JP2005519959A - Ｈｉｖに対する強化された免疫応答を誘導する方法 - Google Patents

Abstract

特定の初回免疫・追加免疫レジメを利用する、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する免疫応答を誘導する効果的な方法が開示される。その特定の初回免疫・追加免疫レジメでは、一般的なＨＩＶ抗原をコードする外来性の遺伝物質を含む、相互に取替え可能な異なる血清型の組み換えアデノウイルスベクターを用いる異種の初回免疫・追加免疫プロトコールが採用される。開示された計画に基づいて、脊椎動物の生きている組織内に、好ましくは哺乳動物（たとえば、ヒト、または市販されているかまたは家畜として獣医学的に重要な非ヒトの哺乳動物）の宿主にワクチンを投与することによって、ＨＩＶ−１抗原（たとえばＧａｇ）が発現され、ＨＩＶ−１を特異的に認識する細胞性免疫応答が誘導される。開示された初回免疫／追加免疫レジメによって、今まで感染していない個体に対する予防上の利点および／または感染した個体内でのウイルス量のレベルを減少させることによる治療効果が提供され、その結果、ＨＩＶ−１感染の無症候期が延長されると考える。

Description

（関連出願についての相互参照）
本出願は、それぞれ２００２年３月１３日に出願された米国仮出願第６０／３６３，８７０号についての優先権を主張するものであり、これらは参照して本明細書に組み込まれる。
（連邦政府から資金を受けている研究開発に関する陳述）
適用されない
（マイクロフィッシュ・アペンディクスへの言及）
適用されない

本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（「ＨＩＶ」）に対する免疫応答を誘導するための強化された方法に関する。異種の初回−追加（ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ）投与の際に、一般的なＨＩＶ抗原をコードする外来遺伝物質を含む組み換えアデノウイルス媒体が採用される。より具体的には、異種の初回−追加免疫スキームにおいて、相互に取替え使用可能な異なる血清型の組み換えアデノウイルス媒体が採用される。出願人らは、ＨＩＶ抗原をコードする外来遺伝物質を含む組み換えアデノウイルス媒体を投与し、次いでＨＩＶ抗原を含む異なる血清型の組み換えアデノウイルスを投与すると、初回投与からの免疫応答が著しく増幅されることを見出した。さらに、この増幅は、同じ組み換えアデノウイルスベクターを、哺乳動物宿主の初回投与および追加投与の両者について、それぞれ独立して利用した時に見られるものよりも、いずれも著しい。さらに、この増幅された免疫応答は、特に細胞性免疫応答において明白であるが、ＨＩＶを特異的に認識することができる。本発明において用いられるウイルスは、選択したアデノウイルスがそのウイルス配列内に導入された外来遺伝物質を効果的に発現させる能力を有するならば、複製能を欠くあらゆるアデノウイルスであり得る。本明細書に開示された発見に基づけば、開示された初回投与／追加投与レジメは、今まで感染していない個体に対する予防上の利点および／または感染した個体内でのウイルス量のレベルを減少させることによる治療効果を提供し、その結果、ＨＩＶ−１感染の無症候期が延長されると確信する。

ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）は、ヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）および関連する疾患の病原因子である。ＨＩＶ−１はレトロウイルス科のＲＮＡウイルスであり、すべてのレトロウイルスの５’ＬＴＲ−ｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖ−ＬＴＲ３’の構成を示す。プロウイルスとして知られているＨＩＶ−１の組み込まれた型の長さは約９．８Ｋｂである。ウイルスのゲノムのそれぞれの末端には、末端反復配列（ＬＴＲ）として知られているフランキング配列が含まれている。ＨＩＶの遺伝子は少なくとも九種のタンパク質をコード化しており、この遺伝子は三種のクラスに分類される。すなわち主な構造タンパク質（Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＥｎｖ）、調節タンパク質（ＴａｔおよびＲｅｖ）、ならびにアクセサリータンパク質（Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、ＶｉｆおよびＮｅｆ）である。

ＨＩＶ−１が感染した個体についての効果的な治療レジメを利用できるようにはなった。しかしながら、これらの薬物は、世界の多くの地域の疾患に顕著な影響を与えることはなく、ヒト集団での感染の広がりを食い止めるという最小限の効果しか与えない。他の多くの感染症においてそうであるように、効果的なワクチンの開発および導入のみにより、ＨＩＶ−１感染の広がりに対して疫学的に顕著な効果を与えよう。ワクチンの開発が成功していないことに関与する数多くの因子が存在する。たとえば、慢性感染者において、ＨＩＶ−１に対する体液性免疫応答および細胞性免疫応答が存在し、かつウイルス感染細胞が破壊されているにも関わらず、一定量のウイルスを生産するということが現在明らかになっている。その他の感染症の場合のように、疾患の成り行きは、免疫応答の速度論および規模、病原体の複製の速度ならびに免疫応答に対する影響の受けやすさの間のバランスの結果である。定着した感染によって進展する免疫応答よりも、急性の感染による既存免疫の方がより効果的である。第二の因子は、ウイルスの遺伝的変異性の著しさである。ＨＩＶ−１の感染力を中和することができる抗ＨＩＶ−１抗体は細胞培養液中に存在するが、これらの抗体は、一般に、それらの活性において、単離ウイルスに特異的である。従来の方法を用いてＨＩＶ−１の血清学上の分類を明らかにすることは不可能であることが分かった。むしろ、このウイルスは血清学上の「連続体」を定義するものであるようであり、従って個々の中和抗体の応答は、せいぜい、わずかなウイルスの変異株に対してのみ効果がある。後者の見解からすれば、抗ＨＩＶ−１細胞性免疫応答を惹起させるであろう免疫原および関連する送達技術を特定することは有益であろう。ＣＴＬ応答を生じさせるためには、抗原細胞内で合成されるかまたは細胞内に導入され、次いでプロテアソーム複合体によって小ペプチドに加工され、最終的に主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩタンパク質の会合のために、小胞体／ゴルジ複合体分泌経路内に移されなければならないことが知られている。ＣＤ８^＋Ｔリンパ球は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）およびＣＤ８細胞表面タンパク質とを介してクラスＩ ＭＨＣと会合している抗原を認識する。未処置のＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化エフェクター細胞または記憶細胞への活性化は、一般に、上述のように、抗原のＴＣＲとの会合ならびに共刺激タンパク質の会合の両者を必要とする。ＣＴＬ応答の最適な誘導には、通常、ＣＤ４^＋Ｔリンパ球からのサイトカインの形式の「援助」が必要であり、このＴリンパ球は、ＴＣＲおよびＣＤ４の関与を介してＭＨＣクラスＩＩ分子と会合している抗原を認識する。

アデノウイルスベクターは、ＨＩＶを含む種々の外来抗原を送達し発現させるための、生きているウイルスベクターとして開発され、処置された個体内でのＣＴＬ応答を効果的に惹起することが証明されている。アデノウイルスはエンベロープを持たないウイルスであり、約３６ｋｂの直鎖状二本鎖のゲノムを含む。このベクターは高いウイルス価を達成し、幅広い細胞親和性を有し、および非分裂細胞に感染することもできる。アデノウイルスベクターは遺伝子導入のための極めて有効な媒体であり、臨床での遺伝子治療の研究に高い頻度で用いられている。さらに、アデノウイルスは、多数の有望なウイルス免疫化プロトコールの基礎を形成している。

（１９９５年２月１５日に公開された）欧州特許出願第０ ６３８ ３１６号および（１９９４年３月９日に公開された）第０ ５８６ ０７６号（両者ともアメリカン・ホーム・プロダクツ社（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｏｍｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に譲渡された）には、ｅｎｖまたはｇａｇを含むＨＩＶ遺伝子を保持し、複製するアデノウイルスベクターが記載されている。チンパンジーおよびイヌにより、これらのベクターに基づいた種々の治療レジメが用いられた。これらレジメのうちのいくつかは、アデノウイルスまたはタンパク質の追加免疫に加えてミョウバン処理が含まれていた。

たとえばＥ１領域において欠失を宿し、複製能を欠くアデノウイルスベクターは、複製するそれらの対応物に代替するさらに安全なベクターである。最近のアデノウイルスベクターは、公知のパッケージングリピートがベクター内に組み込まれている（たとえば、とりわけ、塩基対４５９から３３２８のＥ１配列が欠失したアデノウイルスベクターが開示されているＥＰ ０ ７０７ ０７１号、および、とりわけ、塩基対４５９から３５１０が欠失したアデノウイルスベクターが開示されている米国特許第６，０３３，９０８号を参照すること）。アデノウイルスのパッケージングの効率は、組み込まれた個々のＡ（パッケージング）リピートの数に依存すると教示されている（たとえば、グレーブルおよびヒアリング（Ｇｒａｅｂｌｅ ａｎｄ Ｈｅａｒｉｎｇ）、１９９０ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４ （５）：２０４７−２０５６；グレーブルおよびヒアリング、１９９２ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６（２）：７２３−７３１を参照すること）。

血清型５および６のアデノウイルスは開示されており、公に利用可能である（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（「ＡＴＣＣ」）のそれぞれの寄託受理番号ＶＲ−５およびＶＲ−６を参照すること）。さらに、血清型５の野生型アデノウイルスの配列も公に知られていて、この分野において記述されている（クロボチェックら、１９９２ Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８６： ２８０−５を参照すること）。血清型６のアデノウイルスの完全配列（図１１Ａ−１から１１Ａ−１４に示されてる）は、２００１年１０月１１日に出願された同時係る米国仮出願第６０／３２８，６５５号に最初に開示された。血清型５と同様に、血清型６のアデノウイルスも既に文献に記載されている（ローウェ（Ｒｏｗｅ）ら、１９５３ Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．ＥＸＰ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．８４： ５７０；ローウェら、１９５５ Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｇ．６１： １９７−２１８；およびヒールフォルツアー（Ｈｉｅｒｈｏｌｚｅｒ）ら、１９９１ Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１２１： １７９−９７を参照すること）。Ａｄ５およびＡｄ６以外の血清型のアデノウイルスも公に知られていて、文献に記載されている。

現在までのウイルスワクチンベクターを用いた投与プロトコールは、種々の初回−追加接種スキームを採用している。二種の一般的スキームが頻繁に用いられている：（１）同じウイルス媒体を用いて、哺乳動物宿主の初回処置および追加処置の両者を成し遂げる、および（２）ウイルス媒体に限定されない異なる媒体を利用してプライム処置およびブースト処置を実施する。後者の例は、例えば、ＤＮＡを初回としウイルスを追加とするスキーム、互いに異なるウイルスを用いるあるウイルスを初回とし、他のウイルスを追加とするスキームである。

ＨＩＶ感染に対する強力な細胞性免疫応答を生じさせ得る、予防薬および／または治療薬に基づくＨＩＶワクチンレジメを開発することは、ＡＩＤＳに対する戦いにおいて極めて重要であろう。本発明は、相互に取替え可能な、異なる血清型の組み換えアデノウイルスベクター（この組み換えアデノウイルスベクターには一般的なＨＩＶ抗原をコードする外来遺伝物質が含まれている）の投与に基づく異種の初回−追加ＨＩＶ免疫化レジメを開示することによって、これらの必要性に取り組み、満足させる。本発明の一つの側面は、血清型５、６、および３５のアデノウイルスに由来する組み換えアデノウイルスベクターを採用した、異種免疫化スキームに関する。この内容に合致するワクチンプロトコールは、出願人が知る限り、ＨＩＶについては示されていない。このワクチンの初回−追加レジメは、宿主、たとえばヒトに投与し得る。

本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（「ＨＩＶ」）に対する免疫応答を生じさせるための強化された方法に関する。この方法は、ＨＩＶ抗原をコードする異種遺伝物質を含む、相互に取替え可能な異なる血清型の組み換えアデノウイルス媒体による異種の初回−追加投与に基づくものであり、いずれかのベクターにより、単一の初回−追加免疫スキームにて独立して得られる免疫応答よりも、ＨＩＶに対するより明白な免疫応答をもたらす。ここに開示された方法に基づいて、先ず、哺乳動物の宿主に、ＨＩＶ抗原をコードする遺伝子を含む第一の血清型の組み換えアデノウイルスベクターを含む初回投与を行い、ある期間の後、ＨＩＶ抗原をコードする遺伝子を保持する第二の異なる血清型の組み換えアデノウイルスベクターを含む追加投与を行う。投与を区分する予め定めた短い時間があってよく、この時間は必然的に免疫学的休止時間となる。特定の態様において、この休止は少なくとも４ヶ月の期間である。複数回の初回処置が、通常は１から４回が採用されるが、さらに多くてもよい。初回処置と追加処置との間の期間の長さは、通常、約四ヶ月から一年の間で変わり得るが、その他の期間を用いてもよい。出願人らは、アデノウイルスで初回免疫された応答は、相互に取替え可能な異なる血清型のアデノウイルスを用いて追加免疫することによって、ＨＩＶ抗原に対し著しく増幅された免疫応答となり得ることを見出した。このように、本発明は、相互に取替え可能な血清型アデノウイルスＨＩＶワクチンを、開示された方法に基づいて投与することに関するものである。

従って、本発明は、（ａ）Ｅ１の少なくとも一部が除去されＥ１活性が欠失した、ＨＩＶ−１抗原または免疫学的関連性を有するその改変体をコードする遺伝子を含む、第一の血清型の組み換えアデノウイルスベクターを、哺乳動物宿主に接種する工程、およびその後に（ｂ）Ｅ１の少なくとも一部が除去されてＥ１活性が欠失した、ＨＩＶ−１抗原または免疫学的関連性を有するその改変体をコードする遺伝子を含む、第二のおよび異なる血清型の組み換えアデノウイルスベクターを含む追加免疫を、前記哺乳動物の宿主に接種する工程、を含む、哺乳動物宿主においてＨＩＶ−１抗原に対する強化された免疫応答を誘導する方法に関する。

本発明の免疫化レジメにおいて用いられる組み換えアデノウイルスベクターは、ウイルスの大規模な生産および精製を経ても遺伝的に安定である、複製能を欠くあらゆるアデノウイルスベクターを含み得る。換言すれば、本発明の方法に用いるのに適した組み換えアデノウイルスベクターは、細胞培養で複数の継代を重ねても遺伝的に安定であり、この安定性を大規模な生産および精製処理の間にも維持する、複製能を欠く、精製されたあらゆる組み換えウイルスであり得る。このような組み換えウイルスベクターおよび収集されたウイルスワクチンは、効果的な一価または多価のＨＩＶワクチンに求められている大規模な用量の充填およびそれに続く世界的な流通手続に適するものである。本発明は、血清型５、６および３５を含む（これらの例には限定されない）複製能を欠く組み換えアデノウイルスベクターの使用に基づいた免疫化レジメの説明の、このような基本的要求を満足するものであ。

本発明の免疫化レジメで用いることが好ましいアデノウイルスベクターは、Ｅ１の少なくとも一部が除去されてＥ１活性が欠失したものである。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞などのＥ１を補うセルライン中で、本明細書に従うところのベクターを容易に増殖させることができる。

初回免疫の媒体または追加免疫の媒体のいずれに使用されるものであっても、本出願において用いられる組み換えアデノウイルスベクターは、ＨＩＶ抗原をコードする遺伝子を含む必要がある。特定の態様において、ＨＩＶ抗原または免疫学的関連性を有するその改変体をコードする遺伝子は、哺乳動物宿主（ヒトなど）内で発現するように最適化されたコドンを含む。本発明の方法において用いられる組み換えアデノウイルスベクターは、（ａ）ＨＩＶ抗原をコードする核酸（ＨＩＶタンパク質など）、または生物活性および／または免疫学的関連性を有するその部分、（ｂ）ａ）の核酸が機能するように結合した異種（外来）プロモーターまたは改変された固有のプロモーター；ならびに（ｃ）転写終結配列を含む遺伝子発現カセットも含み得る。異種プロモーターは、プロモーターが用いられるウイルスに固有のものでないか、またはそのウイルスに由来する、ありとあらゆる（改変されたまたは非改変の）プロモーターであり得る。

本発明において用いられるＨＩＶ抗原は、種々のＨＩＶタンパク質、免疫学関連性を有する改変体、および免疫原性を有するその部分を含み得る。従って、本発明には、コドンが最適化された種々の形態のＨＩＶ−１ ｇａｇ（コドンが最適化された全長（「ＦＬ」）Ｇａｇのｐ５５型およびｔＰＡ−Ｇａｇ融合タンパク質が含まれるが、これらに限定されるない）、ＨＩＶ−１ ｐｏｌ、ＨＩＶ−１ ｎｅｆ、ＨＩＶ ｅｎｖ、上記構築物の融合体、および上記の免疫学的関連性を有する選択された改変体が包含される。ＨＩＶ−１ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖおよび／またはＮｅｆの融合タンパク質の具体例としては、ウイルス抗原のコーディング領域のＮＨ_２−末端部分における、リーダーペプチドまたはシグナルペプチドとの融合体が挙げられるが、これらに限定されない。このようなリーダーペプチドとしてはｔＰＡリーダーペプチドが挙げられるが、これに限定されない。

本開示に基づく組み換えウイルスベクターは、本発明の一つの側面を形成する。本発明のその他の側面は、当該アデノウイルスベクターを含む宿主細胞；当該ベクターを含むワクチン組成物；ならびに（ａ）アデノウイルスベクターを、アデノウイルスのＥ１タンパク質を発現する宿主細胞内に導入する工程、および（ｂ）生じたアデノウイルスベクターを回収する工程を含むベクターを作製する方法である。

本発明は初回−追加免疫レジメにも関し、組み換えアデノウイルスベクターは上記ＨＩＶ抗原の種々の組み合わせを含む。このようなＨＩＶ免疫化レジメは、特にヒトＭＨＣや循環するウイルスの遺伝的多様性の状況下で、宿主への投与後に、強化された細胞性免疫応答を提供する。例として、これに限定されないが二価ワクチン（たとえば、ｇａｇとｎｅｆ、ｇａｇとｐｏｌ、またはｐｏｌとｎｅｆの成分）組成物または三価ワクチン（たとえばｇａｇ、ｐｏｌとｎｅｆの成分）組成物を提供する、ウイルスベクターを基礎とする、多価ワクチン組成物が含まれる、このような多価ワクチンを単回投与用に調合してもよく、または個別に調合された成分のそれぞれを複数回接種するように作製してもよい。この目的のための、本発明の方法において用いられる好ましいワクチン組成物は、複数の、異なるクラスのＨＩＶ抗原を含むアデノウイルスベクターである。それぞれのクラスのＨＩＶ抗原は配列操作の対象となり、その結果、可能性のあるワクチンの多数の組み合わせが提供できる。このような組み合わせは本発明の範囲内である。このように組み合わされた様式を利用することによって、単一様式のレジメによる接種の場合と比較して、はるかに強力な細胞性免疫応答を惹起する可能性が高まる。

本明細書に開示された「組み合わされた様式」の概念は、複数のオープンリーディングフレームを含む組み換えウイルスベクターの作製に適したシャトルプラスミド内に、複数のＨＩＶ−１ウイルス抗原を連結させることができ得る、他に採り得る投与形式にも及ぶ。たとえば、三価のベクターにはｇａｇ−ｐｏｌ−ｎｅｆ融合体を含み得る、あるいは、「２＋１」二価ワクチンが含まれてもよい。この二価ワクチンは、たとえば、同じバックボーン内にｇａｇ−ｐｏｌ融合体（たとえば、コドンが最適化されたｐ５５ ｇａｇおよび不活性化され最適化されたｐｏｌ）を含み、それぞれのオープンリーディングフレームは、異なるプロモーターおよび転写終結配列に機能するように連結されている。あるいは、配列内リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）に機能するように連結されたオープンリーディングフレームに、二つのオープンリーディングフレームが単一のプロモーターに機能するように連結されてもよい。

開示された異種手段を介する組み換えアデノウイルスベクターの投与によって、改良された細胞性免疫応答、単一様式のレジメによって生じた応答よりも明白な応答、が提供される。改良されたワクチンの効果は、今まで感染していない個体に対する感染速度を低下させ（すなわち予防上の応用）、および／または感染した個体内でのウイルス量のレベルを減少させ（すなわち治療上の応用）、それによって、ＨＩＶ−１感染の無症候期を延長すべきことである。このような方法でのワクチンの投与、細胞内送達および発現は、宿主のＣＴＬ応答およびＴｈ応答を惹起する。ワクチン接種を受けた個々の個体または（本明細書で述べられるような）哺乳動物宿主は、市販されているかまたは家畜として獣医学的に重要な非ヒト哺乳動物だけでなく、霊長類（ヒトおよび非ヒトの両方）であり得る。

この観点から、本発明は、アデノウイルスＨＩＶワクチンの投与についての方法論に関し、それによって、効果的な免疫学的予防を提供し、ＨＩＶ−１にさらされた後のこのウイルス感染の成立を妨げ、または、長期間の有利な結果を伴うウイルス量の極小化を成立させるためにＨＩＶ−１の急性感染症を緩和する。このような治療レジメには、一価もしくは多価の組成物、および／または種々に組み合わされた様式の応用が含まれてもよい。従って、本発明は、ここに開示されたＨＩＶワクチンの投与スキームを利用する方法を提供する。この投与スキームは、本明細書で開示された種々のパラメータの範囲内で実施され、ならびに哺乳動物の組織内に導入されるとＨＩＶ抗原を細胞内で発現し、発現されたＨＩＶ抗原に対する効果的な免疫応答を誘導するような、この分野において知られている任意のさらなるパラメータの範囲内でも実施される。

このために、本発明は、ワクチン接種を受けた個体、好ましくはヒトにおいて細胞性免疫応答を生じさせる方法に、一つには関し、この個体には、記述されている方法により組み換えアデノウイルスのＨＩＶワクチンが与えられる。

明細書および請求の範囲を通して用いられるように、次の定義および略語が用いられる。
「ＨＡＡＲＴ」は、高度活性抗レトロウイルス療法を表す。

「第一世代」のベクターは複製能を欠くという特徴がある。これらは通常、Ｅ１遺伝子領域が除かれて不活性化されており、および除去されたか不活性化されたＥ３遺伝子領域を有している。

「ＡＥＸ」は、陰イオン交換クロマトグラフィーを表す。

「ＱＰＡ」は、Ｑｕｉｃｋ ＰＣＲに基づく能力検定を表す。

「ｂｐ」は、塩基対を表す。

「ｓ」または「ｓｔｒ」は、トランスジーンがＥ１と平行であるか、または「直線」方向であることを意味する。

「ＰＢＭＣ」は、末梢血単球を表す。

「ＦＬ」は、全長を表す。

「ＦＬｇａｇ」は、図２に示されるような、最適化された全長ｇａｇ遺伝子を表す。

「Ａｄ５−Ｆｌｇａｇ」は、血清型５のアデノウイルスであって、ＣＭＶプロモーターの制御下にある最適化された全長ｇａｇ遺伝子を含む発現カセットを保持する、複製能を欠くウイルスを表す。

「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼが結合する、ＤＮＡ鎖上の認識部位を意味する。このプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼと開始複合体を形成し、転写活性を開始し、進める。この複合体は、エンハンサーなどにより配列を活性化させるか、またはサイレンサーなどにより配列を抑制することによって、修飾し得る。

「リーダー」は、構造遺伝子と共に転写される、構造遺伝子の５’末端におけるＤＮＡ配列を意味する。これは通常、Ｎ−末端ペプチドの延長部を有するタンパク質となり、ときにプロ配列と呼ばれる。

「イントロン」は、遺伝子の中間に存在するＤＮＡの区画であって、遺伝子産物におけるアミノ酸をコードしていないものを意味する。イントロンの前駆ＲＮＡは切除されるため、ｍＲＮＡに転写されたり、またはタンパク質に翻訳されることはない。

ウイルスタンパク質との関連で用いる場合の「免疫学的に関連する」または「生物学的に活性な」は、そのタンパク質が、投与されると、ウイルスの増殖および／または蔓延を遅延させたり、および／または個体内に存在するウイルス量を減少させるのに十分な、測定できる免疫応答を、個体内で惹起させることができることを意味する。同じ用語がヌクレオチド配列に関連して用いられる場合には、この配列が、上記が可能なタンパク質をコードできることを意味する。

「カセット」は、転写制御配列および翻訳制御配列と一緒に、共に発現されるべき核酸配列を表す。カセットを変更することによって、ベクターは、異なる配列を発現することができる。

「ｂＧＨｐＡ」は、ウシ成長ホルモンの転写終結／ポリアデニル化配列を表す。

「ｔＰＡｇａｇ」は、組織プラスミノゲンアクチベーターのリーダー配列と、最適化されたＨＩＶのｇａｇ遺伝子との融合体を表す。

「ＩＡ」または「ｉｎａｃｔ」が用いられている場合、これらは、遺伝子の不活性化型（たとえばＩＡｐｏｌ）を表す。

「ＭＣＳ」は「マルチクローニング部位」を表す。

「Ａｄ５」は、血清型５のアデノウイルスを表す。

「Ａｄ６」は、血清型６のアデノウイルスを表す。

全般に、アデノウイルス構築物、遺伝子構築物は、その中に含まれる遺伝子を引用して名付けられる。たとえば以下のようにする。

「Ａｄ５ ＨＩＶ−１ ｇａｇ」は、元のＨＩＶ−１ ｇａｇアデノウイルスベクターのことも指すが、ｈＣＭＶイントロンＡプロモーター、ヒトにコドンが最適化された全長型のＨＩＶ−１ ｇａｇ遺伝子、およびウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルからなるトランスジーンカセットを含むベクターでもある。

「ＭＲＫ Ａｄ５ ＨＩＶ−１ ｇａｇ」は、「ＭＲＫａＤ５ｇａｇ」または「Ａｄ５ｇａｇ２」とも呼ばれ、Ｅ１が除去された、アデノウイルスの塩基対１から４５０と塩基対３５１１から３５２３を含むアデノウイルスベクターである。このベクターは、イントロンＡを含まないＣＭＶプロモーターの制御下にある、Ｅ１に平行に、ヒトにコドンが最適化されたＨＩＶ−１ ｇａｇ遺伝子を有する。この構築物はまたウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルも含んでいる。

「ｐＶ１ＪｎｓＨＩＶｇａｇ」は、「ＨＩＶＦＬｇａｇＰＲ９９０１」とも呼ばれ、ＣＭＶ最初期（ＩＥ）プロモーターおよびイントロンＡ、コドンが最適化された全長ＨＩＶ ｇａｇ遺伝子、ウシ成長ホルモンに由来するポリアデニル化・転写終結配列、ならびに最小限のｐＵＣバックボーンを含むプラスミドである。

「ｐＶ１ＪｎｓＣＭＶ（イントロンなし）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡ」は、ＣＭＶのイントロンＡ部分が除去され、および全長ＨＩＶ ｇａｇ遺伝子を含むｐＶ１ＪｎｓＨＩＶｇａｇに由来するプラスミドである。このプラスミドは、「ｐＶ１ＪｎｓＨＩＶｇａｇ−ｂＧＨｐＡ」、「ｐＶ１Ｊｎｓ−ｈＣＭＶ−ＦＬ−ｇａｇ−ｂＧＨｐＡ」および「ｐＶ１ＪｎｓＣＭＶ（イントロンなし）＋ＦＬｇａｇ＋ｂＧＨｐＡ」とも呼ばれる。

「ｐＶ１ＪｎｓＣＭＶ（イントロンなし）−ＦＬｇａｇ−ＳＰＡ」は、ＳＰＡ終止配列がｂＧＨｐＡの配列に取って代わった以外はｐＶ１ＪｎｓＣＭＶ（イントロンなし）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡと同じ構成のプラスミドである。このプラスミドは、「ｐＶ１Ｊｎｓ−ＨＩＶｇａｇ−ＳＰＡ」およびｐＶ１Ｊｎｓ−ｈＣＭＶ−ＦＬｇａｇ−ＳＰＡ」とも呼ばれる。

「ｐｄｅｌＥ１ｓｐ１Ａ」は、発現カセットを持たない（すなわちプロモーターまたはポリＡがない）汎用シャトルベクターであり、血清型５の野生型アデノウイルス（Ａｄ５）のｂｐ１からｂｐ３４１とｂｐ３５２４からｂｐ５７９８の配列を含む。このベタクーは、３４１ｂｐで終わり３５２４ｂｐで始まるＡｄ５配列の間にマルチクローニング部位を有する。このプラスミドは、元のＡｄ５シャトルベクターについてもいう。

「ＭＲＫｐｄｅｌＥ１ｓｐ１Ａ」または「ＭＲＫｐｄｅｌＥ１（Ｐａｃ／ｐＩＸ／ｐａｃｋ４５０）」または「ＭＲＫｐｄｅｌＥ１（Ｐａｃ／ｐＩＸ／ｐａｃｋ４５０）Ｃｌａ１」は、発現カセットを持たない（すなわちプロモーターまたはポリＡがない）汎用シャトルベクターであり、血清型５の野生型アデノウイルス（Ａｄ５）のｂｐ１からｂｐ４５０とｂｐ３５１１からｂｐ５７９８の配列を含む。このベクターは、４５０ｂｐで終わり３５１１ｂｐで始まるＡｄ５配列の間にマルチクローニング部位を有する。このシャトルベクターは、ＣＭＶプロモーターおよびｂＧＨｐＡ断片を、両者ともに、直線（「ｓｔｒ．」すなわちＥ１と平行）方向にまたは反対（ｏｐｐ．すなわちＥ１と逆平行）方向に挿入するために用い得る。

「ＭＲＫｐｄｅｌＥ１（Ｐａｃ／ｐＩＸ／ｐａｃｋ４５０）＋ＣＭＶｍｉｎ＋ＢＧＨｐＡ（ｓｔｒ．）」は、さらに別のシャトルベクターであり、このベクターは、ＣＭＶプロモーター（イントロンＡなし）およびｂＧＨｐＡ断片を含む改変されたベクターである。ｈＣＭＶプロモーター（イントロンＡなし）およびウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルを含む発現単位が、選択された遺伝子の唯一のＢｇｌＩＩ部位への挿入が、ＭＲＫｐＡｄ５（Ｅ１／Ｅ３＋）Ｃｌａ１プレプラスミド内に挿入されたとき、このトランスジーンの転写方向を確かなものとしＡｄ５ Ｅ１と平行になるように、シャトルベクター内に挿入されている。

「ＭＲＫｐｄｅｌＥ１−ＣＭＶ（イントロンなし）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡ」は、塩基対１から４５０および塩基対３５１１から５７９８のＡｄ５配列を含むシャトルであり、イントロンＡを含まないヒトＣＭＶ、ヒトにコドンが最適化された全長ＨＩＶ ｇａｇ遺伝子およびウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルを含む発現カセットを有する。このプラスミドは、「ＭＲＫｐｄｅｌＥ１シャトル＋ｈＣＭＶ−ＦＬ−ｇａｇ−ＢＧＨｐＡ」とも呼ばれる。

「ＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３＋ＣＭＶ（イントロンなし）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡ」は、Ｅ１領域（４５１から３５１０）を包含するヌクレオチド以外のＡｄ５配列のすべて、イントロンＡを含まないヒトＣＭＶプロモーター、ヒトにコドンが最適化された全長ＨＩＶ ｇａｇ遺伝子、およびウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルを含むアデノウイルスベクターである。このベクターは、「ＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３＋ｈＣＭＶ−ＦＬ−ｇａｇ−ＢＧＨｐＡ」、「ＭＲＫｐＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇ」、「ＭＲＫｐＡｄ５ｇａｇ」、「ｐＭＲＫＡｄ５ｇａｇ」または「ｐＡｄ５ｇａｇ２」とも呼ばれる。

（発明の詳細な説明）
ヒト免疫不全ウイルス（「ＨＩＶ」）に対する免疫応答を生じさせるための強化された方法が説明される。開示された方法は、着目ＨＩＶ抗原をコードする外来遺伝物質を投与する際、相互に取替え可能な異なる血清型の、組み換えアデノウイルス遺伝子送達媒体の組み合わせを採用する。本発明の方法に基によれば、第一の血清型の組み換えアデノウイルスベクターを用いて、初回処置投与量のＨＩＶ抗原を先ず供給する。この投与量によって、効果的に免疫応答をプライムできるので、循環する免疫系においてその後に抗原が同定されると、この免疫応答は、宿主内の抗原を直ちに認識して応答することができる。次いで、初回処置投与量の後に、この抗原をコードする外来遺伝物質を含有する、第二の異なる血清型のアデノウイルスの追加処置投与を行う。本発明の一つの側面において、血清型５または６の組み換えアデノウイルスベクターを含む初回処置投与量を先ず哺乳動物宿主に投与し、次いで異なる血清型（すなわち、初回処置投与で用いたもの以外の血清型（たとえばＡｄ３５が挙げられるがこれに限定されない）の組み換えアデノウイルスベクターを含む追加処置投与量を投与する。この極めて具体的な態様では、（１）Ａｄ５で初回処置された応答を、ＨＩＶ抗原を含む組み換えＡｄ６媒体で追加処置すること；（２）Ａｄ６で初回処置された応答を、ＨＩＶ抗原を含む組み換えＡｄ５媒体で追加処置すること；（３）Ａｄ５／Ａｄ６で初回処置された応答を、組み換え体のＡｄ３５に基づく媒体で追加処置すること；および（４）Ａｄ３５で初回処置された応答を、組み換え体のＡｄ５／Ａｄ６に基づく媒体で追加処置すること、が包含される。ＨＩＶ抗原に関し、本発明の方法に基づく投与は、接種された哺乳動物宿主内で見られる免疫応答を著しく高める、相加効果ではなく明らかに相乗効果もたらす。この効果は、接種後に生じる細胞性免疫応答において特に明白である。従って、開示された免疫化レジメによって、今まで感染していない個体に対する予防上の利点、およびウイルスが既に感染した個体におけるウイルス量のレベルを減少させることによる治療効果が提供され、それゆえにＨＩＶ−１感染の無症候期が延長する。

従って、本発明は、（ａ）Ｅ１の少なくとも一部が除去されてＥ１活性が欠失した、ＨＩＶ−１抗原または免疫学的関連性を有するその改変体をコードする遺伝子を含む、第一の血清型の組み換えアデノウイルスベクターを、哺乳動物宿主に接種する段階；およびその後に（ｂ）Ｅ１の少なくとも一部が除去されてＥ１活性が欠失し、ＨＩＶ−１抗原または免疫学的関連性を有するその改変体をコードする遺伝子を含む異なる第二の血清型の組み換えアデノウイルスベクターを含む追加免疫を、前記哺乳動物宿主に接種する段階、を含む、哺乳動物の宿主においてＨＩＶ−１抗原に対する強化された免疫応答を誘導する方法に関する。本発明の好ましい態様では、ベクターのＥ１活性を欠失（または本質的に欠失）させるＥ１領域における除去を有するという理由で、複製能を欠くアデノウイルスベクターが採用される。血清型５のアデノウイルスは、哺乳動物の宿主免疫応答の初回処置を十分に行うためにＨＩＶに特異的な抗原をコードする外来遺伝物質を十分に発現させるという目的にとって、極めて効果的なアデノウイルス媒体であることが分かった。血清型６の組み換えアデノウイルスが、血清型５のアデノウイルスで初回処置された応答を極めて効果的に追加処置する能力を有することが、さらに明らかになり、ここに開示された。他に採り得る筋書きにおいて、血清型５の組み換えアデノウイルスを用いて、血清型６のアデノウイルスで初回処置された応答を追加処置することができる。これらの発見は、異なるサブグループのアデノウイルス媒体（たとえばＡｄ５／６−初回（サブグループＣ）／Ａｄ３５−追加（サブグループＢ））を用いても示された。

野生型アデノウイルスの血清型５の配列は知られていて、この分野において記述されている（参照して本明細書に組み込まれるクロボチェックら、１９９２ Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８６： ２８０を参照すること）。従って、本発明の好ましい態様は、初回処置での投与または追加処置での投与において、血清型５の野生型アデノウイルスの配列に基づくアデノウイルス媒体を採用した免疫化スキームである。このウイルスの一つは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（「ＡＴＣＣ」）で、ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−５にて寄託されている。しかしながら、当業者であれば、相互に取替え可能な異なる血清型（たとえば、血清型２、４、６、１２、１６、１７、２４、３１、３３および４２）のアデノウイルスを容易に同定することができ、開示された異種の初回・追加免疫化スキームに同様に組み込むことができる。血清型６のアデノウイルス（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−６）の配列は、血清型５のアデノウイルスの配列に対して核酸レベルで極めて高い相同性（約９８％）を示し、約３６ｋｂの配列内で塩基対の違いは相対的にほとんどない。Ａｄ６のゲノム構成も非常に類似している（図１２を参照すること）。Ａｄ５またはＡｄ６のいずれかの血清型を決定するエピトープを保持するＡｄ５／Ａｄ６のキメラ構築物も、本発明において好ましく用いられる。ただし、血清型を決定するエピトープが、それと組み合わせて用いられるアデノウイルス媒体と区別可能である場合に限られる（すなわち、キメラが追加投与量で利用されるとき、決定基は、初回投与量にて用いられる媒体と区別可能である場合、およびその逆の場合に限られる）。初回処置のベクターおよび追加処置のベクターの血清型を区別可能とすることは、開示された方法を全般的に機能させることにとって重要である。

Ｅ１領域内の除去に加えてさらに除去を含む組み換えアデノウイルスベクターが、本発明の方法の範囲内で用いることも意図される。たとえば、Ｅ１およびＥ３の両方に欠失が含まれるベクターを、本発明の方法の範囲内で用いることが意図される。このようなベクターは、より多量の外来ＤＮＡ（すなわち外来遺伝物質）を収容する能力を持つ。

公知の技術（たとえば、参照して本明細書に組み込まれるヒット（Ｈｉｔｔ）ら、１９９７年、「哺乳動物細胞の中に遺伝子を導入するためのヒトアデノウイルスベクター（Ｈｕｍａｎ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ）」、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４０：１３７−２０６で概説された技術）を用いて、本発明の方法で用いられるアデノウイルスベクターを構築することができる。多くの場合、着目の特定のアデノウイルスに由来する配列を含むプラスミドまたはシャトルベクターが作製される。このプロセスは、上掲のヒットらに記載されている。

アデノウイルスバックボーン（たとえば、ＭＲＫＡｄ５ＨＶＥ３およびｐＭＲＫＡｄ６Ｅ１−、Ａｄ６のゲノムプラスミド）、および適切なシャトルベクターを用いた相同組み換えによって、アデノウイルスのプレプラスミド（たとえば、ｐＭＲＫＡｄ５ｇａｇおよびｐＭＲＫＡｄ６ｇａｇ）を作製することができる。得られた直鎖状のプラスミドは、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞またはその他の相補セルラインに入れた後に複製する能力を有し、ウイルスが生産される。次いで、ウイルスの複製が完了した後に、感染細胞および培地を回収する。

公知のセルライン２９３およびＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）を含む種々のＥ１を相補するセルラインウイルスベクターを増殖させることができる。これらのセルラインの両者は共に、アデノウイルスのＥ１の遺伝子産物を発現する。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）は、ＷＯ９７／００３２６号（１９９７年１月３日に公開されたもの）および発行された米国特許第６，０３３，９０８号に記載されており、これらの両者は参照して本明細書に組み込まれる。このものは、複製能を欠く（ＦＧ）アデノウイルスの産生を補うＥ１遺伝子セグメントが形質導入された初代ヒトレチノブラストセルラインであるが、相同組み換えによる複製能を有するアデノウイルスの出現を防ぐように設計されている。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）のように、４５９ｂｐから３５１０ｂｐまでの、ＡＤ５Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子をコードするトランスジーンを用いて、着目の特定細胞が安定的に形質転換された。２９３細胞は、グラハム（Ｇｒａｈａｍ）ら、１９７７ Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ ３６：５９−７２に記載されており、これは参照して本明細書に組み込まれる。上述のように、用いられる、相補するセルラインに存在するアデノウイルスの配列には配慮を払う必要がある。組み換えの可能性を最小限にしなければならない場合、配列が、ベクター内に存在する配列と重複しないことが好ましい。

本発明で用いる組み換えアデノウイルスベクターには、任意の抗原、特にＨＩＶ−１抗原または免疫学的関連性を有するその改変体をコードする遺伝子を含む。着目ＨＩＶ抗原としては、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびＥｎｖなどのＨＩＶの主要な構造タンパク質、免疫学的関連性を有する改変体、ならびに免疫原性を有するその部分が挙げられるが、これらに限定されない。従って、本発明は、コドンが最適化された種々の形態のＨＩＶ−１ ｇａｇ（コドンが最適化された全長（「ＦＬ」）Ｇａｇのｐ５５型およびｔＰＡ−Ｇａｇ融合タンパク質が含まれるが、これらに限定されない）、ＨＩＶ−１ ｐｏｌ、ＨＩＶ−１ ｎｅｆ、ＨＩＶ ｅｎｖ、および免疫学的関連性を有する選択された改変体が包含される。

着目タンパク質をコードする外来遺伝物質は発現カセットの形態で存在してもよい。遺伝子発現カセットは、（ａ）着目タンパク質をコードする核酸、（ｂ）そのタンパク質をコードする核酸が機能するように結合した異種（外来）プロモーターまたは改変された非外来プロモーター、および（ｃ）転写終結配列を含むものが好ましい。

転写プロモーターは、真核生物のＲＮＡポリメラーゼによって認識されるものが好ましい。好ましい態様において、プロモーターは「強力」または「効果的」なプロモーターである。強力なプロモーターの一例は、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター（チャップマン（Ｃｈａｐｍａｎ）ら、１９９１ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９： ３９７９−３９８６、これは参照して本明細書に組み込まれる）である。ある特定の態様においては、イントロン配列がない。本発明の特定の態様において、イントロンＡのようなイントロン配列がないヒトＣＭＶプロモーターが採用される。出願人らは、イントロンＡ、すなわちヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ｈＣＭＶ）の部分が、アデノウイルスベクターの不安定領域を構成していることを見出した。イントロンＡがないＣＭＶが、ＨＩＶ ｇａｇの発現をする場合、インビトロで同程度の発現能力を発揮すること、さらに、試験を行ったプラスミドＤＮＡの両方の投与量（２０μｇおよび２００μｇ）におけるそれらの抗体とＴ細胞の応答に関して、そのようなＣＭＶが、インビボのＢａｌｂ／ｃマウスにおけるイントロンＡを含む構築物と同等に機能することが、見出された。当業者であれば、その他の多数の公知のプロモーター、たとえば強力な免疫グロブリンプロモーター、またはその他の真核生物の遺伝子プロモーター、のいずれかを用いてもよいことを認識する。これらプロモーターには、ＥＦ１アルファプロモーター、マウスＣＭＶプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＳＶ４０初期／後期プロモーターおよびベータアクチンプロモーター等が含まれる。特定の実施態様において、プロモーターは、Ｔｅｔオペレーター配列などの制御可能な配列も含み得る。たとえば遺伝子産物が望んでいない結果をもたらし、抑制が求められる場合に、このことは、極めて有用であろう。遺伝子発現カセット内に存在する好ましい転写終結配列は、ウシ成長ホルモンの終結／ポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐＡ）、および長さが５０ヌクレオチドという短い合成ポリＡシグナル（ＳＰＡ）（このポリＡシグナルは次のように規定される：ＡＡＴＡＡＡＡＧＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＧＡＴＣＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧ（配列番号４））である。ＣＭＶプロモーター（イントロンＡ領域は欠失）とＢＧＨターミネーターとの組み合わせは、本発明の特定の側面を形成する。しかし、（その他のプロモーター／ターミネーターの組み合わせも用いることができる。特定の実施態様では、リーダーペプチドまたはシグナルペプチドがトランスジーン内に組み込まれている。好ましいリーダーは、組織特異的プラスミノゲンアクチベータータンパク質、すなわちｔＰＡに由来するものである。

本発明の方法によれば、外来ＨＩＶ遺伝物質の発現は、ウイルス感染が継続する可能性を小さくする、および／またはＨＩＶ感染の下によるウイルス量の臨床的に有意に減少したレベルの確立を導びくＨＩＶに対する細胞性免疫応答を強力かつ広範囲に惹起するはずであり、あるいはその発現をＨＡＡＲＴでの治療と組み合わせることで、既に成立したＨＩＶ感染の影響を緩和する（抗ウイルス免疫療法（ＡＲＩ））はずである。あらゆるＨＩＶ抗原（たとえば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｎｅｆ、ｇｐ１６０、ｇｐ４１、ｇｐ１２０、ｔａｔ、ｒｅｖなど）を、本発明の方法で用いられる組み換えウイルスベクターに組み込んでよいが、好ましい実施態様には、コドンが最適化されたｐ５５ ｇａｇ抗原、ｐｏｌおよびｎｅｆが挙げられる。本発明のアデノウイルスベクター媒体では、コドンが最適化されてもよく、またはされていなくてもよい異種の核酸を利用することができる。本発明の特定の実施態様において、コドンが最適化された異種の核酸を含むアデノウイルスベクターで個体を初回免疫し、コドンが最適化されていない核酸を含む相互に取替え可能血清型のアデノウイルスベクターで追加免疫することができる。複数の抗原を投与することには、コドンが最適化された配列およびコドンが最適化されていない配列の種々の異なる組み合わせを活用できる可能性がある。

ＨＩＶ−１の異なる系統分岐に基づいた配列は、本発明での使用に適したものであり、特に好ましいものは系統分岐Ｂおよび系統分岐Ｃである。特に好ましい実施態様は、コンセンサス系統分岐Ｂ配列に基づいた配列（特にコドンが最適化された配列）である。ウイルスワクチンの好ましい型は、ｐｏｌまたはｎｅｆの改変型をコードするものである。ＨＩＶエンベロープ遺伝子およびその改変体を保持するウイルスワクチンの好ましい実施態様のものには、それぞれ１９９７年８月２８日（ＷＯ９７／３１１１５号）および１９９７年１２月２４日に公開されたＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／０２２９４号およびＰＣＴ／ＵＳ９７／１０５１７号の、ＨＩＶコドンが最適化されたｅｎｖ配列が含まれる（両文献は参照して本明細書に組み込まれる）。

多数のＨＩＶ株の数多くの遺伝子配列が、ＧＥＮＢＡＮＫにおいて公的に入手可能であり、および最初にフィールドから分離されたＨＩＶは、これらの株が利用できるようにクオリティー・バイオロジカル（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）社（ゲーサーズバーグ、メリーランド州）と契約を締結した国立アレルギー感染病研究所（ＮＩＡＩＤ）から入手することができる。世界保健機構（ＷＨＯ）、ジュネーブ、スイスから株を入手することもできる。ＨＩＶ−１の株（ＣＡＭ−１；マイヤーズ（Ｍｙｅｒｓ）ら編、「ヒトレトロウイルスおよびＡＩＤＳ（Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ＡＩＤＳ）：１９９５年、ＩＩＡ３からＩＩＡ１９、これは参照して本明細書に組み込まれる）に由来するｇａｇ遺伝子が好ましい。この遺伝子は、系統分岐Ｂ（北米／欧州）配列についてのコンセンサスアミノ酸配列と極めてよく似ている。従って、特定のＨＩＶ ｇａｇ抗原、または免疫学的関連性を有するその部分をコードするヌクレオチド配列を適切に選択することは、当業者の範囲内である。ｐ５５ ｇａｇ抗原に基づく系統分岐Ｂまたは系統分岐Ｃは、地球的規模で有用となり得る。開示された方法の範囲内用いられるベクターへの挿入に最適なトランスジーンは、コドンが最適化された型のｐ５５ ｇａｇである。

組み換えアデノウイルスベクターによって送達される、着目の単一ＨＩＶ抗原に加えて、別々の媒体または同じ媒体のいずれかを介して、二以上の抗原を送達することができる。たとえば、本発明に基づく初回処置投与量は、ｎｅｆおよびｐｏｌの両方を、あるいは二以上の他に採り得るＨＩＶ−１抗原をコードする遺伝子を含む第一の血清型の組み換えアデノウイルスベクターを含み得る。次いで、追加処置投与量は、ｎｅｆおよびｐｏｌの両方をコードする遺伝子を含む第二の異なる血清型の組み換えアデノウイルスベクターを含み得る（またはいずれにせよ、二以上のＨＩＶ−１抗原が初回処置投与量において用いられた）。他に採り得る筋書きにおいて、初回処置投与量は、異なるＨＩＶ−１抗原をコードする遺伝子をそれぞれ含む別々のアデノウイルス媒体の混合物を含み得る。このような場合、追加処置投与量は、異なるＨＩＶ−１抗原をコードする遺伝子をそれぞれ含むベクターの混合物を、追加処置投与量として、初回処置投与量にて送達された抗原と同一のまたは類似の組み合わせの抗原をコードする遺伝物質を含む組み換えウイルスベクターを投与する場合に限り含み得る。上記の技術を組み合わせることによって、これらの二価（たとえば、ｇａｇとｎｅｆ、ｇａｇとｐｏｌ、またはｐｏｌとｎｅｆの成分など）ワクチンまたは三価（たとえばｇａｇ、ｐｏｌとｎｅｆの成分など）ワクチンをさらに投与することができる。従って、本発明の好ましい側面は、本発明の方法によって投与することができる種々のワクチン製剤である。ある特定の抗原から区別可能な複数の成分を含む複合様式のレジメを行うことも、本発明の範囲内である。

二以上の抗原から構成される融合体を採用する、開示される免疫化レジメもまた、ここに包含される。たとえば、複数のオープンリーディングフレームを含むプレウイルスプラスミドの作製に適したシャトルプラスミドに、複数のＨＩＶ−１ウイルス抗原が連結されてもよい。たとえば、三価のベクターにはｇａｇ−ｐｏｌ−ｎｅｆ融合体が含まれてもよく、あるいは、「２＋１」二価ワクチンが含まれてもよい。ここで、この二価ワクチンは、たとえば、ｇａｇ−ｐｏｌ融合体（たとえば、コドンが最適化されたｐ５５ ｇａｇおよび不活性化され最適化されたｐｏｌ）を含み、それぞれのオープンリーディングフレームが異なるプロモーターおよび転写終結配列に機能するように連結されている。あるいは、国際公開番号ＷＯ９５／２４４８５号（このものは参照して本明細書に組み込まれる）に開示されたように、配列内リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）が機能するように連結されたオープンリーディングフレームと共に、同じ構築物において二つのオープンリーディングフレームが単一のプロモーターに機能するように連結されてもよい。ＩＲＥＳに基づく技術が使えない場合、ベクターの安定性を最も高く維持できるように、異なるプロモーターが、それぞれのオープンリーディングフレームを支持するようにすることが好ましい。例示として、そして限定としてでは絶対なく、可能性のあるトランスジーンワクチンは、ｇａｇｐｏｌ融合体およびｎｅｆ遺伝子が同じベクター内に含まれ、ｇａｇｐｏｌ融合体およびｎｅｆ遺伝子について異なるプロモーター配列および終止配列が用いられたような、三種トランスジーンベクターを挙げ得る。さらに、可能性のある本発明の「２＋１」二価ワクチンは、別個のプロモーター配列および終止配列を有するｇａｇおよびｎｅｆを含む構築物と、それに組み合わせて投与される、プロモーター配列および終止配列を有するｐｏｌ遺伝子を含む構築物であリ得る。上記のｇａｇ−ｐｏｌ融合体以外の融合体も、種々の二価ワクチン計画に適しており、そのような融合体は、相互に融合した任意の二種のＨＩＶ抗原から構成され得る（たとえば、ｎｅｆ−ｐｏｌおよびｇａｇ−ｎｅｆ）。これらの組成物は、接種時に生じる免疫応答を多様化させるために、上記のように、追加のＨＩＶ抗原を含むウイルス組成物と一緒に送達されることが好ましい。従って、単独でまた多分第二のウイルスベクターと共に送達される多価ワクチンは、本発明の一部として確かに意図される。開示された組み換えアデノウイルスベクターについての挿入物を決定することに関して、しかしながら、ウイルス媒体の有効なパッケージング制限についての妥当な考慮が払われるべきである、ということに留意することが重要である。たとえば、アデノウイルスは、野生型のＡｄ５の配列の約１０５％のクローン化容量上限値を示すことが明らかにされている。

発現のために選択される遺伝子に関係なく、配列が、哺乳動物（たとえば、ヒトの、好ましくはアデノウイルス構築物の細胞環境内での発現のために「最適化」されることが好ましい。考えられる四種のヌクレオチド塩基の「トリプレット」コドンは、６４種の異形形態で存在し得る。これらの異形が、２０種のみの異なるアミノ酸（ならびに転写開始および転写終結）のメッセージを与えることは、いくつかのアミノ酸が二以上のコドンによってコードされることがあることを意味する。実際、いくつかのアミノ酸は六種もの「重複」した、代替可能なコドンを有している。その一方、その他のいくつかのものは唯一つの必須のコドンを有する。理由が完全に理解されているわけではないが、異なるタイプの細胞の内因性ＤＮＡにおいて代替可能なコドンがすべて均等に存在しているわけではなく、そしてあるタイプの細胞において特定のコドンに関しての気まぐれな自然の階層性または「好み」が存在するようである。一例として、アミノ酸ロイシンは、ＣＴＡ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＣＴＴ、ＴＴＡおよびＴＴＧ（これらはそれぞれ、ｍＲＮＡコドンＣＵＡ、ＣＵＣ、ＣＵＧ、ＣＵＵ、ＵＵＡおよびＵＵＧに対応する）を含む六種のＤＮＡコドンを指定している。微生物のゲノムのコドン頻度の徹底的な分析から、大腸菌の内因性ＤＮＡはロイシンを指定するコドンとしてＣＴＧを最も広く含み、一方酵母および粘菌ＤＮＡはロイシンを指定するコドンとしてＴＴＡを最も広く含むことが明らかになった。この階層性を考慮すると、大腸菌の宿主によってロイシンに富むポリペプチドを高レベルで発現させることの可能性は、コドンが用いられる頻度にある程度は依存するだろうことが一般的に考えられる。たとえば、ＴＴＡコドンに富む遺伝子は、大腸菌においてはほぼ確実に弱くしか発現されない。これに対してＣＴＧに富む遺伝子は、おそらくポリペプチドを多く発現する。同様に、酵母細胞が、ロイシンに富むポリペプチドを発現させるための計画された形質転換の宿主細胞である場合、挿入されたＤＮＡにおいて好ましく用いられるコドンはＴＴＡであろう。

組み換えＤＮＡ技術における、コドン優先現象の意味することは明らかであり、この現象は、形質転換が成功した宿主生物において、外来遺伝子を高レベルで発現させることに以前から数多く失敗していることの説明に役立ち得る−−より低い「優先」のコドンが挿入された遺伝子内に繰り返し存在する可能性があり、および発現のための宿主細胞の機構が効果的に機能しない可能性がある。この現象は、計画された宿主細胞の優先コドンが含まれるように設計された合成遺伝子が、組み換えＤＮＡ技術を実施するために外来遺伝物質の好ましい形態を提供することを、示唆する。このように、本発明の一つの側面は、ワクチン投与プロトコールであり、ここで、組み換えアデノウイルスベクター（初回免疫ベクターおよび追加免疫ベクター）は、コドンがヒトの細胞環境内での発現に最適化されている遺伝子を特定的に含む。本明細書で述べたように、本発明で用いるのに好ましい遺伝子は、コドンが最適化されたＨＩＶ遺伝子であり、特にＨＩＶ ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖまたはｎｅｆであるが、上で述べたように、本発明のアデノウイルス媒体は、コドンが最適化されてもよく、されていなくてもよい異種の核酸を利用することができる。本発明の特定の態様において、コドンが最適化された異種の核酸を含むアデノウイルスベクターを用いて個体を初回免疫することができ、およびコドン最適化されていない核酸を含む、相互に取替え可能な血清型のアデノウイルスを用いて追加免疫することができる。複数の抗原の投与は、コドンが最適化された配列およびコドンが最適化されていない配列の種々の異なる組み合わせを利用する可能性を有する。

本発明に基づく、初回処置または追加処置のいずれかの投与量の組み換えウイルスベクターを含むワクチン組成物は、生理的に許容され得る成分、たとえば緩衝液、標準的な生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水、ショ糖、その他の塩類およびポリソルベートを含み得る。好ましい一つの製剤は：２．５から１０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液、好ましくは約５ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液；２５から１００ｍＭのＮａＣｌ、好ましくは約７５ｍＭのＮａＣｌ；２．５から１０％のショ糖、好ましくは約５％のショ糖；０．０１から２ｍＭのＭｇＣｌ_２；および０．００１％から０．０１％のポリソルベート８０（植物に由来するもの）を含む。ｐＨの範囲は、約７．０から９．０とすべきであり、約８．０が好ましい。当業者は、その他の従来のワクチン用賦形剤を用いてこの製剤を調製してもよいことを認識する。好ましい製剤は、ｐＨが８．０であって、５ｍＭのＴＲＩＳ、７５ｍＭのＮａＣｌ、５％のショ糖、１ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．００５％のポリソルベート８０を含む。このもののｐＨと二価カチオン組成は、Ａｄ５およびＡｄ６が安定する最適条件に近く、およびウイルスがガラスの表面に吸着する可能性を最小化している。このものは筋肉注射時に組織の炎症を生じさせることがない。使用まで凍結することが好ましい。

ワクチンが接種される個体に導入されるワクチン組成物内のウイルス粒子の量は、用いられる転写プロモーターおよび翻訳プロモーターの強さと、発現される遺伝子産物の免疫原性に依存する。一般的に、１×１０^７から１×１０^１２粒子、好ましくは約１×１０^１０から１×１０^１１粒子の免疫学的または予防的に有効な投与量を、筋肉組織に直接投与する。皮下注射、皮内注射、皮膚を介する圧着、およびその他の投与形式、たとえば、腹腔内投与、静脈内投与または吸入による投与、も意図される。本発明のワクチン組成物を非経口的に導入するのと同時にまたはその後に、インターロイキン−１２タンパク質の非経口投与（たとえば、静脈内、筋肉内、皮下またはその他の投与手段）を行うことも有利である。

本発明の投与スキームは、ＨＩＶ抗原（一つまたは複数）をコードする遺伝子を含む第一の血清型のアデノウイルス媒体による免疫応答の初回処置と、所定の長さの時間の経過後の、アデノウイルスで初回処置された応答に対する、ＨＩＶ抗原（一つまたは複数）をコードする遺伝子を含む第二かつ相互に取替え可能な血清型のアデノウイルスによる追加処置に基づくものである。通常、複数回の初回処置（通常は１から４回）を用いるが、より多く用いてもよい。初回処置と追加処置との間の期間の長さは、通常、約四ヶ月から一年の間で変わることがあるが、その他の期間を用いてもよい。時間間隔を選択して、初回処理の投与量を繰り返してもよい。

大型のヒトおよび動物のデータは、ＨＩＶ感染の制御（または解消）における細胞性免疫応答、特にＣＴＬの重要性を支持している。ヒトにおいて、初感染の後に極めて高レベルのＣＴＬが生じ、および高いレベルのＣＴＬはウイルス血症の制御と関係がある。繰り返しＨＩＶにさらされたが、非感染のままである個体の小さな群が記載されている。これらの一団のいくつかにおいて、ＣＴＬが認められている。ＨＩＶ感染のＳＩＶモデルにおいて、初感染の後にＣＴＬが同様に生じ、および抗ＣＤ８モノクローナル抗体の添加によって、この感染の制御が破棄され、病気が進行に向かうことが示されている。

次の非限定的な実施例は本発明をより良く説明するために提供される。

ＨＩＶ−１ Ｇａｇ遺伝子
ヒトにおいて頻繁に用いられるコドンを利用して、ＨＩＶ−１のＣＡＭ−１株からＨＩＶ ｇａｇについての合成遺伝子を構築した；ケルバー（Ｋｏｒｂｅｒ）ら、１９９８年、ヒトレトロウイルスおよびＡＩＤＳ（Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ＡＩＤＳ）、ロスアラモス国立研究所、ロスアラモス、ニューメキシコ州；ならびにレース，アール（Ｌａｔｈｅ，Ｒ．）、１９８５ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８３：１−１２を参照すること。図２は、実施例の、コドンが最適化された全長型ｐ５５ ｇａｇのヌクレオチド配列を示している。系統分岐Ｂ（北米／欧州）配列（ロスアラモスＨＩＶデータベース）についてのコンセンサスアミノ酸配列と極めてよく似ているので、ＨＩＶ−１のＣＡＭ−１株のｇａｇ遺伝子を選択した。ワクチン成分としてのこの「コドンが最適化された」ＨＩＶ ｇａｇ遺伝子の利点は、マウスにおける免疫学的研究において実証されている。ＤＮＡワクチンとして送達した場合、「コドンが最適化された」ＨＩＶ ｇａｇ遺伝子の方が、野生型ＨＩＶ ｇａｇ遺伝子よりも、細胞性免疫を誘導することが５０倍以上強いことが示された。

発現を最適化するために、ｇａｇ遺伝子の開始ＡＴＧの上流にコザック配列（ＧＣＣＡＣＣ）を導入した。Ｖ１Ｊｎｓ−ＨＩＶ ｇａｇベクターから、ＰＣＲにより、コザック配列を伴うＨＩＶ ｇａｇ断片を増幅させた。ｐＶ１ＪｎｓＨＩＶｇａｇは、ＣＭＶ最初期（ＩＥ）プロモーターおよびイントロンＡ、コドンが最適化された全長ＨＩＶ ｇａｇ遺伝子、ウシ成長ホルモンに由来するポリアデニル化・転写終結配列、ならびに最小限のｐＵＣバックボーンを含むプラスミドである；プラスミドバックボーンの記述についてのモントゴメリー（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ）ら、１９９３ ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：７７７−７８３を参照すること。

アデノウイルス血清型５ベクター構築物の作製
Ａ．ｈＣＭＶプロモーターのイントロンＡ部分の除去
ｈＣＭＶプロモーターを増幅するための出発材料として、ＧＭＰグレードのｐＶ１ＪｎｓＨＩＶｇａｇを用いた。ｈＣＭＶプロモーターの両端に適切に配置したプライマーを用いて増幅を実施した。５’プライマーは、ｈＣＭＶプロモーターのＭｓｃ１部の上流側に設けられ、および（ＢｇｌＩＩ認識配列を含むように設計された）３’プライマーはｈＣＭＶプロモーターの３’の位置に設けられた。（高忠実度Ｔａｑポリメラーゼを用いて）得られた、（イントロンＡを除いた）ｈＣＭＶプロモーターの全体を包含するＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ ＰＣＲ平滑末端ベクター内にクローン化した。次いで、Ｍｓｃ１とＢｇｌＩＩとの二重消化によって除去した。次いで、この断片を当初のＧＭＰグレードのｐＶ１ＪｎｓＨＩＶｇａｇプラスミド内にクローン化して戻し、このプラスミドから、Ｍｓｃ１およびＢｇｌＩＩ消化の後に、当初のプロモーター、イントロンＡ、およびｇａｇ遺伝子が除去された。この連結反応の結果、当初のｐＶ１ＪｎｓＨＩＶｇａｇベクターバックボーン内に、ｈＣＭＶプロモーター（イントロンＡを除いた）＋ｂＧＨｐＡ発現カセットが構築された。このベクターをｐＶ１ＪｎｓＣＭＶ（イントロンなし）と称する。

ＢｇｌＩＩ消化を利用してｐＶ１ＪｎｓＨＩＶｇａｇからＦＬｇａｇ遺伝子を切り出し、この１，５２６ｂｐの遺伝子をゲルで精製し、そしてｐＶ１ＪｎｓＣＭＶ（イントロンなし）のＢｇｌＩＩ部位にクローン化した。Ｓｍａ１制限酵素を用いてコロニーを選別し、正しい配向性にてＦＬｇａｇ遺伝子を保持するクローンを特定した。ｐＶ１ＪｎｓＣＭＶ（イントロンなし）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡと称するこのプラスミド全体の配列を決定して、配列の完全性を確認した。

Ｂ．改変されたシャトルベクター−「ＭＲＫｐｄｅ１Ｅ１シャトル」の構築
当初のＡｄ５シャトルベクター（ｐｄｅ１Ｅ１ｓｐ１Ａ；塩基対１から３４１および塩基対３５２４から５７９８のＡｄ５配列を含むベクターを含み、Ａｄ５のヌクレオチドの３４１から３５２４の間のマルチクローニング領域を有するベクター）は、次のような連続したクローン化工程にて行われた、次の三種の改変を含んだ
（１）左側のＩＴＲ領域を延長して、ベクターバックボーンとアデノウイルスの左側のＩＴＲ配列との間にある接合部にＰａｃ１部位を含むようにした。これによって、細菌の相同組み換え系を用いてさらに簡単に操作することができる。
（２）パッケージング領域を延長して、野生型（ＷＴ）アデノウイルスの３４２ｂｐから４５０ｂｐまでの配列を含むようにした。
（３）ｐＩＸの下流領域を１３ヌクレオチド分（すなわちヌクレオチド３５１１から３５２３まで）延長した。

これらの改変（図４）によって、形質転換されたＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）セルライン内に存在するＥＬＡ／Ｅ１Ｂ遺伝子の部分を少しも重複させることなく、Ｅ１除去のサイズを効果的に縮小した。ＡｄシャトルベクターｐｄｅｌＥ１ｓｐ１Ａを改変することによって、すべての操作を実施した。

一旦シャトルベクターの改変が行われて、化学的にコンピテントな大腸菌ＢＪ５１８３細胞を用いる細菌の相同組み換えによって、当初のＡｄ５アデノベクターバックボーンｐＡｄＨＶＥ３の中にこの変化が組み込まれた。

Ｃ．改変されたアデノベクターバックボーンの構築
Ｅ１領域への改変が含まれるように、（Ｅ１領域を包含するヌクレオチド以外の、すべてのＡｄ５配列を含む）当初のアデノベクターｐＡＤＨＶＥ３を再構築した。新たに改変されたシャトルベクター（ＭＲＫｐｄｅｌＥ１シャトル）を、Ｐａｃ１およびＢｓｔＺ１１０１を用いて消化し、そしてアデノウイルス配列に対応する２，７３４ｂｐの断片を単離することによって、このことを達成した。Ｃｌａ１で直線化されたｐＡｄＨＶＥ３（Ｅ３＋アデノベクター）からのＤＮＡと共に、この断片の、大腸菌ＢＪ５１８３コンピテント細胞内への同時形質転換を行った。形質転換から少なくとも二つのコロニーを選択し、そしてＴｅｒｒｉｆｉｃ（商標）ブロス内で、濁度が到達するまで６から８時間培養した。それぞれの細胞ペレットからＤＮＡを抽出し、次いで大腸菌ＸＬ１コンピテント細胞内に形質転換した。形質転換からの一つのコロニーを選択し、プラスミドＤＮＡを精製するために培養した。制限消化によってプラスミドを分析し、正しいクローンを特定した。改変されたアデノベクターをＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３（Ｅ３＋プラスミド）と称した。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）セルライン内で、昔の型と同じく新規アデノベクター（ＭＲＫＨＶＥ３）からウイルスを作製した。加えて、当初のシャトルベクターのこのマルチクローニング部位は、ＣｌａＩ部位、ＢａｍＨＩ部位、ＸｈｏＩ部位、ＥｃｏＲＶ部位、ＨｉｎｄＩＩＩ部位、ＳａｌＩ部位、およびＢｇｌＩＩ部位を含んだ。このＭＣＳは、ＮｏｔＩ部位、ＣｌａＩ部位、ＥｃｏＲＶ部位およびＡｓｃＩ部位を含む新たなＭＣＳに取って代わられた。この新規ＭＣＳは、パッケージング領域およびｐＩＸ遺伝子になされた変異と共にＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３プレプラスミドに導入された。

Ｄ．改変されたｇａｇトランスジーンを含む新規シャトルベクター−「ＭＲＫｐｄｅｌＥ１−ＣＭＶ（イントロンなし）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡ」の構築
改変されたプラスミドｐＶ１ＪｎｓＣＭＶ（イントロンなし）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡをＭｓｃ１で一晩消化し、次いでＳｆｉ１で５０℃にて２時間消化した。次いで、ＤＮＡをダイズヌクレアーゼで３０℃にて３０分間処理した。Ｑｉａｅｘ ＩＩキットを用いてＤＮＡ混合物を脱塩し、次いでクレノウ処理を３７℃で３０分間実施し、トランスジーン断片の末端をすべて平滑化した。次いで、２，５５９ｂｐのトランスジーン断片をゲルで精製した。改変されたシャトルベクター（ＭＲＫｐｄｅｌＥ１シャトル）を、ＥｃｏＲＶによる消化によって直線化し、仔ウシの腸のホスファターゼで処理し、次いで、得られた６，４７９ｂｐの断片をゲルで精製した。次いで、二種の精製断片を互いに連結し、そして数ダースのクローンを選別してシャトルベクター内のトランスジーンの挿入について点検した。診断のための制限消化を実施して、Ｅ１と平行方向にてトランスジーンを保持するクローンを特定した。

Ｅ．ＭＲＫ ＦＧアデノベクターの構築
Ｅ１と平行方向にてＨＩＶ−１ ｇａｇトランスジーンを含むシャトルベクターのＭＲＫｐｄｅｌＥ１−ＣＭＶ（イントロンなし）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡをＰａｃ１で消化した。反応混合物をＢｓｆＺ１７１で消化した。５，２９１ｂｐの断片をゲル抽出によって精製した。ＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３プラスミドをＣｌａ１で３７℃にて一晩消化し、そしてゲルで精製した。約１００ｎｇの５，２９０ｂｐのシャトル＋トランスジーン断片と、約１００ｎｇの直線化されたＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３ ＤＮＡを、化学的にコンピテントな大腸菌ＢＪ５１８３細胞内に同時形質転換した。いくつかのクローンを選択し、そして２ｍＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ（商標）ブロス内で、濁度が到達するまで６から８時間培養した。Ｑｉａｇｅｎアルカリ溶解およびフェノールクロロホルム法を用いて、細胞ペレットからの全ＤＮＡを精製した。イソプロパノールにてＤＮＡを沈殿させ、そして２０μＬのｄＨ_２Ｏ内に再懸濁した。このＤＮＡの２μＬのアリコートを、大腸菌ＸＬ−１コンピテント細胞内に形質転換した。形質転換から単一のコロニーを選択し、そして３ｍＬのＬＢ＋１００μｇ／ｍＬのアンピシリン内で一晩培養した。Ｑｉａｇｅｎカラムを用いてこのＤＮＡを単離した。プラスミドバックボーンだけでなくｇａｇ遺伝子の内部も切断するという制限酵素ＢｓｔＥＩＩでの消化によって、一つの陽性クローンを特定した。このプレプラスミドクローンをＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３＋ＣＭＶ（イントロンなし）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡと称し、そのサイズは３７，４９８ｂｐである。

Ｆ．強化されたアデノウイルス構築物−「ＭＲＫ Ａｄ５ ＨＩＶ−１ｇａｇ」のウイルス作製
ＭＲＫ Ａｄ５ ＨＩＶ−１ ｇａｇは、新規Ｅ３＋アデノベクターバックボーンのＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３内に、Ｅ１と平行方向に挿入されたｈＣＭＶ（イントロンなし）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡトランスジーンを含む。我々は、このアデノベクターをＭＲＫ Ａｄ５ ＨＩＶ−１ ｇａｇと称した。以下にこの構築物の調製についての概略を説明する：
プレプラスミドＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３＋ＣＭＶ（イントロンなし）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡをＰａｃ１で消化してベクターバックボーンを切り離し、そしてリン酸カルシウム法（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ．）社）によって、約６０％のコンフルエンスのＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞を含む６ｃｍの皿内で、３．３μｇを形質移入した。一旦ＣＰＥが（７から１０日に）到達すると、培養物の凍結／解凍を三回行って、そして細胞残屑をペレット化した。この細胞溶解物の１ｍＬを用いて、６ｃｍの皿の中の、８０から９０％のコンフルエンスのＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞を感染させた。一旦ＣＰＥが到達すると、培養物の凍結／解凍を三回行い、細胞残屑をペレット化した。次いで、細胞溶解物を用いて、１５ｃｍの皿に含まれる８０から９０％のコンフルエンスのＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞を感染させた。この感染手順を続けて行い、６回の継代にまで拡大した。次いで、ＣｓＣｌ法によって細胞ペレットからウイルスを抽出した。バンド形成を二回実施した（３種の勾配のＣｓＣｌに続けて、ＣｓＣｌの連続的な勾配）。第二のバンド形成の後に、Ａ１０５緩衝液内でウイルスを透析した。プロナーゼ処理を利用し、次いでフェノール・クロロホルムによってウイルスＤＮＡを抽出した。次いで、ＨｉｎｄＩＩＩを用いてウイルスＤＮＡを消化し、そして［^３３Ｐ］ｄＡＴＰを用いて放射標識化した。ゲル電気泳動で消化産物を分離した後、そのゲルをワットマンろ紙上で乾燥させ、次いでオートラジオグラフィーの対象とした。この消化産物を、プレプラスミドからの消化産物（標識化の前にＰａｃ１／ＨｉｎｄＩＩＩで消化されたもの）と比較した。予想されたサイズが観察され、このことは、ウイルスの取り出しが成功したことを示した。

Ｇａｇの発現に関しては、ウエスタンブロット分析によって、すべてのウイルス構築物（アデノウイルスおよびポックスウイルス）を確認した。

血清型６のアデノウイルスのベクター構築物の作製
Ａ．Ａｄ６プレアデノウイルスプラスミドの構築
第一世代のＡｄ６ベクターを作製するために用いることができる、Ａｄ６に基づくプレアデノウイルスプラスミドを、Ａｄ５とＡｄ６との間の広範囲の配列の相同性（約９８％）を利用して構築した。相同組み換えを用いて、ｗｔＡｄ６配列を細菌のプラスミド内にクローン化した。

ｐＡｄ６Ｅ１−Ｅ３＋を細菌プラスミドとして回収するために用いる一般的なレジメを、図７で説明する。ｗｔＡｄ６の精製ウイルスＤＮＡと、Ａｄ５ ＩＴＲカセットと呼ばれる第二のＤＮＡ断片とによる細菌ＢＪ５１８３の同時形質転換によって、相同組み換えによるウイルスゲノムの環状化が達成された。ＩＴＲカセットは、細菌の複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミド配列によって切り離されたＡｄ５ゲノムの末端の右側（ｂｐ３３７９８から３５９３５）および左側（ｂｐ１から３４１およびｂｐ３５２５から５７６７）の配列を含んでいる。このＩＴＲカセットは、Ａｄ５の３４２から３５２４のＥ１配列が欠失している。ＩＴＲカセット内のＡｄ５配列によって、その中で組み換えが起こり得るＡｄ６の精製ウイルスＤＮＡとの相同性領域が提供される。

可能性のあるクローンを制限分析によって選別し、そして一つのクローンをｐＡｄ６Ｅ１−Ｅ３＋として選択した。次いで、このクローン全体の配列を決定した。ｐＡｄ６Ｅ１−Ｅ３＋は、Ａｄ５配列のｂｐ１から３４１およびｂｐ３５２５から５５４８、Ａｄ６のｂｐ５５４２から３３７８４、およびＡｄ５のｂｐ３３９６７から３５９３５（ｂｐの数は、Ａｄ５およびＡｄ６についての野生型の配列を引用している）を含んでいる。ｐＡｄ６Ｅ１−Ｅ３＋は、その血清型の特異性を構成するＡｄ６ビリオンのすべての構造タンパク質についてのコード配列を含んでいる。

Ｂ．ＨＩＶ−１ ｇａｇ遺伝子を含むＡｄ６プレアデノウイルスプラスミドの構築
（１）アデノウイルスシャトルベクターの構築：
コドンが最適化された全長ＨＩＶ−１ ｇａｇ合成遺伝子を、ＭＲＫｐｄｅｌＥ１（Ｐａｃ／ｐＩＸ／ｐａｃｋ４５０）＋ＣＭＶｍｉｎ＋ｂＧＨｐＡ（ｓｔｒ．）の中に挿入することによって、シャトルプラスミドＭＲＫｐｄｅｌＥ１（Ｐａｃ／ｐＩＸ／ｐａｃｋ４５０）＋ＣＭＶｍｉｎＦＬ−ｇａｇ−ｂＧＨｐＡを構築した。ＭＲＫｐｄｅｌＥ１（Ｐａｃ／ｐＩＸ／Ｐａｃｋ４５０）＋ＣＭＶｍｉｎ＋ｂＧＨｐＡ（ｓｔｒ．）は、Ｅ１配列のｂｐ４５１から３５１０が欠失したＡｄ５配列のｂｐ１から５７９２を含んでいる。ｈＣＭＶプロモーターおよびＢＧＨ ｐＡをＥ１の欠失部の中に、Ｅ１と平行方向にて、唯一のＢｇｌＩＩ部位が両者を隔てるように挿入した。プラスミドｐＶ１Ｊｎｓ−ＨＩＶ−ＦＬｇａｇ−ｏｐｔのＢｇｌＩＩ消化、ゲルでの精製、およびＭＲＫｐｄｅｌＥ１（Ｐａｃ／ｐＩＸ／ｐａｃｋ４５０）＋ＣＭＶｍｉｎ＋ｂＧＨｐＡ（ｓｔｒ．）中のＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位内への連結から、コドンが最適化された全長ＨＩＶ−１ ｇａｇ合成遺伝子を得、プラスミドＭＲＫｐｄｅｌＥ１（Ｐａｃ／ｐＩＸ／ｐａｃｋ４５０）＋ＣＭＶｍｉｎＦＬ−ｇａｇ−ｂＧＨｐＡを作製した。ＭＲＫｐｄｅｌＥ１（Ｐａｃ／ｐＩＸ／ｐａｃｋ４５０）＋ＣＭＶｍｉｎＦＬ−ｇａｇ−ｂＧＨｐＡの遺伝子構造をＰＣＲ分析、制限酵素分析およびＤＮＡ配列分析によって確認した。

（２）プレアデノウイルスプラスミドの構築：
シャトルプラスミドＭＲＫｐｄｅｌＥ１（Ｐａｃ／ｐＩＸ／ｐａｃｋ４５０）＋ＣＭＶｍｉｎＦＬ−ｇａｇ−ｂＧＨｐＡを、制限酵素Ｐａｃ１およびＢｓｔ１１０７Ｉで消化し、次いで、直線化された（ＣｌａＩで消化された）アデノウイルスバックボーンプラスミドｐＡｄ６Ｅ１−Ｅ３＋と共に、大腸菌ＢＪ５１８３株内に同時形質転換した。得られたｐＭＲＫＡｄ６ｇａｇ遺伝子構造を、制限酵素分析およびＤＮＡ配列分析によって確認した。大規模に生産するために、このベクターをコンピテントな大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅ内に形質転換した。回収されたプラスミドを、制限酵素消化分析とＤＮＡ配列分析によって、および一過性な形質移入細胞の培養でのｇａｇトランスジーンの発現によって確認した。

ｐＭＲＫＡｄ６ｇａｇは、Ａｄ５のｂｐ１から４５０とｂｐ３５１１から５５４８、Ａｄ６のｂｐ５５４２から３３７８４、およびＡｄ５のｂｐ３３９６７から３５９３５（ｂｐの数は、Ａｄ５およびＡｄ６についての野生型の配列を引用している）を含んでいる。このプラスミド内に、ウイルスのＩＴＲｓが細菌の複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミド配列によって連結されている。

Ｃ．リサーチグレードの組み換えＭＲＫＡｄ６ｇａｇの作製
前臨床免疫原性を研究するためのウイルスを作製するために、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）の接着性単層細胞培養中に、プレアデノウイルスプラスミドｐＭＲＫＡｄ６ｇａｇを感染性ビリオンとして取り出した。感染性ウイルスを取り出するために、１０μｇのｐＭＲＫＡｄ６ｇａｇを制限酵素ＰａｃＩ（ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）社）で消化し、そしてリン酸カルシウム共沈法（Ｃｅｌｌ Ｐｈｅｃｔ形質移入キット、アマシャム・ファルマシア・バイオテク社）を利用して、６ｃｍの皿の中のＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内に形質移入した。ＰａｃＩ消化によってプラスミド配列からウイルスのゲノムが切り離され、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞の中に入った後に、ウイルスの複製が可能になる。完全ウイルスによる細胞変性効果（ＣＰＥ）が観察された後、感染細胞および培地を回収した。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞を複数回継代することによって、ウイルスのストックを増幅させた。最後の継代から、ＣｓＣｌ超遠心分離法によって、細胞ペレットからウイルスを精製した。精製ウイルスＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ分析と、インビトロで培養したウイルス感染哺乳動物細胞に由来する培養上清のｇａｇのＥＬＩＳＡによって、精製ウイルスの特定と純度を確認した。制限分析のために、消化されたウイルスＤＮＡの末端をＰ^３３−ｄＡＴＰで標識化し、アガロースゲル電気泳動によってサイズ分画し、そしてオートラジオグラフィーによって可視化した。

Ｇａｇの発現に関して、ウエスタンブロット分析によってすべてのウイルス構築物（アデノウイルス５および６）を確認した。

免疫化
アカゲザルの体重を３から１０ｋｇの間であった。すべてのケースにおいて、それぞれのワクチンの全投与量を１ｍＬの緩衝液中に懸濁させた。アカゲザルを（ケタミン／キシラジンで）麻酔して、ワクチンを筋肉内に（「ｉ．ｍ．」）、すなわちツベルクリン用のシリンジ（ベクトン−ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）社、フランクリンレイクス、ニュージャージー州）を用いて、０．５ｍＬのアリコートを両方の三角筋内に投与した。免疫化レジメの期間中のいくつかの時点で集めた血液サンプルから末梢血単球（ＰＢＭＣ）を用意した。米国学術研究会議の研究用動物資源協会の、実験動物の世話と使用についてのガイド内に記載された原則に従って、研究機関の動物管理使用委員会に承認された基準に基づいて、すべての動物の世話と処置を行った。

ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
既に記述されたプロトコール（アレン（Ａｌｌｅｎ）ら、２００１ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（２）：７３８−７４９）に従い、いくつかの変更を加えて、アカゲザルについてのＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施した。抗原特異的な刺激のために、１０−アミノ酸（「ａａ」）の重複を伴った、全ＨＩＶ−１ ｇａｇ配列（シンペップ（Ｓｙｎｐｅｐ）社、ダブリン、カリフォルニア州）を包含する２０−ａａのペプチドから、ペプチドのプールを用意した。それぞれのウェルに、５０μＬの２から４×１０^５の末梢血単球（ＰＢＭＣｓ）を添加した。８０フェムトリットル（「ｆＬ」）より小さいサイズを切り捨てるように設定したＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｚ２粒子アナライザーを用いて、細胞数を計数した。５０μＬの培地、またはペプチドあたり８μｇ／ｍＬの濃度のｇａｇペプチドプールのいずれかを、ＰＢＭＣに添加した。このサンプルのインキュベーションを３７℃、５％のＣＯ_２にて２０から２４時間行った。それに応じて、スポットを展開し、そして特別注文のイメージング装置と、イメージプロ（ＩｍａｇｅＰｒｏ）（シルバースプリング、メリーランド州）のプラットフォームに基づいた自動計数サブルーチンを用いてプレートを処理した。細胞の投入量を１０^６として計測値を標準化した。

抗ｐ２４のＥＬＩＳＡ
Ｃｏｕｌｔｅｒ ｐ２４抗原アッセイキット（ベックマン・クールター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）社、フラートン、カリフォルニア州）からの試薬を用いて、改変された競合的抗ｐ２４アッセイを開発した。簡単に言えば、２５０μＬの血清サンプルに、２０μＬの溶解緩衝液および１５μＬのＣｏｕｌｔｅｒキットからのｐ２４抗原（９．３７５ｐｇ）を追加した。混合後、２００μＬのそれぞれのサンプルを、Ｃｏｕｌｔｅｒキットからのマウス抗ｐ２４ ｍＡｂで被覆したウェルに添加し、３７℃で１．５時間のインキュベーションを行った。次いで、このウェルを洗浄し、そしてＣｏｕｌｔｅｒキットからのビオチン試薬（ポリクローナル抗ｐ２４ビオチン）の２００μＬを、それぞれのウェルに添加した。３７℃でのインキュベーションの１時間後、ストレプトアビジン結合ホースラディシュペルオキシダーゼとＴＭＢ基質とを用いて、Ｃｏｕｌｔｅｒキットに記載されたようにして検出を行った。ＯＤ_{４５０ｎｍ}の値を記録した。ＨＩＶ−血清反応陽性の個体からの血清を連続的に２倍ずつ希釈したものを用いて、７点の標準曲線を作製した。アッセイについての切捨ての下限値は、自由に裁量して、血清反応陽性なヒトの血清の希釈によって規定された１０ミリメルク（Ｍｅｒｃｋ）単位／ｍＬ（ｍＭＵ／ｍＬ）に設定する。この切捨ては、希釈物の対照のみから得られ、陽性の検体では得られないシグナルに対応する最大限に結合した対照シグナルの約６５％にまで低下する。

細胞内サイトカインの染色
抗−ｈＣＤ２８モノクローナル抗体（クローンＬ２９３、ベクトン−ディッキンソン社）および抗ｈＣＤ４９ｄモノクローナル抗体（クローンＬ２５、ベクトン−ディッキンソン社）を、最終濃度が１μｇ／ｍＬとなるように、（１７×１００ｍｍの丸底のポリプロピレン製試験管（ザルスタット（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）社、ニュートン、ノースカロライナ州）の中にある）２×１０^６ＰＢＭＣ／ｍＬの完全ＲＰＭＩ培地の１ｍＬに添加した。ｇａｇ特異的な刺激のために、１０μＬのペプチドプール（ペプチドにつき０．４ｍｇ／ｍＬ）を添加した。この試験管のインキュベーションを３７℃で１時間行った。その後、２０μＬの５ｍｇ／ｍＬのブレフェルジンＡ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社）を添加した。細胞のインキュベーションを３７℃で１６時間、５％のＣＯ_２、９０％の湿度にて行った。４ｍＬの冷ＰＢＳ／２％のＦＢＳをそれぞれの試験管に添加し、そして細胞を１２００ｒｐｍにて１０分間でペレット化した。細胞をＰＢＳ／２％のＦＢＳ中に再懸濁させ、そしていくつかの蛍光性のタグが付けられたｍＡｂｓを用いて表面マーカーのために染色した（３０分間、４℃）：試験管あたり２０μＬの抗ｈＣＤ３−ＡＰＣ・クローンＦＮ−１８（バイオソース（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）社）；２０μＬの抗ｈＣＤ８−ＰｅｒＣＰ・クローンＳＫ１（ベクトン−ディッキンソン社）；および２０μＬの抗ｈＣＤ４−ＰＥ・クローンＳＫ３（ベクトン−ディッキンソン社）。この段階から、暗所でサンプルを扱った。細胞を洗浄し、そして７５０μＬの１×ＦＡＣＳ Ｐｅｒｍ緩衝液（ベクトン−ディッキンソン社）中で１０分間、室温にてインキュベーションを行った。細胞をペレット化し、そしてＰＢＳ／２％のＦＢＳ中に再懸濁させ、そして０．１μｇのＦＩＴＣ−抗ｈＩＦＮ−γ・クローンＭＤ−１（バイオソース社）を添加した。３０分間のインキュベーションの後、細胞を洗浄してＰＢＳ中に再懸濁させた。ベクトン−ディッキンソン社のＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ装置の四色のチャネルのすべてを用いて、サンプルを分析した。データを解析するために、最初に、リンパ球の集団を底部側方散乱光および前方散乱光のゲートで制御され、そしてサイトカインに陽性な事象について遮断される共通する蛍光を、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋の両集団のために、ならびにサンプルの試験管の偽薬およびｇａｇ−ペプチドの両者のために使用した。

結果
Ａ．免疫化レジメ
コドンが最適化された同一ＨＩＶ−１ ｇａｇを発現するＭＲＫＡｄ５ベクターおよびＭＲＫＡｄ６ベクターを含む同種および異種の初回・追加免疫レジメとに従って、３から６匹のアカゲザルの一団を免疫化した。免疫化のスケジュールを表１に記載する。

Ｂ．Ｔ細胞免疫応答
ワクチンで誘導されるＨＩＶ−１ ｇａｇに対するＴ細胞の応答を、タンパク質全配列を包含する２０−ａａのペプチドプールに対するＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを利用して定量した。結果を図５に示す。１００万の末梢血単球（ＰＢＭＣｓ）あたりのスポットを形成する細胞（ＳＦＣ）の数として表されており、ペプチドプールから偽薬の対照を差し引いたものに対応する。

この図は、１０ｅ９ｖｐのＭＲＫＡｄ５−ＨＩＶｇａｇによる二回の初回処置免疫化と、それに続く、長期の休止後（２０から２３週間の期間；ＭＲＫＡｄ６−ＭＲＫＡｄ６の被験体については２２週間；ＭＲＫＡｄ５−ＭＲＫＡｄ５群の被験体の９９Ｄ２６２、９９Ｃ１１７および９９Ｄ２２７については２２週間；そして残りの被験体については２３週間）の１０ｅ９ｖｐのＭＲＫＡｄ５−ＨＩＶｇａｇでの追加免疫によって誘導されたＴ細胞の応答を示す図である。約６ヶ月目に同じ投与量のＭＲＫＡｄ５ ＨＩＶ−１ ｇａｇを投与した結果、追加免疫の直前のレベルよりもわずかに上昇した；追加免疫後のレベルは、追加免疫前の最高レベルより低いレベルでないとしても、追加免疫前の最高レベルにおおむね匹敵していた。これは、最初の二回の免疫化によって生成されたベクターに対する中和免疫の存在が多分原因であろう。追加免疫後の応答は、６匹のサルのすべてについての平均として１０ｅ６のＰＢＭＣあたり２７５ＳＦＣであり、１０ｅ６のＰＢＭＣあたり５００のｇａｇ特異的Ｔ細胞を上回ることはなかった。１０ｅ９ｖｐのＭＲＫＡｄ６ ＨＩＶ−１ ｇａｇを三回（０ヶ月目、１ヶ月目、６ヶ月目）にサルに与えた場合、同様の結果が見られた。三匹のサルのうちの二匹において、追加免疫後のレベルは１０ｅ６のＰＢＭＣあたり５００ＳＦＣを上回ることはなかった。対照的に、二回の初回処置投与量の１０ｅ９ｖｐのＭＲＫＡｄ５−ＨＩＶｇａｇと、１０ｅ９ｐｆｕのＭＲＫＡｄ６−ＨＩＶｇａｇでの追加の一回接種を動物に与えるという両者の様式を組み合わせると、３匹のサルのすべてについての平均として１０ｅ６のＰＢＭＣあたり１０００ＳＦＣを超える最高点の応答にまで、ｇａｇ特異的Ｔ細胞のレベルが上昇した。ＭＲＫＡｄ５−ｇａｇで効果的に初回免疫された免疫応答を、さらに効果的に追加免疫するというＭＲＫＡｄ６−ＨＩＶｇａｇの能力は、最初の二回の免疫化によって生成されたＭＲＫＡｄ５ベクターに対する中和免疫の存在に起因するであろう。初回免疫された応答を追加免疫するというＡｄ６の能力も、より少量の初回処置投与量の１０^７ｖｐのＭＲＫＡｄ５ ＨＩＶ−１ ｇａｇを用いることで明らかとなった（図６）。

異種のＭＲＫＡｄ５で初回免疫しＭＲＫＡｄ６で追加免疫するレジメのワクチン接種を受けた個体からのＰＢＭＣｓを分析した。ここで、初回処置免疫化（１３週目）の後の、および追加処理免疫化（３１週目）の後の細胞内ＩＦＮ−γ染色について分析した。このアッセイから、末梢血におけるＣＤ４^＋ｇａｇ特異的Ｔ細胞およびＣＤ８^＋ｇａｇ特異的Ｔ細胞の相対量に関する情報が提供された（表２）。この結果から、異種のプライム・ブースト免疫化のアプローチによって、アカゲザルのＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＨＩＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の両者を惹起できることが示された。

Ｃ．体液性免疫応答
それぞれの動物についてのいくつかの時点におけるｐ２４特異的抗体の力価を測定した。それぞれの一団の幾何平均力価を計算し、図１０に示した。ＭＲＫＡｄ５ ＨＩＶ−１ ｇａｇまたはＭＲＫＡｄ６ ＨＩＶ−１ ｇａｇの二種の投与量によって、中程度のレベルの抗ｐ２４抗体（約１０００ｍＭＵ／ｍＬ）を誘導することができた。
同じウイルスベクターの追加投与の結果、体液性免疫応答が５から１０倍上昇した。ＭＲＫＡｄ５ ＨＩＶ−１ ｇａｇで初回免疫されたサルをＭＲＫＡｄ６−ｇａｇで追加免疫した結果、抗体レベルが同程度となった。しかしながら、Ａｄ５に特異的な活性の何らかによる有意な中和による否定的な影響をその効果が被る可能性があるので、同じウイルスで追加免疫を行うことには制限があり得る。対照的に、血清型が適合しないＡｄの追加免疫による効果は、Ａｄ５に向けられた予め存在する何らかの中和力価によっては影響を受けない。

血清型６の完全なアデノウイルスベクター構築物の作製
Ａ．完全なＡｄ６プレアデノウイルスプラスミドの構築
Ａｄ５とＡｄ６との間の相同性を利用して構築するのではなく、Ａｄ６配列から、Ａｄ６に基づくプレアデノウイルスプラスミドを得る。このプラスミドを用いて第一世代のＡｄ６ベクターを作製し得る。相同組み換えを用いて、ｗｔＡｄ６配列を細菌のプラスミド内にクローン化する。

このようなｐＭＲＫＡｄ６Ｅ１−細菌プラスミドを回収するために用いる一般的な計画を、図１３で説明する。基本的に、ｗｔＡｄ６の精製ウイルスＤＮＡと、Ａｄ６ ＩＴＲカセットと呼ばれる第二のＤＮＡ断片とによる細菌ＢＪ ５１８３の同時形質転換によって、相同組み換えによるウイルスゲノムの環状化が達成されよう。ＩＴＲカセットは、細菌の複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミド配列によって分離されたＡｄ６ゲノムの末端の右側（ｂｐ３５４６０から３５７５９）および左側（ｂｐ１から４５０およびｂｐ３５０８から３８０７）からの配列を含んでいる。これら三つのセグメントをＰＣＲによって作成しｐＮＥＢ１９３（一般的に用いられている市販のクローニングプラスミド（ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）社のカタログ番号Ｎ３０５１Ｓ）、細菌の複製起点、アンピシリン耐性遺伝子およびＰＣＲ産物がその中に導入されるマルチクローニング部位を含む）内に順番にクローン化してｐＮＥＢＡｄ６−３（ＩＴＲカセット）を得た。このＩＴＲカセットは、Ａｄ５の４５１から３５０７のＥ１配列が欠失している。ＩＴＲカセット内のＡｄ６配列によって、その中で組み換えが起こり得るＡｄ６の精製ウイルスＤＮＡとの相同性領域が提供される。

したがって、ＰＭＲＫＡｄ６Ｅ１−を用いて、先述の実施例に記載されたような、Ｅ１内にトランスジーンを含む第一世代のＡｄ６ベクターを作製することができる。

インビボ免疫原性
Ａ．免疫化
アカゲザルの体重は３から１０ｋｇの間であった。すべてのケースにおいて、それぞれのワクチンの全投与量を１ｍＬの緩衝液中に懸濁させた。アカゲザルを（ケタミン／キシラジンで）麻酔して、ワクチンをｉ．ｍ．にて、ツベルクリン用のシリンジ（ベクトン−ディッキンソン社、フランクリンレイクス、ニュージャージー州）を用いて、０．５ｍＬのアリコートを両方の三角筋内に投与した。免疫化計画の期間中のいくつかの時点で集めた血液サンプルから末梢血単球（ＰＢＭＣ）を用意した。米国学術研究会議の研究用動物資源協会の、実験動物の世話と使用についてのガイド内に記載された原則に従って、研究機関の動物管理使用委員会に承認された基準に基づいて、すべての動物の世話と処置を行った。

Ｂ．ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
既に記述されたプロトコール（アレンら、２００１ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（２）：７３８−７４９）に従い、いくつかの変更を加えて、アカゲザルについてのＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施した。抗原特異的な刺激のために、１０−ａａの重複を伴った、ＨＩＶ−１ ｇａｇ配列の全体（シンペップ社、ダブリン、カリフォルニア州）を包含する２０−ａａのペプチドから、ペプチドのプールを用意した。それぞれのウェルに、５０μＬの２から４×１０^５の末梢血単球（ＰＢＭＣｓ）を添加した；８０ｆＬより小さいサイズを切り捨てるように設定したＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｚ２粒子アナライザーを用いて、細胞を計数した。５０μＬの培地、またはペプチドあたり８μｇ／ｍＬの濃度のｇａｇペプチドプールのいずれかを、ＰＢＭＣに添加した。このサンプルのインキュベーションを３７℃、５％のＣＯ_２にて２０から２４時間行った。それに応じて、スポットを展開し、そして特別注文のイメージング装置と、イメージプロ（シルバースプリング、メリーランド州）のプラットフォームに基づいた自動計数サブルーチンを用いてプレートを処理した；細胞の投入量を１０^６として計測値を標準化した。
Ｃ．結果
異種ブースターとしてのまれな血清型のワクチンベクター。 三匹のアカゲザルの一団を、最初に１０^８ｖｐのＭＲＫＡｄ５−ｇａｇの３回の投与量（０週目、４週目、１６週目）によって免疫化した。５９週目に、１０^１０ｖｐのＡｄ３５ΔＥ１ｇａｇΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６（Ｅ１欠失（Ａｄ３５のｂｐｓ４５７から３４０２）を含むように工作され、およびＡｄ５ Ｏｒｆ６で置換されたＥ４ Ｏｒｆ６（Ａｄ３５のｂｐｓ３１９１２から３４４１８）が欠失したＡｄ３５ウイルス）のワクチンの追加免疫を動物に与えた。未処置の動物の別個の一団には、追加免疫用のワクチンを単回投与した。研究過程の間に集められたＰＢＭＣのＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ分析の結果を表３に示す。

Ａｄ３５に基づくＨＩＶベクターは、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞の既存プールを拡大することに利用できることは明らかである。追加免疫前のレベルから、追加免疫から４週後に測定されたレベルへのｇａｇ特異的Ｔ細胞のレベルの上昇は、未処置の動物において同じブースター用のワクチンによって誘導されたレベルよりも常に大きいものであった。

図１は、ＨＩＶ−１ ｇａｇアデノベクター「ＡＤ５ＨＩＶ−１ｇａｇ」を示す図である。このベクターは、１９９９年７月６日に出願された米国仮出願第６０／１４２，６３１号、および１９９９年８月１３日に出願された米国出願第６０／１４８，９８１号についての優先権が主張された、２０００年７月３日に出願されたＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ００／１８３３２号（ＷＯ０１／０２６０７号）に開示されており、三件の出願のすべては参照して本明細書に組み込まれる。 図２は、最適化されたヒトのＨＩＶ−１ ｇａｇのオープンリーディングフレームの核酸配列を示す図である（配列番号１）。 図３は、２００１年９月１４日に出願されたＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／２８８６１号に開示されたトランスジーン構築物の概略を、元のｇａｇトランスジーンと比較して示す図である。ＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／２８８６１号は、それぞれ２０００年９月１５日、２００１年３月２７日、および２００１年９月７日に出願された米国仮出願第６０／２３３，１８０号、第６０／２７９，０５６号、および第６０／３１７，８１４号についての優先権を主張している；上記の出願のすべては参照して本明細書に組み込まれる。 図４は、ＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／２８８６１号に開示されたベクターを作製する際のＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇのアデノベクターバックボーンになされた改変を示す図であり、かかるベクターは本発明の特定の例において利用される。 図５は、（ａ）１０ｅ９ ｖｐのＭＲＫＡｄ５ ＨＩＶ−１ ｇａｇによる二回の初回処置投与と、１０ｅ９ ｖｐ ＭＲＫＡｄ５ ＨＩＶ−１ ｇａｇによる一回の追加処置（「１０ｅ９ ｖｐ ＭＲＫＡｄ５−１０ｅ９ ｖｐ ＭＲＫＡｄ５」）；（ｂ）１０ｅ９ ｐｆｕ ＭＲＫＡｄ６ ＨＩＶ−１ ｇａｇによる二回の初回処置投与と、１０ｅ９ ｐｆｕ ＭＲＫＡｄ６ ＨＩＶ−１ ｇａｇによる一回の追加処置（「１０ｅ９ ｐｆｕ ＭＲＫＡｄ６−１０ｅ９ ｐｆｕ ＭＲＫＡｄ６」）；または（ｃ）１０ｅ９ ｖｐ のＭＲＫＡｄ５ ＨＩＶ−１ ｇａｇによる二回の初回処置投与と、それに続く１０ｅ９ ｐｆｕ ＭＲＫＡｄ６ ＨＩＶ−１ ｇａｇによる一回の追加処置（「１０ｅ９ ｖｐ ＭＲＫＡｄ５−１０ｅ９ ｐｆｕ ＭＲＫＡｄ６」）で免疫化されたアカゲザルにおけるＧａｇ特異的Ｔ細胞のレベルを示す図である。１００万ＰＢＭＣあたりのスポットを形成する細胞（ＳＦＣ）の数として表されるレベルは、免疫化レジメの開始前（「処置前」）；最初の初回処置投与から４週間後（「投与１後」）；第二の初回処置投与から４週間後（「投与２後」）；ブーストの直前（「ブースト前」）；追加から４週間後（「ブースト後４週目」）；およびブーストから８週間後（「ブースト後８週目」）のそれぞれの動物について、偽薬補正がなされた値である。 図６は、１０ｅ７ ｖｐの投与量のＭＲＫＡｄ５ ＨＩＶ−１ ｇａｇ（０週目；４週目）での二回の初回処置投与、次いで２７週目での１０ｅ７ ｖｐ ＭＲＫＡｄ６ ＨＩＶ−１ ｇａｇの投与によって誘導されるＧａｇ特異的Ｔ細胞の応答を示す図である。提供されたレベルは、免疫化レジメの開始前（「処置前」）；最初の初回処置投与から４週間後（「投与１後」）；第二の初回処置投与から４週間後（「投与量２後」）；追加処置の直前（「ブースト前」）；追加処置から４週間後（「ブースト後４週目」）；および追加処置から８週間後（「ブースト後８週目」）の、それぞれの動物について、偽薬補正がなされたレベルである。追加処置直前のレベルと比較して有意に上昇していることに留意すべきである。ＭＲＫＡｄ６ ＨＩＶ−１ ｇａｇは、初回処置応答の大幅な増幅を惹起し、１０００ＳＦＣ／１０ｅ６ＰＢＭＣという高いレベルにまで達した。追加処置のために用いるＭＶＡの投与量では、未処置の動物においてはわずかなまたは検出できない程度の免疫応答しか誘導しない（図５を参照すること）ので、示されたような追加処置後の増加の大部分は、あらたなリンパ球のプライムによるものではなく、記憶Ｔ細胞の増殖によるものと考えられる。 図７は、本明細書で開示されたｐＡｄＥ１−Ｅ３を回収するために利用される相同組み換えのプロトコールを示す図である。 図８は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターの制限酵素地図を示す図である。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図９Ａ−１から図９Ａ−４５は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２［コード配列］および配列番号３［非コード配列］）。 図１０は、（ａ）１０ｅ９ ｖｐのＭＲＫＡｄ５ ＨＩＶ−１ ｇａｇによる二回の初回処置投与と、１０ｅ９ ｖｐ ＭＲＫＡｄ５ ＨＩＶ−１ ｇａｇによる一回の追加処置（「１０ｅ９ ｖｐ ＭＲＫＡｄ５−１０ｅ９ ｖｐ ＭＲＫＡｄ５」）、（ｂ）１０ｅ９ ｐｆｕ ＭＲＫＡｄ６ ＨＩＶ−１ ｇａｇによる二回の初回処置投与と、１０ｅ９ ｐｆｕ ＭＲＫＡｄ６ ＨＩＶ−１ ｇａｇによる一回の追加処置（「１０ｅ９ ｐｆｕ ＭＶＡ−１０ｅ９ ｐｆｕ ＭＲＫＡｄ６」）、または（ｃ）１０ｅ９ ｖｐのＭＲＫＡｄ５ ＨＩＶ−１ ｇａｇによる二回の初回処置投与と、それに続く１０ｅ９ ｐｆｕ ＭＶＡ ＨＩＶ−１ ｇａｇによる一回の追加処置（「１０ｅ９ ｖｐ ＭＲＫＡｄ５−１０ｅ９ ｐｆｕ ＭＲＫＡｄ６」）で免疫化されたアカゲザルにおけるＧａｇ特異的Ｔ細胞のレベルを示す図である。免疫化レジメの開始時（「処置前」）、最初のプライム処置投与から４週間後（「４週目」）、第二の初回処置投与から４週間後（「８週目」）、ブーストの直前（「ブースト前」）、および追加から８週間後（「ブースト後」）のそれぞれの一団について、幾何平均力価で示されている。 図１１Ａ−１から１１Ａ−１４は、Ａｄ６のゲノムについての核酸配列を示す図である（配列番号５）。 図１１Ａ−１から１１Ａ−１４は、Ａｄ６のゲノムについての核酸配列を示す図である（配列番号５）。 図１１Ａ−１から１１Ａ−１４は、Ａｄ６のゲノムについての核酸配列を示す図である（配列番号５）。 図１１Ａ−１から１１Ａ−１４は、Ａｄ６のゲノムについての核酸配列を示す図である（配列番号５）。 図１１Ａ−１から１１Ａ−１４は、Ａｄ６のゲノムについての核酸配列を示す図である（配列番号５）。 図１１Ａ−１から１１Ａ−１４は、Ａｄ６のゲノムについての核酸配列を示す図である（配列番号５）。 図１１Ａ−１から１１Ａ−１４は、Ａｄ６のゲノムについての核酸配列を示す図である（配列番号５）。 図１１Ａ−１から１１Ａ−１４は、Ａｄ６のゲノムについての核酸配列を示す図である（配列番号５）。 図１１Ａ−１から１１Ａ−１４は、Ａｄ６のゲノムについての核酸配列を示す図である（配列番号５）。 図１１Ａ−１から１１Ａ−１４は、Ａｄ６のゲノムについての核酸配列を示す図である（配列番号５）。 図１１Ａ−１から１１Ａ−１４は、Ａｄ６のゲノムについての核酸配列を示す図である（配列番号５）。 図１１Ａ−１から１１Ａ−１４は、Ａｄ６のゲノムについての核酸配列を示す図である（配列番号５）。 図１１Ａ−１から１１Ａ−１４は、Ａｄ６のゲノムについての核酸配列を示す図である（配列番号５）。 図１１Ａ−１から１１Ａ−１４は、Ａｄ６のゲノムについての核酸配列を示す図である（配列番号５）。 図１２は、Ａｄ６の基本的なゲノム構成を示す図である。直鎖状二本鎖ＤＮＡゲノム（３５７５９ｂｐ）が二本の平行な直線で示されており、１００地図単位に分割されている。転写単位の、ゲノム内での相対的な位置と方向が示されている。初期遺伝子（Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ／Ｂ、Ｅ３およびＥ４）は灰色の棒で示されている。後期遺伝子（Ｌ１からＬ５）（黒色の棒で示されている）は、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）から形成される転写物の選択的スプライシングによって生じ、そしてこれらのすべてはその５’末端にトリパータイトリーダー（１、２、３）を有する。 図１３は、ｐＭＲＫＡｄ６Ｅ１−を回収するために利用される相同組み換えのプロトコールを示す。

Claims (30)

1. 次の工程：
   （ａ）Ｅ１の少なくとも一部が除去されてＥ１活性が欠失した、ＨＩＶ−１抗原または免疫学的関連性を有するその改変体をコードする遺伝子を含む、第一の血清型の組み換えアデノウイルスベクターを、哺乳動物宿主に接種する段階、およびその後に
   （ｂ）Ｅ１の少なくとも一部が除去されてＥ１活性が欠失した、ＨＩＶ−１抗原または免疫学的関連性を有するその改変体をコードする遺伝子を含む、第二の血清型の組み換えアデノウイルスベクターを含む追加免疫を、前記哺乳動物宿主に接種する段階、
   を含む、哺乳動物宿主においてＨＩＶ−１抗原に対する強化された免疫応答を誘導する方法。
2. 前記ＨＩＶ−１抗原がＨＩＶ−１ ｇａｇである、請求項１に記載の方法。
3. 前記ＨＩＶ−１抗原がＨＩＶ−１ ｎｅｆである、請求項１に記載の方法。
4. 前記ＨＩＶ−１抗原がＨＩＶ−１ ｐｏｌである、請求項１に記載の方法。
5. 前記ＨＩＶ−１抗原または免疫学的関連性を有するその改変体をコードする少なくとも一つの遺伝子が、哺乳動物宿主における発現に最適化されたコドンを含む、請求項１に記載の方法。
6. 一つまたはそれ以上の前記組み換えアデノウイルスベクターが遺伝子発現カセットを含み、前記遺伝子発現カセットが、
   （ａ）ＨＩＶ−１抗原をコードする核酸、
   （ｂ）前記抗原をコードする前記核酸が機能するように結合されている異種プロモーター、および
   （ｃ）転写終結配列
   を含む、請求項１に記載の方法。
7. 前記少なくとも一つの組み換えアデノウイルスベクター中の前記遺伝子発現カセットが、Ｅ１領域内に挿入されている、請求項６に記載の方法。
8. プロモーターが、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーターである、請求項６に記載の方法。
9. 転写終結配列が、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化・転写終結配列である、請求項６に記載の方法。
10. （ａ）Ｅ１の少なくとも一部が除去されてＥ１活性が欠失した、ＨＩＶ−１抗原または免疫学的関連性を有するその改変体をコードする遺伝子を含む、血清型５の組み換えアデノウイルスベクターを、哺乳動物宿主に接種する段階、およびその後に
    （ｂ）Ｅ１の少なくとも一部が除去されてＥ１活性が欠失した、ＨＩＶ−１抗原または免疫学的関連性を有するその改変体をコードする遺伝子を含む、血清型６の組み換えアデノウイルスベクターを含む追加免疫を、前記哺乳動物宿主に接種する段階、
    を含む、哺乳動物宿主においてＨＩＶ−１抗原に対する強化された免疫応答を誘導する方法。
11. 段階（ａ）の組み換えアデノウイルスベクターが、塩基対４５１から３５１０が除去されている、請求項１０に記載の方法。
12. 段階（ｂ）の組み換えアデノウイルスベクターが、塩基対４５１から３５０７が除去されている、請求項１０に記載の方法。
13. 前記ＨＩＶ−１抗原または免疫学的関連性を有するその改変体をコードする遺伝子の少なくとも一つが、哺乳動物宿主における発現に最適化されたコドンを含む、請求項１０に記載の方法。
14. 前記ＨＩＶ−１抗原がＨＩＶ−１ ｇａｇである、請求項１０に記載の方法。
15. 前記ＨＩＶ−１抗原がＨＩＶ−１ ｎｅｆである、請求項１０に記載の方法。
16. 前記ＨＩＶ−１抗原がＨＩＶ−１ ｐｏｌである、請求項１０に記載の方法。
17. 一つまたはそれ以上の前記組み換えアデノウイルスベクターが遺伝子発現カセットを含み、前記遺伝子発現カセットが、
    （ａ）ＨＩＶ−１抗原をコードする核酸、
    （ｂ）前記抗原をコードする核酸が機能するように結合されている異種プロモーター、および
    （ｃ）転写終結配列、
    を含む、請求項１０に記載の方法。
18. 前記少なくとも一つの組み換えアデノウイルスベクター中の前記遺伝子発現カセットが、Ｅ１領域内に挿入されている、請求項１７に記載の方法。
19. プロモーターが、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーターである、請求項１７に記載の方法。
20. 転写終結配列が、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化・転写終結配列である、請求項１７に記載の方法。
21. （ａ）Ｅ１の少なくとも一部が除去されてＥ１活性が欠失した、ＨＩＶ−１ ｇａｇ抗原または免疫学的関連性を有するその改変体をコードする遺伝子を含む血清型５の組み換えアデノウイルスベクターを、哺乳動物宿主に接種する段階、およびその後に
    （ｂ）Ｅ１の少なくとも一部が除去されてＥ１活性が欠失した、ＨＩＶ−１ ｇａｇ抗原または免疫学的関連性を有するその改変体をコードする遺伝子を含む、血清型６の組み換えアデノウイルスベクターを含む追加免疫を、前記哺乳動物の宿主に接種する段階、
    を含む、哺乳動物の宿主においてＨＩＶ−１ ｇａｇ抗原に対する強化された免疫応答を誘導する方法。
22. （ａ）Ｅ１の少なくとも一部が除去されてＥ１活性が欠失した、ＨＩＶ−１抗原または免疫学的関連性を有するその改変体をコードする遺伝子を含む、血清型５の組み換えアデノウイルスベクターを、哺乳動物宿主に接種する段階、およびその後に
    （ｂ）Ｅ１の少なくとも一部が除去されてＥ１活性が欠失した、ＨＩＶ−１抗原をまたは免疫学的関連性を有するその改変体をコードする遺伝子を含む血清型３５の組み換えアデノウイルスベクターを含む追加免疫化を、前記哺乳動物宿主に接種する工程、
    を含む、哺乳動物の宿主においてＨＩＶ−１抗原に対する強化された免疫応答を誘導する方法。
23. ＨＩＶ−１抗原または免疫学的関連性を有するその改変体をコードする遺伝子の少なくとも一つが、哺乳動物宿主における発現に最適化されたコドンを含む、請求項２２に記載の方法。
24. 前記ＨＩＶ−１抗原がＨＩＶ−１ ｇａｇである、請求項２２に記載の方法。
25. 前記ＨＩＶ−１抗原がＨＩＶ−１ ｎｅｆである、請求項２２に記載の方法。
26. 前記ＨＩＶ−１抗原がＨＩＶ−１ ｐｏｌである、請求項２２に記載の方法。
27. 一つまたはそれ以上の前記組み換えアデノウイルスベクターが遺伝子発現カセットを含み、前記遺伝子発現カセットが、
    （ａ）ＨＩＶ−１抗原をコードする核酸、
    （ｂ）前記抗原をコードする前記核酸の機能するように結合されている異種プロモーター、および
    （ｃ）転写終結配列
    を含む、請求項２２に記載の方法。
28. 前記少なくとも一つの組み換えアデノウイルスベクター中の遺伝子発現カセットが、Ｅ１領域内に挿入されている、請求項２７に記載の方法。
29. プロモーターがヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーターである、請求項２７に記載の方法。
30. 転写終結配列がウシ成長ホルモンのポリアデニル化・転写終結配列である、請求項２７に記載の方法。

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