JP2005501052A - ポリマー送達系 - Google Patents

Abstract

本発明は、組織中の標的部位に薬剤をターゲティングする方法であって、ポリマー複合物に結合するターゲティングアームおよび捕捉アームを含む多特異性抗体または抗体フラグメントを投与するステップと、組織にポリマー複合物を投与するステップとを含む方法に関する。本発明はまた、標的部位のターゲティング用キットであって、ポリマー複合物に結合するターゲティングアームとおよび捕捉アームを含む多特異性抗体または抗体フラグメントと、ポリマー複合物とを含むキットを提供する。

Description

【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、組織中の標的部位に薬剤をターゲティングする方法であって、ポリマー複合物(polymer conjugate)に結合するターゲティングアームおよび捕捉アーム(capture arm)を含む多特異性抗体または抗体フラグメント(multi-specific antibody or antibody fragment)を投与するステップと、組織にポリマー複合物を投与するステップとを含む方法に関する。本発明はまた、組織内の標的部位のターゲティング用キットであって、ポリマー複合物に結合するターゲティングアームおよび捕捉アームを含む多特異性抗体または抗体フラグメントと、ポリマー複合物とを含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
［関連技術］
治療結果の改良を追求する抗癌治療における現在のアプローチの１つは、長期循環ポリマーへの薬物の結合である。長期循環ポリマーは、薬物、プロドラッグ、または治療薬の血中での半減期を延長し、一般に、薬剤が腫瘍部位に到達する割合が増加する。さらに、腫瘍の微小環境でポリマーを含む高分子を優先的に融合させて、より多数の治療薬を標的部位に到達させることができる。
【０００３】
しかし、半減期の増加につれてポリマーに結合した薬物由来の毒性が増加し、化学療法に悪影響を与え得る副作用が増大し得る。さらに、長期循環ポリマー自体が患者由来の免疫応答を誘発し、ポリマーおよびこれに結合した薬物が天然に存在する抗体に拘束されて無効になり得る。
【発明の開示】
【０００４】
ポリマー−薬物複合物治療に関するこれらのおよび他の問題を克服するために、本発明は、腫瘍部位に局在し、保持されることができる薬物−ポリマー複合物量をさらに増大させる方法に関する。本方法は、癌に指向する一方のアームと、ハプテンに指向する他方のアームとを有する、多特異性抗体などの多特異性ターゲティング薬の予備注射に依存する。典型的には、本発明で有用な薬剤は、（認識ハプテン）_n−（ポリマー骨格）−（薬剤またはプロドラッグ療法部分）_mまたはポリマー骨格−（薬物またはプロドラッグ療法部分）_m（式中、ｎおよびｍは各ポリマー骨格における異なる置換レベルを反映する整数である）を含む一般式を有する。多特異性抗体で癌を予備ターゲティングした後にポリマー−薬物複合物を使用する。前者の場合、一方のアームはハプテンを認識する。後者の場合、二重特異性抗体の一方のアームは、ポリマー骨格の一部もしくは全部、または、付加された薬物の一部もしくは全部に指向する。
【０００５】
本明細書中に開示の方法を、治療または診断目的で使用することができる。さらに、以下の説明から明らかなように、多特異性抗体がポリマー複合物を認識する系は、多様な用途で非常に多目的に使用することができる。
【０００６】
［発明の要約］
本発明は、組織中の標的部位への薬剤のターゲティング方法であって、
（ａ）該標的部位上の抗原に結合するターゲティングアームとポリマー複合物に結合する捕捉アームとを含む、多特異性抗体（ｍｓＡｂ:multi-specific antibody）または多特異的抗体フラグメントを、該組織に投与するステップと、
（ｂ）該捕捉アームに結合するポリマー複合物であって、治療薬、ペプチド、酵素、および標識リガンドからなる群から選択される該薬剤に複合化したポリマーを含むポリマー複合物を組織に投与するステップと
を含む方法に関する。
【０００７】
本発明はまた、組織または組織サンプル内の標的部位のターゲティングに有用なキットであって、
（ａ）該標的部位上の抗原に結合するターゲティングアームと、ポリマー複合物またはハプテン−ポリマー複合物に結合する捕捉アームとを含む多特異性抗体または抗体フラグメントと、
（ｂ）該捕捉アームに結合するポリマー複合物であって、治療薬、ペプチド、酵素、および標識リガンドからなる群から選択される薬剤に複合化したポリマーを含むポリマー複合物と
を含むキットに関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、組織中の標的部位への薬剤のターゲティング方法であって、（ａ）該標的部位上の抗原に結合するターゲティングアームとポリマー複合物に結合する捕捉アームとを含む、多特異性抗体（ｍｓＡｂ）または多特異的抗体フラグメントを組織に投与するステップと、（ｂ）該捕捉アームに結合するポリマー複合物であって、治療薬、ペプチド、酵素、および標識リガンドからなる群から選択される前記薬剤に複合化したポリマーを含むポリマー複合物を組織に投与するステップとを含む方法に関する。好ましくは、本発明のポリマー複合物は、一般式（ポリマー−骨格）−（薬剤）_m（式中、ｍは０を含む整数である）を有する。
【０００９】
本明細書中で使用される、用語「組織」は、当業者が理解している組織を意味するために使用される。本発明で想定する場合、組織はまた、個別の細胞、細胞培養物、体内組織または体液（例えば、血球）またはこれらの群を意味するために使用される。さらに、組織は被験体内に存在するか、生検するか、または被験体から取り出すことができる。組織はまた、体内器官の全体または任意の一部であり得る。さらに、切除と本発明の方法との間にいかなる保存工程を行うことなく被験体から組織をすぐに取り出しているという点で、組織は「新鮮」であり得る。組織はまた、本発明の方法の適用前に標準的な組織調製技術（凍結、急速凍結、パラフィン包埋、および組織固定が含まれるが、これらに限定されない）によって保存されることもできる。
【００１０】
本明細書中で使用される、用語「患者または被験体」は交換可能に使用され、これは、任意の動物、好ましくはヒトおよび非ヒト霊長類を含む哺乳動物を意味するために使用される。
【００１１】
本明細書中で使用される、用語「標的」は、薬剤または化合物の任意のタイプに指向し得る組織の位置(locus)の部位を意味するために使用する。位置は、正常部分および／または疾患部分を含む組織の任意の部分または細胞自体を意味するために使用することができる。位置はまた、罹患組織の病因または症状を含み得る組織周辺の領域を意味し得る。標的部位は、組織全体であってもよく、腫瘍内の血管などの組織の一部であってもよく、または、インビボもしくはインビトロまたはインサイチューで、組織を構成する個々の細胞または細胞群であってもよい。これはまた、標的組織の位置で融合する分子または分子サブユニットであり得る。さらに、標的部位は、罹患組織の近傍の病原体に関連し得るので、このため、標的部位は必ずしも細胞または組織に直接接触しているまたは組み込まれている必要はない。「標的部位」および「標的組織」は、本明細書中では交換可能に使用される。
【００１２】
本発明は、ポリマー複合物を組織内の標的部位に指向させるために多特異性抗体（ｍｓＡｂ）を使用する。本明細書中で使用される、「多特異的抗体」は、本発明のｍｓＡｂが１つを超える抗原またはエピトープに結合または認識するように１つを超える特異性または１つを超える結合価を有する。例えば、本発明の二重特異性抗体には、免疫グロブリンの各アームが個別のエピトープまたはハプテンを認識または結合する抗体が含まれる。本発明の多特異性抗体はまた、二重特異性よりも高い特異性（三重特異性または四重特異性抗体などが含まれるが、これらに限定されない）を含む。例えば、三重特異性抗体は、２つのアームが２つの異なる細胞抗原に指向し、および第３のアームがハプテンまたは薬物に指向する抗体を含み得る。本明細書中で使用される、「多特異性抗体」には、１つを超える結合価を有する抗体も含まれる。例えば、本発明に含まれる抗体は、抗体が二重特異性、さらに３価であるように１つの細胞エピトープに指向する２つのアームおよびハプテンまたは薬物に指向する第３のアームから構成され得る。さらに、標的アームまたはｍｓＡｂのアームは、標的組織上の２つまたはそれ以上の各エピトープに指向することができ、および捕捉アーム（単数または複数）は、ポリマー複合物上の２つまたはそれ以上の各ハプテンに指向し得る。
【００１３】
本発明に含まれるように、ｍｓＡｂは、抗体多特異性抗体フラグメントを含む。抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆ（ａｂ）₂、Ｆａｂ’、およびＦａｂなどの抗体の抗原結合部分である。抗体フラグメントは、インタクトな抗体によって認識されるものと同一の抗原に結合する。例えば、抗ＣＤ２２モノクローナル抗体フラグメントは、ＣＤ２２のエピトープに結合する。本発明のｍｓＡｂには、ＩｇＧ×ＩｇＧ、ＩｇＧ×Ｆ（ａｂ’）₂、ＩｇＧ×Ｆａｂ’、ＩｇＧ×ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）₂×Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆａｂ’×Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆａｂ’×Ｆａｂ’、Ｆａｂ’×ｓｃＦｖ、およびｓｃＦｖ×ｓｃＦｖ二重特異性モノクローナル抗体（ｂｉｓｍＡｂ:bi-specific monoclonal antibody）が含まれるが、これらに限定されない。ｓｃＦｖ×ＩｇＧ×ｓｃＦｖおよびＦａｂ’×ＩｇＧ×Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ×Ｆ（ａｂ’）₂×ｓｃＦｖおよびＦａｂ’×Ｆ（ａｂ’）₂×Ｆａｂ’などの化合物も含まれる。最も好ましくは、一方または両方のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＩｇＧまたはＦ（ａｂ’）₂上の部位特異的結合部位（改変炭水化物または改変もしくは遊離した遊離チオール基など）を使用することができる。これらのｍＡｂは二量体であるので、これらを第２のｍＡｂの２つの分子とカップリングさせることができる。例えば、改変軽鎖炭水化物を有する癌胎児抗原（ＣＥＡ:carcinoembryonic antigen）に指向するｍＡｂ（抗ＣＥＡＦ（ａｂ’）₂）を酸化し、ヒドラジド−マレイミド架橋剤を使用して、各軽鎖あたり少なくとも１つの懸垂マレイミド基を有する誘導体化抗ＣＥＡＦ（ａｂ’）₂に変換することができる。少なくとも抗キレート−Ｆａｂ’×抗ＣＥＡ−Ｆ（ａｂ’）₂−抗キレートＦａｂ’複合物が生成されるように、この化合物を１：２のモル比で抗キレートＦａｂ’−ＳＨとカップリングさせる。得られたｍｓＡｂは、標的組織およびポリマー複合物に関して２価である。本開示中の用語「ｍｓＡｂ」は多特異性抗体および多特異性抗体フラグメントを含むとさらに理解される。
【００１４】
用語「抗体フラグメント」には、特異的抗原への結合によって複合体が形成される抗体と同様に作用する任意の合成または遺伝子操作タンパク質も含まれる。例えば、抗体フラグメントには、重鎖および軽鎖の可変領域からなる単離フラグメント（「Ｆｖ」フラグメント）、軽鎖および重鎖の可変領域がペプチドリンカーで接続された組換え一本鎖ポリペプチド分子（「ｓＦｖタンパク質」）、および超可変領域を模倣するアミノ酸残基または関連ペプチドからなる最小認識単位が含まれる。
【００１５】
本発明のｍｓＡｂは、本来モノクローナルまたはポリクローナルであるが、モノクローナル抗体が好ましい。さらに、ｍｓＡｂのターゲティングアームおよび捕捉アームは、本来モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。好ましくは、標的アームまたは捕捉アームのいずれかはモノクローナルである。最も好ましくは、標的アームおいよび捕捉アームは共にモノクローナルである。
【００１６】
本発明のｍｓＡｂを、標識を保有するように操作することができる。ｍｓＡｂが保有することができる標識の例には、ビオチン−ストレプトアビジン複合体および放射性同位体などの標識リガンドが含まれるが、これらに限定されない。有利には、局在化およびクリアランスの追跡を容易にするために本発明のｍｓＡｂを放射性標識する。
【００１７】
ｍｓＡｂのターゲティングアームおよび捕捉アームの片方または両方は、キメラ抗体、ヒト抗体、またはヒト化抗体であり得る。
【００１８】
本明細書中で使用される、「ターゲティングアーム」は、標的組織の位置に存在する抗原を認識および／または結合するｍｓＡｂの一部を意味するために使用される。抗原は、細胞もしくは組織または細胞表面膜の一部に外部から付着していてもよく、グリコシル−ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）固定タンパク質であってもよく、細胞内部に存在してもよい。さらに、抗原を、流動物（全血、リンパ液、または脳脊髄液の任意の一部が含まれるが、これらに限定されない）に関連させることができる。さらに、抗原は、正常な、異常な、罹患した、または壊死した細胞または組織中に存在してもよく、これらによって融合されてもよく、または、これらによって分泌または放出されてもよい。さらに、抗原は、病原体（標的組織の位置に存在するウイルス、細菌および／またはプリオンが含まれるが、これらに限定されない）上に存在してもよい。したがって、抗原は必ずしも細胞に直接接触している必要も組み込まれている必要もない。抗原は、特定の特徴（識別可能な細胞表面関連抗原など）を有してもよく、１つを超える組織または細胞型によって共有される一般的な特徴を有してもよい。例えば、β１インテグリンは、抗原性を示す種々の正常または罹患組織によって共有される細胞外細胞接着分子であり、本発明において標的部位の位置における抗原と考えられる。抗原の例には、ＭＨＣ複合体成分、受容体、および腫瘍抗原が含まれるが、これらに限定されない。特に、このような抗原には、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、１７−１Ａ、結腸特異的抗原Ｐ、上皮糖タンパク質、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、上皮増殖因子受容体、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、およびＣＤ７４が含まれる。
【００１９】
本明細書中で使用される、「捕捉アーム」は、ポリマー複合物を認識して結合するｍｓＡｂの一部を意味するために使用される。捕捉アームは、ポリマー複合物のポリマー骨格を直接、または、ポリマー骨格に複合化した薬剤を、または、ポリマー−薬物複合物に結合したハプテンを認識してもよい。
【００２０】
例えば、ペプチドから構成されるポリマー骨格に対する抗体を、周知のＡｂ産生方法によって作製する。例えば、（ペプチド）_n−ＫＬＨ（ｎ＝１〜３０）などの免疫原を含むフロイント完全アジュバントの注射後に、フロント不完全アジュバント中に懸濁した同一の免疫原を免疫応答性動物に２回注射し、抗原のｉ．ｖ．促進の３日後に脾臓細胞を採取する。次いで、採取した脾臓細胞を、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞と融合し、得られたクローンの培養上清を、直接結合ＥＬＩＳＡを使用して抗ペプチド反応性について分析した。作製したＡｂの正確な特異性を、元の免疫原のペプチドフラグメントの使用によって分析することができる。これらのフラグメントを、自動化ペプチド合成機を使用して容易に調製することができる。Ａｂ産生について、融合細胞株を選択することができるように酵素欠損ハイブリドーマを単離する。この技術を使用して、ポリマー複合物を含む１つまたは複数のキレート（例えば、Ｉｎ（III）−ＤＴＰＡキレート）に対する抗体を惹起することもできる。Ｉｎ（III）−ジ−ＤＴＰＡに対するマウスモノクローナル抗体は、当分野で公知である（例えば、米国特許第5,256,395号）。
【００２１】
免疫原に対する抗体の最初の惹起後、抗体を配列決定し、その後組換え技術によって調製することができる。マウス抗体および抗体フラグメントのヒト化およびキメラ化は、当業者に周知である。例えば、マウス免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変鎖由来のマウス相補性決定領域をヒト可変ドメインに導入し、その後マウス対照物のフレームワーク領域中のヒト残基と置換することによって、ヒト化モノクローナル抗体を産生する。ヒト化モノクローナル抗体由来の抗体成分の使用により、マウス定常領域の免疫原性に関連する潜在的な問題が回避される。マウス免疫グロブリン可変ドメインの一般的なクローニング技術は、例えば、Orlandiら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、86、3833,1989の文献（その全体が本明細書中で参照して参照して組み込まれる）に記載されている。ヒト化ｍＡｂの産生技術は、例えば、Jonesら、Nature、321、522、1986、Riechmannら、Nature、332、323、1988、Verhoeyenら、Science、239、1534、1988、Carterら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89、4285、1992、Sandhu、Crit.Rev.Biotech.、12、437、1992、およびSingerら、J.Immun.、150、2844、1993（それぞれ本明細書中で参照して組み込まれる）に記載されている。
【００２２】
あるいは、トランスジェニック非ヒト動物から完全なヒト抗体を得ることができる。例えば、Mendezら、Nature Genetics、15、146-156、1997;米国特許第5,633,425号を参照のこと。例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するトランスジェニックマウスからヒト抗体を回収することができる。マウス体液性免疫系を、内因性免疫グロブリン遺伝子の不活化およびヒト免疫グロブリン遺伝子座への導入によってヒト化する。ヒト免疫グロブリン遺伝子座は非常に複雑であり、ほぼ０．２％のヒトゲノムを共に占める多数の個別のセグメントを含む。トランスジェニックマウスが適切な抗体レパートリーを産生することができることを確認するために、ヒト重鎖および軽鎖の遺伝子座の大部分をマウスゲノムに導入しなければならない。生殖細胞系列の配置でヒト重鎖または軽鎖免疫グロブリン遺伝子座のいずれかを含む酵母人工染色体（ＹＡＣ）の形成から開始される段階的プロセスでこれを行う。各インサートが約１Ｍｂのサイズであるので、ＹＡＣ構築には免疫グロブリン遺伝子座の重複フラグメントの相同組換えが必要である。一方が重鎖遺伝子座を含み、他方が軽鎖遺伝子座を含む２つのＹＡＣを、マウス胚幹細胞へのＹＡＣ含有酵母スフェロプラストの融合を介して個別にマウスに導入する。次いで、胚幹細胞クローンを、マウス胚盤胞に微量注入する。得られたキメラ雄を、その生殖系列細胞によるＹＡＣの輸送能力についてスクリーニングし、マウス抗体産生欠損マウスと交配する。２つのトランスジェニック系統（一方はヒト重鎖遺伝子座を含み、他方はヒト軽鎖遺伝子座を含む）の交配により、免疫化に応答してヒト抗体を産生する子孫が作製される。
【００２３】
非再整列ヒト免疫グロブリン遺伝子を、微小核体媒介染色体導入（ＭＭＣＴ:microcell-mediated chromosome transfer）を介してマウス胚幹細胞に移入することもできる。例えば、Tomizukaら、Nature Genetics、16、133、1997を参照のこと。この方法では、ヒト染色体を含む微小核体をマウス胚幹細胞と融合する。導入された染色体は安定に保持され、成体キメラは適切な組織特異的発現を示す。
【００２４】
別の方法として、本発明の抗体または抗体フラグメントは、組み合わせ免疫グロブリンライブラリーから単離したヒト抗体フラグメントに由来し得る。例えば、Barbasら、METHODS:A Companion to Methods in Enzymology、2、119、1991およびWinterら、Ann.Rev.Immunol.、12、433、1994（本明細書中で参照して組み込まれる）を参照のこと。Ｂ細胞不死化によるモノクローナル抗体産生に関する多数の困難を、ファージディスプレイを使用した大腸菌での抗体フラグメントの操作および発現によって克服することができる。高親和性モノクローナル抗体の回復を確実にするために、組み合わせ免疫グロブリンライブラリーは、巨大なレパートリーサイズを含まなければならない。典型的なストラテジーは、免疫化マウスのリンパ球または脾臓細胞から得たｍＲＮＡを使用し、逆転写酵素を使用してｃＤＮＡを合成する。重鎖および軽鎖の遺伝子を、個別にＰＣＲで増幅し、ファージクローニングベクターにライゲーションする。一方が重鎖遺伝子を含み、他方が軽鎖遺伝子を含む２つの異なるライブラリーが産生される。ファージＤＮＡを各ライブラリーから単離し、重鎖および軽鎖配列を共にライゲーションおよび封入して組み合わせライブラリーを形成する。各ファージは、重鎖および軽鎖のｃＤＮＡのランダムな対を含み、大腸菌の感染時に感染細胞中の抗体鎖の発現を指示する。目的の抗原を認識する抗体を同定するために、ファージライブラリーをプレートし、プラーク中に存在する抗体分子をフィルターに移す。フィルターを放射性標識抗原と共にインキュベートし、洗浄して過剰な非結合リガンドを除去する。オートラジオグラム上の放射性スポットにより、抗原に結合した抗体を含むプラークを同定する。ヒト免疫グロブリンファージライブラリーの産生に有用なクローニングベクターおよび発現ベクターを、例えば、STRATAGENEクローニングシステム(La Jolla、CA)から得ることができる。
【００２５】
類似のストラテジーを使用して、高親和性ｓｃＦｖを得ることができる。例えば、Vaughnら、Nat.Biotechnol.、14、309-314、1996を参照のこと。巨大なレパートリーを有するｓｃＦｖライブラリーを、全ての公知のＶ重鎖（Ｖ_H）およびＶ軽鎖（ＶκおよびＶλ）遺伝子ファミリーに対応するＰＣＲプライマーを使用した非免疫化ヒトドナーからのＶ遺伝子の単離によって構築することができる。増幅後、ＶκおよびＶλプールを合わせて１つのプールにする。これらのフラグメントを、ファージミドベクターにライゲーションする。ｓｃＦｖリンカー（Ｇｌｙ₄−Ｓｅｒ₁）₃を、Ｖ軽鎖（Ｖ_L）フラグメントのファージミド上流にライゲーションする。Ｖ_Hおよびリンカー−Ｖ_Lフラグメントを増幅し、Ｊ_H領域上に構築する。得られたＶ_H−リンカーＶ_Lフラグメントを、ファージミドベクターにライゲーションする。ファージミドライブラリーを、上記のフィルターまたは免疫チューブ(Nunc、Maxisorp)を使用して選択することができる。免疫化ウサギのリンパ球または脾臓細胞由来の免疫グロブリンの組み合わせライブラリーの構築およびP.pastorisでのｓｃＦｖ構築物の発現によって類似の結果を得ることができる。例えば、Ridderら、Biotechnology、13、255-260、1995を参照のこと。さらに、適切なｓｃＦｖの単離後、より高い結合親和性およびより遅い解離速度を有する抗体フラグメントを、ＣＤＲ３変異誘発および鎖のシャフリングなどの親和性変異プロセスによって得ることができる。例えば、Jacksonら、Br.J.Cancer、78、181-188、1998、Osbournら、Immunotechnology、2、181-196、1996を参照のこと。
【００２６】
当分野で公知の技術（例えば、抗ＣＥＡ腫瘍Ａｂおよび抗ペプチドＡｂをそれぞれ共にペプシン消化してその各Ｆ（ａｂ’）₂を得る）によってｍｓＡｂを調製することができる。抗ＣＥＡ−Ａｂ−Ｆ（ａｂ’）₂をシステインで還元してＦａｂ’単量体単位を作製し、ビス（マレイミド）ヘキサンなどの架橋剤とさらに反応させてＦａｂ’−マレイミド部分を作製する。抗ペプチドＡｂ−Ｆ（ａｂ’）₂をシステインで還元し、精製して回収した抗ペプチドＦａｂ’−ＳＨを抗ＣＥＡ−Ｆａｂ’−マレイミドと反応させてＦａｂ’×Ｆａｂ’二重特異性Ａｂを作製する。あるいは、抗ペプチドＦａｂ’−ＳＨフラグメントを抗ＣＥＡ Ｆ（ａｂ’）₂とカップリングさせてＦ（ａｂ’）₂×Ｆａｂ’構築物を作製するか、抗ＣＥＡ ＩｇＧとカップリングさせてＩｇＧ×Ｆａｂ’二重特異性構築物を作製することができる。１つの実施形態では、部位特異的様式での過ヨウ素酸塩酸化されている抗ＣＥＡ ＩｇＧ重鎖炭水化物への抗ペプチドＦａｂ’チオール基の結合によってＩｇＧ×Ｆａｂ’構築物を調製し、その後市販のヒドラジド−マレイミド架橋剤との反応によって活性化することができる。使用した成分Ａｂを、公知の技術によってキメラ化またはヒト化することができる。キメラ抗体は、げっ歯類抗体由来の可変ドメインおよび相補性決定領域を含み、残りの抗体分子がヒト抗体に由来する組換えタンパク質である。ヒト化抗体は、モノクローナル抗体のマウス相補性決定領域をマウス免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変鎖からヒト可変ドメインに導入された組換えタンパク質である。
【００２７】
種々の組換え法を使用して、多特異性抗体および抗体フラグメントを産生することができる。例えば、多特異性抗体および抗体フラグメントを、トランスジェニック家畜のミルクで産生することができる。例えば、Colman,A.、Biochem.Soc.Symp.、63、141-147、1998および米国特許第5,827,690号を参照のこと。対合免疫グロブリン重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡセグメントをそれぞれ含む２つのＤＮＡ構築物を調製する。哺乳動物上皮細胞中で発現することが好ましいプロモーター配列を含む発現ベクターにフラグメントをクローン化する。例には、ウサギ、ウシ、およびヒツジのカゼイン遺伝子、ウシαラクトグロブリン遺伝子、ヒツジβラクトグロブリン遺伝子、ならびにマウスホエイ酸タンパク質遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、挿入されたフラグメントを、哺乳動物特異的遺伝子由来の同族ゲノム配列によってその３’側に隣接させる。これにより、ポリアデニル化部位および転写物安定化配列が得られる。発現カセットを受精哺乳動物の卵の前核に同時注入し、その後レシピエント雌の子宮に移植して妊娠させる。出生後、子孫を、サザン分析によって両導入遺伝子の存在についてスクリーニングする。存在すべき抗体について、両重鎖および軽鎖遺伝子は、同一の細胞中で同時に発現されなければならない。トランスジェニック雌由来のミルクを、当分野で公知の標準的な免疫学的方法を使用して抗体または抗体フラグメントの存在および機能性について分析する。抗体を、当分野で公知の標準的方法を使用してミルクから精製することができる。
【００２８】
ヒト抗体由来のＣドメインをコードするフラグメントへのマウス軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインをコードするｃＤＮＡフラグメントのライゲーションによってキメラＡｂを構築する。Ｃドメインは抗原結合に寄与しないので、キメラ抗体は元のマウスＡｂと同一の抗原特異性を保持するが、配列はヒト抗体に近い。キメラＡｂは依然としていくつかのマウス配列を含むが、依然として免疫原性を示し得る。ヒト化Ａｂは抗原認識に必要なマウスアミノ酸のみを含む。ヒト抗体フレームワークへのマウス相補性決定領域由来のアミノ酸の構築によってこの産物を構築する。
【００２９】
他の最近のｍｓＡｂ産生方法は、より一般的な免疫グロブリンイソ型よりも強力に架橋するようにさらなるシステイン残基を有する改変組換えＡｂを含む。例えば、FitzGeraldら、Protein Eng.、10(10)、1221-1225、1997を参照のこと。別のアプローチは、必要な二重特異性を有する２つまたはそれ以上の異なる一本鎖抗体または抗体フラグメントセグメントに架橋した組換え融合タンパク質を操作することである。例えば、Colomaら、Nature Biotech.、15、159-163、1997を参照のこと。分子操作を使用して種々の多特異性融合タンパク質を産生することができる。１つの形態では、多特異性融合タンパク質は１価であり、例えば、１つの抗原について１つの結合部位を有するｓｃＦｖおよび第２の抗原について１つの結合部位を有するＦａｂフラグメントからなる。別の形態では、多特異性融合タンパク質は２価であり、例えば、１つの抗原について２つの結合部位を有するＩｇＧおよび第２の抗原について２つの結合部位を有する２つのｓｃＦｖからなる。
【００３０】
Diabodyとも呼ばれる機能的多特異性一本鎖抗体（ｍｓｃＡｂ:multi-specific single-chain antibody）を、組換え法を使用して哺乳動物細胞で産生することができる。例えば、Mackら、Proc.Natl.Acad.Sci.、92、7021-7025、1995を参照のこと。例えば、ｍｓｃＡｂを、組換え法を使用したグリシン−セリンリンカーを介した２つの一本鎖Ｆｖフラグメントの連結によって産生する。目的の２つの抗体のＶ軽鎖（Ｖ_L）およびＶ重鎖（Ｖ_H）ドメインを、標準的なＰＣＲ法を使用して単離する。次いで、各ハイブリドーマから得たＶ_LおよびＶ_HのｃＤＮＡを２工程融合ＰＣＲにおいて連結させて一本鎖フラグメントを形成させる。第１のＰＣＲ工程で（Ｇｌｙ₄−Ｓｅｒ₁）₃リンカーを導入し、第２の工程ではＶ_LおよびＶ_Hアンプリコンを連結する。各一本鎖分子を、細菌発現ベクターにクローン化する。増幅後、一本鎖分子の１つを切り出し、第２の目的の一本鎖分子を含む他のベクターにサブクローン化する。得られたｍｓｃＡｂフラグメントを、真核生物発現ベクターにサブクローン化する。チャイニーズハムスター卵巣細胞へのベクターのトランスフェクションによって機能性タンパク質発現を得ることができる。多特異性融合タンパク質を、類似の様式で調製する。多特異性一本鎖抗体および多特異性融合タンパク質は、本発明の範囲内に含まれる。
【００３１】
２つまたはそれ以上の異なる一本鎖抗体または抗体フラグメントに連結した多特異性融合タンパク質を、上記と類似の様式で産生する。組換え法を使用して、種々の融合タンパク質を産生することができる。例えば、ヒト化モノクローナル抗ＣＥＡ抗体由来のＦａｂフラグメントおよびマウス抗ジＤＴＰＡ由来のｓｃＦｖを含む融合タンパク質を産生することができる。グリシル−グリシル−グリシル−セリンの三量体である（ＧＧＧＳ）₃などの可撓性リンカーは、ｓｃＦｖを抗ＣＥＡ抗体の重鎖の定常領域に連結させる。あるいは、ｓｃＦｖを、ｈＭＮ−１４の軽鎖の定常領域に連結させることができる。重鎖ＦｄのｓｃＦｖへのインフレーム接続に必要な適切なリンカー配列を、ＰＣＲ反応によってＶλおよびＶκドメインに移入する。次いで、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡフラグメントを、ＣＨ１ドメインをコードするＤＮＡ配列を含むステージング(staging)ベクターにライゲーションする。得られたｓｃＦｖ−ＣＨ１構築物を切り出し、抗ＣＥＡ抗体のＶＨ領域をコードするＤＮＡ配列を含むベクターにライゲーションする。得られたベクターを使用して、多特異性融合タンパク質発現のために哺乳動物細胞にトランスフェクトすることができる。
【００３２】
大腸菌発現系を使用して、大量のｂｓｃＡｂおよび融合タンパク質を産生することができる。例えば、Zhenpingら、Biotechnology、14、192-196、1996を参照のこと。２フラグメントのＶ_LおよびＶ_Hドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在する２つの「重複」ｓｃＦｖフラグメントの大腸菌での同時発現によって機能性ｂａｓｃＡｂを産生することができる。目的の２つの抗体のＶ_LおよびＶ_Hドメインを、標準的なＰＣＲ法を使用して単離する。次いで、目的の第１の抗体のＶ_LドメインのＣ末端がリンカーを介して第２の抗体のＶ_HドメインのＮ末端にライゲーションされるようにｃＤＮＡを細菌発現ベクターにライゲーションする。同様に、目的の第２の抗体のＶ_LドメインのＣ末端を、リンカーを介して第１の抗体のＶ_HドメインのＮ末端にライゲーションする。得られたバイシストロン性オペロンを、強力プロモーター（例えば、リン酸枯渇によって誘導される大腸菌アルカリホスファターゼプロモーター）の転写調節下におく。あるいは、ｌａｃプロモーターおよび２％グリシンおよび１％TritonX-100からなる培地を使用して、一本鎖融合構築物を大腸菌中に首尾よく発現させる。例えば、Yangら、Appl.Environ.Microbiol.、64、2869-2874、1998を参照のこと。大腸菌の熱安定性エンテロトキシンIIシグナル配列を使用して、ペプチドを細胞膜周辺腔に向ける。分泌後、２つのペプチド鎖を結合させて、両方の抗原結合特異性を有する非共有結合ヘテロ二量体を形成する。当分野で公知の標準的手順（例えば、ブドウ球菌プロテインＡクロマトグラフィ）を使用して、ｂｓｃＡｂを精製する。
【００３３】
機能性ｂｓｃＡｂおよび融合タンパク質を、トランスジェニック家畜のミルクで産生することもできる。例えば、Colman,A.、Biochem.Soc.Symp.、63、141-147、1998、米国特許第5,827,690号を参照のこと。上記のようにして得たｂｓｃＡｂフラグメントを、哺乳動物上皮細胞で優先的に発現するプロモーター配列を含む発現ベクターにクローン化する。例には、ウサギ、ウシ、およびヒツジのカゼイン遺伝子、ウシα−ラクトグロブリン遺伝子、ヒツジβーラクトグロブリン遺伝子、およびマウスホエイ酸タンパク質遺伝子由来のプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。挿入したｂｓｃＡｂは、哺乳動物特異的遺伝子由来の同族ゲノム配列によってその３’側に隣接していることが好ましい。これにより、ポリアデニル化部位および転写安定化配列が得られる。次いで、発現カセットを哺乳動物受精卵の前核に注入し、その後レシピエント雌の子宮に移植して妊娠させる。出生後、子孫を、サザン分析によって移入したＤＮＡの存在についてスクリーニングする。トランスジェニック雌由来のミルクを、当分野で公知の標準的な免疫学的方法を使用してｂｓｃＡｂの存在および機能性について分析する。当分野で公知の標準的方法を使用して、ミルクからｂｓｃＡｂを精製することができる。ミルクにおけるｂｓｃＡｂのトランスジェニック産生により、大量のｂｓｃＡｂを得る有効な方法が得られる。
【００３４】
トランスジェニック植物において、機能性ｂｓｃＡｂおよび融合タンパク質を産生することもできる。例えば、Fiedlerら、Biotech.、13、1090-1093、1995、Fiedlerら、Immunotechnology、3、205-216、1997を参照のこと。このような産生により、低コスト、大規模処理、および安定かつ長期の保存を含むいくつかの利点が得られる。上記のようにして得たｂｓｃＡｂフラグメントを、プロモーター配列を含み、かつタンパク質を小胞体に方向付けるためのシグナルペプチド配列をコードする発現ベクターにクローン化する。当業者は、発現産物を植物内の特定の位置に方向付けることができる種々のプロモーターを使用することができる。例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ強力プロモーターを使用してタバコ植物における遍在性発現を行うことができ、種子特異的レグミンＢ４プロモーターを介して器官特異的発現を行う。当分野で公知の標準的方法にしたがって、発現カセットを形質転換する。サザン分析によって形質転換を評価する。当分野で公知の標準的な免疫学的方法を使用して、ｂｓｃＡｂの存在および機能性についてトランスジェニック植物を分析する。当分野で公知の標準的方法を使用して、ｂｓｃＡｂを植物組織から精製することができる。
【００３５】
さらに、トランスジェニック植物により、ｂｓｃＡｂおよび融合タンパク質の長期保存が容易になる。室温で１週間の保存後、機能活性ｓｃＦｖタンパク質をタバコの葉から抽出した。同様に、室温で１年間保存したトランスジェニックタバコ種子は、ｓｃＦｖタンパク質またはその抗原結合活性の損失は認められない。
【００３６】
昆虫細胞中で機能性ｂｓｃＡｂおよび融合タンパク質を産生することもできる。例えば、Mahiouzら、J.Immunol.Methods、212、149-160、1998を参照のこと。昆虫ベースの発現系により、大量の同種で適切に折りたたまれたｂｓｃＡｂの産生手段が得られる。バキュロウイルスは、広範に使用されている昆虫細胞用の発現ベクターであり、組換え抗体分子に首尾よく適用されている。例えば、Miler,L.K.、Ann.Rev.Microbiol.、42、177、1988、Beiら、J.Immunol.Methods、186、245、1995を参照のこと。あるいは、誘導性プロモーターの転写調節下でのｂｓｃＡｂ構築物を含む安定な昆虫細胞株の作製によって、誘導性発現系を使用することができる。例えば、Mahiouzら、J.Immunol.Methods、212、149-160、1998を参照のこと。上記のようにして得たｂｓｃＡｂフラグメントを、DrosphilaメタロチオネインプロモーターおよびヒトＨＬＡ−Ａ２リーダー配列を含む発現ベクターにクローン化する。次いで、構築物を、D.melanogasterSC-2細胞にトランスフェクトする。大量の銅、亜鉛、またはカドミウムへの細胞の曝露によって、発現を誘導する。ｂｓｃＡｂの存在および機能性を、当分野で公知の標準的な免疫学的方法を使用して決定する。当分野で公知の標準的方法を使用して、精製ｂｓｃＡｂを得る。
【００３７】
本発明で使用したポリマーは、薬剤の１つの分子または複数の分子が付着し得る骨格を提供することを意味する。本明細書中で使用される、「複数の分子」は、１つを超える分子を意味する。さらに、１種類を超える薬剤を同一の骨格に付着させて、複数の薬剤を１つのポリマーに送達させることができる。このポリマー骨格に付着させることができる薬剤は、性質（立体化学、化学式、放射性同位体数、原子量、半減期、活性、特異性、活性化エネルギー、放射能、および有効性が含まれるが、これら限定されない）が異なり得る。
【００３８】
本発明のポリマーおよびポリマー骨格の例は、ポリスチレン、ポリグルタミン酸（Ｅ；一文字コード）、およびアスパラギン酸（Ｄ）（これのＤ−アミノ酸アナログを含む）などの１種のアミノ酸のポリマーである。１つの実施形態では、最終ｍｓＡｂ／ポリマー複合系を使用した場合にポリマー複合物を認識するｍｓＡｂのアームが完全に特異的であることを確かめるために、非天然アミノ酸（例えば、Ｄ−アミノ酸）を骨格構造に組み込む。本明細書中で使用される、「コポリマー」は、２種またはそれ以上のアミノ酸のポリマー（３種のアミノ酸のポリマー、４種のアミノ酸のポリマー、および５種のアミノ酸のポリマーが含まれるが、これらに限定されない）を意味する。ポリ（Ｌｙｓ−Ｇｌｕ）｛ポリ［ＫＥ］｝などのコポリマーは、所望の比での基礎単位でこのようなコポリマーを選択する場合に特に有用である。これらの比は、ポリ［ＫＥ］またはポリ［ＫＤ］の場合に１：１０から１０：１までが有利であり得る。ポリ（Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ）（ＫＡＥＹ；５：６：２：１）などのアミノ酸基礎単位に基づくより複雑なコポリマーを使用することもできる。使用されるポリマーの分子量は、一般に、１，０００から１００，０００ダルトンの範囲内である。アミノ酸基礎単位を、認識ハプテンおよび治療薬のキャリアとして作用する能力だけでなく、個々の基礎単位をポリマー複合物全体に合わせて作製する物理的および生物学的性質についても選択する。例えば、好ましいポリマー複合物は、多数の疎水性薬物部分が置換した場合でさえも適切な安定性を保持するものである。ポリペプチドの場合、これはしばしば荷電残基が多数存在することを意味する。正味で正電荷を有する薬剤は時折細胞および組織に非特異的に結合するおそれがあるので、生理学的ｐＨにおいて正味で負電荷を保持する最終ポリマー複合物でさらなる好ましい性質が得られる。ポリペプチドの場合、アスパラギン酸およびグルタミン酸などの酸性残基を優勢にすることにより、最も容易にこの基準が満たされる。第３の好ましい性質は、ポリマー骨格がエステラーゼなどの血清酵素ならびにカルボキシおよびアミノペプチダーゼに安定であることである。この優勢のために、ポリペプチドにＤアミノ酸を組み込み、Ｎ末端およびＣ末端をそれぞれアシル化およびアミド化することができる。好ましい分子量範囲に関して、５，０００と２５，０００との間のベースポリマーの分子量が特に好ましい。
【００３９】
しかし、完全に定義された分子量を有する、より小さいポリマー複合物もまた、本発明の範囲内で好ましい。２〜５０残基鎖長のポリペプチドが容易に産生される固相ペプチド合成技術によって化学的に定義された物質としてこれらを産生することができる。正確な構造が定義される以外のこの試薬型の第２の利点は、鎖中の一定の点に１つまたは任意の所望の数の化学結合手を置く能力である。各部分の選択レベルでの認識ハプテンおよび治療薬の付着のためにこれらをその後に使用することができる。例えば、好ましい薬剤は、２つのリジン単位を含む３８Ｄグルタミン酸残基の４０量体（前者はＤＴＰＡなどの認識部位によりε置換されている）である。次いで、残存するグルタミン酸残基を、タキソール、１０−ヒドロキシカンプトセシン、２−ピロリノドキソルビシン、またはメルファランなどの化学療法薬に部分的に置換する。次いで、残存するグルタミン酸残基を、タキソール、１０−ヒドロキシカンプトセシン、２−ピロリノドキソルビシン、またはメルファランなどの化学療法薬に部分的に置換する。添加した薬物の疎水性に依存して、置換比は変化する。また、認識ハプテンの選択はまた、最終複合物の全体的な水溶性に影響を与え、この目的のために、ＤＴＰＡなどの親水性部分が特に好ましい。一般に、ポリマーに対する薬物の置換比は、利用可能な部位の１０〜５０％であり、概説した所望の物理的性質の維持に十分な非置換残基を残す。
【００４０】
本発明の範囲内でポリペプチド以外のポリマーを使用することができる。ポリ（エチレン）グリコール［ＰＥＧ］は多特異性抗体プロドラッグアプローチのための所望のインビボ特性を有し、ポリマーの末端に異なる化学官能基を有する種々の形態で得ることができる。ほとんどのＰＥＧ誘導体は、いずれかのポリマー鎖の末端に２つの機能性活性部位のみを有する。このようなＰＥＧ由来の薬剤（例えば、ジ−ＳＮ−３８−ＰＥＧなど）は、ＳＮ−３８−ポリマープロドラッグクラスの最も短いメンバーと考えることができる。ＰＥＧ誘導体の所望のインビボ特性を、その二量体機能性による負荷能力の制限によって釣り合いを取る。しかし、より最近では、Poianiら(Bioconjegate Chem.、5、62-630、1994)などのハプテン保有能力がより高いＰＥＧコポリマーの調製が記載されている。ＰＥＧのビス（スクシニミジル）カーボネート誘導体などの両末端が活性化されたＰＥＧ誘導体を、リジンなどの多機能性ジアミンと共重合する。リシルカルボキシル基が重合プロセスに関連しない（−Ｌｙｓ（ＣＯＯＨ）−ＰＥＧ−Ｌｙｓ（ＣＯＯＨ）−ＰＥＧ−）_n反復単位を含むこのような共重合生成物を、ＤＴＰＡなどのハプテン残基またはＳＮ−３８などの薬物残基の付着のために使用することができる。ＤＴＰＡなどのハプテンまたはＳＮ−３８などの薬物を、ＰＥＧ−ポリリシル複合物の末端上に残存する遊離のカルボキシル基と反応させることもできる。最も好ましくは、大量のアミノ酸含有量を使用し、薬物をアミノ酸側鎖に付着させる。認識ハプテンを、ＰＥＧ誘導体の末端に添加する。
【００４１】
認識ハプテンおよび薬物を保有するために使用することができる他の合成ポリマーには、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＭＰＡ）コポリマー、ポリ（スチレン−無水マレイン酸コポリマー（ＳＭＡ:polystyrene-co-maleic acid/anhydride）、ポリ（ビニルエーテル無水マレイン酸）（ＤＩＶＥＭＡ）、ポリエチレンイミン、エトキシル化ポリエチレンイミン、スターバーストデンドリマー、およびポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）が含まれる。例として、多数の無水物単位から構成されるＤＩＶＥＭＡポリマーを限定量のＳＮ−３８と反応させて、ポリマー骨格上の薬物の所望の置換比を得る。残存する無水物基を水性条件下で切断して、遊離のカルボン酸基を得る。限定数の遊離カルボン酸基を標準的な水溶性ペプチドカップリング剤（例えば、ＥＤＡＣ）［貢献者：定義のこと］を使用して活性化し、遊離アミノ基を有する認識部分とカップリングさせる。抗体が既に化合物のＨＳＧ部分に対して惹起しているので、後者の例は、ヒスタミニル−スクシニル−グリシル−リジンアミド（ＨＳＧＫ−ＮＨ₂）である。次いで、遊離εリジン残基は、認識ハプテンのポリマー骨格への付着点となる。最後に、一定の例では、使用ポリマーは天然に存在するポリマーであり得る。これの例は、７個の遊離チオール基を有する低分子量タンパク質のアポメタロチオネイン(apometallothionein)の使用である。このタンパク質をジスルフィド交換によってカリケアミシン(calicheamicin)とカップリングさせて、ジスルフィド結合したポリカリケアミシン複合物を生成する。さらに、タンパク質は、任意の薬物複合化の前に、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＨＳＧなどの認識ハプテンを有するように改変された限定数のリシル残基を有し得る。
【００４２】
放射性核種および認識ハプテンの保有に有用なポリマーを、特定の放射性核種の保有についてのその適合について選択する。ポリマー骨格はアミノ酸からなる場合、例えば、全骨格アミノ酸はＤまたはＬ型であっても、これらの型が混合していてもよい。例えば、放射性核種¹³¹ヨウ素の保有に有用なポリマーには、純粋にＤ型チロシンアミノ酸から作製されたポリマーおよびポリ（Ｇｌｕ．Ｔｙｒ）［１：１］、ポリ（Ｇｌｕ．Ｔｙｒ）［４：１］、およびポリ（Ｌｙｓ．Ａｌａ．Ｇｌｕ．Ｔｙｒ．）［５：６：２：１］などの無作為なコポリマーが含まれる。これらの例では、ポリマーは、当分野で周知の方法を使用した放射性ヨウ素に容易に置換されるチロシンアミノ酸残基を含む。
【００４３】
１つの実施形態では、ｍｓＡｂの捕捉アームは、ポリマー複合物のポリマー骨格に付加した認識ハプテンを認識する。ポリマー複合物が個別の認識ハプテンを含む場合、ポリマー複合物の一般式は、（認識ハプテン）_n−（ポリマー骨格）−（薬剤）_m（式中、ｎおよびｍは０を含む整数である）である。しかし、ｎおよびｍの両方を０にできない。ｍが０である場合、認識ハプテンは必ず標的部位に標的される薬剤として作用する。同様に、ｎが０である場合、ポリマー骨格または薬剤は、捕捉アームのハプテンまたは抗原として作用する。
【００４４】
認識ハプテンの例には、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）の金属イオンキレートが含まれるが、これらに限定されない。少なくとも２つの独立した研究所によって、抗体はインジウム−ＤＴＰＡに対して反応性を示した。低分子量複合体として放射免疫診断および放射免疫治療で使用する場合、このような金属キレートは、これらが腫瘍予備ターゲティングｍｓＡｂに結合しない場合に泌尿器系を介して迅速に排泄されるという望ましい性質を有する。この認識系の型では、抗体は、遊離のキレート剤またはキレート（キレート剤の金属複合体）に対して反応性を示す。さらに、インジウム−ＤＴＰＡに対する抗体は、キレート剤が異なる金属と複合体化する場合にＤＴＰＡに対して異なる親和性を有し得る、または有する。多特異性抗体の捕捉アームを、キレートによって保持された簡単に変化する金属によって親和性を調整することができるので、これを有利に使用することができる。１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）またはＮ，Ｎ’−ジ［２−ヒドロキシ−５−（エチレン−３−カルボキシ）ベンジル］エチレンジアミンＮ，Ｎ’−二酢酸（ＨＢＥＤ）などの他の金属キレート剤に対して抗体を惹起することもできる。大環状キレートＤＯＴＡに対して惹起された抗体は、中心の環が立体的に強固であるので、より多くの異なる金属置換基を受け取ることができる。したがって、種々の金属置換基を有するか、金属をまったく含まない場合でさえも、抗ＤＯＴＡｍＡｂを使用することができる。好ましい実施形態では、本発明のｍｓＡｂは、ＤＯＴＡまたはＤＯＴＡの金属複合体を認識または結合する捕捉アームを含む。
【００４５】
本発明の認識ハプテンは、キレートまたは金属キレートである必要がない。強力な免疫応答を得ることができる他の低分子量の分子を使用して抗体を調製することができる。これの例は、抗体が惹起された親水性種であるヒスタミニル−スクシニル−グリシン（ＨＳＧ）ハプテンである。６７９と呼ばれる１つの特定の抗体が科学論文で広く記載されている。多特異性抗体の捕捉アームのこの型および抗キレート型を、天然で親水性を示し、低分子量の診断薬および治療薬と共に使用されるようにデザインした。本発明を使用して、ポリマーにより最終治療薬の大部分の物理的性質が与えられるので、この上記の親水性の高さはあまり厳密ではない。同様に、これによりインビボ条件下で有用な抗体の惹起に使用することができるはるかにたくさんの免疫原を意図することができる。一般的に使用されている免疫原には、フルオレセインおよび２，４−ジニトロフェニル誘導体などが含まれる。さらに、認識ハプテンには、ペプチドまたは他の分子内に含まれるアミノ酸残基を含み得る。
【００４６】
あるいは、ポリマー骨格自体に含まれるエピトープを認識ハプテンとして使用することができる。
【００４７】
最適な薬物(a drug of choice)が置換されたポリマーを、ＫＬＨなどの周知の免疫原性剤に付着した最適な薬物と同様に、免疫原として使用することもできる。ポリマーまたは薬物−ポリマー複合物を、免疫原性を増強するために高分子と付着させることができ、この複合物を免疫原として使用し、標準的な方法を使用して抗体発現についてのスクリーニングを行った。特定の薬物に対する抗体の産生は有利であり得る一方で、ポリマー骨格に対する抗体の産生は「普遍的」認識ＭＡｂの産生に有利であり得る。したがって、ＤＴＰＡ、ＨＳＧ、またはＤＯＴＡなどの個別の認識単位を使用する場合、二次抗体認識単位はいかなる特定の薬物とも関連せず、同一のポリマー骨格に複合化した種々の薬物に対して同一のｍｓＡｂを使用することができる。２つの異なるポリマー−薬物複合物を現在の併用化学療法と類似の状況で組み合わせて使用する場合（異なる作用様式でのいくつかの薬物の使用における利点を得るため）、この実施形態は有用である。
【００４８】
ポリマー複合物の認識ハプテンは、公知の免疫原認識部分（例えば、公知のハプテン）を含み得る。公知のハプテン（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ））を使用して、抗体に対するポリマー複合物の特異性を高める。ハプテンに対して惹起された抗体が公知であり、本発明の多特異性抗体に組み込むことができるので、これが起こる。したがって、付加したキレート剤またはキレートとのポリマー複合物の結合は、本発明の抗体または抗体フラグメントに対する特異性が高い。ポリマー複合物に付加されるべきハプテンの別の例は、ビタミンＢ１２である。抗Ｂ１２ｍＡｂは公知であり、遊離血清Ｂ１２は存在しないので、ビタミンＢ１２の使用は有利である。したがって、抗体に対して高い特異性を示し得る。
【００４９】
別の実施形態では、画像化および／または治療に使用される放射性核種を、元の認識ハプテンの設計に組み込むことができる。例えば、Ａｃ−Ｇｌｙ−Ｄ−ヨード−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｃ）−Ｇｌｙ−Ｄ−ヨード−Ｔｙｒ−Ｄ−ＯＨを、ヨウ素含有ペプチドと反応性を示す抗体の惹起という明確な目的の免疫原として使用することができるが、同一のペプチドの非ヨードバージョン（すなわち、Ａｃ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｃ）−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−ＯＨ）は使用できない。後者を超える前者に対する抗体（Ａｂ）の特異性を、標準的スクリーニング技術を使用して証明することができる。この実施形態で特に重要なものは、放射免疫アッセイ（ＲＡＩＴ）のためにα粒子放出アスタチンで置換されたペプチドを認識するＡｂ、したがってｍｓＡｂを作製するための免疫原としてのアスタチン置換ペプチドの使用である。他の実施形態では、任意のハプテンを、例えば、¹⁸フッ素、臭素、およびヨウ素の核種（例えば、¹²⁴ヨウ素、および¹²³ヨウ素）を含む元の免疫原の設計に組み込むことができる。同様に、他の非金属（例えば、³²Ｐ、³³Ｐ、および³⁵Ｓ）を使用することができる。
【００５０】
薬物ハプテンを有するポリマーと同様に、本発明で使用されるｍｓＡｂを、ポリマー骨格、放射性核種含有ハプテン、または放射性核種部分から離れたハプテンに対して惹起することができる。個別の数の認識部分（例えば、１つまたは２つのみ）を付加した放射性核種−ハプテンの数と無関係にポリマーに添加することができるので、後者の実施形態が特に好ましい。インジウム−ＤＴＰＡおよびＤＯＴＡならびに他の認識ハプテンなどの特異的放射性各種ハプテンに対して抗体を惹起した。１つの顕著な例は、低分子量のハプテンＨＳＧに対して惹起した６７９と呼ばれる抗体である。
【００５１】
任意の有用な核種は、本発明の範囲内であり得る。¹¹¹インジウムまたは⁹⁰イットリウムなどそれぞれの有用な診断または治療特性を有する放射性核種が特に好ましい。他の有用な核種には、¹⁸Ｆ、³²Ｐ、⁴⁷Ｓｃ、⁶²Ｃｕ、⁶⁴Ｃｕ、⁶⁷Ｃｕ、⁶⁷Ｇａ、⁶⁸Ｇａ、⁸⁶Ｙ、⁹⁰Ｙ、⁸⁹Ｚｒ、Ｔｃ−９９ｍ、¹⁰⁹Ｐｄ、¹¹¹Ａｇ、¹¹¹Ｉｎ、¹²³Ｉ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、¹⁵³Ｓｍ、¹⁵⁵Ｇｄ、¹⁵⁷Ｇｄ、¹⁶¹Ｔｂ、¹⁷⁷Ｌｕ、¹⁸⁶Ｒｅ、¹⁸⁸Ｒｅ、¹⁹⁷Ｐｔ、²¹²Ｐｂ、²¹²Ｂｉ、²¹³Ｂｉ、²²³Ｒａ、および²²⁵Ａｃが含まれるが、これらに限定されない。
【００５２】
放射性金属核種の強固な結合には、放射性金属のためのキレート剤がしばしば必要となる。タンパク質アポメタロチオネインなどの天然に存在するポリマーキレート剤を使用することができる。低分子量キレートの放射性標識で使用される標準的な放射性標識方法および注意を使用して、放射性標識キレートポリマーを調製することができる。例えば、¹¹¹インジウムおよび⁹⁰イットリウムなどの放射性金属を使用した手順には、一般に、純度の高い放射性核種の供給物、脱イオン水を含む全ての緩衝液、ならびに放射性標識手順の間に任意の試薬で使用されるガラス器具およびプラスチック器具の酸洗浄が必要である。放射性標識反応に伴って低酸素緩衝液およびアルゴン雰囲気を使用した、標識を行うために化学的還元工程が必要な¹⁸⁸レニウムなどの放射性金属を使用した手順を行うことが最良である。
【００５３】
ポリマー複合物を、罹患組織の治療または同定に有用な種々の薬剤に複合化させることができる。ポリマー複合物に複合化する薬剤は、治療薬、ペプチド、酵素、および標識リガンドからなる群から選択されることが好ましい。本明細書中で使用される、用語「治療薬」を、標的組織内での細胞または生理学的応答を生じさせるか、誘発するか、開始させる任意の化合物または分子を意味するために使用する。当業者に自明であるべき細胞または生理学的応答の例には、イオン流入もしくは流出、セカンドメッセンジャー経路の開始、ＤＮＡ合成、ｍＲＮＡの翻訳、細胞の細胞周期の開始、細胞の細胞周期の停止、エンドサイトーシス、細胞からの分子の放出、エキソサイトーシス、内在化リガンドに対して作用する細胞質ゾルタンパク質、非プログラム細胞死（細胞毒性）、およびアポトーシスが含まれるが、これらに限定されない。本発明で使用される治療薬の例には、金属キレート複合体、薬物、プロドラッグ、放射性核種、ホウ素追加物(boron addends)、標識化合物、毒素、および他の効果分子（サイトカイン、リンホカイン、ケモカイン、免疫調節物質、放射線増感剤、アスパラギナーゼ、ホウ素追加物、および放射性ハロゲンなど）が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、ポリマー骨格に複合化する治療薬は、治療用放射性同位体、毒素、薬物、プロドラッグ、およびホウ素追加物からなる群から選択される。
【００５４】
本明細書中で使用される、用語「薬剤、リガンド、または化合物」は、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、ポリマー、または小分子を意味することが意図される。
【００５５】
本発明で使用される薬物には、ポリマー複合物に付加することができる限り、現在承認されているか依然として承認されていない任意の化学療法薬が含まれるが、これらに限定されない。典型的には、有用な既に承認されている薬物には、以下の薬剤およびこれらの薬剤の誘導体が含まれるが、これらに限定されない。アナストロゾール、アザシチジン、ブレオマイシン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エストラムスチン、エトポシド、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルタミド、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトタン、ミトザントロン、パクリタキセル、ペントスタチン、プロカルバジン、タモキシフェン、テニポシド、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビン。
【００５６】
さらに、ポリマー複合物は、ホウ素中性子捕捉療法（ＢＮＣＴ:Boron Neutron Capture Therapy）プロトコールで使用すべきホウ素追加物からなる治療薬を含み得る。ＢＮＣＴは、腫瘍局在化¹⁰ホウ素原子の中性子照射によって腫瘍細胞に電離放射線を送達させるようにデザインされたバイナリシステムである。ＢＮＣＴは、安定な同位体（同位体が豊富な¹⁰Ｂ）（天然存在度１９．８％で存在する）を熱中性子で照射して、α粒子および⁷Ｌｉ核が生成される場合に起こる核反応に基づく。これらの粒子の路程は約１細胞直径であり、高い線エネルギー付与が得られる。この核反応によって生成したたった数個の短距離１．７ＭｅＶα粒子で細胞核の標的およびその破壊に十分である。癌のＢＮＴＣを成功させるには、腫瘍部位で高濃度の¹⁰ホウ素を局在化させ、本質的にホウ素を含まない非標的器官を遊離させる方法が必要である。ＢＮＣＴのための予備ターゲティングｍｓＡｂを使用した患者の腫瘍治療のための組成物および方法は、本発明によって容易に改変することができ、本明細書中で参照して組み込まれる、米国特許第6,228,362号に記載されている。さらに、他の元素が中性子捕獲反応に適切である。１つの例はウラニウムである。大量のウラニウムを、フェリチンなどの天然に存在するキレート剤によって結合させることができる。このようなストラテジーは当分野で記載されている（例えば、本発明に容易に適用可能であり、その全体が本明細書中で参照して組み込まれる米国特許第6,228,362号およびその引例）。
【００５７】
さらに、ペプチドおよび酵素をポリマー複合物に複合化することができる。ポリマー複合物に複合化する酵素およびペプチドは、プロドラッグの活性化、体内の解毒経路の調節による通常の治療薬の有効性の改良、補因子としての作用、他のタンパク質のリガンドとしての作用、または薬物の標的特異的毒性の増加に有用であり得る。
【００５８】
本発明の１つの実施形態では、ｍｓＡｂを最初に被験体に投与し、その後ポリマー−酵素複合物を投与する。酵素が標的部位に予備ターゲティングされた後、細胞傷害薬であって、標的部位で作用することが公知のもの、または予備ターゲティングされた酵素によってインサイチューで薬物に変換されるそのプロドラッグ形態を注射する。薬物は、哺乳動物の通常の解毒プロセスを使用して解毒されて、毒性の低い中間体（最も一般的にはグルクロニド）を形成するものである。解毒中間体（例えば、グルクロニド）は、予備ターゲティング酵素によってそのより有毒な形態に再変換され、それにより標的部位での細胞傷害性が増大する。これにより、薬物が再循環する。同様に、投与したプロドラッグは、通常の生物学的プロセスによって活性薬物に変換し得る。予備ターゲティングされた酵素は、解毒薬物の再循環によって治療有効性を改良する。このアプローチを、任意の酵素−薬物対の使用に適合させることができる。類似の予備ターゲティングストラテジーは、米国特許出願第09/399,021号に記載されている。これらの方法を本発明に容易に適用することができ、その全体が本明細書中で参照して組み込まれる。
【００５９】
別の実施形態では、被験体への投与前に酵素−ポリマー複合物をターゲティングｍｓＡｂと混合することができる。酵素−ポリマー−ｍｓＡｂ複合物が標的部位に局在化し、非結合複合物が循環から除去されるのに十分な時間が経過した後、プロドラッグを投与する。上記のように、プロドラッグはその後予備ターゲティング酵素によってインサイチューで薬物に変換される。
【００６０】
本明細書中で使用される、用語「プロドラッグ」を、不活性状態で投与されてその後より活性な状態に変換される治療薬を意味するために使用する。さらに、プロドラッグを、投与時に活性化されて、その後より活性な形態に変換される薬剤を意味するためにも使用する。さらに、プロドラッグはまた、投与時のその活性に特異的ではなく、その後より特異的作用剤に変換されるのも意味し得る。上記のように、プロドラッグは、被験体内で変換してもしなくてもよい。変換はまた、プロドラッグが身体によってより活性であるか特異的である薬剤に天然に代謝される天然のプロセスであるか、より活性であるか特異的な状態にプロドラッグを変換させるためにさらなる薬剤を投与する合成プロセスであり得る。
【００６１】
抗癌治療に有用な一定の細胞傷害薬は、比較的血清に不溶性である。非複合形態で非常に有毒なものもあり、その毒性はプロドラッグへの変換によって非常に減少する。溶解性の低い薬物のより溶解性の高い複合物（例えば、グルクロニド（親水性酸のエステルまたは親水性アミンのアミド））への変換により、血清の水相での溶解性および静脈、動脈、または毛細血管の細胞壁を通過して腫瘍が浸漬した間質液に到達する能力が改良される。プロドラッグの切断により、標的部位に低溶解性薬物が沈着する。このようなプロドラッグから薬物への変換の多数の例は、Hansenに付与された米国特許第5,851,527号に開示されている。
【００６２】
肝臓における芳香族または脂環式アルコール、チオール、フェノール、ならびにアミンなどの一定の有毒物質のグルクロニドへの変換は、これらを解毒してより容易に尿中に排泄する体内での方法である。このような基質に変換することができる１つの抗腫瘍薬物の型は、アントラサイクリングリコシドであり、かつヒトβ−グルクロニダーゼの基質であることが示されているエピルビシン（ドキソルビシンの４−エピマー（アドリアマイシン））である。例えば、Arcamone、Cancer Res.、45、5995、1985を参照のこと。極性基のより少ない他のアナログは、より親油性が高く、このようなアプローチに有望であると予想される。芳香族または脂環式アルコール、チオール、またはアミン基を含む他の薬物または毒素は、このような複合物形成の候補である。これらの薬物またはこれらの他のプロドラッグ形態は、本発明の部位特異的増強法に適切な候補である。
【００６３】
プロドラッグＣＰＴ−１１（イリノテカン）は、カルボキシルエステラーゼによってインビボで活性代謝産物ＳＮ−３８に変換される。ＳＮ−３８は高度に有効な抗腫瘍薬であるにもかかわらず、その毒性のために薬用量を被験体に投与することができない。したがって、本発明の１つの適用は、腫瘍関連抗原およびハプテン（例えば、ジＤＴＰＡ）に特異的なｍｓＡｂを使用してこのような治療薬を腫瘍部位にターゲティングし、その後ジＤＴＰＡ−カルボキシルエステラーゼ−ポリマー複合物を注射することである。一旦適切な腫瘍：バックグラウンド局在化比が達成されると、ＣＰＴ−１１を投与し、腫瘍局在化カルボキシエステラーゼは腫瘍でＣＰＴ−１１をＳＮ−３８に変換するように作用する。その溶解性の低さにより、腫瘍周囲に活性ＳＮ−３８が残存し、それによりターゲティングされた抗原に陰性の隣接腫瘍細胞に効果を発揮する。これは、より有益な方法である。カルボキシエステラーゼの修飾形態は記載されており、本発明の範囲内である。例えば、Potterら、Cancer Res.、58、2646-2651および3627-3632、1998を参照のこと。
【００６４】
エトポシドは、グルクロニドの形成によって広範囲を解毒する広範に使用されている癌治療薬であり、本発明の範囲内である。例えば、Handeら、Cancer Res.、48、1829-1834、1988を参照のこと。グルクロニド複合物を細胞傷害薬から調製し、ｍＡｂ−グルクロニド複合物で予備ターゲティングした腫瘍の治療薬として注射することができる。例えば、Wangら、Cancer Res.、52、4484-4491、1992を参照のこと。したがって、このような複合物を、本明細書中に記載の予備ターゲティングアプローチと共に使用することもできる。同様に、カルボキシルエステラーゼおよびグルクロニダーゼと共に使用するためのダウノマイシンの誘導体に基づいてデザインされたプロドラッグおよびドキソルビシンが記載されている。例えば、Bakinaら、J.Med.Chem.、40、4013-4018、1997を参照のこと。本発明で使用することができるプロドラッグ／酵素対の他の例には、フェノールマスタードおよびβグルクロニダーゼのヒドロキシ誘導体のグルクロニドプロドラッグ；フェノールマスタードもしくはＣＰＴ−１１およびカルボキシペプチダーゼ；メトトレキセート置換αアミノ酸およびカルボキシペプチダーゼＡ；６−メルカプトプリンおよびドキソルビシンおよびβラクタマーゼなどの薬物のペニシリンまたはセファロスポリン複合物；リン酸エトポシドおよびアルカリホスファターゼが含まれるが、これらに限定されない。
【００６５】
本発明の他の実施形態では、体内の解毒経路の調節によって標的部位でプロドラッグを活性化するか通常の治療の有効性を改善することができる酵素を、認識ハプテンに複合化することができる。酵素−ハプテン−ポリマー複合物を、予備ターゲティングｍｓＡｂの投与後に投与し、標的部位に方向付ける。酵素が標的部位に局在した後、標的部位で作用することが公知の細胞傷害薬または予備ターゲティング酵素によってインサイチューで薬物に変換されるそのプロドラッグを注射する。上記のように、薬物は、哺乳動物の通常の解毒プロセスを使用して解毒されてより毒性の低い中間体（最も一般的には、グルクロニド）を形成するものである。解毒中間体（例えば、グルクロニド）は、予備ターゲティング酵素によってより有毒な形態に再変換され、それにより標的部位での細胞傷害性が増大する。これにより、薬物が再循環する。同様に、投与したプロドラッグは、正常な生物学的プロセスによって活性薬物に変換し得る。予備ターゲティング酵素は、解毒薬物の再循環によって治療有効性を改良する。このアプローチを、任意の酵素−薬物対の使用に適合させることができる。別の実施形態では、酵素−ハプテン−ポリマー複合物を、被験体への投与前にターゲティングｍｓＡｂと混合することができる。酵素−ハプテン−ポリマー−ｍｓＡｂ複合物が標的部位に局在化し、非結合複合物が循環から除去されるのに十分な時間が経過した後、プロドラッグを投与する。上記のように、プロドラッグはその後予備ターゲティング酵素によってインサイチューで薬物に変換される。
【００６６】
本発明の別の実施形態では、ポリマー複合物をプロドラッグに複合化することができる。予備ターゲティングｍｓＡｂを被験体に投与し、標的に局在化させ、その後循環で除去される。適切な期間後、プロドラッグ（例えば、ポリグルタミン酸（ＳＮ−３８−エステル）₁₀）を含むポリマー複合物を投与し、それによりプロドラッグが腫瘍標的に特異的に局在化する。腫瘍内および腫瘍周囲での速い細胞溶解速度により、腫瘍への細胞内供給源から放出される酵素の量が増大することが公知である。当業者は、適切に選択したプロドラッグがこれらの酵素によって活性することができるというこの事実を利用することができる。例えば、カルボキシルエステラーゼは、ポリグルタミン酸（ＳＮ−３８−エステル）₁₀のエステル結合の切断によってプロドラッグであるポリグルタミン酸（ＳＮ−３８−エステル）₁₀を活性化して、腫瘍に高濃度の遊離ＳＮ−３８を放出させる。あるいは、適切な酵素を、腫瘍部位にターゲティングすることもできる。
【００６７】
ポリマー複合物からの切断後、薬物は腫瘍細胞によって内在化される。あるいは、標的での架橋によってインタクトな複合体の一部として薬物を内在化することができる。ポリマー複合物は、腫瘍結合ｍｓＡｂの内在化を誘導して、それにより内在化されるべき高レベルの薬物により治療有効性を改善することができる。
【００６８】
種々のプロドラッグをポリマー複合物に複合化させることができる。上記のポリマーの使用例は、ＳＮ−３８（プロドラッグＣＰＴ−１１の活性代謝産物（イリノテカン））を使用して考慮されている。ＳＮ−３８は、エステラーゼ型酵素に感受性を示すアリールエステルを生成するために上記説明で使用した芳香族水酸基を有する。同様に、化学療法で広く使用されているカンプトセシンアナログであるトポテカンは、ＳＮ−３８と類似の様式で使用してエステラーゼ感受性ポリマー−プロドラッグを生成することができる利用可能な芳香族水酸基残基を有する。
【００６９】
ドキソルビシンはまた、カンプトセシンファミリーと類似の酸触媒反応を使用してカルボキシレート含有ポリマー複合物とカップリングさせることができる芳香族水酸基を含む。同様に、ダウノマイシン、エピルビシン、およびイダルビシンのようなドキソルビシンアナログを同様の様式でカップリングさせることができる。ドキソルビシンおよびポリマー複合物への化学結合に十分に活性なアミノ「化学結合手」を有する他の薬物を、多数の方法でこれらの遊離アミノ基を介して有効に複合物とカップリングさせることができる。遊離カルボン酸基を有するポリマーをインサイチューで活性化し、活性化したポリマーをドキソルビシンと混合して、薬物をアミド結合を介してポリマーの側鎖に直接付着させることができる。アミノ含有薬物を、エチレングリコビス（スクシニミジルスクシネート）(EGS)(Pierce Chemical Co.Rockford、IL)またはビス−［２−（スクシニミド−オキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン(BSOCOES)(Molecular Biosciences、Huntsville、AL)などの市販の切断可能な架橋剤との混合によってアミノ懸垂ポリマーとカップリングさせて、ビス（スクシニミジル）エステル基との反応後に２つのアミドとして２つのアミンを架橋することもできる。これらの基が酵素切断に対して感受性を示したままであるのでこれは有利である。例えば、（ドキソルビシン−ＥＧＳ）_n−ポリリジンは、エステラーゼなどの酵素によるＥＧＳ結合鎖中のジエステル基の酵素切断に感受性を示すままである。ドキソルビシンを、確立された手順（ＨｙＢｎ＝ｐ−Ｈ₂ＮＮＨＣ₆Ｈ₄ＣＯ₂Ｈ）を使用して種々のペプチド（例えば、ＨｙＢｎＫ（ＤＴＰＡ）ＹＫ（ＤＴＰＡ）−ＮＨ₂）に複合化させることもできる。Kanekoら、J.Bioconjugate Chem.、2、133-141、1991を参照のこと。
【００７０】
１つの好ましい実施形態では、ポリマー複合物に複合化させた治療薬は、ＤＴＰＡが予備ターゲティングｂｓＭＡｂの認識ハプテンを形成するＤＴＰＡ−ポリマーペプチド−ドキソルビシン複合物を形成するためのアミン残基およびキレート剤（ＤＴＰＡなど）を含むポリマー複合物とカップリングするドキソルビシンを含む。好ましくは、ポリマー複合物は、チロシル−リジンジペプチド（例えば、ポリ［Ｔｙｒ−Ｌｙｓ］（ＤＴＰＡ）−ＮＨ₂）を含み、より好ましくはさらにポリ［Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）］−ＮＨ₂を含む。ビス−ＤＴＰＡ含有ペプチドへのドキソルビシンフェニルヒドラゾン複合物が治療に特に望ましい。
【００７１】
メトトレキセートはまた、ドキソルビシンと類似の様式で活性化カルボン酸含有ポリマーへのカップリングに利用可能なアミノ基を有する。これは、アミノ基含有ポリマーへのカップリングのために活性化することができる２つのグルタミルカルボキシル基（αおよびγ）も有する。メトトレキセートの遊離のカルボン酸基をインサイチューで活性化し、活性化した薬物をアミノ含有ポリマーと混合し、アミド結合を介してポリマーの側鎖に薬物を直接付着させることができる。過剰な未反応または交差反応した薬物を、サイズ排除クロマトグラフィまたはイオン交換クロマトグラフィを使用してポリマー−薬物複合物から容易に分離する。
【００７２】
メイタンシノイドおよびカリケアミシン（エスペラマイシンなど）は、切断して化学的操作で有用な１つのチオールを含む化合物を生成することができる混合したジスルフィドおよびトリスルフィド結合を含む。チオメイテンシノイドまたはチオエスペラ−マイシンを、最初にペプチダーゼによる切断に感受性を示すマレイミド−ペプチドなどの架橋剤と反応させる。次いで、ペプチドのＣ末端を活性化し、ポリリジンなどのアミノ含有ポリマーにカップリングする。
【００７３】
さらに他の実施形態では、治療薬またはプロドラッグポリマーのインビボ標的への多特異性抗体指示送達を、併用化学療法および放射免疫治療を行うように放射性核種の多特異性抗体送達と組み合わせることができる。各治療薬をポリマー複合物に複合化して同時投与するか、第１のポリマー複合物の一部として核種を投与し、第２のポリマー複合物の一部として後の工程で薬物を投与することができる。１つの単純な実施形態では、１つのプロドラッグおよび１つの核種を含むポリマーを構築する。例えば、ポリマー骨格がペプチドポリマーから構成されるポリマー複合物を使用することができ、それによりＳＮ−３８がアリールエステルとしてγグルタミルカルボキシル基に付着し、キレートＤＯＴＡはアミドとしてεアミノ基に付着してポリマー−プロドラッグ−認識ハプテン複合体（例えば、ポリ［Ｇｌｕ（ＳＮ−３８）₁₀−Ｌｙｓ（Ｙ−９０−ＤＯＴＡ）₂］）を生成する。次いで、ＤＯＴＡキレートを、画像化および治療目的の種々の金属（¹¹¹Ｉｎ、⁹⁰Ｙ、¹⁵³Ｓｍ、¹⁷⁷Ｌｕ、および⁸⁹Ｚｒが含まれる）で放射性標識することができる。金属ＤＯＴＡ複合体がポリマー複合物上に認識ハプテンを示すことができるので、ＤＯＴＡ複合体の一部として使用した金属の唯一の要件は、使用した二次認識抗体が十分な親和性の高さでこの特定の金属−ＤＯＴＡ複合体を認識することである。一般に、この親和性（ｌｏｇＫ_a）は、６〜１１である。また、認識ハプテンが放射免疫療法薬（治療薬）と無関係なように、ポリ［Ｇｌｕ（Ｓｎ−３８）₁₀−Ｌｙｓ（Ｙ−９０−ＤＯＴＡ）_n（ヒスタミン−スクシネート）_m］（式中、ｎおよびｍは整数である）などの三置換ポリマーを使用することができる。次いで、プロドラッグを、腫瘍部位に存在するカルボキシルエステラーゼまたは第２のポリマー複合物を使用して部位にターゲティングされたカルボキシルエステラーゼによって活性化する。
【００７４】
あるいは、個別の工程での化学療法薬および放射免疫療法薬の投与によって、併用療法を行うことができる。例えば、ＣＥＡ−腫瘍を発現する被験体に、ＣＥＡに特異的に結合する少なくとも１つのアーム、および認識ハプテンがイットリウム−ＤＯＴＡの複合物であるポリマーに特異的に結合する少なくとも１つの他のアームを有するｍｓＡｂを最初に投与する。その後、被験体を、イットリウム−ＤＯＴＡ−βグルクロニダーゼの複合物を含むポリマー複合物で処置する。ｍｓＡｂおよび酵素の局在化およびクリアランスが十分に行われた後、第２のポリマー複合物を投与する。第２のポリマー複合物は、第１のポリマー複合物に依然として結合していない腫瘍において、ｍｓＡｂによって腫瘍に局在する。プロドラッグおよびその各酵素の標的部位への局在化により、酵素が基質を制限しないことの確認によって活性薬剤の生成が増大する。この実施形態は、当分野で現在実施されている現在のプロドラッグ法を顕著に改良するものである。
【００７５】
核種を前に投与したポリマー複合物の一部として送達させた後の工程でのプロドラッグ−ポリマー投与の別の利点は、照射と薬物療法との相乗効果を操作して最大にすることができることである。照射損傷により、ＲＡＩＴ後に腫瘍はより「漏出」しやすくなると仮定される。これにより、ポリマー−プロドラッグを腫瘍により完全かつ深く侵入させることができる。これにより、化学療法が改良される。
【００７６】
あるいは、ＲＡＩＴ療法薬をポリマー複合物よりもむしろｍｓＡｂに付着させることができる。例えば、⁹⁰Ｙ−ＤＯＴＡに複合化した抗ＣＥＡ×抗ＤＴＰＡｍｓＡｂを、ＣＥＡ発現腫瘍を有する被験体に最初に投与する。この例では、抗インジウム−ＤＴＰＡ抗体がイットリウム−ＤＯＴＡキレートに結合しないという点で、一定の抗キレートｍＡｂの選択性が得られるという利点が得られる。⁹⁰Ｙ−ＤＯＴＡ−抗ＣＥＡ×抗インジウム−ＤＴＰＡが腫瘍で最大になり、その後非標的組織が除去された後、インジウム−ＤＴＰＡ−グルクロニダーゼを含むポリマー複合物が注射され、ＣＥＡ腫瘍部位に特異的に局在化される。次いで、被験体にポリ（Ｇｌｕ）（ＳＮ−３８）₁₀などのポリマー−プロドラッグを注射する。後者は、化学療法を前に投与したＲＡＩＴと首尾よく組み合わせた単量体ＳＮ−３８を活性化するために腫瘍で選択的に切断される。
【００７７】
標的部位に抗原に特異的な少なくとも１つの結合部位および酵素に特異的な少なくとも１つの他の結合部位を含む多特異性抗体または抗体フラグメントを本発明の方法で使用することができることに留意すべきである。このような抗体は、注射前に酵素に結合させることができ、それにより酵素を抗体と共有結合させることが必要であるか、標的部位に注射および局在化することができ、非標的抗体が被験体の循環系から実質的に除去された後、酵素を予備ターゲティングｍｓＡｂに到達および結合し、インサイチューで抗体−酵素複合物を形成するのに十分な量および経路で注射することができる。
【００７８】
ポリマー複合物を、正常組織または罹患組織の同定に有用であり得る標識リガンドとして作用する種々の薬剤に複合化させることもできる。本発明の１つの好ましい実施形態では、ポリマー複合物に複合化させる薬剤は標識リガンドであり、また診断薬という。標識リガンドの例には、放射性同位体、着色剤（ビオチン−ストレプトアビジン複合体など）、造影剤、蛍光化合物もしくは分子、および核磁気共鳴造影法（ＭＲＩ）の増強剤が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、標識リガンドは、放射性同位体、核磁気共鳴造影法の増強剤、造影剤、および着色剤からなる群から選択される。
【００７９】
本発明の１つの実施形態の実施では、ポリマー複合物に複合化された診断薬の投与前にｍｓＡｂを投与する。罹患組織にｍｓＡｂが標的化するのに十分な時間の経過後、診断薬を投与する。診断薬の投与後、画像化を行うことができる。光が送達される種々の構造を直接または間接的に観察する手段によって体腔中の腫瘍を検出し、その後回収することができる。非電離放射線が送達されてこれらの構造から再捕獲することができる限り、任意の身体の部位での病変を観察することができる。例えば、高分解能かつ非侵襲性の画像化技術である陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）を、ヒト疾患の視覚化のために本発明の抗体と共に使用することができる。ＰＥＴでは、陽電子消滅崩壊中に得られた５１１ｋｅＶのγ光子を検出する。¹⁸フッ素および⁶⁸ガリウムを使用したＰＥＴのための類似の予備ターゲティングストラテジーは、それぞれ米国特許第6,187,284号および米国特許出願第09/644,706号に記載されている。これらの出願に記載の方法を本発明に容易に適用可能であり、その全てが本明細書中で参照して組み込まれる。
【００８０】
別の例として、本発明の抗体または抗体フラグメントを、光力学の診断方法または治療方法で使用することができる。この診断方法では、診断薬を例えば全身に注射し、レーザー誘起蛍光法を使用して、内視鏡によって光活性化薬に融合した癌部位を検出することができる。例えば、これは、初期肺腫瘍の蛍光気管支鏡の開示(Doironら、Chest、76、32、1979)（本明細書中で参照して組み込まれる）に提供されている。別の例では、本発明の抗体および抗体フラグメントを単光子放出で使用することができる。例えば、Ｔｃ−９９ｍ標識診断薬を、ｍｓＡｂの投与後に被験体に投与することができる。次いで、被験体をγカメラでスキャニングして、単光子放出コンピュータ断層撮影画像を得て、病変または腫瘍部位を定義する。
【００８１】
本発明を、光力学治療方法で使用することもできる。この方法では、光線感作物質（例えば、ジヘマトポルフィリンエーテルなどのヘマトポルフィリン誘導体）を被験体に投与する。例えば、波長６３０ｎｍの強力な赤色の光の使用によって抗腫瘍活性を開始する。皮膚が太陽光によってあまり光感作されない、より長い波長で有用なものを含む別の光線感作物質を使用することができる。このような光感作物質の例には、ベンゾポルフィリン一酸環Ａ（ＢＰＤ−ＭＡ:benzoporphyrin monoacid ring A）、スズエチオプルプリン（ＳｎＥＴ２）、スルホン化アルミニウムフタロシアニン（ＡｌＳＰｃ）およびルテチウムテキサフィリン（Ｌｕｔｅｘ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００８２】
ポリマー複合物投与のしばらく前にｍｓＡｂを投与することができる。当業者は試薬の用量およびタイミングを容易に得ることができ、これは使用される試薬の特定の性質に依存する。ｍｓＡｂ−Ｆ（ａｂ’）₂誘導体を最初に投与する場合、ポリマー複合物投与の待ち時間は１〜６日間が適切である。ＩｇＧ−Ｆａｂ’ｍｓＡｂ複合物が一次ターゲティングベクターである場合、ポリマー複合物投与前の待ち時間はより長く、好ましくは３〜１５日間の範囲である。多特異性融合タンパク質（例えば、抗ＣＥＡ Ｆａｂ×抗ペプチドｓｃＦｖ）が一次ターゲティングベクターである場合、ポリマー複合物投与前の待ち時間はより短く、好ましくは１〜５日間の範囲である。
【００８３】
標的部位への薬剤のターゲティング方法はまた、組織から非結合ｍｓＡｂを除去するための組織への除去組成物(clearing composition)の投与を含む。ｍｓＡｂの用量とポリマー複合物の用量との間の除去剤を投与する。本発明者らは、ｍｓＡｂのターゲティングアームを認識して結合する、グリコシル化抗イディオタイプＦａｂ’フラグメントからなる除去剤を発見した。この実施例では、ｍｓＡｂを投与し、標的部位に融合させる。残存ｍｓＡｂを除去するために、グリコシル化Ｆａｂ’フラグメントとして、ｍｓＡｂに対する抗イディオタイプＡｂを投与する。除去剤は、１価の様式でｍｓＡｂに結合し、その結合したグリコシル残基は全複合体を肝臓に指向させ、迅速に代謝される。その後ポリマー複合物を被験体に投与する。例えば、抗ＣＥＡ（ＭＮ １４Ａｂ）×抗ペプチドｍｓＡｂを組織に投与し、ｍｓＡｂを最も広い範囲で所望の標的部位に融合させる。残存ｍｓＡｂを除去するために、ＷＩ２と呼ばれるＭＮ−１４に対する抗イディオタイプＡｂをグリコシル化Ｆａｂ’フラグメントとして投与する。ｍｓＡｂのＭＮ−１４アームに対するＷＩ２Ａｂの親和性は高く、除去機構は他の開示された機構と異なり（Goodwinら、前出を参照のこと）、ＷＩ２−Ｆａｂ’は１価の部分であるので架橋を含まない。
【００８４】
本発明はまた、被験体の組織または組織サンプル内の標的部位のターゲティングに有用なキットであって、（ａ）該組織内の抗原に結合するターゲティングアームとポリマー複合物に結合する捕捉アームとを含む多特異性抗体または抗体フラグメントと、（ｂ）該捕捉アームに結合するポリマー複合物であって、治療薬、ペプチド、酵素、および標識リガンドからなる群から選択される該薬剤に結合したポリマーを含むポリマー複合物とを含むキットを提供する。罹患組織の同定または治療を容易にする装置もまたキット中に含めることができる。例には、シリンジなどの適用デバイスが含まれるが、これらに限定されない。罹患組織の同定または治療用の開示の発明の使用に必要な溶液もキット中に含めることができる。
【００８５】
好ましい実施形態では、本発明によって提供されるキットのポリマー複合物は、認識ハプテンをさらに含む。
【００８６】
好ましい実施形態では、キットのｍｓＡｂは、本来モノクローナルまたはポリクローナルであり得るが、モノクローナルが好ましい。さらに、ｍｓＡｂのターゲティングアームおよび捕捉アームは、本来モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。好ましくは、標的アームまたは捕捉アームのいずれかがモノクローナルである。最も好ましくは、標的アームおよび捕捉アームの両方がモノクローナルである。
【００８７】
別の好ましい実施形態では、キットのｍｓＡｂは標識を有するように操作することができる。ｍｓＡｂが有することができる標識の例には、ビオチン−ストレプトアビジン複合体および放射性同位体などの標識リガンドが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明のｍｓＡｂは放射性標識されている。
【００８８】
別の好ましい実施形態では、キットのｍｓＡｂはキメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体であるが、より好ましくはヒト抗体またはヒト化抗体である。さらに別の好ましい実施形態では、ｍｓＡｂのターゲティングアームおよび捕捉アームは、キメラ抗体、ヒト抗体、またはヒト化抗体であり得る。好ましくは、標的アームまたは捕捉アームのいずれかはヒト抗体である。最も好ましくは、標的アームおよび捕捉アームの両方がヒト抗体またはヒト化抗体である。
【００８９】
１つの好ましい実施形態では、本出願によって提供されたキットはまた、組織から非結合ｍｓＡｂを除去する除去組成物を含み得る。除去剤を、ｍｓＡｂの投与または適用とポリマー複合物の投与または適用との間に投与することが好ましい。
【００９０】
別の好ましい実施形態では、本発明のキットは、薬物またはプロドラッグも含み得る。より好ましい実施形態では、キットは、プロドラッグを活性な薬物に変換する酵素と複合化されたポリマー複合物を含む。
【００９１】
本出願の発明は、一般に、疾患の治療または診断のための標的組織のためのｍｓＡｂ／ポリマー複合物の認識系に関する。したがって、ポリマー複合物およびその化学は、本発明の成功に不可欠である。
【００９２】
典型的な(exemplary)認識ハプテンを使用して、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＨＢＥＤ、およびＨＳＧなどのカルボキシル含有キレート誘導体を、カルボジイミド様試薬を使用した限定数のカルボン酸基の活性化の制御によってアミノ含有ポリマーと容易にカップリングさせる。イソチオシアネート誘導アナログを使用して、フルオレセインをアミン含有ポリマーと容易にカップリングさせる。同様に、アミノ含有認識ハプテンを、複数の遊離カルボキシル基を有する適切なカルボキシル活性化ポリマーと容易にカップリングさせる。アルデヒド基もしくはケトン基またはヒドラジニル基もしくはアミノ基を有するハプテンを、任意選択的に含まれるシッフ塩基型中間体を還元するための還元工程を使用して相補的機能性を有するポリマーと容易にカップリングさせる。遊離チオールを有するハプテンを、チオエーテルを得るための活性化ハロゲノ中間体のアルキル化、マイケル付加、またはジスルフィド結合形成によってポリマーと容易にカップリングされる。逆に、遊離チオールはポリマー上に存在し、求電子物質はハプテン上に存在し得る。ハプテン上の遊離水酸基を、適切に誘導化されたポリマーから開始するエーテルまたはエステルとして付着することができ、活性水素をマンニッヒ型縮合反応で使用することができる。
【００９３】
ポリマー複合物およびハプテンの例に関連する上記のいくつかを、本発明で使用すべき薬剤に等しく一般的に適用する。例えば、上記の一部は、ＳＮ−３８（プロドラッグＣＰＴ−１１の活性代謝産物（イリノテカン））などの上記の一定の薬物であった。ＳＮ−３８は、エステラーゼ型酵素に感受性を示すアリールエステルを生成するための上記の説明で使用した芳香族水酸基を有する。同様に、化学療法で使用されるカンプトセシンアナログであるトポテカンおよび１０−ヒドロキシカンプトセシンは共にエステラーゼ感受性ポリマー−プロドラッグを生成するＳＮ−３８と類似の様式で使用することができる利用可能な芳香族水酸基残基を有する。このクラスでは、タキソールおよび一定のビンカアルカロイドを置くこともできる。各例では、遊離水酸基を含む薬物を、エステル結合を使用してポリマーに付着させる。エステル結合使用の好ましい利点は、薬物−ポリマー結合を切断可能であり、細胞内または細胞外に局在する場合のいずれにおいても、遊離および活性薬物を長期間生成して標的部位でその効力を発揮することができることである。ドキソルビシンはまた、カンプトセシンファミリーと類似の酸触媒反応を使用して、カルボン酸含有ポリマー複合物に複合化させることができる水酸基を含む。
【００９４】
ドキソルビシン、およびポリマー複合物と化学カップリングするのに十分に活性なアミノ「化学結合手」を有する他の薬物を、多数の方法でこれらの遊離アミノ基を介して複合物と有効にカップリングさせることができる。遊離カルボン酸基を有するポリマーを、インサイチュー（ＥＤＡＣ；水溶性カルボジイミド）で活性化することができ、ドキソルビシンと混合された活性化ポリマーは、アミド結合を介してポリマーの側鎖に薬物を直接付着させる。アミノ含有薬物を、エチレングリコビス（スクシニミジルスクシネート）(EGS)(Pierce Chemical Co.Rockford、IL)またはビス−［２−（スクシニミド−オキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン(BSOCOES)(Molecular Biosciences、Huntsville、AL)などの市販の切断可能な架橋剤の混合によってアミノ懸垂ポリマーとカップリングさせて、ビス（スクシニミジル）エステル基との反応後に２つのアミドとして２つのアミンを架橋することもできる。好ましい複合物は、例えば、（ドキソルビシン−ＥＧＳ）_n−ポリリジンがエステラーゼなどの酵素によるＥＧＳ結合鎖中のジエステル基の酵素切断に感受性を示すままである複合物である。
【００９５】
ドキソルビシンの多数のアナログが調製されており、これらの多くを類似の方法でポリマーとカップリングさせることもできる。これらのアナログの例は、ドキソルビシン自体よりも腫瘍細胞に対して１００〜１０００倍有毒であると報告されている２−ピロリノドキソルビシン（２−ＰＤＯＸ）である。２−ＰＤＯＸを使用して、ドキソルビシン中に存在する遊離アミノ基をエナミンに変換した。しかし、２−ＰＤＯＸ分子の他の末端で、ケトン基および水酸基を複合化反応に利用可能である。水酸基を、標準的なエステル化化学を使用して活性化ポリグルタミン酸もしくはポリアスパラギン酸ポリマーまたは複数のこれらのサブユニットを含むコポリマーとカップリングさせて、エステル結合薬物−ポリマー複合物を生成することができる。別のアプローチでは、ポリ酸性複合物を標準的なカップリング化学を使用してヒドラジドに部分的に変換し、ヒドラジドをその後ドキソルビシンまたは２−ＰＤＯＸ中のケトン基で縮合することができる。形成したシッフ塩基を還元せずに使用するか、水素化ホウ素ナトリウムまたは水素化シアノホウ素ナトリウムとの短い反応によって還元することができる。
【００９６】
メトトレキセートなどの他の周知の薬物も、上記のドキソルビシンと類似の様式で活性化カルボン酸含有ポリマーとのカップリングに利用可能なアミノ基を有する。メトトレキセートはまた、アミノ基含有ポリマーとのカップリングのために活性化することができる２つのグルタミルカルボキシル基（αおよびγ）を有する。メトトレキセートの遊離カルボン酸基をインサイチュー（ＥＤＴＡ）で活性化し、アミノ含有ポリマーと混合された活性化した薬物は、アミド結合を介してポリマーの側鎖に薬物を直接付着させることができる。低分子量物質のポリマーへのほとんどの複合化と同様に、過剰な非結合または交差反応した薬物を、サイズ排除クロマトグラフィもしくはイオン交換クロマトグラフィ、または透析もしくはダイアフィルトレーションを使用してポリマー−薬物複合物から容易に分離する。
【００９７】
メイタンシノイドおよびカリケアミシン（エスペラマイシンなど）を、本発明の範囲内で使用することもできる。後者は、切断して化学的操作に有用な１つのチオールを含む化合物を作製することができる混合したジスルフィドおよびトリスルフィド結合を含む。ポリＧｌｕＬｙｓ−ＯＨなどのコポリマーを、リンカーにポリマーの遊離リジンアミノ基を付加するようにスクシニミジル／マレイミド架橋剤を使用して処理した。これにより、種々の置換比でチオール含有薬物と反応することができるポリマー上の複数のマレイミド残基が得られる。使用した架橋剤を、ペプチダーゼによる切断に感受性を示すように選択することができる。より好ましくは、カリケアミシンなどの薬物を、還元時にこれらが容易に活性化されるようにジスルフィド結合を介してポリマーに結合する。したがって、システインなどのチオール残基を含むコポリマーが意図される。この好ましい実施形態では、抗成長活性を誘導するカリケアミシン反応カスケードを誘発するために必要な還元プロセスは、細胞外環境と対照的に還元性の高い細胞内区画で起こる傾向が強くなるようであることを強調することができる。したがって、認識ハプテン−ポリマー−薬物複合物によって架橋時に誘導的に内在化される多特異性ターゲティング薬が特に好ましい。重要な一般的問題は、薬物−ポリマー結合が化学結合安定性に関して変化することができ、ポリマー骨格と認識ハプテンとの間の結合が血清分解に対して強力かつ影響を受けないことである。
【００９８】
例えばカルボキシル基を含むクロロ、ブロモ、トシル、またはメシルマスタード誘導体を活性エステル、アジド、または酸塩化物中間体を使用してポリマーにカップリングさせることができる一方で、アルキル化部分が本質的にインタクトなままであるので、アルキル化剤として分類される薬物でさえ本発明の範囲内である。あるいは、マスタード剤の前駆体をポリマーにカップリングさせることができ、前駆体をハロゲン化または類似の反応によって活性薬剤に変換することができる。
【００９９】
ポリマーまたは認識ハプテンとして使用すべきペプチドは、固相支持体を使用する自動化ペプチド合成機ならびに標準的な反復的直交脱保護およびカップリング技術(standard techniques of repetitive orthogonal deprotection and coupling)によって都合よく合成される。その後キレート複合化に使用されるペプチド中の遊離アミノ基を、例えばアセチル化によって有機小部分で有利にブロックする。例えば、その集合樹脂から切断したＡｃ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｃ）−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−ＯＨを、活性エステル／無水物法を使用してその１つのカルボキシル部分を介して活性化し、複数の単位でＫＬＨにカップリングさせる。免疫原使用に、ジシステイニル含有ペプチドＡｃ−Ｃｙｓ（Ｙ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｃｙｓ（Ｙ）−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−ＯＨを、メチル化によって保護されたチオール基を使用して樹脂から除去して、Ａｃ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｃｙｓ−（Ｍｅ）−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−ＯＨ作製することができる。次いで、これを、同一の標準的方法を使用してＫＬＨカップリングを活性化することができる。ペプチドをその後の使用のためにｍｓＡｂ系内で調製する場合、これらを樹脂から有利に切断して、インビボでカルボキシペプチダーゼ活性を阻害する対応Ｃ末端アミドを作製する。
【０１００】
次いで、上記考察で個別に記載の成分を、以下の一般的アプローチを使用した被験体の治療に適用する。第１に、至適用量の多特異性抗体を経験的に決定し、ｍｇタンパク質／ｋｇまたは／ｍ²被験体の用語で示すことができる。第２に、腫瘍標的に投与される薬物の至適用量が決定されるハプテン−ポリマー−薬物複合物のタイミングおよび用量を、至適用量の多特異性抗体での予備ターゲティング後に再度経験的に決定する。これらなどの至適用量の決定を、薬理学および放射薬理学における標準的技術を使用して容易に行う。一旦基本用量およびタイミングが決定されると、方法をより一般的に適用する用意ができる。
【実施例】
【０１０１】
本明細書中で引用した全ての引例は、その全体が本明細書中で参照して組み込まれる。
【０１０２】
［実施例１］
〔ポリ−−グルタミン酸（ＳＮ−３８−エステル）₁₀の調製〕
１０ｇ（２〜６．６６×１０モル）のポリ−−グルタミン酸（１５〜５０ｋＤａ；Sigma Chemical Company）を、２００ｍＬの乾燥蒸留ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）および３．９２ｇ（１×１０^-2モル）のＳＮ−３８と混合する。塩化水素生成系（塩酸および濃硫酸の穏やかな混合および得られたガスの濃硫酸への通過）により、重量が５ｇ増加するまで乾燥塩化水素ガスをＤＭＦに添加する。混合物を、反応バイアルに戻る前にＤＭＦから水を除去するための乾燥硫酸マグネシウムを充填したソックスレー抽出機を使用して３時間加熱還流する。冷却後、生成物ポリ−−グルタミン酸（ＳＮ−３８−（−エステル）₁₀）を含むＤＭＦを、ＤＭＦに対して１０倍過剰のジエチルエーテルで処理する。回収した沈殿物をエーテルで洗浄し、水に入れ、水溶液をクロロホルムで抽出して、残存する遊離ＳＮ−３８を除去する。凍結乾燥固体としてポリ−−グルタミン酸（ＳＮ−３８−エステル）₁₀を回収し、ＳＮ−３８：ポリマー比を分光光度法で決定する。
【０１０３】
［実施例２］
〔ＡｃＬｙｓ（ＨＳＧ）Ｇｌｕ₆［１０−ヒドロキシカンプトセシン］₆Ｌｙｓ［ＨＳＧ］ＮＨ₂の調製〕
最初の樹脂結合リジンをアリルオキシカルボニルε保護基に置換し、最後の［Ｎ末端］リシル残基をそのεアミノ位で同様に保護する標準的な固相合成法を使用して、表題ペプチドを個別の物質として調製する。鎖合成の最後にＮ末端をアシル化する。ペプチド構築時のｔｅｒｔ−ブチルエステルとしてグルタミン酸γカルボキシル基を保護する。Ｆｍｏｃを使用してαアミノ基を保護し、Ｆｍｏｃ脱保護およびカップリングの連続ラウンドを使用して固相上にペプチドを調製する。２つのεＡｌｏｃ基を選択的に除去する。部分的に保護されたペプチドを、適切なカルボキシル基活性化剤を使用してその遊離カルボキシル基によって過剰のトリチル−ＨＳＧと反応させる。最後に、ｔｅｒｔ−ブチル保護基を、ＨＳＧ樹脂由来のトリチルと共にリシルからそれぞれ除去し、トリフルオロ酢酸を使用してペプチドを樹脂から切断する。１０−ヒドロキシカンプトセシンおよびＨＳＧ含有ペプチドを共に触媒およびＤｅａｎ−Ｓｔａｒｋ条件を使用してトルエン中で反応させて、エステルとしてペプチドグルタミン酸γカルボキシル基に結合した１０−ヒドロキシカンプトセシン部分と共にＡｃＬｙｓ（ＨＳＧ）Ｇｌｕ₆［１０−ヒドロキシカンプトセシン］₆Ｌｙｓ［ＨＳＧ］ＮＨ₂が生成される。
【０１０４】
［実施例３］
〔グルタミン酸のランダムコポリマーへのドキソルビシンのカップリング〕
ポリ（Ｇｌｕ，Ｇｌｕ−ＯＭｅ）（４：１）から構成される７０〜１５０ｋＤのランダムコポリマーを、過剰のヒドラジン水和物で処理し、室温で２４時間静置する。過剰のヒドラジンを透析の反復によって除去し、ｐＨ５でポリ（Ｇｌｙ，Ｇｌｕ−ＮＨＮＨ₂）を５倍過剰（評価したヒドラジンに対して）のドキソルビシンと混合する。混合物を一晩撹拌し、過剰なドキソルビシンを透析の反復によって除去する。ドキソルビシンの置換範囲を、分光光度法で決定する。任意選択的に、ドキソルビシンがポリマーに結合したシッフ塩基を、過剰のシアノ水素化ホウ素ナトリウムとの一晩の反応によって還元する。
【０１０５】
［実施例４］
〔メタロチオネイン−ＤＯＴＡへのカリケアミシンのカップリング〕
ＤＯＴＡ溶液を、１／１０のＮ−ヒドロキシ−スルホスクシニミドおよび１／１００のカルボジイミドカップリング剤ＥＤＡＣとの反応により、利用可能な４つの遊離カルボキシル単位のうちのたった１つを活性化させるために、限られた様式で活性化した。次いで、メタロチオネインサンプルを、ｐＨのリン酸緩衝液に対して透析し、メタロチオネインに対して１０倍過剰の活性化ＤＯＴＡキレート剤溶液で処理する。４℃で一晩カップリング反応を進行させ、１ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ６の無金属の０．２Ｍ酢酸アンモニウムに対する反復透析によって、メタロチオネイン−ＤＯＴＡを未反応生成物から精製する。次いで、ＤＯＴＡ−メタロチオネイン複合物を１０倍過剰（遊離チオール基に対して）のカリケアミシンと混合し、４℃で一晩反応させ、ｐＨ６の無金属の０．２Ｍ酢酸アンモニウムに対する反復透析によって非結合薬物から精製する。
【０１０６】
［実施例５］
〔ＤＴＰＡ−ポリマー複合物へのアルキル化剤のカップリング〕
２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）とアミノエチルメタクリレートとのランダムコポリマーを、ラジカル開始剤としてのアンモニウムペルオキシ二硫酸（６０℃、１６時間）によって生成する。遊離第一級アミノ基を含むｐ［ＤＭＡＥＭＡ］−コ−ＡＥＭＡ］生成物を、水に対する多数の透析によって精製する。これを一定量のＤＴＰＡ二無水物を含むリン酸緩衝液（ｐＨ８）で処理し、再度水に対して透析して非結合ＤＴＰＡを除去する。ＤＴＰＡ置換比を、漸増量の¹¹¹Ｉｎ含有冷塩化インジウム溶液でのアリコートの滴定によって評価する。化学療法薬であるクロラムブシルを、等量のジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシニミドを含む乾燥ジオキサンと混合する。２時間の撹拌後、形成されたジシクロヘキシルウレアを濾過して取り出す。利用可能な遊離アミノ基に対してモル過剰のエステル活性化クロラムブシルのジオキサン溶液を、５０％の最終ジオキサン濃度までＤＴＰＡ−ｐ［ＤＭＡＥＭＡ］−コ−ＡＥＭＡ］ポリマーを含むリン酸溶液（ｐＨ８）に添加する。３０分の反応後、塩酸でｐＨ３に調整し、クロラムブシル−ｐ［ＤＭＡＥＭＡ］−コ−ＡＥＭＡ］−ＤＴＰＡポリマーを、濾過によって不溶性薬物から精製し、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４）に対する反復透析によって精製する。
【０１０７】
［実施例６］
〔ポリグルタミン酸ポリマーに対する抗体の開発〕
ポリグルタミン酸（平均分子量１５，０００）を、１／２０モル（ポリＥに対して）のＮ−ヒドロキシスルホスクシニミドの存在下で１／２０モルの水溶液カルボジイミドＥＤＡＣ（ｐＨ４）で処理する。室温で３時間反応を進行させ、粗混合物をＫＬＨを含むリン酸緩衝液（ｐＨ８）に添加する。生成物を、ＰＢＳに対する反復透析によって精製する。これを、最初フロイント完全アジュバントを使用し、その後フロイント不完全アジュバントを使用する免疫担当マウスへの反復注射に使用する。抗体力価に関して免疫応答を測定するために、同一のポリグルタミン酸をより良好なプレート吸着のために非特異性ＩｇＧ分子（キャリアとして）にカップリングさせるか、ＥＬＩＳＡプレート上に直接吸着させることができる。良好な抗体力価を有する多数のマウスを選択し、標準的技術にしたがってこれらの動物由来の脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞株ＳＰ２／０に融合する。ポリグルタミン酸に対する反応性について３０００個までのクローンをＥＬＩＳＡでスクリーニングする。ポリグルタミン酸に結合するＩｇＧの分泌で同定されたこれらのクローンをサブクローン化し、正のハイブリッドを選択し、無血清培地での成長に適合させる。標準的な細胞培養法を使用して大量のＩｇＧを生成し、ＩｇＧまたはＩｇＧのＦ（ａｂ’）₂およびＦａｂ’フラグメントとしてカップリングさせ、以下に詳述した抗ＤＴＰＡ抗体と類似の様式で適切なターゲティングベクターにカップリングさせることができる。
【０１０８】
［実施例７］
〔ドキソルビシンに対する抗体の開発〕
ドキソルビシン（５４．３ｍｇ、１×１０^-4モル）を、２倍モル過剰の架橋剤ビス［スルホスクシニミジル］スベレート（ＢＳ³；Pierce Chemical Co.、Rockford II、１１４．４ｍｇ、２×１０^-4モル）と混合する。室温で３０分間活性化を進行させ、粗混合物を１００ｍｇのウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝液（ｐＨ８）に添加した。生成物［ドキソルビシン］₁₀−ＢＳＡをＰＢＳに対する反復透析によって精製し、最初フロイント完全アジュバントを使用し、その後フロイント不完全アジュバントを使用する免疫担当マウスへの反復注射に使用する。抗体力価に関してドキソルビシンに対する免疫応答を測定するために、薬物を非特異的キャリアタンパク質としてのオボアルブミンにカップリングさせ、後者の複合物を血清試験に使用することができる。良好な抗体力価を有する多数のマウスを選択し、標準的技術にしたがってこれらの動物由来の脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞株ＳＰ２／０に融合する。ドキソルビシン−オボアルブミンに対する反応性について３０００個までのクローンをＥＬＩＳＡでスクリーニングする。ドキソルビシンに結合するＩｇＧの分泌で同定されたこれらのクローンをサブクローン化し、正のハイブリッドを選択し、無血清培地での成長に適合させる。標準的な細胞培養法を使用して大量の抗ドキソルビシンＩｇＧを生成し、ＩｇＧまたはＩｇＧのＦ（ａｂ’）₂およびＦａｂ’フラグメントとしてカップリングさせ、以下に詳述した抗ＤＴＰＡ抗体と類似の様式で適切なターゲティングベクターにカップリングさせることができる。
【０１０９】
［実施例８］
〔抗ＣＥＡ×抗ＤＴＰＡ二重特異性抗体の調製〕
ａ）ＩｇＧへのマレイミド基の導入：１ｍＬのｈＭＮ−１４ＩｇＧ（８．４５ｍｇ／ｍＬ）溶液のｐＨを、約３μＬの１Ｎ ＨＣｌでｐＨ７．２に調整する。これに１０．７μＬの１０ｍＭスルホ−ＳＭＣＣ（１．９倍モル過剰）の水溶液を添加し、反応混合物を室温で４５分間静置する。０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）を使用したSephadex G50/80によるサイズ排除クロマトグラフィによって精製する。タンパク質濃度（Ａ₂₈₀）およびマレイミド含有量を決定する（この条件下で０．９３マレイミド／ＩｇＧが見出された）。後者の決定は、既知の過剰の２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）との反応およびその後のエルマンアッセイによる未消費２−ＭＥの滴定を含む。
【０１１０】
ｂ）７３４Ｆ（ａｂ’）₂の７３４Ｆａｂ’への還元：７３４ＭＡｂ（１．２５ｍＬ；１０ｍｇ）のＦ（ａｂ’）₂フラグメントを、０．１ｍＬの１００ｍＭシステインを含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３）と混合する。緩衝液はまた、１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび１０ｍＭＥＤＴＡを含み、還元ジスルフィド結合の不十分な再酸化を防止するためにアルゴンを流す。反応物を、３７℃で５０分間インキュベートし、溶出緩衝液として０．１Ｍリン酸／５ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ６．５）を使用したSephadex G50/80でのサイズ排除クロマトグラフィによって精製する。
【０１１１】
ｃ）ｈＭＮ−１４−ＩｇＧと７３４−Ｆａｂ’フラグメントとの複合化：上記反応由来のＨＭＮ−１４−マレイミドおよび７３４Ｆａｂ’を１：１のモル比で混合する。反応混合物をアルゴンで流し、室温で約１時間インキュベートする（異なる反応では５０分から１．５時間を首尾よく使用することができる）。反応後、４０倍モル過剰のＮ−エチルマレイミド（２．６４ｍＭ水溶液）を添加し、混合物を４℃で一晩静置して、Ｆａｂ’フラグメント上の過剰のチオール基をブロックする。反応混合物を、Sephadex G50/80および０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）によるサイズ排除クロマトグラフィを使用して精製する。
【０１１２】
ｄ）ＩｇＧ×Ｆａｂ’ｍｓＡｂの精製：カラム（外径０．９ｃｍ）に３ｍＬのAffigel−ＤＴＰＡゲルを充填し、これを使用してＤＴＰＡ含有物質から非結合ＩｇＧを分離する。上記ｃ）由来の粗反応生成物を、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）で予め平衡化したAffigel−ＤＴＰＡカラムに通過させる。非結合ｈＭＮ−１４を、カラムに通す。結合画分を、１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ４．０）を使用してアフィニティカラムから溶離し、カラム由来の溶離物を合わせ、速やかにこのプロセスをプールし、０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）に対して緩衝液を３回交換して透析する。次いで、サンプルを濃縮し、溶離液として０．２Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）を使用したＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷカラムでの分離用サイズ排除ＨＰＬＣによって精製する。ＩｇＧ×Ｆａｂ’の分子量に対応する単量体の化合物を含む画分をプールおよび濃縮する。このスケールでこの方法を使用して、７．７ｍｇの複合物が得られる（収率２１．４％）。生成物は、ＨＰＬＣで１つのピークを示し、ＭＡＬＤＩ質量分析での平均分子量は１９６８０３（エラー率０．２％）であった。
【０１１３】
［実施例９］
〔ホルモン−抗体ターゲティング薬の調製〕
ソマトスタチンアナログＤＴＰＡ−オクトレオチドを、等価のカルボジイミドＥＤＡＣおよびＮ−ヒドロキシ−スルホ−スクシニミド（ｐＨ４）でそれぞれ処理する。混合物を２時間撹拌し、抗体６７９ＩｇＧ（抗ＨＳＧ）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）に対して２０倍モル過剰で添加する。４℃で一晩反応させた後、置換６７９ＭＡｂを、リン酸緩衝化生理食塩水に対する反復透析によって精製する。６７９ＭＡｂに対するＤＴＰＡ−オクトレオチドの置換比を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって決定する。薬剤は、多数のソマトスタチン受容体を発現する腫瘍に対して有用である。
【０１１４】
［実施例１０］
〔ＣＥＡ陽性腫瘍を発現する被験体の処置〕
ＣＥＡ抗原を発現する結腸癌を有する被験体に、１００ｍｇ／ｍ²用量の二重特異性抗体ｈＭＮ−１４×７３４Ｆ（ａｂ’）₂×Ｆａｂ’を投与する。２４時間後、被験体に等用量の上記の実施例２の方法を使用して事前に調製したＡｃＬｙｓ（ＤＴＰＡ）Ｇｌｕ₆［ＳＮ−３８］₆Ｌｙｓ［ＤＴＰＡ］ＮＨ₂ＤＴＰＡ−ポリマー−薬剤複合物のインジウム複合体を投与する。ＤＴＰＡ−ポリマー−薬物は、ｍｓＡｂでの予備ターゲティングのために腫瘍に選択的に局在化され、高濃度の活性薬ＳＮ−３８が局在化する。遊離のＳＮ−３８が局在化複合物から長時間放出され、腫瘍に対して治療効果を発揮する。
【０１１５】
［実施例１１］
〔メタロチオネイン−（ＨＳＧ）₂の調製〕
ヒスタミン−スクシニル−グリシン（ＨＳＧ）溶液を、等モルのＮ−ヒドロキシ−スルホ−スクシニミドおよび等モルのＥＤＣ（ｐＨ４）の水溶液との４時間の反応によって活性化する。リン酸緩衝液（ｐＨ８）に対して予め透析したメタロチオネインサンプルを、メタロチオネインに対して５倍モル過剰の活性化ＨＳＧ溶液で処理する。４℃で一晩カップリング反応を進行させ、無金属０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に対する反復透析によって、未反応副産物からメタロチオネイン−（ＨＳＧ）₂を精製する。次いで、その後の¹⁸⁸レニウムでの還元放射性標識のために、１００倍過剰（スズに対して）のグルコヘ複合プトン酸ナトリウムを含む８００ｍｇ／ｍＬのスズイオン溶液の作製によってメタロチオネイン−（ＨＳＧ）₂複合物を混合し、１〜１０ｍｇの割り当てでバイアルに等分し、ドライアイス上で凍結し、凍結乾燥させ、アルゴンでの真空または半真空下でバイアルをセプタムでシールする。
【０１１６】
［実施例１２］
〔¹⁸⁸レニウムでのメタロチオネイン−（ＨＳＧ）₂の放射性標識〕
実施例１５に記載のように放射性標識のために¹⁸⁸レニウムと調製および混合した１０ｍｇのメタロチオネイン−（ＨＳＧ）₂のサンプルを、¹⁸⁸タングステン／¹⁸⁸レニウムタンデム生成系から新たに溶離した¹⁸⁸レニウム放射性核種を含む生理食塩水の２ｍＬ画分（１００ｍＣｉ）で再構成する。メタロチオネイン−（ＨＳＧ）₂と¹⁸⁸レニウムとの混合物を含む溶液を９５℃で３０分間加熱し、＋７ペルレニウム形態からメタロチオネイン−（ＨＳＧ）₂ポリペプチドの複数の遊離チオール基によって結合することができる形態に¹⁸⁸レニウムを還元する。メタロチオネイン−（ＨＳＧ）₂への¹⁸⁸レニウムの組み込み率は、９０％超である。
【０１１７】
［実施例１３］
〔ｂｉｓＡｂおよび¹⁸⁸レニウム−メタロチオネイン−（ＨＳＧ）₂を使用したターゲティング〕
結腸特異性抗原ｐ（ＣＳＡ−ｐ）と呼ばれる抗原を発現する腫瘍を有する患者を、２００ｍｇのｂｉｓＡｂ Ｍｕ９×６７９ＩｇＧ×Ｆａｂ’［抗ＣＳＡ−ｐ×抗ＨＳＧ］で処置する。１週間後、循環に残存するｂｉｓＡｂの量は、５％ＩＤ／ｇに減少し、腫瘍沈殿物中の残存量は高いままであり、上記の実施例１６に記載のように調製した¹⁸⁸レニウム−メタロチオネイン−（ＨＳＧ）₂で患者を処置する。腫瘍抗原を介して予備ターゲティングしたＭｕ９×６７９ｂｉｓＡｂによる¹⁸⁸レニウム−メタロチオネイン−（ＨＳＧ）₂に対するＨＳＧ部分の認識により、治療用¹⁸⁸レニウム放射性核種を腫瘍部位に特異的に送達させることができる。
【０１１８】
［実施例１４］
〔インジウム−ＤＴＰＡ−ポリ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）［４：１］の調製〕
ポリ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）［４：１］を含む０．２Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）溶液を、過剰のＤＴＰＡ二無水物で処理する。急速な反応により、コポリマーのαアミノ基上のＤＴＰＡが置換されるか、添加した無水基が加水分解する。ＤＴＰＡ結合生成物を、水および酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．５）に対する反復透析によって低分子量物質から精製する。最終透析の前に、３倍モル過剰の酢酸インジウムをＤＴＰＡ−ポリ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）［４：１］中間体に添加し、最終分析の１時間前に撹拌する。残存した水および緩衝液成分の蒸発および凍結乾燥により、生成物を純粋にする。
【０１１９】
［実施例１５］
〔¹³¹ヨウ素−［インジウム−ＤＴＰＡ］−ポリ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）［４：１］の調製〕
実施例１８由来のインジウム−ＤＴＰＡ−ポリ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）［４：１］中間体を、０．３Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）および２００ｍＣｉの¹³¹Ｉ放射性核種と共にIodogen（商標）バイアルに添加した。反応物を室温で１５分間浸透し、放射性ヨウ化インジウム−ＤＴＰＡ−ポリ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）［４：１］をIndogen（商標）バイアルからいかなるさらなる酸化反応も停止させるためにアスコルビン酸が添加された清潔なバイアルに移す。必要に応じて、陰イオン交換カートリッジで未反応¹³¹ヨウ素を除去する。生成物¹³¹ヨウ素−［インジウム−ＤＴＰＡ］−ポリ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）［４：１］を、いつでも使用できる状態にする。
【０１２０】
［実施例１６］
〔ｂｉｓＡｂおよび¹³¹ヨウ素−［インジウム−ＤＴＰＡ］−ポリ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）［４：１］使用したターゲティング〕
上皮糖タンパク質（ＥＧＰ）と呼ばれる抗原を発現する腫瘍を有する患者を、２００ｍｇのｂｉｓＡｂＲＳ７×７３４Ｆ（ａｂ’）₂×Ｆａｂ’［抗ＥＧＰ×抗インジウム−ＤＴＰＡ］で処置する。４日後、循環中のｂｉｓＡｂの残存量は５％ＩＤ／ｇ以下に滴下し、一方で腫瘍沈殿物中の残存量は高いままであり、上記の実施例１９に記載のように調製した１５０ｍＣｉの¹³¹ヨウ素−［インジウム−ＤＴＰＡ］−ポリ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）［４：１］で患者を処置する。腫瘍抗原を介して予備ターゲティングしたＲＳ７×７３４ｂｉｓＡｂによる¹³¹ヨウ素−［インジウム−ＤＴＰＡ］−ポリ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）［４：１］に対するインジウム−ＤＴＰＡ部分の認識により、治療用放射性核種¹³¹ヨウ素を腫瘍部位に特異的に送達させることができる。
【０１２１】
さらなる目的の引例は、以下を含む。
【表１Ａ】

【表１Ｂ】

Claims (20)

1. 組織中の標的部位への薬剤のターゲティング方法であって、
   （ａ）該標的部位上の抗原に結合するターゲティングアームとポリマー複合物に結合する捕捉アームとを含む、多特異性抗体または抗体フラグメントを、該組織に投与するステップと、
   （ｂ）該捕捉アームに結合するポリマー複合物であって、治療薬、ペプチド、酵素、および標識リガンドからなる群から選択される該薬剤に複合化したポリマーを含むポリマー複合物を、該組織に投与するステップと
   を含む方法。
2. 前記ポリマー複合物が、（ポリマー骨格）−（薬剤）_m（式中、ｍは整数である）を含む一般式を有する請求項１の方法。
3. 前記ポリマー複合物が、前記ポリマーに複合化した認識ハプテンをさらに含む請求項１の方法。
4. 前記ポリマー複合物が、（認識ハプテン）_n−（ポリマー骨格）−（薬剤）_m（式中、ｎおよびｍは整数である）を含む一般式を有する請求項３の方法。
5. 前記認識ハプテンが、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ＤＴＰＡの金属複合体、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）、ＤＯＴＡの金属複合体、Ｎ，Ｎ’−ジ［２−ヒドロキシ−５−（エチレン−３−カルボキシ）ベンジル］エチレンジアミンＮ，Ｎ’−二酢酸（ＨＢＥＤ）、ＨＢＥＤの金属複合体、フルオレセイン、２，４−ジニトロフェニル誘導体、ビオチン、およびヒスタミニル−スクシニル−グリシンからなる群から選択される請求項３の方法。
6. 前記多特異性抗体または抗体フラグメントが放射性標識されている請求項１の方法。
7. 前記組織に除去組成物を投与するステップと、前記除去組成物により前記組織から非結合多特異性抗体または抗体フラグメントを除去するステップとをさらに含む請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
8. 前記多特異性抗体または抗体フラグメントがモノクローナル抗体である請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
9. 前記多特異性抗体または抗体フラグメントが、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
10. 前記ポリマーが、単一のアミノ酸のポリマー、２種のアミノ酸のコポリマー、３種のアミノ酸のコポリマー、４種のアミノ酸のコポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧの誘導体、ＰＥＧのコポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）、ポリスチレン−無水マレイン酸コポリマー（ＳＭＡ）、ポリビニルエーテル無水マレイン酸（ＤＩＶＥＭＡ）、ポリエチレンイミン、エトキシル化ポリエチレンイミン、スターバーストデンドリマー、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、アポメタロチオネイン、およびカリケアミシンからなる群から選択される請求項１の方法。
11. 前記治療薬が、治療用放射性同位体、毒素、薬物、プロドラッグ、およびホウ素追加物からなる群から選択される請求項１の方法。
12. 前記標識リガンドが、放射性同位体、核磁気共鳴造影法で使用するための増強剤、造影剤、および着色剤からなる群から選択される請求項１の方法。
13. 被験体の組織または組織サンプル内の標的部位のターゲティングに有用なキットであって、
    （ａ）該組織内の抗原に結合するターゲティングアームとポリマー複合物に結合する捕捉アームとを含む多特異性抗体または抗体フラグメントと、
    （ｂ）該捕捉アームに結合するポリマー複合物であって、治療薬、ペプチド、酵素、および標識リガンドからなる群から選択される該薬剤に結合したポリマーを含むポリマー複合物と
    を含むキット。
14. 前記ポリマー複合物が、認識ハプテンをさらに含む請求項１３のキット。
15. 薬物またはプロドラッグをさらに含む請求項１３のキット。
16. 前記酵素が、前記プロドラッグを活性な薬物に変換する請求項１５のキット。
17. 前記被験体または組織サンプルから非結合多特異性抗体または抗体フラグメントを除去することができる除去剤をさらに含む請求項１３〜１６のいずれかに記載のキット。
18. 前記多特異性抗体または抗体フラグメントが、モノクローナル抗体である請求項１７に記載のキット。
19. 前記多特異性抗体または抗体フラグメントが、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である請求項１７に記載のキット。
20. 前記多特異性抗体または抗体フラグメントが、放射性標識されている請求項１７に記載のキット。