JP2005500838A - ２，４−ジデオキシヘキソース及び２，４，６−トリデオキシヘキソースの製造方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、アルドラーゼ及び水の存在下、少なくとも２の炭素原子及び少なくとも１のα―水素原子を有する置換又は無置換のカルボニル化合物と置換又は無置換アルデヒドとから２，４−ジデオキシヘキソース又は２，４，６−トリデオキシヘキソースを製造する方法に関し、少なくとも２の炭素原子及び少なくとも１のα―水素原子を有する置換又は無置換のカルボニル化合物と置換又は無置換アルデヒドとの反応が、高くても６モル／反応混合物リットルのカルボニル濃度において行なわれ、かつ２，４−ジデオキシヘキソース又は２，４，６−トリデオキシヘキソースの最終濃度が反応混合物の少なくとも２質量％である。
本発明は、本発明に従う方法によって得られた２，４−ジデオキシヘキソース又は２，４，６−トリデオキシヘキソースの医薬品の製造、特にスタチンの製造における使用にもまた関する。
本発明は、本発明に従う方法によって得られた２，４−ジデオキシヘキソース又は２，４，６−トリデオキシヘキソースの医薬品の製造、特にスタチンの製造における使用にもまた関する。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルドラーゼ及び水の存在下、少なくとも２の炭素原子及び少なくとも１のα―水素原子を有する置換又は無置換のカルボニル化合物と置換又は無置換アルデヒドとから２，４−ジデオキシヘキソース又は２，４，６−トリデオキシヘキソースを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
そのような方法は米国特許出願公開第５，７９５，７４９号から公知であり、これは４‐置換３‐ヒドロキシブタナール中間体を経る２，４，６−トリデオキシヘキソースの合成について記載する。反応物としてアセトアルデヒド及び２−置換アルデヒドが、そして触媒としてアルドラーゼが使用される。
【０００３】
そのような酵素により触媒されるアルドール縮合の知られた欠点は、生産力が低いことである。これは特にそのようなアルドール縮合が一般的に低いアルデヒド濃度において行われるためである、なぜなら使用されるアルドラーゼは、より高いアルデヒド濃度においては高い程度まで不活性であるだろうと一般的に考えられているからである。使用される低濃度のもう一つの欠点は、反応の終わりに、反応混合物中の２，４，６−トリデオキシヘキソースの濃度が低く、このことは例えば精製の費用に強く影響する。結果として、そのような技術に基づいて２，４−ジデオキシヘキソース及び２，４，６−トリデオキシヘキソースを製造するための工業的に魅力的な方法を開発することが可能であろうとは期待され得なかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、酵素により触媒されるアルドール縮合により、２，４−ジデオキシヘキソース又は２，４，６−トリデオキシヘキソースの工業的に魅力的な製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
これは、２，４−ジデオキシヘキソース又は２，４，６−トリデオキシヘキソースの最終濃度が反応混合物の少なくとも２質量％であるように、少なくとも２の炭素原子及び少なくとも１のα―水素原子を有する置換又は無置換のカルボニル化合物と置換又は無置換アルデヒドとの反応を、高くても６モル／ｌの反応混合物のカルボニル濃度において行うことにより、本発明に従って達成される。
【０００６】
２，４−ジデオキシヘキソース及び２，４，６−トリデオキシヘキソースの公知の合成方法においては、高くても０．４モル／反応混合物リットルのカルボニル濃度が使用される。高くても反応混合物のおよそ１質量％である、２，４−ジデオキシヘキソース又は２，４，６−トリデオキシヘキソースの最終濃度が得られる。驚いたことに、６モル／ｌまでのカルボニル濃度が適切に使用され得、酵素の失活の程度は高いカルボニル濃度にもかかわらず制限されていることを、出願人は見出した。その結果、２，４−ジデオキシヘキソースまたは２，４，６−トリデオキシヘキソースのより高い最終濃度が得られ得、その結果、生産力が上がり、費用、特に生成物の精製が抑えられる。その結果、工業的に魅力的な方法を開発することが可能であることがわかった。
【０００７】
本発明の枠内において、カルボニルの濃度とは、少なくとも２の炭素原子及び少なくとも１のα―水素原子を有する置換または無置換のカルボニル化合物、置換又は無置換アルデヒド、及び少なくとも２の炭素原子及び少なくとも１のα―水素原子を有する置換又は無置換のカルボニル化合物と置換または無置換のアルデヒドとの反応において形成されるところの中間生成物の濃度の合計であると理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
カルボニルの濃度は、本質的に、合成工程の間、６モル／ｌ未満の値に保たれる。（非常に）短い間の少しだけより高い濃度はほとんど悪影響を有さず、従って本発明の枠内においてやはり容認されることは当業者にとっては明らかであるだろう。好ましくは、カルボニル濃度は反応混合物リットル当たり０．１〜５モル、より好ましくは反応混合物リットル当たり０．６〜４モルの間である。
【０００９】
２，４−ジデオキシヘキソース又は２，４，６−トリデオキシヘキソースの最終濃度は、反応の終わりにおける反応混合物に対して計算されて、実際には、一般的に５〜５０質量％、例えば８〜４０質量％、特に１０〜３５質量％の間である。
【００１０】
少なくとも２の炭素原子及び少なくとも１のα―水素原子を有する置換又は無置換のカルボニル化合物、置換又は無置換アルデヒド、及びアルドラーゼの添加の順序は、非常に重大というわけではない。好ましくは、少なくとも２の炭素原子及び少なくとも１のα―水素原子を有する置換又は無置換のカルボニル化合物の添加の前にアルドラーゼは反応混合物に添加される。特に、選択された条件下、使用される置換又は無置換アルデヒドが、使用される少なくとも２の炭素原子及び少なくとも１のα―水素原子を有する置換又は無置換のカルボニル化合物より少ない程度に自己と反応するとき、少なくとも２の炭素原子及び少なくとも１のα―水素原子を有する置換又は無置換のカルボニル化合物が添加される前に、アルドラーゼが置換又は無置換アルデヒドの少なくとも一部の溶液と混合されることがより好ましい。好ましくは、反応混合物の０．１モル／ｌより多い置換又は無置換アルデヒドが供給され、より好ましくは反応混合物の０．３モル／ｌより多く，特に０．６モル／ｌより多くが供給される。置換又は無置換アルデヒドの初期の濃度のこの選択は、酵素工程の初期反応速度に有利な影響を与える。アルドラーゼは反応の間、幾つかの部分において添加または計量供給され得る。
【００１１】
本発明の１の実施態様において、少なくとも2の炭素原子及び少なくとも1のα―水素原子を有する置換又は無置換のカルボニル化合物及び置換又は無置換アルデヒドの両方及びアルドラーゼはそれぞれ反応混合物に一回で添加される。そうすることにおいて、少なくとも2の炭素原子及び少なくとも1のα―水素原子を有する置換又は無置換のカルボニル化合物、置換又は無置換アルデヒド及びアルドラーゼは同時にそして続けて添加されることができる。この実施態様に従うと、少なくとも2の炭素原子及び少なくとも1のα―水素原子を有する置換又は無置換のカルボニル化合物及び置換又は無置換アルデヒドの添加された量の合計は一般的に反応混合物のリットル当たり６モルにのぼり、実際に、７〜１５質量％、特に反応混合物の５〜２０質量％の最終生成物の濃度が通常達成される。
【００１２】
本発明のもう１つの実施態様において、少なくとも２の炭素原子及び少なくとも１のα―水素原子を有する置換又は無置換のカルボニル化合物、及び／又は置換又は無置換アルデヒドの添加は、少なくとも２回に分けて行われ、それぞれ次の添加は、前の添加からの反応物の少なくとも一部が転化された後に行われる。これは、反応の過程において添加された少なくとも２の炭素原子及び少なくとも１のα―水素原子を有する置換又は無置換のカルボニル化合物及び置換又は無置換アルデヒドの量の合計を反応混合物の１リットル当たり６モルより多くする一方で、同時に、反応の間の任意の時点において反応混合物中のカルボニル濃度が、酵素の失活化を制限するために、６モル／ｌより低いことを可能にする。アルドラーゼは、所望されるならば、一回で添加されるか又は少なくとも２回に分けて添加されることができる。
【００１３】
さらに別の実施態様において、少なくとも２の炭素原子及び少なくとも１のα―水素原子を有する置換又は無置換のカルボニル化合物及び／又は置換又は無置換アルデヒドは反応の間に適宜反応混合物に計量して供給される。好ましくはこの実施態様において、置換又は無置換アルデヒドの少なくとも一部はアルドラーゼと共に供給される。アルドラーゼはもし所望されるならば、一回に添加されることができ、あるいは複数の部分において添加されるか又は適宜計量供給されてもよい。
【００１４】
最後の２つの実施態様は、４０質量％より高い２，４−ジデオキシヘキソース又は２，４，６−トリデオキシヘキソースの最終濃度に導くことができる。さらに、少なくとも２の炭素原子及び少なくとも１のα―水素原子を有する置換又は無置換のカルボニル化合物、置換又は無置換アルデヒド、及び／又はアルドラーゼの反応混合物への計量供給は、酵素コストのかなりの節約をもたらすことができることが見出された。
【００１５】
上の実施態様の組合せもまた可能である。
【００１６】
反応温度及びｐHは非常に重要というわけではなく、両者とも基質の関数として選択される。好ましくは反応は液相において行われる。反応は、例えば−５〜４５℃、好ましくは０〜１０℃の反応温度において、そして５．５〜９の、好ましくは６〜８のｐHにおいて行われることができる。
【００１７】
反応は、好ましくは多かれ少なかれ一定のｐHにおいて行われ、例えばバッファ又は自動滴定が利用される。バッファとして、例えば炭酸ナトリウム及びカリウム、リン酸ナトリウム及びカリウム、トリエタノールアミン／HCｌ、ビス―トリス―プロパン／HCｌ及びHEPES／KOHが使用され得る。好ましくは炭酸カリウム又はナトリウムバッファーが、例えば２０〜４００ミリモル／反応混合物リットルの濃度において使用される。
【００１８】
少なくとも２の炭素原子及び少なくとも１のα―水素原子を有する置換又は無置換のカルボニル化合物の添加された合計量：添加された置換又は無置換アルデヒドのモル比は、非常に重大というわけではなく、１．５：１〜４：１、特に１．８：１〜２．２：１の範囲である。他の比もまた使用され得るが有利性はなにも提供しない。
【００１９】
本発明に従う方法における触媒として、２つのアルデヒド、又はアルデヒドとケトンとの間のアルドール縮合を触媒するアルドラーゼが使用される。好ましくは使用される該アルドラーゼは２−デオキシリボース―５−ホスフェートアルドラーゼ（DERA, EC ４．１．２．４）またはこの突然変異体、より好ましくはEscherichia coliまたはその突然変異種のからのDERAである。使用されるべきDERAの量は非常に重大というわけではないが、例えば使用される反応物、反応物の濃度、所望される反応速度、反応の所望される継続期間及び他の経済的因子の関数として選択される。使用されるべきDERAの量は、５０〜５０００U／置換又は無置換アルデヒドミリモルの範囲である。１U(単位)は酵素活性の尺度であり、３７℃において１分当たり２−デオキシリボース‐５‐ホスフェートの１μｍｏｌｅの転化に対応する。
【００２０】
少なくとも２の炭素原子及び少なくとも１のα―水素原子を有する置換又は無置換のカルボニル化合物は好ましくは２〜６の炭素原子、より好ましくは２〜４の炭素原子を有する。例えばアルデヒド例えばアセトアルデヒド及びプロパナール、及びケトン例えばアセトン及びフロロアセトンが使用され得る。少なくとも２の炭素原子及び少なくとも１のα―水素原子を有する置換又は無置換のカルボニル化合物としてアルデヒドが使用されるとき、もちろん、その（ヘミ）アセタールの形、例えばアルコール、特にメタノール、エタノール、又はグリコールのアセタールとして使用されてもよい。
【００２１】
置換または無置換アルデヒドとして、２〜２０の炭素原子を有するアルデヒド例えばアセトアルデヒド、プロパナール、ブタナール、アセタールで保護されたジアルデヒドまたは置換アルデヒド、特に式ＨＣ（Ｏ）ＣＨ2Ｘを有する置換アセトアルデヒドが使用され得、ここでＸは最終生成物において必要とされる置換基と同じであるか又は転化され得る基を表し、例えばＣＮ基、または次の反応において脱離基として分裂し得る置換基、例えばハロゲン、特にＣｌ，Ｂｒ又はＩ；トシレート基；メシレート基；アシロキシ基特にアセトキシ基；フェナセチル基；アルコキシ基又はアリロキシ基、クロロアセトアルデヒドが特に適切である。
【００２２】
置換又は無置換アセトアルデヒドはそのまま、又はその（ヘミ）アセタール、例えばアルコール例えばメタノール、エタノール、又はグリコールのアセタールの形において使用されてもよい。
【００２３】
式１を有する２，４−ジデオキシヘキソース又は２，４，６−トリデオキシヘキソースは、
【化１】
例えば様々な医薬品の製造、特にＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の合成、より詳細にはスタチン類、例えばロバスタチン、セリバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン，及びフルバスタチン、特にワタナベらにより “Drugs of the future”, (1999年), 第24巻 第5号, 511〜513頁、 Bioorg. & Med. Chem. (1997年), 第5巻 第2号,437〜444頁に記載されるＺＤ‐４５２２の合成の望ましい中間体である。本発明は、従って医薬品、特にスタチン類の合成のための望ましい中間体である、例えば２−（６−ヒドロキシメチル―１，３−ジオキサン―４−イル）酢酸の合成に使用されることができる２，４−ジデオキシヘキソース又は２，４，６−トリデオキシヘキソースへの新しい、経済的で魅力的なルートを提供する。
【００２４】
式１を有する２，４−ジデオキシヘキソース又は２，４，６−トリデオキシヘキソースは、本発明の方法を用いて、アセトアルデヒド及びＨＣ（Ｏ）ＣＨ2Ｘ、ここでＸは上で定義された通りである、から製造され、次に例えば公知の方法により、対応する式２、
【化２】
を有する４−ヒドロキシ―テトラヒドロピラン―２―オンに転化され得る、ここでＸは上のように定義される。この転化のために適する試薬は、例えば塩基としての炭酸カルシウムと一緒に用いるＢｒ2（Tetrahedron Lett.第30巻 第47号, 1989年、6503頁）、重クロム酸ピリジニウムの塩化メチレン溶液（Carbohydrate Res.第300巻1997年301頁）及びテトラ―Ｎ―プロピルアンモニウムテトラ―オキソルテネート（J. Chem. Soc, Chem. Commun. 1987年、1625頁）である。
【００２５】
得られた４−ヒドロキシ―テトラヒドロピラン―２―オンは次にもし所望であれば式３を有する２−（１，３−ジオキサン―４−イル）酢酸誘導体に転化されることができる。
【化３】
ここでＸは上で定義した通りであり、Ｒ1，Ｒ2，及びＲ3はそれぞれ独立して１〜３の炭素原子を有するアルキル基を表す。この転化は例えば、適切なアセタール化試薬及び酸触媒の存在下行われ得る。
【００２６】
次に、２−(１，３−ジオキサン―４―イル)酢酸誘導体は塩基及び水の存在下、加水分解されて式４の塩を生成する。
【化４】
ここでＹは、アルカリ金属、アルカリ土類金属、又は置換若しくは無置換アンモニウム基、好ましくはＮａ，Ｃａ，又はテトラアルキルアンモニウム化合物を表し、かつここでＸ，Ｒ1及びＲ2は上で定義された通りである。加水分解に続いて、Ｙ＝Ｈである式４に従う対応する２−（１，３−ジオキサン−４−イル）酢酸に転化されることができる。
【００２７】
式４に従う対応する２−（１，３−ジオキサン−４−イル）酢酸の塩は、式３に従う２−（１，３−ジオキサン−４−イル）酢酸の対応するエステルに、自体公知である方法で転化されることができ、ここでＸ，Ｒ1，及びＲ2は上で定義された通りであり、Ｒ3は１〜１２の炭素原子を有するアルキル基、６〜１２の炭素原子を有するアリール基、または７〜１２の炭素原子を有するアラルキル基を表す。好ましくは２−（１，３−ジオキサン−４−イル）酢酸の塩は２−（１，３−ジオキサン−４−イル）酢酸の対応するｔ−ブチルエステルに転化される。
【００２８】
式３を有する２−（１，３−ジオキサン−４−イル）酢酸誘導体、ここでＲ3は１〜１２の炭素原子を有するアルキル基、６〜１２の炭素原子を有するアリール基または７〜１２の炭素原子を有するアラルキル基を表す、は、例えば米国特許出願公開第５５９４１５３号において記載されるように、式５を有する対応する２−（６−ヒドロキシメチル―１，３−ジオキサン−４−イル）酢酸、ここでＲ1、Ｒ2，及びＲ3は上で定義した通りである、に転化される得るか
【化５】
又は国際特許出願公開第２００００８０１１号におけるように、転化により式３に従う化合物、但しＸ＝アシロキシ例えばアセトキシ基、かつＲ1、Ｒ2、及びＲ3は上で定義された通りである、に転化され得、続いて一般的に公知である方法において水酸基によるアシロキシ基の置換が行われ得る。
【００２９】
式２を有する４−ヒドロキシ―テトラヒドロピラン―２−オン
【化６】
ここでＸは上で定義した通りである、もまた酸又は塩基の助けで、式６を有するジヒドロキシヘキサン酸に転化され得る。
【化７】
【００３０】
式６を有するジヒドロキシヘキサン酸は、次に式３の２−（１，３−ジオキサン―４−イル）酢酸誘導体に、例えば適切なアセタール化試薬及び酸触媒の存在下、転化されることができ、ここでＸ、Ｒ1、Ｒ2は上で定義された通りであり、Ｒ3は１〜１２の炭素原子を有するアルキル基、６〜１２の炭素原子を有するアリール基、または７〜１２の炭素原子を有するアラルキル基を表す。
【００３１】
本発明は実施例に基づいて説明されるが、それにより制限されない。
【実施例】
【００３２】
１．ＧＣ分析のための対照物質としての多量の６−クロロ―２，４，６−トリデオキシヘキソースの製造
７６ｍＬ(０．６０モル)の５０％クロロアセトアルデヒド溶液及び８４ｍＬ(１．４７モル)のアセトアルデヒドが、１０℃において０．６２Ｌの１００ｍＭＮａＨＣＯ3溶液に添加され、その後ｐＨは４ＮのＮａＯＨによってｐＨ７．０に調節された。酵素反応が２２０ｇの酵素溶液(２０５０Ｕ／ｇ)の添加により開始された。約１８時間の攪拌後、６−クロロ―２，４、６−トリデオキシヘキソースへの最大の転化がＧＣにより測定された。反応は１．７Ｌのアセトンの転化により停止された。４ｇのジカライトがこの混合物に添加され、約３０分の攪拌後、該混合物は濾過された。濾液は５時間、４０℃において真空下、気化された。得られたオイルは、シリカゲルカラム（400ｍＬ）上でカラムクロマトグラフィーにより精製され、石油エーテル(沸点：４０〜７０℃)と酢酸エチルとの体積比１：２の混合物からなる溶出液で溶出された。０．３３のＲf値を有する画分の気化の後、合計で２６ｇの６−クロロー２，４、６−トリデオキシヘキソースが単離された。用語、画分のＲf値は当業者にとって公知であり、カラムにおいてある画分が進んだ距離を、カラムにおいて移動溶媒が進んだ距離で割った値として定義されるか又はカラムにおいて、ある画分がある距離を進むのに必要とする時間を、カラムにおいて移動溶媒が同じ距離を進むのに必要とする時間で割った値として定義される。
【００３３】
６−クロロ―２，４、６−トリデオキシヘキソースの純度はP. P. LankhorstによりPharmacopeial Forum, 第22巻, 第3号, 2414〜2422頁において記載される方法に従って1ＨＮＭＲの手段により決定された。
【００３４】
２．ＧＣ分析
酵素反応の間の６−クロロ―２，４，６−トリデオキシヘキソースの濃度は、ガスクロマトグラフィー分析により測定された。Ｈｅｗｌｅｔ Ｐａｃｋａｒｄ社の水素炎イオン化検出器付ＧＣ、クロムパックＣＰ−Ｓｉｌ５ＣＢカラム（２５ｍ*０．２５ｍｍ、ｄr１．２μｍ）を装備された型式ＨＰ５８９０シリーズＩＩが使用された。アセトン中の既知の化学的純度（１）を用いて６−クロロ―２，４，６−トリデオキシヘキソースの較正曲線に基づいて濃度が測定された。
【００３５】
３．ＤＥＲＡ溶液の調整
組換えEscherichia coli細胞中のＤＥＲＡ酵素を過剰発現させるための標準の技術が適用された。そのような技術はSambrookらのMolecular Cloning : A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, ニューヨーク、1989年に記載されている。この場合、Escherichia coli W３１１０のｄｅｏＣ遺伝子が市販入手可能な発現ベクターpBADMyc-HisB（インビトロジュエン社、グロニンゲン、オランダ）中でクローン化された。遺伝子（終止コドンを含む）がポリメラーゼ連鎖反応により増幅され、ｄｅｏＣのＡＴＧ開始コドンがベクターのＮｃｏｌサイト上のＡＴＧコドンと同一になるようにベクター中のＮｃｏｌ及びＥｃｏＲＩサイトに導入された（翻訳融合）。ｄｅｏＣの終止コドンもまたクローン化されたので、Ｈｉｓタグを有する融合たんぱく、これもまたベクター上にコードされている、の生成が妨げられた。得られるプラスミドｐＢＡＤＤＥＲＡ２．２を有するEscherichia coli ＤＨ１０Ｂ細胞（ライフテクノロジーズ、ブレダ、オランダ）が１０Ｌの曝気されかつ攪拌されたタンク反応器において、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを有する複合Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ培地の上で培養され、アラビノースの添加により０．０１％まで誘導された。細胞密度を増加させるため、２つの追加的な水性溶液、純粋なグリセロールを含む水性溶液（フィード１）及び１３％のイースト抽出物及び１．３％のトリプトン（Ｄｉｆｃｏ社、ミシガン州、ＵＳ）を含む水性溶液（フィード２）が、細胞がＬＢ培地を消費した後、添加された。このようにして、約３５０ｇの湿った細胞が１０Ｌの培養液から得られ、該培養液は遠心分離により回収され、続いてｐＨ７．２のリン酸カリウムバッファ中に再懸濁され、再び遠心分離された。ペレットが−２０℃において貯蔵された後、上澄みが除去された。
【００３６】
文献、例えばＣｈｅｎらのJ. Am. Chem. Soc.第114巻,1992年, 741〜748頁 及びWongらの J. Am. Chem. Soc. 第117巻,1995年, 3333〜3339頁において、組換えE.Coli細胞からのＤＥＲＡの精製について様々な方法が記載されている。しかし、精製はアルドール反応におけるＤＥＲＡの有効な使用のための条件ではない、例えばWongらの J. Am. Chem. Soc. 第117巻,1995年, 3333〜3339頁を参照されたい。ＤＥＲＡの部分精製のために、標準的な技術が使用された。冷凍されたペレットが１００ｍＭのリン酸カリウムバッファ中にｐＨ７．２において懸濁され（１重量部の湿った細胞及び２重量部のバッファ）、その後細胞壁が連続超音波処理で破壊された。透明な粗抽出物が遠心分離により得られ、直接使用されるか又は−２０℃において貯蔵された。溶液はもし所望であるならば、超音波処理で、例えば１０，０００ドルトンのカットオフ値を有するミリポアの超音波膜（ミリポア社、ベドフォード、アメリカ合衆国）を使用して超音波によりさらに濃縮されることができる。この方法により得られた典型的な比活性は、溶液１ｇ当たり１４００〜５３００ユニットの間である。
【００３７】
４．ＤＥＲＡの活性の測定
ＤＥＲＡを合成する組換えE.Coliは、５０ｍＭのリン酸カリウムバッファ中で音波処理に付され、遠心分離されて（１８，５００ｒｐｍ、３０分）、細胞物質を除去した。得られる遊離の細胞抽出物は希釈され、リンクされた分光学的試験で使用された。この試験において、２−デオキシリボース−５−ホスフェートはＤ−グリセルアルデヒド―３−ホスフェートとアセトアルデヒドとに転化され、その後、トリオースホスフェートイソメエラーゼ（ＴＩＭ、ＥＣ５．３．１．１）の存在下、Ｄ−グリセルアルデヒド―３−ホスフェートはジヒドロキシアセトンホスフェートに転化された。最後の段階において、ニコチンアミンアデニンジヌクレオチドが還元型（ＮＡＤＨ）において消費され、それは３４０ｎｍにおける吸収の減少の測定を通して分光学的に追跡された。典型的にはｐＨ７．２の５０ｍＭのトリエタノールアミンバッファを２８７８．５μＭ、ＮＡＤＨの１２ｍＭの水溶液を３０μｌ、３０ユニットのＧＤＨ及び５００ユニットのＴＩＭを３．２Ｍの水性リン酸アンモニウム塩溶液中に含む酵素懸濁物を１１．５μＬ、及び２−デオキシリボース―５−ホスフェートの５０ｍＭ水溶液を３０μＬを含む３ｍｌの合計体積が使用された。反応は５０μｌの遊離の細胞抽出物を添加することにより開始された。温度は３７℃であった。活性は、Ｕ（ユニット）で表され、ここで１ユニットは３７℃において１分あたり１μモルの２−デオキシリボース―５−ホスフェートの転化に対応する酵素活性に等しく、３４０ｎｍにおける吸収の線形減少から計算された。
【００３８】
実施例Ｉ
バッチ実験における６−クロロ―２，４，６−トリデオキシヘキソースの合成
４５％クロロアセトアルデヒド溶液４．３ｍＬ（０．０３モル）及びアセトアルデヒド３．４ｍＬ（０．０６モル）が１００ｍＭのＮａＨＣＯ3のバッファ溶液３７ｍＬに４℃の温度において添加された。この混合物のｐＨは７．３であった。酵素反応は６．３ｍＬ（５２７０Ｕ／ｇ）の酵素溶液の添加により開始された。反応は７．５の一定のｐＨにおいて行われた。定期的に混合物はＧＣで分析された。反応は、６−クロロ―２，４，６−トリデオキシヘキソースの濃度が約８０ｇ／Ｌ（８質量％）に達した後、10ｍＬのアセトンの添加により停止された。
【００３９】
実施例ＩＩ
反復バッチ実験における６−クロロ―２，４，６−トリデオキシヘキソースの製造
実施例Ｉの実験が繰り返された。しかし、６−クロロ―２，４，６−トリデオキシヘキソースの濃度が約８０ｇ／Ｌに達した後、クロロアセトアルデヒドの45％溶液がさらに４．３ｍＬ(０．０３モル)、アセトアルデヒド３．４ｍＬ（０．０６モル）及び６．３ｍＬの酵素溶液（５２７０Ｕ／ｇ）が再び添加された。転化が一定の値に達しさらに増加しなくなるごとに、これはもう３回繰り返された。このようにして、合計でクロロアセトアルデヒドの45％溶液が０．１５モル及び０．３０モルのアセトアルデヒドが添加された。反応は７．５の一定のｐＨにおいて行われた。反応混合物からの試料はＧＣを用いて分析された。最終的な６−クロロ―２，４，６−トリデオキシヘキソースの濃度は約２４０ｇ／Ｌ（２４質量％）であった。
【００４０】
実施例ＩＩＩ
反応成分の計量供給による６−クロロ―２，４，６−トリデオキシヘキソースの合成
８４ｇ（１．０モル）のＮａＨＣＯ3が６．２Ｌの脱ミネラル化水に添加され、その後、該溶液は約２℃まで冷却された。続いて、７２．３ｍＬ（０．４モル）のクロロアセトアルデヒドの45％溶液がこれに添加され、その後、溶液のｐＨは32％ＨＣｌで７．３に調節された。酵素溶液（６．８×１０6Ｕ）がこの混合物に添加され、その後、体積が７．５Ｌに合わせられた。２時間の間に、合計で１．３Ｌ（９．５モル）の45％クロロアセトアルデヒド溶液及び０．９Ｌ（９．９モル）の５０％アセトアルデヒド溶液がこの混合物に計量供給された。この後、５時間の間に、０．８６Ｌ（９．５モル）の50％アセトアルデヒド溶液が添加された。反応混合物は２℃及び７．５の一定のｐＨにおいて一晩攪拌された。反応混合物の合計重量は１０．９ｋｇにのぼった。６−クロロ―２，４，６−トリデオキシヘキソース含有量はガスクロマトグラフィーにより測定され、１２６ｇ／Ｌ(１２．６質量％)であることが見出された。
【００４１】
実施例ＩＶ
反応成分の計量供給による６−クロロ―２，４，６−トリデオキシヘキソースの製造
１１．８ｇ(０．１４モル)のＮａＨＣＯ3が０．４４Ｌの脱ミネラル化水に添加され、その後、該溶液は約２℃まで冷却された。続いて１０．０ｍＬ（０．０７モル）のクロロアセトアルデヒドの４５％溶液がこれに添加され、その後溶液のｐＨは３２％のＨＣｌで７．３のｐＨに調節された。酵素溶液(１．０３×１０6ユニット)がこの混合物に添加された。２時間の間に、０．１９３Ｌ（１．３５モル）のクロロアセトアルデヒドの４５％溶液及び０．１２７Ｌ(１．４０モル)のアセトアルデヒドの50％溶液がこの混合物に計量供給された。この後５時間の間に、アセトアルデヒドの５０％溶液、０．１３４Ｌ（１．４６モル）が添加された。反応混合物は２℃及び７．５の一定のｐＨにおいて一晩攪拌された。６−クロロ―２，４，６−トリデオキシヘキソース含有量はガスクロマトグラフィーにより測定され、１８０ｇ／Ｌ(１８．０質量％)であることが見出された。
【０００１】
本発明は、アルドラーゼ及び水の存在下、少なくとも２の炭素原子及び少なくとも１のα―水素原子を有する置換又は無置換のカルボニル化合物と置換又は無置換アルデヒドとから２，４−ジデオキシヘキソース又は２，４，６−トリデオキシヘキソースを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
そのような方法は米国特許出願公開第５，７９５，７４９号から公知であり、これは４‐置換３‐ヒドロキシブタナール中間体を経る２，４，６−トリデオキシヘキソースの合成について記載する。反応物としてアセトアルデヒド及び２−置換アルデヒドが、そして触媒としてアルドラーゼが使用される。
【０００３】
そのような酵素により触媒されるアルドール縮合の知られた欠点は、生産力が低いことである。これは特にそのようなアルドール縮合が一般的に低いアルデヒド濃度において行われるためである、なぜなら使用されるアルドラーゼは、より高いアルデヒド濃度においては高い程度まで不活性であるだろうと一般的に考えられているからである。使用される低濃度のもう一つの欠点は、反応の終わりに、反応混合物中の２，４，６−トリデオキシヘキソースの濃度が低く、このことは例えば精製の費用に強く影響する。結果として、そのような技術に基づいて２，４−ジデオキシヘキソース及び２，４，６−トリデオキシヘキソースを製造するための工業的に魅力的な方法を開発することが可能であろうとは期待され得なかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、酵素により触媒されるアルドール縮合により、２，４−ジデオキシヘキソース又は２，４，６−トリデオキシヘキソースの工業的に魅力的な製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
これは、２，４−ジデオキシヘキソース又は２，４，６−トリデオキシヘキソースの最終濃度が反応混合物の少なくとも２質量％であるように、少なくとも２の炭素原子及び少なくとも１のα―水素原子を有する置換又は無置換のカルボニル化合物と置換又は無置換アルデヒドとの反応を、高くても６モル／ｌの反応混合物のカルボニル濃度において行うことにより、本発明に従って達成される。
【０００６】
２，４−ジデオキシヘキソース及び２，４，６−トリデオキシヘキソースの公知の合成方法においては、高くても０．４モル／反応混合物リットルのカルボニル濃度が使用される。高くても反応混合物のおよそ１質量％である、２，４−ジデオキシヘキソース又は２，４，６−トリデオキシヘキソースの最終濃度が得られる。驚いたことに、６モル／ｌまでのカルボニル濃度が適切に使用され得、酵素の失活の程度は高いカルボニル濃度にもかかわらず制限されていることを、出願人は見出した。その結果、２，４−ジデオキシヘキソースまたは２，４，６−トリデオキシヘキソースのより高い最終濃度が得られ得、その結果、生産力が上がり、費用、特に生成物の精製が抑えられる。その結果、工業的に魅力的な方法を開発することが可能であることがわかった。
【０００７】
本発明の枠内において、カルボニルの濃度とは、少なくとも２の炭素原子及び少なくとも１のα―水素原子を有する置換または無置換のカルボニル化合物、置換又は無置換アルデヒド、及び少なくとも２の炭素原子及び少なくとも１のα―水素原子を有する置換又は無置換のカルボニル化合物と置換または無置換のアルデヒドとの反応において形成されるところの中間生成物の濃度の合計であると理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
カルボニルの濃度は、本質的に、合成工程の間、６モル／ｌ未満の値に保たれる。（非常に）短い間の少しだけより高い濃度はほとんど悪影響を有さず、従って本発明の枠内においてやはり容認されることは当業者にとっては明らかであるだろう。好ましくは、カルボニル濃度は反応混合物リットル当たり０．１〜５モル、より好ましくは反応混合物リットル当たり０．６〜４モルの間である。
【０００９】
２，４−ジデオキシヘキソース又は２，４，６−トリデオキシヘキソースの最終濃度は、反応の終わりにおける反応混合物に対して計算されて、実際には、一般的に５〜５０質量％、例えば８〜４０質量％、特に１０〜３５質量％の間である。
【００１０】
少なくとも２の炭素原子及び少なくとも１のα―水素原子を有する置換又は無置換のカルボニル化合物、置換又は無置換アルデヒド、及びアルドラーゼの添加の順序は、非常に重大というわけではない。好ましくは、少なくとも２の炭素原子及び少なくとも１のα―水素原子を有する置換又は無置換のカルボニル化合物の添加の前にアルドラーゼは反応混合物に添加される。特に、選択された条件下、使用される置換又は無置換アルデヒドが、使用される少なくとも２の炭素原子及び少なくとも１のα―水素原子を有する置換又は無置換のカルボニル化合物より少ない程度に自己と反応するとき、少なくとも２の炭素原子及び少なくとも１のα―水素原子を有する置換又は無置換のカルボニル化合物が添加される前に、アルドラーゼが置換又は無置換アルデヒドの少なくとも一部の溶液と混合されることがより好ましい。好ましくは、反応混合物の０．１モル／ｌより多い置換又は無置換アルデヒドが供給され、より好ましくは反応混合物の０．３モル／ｌより多く，特に０．６モル／ｌより多くが供給される。置換又は無置換アルデヒドの初期の濃度のこの選択は、酵素工程の初期反応速度に有利な影響を与える。アルドラーゼは反応の間、幾つかの部分において添加または計量供給され得る。
【００１１】
本発明の１の実施態様において、少なくとも2の炭素原子及び少なくとも1のα―水素原子を有する置換又は無置換のカルボニル化合物及び置換又は無置換アルデヒドの両方及びアルドラーゼはそれぞれ反応混合物に一回で添加される。そうすることにおいて、少なくとも2の炭素原子及び少なくとも1のα―水素原子を有する置換又は無置換のカルボニル化合物、置換又は無置換アルデヒド及びアルドラーゼは同時にそして続けて添加されることができる。この実施態様に従うと、少なくとも2の炭素原子及び少なくとも1のα―水素原子を有する置換又は無置換のカルボニル化合物及び置換又は無置換アルデヒドの添加された量の合計は一般的に反応混合物のリットル当たり６モルにのぼり、実際に、７〜１５質量％、特に反応混合物の５〜２０質量％の最終生成物の濃度が通常達成される。
【００１２】
本発明のもう１つの実施態様において、少なくとも２の炭素原子及び少なくとも１のα―水素原子を有する置換又は無置換のカルボニル化合物、及び／又は置換又は無置換アルデヒドの添加は、少なくとも２回に分けて行われ、それぞれ次の添加は、前の添加からの反応物の少なくとも一部が転化された後に行われる。これは、反応の過程において添加された少なくとも２の炭素原子及び少なくとも１のα―水素原子を有する置換又は無置換のカルボニル化合物及び置換又は無置換アルデヒドの量の合計を反応混合物の１リットル当たり６モルより多くする一方で、同時に、反応の間の任意の時点において反応混合物中のカルボニル濃度が、酵素の失活化を制限するために、６モル／ｌより低いことを可能にする。アルドラーゼは、所望されるならば、一回で添加されるか又は少なくとも２回に分けて添加されることができる。
【００１３】
さらに別の実施態様において、少なくとも２の炭素原子及び少なくとも１のα―水素原子を有する置換又は無置換のカルボニル化合物及び／又は置換又は無置換アルデヒドは反応の間に適宜反応混合物に計量して供給される。好ましくはこの実施態様において、置換又は無置換アルデヒドの少なくとも一部はアルドラーゼと共に供給される。アルドラーゼはもし所望されるならば、一回に添加されることができ、あるいは複数の部分において添加されるか又は適宜計量供給されてもよい。
【００１４】
最後の２つの実施態様は、４０質量％より高い２，４−ジデオキシヘキソース又は２，４，６−トリデオキシヘキソースの最終濃度に導くことができる。さらに、少なくとも２の炭素原子及び少なくとも１のα―水素原子を有する置換又は無置換のカルボニル化合物、置換又は無置換アルデヒド、及び／又はアルドラーゼの反応混合物への計量供給は、酵素コストのかなりの節約をもたらすことができることが見出された。
【００１５】
上の実施態様の組合せもまた可能である。
【００１６】
反応温度及びｐHは非常に重要というわけではなく、両者とも基質の関数として選択される。好ましくは反応は液相において行われる。反応は、例えば−５〜４５℃、好ましくは０〜１０℃の反応温度において、そして５．５〜９の、好ましくは６〜８のｐHにおいて行われることができる。
【００１７】
反応は、好ましくは多かれ少なかれ一定のｐHにおいて行われ、例えばバッファ又は自動滴定が利用される。バッファとして、例えば炭酸ナトリウム及びカリウム、リン酸ナトリウム及びカリウム、トリエタノールアミン／HCｌ、ビス―トリス―プロパン／HCｌ及びHEPES／KOHが使用され得る。好ましくは炭酸カリウム又はナトリウムバッファーが、例えば２０〜４００ミリモル／反応混合物リットルの濃度において使用される。
【００１８】
少なくとも２の炭素原子及び少なくとも１のα―水素原子を有する置換又は無置換のカルボニル化合物の添加された合計量：添加された置換又は無置換アルデヒドのモル比は、非常に重大というわけではなく、１．５：１〜４：１、特に１．８：１〜２．２：１の範囲である。他の比もまた使用され得るが有利性はなにも提供しない。
【００１９】
本発明に従う方法における触媒として、２つのアルデヒド、又はアルデヒドとケトンとの間のアルドール縮合を触媒するアルドラーゼが使用される。好ましくは使用される該アルドラーゼは２−デオキシリボース―５−ホスフェートアルドラーゼ（DERA, EC ４．１．２．４）またはこの突然変異体、より好ましくはEscherichia coliまたはその突然変異種のからのDERAである。使用されるべきDERAの量は非常に重大というわけではないが、例えば使用される反応物、反応物の濃度、所望される反応速度、反応の所望される継続期間及び他の経済的因子の関数として選択される。使用されるべきDERAの量は、５０〜５０００U／置換又は無置換アルデヒドミリモルの範囲である。１U(単位)は酵素活性の尺度であり、３７℃において１分当たり２−デオキシリボース‐５‐ホスフェートの１μｍｏｌｅの転化に対応する。
【００２０】
少なくとも２の炭素原子及び少なくとも１のα―水素原子を有する置換又は無置換のカルボニル化合物は好ましくは２〜６の炭素原子、より好ましくは２〜４の炭素原子を有する。例えばアルデヒド例えばアセトアルデヒド及びプロパナール、及びケトン例えばアセトン及びフロロアセトンが使用され得る。少なくとも２の炭素原子及び少なくとも１のα―水素原子を有する置換又は無置換のカルボニル化合物としてアルデヒドが使用されるとき、もちろん、その（ヘミ）アセタールの形、例えばアルコール、特にメタノール、エタノール、又はグリコールのアセタールとして使用されてもよい。
【００２１】
置換または無置換アルデヒドとして、２〜２０の炭素原子を有するアルデヒド例えばアセトアルデヒド、プロパナール、ブタナール、アセタールで保護されたジアルデヒドまたは置換アルデヒド、特に式ＨＣ（Ｏ）ＣＨ2Ｘを有する置換アセトアルデヒドが使用され得、ここでＸは最終生成物において必要とされる置換基と同じであるか又は転化され得る基を表し、例えばＣＮ基、または次の反応において脱離基として分裂し得る置換基、例えばハロゲン、特にＣｌ，Ｂｒ又はＩ；トシレート基；メシレート基；アシロキシ基特にアセトキシ基；フェナセチル基；アルコキシ基又はアリロキシ基、クロロアセトアルデヒドが特に適切である。
【００２２】
置換又は無置換アセトアルデヒドはそのまま、又はその（ヘミ）アセタール、例えばアルコール例えばメタノール、エタノール、又はグリコールのアセタールの形において使用されてもよい。
【００２３】
式１を有する２，４−ジデオキシヘキソース又は２，４，６−トリデオキシヘキソースは、
【化１】
【００２４】
式１を有する２，４−ジデオキシヘキソース又は２，４，６−トリデオキシヘキソースは、本発明の方法を用いて、アセトアルデヒド及びＨＣ（Ｏ）ＣＨ2Ｘ、ここでＸは上で定義された通りである、から製造され、次に例えば公知の方法により、対応する式２、
【化２】
【００２５】
得られた４−ヒドロキシ―テトラヒドロピラン―２―オンは次にもし所望であれば式３を有する２−（１，３−ジオキサン―４−イル）酢酸誘導体に転化されることができる。
【化３】
【００２６】
次に、２−(１，３−ジオキサン―４―イル)酢酸誘導体は塩基及び水の存在下、加水分解されて式４の塩を生成する。
【化４】
【００２７】
式４に従う対応する２−（１，３−ジオキサン−４−イル）酢酸の塩は、式３に従う２−（１，３−ジオキサン−４−イル）酢酸の対応するエステルに、自体公知である方法で転化されることができ、ここでＸ，Ｒ1，及びＲ2は上で定義された通りであり、Ｒ3は１〜１２の炭素原子を有するアルキル基、６〜１２の炭素原子を有するアリール基、または７〜１２の炭素原子を有するアラルキル基を表す。好ましくは２−（１，３−ジオキサン−４−イル）酢酸の塩は２−（１，３−ジオキサン−４−イル）酢酸の対応するｔ−ブチルエステルに転化される。
【００２８】
式３を有する２−（１，３−ジオキサン−４−イル）酢酸誘導体、ここでＲ3は１〜１２の炭素原子を有するアルキル基、６〜１２の炭素原子を有するアリール基または７〜１２の炭素原子を有するアラルキル基を表す、は、例えば米国特許出願公開第５５９４１５３号において記載されるように、式５を有する対応する２−（６−ヒドロキシメチル―１，３−ジオキサン−４−イル）酢酸、ここでＲ1、Ｒ2，及びＲ3は上で定義した通りである、に転化される得るか
【化５】
【００２９】
式２を有する４−ヒドロキシ―テトラヒドロピラン―２−オン
【化６】
【化７】
式６を有するジヒドロキシヘキサン酸は、次に式３の２−（１，３−ジオキサン―４−イル）酢酸誘導体に、例えば適切なアセタール化試薬及び酸触媒の存在下、転化されることができ、ここでＸ、Ｒ1、Ｒ2は上で定義された通りであり、Ｒ3は１〜１２の炭素原子を有するアルキル基、６〜１２の炭素原子を有するアリール基、または７〜１２の炭素原子を有するアラルキル基を表す。
【００３１】
本発明は実施例に基づいて説明されるが、それにより制限されない。
【実施例】
【００３２】
１．ＧＣ分析のための対照物質としての多量の６−クロロ―２，４，６−トリデオキシヘキソースの製造
７６ｍＬ(０．６０モル)の５０％クロロアセトアルデヒド溶液及び８４ｍＬ(１．４７モル)のアセトアルデヒドが、１０℃において０．６２Ｌの１００ｍＭＮａＨＣＯ3溶液に添加され、その後ｐＨは４ＮのＮａＯＨによってｐＨ７．０に調節された。酵素反応が２２０ｇの酵素溶液(２０５０Ｕ／ｇ)の添加により開始された。約１８時間の攪拌後、６−クロロ―２，４、６−トリデオキシヘキソースへの最大の転化がＧＣにより測定された。反応は１．７Ｌのアセトンの転化により停止された。４ｇのジカライトがこの混合物に添加され、約３０分の攪拌後、該混合物は濾過された。濾液は５時間、４０℃において真空下、気化された。得られたオイルは、シリカゲルカラム（400ｍＬ）上でカラムクロマトグラフィーにより精製され、石油エーテル(沸点：４０〜７０℃)と酢酸エチルとの体積比１：２の混合物からなる溶出液で溶出された。０．３３のＲf値を有する画分の気化の後、合計で２６ｇの６−クロロー２，４、６−トリデオキシヘキソースが単離された。用語、画分のＲf値は当業者にとって公知であり、カラムにおいてある画分が進んだ距離を、カラムにおいて移動溶媒が進んだ距離で割った値として定義されるか又はカラムにおいて、ある画分がある距離を進むのに必要とする時間を、カラムにおいて移動溶媒が同じ距離を進むのに必要とする時間で割った値として定義される。
【００３３】
６−クロロ―２，４、６−トリデオキシヘキソースの純度はP. P. LankhorstによりPharmacopeial Forum, 第22巻, 第3号, 2414〜2422頁において記載される方法に従って1ＨＮＭＲの手段により決定された。
【００３４】
２．ＧＣ分析
酵素反応の間の６−クロロ―２，４，６−トリデオキシヘキソースの濃度は、ガスクロマトグラフィー分析により測定された。Ｈｅｗｌｅｔ Ｐａｃｋａｒｄ社の水素炎イオン化検出器付ＧＣ、クロムパックＣＰ−Ｓｉｌ５ＣＢカラム（２５ｍ*０．２５ｍｍ、ｄr１．２μｍ）を装備された型式ＨＰ５８９０シリーズＩＩが使用された。アセトン中の既知の化学的純度（１）を用いて６−クロロ―２，４，６−トリデオキシヘキソースの較正曲線に基づいて濃度が測定された。
【００３５】
３．ＤＥＲＡ溶液の調整
組換えEscherichia coli細胞中のＤＥＲＡ酵素を過剰発現させるための標準の技術が適用された。そのような技術はSambrookらのMolecular Cloning : A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, ニューヨーク、1989年に記載されている。この場合、Escherichia coli W３１１０のｄｅｏＣ遺伝子が市販入手可能な発現ベクターpBADMyc-HisB（インビトロジュエン社、グロニンゲン、オランダ）中でクローン化された。遺伝子（終止コドンを含む）がポリメラーゼ連鎖反応により増幅され、ｄｅｏＣのＡＴＧ開始コドンがベクターのＮｃｏｌサイト上のＡＴＧコドンと同一になるようにベクター中のＮｃｏｌ及びＥｃｏＲＩサイトに導入された（翻訳融合）。ｄｅｏＣの終止コドンもまたクローン化されたので、Ｈｉｓタグを有する融合たんぱく、これもまたベクター上にコードされている、の生成が妨げられた。得られるプラスミドｐＢＡＤＤＥＲＡ２．２を有するEscherichia coli ＤＨ１０Ｂ細胞（ライフテクノロジーズ、ブレダ、オランダ）が１０Ｌの曝気されかつ攪拌されたタンク反応器において、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを有する複合Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ培地の上で培養され、アラビノースの添加により０．０１％まで誘導された。細胞密度を増加させるため、２つの追加的な水性溶液、純粋なグリセロールを含む水性溶液（フィード１）及び１３％のイースト抽出物及び１．３％のトリプトン（Ｄｉｆｃｏ社、ミシガン州、ＵＳ）を含む水性溶液（フィード２）が、細胞がＬＢ培地を消費した後、添加された。このようにして、約３５０ｇの湿った細胞が１０Ｌの培養液から得られ、該培養液は遠心分離により回収され、続いてｐＨ７．２のリン酸カリウムバッファ中に再懸濁され、再び遠心分離された。ペレットが−２０℃において貯蔵された後、上澄みが除去された。
【００３６】
文献、例えばＣｈｅｎらのJ. Am. Chem. Soc.第114巻,1992年, 741〜748頁 及びWongらの J. Am. Chem. Soc. 第117巻,1995年, 3333〜3339頁において、組換えE.Coli細胞からのＤＥＲＡの精製について様々な方法が記載されている。しかし、精製はアルドール反応におけるＤＥＲＡの有効な使用のための条件ではない、例えばWongらの J. Am. Chem. Soc. 第117巻,1995年, 3333〜3339頁を参照されたい。ＤＥＲＡの部分精製のために、標準的な技術が使用された。冷凍されたペレットが１００ｍＭのリン酸カリウムバッファ中にｐＨ７．２において懸濁され（１重量部の湿った細胞及び２重量部のバッファ）、その後細胞壁が連続超音波処理で破壊された。透明な粗抽出物が遠心分離により得られ、直接使用されるか又は−２０℃において貯蔵された。溶液はもし所望であるならば、超音波処理で、例えば１０，０００ドルトンのカットオフ値を有するミリポアの超音波膜（ミリポア社、ベドフォード、アメリカ合衆国）を使用して超音波によりさらに濃縮されることができる。この方法により得られた典型的な比活性は、溶液１ｇ当たり１４００〜５３００ユニットの間である。
【００３７】
４．ＤＥＲＡの活性の測定
ＤＥＲＡを合成する組換えE.Coliは、５０ｍＭのリン酸カリウムバッファ中で音波処理に付され、遠心分離されて（１８，５００ｒｐｍ、３０分）、細胞物質を除去した。得られる遊離の細胞抽出物は希釈され、リンクされた分光学的試験で使用された。この試験において、２−デオキシリボース−５−ホスフェートはＤ−グリセルアルデヒド―３−ホスフェートとアセトアルデヒドとに転化され、その後、トリオースホスフェートイソメエラーゼ（ＴＩＭ、ＥＣ５．３．１．１）の存在下、Ｄ−グリセルアルデヒド―３−ホスフェートはジヒドロキシアセトンホスフェートに転化された。最後の段階において、ニコチンアミンアデニンジヌクレオチドが還元型（ＮＡＤＨ）において消費され、それは３４０ｎｍにおける吸収の減少の測定を通して分光学的に追跡された。典型的にはｐＨ７．２の５０ｍＭのトリエタノールアミンバッファを２８７８．５μＭ、ＮＡＤＨの１２ｍＭの水溶液を３０μｌ、３０ユニットのＧＤＨ及び５００ユニットのＴＩＭを３．２Ｍの水性リン酸アンモニウム塩溶液中に含む酵素懸濁物を１１．５μＬ、及び２−デオキシリボース―５−ホスフェートの５０ｍＭ水溶液を３０μＬを含む３ｍｌの合計体積が使用された。反応は５０μｌの遊離の細胞抽出物を添加することにより開始された。温度は３７℃であった。活性は、Ｕ（ユニット）で表され、ここで１ユニットは３７℃において１分あたり１μモルの２−デオキシリボース―５−ホスフェートの転化に対応する酵素活性に等しく、３４０ｎｍにおける吸収の線形減少から計算された。
【００３８】
実施例Ｉ
バッチ実験における６−クロロ―２，４，６−トリデオキシヘキソースの合成
４５％クロロアセトアルデヒド溶液４．３ｍＬ（０．０３モル）及びアセトアルデヒド３．４ｍＬ（０．０６モル）が１００ｍＭのＮａＨＣＯ3のバッファ溶液３７ｍＬに４℃の温度において添加された。この混合物のｐＨは７．３であった。酵素反応は６．３ｍＬ（５２７０Ｕ／ｇ）の酵素溶液の添加により開始された。反応は７．５の一定のｐＨにおいて行われた。定期的に混合物はＧＣで分析された。反応は、６−クロロ―２，４，６−トリデオキシヘキソースの濃度が約８０ｇ／Ｌ（８質量％）に達した後、10ｍＬのアセトンの添加により停止された。
【００３９】
実施例ＩＩ
反復バッチ実験における６−クロロ―２，４，６−トリデオキシヘキソースの製造
実施例Ｉの実験が繰り返された。しかし、６−クロロ―２，４，６−トリデオキシヘキソースの濃度が約８０ｇ／Ｌに達した後、クロロアセトアルデヒドの45％溶液がさらに４．３ｍＬ(０．０３モル)、アセトアルデヒド３．４ｍＬ（０．０６モル）及び６．３ｍＬの酵素溶液（５２７０Ｕ／ｇ）が再び添加された。転化が一定の値に達しさらに増加しなくなるごとに、これはもう３回繰り返された。このようにして、合計でクロロアセトアルデヒドの45％溶液が０．１５モル及び０．３０モルのアセトアルデヒドが添加された。反応は７．５の一定のｐＨにおいて行われた。反応混合物からの試料はＧＣを用いて分析された。最終的な６−クロロ―２，４，６−トリデオキシヘキソースの濃度は約２４０ｇ／Ｌ（２４質量％）であった。
【００４０】
実施例ＩＩＩ
反応成分の計量供給による６−クロロ―２，４，６−トリデオキシヘキソースの合成
８４ｇ（１．０モル）のＮａＨＣＯ3が６．２Ｌの脱ミネラル化水に添加され、その後、該溶液は約２℃まで冷却された。続いて、７２．３ｍＬ（０．４モル）のクロロアセトアルデヒドの45％溶液がこれに添加され、その後、溶液のｐＨは32％ＨＣｌで７．３に調節された。酵素溶液（６．８×１０6Ｕ）がこの混合物に添加され、その後、体積が７．５Ｌに合わせられた。２時間の間に、合計で１．３Ｌ（９．５モル）の45％クロロアセトアルデヒド溶液及び０．９Ｌ（９．９モル）の５０％アセトアルデヒド溶液がこの混合物に計量供給された。この後、５時間の間に、０．８６Ｌ（９．５モル）の50％アセトアルデヒド溶液が添加された。反応混合物は２℃及び７．５の一定のｐＨにおいて一晩攪拌された。反応混合物の合計重量は１０．９ｋｇにのぼった。６−クロロ―２，４，６−トリデオキシヘキソース含有量はガスクロマトグラフィーにより測定され、１２６ｇ／Ｌ(１２．６質量％)であることが見出された。
【００４１】
実施例ＩＶ
反応成分の計量供給による６−クロロ―２，４，６−トリデオキシヘキソースの製造
１１．８ｇ(０．１４モル)のＮａＨＣＯ3が０．４４Ｌの脱ミネラル化水に添加され、その後、該溶液は約２℃まで冷却された。続いて１０．０ｍＬ（０．０７モル）のクロロアセトアルデヒドの４５％溶液がこれに添加され、その後溶液のｐＨは３２％のＨＣｌで７．３のｐＨに調節された。酵素溶液(１．０３×１０6ユニット)がこの混合物に添加された。２時間の間に、０．１９３Ｌ（１．３５モル）のクロロアセトアルデヒドの４５％溶液及び０．１２７Ｌ(１．４０モル)のアセトアルデヒドの50％溶液がこの混合物に計量供給された。この後５時間の間に、アセトアルデヒドの５０％溶液、０．１３４Ｌ（１．４６モル）が添加された。反応混合物は２℃及び７．５の一定のｐＨにおいて一晩攪拌された。６−クロロ―２，４，６−トリデオキシヘキソース含有量はガスクロマトグラフィーにより測定され、１８０ｇ／Ｌ(１８．０質量％)であることが見出された。
Claims (19)
- アルドラーゼ及び水の存在下、少なくとも２の炭素原子及び少なくとも１のα―水素原子を有する置換又は無置換のカルボニル化合物及び置換又は無置換アルデヒドから２，４−ジデオキシヘキソース又は２，４，６−トリデオキシヘキソースを製造する方法において、少なくとも２の炭素原子及び少なくとも１のα―水素原子を有する置換又は無置換のカルボニル化合物と置換又は無置換アルデヒドとの反応が、高くても６モル／反応混合物リットルのカルボニル濃度において行なわれ、かつ２，４−ジデオキシヘキソース又は２，４，６−トリデオキシヘキソースの最終濃度が反応混合物の少なくとも２質量％であることを特徴とする方法。
- ２，４−ジデオキシヘキソース又は２，４，６−トリデオキシヘキソースの最終濃度が、反応混合物の５〜５０質量％であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- ２，４−ジデオキシヘキソース又は２，４，６−トリデオキシヘキソースの最終濃度が、反応混合物の１０〜３５質量％であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
- 合成工程の間の反応混合物中のカルボニル濃度が、０．６〜４モル／反応混合物リットルであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 少なくとも０．１モル／ｌの置換又は無置換アルデヒドが供給されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
- 少なくとも２の炭素原子及び少なくとも１のα―水素原子を有する置換又は無置換のカルボニル化合物及び／又は置換又は無置換アルデヒドが、少なくとも２回に分けて反応混合物に添加されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
- 少なくとも２の炭素原子及び少なくとも１のα―水素原子を有する置換又は無置換のカルボニル化合物及び／又は置換又は無置換アルデヒドが、反応混合物に時間をかけて計量供給されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
- 添加された、少なくとも２の炭素原子及び少なくとも１のα―水素原子を有する置換又は無置換のカルボニル化合物の合計量：添加された、置換又は無置換アルデヒドのモル比が、１．５：１〜４：１であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
- ２−デオキシリボース―５−ホスフェートアルドラーゼがアルドラーゼとして使用されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
- ２−デオキシリボース―５−ホスフェートアルドラーゼがEscherichia coliから由来することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
- 置換又は無置換アルデヒドとして、式ＨＣ（Ｏ）ＣＨ2Ｘ（ＸはＣＮ，ハロゲン、トシレート基、メシレート基、アシロキシ基、フェナセチルオキシ基、アルキルオキシ基、又はアリールオキシ基を表す）を有する置換アセトアルデヒドが使用されることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
- Ｘが脱離基であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
- アセトアルデヒドが置換又は無置換カルボニル化合物として使用されることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
- 得られた２，４−ジデオキシヘキソース又は得られた２，４，６−トリデオキシヘキソースが、続いて対応する４−ヒドロキシ―テトラヒドロピラン―２−オンに転化されることを特徴とする、請求項１２又は１３のいずれか１項に記載の方法。
- ４−ヒドロキシ―テトラヒドロピラン―２−オンが、続いて２−（１，３−ジオキサン―４−イル）酢酸誘導体に転化される、請求項１４に記載の方法。
- ２−（１，３−ジオキサン―４−イル）酢酸誘導体が、続いて対応する２−（６−ヒドロキシメチル―１，３−ジオキサン―４−イル）酢酸誘導体に転化される、請求項１５に記載の方法。
- ２−（１，３−ジオキサン―４−イル）酢酸誘導体が２−（１，３−ジオキサン―４−イル）酢酸のｔ−ブチルエステルである、請求項１５又は１６のいずれか１項に記載の方法。
- 請求項１〜１３のいずれか１項に従う方法によって得られた、２，４−ジデオキシヘキソース又は２，４，６−トリデオキシヘキソースを医薬品の製造において使用する方法。
- 医薬品がＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、好ましくはスタチン、であることを特徴とする請求項１７に記載の使用。
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