートされる。次いで、このサンプルが、モノクローナル抗体に対する標識化抗体（例えば、標識化抗マウス抗体）で処理され、洗浄され、そして、三元複合体の存在について読まれる。

診断的な使用について、抗体は代表的には、キットの形態で配送される。これらのキットは、代表的には、以下を含む：適切な容器内の、標識または未標識の形態の抗体、間接アッセイ用のインキュベーションのための試薬、および、標識の性質に依存する基質または誘導体化剤。

別の実施形態において、本発明の抗体は、疾患状態の処置に使用され、この状態において、ＬＴ−β−Ｒの活性化が治療的に有効である。このような状態としては、新生物形成の進行、重篤度または作用の処置、予防または減少が挙げられるがこれらに限定されない。

１つの実施形態において、本発明は、本発明のヒト化ＬＴ−β−Ｒ抗体を含む治療有効量の組成物を哺乳動物に投与することによって、所望でない細胞増殖に関連する状態について哺乳動物（例えば、ヒト）を処置する方法である。

別の実施形態において、本発明は、ＬＴ−β−Ｒを過剰発現する固形腫瘍（すなわち、癌腫）を有する哺乳動物（すなわち、ヒト）を処置する方法であり、この方法は、上記哺乳動物に、ＬＴ−β−Ｒに結合するヒト化ＬＴ−β−Ｒ抗体を、腫瘍体積を減少するのに有効な量で投与する工程を包含する。その細胞増殖がＬＴ−β−Ｒにより調節される癌の例は、ＬＴ−β−Ｒのインビトロレベルおよび／または腫瘍組織ライブラリーにおいて発現されるＬＴ−β−Ｒリガンド（すなわち、ＬＴα１β２またはＬＩＧＨＴ）メッセージを測定することによりスクリーニングされ得る。ＬＴ−β−Ｒおよび/またはＬＴ−β−Ｒリガンド（すなわち、ＬＴα１β２またはＬＩＧＨＴ）メッセージが高度に発現されている腫瘍組織ライブラリーが候補である。本発明において企図される腫瘍型としては、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、乳癌、ならびに、前立腺、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）、皮膚、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）、食道および膀胱の癌が挙げられるがこれらに限定されない固形腫瘍が挙げられる。

所望でない細胞増殖に関する症状の処置（特に、腫瘍治療）において使用される本発明のヒト化抗体は、例えば、腫瘍体積の減少により測定した場合、有利には、約１０％、約２０％、約３０％、または約４０％より多く腫瘍細胞の増殖を阻害し、そして、最も有利には、約５０％より多く腫瘍細胞の増殖を阻害する。ヒト化抗体は、スクリーニング（例えば、実施例１０における議論を参照のこと）を通して得られる。例えば、本発明における使用のためのヒト化抗体は、未処置の癌細胞に対しての減少した腫瘍体積（例えば、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％または約５０％より多い）の観点から選択され得る。

本発明はまた、本発明のヒト化抗体および薬学的に受容可能な賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。適切なキャリアおよびその処方物は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、１９８０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，（Ｏｓｌｏら編）に記載される。代表的には、適切な量の薬学的に受容可能な塩が処方物中で使用され、処方物を等張性にする。キャリアの例としては、緩衝液（例えば、生理食塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液）が挙げられる。溶液のｐＨは、好ましくは、約５〜約８であり、より好ましくは、約７．４〜約７．８である。さらに、キャリアは、固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスのような徐放性調製物を含み、このマトリクスは、成形加工した物品の形状（例えば、リポソーム、フィルムまたは微粒子）である。例えば、投与経路および投与される薬学的組成物の濃度に依存して、特定のキャリアがより好ましくあり得ることが、当業者には明らかである。

投与は、注射（例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内）、または、有効な形態で血流内への送達を保証する、注入のような他の方法により達成され得る。

本発明のヒト化抗体は、処置を施される特定の臨床状態を処置するのに有効な用量（すなわち、患者の腫瘍負荷を排除または減少する量）で投与され得る。これらは、通常は、可能である場合は、標的細胞部位にて非経口的に投与されるか、または、静脈内投与される。所定の適用に対する好ましい薬学的処方物および治療有効用量レジメンの決定は、十分に当業者の技術の範囲内である。用量および投薬レジメンは、症状の性質（すなわち、癌の性質）、特定の免疫毒素の特性（使用される場合）、例えば、その治療指数、患者および患者の病歴に依存する。有効投薬量は、例えば、１日あたり、体重１ｋｇあたり、約０．０５〜約１００ｍｇの範囲である。より具体的には、１日あたり、体重１ｋｇあたり、約０．０５ｍｇ、約０．１ｍｇ、約０．２ｍｇ、約０．３ｍｇ、約０．４ｍｇ、約０．５ｍｇ、約０．６ｍｇ、約０．７ｍｇ、約０．８ｍｇ、約０．９ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ｍｇ、約１０ｍｇ、約１５ｍｇ、約２０ｍｇ、または約２５ｍｇ。あるいは、１週間あたり、体重１ｋｇあたり、約０．０５〜約１００ｍｇ、より具体的には、約０．０５ｍｇ、約０．１ｍｇ、約０．２ｍｇ、約０．３ｍｇ、約０．４ｍｇ、約０．５ｍｇ、約０．６ｍｇ、約０．７ｍｇ、約０．８ｍｇ、約０．９ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ｍｇ、約１０ｍｇ、約１５ｍｇ、約２０ｍｇまたは約２５ｍｇ。あるいは、２週あたり、体重１ｋｇあたり、約０．０５〜約１００ｍｇ、より具体的には、約０．０５ｍｇ、約０．１ｍｇ、約０．２ｍｇ、約０．３ｍｇ、約０．４ｍｇ、約０．５ｍｇ、約０．６ｍｇ、約０．７ｍｇ、約０．８ｍｇ、約０．９ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ｍｇ、約１０ｍｇ、約１５ｍｇ、約２０ｍｇ、または約２５ｍｇ。あるいは、３週間あたり、体重１ｋｇあたり、約０．０５〜約１００ｍｇ、より具体的には、約０．０５ｍｇ、約０．１ｍｇ、約０．２ｍｇ、約０．３ｍｇ、約０．４ｍｇ、約０．５ｍｇ、約０．６ｍｇ、約０．７ｍｇ、約０．８ｍｇ、約０．９ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ｍｇ、約１０ｍｇ、約１５ｍｇ、約２０ｍｇまたは約２５ｍｇ。あるいは、４週間あたり、体重１ｋｇあたり、約０．０５〜約１００ｍｇ、より具体的には、約０．０５ｍｇ、約０．１ｍｇ、約０．２ｍｇ、約０．３ｍｇ、約０．４ｍｇ、約０．５ｍｇ、約０．６ｍｇ、約０．７ｍｇ、約０．８ｍｇ、約０．９ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ｍｇ、約１０ｍｇ、約１５ｍｇ、約２０ｍｇまたは２５ｍｇ。

別の実施形態において、腫瘍細胞は、１）患者に、本発明のヒト化抗体を投与すること、および２）化学療法剤により処置される。化学療法剤の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：シスプラチン、タキソール、カンプトサル（ｃａｍｐｔｏｓａｒ）、アドリアマイシン（ｄｏｘ）、５−ＦＵ、ゲムシタビン、ＤＭ−１（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎから入手可能）、ビンブラスチン、アクチノマイシンＤ、エトポシド、メトトレキサート、およびドキソルビシン。治療レジメンおよび個人に投与される投薬量（例えば、投与経路および患者の臨床症状を含む）の決定において、いくつかの変数が、当業者により考慮される。１つの実施形態において、本発明の抗体は、化学療法剤または放射線の存在下で投与されるように設計される。別の実施形態において、本発明の抗体は、化学療法または放射線と組み合せての使用のための指示書と共に処方および梱包されるか、あるいは、化学療法または放射線と組み合せての使用のために市販または販売促進される。

他に示されない限り、本発明の実施は、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、タンパク質化学および免疫学の従来技術を使用し、これらは、当業者の範囲内である。このような技術は、文献に記載されている。例えば、

以下の実施例は、本発明を例示するために提供され、本発明を限定するものとしてみなされるべきでない。

（実施例１−ｍｕＢＨＡ１０可変領域のクローニング）
ＢＨＡ１０マウスハイブリドーマ細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ−１１７９５）由来の総細胞ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙミニキットを製造業者の推奨するプロトコールに従って使用して調製した。重鎖および軽鎖の種々の領域をコードするｃＤＮＡを、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓを製造業者の推奨するプロトコールに従って使用して、プライミングとしてランダムヘキサマーを用いる逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により、総細胞ＲＮＡからクローニングした。

マウスＢＨＡ１０免疫グロブリン重鎖可変ドメインのＰＣＲ増幅のために使用したプライマーは、以下の通りであった：５’ ＴＧＡ ＧＧＡ ＧＡＣ ＧＧＴ ＧＡＣ ＣＧＴ ＧＧＣ ＣＣＴ ＴＧＧ ＣＣＣ Ｃ ３’（配列番号１７）および５’ ＡＧＧ ＴＳＭ ＡＲＣ ＴＧＣ ＡＧＳ ＡＧＴ ＣＷＧ Ｇ ３’（Ｓ＝Ｃ／Ｇ，Ｍ＝Ａ／Ｃ，Ｒ＝Ａ／Ｇ，およびＷ＝Ａ／Ｔ）（配列番号１８）。シグナル配列を含むＢＨＡ１０軽鎖可変ドメインを、以下のプライマーを用いて増幅した：５’ ＡＣＴ ＡＧＴ ＣＧＡ ＣＡＴ ＧＧＧ ＣＷＴ ＣＡＡ ＧＡＴ ＧＧＡ ＧＴＣ ＡＣＡ ＫＶＶＹ ＹＣＷ ＧＧ ３’（Ｋ＝Ｇ／Ｔ、Ｗ＝Ａ／ＴおよびＹ＝Ｃ／Ｔ）（配列番号１９）および５’ ＧＴＴ ＡＧＡ ＴＣＴ ＣＣＡ ＧＣＴ ＴＧＧ ＴＣＣ Ｃ ３’（配列番号２０）。ＰＣＲを、９４℃にて３分間のホットスタート：次いで、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製のＡｄｖａｎＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用する３５サイクル：変性 ９４℃にて１分間、アニーリング ５０℃にて１分間、伸長 ６８℃にて２分間、そして、最後に６８℃にて７分間の伸長に供した。ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｇｅｎ Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キットを製造業者の推奨するプロトコールに従って使用してゲル精製した。精製したＢＨＡ１０ ＰＣＲ産物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｔｅｎ製のＴＯＰＯ ＴＡクローニングキットを製造業者の推奨するプロトコールに従って使用して、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯクローニングベクターにサブクローニングした。重鎖のＲＲＴ−ＰＣＲサブクローンを、ｐＡＮＤ１３８と名付けた。軽鎖のＲＴ−ＰＣＲサブクローンをｐＡＮＤ１４５と名付けた。複数の独立したサブクローンからの挿入物を配列決定した。ＰＣＲプライマー内の変性位置を除いて、独立したサブクローンの挿入配列は同一であった。シグナル配列を用いて増幅したＰＣＲ産物由来のｃＤＮＡ配列により予測された成熟な軽鎖についてのＮ末端アミノ酸配列は、エドマン分解由来の精製真正ＢＨＡ１０軽鎖のＮ末端配列と正確に適合した（ＤＩＶＭＴＱＳＱＫＦ）（配列番号２１）。成熟な重鎖残基１〜１６についての予測配列は、逆ブロック化精製したＢＨＡ１０重鎖のエドマン分解により決定された配列と適合した（［Ｑ］ＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡ）（配列番号２２）。

可変ドメイン配列のＢｌａｓｔ分析は、その免疫グロブリンの同一性を確認した。ＢＨＡ１０重鎖可変ドメインは、マウスサブグループＩＩ（Ｂ）のメンバーである。Ｔｕｃｋｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０６：１２９９−１３０３（１９７９）。ＢＨＡ１０軽鎖可変領域は、マウスκサブグループＩのメンバーである。Ｋａｂａｔら（１９９１） Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ。ＢＨＡ１０マウス可変軽鎖および可変重鎖ドメインの予測されたアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１および配列番号２に示す。

（実施例２−ｃｈＢＨＡ１０の構築および発現）
マウスＢＨＡ１０の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを使用して、マウス−ヒトキメラの発現のためのベクター（ｃｈＢＨＡ１０）を構築した。このベクターにおいて、ｍｕＢＨＡ１０可変領域を、ヒトＩｇＧ１（Ｅｌｌｉｓｏｎら（１９８２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：４０７１−４０７９）およびκ定常領域（Ｈｅｉｔｅｒら（１９８０）Ｃｅｌｌ ２２：１９７−２０７））に連結した。重鎖キメラの構築のために、ＢＨＡ１０重鎖サブクローンｐＡＮＤ１３８からの０．３２ｋｂの部分ＰｓｔＩ−ＢｓｔＥＩＩフラグメントを、５ａ８重鎖プラスミドｐＬＣＢ７（５ａ８は、分子的にクローニングされたＣＤ４特異的ｍＡｂ（ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ−１０８８１）である）からの脱リン酸化した２．８２ｋｂのＰｓｔＩ−ＢｓｔＥＩＩベクターフラグメントにサブクローニングし、ｍＢＨＡ１０重鎖可変領域の５’末端にマウス重鎖シグナル配列番号を、そして、３’末端にスプライスドナー部位を加えた。このプラスミド（いわゆるｐＡＮＤ１４６）において、重鎖の成熟Ｎ末端を、精製された真正ＢＨＡ１０重鎖（ＱＶＱＬＱＱＳＧＰ）（配列番号２３）のＮ末端配列に適合するように再構成する。得られたプラスミドｐＡＮＤ１４６における重鎖配列を、ＤＮＡ配列決定により確認した。ｐＡＮＤ１４６からの０．４３ｋｂのＮｏｔｌ−ＨｉｎｄＩＩＩ重鎖可変ドメインフラグメント、および、ヒトＩｇＧ１定常領域を含む、プラスミドｐＥＡＧ９６４からの１．２１ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩフラグメントを、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＥＢＶ発現ベクター由来のプラスミドｐＣＨ２６９のＮｏｔＩ部位にサブクローニングし、プラスミドｐＡＮＤ１４７を作製した。

軽鎖キメラの構築のために、ＢＨＡ１０軽鎖可変ドメインプラスミドｐＡＮＤ１４５からの０．４２ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントを、直鎖状のリン酸化ｐＵＣ由来のクローニングベクターｐＮＮ０９のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングした。この工程は、得られたプラスミドｐＡＮＤ１４９に側方のＮｏｔＩ部位を追加した。プラスミドｐＡＮＤ１４９における軽鎖配列をＤＮＡ配列決定により確認した。ｐＡＮＤ１４９からの０．４５ｋｂのＮｏｔＩ−ＢｇｌＩＩ軽鎖可変ドメインフラグメント、および、ヒトκ軽鎖定常ドメインを含む、プラスミドｐＥＡＧ９６３からの０．６８ｋｂのＢｃｌＩ−ＮｏｔＩフラグメントを、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｆｅｎ）ＥＢＶ発現ベクター由来のプラスミドｐＣＨ２６９のＮｏｔＩ部位にサブクローニングし、プラスミドｐＡＮＤ１５１を作製した。

発現ベクター（ｃｈＢＨＡ１０重鎖ベクターｐＡＮＤ１４７およびｃｈＢＨＡ１０軽鎖ベクターｐＡＮＤ１５１）を、２９３−ＥＢＮＡ細胞に同時トランスフェクトし、トランスフェクトした細胞を、抗体の分泌および特異性について試験した。空のベクターでトランスフェクトした細胞、または、ｈｕ５ｃ８（分子的にクローニングしたＣＤ１５４特異的ｍＡｂ）およびｈｕＣＢＥ１１（ＬＴ−β−Ｒ特異的ｍＡｂ（ＡＴＣＣ特許寄託物名ＰＴＡ−３３５７を割り当てられている細胞株））に対するＥＢＶ発現ベクターと同時トランスフェクトした細胞をコントロールとした。全細胞溶解物および馴化培地からのプロテインＡ免疫沈降のウェスタンブロット分析（抗ヒト重鎖抗体および抗ヒト軽鎖抗体で展開した）は、ｃｈＢＨＡ１０でトランスフェクトした細胞が、ｈｕ５ｃ８またはｈｕＣＢＥ１１でトランスフェクトした細胞と類似のレベルで抗体重鎖および抗体軽鎖を合成し、効率的に分泌したことを示した。トランスフェクトした細胞からの馴化培地で染色したＬＴ−β−Ｒを発現するＨＴ−２９のＦＡＣＳ分析は、ｃｈＢＨＡ１０抗体が結合し、ｍｕＢＨＡ１０およびｈｕＣＢＥ１１のものと類似の染色パターンを生じた一方で、モックおよびｈｕ５ｃ８でトランスフェクトした細胞からの馴化培地が、ＨＴ−２９細胞上のＬＴ−β−Ｒを染色しなかったことを示した。大規模な一過性トランスフェクションから産生されたキメラＢＨＡ１０を精製し、ｈｕＣＢＥ１１のＫｄよりも約２倍高い見かけ上のＫｄでＨＴ−２９上のＬＴ−β−Ｒを染色するように実証した。これは、ｍｕＣＢＥ１１およびｍｕＢＨＡ１０について測定された相対的親和性と一致した（Ｂｒｏｗｎｉｎｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：８６７，１９９６）。

（実施例３−新形態化ＢＨＡ１０可変ドメインの構築）
ＢＨＡ１０軽鎖可変ドメインはヒトκＩ（Ｈｉｅｔｅｒら（１９８０）Ｃｅｌｌ ２２：１９７−２０７）に対応し、重鎖可変ドメインは、ヒト重サブグループＩ（Ｅｌｌｉｓｏｎら（１９８２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：４０７１−４０７９）に対応する。ヒトアクセプターフレームワークの選択は、プログラムＩｇＢＬＡＳＴを使用するヒト生殖系列配列に対するホモロジーマッチング（Ｓａｔｏら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：３７１−３８１（１９９４））によった：軽鎖については、ヒトＬｌ／Ｌｌ５／Ｊ１（Ｂｅｎｔｌｅｙら（１９８３）Ｃｅｌｌ ３２：１８１−１８９；Ｃｏｘら（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４：８２７−８３６およびＨｅｉｔｅｒら（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１５１６−１５２２）、ならびに、重鎖については、ヒト１−６９／Ｊ６（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：７７６−７９８およびＭａｔｔｉｌａら（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２５：２５７８−２５８２）。新形態化可変軽鎖および新形態化可変重鎖の各々の３つの型を設計した。一般に、第１の型は、マウスドナー配列に対して最も多く復帰変異を含み、一方で、第３の型は、最も少ない復帰変異を含む（すなわち、最も「ヒト化」されている）。

ＢＨＡ１０可変領域を、固有部位除去（ＵＳＥ）とＣｌｏｎｔｅｃｈ製のＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ突然変異誘発およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ製のＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ突然変異誘発キットを使用し、製造業者の推奨するプロトコールに従うＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ突然変異誘発を組み合せて、作製した。ｃｈＢＨＡ１０可変ドメインプラスミドｐＡＮＤ１４６およびｐＡＮＤ１４９を最初の鋳型として使用した。フレームワーク（ＦＲ）変更のための変異原性プライマーを以下に記載する。ヒトアクセプターフレームワークのｃＤＮＡ配列を使用し、サイレント突然変異を導入して、制限部位の変化を生じ、変異したプラスミドの同定を容易にした。変異したプラスミドを、導入された制限部位の変更についてスクリーニングすることにより同定した。得られたプラスミドにおける可変領域ｃＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定により確認した。

種々のＢＨＡ１０ベースのプラスミドおよび以下に記載される対応する発現ベクターを表２に列挙する。

（新形態化可変重鎖（ＶＨ））
可変重鎖１型を、最初に、ＳｔｕＩ制限部位を欠失するフレームワーク２（ＦＲ２）プライマー５’ ＧＣＡ ＣＴＧ ＧＧＴ ＧＡＧ ＧＣＡ ＧＧＣ ＣＣＣ ＴＧＧ ＡＣＡ ＧＧＧ ＡＣＴ ＴＧ ３’（配列番号２４）と共にｐＡＮＤ１４６鋳型を使用するＵＳＥ突然変異誘発により変異させて、プラスミドｐＫＪＳ０３０を作製した。このプラスミドを、引き続いて、オリゴプライマー５’ ＣＣＣ ＡＧＧ ＴＣＣ ＡＡＣ ＴＧＧ ＴＧＣ ＡＧＴ ＣＴＧ ＧＡＧ ＣＴＧ ＡＧＧ ３’（配列番号２５）およびそのフレームワーク１（ＦＲ１）に対する相補体、ならびに、５’ ＧＡＡ ＧＴＴ ＣＡＡ ＧＧＧ ＣＡＧ ＧＧＣ ＣＡＣ ＡＣＴ ＧＡＣ ＡＧＣ ＡＧＡ ＣＡＡ ＡＴＣ ＣＡＣ ＣＡＧ ＣＡＣ ＡＧＣ ＣＴＡ ＣＡＴ ＧＧＡ ＧＣＴ ＣＡＧ ＣＡＧ ＣＣＴ ＧＡＧ ＧＴＣ ＴＧＡ ＡＧＡ ＴＡＣ ＴＧＣ ＧＧＴ ＣＴＡ ＴＴＴ ＣＴＧ ＴＧＣ ＡＡＧ ＡＴＣ Ｃ ３’（配列番号２６）およびそのフレームワーク３（ＦＲ３）に対する相補体を用いるＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ突然変異誘発の２ラウンドに供した。各々の対は、ＰｓｔＩ部位を欠失している。得られた新形態化可変重鎖（ＶＨ＃１）プラスミドをｐＫＪＳ０３６と名付けた。

可変重鎖２型を、ＥｃｏＲＶ部位およびＰｓｔＩ部位を欠失するフレームワーク１プライマー５’ ＣＡＧ ＧＴＣ ＣＡＡ ＣＴＧ ＧＴＧ ＣＡＧ ＴＣＴ ＧＧＡ ＧＣＴ ＧＡＧ ＧＴＧ ＡＡＧ ＡＡＧ ＣＣＴ ＧＧＧ ＴＣＣ ＴＣＡ ＧＴＧ ＡＡＧ ＧＴＧ ＴＣＣ ＴＧＣ ＡＡＧ ＧＣ ３’（配列番号２７）；ＳｔｕＩ部位を欠失するフレームワーク２プライマー５’ ＧＣＡ ＣＴＧ ＧＧＴ ＧＡＧ ＧＣＡ ＧＧＣ ＣＣＣ ＴＧＧ ＡＣＡ ＧＧＧ ＡＣＴ ＴＧ ３’（配列番号２８）；および、ＳａｃＩ部位を作製するフレームワーク３プライマー５’ ＧＡＡ ＧＴＴ ＣＡＡ ＧＧＧ ＣＡＧ ＧＧＣ ＣＡＣ ＡＡＴ ＣＡＣ ＴＧＣ ＡＧＡ ＣＡＡ ＡＴＣ ＣＡＣ ＣＡＧ ＣＡＣ ＡＧＣ ＣＴＡ ＣＡＴ ＧＧＡ ＧＣＴ ＣＡＧ ＣＡＧ ＣＣＴ ＧＡＧ ＧＴＣ ＴＧＡ ＡＧＡ ＴＡＣ ＴＧＣ ＧＧＴ ＣＴＡ ＴＴＡ ＣＴＧ ＴＧＣ ＡＡＧ ＡＴＣ Ｃ ３’（配列番号２９）と共にｐＡＮＤ１４６鋳型を用いる、ＵＳＥ突然変異誘発の単ラウンドに供した。得られた新形態化可変重鎖（ＶＨ＃２）プラスミドをｐＫＪＳ０３１と名付けた。

可変重鎖３型を、最初に、ＥｃｏＲＶ部位およびＰｓｔＩ部位を欠失したフレームワーク１プライマー５’ ＣＡＧ ＧＴＣ ＣＡＡ ＣＴＧ ＧＴＧ ＣＡＧ ＴＣＴ ＧＧＡ ＧＣＴ ＧＡＧ ＧＴＧ ＡＡＧ ＡＡＧ ＣＣＴ ＧＧＧ ＴＣＣ ＴＣＡ ＧＴＧ ＡＡＧ ＧＴＧ ＴＣＣ ＴＧＣ ＡＡＧ ＧＣ ３’（配列番号３０）およびＳａｃＩ部位を作製したフレームワーク３プライマー５’ ＧＡＡ ＧＴＴ ＣＡＡ ＧＧＧ ＣＡＧ ＧＧＴ ＣＡＣ ＡＡＴ ＣＡＣ ＴＧＣ ＡＧＡ ＣＡＡ ＡＴＣ ＣＡＣ ＣＡＧ ＣＡＣ ＡＧＣ ＣＴＡ ＣＡＴ ＧＧＡ ＧＣＴ ＣＡＧ ＣＡＧ ＣＣＴ ＧＡＧ ＧＴＣ ＴＧＡ ＡＧＡ ＴＡＣ ＴＧＣ ＧＧＴ ＣＴＡ ＴＴＡ ＣＴＧ ＴＧＣ ＡＡＧ ＡＴＣ Ｃ ３’（配列番号３１）と共にｐＡＮＤ１４６を使用するＵＳＥ突然変異誘発により変異させ、ｐＫＪＳ０３２を作製した。次いで、プラスミドｐＫＪＳ０３２を、フレームワーク２プライマー対５’ ＧＧＣ ＣＣＣ ＴＧＧ ＡＣＡ ＧＧＧ ＡＣＴ ＴＧＡ ＧＴＧ ＧＡＴ ＧＧＧ ＡＴＧ ＧＡＴ ＴＴＡ ＴＣＣ ＴＧＧ ３’（配列番号３２）およびその相補体と共にＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ突然変異誘発のための鋳型として使用して、ＨｐａＩＩ部位の欠失を生じた。得られた新形態化可変重鎖（ＶＨ＃３）プラスミドをｐＫＪＳ０３７と名付けた。

ｈｕＢＨＡ１０重鎖のための発現ベクターを、ｐＫＪＳ０３６、ｐＫＪＳ０３１またはｐＫＪＳ０３７からの０．４２５ｋｂのＮｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ重鎖可変ドメインフラグメント、および、ヒトＩｇＧ１定常領域を含むプラスミドｐＥＡＧ９６４からの１．２１ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩフラグメントを、ｐＣＥＰ４ ＥＢＶ発現ベクター由来のプラスミドｐＣＨ２７４のＮｏｔＩ部位にサブクローニングして、重鎖発現ベクターｐＫＪＳ０４４（重鎖＃１発現ベクター）、ｐＫＪＳ０４５（重鎖＃２発現ベクター）およびｐＫＪＳ０４６（重鎖＃３発現ベクター）を産生した。

（新形態化可変軽鎖（ＶＬ））
可変軽鎖１型を、最初に、フレームワーク１プライマー５’ＧＡＴ ＧＧＡ ＧＡＣ ＡＴＴ ＣＡＧ ＡＴＧ ＡＣＣ ＣＡＧ ＴＣＴ ＣＣＴ ＡＧＣ ＴＣＣ ＣＴＧ ＴＣＣ ＧＣＣ ＴＣＡ ＧＴＡ ＧＧＡ ＧＡＣ ＡＧＧ ＧＴＣ ＡＣＣ ＡＴＣ ＡＣＣ ＴＧＣ ＡＡＧ ＧＣ ３’（配列番号３３）、ＸｍａＩ部位を導入したフレームワーク２プライマー５’ ＧＴＡ ＧＣＣ ＴＧＧ ＴＴＣ ＣＡＡ ＣＡＧ ＡＡＡ ＣＣＣ ＧＧＧ ＡＡＧ ＧＣＴ ＣＣＴ ＡＡＡ ＴＣＡ Ｃ ３’（配列番号３４）、ＸｂａＩ部位を導入した５’フレームワーク３プライマー５’ ＣＡＧ ＴＧＧ ＡＧＴ ＣＣＣ ＴＴＣ ＴＡＧ ＡＴＴ ＣＡＣ ＡＧＧ ＣＡＧ ３’（配列番号３５）、および、ＰｓｔＩ部位を導入した３’フレームワーク３プライマー５’ ＣＴＣ ＡＣＣ ＡＴＣ ＡＧＣ ＡＧＣ ＣＴＧ ＣＡＧ ＣＣＴ ＧＡＡ ＧＡＣ ＴＴＣ ＧＣＡ ＡＣＣ ＴＡＴ ＴＴＣ ＴＧＴ ＣＡＧ Ｃ ３’（配列番号３６）と共に、鋳型プラスミドｐＡＮＤ１４９上でのＵＳＥ突然変異誘発に供した。得られたプラスミドをｐＫＪＳ０３３と名付けた。プラスミドｐＫＪＳ０３３は、フレームワーク２内の所望でない残基を含み、従って、ＸｍａＩ部位を除去して、ＢｃｌＩ部位を追加した第２のフレームワーク２プライマー対５’ ＧＧＧ ＴＡＴ ＴＡＡ ＴＧＴ ＡＧＣ ＣＴＧ ＧＴＡ ＴＣＡ ＡＣＡ ＧＡＡ ＡＣＣ ＡＧＧ ＧＡＡ ＧＧＣ ＴＣＣ ３’（配列番号３７）およびその相補体を使用するＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ突然変異誘発に供した。プラスミドｐＫＪＳ０３３はまた、固有のＫｐｎＩ部位を導入されたフレームワーク４プライマー対５’ ＣＣＴ ＡＴＣ ＣＡＴ ＴＣＡ ＣＧＴ ＴＣＧ ＧＣＣ ＡＧＧ ＧＴＡ ＣＣＡ ＡＧＧ ＴＧＧ ＡＧＡ ＴＣＴ ＡＡＣ ＡＡＧ ＧＧＣ Ｇ ３’（配列番号３８）およびその相補体を用いるＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ突然変異誘発の追加のラウンドに供した。これらの反応により、プラスミドｐＫＪＳ０３８を作製した。プラスミドｐＫＪＳ０３８は、フレームワーク２内に誤りを含み、従って、第３のフレームワーク２プライマー対、５’ ＣＣＣ ＴＧＧ ＴＴＴ ＣＴＧ ＴＴＧ ＡＴＡ ＣＣＡ ＧＧＣ ＡＡＣ ＧＴＴ ＡＡＴ ＡＣＣ ＣＡＣ ３’（配列番号３９）およびその相補体を用いるＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ突然変異誘発の追加のラウンドに供し、ＢｃｌＩ部位の欠失を生じた。得られた新形態化可変軽鎖（ＶＬ＃１）プラスミドをｐＫＪＳ０５１と名付けた。

可変軽鎖２型を、最初に、フレームワーク１プライマー５’ ＧＡＴ ＧＧＡ ＧＡＣ ＡＴＴ ＣＡＧ ＡＴＧ ＡＣＣ ＣＡＧ ＴＣＴ ＣＣＴ ＡＧＣ ＴＣＣ ＣＴＧ ＴＣＣ ＧＣＣ ＴＣＡ ＧＴＡ ＧＧＡ ＧＡＣ ＡＧＧ ＧＴＣ ＡＣＣ ＡＴＣ ＡＣＣ ＴＧＣ ＡＡＧ ＧＣ ３’（配列番号４０）、ＸｍａＩ部位を追加したフレームワーク２プライマー５’ ＧＴＡ ＧＣＣ ＴＧＧ ＴＴＣ ＣＡＡ ＣＡＧ ＡＡＡ ＣＣＣ ＧＧＧ ＡＡＧ ＧＣＴ ＣＣＴ ＡＡＡ ＴＣＡ Ｃ ３’（配列番号４１）、ＸｂａＩ部位を追加した５’フレームワーク３プライマー５’ ＣＡＧ ＴＧＧ ＡＧＴ ＣＣＣ ＴＴＣ ＴＡＧ ＡＴＴ ＣＡＧ ＣＧＧ ＣＡＧ ＴＧＧ ＡＴＣ ３’（配列番号４２）、および、ＰｓｔＩ部位を追加した３’フレームワーク３プライマー５’ ＣＴＣ ＡＣＣ ＡＴＣ ＡＧＣ ＡＧＣ ＣＴＧ ＣＡＧ ＣＣＴ ＧＡＡ ＧＡＣ ＴＴＣ ＧＣＡ ＡＣＣ ＴＡＴ ＴＴＣ ＴＧＴ ＣＡＧ Ｃ ３’（配列番号４３）を使用する鋳型プラスミドｐＡＮＤ１４９上でのＵＳＥ突然変異誘発に供した。得られたプラスミドをｐＫＪＳ０３４と名付けた。プラスミドｐＫＪＳ０３４は、フレームワーク３およびフレームワーク２の両方に所望でない変異を含んだ。フレームワーク３の変異を、ＰｓｔＩ部位を除去した新しい３’フレームワーク３プライマー対５’ ＧＣＴ ＧＡＣ ＡＧＡ ＡＡＴ ＡＧＧ ＴＴＧ ＣＧＡ ＡＧＴ ＣＴＴ ＣＡＧ ＧＣＴ ＧＧＡ ＧＧＣ ＴＧＣ ＴＧＡ ＴＧＧ ３’（配列番号４４）およびその相補体；ならびに、ＸｂａＩ部位を除去した新しい５’ フレームワーク３プライマー５’ ＧＧＴ ＡＣＡ ＧＴＧ ＧＡＧ ＴＣＣ ＣＴＴ ＣＣＡ ＧＡＴ ＴＣＡ ＧＣＧ ＧＣＡ ＧＴＧ ＧＡＴ ＣＴＧ ＧＧ ３’（配列番号４５）を使用するＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ突然変異誘発の連続ラウンドによりプラスミドｐＫＪＳ０３４において矯正した。ｐＫＪＳ０３４上のフレームワーク２のエラーを、次いで、ＸｍａＩ部位を除去し、かつＢｃｌＩ部位を追加したプライマー対５’ ＧＧＧ ＴＡＴ ＴＡＡ ＴＧＴ ＡＧＣ ＣＴＧ ＧＴＡ ＴＣＡ ＡＣＡ ＧＡＡ ＡＣＣ ＡＧＧ ＧＡＡ ＧＧＣ ＴＣＣ ３’（配列番号４６）およびその相補体を用いる突然変異誘発の別のラウンドにより矯正した。プラスミドｐＫＪＳ０３４を、次いで、ＫｐｎＩ部位を導入したフレームワーク４プライマー対５’ ＣＣＴ ＡＴＣ ＣＡＴ ＴＣＡ ＣＧＴ ＴＣＧ ＧＣＣ ＡＧＧ ＧＴＡ ＣＣＡ ＡＧＧ ＴＧＧ ＡＧＡ ＴＣＴ ＡＡＣ ＡＡＧ ＧＧＣ Ｇ ３’（配列番号４７）およびその相補体を用いるＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ突然変異誘発の最終ラウンドに供した。得られた新形態化軽鎖（ＶＬ＃２）プラスミドをｐＫＪＳ０３９と名付けた。

可変軽鎖３型を、最初に、フレームワーク１プライマー５’ ＧＡＴ ＧＧＡ ＧＡＣ ＡＴＴ ＣＡＧ ＡＴＧ ＡＣＣ ＣＡＧ ＴＣＴ ＣＣＴ ＡＧＣ ＴＣＣ ＣＴＧ ＴＣＣ ＧＣＣ ＴＣＡ ＧＴＡ ＧＧＡ ＧＡＣ ＡＧＧ ＧＴＣ ＡＣＣ ＡＴＣ ＡＣＣ ＴＧＣ ＡＡＧ ＧＣ ３’（配列番号４８）、ＸｍａＩ部位を組み込んだフレームワーク２プライマー５’ ＧＴＡ ＧＣＣ ＴＧＧ ＴＴＣ ＣＡＡ ＣＡＧ ＡＡＡ ＣＣＣ ＧＧＧ ＡＡＧ ＧＣＴ ＣＣＴ ＡＡＡ ＴＣＡ Ｃ ３’（配列番号４９）、ＸｂａＩ部位を組み込んだ５’フレームワーク３プライマー５’ ＣＡＧ ＴＧＧ ＡＧＴ ＣＣＣ ＴＴＣ ＴＡＧ ＡＴＴ ＣＡＧ ＣＧＧ ＣＡＧ ＴＧＧ ＡＴＣ ３’（配列番号５０）、およびＰｓｔＩ部位を組み込んだ３’フレームワーク３プライマー５’ ＣＴＣ ＡＣＣ ＡＴＣ ＡＧＣ ＡＧＣ ＣＴＧ ＣＡＧ ＣＣＴ ＧＡＡ ＧＡＣ ＴＴＣ ＧＣＡ ＡＣＣ ＴＡＴ ＴＡＣ ＴＧＴ ＣＡＧ ＣＡＡ ＴＡＴ Ｇ ３’（配列番号５１）を用いて、鋳型プラスミドｐＡＮＤ１４９上でのＵＳＥ突然変異誘発に供し、ｐＫＪＳ０３５を作製した。プラスミドｐＫＪＳ０３５を、新しいＫｐｎＩ部位を組み込んだフレームワーク４プライマー対５’ ＣＣＴ ＡＴＣ ＣＡＴ ＴＣＡ ＣＧＴ ＴＣＧ ＧＣＣ ＡＧＧ ＧＴＡ ＣＣＡ ＡＧＧ ＴＧＧ ＡＧＡ ＴＣＴ ＡＡＣ ＡＡＧ ＧＧＣ Ｇ ３’（配列番号５２）およびその相補体を用いるＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ突然へに誘発の単ラウンドに供した。得られた新形態化可変軽鎖（ＶＬ＃３）プラスミドをｐＫＪＳ０４０と名付けた。

ｈｕＢＨＡ１０軽鎖のための発現ベクターを、ｐＫＪＳ０５１、ｐＫＪＳ０３９またはｐＫＪＳ０４０からの０．４５３ｋｂのＮｏｔＩ−ＢｇｌＩＩ軽鎖可変ドメインフラグメント、および、ヒトκ軽鎖定常ドメインを含むプラスミドｐＥＡＧ９６３からの０．６７８ｋｂのＢｃｌＩ−ＮｏｔＩフラグメントを、ｐＣＥＰ４ ＥＢＶ発現ベクター由来のプラスミドｐＣＨ２７４のＮｏｔＩ部位にサブクローニングすることにより作製し、軽鎖発現ベクターｐＫＪＳ０４８（軽鎖＃１発現ベクター）、ｐＫＪＳ０４９（軽鎖＃２発現ベクター）およびｐＫＪＳ０５０（軽鎖＃３発現ベクター）を生じた。

（実施例４−新形態化ヒト化ＢＨＡ１０抗体（１型、２型、３型および４型）の構築および発現）
上記の種々の発現ベクターを一緒に対にして、表２に列挙および記載し、そして、２９３−ＥＢＮＡ細胞に同時トランスフェクトした。１型ｈｕＢＨＡ１０は、ｐＫＪＳ４４（重鎖＃１発現ベクター）およびｐＫＪＳ４８（軽鎖＃１発現ベクター）の対を含んだ；２型ｈｕＢＨＡ１０は、ｐＫＪＳ４５（重鎖＃２発現ベクター）およびｐＫＪＳ４９（軽鎖＃２発現ベクター）の対を含んだ；３型ｈｕＢＨＡ１０は、ｐＫＪＳ４６（重鎖＃３発現ベクター）およびｐＫＪＳ５０（軽鎖＃３発現ベクター）の対を含んだ；そして、４型ｈｕＢＨＡ１０は、ｐＫＪＳ４６（重鎖＃３発現ベクター）およびｐＫＪＳ４９（軽鎖＃２発現ベクター）の対を含んだ。これらのベクターを、２９３−ＥＢＮＡ細胞に同時トランスフェクトし、これらのトランスフェクトした細胞を、抗体の分泌および特異性について試験した。馴化培地のウェスタンブロット分析（抗ヒト重鎖抗体および抗ヒト軽鎖抗体を用いて検出）は、ｈｕＢＨＡ１０でトランスフェクトした細胞が、ｃｈＢＨＡ１０でトランスフェクトした細胞と類似するレベルで重鎖および軽鎖を合成し、効率的に分泌したことを示した。トランスフェクトした細胞からの馴化培地で染色した、ＬＴ−β−Ｒを発現するＨＴ−２９細胞のＦＡＣＳ分析は、２型ｈｕＢＨＡ１０よりも、３型ｈｕＢＨＡ１０ ｍＡｂがより少なく結合したことを示した。これは、ｃｈＢＨＡ１０に類似した（図３）。混合適合（ｍｉｘ ａｎｄ ｍａｔｃｈ）同時トラスフェクションは、この減少が、３型の可変軽鎖（ＶＬ＃３）に起因し得ることを示唆し（図２）、これは、２つのフレームワーク残基（残基３６および８７）において、２型の可変軽鎖（ＶＬ＃２）由来であった。次いで、４型ｈｕＢＨＡ１０を、ｐＫＪＳ４６（重鎖＃３発現ベクター）とｐＫＪＳ４９（軽鎖＃２発現ベクター）とを対にすることによって構築した。

ｃｈＢＨＡ１０およびｈｕＢＨＡ１０１型〜４型を用いる２９３−ＥＢＮＡ細胞の同時トランスフェクションをスケールアップし、馴化培地を回収した。抗体を、プロテインＡ−セファロースで精製し、精製したｍＡｂを活性についてアッセイした。リンホトキシン−βレセプターへの結合を、細胞株ＨＴ２９におけるプロテインＡ精製抗体のＦＡＣＳ分析により決定した。

（実施例５ Ａ３７５細胞におけるＩＬ−８−アゴニズム）
Ａ３７５細胞を１０^５／ｍｌにて、可溶性抗体またはヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に捕捉された抗体のいずれかでコーティングされたウェルを含む９６ウェルプレートにプレートした。培養プレートを一晩インキュベートした。ＢＨＡ１０改変体でトランスフェクトした２９３−Ｅ細胞由来のプロテインＡ精製抗体を、図１に示す所定の濃度にてアッセイした。プロテインＡ精製したｈｕ−ＣＲＢ１１をポジティブコントロールとして使用した。Ａ３７５細胞におけるＩＬ−８アゴニズムを図１に示す。生物活性のランク順位は、ｃｈＢＨＡ１０＝４型ｈｕＢＨＡ１０＝２型ｈｕＢＨＡ１０＞３型ｈｕＢＨＡ１０であった。４型ｈｕＢＨＡ１０は、２型ｈｕＢＨＡ１０よりヒト化されていたために、安定なＣＨＯ細胞株の世代について選択した。

（実施例６−４型ｈｕＢＨＡ１０についての安定なＣＨＯ発現ベクターの構築）
ｈｕＢＨＡ１０４型に対するＥＢＶ発現ベクター（軽鎖＃２発現ベクター：ｐＫＪＳ０４９；重鎖＃３発現ベクター：ｐＫＪＳ０４６）を、２９３ＥＢＮＡ細胞に同時トランスフェクトし、トランスフェクトした細胞を、抗体分泌について試験した。馴化培地のウェスタンブロット分析は、トランスフェクトした細胞が重鎖および軽鎖を合成し、かつ効率的に分泌したことを確認した。ＥＢＶベクターは、外来性の５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲ、ならびに、免疫グロブリンの可変ドメインおよび定常ドメインを隔てるイントロンを含み、ここでは、安定なＣＨＯ発現ベクターのためにｃＤＮＡが所望される。従って、ｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲによりクローニングした。

一過性に同時トランスフェクトしたｈｕＢＨＡ１０発現細胞由来の総細胞ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙミニキットを製造業者の推奨するプロトコールに従って使用して調製した。重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡを、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔを製造業者の推奨するプロトコールに従って使用して、ＲＴ−ＰＣＲにより総細胞ＲＮＡからクローニングした。このＲＴ−ＰＣＲは、重鎖のプライミングのために５’ ＣＧＧ ＡＴＣ ＣＴＣ ＡＡＣ ＣＧＧ ＧＡＧ ＡＣＡ ＧＧＧ ＡＧＡ ＧＧＣ Ｔ ３’（配列番号５３）を、そして、軽鎖のプライミングのために５’ ＣＧＧ ＡＴＣ ＣＣＴ ＡＡＣ ＡＣＴ ＣＴＣ ＣＣＣ ＴＧＴ ＴＧＡ Ａ ３’（配列番号５４）を用いる。ｈｕＢＨＡ１０免疫グロブリン重鎖ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅について、使用したプライマーは以下の通りであった：５’ ＧＣＴ ＡＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＡＣ ＴＧＧ ＡＣＣ ＴＧＧ ３’（配列番号５５）（開始メチオニンの直ぐ５’側にＢａｍＨＩ部位およびＡＣＣを加えるため、Ｋｏｚａｋシグナルを加えるため）および５’ ＣＧＧ ＡＴＣ ＣＴＣ ＡＡＣ ＣＧＧ ＧＡＧ ＡＣＡ ＧＧＧ ＡＧＡ ＧＧＣ Ｔ ３’（配列番号５６）（重鎖Ｃ末端のリジン残基を遺伝的に取り除くため、そして、終止コドンの直ぐ３’側にＢａｍＨＩ部位を加えるため）。ｈｕＢＨＡ１０免疫グロブリン軽鎖ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅について、使用したプライマーは以下の通りであった：５’ ＣＣＣ ＴＴＡ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＧＣ ＴＴＣ ＡＡＧ ＡＴＧ ＧＡＧ ３’（配列番号５７）（開始メチオニンの直ぐ５’側にＢａｍＨＩ部位およびＡＣＣを加えるため、Ｋｏｚａｋシグナルを加えるため）および５’ ＣＧＧ ＡＴＣ ＣＣＴ ＡＡＣ ＡＣＴ ＣＴＣ ＣＣＣ ＴＧＴ ＴＧＡ Ａ ３’（配列番号５８）（終止コドンの直ぐ３’側にＢａｍＨＩ部位を加えるため）。ｃＤＮＡを、９５℃にて２．５分間；Ａｄｖａｎｔａｇｅ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用する、変性 ９４℃にて０．５分、アニーリング ５５℃にて０．７５分、伸長 ６８℃にて１分の１０サイクル；次いで、６８℃での最後の５分間の伸長、のホットスタートＰＣＲに供した。サンプルとして最初の反応からの１０μｌとＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用する２次増幅を実施した：変性 ９４℃にて０．５分、アニーリング ５０℃にて０．７５分、および伸長 ７２℃にて１分；次いで、７２℃での最後の１０分間の伸長。ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｇｅｎ Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キットを製造業者の推奨するプロトコールに従って使用してゲル精製した。精製したＰＣＲ産物を、製造業者の推奨するプロトコールに従って使用して、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のｐＣＲ４ＴＯＰＯクローニングベクターにサブクローニングした。精製したＰＣＲ産物を、製造業者の推奨するＴＯＰＯクローニングのためのプロトコールに従って使用して、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のｐＣＲ４ＴＯＰＯクローニングベクターにサブクローニングした。複数の独立したサブクローンからの挿入物を配列決定した。配列を確認した軽鎖ｃＤＮＡサブクローンを、ｐＫＪＳ０７２と名付けた。配列を確認した重鎖ｃＤＮＡサブクローンを、ｐＫＪＳ０７１と名付けた。

ｐＫＪＳ０７２からの７２６ｂｐのＢａｍＨＩ軽鎖ｃＤＮＡフラグメントを、ｈｕ５ｃ８軽鎖発現ベクターｐＸＬＣ２からのリン酸化した６．１９ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントにサブクローニングして、ｎｅｏ含有ｈｕＢＨＡ１０軽鎖発現ｐＫＪＳ０７７を作製した（図３）。このプラスミドは、４型ＢＨＡ１０軽鎖およびネオマイシン耐性遺伝子を含む。軽鎖発現カセットは、ヒトＣＭＶ最初期プロモーターおよび第１イントロン（小さな欠失を含む）、ならびに、ヒト成長ホルモンポリアデニル化配列を含む。

同様に、ｐＫＪＳ０７１からの１４０４ｂｐのＢａｍＨＩ重鎖ｃＤＮＡフラグメントを、リン酸化したＢａｍＨＩで直鎖状にしたｐＶ８０にサブクローニングして、ｄｈｆｒ含有ｈｕＢＨＡ１０重鎖ベクターｐＫＪＳ０７８を作製した（図５）。このプラスミドは、４型ＢＨＡ１０重鎖およびｄｈｆｒ遺伝子を含む。重鎖発現カセットは、ヒトＣＭＶの最初期プロモーターおよび第１イントロン（小さな欠失を含む）、ならびに、ヒト成長ホルモンポリアデニル化配列を含む。ｄｈｆｒ発現カセットは、ＳＶ４０初期プロモーターおよびＳＶ４０ポリアデニル化配列を含む。

発現ベクターを、ＣＯＳ細胞に同時トランスフェクトし、トランスフェクトした細胞を、抗体の分泌および特異性について試験した（空のベクターまたはＭ９２ベクターをネガティブコントロールとして使用した）。馴化培地のウェスタンンブロット分析（抗ヒト重鎖抗体および抗ヒト軽鎖抗体を用いて発色した）は、トランスフェクトした細胞が、重鎖および軽鎖を合成して効率的に分泌し、そして、ＦＡＣＳ分析において、ｈｕＢＨＡ１０でトランスフェクトした細胞からの馴化培地が、ＬＴ−β−Ｒを発現するＨＴ−２９細胞を選択的に染色したことを示した。

（実施例７−４型ｈｕＢＨＡ１０を発現するＣＨＯ細胞株）
４型ｈｕＢＨＡ１０のための発現プラスミドｐＫＪＳ０７７およびｐＫＪＳ０７８を、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。

（実施例８−抗体親和性測定）
ＨＴ２９細胞を５ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳで３０分間処理し、その後、激しく撹拌することにより回収した。細胞を、丸底９６ウェルプレートに、２．５×１０^５細胞／ウェルにて撒いた。ＢＨＡ１０改変体でトランスフェクトした２９３−Ｅ細胞からの上清を、所定の希釈にて、総用量１００μｌでウェルに添加し、４℃にて１時間インキュベートした。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（５％ＦＢＳを含有するＰＢＳ）で２回洗浄し、１：１００希釈のＰＥ結合体化抗ヒト重鎖抗体および抗ヒト軽鎖抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に１時間インキュベートした。次いで、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、１．０％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ １００μｌ中に再懸濁した。次いで、サンプルを分析のためにＦＡＣＳ装置に移した。ＢＨＡ１０改変体でトランスフェクトした２９３−Ｅ細胞からのプロテインＡ精製した抗体を、図２に示すような所定の濃度にてアッセイした。プロテインＡ精製したＣＢＥ１１および５Ｃ８（抗ＣＤ４０Ｌ抗体）研究用標準を、それぞれ、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとして使用した。結合活性のランク順位は、ｃｈＢＨＡ１０＝４型ｈｕＢＨＡ１０＝２型ｈｕＢＨＡ１０＞３型ｈｕＢＨＡ１０であった。

（実施例９−ＷｉＤｒ細胞に対する細胞傷害性）
抗ヒトＩｇＧ Ｆｃでコーティングしたウェル上で、可溶性抗ＬＴ−β−Ｒ抗体と共にＷｉＤｒ結腸癌細胞を使用する細胞傷害性アッセイは、本発明の抗ＬＴ−β−Ｒ抗体が、癌細胞における細胞傷害性を増加することを示す。ＷｉＤｒ細胞を、８０ユニット／ｍｌのｈｕＩＦＮ−γの存在下で、６×１０^４／ｍｌにて、可溶性抗体、または、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で捕捉された抗体のいずれかでコーティングされたウェルを含む９６ウェルプレートにプレートした。この培養プレートを５日間インキュベートした。ＭＴＴを４時間添加し、得られた沈殿を１０ｍＭ ＨＣｌ中の１０％ ＳＤＳとの一晩のインキュベーションにより溶解させ、そして、ＯＤをマイクロプレートリーダーで読む。

（実施例１０−ｈｕＢＨＡ１０の前処置は、ＷｉＤｒ腫瘍の増殖を遅くする）
６週齢のヌードマウスに、１００μｇの抗ＬＦＡ３抗体（１Ｅ６）、１００μｇの抗ＬＴ−β−Ｒ抗体（すなわち、新形態化ｈｕＢＨＡ１０）を腹腔内注射するか、または、注射しない（コントロール）。次いで、これらの動物に、１×１０^６のＷｉＤｒ結腸直腸腺癌細胞を皮下注射する。新形態化ｈｕＢＨＡ１０で処理したマウスを、毎週、１００μｇの抗体で再処置し、ｍＢＨＡ１０動物は、１４日目にのみ再処置する。腫瘍サイズを毎週測定し、腫瘍球の体積を算出する。これらの腫瘍が２．０ｃｍ^３の体積（直径１６ｍｍ）に達すると、動物を屠殺し、動物の死を生存チャートに記載する。新形態化ｈｕＢＨＡ１０での前処置は、ヌードマウスにおけるＷｉＤｒ腫瘍の進行を遅くすることが期待される。

（実施例１１−前もって増殖したＷｉＤｒ腫瘍の増殖の減速およびＷｉＤｒ腫瘍を有するヌードマウスの生存の増加）
１０^６個のＷｉＤｒ細胞をヌードマウスにおいて１０日間皮下で前もって増殖させる。これらのマウスは、毎週のＰＢＳもしくは新形態化ｈｕＢＨＡ１０または隔週のｍＢＨＡ１０のいずれかの皮下注射を受ける。腫瘍重量を、幅および長さの計測値から算出し、２０００ｍｇを超える腫瘍を有する動物を屠殺し、屠殺時点でのこれらの腫瘍重量を、統計的な平均に留まらせる。以下の式を使用して腫瘍重量を算出する：（幅×幅×長さ）／２＝腫瘍重量（ｍｇ）。本発明の新形態化ｈｕＢＨＡ１０抗体は、インビボで前もって増殖させた腫瘍の進行を減速することが期待される。さらに、腫瘍を増殖させ、上記のように処置して、動物の生存率を測定する。本発明の新形態化ｈｕＢＨＡ１０抗体は、前以て増殖させた腫瘍を有するマウスにおいて、インビボでの延長した生存を誘導することが期待される。

種々の改変および変更が、本発明の精神または範囲から逸脱することなく、本発明のポリペプチド、組成物および方法においてなされ得ることが当業者に明らかである。従って、本発明は、本発明の変更および改変が、添付の特許請求の範囲およびその等価物の範囲内に入る限り、それを包含することを意図する。本明細書中に引用される全ての刊行物および特許文献、ならびに、図面および配列表中に見られる文書は、各々が個々に示されたのと同じ程度に、あらゆる目的のために、その全体が本明細書中に参考として援用される。

図１は、Ａ３７５細胞に対する、ＩＬ−８アゴニズムについての、ｈｕＢＨＡ１０の異なる型（２型〜４型）の比較を示す。ＩＬ−８アッセイは、実施例５に記載されるように実施した。黒四角：キメラＢＨＡ１０；白丸：２型；黒丸：３型；白菱形：４型；白三角：ｈｕＣＢＥ１１（ポジティブコントロール）。 図２は、ＨＴ２９細胞に結合する精製したｈｕＢＨＡ１０抗体２型〜４型のＦＡＣＳ分析の結果を示す。ＦＡＣＳ分析は、実施例８のように実施した。黒四角：キメラＢＨＡ１０；白丸：２型；黒丸：３型；白菱形：４型；白三角：ｈｕＣＢＥ１１（ポジティブコントロール）；十字：Ｍ９２（抗ＣＤ４０Ｌ抗体）（ネガティブコントロール）。 図３は、ｐＫＪＳ０７７のプラスミドマップを示す。このプラスミドは、軽鎖＃２およびネオマイシン耐性遺伝子を含む。この軽鎖発現カセットは、ヒトＣＭＶ最初期プロモーターおよび第１イントロン（小さな欠失を含む）ならびに、ヒト成長ホルモンポリアデニル化配列を含む。 図４（Ａ）は、軽鎖＃２をコードする核酸配列（可変領域−一重下線；定常領域−二重下線）（配列番号５９）を示し、図４（Ｂ）は、対応するアミノ酸配列（可変領域−一重下線；定常領域−二重下線）（配列番号６０）を示す。 図５は、ｐＫＪＳ０７８のプラスミドマップを示す。このプラスミドは、重鎖＃３およびＤＨＦＲ遺伝子を含む。この重鎖発現カセットは、ヒトＣＭＶ最初期プロモーターおよび第１イントロン（小さな欠失を含む）ならびにヒト成長ホルモンポリアデニル化配列を含む。ＤＨＦＲ発現カセットは、ＳＶ４０初期プロモーターおよびＳＶ４０ポリアデニル化配列を含む。 図６（Ａ）は、重鎖＃３をコードする核酸配列（可変領域−一重下線；定常領域−二重下線）（配列番号６１）を示し、図６（Ｂ）は、対応するアミノ酸配列（可変領域−一重下線；定常領域−二重下線）（配列番号６２）を示す。

Claims (44)

1. ヒト化抗リンホトキシン−βレセプター（ＬＴ−β−Ｒ）抗体であって、該抗体の軽鎖相補性決定領域は、配列番号１のアミノ酸残基２４〜３４、５０〜５６および８９〜９７により規定され、かつ、該抗体の重鎖相補性決定領域は、配列番号２のアミノ酸残基３１〜３５、５０〜６５および９５〜１０２により規定され、該抗体は、その軽鎖中に以下の残基：
   Ｙ３６、Ｓ４９、Ｔ６３およびＦ８７；
   のうち少なくとも１種を含むか、または、その重鎖中に以下の残基：
   Ｙ２７、Ｔ３０、Ｉ４８、Ａ６７、Ｌ６９およびＦ９１（Ｋａｂａｔ番号付け慣例）
   のうち少なくとも１種を含む、ヒト化抗体。
2. 請求項１に記載のヒト化抗体と同じリンホトキシン−βレセプターのエピトープに結合する、抗体。
3. ヒト化抗リンホトキシン−βレセプター（ＬＴ−β−Ｒ）抗体であって、該抗体の軽鎖相補性決定領域は、配列番号１のアミノ酸残基２４〜３４、５０〜５６および８９〜９７により規定され、かつ、該抗体の重鎖相補性決定領域は、配列番号２のアミノ酸残基３１〜３５、５０〜６５および９５〜１０２により規定され、該抗体は、その軽鎖中に以下の残基Ｙ３６、Ｓ４９およびＦ８７（Ｋａｂａｔ番号付け慣例）を含む、ヒト化抗体。
4. ヒト化抗リンホトキシン−βレセプター（ＬＴ−β−Ｒ）抗体であって、該抗体の軽鎖相補性決定領域は、配列番号１のアミノ酸残基２４〜３４、５０〜５６および８９〜９７により規定され、かつ、該抗体の重鎖相補性決定領域は、配列番号２のアミノ酸残基３１〜３５、５０〜６５および９５〜１０２により規定され、該抗体は、その重鎖中に残基Ｙ２７およびＴ３０（Ｋａｂａｔ番号付け慣例）を含む、ヒト化抗体。
5. 前記抗体が、配列番号６のアミノ酸残基１〜１０７により規定される軽鎖可変ドメイン配列を含む、請求項１に記載の抗体。
6. 前記抗体が、配列番号１４のアミノ酸残基１〜１１３により規定される重鎖可変ドメイン配列を含む、請求項１に記載の抗体。
7. 前記抗体が、配列番号１４のアミノ酸残基１〜１１３により規定される重鎖可変ドメイン配列をさらに含む、請求項５に記載の抗体。
8. 前記抗体が、配列番号１５のアミノ酸残基１〜２１４により規定される軽鎖ドメイン配列を含む、請求項１に記載の抗体。
9. 前記抗体が、配列番号１６のアミノ酸残基１〜４４２により規定される重鎖ドメイン配列を含む、請求項１に記載の抗体。
10. 前記抗体が、配列番号１５のアミノ酸残基１〜２１４により規定される軽鎖ドメイン配列、および、配列番号１６のアミノ酸残基１〜４４２により規定される重鎖ドメイン配列を含む、請求項１に記載の抗体。
11. 細胞株クローン３Ｄ９（２００２年９月２７日に寄託された、ＡＴＣＣ特許寄託物名ＰＴＡ−４７２６）により産生される抗体と同じ重鎖および軽鎖のポリペプチドプチド配列を含む、抗体。
12. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体を産生する、細胞。
13. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体であって、親抗体の結合特性を実質的に保持する、抗体。
14. 前記抗体が、さらに、細胞毒性部分に連結されている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体。
15. 前記抗体が、さらに、化学療法薬物に連結されている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体。
16. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
17. ヒトにおける新生物形成の進行、重篤度または作用を処置または軽減する方法であって、該方法は、請求項１６に記載の組成物を該ヒトに投与する工程を包含する、方法。
18. ヒトにおける腫瘍体積を減少する方法であって、該方法は、請求項１６に記載の組成物を該ヒトに投与する工程を包含する、方法。
19. 細胞株クローン３Ｄ９（２００２年９月２７日に寄託された、ＡＴＣＣ特許寄託物名ＰＴＡ−４７２６）により産生される抗体の軽鎖に対するコード配列を含む、単離された核酸。
20. 細胞株クローン３Ｄ９（２００２年９月２７日に寄託された、ＡＴＣＣ特許寄託物名ＰＴＡ−４７２６）により産生される抗体の重鎖に対するコード配列を含む、単離された核酸。
21. 配列番号５の残基１〜１０７に対するコード配列を含む、単離された核酸。
22. 配列番号１３の残基１〜１１３に対するコード配列を含む、単離された核酸。
23. 請求項２１に記載の核酸を含む、発現ベクター。
24. 請求項２２に記載の核酸を含む、発現ベクター。
25. 請求項２３または２４に記載の発現ベクターを含む、細胞。
26. 細胞株クローン３Ｄ９（２００２年９月２７日に寄託された、ＡＴＣＣ特許寄託物名ＰＴＡ−４７２６）の、細胞。
27. 前記抗体が抗原結合フラグメントである、請求項１〜１１および１３〜１５のいずれか１項に記載の抗体。
28. 前記フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）_２フラグメント、およびＦ_ｖフラグメントからなる群から選択される、請求項２７に記載の抗体。
29. 前記抗体が、ポリエチレングリコールまたはアルブミンに結合体化されている、請求項１〜１１、１３〜１５、２７および２８のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
30. 前記抗体の定常領域が、改変されていない抗体と比較して、少なくとも１つの定常領域媒介性の生物学的エフェクター機能を減少するように改変されている、請求項１〜１１、１３〜１５および２７〜２９のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
31. 変更されたエフェクター機能を有するＦｃ領域を含む、請求項１〜１１、１３〜１５および２７〜３０のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
32. ３Ｄ９（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−４７２６）からなる、ハイブリドーマ細胞。
33. 前記ハイブリドーマ細胞が、ヒト化抗体またはその抗原結合部分を産生する、請求項３２に記載のハイブリドーマ細胞。
34. 配列番号１由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）および可変領域フレームワークアミノ酸残基Ｙ３６、Ｓ４９およびＦ８７（Ｋａｂａｔ番号付けシステム）を含む軽鎖であって、該軽鎖の残りは、ヒト抗体由来である、軽鎖。
35. 配列番号２由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）および可変領域フレームワークアミノ酸残基Ｙ２７およびＴ３０（Ｋａｂａｔ番号付けシステム）を含む重鎖であって、該重鎖の残りは、ヒト抗体由来である、重鎖。
36. 請求項３４に記載の軽鎖および、請求項３５に記載の重鎖を含むヒト化抗体、または、該抗体の抗原結合フラグメント。
37. リンホトキシン−βレセプター（ＬＴ−β−Ｒ）に結合する、請求項３６に記載の抗体。
38. 配列番号１として示されるＢＨＡ１０可変軽鎖配列のＣＤＲを含む、ヒト化抗体。
39. 配列番号２として示されるＢＨＡ１０可変重鎖配列のＣＤＲを含む、ヒト化抗体。
40. ＬＴ−β−Ｒに特異的に結合する、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントであって、該抗体またはフラグメントは、マウスＢＨＡ１０抗体由来のＣＤＲに対応するＣＤＲを含む可変領域を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメント。
41. Ｆａｂフラグメントである、請求項４０に記載のフラグメント。
42. 患者における癌を処置または軽減する方法であって、請求項１〜１１、１３〜１５、２７〜３１および３６〜４０のいずれか１項に記載のヒト化抗体の有効投薬量を該患者に投与する工程を包含する、方法。
43. 患者における固形腫瘍を処置または減少する方法であって、請求項１〜１１、１３〜１５、２７〜３１および３６〜４０のいずれか１項に記載のヒト化抗体の有効投薬量を該患者に投与する工程を包含する、方法。
44. 前記固形腫瘍が、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、乳癌、前立腺癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、皮膚癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、食道癌および膀胱癌からなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。

Images