JP2005073606A

JP2005073606A - 培養基材

Info

Publication number: JP2005073606A
Application number: JP2003309107A
Authority: JP
Inventors: Takehiko Nakamura; 武彦中村; Michiya Sato; 倫也佐藤
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 2003-09-01
Filing date: 2003-09-01
Publication date: 2005-03-24

Abstract

【課題】安全性が高く、細胞や組織片を効率的に増殖させることが可能な新規な培養基材を提供する。
【解決手段】光反応性物質と多糖とが結合した「光反応性多糖」が光架橋してなる光架橋多糖を含む、細胞又は組織の培養のための培養基材、かかる培養基材を培地に加え、更に組織又は細胞を添加することを特徴とする組織又は細胞の培養方法、上記培養基材と細胞又は組織を含む組成物、及びかかる組成物の、細胞又は組織の移植のための使用。
【選択図】なし

Description

本発明は、光架橋多糖を含む、細胞又は組織を培養するための培養基材、細胞・組織を含む該培養基材、その用途に関するものである。

従来、多糖に光反応性基を導入した例として、光反応性グリコサミノグリカンと、それを架橋させて得られる光架橋グリコサミノグリカンが知られている（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４）。そしてかかる光架橋グリコサミノグリカンからなるゲル（特許文献５）やスポンジ（特許文献６）も知られている。

しかし、これらの光架橋多糖を細胞や組織の培養用の基材として用いる技術は開示されておらず、またかかる培養を行なった際に優れた生育性を示すことは何ら示唆されていない。

特開平６−７３１０２号公報特開平８−１４３６０４号公報特開平９−８７２３６号公報特開２００２−２４９５０１号公報特表平１１−５１２７７８号公報国際公開ＷＯ０２／０６０９７１号パンフレット

近年、細胞や組織を培養し、その培養物を生体に移植する再生医療が注目されている。再生医療における移植片は、生体内に移植された際に細胞又は組織の形状を保持する必要があるため、通常は基材を用いた培養を行うが、かかる基材は細胞・組織とともに生体内に移植されるため、安全性が要求される。

従って、安全性を担保しつつ、培養において優れた生育性を保持する培養基材が再生医療の分野においては要求されている。

本発明者は上記課題の解決のために鋭意検討した結果、従来から安全性が高いことが知られていた光架橋多糖を含む培養基材を用いると、細胞・組織が優れた生育性を有することを見い出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）光反応性物質と多糖とが結合した「光反応性多糖」が光架橋してなる光架橋多糖を含む細胞又は組織を培養するための培養基材。
（２）多糖がグリコサミノグリカン又はその誘導体であることを特徴とする（１）記載の培養基材。
（３）「グリコサミノグリカン」が、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸であることを特徴とする（２）記載の培養基材。
（４）多糖がホモグリカン又はその誘導体であることを特徴とする（１）記載の培養基材。
（５）「ホモグリカン又はその誘導体」が、カルボキシメチルセルロース又はヒドロキシメチルセルロースであることを特徴とする（４）記載の培養基材。
（６）多糖が「グリコサミノグリカン又はその誘導体」と「ホモグリカン又はその誘導体」とを含む（１）記載の培養基材。
（７）「光反応性物質」が、ケイ皮酸又は置換ケイ皮酸であることを特徴とする（１）〜（６）いずれか記載の培養基材。
（８）「光反応性物質」と「多糖」とが、スペーサー物質を介して共有結合していることを特徴とする（１）〜（７）いずれか記載の培養基材。
（９）「スペーサー物質」がアミノアルコール又はアミノ酸であることを特徴とする（８）記載の培養基材。
（１０）（１）〜（９）いずれか記載の培養基材として組織又は細胞を培養することを特徴とする組織又は細胞の培養方法。
（１１）（１）〜（９）いずれか記載の培養基材と、細胞又は組織を含む組成物。
（１２）（１１）記載の組成物の、細胞又は組織の移植のための使用。

本発明により、高い安全性と細胞・組織の生育性とを兼ね備えた培養基材が提供される。

以下、発明を実施するための最良の形態を具体的に詳説する。
本発明培養基材は、光反応性物質と多糖とが結合した「光反応性多糖」が光架橋してなる光架橋多糖を含む、細胞又は組織の培養するための培養基材である。

本発明培養基材における「細胞」及び「組織」は、生体外で増殖させることができる細胞・組織である限りにおいて特に限定はされないが、特に中胚葉由来の細胞・組織が例示され、好ましくは結合組織由来の細胞・組織が挙げられ、特に軟骨細胞、軟骨組織が好ましくは例示される。

本発明培養基材における「光反応性物質」とは、光反応性架橋基を有する物質である。前記光反応性架橋基は光の照射により重合又は二量化等の架橋反応を生じる官能基であればその種類は特に限定されない。本発明培養基材においては、その導入によりグリコサミノグリカン又はその誘導体のグリコシド結合を切断されない様な基が好ましい。

このような光反応性架橋基を有する光反応性物質は、たとえばケイ皮酸、置換ケイ皮酸（例えばアミノケイ皮酸（ベンゼン環の何れかの水素がアミノ基に置換したケイ皮酸：好ましくはp-アミノケイ皮酸））、アクリル酸、マレイン酸、フマル酸、フリルアクリル酸、チオフェンアクリル酸、シンナミリデン酢酸、ソルビン酸、チミン、クマリン又はこれらの誘導体が例示される。その中でも特にケイ皮酸、置換ケイ皮酸又はそれらの誘導体が安全性の面から好ましい。

本発明組成物における「多糖」とは、単糖が３以上、好ましくは５以上グリコシド結合で結合してなる糖を示す。その中でも特にヘキスロン酸残基とヘキソサミン残基との二糖の繰り返し構造を基本骨格とする「グリコサミノグリカン」又はその誘導体、「ホモグリカン」又はその誘導体が好ましく、特に「グリコサミノグリカン」が好ましい。「グリコサミノグリカン」とは、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、及びケラタン硫酸があげられる。また「ホモグリカン」とは、１種類の単糖のみからなる多糖であるが、その中でもグルカン（アミロース、セルロース等が挙げられる）、マンナン、グリクロナン（ペクチン酸、アルギン酸等が挙げられる）、ポリグリコサミン（キチン、コロミン酸等）、ポリガラクトサミン等が例示され、これらの中ではグルカンが挙げられ、特にセルロースが好ましい。

ここでグリコサミノグリカンの「誘導体」とは、例えば硫酸化誘導体（硫酸化ヒアルロン酸、コンドロイチンポリ硫酸など）、脱硫酸化誘導体（脱硫酸化ヘパリン（6位脱硫酸化ヘパリン（ＷＯ００／０６６０８）、2位脱硫酸化ヘパリンなど（特開２００３−１１３０９０））など）、酸化還元誘導体（過ヨウ素酸酸化還元ヘパリン（特開平１１−３１０６０２）など）が挙げられる。

本発明培養基材に使用するグリコサミノグリカンの分子量（重量平均分子量）は1,000〜10,000,000、好ましくは2,000〜3,000,000、より好ましくは3,000〜2,700,000、最も好ましくは4,000〜2,500,000である。ただし、グリコサミノグリカンがヒアルロン酸の場合には3万〜1,000万が好ましく、20万〜300万がより好ましく、さらに好ましくは30万〜200万、最も好ましくは40万〜120万である。

この様な「グリコサミノグリカン又はその誘導体」の中でも、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、6位脱硫酸化ヘパリン、過ヨウ素酸酸化還元ヘパリンなどが好ましくは挙げられ、ヒアルロン酸が最も好ましいが、これに限定はされない。なお、使用するグリコサミノグリカンは必ずしも一種類のみに限定されるわけではなく、複数のグリコサミノグリカンを本発明培養基材に使用しても良い。

また、ホモグリカンの「誘導体」とは、例えばカルボキシメチル化誘導体（例えばカルボキシメチルセルロース等）、ヒドロキシメチル化誘導体（ヒドロキシメチルセルロース等）、脱アセチル化誘導体（キトサン等）が例示されるが、水溶性を呈する誘導体が好ましく、特にカルボキシメチル化誘導体（その中でも特にカルボキシメチルセルロースが好ましい）又はヒドロキシメチル化誘導体（その中でも特にヒドロキシメチルセルロースが好ましい）が特に好ましく、カルボキシメチル化誘導体が最も好ましい。

かかる多糖は、「ホモグリカン又はその誘導体」と「グリコサミノグリカン又はその誘導体」との双方を含む混合物を使用することも可能である。例えば光反応性物質を結合したカルボキシメチルセルロースと、光反応性物質を結合したコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸又はヘパリンとを混同し、この光反応性多糖を使用して基材とすることも可能である。カルボキシメチルセルロースの様な比較的高分子の多糖と低分子の多糖とを混合して使用することで、優れた形態保持性を担保することが可能となる。

本発明培養基材における「光反応性物質」と「多糖又はその誘導体」との「結合」とは、化学結合、とりわけ共有結合が好ましい。「光反応性物質」は、直接「多糖又はその誘導体」に化学結合していても良いが、スペーサー物質を介して結合している方が好ましい。かかるスペーサー物質は多糖に光反応性物質を付加する際に、その付加を容易にし、また光反応性基の多糖への導入率が低い場合であっても容易に架橋するため、未修飾の多糖に近い物性が得られる。スペーサー物質としては炭素数２〜８の鎖状又は環状の炭化水素残基を有する二価又は多価の化合物を使用することが好ましい。例えば光反応性物質がケイ皮酸の場合は、スペーサー物質として炭素数２〜８のアミノアルコールやアミノ酸を使用することができる。この場合、ケイ皮酸のカルボキシル基にアミノアルコールがエステル結合又はアミド結合、又はアミノ酸がアミド結合していることが好ましい。特に好ましいスペーサー物質はn-アミノプロパノール又はn-アミノブタノールが挙げられる。上述の光反応性多糖である光反応性グリコサミノグリカンは、例えば特開平６−７３１０２号公報、特開平８−１４３６０４号公報、特表平１１−５１２７７８号公報などの公知の方法に従って調製することができる。

本発明培養基材は、ゲルであっても、スポンジであっても細胞・組織をその上で培養することができる限りにおいて特に限定はされないが、細胞・組織の形状の保持能力が高いことからスポンジが好ましい。かかるスポンジは、例えばＷＯ０２／０６０９７１号記載の方法により調製することも可能である。この様な本発明培養基材の製造に使用する未架橋の光反応性多糖は、光反応性物質の導入率が2〜20%であることが好ましく、3〜18%であることがより好ましい。なお「導入率」とは、多糖中に存在する「光反応性物質を導入可能な官能基のモル数」に対する「導入された光反応性物質のモル数（＝光反応性架橋基の導入数）」を百分率で表示した値である（導入率の測定方法の例は後述の実施例を参照されたい）。また、ここで、光反応性架橋基を導入可能な多糖の官能基とは、光反応性架橋基及び作用するスペーサー物質の種類によって異なる。多糖として「グリコサミノグリカン又はその誘導体」を用い、光反応性物質又はスペーサー物質に含まれるカルボキシル基を「グリコサミノグリカン又はその誘導体」への結合に使用する場合は、グリコサミノグリカン又はその誘導体のアミノ基又はヒドロキシル基が例示され、光反応性物質又はスペーサー物質に含まれるアミノ基を「グリコサミノグリカン又はその誘導体」への結合に使用する場合は、「グリコサミノグリカン又はその誘導体」のカルボキシル基が例示される。また、多糖として例えば「カルボキシメチルセルロース」を用い、光反応性物質又はスペーサー物質に含まれるカルボキシル基をカルボキシメチルセルロースへの結合に使用する場合は、カルボキシメチルセルロースのヒドロキシル基が例示される。この場合には、スペーサーは多糖にエステル結合により結合される。

また、本発明培養基材を構成する光架橋多糖の架橋率は、1〜50%が例示され、好ましくは3〜40%が例示される。ここで、架橋率とは、導入された光反応性物質の光反応性架橋基のモル数に対し、二量化又は重合した光架橋基のモル数を百分率で表した値を指す。その測定方法の例は、後述の実施例を参照されたい。

本発明培養基材においては、架橋反応を行なう前の光反応性グリコサミノグリカンが水溶性であるため、溶液の状態で、予め光反応性グリコサミノグリカンと溶媒以外の物質（例えば、未反応の光反応性物質、不純物、異物）を分離しておくことにより、得られる本発明培養基材の純度を細胞又は組織培養或いは医療目的に使用しうる程度に高めることが容易にできる。溶液中の不純物や異物などの除去は、例えば、透析、濾過、遠心分離などの常法に従って行うことができる。

本発明培養基材は、例えば細胞（培養細胞、初代培養細胞を含む）や組織（生体から取り出した組織片など）の培養のための培地を本発明培養基材に含浸させて培地を十分に含ませた後、細胞や組織を基材上或いはその内部で培養するために用いることができる。

この様に培養を行って得られる、培養された細胞又は組織と本発明培養基材とを含む組成物は、例えば生体の損傷部位を補綴するための移植片として使用することが可能である。かかる組成物は、細胞又は組織の他に何らかの生理活性物質を含んでいても良い。かかる生理活性物質の例としては、線維芽細胞増殖因子（FGF）、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）、神経細胞増殖因子（NGF）などの各種増殖因子が好ましくは挙げられる。

以下、光架橋ヒアルロン酸を用いた実施例により本発明をより具体的に説明する。
＜測定例１：導入率の測定方法＞
光反応性架橋基の導入率は、グリコサミノグリカンの繰り返し二糖単位あたりに導入された光反応性架橋基の数を百分率で表した値を意味する。導入率の算出に必要なグリコサミノグリカンの量は、検量線を利用したカルバゾール測定法により測定し、光反応性架橋基としてケイ皮酸又は置換ケイ皮酸を使用した場合のケイ皮酸の量は、検量線を利用した吸光度測定法（測定波長269nm）により測定した。

＜測定例２：架橋率の測定方法＞
架橋率は、1mol/l水酸化ナトリウム水溶液1mlで被検物質1gを1時間鹸化した後、得られた溶液を酸性にして酢酸エチルで光反応性架橋基由来物（単量体、二量体）を抽出し、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により解析し、検量線法によって二量体の量を測定した。そしてグリコサミノグリカンに導入された光反応性架橋基に対する二量体となった光反応性架橋基のモル数を百分率で表した。

＜調製例：光反応性ヒアルロン酸の調製＞
1重量%ヒアルロン酸ナトリウム（鶏冠由来：生化学工業株式会社製：重量平均分子量90万）の水溶液500gに、水／ジオキサン＝250mL／375mLの混合溶液を加えて撹拌した。室温でN-ヒドロキシコハク酸イミド860mg/水2mL（0.6当量／ヒアルロン酸二糖単位（mol/mol））、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロプル)カルボジイミド塩酸塩（EDCI/HCl） 717mg／水2mL（0.3当量／ヒアルロン酸二糖単位（mol/mol））、ケイ皮酸アミノプロピル塩酸塩(HCl・H₂N(CH₂)₃OCO-CH=CH-Ph：Phはフェニル基を示す)903mg／水2mL（0.3当量／ヒアルロン酸二糖単位（mol/mol））を順次加え、2時間30分間撹拌した。炭酸水素ナトリウム2.5g／水50mLを加えて一昼夜撹拌した後、塩化ナトリウム30gを加えた。この反応溶液に2Lのエタノールを投入し、沈殿物を析出させ、この沈殿物を80％エタノールで2回、エタノールで2回洗浄した後、室温で一晩乾燥させ、5.24gの白色固体（ケイ皮酸3-アミノプロピルエステル導入ヒアルロン酸：「ケイ皮酸導入ヒアルロン酸」とも記載する）を得た。ヒアルロン酸繰り返し二糖単位あたりのケイ皮酸の導入率は8.2%だった。

＜実施例１：スポンジ状の本発明培養基材の調製＞
上記ケイ皮酸導入ヒアルロン酸を4%（w/w）となるように注射用水に溶解させた。この溶液を6cm×2.5cm、厚さ1mmとなるように強化ガラス板で調製した型に流し込み、-20℃で凍結させた。凍結後800W高圧水銀ランプで両面から200mJ/cm²の紫外線を照射し、乳白色のシート状のスポンジを得た。
上記測定例２記載の方法により架橋率を測定したところ、33%の架橋率を示した。

＜実施例２：培養実験＞
ブタ関節（下田畜産製）より軟骨スライスを切り出し、プロテアーゼ（和光純薬工業株式会社製）にて1時間処理後、5%（w/w）コラゲナーゼ（シグマ社製）で37℃条件下16時間処理した。液体画分を回収し、セルストレーナーを通過させ、ダルベッコの調整イーグル培地（DMEM）/F12培地（10%牛胎児血清、ゲンタマイシン、アスコルビン酸添加）にて浮遊させた（この液を「軟骨細胞液」と記載する）。軟骨片2.7mgより5.8ｘ10⁷細胞を得た。

各スポンジシートを無菌的に2.5×2.0mmのサイズに切り取り、６穴プレートに入れ、1×10⁷個/mlに調整した軟骨細胞液1mlを本発明培養基材にゆっくりと染み込ませた。300μl程度の軟骨細胞液が本発明培養基材に保持された。スポンジシートに完全に培地が浸透したのを確認した後、各穴に5mlの培地を添加し5%CO₂インキュベーターにて48時間培養した。

その結果、特に本発明培養基材の密な部分では細胞が集塊をつくり増殖しており、その他の部分においても細胞の増殖が大幅に進み、本発明培養基材からこぼれ落ちる程度にまで増殖が進んでいた。

本発明は、細胞培養、組織培養など、特に再生医療の分野において利用することが可能である。

Claims

光反応性物質と多糖とが結合した「光反応性多糖」が光架橋してなる光架橋多糖を含む細胞又は組織を培養するための培養基材。
多糖がグリコサミノグリカン又はその誘導体であることを特徴とする請求項１記載の培養基材。
「グリコサミノグリカン」が、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸であることを特徴とする請求項２記載の培養基材。
多糖がホモグリカン又はその誘導体であることを特徴とする請求項１記載の培養基材。
「ホモグリカン又はその誘導体」が、カルボキシメチルセルロース又はヒドロキシメチルセルロースであることを特徴とする請求項４記載の培養基材。
多糖が「グリコサミノグリカン又はその誘導体」と「ホモグリカン又はその誘導体」とを含む請求項１記載の培養基材。
「光反応性物質」が、ケイ皮酸又は置換ケイ皮酸であることを特徴とする請求項１〜６いずれか一項記載の培養基材。
「光反応性物質」と「多糖」とが、スペーサー物質を介して共有結合していることを特徴とする請求項１〜７いずれか一項記載の培養基材。
「スペーサー物質」がアミノアルコール又はアミノ酸であることを特徴とする請求項８記載の培養基材。
請求項１〜９いずれか一項記載の培養基材として組織又は細胞を培養することを特徴とする組織又は細胞の培養方法。
請求項１〜９いずれか一項記載の培養基材と、細胞又は組織を含む組成物。
請求項１１記載の組成物の、細胞又は組織の移植のための使用。