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JP2005520489A - アポリポタンパク質（ａ）発現のアンチセンス調節 - Google Patents

アポリポタンパク質（ａ）発現のアンチセンス調節 Download PDF

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JP2005520489A JP2003519238A JP2003519238A JP2005520489A JP 2005520489 A JP2005520489 A JP 2005520489A JP 2003519238 A JP2003519238 A JP 2003519238A JP 2003519238 A JP2003519238 A JP 2003519238A JP 2005520489 A JP2005520489 A JP 2005520489A
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Abstract

アポリポタンパク質（ａ）の発現を調節するためのアンチセンス化合物、組成物および方法が提供される。該組成物は、アポリポタンパク質（ａ）をコードする核酸に標的を定められたアンチセンス化合物、とりわけアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んで成る。アポリポタンパク質（ａ）の発現を調節するためおよびアポリポタンパク質（ａ）の発現に関連する疾患の治療のためのこれらの化合物の使用方法が提供される。

Description

本発明は、アポリポタンパク質（ａ）の発現を調節するための組成物および方法を提供する。とりわけ、本発明は、アポリポタンパク質（ａ）をコードする核酸と特異的にハイブリダイズ可能な化合物、とりわけオリゴヌクレオチドに関する。こうした化合物はアポリポタンパク質（ａ）の発現を調節することが示されている。
リポタンパク質は、タンパク質、リン脂質およびコレステロールよりなる両親媒性コーティングにより取り巻かれる、アシルグリセロールおよびコレステリルエステルの非極性コアよりなる球状のミセル様粒子である。リポタンパク質はそれらの機能および物理特性に基づき、５つの広範な範疇、すなわち、カイロミクロン（食物脂質を腸から組織へ輸送する）、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、中密度リポタンパク質（ＩＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、（これらはすべて、トリアシルグリセロールおよびコレステロールを肝から組織に輸送する）、ならびに高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）（内因性コレステロールを組織から肝に輸送する）に分類されている。
リポタンパク質粒子は継続的代謝プロセシングを受け、また、変動可能な特性および組成を有する。リポタンパク質の密度は、それらの外側のコーティングの密度が内部コアのものより小さいため、粒子径の減少を伴わずに増大する。リポタンパク質のタンパク質成分はアポリポタンパク質として知られる。最低９種のアポリポタンパク質が、多様なヒトリポタンパク質のなかにかなりの量で分布している。
リポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ）としてもまた知られる）は、前粥腫形成性ＬＤＬクラスのコレステロール豊富な粒子である。Ｌｐ（ａ）は旧世界霊長類およびヨーロッパハリネズミ中でのみ見出されるため、それは脂質およびリポタンパク質の代謝において不可欠の役割を演じていないことが示唆されている。大部分の研究は、高濃度のＬｐ（ａ）が心血管系疾患のリスク増大と強く関連することを示している（非特許文献１）。これらの観察結果は、Ｌｐ（ａ）の濃度および生理学的特性を制御する因子を検討するためのヒトおよび他の霊長類における多数の研究を刺激した（非特許文献１）。
Ｌｐ（ａ）は２種のジスルフィド結合された別個のタンパク質すなわちアポリポタンパク質（ａ）（もしくはＡｐｏＡ）およびアポリポタンパク質Ｂ（もしくはＡｐｏＢ）を含有する（非特許文献１）。アポリポタンパク質（ａ）は、Ｌｐ（ａ）の生理学的濃度を独占的に制御することが示されたＬＰＡ遺伝子によりコードされる唯一のアポリポタンパク質である（非特許文献１）。それはＬＰＡ遺伝子中のＫｒｉｎｇｌｅ ４をコードする５．５ｋｂの配列のタンデムリピートの数における対立遺伝子間の差異により、大きさが変動する（非特許文献１）。
１９８７年のヒトアポリポタンパク質（ａ）のクローニングはヒトプラスミノーゲンに対する相同性を示した（非特許文献２）。アポリポタンパク質（ａ）をコードする遺伝子座ＬＰＡは、プラスミノーゲンの相同な遺伝子に対しすぐ近接の染色体６ｐ２６−２７に限局化された（非特許文献３）。
ヒトアポリポタンパク質（ａ）を発現するトランスジェニックマウスは、大動脈中の脂質を染色する傷害の発生に対し対照マウスより感受性が高いことが見出され、そして、結果として、アポリポタンパク質（ａ）は動脈壁中の脂質沈着と共局在化している（非特許文献４）。これらの研究の拡大として、アポリポタンパク質（ａ）の主要なｉｎ ｖｉｖｏ作用が、潜在性トランスフォーミング増殖因子−βの低下された活性化を引き起こすプラスミノーゲンのプラスミンへの転換の阻害であることが確立された。トランスフォーミング増殖因子−βは平滑筋細胞の移動および増殖の負の調節物質であるため、プラスミノーゲン活性化の阻害は、アテローム硬化性傷害のアポリポタンパク質（ａ）誘導の可能な機構を示す（非特許文献５）。
アポリポタンパク質（ａ）の発現増加により引き起こされるＬｐ（ａ）の血漿レベル上昇は、アテローム硬化症のリスク増大、ならびに高コレステロール血症（非特許文献６）、心筋梗塞（非特許文献７）および血栓症（非特許文献８）を包含するその症状発現と関連する。
さらに、Ｌｐ（ａ）の血漿濃度は遺伝的因子により強く影響され、そして大部分の薬物および食餌の操作に対し難治性である（非特許文献９；非特許文献１０）。上昇したＬｐ（ａ）レベルの薬理学的治療はささやかにのみ成功裏であり、そして、血漿交換が最も有効な治療様式のままである（非特許文献１１）。
Ｍｏｒｉｓｈｉｔａらは、ＨｅｐＧ２細胞におけるアポリポタンパク質（ａ）発現の阻害のための、アポリポタンパク質（ａ）に対するリボザイムオリゴヌクレオチドの使用を報告した（非特許文献１２）。
ヒトアポリポタンパク質（ａ）遺伝子の５’調節領域をコードするヌクレオチド配列、および、ヌクレオチド位置−２０８から−１４４８までのヒトアポリポタンパク質（ａ）からの最低３０の連続する相補ヌクレオチドを含んで成る単離されたヌクレオチド配列が、特許文献１に開示かつ特許請求されている（Ｌａｗｎ、１９９８）。
今日まで、アポリポタンパク質（ａ）の機能を阻害することに向けられた研究および治療戦略は、Ｌｐ（ａ）血漿交換およびリボザイムオリゴヌクレオチドの以前に引用された使用に関するものであった。結果として、アポリポタンパク質（ａ）の機能を効果的に阻害することが可能な付加的な作用物質に対する長い間感じられた必要性が存続している。
アンチセンス技術は特異的遺伝子産物の発現を低下させる有効な手段として出現してきており、そして、従って、アポリポタンパク質（ａ）の発現の調節を伴う多数の治療的、診断的および研究の応用において、独特に有用であることが判明するかもしれない。
本発明は、アポリポタンパク質（ａ）の発現を調節するための組成物および方法を提供する。
米国特許第５，７２１，１３８号明細書 ＲａｉｎｗａｔｅｒとＫａｍｍｅｒｅｒ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｚｏｏｌ．、１９９８、２８２、５４−６１ ＭｃＬｅａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、１９８７、３３０、１３２−１３７ Ｆｒａｎｋら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、１９８８、７９、３５２−３５６ Ｌａｗｎら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９２、３６０、６７０−６７２ Ｇｒａｉｎｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９４、３７０、４６０−４６２ Ｓｅｅｄら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９９０、３２２、１４９４−１４９９ Ｓａｎｄｋａｍｐら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、１９９０、３６、２０−２３ Ｎｏｗａｋ−Ｇｏｔｔｌら、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、１９９７、９９、Ｅ１１ ＫａｔａｎとＢｅｙｎｅｎ、Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．、１９８７、１２５、３８７−３９９ Ｖｅｓｓｂｙら、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、１９８２、４４、６１−７１ ＨａｊｊａｒとＮａｃｈｍａｎ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．、１９９６、４７、４２３−４４２ Ｍｏｒｉｓｈｉｔａら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１９９８、９８、１８９８−１９０４
本発明は、アポリポタンパク質（ａ）をコードする核酸に標的を定められかつアポリポタンパク質（ａ）の発現を調節する化合物、とりわけアンチセンスオリゴヌクレオチドに向けられる。本発明の化合物を含んで成る製薬学的および他の組成物もまた提供される。細胞もしくは組織を、本発明のアンチセンス化合物もしくは組成物の１種もしくはそれ以上と接触させることを含んで成る、前記細胞もしくは組織中でのアポリポタンパク質（ａ）の発現の調節方法がさらに提供される。治療上もしくは予防上有効な量の本発明のアンチセンス化合物もしくは組成物の１種もしくはそれ以上を投与することによる、アポリポタンパク質（ａ）の発現と関連する疾患もしくは状態を有するもしくはそれに罹りやすいと疑われる動物、とりわけヒトの治療方法がさらに提供される。
発明の詳細な記述
本発明は、アポリポタンパク質（ａ）をコードする核酸分子の機能の調節、最終的には産生されるアポリポタンパク質（ａ）の量の調節における使用のためのオリゴマー化合物、とりわけアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する。これは、アポリポタンパク質（ａ）をコードする１種もしくはそれ以上の核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物を提供することにより達成される。本明細書で使用されるところの「標的核酸」および「アポリポタンパク質（ａ）をコードする核酸」という用語は、アポリポタンパク質（ａ）をコードするＤＮＡ、こうしたＤＮＡから転写されたＲＮＡ（ｍＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）およびｍＲＮＡを包含する）、ならびにこうしたＲＮＡ由来のｃＤＮＡもまた包含する。その標的核酸とオリゴマー化合物の特異的ハイブリダイゼーションは、該核酸の正常の機能を妨害する。それに特異的にハイブリダイズする化合物による標的核酸の機能のこの調節は、一般に「アンチセンス」と称される。妨害されるべきＤＮＡの機能は複製および転写を包含する。妨害されるべきＲＮＡの機能は、例えば、タンパク質翻訳の部位へのＲＮＡの移行、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、１種もしくはそれ以上のｍＲＮＡ種を生じさせるＲＮＡのスプライシング、およびＲＮＡにかかわるもしくはそれにより助長されるかもしれない触媒活性のような、全部の重要な機能を包含する。標的核酸の機能のこうした妨害の全体的効果は、アポリポタンパク質（ａ）の発現の調節である。本発明の情況において、「調節」は遺伝子の発現の増大（刺激）もしくは減少（阻害）のいずれかを意味する。本発明の情況において、阻害は、好ましい形態の遺伝子発現の調節であり、かつ、ｍＲＮＡが好ましい標的である。
アンチセンスに対する特異的な核酸を標的とすることが好ましい。特定の核酸へのアンチセンス化合物の「ターゲッティング」は、本発明の情況において、多段階の過程である。該過程は通常、その機能が調節されるべきである核酸配列の同定で開始する。これは、例えば、その発現が特定の障害もしくは疾患状態と関連する細胞遺伝子（もしくは該遺伝子から転写されたｍＲＮＡ）、または感染性病原体からの核酸分子であってよい。本発明において、標的はアポリポタンパク質（ａ）をコードする核酸分子である。ターゲッティング過程はまた、所望の効果、例えばタンパク質の発現の検出もしくは調節が生じることができるようなものを発生させるアンチセンス相互作用のための、この遺伝子内の部位（１個もしくは複数）の決定も包含する。本発明の情況内で、好ましい遺伝子内（ｉｎｔｒａｇｅｎｉｃ）部位は、該遺伝子の読取り枠（ＯＲＦ）の翻訳開始もしくは終止コドンを包含する領域である。当該技術分野で既知であるとおり、翻訳開始コドンは典型的に５’−ＡＵＧ（転写されたｍＲＮＡ分子において；対応するＤＮＡ分子中では５’−ＡＴＧ）であるため、翻訳開始コドンはまた「ＡＵＧコドン」、「開始コドン」もしくは「ＡＵＧ開始コドン」とも称される。少数の遺伝子は、ＲＮＡ配列５’−ＧＵＧ、５’−ＵＵＧもしくは５’−ＣＵＧを有する翻訳開始コドンを有し、そして、５’−ＡＵＡ、５’−ＡＣＧおよび５’−ＣＵＧがｉｎ ｖｉｖｏで機能することが示されている。従って、「翻訳開始コドン」および「開始コドン」という用語は、各例におけるイニシエーターアミノ酸が典型的にメチオニン（真核生物において）もしくはホルミルメチオニン（原核生物において）であっても、多くのコドン配列を包含する可能性がある。真核生物および原核生物の遺伝子が２種もしくはそれ以上の代替の開始コドンを有してよく、そのいずれか１つが特定の細胞型もしくは組織中、または特定の組の条件下で翻訳開始に優先的に利用されるかもしれないこともまた、当該技術分野で既知である。本発明の情況において、「開始コドン」および「翻訳開始コドン」は、こうしたコドンの配列（１種もしくは複数）に関係なく、アポリポタンパク質（ａ）をコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡ分子の翻訳を開始するのにｉｎ ｖｉｖｏで使用されるコドン（１個もしくは複数）を指す。
遺伝子の翻訳終止コドン（もしくは「終止コドン」）は３種の配列、すなわち５’−ＵＡＡ、５’−ＵＡＧおよび５’−ＵＧＡ（対応するＤＮＡ配列はそれぞれ５’−ＴＡＡ、５’−ＴＡＧおよび５’−ＴＧＡである）の１つを有するかもしれないこともまた当該技術分野で既知である。「開始コドン領域」および「翻訳開始コドン領域」という用語は、翻訳開始コドンからいずれかの方向（すなわち５’もしくは３’）に約２５から約５０までの連続するヌクレオチドを包含するｍＲＮＡもしくは遺伝子のような一部分を指す。同様に、「終止コドン領域」および「翻訳終止コドン領域」という用語は、翻訳終止コドンからいずれかの方向（すなわち５’もしくは３’）に約２５から約５０までの連続するヌクレオチドを包含するこうしたｍＲＮＡもしくは遺伝子の一部分を指す。
翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとの間の領域を指すことが当該技術分野で既知である読取り枠（ＯＲＦ）もしくは「コーディング領域」もまた、効果的に標的を定められるかもしれない領域である。他の標的領域は、翻訳開始コドンから５’の方向のｍＲＮＡの一部分を指すことが当該技術分野で既知でありかつ従ってｍＲＮＡもしくは該遺伝子上の対応するヌクレオチドの５’ｃａｐ部位と翻訳開始コドンとの間のヌクレオチドを包含する５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、および、翻訳終止コドンから３’の方向のｍＲＮＡの該部分を指すことが当該技術分野で既知でありかつ従って翻訳終止コドンとｍＲＮＡもしくは該遺伝子上の対応するヌクレオチドの３’端との間のヌクレオチドを包含する３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を包含する。ｍＲＮＡの５’ｃａｐは、５’−５’三リン酸結合を介してｍＲＮＡの最も５’の残基に結合されたＮ７−メチル化グアノシン残基を含んで成る。ｍＲＮＡの５’ｃａｐ領域は、５’ｃａｐ構造それ自身、ならびにｃａｐに隣接する最初の５０ヌクレオチドを包含するとみなされる。５’ｃａｐ領域もまた好ましい標的領域であるかもしれない。
いくつかの真核生物ｍＲＮＡ転写物は直接翻訳されるとは言え、多くは、それが翻訳される前に転写物から摘出される、「イントロン」として知られる１個もしくはそれ以上の領域を含有する。残存する（そして従って翻訳される）領域は「エキソン」として知られ、そして、一緒にスプライスされて連続するｍＲＮＡ配列を形成する。ｍＲＮＡのスプライス部位、すなわちイントロン−エキソン接合部もまた好ましい標的領域であるかもしれず、そして、異常なスプライシングが疾患に関与する、もしくは特定のｍＲＮＡスプライス産物の過剰産生が疾患に関与する状況でとりわけ有用である。再配列もしくは欠失による異常な融合結合物もまた好ましい標的である。イントロンもまた、例えばＤＮＡもしくは前ｍＲＮＡに標的を定められたアンチセンス化合物の有効かつ従って好ましい標的領域でもある可能性があることもまた見出されている。
１個もしくはそれ以上の標的部位が一旦同定されれば、標的に十分相補的である、すなわち十分に良好にかつ十分な特異性を伴ってハイブリダイズして所望の効果を生じさせるオリゴヌクレオチドが選ばれる。
本発明の情況において、「ハイブリダイゼーション」は、相補的ヌクレオシドもしくはヌクレオチド塩基間のワトソン−クリック型、フーグスティーンもしくは逆フーグスティーン水素結合であってよい水素結合を意味する。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成により対形成する相補的核酸塩基である。本明細書で使用されるところの「相補的」は、２種のヌクレオチド間の正確な対形成の能力を指す。例えば、オリゴヌクレオチドのある位置のヌクレオチドが、あるＤＮＡもしくはＲＮＡ分子の同一の位置のヌクレオチドと水素結合することが可能である場合には、該オリゴヌクレオチドおよび該ＤＮＡもしくはＲＮＡはその位置で相互と相補的であるとみなされる。該オリゴヌクレオチドおよび該ＤＮＡもしくはＲＮＡは、各分子の十分な数の対応する位置が相互と水素結合することができるヌクレオチドにより占有される場合に、相互に対し相補的である。従って、「特異的にハイブリダイズ可能」および「相補的」は、オリゴヌクレオチドとＤＮＡもしくはＲＮＡ標的との間で安定かつ特異的な結合が存在するような、十分な程度の相補性もしくは正確な対形成を示すのに使用される用語である。アンチセンス化合物の配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるべきその標的核酸のものに１００％相補的である必要はないことが当該技術分野で理解されている。アンチセンス化合物は、標的ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子への該化合物の結合が標的ＤＮＡもしくはＲＮＡの正常の機能を妨害して有用性の喪失を引き起こし、かつ、特異的結合が望ましい条件下、すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイもしくは治療的治療の場合に生理学的条件下で、および、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの場合には該アッセイが実施される条件下で、非標的配列への該アンチセンス化合物の非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性が存在する場合に、特異的にハイブリダイズ可能である。
標的にハイブリダイズしかつ標的の発現を阻害する本発明のアンチセンスおよび他の化合物は実験により同定され、そして、これらの化合物の配列は本発明の好ましい態様として下で同定される。これらの好ましい配列がそれに対して相補的である標的部位は、下で「活性部位」と称され、そして従ってターゲッティングのための好ましい部位である。従って、本発明の別の態様は、これらの活性部位にハイブリダイズする化合物を包含する。
アンチセンス化合物は研究試薬および診断薬として普遍的に使用される。例えば、極めて鋭敏な特異性を伴い遺伝子発現を阻害することが可能であるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定の遺伝子の機能を解明するために当業者によりしばしば使用される。アンチセンス化合物はまた、例えば、生物学的経路の多様なメンバーの機能を識別するのにも使用される。アンチセンス調節は、従って、研究の使用に利用されている。
キットおよび診断薬における使用のため、本発明のアンチセンス化合物は、単独でまたは他のアンチセンス化合物もしくは治療薬と組合せで、細胞および組織内で発現される遺伝子の一部分もしくは全体の発現パターンを解明するためのディファレンシャルおよび／もしくはコンビナトリアル分析における手段として使用することができる。
１種もしくはそれ以上のアンチセンス化合物で処理された細胞もしくは組織内の発現パターンを、アンチセンス化合物で処理されない対照細胞もしくは組織と比較し、そして、生じられたパターンを遺伝子発現の差示的レベルについて分析する。それらが、例えば検査された遺伝子の疾患との関連、シグナル伝達経路、細胞局在化、発現レベル、大きさ、構造もしくは機能に関するためである。これらの分析は、刺激されたもしくは未刺激の細胞で、また、発現パターンに影響を及ぼす他の化合物の存在もしくは非存在下で実施することができる。
当該技術分野で既知の遺伝子発現分析方法の例は、ＤＮＡアレイもしくはマイクロアレイ（ＢｒａｚｍａとＶｉｌｏ、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、２０００、４８０、１７−２４；Ｃｅｌｉｓら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、２０００、４８０、２−１６）、ＳＡＧＥ（遺伝子発現の連続分析）（Ｍａｄｄｅｎら、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ、２０００、５、４１５−４２５）、ＲＥＡＤＳ（消化されたｃＤＮＡの制限酵素増幅）（ＰｒａｓｈａｒとＷｅｉｓｓｍａｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９９９、３０３、２５８−７２）、ＴＯＧＡ（全遺伝子発現分析）（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２０００、９７、１９７６−８１）、タンパク質アレイおよびプロテオミクス（Ｃｅｌｉｓら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、２０００、４８０、２−１６；Ｊｕｎｇｂｌｕｔら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１９９９、２０、２１００−１０）、発現配列タグ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ）（ＥＳＴ）配列決定（Ｃｅｌｉｓら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、２０００、４８０、２−１６；Ｌａｒｓｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０００、８０、１４３−５７）、サブトラクション（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ）ＲＮＡフィンガープリント法（ＳｕＲＦ）（Ｆｕｃｈｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０００、２８６、９１−９８；Ｌａｒｓｏｎら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、２０００、４１、２０３−２０８）、サブトラクション（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ）クローニング、ディファレンシャルディスプレイ（ＤＤ）（ＪｕｒｅｃｉｃとＢｅｌｍｏｎｔ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０００、３、３１６−２１）、ＣＧＨ法（Ｃａｒｕｌｌｉら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ．、１９９８、３１、２８６−９６）、ＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）技術（ＧｏｉｎｇとＧｕｓｔｅｒｓｏｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｎｃｅｒ、１９９９、３５、１８９５−９０４）および質量分析法（（Ｔｏ、Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ、２０００、３、２３５−４１に総説される）を包含する。
アンチセンスの特異性および感受性もまた、治療的用途に、当業者により利用される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは動物およびヒトにおける疾患状態の治療において治療的部分として使用されている。リボザイムを包含するアンチセンスオリゴヌクレオチド薬物はヒトに安全かつ効果的に投与されており、また、多数の臨床試験が現在進行中である。従って、オリゴヌクレオチドは、細胞、組織および動物、とりわけヒトの治療のための治療レジメンで有用であるように設計されることができる有用な治療のモダリティーである可能性があることが確立されている。
本発明の情況において、「オリゴヌクレオチド」という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）もしくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはそれらの模倣物のオリゴマーもしくはポリマーを指す。本用語は、天然に存在する核酸塩基、糖および共有ヌクレオシド間（バックボーン）結合から構成されるオリゴヌクレオチド、ならびに、同様に機能する天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドを包含する。こうした修飾もしくは置換オリゴヌクレオチドは、しばしば、例えば、高められた細胞の取込み、核酸標的に対する高められた親和性、およびヌクレアーゼの存在下での増大された安定性のような所望の特性のために、天然の形態を上回って好ましい。
アンチセンスオリゴヌクレオチドはアンチセンス化合物の好ましい一形態である一方、本発明は、限定されるものでないが下述されるもののようなオリゴヌクレオチド模倣物を挙げることができる他のオリゴマーアンチセンス化合物を包含する。本発明のアンチセンス化合物は、好ましくは約８から約５０までの核酸塩基（すなわち約８から約５０までの結合されたヌクレオシド）を含んで成る。とりわけ好ましいアンチセンス化合物はアンチセンスオリゴヌクレオチド、なおより好ましくは約１２から約３０までの核酸塩基を含んで成るものである。アンチセンス化合物は、リボザイム、外部ガイド配列（ｅｘｔｅｒｎａｌ ｇｕｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド（オリゴザイム（ｏｌｉｇｏｚｙｍｅ））、および標的核酸にハイブリダイズしかつその発現を調節する他の短い触媒的ＲＮＡもしくは触媒的オリゴヌクレオチドを包含する。
当該技術分野で既知であるとおり、ヌクレオシドは塩基と糖の組合せである。ヌクレオシドの塩基部分は通常複素環塩基である。こうした複素環塩基の２種の最も普遍的な分類はプリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合されるリン酸基をさらに包含するヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を包含するヌクレオシドについて、リン酸基は糖の２’、３’もしくは５’いずれかのヒドロキシル部分に連結されることができる。オリゴヌクレオチドの形成において、リン酸基は隣接するヌクレオシドを相互に共有結合して直鎖状ポリマー化合物を形成する。順に、この直鎖状ポリマー構造のそれぞれの端は、さらに結合されて環状構造を形成する可能性があるが、しかしながら、開放の直鎖状構造が一般に好ましい。オリゴヌクレオチド構造内で、リン酸基はオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間バックボーンを形成すると普遍的に称される。ＲＮＡおよびＤＮＡの通常の結合もしくはバックボーンは３’から５’のホスホジエステル結合である。
本発明で有用な好ましいアンチセンス化合物の特定の例は、修飾されたバックボーンもしくは非天然のヌクレオシド間結合を含有するオリゴヌクレオチドを包含する。本明細で定義されるところの、修飾されたバックボーンを有するオリゴヌクレオチドは、バックボーン中にリン原子を保持するものおよびバックボーン中にリン原子を有しないものを包含する。本明細の目的上、およびときに当該技術分野で言及されるとおり、それらのヌクレオシド間バックボーン中にリン原子を有しない修飾オリゴヌクレオチドもまたオリゴヌクレオシドであるとみなすことができる。
好ましい修飾オリゴヌクレオチドバックボーンは、例えば、ホスホロチオエート、キラルなホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルならびに３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネートおよびキラルなホスホネートを包含する他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを包含するホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、通常の３’−５’結合を有するセレノホスフェートおよびボラノホスフェート、これらの２’−５’結合類似物、ならびに１個もしくはそれ以上のヌクレオチド間結合が３’から３’、５’から５’もしくは２’から２’結合である逆転された極性を有するものを包含する。逆転された極性を有する好ましいオリゴヌクレオチドは、最も３’のヌクレオチド間結合に単一の３’から３’結合、すなわち無塩基（ａｂａｓｉｃ）であってもよい（核酸塩基が欠けているかもしくはその代わりにヒドロキシル基を有する）単一の逆転されたヌクレオシド残基を含んで成る。多様な塩、混合塩および遊離酸の形態もまた包含される。
上のリン含有結合の製造法を教示する代表的な米国特許は、限定されるものでないが、米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，４６９，８６３号；同第４，４７６，３０１号；同第５，０２３，２４３号；同第５，１７７，１９６号；同第５，１８８，８９７号；同第５，２６４，４２３号；同第５，２７６，０１９号；同第５，２７８，３０２号；同第５，２８６，７１７号；同第５，３２１，１３１号；同第５，３９９，６７６号；同第５，４０５，９３９号；同第５，４５３，４９６号；同第５，４５５，２３３号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７６，９２５号；同第５，５１９，１２６号；同第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３０６号；同第５，５５０，１１１号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６１号；同第５，１９４，５９９号；同第５，５６５，５５５号；同第５，５２７，８９９号；同第５，７２１，２１８号；同第５，６７２，６９７号および同第５，６２５，０５０号明細書を挙げることができ、そのあるものは本出願と共通に所有され、また、そのそれぞれは引用することにより本明細書に組み込まれる。
その中にリン原子を包含しない好ましい修飾オリゴヌクレオチドバックボーンは、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合されたヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１個もしくはそれ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間結合により形成されるバックボーンを有する。これらは、モルホリノ結合（部分的にヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサンバックボーン；スルフィド、スルホキシドおよびスルホンバックボーン；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン；リボアセチルバックボーン；アルケン含有バックボーン；スルファメートバックボーン；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノバックボーン；スルホネートおよびスルホンアミドバックボーン；アミドバックボーンを有するもの；ならびに混合されたＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２成分の部分を有する他者を包含する。
上のオリゴヌクレオシドの製造法を教示する代表的な米国特許は、限定されるものでないが、米国特許第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同５，２１４，１３４号；同第５，２１６，１４１号；同第５，２３５，０３３号；同第５，２６４，５６２号；同第５，２６４，５６４号；同第５，４０５，９３８号；同第５，４３４，２５７号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７０，９６７号；同第５，４８９，６７７号；同第５，５４１，３０７号；同第５，５６１，２２５号；同第５，５９６，０８６号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６０８，０４６号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６１８，７０４号；同第５，６２３，０７０号；同第５，６６３，３１２号；同第５，６３３，３６０号；同第５，６７７，４３７号；同第５，７９２，６０８号；同第５，６４６，２６９号および同第５，６７７，４３９号明細書を挙げることができ、そのあるものは本明細と共通に所有され、かつ、そのそれぞれは引用することにより本明細書に組み込まれる。
他の好ましいオリゴヌクレオチド模倣物においては、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合すなわちバックボーン双方が新規基で置き換えられる。塩基単位は適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。１つのこうしたオリゴマー化合物、すなわち優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣物はペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物においては、オリゴヌクレオチドの糖−バックボーンが、アミド含有バックボーン、とりわけアミノエチルグリシンバックボーンで置き換えられる。該核酸塩基は保持されかつバックボーンのアミド部分のアザ窒素原子に直接もしくは間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の製造法を教示する代表的米国特許は、限定されるものでないが米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；および同第５，７１９，２６２号明細書を挙げることができ、そのそれぞれは引用することにより本明細書に組み込まれる。ＰＮＡ化合物のさらなる教示はＮｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１、２５４、１４９７−１５００に見出すことができる。
本発明の最も好ましい態様は、ホスホロチオエートバックボーンをもつオリゴヌクレオチドおよびヘテロ原子バックボーンをもつオリゴヌクレオシド、ならびに、とりわけ、上に言及される米国特許第５，４８９，６７７号明細書の−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−［メチレン（メチルイミノ）もしくはＭＭＩバックボーンとして知られる］、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−［式中、天然のホスホジエステルバックボーンが−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−として表される］、ならびに上に言及される米国特許第５，６０２，２４０号明細書のアミドバックボーンである。上に言及される米国特許第５，０３４，５０６号明細書のモルホリノバックボーン構造を有するオリゴヌクレオチドもまた好ましい。
修飾オリゴヌクレオチドはまた１個もしくはそれ以上の置換糖部分も含有してよい。好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に、以下、すなわち、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルの１つを含んで成り、式中、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは置換もしくは未置換のＣ１ないしＣ１０アルキルもしくはＣ２ないしＣ１０アルケニルおよびアルキニルであってよい。Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２がとりわけ好ましく、式中、ｎおよびｍは１から約１０までである。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に、以下、すなわち、Ｃ１ないしＣ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改良するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬動力学特性を改良するための基、および類似の特性を有する他の置換基の１つを含んで成る。好ましい修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）もしくは２’−ＭＯＥとしてもまた知られる）（Ｍａｒｔｉｎら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９９５、７８、４８６−５０４）、すなわちアルコキシアルコキシ基を包含する。さらなる好ましい修飾は、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち下の実施例に記述されるところの、２’−ＤＭＡＯＥとしてもまた知られるＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルもしくは２’−ＤＭＡＥＯＥとしてもまた当該技術分野で知られる）、すなわち下の実施例にもまた記述される２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２を包含する。
さらなる好ましい修飾は、２’−ヒドロキシル基が糖環の３’もしくは４’炭素原子に結合されそれにより二環糖部分を形成するロック核酸（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）（ＬＮＡ）を包含する。該結合は、好ましくは、２’酸素原子および４’炭素原子を架橋するメチレン（−ＣＨ２−）ｎ基であり、式中ｎは１もしくは２である。ＬＮＡおよびその製造法は第ＷＯ ９８／３９３５２号および同第ＷＯ ９９／１４２２６号明細書に記述される。
他の好ましい修飾は、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’−アリル（２’−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）を包含する。２’−修飾はアラビノ（上）位置もしくはリボ（下）位置であってよい。好ましい２’−アラビノ修飾は２’−Ｆである。類似の修飾を、オリゴヌクレオチドの他の位置、とりわけ、３’末端ヌクレオチドもしくは２’−５’結合オリゴヌクレオチド中の糖の３’位、および５’末端ヌクレオチドの５’位でもまた行ってもよい。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分のような糖模倣物を有してもよい。こうした修飾糖構造の製造法を教示する代表的な米国特許は、限定されるものでないが、米国特許第４，９８１，９５７号；同第５，１１８，８００号；同第５，３１９，０８０号；同第５，３５９，０４４号；同第５，３９３，８７８号、同第５，４４６，１３７号；同第５，４６６，７８６号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５１９，１３４号；同第５，５６７，８１１号；同第５，５７６，４２７号；同第５，５９１，７２２号；同第５，５９７，９０９号；同第５，６１０，３００号；同第５，６２７，０５３号；同第５，６３９，８７３号；同第５，６４６，２６５号；同第５，６５８，８７３号；同第５，６７０，６３３号；同第５，７９２，７４７号；および同第５，７００，９２０号明細書を挙げることができ、そのあるものは本出願と共通に所有され、かつ、そのそれぞれはそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる。
オリゴヌクレオチドはまた、核酸塩基（単純に「塩基」と当該技術分野でしばしば称される）の修飾もしくは置換も包含してよい。本明細書で使用されるところの「未修飾」もしくは「天然の」核酸塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を包含する。修飾核酸塩基は、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３）ウラシルおよびシトシン、ならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、とりわけ５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンのような他の合成および天然の核酸塩基を包含する。さらなる修飾核酸塩基は、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、置換フェノキサジンシチジン（例えば９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）のようなＧ−クランプ（Ｇ−ｃｌａｍｐｓ）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドル−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）のような三環性ピリミジンを包含する。修飾核酸塩基はまた、プリンもしくはピリミジン塩基が他の複素環で置き換えられるもの、例えば、７−デアザアデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン、および２−ピリドンも包含してもよい。さらなる核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号明細書に開示されるもの、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８５８−８５９ページ、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．編 ジョン ワイリー アンド サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、１９９０に開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０、６１３に開示されるもの、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．、第１５章、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２８９−３０２ページ、Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．とＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．編、ＣＲＣ プレス（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）、１９９３に開示されるものを包含する。これらの核酸塩基のあるものは本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増大させるのにとりわけ有用である。これらは、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびに、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを包含するＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンを包含する。５−メチルシトシン置換は核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃だけ増大させることが示されており（ＳＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．、Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．とＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．編、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＣＲＣ プレス（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）、ボカレイトン、１９９３、ｐｐ．２７６−２７８）、そして、現在、なおよりとりわけ２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組合せられる場合に、好ましい塩基置換である。
上に示された修飾核酸塩基のあるもの、ならびに他の修飾核酸塩基の製造法を教示する代表的米国特許は、限定されるものでないが、上に示された米国特許第３，６８７，８０８号明細書；ならびに米国特許第４，８４５，２０５号；同第５，１３０，３０２号；同第５，１３４，０６６号；同第５，１７５，２７３号；同第５，３６７，０６６号；同第５，４３２，２７２号；同第５，４５７，１８７号；同第５，４５９，２５５号；同第５，４８４，９０８号；同第５，５０２，１７７号；同第５，５２５，７１１号；同第５，５５２，５４０号；同第５，５８７，４６９号；同第５，５９４，１２１号、同第５，５９６，０９１号；同第５，６１４，６１７号；同第５，６４５，９８５号；同第５，８３０，６５３号；同第５，７６３，５８８号；同第６，００５，０９６号；および同第５，６８１，９４１号明細書（そのあるものは本出願と共通に所有され、かつ、そのそれぞれは引用することにより本明細書に組み込まれる）、ならびに米国特許第５，７５０，６９２号明細書（本出願と共通に所有されかつまた引用することにより本明細書に組み込まれる）を挙げることができる。
本発明のオリゴヌクレオチドの別の修飾は、該オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布もしくは細胞の取込みを高める１種もしくはそれ以上の部分もしくは複合物（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を該オリゴヌクレオチドに化学的に結合することを伴う。本発明の化合物は、一級もしくは二級ヒドロキシル基のような官能基に共有結合された複合基を包含することができる。本発明の複合基は、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬動力学特性を高める基、およびオリゴマーの薬物動態特性を高める基を包含する。典型的な複合基は、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリンおよび色素を包含する。本発明の情況において薬動力学特性を高める基は、オリゴマーの取込みを向上させ、分解に対するオリゴマーの抵抗性を高め、かつ／もしくはＲＮＡとの配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基を包含する。本発明の情況において、薬物動態特性を高める基は、オリゴマーの取込み、分布、代謝もしくは排泄を改良する基を包含する。代表的複合基は、１９９２年１０月２３日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６号明細書（その開示全体は引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示される。複合部分は、限定されるものでないが、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８９、８６、６５５３−６５５６）のような脂質部分、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．、１９９４、４、１０５３−１０６０）、チオエーテル、例えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９２、６６０、３０６−３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．、１９９３、３、２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９２、２０、５３３−５３８）、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１９９１、１０、１１１１−１１１８；Ｋａｂａｎｏｖら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、１９９０、２５９、３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、１９９３、７５、４９−５４）、リン脂質、例えばジヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９９５、３６、３６５１−３６５４；Ｓｈｅａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９０、１８、３７７７−３７８３）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９５、１４、９６９−９７３）、もしくはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９９５、３６、３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１９９５、１２６４、２２９−２３７）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノカルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、１９９６、２７７、９２３−９３７）を挙げることができる。本発明のオリゴヌクレオチドはまた、活性の薬物物質、例えば、アスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）−（＋）−プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、２，３，５−三ヨウ化安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾチアジアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメチシン、バルビツール酸、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌薬もしくは抗生物質に複合させてもよい。オリゴヌクレオチド−薬物複合物およびそれらの製造法は、米国特許出願第０９／３３４，１３０号明細書（１９９９年６月１５日出願）（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述される。
こうしたオリゴヌクレオチド複合物の製造法を教示する代表的な米国特許は、限定されるものでないが、米国特許第４，８２８，９７９号；同第４，９４８，８８２号；同第５，２１８，１０５号；同第５，５２５，４６５号；同第５，５４１，３１３号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５５２，５３８号；同第５，５７８，７１７号、同第５，５８０，７３１号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５９１，５８４号；同第５，１０９，１２４号；同第５，１１８，８０２号；同第５，１３８，０４５号；同第５，４１４，０７７号；同第５，４８６，６０３号；同第５，５１２，４３９号；同第５，５７８，７１８号；同第５，６０８，０４６号；同第４，５８７，０４４号；同第４，６０５，７３５号；同第４，６６７，０２５号；同第４，７６２，７７９号；同第４，７８９，７３７号；同第４，８２４，９４１号；同第４，８３５，２６３号；同第４，８７６，３３５号；同第４，９０４，５８２号；同第４，９５８，０１３号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，２４５，０２２号；同第５，２５４，４６９号；同第５，２５８，５０６号；同第５，２６２，５３６号；同第５，２７２，２５０号；同第５，２９２，８７３号；同第５，３１７，０９８号；同第５，３７１，２４１号；同第５，３９１，７２３号；同第５，４１６，２０３号；同第５，４５１，４６３号；同第５，５１０，４７５号；同第５，５１２，６６７号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５６５，５５２号；同第５，５６７，８１０号；同第５，５７４，１４２号；同第５，５８５，４８１号；同第５，５８７，３７１号；同第５，５９５，７２６号；同第５，５９７，６９６号；同第５，５９９，９２３号；同第５，５９９，９２８号および同第５，６８８，９４１号明細書を挙げることができ、そのあるものは本出願と共通に所有され、かつ、そのそれぞれは引用することにより本明細書に組み込まれる。
所定の化合物中の全部の位置が均一に修飾される必要はなく、そして、実際に、前述の修飾の１個以上が、単一の化合物もしくはオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドにさえ組み込まれてよい。本発明はまた、キメラ化合物であるアンチセンス化合物も包含する。本発明の情況における「キメラの（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）」アンチセンス化合物もしくは「キメラ（ｃｈｉｍｅｒａ）」は、それぞれが最低１個の単量体単位、すなわちオリゴヌクレオチド化合物の場合はヌクレオチドで構成される、２種もしくはそれ以上の化学的に別個の領域を含有するアンチセンス化合物、とりわけオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には、ヌクレアーゼ分解に対する増大された抵抗性、増大された細胞の取込み、および／もしくは標的核酸に対する増大された結合親和性をオリゴヌクレオチドに賦与するように該オリゴヌクレオチドが修飾されている最低１個の領域を含有する。オリゴヌクレオチドの付加的な一領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡもしくはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することが可能な酵素の基質としてはたらくかもしれない。例として、ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞のエンドヌクレアーゼである。従って、ＲＮアーゼＨの活性化はＲＮＡ標的の切断をもたらし、それにより遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率を大きく高める。結果として、同一の標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドに比較して、キメラオリゴヌクレオチドを使用する場合に、より短いオリゴヌクレオチドを用いて匹敵する結果をしばしば得ることができる。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動、および、必要な場合は当該技術分野で既知の関連する核酸ハイブリダイゼーション技術により慣例に検出することができる。
本発明のキメラアンチセンス化合物は、２種もしくはそれ以上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、および／もしくは上述されたところのオリゴヌクレオチド模倣物の混成構造として形成させてよい。こうした化合物はまた、当該技術分野でハイブリッドもしくはギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）とも称される。こうしたハイブリッド構造の製造法を教示する代表的な米国特許は、限定されるものでないが、米国特許第５，０１３，８３０号；同第５，１４９，７９７号；同第５，２２０，００７号；同第５，２５６，７７５号；同第５，３６６，８７８号；同第５，４０３，７１１号；同第５，４９１，１３３号；同第５，５６５，３５０号；同第５，６２３，０６５号；同第５，６５２，３５５号；同第５，６５２，３５６号；および同第５，７００，９２２号明細書を挙げることができ、そのあるものは本出願と共通に所有され、かつ、そのそれぞれはそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる。
本発明により使用されるアンチセンス化合物は、固相合成の公知の技術により便宜的にかつ慣例に作成してよい。こうした合成のための装置は、例えばアプライド バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（カリフォルニア州フォスターシティ）を包含するいくつかの供給元により販売されている。当該技術分野で既知のこうした合成のためのいずれの他の手段も付加的にもしくは代替的に使用してよい。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体のようなオリゴヌクレオチドを製造するための類似の技術を使用することが公知である。
本発明のアンチセンス化合物はｉｎ ｖｉｔｒｏで合成され、そして生物学的起源のアンチセンス組成物、もしくはアンチセンス分子のｉｎ ｖｉｖｏ合成を指図するよう設計された遺伝子ベクター構築物を包含しない。
本発明の化合物はまた、例えば、取込み、分布および／もしくは吸収において補助するためのリポソーム、受容体に標的を定められた分子、経口、直腸、局所もしくは他の製剤として他の分子、分子構造もしくは化合物の混合物と混合、被包化、複合体形成（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）もしくは別の方法で連合させてもよい。こうした取込み、分布および／もしくは吸収を補助する製剤の製造法を教示する代表的米国特許は、限定されるものでないが、米国特許第５，１０８，９２１号；同第５，３５４，８４４号；同第５，４１６，０１６号；同第５，４５９，１２７号；同第５，５２１，２９１号；同第５，５４３，１５８号；同第５，５４７，９３２号；同第５，５８３，０２０号；同第５，５９１，７２１号；同第４，４２６，３３０号；同第４，５３４，８９９号；同第５，０１３，５５６号；同第５，１０８，９２１号；同第５，２１３，８０４号；同第５，２２７，１７０号；同第５，２６４，２２１号；同第５，３５６，６３３号；同第５，３９５，６１９号；同第５，４１６，０１６号；同第５，４１７，９７８号；同第５，４６２，８５４号；同第５，４６９，８５４号；同第５，５１２，２９５号；同第５，５２７，５２８号；同第５，５３４，２５９号；同第５，５４３，１５２号；同第５，５５６，９４８号；同第５，５８０，５７５号；および同第５，５９５，７５６号明細書を挙げることができ、そのそれぞれは引用することにより本明細書に組み込まれる。
本発明のアンチセンス化合物は、ヒトを包含する動物への投与に際してその生物学的に活性の代謝物もしくは残基を（直接もしくは間接的に）提供することが可能である、いずれかの製薬学的に許容できる塩、エステル、もしくはこうしたエステルの塩、またはいずれかの他の化合物を包含する。従って、例えば、本発明の化合物のプロドラッグおよび製薬学的に許容できる塩、こうしたプロドラッグの製薬学的に許容できる塩、および他の生物学的同等物（ｂｉｏｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）に対する開示もまた引き出される。
「プロドラッグ」という用語は、内因性の酵素の作用または他の化学物質および／もしくは条件により身体もしくはその細胞内で活性の形態（すなわち薬物）に転化される不活性の形態で製造される治療薬を示す。とりわけ、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグのバージョンは、１９９３年１２月９日公開のＧｏｓｓｅｌｉｎらへの第ＷＯ ９３／２４５１０号もしくはＩｍｂａｃｈらへの第ＷＯ ９４／２６７６４号明細書および米国特許第５，７７０，７１３号明細書に開示される方法により、ＳＡＴＥ［（Ｓ−アセチル−２−チオエチル）ホスフェート］」誘導体として製造される。
「製薬学的に許容できる塩」という用語は、本発明の化合物の生理学的および製薬学的に許容できる塩、すなわち、特許化合物の所望の生物学的活性を保持しかつ望ましくない毒物学的影響をそれに与えない塩を指す。
製薬学的に許容できる塩基付加塩は、アルカリおよびアルカリ土類金属もしくは有機アミンのような金属もしくはアミンと形成される。陽イオンとして使用される金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどである。適するアミンの例は、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミンおよびプロカインである（例えば、Ｂｅｒｇｅら、“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ，”Ｊ．ｏｆ Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．、１９７７、６６、１−１９を参照されたい）。前記酸性化合物の塩基付加塩は、遊離酸の形態を十分な量の所望の塩基と接触させて慣習的様式で塩を生じさせることにより製造する。遊離酸の形態は、慣習的様式で、塩の形態を酸と接触させることおよび遊離酸を単離することにより再生してもよい。遊離酸の形態は、極性溶媒中の溶解性のようなある種の物理特性がそれらのそれぞれの塩の形態といくぶん異なるが、しかし、それ以外は、該塩は本発明の目的上それらのそれぞれの遊離酸に同等である。本明細書で使用されるところの「製薬学的付加塩」は、本発明の組成物の成分の１つの酸の形態の製薬学的に許容できる塩を包含する。これらはアミンの有機もしくは無機酸塩を包含する。好ましい酸塩は、塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩およびリン酸塩である。他の適する製薬学的に許容できる塩は当業者に公知であり、そして、例えば、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸もしくはリン酸のような無機酸と；有機カルボン酸、スルホン酸、スルホもしくはホスホ酸またはＮ−置換スルファミン酸、例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、ケイヒ酸、マンデル酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、２−フェノキシ安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、エムボン酸（ｅｍｂｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ニコチン酸もしくはイソニコチン酸と；および、天然のタンパク質合成に関与する２０種のα−アミノ酸のようなアミノ酸、例えばグルタミン酸もしくはアスパラギン酸と、ならびにまた、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、２−もしくは３−ホスホグリセリン酸、グルコース−６−リン酸、Ｎ−シクロヘキシルスルファミン酸と（シクラメートの形成を伴う）、またはアスコルビン酸のような他の酸性有機化合物とのような、多様な無機および有機酸の塩基性塩を包含する。化合物の製薬学的に許容できる塩はまた、製薬学的に許容できる陽イオンを用いて製造してもよい。適する製薬学的に許容できる陽イオンは当業者に公知であり、そして、アルカリ、アルカリ土類、アンモニウムおよび四級アンモニウム陽イオンを包含する。炭酸塩もしくは炭酸水素塩もまた可能である。
オリゴヌクレオチドについて、製薬学的に許容できる塩の好ましい例は、限定されるものでないが、（ａ）ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウムのような陽イオン、スペルミンおよびスペルミジンのようなポリアミンなどと形成される塩；（ｂ）無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などと形成される酸付加塩；（ｃ）例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などのような有機酸と形成される塩；ならびに（ｄ）塩素、臭素およびヨウ素のような元素陰イオンから形成される塩を挙げることができる。
本発明のアンチセンス化合物は、診断薬、治療薬、予防薬に、ならびに研究試薬およびキットとして利用することができる。治療薬に関しては、アポリポタンパク質（ａ）の発現を調節することにより治療することができる疾患もしくは障害を有すると疑われる動物、好ましくはヒトを、本発明のアンチセンス化合物を投与することにより治療する。本発明の化合物は、有効量の該アンチセンス化合物を適する製薬学的に許容できる希釈剤もしくは担体に添加することにより、製薬学的組成物中で利用することができる。本発明のアンチセンス化合物および方法の使用はまた、予防的に、例えば、例えば感染症、炎症もしくは腫瘍形成を予防するもしくは遅らせるためにも有用であるかもしれない。
本発明のアンチセンス化合物は、これらの化合物がアポリポタンパク質（ａ）をコードする核酸にハイブリダイズしてこの事実を探究するためにサンドイッチおよび他のアッセイが容易に構築されることを可能にするために、研究および診断に有用である。アポリポタンパク質（ａ）をコードする核酸との本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは当該技術分野で既知の手段により検出することができる。こうした手段は、オリゴヌクレオチドへの酵素の複合、オリゴヌクレオチドの放射標識、もしくはいずれかの他の適する検出手段を包含してよい。サンプル中のアポリポタンパク質（ａ）のレベルを検出するためのこうした検出手段を使用するキットもまた製造されるかもしれない。
本発明はまた、本発明のアンチセンス化合物を包含する製薬学的組成物および製剤も包含する。本発明の製薬学的組成物は、局所もしくは全身治療が望ましいかどうかに、および治療されるべき領域に依存して、多数の方法で投与してよい。投与は、局所（眼、ならびに膣および直腸送達を包含する粘膜へを包含する）、肺、例えばネブライザーによるを包含する粉末もしくはエアゾル剤の吸入（ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ）もしくは吸入（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｉｏｎ）による；気管内、鼻内、表皮および経皮）、経口または非経口であってよい。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）もしくは注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）；または頭蓋内、例えばクモ膜下もしくは脳室内投与を包含する。最低１個の２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を伴うオリゴヌクレオチドが経口投与にとりわけ有用であると考えられる。
局所投与のための製薬学的組成物および製剤は、経皮貼付剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、スプレー剤、液体および散剤を包含してよい。慣習的な製薬学的担体、水性、粉末もしくは油性の基剤、増粘剤などが必要もしくは望ましいかもしれない。被覆されたコンドーム、手袋などもまた有用かもしれない。好ましい局所製剤は、本発明のオリゴヌクレオチドが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤および界面活性剤のような局所送達剤と混合状態にあるものを包含する。好ましい脂質およびリポソームは、中性（例えばジオレオイルホスファチジル ＤＯＰＥ エタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリン ＤＭＰＣ、ジステアロリホスファチジルコリン）陰イオン性（例えばジミリストイルホスファチジルグリセロール ＤＭＰＧ）ならびに陽イオン性（例えばジオレオイルテトラメチルアミノプロピル ＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン ＤＯＴＭＡ）を包含する。本発明のオリゴヌクレオチドはリポソーム内に被包化してよいか、もしくはそれと、とりわけ陽イオン性リポソームと複合体形成してよい。あるいは、オリゴヌクレオチドは脂質、とりわけ陽イオン性脂質と複合体形成してよい。好ましい脂肪酸およびエステルは、限定されるものでないが、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、もしくはＣ１−１０アルキルエステル（例えばイソプロピルミリステート ＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリド、またはそれらの製薬学的に許容できる塩を挙げることができる。局所製剤は、１９９９年５月２０日出願の米国特許出願第０９／３１５，２９８号明細書（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に詳細に記述される。
経口投与のための組成物および製剤は、散剤もしくは顆粒剤、微粒子、ナノ粒子、水もしくは非水性媒体中の懸濁剤もしくは溶液、カプセル剤、ゲルカプセル剤、カシェ剤、錠剤もしくはミニ錠剤（ｍｉｎｉｔａｂｌｅｔ）を包含する。増粘剤、着香料、希釈剤、乳化剤、分散助剤もしくは結合剤が望ましいかもしれない。好ましい経口製剤は、本発明のオリゴヌクレオチドが１種もしくはそれ以上の浸透増強剤界面活性剤およびキレート剤とともに投与されるものである。好ましい界面活性剤は、脂肪酸および／またはそのエステルもしくは塩、胆汁酸および／もしくはその塩を包含する。好ましい胆汁酸／塩は、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）およびウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ−２４，２５−ジヒドロフシジン酸ナトリウム、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム、を包含する。好ましい脂肪酸は、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリル酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、もしくはモノグリセリド、ジグリセリド、またはそれらの製薬学的に許容できる塩（例えばナトリウム）を包含する。浸透増強剤の組合せ、例えば胆汁酸／塩と組合せの脂肪酸／塩もまた好ましい。とりわけ好ましい組合せはラウリン酸、カプリン酸およびＵＤＣＡのナトリウム塩である。さらなる浸透増強剤は、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルを包含する。本発明のオリゴヌクレオチドは、噴霧乾燥された粒子を包含するかまたは微粒子もしくはナノ粒子を形成するよう複合体形成された顆粒の形態にて経口で送達させてもよい。オリゴヌクレオチド複合体形成剤は、ポリアミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；ポリアルキルアクリレート、ポリオキセタン、ポリアルキルシアノアクリレート；陽イオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびデンプン；ポリアルキルシアノアクリレート；ＤＥＡＥ−誘導体化ポリイミン、ポルラン、セルロースおよびデンプンを包含する。とりわけ好ましい複合体形成剤は、キトサン、Ｎ−トリメチルキトサン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリドン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレン Ｐ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えばｐ−アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソへキシルシアノアクリレート）、ＤＥＡＥ−メタクリレート、ＤＥＡＥ−ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミンおよびＤＥＡＥ−デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリへキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギン酸塩、ならびにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を包含する。オリゴヌクレオチドの経口製剤およびそれらの製造法は、米国特許出願第０８／８８６，８２９号（１９９７年７月１日出願）、同第０９／１０８，６７３号（１９９８年７月１日出願）、同第０９／２５６，５１５号（１９９９年２月２３日出願）、同第０９／０８２，６２４号（１９９８年５月２１日出願）および同第０９／３１５，２９８号明細書（１９９９年５月２０日出願）（そのそれぞれはそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に詳細に記述される。
非経口、クモ膜下もしくは脳室内投与のための組成物および製剤は、緩衝剤、希釈剤、ならびに限定されるものでないが浸透増強剤、担体化合物および他の製薬学的に許容できる担体もしくは賦形剤を挙げることができる他の適する添加物もまた含有してもよい滅菌の水性溶液を包含してよい。
本発明の製薬学的組成物は、限定されるものでないが溶液、乳剤、およびリポソーム含有製剤を挙げることができる。これらの組成物は、限定されるものでないが予め形成された液体、自己乳化する固形物、および自己乳化する半固形物を挙げることができる多様な成分から生成させてよい。
単位投与剤形で便宜的に提示されるかもしれない本発明の製薬学的製剤は、製薬業界で公知の慣習的技術に従って製造してよい。こうした技術は、有効成分を製薬学的担体（１種もしくは複数）または賦形剤（１種もしくは複数）との連合にもたらすことの段階を包含する。一般に、製剤は、有効成分を液体担体もしくは微細に分割された固体担体または双方との連合に均一にかつ緊密にもたらすこと、およびその後、必要な場合は生成物を造形することにより製造する。
本発明の組成物は、限定されるものでないが錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液体シロップ剤、軟ゲル剤、坐剤および浣腸剤を挙げることができる多くの可能な投薬形態のいずれに処方してもよい。本発明の組成物は水性、非水性もしくは混合媒体中の懸濁剤として処方してもまたよい。水性懸濁剤は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／もしくはデキストランを包含する、懸濁剤の粘度を増大させる物質をさらに含有してもよい。懸濁剤はまた安定剤も含有してよい。
本発明の一態様において、製薬学的組成物は泡沫剤として処方かつ使用してよい。製薬学的泡沫剤は、限定されるものでないが乳剤、マイクロエマルション、クリーム剤、ゼリー剤およびリポソームを挙げることができる製剤を包含する。性質が基本的に類似である一方、これらの製剤は最終生成物の成分および粘稠度が変動する。こうした組成物および製剤の製造法は、製薬学的および製剤の技術分野の当業者に公知であり、そして、本発明の組成物の製剤に適用してよい。
乳剤
本発明の組成物は乳剤として製造かつ処方してよい。乳剤は、典型的には、直径が通常０．１μｍを超える液滴の形態で別のもの中に分散された一方の液体の不均質な系である。（Ｉｄｓｏｎ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ、Ｌｉｂｅｒｍａｎ、ＲｉｅｇｅｒとＢａｎｋｅｒ（編）、１９８８、マルセル デッカー インク（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻中、ｐ．１９９；Ｒｏｓｏｆｆ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ、Ｌｉｂｅｒｍａｎ、ＲｉｅｇｅｒとＢａｎｋｅｒ（編）、１９８８、マルセル デッカー インク（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻中、ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ、Ｌｉｂｅｒｍａｎ、ＲｉｅｇｅｒとＢａｎｋｅｒ（編）、１９８８、マルセル デッカー インク（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第２巻中、ｐ．３３５；Ｈｉｇｕｃｈｉら、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、マック パブリッシング カンパニー（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．）、フィラデルフィア州イーストン、１９８５中、ｐ．３０１）。乳剤は、しばしば、相互と緊密に混合かつ分散された２種の混合不可能な液相で構成する二相系である。一般に、乳剤は油中水型（ｗ／ｏ）もしくは水中油型（ｏ／ｗ）の異種のいずれかであってよい。水相を微小な液滴に微細に分割しかつ大量の油相中にそれとして分散させる場合、生じる組成物は油中水型（ｗ／ｏ）乳剤と呼ばれる。あるいは、油相を微小な液滴に微細に分割しかつ大量の水相中にそれとして分散させる場合、生じる組成物は水中油型（ｏ／ｗ）乳剤と呼ばれる。乳剤は、水相、油相のいずれか中に溶液として、もしくはそれ自身別個の相として存在してよい、分散された相および有効成分に加えて付加的な成分を含有してもよい。乳化剤、安定剤、色素および抗酸化剤のような製薬学的賦形剤もまた、必要とされるように乳剤中に存在してもよい。製薬学的乳剤はまた、例えば油中水中油（ｏ／ｗ／ｏ）および水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）乳剤の場合のように、２種以上の相から構成される多相乳剤（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｅｍｕｌｓｉｏｎ）であってもよい。こうした複雑な製剤は、しばしば、単純な二相乳剤が提供しないある種の利点を提供する。ｏ／ｗ乳剤の個々の油滴が小さな水滴を囲む多相乳剤はｗ／ｏ／ｗ乳剤を構成する。同様に、油連続相中で安定化された水の球体に囲まれる油滴の系はｏ／ｗ／ｏ乳剤を提供する。
乳剤は熱力学的安定性がほとんどもしくは全くないことを特徴とする。しばしば、乳剤の分散されたもしくは不連続な相は、外的なもしくは連続する相中に良好に分散され、そして乳化剤もしくは該乳剤の粘度の手段によってこの形態で維持される。乳剤の相のいずれも、乳剤型の軟膏基剤およびクリーム剤の場合がそうであるように、半固形もしくは固形であってよい。乳剤を安定化する他の手段は乳化剤の使用を必要とし、これは乳剤のいずれかの相中に組み込まれてよい。乳化剤は、４つの範疇、すなわち、合成界面活性剤、天然に存在する乳化剤、吸収基剤、および微細に分散された固体に広範に分類されてよい（Ｉｄｓｏｎ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ、Ｌｉｂｅｒｍａｎ、ＲｉｅｇｅｒとＢａｎｋｅｒ（編）、１９８８、マルセル デッカー インク（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻中、ｐ．１９９）。
界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｅ ａｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔｓ）としてもまた知られる合成の界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ）は、乳剤の製剤において広範な応用性を見出しており、そして文献中で総説されている（Ｒｉｅｇｅｒ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ、Ｌｉｂｅｒｍａｎ、ＲｉｅｇｅｒとＢａｎｋｅｒ（編）、１９８８、マルセル デッカー インク（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻中、ｐ．２８５；Ｉｄｓｏｎ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ、Ｌｉｂｅｒｍａｎ、ＲｉｅｇｅｒとＢａｎｋｅｒ（編）、マルセル デッカー インク（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、１９８８、第１巻中、ｐ．１９９）。界面活性剤は典型的には両親媒性であり、そして親水性および疎水性部分を含んで成る。界面活性剤の疎水性の性質に対する親水性の比は親水／親油バランス（ＨＬＢ）と命名され、そして、製剤の製造における界面活性剤の分類および選択において価値のある手段である。界面活性剤は、親水性基の性質に基づいて多様な分類、すなわち非イオン性、陰イオン性、陽イオン性および両性に分類してよい（Ｒｉｅｇｅｒ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ、Ｌｉｂｅｒｍａｎ、ＲｉｅｇｅｒとＢａｎｋｅｒ（編）、１９８８、マルセル デッカー インク（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻中、ｐ．２８５）。
乳剤製剤で使用される天然に存在する乳化剤は、ラノリン、ミツロウ、ホスファチド、レシチンおよびアラビアゴムを包含する。無水ラノリンおよび親水性ワセリンのような吸収基剤は、それらが水を吸い込んでｗ／ｏ乳剤を形成することができるがなおそれらの半固形の粘稠度を保持するような親水性の特性を有する。微細に分割された固体もまた、とりわけ界面活性剤と組合せでおよび粘性の製剤において良好な乳化剤として使用されている。これらは、重金属水酸化物のような極性の無機固体、ベントナイト、アッタパルジャイト、ヘクトナイト、カオリン、モントモリロナイト、コロイド状ケイ酸アルミニウムおよびコロイド状ケイ酸アルミニウムマグネシウムのような非膨潤性粘土、色素、ならびに炭素もしくは三ステアリン酸グリセリルのような非極性固体を包含する。
多様な非乳化物質もまた乳剤の製剤に包含され、そして乳剤の特性に寄与する。これらは、脂肪、油、蝋、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、緩和剤、親水コロイド、保存剤および抗酸化剤を包含する（Ｂｌｏｃｋ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ、Ｌｉｂｅｒｍａｎ、ＲｉｅｇｅｒとＢａｎｋｅｒ（編）、１９８８、マルセル デッカー インク（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻中、ｐ．３３５；Ｉｄｓｏｎ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ、Ｌｉｂｅｒｍａｎ、ＲｉｅｇｅｒとＢａｎｋｅｒ（編）、１９８８、マルセル デッカー インク（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻中、ｐ．１９９）。
親水コロイド（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｌｉｃ ｃｏｌｌｏｉｄ）またはハイドロコロイド（ｈｙｄｒｏｃｏｌｌｏｉｄ）は、多糖（例えば、アラビアゴム、寒天、アルギン酸、カラギーナン、グアールガム、カラヤゴムおよびトラガカント）、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）のような天然に存在するガムおよび合成ポリマー、ならびに合成ポリマー（例えばカーボマー、セルロースエーテルおよびカルボキシビニルポリマー）を包含する。これらは水中で分散もしくは膨潤してコロイド溶液を形成し、それが分散された相の液滴の周囲に強い界面間薄膜を形成しかつ外側相の粘度を増大させることにより乳剤を安定化する。
乳剤はしばしば、微生物の成長を容易に支援するかもしれない炭水化物、タンパク質、ステロールおよびホスファチドのような多数の成分を含有するため、これらの製剤はしばしば保存剤を組み込む。乳剤の製剤中に包含される普遍的に使用される保存剤は、メチルパラベン、プロピルパラベン、四級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルおよびホウ酸を包含する。製剤の劣化を予防するために、抗酸化剤もまた乳剤の製剤に普遍的に添加される。使用される抗酸化剤は、トコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンのようなフリーラジカル捕捉剤、もしくはアスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウムのような還元剤、ならびにクエン酸、酒石酸およびレシチンのような抗酸化剤の共力剤であってよい。
皮膚科学的、経口および非経口の経路を介する乳剤の製剤の適用、ならびにそれらの製造方法は文献に総説されている（Ｉｄｓｏｎ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ、Ｌｉｂｅｒｍａｎ、ＲｉｅｇｅｒとＢａｎｋｅｒ（編）、１９８８、マルセル デッカー インク（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻中、ｐ．１９９）。経口送達のための乳剤の製剤は、処方の容易さ、吸収および生物学的利用性の見地からの効率の理由のため、非常に広範に使用されている。（Ｒｏｓｏｆｆ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ、Ｌｉｂｅｒｍａｎ、ＲｉｅｇｅｒとＢａｎｋｅｒ（編）、１９８８、マルセル デッカー インク（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻中、ｐ．２４５；Ｉｄｓｏｎ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ、Ｌｉｂｅｒｍａｎ、ＲｉｅｇｅｒとＢａｎｋｅｒ（編）、１９８８、マルセル デッカー インク（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻中、ｐ．１９９）。鉱物油基剤の緩下剤、油溶性ビタミンおよび高脂肪栄養製剤は、ｏ／ｗ乳剤として経口で普遍的に投与されている物質である。
本発明の一態様において、オリゴヌクレオチドおよび核酸の組成物はマイクロエマルションとして処方される。マイクロエマルションは、単一の光学的に等方性かつ熱力学的に安定な液体の溶液である、水、油、および両親媒性物質の系と定義してよい（Ｒｏｓｏｆｆ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ、Ｌｉｂｅｒｍａｎ、ＲｉｅｇｅｒとＢａｎｋｅｒ（編）、１９８８、マルセル デッカー インク（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻中、ｐ．２４５）。典型的には、マイクロエマルションは、最初に水性界面活性剤溶液中に油を分散させること、およびその後十分な量の第四の成分、一般には中鎖長のアルコールを添加して透明な系を形成させることにより製造される系である。従って、マイクロエマルションはまた、界面活性の分子の界面間薄膜により安定化される２種の混合不可能な液体の熱力学的に安定な等方性に澄明な分散剤としても記述されている（ＬｅｕｎｇとＳｈａｎ、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ：Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｒｏｓｏｆｆ，Ｍ．編、１９８９、ＶＣＨ パブリッシャーズ（ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、ニューヨーク中、１８５−２１５ページ）。マイクロエマルションは、普遍的に、油、水、界面活性剤、補助界面活性剤（ｃｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）および電解質を包含する３ないし５成分の組合せを介して製造する。マイクロエマルションが油中水型（ｗ／ｏ）のものであるかもしくは水中油型（ｏ／ｗ）のものであるかは、使用される油および界面活性剤の特性、ならびに界面活性剤分子の極性頭部および炭化水素尾部の構造および幾何学的充填に依存する（Ｓｃｈｏｔｔ、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、マック パブリッシング カンパニー（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｉｎｇ Ｃｏ．）、フィラデルフィア州イーストン、１９８５中、ｐ．２７１）。
相図を利用する現象学的アプローチが広範囲に研究されており、そして、マイクロエマルションの処方方法の当業者への包括的知識を生じた（Ｒｏｓｏｆｆ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ、Ｌｉｂｅｒｍａｎ、ＲｉｅｇｅｒとＢａｎｋｅｒ（編）、１９８８、マルセル デッカー インク（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻中、ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ、Ｌｉｂｅｒｍａｎ、ＲｉｅｇｅｒとＢａｎｋｅｒ（編）、１９８８、マルセル デッカー インク（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻中、ｐ．３３５）。慣習的乳剤に比較して、マイクロエマルションは、自発的に形成される熱力学的に安定な液滴の製剤中に水に不溶性の薬物を可溶化するという利点を提供する。
マイクロエマルションの製造で使用される界面活性剤は、限定されるものでないが、単独でもしくは補助界面活性剤と組合せの、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、ブリッジ（Ｂｒｉｊ）９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレエート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレエート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレエート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセキオレエート（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレエート（ＤＡＯ７５０）を挙げることができる。補助界面活性剤、通常はエタノール、１−プロパノールおよび１−ブタノールのような短鎖アルコールは、界面活性剤の薄膜中に浸透すること、および結果として界面活性剤分子間に生成される空隙により乱雑な薄膜を創製することにより、二面間の流動性を増大させるようはたらく。マイクロエマルションは、しかしながら、補助界面活性剤の使用を伴わずに製造してもよく、そして、アルコールを含まない自己乳化するマイクロエマルション系が当該技術分野で既知である。水相は、典型的には、限定されるものでないが水、薬物の水性溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコールの誘導体を挙げることができる。油相は、限定されるものでないが、カプテックス（Ｃａｐｔｅｘ）３００、カプテックス（Ｃａｐｔｅｘ）３５５、カプマル（Ｃａｐｍｕｌ）ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８−Ｃ１２）モノ、ジおよびトリグリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化合物Ｃ８−Ｃ１０グリセリド、植物油およびシリコーン油のような物質を挙げることができる。
マイクロエマルションは、薬物の可溶化および薬物の高められた吸収の見地からとりわけ興味深い。脂質に基づくマイクロエマルション（ｏ／ｗおよびｗ／ｏ双方）が、ペプチドを包含する薬物の経口の生物学的利用性を高めることが示唆されている（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９４、１１、１３８５−１３９０；Ｒｉｔｓｃｈｅｌ、Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１９９３、１３、２０５）。マイクロエマルションは、改良された薬物の可溶化、酵素的加水分解からの薬物の保護、膜の流動性および浸透性の界面活性剤に誘発される変化による薬物吸収の可能な増強、製造の容易さ、固体の投薬形態を上回る経口投与の容易さ、改良された臨床的効力、ならびに低下された毒性という利点を提供する（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９４、１１、１３８５；Ｈｏら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、１９９６、８５、１３８−１４３）。しばしば、マイクロエマルションは、それらの成分が周囲温度に一緒にもたらされる場合に自発的に生じるかもしれない。これは、熱不安定性な薬物、ペプチドもしくはオリゴヌクレオチドを処方する場合にとりわけ有利であるかもしれない。マイクロエマルションはまた、化粧品および製薬学的双方の応用における有効成分の経皮送達でも有効である。本発明のマイクロエマルション組成物および製剤は、消化管からのオリゴヌクレオチドおよび核酸の増大された全身吸収を助長し、ならびに、消化管、膣、頬腔および他の投与領域内のオリゴヌクレオチドおよび核酸の局所の細胞取込みを向上させることができることが期待される。
本発明のマイクロエマルションはまた、ソルビタンモノオレエート（グリル（Ｇｒｉｌｌ）３）、ラブラソール（Ｌａｂｒａｓｏｌ）、ならびに該製剤の特性を改良しかつ本発明のオリゴヌクレオチドおよび核酸の吸収を高めるための浸透増強剤のような、付加的な成分および添加物も含有してよい。本発明のマクロエマルションで使用される浸透増強剤は、５つの広範な範疇、すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、およびキレート形成しない非界面活性剤の１つに属すると分類してよい（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、ｐ．９２）。これらの分類のそれぞれは上で論考した。
リポソーム
薬物の製剤について研究かつ使用されている、マイクロエマルション以外の多くの組織化された界面活性剤構造が存在する。これらは、単層、ミセル、二重層および小胞を包含する。リポソームのような小胞は、それらの特異性、およびそれらが薬物送達の見地から提供する作用の持続期間のため、大きな興味を引いてきた。本発明で使用されるところの「リポソーム」という用語は、球形の二重層（１個もしくは複数）中に配置される両親媒性脂質から構成される小胞を意味する。
リポソームは、親油性物質および水性の内側から形成される膜を有する単層もしくは多層小胞である。水性部分は送達されるべき組成物を含有する。陽イオン性リポソームは細胞壁に融合することが可能であるという利点を有する。非陽イオン性リポソームは、細胞壁と効果的にのように融合することが可能でないとは言え、ｉｎ ｖｉｖｏでマクロファージにより取込まれる。
無傷の哺乳動物皮膚を横断するためには、脂質小胞は、適する経皮勾配の影響下で、それぞれが５０ｎｍ未満の直径をもつ一連の微細な孔を通過しなければならない。従って、高度に変形可能でありかつこうした微細な孔を通過することが可能であるリポソームを使用することが望ましい。
リポソームのさらなる利点は；天然のリン脂質から得られるリポソームは生物適合性かつ生物分解性である；リポソームは広範な水および脂質溶解性薬物を組み込むことができる；リポソームはそれらの内部区画中の被包化された薬物を代謝および分解から保護することができる、を包含する（Ｒｏｓｏｆｆ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ、Ｌｉｂｅｒｍａｎ、ＲｉｅｇｅｒとＢａｎｋｅｒ（編）、１９８８、マルセル デッカー インク（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻中、ｐ．２４５）。リポソーム製剤の製造における重要な考慮は、脂質表面電荷、小胞の大きさ、およびリポソームの水性容量である。
リポソームは作用部位への有効成分の移動および送達に有用である。リポソーム膜は生物学的膜に構造的に類似であるため、リポソームが組織に適用される場合に、リポソームは細胞膜に溶け込み始める。リポソームおよび細胞の合併が進行する際に、リポソームの内容物が細胞中に出され、そこで有効成分が作用するかもしれない。
リポソーム製剤は、多くの薬物の送達様式として広範な検討の焦点であった。局所投与に関して、リポソームが他の製剤を上回るいくつかの利点を提示することの増大する証拠が存在する。こうした利点は、投与された薬物の高全身吸収に関して低下された副作用、所望の標的での投与された薬物の増大された蓄積、ならびに皮膚中に親水性および疎水性双方の多様な薬物を投与する能力を包含する。
いくつかの報告が、皮膚中に高分子量ＤＮＡを包含する作用物質を送達するリポソームの能力を詳述している。鎮痛薬、抗体、ホルモンおよび高分子量ＤＮＡを包含する化合物が皮膚に投与されている。大多数の適用は表皮上部のターゲッティングをもたらした。
リポソームは２つの広範な分類にある。陽イオン性リポソームは正に荷電したリポソームであり、負に荷電したＤＮＡ分子と相互作用して安定な複合体を形成する。正に荷電したＤＮＡ／リポソーム複合体が負に荷電した細胞表面に結合し、そしてエンドソーム中にインターナリゼーションされる。エンドソーム内の酸性のｐＨによりリポソームが破裂されて、それらの内容物を細胞の細胞質中に放出する（Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１９８７、１４７、９８０−９８５）。
ｐＨ感受性もしくは負に荷電したリポソームは、それと複合体形成するよりもむしろＤＮＡを捕捉する。ＤＮＡおよび脂質双方が同様に荷電しているため、複合体形成よりもむしろ反発が起こる。にもかかわらず、若干のＤＮＡはこれらのリポソームの水性内部内に捕捉される。ｐＨ感受性のリポソームは、チミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを培養物中の細胞単層に送達させるのに使用されている。外因性遺伝子の発現が標的細胞中で検出された（Ｚｈｏｕら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、１９９２、１９、２６９−２７４）。
リポソーム組成物の１つの主要な型は、天然に生じるホスファチジルコリン以外のリン脂質を包含する。中性のリポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）もしくはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成させることができる。陰イオン性リポソーム組成物は、一般にジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成される一方、陰イオン性の融合発生性（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）リポソームは主としてジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別の型のリポソーム組成物は、例えばダイズＰＣおよび卵ＰＣのようなホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成される。別の型は、リン脂質および／もしくはホスファチジルコリンおよび／もしくはコレステロールの混合物から形成される。
いくつかの研究が皮膚へのリポソーム薬物製剤の局所送達を評価している。インターフェロンを含有するリポソームのモルモット皮膚への適用は、皮膚ヘルペス潰瘍の低減をもたらした一方、他の手段（例えば溶液としてもしくは乳剤として）を介するインターフェロンの送達は無効であった（Ｗｅｉｎｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、１９９２、２、４０５−４１０）。さらに、付加的な研究は、水性系を使用するインターフェロンの投与に対するリポソーム製剤の一部として投与されたインターフェロンの有効性を試験し、そして、リポソーム製剤が水性投与より優れていたと結論した（ｄｕ Ｐｌｅｓｓｉｓら、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９２、１８、２５９−２６５）。
非イオン性リポソーム系、とりわけ非イオン性界面活性剤およびコレステロールを含んで成る系もまた、皮膚への薬物の送達におけるそれらの有用性を決定するために検査されている。ノヴァサム［Ｎｏｖａｓｏｍｅ］ＴＭＩ（グリセリルジラウレート／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）およびノヴァサム［Ｎｏｖａｓｏｍｅ］ＴＭＩＩ（グリセリルジステアレート／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含んで成る非イオン性リポソーム製剤を使用して、マウス皮膚の真皮中にシクロスポリン−Ａを送達させた。結果は、こうした非イオン性リポソーム系が皮膚の多様な層へのシクロスポリン−Ａの沈着の助長において有効であったことを示した（Ｈｕら Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．、１９９４、４、６、４６６）。
リポソームはまた、「静電的に安定化された」リポソーム（本明細書で使用されるところの、リポソーム中に組み込まれる場合にこうした特化された（ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ）脂質を欠くリポソームに関して高められた循環寿命をもたらす１種もしくはそれ以上の特化された脂質を含んで成るリポソームを指す用語）も包含する。静電的に安定化されたリポソームの例は、リポソームの小胞を形成する脂質部分の一部が（Ａ）モノシアロガングリオシド ＧＭ１のような１種もしくはそれ以上の糖脂質を含んで成るか、または（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分のような１種もしくはそれ以上の親水性ポリマーで誘導体化されるものである。いずれかの特定の論理により拘束されることを願わないとは言え、少なくとも、ガングリオシド、スフィンゴミエリンもしくはＰＥＧ誘導体化脂質を含有する静電的に安定化されたリポソームに関しては、これらの静電的に安定化されたリポソームの高められた循環半減期が、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞中への低下された取込みに由来すると、当該技術分野で考えられている（Ａｌｌｅｎら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９８７、２２３、４２；Ｗｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９３、５３、３７６５）。１種もしくはそれ以上の糖脂質を含んで成る多様なリポソームが当該技術分野で既知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９８７、５０７、６４）は、リポソームの血中半減期を向上させるモノシアロガングリオシド ＧＭ１、ガラクトセレブロシド硫酸およびホスファチジルイノシトールの能力を報告した。これらの知見はＧａｂｉｚｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９８８、８５、６９４９）により詳述された。双方ともＡｌｌｅｎらへの米国特許第４，８３７，０２８号明細書および第ＷＯ ８８／０４９２４号明細書は、（１）スフィンゴミエリンおよび（２）ガングリオシド ＧＭ１もしくはガラクトセレブロシド硫酸エステルを含んで成るリポソームを開示する。米国特許第５，５４３，１５２号明細書（Ｗｅｂｂら）はスフィンゴミエリンを含んで成るリポソームを開示する。１，２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチジルコリンを含んで成るリポソームが第ＷＯ ９７／１３４９９号明細書（Ｌｉｍら）に開示される。
１種もしくはそれ以上の親水性ポリマーで誘導体化された脂質を含んで成る多くのリポソーム、およびそれらの製造方法が当該技術分野で既知である。Ｓｕｎａｍｏｔｏら（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．、１９８０、５３、２７７８）はＰＥＧ部分を含有する非イオン性洗剤、２Ｃ１２１５Ｇを含んで成るリポソームを記述した。Ｉｌｌｕｍら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、１９８４、１６７、７９）は、ポリマー性グリコールを含むポリスチレン粒子の親水性コーティングが、有意に高められた血中半減期をもたらしたことを示した。ポリアルキレングリコール（例えばＰＥＧ）のカルボン酸基の結合により修飾された合成リン脂質がＳｅａｒｓにより記述されている（米国特許第４，４２６，３３０号および同第４，５３４，８９９号明細書）。Ｋｌｉｂａｎｏｖら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、１９９０、２６８、２３５）は、ＰＥＧもしくはＰＥＧステアレートで誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含んで成るリポソームが血液循環半減期の有意の増大を有することを立証する実験を記述した。Ｂｌｕｍｅら（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、１９９０、１０２９、９１）は、こうした観察結果を、他のＰＥＧ誘導体化されたリン脂質、例えば、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）およびＰＥＧの組合せから形成されるＤＳＰＥ−ＰＥＧに拡大した。それらの外表面上に共有結合されたＰＥＧ部分を有するリポソームは、Ｆｉｓｈｅｒへの欧州特許第ＥＰ ０ ４４５ １３１ Ｂ１号および第ＷＯ ９０／０４３８４号明細書に記述される。１〜２０モルパーセントのＰＥＧ誘導体化ＰＥを含有するリポソーム組成物、およびそれらの使用方法が、Ｗｏｏｄｌｅら（米国特許第５，０１３，５５６号および同第５，３５６，６３３号明細書）ならびにＭａｒｔｉｎら（米国特許第５，２１３，８０４号明細書および欧州特許第ＥＰ ０ ４９６ ８１３ Ｂ１号明細書）により記述されている。多数の他の脂質−ポリマー複合物を含んで成るリポソームは、第ＷＯ ９１／０５５４５号明細書および米国特許第５，２２５，２１２号明細書（双方ともＭａｒｔｉｎらへ）ならびに第ＷＯ ９４／２００７３号明細書（Ｚａｌｉｐｓｋｙら）に開示される。ＰＥＧで修飾されたセラミド脂質を含んで成るリポソームは第ＷＯ ９６／１０３９１号明細書（Ｃｈｏｉら）に記述される。米国特許第５，５４０，９３５号明細書（Ｍｉｙａｚａｋｉら）および同第５，５５６，９４８号明細書（Ｔａｇａｗａら）は、それらの表面上の官能性部分でさらに誘導体化される可能性があるＰＥＧ含有リポソームを記述する。
核酸を含んで成る、制限された数のリポソームが当該技術分野で既知である。Ｔｈｉｅｒｒｙらへの第ＷＯ ９６／４００６２号明細書はリポソーム中への高分子量核酸の被包化方法を開示する。Ｔａｇａｗａらへの米国特許第５，２６４，２２１号明細書はタンパク質に結合されたリポソームを開示し、そして、こうしたリポソームの内容物がアンチセンスＲＮＡを包含してよいことを強く主張する。Ｒａｈｍａｎらへの米国特許第５，６６５，７１０号明細書は、リポソーム中へのオリゴヌクレオチドのある被包化方法を記述する。Ｌｏｖｅらへの第ＷＯ ９７／０４７８７号明細書は，ｒａｆ遺伝子に標的を定められたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んで成るリポソームを開示する。
トランスファーソーム（ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ）はなお別の型のリポソームであり、そして、薬物送達ベヒクルの魅力的な候補である高度に変形可能な脂質凝集物である。トランスファーソームは、それらが液滴より小さい孔を通って浸透することが容易に可能であるくらい高度に変形可能である脂質液滴として記述されてもよい。トランスファーソームは、それらが使用される環境に適合可能であり、例えば、それらは自己至適化し（皮膚の孔の形状に適合する）、自己修復性であり、断片化することを伴わずにそれらの標的に頻繁に到達し、そしてしばしば自己負荷性である。トランスファーソームを作成するためには、表面縁活性化物質（ｓｕｒｆａｃｅ ｅｄｇｅ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、通常は界面活性剤を標準的リポソーム組成物に添加することが可能である。トランスファーソームは血清アルブミンを皮膚に送達するのに使用されている。血清アルブミンの、トランスファーソームに媒介される送達は、血清アルブミンを含有する溶液の皮下注入と同じくらい効果的であることが示されている。
界面活性剤は、乳剤（マイクロエマルションを包含する）およびリポソームのような製剤における広範な応用を見出している。天然および合成双方の多くの異なる型の界面活性剤の特性の最も普遍的な分類および等級付け方法は、親水／親油バランス（ＨＬＢ）の使用による。親水性基（「頭部」としてもまた知られる）の性質は、製剤中で使用される多様な界面活性剤を分類するための最も有用な手段を提供する（Ｒｉｅｇｅｒ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ、マルセル デッカー インク（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、１９８８、ｐ．２８５）。
界面活性剤分子がイオン化されない場合、それは非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は、製薬学的および化粧品製品において広範な応用を見出しており、そして、広範なｐＨ値にわたって使用可能である。一般に、それらのＨＬＢ値は、それらの構造に依存して２から約１８までの範囲にわたる。非イオン性界面活性剤は、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、ショ糖エステルおよびエトキシル化エステルのような非イオン性エステルを包含する。非イオン性アルカノールアミド、および脂肪アルコールエトキシレートのようなエーテル、プロポキシル化アルコール、ならびにエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーもまたこの分類に包含される。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤の分類の最も普及しているメンバーである。
界面活性剤分子が、それが水中に溶解もしくは分散される場合に負の電荷を運搬する場合は、該界面活性剤は陰イオン性として分類される。陰イオン性界面活性剤は、石鹸のようなカルボン酸塩、アシルラクチル酸塩（ａｃｙｌ ｌａｃｔｙｌａｔｅ）、アミノ酸のアシルアミド、アルキル硫酸塩およびエトキシル化アルキル硫酸塩のような硫酸のエステル、アルキルベンゼンスルホン酸塩のようなスルホン酸塩、アシルイセチオン酸塩、アシルタウリンおよびスルホコハク酸塩、ならびにリン酸塩を包含する。陰イオン性界面活性剤の分類の最も重要なメンバーはアルキル硫酸塩および石鹸である。
界面活性剤分子が、それが水中に溶解もしくは分散される場合に正の電荷を運搬する場合は、該界面活性剤は陽イオン性として分類される。陽イオン性界面活性剤は四級アンモニウム塩およびエトキシル化アミンを包含する。四級アンモニウム塩はこの分類の最も使用されるメンバーである。
界面活性剤分子が正もしくは負いずれかの電荷を運搬する能力を有する場合は、該界面活性剤は両性として分類される。両性界面活性剤は、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタインおよびホスファチドを包含する。
薬物生成物、製剤および乳剤における界面活性剤の使用は総説されている（Ｒｉｅｇｅｒ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ、マルセル デッカー インク（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、１９８８、ｐ．２８５）。
浸透増強剤
一態様において、本発明は、動物の皮膚への核酸、とりわけオリゴヌクレオチドの効率的送達を遂げるために多様な浸透増強剤を使用する。大部分の薬物は、イオン化および非イオン化双方の形態で溶液中に存在する。しかしながら、通常、脂質溶解性もしくは親油性の薬物のみが細胞膜を容易に横断する。非親油性薬物でさえ、横断されるべき膜を浸透増強剤で処理する場合に細胞膜を横断するかもしれないことが発見された。細胞膜を横切る非親油性薬物の拡散を補助することに加えて、浸透増強剤はまた、親油性薬物の浸透性も高める。
浸透増強剤は、５つの広範な範疇、すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤およびキレート形成しない非界面活性剤の１つに属するとして分類してよい（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、ｐ．９２）。上に挙げられた分類の浸透増強剤のそれぞれを下により詳細に記述する。
界面活性剤：本発明に関して、界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）（もしくは「界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｅ−ａｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）」）は、水性溶液に溶解される場合に、粘膜を通るオリゴヌクレオチドの吸収が高められるという結果を伴い、溶液の表面張力もしくは水性溶液と別の液体との間の界面間張力を低下させる化学的実体である。胆汁塩および脂肪酸に加えて、これらの浸透増強剤は、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル）（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、ｐ．９２）；ならびにＦＣ−４３のようなパーフルオロケミカル乳剤を包含する。Ｔａｋａｎａｓｈｉら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１９８８、４０、２５２）。
脂肪酸：浸透増強剤として作用する多様な脂肪酸およびそれらの誘導体は、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１−モノオレオイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのＣ１−１０アルキルエステル（例えばメチル、イソプロピルおよびｔ−ブチル）、ならびにそれらのモノおよびジグリセリド（すなわちオレエート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレエートなど）を包含する（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、ｐ．９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９０、７、１−３３；Ｅｌ Ｈａｒｉｒｉら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１９９２、４４、６５１−６５４）。
胆汁塩：胆汁の生理学的役割は、脂質および脂肪溶解性ビタミンの分散および吸収の助長を包含する（Ｂｒｕｎｔｏｎ、第３８章、Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第９版、Ｈａｒｄｍａｎら編、マグロウ−ヒル（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ）、ニューヨーク、１９９６中、ｐｐ．９３４−９３５）。多様な天然の胆汁塩およびそれらの合成誘導体が浸透増強剤として作用する。従って、「胆汁塩」という用語は、胆汁の天然に存在する成分のいずれか、ならびにそれらの合成誘導体のいずれかを包含する。本発明の胆汁塩は、例えば、コール酸（もしくはその製薬学的に許容できるナトリウム塩すなわちコール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリコール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ−２４，２５−ジヒドロフシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウムおよびポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）を包含する（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、９２ページ；Ｓｗｉｎｙａｒｄ、第３９章、Ｒｅｍｉｎｇｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｇｅｎｎａｒｏ編、マック パブリッシング カンパニー（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．）、フィラデルフィア州イーストン、１９９０中、７８２−７８３ページ；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９０、７、１−３３；Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、１９９２、２６３、２５；Ｙａｍａｓｈｉｔａら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、１９９０、７９、５７９−５８３）。
キレート剤：本発明に関連して使用されるところのキレート剤は、粘膜を通るオリゴヌクレオチドの吸収が高められるという結果を伴い、それと錯体を形成することにより溶液から金属イオンを除去する化合物と定義することができる。本発明において浸透増強剤としてのそれらの使用に関して、キレート剤は、ＤＮアーゼ阻害剤としてもまた作用することという付加された利点を有する。大部分の特徴づけられたＤＮＡヌクレアーゼは触媒作用に二価金属イオンを必要とし、そして従ってキレート剤により阻害されるからである（Ｊａｒｒｅｔｔ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．、１９９３、６１８、３１５−３３９）。本発明のキレート剤は、限定されるものでないが、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチル酸塩（例えばサリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチル酸塩およびホモバニル酸塩）、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス（ｌａｕｒｅｔｈ）−９、およびβ−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体（エナミン）を挙げることができる（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、９２ページ；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９０、７、１−３３；Ｂｕｕｒら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．．、１９９０、１４、４３−５１）。
キレート形成しない非界面活性剤：本明細書で使用されるところの、キレート形成しない非界面活性剤の浸透増強化合物は、キレート剤もしくは界面活性剤としてわずかな活性を示すがしかしにもかかわらず栄養粘膜を通るオリゴヌクレオチドの吸収を高める化合物と定義することができる（Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９０、７、１−３３）。この分類の浸透増強剤は、例えば、不飽和環状尿素、１−アルキル−および１−アルケニルアザシクロアルカノン誘導体（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、９２ページ）；ならびに、ジクロフェナクナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾンのような非ステロイド性抗炎症薬（Ｙａｍａｓｈｉｔａら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１９８７、３９、６２１−６２６）を包含する。
細胞レベルでのオリゴヌクレオチドの取込みを高める作用物質はまた、本発明の製薬学的および他の組成物に添加してもよい。例えば、リポフェクチン（Ｊｕｎｉｃｈｉら、米国特許第５，７０５，１８８号明細書）のような陽イオン性脂質、陽イオン性グリセロール誘導体、およびポリリシン（Ｌｏｌｌｏら、ＰＣＴ出願第ＷＯ ９７／３０７３１号明細書）のようなポリカチオン型分子もまた、オリゴヌクレオチドの細胞の取込みを高めることが知られている。
エチレングリコールおよびプロピレングリコールのようなグリコール、２−ピロールのようなピロール、アゾン、ならびにリモネンおよびメントンのようなテルペンを包含する他の作用物質を、投与される核酸の浸透を高めるのに利用してもよい。
担体
本発明のある種の組成物は製剤中に担体化合物もまた組み込む。本明細書で使用されるところの「担体化合物」もしくは「担体」は、不活性である（すなわちそれ自身生物学的活性を有しない）がしかし例えば生物学的に活性の核酸を分解することもしくは循環からのその除去を促進することにより生物学的活性を有する核酸の生物学的利用性を低下させるｉｎ ｖｉｖｏ過程により核酸として認識される、核酸もしくはその類似物を指すことができる。核酸および担体化合物の、典型的には過剰の後者の物質を伴う共投与は、おそらく共通の受容体に対する担体化合物と核酸との間の競争により、肝、腎もしくは他の循環外の貯蔵所（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）にて回収される核酸の量の実質的低減をもたらす可能性がある。例えば、肝組織における部分的にホスホロチオエートのオリゴヌクレオチドの回収は、それがポリイノシン酸、デキストラン硫酸、ポリシチジン酸もしくは４−アセトアミド−４’イソチオシアノ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸と共投与される場合に低下される可能性がある（Ｍｉｙａｏら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．、１９９５、５、１１５−１２１；Ｔａｋａｋｕｒａら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＆ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．、１９９６、６、１７７−１８３）。
賦形剤
担体化合物と対照的に、「製薬学的担体」もしくは「賦形剤」は、１種もしくはそれ以上の核酸を動物に送達するための製薬学的に許容できる溶媒、懸濁化剤もしくはいずれかの他の薬理学的に不活性のベヒクルである。賦形剤は液体もしくは固体であってよく、そして、所定の製薬学的組成物の核酸および他の成分と組合せられる場合に所望の容積、粘稠度などを提供するように、計画された投与様式を念頭におき選択される。典型的な製薬学的担体は、限定されるものでないが、結合剤（例えば糊化済トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンもしくはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；増量剤（例えば乳糖および他の糖、微晶質セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレートもしくはリン酸水素カルシウムなど）；滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩、硬化植物油、トウモロコシデンプン、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（例えばデンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）；ならびに湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウムなど）を挙げることができる。
核酸と有害に反応しない、非経口投与に適する製薬学的に許容できる有機もしくは無機賦形剤もまた、本発明の組成物を処方するのに使用することができる。適する製薬学的に許容できる担体は、限定されるものでないが、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどを挙げることができる。
核酸の局所投与のための製剤は、滅菌および非滅菌の水性溶液、アルコールのような普遍的溶媒中の非水性溶液、または液体もしくは固体の油基剤中の核酸の溶液を包含してよい。溶液はまた、緩衝剤、希釈剤および他の適する添加物も含有してもよい。核酸と有害に反応しない、非経口投与に適する製薬学的に許容できる有機もしくは無機賦形剤を使用することができる。
適する製薬学的に許容できる賦形剤は、限定されるものでないが、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどを挙げることができる。
他成分
本発明の組成物は、それらの技術で確立された使用レベルの、製薬学的組成物中で慣習的に見出される他の付属成分を付加的に含有してもよい。従って、例えば、組成物は、例えば鎮痒薬、収れん剤、局所麻酔薬もしくは抗炎症薬のような付加的な適合性の製薬学的有効成分を含有してもよいか、または、色素、着香料、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤および安定剤のような、本発明の組成物の多様な投薬形態を物理的に処方することにおいて有用な付加的物質を含有してもよい。しかしながら、こうした物質は、添加される場合に、本発明の組成物の成分の生物学的活性をむやみに妨害すべきでない。製剤は滅菌することができ、そして、所望の場合は、製剤の核酸（１種もしくは複数）と有害に相互作用しない補助作用物質、例えば滑沢剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響するための塩、緩衝剤、着色料、着香料および／もしくは芳香物質などと混合することができる。
水性懸濁剤は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／もしくはデキストランを包含する、懸濁剤の粘度を増大させる物質を含有してよい。懸濁剤はまた安定剤も含有してもよい。
本発明のある態様は、（ａ）１種もしくはそれ以上のアンチセンス化合物、および（ｂ）非アンチセンス機構により機能する１種もしくはそれ以上の他の化学療法剤、を含有する製薬学的組成物を提供する。こうした化学療法剤の例は、限定されるものでないが、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マホスファミド、イホスファミド、シトシンアラビノシド、ビスクロロエチルニトロソウレア、ブスルファン、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラニン、マイトキサントロン、アムサクリン、クロラムブシル、メチルシクロヘキシルニトロソウレア、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−アザシチジン、ヒドロキシウレア、デオキシコホルマイシン、４−ヒドロキシペルオキシシクロホスホルアミド、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、５−フルオロデオキシウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキセート（ＭＴＸ）、コルヒチン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド（ＶＰ−１６）、トリメトレキセート、イリノテカン、トポテカン、ゲムシタビン、テニポシド、シスプラチンおよびジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）を挙げることができる。全般として、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、第１５版、１９８７、ｐｐ．１２０６−１２２８、Ｂｅｒｋｏｗら編、ニュージャージー州ローウェイを参照されたい。本発明の化合物とともに使用される場合、こうした化学療法剤は、個別に（例えば５−ＦＵおよびオリゴヌクレオチド）、連続して（例えば、ある時間の期間の間、５−ＦＵおよびオリゴヌクレオチド、次いでＭＴＸおよびオリゴヌクレオチド）、または１種もしくはそれ以上の他のこうした化学療法剤と併用で（例えば、５−ＦＵ、ＭＴＸおよびオリゴヌクレオチド、もしくは５−ＦＵ、放射線治療およびオリゴヌクレオチド）使用してよい。限定されるものでないが非ステロイド性抗炎症薬およびコルチコステロイドを挙げることができる抗炎症薬、ならびに限定されるものでないがリビビリン、ビダラビン、アシクロビルおよびガンシクロビルを挙げることができる抗ウイルス薬もまた、本発明の組成物に組合せてもよい。全般として、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、第１５版、Ｂｅｒｋｏｗら編、１９８７、ニュージャージー州ローウェイ、それぞれ２４９９−２５０６および４６−４９ページを参照されたい）。他の非アンチセンス化学療法剤もまた本発明の範囲内にある。２種もしくはそれ以上の組合せられた化合物を一緒にもしくは連続して使用してよい。
別の関係する態様において、本発明の組成物は、第一の核酸に標的を定められた１種もしくはそれ以上のアンチセンス化合物、とりわけオリゴヌクレオチド、および第二の核酸標的に標的を定められた１種もしくはそれ以上の付加的なアンチセンス化合物を含有してよい。アンチセンス化合物の多数の例が当該技術分野で既知である。２種もしくはそれ以上の組合せられた化合物を一緒にもしくは連続して使用してよい。
治療的組成物の製剤、およびそれらのその後の投与は当業者の熟練内にあると考えられる。投与は治療されるべき疾患状態の重症度および応答性に依存し、治療の経過は数日から数ヶ月まで、または治癒が遂げられるかもしくは疾患状態の軽減が達成されるまで持続する。至適の投与計画は患者の体内の薬物蓄積の測定値から計算することができる。当業者は、至適投薬量、投与の方法論および反復速度を容易に決定することができる。至適投薬量は個々のオリゴヌクレオチドの相対的効力に依存して変動するかもしれず、かつ、一般に、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの動物モデルで有効であることが見出されるＥＣ５０に基づいて推定することができる。一般に、投薬量は体重１ｋｇあたり０．０１μｇから１００ｇまでであり、そして、毎日、毎週、毎月もしくは毎年１回もしくはそれ以上、または２ないし２０年ごとに１回さえ投与してよい。当業者は、体液もしくは組織中の該薬物の測定された滞留時間および濃度に基づいて、投与のための反復速度を容易に推定することができる。成功裏の治療後に、患者に維持療法を受けさせて該疾患状態の再発を予防することが望ましいかもしれず、ここで、オリゴヌクレオチドは、毎日１回もしくはそれ以上ないし２０年ごとに１回、体重１ｋｇあたり０．０１μｇから１００ｇまでの範囲にわたる維持用量で投与する。
本発明はその好ましい態様のあるものに従った特異性を伴い記述された一方、以下の実施例は本発明を具体的に説明するためにのみはたらき、そして、それを制限することを意図していない。
実施例
実施例１
オリゴヌクレオチド合成のためのヌクレオシドホスホルアミダイト
デオキシおよび２’−アルコキシアミダイト
２’−デオキシおよび２’−メトキシβ−シアノエチルジイソプロピルホスホルアミダイトは商業的供給源（例えばケムジーンズ（Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ）、マサチューセッツ州ニーダムもしくはグレン リサーチ インク（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）バーモント州スターリング）から購入した。他の２’−Ｏ−アルコキシ置換ヌクレオシドアミダイトは、米国特許第５，５０６，３５１号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されるとおり製造する。２’−アルコキシアミダイトを使用して合成されるオリゴヌクレオチドについて、テトラゾールおよび塩基の拍動送達後の待機段階を３６０秒に増大させたことを除き、未修飾オリゴヌクレオチドについての標準的周期を利用した。
５−メチル−２’−デオキシシチジン（５−Ｍｅ−Ｃ）ヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドは、商業的に入手可能なホスホルアミダイト（グレン リサーチ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、バーモント州スターリングもしくはケムジーンズ（Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ）、マサチューセッツ州ニーダム）を使用して、公表された方法（Ｓａｎｇｈｖｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９３、２１、３１９７−３２０３）に従って合成した。
２’−フルオロアミダイト
２’−フルオロデオキシアデノシンアミダイト
２’−フルオロオリゴヌクレオチドは以前に（Ｋａｗａｓａｋｉら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９９３、３６、８３１−８４１）かつ米国特許第５，６７０，６３３号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）記述されたとおり合成した。簡潔には、保護されたヌクレオシドＮ６−ベンゾイル−２’−デオキシ−２’−フルオロアデノシンを、商業的に入手可能な９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンを出発原料として利用し、かつ、文献の手順を改変してそれにより２’−α−フルオロ原子が２’−β−トリチル基のＳＮ２−置換により導入されることにより合成した。従って、Ｎ６−ベンゾイル−９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンが、３’，５’−ジテトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）中間体として中程度の収量で選択的に保護された。ＴＨＰおよびＮ６−ベンゾイル基の脱保護を、標準的方法論を使用して達成し、また、標準的方法を使用して、５’−ジメトキシトリチル−（ＤＭＴ）および５’−ＤＭＴ−３’−ホスホルアミダイト中間体を得た。
２’−フルオロデオキシグアノシン
２’−デオキシ−２’−フルオログアノシンの合成は、出発原料としてのテトライソプロピルジシロキサニル（ＴＰＤＳ）保護された９−β−Ｄ−アラビノフラノシルグアニン、および、中間体ジイソブチリルアラビノフラノシルグアノシンへの転化を使用して達成した。ＴＰＤＳ基の脱保護、次いでＴＨＰでのヒドロキシル基を保護し、ジイソブチリルジ−ＴＨＰ保護アラビノフラノシルグアニンを生じた。選択的Ｏ−脱アシル化およびトリフラート化、次いでフッ化物で粗生成物を処理し、その後ＴＨＰ基を脱保護した。標準的方法論を使用して、５’−ＤＭＴ−および５’−ＤＭＴ−３’−ホスホルアミダイトを得た。
２’−フルオロウリジン
２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンの合成は、２，２’−アンヒドロ−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシルを７０％フッ化水素−ピリジンで処理した、文献の手順の変法により達成した。標準的手順を使用して、５’−ＤＭＴおよび５’−ＤＭＴ−３’ホスホルアミダイトを得た。
２’−フルオロデオキシシチジン
２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンは、２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンのアミノ化、次いでＮ４−ベンゾイル−２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンを生じる選択的保護を介して合成した。標準的手順を使用して、５’−ＤＭＴおよび５’−ＤＭＴ−３’ホスホルアミダイトを得た。
２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）修飾アミダイト
２’−Ｏ−メトキシエチル置換ヌクレオシドアミダイトは、以下のとおり、あるいは、Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ、１９９５、７８、４８６−５０４の方法に従って製造する。
２，２’−アンヒドロ［１−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−メチルウリジン］
５−メチルウリジン（リボシルチミン、ヤマサ、銚子市により商業的に入手可能）（７２．０ｇ、０．２７９Ｍ）、炭酸ジフェニル（９０．０ｇ、０．４２０Ｍ）および重炭酸ナトリウム（２．０ｇ、０．０２４Ｍ）をＤＭＦ（３００ｍＬ）に添加した。混合物を攪拌しながら還流に加熱して、発生された二酸化炭素ガスを制御された様式で放出させた。１時間後に、わずかに黒ずんだ溶液を減圧下に濃縮した。生じるシロップを攪拌しながらジエチルエーテル（２．５Ｌ）中に注いだ。生成物はガム状物を形成した。エーテルをデカンテーションし、そして残渣を最少量のメタノール（約４００ｍＬ）に溶解した。溶液を新鮮なエーテル（２．５Ｌ）中に注いで比較的堅いガム状物を生じた。エーテルをデカンテーションし、そしてガム状物を真空オーブン（１ｍｍＨｇで６０℃２４時間）中で乾燥して固形物を生じ、これを淡黄褐色粉末に粉砕した（５７ｇ、８５％粗収率）。ＮＭＲスペクトルは、そのナトリウム塩としてのフェノールで汚染された（約５％）該構造に一致した。物質を、さらなる反応についてそうであるように使用した（もしくは、酢酸エチル中メタノールの勾配（１０〜２５％）を使用するカラムクロマトグラフィーによりそれをさらに生成して白色固形物、ｍｐ ２２２−４℃を生じることができる）。
２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン
２，２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１９５ｇ、０．８１Ｍ）、トリス（２−メトキシエチル）ホウ酸塩（２３１ｇ、０．９８Ｍ）および２−メトキシエタノール（１．２Ｌ）を２Ｌのステンレス鋼圧容器に添加し、そして１６０℃で予め加熱された油浴中に入れた。１５５〜１６０℃で４８時間加熱した後に、容器を開放し、そして溶液を乾固まで蒸発させかつＭｅＯＨ（２００ｍＬ）とともに摩砕した。残渣を熱アセトン（１Ｌ）に懸濁した。不溶性の塩を濾過し、アセトン（１５０ｍＬ）で洗浄し、そして濾液を蒸発させた。残渣（２８０ｇ）をＣＨ３ＣＮ（６００ｍＬ）に溶解しかつ蒸発させた。シリカゲルカラム（３ｋｇ）を、０．５％Ｅｔ３ＮＨを含有するＣＨ２Ｃｌ２／アセトン／メタノール（２０：５：３）で充填した。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（２５０ｍＬ）に溶解し、そして、カラムに負荷する前にシリカ（１５０ｇ）に吸着させた。生成物を充填溶媒で溶出して１６０ｇ（６３％）の生成物を生じた。付加的な物質を、不純な画分で再作業することにより得た。
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン
２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（１６０ｇ、０．５０６Ｍ）をピリジン（２５０ｍＬ）と共蒸発させ、そして乾燥された残渣をピリジン（１．３Ｌ）に溶解した。塩化ジメトキシトリチルの第一のアリコート（９４．３ｇ、０．２７８Ｍ）を添加し、そして混合物を室温で１時間攪拌した。塩化ジメトキシトリチルの第二のアリコート（９４．３ｇ、０．２７８Ｍ）を添加し、そして反応を追加の１時間攪拌した。メタノール（１７０ｍＬ）をその後添加して反応を停止した。ＨＰＬＣはおよそ７０％の生成物の存在を示した。溶媒を蒸発させ、そしてＣＨ３ＣＮ（２００ｍＬ）とともに摩砕した。残渣をＣＨＣｌ３（１．５Ｌ）に溶解し、そして２×５００ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３および２×５００ｍＬの飽和ＮａＣｌで抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過しかつ蒸発させた。２７５ｇの残渣を得た。残渣を、０．５％Ｅｔ３ＮＨを含有するＥｔＯＡｃ／ヘキサン／アセトン（５：５：１）で充填かつ溶出される３．５ｋｇのシリカゲルカラムで精製した。純粋な画分を蒸発させて１６４ｇの生成物を生じた。付加的なおよそ２０ｇを不純な画分から得て、１８３ｇ（５７％）の合計収量を生じた。
３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（１０６ｇ、０．１６７Ｍ）、ＤＭＦ／ピリジン（５６２ｍＬのＤＭＦおよび１８８ｍＬのピリジンから調製された３：１混合物の７５０ｍＬ）、ならびに無水酢酸（２４．３８ｍＬ、０．２５８Ｍ）を合わせそして室温で２４時間攪拌した。反応を、ＴＬＣサンプルをＭｅＯＨの添加で最初にクエンチすることによりＴＬＣによりモニターした。ＴＬＣにより判断されるところの反応の完了に際してＭｅＯＨ（５０ｍＬ）を添加し、そして混合物を３５℃で蒸発させた。残渣をＣＨＣｌ３（８００ｍＬ）に溶解し、そして２×２００ｍＬの飽和重炭酸ナトリウムおよび２×２００ｍＬの飽和ＮａＣｌで抽出した。水層を２００ｍＬのＣＨＣｌ３で戻し抽出した（ｂａｃｋ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ）。合わせられた有機物を硫酸ナトリウムで乾燥しかつ蒸発させて１２２ｇの残渣（およそ９０％の生成物）を生じた。残渣を３．５ｋｇのシリカゲルカラム上で精製し、そしてＥｔＯＡｃ／ヘキサン（４：１）を使用して溶出した。純粋な生成物画分を蒸発させて９６ｇ（８４％）を生じた。追加の１．５ｇを後の画分から回収した。
３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン
第一の溶液を、３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（９６ｇ、０．１４４Ｍ）をＣＨ３ＣＮ（７００ｍＬ）に溶解することにより調製し、そしてわきに置いた。トリエチルアミン（１８９ｍＬ、１．４４Ｍ）をＣＨ３ＣＮ（１Ｌ）中のトリアゾール（９０ｇ、１．３Ｍ）の溶液に添加し、−５℃に冷却し、そして頭上攪拌機を使用して０．５時間攪拌した。ＰＯＣｌ３を、−１０℃で維持された攪拌された溶液に３０分の期間にわたって一滴ずつ添加し、そして生じる混合物を追加の２時間攪拌した。第一の溶液を、後者の溶液に４５分の期間にわたって一滴ずつ添加した。生じる反応混合物を低温室に一夜保存した。塩を反応混合物から濾過し、そして溶液を蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃ（１Ｌ）に溶解し、そして不溶性固形物を濾過により除去した。濾液を１×３００ｍＬのＮａＨＣＯ３および２×３００ｍＬの飽和ＮａＣｌで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥しかつ蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃとともに摩砕して表題化合物を生じた。
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン
ジオキサン（５００ｍＬ）およびＮＨ４ＯＨ（３０ｍＬ）中の３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン（１０３ｇ、０．１４１Ｍ）の溶液を室温で２時間攪拌した。ジオキサン溶液を蒸発させ、そして残渣をＭｅＯＨ（２×２００ｍＬ）と共沸させた。残渣をＭｅＯＨ（３００ｍＬ）に溶解し、そして２リットルのステンレス鋼圧容器に移した。ＮＨ３ガスで飽和されたＭｅＯＨ（４００ｍＬ）を添加し、そして容器を１００℃に２時間加熱した（ＴＬＣは完全な転化を示した）。容器の内容物を乾固まで蒸発させ、そして残渣をＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）に溶解しかつ飽和ＮａＣｌ（２００ｍＬ）で１回洗浄した。有機物を硫酸ナトリウムで乾燥し、そして溶媒を蒸発させて８５ｇ（９５％）の表題化合物を生じた。
Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン（８５ｇ、０．１３４Ｍ）をＤＭＦ（８００ｍＬ）に溶解し、そして無水安息香酸（３７．２ｇ、０．１６５Ｍ）を攪拌しながら添加した。３時間攪拌した後、ＴＬＣは反応がおよそ９５％完了であることを示した。溶媒を蒸発させ、そして残渣をＭｅＯＨ（２００ｍＬ）と共沸させた。残渣をＣＨＣｌ３（７００ｍＬ）に溶解し、そして飽和ＮａＨＣＯ３（２×３００ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（２×３００ｍＬ）で抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥しかつ蒸発させて残渣（９６ｇ）を生じた。残渣を、溶出溶媒として０．５％Ｅｔ３ＮＨを含有するＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１）を使用する１．５ｋｇのシリカカラムでクロマトグラフィー分離した。純粋な生成物の画分を蒸発させて９０ｇ（９０％）の表題化合物を生じた。
Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン−３’−アミダイト
Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン（７４ｇ、０．１０Ｍ）をＣＨ２Ｃｌ２（１Ｌ）に溶解した。テトラゾールジイソプロピルアミン（７．１ｇ）および２−シアノエトキシテトラ（イソプロピル）ホスファイト（４０．５ｍＬ、０．１２３Ｍ）を窒素雰囲気下で攪拌しながら添加した。生じる混合物を室温で２０時間攪拌した（ＴＬＣは反応が９５％完了であることを示した）。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３（１×３００ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（３×３００ｍＬ）で抽出した。水性洗浄液をＣＨ２Ｃｌ２（３００ｍＬ）で戻し抽出し、そして抽出物を合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥しかつ濃縮した。得られた残渣を、溶出溶媒としてＥｔＯＡｃ／ヘキサン（３：１）を使用する１．５ｋｇのシリカカラムでクロマトグラフィー分離した。純粋な画分を合わせて９０．６ｇ（８７％）の表題化合物を生じた。
２’−Ｏ−（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトおよび２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイト
２’−（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト
２’−（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト（２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトとしてもまた当該技術分野で知られる）は以下の段落に記述されるとおり製造する。アデノシン、シチジンおよびグアノシンヌクレオシドアミダイトは、環外アミンをアデノシンおよびシチジンの場合にベンゾイル部分で、ならびにグアノシンの場合にイソブチリルで保護することを除き、チミジン（５−メチルウリジン）に類似に製造する。
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−Ｏ２−２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン
Ｏ２−２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（Ｐｒｏ．Ｂｉｏ．Ｓｉｎｔ．、イタリア・バレーゼ、１００．０ｇ、０．４１６ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（０．６６ｇ、０．０１３等量、０．００５４ｍｍｏｌ）を、アルゴン雰囲気下かつ機械的攪拌を伴い周囲温度で無水ピリジン（５００ｍｌ）に溶解した。ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルクロロシラン（１２５．８ｇ、１１９．０ｍＬ、１．１等量、０．４５８ｍｍｏｌ）を一部分で添加した。反応を周囲温度で１６時間攪拌した。ＴＬＣ（Ｒｆ ０．２２、酢酸エチル）は完了した反応を示した。溶液を減圧下に濃厚な油状物まで濃縮した。これを、ジクロロメタン（１Ｌ）と飽和重炭酸ナトリウム（２×１Ｌ）および塩水（１Ｌ）との間で分配した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥しかつ濃厚な油状物まで減圧下に濃縮した。油状物を酢酸エチルおよびエチルエーテルの１：１混合物（６００ｍＬ）に溶解し、そして溶液を−１０℃に冷却した。生じる結晶生成物を濾過により収集し、エチルエーテル（３×２００ｍＬ）で洗浄し、そして１４９ｇ（７４．８％）の白色固形物まで乾燥（４０℃、１ｍｍＨｇ、２４時間）した。ＴＬＣおよびＮＭＲは純粋な生成物と一致した。
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−５−メチルウリジン
２Ｌのステンレス鋼の攪拌されない圧反応器中にテトラヒドロフラン中ボラン（１．０Ｍ、２．０等量、６２２ｍＬ）を添加した。ヒュームフード中かつ人的攪拌を伴い、エチレングリコール（３５０ｍＬ、過剰）を、水素ガスの発生が止むまで最初に慎重に添加した。５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−Ｏ２−２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１４９ｇ、０．３１１ｍｏｌ）および重炭酸ナトリウム（０．０７４ｇ、０．００３等量）を、人的攪拌を伴い添加した。反応器を封止し、そして１６０℃の内部温度が達成されるまで油浴中で加熱し、そしてその後１６時間維持した（圧＜１００ｐｓｉｇ）。反応容器を周囲まで冷却しかつ開放した。ＴＬＣ（所望の生成物についてＲｆ ０．６７およびａｒａ−Ｔ副生成物についてＲｆ ０．８２、酢酸エチル）は生成物への約７０％の転化を示した。付加的な副生成物形成を回避するため、反応を停止し、温水浴（４０〜１００℃）中減圧（１０ないし１ｍｍＨｇ）下で濃縮し、より極端な条件を使用してエチレングリコールを除去した。［あるいは、一旦低沸点溶媒がなくなれば、残存する溶液を酢酸エチルと水との間で分配することができる。生成物は有機層中にあることができる。］残渣をカラムクロマトグラフィー（２ｋｇシリカゲル、酢酸エチル−ヘキサン勾配１：１ないし４：１）により精製した。適切な画分を合わせ、ストリップし、そして出発原料（１７．４ｇ）で汚染された白色の砕けやすい泡状物としての生成物（８４ｇ、５０％）および純粋な再使用可能な出発原料２０ｇまで乾燥した。出発原料より少なく純粋な回収された出発原料に基づく収率は５８％であった。ＴＬＣおよびＮＭＲは９９％純粋な生成物と一致した。
２’−Ｏ−（［２−フタルイミドキシ）エチル］−５’−ｔ−ブチルジフェニルシリル−５−メチルウリジン
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−５−メチルウリジン（２０ｇ、３６．９８ｍｍｏｌ）をトリフェニルホスフィン（１１．６３ｇ、４４．３６ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシフタルイミド（７．２４ｇ、４４．３６ｍｍｏｌ）と混合した。その後、それを高真空下で４０℃で２日間Ｐ２Ｏ５で乾燥した。反応混合物をアルゴンで洗い流し、そして無水ＴＨＦ（３６９．８ｍＬ、アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）、ｓｕｒｅ ｓｅａｌボトル）を添加して澄明な溶液を得た。アゾジカルボン酸ジエチル（６．９８ｍＬ、４４．３６ｍｍｏｌ）を反応混合物に一滴ずつ添加した。生じる濃赤色の着色が次の滴を添加する前にちょうど脱色されるような添加の速度を維持する。添加が完了した後に反応を４時間攪拌した。その時点までにＴＬＣは反応の完了を示した（酢酸エチル：ヘキサン、６０：４０）。溶媒を真空中で蒸発させた。得られた残渣をフラッシュカラム上に置き、そして酢酸エチル：ヘキサン（６０：４０）で溶出して２’−Ｏ−（［２−フタルイミドキシ）エチル］−５’−ｔ−ブチルジフェニルシリル−５−メチルウリジンを白色泡状物（２１．８１９ｇ、８６％）として得た。
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［（２−ホルムアドキシミノオキシ）エチル］−５−メチルウリジン
２’−Ｏ−（［２−フタルイミドキシ）エチル］−５’−ｔ−ブチルジフェニルシリル−５−メチルウリジン（３．１ｇ、４．５ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ２Ｃｌ２（４．５ｍＬ）に溶解し、そしてメチルヒドラジン（３００ｍＬ、４．６４ｍｍｏｌ）を−１０℃ないし０℃で一滴ずつ添加した。１時間後に混合物を濾過し、濾液を氷冷ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、そして合わせられた有機層を水、塩水で洗浄しかつ無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶液を濃縮して２’−Ｏ−（アミノオキシエチル）チミジンを得、これをその後ＭｅＯＨ（６７．５ｍＬ）に溶解した。これにホルムアルデヒド（２０％水性溶液、ｗ／ｗ、１．１等量）を添加し、そして生じる混合物を１時間攪拌した。溶媒を真空下に除去し；残渣をクロマトグラフィー分離して、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［（２−ホルムアドキシミノオキシ）エチル］−５−メチルウリジンを白色泡状物（１．９５ｇ、７８％）として得た。
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル］−５−メチルウリジン
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［（２−ホルムアドキシミノオキシ）エチル］−５−メチルウリジン（１．７７ｇ、３．１２ｍｍｏｌ）を無水ＭｅＯＨ中の１Ｍ ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（ＰＰＴＳ）の溶液（３０．６ｍＬ）に溶解した。シアノホウ水素化ナトリウム（０．３９ｇ、６．１３ｍｍｏｌ）を不活性雰囲気下１０℃でこの溶液に添加した。反応混合物を１０℃で１０分間攪拌した。その後、反応容器を氷浴から取り出しかつ室温で２時間攪拌し、反応をＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２中５％ＭｅＯＨ）によりモニターした。水性ＮａＨＣＯ３溶液（５％、１０ｍＬ）を添加しそして酢酸エチル（２×２０ｍＬ）で抽出した。酢酸エチル層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、乾固まで蒸発させた。残渣をＭｅＯＨ中の１Ｍ ＰＰＴＳの溶液（３０．６ｍＬ）に溶解した。ホルムアルデヒド（２０％ ｗ／ｗ、３０ｍＬ、３．３７ｍｍｏｌ）を添加し、そして反応混合物を室温で１０分間攪拌した。反応混合物を氷浴中で１０℃に冷却し、シアノホウ水素化ナトリウム（０．３９ｇ、６．１３ｍｍｏｌ）を添加し、そして反応混合物を１０℃で１０分間攪拌した。１０分後に反応混合物を氷浴から取り出しかつ室温で２時間攪拌した。反応混合物に５％ＮａＨＣＯ３（２５ｍＬ）溶液を添加し、そして酢酸エチル（２×２５ｍＬ）で抽出した。酢酸エチル層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥しかつ乾固まで蒸発させた。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、そしてＣＨ２Ｃｌ２中５％ＭｅＯＨで溶出して、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル］−５−メチルウリジンを白色泡状物（１４．６ｇ、８０％）として得た。
２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン
トリエチルアミントリヒドロフルオリド（３．９１ｍＬ、２４．０ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦおよびトリエチルアミン（１．６７ｍＬ、１２ｍｍｏｌ、無水、ＫＯＨ上に保管）に溶解した。その後、トリエチルアミン−２ＨＦのこの混合物を５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル］−５−メチルウリジン（１．４０ｇ、２．４ｍｍｏｌ）に添加しかつ室温で２４時間攪拌した。反応をＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２中５％ＭｅＯＨ）によりモニターした。溶媒を真空下に除去し、そして残渣をフラッシュカラム上に置きかつＣＨ２Ｃｌ２中１０％ＭｅＯＨで溶出して、２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン（７６６ｍｇ、９２．５％）を得た。
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン
２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン（７５０ｍｇ、２．１７ｍｍｏｌ）を４０℃で高真空下にＰ２Ｏ５で一夜乾燥した。その後、それを無水ピリジン（２０ｍＬ）と共蒸発させた。得られた残渣をアルゴン雰囲気下でピリジン（１１ｍＬ）に溶解した。４−ジメチルアミノピリジン（２６．５ｍｇ、２．６０ｍｍｏｌ）、塩化４，４’−ジメトキシトリチル（８８０ｍｇ、２．６０ｍｍｏｌ）を混合物に添加し、そして反応混合物を、出発原料の全部が消失するまで室温で攪拌した。ピリジンを真空下に除去し、そして残渣をクロマトグラフィー分離しかつＣＨ２Ｃｌ２中１０％ＭｅＯＨで溶出して、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン（１．１３ｇ、８０％）を得た。
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト］
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン（１．０８ｇ、１．６７ｍｍｏｌ）をトルエン（２０ｍＬ）と共蒸発させた。残渣にＮ，Ｎ−ジイソプロピルアミンテトラゾニド（０．２９ｇ、１．６７ｍｍｏｌ）を添加し、そして高真空下４０℃で一夜Ｐ２Ｏ５で乾燥した。その後、反応混合物を無水アセトニトリル（８．４ｍＬ）に溶解し、そして２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ１，Ｎ１−テトライソプロピルホスホルアミダイト（２．１２ｍＬ、６．０８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を不活性雰囲気下周囲温度で４時間攪拌した。反応の進行をＴＬＣ（ヘキサン：酢酸エチル １：１）によりモニターした。溶媒を蒸発させ、その後残渣を酢酸エチル（７０ｍＬ）に溶解しかつ５％水性ＮａＨＣＯ３（４０ｍＬ）で洗浄した。酢酸エチル層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥しかつ濃縮した。得られた残渣をクロマトグラフィー分離して（溶離液として酢酸エチル）、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト］を泡状物（１．０４ｇ、７４．９％）として得た。
２’−（アミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト
２’−（アミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト（２’−Ｏ−（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトとしてもまた当該技術分野で知られる）は以下の段落に記述されるとおり製造する。アデノシン、シチジンおよびチミジンヌクレオシドアミダイトは同様に製造する。
Ｎ２−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト］
２’−Ｏ−アミノオキシエチルグアノシン類似物は、ジアミノプリンリボシドの選択的２’−Ｏ−アルキル化により得てよい。少量の３’−Ｏ−異性体と一緒に２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）ジアミノプリンリボシドを提供するために、複数グラム（ｍｕｌｔｉｇｒａｍ）量のジアミノプリンリボシドをシェーリング ＡＧ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ）（ベルリン）から購入してよい。２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）ジアミノプリンリボシドを分割し、そしてアデノシンデアミナーゼでの処理により２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）グアノシンに転化してよい。（ＭｃＧｅｅ，Ｄ．Ｐ．Ｃ．、Ｃｏｏｋ，Ｐ．Ｄ．、Ｇｕｉｎｏｓｓｏ，Ｃ．Ｊ．、第ＷＯ ９４／０２５０１ Ａ１号明細書 ９４０２０３。）標準的保護手順が２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシン、および還元されて２−Ｎ−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシンを提供するかもしれない２−Ｎ−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシンを提供するはずである。前のとおり、ヒドロキシル基をミツノブ反応を介してＮ−ヒドロキシフタルイミドにより置換してよく、そして、保護されたヌクレオシドを通常どおりホスフィチル化して、２−Ｎ−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（［２−フタルミドキシ］エチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト］を生じる。
２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−ＤＭＡＥＯＥ）ヌクレオシドアミダイト
２’−ジメチルアミノエトキシエトキシヌクレオシドアミダイト（２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチル、すなわち２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２もしくは２’−ＤＭＡＥＯＥヌクレオシドアミダイトとしてもまた当該技術分野で知られる）は以下のとおり製造する。他のヌクレオシドアミダイトは同様に製造する。
２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル］−５−メチルウリジン
２［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］エタノール（アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）、６．６６ｇ、５０ｍｍｏｌ）を、１００ｍＬボンベ（ｂｏｍｂ）中で攪拌しながらテトラヒドロフラン中のボランの溶液（１Ｍ、１０ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）にゆっくりと添加する。固体が溶解する際に水素ガスが発生する。Ｏ２−，２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１．２ｇ、５ｍｍｏｌ）および重炭酸ナトリウム（２．５ｍｇ）を添加しかつボンベを封止し、油浴中に入れかつ１５５℃に２６時間加熱する。ボンベを室温に冷却しかつ開放する。粗溶液を濃縮し、そして残渣を水（２００ｍＬ）とヘキサン（２００ｍＬ）との間で分配する。過剰のフェノールがヘキサン層に抽出される。水層を酢酸エチル（３×２００ｍＬ）で抽出し、そして合わせられた有機層を水で１回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥しかつ濃縮する。残渣を、溶離液としてメタノール／ジクロロメタン １：２０（２％トリエチルアミンを有する）を使用してシリカゲル上でカラム分離する（ｃｏｌｕｍｎｅｄ）。カラム画分を濃縮する際に無色固形物が生じ、これを収集して、表題化合物を白色固形物として生じる。
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル］］−５−メチルウリジン
無水ピリジン（８ｍＬ）中の０．５ｇ（１．３ｍｍｏｌ）の２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル）］−５−メチルウリジンに、トリエチルアミン（０．３６ｍＬ）および塩化ジメトキシトリチル（ＤＭＴ−Ｃｌ、０．８７ｇ、２等量）を添加しかつ１時間攪拌する。反応混合物を水（２００ｍＬ）中に注ぎかつＣＨ２Ｃｌ２（２×２００ｍＬ）で抽出する。合わせられたＣＨ２Ｃｌ２層を飽和ＮａＨＣＯ３溶液、次いで飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、そして無水硫酸ナトリウムで乾燥する。溶媒の蒸発、次いでＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２：Ｅｔ３Ｎ（２０：１、ｖ／ｖ、１％トリエチルアミンを含む）を使用するシリカゲルクロマトグラフィーは表題化合物を生じる。
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル）］−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−（シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト
ジイソプロピルアミノテトラゾリド（０．６ｇ）および２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト（１．１ｍＬ、２等量）を、アルゴンの雰囲気下で、ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）に溶解された５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル）］−５−メチルウリジン（２．１７ｇ、３ｍｍｏｌ）の溶液に添加する。反応混合物を一夜攪拌しそして溶媒を蒸発させる。生じる残渣を、溶離液として酢酸エチルを用いるシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、表題化合物を生じる。
実施例２
オリゴヌクレオチド合成
未置換および置換ホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）オリゴヌクレオチドは、ヨウ素による酸化を伴う標準的ホスホルアミダイトの化学を使用し、自動化ＤＮＡ合成機（アプライド バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）モデル３８０Ｂ）で合成する。
ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）は、標準酸化ボトルを、ホスファイト結合の段階的イオウ化（ｔｈｉａｔｉｏｎ）のためにアセトニトリル中の３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシドの０．２Ｍ溶液により置き換えた以外は、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドについてのとおり合成する。イオウ化待機段階を６８秒に増大させ、次いでキャッピング段階を行った。ＣＰＧカラムからの切断および５５℃（１８時間）で濃水酸化アンモニウム中で脱保護（ｄｅｂｌｏｃｋｉｎｇ）した後に、２．５容量のエタノールを用いて０．５Ｍ ＮａＣｌ溶液から２回沈殿させることによりオリゴヌクレオチドを精製した。ホスフィネートオリゴヌクレオチドは米国特許第５，５０８，２７０号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されるとおり製造する。
アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドは米国特許第４，４６９，８６３号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されるとおり製造する。
３’−デオキシ−３’−メチレンホスホネートオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，６１０，２８９号もしくは同第５，６２５，０５０号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されるとおり製造する。
ホスホルアミダイトオリゴヌクレオチドは米国特許第５，２５６，７７５号明細書もしくは米国特許第５，３６６，８７８号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されるとおり製造する。
アルキルホスホノチオエートオリゴヌクレオチドは、公開ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００９０２号および同第ＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９７６号明細書（それぞれ第ＷＯ ９４／１７０９３号および同第ＷＯ ９４／０２４９９号明細書として公開される）（引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されるとおり製造する。
３’−デオキシ−３’−アミノホスホルアミデートオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，４７６，９２５号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されるとおり製造する。
ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドは米国特許第５，０２３，２４３号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されるとおり製造する。
ボラノホスフェートオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，１３０，３０２号および同第５，１７７，１９８号明細書（双方とも引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されるとおり製造する。
実施例３
オリゴヌクレオシド合成
ＭＭＩ結合オリゴヌクレオシドとしてもまた同定されるメチレンメチルイミノ結合オリゴヌクレオシド、ＭＤＨ結合オリゴヌクレオシドとしてもまた同定されるメチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴヌクレオシド、およびアミド−３結合オリゴヌクレオシドとしてもまた同定されるメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド、ならびに、アミド−４結合オリゴヌクレオシドとしてもまた同定されるメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシド、ならびに、例えば交互に並ぶＭＭＩおよびＰ＝ＯもしくはＰ＝Ｓ結合を有する混合バックボーン化合物は、米国特許第５，３７８，８２５号、同第５，３８６，０２３号、同第５，４８９，６７７号、同第５，６０２，２４０号および同第５，６１０，２８９号明細書（その全部は引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されるとおり製造する。
ホルムアセタールおよびチオホルムアセタール結合オリゴヌクレオシドは、米国特許第５，２６４，５６２号および同第５，２６４，５６４号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されるとおり製造する。
エチレンオキシド結合オリゴヌクレオシドは、米国特許第５，２２３，６１８号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されるとおり製造する。
実施例４
ＰＮＡ合成
ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（ＰＮＡ）：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９６、４、５−２３に言及される多様な手順のいずれかに従って製造する。それらはまた、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７００，９２２号および同第５，７１９，２６２号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）に従って製造してもよい。
実施例５
キメラオリゴヌクレオチドの合成
本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドもしくは混合オリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドはいくつかの異なる型のものであることができる。これらは、結合されるヌクレオシドの「ギャップ」セグメントが、結合されるヌクレオシドの５’と３’の「ウイング（ｗｉｎｇ）」セグメントの間に位置される第一の型、および、「ギャップ」セグメントがオリゴマー化合物の３’もしくは５’いずれかの末端に配置される第二の「開放端」型を包含する。第一の型のオリゴヌクレオチドは「ギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）」もしくはギャップトオリゴヌクレオチド（ｇａｐｐｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）としてもまた当該技術分野で既知である。第二の型のオリゴヌクレオチドは「ヘミマー（ｈｅｍｉｍｅｒ）」もしくは「ウィングマー（ｗｉｎｇｍｅｒ）」としてもまた当該技術分野で既知である。
［２’−Ｏ−Ｍｅ］−−［２’−デオキシ］−−［２’−Ｏ−Ｍｅ］キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
２’−Ｏ−アルキルホスホロチオエートおよび２’−デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドセグメントを有するキメラオリゴヌクレオチドは、上のとおり、アプライド バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の自動化ＤＮＡ合成機モデル３８０Ｂを使用して合成する。オリゴヌクレオチドは、自動化合成機、ならびにＤＮＡ部分について２’−デオキシ−５’−ジメトキシトリチル−３’−Ｏ−ホスホルアミダイト、ならびに５’および３’ウイングについて５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−ホスホルアミダイトを使用して合成する。標準的合成周期は、ＲＮＡについて４回および２’−Ｏ−メチルについて２回反復される、テトラゾールおよび塩基の供給後の待機段階を６００秒に増大させることにより改変する。完全に保護されたオリゴヌクレオチドを支持体から切断し、そしてリン酸基を３：１アンモニア／エタノール中で室温で一夜脱保護し、その後乾固まで凍結乾燥する。その後、室温で２４時間のメタノール性アンモニア中での処理を行って全部の塩基を脱保護し、そしてサンプルを再度乾固まで凍結乾燥する。ペレットをＴＨＦ中１Ｍ ＴＢＡＦに室温で２４時間再懸濁して２’位を脱保護する。その後、反応を１Ｍ ＴＥＡＡでクエンチし、そしてその後、サンプルを、Ｇ２５サイズ排除カラム上で脱塩される前にロトバック（ｒｏｔｏｖａｃ）により１／２容量に減量する。その後、回収されたオリゴを、収量について分光測光的に、ならびに純度についてキャピラリー電気泳動および質量分析により分析する。
［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）］−−［２’−デオキシ］−−［２’−Ｏ−（メトキシエチル）］キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）］−−［２’−デオキシ］−−［２’−Ｏ−（メトキシエチル）］キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルアミダイトについての２’−Ｏ−（メトキシエチル）アミダイトの置換を伴い、２’−Ｏ−メチルキメラオリゴヌクレオチドについての上の手順に従って製造した。
［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル］−−［２’−デオキシホスホロチオエート］−−［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル］キメラオリゴヌクレオチド
［２’−Ｏ−（２−メトキシエチルホスホジエステル］−−［２’−デオキシホスホロチオエート］−−［２’−Ｏ−（メトキシエチル）ホスホジエステル］キメラオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルアミダイトについての２’−Ｏ−（メトキシメチル）アミダイトの置換、キメラ構造のウイング部分内のホスホジエステルヌクレオチド間結合を生成させるためのヨウ素での酸化、および、中央のギャップのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を生成させるための３，Ｈ−１，２ベンゾジチオール−３−オン１，１ジオキシド（ビューケージ（Ｂｅａｕｇａｇｅ）試薬）を利用する硫化を伴い、２’−Ｏ−メチルキメラオリゴヌクレオチドについての上の手順に従って製造する。
他のキメラオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオシドおよび混合キメラオリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、米国特許第５，６２３，０６５号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）に従って合成する。
実施例６
オリゴヌクレオチドの単離
細孔性ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）カラム（アプライド バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））からの切断、および濃水酸化アンモニウム中５５℃で１８時間脱保護した後に、オリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオシドを、２．５容量のエタノールを用いる０．５Ｍ ＮａＣｌからの２回の沈殿により精製する。合成されたオリゴヌクレオチドは、変性ゲル上でのポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し、そして最低８５％の完全長物質であることを判断した。合成で得られたホスホロチオエートおよびホスホジエステル結合の相対量を、３１Ｐ核磁気共鳴分光法により定期的に確認し、また、いくつかの研究については、オリゴヌクレオチドをＣｈｉａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１、２６６、１８１６２−１８１７１により記述されるとおりＨＰＬＣにより精製した。ＨＰＬＣ精製された物質で得られた結果は、ＨＰＬＣ精製されない物質で得られたものに類似であった。
実施例７
オリゴヌクレオチド合成−９６穴プレート形式
オリゴヌクレオチドを、標準的な９６穴形式で同時に９６種の配列を集成することが可能な自動化合成機上で固相Ｐ（ＩＩＩ）ホスホルアミダイト化学を介して合成した。ホスホジエステルヌクレオチド間結合は水性ヨウ素を用いる酸化により提供された。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、水性アセトニトリル中で３，Ｈ−１，２ベンゾジチオール−３−オン１，１，ジオキシド（ビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）試薬）を利用する硫化により生成させた。標準的な塩基保護されたβ−シアノエチルジイソプロピルホスホルアミダイトは、商業的供給元（例えばＰＥ−アプライド バイオシステムズ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、カリフォルニア州フォスターシティ、もしくはファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ニュージャージー州ピスカタウェイ）から購入した。非標準的ヌクレオシドは既知の文献もしくは特許を与えられた方法に従って合成する。それらは、塩基保護されたβ−シアノエチルジイソプロピルホスホルアミダイトとして利用する。
オリゴヌクレオチドを支持体から切断し、そして上昇された温度（５５〜６０℃）で１２〜１６時間、濃ＮＨ４ＯＨで脱保護し、そしてその後遊離された生成物を真空中で乾燥した。乾燥された生成物をその後、滅菌水に再懸濁してマスタープレートを提供し、これから、全部の分析および試験プレートサンプルをその後、ロボット式ピペッターを利用して希釈する。
実施例８
オリゴヌクレオチド分析−９６穴プレート形式
各ウェル中のオリゴヌクレオチドの濃度は、サンプルの希釈およびＵＶ吸収分光法により評価した。個々の生成物の完全長の完全性は、９６穴形式（ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）Ｐ／ＡＣＥＴＭ ＭＤＱ）、もしくは個別に調製されたサンプルについては商業的ＣＥ装置（例えばベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）Ｐ／ＡＣＥＴＭ ５０００、ＡＢＩ ２７０）のいずれかでのキャピラリー電気泳動（ＣＥ）により評価した。塩基およびバックボーン組成は電子スプレー質量分析法を利用する化合物の質量分析により確認した。全部のアッセイ試験プレートは、単一および複数チャンネルのロボット式ピペッターを使用してマスタープレートから希釈した。プレートは、プレート上の化合物の最低８５％が最低８５％の完全長であった場合に許容できると判断した。
実施例９
細胞培養およびオリゴヌクレオチド処理
標的核酸発現に対するアンチセンス化合物の影響は、標的核酸が測定可能なレベルで存在することを条件に、多様な細胞型のいずれでも試験することができる。これは、例えばＰＣＲもしくはノーザンブロット分析を使用して慣例に測定することができる。以下の７細胞型を具体的説明の目的上提供するが、しかし、標的が選ばれた細胞型で発現されることを条件に、他の細胞型を慣例に使用することができる。これは、当該技術分野で慣例の方法、例えばノーザンブロット分析、リボヌクレアーゼ保護アッセイもしくはＲＴ−ＰＣＲにより容易に測定することができる。
Ｔ−２４細胞：
ヒト移行上皮細胞膀胱癌細胞系Ｔ−２４はアメリカン タイプ カルチャー コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）（バージニア州マナサス）から得た。Ｔ−２４細胞は、１０％ウシ胎児血清（ギブコ／ライフ テクノロジーズ（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ゲイタースバーグ）、ペニシリン１ｍＬあたり１００単位、およびストレプトマイシン１ｍＬあたり１００マイクログラム（ギブコ／ライフ テクノロジーズ（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ゲイタースバーグ）を補充された完全マッコイ５Ａ基礎培地（ギブコ／ライフ テクノロジーズ（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ゲイタースバーグ）中で慣例に培養した。細胞は、それらが９０％コンフルエンスに達した場合に、トリプシン処理および希釈により慣例に継代した。細胞を、ＲＴ−ＰＣＲ分析での使用のために７０００細胞／ウェルの密度で９６穴プレート（ファルコン−プライマリア（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ）＃３８７２）に接種した。
ノーザンブロッティングもしくは他の分析のためには、細胞を１００ｍｍもしくは他の標準的組織培養プレート上に接種し、そして適切な容量の培地およびオリゴヌクレオチドを使用して同様に処理してもよい。
Ａ５４９細胞：
ヒト肺癌細胞系Ａ５４９はアメリカン タイプ カルチャー コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）（バージニア州マナサス）から得た。Ａ５４９細胞は、１０％ウシ胎児血清（ギブコ／ライフ テクノロジーズ（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ゲイタースバーグ）、ペニシリン１ｍＬあたり１００単位、およびストレプトマイシン１ｍＬあたり１００マイクログラム（ギブコ／ライフ テクノロジーズ（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ゲイタースバーグ）を補充されたＤＭＥＭ基礎培地（ギブコ／ライフ テクノロジーズ（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ゲイタースバーグ）中で慣例に培養した。細胞は、それらが９０％コンフルエンスに達した場合にトリプシン処理および希釈により慣例に継代した。
ＮＨＤＦ細胞：
ヒト新生児皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）はクローンティックス コーポレーション（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（メリーランド州ウォーカーズビル）から得た。ＮＨＤＦは、供給元により推奨されたとおり補充された線維芽細胞成長培地（クローンティックス コーポレーション（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、メリーランド州ウォーカーズビル）中で慣例に維持した。細胞は、供給元により推奨されたとおり１０継代までの間維持した。
ＨＥＫ細胞：
ヒト胎児ケラチノサイト（ＨＥＫ）はクローンティックス コーポレーション（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（メリーランド州ウォーカーズビル）から得た。ＨＥＫは、供給元により推奨されたとおり処方されたケラチノサイト成長培地（クローンティックス コーポレーション（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、メリーランド州ウォーカーズビル）中で慣例に維持した。細胞は、供給元により推奨されたとおり１０継代までの間慣例に維持した。
ＨｅｐＧ２細胞：
ヒト肝芽細胞腫細胞系ＨｅｐＧ２はアメリカン タイプ カルチャー コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）（バージニア州マナサス）から得た。ＨｅｐＧ２細胞は、１０％ウシ胎児血清、非必須アミノ酸および１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ギブコ／ライフ テクノロジーズ（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ゲイタースバーグ）を補充されたイーグルＭＥＭ中で慣例に培養した。細胞は、それらが９０％コンフルエンスに達した場合にトリプシン処理および希釈により慣例に継代した。細胞を、ＲＴ−ＰＣＲ分析での使用のために７０００細胞／ウェルの密度で９６穴プレート（ファルコン−プライマリア（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ）＃３８７２）に接種した。
ノーザンブロッティングもしくは他の分析のためには、細胞を１００ｍｍもしくは他の標準的組織培養プレート上に接種し、そして適切な容量の培地およびオリゴヌクレオチドを使用して同様に処理してもよい。
ＡＭＬ１２細胞：
ＡＭＬ１２（αマウス肝１２）細胞系は、ヒトＴＧＦαについてトランスジェニックのマウス（ＣＤ１血統、系統ＭＴ４２）からの肝細胞から樹立した。細胞は、０．００５ｍｇ／ｍｌインスリン、０．００５ｍｇ／ｍｌトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌセレンおよび４０ｎｇ／ｍｌデキサメサゾン、ならびに９０％；１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコの改変イーグル培地およびハムＦ１２培地の１：１混合物中で培養する。継代培養のためには、消費された培地を除去し、そして０．２５％トリプシン、０．０３％ＥＤＴＡ溶液の新鮮培地を添加する。新鮮トリプシン溶液（１ないし２ｍｌ）を添加し、そして、細胞がはがれるまで培養物を室温でそのまま放置する。
細胞は、それらが９０％コンフルエンスに達した場合にトリプシン処理および希釈により慣例に継代した。細胞を、ＲＴ−ＰＣＲ分析での使用のために７０００細胞／ウェルの密度で９６穴プレート（ファルコン−プライマリア（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ）＃３８７２）に接種した。
ノーザンブロッティングもしくは他の分析のためには、細胞を１００ｍｍもしくは他の標準的組織培養プレート上に接種し、そして適切な容量の培地およびオリゴヌクレオチドを使用して同様に処理してもよい。
初代マウス肝細胞：
初代マウス肝細胞は、チャールズ リバー ラブス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ）（マサチューセッツ州ウィルミントン）から購入されたＣＤ−１マウスから調製し、そして、１０％ウシ胎児血清（ギブコ／ライフ テクノロジーズ（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ゲイタースバーグ）、２５０ｎＭデキサメサゾン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））および１０ｎＭウシインスリン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を補充された肝細胞接着培地（Ｈｅｐａｔｏｙｔｅ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｍｅｄｉａ）（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））中で慣例に培養した。細胞を、ＲＴ−ＰＣＲ分析での使用のために１００００細胞／ウェルの密度で９６穴プレート（ファルコン−プライマリア（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ）＃３８７２）に接種した。
ノーザンブロッティングもしくは他の分析のためには、細胞を、ラット尾コラーゲン（２００μｇ／ｍＬ）（ベクトン ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））で被覆された１００ｍｍもしくは他の標準的組織培養プレート上に接種し、そして適切な容量の培地およびオリゴヌクレオチドを使用して同様に処理する。
アンチセンス化合物での処理：
細胞が８０％コンフルエンシーに達した場合にそれらをオリゴヌクレオチドで処理する。９６穴プレート中で成長された細胞については、ウェルを２００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭＴＭ−１血清使用量低減培地（ギブコ ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ））で１回洗浄し、そしてその後、３．７５μｇ／ｍＬのリポフェクチン［ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ］ＴＭ（ギブコ ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ））および所望の濃度のオリゴヌクレオチドを含有する１３０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭＴＭ−１で処理する。４〜７時間の処理後に培地を新鮮培地と交換する。細胞はオリゴヌクレオチド処理１６〜２４時間後に収集する。
使用されるオリゴヌクレオチドの濃度は細胞系ごとに変動する。特定の細胞系について至適のオリゴヌクレオチド濃度を決定するためには、細胞をある範囲の濃度の陽性対照オリゴヌクレオチドで処理する。ヒト細胞について、陽性対照オリゴヌクレオチドは、ヒトＨ−ｒａｓに標的を定められるホスホロチオエートバックボーンをもつ２’−Ｏ−メトキシエチルギャップマー（２’−Ｏ−メトキシエチルが下線で示される）、ＩＳＩＳ １３９２０、ＴＣＣＧＴＣＡＴＣＧＣＴＣＣＴＣＡＧＧＧ、配列番号１である。マウスもしくはラット細胞について、陽性対照オリゴヌクレオチドは、マウスおよびラット双方のｃ−ｒａｆに標的を定められるホスホロチオエートバックボーンをもつ２’−Ｏ−メトキシエチルギャップマー（２’−Ｏ−メトキシエチルが太字で示される）、ＩＳＩＳ １５７７０、ＡＴＧＣＡＴＴＣＴＧＣＣＣＣＣＡＡＧＧＡ、配列番号２である。その後、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ（ＩＳＩＳ １３９２０について）もしくはｃ−ｒａｆ（ＩＳＩＳ １５７７０について）のｍＲＮＡの８０％阻害をもたらす陽性対照オリゴヌクレオチドの濃度を、その細胞系についてのその後の実験での新たなオリゴヌクレオチドのスクリーニング濃度として利用する。８０％阻害が達成されない場合には、Ｈ−ｒａｓもしくはｃ−ｒａｆのｍＲＮＡの６０％阻害をもたらす陽性対照オリゴヌクレオチドの最低濃度を、その細胞系についてのその後の実験でのオリゴヌクレオチドスクリーニング濃度として利用する。６０％阻害が達成されない場合は、その特定の細胞系は、オリゴヌクレオチドトランスフェクション実験に不適とみなす。
実施例１０
アポリポタンパク質（ａ）発現のオリゴヌクレオチド阻害の分析
アポリポタンパク質（ａ）発現のアンチセンス調節は当該技術分野で既知の多様な方法にてアッセイすることができる。例えば、アポリポタンパク質（ａ）のｍＲＮＡレベルは、例えばノーザンブロット分析、競争的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）もしくは実時間ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により定量することができる。実時間定量的ＰＣＲが現在好ましい。ＲＮＡ分析は全細胞ＲＮＡもしくはポリ（Ａ）＋ ｍＲＮＡで実施することができる。ＲＮＡの単離方法は、例えばＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１巻、ｐｐ．４．１．１−４．２．９および４．５．１−４．５．３、ジョン ワイリー アンド サンズ インク（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、１９９３に教示される。ノーザンブロット分析は当該技術分野で慣例であり、かつ、例えばＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１巻、ｐｐ．４．２．１−４．２．９、ジョン ワイリー アンド サンズ インク（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、１９９６に教示される。実時間定量的（ＰＣＲ）は、ＰＥ−アプライド バイオシステムズ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、カリフォルニア州フォスターシティから入手可能かつ製造元の説明書に従って使用される、商業的に入手可能なＡＢＩ プリズム［ＰＲＩＳＭ］ＴＭ ７７００配列検出装置を使用して、便宜的に達成することができる。
アポリポタンパク質（ａ）のタンパク質レベルは、免疫沈降法、ウェスタンブロット分析（イムノブロッティング）、ＥＬＩＳＡもしくは蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）のような当該技術分野で公知の多様な方法で定量することができる。アポリポタンパク質（ａ）に向けられる抗体は、抗体のＭＳＲＳカタログ（エアリー コーポレーション（Ａｅｒｉｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ミシガン州バーミングハム）のような多様な供給源から同定かつ得ることができるか、もしくは、慣習的抗体生成法を介して調製することができる。ポリクローナル抗血清の調製方法は、例えばＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２巻、ｐｐ．１１．１２．１−１１．１２．９、ジョン ワイリー アンド サンズ インク（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、１９９７に教示される。モノクローナル抗体の調製法は、例えばＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２巻、ｐｐ．１１．４．１−１１．１１．５、ジョン ワイリー アンド サンズ インク（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、１９９７に教示される。
免疫沈降法は当該技術分野で標準的であり、そして、例えばＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２巻、ｐｐ．１０．１６．１−１０．１６．１１、ジョン ワイリー アンド サンズ インク（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、１９９８に見出すことができる。ウェスタンブロット（イムノブロット）分析は当該技術分野で標準的であり、そして、例えばＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２巻、ｐｐ．１０．８．１−１０．８．２１、ジョン ワイリー アンド サンズ インク（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、１９９７に見出すことができる。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）は当該技術分野で標準的であり、そして、例えばＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２巻、ｐｐ．１１．２．１−１１．２．２２、ジョン ワイリー アンド サンズ インク（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、１９９１に見出すことができる。
実施例１１
ポリ（Ａ）＋ ｍＲＮＡの単離
ポリ（Ａ）＋ ｍＲＮＡはＭｉｕｒａら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、１９９６、４２、１７５８−１７６４に従って単離することができる。他のポリ（Ａ）＋ ｍＲＮＡ単離方法は、例えばＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１巻、ｐｐ．４．５．１−４．５．３、ジョン ワイリー アンド サンズ インク（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、１９９３に教示される。簡潔には、９６穴プレート上で成長される細胞については、成長培地を細胞から除去し、そして各ウェルを２００μＬの冷ＰＢＳで洗浄する。６０μＬの溶解緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ−４０、２０ｍＭバナジル−リボヌクレオシド錯体）を各ウェルに添加し、プレートを穏やかに攪拌し、そしてその後室温で５分間インキュベートする。５５μＬのライセートをオリゴｄ（Ｔ）被覆９６穴プレート（ＡＧＣＴ インク（ＡＧＣＴ Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州アーヴァイン）に移す。プレートを室温で６０分間インキュベートし、２００μＬの洗浄緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．３Ｍ ＮａＣｌ）で３回洗浄する。最後の洗浄後に、プレートをペーパータオル上で吸い取って過剰の洗浄緩衝液を除去し、そしてその後５分間風乾する。７０℃に予め加熱された６０μＬの溶出緩衝液（５ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．６）を各ウェルに添加し、プレートを９０℃のホットプレート上で５分間インキュベートし、そしてその後、溶出物を新しい９６穴プレートに移す。
１００ｍｍもしくは他の標準的プレート上で成長された細胞は、適切な容量の全部の溶液を使用して同様に処理してよい。
実施例１２
全ＲＮＡの単離
全ＲＮＡは、製造元の推奨される手順に従って、キアゲン インク（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．）（カリフォルニア州バレンシア）から購入されるＲＮイージー ９６［ＲＮＥＡＳＹ ９６］ＴＭキットおよび緩衝液を使用して単離することができる。簡潔には、９６穴プレート上で成長される細胞について、成長培地を細胞から除去し、そして各ウェルを２００μＬの冷ＰＢＳで洗浄する。１００μＬの緩衝液ＲＬＴを各ウェルに添加し、そしてプレートを２０秒間活発に攪拌する。その後、１００μＬの７０％エタノールを各ウェルに添加し、そしてピペットで３回出し入れすることにより内容物を混合する。その後、サンプルを、廃棄物収集トレイを備え付けられたキアバック［ＱＩＡＶＡＣ］ＴＭマニホールドに接続されかつ真空源に接続されたＲＮイージー ９６［ＲＮＥＡＳＹ ９６］ＴＭ穴プレートに移す。真空を１５秒間適用する。１ｍＬの緩衝液ＲＷ１をＲＮイージー ９６［ＲＮＥＡＳＹ ９６］ＴＭプレートの各ウェルに添加し、そして真空を再度１５秒間適用した。その後、１ｍＬの緩衝液ＲＰＥをＲＮイージー ９６［ＲＮＥＡＳＹ ９６］ＴＭプレートの各ウェルに添加し、そして真空を１５秒の期間、適用する。その後、緩衝液ＲＰＥ洗浄を反復し、そして真空を追加の１０分間適用する。その後、プレートをキアバック［ＱＩＡＶＡＣ］ＴＭマニホールドから取り外し、そしてペーパータオル上で吸い取る。その後、プレートを、１．２ｍＬの収集管を含有する収集管ラックを備え付けられたキアバック［ＱＩＡＶＡＣ］ＴＭマニホールドに再接続する。その後、ＲＮＡを、各ウェルに６０μＬの水をピペットで入れること、１分インキュベートすること、およびその後３０秒間真空を適用することにより溶出する。溶出段階を、追加の６０μＬの水で反復する。
反復するピペット操作および溶出の段階を、キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）バイオ−ロボット（Ｂｉｏ−Ｒｏｂｏｔ）９６０４（キアゲン インク（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州バレンシア）を使用して自動化してもよい。本質的に、培養プレート上の細胞の溶解後に、プレートをロボットのデッキに移し、そこでピペット操作、ＤＮアーゼ処理および溶出段階を実施する。
実施例１３
アポリポタンパク質（ａ）のｍＲＮＡレベルの実時間定量的ＰＣＲ分析
アポリポタンパク質（ａ）のｍＲＮＡレベルの定量は、製造元の説明書に従ってＡＢＩ プリズム［ＰＲＩＳＭ］ＴＭ７７００配列検出装置（ＰＥ−アプライド バイオシステムズ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、カリフォルニア州フォスターシティ）を使用する実時間定量的ＰＣＲにより測定することができる。これは、実時間でのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成物の高スループット定量を可能にする、閉鎖管のゲルに基づかない蛍光検出系である。ＰＣＲが完了した後に増幅生成物が定量される標準的ＰＣＲと対照的に、実時間定量的ＰＣＲでの生成物は、それらが蓄積する際に定量される。これは、順および逆ＰＣＲプライマー間で特異的にアニーリングしかつ２種の蛍光色素を含有するオリゴヌクレオチドプローブをＰＣＲ反応に包含することにより達成される。レポーター色素（例えば、ＪＯＥ、ＦＡＭもしくはＶＩＣ、オペロン テクノロジーズ インク（Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州アルメダもしくはＰＥ−アプライド バイオシステムズ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、カリフォルニア州フォスターシティのいずれかから得られる）をプローブの５’端に結合し、そしてクエンチャー色素（例えばＴＡＭＲＡ、オペロン テクノロジーズ インク（Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州アルメダもしくはＰＥ−アプライド バイオシステムズ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、カリフォルニア州フォスターシティのいずれかから得られる）をプローブの３’端に結合する。プローブおよび色素が無傷である場合、レポーター色素の発光は３’のクエンチャー色素の近接により消光される。増幅の間、標的配列へのプローブのアニーリングが、Ｔａｑポリメラーゼの５’−エンドヌクレアーゼ活性により切断されることができる基質を創製する。ＰＣＲ増幅周期の伸長期の間に、Ｔａｑポリメラーゼによるプローブの切断がプローブの残部から（およびこれゆえにクエンチャー部分から）レポーター色素を遊離し、そして配列特異的な蛍光シグナルを生成させる。各周期で、付加的なレポーター色素分子がそれらのそれぞれのプローブから切断され、そして、蛍光強度を、ＡＢＩ プリズム［ＰＲＩＳＭ］ＴＭ７７００配列検出装置に作り付けられたレーザー光学系により一定の間隔でモニターする。各アッセイにおいて、未処理の対照サンプルからのｍＲＮＡの連続希釈物を含有する一連の同時反応が標準曲線を生成させ、それを使用して、試験サンプルのアンチセンスオリゴヌクレオチド処理後の阻害パーセントを定量する。
定量的ＰＣＲ分析の前に、測定されている標的遺伝子に特異的なプライマー−プローブの組を、ＧＡＰＤＨ増幅反応で「多重化（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ）」されるそれらの能力について評価する。多重化において、標的遺伝子および内的標準遺伝子ＧＡＰＤＨ双方が単一サンプル中で同時発生的に増幅される。この分析において、未処理の細胞から単離されたｍＲＮＡを連続的に希釈する。各希釈物を、ＧＡＰＤＨのみ、標的遺伝子のみ（「一重化（ｓｉｎｇｌｅ−ｐｌｅｘｉｎｇ）」）もしくは双方（多重化）に特異的なプライマー−プローブの組の存在下で増幅する。ＰＣＲ増幅後に、希釈の関数としてのＧＡＰＤＨおよび標的ｍＲＮＡのシグナルの標準曲線を、一重化されたおよび多重化された双方のサンプルから生成させる。多重化されたサンプルから生成されるＧＡＰＤＨおよび標的のシグナルの傾きおよび相関係数双方が、一重化されたサンプルから生成されるそれらの対応する値の１０％以内にある場合は、その標的に特異的なプライマー−プローブの組を多重化可能（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘａｂｌｅ）とみなす。他のＰＣＲ方法もまた当該技術分野で既知である。
ＰＣＲ試薬は、ＰＥ−アプライド バイオシステムズ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、カリフォルニア州フォスターシティから得る。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、２５μＬの全ＲＮＡ溶液を含有する９６穴プレートに、２５μＬのＰＣＲカクテル（１×タックマン［ＴＡＱＭＡＮ］ＴＭ緩衝液Ａ、５．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、３００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰのそれぞれ、６００μＭのｄＵＴＰ、１００ｎＭの順プライマー、逆プライマーおよびプローブのそれぞれ、２０単位のＲＮアーゼ阻害剤、１．２５単位のアンプリタック ゴールド［ＡＭＰＬＩＴＡＱ ＧＯＬＤ］ＴＭ、ならびに１２．５単位のＭｕＬＶ逆転写酵素）を添加することにより実施する。ＲＴ反応は４８℃で３０分間のインキュベーションにより実施する。アンプリタック ゴールド［ＡＭＰＬＩＴＡＱ ＧＯＬＤ］ＴＭを活性化するための９５℃での１０分のインキュベーション後に、４０周期の２段階ＰＣＲプロトコルを実施する。すなわち、９５℃１５秒間（変性）、次いで６０℃１．５分間（アニーリング／伸長）。
実時間ＲＴ−ＰＣＲにより得られる遺伝子標的の量は、ＧＡＰＤＨ（その発現が一定である遺伝子）の発現レベルを使用して、もしくはリボグリーン［ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ］ＴＭ（モレキュラー プローブス インク（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）オレゴン州ユージーン）を使用して全ＲＮＡを定量することによるかのいずれかで、正規化することができる。ＧＡＰＤＨ発現は、実時間ＲＴ−ＰＣＲにより、標的と同時に、もしくは別個に多重化を実施することにより定量する。全ＲＮＡは、モレキュラー プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）（オレゴン州ユージーン）からのリボグリーン［ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ］ＴＭＲＮＡ定量試薬を使用して定量する。リボグリーン［ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ］ＴＭによるＲＮＡ定量方法は、Ｊｏｎｅｓ，Ｌ．Ｊ．ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９８、２６５、３６８−３７４に教示される。
本アッセイにおいて、１７５μＬのリボグリーン［ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ］ＴＭ作業試薬（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５で２８６５倍に希釈されたリボグリーン［ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ］ＴＭ試薬）を、２５μＬの精製された細胞ＲＮＡを含有する９６穴プレートにピペットで入れる。プレートを、４８０ｎｍでの励起および５２０ｎｍでの発光を用いてサイトフルオル（ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ）４０００（ＰＥ アプライド バイオシステムズ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））で読み取る。
ヒトアポリポタンパク質（ａ）に対するプローブおよびプライマーは、公表された配列情報（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＮＭ＿００５５７７、配列番号３として本明細書に組み込まれる）を使用して、ヒトアポリポタンパク質（ａ）配列にハイブリダイズするよう設計する。
ヒトＧＡＰＤＨについて、標準的ＰＣＲプライマーは：順プライマー：ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ（配列番号４）逆プライマー：ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ（配列番号５）であり、そして、ＰＣＲプローブは：５’ＪＯＥ−ＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＴＣＡＧＣＣ−ＴＡＭＲＡ３’（配列番号６）であり、ここでＪＯＥ（ＰＥ−アプライド バイオシステムズ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、カリフォルニア州フォスターシティ））は蛍光レポーター色素であり）、そしてＴＡＭＲＡ（ＰＥ−アプライド バイオシステムズ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、カリフォルニア州フォスターシティ））はクエンチャー色素である。
実施例１４
アポリポタンパク質（ａ）のｍＲＮＡレベルのノーザンブロット分析
アンチセンス処理１８時間後に、細胞単層を冷ＰＢＳで２回洗浄し、そして１ｍＬのＲＮＡゾール［ＲＮＡＺＯＬ］ＴＭ（テル−テスト「Ｂ」インク（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ“Ｂ”Ｉｎｃ．）、テキサス州フレンズウッド）中で溶解する。全ＲＮＡは製造元の推奨されるプロトコルに従って調製する。２０マイクログラムの全ＲＮＡを、ＭＯＰＳ緩衝系（アムレスコ インク（ＡＭＲＥＳＣＯ，Ｉｎｃ．）オハイオ州ソロン）を使用する１．１％ホルムアルデヒドを含有する１．２％アガロースゲルを通る電気泳動により分画する。ＲＮＡを、ノーザン／サザン転写緩衝系（テル−テスト「Ｂ」インク（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ“Ｂ”Ｉｎｃ．）、テキサス州フレンズウッド）を使用する一夜キャピラリー転写により、ゲルからハイボンド［ＨＹＢＯＮＤ］ＴＭ−Ｎ＋ナイロンメンブレン（アマーシャム ファルマシア バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ニュージャージー州ピスカタウェイ）に転写する。ＲＮＡの転写をＵＶ可視化により確認する。メンブレンを、ストラタリンカー［ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ］ＴＭＵＶクロスリンカー（Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ）２４００（ストラタジーン インク（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州ラホヤ）を使用してＵＶ架橋することにより固定し、そしてその後、ストリンジェントな条件についての製造元の推奨を使用して、クイックハイブ［ＱＵＩＣＫＨＹＢ］ＴＭハイブリダイゼーション溶液（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州ラホヤ）を使用してプロービングする。
ヒトアポリポタンパク質（ａ）を検出するために、ヒトアポリポタンパク質（ａ）特異的プローブを、順および逆プライマーを使用するＰＣＲにより調製する。負荷および転写効率における変動を正規化するために、メンブレンを細片に切り、そしてヒトグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）ＲＮＡ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、カリフォルニア州パロアルト）についてプロービングする。
ハイブリダイズされたメンブレンは、ホスホルイメジャー［ＰＨＯＳＰＨＲＩＭＡＧＥＲ］ＴＭおよびＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴＴＭソフトウェアＶ３．３（モレキュラー ダイナミックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）、カリフォルニア州サニーベール）を使用して可視化かつ定量する。データを、未処理の対照中のＧＡＰＤＨレベルに対し正規化する。
実施例１５
ヒトアポリポタンパク質（ａ）に標的を定める、２’−ＭＯＥウイングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
本発明により、一連のオリゴヌクレオチドを、公表された配列（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＮＭ＿００５５７７、配列番号３として本明細書に組み込まれる）を使用して、ヒトアポリポタンパク質（ａ）ＲＮＡの多様な領域に標的を定めるよう設計した。該オリゴヌクレオチドを表１に示す。「標的部位」はオリゴヌクレオチドが結合する特定の標的配列の最初の（最も５’の）ヌクレオチド番号を示す。表１中の全化合物は、双方の側（５’および３’の方向）で５ヌクレオチドの「ウイング」により隣接される１０の２’−デオキシヌクレオチドよりなる中央「ギャップ」領域から構成される長さ２０ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。該ウイングは２’−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間（バックボーン）結合は該オリゴヌクレオチド全体でホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。全シチジン残基は５−メチルシチジンである。
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実施例１６
アポリポタンパク質（ａ）のタンパク質レベルのウェスタンブロット分析
ウェスタンブロット分析（イムノブロット分析）は標準的方法を使用して実施する。細胞をオリゴヌクレオチド処理１６〜２０時間後に収集し、ＰＢＳで１回洗浄し、レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）緩衝液（１００μｌ／ウェル）に懸濁し、５分間沸騰させそして１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷する。ゲルを１５０Ｖで１．５時間泳動し、そしてウェスタンブロッティングのためメンブレンに転写する。一次抗体種に対し向けられた放射標識もしくは蛍光で標識された二次抗体とともに、アポリポタンパク質（ａ）に向けられた適切な一次抗体を使用する。バンドを、ホスホルイメジャー［ＰＨＯＳＰＨＲＩＭＡＧＥＲ］ＴＭ（モレキュラー ダイナミックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）、カリフォルニア州サニーベール）を使用して可視化する。
【配列表】
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Claims (20)

  1. ヒトアポリポタンパク質（ａ）をコードする核酸分子と特異的にハイブリダイズしかつヒトアポリポタンパク質（ａ）の発現を阻害する、ヒトアポリポタンパク質（ａ）をコードする核酸分子に標的を定められた長さ８ないし５０核酸塩基の化合物。
  2. アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１記載の化合物。
  3. アンチセンスヌクレオチドが、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０もしくは４１を含んで成る配列を有する、請求項２記載の化合物。
  4. アンチセンスオリゴヌクレオチドが最低１個の修飾ヌクレオシド間結合を含んで成る、請求項２記載の化合物。
  5. 修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項４記載の化合物。
  6. アンチセンスオリゴヌクレオチドが最低１個の修飾糖部分を含んで成る、請求項２記載の化合物。
  7. 修飾糖部分が２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分である、請求項６記載の化合物。
  8. アンチセンスオリゴヌクレオチドが最低１個の修飾核酸塩基を含んで成る、請求項２記載の化合物。
  9. 修飾核酸塩基が５−メチルシトシンである、請求項８記載の化合物。
  10. アンチセンスオリゴヌクレオチドがキメラオリゴヌクレオチドである、請求項２記載の化合物。
  11. ヒトアポリポタンパク質（ａ）をコードする核酸分子上の活性部位の最低８核酸塩基部分と特異的にハイブリダイズする、長さ８ないし５０核酸塩基の化合物。
  12. 請求項１記載の化合物および製薬学的に許容できる担体もしくは希釈剤を含んで成る組成物。
  13. コロイド分散系をさらに含んで成る、請求項１２記載の組成物。
  14. 化合物がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１２記載の組成物。
  15. ヒトアポリポタンパク質（ａ）の発現が阻害されるように、細胞もしくは組織を請求項１記載の化合物と接触させることを含んで成る、前記細胞もしくは組織中でのヒトアポリポタンパク質（ａ）の発現の阻害方法。
  16. ヒトアポリポタンパク質（ａ）の発現が阻害されるように、ヒトアポリポタンパク質（ａ）に関連する疾患もしくは状態を有するヒトに、治療上もしくは予防上有効な量の請求項１記載の化合物を投与することを含んで成る、前記ヒトの治療方法。
  17. 状態が異常な脂質代謝を伴う、請求項１６記載の方法。
  18. 状態が異常なコレステロール代謝を伴う、請求項１６記載の方法。
  19. 状態がアテローム硬化症である、請求項１６記載の方法。
  20. 疾患が心血管系疾患である、請求項１６記載の方法。
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