JP2005055879A - 共焦点走査型顕微鏡、注目領域指定方法、及びプログラム - Google Patents

Abstract

【課題】 共焦点画像より形成される試料の立体像に対する三次元の注目領域の指示を少ない労力で行えるようにする。
【解決手段】 試料４に対する対物レンズ３の焦点位置をその光軸方向に変化させて複数枚取得した試料４の二次元共焦点画像を当該光軸方向に積層して得られる三次元像の、三次元空間で相互に交差するＸＹ、ＹＺ、ＸＺの３平面への射影像を構築する処理をＣＰＵ８が行う。そして、この二次元共焦点画像の各々を構成する画素のうち、当該画素のこの３平面への射影点がいずれも当該３平面に対して各々指定されている領域に含まれているものを統合してなる注目領域を、この二次元共焦点画像の各々に形成する。
【選択図】 図１

Description

本発明は、共焦点走査型顕微鏡の光学系を介して試料を光で走査し、試料からの反射光または透過光を用いて得られる試料像の利用技術に関し、特に、このようにして得られた試料像に対して、当該試料における立体的な部分領域を指示するための技術に関する。

共焦点走査型顕微鏡は、点光源を用いて試料を走査するとともに、試料からの反射光や透過光のうちピンホールを通過した光のみを光検出器により電気信号に変換し、この電気信号から当該試料の三次元情報を得るようにしたものである。

このような共焦点走査型顕微鏡では、レーザ光などの点光源とピンホールとを組み合わせて試料をピンポイントで照明することによって、測定点以外からの散乱光を抑制させる。また、光検出器の前面に空間フィルタとしてのピンホールを配置しておき、測定点と同一面内にあるノイズ光についてはピンホール周辺に結像させる一方で、測定点から光軸方向にずれた面からの光については対物レンズでピンホールの前で広げてしまうことによって、ピンホールを通過する光を抑制させる。この結果、測定点以外からの反射光や透過光がカットされ、光電変換器により三次元空間中の一点だけが測定可能となる。

ところで、共焦点走査型顕微鏡は光軸方向に高い分解能を有していることも知られている。つまり、光軸上で焦点の合ったときには測定される光の強度が増大する一方で、焦点から外れているときには光の強度がほぼゼロになる。そこで、試料面でスポット光を二次元走査（面走査）しつつ、光軸方向となるＺ方向に所定のピッチで焦点を移動させることにより、Ｚ方向に対する垂直面にスライスされた複数枚の試料像を得ることができる。これらの試料像は試料の立体的な（三次元的な）体様を表している。従って、このようにして得られた、試料のＺ方向の各位置（以下、「各Ｚ位置」と記す）でのこれらのスライス像（二次元共焦点画像）からこの試料の立体像を構築することができる。

このようにして構築された立体像における三次元的な部分領域に注目し、この注目領域に対する再走査や三次元的な解析（注目領域の体積の算出など）をすることがある。このとき、三次元的な注目領域をどのようにして指示し抽出するかが問題となる。

三次元的な注目領域を指示または抽出する一般的な手法として、試料の各Ｚ位置でのスライス像の各々に対して注目領域を指示または抽出し、この指示または抽出がされた領域を三次元的に連結するという手法がある。このような手法に従ってスライス像に対して領域を指示するときは、二次元のスライス像を表示させているモニタ等の表示部上に、指示者がコンピュータのマウス等の入力装置を操作して円などを描画し、その描画によって示された領域を指示された領域とする。このような描画による領域の指示を各位置での試料のスライス像に個別に行い、最後に各Ｚ位置のスライス像において指示がされた注目領域を全て連結することにより、三次元的な注目領域の指示がされる。

この他、三次元的な注目領域を抽出する技術として、例えば特許文献１に開示されているものがある。
この技術は、三次元物体を示す三次元画像を複数の二次元二値化画像に分割して入力する二次元画像入力部と、この二次元画像入力部で入力された各二次元二値化画像に対して二次元連結成分を抽出してラベリング処理を施す二次元画像ラベリング処理部と、この二次元画像ラベリング処理部で得られたラベリング領域毎に代表点を抽出する二次元画像代表点抽出部と、この二次元画像代表点抽出部で抽出された代表点の隣接する二次元画像間の連結を検出して代表点の連結成分を抽出する代表点連結検出部と、この代表点連結検出部で抽出された代表点の連結成分を内包する三次元連結成分に対してラベリング処理を施す三次元画像ラベリング処理部を備えたことを特徴としている。

その抽出方法は、まず二次元画像入力部によって三次元物体をスライスして複数の二次元画像を得、続いてラベリング処理によって各二次元画像の連結成分を求める。二次元連結成分が求まると、代表点抽出部は各二次元連結成分の代表点を求める。そして、得られた代表点の二次元画像間の連結が検出されたなら、その代表点を含むすべての二次元連結成分を三次元連結成分として抽出する。このようにして得られた三次元連結成分から、注目する領域の三次元連結成分のみを抽出するというものである。

この他、本発明に関連する技術として、例えば特許文献２に開示されているものがある。この技術は、粒子が分布する三次元の被験物体内についての、相互位置関係が明確な断層画像群の濃淡画像データを得ることによって当該粒子の三次元的な濃淡画像データを得、その各画素のデータについてその濃度を二値化することによって粒子の三次元的な二値画像データを得る。そして、この二値画像データについて三次元的に縮退処理を施すことによって各粒子の二値画像データをその中心点の二値画像データのみとし、この二値画像データによって各粒子の位置を三次元的に確定するというものである。
特公平７−７４４４号公報 特開平６−９４５９５号公報

前述した一般的な手法によって三次元的な注目領域を指示または抽出する場合では、領域を指示する場合に各Ｚ位置におけるスライス像の各々に対し観察者が領域の指示を行う必要があるため、スライス数を多くする（試料に対する対物レンズの焦点位置を対物レンズの光軸方向に位置を違えた二次元共焦点画像を多数取得する）とその指示に多大な労力を要することとなる。

また、前述した特許文献１に開示されている手法を用いて領域を抽出する場合では、連結しているとして代表点連結検出部で検出する範囲設定値によっては、本来１つの領域として連結しているはずの領域を２つ以上に分離している領域として検出してしまうおそれがある。

本発明は上述した問題に鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は、共焦点画像より形成される試料の立体像に対する三次元の注目領域の指示を少ない労力で行えるようにすることである。

本発明の態様のひとつである共焦点走査型顕微鏡は、観察対象である試料に対する対物レンズの集光位置を当該対物レンズの光軸方向に変化させて複数枚取得した当該試料の二次元共焦点画像を当該光軸方向に積層して得られる三次元像の、三次元空間で各々交差する３平面への射影像を構築する射影像構築手段と、当該二次元共焦点画像の各々を構成する画素のうち、当該画素の当該３平面への射影点がいずれも当該３平面に対して各々指定されている領域に含まれているものを統合してなる注目領域を当該二次元共焦点画像の各々に形成する注目領域形成手段と、を有することを特徴とするものである。

この構成によれば、試料の観察者が、当該３平面の各々に対し、そこに表されている射影像を参考にして所望の領域を指定する作業を行うだけで、二次元共焦点画像の各々にその指定された領域に基づいた注目領域が形成されて各二次元共焦点画像への領域の指示が完了する。

なお、上述した本発明に係る共焦点走査型顕微鏡において、前述した３平面の各々から前述した射影像が表されている領域を抽出する領域抽出手段を更に有し、注目領域形成手段が、当該領域抽出手段によって抽出された領域を当該３平面に対して各々指定されている領域として前記注目領域を形成するようにしてもよい。

こうすることにより、試料像の三次元像の全体を包含するように注目領域を指示するのであれば、観察者が当該３平面の各々に対して領域を指定する作業さえも行うことなく、二次元共焦点画像の各々に注目領域が形成されて各二次元共焦点画像への領域の指示が完了する。

また、前述した本発明に係る共焦点走査型顕微鏡において、前述した指定されている領域が前述の射影像と共に前述の３平面上に示されている画像を表示する指定領域表示手段を更に有するように構成してもよい。

なお、このとき、上述した画像は、前述の指定されている領域が前述の射影像と共に示されている前述の３平面のうちのいずれかを少なくとも含む二次元画像であってもよい。
また、前述した本発明に係る共焦点走査型顕微鏡において、前述した注目領域が前述の三次元像と共に示されている画像を表示する注目領域表示手段を更に有するように構成してもよい。

なお、このとき、上述した画像は、前述の注目領域が前述の三次元像と共に斜視像として示されている画像であってもよい。
また、このとき、上述した画像は、前述の注目領域と前述の三次元像とを所定の平面に沿って切断したときの断面が表されている二次元画像であってもよい。

また、前述した本発明に係る共焦点走査型顕微鏡において、前述の注目領域を走査して前述の試料の三次元像を新たに取得する走査手段を更に有するように構成してもよい。
本発明の別の態様のひとつである注目領域指定方法は、観察対象である試料に対する共焦点走査型顕微鏡の対物レンズの集光位置を当該対物レンズの光軸方向に変化させて複数枚取得した当該試料の二次元共焦点画像を当該光軸方向に積層して得られる三次元像の、三次元空間で相互に交差する３平面への射影像を構築し、当該二次元共焦点画像の各々を構成する画素のうち、当該画素の当該３平面への射影点がいずれも当該３平面に対して各々指定されている領域に含まれているものを統合してなる注目領域を当該二次元共焦点画像の各々に形成することを特徴とするものである。

こうすることにより、前述した本発明に係る共焦点走査型顕微鏡と同様、試料の観察者が、当該３平面の各々に対し、そこに表されている射影像を参考にして所望の領域を指定する作業を行うだけで、二次元共焦点画像の各々にその指定された領域に基づいた注目領域が形成されて各二次元共焦点画像への領域の指示が完了する。

なお、上述した本発明に係る注目領域指定方法において、前述した３平面の各々から前述した射影像が表されている領域の抽出を行い、前述した注目領域の形成では、この抽出のされた領域を当該３平面に対して各々指定されている領域として当該形成を行うようにしてもよい。

こうすることにより、前述した本発明に係る共焦点走査型顕微鏡と同様、試料像の三次元像の全体を包含するように注目領域を指示するのであれば、観察者が当該３平面の各々に対して領域を指定する作業さえも行うことなく、二次元共焦点画像の各々に注目領域が形成されて各二次元共焦点画像への領域の指示が完了する。

なお、上述した本発明に係る方法をコンピュータに行わせるためのプログラムであっても、このプログラムを当該コンピュータによって実行させることにより、上述した本発明に係る方法と同様の作用が生じる結果、前述した課題が解決される。

本発明によれば、上述したいずれの態様によっても、試料の観察者は共焦点画像より形成される試料の立体像に対する三次元の注目領域の指示を少ない労力で行うことができるという効果を奏する。

以下、本発明の実施の形態を図面に基づいて説明する。なお、ここでは、共焦点走査型光学顕微鏡の光学系を制御して試料を二次元走査することで試料形状情報の取得を行う例であって、［実施例１］では三次元注目領域の指示を行う例について、また［実施例２］では三次元注目領域の抽出を行う例について、それぞれ説明する。

まず図１について説明する。同図は、本発明を実施する共焦点走査型顕微鏡システムの構成の第一の例を示している。
図１において、光源１はレーザ光などの点光源である。この光源１から発せられたスポット光は二次元走査スキャナ２に導かれる。

二次元走査スキャナ２は光源１からのスポット光を試料４上でその光軸に対して垂直な方向に二次元走査させるものであり、例えばＸ方向への走査用としてのガルバノミラーまたはレソナントスキャナであるＸスキャナと、Ｘ方向に対する垂直な方向であるＹ方向への走査用としてのガルバノミラーであるＹスキャナとを有している。二次元走査スキャナ２は、これらのＸスキャナとＹスキャナとをＸ方向およびＹ方向に各々振ることによってスポット光を試料４上でＸＹの２方向に走査させる。

二次元走査スキャナ２によって二次元走査されたスポット光は対物レンズ３を通過した後にステージ５上の試料４に照射される。なお、ステージ５はＺ軸方向（ＸＹ両方向に垂直な方向）に移動可能であり、試料４をスポット光の光軸方向に移動させることができる。

スポット光が照射された試料４からの反射光または透過光は、対物レンズ３を通して二次元走査スキャナ２へ戻され、その後光検出器６に導かれる。この光検出器６の受光面の前面には、図示しないピンホールが設けられており、光検出器６はこのピンホールを透過した光を受光し、受光した光をその光強度に応じた電気信号へ変換する。

光検出器６にはＡ／Ｄ変換器７を介してＣＰＵ（中央演算装置）８が接続されている。ＣＰＵ８は、二次元走査スキャナ２と直接に接続もされており、更に、ステージ５、メモリ９、及びフレームメモリ１０とも各々接続されている。このうち、フレームメモリ１０には表示部１１が接続されている。

ＣＰＵ８は所定の制御プログラムを実行することによって図１に示されているシステム全体の動作の制御を司るものであり、例えば、二次元走査スキャナ２に対しスポット光の走査やステージ５のＺ軸方向の移動の制御を行うと共に、光検出器６によって検出される試料４からの光の強度の検出値に基づいた三次元の立体像の生成や、生成された立体像をＸＹ平面、ＸＺ平面、ＹＺ平面の各基準平面に射影したときの射影像（プロジェクション像）の生成を行うための処理を行う。

また、ＣＰＵ８は入力装置１３とも接続されており、図１に示されているシステムの使用者によって操作される入力装置１３からの当該操作に従って、使用者が指示する領域の表示部１１への描画や、二次元共焦点画像での注目領域の形成のための処理なども行う。なお、この入力装置１３はマウスやキーボードを備えている。

メモリ９は、光検出器６より検出される試料４の光強度検出値より生成される共焦点画像の画像データ、この共焦点画像の画像データよりＣＰＵ８によって生成される試料４についての三次元の立体像（試料像）を表現している画像データや、その立体像についてのＸＹ平面、ＸＺ平面、ＹＺ平面の各平面への射影像を表現している画像データ、更には注目領域を特定するためのデータなどを格納して保持する。

表示部１１は、ＣＰＵ８によって生成されてフレームメモリ１０に格納された、試料４についての三次元の立体像やＸＹ平面、ＸＺ平面、ＹＺ平面の各平面への射影像を表現している画像データを読み出してこれらの立体像や射影像を表示する。

ここで、ＣＰＵ８、メモリ９、フレームメモリ１０、表示部１１、記憶装置１２、及び入力装置１３は、標準的な構成のコンピュータシステム、すなわち、制御プログラムの実行によってこのコンピュータシステムの動作制御を司るＣＰＵと、このＣＰＵが必要に応じてワークメモリとして使用するメインメモリと、各種の画像や情報を表示する表示装置と、各種のプログラムや制御データなどを記憶して保存しておく例えばハードディスク装置などの記憶装置と、使用者によって操作されるキーボードやマウス等からなり当該操作に対応する当該使用者からの指示を取得してＣＰＵへ伝える入力装置と、Ａ／Ｄ７から出力されるデジタルデータの取得及び二次元走査用スキャナ２やステージ５の動作を制御する制御信号の送出を管理するインタフェース部とを有しているコンピュータを利用することができる。

次に、図１に示した共焦点走査型顕微鏡システムのＣＰＵ８によって行われる制御処理について、図２を参照しながら説明する。なお、図２にフローチャートで示した処理は、記憶装置１２に格納されている所定の制御プログラムをＣＰＵ８が読み込んで実行することによって実現され、このシステムの使用者によって入力装置１３へなされた実行開始の指示がＣＰＵ８によって検出されると開始される。

図２中で用いている変数について説明すると、ｉは画素のＸ座標（ｉ＝１，２，３，…，Ｎｉ）、ｊは画素のＹ座標（ｊ＝１，２，３，…，Ｎｊ）、ｋは共焦点画像のＺ方向における測定位置（ｋ＝０，１，２，３，…，Ｎｋ）であり、Ｉ（ｉ，ｊ，ｋ）は、ｉ，ｊ，ｋで特定される位置の画素についての共焦点画像データである。

まず、Ｓ１０１において、変数ｋに初期値「０」を代入する処理が行われる。
続いて、Ｓ１０２では、ステージ５の動作を制御して試料４のＺ方向の位置を二次元共焦点画像の取得開始の位置に移動させる処理が行われる。

次に、Ｓ１０３では、このときの試料４のＺ方向の位置における共焦点画像データＩ（ｉ，ｊ，ｋ）を取得してメモリ９の所定の記憶領域に格納する処理が行われる。なお、このＳ１０３の処理では、ｉ，ｊの値の逐次更新を行って、このときの試料４のＺ方向の位置における二次元共焦点画像の１画面全体についての画像データを取得するものとする。

続いて、Ｓ１０４では、変数ｋの現在の値に１を加算した結果を改めて変数ｋに代入する処理が行われる。
Ｓ１０５では、ステージ５の動作を制御して試料４のＺ方向の位置をΔＺだけ移動させる処理が行われる。なお、このΔＺは二次元共焦点画像の測定間隔を示す値であり、ここでは予め設定されているものとする。

Ｓ１０６では、前ステップの処理による移動後の試料４のＺ方向の位置が二次元共焦点画像の取得終了の位置を超えたか否かを判定する処理が行われ、超えたと判定されたとき（Ｓ１０６の判定結果がＹｅｓのとき）はＳ１０７に処理を進める。一方、未だ超えていないと判定されたとき（Ｓ１０６の判定結果がＮｏのとき）にはＳ１０３へ処理を戻して上述した処理が繰り返される。

Ｓ１０７では、以上までのＳ１０３処理の繰り返しによって取得された試料４のＺ方向の各位置における二次元共焦点画像（以下の説明においては、これらの二次元共焦点画像を単に「二次元画像」とも称することとする）の画像データに基づいて試料４についての三次元の立体像（試料像）を表す画像データを生成し、その試料像を表示部１１に表示させる処理が行われる。この試料像の立体像は、試料４のＺ方向の各位置における共焦点画像をそのＺ方向に積層したものである。なお、本実施例においては、試料４についての試料像を、図３に示すような、試料４を斜め上方から見た斜視像として表示部１１に表示させる。

Ｓ１０８では、射影像構築処理、すなわち、前ステップの処理によって生成された試料像についてのＸＹ平面、ＸＺ平面、ＹＺ平面の各基準平面への射影像を表す画像データを構築する処理が行われ、更に、これらの射影像を、例えば図３のような、試料像との関連が理解できるように表示部１１へ表示させる処理が行われる。なお、このＸＹ平面、ＸＺ平面、及びＹＺ平面の３平面は、３次元空間において相互に直交していることは当然のことである。

次に、Ｓ１０９では、マウスなどの入力装置１３に対してなされた操作に応じ、表示部１１に表示されている上述した各基準平面に対して注目領域を指定するための線を描画して表示する処理が行われる。

図３の例では、ａ、ｂ、ｃの符号を付して示されている閉曲線が各射影像に描かれており、これらの閉曲線によって注目領域の形成のための指定がされている。
なお、このようにして指定された領域には、基準平面間での関連を明らかにするため、同一の番号を付す処理が行われる。図３の例では、ａ、ｂ、ｃの各閉曲線に番号「１」が付されていることを示している。

以上のようにして領域の指定の取得が終了したならば、Ｓ１１０において、注目領域形成処理、すなわち、各基準平面の射影像上の領域に付された番号に基づいて二次元画像上で注目領域を形成して表示する処理が行われる。この処理は具体的には以下のようにして行われる。

まず、二次元画像を構成する各画素について、その画素をＸＹ平面、ＸＺ平面、ＹＺ平面の各基準平面に射影したときの位置が、その基準平面での指定された領域内であって同一番号が付されているものに基準平面の全てで含まれるか否かを判定し、この判定条件に合致する画素にのみ、その指定領域に付されていたものと同一の番号を付して表示する処理が行われる。ここで表示される画像は、図３の「二次元画像」、すなわち、注目領域（破線の表示）と三次元像（網掛けの表示）とを所定の平面に沿って切断したときの断面が表されている画像である。この処理を、二次元画像を構成する全ての画素について、そしてメモリ９に格納されている各Ｚ位置の二次元画像データの全てについて行った後に、同一の番号が付された画素を統合して領域を形成する処理が行われる。この結果、基準平面においてなされた領域の指定が三次元での注目領域の指示となる。

以上までの処理が図１のＣＰＵ８によって行われることにより、図１のシステムに対する三次元の注目領域の指示が、システムの使用者によるＸＹ平面、ＸＺ平面、ＹＺ平面の３つの各基準平面に対する領域の指定のみで可能となり、三次元の注目領域の指示のために必要な使用者の作業量が大幅に軽減される。

その後、Ｓ１１１において、前ステップの処理によって画素を統合して形成された注目領域を三次元の立体像として表す画像データを生成し、その注目領域の立体像を試料４の立体像に重ねて表示部１１に表示させる処理が行われる。なお、本実施例においては、注目領域の試料像（同図における一点鎖線で表されている像）を、図３に示すような、試料４と同様の、斜め上方から見た斜視像として表示部１１に表示させる。

続くＳ１１２では、二次元走査スキャナ２及びステージ５を制御し、このようにして形成された注目領域内に対してスポット光を再び二次元走査させ、その注目領域内における試料４の共焦点画像（例えばより高倍率の画像）を改めて取得する処理が行われる。

なお、Ｓ１１２の処理に代えて、注目領域に対して体積等の三次元解析処理を行うようにしてもよい。
以上のように、実施例１によれば、システムの使用者が注目領域の再走査や三次元解析をする場合の作業量が大幅に軽減される。

図４について説明する。同図は、本発明を実施する共焦点走査型顕微鏡システムの構成の第二の例を示している。この第二の例の構成は基本的には図１に示した第一の例の構成と同様であり、両者の違いは、第二の例ではＣＰＵ８によって注目領域抽出処理が更に実行される点のみである。

この図４に示した共焦点走査型顕微鏡システムのＣＰＵ８によって行われる制御処理について、図５を参照しながら説明する。なお、図５にフローチャートで示したこの処理は、記憶装置１２に格納されている所定の制御プログラムをＣＰＵ８が読み込んで実行することによって実現され、このシステムの使用者によって入力装置１３へなされた実行開始の指示がＣＰＵ８によって検出されると開始される。

図５中で用いている変数は、図２に示したフローチャートで用いたものと同様であり、ｉは画素のＸ座標（ｉ＝１，２，３，…，Ｎｉ）、ｊは画素のＹ座標（ｊ＝１，２，３，…，Ｎｊ）、ｋは共焦点画像のＺ方向における測定位置（ｋ＝０，１，２，３，…，Ｎｋ）であり、Ｉ（ｉ，ｊ，ｋ）は、ｉ，ｊ，ｋで特定される位置の画素についての共焦点画像データである。

図５において、Ｓ２０１からＳ２０８にかけての処理は、図２のＳ１０１からＳ１０８にかけての処理と同様のものである。
Ｓ２０９では、注目領域抽出処理、すなわち、Ｓ２０８の射影像構築処理によって構築された、試料像についてのＸＹ平面、ＸＺ平面、ＹＺ平面の各基準平面への射影像である領域を抽出する処理が行われる。本実施例においては、試料像についてのＸＹ平面、ＸＺ平面、ＹＺ平面の各基準平面への射影像をその輝度に基づいて二値化して得られる二値画像を生成し、この二値画像のうちの一方の値の領域を抽出する処理が行われる。ここで、二値画像を生成するための、各画素の輝度の高低の判定の対象とする閾値の値は、この図５の処理の実行開始前に入力装置１３を介して図４のシステムの使用者から指定された値を使用するようにしてもよいし、また、このＳ２０９の処理が実行されるときに図４のシステムの使用者にその値の指定を入力装置１３へ入力させるようにしてもよい。

このようにして抽出された領域には、基準平面間での関連を明らかにするため、同一の番号を付す処理が行われる。図６に示した領域の抽出例では、試料像についてのＸＹ平面、ＸＺ平面、ＹＺ平面の各基準平面への射影像に共通の番号「１」が付されていることを示している。

以上のようにして領域の抽出が終了したならば、Ｓ２１０において、注目領域形成処理、すなわち、各基準平面に表された二値画像である射影像上の抽出領域に基づいて二次元画像に注目領域を形成する処理が行われる。この処理は図２のＳ１１０の処理と同様である。

まず、二次元画像を構成する各画素について、その画素をＸＹ平面、ＸＺ平面、ＹＺ平面の各基準平面に射影したときの位置が、その基準平面での抽出領域内であって同一番号が付されているものに基準平面の全てで含まれるか否かを判定し、この判定条件に合致する画素にのみ、その抽出領域に付されていたものと同一の番号を付す処理が行われる。この処理を、二次元画像を構成する全ての画素について、そしてメモリ９に格納されている各Ｚ位置の二次元画像データの全てについて行う。この結果、Ｓ２０９の処理で行われた基準平面での領域の抽出の結果が三次元での注目領域の抽出結果となる。

以上までの処理が図１のＣＰＵ８によって行われることにより、三次元上に配置された試料像を注目領域として抽出することが可能となり、観察者が当該３平面の各々に対して領域を指定する作業さえも行うことなく、二次元共焦点画像の各々に注目領域が形成される。

その後、Ｓ２１１では、このようにして形成された注目領域に対して三次元解析を行い、その結果を出力する処理が行われる。ここで行われる三次元解析処理としては、例えば注目領域（すなわち、試料４）の体積や表面積の算出、寸法、角度、若しくは位置の計測、慣性モーメントの算出、外接図形若しくは楕円体相当図形の算出、注目領域内の画素の輝度の平均値、最大値、若しくは最小値の算出、又は画素の密度の算出などである。

なお、このＳ２１１の処理に代えて、図２に示したＳ１１２の処理、すなわち、注目領域に対する再走査を行って共焦点画像データを再取得する処理を行うことも、もちろん可能である。

また、試料像のうちの一部の領域のみを抽出したい場合は、射影像である二値画像を作成する処理において、例えばマウスなどの入力装置１３への操作によって指示された領域領域のみの二値画像を作成する処理を行うようにすればよい。あるいは、射影像の二値画像を作成する処理を完了した後に、例えばマウスなどの入力装置１３への操作によって指示された領域以外を削除する処理を行うようにしてもよい。

なお、以上までに説明した各実施例においては、共焦点画像の測定位置は相対情報として示していたが、Ｚ位置の絶対情報または絶対情報に基づいて得られる相対情報を用いて示すようにしてもよい。

また、これらの各実施例では、Ｚ方向の相対移動として、ステージ５を移動させるようにしていたが、対物レンズ３を移動させるようにしてもよい。
ところで、図２及び図５にフローチャートで示した処理を、前述したような標準的なコンピュータのＣＰＵに行わせるための制御プログラムを作成してコンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録させておき、そのプログラムを記録媒体からコンピュータに読み込ませてＣＰＵで実行させるようにしても、本発明の実施は可能である。

記録させた制御プログラムをコンピュータシステムで読み取ることの可能な記録媒体の例を図７に示す。このような記録媒体としては、例えば、コンピュータシステム２０に内蔵若しくは外付けの付属装置として備えられるＲＯＭやハードディスク装置などの記憶装置２１、コンピュータシステム２０に備えられる媒体駆動装置２２へ挿入することによって記録された制御プログラムを読み出すことのできるフレキシブルディスク、ＭＯ（光磁気ディスク）、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭなどといった携帯可能記録媒体２３等が利用できる。

また、記録媒体は通信回線２４を介してコンピュータシステム２０と接続される、プログラムサーバ２５として機能するコンピュータシステムが備えている記憶装置２６であってもよい。この場合には、制御プログラムを表現するデータ信号で搬送波を変調して得られる伝送信号を、プログラムサーバ２５から伝送媒体である通信回線２４を通じてコンピュータシステム２０へ伝送するようにし、コンピュータシステム２０では受信した伝送信号を復調して制御プログラムを再生することでこの制御プログラムをコンピュータシステム２０のＣＰＵで実行できるようになる。

その他、本発明は、上述した実施形態に限定されることなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内で種々の改良・変更が可能である。

本発明を実施する共焦点走査型顕微鏡システムの構成の第一の例を示す図である。 図１のＣＰＵによって行われる制御処理の処理内容を示すフローチャートである。 注目領域の指示の方法を説明する図である。 本発明を実施する共焦点走査型顕微鏡システムの構成の第二の例を示す図である。 図４のＣＰＵによって行われる制御処理の処理内容を示すフローチャートである。 注目領域の抽出の方法を説明する図である。 記録させた制御プログラムをコンピュータで読み取ることの可能な記録媒体の例を示す図である。

符号の説明

１ 光源
２ 二次元走査用スキャナ
３ 対物レンズ
４ 試料
５ ステージ
６ 光検出器
７ Ａ／Ｄ変換器
８ ＣＰＵ
９ メモリ
１０ フレームメモリ
１１ 表示部
１２ 記憶装置
１３ 入力装置
２０ コンピュータシステム
２１ 記憶装置
２２ 媒体駆動装置
２３ 携帯可能記録媒体
２４ 通信回線
２５ プログラムサーバ
２６ 記憶装置

Claims (13)

1. 観察対象である試料に対する対物レンズの焦点位置を当該対物レンズの光軸方向に変化させて複数枚取得した当該試料の二次元共焦点画像を当該光軸方向に積層して得られる三次元像の、三次元空間で相互に交差する３平面への射影像を構築する射影像構築手段と、
   前記二次元共焦点画像の各々を構成する画素のうち、当該画素の前記３平面への射影点がいずれも当該３平面に対して各々指定されている領域に含まれているものを統合してなる注目領域を当該二次元共焦点画像の各々に形成する注目領域形成手段と、
   を有することを特徴とする共焦点走査型顕微鏡。
2. 前記３平面の各々から前記射影像が表されている領域を抽出する領域抽出手段を更に有し、
   前記注目領域形成手段は、前記領域抽出手段によって抽出された領域を前記３平面に対して各々指定されている領域として前記注目領域を形成する、
   ことを特徴とする請求項１に記載の共焦点走査型顕微鏡。
3. 前記指定されている領域が前記射影像と共に前記３平面上に示されている画像を表示する指定領域表示手段を更に有することを特徴とする請求項１に記載の共焦点走査型顕微鏡。
4. 前記画像は、前記指定されている領域が前記射影像と共に示されている前記３平面のうちのいずれかを少なくとも含む二次元画像であることを特徴とする請求項３に記載の共焦点走査型顕微鏡。
5. 前記注目領域が前記三次元像と共に示されている画像を表示する注目領域表示手段を更に有することを特徴とする請求項１に記載の共焦点走査型顕微鏡。
6. 前記画像は、前記注目領域が前記三次元像と共に斜視像として示されている画像であることを特徴とする請求項５に記載の共焦点走査型顕微鏡。
7. 前記画像は、前記注目領域と前記三次元像とを所定の平面に沿って切断したときの断面が表されている二次元画像であることを特徴とする請求項５に記載の共焦点走査型顕微鏡。
8. 前記注目領域を走査して前記試料の三次元像を新たに取得する走査手段を更に有することを特徴とする請求項１に記載の共焦点走査型顕微鏡。
9. 観察対象である試料に対する共焦点走査型顕微鏡の対物レンズの焦点位置を当該対物レンズの光軸方向に変化させて複数枚取得した当該試料の二次元共焦点画像を当該光軸方向に積層して得られる三次元像の、三次元空間で相互に交差する３平面への射影像を構築し、
   前記二次元共焦点画像の各々を構成する画素のうち、当該画素の前記３平面への射影点がいずれも当該３平面に対して各々指定されている領域に含まれているものを統合してなる注目領域を当該二次元共焦点画像の各々に形成する、
   ことを特徴とする注目領域指定方法。
10. 前記３平面の各々から前記射影像が表されている領域の抽出を行い、
    前記注目領域の形成では、前記抽出のされた領域を前記３平面に対して各々指定されている領域として当該形成を行う、
    ことを特徴とする請求項９に記載の注目領域指定方法。
11. 観察対象である試料に対する共焦点走査型顕微鏡の対物レンズの焦点位置を当該対物レンズの光軸方向に変化させて複数枚取得した当該試料の二次元共焦点画像を当該光軸方向に積層して得られる三次元像の、三次元空間で相互に交差する３平面への射影像を構築する射影像構築処理と、
    前記二次元共焦点画像の各々を構成する画素のうち、当該画素の前記３平面への射影点がいずれも当該３平面に対して各々指定されている領域に含まれているものを統合してなる注目領域を当該二次元共焦点画像の各々に形成する注目領域形成処理と、
    をコンピュータに行わせるためのプログラム。
12. 前記３平面の各々から前記射影像が表されている領域を抽出する領域抽出処理を更に前記コンピュータに行わせ、
    前記注目領域形成処理は、前記領域抽出処理が行われることによって抽出された領域を前記３平面に対して各々指定されている領域として前記注目領域を形成する処理を前記コンピュータに行わせる、
    ことを特徴とする請求項１１に記載のプログラム。
13. 前記注目領域に対して三次元解析を施す三次元解析処理を更に前記コンピュータに行わせることを特徴とする請求項１１に記載のプログラム。
    
    

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