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JP2004533206A - Cancer-related genes as targets for chemotherapy - Google Patents

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JP2004533206A JP2002534562A JP2002534562A JP2004533206A JP 2004533206 A JP2004533206 A JP 2004533206A JP 2002534562 A JP2002534562 A JP 2002534562A JP 2002534562 A JP2002534562 A JP 2002534562A JP 2004533206 A JP2004533206 A JP 2004533206A
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Abstract

ガン関連遺伝子配列および得られたアミノ酸配列は、これらのガン関連遺伝子の発現の調節に基づいて潜在的な抗腫瘍物質を分析するためのプロセスとともに開示される。また開示されたポリペプチドと反応する抗体および遺伝子配列を用いてガンを診断し、処置する方法も開示される。また新規の遺伝子およびポリペプチドもまた開示される。The cancer-related gene sequences and the resulting amino acid sequences are disclosed along with a process for analyzing potential anti-tumor agents based on the regulation of the expression of these cancer-related genes. Also disclosed are methods of diagnosing and treating cancer using antibodies and gene sequences that react with the disclosed polypeptides. Also disclosed are novel genes and polypeptides.

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本出願は２０００年１０月１１日に出願された合衆国仮特許出願番号６０／２３９２９４号、２０００年１０月１１日に出願された合衆国仮特許出願番号６０／２３９２９７号、２０００年１０月１１日に出願された合衆国仮特許出願番号６０／２３９６０５号、２０００年１０月１２日に出願された合衆国仮特許出願番号６０／２３９８０２号、２０００年１０月１２日に出願された合衆国仮特許出願番号６０／２３９８０５号、２０００年１０月１２日に出願された合衆国仮特許出願番号６０／２３９８０６号、２０００年１０月１６日に出願された合衆国仮特許出願番号６０／２４０６２２号、２０００年１０月１９日に出願された合衆国仮特許出願番号６０／２４１６８２号、２０００年１０月１９日に出願された合衆国仮特許出願番号６０／２４１７２３号、２０００年１０月３１日に出願された合衆国仮特許出願番号６０／２４４９３２号の優先権を主張し、その開示は全体で引用例としてここに組み込まれている。
【０００２】
本発明は、ガンの発現および促進プロセスに関与するガン関連遺伝子および発現産物をスクリーニングする方法および、小有機化合物およびその他の分子を含む潜在的な抗ガン物質をスクリーニングするための前記遺伝子の利用に関する。
【０００３】
【発明の背景】
ガン関連遺伝子は、遺伝子がガン細胞中には発現するが非ガン細胞中には発現しないか、あるいは前記遺伝子が正常あるいは非ガン細胞に対してガン細胞中に過剰に発現するかあるいは高いレベルで発現する等のガン細胞と正常細胞との間の遺伝的差異を示す点で、有益である。加えて、特に同じ型の組織の、ガン細胞中には起こらない正常細胞中での前記遺伝子の発現は、ガンプロセスにおける重要な機能を示すことができる。例えば、新規薬剤のスクリーニング分析は、特定の化合物での処置に対するｉｎ ｖｉｔｒｏでのモデル細胞に基づくシステムの応答に基づく。サイトカインの放出、細胞表面標識の変換、特定の酵素の活性化およびイオン流動およびまたはｐＨの変換を含む細胞応答の種々の測定は、利用されてきた。前記選別の一部は、ガン遺伝子（あるいは遺伝子突然変異）等の特定の遺伝子に依存する。本発明にしたがって、ガン関連遺伝子は特定され、その推定アミノ酸配列が決定された。前記遺伝子は、ガンの診断、抗ガン物質のスクリーニングおよび前記物質を用いたガンの処置において、特にこれらの遺伝子が、細胞表面標識等の標識として働くことが可能であり、それにより抗体、好ましくはアポトーシス因子を含む細胞傷害性因子と複合する抗体等の抗腫瘍物質にとっての格好の標識を提供するポリペプチドをコード化している点で有益である。
【０００４】
【発明の簡単な要約】
本発明にしたがって、ここで一連のガンに関連する遺伝子、あるいはそうでなければガンの発現および促進プロセスに関与する遺伝子およびその発現アミノ酸配列が提供される。
【０００５】
特定の実施例において、前記遺伝子は配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９と一致し、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０の配列より成るポリペプチドを含むポリペプチドをコード化する。
【０００６】
より特に、前記遺伝子は、特定の組織、例えば肺由来の非ガン細胞と比較してガン細胞中でその発現が変化し、ここでその遺伝子は、配列番号：１のヌクレオチド配列、あるいは前記配列と実質的に同一の配列およびまたは配列番号：２のアミノ酸配列を持つポリペプチドあるいはそれから保存アミノ酸置換により異なるポリペプチドをコード化する配列と一致するポリヌクレオチドを含む。
【０００７】
本発明の別の目的は、ガン特異的あるいは関連遺伝子の発現を上向きあるいは下向きに調節するための選択された化学物質の潜在的能力の分析のために、前記特異的遺伝子を用いる方法を提供することである。
【０００８】
本発明のさらなる目的は、培養増殖した時あるいはｉｎ ｓｉｔｕで維持された時の選択された細胞のガンあるいは非ガン状態（すなわち潜在的なガン状態）を判断する手段として、前記特異的遺伝子あるいはその部分の発現あるいは不発現、または発現量を検出する方法を提供することである。
【０００９】
本発明のまたさらなる目的は、特異的な遺伝子あるいはそのタンパク質産物を調節する（すなわち増加あるいは減少させる）能力から判断された、選択された化学物質を用いてガン状態を処置するための方法を提供することである。
【００１０】
本発明はまた、ガン細胞を、遺伝子によってコード化された発現産物に対して活性を持つ物質と接触させることより成る、ガンを処置するためのプロセスに関し、ここで前記プロセスはｅｘ ｖｉｖｏあるいはｉｎ ｖｉｖｏで実施され得る。また前記産物はここに開示される。前記物質は、前記発現産物に特異的な抗体あるいはその他の分子または部分より成り得る。好ましい実施例において、前記遺伝子のポリペプチド産物は、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０等のここに開示されたようなポリペプチドである。
【００１１】
【発明の説明】
本発明は、化学療法薬、特に抗ガン物質のための標的としてのガン関連遺伝子（配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９）および発現アミノ酸配列（配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０）に対するヌクレオチド配列を用いるためのプロセスに関する。
【００１２】
その発現あるいは不発現または発現量が特定の細胞のガンあるいは非ガン状態の指標となり、またその発現が特定の組織から得られた非ガン細胞と比較してガン細胞中で変化する特有の遺伝子配列は、ここに開示されたヌクレオチド配列、あるいは前記配列に実質的に同一、最低約９０％同一、好ましくは９５％同一、最も好ましくは最低約９８％同一の配列を含み、特にここで前記遺伝子は、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９の配列を持つ。以下の結果については、前記配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースの範囲内で検索された。
【００１３】
本発明は、以下の特徴を持つヌクレオチド配列および発現ポリペプチドに関する。
【００１４】
一つのヌクレオチド配列はジーンバンク登録番号：ＮＭ＿０１４１０９およびＡＡ２３５４４８であり、以下の特異的な特徴によって特定された、ガン中の増幅したブロモドメイン含有タンパク質に相当する：ＵｎｉＧｅｎｅクラスター：Ｈｓ．４６６７７；Ｌｏｃｕｓ Ｌｉｎｋ 番号：無し；配列情報：１９３４ｂｐ ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡは配列番号：１）、１０８６ｂｐ ＯＲＦおよび３６２アミノ酸（配列番号：２）；染色体上の位置：８ｑ２４（解読されたヒトゲノム配列に対する配列に基づく）。堆積した情報は、未知の機能のｃＤＮＡクローンから推定されたコード化配列の予測を示した。本発明にしたがって、このメッセージは正常肺組織に対して肺ガン中で最低３倍増加した。Ｐｒｏｓｉｔｅデータベースの検索は、ブロモドメイン２配列と１００％の類似性を有するドメインを明らかにし、前記ドメインは多くの転写因子中に含まれる。正常な増殖の維持におけるブロモドメインタンパク質の主な役割は、その４つが転移休止点で同定されたことと共に、複数のブロモドメインタンパク質のガンにおける影響によって示される。
【００１５】
新規の遺伝子は、ｄｂＥＳＴ内に存在するＥＳＴ配列に基づいて同定された。この新規遺伝子は、Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅレセプターファミリーの新規の一つに相当し、そこから発現したポリペプチドの一部はヒトｔｏｌｌ−ｌｉｋｅレセプター１に最低３９％同一の配列を持つ。ヒトＴｏｌｌ−ｌｉｋｅレセプターの５つ（ＴＬＲｓ１−５と称す）は、対応するハエ分子の直接相同体であり、ヒトの先天性免疫の重要な要素を構成し得る。発現分析は、この遺伝子が特にＢリンパ球により発現されることを示す。特徴は：クラスター中のサンプルＥＳＴのジーンバンク登録番号：ＡＡ６４８８３６；ＵｎｉＧｅｎｅクラスター：Ｈｓ．８９２０６；Ｌｏｃｕｓ Ｌｉｎｋ番号：１０３３０；クラスター名：ＥＳＴｓ、わずかに類似したＴＬＲ６［Ｈ．サピエンス］；配列情報：コード化されたポリペプチド配列番号：４を持つ１２７４ｂｐ ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡは配列番号：３）であった。Ｕｎｉｇｅｎｅクラスターは、全て扁桃腺から得られた１０の配列から成る。マイクロアレイ発現分析は、Ｂリンパ球中での特異的な発現を示す。
【００１６】
一つのヌクレオチド配列はジーンバンク登録番号：ＡＢ０１５６３１であり、以下の特異的な特徴を持つ：ジーンバンク登録番号：ＡＢ０１５６３１；ＵｎｉＧｅｎｅクラスター：Ｈｓ．８７５２；Ｌｏｃｕｓ Ｌｉｎｋ番号：１０３３０；クラスター名：膜貫通型タンパク質４；配列情報：８１４ｂｐ ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡは配列番号：６のコード化ポリペプチドを持つ配列番号：５）および染色体上の位置：１２。ＵｎｉＧｅｎｅクラスターは、複数の組織から得られた２２以上の配列より成る。正常組織中での発現の最大値は骨格筋で検出された。
【００１７】
一つのヌクレオチド配列はジーンバンク登録番号：ＮＭ＿０１４３９７、ＡＢ０２６２８９であり、以下の特異的な特徴を持つ：ＵｎｉＧｅｎｅクラスター：Ｈｓ．９６２５；Ｌｏｃｕｓ Ｌｉｎｋ番号：２７０７３；公開クラスター名：ＳＩＤ６−１５１２、推定セリン−トレオニンタンパク質キナーゼ；配列情報：１５９７ｂｐ ｍＲＮＡ（配列番号：７）、９２１ｂｐ ＯＲＦおよび３０７アミノ酸（および配列番号：８）および染色体上の位置：９ｑ３３。ジーンバンクの記録から、完全なｍＲＮＡおよびタンパク質配列は得られる。ＳＩＤ６−１５１２は、細胞周期調節に関連するキナーゼであるマウスＮＥＫ１と類似する配列を共有する。ＵｎｉＧｅｎｅクラスターは、種々の組織源由来の１５０以上のＥＳＴ配列を含む。ＢＬＡＳＴスコアの最大値はタンパク質キナーゼｎｅｋ１で得られ、前記ｎｅｋ１は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓの細胞分裂の開始を制御するタンパク質キナーゼであるＮＩＭＡの触媒ドメインと約４２％同一のＮ末端タンパク質キナーゼドメインを包含する。加えて、Ｎｅｋ１およびＮＩＭＡの両方は、長い塩基性Ｃ末端伸長を持ち、それにより全体構造が類似する。
【００１８】
一つのヌクレオチド配列はジーンバンク登録番号：ＮＭ＿００６０３５、ＡＦ１２８６２５であり、以下の特異的な特徴を持つ：ＵｎｉＧｅｎｅクラスター：Ｈｓ．１２９０８；Ｌｏｃｕｓ Ｌｉｎｋ 番号：９５７８；クラスター名：ＣＤＣ４２結合タンパク質キナーゼベータ（ＤＭＰＫ−様；ＭＲＣＫベータ）；配列情報：６７８０ｂｐ ｍＲＮＡ（配列番号：９）、５１３６ｂｐ ＯＲＦおよび１７１１アミノ酸（配列番号：１０）および染色体上の位置：１４ｑ３２．３。ＵｎｉＧｅｎｅクラスターは、種々の組織源由来の２１５以上のＥＳＴ配列を含有した。ｐ２１ ＧＴＰアーゼ、ＲｈｏおよびＣｄｃ４２は、セリン／トレオニンタンパク質キナーゼサブファミリーの一部に結合することにより、多くの細胞機能を調節する。これらの機能には、細胞増殖および分化の特徴である細胞骨格の再構築を含む。これらのｐ２１ ＧＴＰアーゼ調節キナーゼの２つ、筋緊張性ジストロフィータンパク質キナーゼ関連Ｃｄｃ４２結合キナーゼ（ＭＲＣＫアルファおよびベータ）は、アクチン−ミオシン収縮性の活性化のための要件である、非筋ミオシン軽鎖のリン酸化のために示された。ＢＬＡＳＴ検索は、ヒト筋緊張性ジストロフィーキナーゼと約４９％同一の配列番号：１０の一部を示した。
【００１９】
一つのヌクレオチド配列はジーンバンク登録番号：ＮＭ＿００２６５４であり、以下の特異的な特徴を持つ：ＵｎｉＧｅｎｅクラスター：Ｈｓ．１９８２８１；Ｌｏｃｕｓ Ｌｉｎｋ番号：５３１５；クラスター名：ピルビン酸キナーゼ、筋肉；配列情報：２２８７ｂｐ ｍＲＮＡ（配列番号：１２の発現アミノ酸配列を伴う配列番号：１１）および染色体上の位置：１５ｑ２２。この遺伝子は、タンパク質キナーゼの内のｃｄｋファミリーの小サブファミリーの一つである。ＰＣＴＡＩＲＥ−３は、最終分化細胞中の情報伝達において役割を果たすように見える。ヒトおよびマウスＰＣＴＡＩＲＥ−３遺伝子のクローン作成は、開示されてきたが、その他の情報は科学文献からは得ることはできない。ＵｎｉＧｅｎｅクラスターは、複数の組織から得られた６４配列より成る。ＰＣＴＡＩＲＥ−３は、試験した結腸腺ガン中に発現し、試験した正常結腸組織サンプル中に低レベルで発現したかあるいはまったく発現しなかった。
【００２０】
一つのヌクレオチド配列はジーンバンク登録番号：ＮＭ＿００６２９３であり、以下の特異的な特徴を持つ：ＵｎｉＧｅｎｅクラスター：Ｈｓ．３０１；Ｌｏｃｕｓ Ｌｉｎｋ番号：７３０１；クラスター名：ＴＹＲＯ３タンパク質チロシンキナーゼ；配列情報：４３６４ｂｐ ｍＲＮＡ（配列番号：１４の発現アミノ酸配列を伴う配列番号：１３）および染色体上の位置：１５ｑ１５．１−ｑ２１．１。ＵｎｉＧｅｎｅクラスターは、複数の組織から得られた４５以上の配列より成る。正常組織中の発現の最高レベルは脳内で検出された。配列番号：１４は、種々のレセプターチロシンキナーゼに対してかなりの相同性を示す。例えば、配列番号：１４の一部は、ＡＸＬレセプターチロシンキナーゼに対して最低約４３％同一である。ＮＩＨ３Ｔ３細胞中でのａｘｌ ｃＤＮＡの過剰な発現は、１４０ｋＤのａｘｌチロシンリン酸化タンパク質の同時出現を伴う悪性形質転換を引き起こす。
【００２１】
一つのヌクレオチド配列はジーンバンク登録番号：ＮＭ＿００２９６９であり、以下の特異的な特徴を持つ：ＵｎｉＧｅｎｅクラスター：Ｈｓ．５５０３９；Ｌｏｃｕｓ Ｌｉｎｋ番号：６３００；クラスター名：マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ１２；配列情報：１４５７ｂｐ ｍＲＮＡ（配列番号：１６の発現アミノ酸配列を伴う配列番号：１５）および染色体上の位置：２２ｑ１３．３３。ＵｎｉＧｅｎｅクラスターは、複数の組織から得られた２２以上の配列より成る。正常組織中の発現の最高レベルは、骨格筋中で検出された。この配列は、例えばヒトマイトジェン活性化タンパク質キナーゼｐ３８デルタ等の種々のマイトジェン活性化タンパク質キナーゼに対してかなりの相同性を示す。ｐ３８マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）は、ストレスおよび炎症反応において重大な役割を果たし、またヒト免疫不全ウイルス遺伝子発現の活性化に関連する。
【００２２】
一つのヌクレオチド配列はジーンバンク登録番号：Ｗ３１３４４であり、以下の特異的な特徴を持つ：ＵｎｉＧｅｎｅクラスター：Ｈｓ．５５４４４；Ｌｏｃｕｓ Ｌｉｎｋ番号：未知；クラスター名：ＥＳＴｓ；染色体上の位置：未知。ＵｎｉＧｅｎｅクラスターは９以上の配列より成り、その全てが副甲状腺から得られる。ジーンバンクデータベースは、ＡＦ１５３８１９（ホモサピエンス内向き整流性カリウムチャンネルＫｉｒ２．１）に対して正確な一致を示す。この一致は、ジーンバンク登録の３′未翻訳領域に完全に限定される。チロカルシンおよびＫｉｒ２．１遺伝子の翻訳産物は同一である。しかし、我々は、チロカルシンがいくつかのスプライシングをＫｉｒ２．１と共有する完全に異なる遺伝子であるという可能性を正式に除外することはできない。配列番号：１７は、Ｋｉｒ２．１に対するヌクレオチド配列を示し、配列番号：２１は、甲状腺腺癌に特異的な、発現分析により同定されたＥＳＴクラスターを示す。配列番号：１７から得られたアミノ酸配列は、配列番号：１８として示される。ＥＳＴクラスターの配列は、既知のタンパク質に対する明らかな相同性を示さない。しかし、ＥＳＴクラスターが単にＫｉｒ２．１の３′未翻訳領域である場合には、この遺伝子は、内向き整流性カリウムチャンネルである。
【００２３】
一つのヌクレオチド配列は、Ｓｏｘ２−ｌｉｋｅ ＨＭＧ−ｂｏｘ腫瘍形成発現配列に相当するジーンバンク登録番号：ＡＡ１３３３３４であり、以下の特異的な特徴を持つ：ＵｎｉＧｅｎｅクラスター：Ｈｓ．１２９９１１；Ｌｏｃｕｓ Ｌｉｎｋ番号：無し；配列情報：１０５０ｂｐ ｍＲＮＡ（ｂｐ＝塩基対、配列番号：１９）、２６４ｂｐ ＯＲＦおよび８８アミノ酸（配列番号：２０）および染色体上の位置：未知。配列番号：１９は、Ｇｅｎｅ ＬｏｇｉｃデータベースにおけるＥＳＴ（発現配列タグ）として表される。配列番号：１９は、公開データベース中の重複コンティグにより、１０５０ｂｐに伸長される。ｕｎｉｇｅｎｅクラスターは広範囲の発現を示し、メッセージは正常肺組織に対して肺ガン中で最低３倍上向き調節されることが発見された。この配列は、ヒツジＳＯＸ−２遺伝子に著しく相同性を示し、マウスＳＯＸ−２遺伝子により少ない程度で相同性を示す。Ｓｏｘ遺伝子ファミリーは、ＨＭＧ ｂｏｘとして知られる７９アミノ酸ＤＮＡ結合ドメインの占有を通して関連する、多数の初期発現遺伝子より成る。これらの遺伝子は、遺伝子発現の調節に関連する可能性のある転写因子である。
【００２４】
本発明のプロセスにおいて用いられるヌクレオチドおよび遺伝子産物であるポリペプチドは、組み換え型ポリヌクレオチドあるいはポリペプチド、通常のポリヌクレオチドあるいはポリペプチド、もしくは合成ポリヌクレオチドあるいはポリペプチドより成り、好ましくは組み換え型ポリヌクレオチドあるいはポリペプチドである。
【００２５】
ここに開示される前記ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの断片はまた、本発明のプロセスの実施において有益であり得る。例えば、ポリペプチド（配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０）の断片、誘導体あるいは類似体は、（ｉ）アミノ酸残基の一つあるいはそれ以上が保存あるいは非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）と置き換えられ、前記置換アミノ酸残基が遺伝暗号によってコード化されたものであるかあるいはないもの、または（ｉｉ）アミノ酸残基の一つあるいはそれ以上が置換基グループを含むもの、あるいは（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を延長するための化合物（例えばポリエチレングリコール）等の別の化合物に溶解するもの、もしくは（ｉｖ）追加のアミノ酸が、リーダーあるいは分泌配列、または成熟ポリペプチドあるいはプロタンパク質配列の精製に従事する配列等の、成熟ポリペプチドに融合するものであり得る。前記断片、誘導体および類似体は、ここでの教示からこの分野における通常の知識を有する者の範囲内にあると思われる。
【００２６】
一見地において、本発明は、配列番号：３のポリヌクレオチドと最低６５％同一のポリヌクレオチドあるいはその補足物より成る単離されたポリヌクレオチドに関する。好ましい実施例において、前記の単離されたポリヌクレオチドは、配列番号：３の配列と最低８０％、好ましくは最低約９０％、最も好ましくは最低約９５％、特に最低約９８％同一である配列を持つポリヌクレオチドより成り、そして最も特には配列番号：３の配列と同一である。本発明の単離されたポリヌクレオチドはまた、任意の前記のものの補足物を含み得る。
【００２７】
別の見地において、本発明は、配列番号：４のアミノ酸配列と最低９０％同一のアミノ酸配列より成る、精製ポリペプチドを含む単離されたポリペプチドに関する。好ましい実施例において、前記の単離されたポリペプチドは、配列番号：４の配列と最低９５％、好ましくは最低約９８％同一の配列を持つアミノ酸配列より成り、特に配列番号：４の配列と同一である。本発明はまた、前記ポリペプチドの単離された活性断片を含み、ここで前記断片はポリペプチドの生物学的活性を保持し、あるいはここで前記活性断片は、ガンの処置、予防あるいは診断のための特異的な標的として有益である。
【００２８】
本発明のプロセスの実施において有益なポリヌクレオチドおよびポリペプチドは同様に、単離あるいは精製された形状で得られ得る。加えて、本発明のプロセスの実施に有益なようにここに開示されたポリペプチドは、機能の点で異なる型のタンパク質を含み、したがって、ここに列挙されたように、そのいくつかは酵素であり、いくつかは転写因子であり、その他には細胞表面レセプターであり得る。故に、前記ガン関連タンパク質の本発明のプロセスにおける用いられ方は、タンパク質の機能および細胞局在に依存してはっきり異なり得る。したがって、ここに開示された方法の変更あるいは最適化は、前記相違の観点において望ましいものであり得る。例えば、細胞表面レセプターは細胞傷害性抗体の優れた標的であり、一方転写因子あるいは酵素は抗悪性腫瘍活性を持つ小有機化合物に対する有益な標的である。
【００２９】
ここで用いられるときに、“単離された”という用語は、物質がその元の環境（例えば、自然発生の場合には、自然環境）から取り外されることを意味する。それはまた組み換えにより生産し、続いて精製することもできる。例えば、生きている動物中に存在する自然発生ポリヌクレオチドあるいはポリペプチドは単離されないが、自然分類中の共存物質のいくつかあるいは全てから分離された同じポリヌクレオチドあるいはポリペプチドは単離される。前記ポリヌクレオチド、例えば組み換えにより調製されたものは、ベクターの一部であり得る。そしてまたは前記ポリヌクレオチドあるいはポリペプチドは、構成物の一部であり得る。さらに前記ベクターあるいは構成物がその自然環境の一部でない場合には、単離され得る。本発明の一つの実施例において、前記単離あるいは精製されたポリペプチドは、本発明の実施のための抗体の生成において有益であり、あるいはここで前記抗体は、アポトーシス因子等の細胞傷害性あるいは細胞溶解性因子に付着する。
【００３０】
この分野において知られているように、２つのポリペプチド間の“類似性”は、第１のポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存アミノ酸置換体と第２のポリペプチドの配列を比較することにより測定される。
【００３１】
ジーンバンク寄託から得られた、ここに開示された配列情報は、ペプチド合成による対応する全長ポリペプチドを調製するために、この分野における通常の知識を有する者が容易に利用することができる。本発明の方法において用いるための、ここに開示されたポリヌクレオチドあるいはポリペプチドについても同様である。
【００３２】
ここで用いられるときに、“部分”、“分節”および“断片”という用語は、ポリペプチドに関して用いられる場合には、アミノ酸残基等の残基の連続した配列を示し、前記配列はより大きな配列の部分集合を形成する。例えば、ポリペプチドが、トリプシンあるいはキモトリプシン等の任意の一般のエンドペプチダーゼでの処理を受けた場合には、前記処理の結果として生じたオリゴペプチドは、最初のポリペプチドの部分、分節あるいは断片に相当する。ポリヌクレオチドに関して用いられた場合には、前記用語は、前記ポリヌクレオチドの任意の一般のエンドヌクレアーゼでの処置によって生成された産物を示す。
【００３３】
本発明はさらに、ここに開示された任意のポリヌクレオチドより成るベクターおよび、前記ベクターあるいは前記ポリヌクレオチドより成るかあるいはここに開示されたポリペプチド、特にそのアミノ酸配列が配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０の配列であるポリペプチドを発現する組み換え細胞に関する。
【００３４】
前記細胞およびベクターを生成する方法は、分子生物学分野における通常の知識を有する者によく知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８９）、Ｗｕ ｅｔ ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９７）、およびＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６２，（Ｔｕａｎ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９７）参照。その開示は引用例としてここに組み込まれている。
【００３５】
他の見地において、本発明は、
（ａ）化合物を配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９より成るグループから選択された配列を持つポリヌクレオチドと一致する遺伝子に、前記遺伝子の発現を促進する条件下で接触させ、
（ｂ）前記化合物が存在しなかった場合との比較における前記遺伝子の発現の差異を検出し、
それによりガン関連遺伝子の活性を調節する因子を同定することより成る、ガン関連遺伝子の活性を調節する因子を同定するためのプロセスに関する。
【００３６】
本発明の特異的な実施例において、本発明に有益な遺伝子は、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９から選択された配列を持つポリヌクレオチドと一致する遺伝子より成るか、あるいはここに開示された任意のポリヌクレオチドの配列より成り得る（ここで後者はｃＤＮＡ配列である）。ここで用いられるときに、“一致する（対応する）遺伝子”は、ここに開示されたヌクレオチド配列（すなわち配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９）の１つによってコード化されるＲＮＡと最低９０％同一、好ましくは最低９５％同一、最も好ましくは最低９８％同一、そして特に同一であるＲＮＡをコード化する遺伝子を示す。前記遺伝子はまた、任意のここに開示された配列、好ましくは配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０と同じポリペプチド配列をコード化するが、前記アミノ酸配列との差異を含み得る。ここで前記差異は保存アミノ酸置換体に限定され、ここで同じ３次元構造全体は維持され、したがって同じ抗原性の特徴は維持される。したがって、アミノ酸配列は本発明の範囲内のものであり、ここで前記アミノ酸配列は、ここに開示された配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０の配列より成るポリペプチドと反応する抗体と同じ抗体と反応する。
【００３７】
ここで用いられるときに、“保存アミノ酸置換体”という用語は、以下の５つのグループの１つの置換体としてここに定義される：
Ｉ．小さい、脂肪族の、無極性あるいはわずかに極性のある残基：
Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；
ＩＩ．有極性の、負の電荷を帯びた残基およびそのアミド：
Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
ＩＩＩ．有極性の、正の電荷を帯びた残基：
Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；
ＩＶ．大きい、脂肪族の、無極性残基：
Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ
Ｖ．大きい、芳香族残基：
Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ
本発明にしたがって、細胞系、初代細胞あるいは組織サンプルを用いたモデル細胞システムは増殖培地中で保存され、単一の濃度あるいはある範囲の濃度の化合物で処理され得る。処理後特定の時間で、細胞ＲＮＡｓは処理された細胞、初代細胞あるいは腫瘍から単離され、前記ＲＮＡｓは選択された遺伝子の発現を示す。その後細胞ＲＮＡは分割され、特異的なＲＮＡ転写産物の存在およびまたは量を検出する分析を受ける。前記転写産物は、その後例えば逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）その他等の標準法を用いて、検出目的のために増幅され得る。特異的ＲＮＡ転写産物の存在あるいは不在またはレベルは、それらの測定および、正常サンプルと比較した処理された化合物に対するサンプルの反応の様式と程度について得られた測定基準から確定される。
【００３８】
前記にしたがって、ガン関連遺伝子配列（配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９）を用いるためのプロセスがここに開示され、前記ガン関連遺伝子配列の発現は、本発明の方法の結果として、試験される細胞あるいは組織のガンあるいは非ガン状態を特徴付けるために関連付けられあるいは用いられ、またはそうすることができる。したがって、本発明のプロセスは、特異的モデルシステムにおけるここに開示されたポリヌクレオチド配列の発現の変化に基づいて、新規抗悪性腫瘍物質を同定する。したがって本発明の方法は、種々の細胞系あるいは、さまざまな期間適切な培養条件化でｉｎ ｖｉｔｒｏで保存されあるいは適切な動物モデル中にｉｎ ｓｉｔｕで保存された腫瘍から得られた初代サンプルと共に用いることができる。
【００３９】
より特に、ガン細胞中で、非ガン細胞中での発現レベルとは異なるレベルで発現する遺伝子が同定された。一つの例において、同定された遺伝子は、正常細胞中よりもガン細胞中でより高いレベルで発現する。
【００４０】
本発明のポリヌクレオチドは、付随制御あるいは調節配列を伴う完全作用遺伝子、または単に一致するポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列あるいは活性断片もしくはその類似体を含むことができる。
【００４１】
本発明の一つの実施例において、前記遺伝子調節は下向き調節であり、そのため試験される化学物質への露出の結果として、ガン細胞の一つあるいはそれ以上の遺伝子は、前記物質へ露出しなかった場合の発現と比較して前記物質へ露出した場合、より低いレベルで発現する（あるいはまったく発現しない）。例えば、配列番号：２のポリペプチドをコード化する遺伝子は、正常肺細胞中よりも肺ガンの細胞中でより高いレベルで発現する。
【００４２】
好ましい実施例において、選択された一連の前記遺伝子は、本発明に従った使用のために同定された遺伝子配列を含む参照細胞中に発現するが、試験される細胞の化学物質への露出の結果として生じた試験された細胞中には発現しない。したがって、ここで前記化学物質は、試験された細胞の遺伝子の、参照細胞の同じ遺伝子よりもより低いレベルでの発現を引き起こす。これは下向き調節を示し、また試験される化学物質が抗悪性腫瘍活性を持つことを示す。
【００４３】
任意の配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０と同じタンパク質をコード化する配列はまた、前記配列の同一性パーセントにもかかわらず、本発明の任意の方法によって、それらがどのように別に開示されあるいは限定されるかにかかわらず、明確に意図される。したがって、任意の前記配列は、本発明にしたがって開示された任意の方法の実施での使用に利用できる。前記配列はまた、配列番号：１の配列内に存在する、ここで定義される任意の読み取り枠を含む。
【００４４】
本開示によって同定される遺伝子は、“ガン関連”という用語がここで用いられるときに、“ガン関連”遺伝子と見なされ、また正常（すなわち非ガン）細胞中でのこれらの遺伝子の発現と比較してガン細胞に（例えば発現割合の増加、発現程度の増加あるいは複製数の増加に起因して）より高いレベルで発現する遺伝子を含む。ここで前記の試験細胞あるいは組織のガン状態は、以下の実施例に開示される逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）等の、この分野において知られた方法により判断される。特異的な実施例において、これはその配列が配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９の配列と一致する遺伝子に関する。ここで用いられるときに、“一致する（対応する）”という用語は、遺伝子が指示されたヌクレオチド配列を持つか、あるいは遺伝子が指示された配列によってコード化されるものと実質的に同じＲＮＡをコード化することを意味する。“実質的に”という用語は、ここで定義されたときに、最低約９０％同一を意味し、その挿入変異体を含む。
【００４５】
ここに開示された配列は、本質的にゲノムの配列であり、したがってヒト遺伝子等の事実上の遺伝子の配列に相当し、あるいはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から得られたｃＤＮＡ配列であり、したがって対応するゲノム配列から得られた連続したエキソン配列に相当し、またはそれらは本発明を実施するために完全に合成され得る。最初のＲＮＡ転写産物の最終ｍＲＮＡへの変換中に起こり得るプロセスのために、ここに開示された配列は、全ゲノム配列より短い配列に相当し得る。これらはまたリボソームおよびトランスファーＲＮＡｓから得られた配列をも示し得る。結果として、細胞中に存在する（そしてゲノム配列に相当する）遺伝子および主にｃＤＮＡ配列である、ここに開示された配列は、同一であるかあるいはｃＤＮＡが全長ゲノム配列よりも短い配列を含み得る。前記遺伝子およびｃＤＮＡ配列はさらに、それらが共に類似のＲＮＡ配列をコード化するために、一致する配列であると見なされる。したがって、限定されない例として、後により短いｍＲＮＡに加工されるＲＮＡ転写産物をコード化する遺伝子は、前記ＲＮＡｓの両方をコード化すると考えられ、したがって（通常のワトソン−クリック相補性法則を用いて）ｃＤＮＡ（例えばここに開示された配列）に相補的なＲＮＡをコード化し、あるいはそうでなければｃＤＮＡによってコード化される。したがって、ここに開示された配列は、発現の相対値を測定するために用いられるガンあるいは正常細胞中に含まれる遺伝子と一致する。それは前記配列が前記遺伝子によってコード化されるＲＮＡｓと同じ配列あるいは相補的であるためである。前記遺伝子はまた、異なる対立遺伝子および本発明のプロセスに用いられる細胞中に発生し得る接合変異体を含む。
【００４６】
遺伝子が、指示された配列を持つポリヌクレオチドによりコード化されるかあるいは前記ポリヌクレオチドとのハイブリッド形成等により相補的なＲＮＡと、最低９０％同一、好ましくは最低９５％同一、最も好ましくは最低９８％同一、そして特にまったく同一の（自然発生接合変異体および対立遺伝子を含む、処理されたあるいは処理されない）ＲＮＡをコード化する場合に、本発明の遺伝子は、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９の配列を持つポリヌクレオチドと“一致”する。加えて、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９から選択された配列と最低９０％同一、好ましくは前記配列と最低約９５％同一、より好ましくは前記配列と最低約９８％同一、そして最も好ましくは前記配列より成る配列を含む遺伝子は、これらの遺伝子と一致する遺伝子であるとして、本発明の全てのプロセスによって明確に意図される。加えて、任意のこれらの配列と同じタンパク質をコード化する配列はまた、前記配列の同一性パーセントにもかかわらず、任意のあるいは全ての前記配列に依存する本発明の任意の方法によって、それらがどのように別に開示されあるいは限定されるかにかかわらず、明確に意図される。したがって、任意の前記配列は、本発明に従って開示された任意の方法の実施における使用に利用できる。前記配列はまた、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９の任意の配列中に存在する、ここに開示されたような任意の読み取り枠を含む。
【００４７】
さらに本発明にしたがって、“同一性パーセント”あるいは“同一性パーセントの”という用語は、配列に関して用いられる場合には、配列が、比較される配列（“比較配列”）と開示あるいは請求された配列（“参照配列”）とのアライメントの後に、請求あるいは開示された配列と比較されることを意味する。その後同一性パーセントは以下の公式にしたがって測定される：
同一性パーセント＝１００［１−（Ｃ／Ｒ）］
ここでＣは、参照配列と比較配列との間のアライメントの全長にわたる参照配列と比較配列との間の差異の数であり、ここで（ｉ）比較配列中に一致するアライメントされた塩基あるいはアミノ酸のない参照配列中の各塩基およびアミノ酸および（ｉｉ）参照配列中の各ギャップおよび（ｉｉｉ）比較配列中のアライメントされた塩基あるいはアミノ酸と異なる参照配列中のアライメントされた各塩基あるいはアミノ酸は差異を構成し、Ｒは、参照配列中に構成されたギャップも塩基あるいはアミノ酸として数に入れた、比較配列とのアライメントの全長の参照配列中の塩基あるいはアミノ酸の数である。
【００４８】
アライメントが比較配列と参照配列との間に存在し、それに対する上記のように計算された同一性パーセントが規定の最小同一性パーセントと同等あるいはそれ以上である場合には、たとえアライメントが、上記の算出された同一性パーセントが規定の同一性パーセント以下である場合に存在したとしても、比較配列は参照配列に対して規定の最小同一性パーセントを持つ。
【００４９】
別に注記がある場合を除いて、ここで用いられるときに、全ての用語は以下のように定義される。
【００５０】
本発明にしたがって、“ＤＮＡ分節”あるいは“ＤＮＡ配列”という用語は、個別の断片の形態あるいはより大きいＤＮＡ構成体の構成要素としてのＤＮＡポリマーを示し、最低一度実質的に精製された状態、すなわち汚染内因性物質の無い状態で、および例えばクローニングベクターの使用等の標準生化学方法によって、分節およびその構成ヌクレオチド配列の同定、取り扱いおよび回収を可能にする量あるいは濃度で単離されたＤＮＡから得られる。前記分節は、通常真核生物遺伝子中に存在する内側非翻訳配列、すなわちイントロンから成る連続した読み取り枠の状態で提供される。非翻訳ＤＮＡの配列は読み取り枠の下流に存在し、ここで同じものはコード化領域の取り扱いあるいは発現を妨げない。
【００５１】
“コード化領域”という用語は、その自然ゲノム環境において遺伝子の発現産物を自然あるいは正常にコード化する遺伝子の部分、すなわちｉｎ ｖｉｖｏで遺伝子の自然発現産物をコード化する領域を示す。コード化領域は、正常、突然変異あるいは変換遺伝子から得ることができ、あるいはさらにＤＮＡ配列、またはＤＮＡ合成の分野における通常の知識を有する者によく知られた方法を用いて研究室内で完全に合成された遺伝子から得ることもできる。
【００５２】
本発明にしたがって、“ヌクレオチド配列”という用語は、デオキシリボヌクレオチドのヘテロポリマーを示す。通常、本発明によって提供されるタンパク質をコード化するＤＮＡ分節は、微生物あるいはウイルスオペロンから得られた調節因子より成る組み換え型転写ユニット中で発現することが可能な合成遺伝子を提供するために、ｃＤＮＡ断片および短オリゴヌクレオチドリンカーから、あるいは一連のオリゴヌクレオチドから組み立てられる。
【００５３】
“発現産物”という用語は、遺伝子および、遺伝暗号縮重の結果として生じる同等物をコード化し、したがって同じアミノ酸をコード化する任意の核酸配列の自然翻訳産物であるポリペプチドあるいはタンパク質を意味する。
【００５４】
“活性断片”という用語は、コード化配列に関して用いられる場合には、その発現産物が完全コード化領域の発現産物と同じ生物学的機能あるいは活性を本質的に保有する完全コード化領域以下の領域より成る部分を意味する。
【００５５】
“プライマー”という用語は、ＤＮＡの１つのストランドと組み合わさり、ＤＮＡポリメラーゼがデオキシリボヌクレオチド鎖の合成を開始するフリーの３′−ＯＨ末端を提供する短核酸配列を意味する。
【００５６】
“プロモーター”という用語は、転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼの結合に関するＤＮＡの領域を意味する。“エンハンサー”という用語は、存在し活性化している場合に、発現している異なるＤＮＡ配列の発現を増加させ、それにより前記の異なるＤＮＡ配列から形成される発現産物の量を増加させる効力を持つＤＮＡの領域を示す。
【００５７】
“読み取り枠（ＯＲＦ）”という用語は、終始コドンを除くアミノ酸をコード化する一連のトリプレットを意味し、（潜在的に）タンパク質に翻訳可能な配列である。
【００５８】
ここで用いられるときに、ＤＮＡ配列への言及は単鎖および２本鎖ＤＮＡの両方を含む。したがって特定の配列は、他の指示がある場合を除いて、前記配列の単鎖ＤＮＡ、相補鎖を伴う前記配列の２本鎖（２本鎖ＤＮＡ）および前記配列の相補鎖を示す。
【００５９】
本発明はまた、本発明にしたがった遺伝子配列の発現の調節に基づく潜在的な抗腫瘍物質を分析する方法および、ここに開示された遺伝子配列および前記遺伝子の共通発現あるいは調節に基づく関連遺伝子配列の発現傾向の結果を受けて、ガンあるいは潜在的なガン状態を診断するための方法に関する。
【００６０】
前記分析の実施において、相対抗腫瘍性活性は、特定の化学物質がガン細胞中に存在する遺伝子の発現を調節する程度によって確定することができる。したがって、ガン状態に関連する遺伝子（すなわちここに開示され、ガン細胞中に存在する本発明の配列の一つを含む遺伝子）の発現を、本発明の分析により試験される第２の化学物質より大きい程度で調節する第一の化学物質は、それにより前記第２の化学物質よりも高い、あるいはより望ましい、もしくはより有益な抗腫瘍性活性を持つと思われる。
【００６１】
測定される遺伝子発現は通常、指標としてのＲＮＡ発現を用いて分析される。したがって、検出されるＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）のレベルが大きいほど、対応する遺伝子の発現レベルは高くなる。したがって、絶対的あるいは相対的な遺伝子発現は、前記遺伝子によってコード化されるＲＮＡｓの相対発現によって測定される。
【００６２】
ＲＮＡは、カオトロピック剤（例えばトリアゾール）を含むフェノール溶液を用いた溶解および変性、続くイソプロパノール沈殿、エタノール洗浄および水溶液中での再懸濁；あるいは溶解および変性、続くＱｉａｇｅｎ樹脂等の固体支持材上での単離および水溶液中での再構成；もしくは非フェノール水溶液中での溶解および変性、続くＲＮＡのＤＮＡ鋳型複製への酵素変換を含む種々の方法で、サンプルから単離することができる。
【００６３】
通常、本発明のプロセスの適用に先立って、ここに開示された遺伝子および遺伝子群に対する安定状態ＲＮＡ発現レベルが得られる。前記発現の安定状態レベルは、ここで測定されたように潜在的な抗腫瘍性物質により影響をうける。前記の発現の安定状態レベルは、感度が高く特異的で正確な任意の方法により容易に測定される。前記方法は、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア等の任意の複数の市販ソフトウェアパッケージを使用するように設計された遺伝子特異的プライマープローブ結合を伴うＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ７７００配列検出システムを用いたリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、フィルター、床あるいはマイクロチップを基礎としたアレイを含む、定量のための適切な内部制御を用いた固体支持材を基礎としたハイブリダイゼーションアレイ技術、例えば化学発光、蛍光あるいは電気化学反応に基づいた検出システムを用いた固体支持材を基礎としたハイブリダイゼーションアレイを含むが、決してこれらに限定されない。
【００６４】
ガン状態の指標となる遺伝子傾向は、ガンであると認められる全ての細胞に特有のものである必要はない。したがって、ここに開示された方法は、全ての細胞が完全な傾向を示しているわけではない組織内のガン状態の存在の検出に有益である。したがって、例えば配列番号：１の配列と一致する配列より成る、一連の選択された遺伝子は、適切なプローブＤＮＡあるいはＲＮＡを用いて、腫瘍あるいは悪性組織のサンプルから得られた細胞の６０％程度にしか存在せず、一方対応する非ガンあるいはその他の正常組織から得られた細胞の６０％程度に不在である（したがって前記正常組織細胞の４０％程度には存在する）ことが見出され得る。好ましい実施例において、前記遺伝子傾向は、ここに開示された肺ガン等のガン組織から得られた細胞の最低５０％中に存在することが見出される。追加の実施例において、前記遺伝子傾向は、ガン組織から得られた細胞の最低１００％中に存在し、対応する正常非ガン組織サンプルの最低１００％に不在であることが見出される。しかしながら後者の実施例はめったに無いことである。
【００６５】
別の見地において、本発明は試験細胞のガン状態を確定するためのプロセスに関し、前記プロセスは、ここに開示された遺伝子配列の前記試験細胞中での発現を測定し、その後前記発現と、ガンでないことが分かっている最低一つの細胞中の最低一つの前記遺伝子の発現とを比較し、それにより前記発現の差異が、前記細胞がガンであることを示唆することより成る。
【００６６】
一つの実施例において、前記発現の変化は、複製数の増加あるいは減少を含む複製数の変化である。本発明にしたがって、前記遺伝子複製数の変化は、前記遺伝子配列によりコード化されるメッセンジャーＲＮＡの発現の変化を測定することにより確定することができる。
【００６７】
遺伝子複製数の変化は、特定の遺伝子配列によりコード化されるメッセンジャーＲＮＡの発現の変化を測定することにより確定することができ、特に前記遺伝子複製数の変化は、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９の配列によりコード化されるメッセンジャーＲＮＡの発現の変化を測定することにより確定することができる。また本発明にしたがって、前記遺伝子は、ガン開始遺伝子、ガン促進遺伝子あるいはガン抑制遺伝子であり得る。本発明の方法の実施において、ガン促進遺伝子は、腫瘍形成あるいは増殖を直接開始あるいは抑制せず、その発現産物の作用を介する等によりガン状態の進行を方向付け、増進しあるいは促進するように働き、腫瘍形成およびまたは増殖を減少させる効果を持つ遺伝子あるいは遺伝子発現産物に対して働く遺伝子を含む。
【００６８】
配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９の配列と一致する遺伝子の発現の存在あるいは不在は、特定細胞のガン状態の指標となり得るが、単なる前記遺伝子の存在あるいは不在は、単独では悪性状態を把握するに十分ではなく、したがって、前記遺伝子傾向の発現のレベルはまた、ガン状態の獲得を確定するために重要な要素であり得る。したがって、遺伝子の傾向はガンおよび非ガン細胞の両方に存在し得るが、発現のレベルは、ここに開示され、その全てがこの分野においてよく知られている任意の方法により測定された場合には、非ガン細胞とガン細胞との間で異なり得る。したがって、培養もしくはｉｎ ｓｉｔｕの特定細胞、細胞のグループ、あるいは組織のガン状態の存在を診断する別の方法として、実質的に類似する配列および前記配列より成る配列を含む、ここに開示された遺伝子の発現のレベルを測定することはまた不可欠となる。
【００６９】
ここに開示されたポリペプチド、すなわち配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９の配列によりコード化される任意のポリペプチドと同一あるいは類似の配列を持つポリペプチド等、すなわちそのアミノ酸配列が配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０の配列であるポリペプチド等の発現のレベルはまた、遺伝子発現の指標である。
【００７０】
前記にしたがって、本発明はさらに、試験される細胞のガン状態を確定するためのプロセスに関し、ここで前記プロセスは、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９の配列と実質的に同一の配列あるいはその特徴的な断片もしくは任意の前記配列の補足物を含む配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９の配列から選択されたヌクレオチド配列の一つを含む最低一つの遺伝子の前記細胞中での発現のレベルを測定し、その後前記発現をガンでないことが分かっている細胞の発現と比較し、それにより前記発現の差異が、前記の試験される細胞がガンであることを示唆することより成る。
【００７１】
本発明にしたがって、その一部として配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９の配列の一つを含む遺伝子の遺伝子発現は、好ましくは前記ヌクレオチド配列の断片であるプローブの使用により測定されるが、プローブが前記遺伝子の異なる部分から形成され得ることは理解されるべきである。前記遺伝子の発現は、ここに開示された特異的なヌクレオチド配列以外の遺伝子の部分から転写されたメッセンジャーＲＮＡとハイブリッド形成するヌクレオチドプローブの使用により測定され得る。
【００７２】
遺伝子がガンプロセスに関連すると判断される種々の異なる状況があることは注意すべきである。したがって、いくつかの遺伝子はガン遺伝子であり、ガンプロセスに直接関連するタンパク質をコード化し、それにより動物中のガンの発現を促進する。加えて、その他の遺伝子は特定の細胞あるいは細胞型におけるガン状態を抑制するために働き、それにより動物中のガン状態形成に逆らって働き得る。その他の遺伝子は単にガンプロセスあるいは状態に直接あるいは間接的に関連し、ガン状態に関して補助的な能力で働き得る。前記の遺伝子の型の全ては、ここに開示された発明にしたがって確定されると思われる。したがって、本発明の前記プロセスによって確定された遺伝子は、ガン遺伝子であり、あるいは前記プロセスによって確定された遺伝子は、ガン促進遺伝子であり得る。後者は、ガン状態の促進あるいはガン増殖の進行の促進もしくはガン細胞の増殖の調節に関して、ｉｎ ｖｉｖｏあるいはｅｘ ｖｉｖｏでガンプロセスに直接あるいは間接的に影響を与える遺伝子を含む。加えて、前記プロセスにより確定された遺伝子は、ガン抑制遺伝子であり得る。前記遺伝子はガン状態の発現あるいは進行を抑制するために直接あるいは間接的に働く。前記遺伝子は間接的に働き得る。ここでその発現は、ガン状態の進行の開始あるいは促進に直接的に関連する複数のその他の遺伝子あるいは遺伝子発現産物の活性を変える。例えば、野生型あるいは突然変異型のポリペプチドをコード化し、前記ポリペプチドがガン抑制遺伝子あるいはその発現産物の抑制に働く遺伝子は、それにより腫瘍増殖を促進するために間接的に働く。
【００７３】
前記にしたがって、本発明のプロセスは、ｉｎ ｖｉｖｏあるいはｅｘ ｖｉｖｏで腫瘍増殖の開始、抑制あるいは促進を含むガンプロセスに影響を与える、それ自体がポリペプチドあるいは小化学物質であるガン調節因子を含む。前記ガン調節因子は、遺伝子発現を増加させる効力を持ち得る。あるいは前記ガン調節因子は遺伝子発現を減少させる効力を持ち得る。前記関係はここに開示されている。
【００７４】
ここでの開示に沿って、本発明はまたガンを処置するためのプロセスに関し、前記プロセスは、ガン細胞を、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９の配列等のここに開示された遺伝子配列によりコード化された発現産物に対する活性を持つ因子に接触させることより成る。
【００７５】
ガン細胞中での発現あるいは増加した発現に起因した、ここに開示された遺伝子によってコード化されたタンパク質は、例えば細胞傷害性因子に結合する抗体等の親和性構造体を用いる“標的治療”用の非常に有益な治療用標的に相当する。前記方法論において、前記細胞表面分子に対する内因性リガンドあるいは結合相手について何も知っている必要がないことは、有利な点である。むしろ、細胞死あるいは細胞周期の遮断を引き起こすことができる複数の因子と結合する（人口ペプチド、代替リガンドその他同種のものを含むことができる）細胞表面分子を特異的に認識することができる抗体あるいは相当分子は、これらのタンパク質に対して治療上の期待を与える。したがって前記方法は、細胞内タンパク質に対するいわゆる自殺“弾丸”の使用を含む。
【００７６】
分子生物学の方法および組み換え技術の出現により、現在では組み換え手段によって抗体分子を産生し、それにより抗体のポリペプチド構造中に見られる特異的なアミノ酸配列をコード化する遺伝子配列を生み出すことが可能である。前記抗体は、前記抗体のポリペプチド鎖をコード化する遺伝子配列をクローニングすることにより産生することができ、あるいは特異的エピトープおよび抗原決定基に対する親和性を持つ活性化四量体（Ｈ２Ｌ２）構造を形成するための、合成された鎖のｉｎ ｖｉｔｒｏでの組立を伴う、前記ポリペプチド鎖の直接合成により産生することができる。これは、異なる種および源由来の中和抗体に特有の配列を持つ抗体の迅速な産生を可能にする。
【００７７】
抗体の源、あるいは抗体が組み換えにより構成され、もしくは生物反応器中で、研究室あるいは企業規模の大細胞培養を用い、ウシ、ヤギおよびヒツジ等の遺伝子組み換え動物を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏあるいはｉｎ ｖｉｖｏで抗体が合成され、もしくはプロセスのどの段階にも生体を用いない直接化学合成により抗体が合成されるかに関係なく、全ての抗体は類似の全体３次元構造を持つ。この構造はしばしばＨ２Ｌ２のように提示され、抗体が通常２つの軽（Ｌ）アミノ酸鎖と２つの重（Ｈ）アミノ酸鎖より成ることを示す。両鎖は構造上相補的な抗原標的と相互作用できる領域を持つ。標的と相互作用する前記領域は、“可変”あるいは“Ｖ”領域のように示され、抗原特異性の異なる抗体とアミノ酸配列が異なることを特徴とする。
【００７８】
ＨあるいはＬ鎖の可変領域は、抗原標的と特異的に結合することができるアミノ酸配列を包含する。これらの配列内には、特異性の異なる抗体間での極端な可変性のために“超可変”と呼ばれる短い配列がある。前記超可変領域はまた、“相補性決定領域”あるいは“ＣＤＲ”領域のように示される。これらのＣＤＲ領域は、特定の抗原決定構造に対する抗体の基本的な特異性の原因となる。
【００７９】
ＣＤＲｓは可変領域内のアミノ酸の不連続の配列であるが、種に関係なく、可変重鎖および軽鎖領域内のこれらの重要なアミノ酸配列の配置位置は、可変鎖のアミノ酸配列内の同様の位置をとると思われる。全ての抗体の可変重鎖および軽鎖は、軽（Ｌ）鎖および重（Ｈ）鎖それぞれについて（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３と称される）その他のものと不連続である、それぞれ３つのＣＤＲ領域を持つ。対応するＣＤＲ領域はＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６０９−６６１６（１９７７）により開示されている。番号の付いた図式は図中に提示され、ここでＣＤＲｓは下線を引かれ、番号はＫａｂａｔの図式に従う。
【００８０】
全ての哺乳類種において、抗体ポリペプチドは定常（すなわち高度に保存された）および可変領域を含有し、後者の内部に、ＣＤＲｓおよびＣＤＲｓの外側の重鎖あるいは軽鎖の可変領域内のアミノ酸配列で構成されているいわゆる“枠組み構造領域”がある。
【００８１】
本発明にしたがって開示された抗体はまた完全に合成することができる。ここで抗体のポリペプチド鎖は合成され、レセプターとしてここに開示されたポリペプチドと結合するように最適化され得る。前記抗体は、キメラあるいはヒト化抗体であり得る。また前記抗体は完全四量体構造であるかあるいは二量体であり、単鎖重鎖および単鎖軽鎖のみから成り得る。前記抗体はまた、レセプターとしてここに開示された任意のポリペプチドと反応し、結合することができる、ＦａｂおよびＦ（ａｂ２）′断片等の断片を含み得る。
【００８２】
一見地において、本発明は、ここに開示されたアミノ酸配列を持つポリペプチド、好ましくは配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０の一つのアミノ酸配列を持つポリペプチドと反応する、特にここで前記ポリペプチドに特異的である、ここに開示された免疫グロブリンあるいは抗体に関する。前記抗体は通常組成物、特に薬学的組成物の形態であり得る。
【００８３】
ここで有益な薬学的組成物はまた、任意の適切な希釈剤あるいは賦形剤を含む薬学的許容担体を含み、前記薬学的許容担体は、それ自体は組成物を受容する個体に有害な抗体の産生を引き起こさない任意の薬学的因子を含み、また過度の毒性を伴わずに投与され得る。薬学的許容担体は、鼻およびその他の気道送達用のあるいは眼のシステムへの送達用の噴霧の形成に有益な担体を含む、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールおよびその他同種のものを含むがこれらに限定されない。薬学的許容担体、希釈剤およびその他の賦形剤の詳細な議論は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．ｃｕｒｒｅｎｔ ｅｄｉｔｉｏｎ）に示される。
【００８４】
本発明のプロセスは、上記の列挙されたプロセスの実施例を含み、ここでガン細胞はｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏで接触させられ、好ましくはここで前記因子は、前記発現産物に対する親和性を持つ、全体分子構造の部分あるいは一部より成る。一つの前記実施例において、前記発現産物に対する親和性を持つ前記部分は抗体であり、特にここで前記発現産物はポリペプチドあるいはオリゴペプチドであり、もしくはオリゴペプチドの一部より成り、あるいはポリペプチドより成る。
【００８５】
したがって前記因子は、親和性部分および抗ガン活性部分の両方より成る単分子構造であり得る。ここで前記部分は、分離されたときに前記活性を保有する別個の分子あるいは分子構造から得られ、またここで前記因子は、前記部分が付加体の形態中に組み込まれるように、前記部分を一つのより大きい分子構造中に組み込むことにより形成される。前記抗ガン部分および親和性部分は、単ポリペプチドあるいはポリペプチド様構造等の形状で共有結合し、あるいは化学分野においてよく知られた方法によって形成された構造で、疎水的相互作用あるいは静電的相互作用等により非共有結合し得る。あるいは、抗ガン部分および親和性部分は、同じ化学構造の一部として一つ以上の活性を示す一つの分子の別個のドメインから形成され得る。ここで活性の一つはガン細胞あるいは腫瘍形成もしくは腫瘍増殖に対するものであり、その他の活性はガンプロセスあるいはガン状態に関連する遺伝子の発現により産生された発現産物に対する親和性である。
【００８６】
本発明の一つの実施例において、タンパク質あるいはその他のポリペプチド等の化学因子は、ガンプロセスに関連する遺伝子、特に本発明にしたがってここに開示された遺伝子によりコード化されたポリペプチドあるいはタンパク質等のガン細胞の発現産物に対する親和性を持つ抗体等の因子と結合する。したがって、ここで前記発現産物の存在は腫瘍発現およびまたは増殖に不可欠であり、前記発現産物への前記因子の結合は、前記腫瘍促進活性を打ち消す効果を持つ。一つの前記実施例において前記因子は、細胞自殺を引き起こし、それによりガン細胞を殺し、腫瘍増殖を中止させるアポトーシス誘導因子である。
【００８７】
ここに開示された遺伝子と同様の方法で調節され、したがってその発現が化合物に応じた調製において変化するガン細胞内のその他の遺伝子は、通常の代謝経路、情報伝達系、生理的あるいは機能的経路内に位置する遺伝子に相当し、したがって前記の共通して調節される遺伝子のグループ（本発明にしたがって開示された遺伝子あるいは類似配列を含むグループ）を分析し、同定することにより、（ａ）特定の経路に対して既知遺伝子および新規遺伝子を指定し、（ｂ）その機能が既に特定されあるいは開示された遺伝子を持つ経路に分類された新規遺伝子の特異的な機能および機能的役割を同定することができる。例えば、１０個の遺伝子のグループを同定し、その内の最低一つはここに開示された遺伝子であり、調製された方法で発現を変化し、ここに開示された配列によりコード化されたポリペプチド等の一つの機能が既知である場合には、その後それによりその他の遺伝子は同様の機能あるいは経路で関連付けられ、したがってガン発現あるいはガン促進プロセスにおいて役割を果たし得る。同様に、遺伝子が正常細胞中で発見されるがガン細胞中で発見されないか、あるいはガン細胞に対し正常細胞中により高いレベルで発現する場合には、その結果、ガンあるいはその他の疾患との関係に関しては同様の結論が出され得る。したがって、本発明にしたがって開示されたプロセスは、遺伝子に機能を与える新規方法、すなわち機能的ゲノム科学の新規方法、および特定の細胞系に対する潜在的な治療効果を持つ化合物を同定するための方法を速やかに提供する。ガン以外の種々の疾患が、影響を受ける特定の細胞系に関連することが知られているあるいは示されている場合に、前記化合物は、前記疾患に対して治療上の関連性を持ち得る。
【００８８】
ここに開示されたポリペプチド、好ましくは配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０のポリペプチドはまた、ワクチンとしての使用を示し、ここでポリペプチドはガン細胞上に存在する表面タンパク質に相当し、前記ポリペプチドは、動物、特にヒト中のガン細胞に特異的であり、前記ガン細胞を溶解するように働く細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）を活性化する目的で前記動物に投与され得る。ワクチンとして用いられる場合に、前記ポリペプチドは薬学的組成物の状態で存在する。本発明はまた、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０のポリペプチドと同じあるいは同様の免疫原性特性を持つポリペプチドを用い、それによりガンを患う危険性のある動物あるいはガンに苦しむ動物等の動物に投与した後、同じあるいは同様の免疫原性応答を引き出すことができる。したがって、本発明にしたがって開示されたポリペプチドは、通常免疫原性組成物としての使用を示す。
【００８９】
本発明はまた、産物を産生するための方法より成るプロセスに関し、前記プロセスは、因子（すなわちここに開示された分析法にしたがって同定された治療因子）を同定するための開示されたプロセスの一つにしたがって前記因子を同定することより成る。ここで前記産物は、前記同定プロセスあるいは分析の結果として前記因子に関して集められた情報であり、またここで前記情報は前記因子の化学的特性およびまたは構造およびまたは属性を伝達するために十分である。例えば本発明は特に、本発明の分析の実施者が望ましい酵素調節活性を持つ化合物を選別する分析を用い、化合物を同定し、その後本発明にしたがって因子を複製し、治療あるいは研究目的でそれを投与するために情報を利用する他の実施者に情報（すなわち構造、投与量その他に関する情報）を伝達する状況を意図する。例えば、分析の実施者（実施者１）は化合物の構造あるいは特性を知らずに（例えばここで多数のコード番号が用いられ、最初の実施者はただ前記のコード番号を付されたサンプルを与えられる）多数の試験化合物を選別し、選別プロセスの実施、一つあるいはそれ以上の本発明の分析プロセスの使用の後に、その後第２の実施者（実施者２）に口頭あるいは書面もしくは同様の方法で特定の調節活性を持つ化合物を同定するに十分な情報（例えば対応する結果を伴うコード番号）を伝えることができる。この実施者１から実施者２への情報の伝達は、本発明によって特に意図される。
【００９０】
ここに開示された発明の方法において有益な遺伝子は、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７あるいは１９の配列を持つポリヌクレオチドと一致する遺伝子であり、悪性ガンにおいて過剰に発現する遺伝子に相当する。例えばそれは肺に対する配列番号：１と一致する遺伝子であり、後者は正常肺組織と比較して肺ガンサンプル中で最低３倍多く発現する。加えて任意の特定のサンプルにおいて、全てのガン細胞がこの遺伝子を発現するわけではなく、十分な数の前記細胞中でのその十分な発現は、ガンあるいは潜在的なガン状態の決定を保証するのに十分である。
【００９１】
したがって、本発明にしたがって開示されたポリヌクレオチド配列は、正常組織サンプルに比べてガン中に発現し、あるいは正常組織に比べてガン中により高いレベルで発現し得る。さらに、正常組織中での前記ポリヌクレオチドあるいは遺伝子、配列発現は、ガンにかかりやすい家系である個人と関連があり得る。
【００９２】
前記遺伝子配列は、ガン発現あるいはガン細胞増殖／生存等のガン進行に直接の役割を果たし得る。例えば、ここに開示された一つあるいはそれ以上の配列と同じポリペプチドをコード化する一つあるいはそれ以上の遺伝子は、酵素あるいはその他の細胞機能を阻害する小分子、例えばキナーゼ阻害剤のスクリーニングおよび発見のための、新規の個々の遺伝子標的に相当する。前記分子はガンに対する有益な治療物質である。加えて、ガン中のこれらの遺伝子の発現を下向き調節する小有機分子等の小分子あるいは因子は、有益な抗ガン治療物質である。正常組織中での前記遺伝子の発現は、肺ガンの発症の傾向を示し得る。コード化されたポリペプチドは、細胞溶解性抗体、あるいは細胞傷害性もしくは細胞溶解性因子と結合する抗体等の治療用分子に対して潜在的に有益な細胞表面標的であり得る。
【００９３】
ここに開示された本発明の方法の実施において、特定の緩衝液、培地、試薬、細胞、培養条件およびその他同種のものについての言及は、限定することを意図するものではなく、この分野における通常の知識を有する者が、議論が提起された特定の状況において、関連するあるいは価値があると認識する全ての関連物質を含むように読まれるべきであることは注意すべきである。例えば、一つの緩衝システムあるいは培養培地を他のものに換え、同一でなくとも同様の結果を得ることがしばしば可能である。この分野における通常の知識を有する者は、必要以上の試験がなくとも、前記置き換えをし、ここに開示された方法および手段の使用において目的を最適に果たすことができるように、前記システムおよび方法論の十分な知識を持つ。
【００９４】
本発明はここで、以下の限定されない実施例を通してさらに開示される。実施例の開示の適用において、本発明にしたがって開示された方法のその他のおよび異なる実施例は、関連する分野における通常の知識を有する者に前記実施例を示すであろうことは、はっきりと意図されるべきである。以下の実施例は、潜在的な抗腫瘍物質が一つあるいはそれ以上のここに開示された遺伝子を用いて同定され得る方法を示す。
【００９５】
【発明の実施の形態】
（実施例）
ＳＷ４８０細胞を、２ｍＭのＬ−グルタミン（９０％）および１０％ウシ胎仔血清を添加したＬｅｉｂｏｖｉｔｚ′ｓ Ｌ−１５培地中で、１０５個細胞／ｃｍ２の濃度まで増殖させる。細胞は、３７℃で２から５分間、０．０２％トリプシン、０．０２％ＥＤＴＡで処理された後回収される。トリプシン処理された細胞はその後３０ｍｌの増殖培地で希釈され、９６ウェルプレート中にウェルあたり５０，０００個の細胞濃度（２００μｌ／ウェル）で播種される。次の日、細胞は、合成緩衝液のみあるいは試験される化学物質を含有する合成緩衝液で、２４時間処理される。その後培地は除去され、細胞は溶解され、ＲＮＡはＱｉａｇｅｎから購入したＲＮＡｅａｓｙ試薬およびプロトコルを用いて回収される。ＲＮＡは定量され、１μｌ中１０ｎｇのサンプルは、１×ＰＣＲ緩衝液、ＲＮＡｓｉｎ、逆転写酵素、ヌクレオシド３リン酸、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ、Ｔｗｅｅｎ２０、グリセロール、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および特異的ＰＣＲプライマーと参照遺伝子（１８Ｓ ＲＮＡ）に対するプローブおよび試験遺伝子（遺伝子Ｘ）を含有する２４μｌのＴａｑｍａｎ反応混合に添加される。その後逆転写は、４８℃で３０分間実施される。その後サンプルにＰｅｒｌｉｎ Ｅｌｍｅｒ ７７００配列検出器が用いられ、サンプルは９５℃で１０分間熱変性される。増幅は、６０℃で１５秒間のアニーリング、続く７２℃で６０秒間の伸長および９５℃で３０秒間の変性という設定を用いて、４０サイクルまで実施された。その後データファイルは保存され、データは適切なベースラインウィンドウズ（Ｒ）と閾値を用いて分析される。
【００９６】
その後標的と参照遺伝子間の量的差異は算出され、相対発現値は用いられたサンプルの全てについて測定される。その後この方法は、ここに開示された遺伝子と機能的に関連するその他の遺伝子に対して繰り返され、機能あるいは発現のレベルが示される。一対の遺伝子それぞれに対する相対発現割合は測定される（すなわち発現の割合は、発現が測定されるその他の遺伝子のそれぞれに対する各標的遺伝子について測定され、ここで、各遺伝子の絶対発現は、選別される各化合物あるいは化学因子に対する参照遺伝子に相対して測定される）。その後サンプルは記録され、コントロールに対する処理されたサンプルの発現の変化の程度にしたがって評価される。他の化学因子に対して一つの化学因子によって調節された、コントロールに対する特定の遺伝子の発現全体はまた、確定される。特定の遺伝子あるいは一組の遺伝子に対して最も大きい効力を持つ化学因子は、最も抗腫瘍性を持つと考えられる。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
No. 60 / 239,294 filed on Oct. 11, 2000, and US Provisional Patent Application No. 60 / 239,297 filed on Oct. 11, 2000, filed on Oct. 11, 2000. U.S. Provisional Patent Application No. 60 / 239,605 filed, U.S. Provisional Patent Application No. 60/239802, filed October 12, 2000, U.S. Provisional Patent Application No. 60/239, filed October 12, 2000. No. 239805, U.S. Provisional Patent Application No. 60/239806, filed Oct. 12, 2000, U.S. Provisional Patent Application No. 60 / 240,622, filed Oct. 16, 2000, Oct. 19, 2000. U.S. Provisional Patent Application No. 60 / 241,682 filed, U.S. Provisional Patent Application filed October 19, 2000 Issue No. 60/241723, claims the priority of which was filed United States Provisional Patent Application No. 60/244932 on October 31, 2000, the disclosure of which is incorporated herein by reference in as a whole.
[0002]
The present invention relates to a method for screening for cancer-related genes and expression products involved in the process of cancer expression and promotion, and the use of said genes for screening potential anticancer substances including small organic compounds and other molecules. .
[0003]
BACKGROUND OF THE INVENTION
A cancer-related gene is one in which the gene is expressed in cancer cells but not in non-cancer cells, or the gene is over-expressed in cancer cells relative to normal or non-cancer cells, or at a high level. It is advantageous in that it indicates a genetic difference between cancer cells and normal cells, such as expression. In addition, expression of the gene in normal cells, not occurring in cancer cells, especially of the same type of tissue, can indicate important functions in the cancer process. For example, screening assays for new drugs are based on the response of a model cell-based system in vitro to treatment with a particular compound. Various measures of cellular response, including the release of cytokines, conversion of cell surface labels, activation of certain enzymes and conversion of ionic flux and / or pH have been utilized. Part of the selection depends on specific genes, such as oncogenes (or gene mutations). In accordance with the present invention, cancer-related genes have been identified and their deduced amino acid sequences determined. The genes are particularly useful in diagnosing cancer, screening for anti-cancer substances and treating cancer with the substances, in particular, these genes can serve as labels, such as cell surface labels, whereby antibodies, preferably antibodies, Advantageously, it encodes a polypeptide that provides a suitable label for anti-tumor agents such as antibodies that are conjugated to cytotoxic factors, including apoptotic factors.
[0004]
BRIEF SUMMARY OF THE INVENTION
In accordance with the present invention there is now provided a series of cancer-related genes or genes involved in cancer expression and promotion processes and their expressed amino acid sequences.
[0005]
In certain embodiments, the gene corresponds to SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 and 19, and SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, Encode a polypeptide comprising a polypeptide consisting of the sequences 14, 16, 18 and 20.
[0006]
More particularly, the gene has an altered expression in cancer cells as compared to a non-cancerous cell from a particular tissue, such as lung, wherein the gene has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or Includes a polynucleotide having a substantially identical sequence and / or a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a sequence identical thereto that encodes a different polypeptide by conservative amino acid substitutions.
[0007]
It is another object of the present invention to provide a method of using said specific gene for the analysis of the potential of a selected chemical to up or down regulate the expression of a cancer specific or related gene. That is.
[0008]
A further object of the present invention is to provide a method for determining the cancer or non-cancerous state (ie, potential cancer state) of a selected cell when grown in culture or maintained in situ, as described above. It is an object of the present invention to provide a method for detecting the expression or non-expression of a portion, or the amount of expression.
[0009]
It is a still further object of the present invention to provide a method for treating a cancer condition with a selected chemical, as judged by its ability to modulate (ie, increase or decrease) a specific gene or its protein product. It is to be.
[0010]
The present invention also relates to a process for treating cancer, comprising contacting a cancer cell with a substance having an activity on an expression product encoded by the gene, wherein said process is ex vivo or in vivo. May be implemented. Also said product is disclosed herein. The substance may consist of an antibody or other molecule or moiety specific for the expression product. In a preferred embodiment, the polypeptide product of the gene is a polypeptide as disclosed herein, such as SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 and 20.
[0011]
DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention relates to cancer-associated genes (SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, and 19) and expressed amino acid sequences (targets for chemotherapeutic agents, particularly anticancer agents). SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, and 20).
[0012]
Unique gene sequence whose expression or non-expression or expression level is indicative of cancer or non-cancer state of a specific cell, and whose expression is changed in cancer cells compared to non-cancer cells obtained from a specific tissue Comprises a nucleotide sequence disclosed herein, or a sequence substantially identical, at least about 90% identical, preferably 95% identical, most preferably at least about 98% identical to said sequence, in particular wherein said gene is , SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, and 19. For the following results, the sequences were searched within the GenBank database.
[0013]
The present invention relates to nucleotide sequences and expressed polypeptides having the following characteristics.
[0014]
One nucleotide sequence is Genebank accession numbers: NM_014109 and AA235448, corresponding to the amplified bromodomain-containing protein in cancer, identified by the following specific features: UniGene cluster: Hs. 46677; Locus Link Number: None; Sequence Information: 1934 bp mRNA (cDNA is SEQ ID NO: 1), 1086 bp ORF and 362 amino acids (SEQ ID NO: 2); Location on chromosome: 8q24 (based on sequence relative to decoded human genome sequence) ). The information deposited showed predictions of the coding sequence deduced from cDNA clones of unknown function. In accordance with the present invention, this message increased at least 3-fold in lung cancer relative to normal lung tissue. A search of the Prosite database reveals a domain with 100% similarity to the bromodomain 2 sequence, which domain is included in many transcription factors. The major role of bromodomain proteins in maintaining normal growth is indicated by the effect of multiple bromodomain proteins on cancer, with four of them identified at metastatic breakpoints.
[0015]
A new gene was identified based on the EST sequence present in dbEST. This novel gene represents a novel member of the Toll-like receptor family, and a portion of the polypeptide expressed therefrom has a sequence at least 39% identical to human toll-like receptor 1. Five of the human Toll-like receptors, termed TLRs1-5, are direct homologs of the corresponding fly molecules and may constitute a key component of human innate immunity. Expression analysis indicates that this gene is specifically expressed by B lymphocytes. Features include: Gene bank accession number for sample ESTs in the cluster: AA648488; UniGene cluster: Hs. 89206; Locus Link No .: 10330; Cluster Name: ESTs, slightly similar TLR6 [H. Sapiens]; Sequence information: encoded polypeptide 1274 bp mRNA having cDNA SEQ ID NO: 4 (cDNA is SEQ ID NO: 3). The Unigene cluster consists of 10 sequences, all obtained from the tonsils. Microarray expression analysis shows specific expression in B lymphocytes.
[0016]
One nucleotide sequence is Genebank Accession Number: AB015563 and has the following specific features: Genebank Accession Number: AB015563; UniGene Cluster: Hs. 8752; Locus Link No .: 10330; Cluster name: transmembrane protein 4; Sequence information: 814 bp mRNA (cDNA is SEQ ID NO: 5 having encoding polypeptide of SEQ ID NO: 6) and position on chromosome: 12 The UniGene cluster consists of 22 or more sequences obtained from multiple tissues. Maximal expression in normal tissues was detected in skeletal muscle.
[0017]
One nucleotide sequence is Genebank accession number: NM_014397, AB026289 and has the following specific features: UniGene cluster: Hs. 9625; Locus Link No .: 27073; Public Cluster Name: SID6-1512, Putative Serine-Threonine Protein Kinase; Sequence Information: 1597 bp mRNA (SEQ ID NO: 7), 921 bp ORF and 307 amino acids (and SEQ ID NO: 8) and on chromosome Position: 9q33. From the Genebank record, the complete mRNA and protein sequence is obtained. SID6-1512 shares a similar sequence with mouse NEK1, a kinase involved in cell cycle regulation. The UniGene cluster contains more than 150 EST sequences from various tissue sources. Maximum BLAST scores are obtained with the protein kinase nek1, which includes an N-terminal protein kinase domain that is approximately 42% identical to the catalytic domain of NIMA, a protein kinase that controls the initiation of cell division in Aspergillus nidulans. In addition, both Nek1 and NIMA have long basic C-terminal extensions, so that the overall structure is similar.
[0018]
One nucleotide sequence is Genebank Accession Number: NM_006035, AF128625, with the following specific features: UniGene cluster: Hs. 12908; Locus Link No .: 9578; Cluster name: CDC42 binding protein kinase beta (DMPK-like; MRCKbeta); Sequence information: 6780 bp mRNA (SEQ ID NO: 9), 5136 bp ORF and 1711 amino acids (SEQ ID NO: 10) and chromosome Top position: 14q32.3. The UniGene cluster contained more than 215 EST sequences from various tissue sources. The p21 GTPase, Rho and Cdc42 regulate many cell functions by binding to parts of the serine / threonine protein kinase subfamily. These functions include cytoskeletal remodeling that is characteristic of cell proliferation and differentiation. Two of these p21 GTPase-regulated kinases, myotonic dystrophy protein kinase-related Cdc42 binding kinases (MRCK alpha and beta), are components of the non-muscle myosin light chain, which is a requirement for activation of actin-myosin contractility. Indicated for phosphorylation. A BLAST search showed a portion of SEQ ID NO: 10 that was approximately 49% identical to human myotonic dystrophy kinase.
[0019]
One nucleotide sequence is Genebank Accession Number: NM_002654, which has the following specific features: UniGene cluster: Hs. Locus Link No .: 5315; Cluster name: pyruvate kinase, muscle; Sequence information: 2287 bp mRNA (SEQ ID NO: 11 with expressed amino acid sequence of SEQ ID NO: 12) and position on chromosome: 15q22. This gene is one of the small subfamilies of the cdk family of protein kinases. PCTAIRE-3 appears to play a role in signaling in terminally differentiated cells. Although the cloning of the human and mouse PCTAIRE-3 genes has been disclosed, no other information is available from the scientific literature. The UniGene cluster consists of 64 sequences from multiple tissues. PCTAIRE-3 was expressed in colonic adenocarcinoma tested and at low or no expression in normal colon tissue samples tested.
[0020]
One nucleotide sequence is Genebank Accession Number: NM_006293 and has the following specific features: UniGene cluster: Hs. Locus Link No .: 7301; Cluster name: TYRO3 protein tyrosine kinase; Sequence information: 4364 bp mRNA (SEQ ID NO: 13 with expressed amino acid sequence of SEQ ID NO: 14) and position on chromosome: 15q15.1-q21.1 . The UniGene cluster consists of more than 45 sequences from multiple tissues. The highest levels of expression in normal tissues were detected in the brain. SEQ ID NO: 14 shows considerable homology to various receptor tyrosine kinases. For example, a portion of SEQ ID NO: 14 is at least about 43% identical to AXL receptor tyrosine kinase. Overexpression of axl cDNA in NIH3T3 cells results in malignant transformation with the concomitant appearance of a 140 kD axl tyrosine phosphorylated protein.
[0021]
One nucleotide sequence is Genebank Accession Number: NM_002969 and has the following specific features: UniGene cluster: Hs. Locus Link No .: 6300; Cluster Name: Mitogen Activated Protein Kinase 12; Sequence Information: 1457 bp mRNA (SEQ ID NO: 15 with Expressed Amino Acid Sequence of SEQ ID NO: 16) and Location on Chromosome: 22q13.33. The UniGene cluster consists of 22 or more sequences obtained from multiple tissues. The highest levels of expression in normal tissues were detected in skeletal muscle. This sequence shows considerable homology to various mitogen-activated protein kinases such as, for example, human mitogen-activated protein kinase p38delta. p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) plays a critical role in stress and inflammatory responses and is involved in activating human immunodeficiency virus gene expression.
[0022]
One nucleotide sequence is GeneBank Accession Number: W31344 and has the following specific features: UniGene cluster: Hs. 55444; Locus Link number: unknown; cluster name: ESTs; location on chromosome: unknown. The UniGene cluster consists of nine or more sequences, all of which are obtained from the parathyroid gland. The Genebank database shows an exact match for AF153819 (Homo sapiens inward rectifier potassium channel Kir2.1). This match is completely restricted to the 3 'untranslated region of the Genebank entry. The translation products of the thyrocalcin and Kir2.1 genes are identical. However, we cannot formally rule out the possibility that tyrocalcin is a completely different gene sharing some splicing with Kir2.1. SEQ ID NO: 17 shows the nucleotide sequence for Kir2.1, SEQ ID NO: 21 shows the EST cluster identified by expression analysis, specific for thyroid adenocarcinoma. The amino acid sequence obtained from SEQ ID NO: 17 is shown as SEQ ID NO: 18. The sequences of the EST cluster show no apparent homology to known proteins. However, if the EST cluster is simply the 3 'untranslated region of Kir2.1, this gene is an inward rectifier potassium channel.
[0023]
One nucleotide sequence is Genebank Accession Number: AA133334, which corresponds to the Sox2-like HMG-box oncogenic expression sequence and has the following specific features: UniGene cluster: Hs. 129911; Locus Link Number: None; Sequence Information: 1050 bp mRNA (bp = base pairs, SEQ ID NO: 19), 264 bp ORF and 88 amino acids (SEQ ID NO: 20) and location on chromosome: unknown. SEQ ID NO: 19 is represented as EST (Expressed Sequence Tag) in the Gene Logic database. SEQ ID NO: 19 is extended to 1050 bp by overlap contig in the public database. The unigene cluster showed widespread expression and the message was found to be up-regulated at least 3-fold in lung cancer relative to normal lung tissue. This sequence shows significant homology to the sheep SOX-2 gene and to a lesser extent to the mouse SOX-2 gene. The Sox gene family consists of a number of early-expressed genes related through the occupation of a 79 amino acid DNA binding domain known as the HMG box. These genes are transcription factors that may be involved in regulating gene expression.
[0024]
The polypeptide used as the nucleotide and gene product used in the process of the present invention comprises a recombinant polynucleotide or polypeptide, a normal polynucleotide or polypeptide, or a synthetic polynucleotide or polypeptide, preferably a recombinant polynucleotide or polypeptide. Is a polypeptide.
[0025]
The polynucleotides and polypeptide fragments disclosed herein may also be useful in practicing the processes of the present invention. For example, fragments, derivatives or analogs of the polypeptides (SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 and 20) may have (i) one or more of the amino acid residues Conserved or non-conserved amino acid residues (preferably conserved amino acid residues), wherein the substituted amino acid residues are or are not encoded by the genetic code, or (ii) one of the amino acid residues Or more than one containing a substituent group, or (iii) the mature polypeptide is soluble in another compound, such as a compound for extending the half-life of the polypeptide (eg, polyethylene glycol), or (iv). Additional amino acids are leader or secretory sequences or sequences involved in purifying the mature polypeptide or proprotein sequence Of may be one that is fused to the mature polypeptide. Such fragments, derivatives and analogs are believed to be within the purview of those of ordinary skill in the art from the teachings herein.
[0026]
In one aspect, the present invention relates to an isolated polynucleotide comprising a polynucleotide at least 65% identical to the polynucleotide of SEQ ID NO: 3, or a complement thereof. In a preferred embodiment, the isolated polynucleotide is at least 80%, preferably at least about 90%, most preferably at least about 95%, and especially at least about 98% identical to the sequence of SEQ ID NO: 3. And most particularly is identical to the sequence of SEQ ID NO: 3. An isolated polynucleotide of the present invention may also include any of the foregoing supplements.
[0027]
In another aspect, the invention relates to an isolated polypeptide, including a purified polypeptide, consisting of an amino acid sequence at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. In a preferred embodiment, the isolated polypeptide comprises an amino acid sequence having at least 95%, preferably at least about 98%, identical to the sequence of SEQ ID NO: 4, particularly the sequence of SEQ ID NO: 4. Identical. The present invention also includes an isolated active fragment of the polypeptide, wherein the fragment retains the biological activity of the polypeptide, or wherein the active fragment is used to treat, prevent or diagnose cancer. As a specific target for
[0028]
Polynucleotides and polypeptides useful in practicing the processes of the present invention may also be obtained in isolated or purified form. In addition, the polypeptides disclosed herein to benefit the practice of the processes of the present invention include proteins of different types in terms of function, and thus, as listed herein, some of them are enzymatic. Yes, some are transcription factors and others may be cell surface receptors. Thus, the way in which the cancer-associated protein is used in the process of the present invention may vary significantly depending on the function and cellular localization of the protein. Accordingly, modifications or optimizations of the methods disclosed herein may be desirable in light of the above differences. For example, cell surface receptors are excellent targets for cytotoxic antibodies, while transcription factors or enzymes are valuable targets for small organic compounds with antineoplastic activity.
[0029]
As used herein, the term "isolated" means that the substance is removed from its original environment (eg, in the case of natural occurrence, the natural environment). It can also be produced recombinantly and subsequently purified. For example, a naturally occurring polynucleotide or polypeptide present in a living animal is not isolated, but the same polynucleotide or polypeptide isolated from some or all of the co-existing substances in the natural class is isolated. The polynucleotide, eg, recombinantly prepared, can be part of a vector. And or the polynucleotide or polypeptide may be part of a construct. Further, if the vector or construct is not part of its natural environment, it can be isolated. In one embodiment of the present invention, the isolated or purified polypeptide is useful in generating an antibody for the practice of the present invention, or wherein the antibody is cytotoxic, such as an apoptotic factor or the like. Attach to cytolytic factor.
[0030]
As is known in the art, "similarity" between two polypeptides is determined by comparing the amino acid sequence of a first polypeptide and conservative amino acid substitutions thereof with the sequence of a second polypeptide. Is done.
[0031]
The sequence information disclosed herein obtained from the gene bank deposit can be readily utilized by those of ordinary skill in the art to prepare the corresponding full-length polypeptide by peptide synthesis. The same applies to the polynucleotide or polypeptide disclosed herein for use in the method of the present invention.
[0032]
As used herein, the terms "portion,""segment," and "fragment," when used in reference to a polypeptide, refer to a contiguous sequence of residues, such as amino acid residues, wherein the sequence is larger. Form a subset of the array. For example, if the polypeptide has been treated with any common endopeptidase such as trypsin or chymotrypsin, the resulting oligopeptide will correspond to a portion, segment or fragment of the original polypeptide. I do. When used in reference to a polynucleotide, the term refers to the product produced by treatment of the polynucleotide with any common endonuclease.
[0033]
The present invention further provides a vector comprising any of the polynucleotides disclosed herein and a polypeptide comprising said vector or said polynucleotide or disclosed herein, especially the amino acid sequence of which is SEQ ID NO: 2, 4, 6 , 8, 10, 12, 14, 16, 16, 18 and 20.
[0034]
Methods for producing such cells and vectors are well known to those of ordinary skill in the field of molecular biology. See, for example, Sambrook, et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NJ. Y. , (1989), Wu et al, Methods in Gene Biotechnology (CRC Press, New York, NY, 1997), and Recombinant Gene Expression Protocols, in Methods Medicine. 62, (Tuan, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 1997). The disclosure is incorporated herein by reference.
[0035]
In another aspect, the present invention provides
(A) converting the compound to a gene corresponding to a polynucleotide having a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, and 19; Contact under promoting conditions,
(B) detecting a difference in expression of the gene as compared to when the compound was absent,
A process for identifying a factor that modulates the activity of a cancer-related gene, comprising identifying a factor that modulates the activity of a cancer-related gene.
[0036]
In a specific embodiment of the present invention, the gene useful for the present invention is a polynucleotide having a sequence selected from SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, and 19. It can consist of the matching gene or can consist of the sequence of any of the polynucleotides disclosed herein (the latter being the cDNA sequence). As used herein, a “matching (corresponding) gene” is a nucleotide sequence disclosed herein (ie, SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, and 19). A gene encoding an RNA that is at least 90% identical, preferably at least 95% identical, most preferably at least 98% identical, and especially identical to the RNA encoded by one of the above. The gene may also encode any of the sequences disclosed herein, preferably the same polypeptide sequence as SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, and 20, It may include differences from the amino acid sequence. Here, the differences are limited to conservative amino acid substitutions, where the same overall three-dimensional structure is maintained, thus maintaining the same antigenic characteristics. Accordingly, the amino acid sequences are within the scope of the present invention, wherein said amino acid sequences correspond to SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, and 20 disclosed herein. Reacts with the same antibody that reacts with the polypeptide consisting of the sequence.
[0037]
As used herein, the term "conservative amino acid substitution" is defined herein as a substitution of one of the following five groups:
I. Small, aliphatic, nonpolar or slightly polar residues:
Ala, Ser, Thr, Pro, Gly;
II. Polar, negatively charged residues and their amides:
Asp, Asn, Glu, Gln;
III. Polar, positively charged residues:
His, Arg, Lys;
IV. Large, aliphatic, non-polar residues:
Met, Leu, Ile, Val, Cys
V. Large, aromatic residues:
Phe, Tyr, Trp
In accordance with the present invention, model cell systems using cell lines, primary cells or tissue samples can be stored in growth media and treated with a single concentration or a range of concentrations of the compound. At a specific time after treatment, cellular RNAs are isolated from the treated cells, primary cells or tumors, and the RNAs exhibit expression of a selected gene. The cellular RNA is then split and subjected to analysis to detect the presence and / or amount of a specific RNA transcript. The transcript can then be amplified for detection purposes using standard methods such as, for example, reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) and the like. The presence or absence or level of specific RNA transcripts is determined from their measurements and metrics obtained for the mode and extent of the sample's response to the treated compound as compared to a normal sample.
[0038]
In accordance with the foregoing, a process for using a cancer-associated gene sequence (SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, and 19) is disclosed herein, comprising expressing the cancer-associated gene sequence. Can be associated or used or can be used to characterize the cancerous or non-cancer state of the cell or tissue being tested as a result of the method of the invention. Thus, the process of the present invention identifies novel antineoplastic agents based on altered expression of a polynucleotide sequence disclosed herein in a specific model system. Thus, the method of the present invention may be used with primary samples obtained from tumors stored in vitro in various cell lines or in appropriate culture conditions for various periods of time or in an appropriate animal model. Can be.
[0039]
More particularly, genes that are expressed at different levels in cancer cells than in non-cancer cells were identified. In one example, the identified gene is expressed at higher levels in cancer cells than in normal cells.
[0040]
Polynucleotides of the invention can include a fully acting gene with associated regulatory or regulatory sequences, or simply a polynucleotide sequence encoding a matching polypeptide or an active fragment or analog thereof.
[0041]
In one embodiment of the invention, the gene regulation is a down regulation, so that one or more genes of the cancer cells were not exposed to the substance as a result of exposure to the chemical to be tested. It is expressed at lower levels (or not at all) when exposed to the substance as compared to the case expression. For example, the gene encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 2 is expressed at higher levels in lung cancer cells than in normal lung cells.
[0042]
In a preferred embodiment, the selected set of said genes is expressed in a reference cell containing the gene sequence identified for use according to the invention, but as a result of exposure of the tested cell to a chemical. It is not expressed in the cells tested as a result. Thus, here the chemical causes a lower level of expression of the gene in the cell tested than in the reference cell. This indicates a down regulation and also indicates that the tested chemical has antineoplastic activity.
[0043]
Sequences encoding the same protein as any of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 and 20 also provide for any of the present invention, despite the percent identity of said sequences. Are specifically intended, regardless of how they are separately disclosed or limited. Accordingly, any of the above sequences may be utilized for use in performing any of the methods disclosed in accordance with the present invention. The sequence also includes any open reading frame as defined herein, occurring within the sequence of SEQ ID NO: 1.
[0044]
Genes identified according to the present disclosure, when the term "cancer-associated" is used herein, are considered "cancer-associated" genes and compared to the expression of these genes in normal (ie, non-cancer) cells. And include genes that are expressed at higher levels in cancer cells (eg, due to increased expression rates, increased expression levels, or increased copy numbers). Here, the cancer state of the test cell or tissue is determined by a method known in the art, such as the reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) disclosed in the Examples below. In a specific example, this relates to a gene whose sequence matches the sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 and 19. As used herein, the term "matching" refers to a gene having the indicated nucleotide sequence or substantially the same RNA as the gene encoded by the indicated sequence. Means to code. The term “substantially”, as defined herein, means at least about 90% identical and includes insertional variants thereof.
[0045]
The sequences disclosed herein are essentially genomic sequences, and thus correspond to the sequences of a de facto gene, such as a human gene, or are cDNA sequences obtained from messenger RNA (mRNA) and, therefore, the corresponding sequences. Corresponds to contiguous exon sequences obtained from the genomic sequence, or they can be completely synthesized to practice the invention. Due to possible processes during the conversion of the initial RNA transcript to the final mRNA, the sequences disclosed herein may correspond to sequences shorter than the entire genomic sequence. They may also indicate sequences obtained from ribosomes and transfer RNAs. As a result, the sequences disclosed herein, which are genes and predominantly cDNA sequences present in cells (and corresponding to genomic sequences), may be identical or the cDNA may comprise a sequence shorter than the full-length genomic sequence. . The gene and cDNA sequences are further considered to be identical sequences because they both encode similar RNA sequences. Thus, by way of non-limiting example, a gene encoding an RNA transcript that is later processed into shorter mRNAs would encode both of the RNAs, and thus (using the usual Watson-Crick complementation rules) Encodes an RNA that is complementary to the cDNA (eg, the sequences disclosed herein), or is otherwise encoded by the cDNA. Thus, the sequences disclosed herein are consistent with the genes contained in cancer or normal cells used to determine relative expression. This is because the sequence is the same or complementary to the RNAs encoded by the gene. The genes also include different alleles and conjugation variants that can occur in cells used in the processes of the present invention.
[0046]
The gene is at least 90% identical, preferably at least 95% identical, and most preferably at least 98% identical to an RNA encoded by a polynucleotide having the indicated sequence or complementary to the RNA, such as by hybridization with said polynucleotide. The genes of the present invention, when encoding RNAs that are% identical, and particularly identical (either treated or untreated, including naturally occurring conjugation mutants and alleles), have SEQ ID NOs: 1, 3, 5, "Matches" with a polynucleotide having the sequence of 7, 9, 11, 13, 15, 17 and 19. In addition, at least 90% identical to a sequence selected from SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 and 19, preferably at least about 95% identical to said sequence, more preferably Genes containing sequences that are at least about 98% identical to the sequences, and most preferably consist of the sequences, are expressly contemplated by all processes of the invention as being genes that are consistent with these genes. In addition, sequences that encode the same protein as any of these sequences may also be modified by any of the methods of the invention that rely on any or all of the sequences, despite the percent identity of the sequences. Regardless of how they are separately disclosed or limited, they are expressly intended. Thus, any of the above sequences may be utilized for use in performing any of the methods disclosed in accordance with the present invention. The sequence also includes any open reading frame as disclosed herein, which is present in any of the sequences of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, and 19.
[0047]
Further in accordance with the present invention, the terms "percent identity" or "percent identity" when used in reference to a sequence refer to the sequence to which the sequence is compared or compared to the sequence to be compared ("comparison sequence"). ("Reference sequence") after comparison to the claimed or disclosed sequence. The percent identity is then determined according to the following formula:
Percent identity = 100 [1- (C / R)]
Where C is the number of differences between the reference and comparison sequences over the entire length of the alignment between the reference and comparison sequences, where (i) the aligned bases or amino acids that match in the comparison sequence Each base and amino acid in the reference sequence without the difference and (ii) each gap in the reference sequence and (iii) each aligned base or amino acid in the reference sequence that is different from the aligned base or amino acid in the comparison sequence Where R is the number of bases or amino acids in the reference sequence that is the full length of the alignment with the comparison sequence, including any gaps formed in the reference sequence as bases or amino acids.
[0048]
If an alignment exists between the comparison sequence and the reference sequence and the percent identity calculated above as described above is equal to or greater than the specified minimum percent identity, Even if the calculated percent identity is less than or equal to the specified percent identity, the comparison sequence has the specified minimum percent identity to the reference sequence.
[0049]
Except where otherwise noted, all terms as used herein are defined as follows.
[0050]
According to the present invention, the term "DNA segment" or "DNA sequence" refers to a DNA polymer in the form of discrete fragments or as a component of a larger DNA construct, and has been substantially purified at least once, Obtained from isolated DNA in the absence of contaminating endogens and in amounts or concentrations that allow identification, handling and recovery of the segment and its constituent nucleotide sequences by standard biochemical methods, for example, using cloning vectors. Can be The segments are provided in a continuous open reading frame consisting of inner untranslated sequences, usually introns, which are present in eukaryotic genes. The sequence of the untranslated DNA is downstream of the open reading frame, where the same does not interfere with the handling or expression of the coding region.
[0051]
The term "coding region" refers to that portion of a gene that naturally or normally encodes the gene's expression product in its natural genomic environment, ie, the region that encodes the gene's natural expression product in vivo. The coding region may be obtained from a normal, mutated or converted gene, or may be completely synthesized in a laboratory using methods well known to those of ordinary skill in the art of DNA sequencing or DNA synthesis. It can also be obtained from a given gene.
[0052]
According to the present invention, the term "nucleotide sequence" refers to a heteropolymer of deoxyribonucleotides. Usually, the DNA segment encoding the protein provided by the present invention is a cDNA segment to provide a synthetic gene that can be expressed in a recombinant transcription unit consisting of a regulatory element obtained from a microorganism or viral operon. Assembled from fragments and short oligonucleotide linkers or from a series of oligonucleotides.
[0053]
The term “expression product” refers to a polypeptide or protein that encodes a gene and its equivalent as a result of the genetic code degeneracy, and is therefore a natural translation of any nucleic acid sequence that encodes the same amino acid.
[0054]
The term "active fragment", when used in reference to a coding sequence, refers to a region below the full coding region whose expression product essentially retains the same biological function or activity as the expression product of the full coding region. Means a part consisting of
[0055]
The term "primer" refers to a short nucleic acid sequence that, in combination with one strand of DNA, provides a free 3'-OH terminus at which DNA polymerase initiates synthesis of a deoxyribonucleotide chain.
[0056]
The term "promoter" refers to a region of DNA that is involved in binding RNA polymerase to initiate transcription. The term "enhancer", when present and activating, has the effect of increasing the expression of a different DNA sequence being expressed, thereby increasing the amount of expression product formed from said different DNA sequence. The region of DNA is shown.
[0057]
The term "open reading frame" (ORF) refers to a series of triplets that encode amino acids excluding the stop codon and is (potentially) a sequence translatable into protein.
[0058]
As used herein, references to DNA sequences include both single-stranded and double-stranded DNA. Thus, a particular sequence, unless otherwise indicated, indicates a single-stranded DNA of the sequence, a double-stranded (double-stranded DNA) of the sequence with a complementary strand, and a complementary strand of the sequence, unless otherwise indicated.
[0059]
The present invention also provides a method for analyzing potential anti-tumor agents based on the regulation of the expression of a gene sequence according to the invention, and the gene sequences disclosed herein and related gene sequences based on the common expression or regulation of said genes The present invention relates to a method for diagnosing a cancer or a potential cancer condition based on the result of the tendency of the expression.
[0060]
In performing the assays, the relative anti-tumor activity can be determined by the degree to which a particular chemical modulates the expression of a gene present in cancer cells. Thus, the expression of a gene associated with a cancer condition (ie, a gene disclosed herein and comprising one of the sequences of the present invention present in a cancer cell) is determined by a second chemical tested by the assay of the present invention. A first chemical that modulates to a greater degree would thereby have a higher, more desirable, or more beneficial anti-tumor activity than the second chemical.
[0061]
The measured gene expression is usually analyzed using RNA expression as an indicator. Therefore, the higher the level of detected RNA (messenger RNA), the higher the expression level of the corresponding gene. Thus, absolute or relative gene expression is measured by the relative expression of RNAs encoded by the gene.
[0062]
RNA is dissolved and denatured using a phenol solution containing a chaotropic agent (eg, triazole), followed by isopropanol precipitation, ethanol washing and resuspension in aqueous solution; or dissolution and denaturation, followed by solid support such as Qiagen resin. Can be isolated from a sample in a variety of ways, including isolation and reconstitution in aqueous solution; or dissolution and denaturation in non-phenol aqueous solutions, followed by enzymatic conversion of RNA to DNA template replication.
[0063]
Typically, prior to application of the process of the present invention, steady state RNA expression levels for the genes and genes disclosed herein will be obtained. The steady state level of expression is affected by potential antineoplastic agents as measured herein. The steady state level of expression is readily measured by any method that is sensitive, specific and accurate. The method includes, for example, real-time quantitative polymerase chain reaction (PCR) using a Perkin-Elmer 7700 sequence detection system with gene-specific primer-probe binding designed to use any of a number of commercially available software packages, such as Primer Express software. ), Based on solid support-based hybridization arrays with appropriate internal controls for quantification, including filters, beds or microchip-based arrays, for example based on chemiluminescence, fluorescence or electrochemical reactions Including but not limited to hybridization arrays based on solid supports using detection systems.
[0064]
Genetic trends that are indicative of cancer status need not be unique to all cells that are recognized as having cancer. Thus, the methods disclosed herein are useful for detecting the presence of a cancer condition in tissue where not all cells show a complete trend. Thus, for example, a series of selected genes, consisting of a sequence corresponding to the sequence of SEQ ID NO: 1, can represent as much as 60% of cells obtained from tumor or malignant tissue samples using appropriate probe DNA or RNA. But can be found to be absent in as much as 60% of the cells obtained from the corresponding non-cancerous or other normal tissue (and therefore present in as much as 40% of the normal tissue cells). In a preferred embodiment, the genetic predisposition is found to be present in at least 50% of cells obtained from cancer tissue such as the lung cancers disclosed herein. In further or additional embodiments, the genetic propensity is found to be present in at least 100% of cells obtained from the cancer tissue and absent in at least 100% of the corresponding normal non-cancerous tissue sample. However, the latter embodiment is rare.
[0065]
In another aspect, the present invention relates to a process for determining the cancer status of a test cell, comprising measuring the expression of a gene sequence disclosed herein in the test cell, and then determining the expression Comparing the expression of at least one of said genes in at least one cell known not to be, whereby said difference in expression is indicative of said cell being cancerous.
[0066]
In one embodiment, the change in expression is a change in copy number, including an increase or decrease in copy number. According to the present invention, the change in the number of gene copies can be determined by measuring a change in the expression of the messenger RNA encoded by the gene sequence.
[0067]
A change in the number of gene copies can be determined by measuring a change in the expression of a messenger RNA encoded by a specific gene sequence. In particular, the change in the number of gene copies is determined by SEQ ID NO: 1, 3, 5, , 7, 9, 11, 13, 15, 17, and 19 can be determined by measuring changes in the expression of the messenger RNA encoded by the sequences. Also according to the present invention, said gene may be a cancer initiation gene, a cancer promoting gene or a cancer suppressor gene. In practicing the methods of the present invention, a cancer promoting gene does not directly initiate or suppress tumorigenesis or growth, but rather acts to direct, enhance or promote the progression of a cancer state, such as through the action of its expression product. , Genes that have the effect of reducing tumor formation and / or proliferation or genes that act on gene expression products.
[0068]
The presence or absence of expression of a gene that matches the sequence of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, and 19 can be an indicator of the cancer state of a specific cell. Is not alone sufficient to detect a malignant condition, and therefore, the level of expression of said genetic propensity may also be an important factor in determining the acquisition of a cancer condition. Thus, while genetic trends can be present in both cancerous and non-cancer cells, the level of expression is determined by the methods disclosed herein, all of which are measured by any method well known in the art. May differ between non-cancer cells and cancer cells. Thus, as another method of diagnosing the presence of a cancerous condition in a particular cell, group of cells, or tissue in culture or in situ, the genes disclosed herein, including substantially similar sequences and sequences consisting of said sequences, Measuring the level of expression of is also essential.
[0069]
Has a sequence identical or similar to any of the polypeptides disclosed herein, ie, any of the polypeptides encoded by the sequences of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, and 19; The level of expression of a polypeptide, such as a polypeptide whose amino acid sequence is the sequence of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, and 20, is also an indicator of gene expression. is there.
[0070]
In accordance with the foregoing, the present invention further relates to a process for determining the cancer status of a cell to be tested, wherein said process comprises SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, And SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 and 19 comprising substantially the same sequence or a characteristic fragment thereof or a complement of any of the above sequences. Measuring the level of expression in the cell of at least one gene comprising one of the nucleotide sequences selected from the sequence, and then comparing the expression to the expression of a cell known not to be cancerous, The difference in expression consists of indicating that the cell being tested is a cancer.
[0071]
According to the present invention, the gene expression of a gene comprising one of the sequences SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 and 19 as part thereof, is preferably of the nucleotide sequence As measured by the use of probes that are fragments, it should be understood that probes can be formed from different parts of the gene. Expression of the gene can be measured by use of a nucleotide probe that hybridizes to messenger RNA transcribed from a portion of the gene other than the specific nucleotide sequences disclosed herein.
[0072]
It should be noted that there are a variety of different situations where genes are determined to be involved in the cancer process. Thus, some genes are oncogenes, which encode proteins directly involved in the cancer process, thereby promoting the expression of cancer in animals. In addition, other genes may act to suppress the cancer state in a particular cell or cell type, thereby acting against the formation of the cancer state in the animal. Other genes are directly or indirectly involved in the cancer process or condition and may act with auxiliary abilities with respect to the cancer condition. All of the above genotypes will be determined according to the invention disclosed herein. Thus, the gene defined by the process of the invention may be an oncogene, or the gene defined by the process may be a cancer promoting gene. The latter include genes that directly or indirectly affect cancer processes in vivo or ex vivo with respect to promoting cancer status or promoting cancer growth or regulating cancer cell growth. In addition, the gene identified by the process may be a cancer suppressor gene. The gene acts directly or indirectly to suppress the expression or progression of a cancer state. Said genes can work indirectly. Here, its expression alters the activity of several other genes or gene expression products that are directly involved in initiating or promoting the progression of a cancerous condition. For example, a gene that encodes a wild-type or mutant polypeptide, wherein the polypeptide acts to suppress a cancer suppressor gene or its expression product, thereby indirectly acting to promote tumor growth.
[0073]
In accordance with the foregoing, the processes of the present invention include cancer modulators, which are themselves polypeptides or small chemicals, that affect cancer processes, including initiating, suppressing or promoting tumor growth, in vivo or ex vivo. The cancer modulator may have the effect of increasing gene expression. Alternatively, the cancer modulator may have the effect of reducing gene expression. Said relationship is disclosed herein.
[0074]
In accordance with the disclosure herein, the present invention also relates to a process for treating cancer, the process comprising the steps of treating cancer cells with SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, and Contacting an agent having activity against the expression product encoded by the gene sequences disclosed herein, such as the 19 sequences.
[0075]
Proteins encoded by the genes disclosed herein, resulting from expression in cancer cells or increased expression, can be used for "targeted therapy" using, for example, affinity structures such as antibodies that bind to cytotoxic factors. Represents a very valuable therapeutic target. It is an advantage that in the methodology, it is not necessary to know anything about the endogenous ligand or binding partner for the cell surface molecule. Rather, antibodies that specifically recognize cell surface molecules that can bind to multiple factors that can cause cell death or block the cell cycle (including artificial peptides, alternative ligands, and the like) Considerable molecules offer therapeutic promise for these proteins. Thus, the method involves the use of so-called suicide "bullets" against intracellular proteins.
[0076]
With the advent of molecular biology methods and recombinant technologies, it is now possible to produce antibody molecules by recombinant means, thereby generating gene sequences that encode specific amino acid sequences found in the polypeptide structure of the antibody It is. The antibody can be produced by cloning the gene sequence encoding the polypeptide chain of the antibody, or it can be an activated tetramer (H) having affinity for a specific epitope and antigenic determinant. 2 L 2 )) Can be produced by direct synthesis of said polypeptide chain, with in vitro assembly of the synthesized chain to form a structure. This allows for the rapid production of antibodies with sequences unique to neutralizing antibodies from different species and sources.
[0077]
The source of the antibody, or the antibody is made up recombinantly, or in a bioreactor, using laboratory or enterprise scale large cell culture, using transgenic animals such as cows, goats and sheep, in vitro or in vivo. All antibodies have a similar overall three-dimensional structure, regardless of whether the antibody is synthesized at, or by direct chemical synthesis without using the organism at any stage of the process. This structure is often H 2 L 2 To indicate that the antibody usually consists of two light (L) amino acid chains and two heavy (H) amino acid chains. Both chains have regions that can interact with structurally complementary antigen targets. Said regions interacting with the target are designated as "variable" or "V" regions and are characterized by a different amino acid sequence from antibodies with different antigen specificities.
[0078]
The variable region of the H or L chain includes an amino acid sequence that can specifically bind to an antigen target. Within these sequences are short sequences called "hypervariable" due to extreme variability between antibodies of different specificities. The hypervariable region is also designated as a "complementarity determining region" or "CDR" region. These CDR regions are responsible for the basic specificity of the antibody for a particular antigenic determinant.
[0079]
CDRs are discontinuous sequences of amino acids in the variable region, but regardless of species, the location of these important amino acid sequences in the variable heavy and light chain regions is similar to that in the variable chain amino acid sequence. It seems to take position. The variable heavy and light chains of all antibodies are discontinuous with the other for the light (L) and heavy (H) chains, respectively (designated L1, L2, L3, H1, H2, H3). , Each having three CDR regions. The corresponding CDR regions are described in Kabat et al. Biol. Chem. 252: 6609-6616 (1977). The numbered schemes are presented in the figures, where the CDRs are underlined and the numbers follow the Kabat scheme.
[0080]
In all mammalian species, the antibody polypeptide contains constant (ie, highly conserved) and variable regions, and within the latter, the CDRs and amino acid sequences within the variable regions of the heavy or light chains outside the CDRs. There is a so-called “framework area” that is configured.
[0081]
The antibodies disclosed according to the invention can also be completely synthesized. Here, the polypeptide chains of the antibody can be synthesized and optimized to bind to the polypeptides disclosed herein as receptors. The antibodies can be chimeric or humanized antibodies. The antibody may be a complete tetramer structure or a dimer, and may be composed of only a single heavy chain and a single light chain. The antibody also reacts with and binds to any of the polypeptides disclosed herein as a receptor. 2 ) 'Fragments.
[0082]
In one aspect, the invention relates to a polypeptide having the amino acid sequence disclosed herein, preferably one of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 and 20. The present invention relates to an immunoglobulin or an antibody disclosed herein that reacts with a polypeptide having the same, and in particular, is specific for the polypeptide. The antibody may be in the form of a normal composition, especially a pharmaceutical composition.
[0083]
Pharmaceutical compositions useful herein also include a pharmaceutically acceptable carrier, including any suitable diluents or excipients, wherein the pharmaceutically acceptable carrier is an antibody that is itself harmful to the individual receiving the composition. And can be administered without undue toxicity. Pharmaceutically acceptable carriers include water, saline, glycerol and ethanol and the like, including carriers useful in the formation of a spray for nasal and other airway delivery or for delivery to an ophthalmic system. It is not limited to these. A detailed discussion of pharmaceutically acceptable carriers, diluents and other excipients is provided in REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., NJ current edition).
[0084]
The process of the present invention includes examples of the above-listed processes, wherein the cancer cells are contacted in vivo and ex vivo, preferably wherein the factor has an affinity for the expression product. Consists of parts or parts of the overall molecular structure. In one such embodiment, the portion having an affinity for the expression product is an antibody, particularly where the expression product is a polypeptide or oligopeptide, or consists of a portion of an oligopeptide, or Become.
[0085]
Thus, the factor may be a monomolecular structure consisting of both an affinity moiety and an anti-cancer active moiety. Wherein the moiety is obtained from a separate molecule or molecular structure that retains the activity when separated, and wherein the factor is such that the moiety is incorporated into an adduct form. It is formed by incorporation into one larger molecular structure. The anti-cancer portion and the affinity portion may be covalently bonded in the form of a single polypeptide or a polypeptide-like structure, or may be formed by a method well known in the chemical field, and may have hydrophobic interaction or electrostatic Non-covalent bonding may occur due to interaction or the like. Alternatively, the anti-cancer moiety and the affinity moiety can be formed from separate domains of one molecule that exhibit one or more activities as part of the same chemical structure. Here one of the activities is for cancer cells or tumorigenesis or tumor growth, and the other activity is the affinity for expression products produced by the expression of genes associated with the cancer process or condition.
[0086]
In one embodiment of the invention, the chemical agent, such as a protein or other polypeptide, is a gene associated with a cancer process, particularly a polypeptide or protein encoded by a gene disclosed herein in accordance with the invention. Binds to factors such as antibodies that have an affinity for cancer cell expression products. Thus, here the presence of the expression product is essential for tumor expression and / or growth, and the binding of the factor to the expression product has the effect of counteracting the tumor promoting activity. In one such embodiment, the factor is an apoptosis-inducing factor that causes cell suicide, thereby killing cancer cells and stopping tumor growth.
[0087]
Other genes in cancer cells that are regulated in a manner similar to the genes disclosed herein, and whose expression is altered in a compound-dependent manner, can be found in normal metabolic, signaling, physiological or functional pathways. (A) by analyzing and identifying the group of commonly regulated genes (groups containing the genes disclosed in accordance with the present invention or similar sequences) that correspond to genes located within (B) identifying the specific function and functional role of the novel gene whose function has already been identified or classified into the pathway having the disclosed gene. Can be. For example, a group of 10 genes was identified, at least one of which is a gene disclosed herein, which alters expression in a prepared manner and which is encoded by the sequences disclosed herein. If one function, such as a peptide, is known, then the other genes can then be associated with similar functions or pathways, and thus play a role in cancer expression or cancer promotion processes. Similarly, if a gene is found in normal cells but not in cancer cells, or is expressed at higher levels in cancer cells than in cancer cells, it may be associated with cancer or other diseases A similar conclusion can be made for Thus, the process disclosed in accordance with the present invention provides a novel method of conferring function on genes, a new method of functional genomics, and a method for identifying compounds with potential therapeutic effects on particular cell lines. Provide promptly. Where various diseases other than cancer are known or indicated to be associated with the particular cell line affected, the compounds may have a therapeutic relevance to the disease.
[0088]
The polypeptides disclosed herein, preferably those of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, and 20, also indicate use as vaccines, wherein the polypeptides are Corresponding to surface proteins present on cancer cells, the polypeptide is specific for cancer cells in animals, especially humans, and acts on cytotoxic T lymphocytes (CTLs) that act to lyse the cancer cells. It may be administered to the animal for activation purposes. When used as a vaccine, the polypeptide is present in a pharmaceutical composition. The invention also uses polypeptides having the same or similar immunogenic properties as the polypeptides of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 and 20, thereby reducing cancer. Following administration to an animal, such as an animal at risk for suffering or an animal suffering from cancer, the same or similar immunogenic response can be elicited. Thus, the polypeptides disclosed in accordance with the present invention usually indicate use as immunogenic compositions.
[0089]
The invention also relates to a process comprising a method for producing a product, the process comprising one of the disclosed processes for identifying an agent (ie, a therapeutic agent identified according to the assays disclosed herein). And identifying said factor according to Wherein the product is information gathered about the factor as a result of the identification process or analysis, wherein the information is sufficient to convey the chemical properties and / or structure and / or attributes of the factor . For example, the present invention specifically employs assays in which the practitioner of the present invention screens for compounds having the desired enzyme modulating activity, identifies the compound, and then replicates the factor in accordance with the present invention and converts it for therapeutic or research purposes. It is intended to convey information (ie, information regarding structure, dosage, etc.) to other practitioners that utilize the information for administration. For example, the practitioner of the analysis (Practitioner 1) may be unaware of the structure or properties of the compound (eg, where a number of code numbers are used, and the first practitioner may only be given a sample with said code number 3.) screening a large number of test compounds, performing the screening process, and using one or more of the analytical processes of the present invention, and then verbally or in writing or in a similar manner to a second practitioner (Practitioner 2). Sufficient information (eg, a code number with the corresponding result) can be conveyed to identify compounds with a particular modulating activity. This transmission of information from practitioner 1 to practitioner 2 is specifically contemplated by the present invention.
[0090]
Genes useful in the methods of the invention disclosed herein are those that correspond to a polynucleotide having the sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, or 19, It corresponds to a gene that is overexpressed in cancer. For example, it is a gene corresponding to SEQ ID NO: 1 for the lung, the latter being expressed at least three times more in lung cancer samples compared to normal lung tissue. In addition, in any particular sample, not all cancer cells will express this gene, and their full expression in a sufficient number of said cells will ensure the determination of a cancer or potential cancer state. Is enough.
[0091]
Thus, the polynucleotide sequences disclosed in accordance with the present invention may be expressed in cancer compared to normal tissue samples, or may be expressed at higher levels in cancer compared to normal tissues. Furthermore, the expression of the polynucleotide, gene, or sequence in normal tissues may be associated with individuals who are of a family susceptible to cancer.
[0092]
The gene sequence may play a direct role in cancer progression, such as cancer expression or cancer cell proliferation / survival. For example, one or more genes encoding the same polypeptide as one or more of the sequences disclosed herein can be used to screen enzymes or other small molecules that inhibit cellular function, such as kinase inhibitors. Represents new individual gene targets for discovery. Said molecules are valuable therapeutics against cancer. In addition, small molecules or factors, such as small organic molecules, that down regulate the expression of these genes in cancer are valuable anti-cancer therapeutics. Expression of the gene in normal tissues may indicate a propensity to develop lung cancer. The encoded polypeptide may be a potentially useful cell surface target for therapeutic molecules such as cytolytic antibodies or antibodies that bind to cytotoxic or cytolytic factors.
[0093]
In practicing the methods of the invention disclosed herein, references to particular buffers, media, reagents, cells, culture conditions and the like are not intended to be limiting and It should be noted that those with knowledge of the above should be read to include all relevant substances that they perceive as relevant or valuable in the particular situation in which the discussion is raised. For example, it is often possible to replace one buffer system or culture medium with another and obtain similar, if not identical, results. Those of ordinary skill in the art will be able to make such substitutions without undue testing and to optimally serve the purpose in using the methods and means disclosed herein. Have sufficient knowledge of
[0094]
The present invention will now be further disclosed through the following non-limiting examples. It is expressly intended that in applying the disclosure of the embodiments, other and different embodiments of the disclosed method according to the present invention will show said embodiments to those having ordinary knowledge in the relevant field. It should be. The following examples illustrate how potential anti-tumor agents can be identified using one or more of the genes disclosed herein.
[0095]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
(Example)
SW480 cells were cultured in Leibovitz's L-15 medium supplemented with 2 mM L-glutamine (90%) and 10% fetal calf serum. 5 Individual cells / cm 2 To a concentration of. Cells are harvested after treatment with 0.02% trypsin, 0.02% EDTA for 2-5 minutes at 37 ° C. The trypsinized cells are then diluted in 30 ml of growth medium and seeded in 96-well plates at a concentration of 50,000 cells per well (200 μl / well). The next day, cells are treated with synthetic buffer alone or synthetic buffer containing the chemical to be tested for 24 hours. The media is then removed, the cells are lysed, and the RNA is recovered using RNAeasy reagents and protocols purchased from Qiagen. RNA was quantified and 10 ng of sample in 1 μl was sampled with 1 × PCR buffer, RNAsin, reverse transcriptase, nucleoside triphosphate, AmpliTaq Gold, Tween 20, glycerol, bovine serum albumin (BSA) and specific PCR primers and reference gene Add to the 24 μl Taqman reaction mix containing the probe for (18S RNA) and the test gene (gene X). Thereafter, reverse transcription is performed at 48 ° C. for 30 minutes. The sample is then heat denatured at 95 ° C. for 10 minutes using a Perlin Elmer 7700 sequence detector. Amplification was performed for up to 40 cycles using a setting of 60 ° C. for 15 seconds annealing followed by 72 ° C. for 60 seconds extension and 95 ° C. for 30 seconds denaturation. The data file is then saved and the data is analyzed using the appropriate baseline Windows and threshold.
[0096]
Thereafter, the quantitative difference between the target and reference genes is calculated, and the relative expression values are measured for all of the samples used. The method is then repeated for other genes functionally related to the genes disclosed herein, indicating the level of function or expression. The relative expression ratio for each of the pair of genes is measured (ie, the expression ratio is measured for each target gene for each of the other genes whose expression is measured, where the absolute expression of each gene is selected. Measured relative to a reference gene for each compound or chemical agent). The sample is then recorded and evaluated according to the degree of change in expression of the treated sample relative to the control. The overall expression of a particular gene relative to a control, regulated by one chemical factor relative to other chemical factors, is also determined. Chemical agents that have the greatest potency for a particular gene or set of genes are considered to be the most antitumor.

Claims (32)

ガン関連遺伝子の活性を調節する因子を同定するための一つのプロセスであって、ここで前記プロセスが、
（ａ）化合物を配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９より成るグループから選択された配列を持つポリヌクレオチドと一致する遺伝子を含有する細胞に、前記遺伝子の発現を促進する条件下で接触させ；
（ｂ）前記化合物が存在しなかった場合と比較した前記遺伝子の発現の差異を検出し、
それによりガン関連遺伝子の活性を調節する因子を同定することより成ることを特徴とするプロセス。One process for identifying an agent that modulates the activity of a cancer-related gene, wherein the process comprises:
(A) adding the compound to a cell containing a gene that corresponds to a polynucleotide having a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, and 19; Contacting under conditions that promote gene expression;
(B) detecting a difference in expression of the gene as compared to when the compound was absent,
A process comprising identifying factors that modulate the activity of a cancer-related gene. 請求項１記載のプロセスであって、ここで前記遺伝子が配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９より成るグループから選択された配列を持つことを特徴とするプロセス。The process of claim 1, wherein the gene has a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, and 19. And the process. 請求項１記載のプロセスであって、ここで前記細胞がガン細胞であり、前記発現の差異が発現の減少であることを特徴とするプロセス。2. The process of claim 1, wherein the cells are cancer cells, and wherein the difference in expression is a decrease in expression. 請求項２記載のプロセスであって、ここで前記細胞がガン細胞であり、前記発現の差異が発現の減少であることを特徴とするプロセス。3. The process of claim 2, wherein said cells are cancer cells, and wherein said difference in expression is a decrease in expression. 抗腫瘍物質を同定するための一つのプロセスであって、ここで前記プロセスが、腫瘍性活性を示す細胞を、先に請求項１から４記載の一つのプロセスを用いてガン関連遺伝子調節因子であると同定された化合物に接触させ、前記接触がなかった場合と比較した、前記接触後の前記腫瘍性活性の減少を検出することより成ることを特徴とするプロセス。5. A process for identifying an anti-tumor agent, wherein said process is used to identify cells exhibiting neoplastic activity with a cancer-related gene modulator using one of the processes previously described in claims 1-4. Contacting a compound identified as being, and detecting a decrease in said neoplastic activity after said contact compared to the absence of said contact. 請求項５記載のプロセスであって、ここで前記腫瘍性活性が促進された細胞複製であることを特徴とするプロセス。6. The process of claim 5, wherein said neoplastic activity is enhanced cell replication. 請求項５記載のプロセスであって、ここで前記抗腫瘍性活性の減少が細胞の死の結果起こることを特徴とするプロセス。6. The process of claim 5, wherein the reduction in antitumor activity occurs as a result of cell death. 抗腫瘍物質を同定するための一つのプロセスであって、ここで前記プロセスが、ガン状態を示す動物に、先に請求項１から７記載の一つのプロセスにしたがって同定された因子の有効量を投与し、前記ガン状態の減少を検出することより成ることを特徴とするプロセス。9. A process for identifying an anti-tumor agent, wherein said process comprises administering to an animal exhibiting a cancer state an effective amount of a factor previously identified according to one of the processes of claims 1-7. Administering to said composition and detecting a reduction in said cancer condition. 細胞のガン状態を確定するための一つのプロセスであって、ここで前記プロセスが、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３，１５、１７および１９より成るグループから選択された配列を持つポリヌクレオチドと一致する最低一つの遺伝子の、前記細胞中の発現のレベルにおける増加を測定することより成り、ここで既知の非ガン細胞と比較して増加した発現がガン状態あるいは潜在的なガン状態を示すことを特徴とするプロセス。A process for determining the cancer status of a cell, wherein the process is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 and 19. Measuring an increase in the level of expression in said cell of at least one gene that is consistent with a polynucleotide having a sequence that is different from the known non-cancerous cell. A process characterized by indicating a typical cancer condition. 一つの抗体であって、ここで前記抗体が配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０より成るグループから選択されたアミノ酸配列より成るポリペプチドと反応することを特徴とする抗体。An antibody, wherein said antibody reacts with a polypeptide consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, and 20 An antibody, characterized in that: 請求項１０記載の抗体であって、ここで前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする抗体。11. The antibody according to claim 10, wherein said antibody is a monoclonal antibody. 請求項１０記載の抗体であって、ここで前記抗体が組み換え抗体であることを特徴とする抗体。11. The antibody according to claim 10, wherein said antibody is a recombinant antibody. 請求項１０記載の抗体であって、ここで前記抗体が合成抗体であることを特徴とする抗体。The antibody of claim 10, wherein said antibody is a synthetic antibody. 請求項１０記載の抗体であって、ここで前記抗体がさらに細胞傷害性因子より成ることを特徴とする抗体。11. The antibody of claim 10, wherein said antibody further comprises a cytotoxic factor. 請求項１４記載の抗体であって、ここで前記細胞傷害性因子がアポトーシス因子であることを特徴とする抗体。15. The antibody according to claim 14, wherein said cytotoxic factor is an apoptotic factor. ガンを処置するための一つのプロセスであって、ここで前記プロセスが、ガン細胞を配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９より成るグループから選択された遺伝子配列によりコード化された発現産物に対する活性を持つ因子に接触させることより成ることを特徴とするプロセス。A process for treating cancer, wherein said process comprises selecting cancer cells from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, and 19; Contacting with an agent having activity on the expression product encoded by the gene sequence. 請求項１６記載のプロセスであって、ここで前記ガン細胞をｉｎ ｖｉｖｏで接触させることを特徴とするプロセス。17. The process of claim 16, wherein the cancer cells are contacted in vivo. 請求項１６記載のプロセスであって、ここで前記因子が前記発現産物に対する親和性を持つことを特徴とするプロセス。17. The process of claim 16, wherein said factor has an affinity for said expression product. 請求項１８記載のプロセスであって、ここで前記因子が請求項１０から１５記載の抗体であることを特徴とするプロセス。19. A process according to claim 18, wherein said factor is an antibody according to claims 10-15. 一つの免疫原性組成物であって、ここで前記免疫原性組成物が、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０より成るグループから選択された配列と最低９０％同一のアミノ酸配列より成り、ここでアミノ酸の差異が保存アミノ酸置換の結果のみから生じることを特徴とする免疫原性組成物。An immunogenic composition, wherein said immunogenic composition is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, and 20 An immunogenic composition comprising an amino acid sequence at least 90% identical to the sequence, wherein amino acid differences result only from the result of conservative amino acid substitutions. 請求項２０記載の免疫原性組成物であって、ここで前記同一性パーセントが最低９５％であることを特徴とする免疫原性組成物。21. The immunogenic composition of claim 20, wherein said percent identity is at least 95%. 請求項２０記載の免疫原性組成物であって、ここで前記同一性パーセントが最低９８％であることを特徴とする免疫原性組成物。21. The immunogenic composition of claim 20, wherein said percent identity is at least 98%. 請求項２０記載の免疫原性組成物であって、ここで前記ポリペプチドが配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０より成るグループから選択された一つの配列を持つことを特徴とする免疫原性組成物。21. The immunogenic composition of claim 20, wherein said polypeptide is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, and 20. An immunogenic composition having two sequences. ガンに苦しむ動物のガンを処置するための一つのプロセスであって、ここで前記プロセスが、前記動物に、前記免疫原性組成物に特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球の産生を誘導するに十分な量の請求項２０から２３記載の免疫原性組成物を投与することより成ることを特徴とするプロセス。One process for treating cancer in an animal afflicted with cancer, wherein the process induces the animal to produce cytotoxic T lymphocytes specific for the immunogenic composition. A process comprising administering a sufficient amount of the immunogenic composition according to claims 20 to 23. 請求項２４記載のプロセスであって、ここで前記動物がヒトであることを特徴とするプロセス。25. The process of claim 24, wherein said animal is a human. ガンに苦しむ動物のガン状態を処置するための一つのプロセスであって、ここで前記プロセスが、前記動物に、先に請求項８記載のプロセスを用いて抗腫瘍性活性を持つと同定された因子の治療上有効な量を投与することより成ることを特徴とするプロセス。9. A process for treating a cancer condition in an animal afflicted with cancer, wherein the process has been identified in the animal as having anti-tumor activity using the process of claim 8. A process comprising administering a therapeutically effective amount of an agent. 動物をガンから守るための一つのプロセスであって、ここで前記プロセスが、ガンを発症する危険性のある動物に、先に請求項８記載のプロセスを用いて抗腫瘍性活性を持つと同定された因子の治療上有効な量を投与することより成ることを特徴とするプロセス。9. A process for protecting an animal from cancer, wherein said process identifies an animal at risk for developing cancer as having antitumor activity using the process of claim 8 above. Administering a therapeutically effective amount of the indicated factor. 産物を産生するための一つの方法であって、ここで前記方法が、請求項１から８記載のプロセスにしたがって因子を同定することより成り、ここで前記産物が前記プロセスの結果としての前記因子に関して集められた情報であり、またここで前記情報が前記因子の化学的構造およびまたは属性を伝達するのに十分であることを特徴とする方法。9. A method for producing a product, wherein the method comprises identifying an agent according to the process of claim 1, wherein the product is the factor as a result of the process. A method characterized in that the information is gathered about and wherein said information is sufficient to convey the chemical structure and / or attributes of said factor. 一つの単離されたポリヌクレオチドであって、ここで前記ポリヌクレオチドが配列番号：３あるいはその補足物より成るグループから選択された一つと最低９５％同一の配列を持つポリヌクレオチドより成ることを特徴とするポリヌクレオチド。An isolated polynucleotide, wherein said polynucleotide comprises a polynucleotide having a sequence at least 95% identical to one selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3 or a complement thereof. Polynucleotide. 請求項２９記載の単離されたポリヌクレオチドであって、ここで前記ポリヌクレオチドが配列番号：３の配列より成ることを特徴とするポリヌクレオチド。30. The isolated polynucleotide of claim 29, wherein said polynucleotide comprises the sequence of SEQ ID NO: 3. 一つの単離されたポリヌクレオチドであって、ここで前記ポリヌクレオチドが、
（ａ）配列番号：４のアミノ酸配列をコード化するポリヌクレオチドおよび
（ｂ）（ａ）の補足物
より成るグループから選択されたポリヌクレオチドより成ることを特徴とするポリヌクレオチド。An isolated polynucleotide, wherein said polynucleotide comprises:
A polynucleotide comprising (a) a polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and (b) a polynucleotide selected from the group consisting of the complement of (a). 一つの単離されたポリヌクレオチドであって、ここで前記ポリヌクレオチドが配列番号：４のアミノ酸配列と最低９５％同一のアミノ酸配列より成り、ここで配列同一性の差異が保存アミノ酸置換の結果のみから生じることを特徴とするポリヌクレオチド。An isolated polynucleotide, wherein said polynucleotide consists of an amino acid sequence at least 95% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, wherein the difference in sequence identity is only the result of conservative amino acid substitutions Or a polynucleotide originating from.
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