JP2004532603A - Ｄｎａ発現ベクターおよび使用法 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＤＮＡワクチン挿入物を送達するためのベクターとして有用な新規のｐＧＡ構築物を提供する。ワクチン挿入物は、様々なウイルス、細菌、寄生生物、および／または菌類のＤＮＡ転写物を含んでもよい。病原体ワクチン挿入物を含む治療的有効量の新規ｐＧＡ構築物を投与し、その後、同じワクチン挿入物を含む生ベクターワクチンを用いて追加免疫化を行うことによって、マルチエピトープＣＤ８ Ｔ細胞応答を惹起する方法も述べられる。

Description

【０００１】
本出願は、２０００年３月２に出願された米国特許仮出願第６０／１８６，３６４号および２０００年１２月１日に出願された第６０／２５１，０８３号からの優先権の恩典を主張する。
【０００２】
政府支援
本明細書で述べられる成果は、一部が、米国立衛生研究所助成金５ Ｐ０１ ＡＩ４３０４５および米国立衛生研究所／米国立アレルギー感染症研究所助成金Ｒ２１ ＡＩ４４３２５−０１によって支援されている可能性がある。米国政府は本発明において一定の権利を有し得る。
【０００３】
発明の分野
本発明は、一般的に、分子遺伝学および免疫学の分野に関する。さらに詳細には、本発明は、新規のＤＮＡ発現ベクター、免疫原タンパク質をコードするＤＮＡを含む新規のベクター、および免疫原タンパク質をコードするＤＮＡを含む新規のベクターを投与することによってヒトを含む動物を免疫化する新規の方法について述べる。
【０００４】
発明の背景
ワクチンは、世界の保健に重大かつ長期にわたる影響を及ぼしてきた。天然痘は撲滅され、ポリオは根絶に近づいており、ジフテリア、麻疹、おたふくかぜ、百日咳、および破傷風などの疾患の蔓延が阻止されている。それにもかかわらず、微生物は依然として主な死因であり、現行のワクチンはヒトおよび家畜の感染症のほんの一握りにしか対応していない。ワクチンがない一般的な感染症によって年に１２００億米ドルの損害をこうむっている（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、１９９７）。先進工業諸国では、免疫不全症ウイルスなどの感染症の出現ならびに薬剤耐性型結核のような疾患の再出現は新たな脅威をもたらし、ワクチン開発への難題を投げかける。有効なワクチンは入手不可能または法外に高いことが多い、第三世界の国々において、新たなワクチンおよび改善されたワクチンの必要性はさらに著しい。最近、抗原を発現するＤＮＡの直接注射は防御免疫応答を開始することが示されている。
【０００５】
ＤＮＡに基づくワクチンは、ワクチン接種された宿主においてタンパク質免疫原を発現させるために細菌プラスミドを使用する。目的の免疫原をコードするｃＤＮＡを真核生物発現プラスミドにクローニングするために、組換えＤＮＡ技術が使用される。次いで、ワクチンプラスミドは細菌内で増幅され、精製され、ワクチン接種される宿主に直接接種される。ＤＮＡは、一般的に、食塩水に溶解したＤＮＡの針注射、またはＤＮＡをコーティングした金ビーズを皮膚に送達する遺伝子銃装置によって接種される。プラスミドＤＮＡは宿主細胞に吸収され、ワクチンタンパク質が発現され、プロセシングされ、自己主要（ｓｅｌｆ−ｍａｊｏｒ）組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子およびクラスＩＩ分子において提示され、ＤＮＡによりコードされる免疫原に対する免疫応答が生じる。
【０００６】
ＤＮＡワクチン（「遺伝子的免疫化（ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）」とも呼ばれる）の歴史的な根拠は、遺伝子療法に関する研究およびレトロウイルスベクターを用いた研究から同時に生まれた。筋肉へのＤＮＡ送達に関する遺伝子療法研究によって、純粋なＤＮＡは、骨格筋細胞トランスフェクションの媒介においてリポソーム内に封入したＤＮＡと同じくらい有効であることが明らかになった（Ｗｏｌｆｆら、１９９０）。この封入されていないＤＮＡは、風変わりな用語である「裸のＤＮＡ」と呼ばれる。この用語は、核酸ワクチン接種に用いられる純粋なＤＮＡの説明のためによく知れるようになってきた。植物細胞にＤＮＡを送達するために開発された遺伝子銃もまた、ＤＮＡを皮膚に送達する遺伝子療法研究に用いられた。プラスミドによって発現されるヒト成長ホルモンがマウスの成長を変える能力を試験した一連の実験において、このプラスミド接種が成長を変えず、抗体を誘発したことが明らかにされた（Ｔａｎｇ、Ｄｅ Ｖｉｔ、およびＪｏｈｎｓｔｏｎ、１９９２）。これは、接種プラスミドＤＮＡによる免疫応答の惹起（ｒａｉｓｅ）の初めての証明であった。同時に、レトロウイルスベクターを用いた実験によって、ごくわずかな（１０^４〜１０^５個程度の）感染細胞によって防御免疫応答を惹起できることが証明された。ニワトリインフルエンザモデルにおいて行われた、ワクチン接種用の感染形態のレトロウイルスベクターを産生するのに使用されたことのあるプラスミドＤＮＡの直接的な試験によって防御免疫が得られた（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、ＨｕｎｔおよびＷｅｂｓｔｅｒ、１９９３）。
【０００７】
ＨＩＶ−１は２０００年までに世界人口の１％に感染し、そのために、この最近出現した病原体に対するワクチン開発が世界保健の最優先事項となっている。ＤＮＡワクチンの前臨床試験によって、チンパンジーにおいて、非常に弱力化されたＨＩＶ−１の攻撃をＤＮＡだけで防御することができるが（Ｂｏｙｅｒら、１９９７）、マカク（ｍａｃａｑｕｅ）においてさらに毒性の高いＳＩＶの攻撃を防御できないことが証明された（Ｌｕら、１９９７）。ＤＮＡによる初回抗原刺激とエンベロープ糖タンパク質による追加抗原刺激の併用によって、ＳＩＶとＨＩＶの非病原性キメラ（ＳＨＩＶ−ＩＩＩｂ）を用いた同種攻撃に対して、中和抗体に関連した防御が惹起された（Ｌｅｔｖｉｎら、１９９７）。つい最近、ＳＨＩＶ−ｓ（シミアンウイルスとヒト免疫不全症ウイルスのキメラ）による一連の攻撃を防御する能力について８種類の異なるプロトコールを試験した比較試験において、ＤＮＡ皮内接種による初回抗原刺激および組換え鶏痘ウイルスベクターを用いた追加抗原刺激を含む免疫化プロトコールにより攻撃感染の最高の封じ込め（ｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ）が示された（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、１９９９）。この攻撃感染の封じ込めは、攻撃ウイルスに対する中和抗体の存在と無関係である。攻撃感染の封じ込めに効果がないことが判明したプロトコールは、皮内ＤＮＡ接種または遺伝子銃ＤＮＡ接種による初回抗原刺激および追加抗原刺激による免疫化、皮内ＤＮＡ接種または遺伝子銃ＤＮＡ接種を用いた初回抗原刺激、次に、タンパク質サブユニットを用いた追加抗原刺激による免疫化、遺伝子銃ＤＮＡ接種を用いた初回抗原刺激および組換え鶏痘ウイルスを用いた追加抗原刺激による免疫化、タンパク質のみを用いた免疫化、ならびに組換え鶏痘ウイルスのみを用いた免疫化を含んだ（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、１９９９）。ヒトでのＤＮＡワクチン初期臨床試験によって、副作用はなく（ＭａｃＧｒｅｇｏｒら、１９９６）、細胞溶解性Ｔ細胞は惹起しないことが明らかになった（Ｃａｌａｒｏｔａら、１９９８）。多くの研究によって、同時トランスフェクションされたリンホカインおよび補助刺激分子が免疫化効率を高める能力がスクリーニングされている（ＲｏｂｉｎｓｏｎおよびＰｅｒｔｍｅｒ、印刷中）。
【０００８】
ＤＮＡワクチン法の欠点として、ＤＮＡによりコードされる産物（例えば、タンパク質）に対する免疫化の制限、ならびに真核生物による細菌タンパク質および寄生生物タンパク質の異常プロセシングの可能性が挙げられる。ＤＮＡワクチンの既存の方法に関する別の重大な問題は、ワクチン挿入物配列の中には細菌内でのＤＮＡワクチンプラスミドの増殖および増幅間に不安定になるものもあることである。不安定の原因として考えられる１つは、プラスミド増殖の際の、細菌エンドヌクレアーゼが認識することができるワクチン挿入物またはプラスミドバックボーンの二次構造の曝露である。
【０００９】
従って、ＨＩＶ−１を含む様々な感染症に対するワクチンとして有用な免疫原タンパク質を真核生物で発現するための、細菌宿主内での安定性が改善した、ヒトを含む動物において安全に使用することができるＤＮＡ発現ベクターが必要とされる。
【００１０】
発明の概要
本発明は新規ｐＧＡ構築物を提供する。新規ｐＧＡ構築物はＤＮＡワクチン送達のためのベクターとして有用である。
【００１１】
本発明はまた、ワクチン挿入物を有する新規ｐＧＡ構築物を提供する。病原体ワクチン挿入物は、任意のウイルス、細菌、寄生生物、および／または菌類のＤＮＡ転写単位を含んでもよい。
【００１２】
本発明は、病原体ワクチン挿入物を含む治療的有効量の新規のｐＧＡ構築物を投与することによって患者を免疫化する新規の方法について述べる。
【００１３】
本発明は、病原体ワクチン挿入物を含む治療的有効量の新規ｐＧＡ構築物を投与し、その後、同じワクチン挿入物を含む生ベクターワクチン（例えば、組換え改変ワクシニアアンカラ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｃｃｉｎｉａ Ａｎｋａｒａ；ＭＶＡ）ベクター）を用いて追加免疫化を行うことによって、患者を免疫化する新規の方法について述べる。
【００１４】
本発明はまた、病原体ワクチン挿入物を含む治療的有効量の新規ｐＧＡ構築物を投与し、その後、同じワクチン挿入物を含む生ベクターワクチン（例えば、組換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクター）を用いて追加免疫化を行うことによって、マルチエピトープＣＤ８ Ｔ細胞応答を惹起する新規の方法について述べる。
【００１５】
本発明は以下でさらに詳細に説明される。
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、新規のベクター、病原体ワクチン挿入物を含む新規のベクター、および病原体に対して患者を免疫化する新規の方法に関する。新規の免疫化方法は、病原体の感染、蔓延、または増殖を制限し得る細胞性免疫応答および体液性免疫応答を誘発し、その後の病原体による攻撃を防御する。
【００１７】
ＤＮＡワクチンの代表的な参考文献として、免疫応答惹起の最初の証明（Ｔａｎｇ、Ｄｅ Ｖｉｔ、およびＪｏｈｎｓｔｏｎ、１９９２）、細胞傷害性Ｔ細胞（Ｔｃ）により媒介される免疫の最初の証明（Ｕｌｍｅｒら、１９９３）、皮内（ｉ．ｄ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、鼻腔内（ｉ．ｎ．）、および遺伝子銃（ｇ．ｇ．）免疫化の防御効力の最初の証明（Ｆｙｎａｎら、１９９３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、Ｈｕｎｔ、およびＷｅｂｓｔｅｒ、１９９３）、遺伝子アジュバントの最初の使用（ＸｉａｎｇおよびＥｒｔｌ、１９９５）、ライブラリー免疫化（ｌｉｂｒａｒｙ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）の最初の使用（Ｂａｒｒｙ、Ｌａｉ、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、１９９５）、ならびにＤＮＡ送達法によるＴヘルパー型免疫応答を調節する能力の最初の証明（Ｆｅｌｔｑｕａｔｅら、１９９７）が挙げられる。ＤＮＡワクチン情報をまとめた非常に有用なウエブサイトがｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｗｅｂ．ｃｏｍ／Ｄｎａｖａｘ／ｄｎａｖａｘ．ｈｔｍｌで見られる。
【００１８】
便宜上、明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲内で用いられる特定の用語をここに集める。
【００１９】
定義
本明細書において用いられる「核酸」という用語は、任意の、天然および合成の線状のおよび連続的なヌクレオチドおよびヌクレオシド、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、およびそれらの誘導体を意味する。理解しやすくするために、このような核酸は、本明細書ではひとまとめにして「構築物」、「プラスミド」、または「ベクター」と呼ばれうる。本発明の核酸の代表例として、発現ベクター、クローニングベクター、コスミドベクター、および形質転換ベクターを含む細菌プラスミドベクター（ｐＢＲ３２２などがあるが、これに限定されない）、動物ウイルスベクター（例えば、改変されたアデノウイルス、インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルスなどがあるが、これに限定されない）、バクテリオファージ核酸に由来するベクター、ならびに化学合成されたＤＮＡまたはＲＮＡのような合成オリゴヌクレオチドが挙げられる。「核酸」という用語は、改変されたまたは誘導体化されたヌクレオチドおよびヌクレオシド（これに限定されないが５−ブロモウラシルなどのハロゲン化ヌクレオチドなどがあるが、これに限定されない）、およびビオチン標識ヌクレオチドなどの誘導体化されたヌクレオチドをさらに含む。
【００２０】
本明細書において用いられる「単離された核酸」という用語は、（ａ）天然のどの核酸の構造とも同一でない、または（ｂ）３つを超える別々の遺伝子にまたがる天然のゲノム核酸のどの断片の構造とも同一でない構造を有する核酸を意味し、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの誘導体もしくは変異種を含む。この用語は以下を含むが、これらに限定されない：（ａ）天然のゲノム分子の一部の配列を有するが、それが天然の種のゲノムにおいて前記分子の一部に隣接するコード配列の少なくとも１つと隣接しないＤＮＡ；（ｂ）得られる分子がどのベクターとも天然のゲノムＤＮＡとも同一にならないように、ベクターまたは原核生物もしくは真核生物のゲノム核酸に組み込まれた核酸；（ｃ）ｃＤＮＡ、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、もしくは化学合成によって生成された断片、または制限断片などの、ばらばらの分子；（ｄ）ハイブリッド遺伝子（すなわち、融合タンパク質をコードする遺伝子）の一部である組換えヌクレオチド配列、ならびに（ｅ）非天然のハイブリッド配列の一部である組換えヌクレオチド配列。
【００２１】
いくつかの目的のためには、ヌクレオチド配列が精製された形態であることが有利である。核酸に関連する「精製された」という用語は、天然環境に比べて配列の純度が高いことを示す。
【００２２】
本明細書において用いられる「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、ペプチド結合によって結合された、連続した配列の３つ以上のアミノ酸からなるアミノ酸重合体を意味する。「ポリペプチド」という用語は、タンパク質、タンパク質断片、タンパク質類似体、オリゴペプチドなどを含む。「ポリペプチド」という用語は、核酸によってコードされるか、組換え技術によって生成されるか、適切な供給源から単離されるか、または合成される、前記で定義されたポリペプチドを意図している。「ポリペプチド」という用語は、化学修飾アミノ酸または標識リガンドに共有結合もしくは非共有結合されたアミノ酸を含む、前記で定義されたポリペプチドをさらに意図している。
【００２３】
核酸（例えば、ｃＤＮＡ）について言及するために本明細書で用いられる「断片」という用語は、人工的に（例えば、化学合成によって）構築された、または制限エンドヌクレアーゼもしくは機械的剪断を用いて天然産物を複数の部分に切断することによって構築された目的の核酸の単離された部分、あるいはＰＣＲ、ＤＮＡポリメラーゼ、もしくは当技術分野において周知の他の任意の重合法によって合成された核酸または当業者に周知の組換え核酸技術によって宿主細胞において発現された核酸の部分を意味する。本明細書において用いられる「断片」という用語はまた、少なくとも１種類のプロテアーゼによるタンパク質分解切断によって天然に生じるポリペプチドから切断された、または当業者に周知の化学的方法によって合成された天然のポリペプチドの部分である、ポリペプチドの単離された部分を意味してもよい。
【００２４】
本明細書において用いられる「遺伝子」という用語は、ＲＮＡ全体、タンパク質全体、またはこのＲＮＡ全体もしくはタンパク質全体の任意の部分を合成するための遺伝情報をコードするＲＮＡまたはＤＮＡ両方を含む核酸配列を意味する。特定の生物のゲノムの天然の部分ではない遺伝子は「外来遺伝子」、「異種遺伝子」、または「外因性遺伝子」と呼ばれ、特定の生物のゲノムの天然の部分である遺伝子は「内因性遺伝子」と呼ばれる。
【００２５】
本明細書において用いられる「発現された」または「発現」という用語は、遺伝子の核酸２本鎖の一方のある領域に対して部分的に少なくとも相補的なＲＮＡ核酸分子を生じるような、遺伝子からの転写を意味する。本明細書において用いられる「発現された」または「発現」という用語はまた、タンパク質もしくはポリペプチドまたはその一部を生じるような、前記ＲＮＡ核酸分子からの翻訳を意味する。
【００２６】
本明細書において用いられる「遺伝子座」という用語は、染色体上での遺伝子の部位を意味する。遺伝子対が遺伝形質を支配し、それぞれの遺伝子は一対の染色体上の同じ位置にある。これらの遺伝子対（すなわち対立遺伝子）は形質発現において両方が優性でもよく、両方が劣性でもよい。どちらの場合でも、個体は、その遺伝子対が支配する形質についてホモ接合型であると言われている。遺伝子対（対立遺伝子）が一方が優性形質および他方が劣性形質からなる場合、個体は、遺伝対が支配する形質についてヘテロ接合型である。例えば、組換え事象により引き起こされるまたは変異の結果として生じる、遺伝子または核酸分子における天然の変化は、類似するが同一でないヌクレオチド配列を有する対立遺伝子変異種を生じる。このような対立遺伝子変異種は、一般的に、それと比較される遺伝子によってコードされるタンパク質と類似の活性を有するタンパク質をコードする。なぜなら、機能を変える変異体は一般的に自然淘汰に不利であるからである。対立遺伝子変異種はまた、遺伝子の非翻訳領域（例えば、３’または５’の非翻訳領域）における変化を含んでもよく、オルタナティブエキソンが隣接して配置されるような新生転写物のオルタナティブスプライシングを伴うこともできる。
【００２７】
本明細書において用いられる「転写調節配列」という用語は、遺伝子核酸配列に連結され、遺伝子の転写発現を調節するヌクレオチド配列を意味する。「転写調節配列」は単離されてもよく、適切な細胞においてベクターＤＮＡの一部の調節された転写を可能にするようにベクター核酸に組み込まれてもよい。「転写調節配列」は、ｍＲＮＡに転写することができるタンパク質コード配列の５’末端領域にある核酸配列領域の前にあってもよいが、これに限定されない。転写調節配列はまた、タンパク質コード領域内に位置してもよく、「イントロン」領域として特定される遺伝子領域内にあってもよく、核酸領域にある核酸配列領域内にあってもよい。
【００２８】
本明細書において用いられる「コード領域」という用語は、タンパク質に翻訳することができるヌクレオチドの連続線状配列を意味する。完全長コード領域が完全長タンパク質（すなわち、翻訳後修飾されておらず、その天然状態で翻訳された完全なタンパク質）に翻訳される。完全長コード領域はまた任意のリーダータンパク質配列を含んでもよく、または天然では翻訳されたタンパク質から切り出され得る他の任意のタンパク質領域を含んでもよい。
【００２９】
本明細書において用いられる「プローブ」という用語は核酸を指す場合、相補配列（または、プローブ配列とは異なるが、使用されるハイブリダイゼーションストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションを妨げる程度まで異ならない相補配列）とハイブリダイズし、それにより相補配列の存在を特定するために使用することができるヌクレオチド配列を意味する。プローブは、標識（放射性基、ビオチン、または当技術分野において周知の他の任意の標識などがあるが、これだけではない）を用いて修飾されてもよい。
【００３０】
本明細書において用いられる「核酸ベクター」という用語は、トランスフェクションまたは形質転換によって細胞に導入され、宿主細胞ゲノムとは関係なくまたは宿主細胞ゲノム内で複製することができる、天然または合成の一本鎖または二本鎖のプラスミドまたはウイルス核酸分子を意味する。プラスミドベクターのヌクレオチド配列に基づいて適切な制限酵素を用いた処理によって、環状二本鎖プラスミドを線状化することができる。ベクターを制限酵素で切断し、部分を一緒に連結することによって、核酸をベクターに挿入することができる。核酸分子はＲＮＡでもＤＮＡでもよい。
【００３１】
本明細書において用いられる「発現ベクター」という用語は、Ｍａｇｏタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結される少なくとも１つの調節配列をさらに含み得る核酸ベクターを意味する。調節配列は当技術分野において十分に認知されており、当業者が過度に実験することなく、連結ヌクレオチド配列の良好な発現を確かなものとするように選択することができる。本明細書において用いられる「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー、および発現を制御することができる他のエレメントを含む。適切な発現ベクター、プロモーター、および他の発現制御エレメントを設計するために、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）などの標準的な分子生物学の教科書を参照してもよい。しかしながら、適切な発現ベクターの選択は、形質転換されるべき宿主細胞の選択および／または発現されるべきタンパク質の種類を含む複数の要因によって左右されることが理解されるべきである。
【００３２】
本明細書において用いられる「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、核酸を宿主に挿入する過程を意味する。形質転換またはトランスフェクションによる原核生物または真核生物への核酸の導入を容易にするための多くの技法が当業者に周知である。これらの方法は、宿主細胞が核酸分子を取り込めるようにする様々な技法（例えば、高濃度の塩（カルシウム塩もしくはマグネシウム塩などがあるが、これだけではない）、電場、界面活性剤、またはリポソーム媒介トランスフェクションによる細胞の処理）を必要とする。
【００３３】
「組換え細胞」という用語は、天然では互いに共有結合していない核酸セグメントの新たな組み合わせを有する細胞を意味する。核酸セグメントの新たな組み合わせを、当業者に利用可能な様々な核酸操作技法を用いて生物に導入することができる。組換え細胞は真核細胞でもよく、原核細胞でもよく、哺乳動物細胞でもよい。組換え細胞はゲノム外にベクターを有してもよい。ゲノム外核酸ベクターは細胞ゲノムに挿入されない。組換え細胞はゲノム内にベクターまたはその一部をさらに有してもよい。用語ゲノム内は、組換え細胞のゲノム内に組み込まれた核酸構築物を定義する。
【００３４】
本明細書において用いられる「組換え核酸」という用語は、真核細胞にも原核細胞にも天然では見出されない少なくとも２つの核酸配列の組み合わせを意味する。核酸配列として、核酸ベクター、遺伝子発現調節エレメント、複製起点、発現時に抗生物質耐性を付与する配列、およびタンパク質コード配列が挙げられ得るが、これに限定されない。「組換えポリペプチド」という用語は、位置、純度、または構造の点で天然のポリペプチドとは異なるように組換えＤＮＡ技法によって産生されたポリペプチドを含むことが意図される。一般的に、このような組換えポリペプチドは、天然で通常観察されるものとは異なる量で細胞に存在する。
【００３５】
本明細書において用いられる「患者」という用語は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを意味する。
【００３６】
本明細書において用いられる「免疫化する」または「免疫化」という用語は、病原体により引き起こされる感染（すなわち、疾患）の発現を（部分的または完全に）防御する、患者における免疫応答の発生を意味する。本発明によって免疫化された患者は病原体に感染しないか、または免疫化なして起こる程度より少ない程度で感染する。免疫化は本質的に予防的免疫化でも治療的免疫化でもよい。すなわち、以前に感染していない患者および感染患者の両方とも本発明によって免疫化することができる。
【００３７】
本明細書において用いられる「ＤＮＡ転写単位」という用語は、少なくとも２つの成分である抗原コードＤＮＡおよび転写プロモーターエレメントを含むポリヌクレオチド配列を意味する。ＤＮＡ転写単位は、選択的に、エンハンサーエレメント、スプライシングシグナル、終結シグナルおよびポリアデニル化シグナル、ウイルスレプリコン、ならびに／または細菌プラスミド配列などのさらなる配列を含んでもよい。ＤＮＡ転写単位は、多くの既知の方法によって作製することができる。例えば、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（その開示は全体的に参照として本明細書に組み入れられる）に記載のように、ＤＮＡ転写単位を構築するために、望ましい抗原をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入することができる。
【００３８】
本明細書において用いられる「ワクチン挿入物」という用語は、病原体のＤＮＡ転写単位を意味する。好ましくは、ワクチン挿入物は、患者において免疫応答を生じることができるＤＮＡ転写単位である。例えば、ワクチン挿入物は、任意のウイルス、細菌、寄生生物および／または菌類に由来する抗原をコードする病原体ワクチン挿入物である。例示的なウイルスとして、ヘルペスウイルス、オルトミクソウイルス、ライノウイルス、ピコルナウイルス、アデノウイルス、パラミクソウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、ブニアウイルス、風疹ウイルス、レオウイルス、麻疹、ヘパドナウイルス、エボラ、レトロウイルス（ヒト免疫不全症ウイルスを含む）などが挙げられる。例示的な細菌として、結核、マイコバクテリア、スピロヘータ、リケッチア、クラミジア、マイコプラズマなどが挙げられる。例示的な寄生生物としてマラリアなどが挙げられる。例示的な菌類として、酵母、かびなどが挙げられる。このリストは、本明細書に記載の方法によって防御免疫応答が生じることができる全ての可能性のある病原体を含まないことが当業者に理解されると考えられる。
【００３９】
本明細書において用いられる「抗原」という用語は、病原体に対して防御応答を誘発することができる、病原体により発現される任意のタンパク質、炭水化物、または他の部分を意味する。抗原は病原体の構造成分でもよく、構造成分でなくてもよい。「抗原」という用語に意図されているものはまた、様々な長さの翻訳産物でもポリペプチドでもよい、遺伝子によってコードされる抗原である。抗原は、グリコシル化、ミリストイル化、またはリン酸化などの通常の宿主細胞修飾を受ける。さらに、細胞内、細胞外、または細胞表面に発現するように抗原を設計することができる。さらに、集合し、細胞から放出するように抗原を設計することができる。
【００４０】
本明細書において用いられる「アジュバント」という用語は、ワクチンの免疫原性を高めるためにワクチンに添加される物質を意味する。アジュバントが働く機構は完全に分かっていない。抗原をゆっくりと放出することで免疫応答を高めると考えられているアジュバントもあり、その一方で、それ自体で強力な免疫原性があり、協力作用的に機能すると考えられているアジュバントもある。既知のワクチンアジュバントとして、油性および水性のエマルジョン（ｏｉｌ ａｎｄ ｗａｔｅｒ ｅｍｕｌｓｉｏｎ）（例えば、完全フロイントアジュバントおよび不完全フロイントアジュバント）、コリネバクテリウム・パルヴム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ）、水酸化アルミニウム、グルカン、デキストラン硫酸、酸化鉄、アルギン酸ナトリウム、バクトアジュバント（Ｂａｃｔｏ−Ａｄｊｕｖａｎｔ）、ある特定の合成重合体（例えば、ポリアミノ酸およびアミノ酸共重合体）、サポニン、「レグレシン（ＲＥＧＲＥＳＳＩＮ）」（Ｖｅｔｒｅｐｈａｒｍ、Ａｔｈｅｎｓ、Ｇａ．）、「アブリジン（ＡＶＲＩＤＩＮＥ）」（Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−プロパンジアミン）、パラフィン油、およびムラミルジペプチドが挙げられるが、これに限定されない。アジュバントはまた、遺伝子アジュバント（例えば、同時接種ＤＮＡにコードされる免疫調節分子）を含む。同時接種ＤＮＡはワクチン免疫原と同じワクチン構築物内にあってもよく、別々のＤＮＡベクター内にあってもよい。
【００４１】
本明細書において用いられる「薬学的に許容される担体」という用語は、副作用なくウシ宿主に注射することができるワクチンを含有するための賦形剤を意味する。当技術分野において周知の適切な薬学的に許容される担体として、滅菌水、食塩水、グルコース、デキストロース、または緩衝溶液が挙げられるが、これに限定されない。担体には、希釈剤、安定化剤（すなわち、糖およびアミノ酸）、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、増粘剤、顔料などを含むがこれに限定されない、補助剤が含まれ得る。
【００４２】
本明細書において用いられる「選択（ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ）マーカー遺伝子」という用語は、選択マーカー遺伝子を含む細胞集団を、発現選択マーカー遺伝子を有さない細胞集団から選択するのを可能にする、発現遺伝子を意味する。例えば、「選択マーカー遺伝子」は、特定の抗生物質によって以前では悪影響を受けていた微生物に抗生物質耐性を付与することができる「抗生物質耐性遺伝子」でもよい。このような耐性は、変異、または微生物を形質転換する耐性遺伝子含有プラスミドによる耐性獲得から生じるものでもよい。
【００４３】
本明細書において用いられる「ターミネーター配列」または「ターミネーター」という用語は、転写を止めるように機能するヌクレオチド配列を意味する。本明細書において用いられる「転写」または「転写する」という用語は、相補的塩基対形成によってＤＮＡ鋳型上でＲＮＡ分子が形成される過程を意味する。この過程はＲＮＡポリメラーゼによって媒介される。
【００４４】
本明細書において用いられる「ＶＬＰ」という用語はウイルス様粒子を意味し、この用語が使用される場合、ウイルスタンパク質の凝集も意味する。
【００４５】
ＤＮＡをベースとする免疫化の主な免疫学的利点は、免疫原がＭＨＣクラスＩ分子およびクラスＩＩ分子の両方によって提示されることである。内因的に合成されたタンパク質は、ペプチドエピトープをＭＨＣ Ｉ分子およびＩＩ分子に積み込むためにプロセシング経路に速やかに入る。ＭＨＣ Ｉにより提示されたエピトープは細胞傷害性Ｔ細胞（Ｔｃ）応答を惹起するが、ＭＨＣ ＩＩにより提示されたエピトープはヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）を惹起する。対照的に、細胞内で合成されない免疫原は、主としてＭＨＣ ＩＩエピトープの積み込みおよびＴｃではなくＴｈの惹起に制限される。弱力化生ワクチン、または細胞において免疫原を産生し、ＴｈおよびＴｃの両方を惹起する組換えウイルスベクターと比較した場合、ＤＮＡワクチンは、非感染性であり、免疫応答を免疫化に望ましい抗原だけに集中させるという利点を有する。ＤＮＡワクチンはまた、１型ヘルパーＴ細胞または２型ヘルパーＴ細胞を惹起するために比較的容易に操作することができるので有利である。これによって、ワクチンを、感染と闘うために動員される免疫応答のタイプに合わせることが可能になる。プラスミドを組換えＤＮＡ技術を用いて容易に構築できること、ワクチン産生（プラスミドＤＮＡの増殖および精製）のために遺伝子的方法が使用できること、および広範囲の温度にわたるＤＮＡ安定性のために、ＤＮＡワクチンはまた費用対効果が大きい。
【００４６】
最良の免疫応答は、組換えタンパク質産生のために開発されたベクターをもとにした非常に活発な発現ベクターを用いて達成される（ＲｏｂｉｎｓｏｎおよびＰｅｒｔｍｅｒ、１９９８）。最も頻繁に用いられる転写制御エレメントとして強力なプロモーターが挙げられる。使用に適した１つのこのようなプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時初期プロモーターであるが、本発明の範囲を逸脱することなく他のプロモーターをＤＮＡワクチンに使用してもよい。本発明に有用な他の転写制御エレメントとして、強力なポリアデニル化シグナル（例えば、ウシ成長ホルモンをコードする遺伝子から得られたもの、またはウサギβグロビンポリアデニル化シグナル）が挙げられる（Ｂｏｈｍら、１９９６；Ｃｈａｐｍａｎら、１９９１；Ｈａｒｔｉｋｋａら、１９９６；Ｍａｎｔｈｏｒｐｅら、１９９３；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら、１９９３）。ＣＭＶ即時初期プロモーターはイントロンＡがあってもなくても使用されうる（Ｃｈａｐｍａｎ、１９９１）。イントロンＡの存在は、恐らく、発現されたＲＮＡに、真核生物ｍＲＮＡとしてのプロセシングおよび機能を支援する配列を与えることによって、ＲＮＡウイルス、細菌、および寄生生物からの多くの抗原の発現を増加させる。発現はまた、当技術分野において周知の他の方法（原核生物ｍＲＮＡのコドン使用頻度を真核細胞の使用頻度に合わせて最適化することを含むが、これに限定されない）によって増大させることができることが理解されると考えられる（Ａｎｄｒｅら、１９９８；Ｕｃｈｉｊｉｍａら、１９９８）。１種類を超える免疫原または１種類の免疫原および免疫刺激タンパク質を発現させるために、多シストロン性ベクターを使用してもよい（Ｉｗａｓａｋｉら、１９９７ａ；Ｗｉｌｄら、１９９８）。
【００４７】
免疫原はまた、発現された抗原を特定の細胞区画に向けることによって、抗体またはＴｃの惹起に多かれ少なかれ効果があるように操作することができる。例えば、抗体応答は、細胞内部に局在する抗原より、細胞の細胞膜上に提示された抗原または細胞から分泌された抗原によって効果的に惹起される（Ｂｏｙｌｅ、Ｋｏｎｉａｒａｓ、およびＬｅｗ、１９９７；Ｉｎｃｈａｕｓｐｅら、１９９７）。Ｔｃ応答は、ＤＮＡにコードされるタンパク質を、急速な細胞質分解を引き起こすプロテオソームに向けるＮ末端ユビキチン化シグナル、およびＭＨＣ Ｉ経路へのより効率的なペプチドの積み込みによって増大させることができる（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ、Ｚｈａｎｇ、およびＷｈｉｔｔｏｎ、１９９７；ＴｏｂｅｒｙおよびＳｉｌｉｃｉａｎｏ、１９９７；ＷｕおよびＫｉｐｐｓ、１９９７）。ＤＮＡで惹起される免疫応答の機構基礎の概説については、ＲｏｂｉｎｓｏｎおよびＰｅｒｔｍｅｒ、ウイルス研究の進歩（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、５３巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（２０００）を参照のこと（この開示はその全体が参照として本明細書に組み入れられる）。
【００４８】
抗体応答に及ぼす様々なタンパク質コンフォメーション形態の影響、ＭＨＣ Ｉエピトープ（ミニ遺伝子）のひも（ｓｔｒｉｎｇ）がＴｃ応答を惹起する能力、および抗原と免疫標的タンパク質とを融合する効果が、特定の挿入物を用いて評価されている。ウイルス様粒子などの順序づけられた構造は、順序づけられていない構造より抗体惹起に効果があるように見える（Ｆｏｍｓｇａａｒｄら、１９９８）。これは、免疫原の規則的な配列が、Ｉｇ受容体の架橋ならびに抗体を増やし、産生するＢ細胞のシグナリングに抗原単量体より効果があることを反映している可能性が高い。様々な病原体からのＭＨＣエピトープのひもをコードする組換えＤＮＡ分子が、多くの病原体に対するＴｃ応答を誘発することができる（Ｈａｎｋｅら、１９９８ｂ）。これらのＴｃエピトープのひもは、これらがＴｈエピトープも含む場合に最も効果的である（Ｍａｅｃｋｅｒら、１９９８；Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９８）。
【００４９】
免疫応答を操作するための別のアプローチは、免疫原と免疫標的分子または免疫刺激分子を融合することである。現在まで、これらの融合の最も成功した例は、分泌型免疫原を抗原提示細胞（ＡＰＣ）またはリンパ節に向けたものである（Ｂｏｙｌｅ、Ｂｒａｄｙ、およびＬｅｗ、１９９８）。分泌型ヒトＩｇＧとＣＴＬＡ−４の融合は、ＩｇＧに対する抗体応答を１０００倍を超えて増加させ、応答の偏りを補体（Ｃ’）依存性抗体からＣ’非依存性抗体に変えた。
【００５０】
ヒトＩｇＧとＬ−セレクチンとの融合もまた抗体応答を増加させるが、惹起した抗体のＣ’結合特性を変えなかった。Ｌ−セレクチンと融合した免疫原は、恐らく、入り口として働く高内皮細静脈に結合することによってリンパ節に送達された。抗原とサイトカインｃＤＮＡとの融合は、中程度の抗体、Ｔｈ、およびＴｃ応答の増加をもたらした（Ｈａｋｉｍ、Ｌｅｖｙ、およびＬｅｖｙ、１９９６；Ｍａｅｃｋｅｒら、１９９７）。ＩＬ−４融合は抗体応答を増加させたが、ＩＬ−１２およびＩＬ−１βはＴ細胞応答を増大させた。
【００５１】
ＤＮＡ送達のための２つのアプローチは、皮下注射針を用いた食塩水に溶解したＤＮＡの注射、またはＤＮＡでコーティングした金ビーズの遺伝子銃送達である。食塩水注射はＤＮＡを細胞外空間に送達するが、遺伝子銃送達はＤＮＡを直接細胞内に打ち込む。食塩水注射には、遺伝子銃よりかなり多量の（１００倍〜１０００倍の）ＤＮＡが必要である（Ｆｙｎａｎら、１９９３）。これらの２種類の送達はまた、食塩水注射は応答を１型ヘルパーＴ細胞に偏らせるが、遺伝子銃送達は応答を２型ヘルパーＴ細胞に偏らせる点で異なる（Ｆｅｌｔｑｕａｔｅら、１９９７；Ｐｅｒｔｍｅｒ、ロバーツ、およびハイネス、１９９６）。食塩水に溶解して注射されたＤＮＡは急速に体全体に広がる。銃によって送達されたＤＮＡは標的部位に局在する。どちらの接種方法に従っても、細胞外プラスミドＤＮＡの半減期はほぼ１０分と短い（Ｋａｗａｂａｔａ、Ｔａｋａｋｕｒａ、およびＨａｓｈｉｄａ、１９９５；Ｌｅｗら、１９９５）。食塩水注射によるワクチン接種は筋肉内（ｉ．ｍ．）でも皮内（ｉ．ｄ．）でもよい（Ｆｙｎａｎら、１９９３）。
【００５２】
様々なプラスミドの静脈内注射および皮下注射が様々な程度の成功を収めているが（Ｂｏｈｍら、１９９８；Ｆｙｎａｎら、１９９３）、腹腔内注射は不成功に終わっている（Ｂｏｈｍら、１９９８；Ｆｙｎａｎら、１９９３）。遺伝子銃送達は、皮膚または外科的に曝露された筋肉に送達することができる。マウスでの免疫応答惹起に効果のあったＤＮＡ送達の方法および経路は、他の種において有効である。
【００５３】
ＤＮＡの粘膜送達による免疫化は、非経口接種経路を用いた免疫化よりうまくいかなかった。食塩水に溶解したＤＮＡの鼻腔内投与は、大成功（Ａｓａｋｕｒａら、１９９７；Ｓａｓａｋｉら、１９９８ｂ）および限られた成功（Ｆｙｎａｎら、１９９３）を収めた。遺伝子銃は、膣粘膜へのＤＮＡ送達後にＩｇＧを首尾よく惹起した（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎら、１９９５）。リポソーム（ＭｃＣｌｕｓｋｉｅら、１９９８）、マイクロスフェア（Ｃｈｅｎら、１９９８ａ；Ｊｏｎｅｓら、１９９７）、および組換え赤痢菌ベクター（Ｓｉｚｅｍｏｒｅ、Ｂｒａｎｓｔｒｏｍ、およびＳａｄｏｆｆ、１９９５；Ｓｉｚｅｍｏｒｅ、Ｂｒａｎｓｔｒｏｍ、およびＳａｄｏｆｆ、１９９７）を用いて、粘膜表面へのＤＮＡ送達のある程度の成功も達成された。
【００５４】
応答を惹起するために必要とされるＤＮＡの用量は、送達方法、宿主、ベクター、およびコードされる抗原によって決まる。送達方法に関して最も大きな影響が見られる。一般的に、１０μｇ〜１ｍｇのＤＮＡがＤＮＡの食塩水注射に用いられるが、０．２μｇ〜２０μｇのＤＮＡがＤＮＡの遺伝子銃送達に用いられる。一般的に、それより少ない用量のＤＮＡがマウスで用いられ（食塩水注射については１０μｇ〜１００μｇ、遺伝子銃送達については０．２μｇ〜２μｇ）、それより高い用量が霊長類で用いられる（食塩水注射については１００μｇ〜１ｍｇ、遺伝子銃送達については２μｇ〜２０μｇ）。遺伝子銃送達に必要とされるＤＮＡがかなり少ない量であるのは、ＤＮＡを金ビーズで細胞に直接送達することを反映している。
【００５５】
応答惹起に及ぼす抗原の顕著な影響の一例が、インフルエンザ血球凝集素または免疫不全症ウイルスエンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）を発現するＤＮＡがウサギにおいて抗体応答を惹起する能力を比較した研究において見つけることができる（Ｒｉｃｈｍｏｎｄら、１９９８）。同様の免疫化条件下で、血球凝集素を発現するＤＮＡは、長時間効果のある、高アビディティー、高力価の抗体（約１００μｇ／ｍｌの特異的抗体）を惹起したが、Ｅｎｖを発現するＤＮＡは、一過性の、低アビディティー、および低力価の抗体応答（＜１０μｇ／ｍｌの特異的抗体）しか惹起しなかった。惹起された抗体のこれらの差は、血球凝集素がＴ依存性抗原であり、高度にグリコシルされた免疫不全症ウイルスＥｎｖがＴ非依存性抗原として作用することを反映していると仮説を立てられた。
【００５６】
ＤＮＡで初回抗原刺激された免疫応答を追加抗原刺激するために、タンパク質および組換えウイルスの両方が用いられている。タンパク質追加抗原刺激は、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖに対する中和抗体応答を増大させるために用いられた。組換えポックスウイルスによる追加抗原刺激は、体液性免疫応答および細胞性免疫応答の両方を増大させるために用いられた。
【００５７】
ＤＮＡで惹起された抗体応答が天然に感染した動物における抗体応答のほんの少ししかない免疫不全症ウイルスＥｎｖなどの弱い免疫原については、タンパク質追加抗原刺激が、低力価の抗体応答を増大させる手段をもたらした（Ｌｅｔｖｉｎら、１９９７；Ｒｉｃｈｍｏｎｄら、１９９８）。ウサギでの研究において、タンパク質追加抗原刺激は、抗体力価およびアビディティーならびに抗体応答の持続性を増加させた（Ｒｉｃｈｍｏｎｄら、１９９８）。タンパク質追加抗原刺激に対する二次免疫応答と一致して、ＤＮＡで初回抗原刺激された動物は、タンパク質追加抗原刺激後に、タンパク質だけを与えた動物より急速な抗体増加および高い力価の抗体を示した。しかしながら、第２のタンパク質免疫化による抗体応答の動態および力価は、ＤＮＡ初回免疫化を行った動物およびＤＮＡ初回免疫化を行っていない動物においてほぼ同じであった。
【００５８】
組換えポックスウイルス追加抗原刺激は、ＤＮＡで初回抗原刺激されたＣＤ８＋細胞応答を追加抗原刺激する、非常に良好な方法であることが実証されている（Ｈａｎｋｅら、１９９８ａ；Ｋｅｎｔら、１９９８；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、１９９８）。ＤＮＡで初回抗原刺激されたマウスまたはマカクにおいて、ポックスウイルス追加抗原刺激後に抗原特異的ＣＤ８＋細胞は１０倍ほど増加した。免疫化の順番を試験した研究によって、最初にＤＮＡを送達しなければならないことが明らかになった（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、１９９８）。これは、ＤＮＡが免疫応答を望ましい免疫原に集中させることを反映していると仮説を立てられた。ポックスウイルス追加抗原刺激後のＣＤ８＋細胞応答のさらなる増加は、ポックスウイルスベクターにより発現される多量の抗原、ならびに免疫応答を高めるポックスウイルス誘導サイトカインを反映していると仮説を立てられた（Ｋｅｎｔら、１９９８；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、１９９８）。
【００５９】
多くの様々なポックスウイルスを、ポックス追加抗原刺激に使用することができる。改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）と名付けられたワクシニアウイルスがマウスモデルにおいて特に効果があった（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、１９９８）。これは、哺乳動物モデルにおいて複製欠損であるＭＶＡが、宿主免疫応答を逃れる能力が弱まっていることを反映している可能性がある。
【００６０】
ＤＮＡ初回抗原刺激、それに続くポックスウイルス追加抗原刺激によって惹起された応答は、防御細胞性免疫応答の惹起に非常に効果があり得る。マウスにおいて、ＤＮＡの筋肉内注射、それに続く組換えポックス追加抗原刺激は、マラリア攻撃を防御した（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、１９９８）。マカクにおいて、皮内の（遺伝子銃ではない）ＤＮＡ初回抗原刺激、それに続く組換えポックスウイルス追加抗原刺激はシミアンウイルスおよびヒト免疫不全症ウイルスのキメラによる攻撃を防いだ （Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、１９９９）。
【００６１】
ＨＩＶ−１などの免疫不全症ウイルスに対するＤＮＡワクチンは攻撃（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）に立ちむかい、ＡＩＤＳにつながる容赦ない長期感染が阻止されるように、入ってくる感染を十分に制限する。これは、中和抗体が惹起されにくく、特定のウイルス株に特異的であることによって悪化される（ＢｕｒｔｏｎおよびＭｏｎｔｅｆｉｏｒｉ、１９９７；ＭｏｏｒｅおよびＨｏ、１９９５）。中和抗体の惹起に問題があったので、感染を大幅に抑えるのに十分な強さの細胞性応答の惹起にかなりの努力が集中した。現在まで、高力価Ｔｃ惹起の最良の成功は、ＤＮＡ初回抗原刺激、それに続いて組換えポックスウイルス追加抗原刺激を用いた免疫化プロトコールから得られている。細胞傷害活性アッセイ法を用いた特異的Ｔｃレベルの測定（Ｋｅｎｔら、１９９８）、特異的ＳＩＶ Ｇａｇエピトープに対するＭＨＣ特異的四量体を用いた染色、およびＳＩＶまたはＳＨＩＶによる攻撃（Ｈａｎｋｅ、１９９９）によって、このプロトコールの効力が評価されている。
【００６２】
多くの際立った発見が、ＤＮＡ初回抗原刺激および組換えポックスウイルス追加抗原刺激を用いた前臨床試験から明らかになっている。第１の発見は、血漿ウイルスＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を用いて検出することができるレベル以下で、攻撃感染を防ぐことができることである（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、１９９９）。第２の発見は、この防御が長時間効果があり、中和抗体の存在を必要としないことである（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、１９９９）。第３の発見は、ＤＮＡの食塩水注射による皮内ＤＮＡ初回抗原刺激が、防御免疫の惹起について遺伝子銃初回抗原刺激より優れていることである（Ｐ＝０．０１、フィッシャーの正確検定）（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、１９９９）。
【００６３】
本発明の新規のｐＧＡベクターは、原核生物複製起点、プラスミド選択用の選択マーカー遺伝子、および真核細胞用の転写カセットを有する。同じ転写方向であり、選択マーカー遺伝子の後ろにあるλターミネーターの含有が、本発明のｐＧＡベクターに特有のものである。プラスミドが細菌内で産生されている間、このターミネーター配列は、カナマイシンカセットからワクチン配列への読みとばし（ｒｅａｄ ｔｈｒｏｕｇｈ）を防ぐ。転写読みとばし阻止は、細菌エンドヌクレアーゼが認識できる二次構造の曝露を制限することでワクチン挿入物配列を安定化させる。
【００６４】
本発明のｐＧＡベクターに組み込まれる転写カセットは、転写を制御するために、サイトメガロウイルス即時初期プロモーター（ＣＭＶＩＥ）およびウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨｐＡ）からの配列を使用する。組織プラスミノゲンアクチベーター遺伝子（ｔＰＡ）リーダー配列の合成ホモログであるリーダー配列は、この転写カセットにおいて任意である。本発明のベクターは、ワクチン挿入物を受け入れるために使用することができる部位、および転写カセットがＣＭＶＩＥプロモーターにイントロンＡ配列を含むかどうかという点で異なる。イントロンＡ配列およびｔＰＡリーダー配列は両方とも、ある場合において、強力な発現の利点をワクチン挿入物に与えることが示されている（Ｃｈａｐｍａｎら、１９９１）。
【００６５】
ｐＧＡ１は３８９４ｂｐのプラスミドである。ｐＧＡ１は、プロモーター（１〜６９０ｂｐ）、ＣＭＶ−イントロンＡ（６９１〜１６３８ｂｐ）、ｔＰＡリーダー配列の合成模倣物（１６５９〜１７２１ｂｐ）、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（１７６１〜１９８３ｂｐ）、λＴ０ターミネーター（１９８４〜２０１８ｂｐ）、カナマイシン耐性遺伝子（２０３７〜２８３０ｂｐ）、およびＣｏｌＥＩレプリケーター（２８３１〜３８９０ｂｐ）を含む。ｐＧＡ１構築物のＤＮＡ配列（配列番号：１）を図２に示す。図１において表示した制限部位は、ワクチン挿入物のクローニングに有用なシングルカッター（ｓｉｎｇｌｅ ｃｕｔｔｅｒ）である。ＣｌａＩまたはＢｓｐＤ１部位は、ワクチン挿入物の５’末端がｔＰＡリーダー上流にクローニングされる時に用いられる。ＮｈｅＩ部位は、配列をｔＰＡリーダー配列とインフレームでクローニングするために用いられる。ＳｍａＩとＢｌｎＩの間に表示した部位は、ワクチン挿入物の３’末端のクローニングに用いられる。
【００６６】
ｐＧＡ２は、ｐＧＡ１に見られる９４７ｂｐのイントロンＡ配列を欠く２９４７ｂｐのプラスミドである。ｐＧＡ２は、イントロンＡ配列の欠失以外はｐＧＡ１と同じである。ｐＧＡ２は、効率的な発現のために上流イントロンを必要としない配列のクローニング、または上流イントロンが良好な発現のために必要とされるスプライシングのパターンを妨げる可能性のある配列のクローニングに有用である。図３は、ワクチン挿入物のクローニングに有用な制限部位を有するｐＧＡ２地図を示し、図４は配列番号：２のＤＮＡ配列を示す。ワクチン挿入物をｐＧＡ２にクローニングするための制限部位の使用法は、断片をｐＧＡ１にクローニングするために用いられるものと同じである。
【００６７】
ｐＧＡ３は、イントロンＡを含む３８９３ｂｐのプラスミドである。ｐＧＡ３は、ワクチン挿入物の導入に使用することができるクローニング部位以外はｐＧＡ１と同じである。ｐＧＡ３において、ｔＰＡリーダー配列の上流にクローニングされる挿入物はＨｉｎｄＩＩＩ部位を使用する。ｔＰＡリーダー配列の下流にクローニングされる配列はＳｍａＩ部位とＢｌｎＩ部位の間の部位を使用する。ｐＧＡ３において、これらの部位はＢａｍＨＩ部位を含む。図５はｐＧＡ３地図を示し、図６は配列番号：３のＤＮＡ配列を示す。
【００６８】
本明細書での開示を考慮すると、当業者は、本明細書に記載の新規のｐＧＡ構築物に、当技術分野において周知の任意のワクチン挿入物（ＨＩＶ、インフルエンザ、麻疹、ヘルペス、エボラなどのようなウイルス病原体が挙げられるが、これに限定されない）を使用することができることを理解すると考えられる。
【００６９】
例えば、本発明は、免疫不全症ウイルス、より好ましくはＨＩＶ（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の全てのクレード（ｃｌａｄｅ）ならびにそれらの変異体を含む）に由来する挿入物；インフルエンザウイルス遺伝子（全てのサブタイプおよびそれらの変異体を含む）；ならびに麻疹遺伝子に由来するワクチン挿入物を意図する。当業者は、免疫不全症ウイルス；インフルエンザウイルス；麻疹ウイルス；およびそれらの変異体に由来する挿入物に関する議論が本質的に例示であり、例示のためだけに示されることを理解すると考えられる。
【００７０】
本発明の免疫不全症ウイルスワクチン挿入物は、一本のＤＮＡから非感染性ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を発現するように設計された。これは、免疫不全症ウイルスが一本のウイルスＲＮＡから複数の遺伝子産物を発現するために通常用いるサブゲノムスプライシングエレメントを用いて達成された。（ｉ）完全長ウイルスＲＮＡに存在するスプライス部位およびアクセプター、（ｉｉ）Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、ならびに（ｉｉｉ）Ｒｅｖタンパク質が、サブゲノムスプライシングパターンに重要である。レトロウイルスＲＮＡにおけるスプライス部位は、真核生物ＲＮＡにおけるスプライス部位の特徴的な配列を使用する。ＲＲＥは、ウイルスＲＮＡを核から細胞質へ輸送するＲｅｖタンパク質と相互作用する約２００ｂｐのＲＮＡ構造である。Ｒｅｖ非存在下では、約１０ｋｂの免疫不全症ウイルスＲＮＡがスプライシングを受けて、調節遺伝子Ｔａｔ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆのｍＲＮＡになる。これらの遺伝子は、ＲＴとＥｎｖの間に存在し、ゲノム３’末端にあるエキソンによりコードされる。Ｒｅｖ存在下では、複雑にスプライシングされたＴａｔ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆのｍＲＮＡに加えて、１回だけスプライシングされたＥｎｖ ｍＲＮＡならびにスプライシングされていないＧａｇおよびＰｏｌのｍＲＮＡが発現される。
【００７１】
一本のＤＮＡからの非感染性ＶＬＰの発現は、免疫不全症ウイルスワクチンに多くの有利な特徴をもたらす。一本のＤＮＡからの多数のタンパク質の発現は、ワクチン接種された宿主に、これらのタンパク質に含まれるＴ細胞エピトープおよびＢ細胞エピトープの幅（ｂｒｅａｄｔｈ）に応答する機会をもたらす。複数のエピトープを含むタンパク質の発現は、多様な組織適合型によるエピトープ提示の機会をもたらす。全タンパク質を使用することによって、異なる組織適合型の宿主に、広範囲のＴ細胞応答を惹起する機会をもたらす。このようなことは、高い変異率が素早い免疫応答回避を指示する免疫不全症ウイルス感染の効果的な封じ込めに必須でありうる（Ｅｖａｎｓら、１９９９）（Ｐｏｉｇｎａｒｄら、１９９９；Ｅｖａｎｓら、１９９５）。まさに薬物療法と同じように、回避のために複数の変異を必要とするマルチエピトープＴ細胞応答は、回避のために１回の変異しか必要としないシングルエピトープＴ細胞応答より優れた防御をもたらすと考えられる。
【００７２】
抗体応答は、多くの場合、順序付けられた配列のエピトープを応答Ｂ細胞に提示する多価ワクチンによって最も良好に初回抗原刺激される （ＢａｃｈｍａｎｎおよびＺｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ、１９９７）。ウイルス様粒子は、ビリオン膜におけるＥｎｖの多価性（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｃｙ）によって抗Ｅｎｖ抗体応答の惹起を容易にする。これらの粒子はまた、変性していない正常形態のＥｎｖを免疫系に提示する。
【００７３】
本発明の新規のベクターは、アジュバント、またはＤＮＡの取り込みを促進する能力もしくは免疫系細胞を接種部位に動員する能力を有する他の物質の存在下で患者に投与されることができる。態様は、ＤＮＡワクチンと従来のアジュバントまたは遺伝子アジュバントを組み合わせることを含む。ＤＮＡの安定性および取り込みに有利に働くか、免疫系細胞を接種部位に動員するか、または応答リンパ球の免疫活性化を促進する試薬を含む従来のアジュバントとして、油性および水性のエマルジョン（例えば、完全フロイントアジュバントおよび不完全フロイントアジュバント）、コリネバクテリウム・パルヴム、ＢＣＧ、水酸化アルミニウム、グルカン、デキストラン硫酸、酸化鉄、アルギン酸ナトリウム、バクトアジュバント、ある特定の合成重合体（例えば、ポリアミノ酸およびアミノ酸共重合体）、サポニン、「レグレシン」（Ｖｅｔｒｅｐｈａｒｍ、Ａｔｈｅｎｓ、Ｇａ．）、「アブリジン」（Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−プロパンジアミン）、パラフィン油、およびムラミルジペプチドが挙げられるが、これに限定されない。本発明はまた、遺伝子アジュバント（例えば、同時接種ＤＮＡにコードされる免疫調節分子）の使用を意図する。同時接種ＤＮＡは、ワクチン免疫原と同じワクチン構築物内にあってもよく、別のＤＮＡベクター内にあってもよい。
【００７４】
本発明によるワクチンは、任意の非経口経路または局所経路を含む様々な方法で投与することができる。例えば、個体は、静脈内、腹腔内、皮内、皮下、または筋肉内方法によって接種することができる。接種は、例えば、皮下注射針、針のない送達装置（例えば、液体の流れを標的部位に進ませるもの）を使用してもよく、金ビーズ上にあるＤＮＡを標的部位に打ち込む遺伝子銃を使用してもよい。病原体ワクチン挿入物を含むベクターは、鼻腔内投与（すなわち、点鼻剤もしくは吸入剤）、または溶剤、ゲル剤、泡、もしくは坐剤による直腸内投与もしくは腟内投与を含む様々な方法によって粘膜表面に投与することができる。または、ワクチン挿入物を含むベクターは、錠剤、カプセル剤、チュアブル錠、シロップ剤、乳濁液などの形で経口投与することができる。別の態様において、ベクターは、受動的皮膚パッチ（ｐａｓｓｉｖｅ ｓｋｉｎ ｐａｔｃｈ）、イオン導入手段などによって経皮投与することができる。
【００７５】
任意の適切な生理学的に許容される媒質が、病原体ワクチン挿入物を含むベクターの患者への導入に適している。例えば、当技術分野において周知の適切な薬学的に許容される担体として、滅菌水、食塩水、グルコース、デキストロース、または緩衝溶液が挙げられるが、これに限定されない。担体として、希釈剤、安定化剤（すなわち、糖およびアミノ酸）、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、増粘剤、顔料などを含むが、これに限定されない補助剤が挙げられ得る。
【００７６】
本発明は、例示のために示され、限定するものとして解釈すべきでない以下の実施例によってさらに例示される。全ての参考文献、公開された特許、および本出願を通じて引用された特許の内容は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【００７７】
実施例１：ｐＧＡ１の構造および配列
図１および図２に図示するｐＧＡ１は、ＣｏｌＥ１複製起点、抗生物質選択のためのカナマイシン耐性遺伝子、λＴ０ターミネーター、および真核生物発現カセット（上流イントロンを含む）を含む。ＣｏｌＥ１複製起点は、複製起点（ｏｒｉ）を含み、ＲＮＡプライマーをコードし、２つの負の複製開始レギュレーターをコードする６００ヌクレオチドＤＮＡ断片である。プラスミド複製のための酵素機能は全て細菌宿主によりもたらされる。ＣｏｌＥ１レプリケーターを含む元々の構築プラスミドはｐＢＲ３２２であった（Ｂｏｌｉｖａｒら、１９７７；Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、１９７８）。
【００７８】
カナマイシン耐性遺伝子は、細菌におけるプラスミド選択用の抗生物質耐性遺伝子である。λＴ０ターミネーターは、原核生物でのプラスミド増殖間の、カナマイシン耐性遺伝子からワクチン転写カセットへの読みとばしを防ぐ（ＳｃｈｏｌｔｉｓｓｅｋおよびＧｒｏｓｓｅ、１９８７）。ワクチン発現カセットへの読みとばしを防ぐことにより、ターミネーターは、細菌における増殖間でのプラスミド挿入物の安定化を助ける。
【００７９】
真核生物発現カセットは、イントロンＡを含むＣＭＶ即時初期プロモーター（ＣＭＶＩＥ−ＩＡ）、およびウシ成長ホルモンポリアデニル化配列からの終結配列（ＢＧＨｐＡ）からなる。転写カセット内に、組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔＰＡ）リーダー配列の合成模倣物をオプションとして含める。これらのエレメントを有するカセットは、真核細胞での外来遺伝子発現に非常に有効であることが実証されている（Ｃｈａｐｍａｎら、１９９１）。転写カセット内のクローニング部位として、ｔＰＡリーダーの上流にあるＣｌａＩ部位、ｔＰＡリーダーとインフレームにクローニングするためのＮｈｅＩ部位、ならびにＢＧＨｐＡの前にクローニングするためのＸｍｎＩ、ＳｍａＩ、ＲｓｒＩＩ、ＡｖｒＩＩ、およびＢｌｎＩ部位が挙げられる。
【００８０】
ＣｏｌＥ１レプリケーター、カナマイシン耐性遺伝子、および真核細胞用の転写制御エレメントは、市販のベクターｐＺＥｒＯ−２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）および真核生物発現ベクターｐＪＷ４３０３（Ｌｕら、１９９７）からのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）断片を用いて１つのプラスミドにまとめられた。
【００８１】
ｐＺＥｒＯ２（ｎｔ１３１９〜ｎｔ３１７８）からの１８５３ｂｐ断片は、ＣｏｌＥ１複製起点およびカナマイシン耐性遺伝子を含んでいた。ｐＪＷ４３０３（ｎｔ３７６〜ｎｔ２４１６）からの２０４０ｂｐ断片は、イントロンＡを含むＣＭＶＩＥプロモーター、組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔＰＡ）リーダーの合成模倣物、およびウシ成長ホルモンポリアデニル化部位（ＢＧＨｐＡ）を含んでいた。ＳａｌＩ部位を含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、断片を増幅した。反対の転写方向でｐＺＥｒＯ２からのカナマイシン耐性転写カセットおよびｐＪＷ４３０３からの真核生物転写カセットを含む連結産物を、さらなる開発のために特定した。このｐＧＡベクター母体のヌクレオチド番号付けをＣＭＶプロモーター５’末端の第一番目の塩基対から始めた。
【００８２】
このｐＧＡベクター母体にＴ０ターミネーターを、５’末端にＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ部位および３’末端にＸｂａＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含む３９１ｂｐ断片のＰＣＲ増幅によって導入した。この断片の最初の３５５ｂｐは、ｐＪＷ４３０３転写カセットに由来するＢＧＨｐＡ配列内の配列であり、合成オリゴヌクレオチド内の次の３６塩基がＴ０配列およびＸｂａＩ部位を導入した。導入されたＴ０ターミネーター配列は、以下のようなヌクレオチド配列を含んだ。

【００８３】
ｐＸｅＲＯ２およびｐＪＷ４３０３から作製されたプラスミド内のＴ０ターミネーターを含まない相同断片を、Ｔ０ターミネーター含有ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片で置換した。Ｔ０方向を確かめるために、この産物を配列決定した。
【００８４】
ヌクレオチド１７５５〜１８４５間の真核生物転写カセットの領域は、ＳＩＶ ｎｅｆのリーディングフレームの最後の３０ｂｐを含んだ。ｎｔ１８５８の配列を変異させ、ＡｖｒＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を作製することにより、この領域をｐＧＡから除去した。天然のＡｖｒＩＩ部位がｎｔ１７５５にある。ＡｖｒＩＩ酵素による消化、次に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによる再連結によって、ヌクレオチド１７５５〜１８４５間のＤＮＡのＳＩＶセグメントを除去した。ｐＧＡベクターへのＨＩＶ−１配列のクローニングを容易にするために、部位特異的変異誘発を用いてＣｌａＩ部位を第１６４５番目の塩基に導入し、ＲｓｒＩＩ部位を第１７４３番目の塩基に導入した。構築物を配列分析によって確かめた。
【００８５】
実施例２：ｐＧＡ２の構造および配列
図３および図４に図示したｐＧＡ２は、ＣＭＶＩＥプロモーターからイントロンＡ配列を欠失した以外はｐＧＡ１と同一である。ＣＭＶＩＥプロモーターにおけるｍＲＮＡキャップ部位の８ｂｐ下流にＣｌａＩ部位を導入することによって、ｐＧＡ１からｐＧＡ２を作製した。以下の相補プライマーを用いたオリゴヌクレオチド特異的変異誘発を用いて、ＣｌａＩ部位を導入した。

【００８６】
新たなＣｌａＩ部位を挿入した後、ｐＧＡ１から９４６ｂｐのＣｌａＩ断片を除去するためにｐＧＡ１をＣｌａＩで消化し、次いで、再連結してｐＧＡ２を得た。
【００８７】
実施例３：ｐＧＡ３の構造および配列
図５および図６に図示したｐＧＡ３は、ｎｔ１６４５のＣｌａＩ部位の代わりにＨｉｎｄＩＩＩ部位を、ヌクレオチド１７４３のＲｓｒＩＩ部位の代わりにＢａｍＨＩ部位を導入した以外はｐＧＡ１と同一である。
【００８８】
実施例４：ｐＧＡ３およびｐＪＷ４３０３の発現および免疫原性の比較
ワクチンベクターとしてのｐＧＡプラスミドの効力を確かめるために、ｐＧＡプラスミドを、以前に述べられたワクチンベクターｐＪＷ４３０３と比較した。ｐＪＷ４３０３プラスミドは、マウス、ウサギ、およびアカゲザルにおけるＤＮＡワクチン接種に使用されている（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、１９９９；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、１９９７；Ｐｅｒｔｍｅｒら、１９９５；Ｆｅｌｔｑｕａｔｅら、１９９７；Ｔｏｒｒｅｓら、１９９９）。正常な細胞膜型Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）インフルエンザウイルス血球凝集素をコードするワクチン挿入物を含むｐＧＡ３（ｐＧＡ３／Ｈ１）および同じ断片をコードするｐＪＷ４３０３（ｐＪＷ４３０３／Ｈ１）を用いて比較を行った。ｐＧＡ３およびｐＪＷ４３０３は両方ともインフルエンザＨ１配列の上流にイントロンＡを含む。
【００８９】
ｐＧＡ３／Ｈ１およびｐＪＷ４３０３／Ｈ１ワクチンプラスミドは、以下にまとめたように真核細胞においてほぼ同じレベルのＨ１を発現した。
【００９０】

【００９１】
ヒト胎児腎臓２９３Ｔ細胞にプラスミド２μｇを一過的にトランスフェクトし、抗原捕獲ＥＬＩＳＡ（ａｎｔｉｇｅｎ−ｃａｐｔｕｒｅ ＥＬＩＳＡ）を用いて上清および細胞溶解物のＨ１をアッセイした。捕獲抗体はポリクローナルウサギＨ１抗血清であり、検出抗体はポリクローナルマウスＨ１抗血清であった。ｐＧＡ３／Ｈ１は、ｐＪＷ４３０３／Ｈ１よりわずかに多いＨ１を発現した（５．８ ＨＡ単位に対して５．１ Ｈ１単位）（表６）。予想通り、Ｈ１抗原の９０％が細胞溶解物中にあった。ｐＧＡ３／Ｈ１およびｐＪＷ４３０３／Ｈ１を用いた比較免疫化研究によって、ｐＧＡ３／Ｈ１の免疫原性はｐＪＷ４３０３／Ｈ１と同等であるか、またはｐＪＷ４３０３／Ｈ１より高いことが証明された（図７）。免疫原性はＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて評価した。この実施例では、ＤＮＡでコーティングされた金粒子を用いて、遺伝子銃によってマウスにワクチン接種を行った。低用量（０．１μｇ）または高用量（１μｇ）のプラスミドＤＮＡを用いて、マウスに初回抗原刺激および追加抗原刺激を行った。追加免疫化は初回免疫化の４週間後に行った。ｐＧＡ３／Ｈ１による免疫化後の、免疫化に応答して惹起された抗Ｈ１ ＩｇＧ量は、ｐＪＷ４３０３／Ｈ１による免疫化後の抗Ｈ１ ＩｇＧ量と同じくらいであるか、またはそれより多かった（図７）。従って、ｐＧＡベクターは、免疫応答の惹起に、ｐＪＷ４３０３ベクターと同じくらい効果があるか、またはｐＪＷ４３０３ベクターより効果があることが実証された。
【００９２】
実施例５：ｐＧＡベクター内の免疫不全症ウイルスワクチン挿入物
ウイルス様粒子を発現する免疫不全症ウイルスワクチン挿入物がｐＧＡ１およびｐＧＡ２において開発されている。このＶＬＰ挿入物は、米国に特有のＨＩＶ−１配列と一致するようにクレードＢ ＨＩＶ−１配列を用いて設計された。クレードＢでは、様々な分離株がクラスター多様性を示し、各分離株は、クレードの共通配列由来の全体的な類似した多様性を有する（Ｓｕｂｂａｒａｏ、Ｓｃｈｏｃｈｅｔｍａｎ、１９９６）。従って、任意のクレードＢ分離株が、他のクレードＢ分離株の相応する配列として使用することができる。ＨＩＶ−１分離株は、補助受容体として様々なケモカイン受容体を用いる。伝播しているウイルスの大部分がＣＣＲ−５補助受容体を用いる（Ｂｅｒｇｅｒ，Ｅ．Ａ．、１９９７）。従って、ＣＣＲ−５を使用するＥｎｖを有するように、ワクチン挿入物を設計した。
【００９３】
ＨＩＶ−１ ＤＮＡワクチンによるＲ５−Ｅｎｖを含むＶＬＰの発現はまた、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞およびマクロファージ）へのＥｎｖによる粒子の侵入を支援するという利点がある。樹状細胞およびマクロファージは両方とも、ＣＤ４受容体、およびＣＣＲ−５指向性（Ｒ５）ＨＩＶ−１ Ｅｎｖが使用するＣＣＲ−５補助受容体を発現する。ワクチンにＲ５ Ｅｎｖを使用することによって、トランスフェクトされた非プロフェッショナルＡＰＣ（例えば、ケラチン生成細胞または筋細胞）において発現されたＶＬＰは、Ｅｎｖによる侵入によってＡＰＣ細胞質に侵入することができる。ＡＰＣ細胞質への侵入後、ＶＬＰは、プロセシングおよびクラスＩ組織適合抗原による提示に用いられる。ＤＮＡに基づく免疫化は、抗原提示のためのプロフェッショナルＡＰＣに依存する（Ｃｏｒｒら、１９９６；Ｆｕら、１９９７；Ｉｗａｓａｋｉら、１９９７）。ＤＮＡに基づく免疫化の多くは、プロフェッショナルＡＰＣの直接トランスフェクションによって達成される（Ｃｏｎｄｏｎら、１９９６；Ｐｏｒｇａｄｏｒら、１９９８）。トランスフェクトされた筋細胞またはケラチン生成細胞は抗原の工場として働くが、免疫応答を直接惹起しない（Ｔｏｒｒｅｓら、１９９７）。集合され、トランスフェクトされたケラチン生成細胞または筋細胞から放出され、次いで、プロフェッショナルＡＰＣに積極的に侵入する発現抗原を使用することによって、免疫化効率を高めることができる。
【００９４】
ｐＧＡ２／ＪＳ２構築における目標は、（ｉ） ＣＣＲ−５を使用するクレードＢ ＶＬＰを高発現で得ること、（ｉｉ）非感染性ＶＬＰを産生すること、および（ｉｉｉ）ワクチンプラスミドのサイズを最小限にすることであった。ＣＣＲ−５を使用するＶＬＰ（ｐＧＡ２／ＪＳ２）の構築後、Ｅｎｖ欠損ＶＬＰを発現するＪＳ２誘導体を作製した。このプラスミド挿入物をＪＳ５と呼んだ。この配列はＥｎｖを含むＪＳ２ ＶＬＰより効果の弱いワクチンであると予想されるが、このＥｎｖを含まないＶＬＰはワクチン接種にある有利な点をもたらす。これらの有利な点として、Ｅｎｖについてのセロコンバージョンによってワクチン接種集団の感染をモニターできることが挙げられる。Ｅｎｖ配列の欠失はまたワクチンプラスミドのサイズを小さくする。ｐＧＡ２／ＪＳ２のＤＮＡ配列を図１７に示し、ｐＧＡ１／ＪＳ５のＤＮＡ配列を図１８に示す。
【００９５】
高発現のＶＬＰプラスミドを得るために、以下の表に示すように候補ワクチンを７つの異なるＨＩＶ−１配列から構築した。
【００９６】

【００９７】
初期構築物ｐＢＨ１０−ＶＬＰは、細菌において安定であり、かつ真核細胞において高発現するＩＩＩｂ配列から作製された。ＢＨ１０配列は、ＮＩＨの後援を受けているＡＩＤＳ貯蔵所（カタログ番号９０）から入手した。親ｐＢＨ１０は、ｐＢＨ１０−ＶＬＰを構築するためのＰＣＲ反応の鋳型として使用した。
【００９８】
５’から３’の１０５ｂｐの５’非翻訳リーダー配列ならびにＧａｇ開始コドンからＲＴコード配列末端までのｇａｇ配列およびｐｏｌ配列を含むＧａｇ−Ｒｔ ＰＣＲ産物（５’ＰＣＲ産物）を得るように、プライマーを設計した。このオリゴヌクレオチドプライマーによって、ＰＣＲ産物の５’末端にＣｌａＩ部位が導入され、ＰＣＲ産物の３’末端にＥｃｏＲＩ部位およびＮｈｅＩ部位が導入された。５’ＰＣＲ産物を増幅するために、センスプライマー１

およびアンチセンスプライマー２

を使用した。
【００９９】
ＨＩＶ−１ ｅｎｖ領域のＰＣＲ産物（３’ＰＣＲ産物）は、ｖｐｕ、ｔａｔ、ｒｅｖ、およびｅｎｖ配列、ならびにこれらの各ｍＲＮＡの正しいプロセシングおよび発現に必要なスプライスアクセプター部位を含んだ。この産物の５’末端にＥｃｏＲＩ部位が導入され、３’末端にＮｈｅＩ部位およびＲｓｒＩＩ部位が導入された。３’ＰＣＲ産物を増幅するために、センスプライマー３

およびアンチセンスプライマー４

を使用した。
【０１００】
５’ＰＣＲ産物をｐＧＡ１にＣｌａＩ部位およびＮｈｅＩ部位でクローニングし、構築物の同一性を配列決定で確かめた。次いで、３’ＰＣＲ産物を５’クローンにＥｃｏＲＩ部位およびＮｈｅＩ部位で挿入して、ｐＢＨ１０−ＶＬＰを得た。このＶＬＰの構築は、ＬＴＲ、インテグラーゼ、ｖｉｆ、およびｖｐｒ配列を欠くプロウイルス配列をもたらした（図８Ａを参照のこと）。
【０１０１】
ＢＨ１０−ＶＬＰはＲ５ ＥｎｖではなくＸ４を有したので、ＢＨ１０−ＶＬＰのｅｎｖ配列を、６つの異なるＲ５ Ｅｎｖをコードする配列で置換した。これは、様々なウイルスゲノムに由来するｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、およびｅｎｖコード配列を含むＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＢＨ１０−ＶＬＰにクローニングすることによって行われた。得られたｅｎｖ配列およびｒｅｖ配列は、置換配列およびＢＨ１０配列のキメラであった（例えば、図８Ｂを参照のこと）。ＡＤＡエンベロープの場合、ＢＨ１０−ＶＬＰのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ領域をＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片で置換するのを容易にするために、ＡＤＡ配列にＢａｍＨＩ部位を導入した（図８）。これらの構築の結果を表１にまとめる。６つの試験配列の１つ６Ａ−ＶＬＰは、形質転換細菌における不十分なプラスミド増殖に関連することが見出された。このプラスミドは、さらなるワクチン開発に使用しなかった（表１）。
【０１０２】
細菌において良好な増殖を示すプラスミドのうち、最も良いＶＬＰ発現がＡＤＡ−ＶＬＰで見出された（表１）。２９３Ｔ細胞での一過性トランスフェクションにおいて、ＡＤＡ−ＶＬＰの発現は、ＡＤＡまたはＩＩＩｂの野生型プロウイルスの発現より高かった（図９）。発現はまた、アカゲザルにおいて細胞傷害性Ｔ細胞（Ｔｃ）応答を首尾よく初回抗原刺激した（Ｋｅｎｔら、１９９８）、以前のＶＬＰ−ワクチン（ｄｐｏｌ）（Ｒｉｃｈｍｏｎｄら、１９９８）より高かった。
【０１０３】
実施例６：安全変異（ｓａｆｅｔｙ ｍｕｔａｔｉｏｎ）
さらなるワクチン開発に好ましい候補としてＡＤＡ−ＶＬＰを特定したら、ヒトにおいて使用するための安全性を高めるために、このプラスミドを変異させた。さらなる変異は、ウイルスＲＮＡのキャプシド形成において活発に働くＮＣのジンクフィンガーを不能にし、ウイルス逆転写酵素およびウイルスプロテアーゼの活性を不活化するように点変異を付加した（図８）。以下の表は安全点変異の位置をまとめている。
【０１０４】

^１アミノ酸の番号は、ＨＩＶ−１ ＢＨ１０配列における個々の遺伝子に対応する。
^２野生型ＨＩＶ−１ ＢＨ１０配列におけるヌクレオチドの番号。
【０１０５】
部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い製造業者のプロトコールに従って、変異を生じさせた。全ての変異を配列決定によって確かめた。変異誘発に使用したプライマー対は以下の通りであった。

【０１０６】
ジンクフィンガー変異およびＲＴ変異を含むＡＤＡ−ＶＬＰは、変異のないＶＬＰプラスミドより効率的にＧａｇおよびＥｎｖを発現することが見出された（図１０）。プロテアーゼ遺伝子を不活化した変異はＶＬＰ発現を著しく低下させ（図１０）、ワクチンプラスミドのさらなる開発に含めなかった。変異のないＡＤＡ−ＶＬＰをＪＳ１と呼び、変異のあるＡＤＡ−ＶＬＰをＪＳ２と呼ぶ。
【０１０７】
実施例７：ＪＳ５ワクチン挿入物の構築
Ｇａｇ、ＲＴ、Ｔａｔ、およびＲｅｖを発現するプラスミドであるＪＳ５挿入物は、ＪＳ２から、ＡＤＡ ＥｎｖのＢｇｌＩＩ断片を欠失させることによって構築された（図８）。この欠失によって、ｐＧＡ２／ＪＳ２配列のｎｔ４９０６〜５４８６配列が除去され、ｅｎｖ遺伝子に未熟停止コドンが生じ、ｔａｔ、ｒｅｖ、およびｖｐｕコード領域、ＲＲＥ、ならびにスプライスアクセプター部位が無傷なままで、Ｅｎｖの８５４アミノ酸のうち２６９アミノ酸が発現される。ｐＧＡ１／ＪＳ５のＤＮＡ配列を図１８に示す。
【０１０８】
実施例８：ＪＳ２およびＪＳ５ワクチンプラスミドのサイズの最小化
ＪＳ２およびＪＳ５ワクチン挿入物は、元々は、ワクチン挿入物上流にＣＭＶＩＥプロモーターの約１ｋｂイントロンＡを含むベクターであるｐＧＡ１において構築された。このイントロンが高レベルのワクチン発現に必要であるかどうかを確かめるために、イントロンＡを欠き、ＪＳ２およびＪＳ５ワクチン挿入物を発現するｐＧＡ２ベクターが構築された。この発現試験において、ｐＧＡ２は、ＪＳ２についてはｐＧＡ１と同じくらい良好な発現パターンを有することが実証された（図１１）。この結果とは対照的に、ｐＧＡ１によるＪＳ５の発現はｐＧＡ２によるＪＳ５の発現より非常に効率的であった（図１１）。ＪＳ５挿入物について、イントロンＡ非存在下での発現はイントロンＡ存在下での発現の１／２〜１／３であった。
【０１０９】
実施例９．ワクチン挿入物ＪＳ２およびＪＳ５における安全変異の効力についての試験
ＲＴにおける３つの点変異（表２）は、ＪＳ２およびＪＳ５の検出可能なレベルの逆転写酵素活性を完全になくした。逆転写産物がＰＣＲによって増幅される非常に感度の高い逆転写酵素アッセイ法を使用した（Ｙａｍａｍｏｔｏ、Ｆｏｌｋｓ、Ｈｅｎｅｉｎｅ、１９９６）。このアッセイ法は、１０個と少ないウイルス粒子中の逆転写酵素を検出することができる。逆転写酵素アッセイ法を、一過的にトランスフェクトされた細胞の培養上清に対して行った。ＪＳ１ワクチンにおいて１０個と少ない粒子（４×１０^−３ｐｇのｐ２４）の逆転写酵素活性が容易に検出されたが、ＪＳ２またはＪＳ５挿入物では検出することができなかった。
【０１１０】
ＪＳ２およびＪＳ５ワクチン挿入物における欠失およびジンクフィンガー変異（表２）は、粒子中のウイルスＲＮＡレベルを少なくとも１／１０００に低下させた。一過的にトランスフェクトされた細胞の上清からペレット化された粒子を、ウイルスＲＮＡのパッケージング効率について試験した。ＶＬＰをＤＮａｓｅで処理し、ＲＮＡを抽出し、ＲＴ ＰＣＲ前にＲＮＡ量をｐ２４レベルによって標準化した。ＲＴ ＰＣＲ反応の後に、ウイルス配列に特異的なプライマーを用いてネスティッドＰＣＲを行った。ＶＬＰ ＲＮＡの終点希釈（ｅｎｄ ｐｏｉｎｔ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）を、野生型ＨＩＶ−１ ＢａｌウイルスにパッケージングされるＲＮＡから得られたシグナルと比較した。
【０１１１】
ＪＳ２およびＪＳ５のパッケージングは両方とも、以下にまとめたようにプラスミドにおける欠失によって１／５００〜１／１０００に制限された。
【０１１２】

【０１１３】
ジンクフィンガー変異は、ＪＳ２粒子のパッケージング効率をさらに１／２０に減少させたが、ＪＳ５粒子のパッケージング効率にさらに影響を及ぼさなかった。このパッケージングパターンは、独立したトランスフェクションにおいて産生された粒子について再現可能であった。
【０１１４】
実施例１０：タンパク質発現のウエスタンブロット分析
図１２Ａ〜Ｄに示すウエスタンブロット分析によって、ｐＧＡ２／ＪＳ２およびｐＧＡ１／ＪＳ５の予想発現パターンが明らかになった。細胞溶解物では未熟タンパク質および成熟タンパク質が両方とも観察されたが、ＶＬＰ含有溶解物では成熟形態のＧａｇおよびＥｎｖしか見出されなかった（図１２Ｂおよび１２Ｃ）。逆転写酵素は細胞溶解物において容易に検出された（図１２Ｄ）。
【０１１５】
実施例１１：ｐＧＡ２／８９．６ ＳＨＩＶベクターの構築
最初の免疫原性試験は、ＨＩＶ−１を発現するワクチンプラスミドではなくＳＨＩＶを発現するＶＬＰを用いて行われた。ＳＨＩＶは、マカクにおいて良好に増殖する、シミアンウイルス配列およびヒト免疫不全症ウイルス配列のハイブリッドである（Ｌｉら、１９９２）。ＳＨＩＶを使用することによって、少なくとも部分的にはＨＩＶ−１起源のワクチンをマカクモデルでの効力について試験することができる。
【０１１６】
ｐＧＡ２／８９．６（ｐＧＡ２／Ｍ２とも呼ばれる）は、ＳＨＩＶ−８９．６に由来する配列を発現する（Ｒｅｉｍａｎｎ、Ｌｉ、Ｖｏｓｓら、１９９６；Ｒｅｉｍａｎｎ、Ｌｉ、Ｖｅａｚｅｙら、１９９６）。８９．６Ｅｎｖは患者分離株である（Ｃｏｌｌｍａｎら、１９９２）。ＳＨＩＶ−８９．６ウイルスは、ワクチン効力の迅速な決定を可能にする高病原性攻撃ストック（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｓｔｏｃｋ）（ＳＨＩＶ−８９．６Ｐと呼ばれる）として利用することができる（Ｒｅｉｍａｎｎ、Ｌｉ、Ｖｏｓｓら、１９９６；Ｒｅｉｍａｎｎ、Ｌｉ、Ｖｅａｚｅｙら、１９９６）。ＳＨＩＶ−８９．６Ｐ攻撃は、直腸内経路および静脈内経路によって投与することができる。ＳＨＩＶ−８９．６およびＳＨＩＶ８９．６Ｐは交差中和抗体を生じない。
【０１１７】
ｐＧＡ２／８９．６（図１３）にはｐＧＡ２／ＪＳ２の設計上の特徴の多くがある。両方とも免疫不全症ウイルスＶＬＰを発現する。ｐＧＡ２／ＪＳ２の場合ではＨＩＶ−１ ＶＬＰであるのに対して、ｐＧＡ２／８９．６により発現されるＶＬＰはＳＨＩＶ ＶＬＰである。ｐＧＡ２／８９．６におけるｇａｇ−ｐｏｌ配列はＳＩＶ２３９に由来するのに対して、ｔａｔ、ｒｅｖ、およびｅｎｖ配列はＨＩＶ−１−８９．６に由来する。ｐＧＡ２／８９．６はまた、インテグラーゼ、ｖｉｆ、およびｖｐｒ配列が欠失されておらず、逆転写酵素遺伝子が点変異によって不活化されていない点でｐＧＡ２／ＪＳ２とは異なる。最後に、ＮＣにおけるジンクフィンガーが、点変異ではなく欠失によって不活化されている。
【０１１８】
Ｇａｇ−Ｐｏｌ−Ｅｎｖを発現するｐＧＡ２／８９．６と共にＧａｇ−Ｐｏｌ発現ベクターの防御効率を評価するために、ｐＧＡ１／Ｇａｇ−Ｐｏｌも構築した。このベクターはｐＧＡ１／ＪＳ５およびｐＧＡ２／８９．６から構築した（図１３）。
【０１１９】
実施例１２：ｐＧＡ２／８９．６ ＳＨＩＶプラスミド発現とｐＧＡ２／ＪＳ２発現の比較
ｐＧＡ２／８９．６およびｐＧＡ１／Ｇａｇ−Ｐｏｌは両方ともｐＧＡ２／ＪＳ２とほぼ同じレベルのＧａｇを発現した。発現の比較研究は、一過的にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞で行った。一過的にトランスフェクトされた細胞の溶解物および上清の分析によって、両プラスミドがほぼ同じレベルのキャプシド抗原を発現することが明らかになった（図１４）。ＨＩＶ−１ ｐ２４およびＳＩＶ ｐ２７の市販の抗原捕獲ＥＬＩＳＡキットを用いて、キャプシドタンパク質を定量した。
【０１２０】
実施例１３：ｐＧＡ２／８９．６ ＳＨＩＶワクチンプロトコール
全身ＤＮＡ初回抗原刺激、それに続く組換えＭＶＡ（ｒＭＶＡ）追加抗原刺激が、ＳＨＩＶ−８９．６Ｐ攻撃株（Ａｍａｒａら、２００１）による粘膜攻撃を防御する能力を調べるために、アカゲザルモデルを使用した。
【０１２１】
ワクチン（ｐＧＡ２／８９．６）のＤＮＡ成分を実施例１１に記載のように作製し、免疫不全症ウイルスのサブゲノムスプライシング機構を用いて一本の転写物から８つの免疫不全症ウイルスタンパク質（ＳＩＶ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｉｆ、Ｖｐｘ、およびＶｐｒ、ならびにＨＩＶ Ｅｎｖ、Ｔａｔ、およびＲｅｖ）を発現させた。ｒＭＶＡ追加抗原刺激（８９．６−ＭＶＡ）はバーナードモス（Ｂｅｒｎａｒｄ Ｍｏｓｓ）博士（ＮＩＨ）によって提供され、ＨＩＶ８９．６ＥｎｖおよびＳＩＶ２３９Ｇａｇ−Ｐｏｌ（それぞれＭＶＡの欠失ＩＩおよび欠失ＩＩＩに挿入）をワクシニアウイルス初期／後期プロモーターの制御下で発現する（ＷｙａｔｔおよびＭｏｓｓ、未発表の結果）。８９．６Ｅｎｖタンパク質はｇｐ４１のＣ末端１１５アミノ酸が切断された。改変Ｈ５プロモーターが両外来遺伝子の発現を制御した。
【０１２２】
このワクチン接種試験は、ＤＮＡワクチンの皮内投与および筋肉内投与、ならびにマカクＧＭ−ＣＳＦ発現プラスミドである遺伝子アジュバントが、ワクチン挿入物により惹起された免疫応答を高める能力を比較した。ワクチン接種は、０週および８週でのＤＮＡによる初回抗原刺激および２４週でのｒＭＶＡによる追加抗原刺激によって行われた。ＧＭ−ＣＳＦ発現プラスミドの同時送達のために、２．５ｍｇ／ｍｌ ｐＧＡ２／８９．６および２．５ｍｇ／ｍｌ ｐＧＭ−ＣＳＦを含む溶液を用いて、１〜１００μｌ皮内接種を行った。
【０１２３】
ＤＮＡの皮内送達および筋肉内送達を、２種類の用量２．５ｍｇおよび２５０μｇのＤＮＡについて比較した。６匹のアカゲザルからなる４つのワクチン群に、針のないジェット式注射装置（Ｂｉｏｊｅｃｔ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ ＯＲ）を用いて、皮内（ｉ．ｄ．）経路または筋肉内（ｉ．ｍ．）経路によって、２．５ｍｇ（高用量）または２５０μｇ（低用量）のＤＮＡのいずれかで初回抗原刺激を行った。８９．６−ＭＶＡ追加免疫化（２×１０^８ｐｆｕ）は、針を用いて皮内および筋肉内に注射した。対照群は、２匹の偽性免疫化動物および２匹の投薬されていない動物を含んだ。ワクチン接種プロトコールを以下のようにまとめた。
【０１２４】

ＶＬＰ ＤＮＡはＮｅｆを除く全てのＳＨＩＶ−８９．６タンパク質を発現し、ＬＴＲが切断され、２番目のＺＮ＋＋フィンガーが細胞表面Ｅｎｖを発現するように変異されている。ｇａｇ−ｐｏｌ ＤＮＡは、ＳＩＶ ｍａｃ ２３９ ｇａｇ−ｐｏｌを発現する。ＭＶＡ ｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖは、８９．６切断ｅｎｖおよびＳＩＶ ｍａｃ ２３９ ｇａｇ−ｐｏｌを発現する。ＭＶＡ ｇａｇ−ｐｏｌは、ＳＩＶ ｍａｃ ２３９ ｇａｇ−ｐｏｌを発現する。ＭＶＡ用量は１×１０^８ｐｆｕである。
【０１２５】
ワクチンが長期免疫を生じたかどうかを試験するために、ｒＭＶＡ追加抗原刺激の７ヶ月後に動物を攻撃した。ほとんどのＨＩＶ−１感染は粘膜表面を横断して伝播されるので、ワクチンが免疫不全症ウイルス粘膜攻撃の蔓延を防ぐことができるかどうかを試験するために、直腸内攻撃を投与した。簡単に述べると、アカゲザルにおける最初のＳＨＩＶ−８９．６Ｐストックの１回の静脈内継代、その後の１回の直腸内継代によって、攻撃ストック（１ｍｌにつき５．７×１０^９コピーのウイルスＲＮＡ）を作製した。リンパ球をウイルス血症ピークで直腸内感染動物から採取し、ＣＤ８を枯渇させ、ストック作製のためにマイトジェンで刺激した。直腸内攻撃前に、絶食させた動物を麻酔し（ケタミン、１０ｍｇ／ｋｇ）、骨盤部位を少し高い位置にして腹這いにした。栄養チューブ［８Ｆｒ（２．７ｍｍ）×１６インチ（４１ｃｍ）、シャーウッドメディカル（Ｓｈｅｒｗｏｏｄ Ｍｅｄｉｃａｌ）、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ］を直腸に１５〜２０ｃｍ挿入した。栄養チューブの挿入後、ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）２ｍｌに２０直腸内感染用量を含む注射器を栄養チューブに取り付け、接種物を直腸にゆっくりと注入した。接種物を送達した後、栄養チューブにウシ胎児血清を含まないＲＰＭＩ ３．０ｍｌを流し、次いで、チューブをゆっくりと引き抜いた。攻撃後１０分間、動物を、骨盤部位を少し高い位置にして同じ位置で固定した。
【０１２６】
実施例１４：ワクチンで惹起されたＴ細胞応答
図１５に示すように、ＤＮＡ初回抗原刺激、それに続くｒＭＶＡ追加抗原刺激によって高頻度のウイルス特異的Ｔ細胞が生じ、これはｒＭＶＡ追加抗原刺激の１週間後にピークに達した。Ｇａｇ−ＣＭ９エピトープを認識するＴ細胞の頻度を、Ｍａｍｕ−Ａ^＊０１−四量体を用いて評価した。ＧａｇおよびＥｎｖ全体にわたるエピトープを認識するＴ細胞の頻度を、重複Ｇａｇペプチドおよび重複Ｅｎｖペプチドのプールならびに酵素結合イムノスポット（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ：ＥＬＩＳＰＯＴ）法を用いて評価した。
【０１２７】
四量体分析のために、約１×１０^６個のＰＢＭＣの表面を、ＣＤ３抗体（ＦＮ−１８、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）、ＣＤ８抗体（ＳＫ１、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）、およびＧａｇ−ＣＭ９（ＣＴＰＹＤＩＮＱＭ）−ＭａｍｕＡ^＊０１四量体抗体（それぞれ、ＦＩＴＣ、ＰｅｒＣＰ、およびＡＰＣに結合）を用いて、１００μｌの体積で８〜１０℃で３０分間、染色した。細胞を、２％ＦＢＳを含む冷ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳに溶解した１％パラホルムアルデヒドで固定し、２４時間以内に、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で分析を行った。細胞を、最初に、前方散乱光および側方散乱光を用いてリンパ球集団にゲーティングし、次いで、ＣＤ３細胞にゲーティングした。次いで、ＣＤ３細胞を、ＣＤ８細胞および四量体結合細胞について分析した。各試料について約１５０，０００個のリンパ球を得た。ＦｌｏＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ）を用いて、データを分析した。
【０１２８】
ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴのために、ＭＵＬＴＩＳＣＲＥＥＮ ９６ウェル濾過プレート （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｉｎｃ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を、２μｇ／ｍｌの濃度で重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）に溶解した抗ヒトＩＦＮ−γ抗体（クローンＢ２７、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で、８〜１０℃で一晩コーティングした。プレートをＲＰＭＩ培地で２回洗浄し、次いで、完全培地（１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ）で３７℃で１時間ブロックした。プレートを何も添加していないＲＰＭＩ培地でもう５回洗浄し、２×１０^４〜５×１０^５細胞／ウェルの数の細胞を完全培地１００μｌに二つ組播種した。ペプチドプールを完全培地に溶解して各ペプチド最終濃度２μｇ／ｍｌ、体積１００μｌで各ウェルに添加した。細胞を、５％ＣＯ_２、３７℃で約３６時間培養した。プレートを洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ）で６回洗浄し、次いで、２％ＦＢＳを含む洗浄緩衝液で希釈した１μｇ／ｍｌビオチン化抗ヒトＩＦＮ−γ抗体（クローン７−８６−１、Ｄｉａｐｈａｒｍａ Ｇｒｏｕｐ Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＯＨ）とインキュベートした。プレートを３７℃で２時間インキュベートし、洗浄緩衝液で６回洗浄した。アビジン−ＨＲＰ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を各ウェルに添加し、３７℃で３０〜６０分間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で６回洗浄し、安定なＤＡＢ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）を基質として用いてスポットを発色させた。立体解剖顕微鏡を用いてスポットを数えた。オボアルブミンペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）を各分析において対照として含めた。オボアルブミンペプチドのバックラウンドスポットは、一般的に、５×１０^５ ＰＢＭＣの場合＜５であった。このバックラウンドは、１×１０^６ ＰＢＭＣについて標準化された場合、＜１０であった。このバックラウンドの２倍（≧２０）のＥＬＩＳＰＯＴ総数だけを有意とみなした。細胞希釈が異なるとフィーダー細胞の非存在下でのスポット形成の効率が異なるので、ＥＬＩＳＰＯＴの頻度は概算値である（３４）。ある特定の時点の全ての動物について同じ細胞希釈を使用したが、記憶応答（ｍｅｍｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）およびピークエフェクター応答（ｐｅａｋ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を検出するために異なる希釈を使用した。
【０１２９】
ワクチン接種群での、追加抗原刺激後のＥＬＩＳＰＯＴ応答と攻撃後のＥＬＩＳＰＯＴ応答の相関関係、記憶ＥＬＩＳＰＯＴ応答と攻撃後のＥＬＩＳＰＯＴ応答の相関関係、およびウイルス負荷（ｖｉｒａｌ ｌｏａｄ）対数とＥＬＩＳＰＯＴ頻度の相関関係を評価するために、単回帰分析を使用した。ウイルス負荷対数およびＥＬＩＳＰＯＴ応答対数を用いた２標本ｔ検定によって、ワクチン群と対照群の比較を行った。２標本ｔ検定を用いて、Ａ^＊０１マカクと非Ａ^＊０１マカクとのＥＬＩＳＰＯＴまたはウイルス負荷対数の比較を行った。ピークＤＮＡ／ＭＶＡ ＥＬＩＳＰＯＴ、記憶ＤＮＡ／ＭＶＡ ＥＬＩＳＰＯＴ、および対数変換されたＧａｇ抗体データに及ぼす用量および投与経路の影響を調べるために、二元配置の分散分析を使用した。
【０１３０】
Ｇａｇ−ＣＭ９四量体分析は、Ｍａｍｕ−Ａ^＊０１組織適合型を発現するマカクに制限されたが、ＥＬＩＳＰＯＴ応答は特定の組織適合型に依存しなかった。Ｔ細胞応答の急性（エフェクター細胞ピーク）期および長期（記憶）期の両方をスコア付けるために、時間Ｔ細胞アッセイ法を設計した（図１５Ａ）。予想通り、ＤＮＡ免疫化によって低レベルの記憶細胞が惹起され、これはｒＭＶＡ追加抗原刺激の１週間以内に高頻度まで増殖した（図１５）。Ｍａｍｕ−Ａ^＊０１マカクにおいて、Ｇａｇ−ＣＭ９エピトープ特異的細胞は、総ＣＤ８ Ｔ細胞の１９％という高い頻度まで増殖した（図１５Ｂの動物２を参照のこと）。この特異的細胞ピークは、ＤＮＡ／ＭＶＡ記憶プールに１／１０以下に縮小した（図１５ＡおよびＢ）。Ｇａｇペプチドの３つのプールのＥＬＩＳＰＯＴもまた、ＤＮＡ／ＭＶＡ記憶応答に縮小する前に大幅に増大した（１×１０^６ ＰＢＭＣの場合４０００スポットまでの頻度）（図１５Ｃ）。ＥＬＩＳＰＯＴの頻度は、Ａ^＊０１組織適合型のあるマカクおよびＡ^＊０１組織適合型のないマカクにおいて同じであった（Ｐ＞０．２）。ワクチン応答のピーク期および記憶期の両方で、異なるワクチン群におけるＥＬＩＳＰＯＴの高さ（ｈｅｉｇｈｔ）の順序は、２．５ｍｇ皮内＞２．５ｍｇ筋肉内＞２５０μｇ皮内＞２５０μｇ筋肉内であった（図１５Ｃ）。ＩＦＮ−γ−ＥＬＩＳＰＯＴはＣＤ４細胞およびＣＤ８細胞の両方を含んだ（進行中の研究）。ペプチドによる再刺激後の、Ｇａｇ−ＣＭ９特異的ＣＤ８細胞の溶解活性は良好であった（データ示さず）。
【０１３１】
印象的なことに、非近交動物集団において、ＧａｇおよびＥｎｖ全体にわたるペプチドのプールがＩＦＮ−γ−ＥＬＩＳＰＯＴを刺激した（図１６Ａ）。ワクチンで惹起されたＴ細胞が記憶期にある時期であるｒＭＶＡ追加抗原刺激の２５週間後に、細胞応答の幅を試験した。Ｇａｇペプチドの７プールのうち７つ、およびＥｎｖペプチドの２１プールのうち１６がワクチン接種動物のＴ細胞によって認識された。認識されなかった５つのＥｎｖプールのうち２つは、米国疾病管理センターでのマカクＤＮＡ／ＭＶＡワクチン試験において認識されている（データ示さず）。残りの３つ（プール１９〜２１）は本発明者らの免疫原において切断されており（Ａｍａｒａら、２００１、提出済み）、負の対照とした。ＧａｇおよびＥｎｖ ＥＬＩＳＰＯＴの頻度は、ＤＮＡ／ＭＶＡ記憶応答において全般的にほぼ同じであった（図１６Ｂ）。最大の応答幅は高用量皮内ＤＮＡ初回抗原で刺激された動物の幅であり、平均して１０のペプチドプール（４．５ Ｇａｇおよび５．３ Ｅｎｖ）が認識された。幅についてのワクチン群の順序はピークＤＮＡ／ＭＶＡ応答と同じであった：２．５ｍｇ皮内＞２．５ｍｇ筋肉内＞２５０μｇ皮内＞２５０μｇ筋肉内（図１６Ｂ）。
【０１３２】
実施例１５：ＡＩＤＳの攻撃およびＡＩＤＳに対する防御
ワクチンで惹起されたＴ細胞が記憶期にあるｒＭＶＡ追加抗原刺激の７ヶ月後に、高病原性ＳＨＩＶ−８９．６Ｐ攻撃を直腸内に投与した（図１５）。
【０１３３】
ＳＨＩＶコピー数の決定：
ＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＡＣＤで血液凝固阻止された血漿１５０μｌからウイルスＲＮＡを直接抽出し、ＡＶＥ緩衝液６０μｌに溶出し、ＳＨＩＶ ＲＮＡ定量を行うまで−８０℃で凍結させた。５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、４ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ各ｄＮＴＰ、２．５μＭランダムヘキサマー、２０単位ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ ＲＴ、および８単位ＲＮａｓｅ阻害剤を含む最終体積２０μｌ中で、精製血漿ＲＮＡ ５μｌを逆転写した。反応物を２５℃で１０分間インキュベートし、続いて、４２℃で２０分間インキュベートし、逆転写酵素を９９℃で５分間不活化させた。５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、４ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．４ｍＭ各ｄＮＴＰ、０．２μＭフォワードプライマー、０．２μＭリバースプライマー、０．１μＭプローブ、および５単位ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼを含む最終体積５０μｌに、反応混合物を調節した（全ての試薬はパーキンエルマーアプライドバイオシステムズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡから入手した）。ＳＩＶ ｇａｇ遺伝子の保存部分内のプライマー配列は以前に述べられたものと同じである（Ｓｔａｐｒａｎｓ，Ｓ．ら、１９９６）。
【０１３４】
パーキンエルマーアプライドバイオシステムズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）７７００配列検出システム（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）を、ＰＣＲプロフィール：９５℃１０分、続いて９３℃３０秒、５９．５℃１分の４０サイクルと共に使用した。７７００配列検出器および内部保存ｇａｇ遺伝子配列に対するプローブを用いて、ＰＣＲ産物の蓄積をモニターした。ここで、ＦＡＭおよびＴａｍｒａはレポーター色素およびクエンチャー色素を示す。ＳＩＶ ｂＤＮＡ法（Ｂａｙｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）により定量されたビリオン由来ＳＩＶｍａｃ２３９ ＲＮＡからなる外部標準曲線との比較によって、ＳＨＩＶ ＲＮＡコピー数を決定した。全ての標本を抽出し、二つ組増幅し、平均結果を記録した。０．１５ｍｌの血漿投入量で、アッセイ法の感度は１０^３コピーＲＮＡ／ｍｌ血漿であり、線形動的範囲は１０^３〜１０^８ ＲＮＡコピーである（Ｒ^２＝０．９９５）。アッセイ内変導係数（ｉｎｔｒａ−ａｓｓａｙ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）は、＞１０^４ ＳＨＩＶ ＲＮＡコピー／ｍｌを含む試料については＜２０％であり、１０^３〜１０^４ ＳＨＩＶ ＲＮＡコピー／ｍｌを含む試料については＜２５％である。１６週目および２０週目のワクチン接種動物における少ないＳＨＩＶ ＲＮＡコピー数をより正確に定量するために、ＳＨＩＶ ＲＮＡアッセイ法の感度を高める以下の変更を行った：１）≦１ｍｌの血漿からのビリオンを２３，０００ｇ、１０℃で１５０分間の遠心分離によって濃縮し、ウイルスＲＮＡを抽出した；２）一段階ＲＴ−ＰＣＲ法を使用した。ＳＨＩＶ ＲＮＡコピーの絶対数を同じＳＩＶｍａｃ２３９標準との比較によって決定した。これらの変更によって、３００コピーＳＨＩＶ ＲＮＡ／ｍｌの信頼性の高い定量限界、および最初の使用した方法により得られた値と非常に相関するＳＨＩＶ ＲＮＡ値が得られた（ｒ＝０．９１、ｐ＜０．０００１）。
【０１３５】
攻撃結果：
攻撃は、ワクチン接種動物および対照動物の全てに感染した。しかしながら、攻撃２週間後までに、ワクチン群の血漿ウイルスＲＮＡ力価（幾何平均１×１０^７〜５×１０^７）は、対照動物（幾何平均４×１０^８）の少なくとも１／１０であった（図１９Ａ）。攻撃８週間後までに、高用量ＤＮＡ初回抗原刺激群および低用量皮内ＤＮＡ初回抗原刺激群は両方とも、負荷の幾何平均を約１０００コピーウイルスＲＮＡ／ｍｌまで減らした。この時、低用量筋肉内ＤＮＡ初回抗原刺激群のウイルスＲＮＡコピーの幾何平均は６×１０^３であり、非ワクチン接種対照の幾何平均は２×１０^６であった。攻撃２０週間後までに、低用量筋肉内群でさえもウイルスＲＮＡコピーの幾何平均を１０００まで減らした。この時、非ワクチン接種対照はＡＩＤＳで死につつあった。２４匹のワクチン接種動物のうち、低用量筋肉内群の１匹の動物でしか断続的ウイルス負荷が１×１０^４コピー／ｍｌを上回らなかった（図１９Ｄ）。
【０１３６】
ウイルス負荷の急速な減少が、ワクチン接種されたマカクをＣＤ４細胞喪失および急速なＡＩＤＳ発症から守った（図１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｅ）。攻撃５週間後までに、非ワクチン接種対照の全てが、ＳＨＩＶ−８９．６Ｐ感染の特徴である完全なＣＤ４細胞枯渇をこうむった（図１９Ｂ）。ＣＤ４がゆっくりと減少した（図１９Ｅ）、動物２２（前記を参照のこと）を除くワクチン接種動物の全てがＣＤ４細胞を維持した。攻撃２３週間後までに、４匹の対照動物のうち３匹がＡＩＤＳで死んだ（図１９Ｃ）。これらの動物には、様々な程度の、下痢を伴う全腸炎、クリプトスポリジウム症、大腸菌性膀胱炎、腸内カンピロバクター感染、巨脾腫（ｓｐｅｎｏｍｅｇａｌｙ）、リンパ節症、およびＳＩＶ関連巨細胞性肺炎があった。対照的に、２４匹全てのワクチン接種動物が健康を保った。
【０１３７】
細胞内サイトカインアッセイ法：
５ｍｌポリプロピレンチューブ内で、０．１％ＢＳＡならびに抗ヒトＣＤ２８および抗ヒトＣＤ４９ｄ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）補助刺激抗体（１μｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ １００μｌの体積中、１００μｇ／ｍｌのＧａｇ−ＣＭ９ペプチド（ＣＴＰＹＤＩＮＱＭ）を用いて、約１×１０^６ ＰＢＭＣを３７℃で１時間刺激した。１０％ＦＢＳおよびモネンジン（１０μｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ ９００μｌを添加し、細胞を、５％ＣＯ_２下、５度の角度で、３７℃でさらに５時間培養した。細胞の表面を、ＰｅｒＣＰ結合ＣＤ８抗体（クローンＳＫ１、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて８℃〜１０℃で３０分間染色し、２％ＦＢＳを含む冷ＰＢＳで２回洗浄し、固定し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ Ｉｎｃ．）で浸透性を高めた。次いで、細胞を、Ｐｅｒｍ洗浄溶液（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に溶解したヒトＣＤ３抗体（クローンＦＮ−１８、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）およびＩＦＮ−γ抗体（クローンＢ２７、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）（それぞれ、ＦＩＴＣおよびＰＥに結合）と４℃で３０分間インキュベートした。細胞を、Ｐｅｒｍ洗浄溶液で２回、何も添加していないＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳに溶解した１％パラホルムアルデヒドに再懸濁した。ＦＡＣＳｃａｌｉｂｅｒで約１５０，０００個のリンパ球を得、ＦｌｏＪｏソフトウェアを用いて分析した。
【０１３８】
増殖アッセイ法：
約２０万個のＰＢＭＣを、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩに溶解して体積２００μｌで適切な抗原を用いて、５％ＣＯ_２下、３７℃で５日間、三つ組刺激した。ＳＨＩＶ−８９．６ ＧａｇおよびＰｏｌまたはＳＨＩＶ−８９．６ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびＥｎｖのいずれかを発現するＤＮＡでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞からの上清を、抗原として直接使用した。偽性ＤＮＡ（ベクターのみ）でトランスフェクトされた細胞からの上清は、負の対照とした。６日目に、細胞を、ウェル１個につき１μＣｉのトリチウム化チミジンで１６〜２０時間パルス標識した。細胞を、自動セルハーベスター（ＴＯＭＴＥＣ、Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ ９６，Ｍｏｄｅｌ １０１０、Ｈａｍｄｅｎ、ＣＴ）を用いて採取し、Ｗａｌｌａｃ １４５０ ＭＩＣＲＯＢＥＴＡシンチレーションカウンター（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて計測した。刺激指数は、８９．６抗原で刺激されたＰＢＭＣに取り込まれたトリチウム化チミジンの総数／偽性抗原で刺激された同じＰＢＭＣに取り込まれたトリチウム化チミジンの総数である。
【０１３９】
攻撃後Ｔ細胞結果：
ウイルス攻撃の封じ込めは、抗ウイルスＴ細胞の爆発と関連していた（図１５；図２０Ａ）。攻撃１週間後に、末梢血中の四量体＋細胞の頻度は減少した。これは、もしかすると、感染部位への特異的Ｔ細胞の動員を反映しているのかもしれない（図２０Ａ）。しかしながら、攻撃２週間後までに、末梢血中の四量体＋細胞は、ＭＶＡ追加抗原刺激後と同じくらいの頻度またはそれより高い頻度まで急速に増殖した（図１５、２０Ａ）。四量体＋細胞の大部分は、ペプチドＧａｇ−ＣＭ９による６時間の刺激に応答してＩＦＮ−γを産生し（図２０Ｂ）、慢性ウイルス感染において時々観察される「静かな（ｓｔｕｎｎｅｄ）」ＩＦＮ−γの負の表現型を有さなかった。攻撃後のＴ細胞の爆発はウイルス負荷の低下を伴った。攻撃１２週間後までに、ウイルス特異的Ｔ細胞はピーク高さの約１／１０であった（図１５Ａ、２０Ａ、およびデータ示さず）。ピークＤＮＡ／ＭＶＡ誘導ＥＬＩＳＰＯＴの高さは、ＥＬＩＳＰＯＴにより測定された攻撃後Ｔ細胞応答の高さの前兆となった（ｒ＝＋０．７９、Ｐ＜０．０００１）。ワクチン接種動物における勢いのある二次応答とは対照的に、投薬されていない動物は弱い一次応答を展開した（図１５Ｂ、１５Ｃ、および２０Ａ）。四量体＋細胞は総ＣＤ８細胞の１％未満でピークに達し（図２０Ａ）、ワクチン群での１０００〜６０００の非常に高い頻度とは対照的に、ＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞は約３００の平均頻度で存在した（図１５Ｃ）（Ｐ＜０．０５）。対照群での四量体＋細胞は、ワクチン群での四量体＋細胞と同様に、Ｇａｇ−ＣＭ９ペプチドによる刺激後に主にＩＦＮ−γを産生する（図２０Ｂ）。攻撃１２週間後までに、４匹の対照のうち３匹のＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞は検出不可能なレベルであった（データ示さず）。高ウイルス負荷の存在下での抗ウイルスＣＤ８細胞のこの急速な喪失は、ＣＤ４の助けが無いことを反映しているもかもしれない。
【０１４０】
Ｔ細胞増殖応答によって、ウイルス特異的ＣＤ４細胞は攻撃から生き残り、抗ウイルス免疫応答を支援できることが証明された（図２０Ｃ）。攻撃１２週間後で、Ｇａｇ−Ｐｏｌ−ＥｎｖまたはＧａｇ−Ｐｏｌタンパク質の平均刺激指数はワクチン群において３５〜１４であったが、対照群では検出することができなかった。増殖アッセイ法と一致して、細胞内サイトカインアッセイ法によって、ワクチン接種動物にはウイルス特異的ＣＤ４細胞が存在するが、対照動物には存在しないことが証明された（データ示さず）。増殖応答の大きさについてのワクチン群の全体的な順序は、２．５ｍｇ皮内＞２．５ｍｇ筋肉内＞２５０μｇ皮内＞２５０μｇ筋肉内であった。
【０１４１】
リンパ節の保存：
攻撃１２週間後で、ワクチン接種動物からのリンパ節は形態学的に完全な状態のままであり、感染に応答していたが、感染した対照からのリンパ節は機能が破壊されていた（図５）。ワクチン接種動物からのリンパ節は、拡大した胚中心ならびに不連続な暗い区域および明るい区域のある多数の反応性二次濾胞を含んだ（図５Ａ）。対照的に、ワクチン接種されていない対照動物からのリンパ節は濾胞および傍皮質の喪失を示したのに対して（図５Ｂ）、ワクチン接種されておらず、攻撃されていない動物からのリンパ節は、正常な数の最小限に反応性の胚中心を示した（図５Ｃ）。胚中心は、感染対照ではリンパ節総面積の＜０．０５％、非感染対照ではリンパ節面積の２％、ワクチン接種群ではリンパ節面積の１８％までを占めた（図５Ｄ）。低用量ＤＮＡ初回抗原刺激を与えた動物の胚中心が占めるリンパ節面積は、高用量ＤＮＡ初回抗原刺激を与えた動物の約２倍であった。このことは、低用量動物における勢いのある免疫反応性を示唆している（図５Ｄ）。攻撃１２週間後での、ウイルスＲＮＡのインサイチューハイブリダイゼーションによって、２４匹のワクチン接種マカクのうち３匹からのリンパ節において、ウイルスを発現する細胞は極めて少ないことが明らかになったが、各感染対照動物からのリンパ節において、ウイルスを発現する細胞は容易に検出された（図５Ｅ）。ＣＤ４ Ｔ細胞が完全に枯渇した対照において、感染リンパ節細胞の細胞形態はマクロファージの表現型と一致した（データ示さず）。
【０１４２】
時間的抗体応答：
総抗Ｇａｇ抗体に対するＥＬＩＳＡは、ウェルをコーティングするために細菌産生ＳＩＶ ｇａｇ ｐ２７（２μｇ／ｍｌ、重炭酸緩衝液に溶解）を使用した。抗Ｅｎｖ抗体に対するＥＬＩＳＡは、一過的にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞において産生された８９．６ Ｅｎｖ（ヒツジＥｎｖ抗体（カタログ番号６２０５；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｆａｉｒｂｒｏｏｋ ＣＡ）を用いて捕獲された）を使用した。ＳＨＩＶ−８９．６感染マカクからの血清と既知量の抗Ｇａｇまたは抗Ｅｎｖ ＩｇＧを用いて、ＧａｇおよびＥｎｖ ＥＬＩＳＡの標準曲線を作製した。ヤギ抗マカクＩｇＧ−ＰＯ（カタログ番号ＹＮＧＭＯＩＧＧＦＣＰ、Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ）およびＴＭＢ基質（カタログ番号Ｔ３４０５、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて、結合抗体を検出した。血清を、二つ組のウェルにおいて３倍希釈でアッセイした。試験血清の希釈を、乳清緩衝液（１×ＰＢＳに溶解した４％乳清および０．１％ｔｗｅｅｎ２０）に溶解して行った。ブロッキング緩衝液は、乳清緩衝液＋０．５％脱脂粉乳からなった。反応を２Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４で止め、光学密度を４５０ｎｍで読み取った。ＳＯＦＴｍａｘ２．３ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて、標準曲線をフィットさせ、試料濃度をμｇ抗体／ｍｌ血清として挿入した。
【０１４３】
結果は、初回抗原刺激／追加抗原刺激ストラテジーが低レベルの抗Ｇａｇ抗体および検出不可能なレベルの抗Ｅｎｖ抗体を惹起したことを示した（図２２）。しかしながら、攻撃後、Ｅｎｖ抗体およびＧａｇ抗体は両方とも既往反応を受け、総Ｇａｇ抗体は１ｍｇ／ｍｌに近い高さに達し、総Ｅｎｖ抗体は１００μｇ／ｍｌまでの高さに達した（図２２ＡおよびＢ）。
【０１４４】
攻撃２週間後までに、高用量ＤＮＡ初回抗原刺激群において、８９．６免疫原に対する中和抗体は存在したが、ＳＨＩＶ−８９．６Ｐ攻撃に対する中和抗体は存在しなかった（幾何平均力価は皮内群では３５２、筋肉内群では３０３）（図２２Ｃ）。攻撃５週間後までに、８９．６Ｐに対する中和抗体が生じ（幾何平均力価は高用量皮内群では２００、高用量筋肉内群では１２６）（図２２Ｄ）、８９．６に対する中和抗体は低下し始めた。従って、８９．６に対する抗体応答の初回抗原刺激は、ＳＨＩＶ−８９．６Ｐに対する中和抗体につながるＢ細胞応答を妨げなかった。攻撃１６〜２０週間後までに、Ｇａｇ抗体およびＥｎｖ抗体はほとんどの動物において減少した（図２２ＡおよびＢ）。これは、ウイルス感染の蔓延の阻止と一致した。
【０１４５】
Ｔ細胞は防御と相関関係にある
攻撃２週間後および３週間後の血漿ウイルスＲＮＡレベルは、ＤＮＡ／ＭＶＡ惹起ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴのピーク攻撃前頻度と逆の相関関係にあった（それぞれ、ｒ＝−０．５３、Ｐ＝０．００８、およびｒ＝−０．７０、Ｐ＝０．０００２）（図２３Ａ）。
【０１４６】
重要なことに、これらの相関関係は、免疫応答がウイルス血症レベルを活発に下げていた間に観察された。攻撃後の後の時間で、検出レベルまたは検出レベル未満のウイルス負荷のクラスタリングは相関関係を排除した。ウイルス負荷と、攻撃後ＥＬＩＳＰＯＴ、増殖応答、および中和抗体応答との相関関係も求めた。攻撃２週間後のＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴレベルは、攻撃３週間後のウイルス負荷と相関関係にあった（ｒ＝−０．５１、Ｐ＝０．００９）（データ示さず）。攻撃後の増殖応答と中和抗体応答はウイルス負荷と相関関係になかった。
【０１４７】
用量および経路
ＤＮＡの用量は、細胞性応答および体液性応答に有意な影響を及ぼしたのに対して（Ｐ＜０．０５）、ＤＮＡの投与経路は体液性応答にだけ有意な影響を及ぼした（図２３Ｃ〜Ｅ）。ＤＮＡ送達の皮内経路は筋肉内経路よりＧａｇ抗体産生に約１０倍効果があった（Ｐ＝０．０２）（図２３Ｅ）。本発明者らのデータセット内で、皮内ＤＮＡ注射は、ウイルス特異的Ｔ細胞の高さおよび幅の初回抗原刺激に約３倍効果があった（図２３ＣおよびＤ）。しかしながら、これらの差異は有意ではなかった（高さ、Ｐ＝０．２；幅、Ｐ＝０．０８）。興味深いことに、ＤＮＡの経路および用量は防御の程度に有意な影響を及ぼさなかった。攻撃２０週間後の、高用量ＤＮＡ初回抗原刺激動物のウイルスＲＮＡレベルの幾何平均（７×１０^２および５×１０^２）は、低用量ＤＮＡ初回抗原刺激動物（９×１０^２および１×１０^３）よりわずかに少なかった。最も高い断続的ウイルス負荷を有する動物（マカク２２）が低用量筋肉内初回抗原刺激群にあった（図１９Ｄ）。従って、ウイルス血症の蔓延を防ぐのが遅かった（図１９Ａ）、低用量筋肉内初回抗原刺激群は、十分な長期防御を示さない可能性がある。この応答の幅は、ウイルス負荷の封じ込めに対して速やかな効果がなかったが、時間と共にウイルス回避の頻度に影響を及ぼすかもしれない。
【０１４８】
これらの結果は、多タンパク質ＤＮＡ／ＭＶＡワクチンが、非常に毒性のある免疫不全症ウイルス粘膜攻撃の蔓延を防ぐことができる記憶免疫応答を惹起できることをはっきりと証明している。本発明者らの、優れたウイルス蔓延防止レベルは、ＤＮＡまたはｒＭＶＡワクチンだけを用いて達成されたもの（Ｅｇａｎら、２０００；Ｉ．Ｏｕｒｍａｎｏｖら、２０００）より好ましく、アジュバントとしてインターロイキン−２を使用したＤＮＡ免疫化で得られたもの（Ｂａｒｏｕｃｈら、２０００）に匹敵する。これらの以前の研究の全てが３回を超えるワクチン接種を使用し、誰も粘膜攻撃を使用しておらず、ほとんどがピークエフェクター応答で攻撃し、本発明者らの研究でなされたように「長期」効力を試験するためにワクチン接種後長い期間をとらなかった。本発明者らの結果はまた、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴによって測定された、ワクチンで惹起されたＴ細胞がウイルス血症の蔓延の防止と相関することを初めて証明している。今や、この比較的簡単なアッセイ法は、ＨＩＶ−１のＤＮＡおよびＭＶＡ免疫原の前臨床評価に使用することができ、ヒトにおける臨床試験の効力のマーカーとして使用できるはずである。
【０１４９】
ＤＮＡ／ＭＶＡワクチンは感染を阻止しなかった。正しくは、このワクチンは感染の蔓延を妨げ、ウイルス負荷を血液１ｍｌにつき１０００コピーのウイルスＲＮＡ近くまでまたはそれ未満に急速に減少させた。感染の阻止ではなく封じ込めは、ウイルスに慢性感染を確立する機会を与える（Ｃｈｕｎら、１９９８）。それにもかかわらず、多タンパク質ＤＮＡ／ＭＶＡワクチンは、急速にウイルス負荷を減らすことによって長期間進行しない可能性を広げ、ＨＩＶ蔓延を制限する。
【０１５０】
実施例１６：Ｇａｇ−Ｐｏｌワクチン試験
ワクチンにＥｎｖを含める重要性を確かめるために、Ｇａｇ−Ｐｏｌ−ＥｎｖではなくＧａｇ−Ｐｏｌを発現する免疫原を用いた試験を行った（構築物については図２７を参照のこと）。Ｅｎｖを含まなかったワクチンには、この分野においてある利点（例えば、感染マーカーとして抗Ｅｎｖ抗体をスクリーニングできること）があった。この試験は、ｐＧＡ１／Ｇａｇ−Ｐｏｌおよびバーナードモス博士 （ＮＩＨ−ＮＩＡＩＤ）により提供されたＳＩＶ２３９のＧａｇ−Ｐｏｌ配列を発現するｒＭＶＡ（ＭＶＡ／Ｇａｇ−Ｐｏｌ）を使用した。
【０１５１】
「Ｇａｇ−Ｐｏｌ」免疫原は、「Ｇａｇ−Ｐｏｌ−Ｅｎｖ」（ｐＧＡ２／８９．６ＭＶＡ／８９．６）免疫原について前記実施例１３に記載したスケジュールを用いて投与した（表４、群５および群６を参照のこと）。高用量群および低用量群を初回抗原刺激するために同じＤＮＡ用量２．５ｍｇおよび２５０μｇを使用し、皮内経路によって投与を行った。実施例１３〜１５に記載の前記ワクチン試験と同様に、２〜３匹のｍａｍｕ Ａ^＊０１マカクを各試験群に含めた。ｐ１１ｃ−ｍ四量体を用いて、および前記実施例に記載のように重複ペプチドプールによって刺激されたＥＬＩＳＰＯＴを用いて、ｐ１１ｃ−ｍエピトープに特異的なＴ細胞応答についてＴ細胞応答を追跡した。
【０１５２】
免疫化後、ワクチンレシピエントは、Ｇａｇ−Ｐｏｌ−Ｅｎｖワクチン試験で観察されたものと同様の抗Ｇａｇ Ｔ細胞応答を示した。ｒＭＶＡ追加抗原刺激の７．５ヵ月後に、動物の直腸内をＳＨＩＶ−８９．６Ｐで攻撃した（図２８）。急速なＣＤ４細胞喪失から動物を守ったＧａｇ−Ｐｏｌ−Ｅｎｖワクチンプロトコールとは対照的に、Ｇａｇ−Ｐｏｌ動物は一様にＣＤ４細胞を喪失した（図２８Ｂおよび２８Ｄ）。この喪失は、低用量皮内ＤＮＡ初回抗原刺激を与えた群において最も顕著であった。ＣＤ４細胞喪失と一致して、Ｇａｇ−Ｐｏｌ ＤＮＡ免疫化群はまた、Ｇａｇ−Ｐｏｌ−Ｅｎｖ群よりウイルス負荷の低下に効果がなかった（図２８Ａおよび２８Ｃ）。これらの群の幾何平均ウイルス負荷は攻撃３週間後で１０〜１００倍多く、攻撃５週間後で１０倍多かった。これらの結果は、Ｅｎｖ遺伝子が、攻撃された動物においてＣＤ４細胞防御およびウイルスＲＮＡレベル低下に重要な役割を果たしていることを証明している。これらの結果はまた、Ｇａｇ−Ｐｏｌ−Ｅｎｖ ＤＮＡ／ＭＶＡワクチンが、有害な攻撃からのレシピエントの防御においてＧａｇ−Ｐｏｌ ＤＮＡ／ＭＶＡワクチンより効果的に機能することを示している。
【０１５３】
実施例１７：麻疹挿入物
ワクチン接種によってより早くかつ効率的な抗Ｈ抗体応答が得られるかどうかを確かめるために、麻疹Ｈおよび補体成分Ｃ３ｄの融合を発現するＤＮＡワクチンを使用した。デムプセイ（Ｄｅｍｐｓｅｙ）らによるマウスでの以前の研究において、２または３コピーのＣ３ｄとモデル抗原であるニワトリ卵白リゾチームとの融合は、免疫化効率を１０００倍を超えて増大させた（Ｄｅｍｐｓｅｙら、１９９６）。これは、血球凝集素阻害（ＨＩ）活性および防御免疫の急速な出現をもたらした（Ｒｏｓｓら、２０００およびＲｏｓｓら、２００１）。
【０１５４】
ヒト免疫系において、補体活性化の１つの結果は、活性化タンパク質への第３補体タンパク質Ｃ３ｄ断片の共有結合である。次に、Ｃ３ｄは、Ｂリンパ球活性化を増幅するＢ細胞刺激機能を有する分子である、Ｂリンパ球上のＣＤ２１に結合する。麻疹Ｈ−Ｃ３ｄ融合タンパク質において、融合のＨ部分は、Ｂ細胞上の抗Ｈ Ｉｇ受容体に結合し、このＢ細胞受容体を介してシグナルを発するのに対して、融合のＣ３ｄ部分はＣＤ２１に結合し、ＣＤ１９を介してシグナルを発すると考えられる。この仮説において、Ｈ−Ｃ３ｄ融合タンパク質に応答するＢ細胞は、Ｈのみに応答するＢ細胞より効果的なシグナリングを受けると考えられる。分泌型Ｈと３コピーのＣ３ｄとの融合（ｓＨ−３Ｃ３ｄ）を発現するＤＮＡでワクチン接種されたマウスは、ｓＨのみを発現するＤＮＡより中和抗体活性の急速な出現および高いレベルを生じた。
【０１５５】
プラスミドＤＮＡ：
真核生物挿入物転写開始のための２コピーのサイトメガロウイルス即時初期プロモーター（ＣＭＶ−ＩＥ）＋イントロンＡ（ＩＡ）、および転写終結のためのウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ＢＧＨポリＡ）を含むように、ｐＴＲ６００真核生物発現ベクターを構築した。このベクターは、遺伝子セグメントの簡単な挿入のためのマルチクローニングサイト、原核生物複製のためのＣｏｌＥ１複製起点、および抗生物質培地での選択のためのカナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎ^ｒ）を含む（図２９Ａ）。
【０１５６】
エドモントン（Ｅｄｍｏｎｔｏｎ）株に由来する血球凝集素（Ｈ）ｃＤＮＡ配列およびＣ３ｄ配列を以前に述べられたようにクローニングし、固有の制限エンドヌクレアーゼ部位を用いてｐＴＲ６００ワクチンベクターに導入した（図２９Ｂ）。Ｈの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠失させることによって、分泌型を作製した。これは、組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔｐＡ）リーダー配列のＮ末端合成模倣物とインフレームでＨ遺伝子の断片をクローニングするためにＰＣＲを用いて達成された（Ｔｏｒｒｅｓら、２０００）。
【０１５７】
ｓＨ−Ｃ３ｄ融合タンパク質を発現するベクターは、以前に述べられたように、ｓＨ遺伝子３’末端とインフレームでマウスＣ３ｄホモログの３つの縦列反復をクローニングすることによって作製された（Ｄｅｍｐｓｅｙ、１９９６；Ｒｏｓｓら、２０００；およびＲｏｓｓら、２００１）。構築物設計はデムプセイ（Ｄｅｍｐｓｅｙ）らに基づいており、ｐＳＬＧ−Ｃ３ｄからの配列を使用した。４個のグリシンおよび１個のセリンの２回の反復｛（Ｇ_４Ｓ）_２｝からなるリンカーは、ＨおよびＣ３ｄの接合部で、および各Ｃ３ｄ反復間で融合された。Ｃ３ｄ接合部ならびにｓＨおよびＣ３ｄの接合部の間の潜在的なタンパク質分解切断部位は、ＡｒｇコドンをＧｌｙコドンに変異させるＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩ融合を用いることによって変異された。
【０１５８】
プラスミドを大腸菌ＤＨ５α株において増幅し、陰イオン交換樹脂カラム（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて精製し、ｄＨ_２Ｏに溶解して−２０℃で保存した。適切な制限酵素消化およびゲル電気泳動によってプラスミドを確かめた。２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでの光学密度を読み取ることによって、ＤＮＡ調製物の純度を測定した。
【０１５９】
マウスおよびＤＮＡ免疫化：
接種のために、６〜８週齡のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使用した。簡単に述べると、ケタミンＨＣｌ ５ｍｌ（１００ｍｇ／ｍｌ）およびキシラジン１ｍｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）の混合物０．０３〜０．０４ｍｌを用いて、マウスに麻酔をかけた。マウスを、４００ｐｓｉのヘリウム圧設定で、約１μｍ金ビーズ（ＤｅＧｕｓｓａ−Ｈｕｌｓ Ｃｏｒｐ．、Ｒｉｄｇｅｆｉｅｌｄ Ｐａｒｋ、ＮＪ）０．５ｍｇにつき０．５μｇのＤＮＡを含む２遺伝子銃量を用いて免疫化した。
【０１６０】
トランスフェクションおよび発現分析：
ヒト胎児腎臓細胞２９３Ｔ株（５×１０^５細胞／トランスフェクション）を、製造業者のガイドライン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）に従って、１２％リポフェクタミンを用いてＤＮＡ ２μｇでトランスフェクトした。上清を収集し、−２０℃で保存した。以前に述べられたように（Ｃａｒｄｏｓｏら、１９９８）、Ｈに対する定量抗原捕獲ＥＬＩＳＡを行った。
【０１６１】
ウエスタンハイブリダイゼーション分析のために、上清または細胞溶解物１５μｌを、ＳＤＳ試料緩衝液 （Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で１：２に希釈し、１０％ポリアクリルアミド／ＳＤＳゲルにロードした。分離したタンパク質をニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に移し、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０および１％脱脂粉乳を含むＰＢＳで１：１０００に希釈したポリクローナルウサギ抗ＨＡ抗血清とインキュベートした。徹底的な洗浄の後、１：２０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗血清および化学発光増幅法（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を用いて、結合したウサギ抗体を検出した。
【０１６２】
抗体アッセイ法：
抗Ｈ特異的ＩｇＧレベルと評価するために、定量ＥＬＩＳＡを行った。簡単に述べると、ＭＶのＨタンパク質を構成的に発現するＬｔｋ⁻細胞（２４）を９６ウェルプレート内で増殖させた。抗血清希釈を、Ｈ抗原を発現する無傷の細胞とインキュベートした。抗Ｈ抗体を細胞に３０分間結合させ、その後、細胞をアセトン（８０％）で固定した。ビオチン化抗マウスＩｇＧ抗体およびストレプトアビジン−ホスファターゼ（アルカリ性）システム（Ｓｉｇｍａ）を用いて、特異的抗体応答を検出した。このシステムを標準化するために、Ｈ抗原を発現しないＬｔｋ⁻細胞への抗体結合を使用した。結果は終点希釈力価として表された。
【０１６３】
中和アッセイ法：
中和アッセイ法は、６ウェルプレート内で増殖されたベロ細胞に対して行った（２５）。簡単に述べると、１００〜２００ｐ．ｆ．ｕ．の麻疹ウイルスエドモントン株を血清の系列希釈と混合し、３７℃で１時間インキュベートし、次いで、プレートに接種した。プレートを３７℃で４８時間インキュベートし、プラークを数えた。中和力価は、プラーク形成を５０％または９０％減少させるのに必要とされる血清希釈の逆数として定義される。免疫前血清は負の対照とした。
【０１６４】
結果：
エドモントン株からの分泌型Ｈ（ｓＨ）を発現するように、または分泌型ＨとＣ３ｄとの融合（ｓＨ−３Ｃ３ｄ）を発現するように２種類の血球凝集素発現ワクチンプラスミドをｐＴＲ６００ベクターにおいて構築した（図２９）。ｓＨはＨのエクトドメイン全体に相当するが、膜貫通領域および細胞質領域を排除した。このクローニングによって、組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔｐＡ）リーダー配列のＮ末端合成模倣物がＨ配列とインフレームで配置された。ｔＰＡリーダーおよびＨ配列を、Ｈの膜貫通ドメインのすぐ３’側で融合した。ｓＨ−３Ｃ３ｄ融合タンパク質は、分泌型Ｈ遺伝子とインフレームでマウスＣ３ｄホモログの３つの縦列反復をクローニングすることによって作製された（図２９Ｂ）。各Ｃ３ｄ分子間の接合部ならびにＨタンパク質と最初のＣ３ｄコード領域の間の接合部に見られるタンパク質分解切断部位は、変異誘発によって破壊された。
【０１６５】
ウエスタンブロット分析は、予想サイズのｓＨおよびｓＨ−３Ｃ３ｄタンパク質を明らかにした。ＭＶ Ｈ抗血清に対するウサギポリクローナル抗体を用いて、ウエスタンブロット分析は、トランスフェクト細胞の上清中に分泌型Ｈに対応する約７０ｋＤの広いバンドを示した。約１９０ｋＤの高分子量バンドがｓＨ−３Ｃ３ｄ融合タンパク質の予想サイズと一致する（図３０）。ウエスタンブロットによって、ｓＨ−Ｃ３ｄ融合タンパク質のタンパク質分解切断の証拠は見られなかった。
【０１６６】
麻疹ウイルスＨは、ｓＨまたはｓＨ−３Ｃ３ｄを含むプラスミドによって、膜貫通結合型の抗原と比較してわずかに少ないレベルで発現された。ヒト２９３Ｔ細胞を２μｇのプラスミドで一過的にトランスフェクトし、抗原捕獲ＥＬＩＳＡを用いて上清および細胞溶解物の両方のＨをアッセイした。ｓＨ−ＤＮＡおよびｓＨ−３Ｃ３ｄ−ＤＮＡでトランスフェクトされた細胞の両方について、Ｈタンパク質の約７５％が上清に分泌された。予想通り、膜貫通型Ｈを発現するプラスミドでトランスフェクトされた細胞の細胞溶解物に、Ｈ抗原の約９９％が検出された。
【０１６７】
麻疹Ｈ ＤＮＡ免疫化に対する抗体応答：
ｓＨ−３Ｃ３ｄ発現ＤＮＡプラスミドは、ｓＨ ＤＮＡより高力価のＥＬＩＳＡ抗体を惹起した。ＤＮＡでコーティングされた金粒子によって、０．１μｇまたは１μｇ接種物を用いた遺伝子銃でＢＡＬＢ／ｃマウスにワクチン接種を行った。ワクチン接種の４週間後および２６週間後に、マウスに、最初の免疫化で与えた同じ用量のＤＮＡで追加抗原刺激を行った。抗Ｈ抗体の出現の時間パターンは、ｓＨ ＤＮＡワクチン接種マウスと比較して、Ｃ３ｄ融合発現ＤＮＡワクチン接種マウスにおいて速く出始めることを示した。良好な力価の抗体が最初の免疫化によって惹起された。これらは、２回目および３回目の免疫化によって追加抗原刺激され、３回目の免疫化の後、ｓＨ−３Ｃ３Ｄワクチン接種マウスの力価はｓＨ ＤＮＡワクチン接種マウスより５〜６倍高かった。
【０１６８】
中和アッセイ法：
ＭＶ中和についての血清の調査によって、０．１μｇ ｓＨ−３Ｃ３ｄ発現ＤＮＡの２回目の接種後、力価は１７００まであることが分かった。ベロ細胞に対して行われた中和抗体研究によって、ｓＨ−３Ｃ３ｄ構築物によって誘発されたマウス血清におけるプロトタイプＭＶエドモントン株に対する中和活性の力価は、ｓＨ発現ＤＮＡワクチン接種マウスの血清における力価より高いことが検出された。ｓＨ−３Ｃ３ｄ発現プラスミドワクチン接種マウスは中和抗体レベルが急激に上昇し、１４週目までにプラトーに達した。対照的に、ｓＨ発現ＤＮＡでは、検出可能なレベルの中和抗体を誘発するのに３回のワクチン接種を要した。ワクチン接種の２８週間後、ｓＨ−３Ｃ３ｄ−ＤＮＡワクチン接種マウスからの血清は、ＭＶ感染のプラーク形成を９０％減少させることができる中和力価（＞２５０）を有した。
【０１６９】
Ｃ３ｄタンパク質発現構築物でワクチン接種されたマウスでのＨに対する抗体応答の高さの増加は、ｓＨのみを発現するＤＮＡでワクチン接種されたマウスと比較して７〜１５倍多かった。ｓＨ−３Ｃ３ｄ発現ＤＮＡによって発現されたタンパク質の量がｓＨのみを発現するプラスミドの約６０％であったので、ｓＨ−３Ｃ３ｄ発現ＤＮＡを用いた抗体応答の増加はかなり興味深いものである。
【０１７０】
全抗体レベルの増加に加えて、インビトロ感染アッセイ法においてＭＶを特異的に中和することができる抗体がさらに速く出始めた。ｓＨ−３Ｃ３ｄ発現ＤＮＡでワクチン接種されたマウスでは、２回目の免疫化の後に検出可能なレベルの中和抗体が観察された。中和抗体の力価は１４週目（５０％プラーク減少、１７００）でピークに達し、これは、防御のための最小限の相関関係（５０％プラーク減少、＞１２０）をかなり上回る。対照的に、ｓＨ発現ＤＮＡでワクチン接種されたマウスの中和抗体レベルは、３回目のワクチン接種後でさえも低かった（５０％プラーク減少、１８０）（図３１）。
【０１７１】
実施例１８：Ｃ３ｄを含む、およびＣ３ｄを含まないインフルエンザ挿入物
プラスミドベクターの構築手順および精製手順はＪＷ４３０３について以前に述べられている（Ｔｏｒｒｅｓら、１９９９；Ｐｅｒｔｍｅｒら１９９５；Ｆｅｌｔｑｕａｔｅら１９９７）。簡単に述べると、Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）からのインフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）配列を、固有の制限部位を用いてｐＪＷ４３０３またはｐＧＡ真核生物発現ベクターにクローニングした。
【０１７２】
２種類のＨＡ、分泌（ｓ）型および膜貫通（ｔｍ）結合型が以前に述べられている（Ｔｏｒｒｅｓら１９９９；Ｆｅｌｔｑｕａｔｅら、１９９７）。ｐＪＷ４３０３においてｓＨＡまたはｔｍＨＡを発現するベクターを、それぞれｐＪＷ／ｓＨＡおよびｐＪＷ／ｔｍＨＡと呼び、ｐＧＡにおいてｓＨＡ、ｔｍＨＡ、またはｓＨＡ−３Ｃ３ｄを発現するベクターを、それぞれｐＧＡ／ｓＨＡ、ｐＧＡ／ｔｍＨＡ、およびｐＧＡ／ｓＨＡ−３Ｃ３ｄと呼んだ。
【０１７３】
ＨＡ−Ｃ３ｄ融合タンパク質を発現するベクターは、マウスＣ３ｄホモログの３つの縦列反復をクローニングし、３つの縦列反復を分泌型ＨＡ遺伝子とインフレームに配置することによって作製された。設計された構築物はＤｅｍｐｓｅｙら（１９９６）に基づいた。４個のグリシンおよび１個のセリンの２回の反復［（Ｇ_４Ｓ）_２］からなるリンカーは、各Ｃ３ｄ反復の接合部で融合された。ｐＧＡ／ｓＨＡ−３Ｃ３ｄプラスミドは、ｐＧＡ／ｓＨＡベクターにより発現されたタンパク質の約５０％を発現した。しかしながら、上清で見出されたｓＨＡ−３Ｃ３ｄと細胞溶解物で見出されたｓＨＡ−３Ｃ３ｄの比は、ｐＧＡ／ｓＨＡにより発現された抗原の比とほぼ同じであった。８０％を超えるタンパク質が上清に分泌された。ウエスタン分析において、高分子量のバンドが１２０ｋＤａで検出され、これはｓＨＡ−３Ｃ３ｄ融合タンパク質に相当した。従って、ｓＨＡ−３Ｃ３ｄ融合タンパク質は、ｓＨＡ抗原と同じくらい効率的に上清に分泌される。
【０１７４】
マウスおよびＤＮＡ免疫化：
接種のために、６〜８週齡のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使用した。マイクロアイソレーターユニットに収容し、飼料および水を自由に与えたマウスを、ＵＳＤＡ実験動物ガイドラインに従って飼育した。ケタミンＨＣｌ ５ｍｌ（１００ｍｇ／ｍｌ）およびキシラジン１ｍｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）の混合物０．０３〜０．０４ｍｌを用いて、マウスに麻酔をかけた。手持ち式のアクセル（Ａｃｃｅｌｌ）遺伝子送達システムを用いて、毛をそり落とした腹部皮膚に遺伝子銃免疫化を行った。４００ｐｓｉのヘリウム圧設定で約１μｍ金ビーズ（ＤｅＧｕｓｓａ−Ｈｕｌｓ Ｃｏｒｐ．、Ｒｉｄｇｅｆｉｅｌｄ Ｐａｒｋ、ＮＪ）０．５ｍｇにつき０．５μｇのＤＮＡを含む２遺伝子銃量で免疫化を行った。
【０１７５】
インフルエンザウイルス攻撃：
生きている、マウスに適合されたインフルエンザウイルス（Ａ／ＰＲ／８／３４）による攻撃は、３致死量のウイルスを含むようにＰＢＳで希釈した尿膜腔液５０μｌを、ケタミンで麻酔したマウスの鼻孔に注入することよって行った。この方法は急速な肺感染につながり、非免疫化マウスの１００％が死に至る。ワクチン接種の８週間後または１４週間後、個々のマウスを攻撃し、体重減少および生存についてモニターした。データを、攻撃後の日数に対する群における個々の平均体重（攻撃前の体重の％）としてグラフ化した。
【０１７６】
ＨＡ ＤＮＡ免疫化プロトコールに対する抗体応答：
ｔｍＨＡ発現ＤＮＡプラスミドおよびｓＨＡ−３Ｃ３ｄ発現ＤＮＡプラスミドは、ｓＨＡ ＤＮＡより高力価のＥＬＩＳＡ抗体を惹起した。ＤＮＡでコーティングされた金粒子によって、０．１μｇまたは１μｇ用量の接種物を用いた遺伝子銃でＢＡＬＢ／ｃマウスにワクチン接種を行った。ワクチン接種の４週間後に、各群のマウスの半分に、最初の免疫化で与えた同じ用量のＤＮＡで追加抗原刺激を行った。ｓＨＡ−３Ｃ３ｄ発現プラスミドおよびｔｍＨＡ発現プラスミドにより誘導された総抗ＨＡ ＩｇＧは異なる実験マウス群においてほぼ同じであり、ｓＨＡ発現プラスミドにより惹起された量より３〜５倍多かった（図２４）。さらに、誘発された抗ＨＡ抗体の量は、ワクチン接種に用いられたＤＮＡ量と比較して用量依存的に増加した（図２４Ｅ〜２４Ｆ）。全体的に見て、用量反応曲線および抗ＨＡ抗体出現の時間パターンは、ｔｍＨＡ ＤＮＡまたはｓＨＡ−３Ｃ３ｄ−ＤＮＡでワクチン接種されたマウスにおいてほぼ同じであったが、ｓＨＡ−ＤＮＡでワクチン接種されたマウスでは低く、遅かった。予想通り、追加免疫化は両方とも、ＨＡ抗体の力価を促進および増大させた。
【０１７７】
マウスＨＡ抗血清のアビディティー：
チオシアン酸ナトリウム（ＮａＳＣＮ）置換（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）ＥＬＩＳＡによって、ｓＨＡ−３Ｃ３ｄ発現ＤＮＡで生じたＨＡ特異的抗体のアビディティーが、ｓＨＡ−ＤＮＡまたはｔｍＨＡ−ＤＮＡでワクチン接種されたマウスからの抗体より一貫して高いことが証明された（図２５）。抗原−抗体相互作用を破壊するために段階濃度のカオトロピック剤ＮａＳＣＮを使用することによって、ＨＡ特異的抗体のアビディティーを比較した。低いアビディティーを有する抗体と抗原との結合は、高いアビディティーを有する抗体と抗原との結合より低い濃度のＮａＳＣＮで破壊される。ｓＨＡ−ＤＮＡまたはｔｍＨＡ−ＤＮＡ（０．１μｇ用量または１μｇ用量）で追加抗原刺激されたマウスからワクチン接種８週間後に収集された抗血清の５０％を遊離するのに必要とされるＮａＳＣＮの有効濃度（ＥＤ_５０）は、約１．２０Ｍであった（図２５Ａ）。対照的に、ｓＨＡ−３Ｃ３ｄ−ＤＮＡでワクチン接種および追加抗原刺激されたマウスからの抗血清のＥＤ_５０は、約１．７５Ｍであった（図２５Ｂ）。攻撃時（ワクチン接種の１４週間後）に、ｓＨＡ−ＤＮＡワクチン接種マウスおよびｔｍＨＡ−ＤＮＡワクチン接種マウスからの抗体のＥＤ_５０は、約１．８Ｍまで増加した（図２５Ｃ）。ｓＨＡ−３Ｃ３ｄ−ＤＮＡでワクチン接種されたマウスからの抗体のＥＤ_５０は、約２．０まで増加した（図２５Ｄ）。これらの結果は、ｓＨＡ−３Ｃ３ｄ−ＤＮＡワクチン接種マウスからの抗体が、ｓＨＡ ＤＮＡワクチン接種マウスまたはｔｍＨＡ−ＤＮＡワクチン接種マウスからの抗体より急速な親和性成熟を受けたことを示唆している。ｓＨＡ−３Ｃ３ｄおよびｔｍＨＡに対する抗体の時間アビディティー成熟の差は、惹起された抗体のレベルと無関係であった。これらのプラスミドは両方とも、抗体出現の時間パターンおよび抗体を惹起する能力についての用量反応曲線が類似した（図２５）。
【０１７８】
血球凝集素阻害（ＨＩ）力価：
惹起された抗体が、シアル酸へのＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）の結合をブロックする能力を評価するために、血球凝集素阻害アッセイ法（ＨＩ）を行った。ＨＩ力価は、ワクチン接種の８週間後および１４週間後にマウスから採取された血清試料から測定した。全ての追加抗原刺激マウスが、与えられた用量にもワクチンにも関係なく１４週目で測定可能なＨＩ力価を有した。ｓＨＡ−３Ｃ３ｄ−ＤＮＡワクチン接種マウスについては最高力価（１：１２００まで）を記録した。追加抗原刺激されていないマウスは大きなＨＩ力価変動を示した。０．１μｇ用量のｓＨＡ−ＤＮＡ発現プラスミドまたはｔｍＨＡ ＤＮＡ発現プラスミドでワクチン接種された、追加抗原刺激されていないマウスは、１：１０という低いＨＩ力価を有した。対照的に、ｓＨＡ−３Ｃ３ｄ−ＤＮＡワクチン接種マウスは、１：６４０より大きな力価を有した。８週目に測定可能なＨＩ力価（１：１６０）を有した唯一のワクチン接種マウスは、１μｇ用量のｓＨＡ−３Ｃ３ｄ−ＤＮＡでワクチン接種された追加抗原刺激マウスであった。これらの結果から、Ｃ３ｄはｓＨＡと融合すると、抗体のアビディティー成熟、従って、ＨＡに対する中和抗体の産生を高めるように特異的Ｂ細胞を刺激できることが分かる。
【０１７９】
インフルエンザ攻撃に対する防御効力：
ｓＨＡ−３Ｃ３ｄ ＤＮＡは、ＨＩ抗体の最高力価の誘発と一致して、ｓＨＡまたはｔｍＨＡ ＤＮＡより効果的な防御を惹起した。様々なＨＡ−ＤＮＡワクチンの防御効力を試験するために、致死量のＡ／ＰＲ／８／３４インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１）を用いてマウスを攻撃し、罹患率（体重減少を測定）および死亡率を毎日モニターした。各動物の体重減少を、攻撃後の日数に対する攻撃前の平均体重の％としてグラフ化した（図２６）。ウイルスで攻撃された、投薬されていないマウスおよびｐＧＡベクターのみでワクチン接種されたマウスは急速な体重減少を示し、マウスは全て攻撃８日後までに体重の＞２０％を減らした（図２６）。対照的に、ＰＢＳ偽性で攻撃されたマウスは、１４日間の観察にわたって体重減少を示さなかった。全ての追加抗原刺激マウスが、投与されたＤＮＡプラスミドの用量に関係なくワクチン接種１４週間後の攻撃から生き残った。しかしながら、０．１μｇ用量のｓＨＡ−ＤＮＡでワクチン接種された追加抗原刺激マウスは、回復する前に攻撃の８日後、最初の体重の９２％まで落ちた（図２６）。対照的に、１μｇ用量で追加抗原刺激されたマウスをワクチン接種８週間後に攻撃した場合、攻撃から生き残っている唯一のマウスは、ワクチン接種１４週間後に攻撃されたマウスから観察されたものより大きな体重減少にもかかわらず、ｓＨＡ−３Ｃ３ｄワクチン接種マウスおよびｔｍＨＡ−ＤＮＡワクチン接種マウスであった。ワクチン接種８週間後の攻撃から生き残っている、唯一の、０．１μｇ用量で追加抗原刺激されたマウスは、ｓＨＡ−３Ｃ３ｄワクチン接種マウスであった（図２６）。
【０１８０】
追加抗原刺激のない０．１μｇ用量の免疫化のうち、ｓＨＡ−３Ｃ３ｄ ＤＮＡワクチン接種マウスだけが、ワクチン接種１４週間後の攻撃から生き残った（図２６）。一回のＤＮＡワクチン接種を与えた全てのマウスが体重を失った。しかしながら、これらのマウスのうち、ｓＨＡ−３Ｃ３ｄ−ＤＮＡワクチン接種マウスの体重減少が最も少なく、これらのマウスは、致死攻撃から生き残った唯一のマウスであった（図２６）。これらの結果によって、３Ｃ３ｄタンパク質はＨＡと融合するとＤＮＡワクチン効率を高め、致死インフルエンザウイルス攻撃からの防御をもたらすのに必要とされるＤＮＡ用量およびワクチン接種回数を減らすことが証明された。
【０１８１】
実施例１９：ＨＩＶ ｇｐ１２０−Ｃ３ｄ融合構築物
本研究では、３コピーのマウスＣ３ｄとＨＩＶ Ｅｎｖ ｇｐ１２０サブユニットのカルボキシ末端を融合するために、実施例１８に記載のものと同様のアプローチを使用した。ＤＮＡワクチン接種を用いて、ＢＡＬＢ／ｃマウスに接種を行い、免疫応答の上昇をアッセイした。この融合構築物は、それぞれの野生型ｇｐ１２０配列より高いＥｎｖに対する免疫応答、および速いアビディティー成熟の開始を誘導した。これらの結果は、抗体を惹起するためのＤＮＡワクチンの効力が、タンパク質とＣ３ｄを融合することによって有意に改善できることを示唆している。
【０１８２】
プラスミドＤＮＡ：
前記実施例１に記載のように、真核生物挿入物転写開始のためのサイトメガロウイルス即時初期プロモーター（ＣＭＶ−ＩＥ）＋イントロンＡ（ＩＡ）、および転写終結のためのウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ＢＧＨポリＡ）を含むように、ｐＧＡを構築した。ほぼ全てのｇｐ１２０領域をコードする、分離株ＡＤＡ、ＩＩＩｂ、および８９．６からのＨＩＶエンベロープ配列ならびにＣ３ｄ配列を、固有の制限エンドヌクレアーゼ部位を用いてｐＧＡワクチンベクターにクローニングした。ｇｐ１２０セグメントはアミノ酸３２〜４６５の領域をコードし、アミノ酸配列ＶＡＰＴＲＡで終わった。最初の３２アミノ酸が各ｓｇｐ１２０のＮ末端から欠失され、組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔｐＡ）から配列決定されたリーダーで置換された。ｓｇｐ１２０−Ｃ３ｄ融合タンパク質を発現するベクターは、ｓｇｐ１２０発現ＤＮＡとインフレームでマウスＣ３ｄホモログの３つの縦列反復をクローニングすることによって作製された。構築物設計はデムプセイ（Ｄｅｍｐｓｅｙ）ら（１９９６）に基づいた。４個のグリシンおよび１個のセリンの２回の反復｛（Ｇ_４Ｓ）_２｝からなるリンカーは、ＨＡおよびＣ３ｄの接合部で、ならびに各Ｃ３ｄ反復間で融合された。Ｃ３ｄ接合部ならびに３Ｃ３ｄの接合部の間の潜在的なタンパク質分解切断部位は、ＡｒｇコドンをＧｌｙコドンに変異させるようにＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を連結することによって変異された。
【０１８３】
プラスミドを大腸菌ＤＨ５α株において増幅し、陰イオン交換樹脂カラム（キアゲン、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて精製し、ｄＨ_２Ｏに溶解して−２０℃で保存した。適切な制限酵素消化およびゲル電気泳動によってプラスミドを確かめた。２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでの光学密度を読み取ることによって、ＤＮＡ調製物の純度を測定した。
【０１８４】
マウスおよびＤＮＡ免疫化：
前記実施例１７に記載のように、６〜８週齡のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）にワクチン接種を行った。簡単に述べると、マウスを、４００ｐｓｉのヘリウム圧設定で、約１μｍ金ビーズ（ＤｅＧｕｓｓａ−Ｈｕｌｓ Ｃｏｒｐ．、Ｒｉｄｇｅｆｉｅｌｄ Ｐａｒｋ、ＮＪ）０．５ｍｇにつき０．５μｇのＤＮＡを含む２遺伝子銃量を用いて免疫化した。
【０１８５】
トランスフェクションおよび発現分析およびウエスタンハイブリダイゼーション実験は、ニトロセルロース膜を０．１％Ｔｗｅｅｎ２０および１％脱脂粉乳を含むＰＢＳで１：１０００に希釈したポリクローナルヒトＨＩＶ感染患者抗血清とインキュベーションした以外は実施例１７に記載のように行った。徹底的な洗浄の後、１：２０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒト抗血清および化学発光増幅法（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を用いて、結合したヒト抗体を検出した。
【０１８６】
ＥＬＩＳＡおよびアビディティーアッセイ法：
免疫血清中の抗Ｅｎｖ ＩｇＧの力価を評価するために、述べられたように（Ｒｉｃｈｍｏｎｄら、１９９８）、プレートをコーティングするのに精製ＨＩＶ−１−ＩＩＩＢ ｇｐ１２０ ＣＨＯ発現タンパク質（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌ）を用いて、終点ＥＬＩＳＡを行った。または、プレートを、ヒツジ抗Ｅｎｖ抗体（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｚｙｍｅｓ Ｉｎｃ．、Ｆａｌｌｂｒｏｏｋ、ＣＡ）でコーティングし、ｓｇｐ１２０発現ベクターで一過的にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞において産生されたｓｇｐ１２０を捕獲するために使用した。ワクチン接種マウスからのマウス血清を結合させ、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧによって検出した。バックグラウンドより２倍高い終点力価が陽性とみなされた。アビディティーＥＬＩＳＡを、試料および標準の添加まで血清抗体測定ＥＬＩＳＡと同様に行った。Ｏ．Ｄ．によってほぼ同じ濃度の特異的ＩｇＧが得られるように試料を希釈した。プレートを０．０５％ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。次いで、異なる濃度の、ＰＢＳに溶解したカオトロピック剤チオシアン酸ナトリウム（ＮａＳＣＮ）を添加した（０Ｍ、１Ｍ、１．５Ｍ、２Ｍ、２．５Ｍ、および３Ｍ ＮａＳＣＮ）。プレートを室温で１５分間放置し、次いで、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で６回洗浄した。後のステップを血清抗体測定ＥＬＩＳＡと同様に行い、初期ＩｇＧの％を初期Ｏ．Ｄ．の％として計算した。全てのアッセイ法を三つ組行った。
【０１８７】
中和抗体アッセイ法：
抗体によるＨＩＶ−１ ＩＩＩＢおよび８９．６の中和を、以前に述べられたように（Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉら、１９８８）、ＭＴ−２細胞死滅アッセイ法において測定した。簡単に述べると、ポリ−Ｌ−リジンでコーティングされた９６ウェルマイクロタイタープレートの三つ組のウェル内の複数の血清試料希釈（増殖培地１００μｌで希釈）に、細胞を含まないウイルス（１０^８ ＴＣＩＤ_５０のウイルスを含む５０μｌ）を添加し、３７℃で１時間インキュベートし、その後、ＭＴ−２細胞を添加した（ウェル１個につき、１００□ｌに溶解した１０^５細胞を添加した）。細胞密度が減少し、必要な場合に、インキュベーションの３日後に培地を交換した。対照ウェルでの細胞変性効果が＞７０％であるが、１００％未満である場合に、フィンターのニュートラルレッド（Ｆｉｎｔｅｒ’ｓ ｎｅｕｔｒａｌ ｒｅｄ）による生細胞の染色によって、中和を測定した。％防御は、試験ウェル（細胞＋ウイルス）間の吸収（Ａ_５４０）の差を計算し、この結果を、細胞対照ウェル（細胞のみ）およびウイルス対照ウェル（ウイルスのみ）間の吸収の差で割ることによって求めた。中和力価は、ウイルスによる死滅から細胞の少なくとも５０％を防御するのに必要とされる血漿希釈の逆数として表される。
【０１８８】
結果：
Ｅｎｖは、ｓｇｐ１２０−Ｃ３ｄ発現プラスミドによる２／４のレベル以外は、分泌型の抗原を含むどちらのプラスミドでもほぼ同じ全体レベルで発現された。ヒト２９３Ｔ細胞をプラスミド２μｇで一過的にトランスフェクトし、抗原捕獲ＥＬＩＳＡを用いて、上清および細胞溶解物の両方をｇｐ１２０についてアッセイした。ｓｇｐ１２０構築物は４５０〜８００ｎｇ／ｍｌを発現したが、３Ｃ３ｄ融合は１４０〜２５０ｎｇ／ｍｌを発現した。ｓｇｐ１２０トランスフェクト細胞およびｓｇｐ１２０−３Ｃ３ｄ−ＤＮＡトランスフェクト細胞の両方で、上清にＥｎｖタンパク質の約９０％が存在した（データ示さず）。異なるｓｇｐ１２０の発現レベルの約２倍の差は、Ｅｎｖ遺伝子の差ならびに捕獲抗体および検出抗体が異なるＥｎｖを認識する効率の差を反映している可能性が高い。
【０１８９】
ウエスタンブロット分析は、予想サイズのｓｇｐ１２０およびｓｇｐ１２０−３Ｃ３ｄタンパク質を明らかにした。ヒト患者ポリクローナル抗血清を用いて、ウエスタンブロット分析は、ｇｐ１２０に対応する１１５〜１２０ｋＤの予想される広いバンドを示した。約２４０ｋＤでの高分子量のバンドがｓｇｐ１２０−３Ｃ３ｄ融合タンパク質の予想サイズと一致した。抗原捕獲アッセイ法と一致して、濃いタンパク質バンドがｓｇｐ１２０−ＤＮＡトランスフェクト細胞の上清に存在したが、それより薄いバンドがｓｇｐ１２０−３Ｃ３ｄ−ＤＮＡトランスフェクト細胞の上清に存在した（データ示さず）。ウエスタンブロット分析によって、ｓｇｐ１２０−Ｃ３ｄ融合タンパク質のタンパク質分解切断の証拠は見られなかった。
【０１９０】
Ｅｎｖ ｇｐ１２０ ＤＮＡ免疫化に対する免疫応答：
ｓｇｐ１２０−３Ｃ３ｄ発現ＤＮＡプラスミドは、ｓｇｐ１２０ ＤＮＡより高力価のＥＬＩＳＡ抗体を惹起した。ＤＮＡでコーティングされた金粒子によって、１μｇ用量の接種物を用いた遺伝子銃でＢＡＬＢ／ｃマウスにワクチン接種を行った。１日目にマウスにワクチン接種を行い、次いで、４週間、１４週間、および２６週間で、最初の免疫化で与えた同じＤＮＡを用いて追加抗原刺激を行った。血清をｇｐ１２０−ＩＩＩＢコーティングプレートでアッセイした場合、Ｃ３ｄ融合タンパク質を発現するＤＮＡでワクチン接種されたマウスの抗Ｅｎｖ抗体量は、対応するｓｇｐ１２０発現プラスミドにより惹起された抗体量より３〜７倍多かった。Ｃ３ｄ構築物のうち、ｓｇｐ１２０−（ＩＩＩＢ）−３Ｃ３ｄでワクチン接種されたマウスの抗体レベルが最も高く、ｓｇｐ１２０−（ＡＤＡ）−３Ｃ３ｄ発現ＤＮＡでワクチン接種されたマウスの抗Ｅｎｖ抗体レベルが最も低かった。抗Ｅｎｖ抗体の出現の時間パターンによって、試験した全ての構築物のそれぞれの接種で力価が追加抗原刺激されることが明らかになった。
【０１９１】
様々なＥｎｖによって惹起された抗体レベルの差は、惹起された抗体の特異性によって決まるように見えた。相同なＥｎｖの上に抗体を捕獲する別のＥＬＩＳＡプロトコールを用いると、Ｃ３ｄ融合の全てがほぼ同じレベルの抗体を惹起するように見えた。このアッセイ法では、一過的に産生されたｓｇｐ１２０タンパク質を捕獲するためにヒツジ抗Ｅｎｖ抗体を使用した。このアッセイ法によって、各ｓｇｐ１２０−３Ｃ３ｄ構築物によって惹起される抗体のレベルは低いが、ほぼ同じであることが明らかになった。このアッセイ法において検出された低レベルの抗体は、抗体を捕獲するために用いられた、トランスフェクションによって産生されたＥｎｖのレベルが、プレートをコーティングするために商業生産されたＩＩＩＢ ｇｐ１２０を使用したアッセイ法でのＥｎｖのレベルより少ないことを反映している可能性が高い。ＥＬＩＳＡ法を用いて予想されたように、最も弱い抗体応答でさえも達成するのに追加免疫化が必要であった。
【０１９２】
マウスＥｎｖ抗血清のアビディティー：
チオシアン酸ナトリウム（ＮａＳＣＮ）置換ＥＬＩＳＡによって、ｓｇｐ１２０−３Ｃ３ｄ発現ＤＮＡを用いて生じた抗体のアビディティーが、ｓｇｐ１２０−ＤＮＡワクチン接種マウスからの抗体より一貫して高いことが証明された。アビディティーアッセイ法は、惹起された抗血清のタイプ特異性および捕獲抗原として使用するためのＩＩＩＢタンパク質の商業的な入手のしやすさ（他のタンパク質は入手しにくい）のためにｓｇｐ１２０−（ＩＩＩＢ）およびｓｇｐ１２０−（ＩＩＩＢ）−３Ｃ３ｄによって惹起された血清に対して行った。抗原−抗体相互作用を破壊するために段階濃度のカオトロピック剤ＮａＳＣＮを使用することによって、特異的Ｅｎｖ抗体のアビディティーを比較した。結果から、ｓｇｐ１２０−３Ｃ３ｄ−ＤＮＡワクチン接種マウスからの抗体は、ｓｇｐ１２０−ＤＮＡワクチン接種マウスからの抗体より急速な親和性成熟を受けたことが分かった。
【０１９３】
Ｅｎｖ−３Ｃ３ｄ発現プラスミドは少量の中和抗体を誘発する：
ＭＴ−２細胞で行われた中和抗体研究から、ｇｐ１２０−３Ｃ３ｄ構築物によって生じた血清における中和活性力価が、ｓｇｐ１２０構築物によって生じた血清における中和活性力価より高いことが検出された。血清を、２種類のシンシチウム（ＩＩＩＢ（Ｘ４）および８９．６（Ｘ４Ｒ５）ウイルスを含む）に対して試験した。ｓｇｐ１２０−３Ｃ３ｄ発現プラスミドでワクチン接種されたマウスの、ＨＩＶ同種株に対する中和抗体のレベルは非常に低かった。中和抗体のレベルは、ニュートラルレッドの取り込みによって測定される、ウイルスによる死滅からのＭＴ−２細胞の防御によって試験された。ｇｐ１２０発現ＤＮＡによって惹起された中和抗体の力価はアッセイ法のバックグラウンドであった。
【０１９４】
この研究の結果によって、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖと３コピーのマウスＣ３ｄの融合は、ワクチン接種マウスにおいてＥｎｖに対する抗体応答を上昇させたことが分かった。３種類のｓｇｐ１２０配列発現ＤＮＡプラスミドでワクチン接種されたどのマウスも、４回のワクチン接種の後（初回抗原刺激の２８週間後）、低いかまたは検出不可能な抗体レベルを示した。対照的に、ｓｇｐ１２０および３Ｃ３ｄタンパク質の融合を発現するＤＮＡでワクチン接種されたマウスは、迅速な抗体の出現（３回のワクチン接種）ならびに高レベルの抗体を誘発した。
【０１９５】
Ｅｎｖ抗体の抗体力価およびアビディティー成熟の上昇とは対照的に、ワクチン接種マウスにおいて誘発された中和抗体の量は少なかった。ｓｇｐ１２０発現プラスミドでワクチン接種されたマウスの中和抗体レベルは低く、このレベルは、ｓｐ１２０−３Ｃ３ｄ発現プラスミドでワクチン接種されたマウスにおいて、わずかに少し増加した。しかしながら、中和抗体レベルは４回目の免疫化後に明らかに増加した。中和抗体の不十分な力価は、ｓｇｐ１２０−３Ｃ３ｄ融合タンパク質が、中和エピトープを応答Ｂ細胞に適切に曝露しないために、中和抗体を本質的に十分に惹起できないことを反映した可能性がある。マウス血清におけるＨＩＶ−１中和アッセイ法の本質的な高いバックグラウンドもまた不十分な中和力価に寄与した可能性がある。
【０１９６】
これらの結果は、抗体産生および抗体成熟の増大における分子アジュバントとしてのＣ３ｄ融合の有効性を証明している。さらに、Ｅｎｖに対する中和抗体応答は、Ｃ３ｄ融合ワクチンでワクチン接種されたマウスにおいて少し増加した。麻疹ウイルスおよびンフルエンザウイルスに由来する分泌型ＨＡを用いた実施例１７および１８で見られた結果と同様に、Ｃ３ｄによる抗体応答の上昇が、非融合ｓｇｐ１２０を発現するプラスミドの半分の量しかタンパク質を発現しないプラスミドで達成された。
【０１９７】
参照

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の新規のｐＧＡ１構築物を示す。表示はベクターにおけるエレメントの名称および位置である。イタリック体の表示は、ベクターへのワクチン挿入物のクローニングに有用な固有の制限エンドヌクレアーゼ部位である。
【図２】図１に示した新規のｐＧＡ１構築物の配列番号：１のＤＮＡ配列を示す。プラスミドにおけるエレメントの位置をヌクレオチド配列の下に示す。
【図３】本発明の新規のｐＧＡ２構築物を示す。表示はベクターにおけるエレメントの名称および位置である。イタリック体の表示は、ベクターへのワクチン挿入物のクローニングに有用な固有の制限エンドヌクレアーゼ部位である。
【図４】図３に示した新規のｐＧＡ２構築物の配列番号：２のＤＮＡ配列を示す。プラスミドにおけるエレメントの位置をヌクレオチド配列の下に示す。
【図５】本発明の新規のｐＧＡ３構築物を示す。表示はベクターにおけるエレメントの名称および位置である。イタリック体の表示は、ベクターへのワクチン挿入物のクローニングに有用な固有の制限エンドヌクレアーゼ部位である。
【図６】図５に示した新規のｐＧＡ３構築物の配列番号：３のＤＮＡ配列を示す。プラスミドにおけるエレメントの位置をヌクレオチド配列の下に示す。
【図７】ｐＧＡベクター（ｐＧＡ３／Ｈ１）およびｐＪＷ４３０３研究ベクター（ｐＪＷ４３０３／Ｈ１）において発現されたインフルエンザＨ１血球凝集素によって惹起された抗ＨＡ ＩｇＧのレベルの比較である。遺伝子銃接種を用いて、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、低用量（０．１μｇ）または高用量（１μｇ）の表示プラスミドによって免疫化しかつ追加抗原刺激した。初回免疫化の４週間後に追加免疫化を行った。
【図８】図８Ａは親野生型ＢＨ１０プロウイルスの模式図を示す。ここから非感染性ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生する構築物を作製した。点で示す領域はＶＬＰ構築物において欠失された配列を示す。ＢＨ１０プロウイルスの様々な領域の位置および表示を四角い枠の中に示す。長末端反復をコードするＵ３ＲＵ５領域は転写制御エレメントを含む。他の全ての表示領域はタンパク質をコードする。明確にするために、ｐｏｌ（Ｐｒｔ、ＲＴ、Ｉｎｔ）ならびにｅｎｖ（ＳＵおよびＴＭ）によって発現される産物を示す。図８ＢはＪＳ２ワクチン挿入物を示す。この６．７ｋｂワクチン挿入物は、ＨＩＶ−１−ＩＩＩｂ ＢＨ１０株のＧａｇ配列、Ｐｒｔ配列、およびＲＴ配列、ＡＤＡに由来するＴａｔタンパク質およびＶｐｕタンパク質、ならびにＡＤＡ配列およびＢＨ１０配列のキメラであるＲｅｖタンパク質およびＥｎｖタンパク質を発現する。Ｇａｇ配列は、ウイルスＲＮＡのパッケージングを制限するためのジンクフィンガー変異を含む。ＲＴ配列は、逆転写酵素活性を無くす３つの点変異を含む。表示は図８Ａと同じである。括弧でくくった領域は、ＣＣＲ−５を使用するＥｎｖを導入するためにＢＨ１０配列をＡＤＡ由来の配列で置換したＢＨ１０領域を示す。ｘは安全変異を示す。図８ＣはＪＳ５挿入物を示す。ＪＳ５は、Ｇａｇ、Ｐｒｔ、ＲＴ、Ｖｐｕ、Ｔａｔ、およびＲｅｖを発現する６ｋｂワクチン挿入物である。ＪＳ５は、Ｅｎｖにおける配列が欠失された以外はＪＳ２と同じ配列からなる。欠失配列は図８Ｂに黒い四角い囲みとして示される。表示は図８Ａおよび８Ｂと同じである。Ｅｎｖの３’領域にあるＲｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）は構築物に維持される。
【図９Ａおよび図９Ｂ】ＪＳ２ワクチン挿入物構築における中間体に関するＧａｇ発現およびＥｎｖ発現をそれぞれ示す。データは、２９３Ｔ細胞での一過的トランスフェクションに由来する。ｐＧＡ１／ＪＳ１（ＡＤＡ ＶＬＰ）は、野生型ＨＩＶ−１ ＡＤＡまたはＨＩＶ−１ ＩＩＩｂプロウイルス、および以前の研究で用いられたＶＬＰ産生ＤＮＡ（ｄＰｏｌ）より高いレベルのＧａｇ（図９Ａ）およびＥｎｖ（図９Ｂ）を産生した。
【図１０】安全変異のない挿入物を発現するワクチンベクター（ＪＳ１およびＪＳ４）、ジンクフィンガーおよびＲＴに点変異のある挿入物を発現するワクチンベクター（ＪＳ２およびＪＳ５）、ならびにジンクフィンガー、ＲＴ、およびプロテアーゼに点変異のある挿入物を発現するワクチンベクター（ＪＳ３およびＪＳ６）によって一過的にトランスフェクトされた細胞におけるｐ２４キャプシド発現を示す。ジンクフィンガーおよびＲＴにおける安全変異は活発なＶＬＰ発現を指示するが、Ｐｒｔにおける安全変異はそうではないことに留意されたい。安全変異の存在下での高レベル発現に基づいて、引き続くベクター開発のためにＪＳ２およびＪＳ５が選択された。
【図１１Ａおよび図１１Ｂ】イントロンＡを有するｐＧＡベクターおよびイントロンＡをもたないｐＧＡベクターによって発現された新規の候補ワクチン構築物のＧａｇ発現およびＥｎｖ発現をそれぞれ示す。ＰＧＡ１はイントロンＡを含むが、ｐＧＡ２はイントロンＡを含まない。好ましい発現レベルに基づいてワクチンにおいて使用するためにｐＧＡ２／ＪＳ２およびｐＧＡ１／ＪＳ５が選択された。
【図１２】（１）偽性、（２）ｐＧＡ２／ＪＳ２、および（３）ｐＧＡ１／ＪＳ５でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞からの細胞溶解物および組織培養上清のウエスタンブロットを示す。ここで一次抗体は、感染患者由来の抗ＨＩＶ Ｉｇ（図１２Ａ）、抗ｐ２４（図１２Ｂ）、抗ｇｐ１２０（図１２Ｃ）、および抗ＲＴ（図１２Ｄ）からそれぞれプールされた。
【図１３】ｐＧＡを示す。
【図１４】ｐＧＡ２／８９．６、ｐＧＡ１／Ｇａｇ−Ｐｏｌ、およびｐＧＡ２／ＪＳ２間でのＧａｇ発現レベルの比較である。発現の比較研究は、一過的にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞で行った。
【図１５】Ｇａｇ特異的Ｔ細胞の時間的頻度を示す。図１５Ａ：ＤＮＡ初回免疫化およびｒＭＶＡ追加免疫化により惹起されたＧａｇ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答である。概略図は、高用量皮内ＤＮＡ免疫化動物において得られたＧａｇ−ＣＭ９四量体データを示す。図１５Ｂ：攻撃前の様々な時点および攻撃２週間後での、Ｍａｍｕ−Ａ^＊０１ワクチン接種マカクおよび対照マカクにおけるＧａｇ−ＣＭ９−Ｍａｍｕ−Ａ^＊０１四量体特異的Ｔ細胞である。各グラフの右上隅の数字は、総ＣＤ８ Ｔ細胞の％としての四量体特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の頻度を示す。各グラフの段の上の数字は個々の動物を指定する。図１５Ｃ：攻撃前の様々な時点および攻撃２週間後での、Ａ^＊０１および非Ａ^＊０１（斜線の棒）のワクチン接種されたマカクおよびワクチン接種されていないマカクにおけるＧａｇ特異的ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴである。約１０〜１３のＧａｇペプチド（１２個における２２ｍｅｒの重複）の３つのプールを分析に使用した。データの棒の上の数字は、各群のＥＬＩＳＰＯＴの相加平均±標準偏差を示す。グラフの上の数字は個々の動物を指定する。^＊、データ入手できず；＃、＜２０ ＥＬＩＳＰＯＴ／１×１０^６ ＰＢＭＣ。
【図１６】ＤＮＡ／ＭＶＡ記憶応答におけるＧａｇおよびＥｎｖに対するＩＦＮ−γ産生ＥＬＩＳＰＯＴの高さおよび幅を示す。図１６Ａ：個々のＧａｇペプチドプールおよびＥｎｖペプチドプールに対する応答である。群内の動物のデータを同じ記号で示す。図１６Ｂ：異なる群のＥＬＩＳＰＯＴ応答の高さおよび幅の平均である。高さは、各群の動物のＧａｇ ＥＬＩＳＰＯＴおよびＥｎｖ ＥＬＩＳＰＯＴの合計の平均±標準偏差である。幅は、各群の動物によって認識されたＧａｇプールおよびＥｎｖプールの数の平均±標準偏差である。ＥＬＩＳＰＯＴ応答は、記憶期の間、ｒＭＶＡ追加抗原刺激後２５週目（攻撃の４週間前）で、約７０アミノ酸のＧａｇ配列を代表するＧａｇペプチド（１２個において約７つの２２ｍｅｒの重複）の７プール、および約４０アミノ酸のＥｎｖ配列を代表するＥｎｖペプチド（１１個において約１０の１５ｍｅｒの重複）の２１プールを用いてＰＢＭＣにおいて測定された。
【図１７】病原体ワクチン挿入物を含むｐＧＡ２構築物の配列番号：４のＤＮＡ配列を示す。ＪＳ２はクレードＢ ＨＩＶ−１ ＶＬＰを発現する。配列番号：４のヌクレオチド配列およびコードされるタンパク質の両方を示す。
【図１８】病原体ワクチン挿入物を含むｐＧＡ１構築物のＤＮＡ配列を示す。ＪＳ５はクレードＢ ＨＩＶ−１ Ｇａｇ−ｐｏｌ挿入物を発現する。この配列およびコードされるタンパク質の両方を示す。
【図１９】ワクチン接種動物および対照動物を攻撃した後の、時間的な、ウイルス負荷、ＣＤ４総数、および生存を示す。図１９Ａ：幾何平均ウイルス負荷である。図１９Ｂ：攻撃後様々な週での、ワクチン群および対照群の幾何平均ＣＤ４総数である。群の記号表をパネルＢに示す。図１９Ｃ：ワクチン接種動物および対照動物の生存曲線である。点線は２４匹全てのワクチン接種動物を示す。図１９Ｄ：ウイルス負荷である。図１９Ｅ：ワクチン群および対照群における個々の動物のＣＤ４総数である。動物番号の記号表を図１９Ｅに示す。攻撃後最初の１２週間のアッセイ法のバックグラウンドは１０００コピーＲＮＡ／１ｍｌ血漿であった。１０００未満の負荷がある動物を負荷５００と記録した。１６週目および２０週目の検出のためのバックグラウンドは３００コピーＲＮＡ／ｍｌであった。３００未満のウイルスレベルがある動物を３００と記録した。
【図２０】ワクチン群および対照群における攻撃後のＴ細胞応答を示す。図２０Ａ：時間的な四量体＋細胞およびウイルス負荷である。図２０Ｂ：攻撃２週間後でのＧａｇ−ＣＭ９ペプチドによる刺激に反応したＩＦＮ−γ産生についての細胞内サイトカインアッセイ法。このエクスビボアッセイ法によって、図１５Ａで示されたピーク攻撃後四量体＋細胞の機能状態を評価することができる。図２０Ｃ：攻撃１２週間後での増殖アッセイ法。一過性トランスフェクションによって産生されたＧａｇ−Ｐｏｌ−Ｅｎｖ（白棒）およびＧａｇ−Ｐｏｌ（斜線棒）を刺激のために使用した。偽性トランスフェクトされた培養物からの上清を対照抗原とした。刺激のためにタンパク質を約１μｇ／ｍｌ ｐ２７ Ｇａｇで使用した。刺激指数は、ウイルス抗原存在下での培養物の増殖／偽性抗原存在下での培養物の増殖である。
【図２１】攻撃１２週間後でのリンパ節の組織形態およびウイルス負荷を示す。図２１Ａ：拡大した胚中心ならびに不連続な暗い区域および明るい区域のある非常に多くの二次濾胞が存在することを特徴とする濾胞過形成の証拠を示す、ワクチン接種マカクからの代表的なリンパ節。図２１Ｂ：濾胞減少および傍皮質リンパ細胞萎縮を示す、対照感染動物からの代表的なリンパ節。図２１Ｃ：非反応性胚中心を示す、齢が一致した非感染マカクからの代表的なリンパ節。図２１Ｄ：濾胞過形成の非特異的な指標を示すために、胚中心が占めるリンパ節総面積の割合を測定した。非感染対照のデータは、４匹の年齢が一致したアカゲザルのデータである。図２１Ｅ：ＳＨＩＶ−８９．６ ｇａｇおよびｐｏｌに相補的なアンチセンスリボプローブカクテルを用いたインサイチューハイブリダイゼーションによって、リンパ節のウイルス荷重（ｖｉｒａｌ ｂｕｒｄｅｎ）を測定した。検査されたリンパ節は全て鼠径リンパ節であった。
【図２２】攻撃後の時間的な抗体応答を示す。酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて、総Ｇａｇ抗体（図２２Ａ）または総Ｅｎｖ抗体（図２２Ｂ）のマイクログラムを測定した。ＭＴ−２細胞死滅およびニュートラルレッド染色を用いて、８９．６（図２２Ｃ）および８９．６Ｐ（図２２Ｄ）に対する中和抗体の力価を測定した。力価は、ヒトＰＢＭＣで増殖された表示ウイルスの５０％中和を生じる血清希釈の逆数である。動物の記号は図１９と同じである。
【図２３】ワクチン試験の相関関係および用量反応曲線（図２３ＡおよびＢ）を示す。攻撃２週間後（図２３Ａ）および３週間後（図２３Ｂ）での、ピークワクチン惹起ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴとウイルス負荷には逆相関がある。動物３（図１５Ｃを参照のこと）のピークＤＮＡ／ＭＶＡ ＥＬＩＳＰＯＴ試料がなくなったために、２４匹のワクチン接種動物のうち２３匹だけを相関関係に含める。図２３Ｃ：ピークＤＮＡ−ＭＶＡ応答でのＧａｇ ＥＬＩＳＰＯＴの平均高さの用量反応曲線（図１５Ｃからのデータ）。図２３Ｄ：ＤＮＡ／ＭＶＡ記憶ＥＬＩＳＰＯＴ応答の幅の用量反応曲線（図１６Ｂからのデータ）。図２３Ｅ：ＭＶＡ追加抗原刺激後のピーク抗Ｇａｇ抗体応答の用量反応曲線（図２２Ａからのデータ）。異なる用量のＤＮＡが、異なるレベルのＥＬＩＳＰＯＴおよび抗体応答を惹起した（Ｐ＜０．０５）。ＤＮＡ接種経路は抗体に有意な影響を及ぼしたが（Ｐ＝０．０２）、ＥＬＩＳＰＯＴ応答には影響を及ぼさなかった。
【図２４】ＨＡタンパク質を発現するＤＮＡの遺伝子銃接種により惹起された抗ＨＡ ＩｇＧを示す。
【図２５】３種類の異なるＨＡ ＤＮＡワクチンにより惹起された抗ＨＡ ＩｇＧのアビディティーを示す。
【図２６】ウイルス攻撃後の体重減少からの防御を示す。
【図２７】ワクチンにＥｎｖを含める重要性を示す。
【図２８】ＳＨＩＶ−８９．６Ｐで直腸内に攻撃された動物に投与されるワクチンにＥｎｖを含める重要性を示す。
【図２９】ベクターＤＮＡワクチン構築物の模式図である。
【図３０】インビトロでのワクチン構築物の発現を示すウエスタンブロットの結果を示す。
【図３１】麻疹ウイルス中和抗体の時間的な曲線を示す。

Claims (32)

1. λＴ０ターミネーターをコードする終結配列；
   原核生物複製起点；
   選択マーカー遺伝子；および
   病原体に由来する一つまたは複数の免疫原をコードするワクチン挿入物を含む真核生物転写カセット
   を含むベクター。
2. 病原体がウイルス病原体である、請求項１記載のベクター。
3. ウイルス病原体がＨＩＶ、麻疹、インフルエンザ、ポリオ、および風疹からなる群より選択される、請求項１記載のベクター。
4. 一つまたは複数の免疫原が、ＨＩＶ Ｇａｇ、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ Ｐｏｌ、ＨＩＶ Ｅｎｖ、ＨＩＶ ＶＬＰ、麻疹融合タンパク質、麻疹血球凝集素（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、麻疹核タンパク質、インフルエンザ血球凝集素、それらの変異体、およびそれらの部分配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）からなる群より選択される、請求項１記載のベクター。
5. 一つまたは複数の免疫原が、ＨＩＶ Ｇａｇ、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ Ｐｏｌ、ＨＩＶ Ｅｎｖ、およびＨＩＶ ＶＬＰ、それらの変異体、ならびにそれらの部分配列からなる群よりさらに選択される、請求項１記載のベクター。
6. 一つまたは複数の免疫原をコードするワクチン挿入物が少なくとも１つのＣ３ｄ遺伝子をさらに含む、請求項１記載のベクター。
7. 請求項１記載のベクターを含む治療的有効量の生理学的に許容される組成物を投与する段階を含む、患者を免疫化または治療する方法。
8. ＨＩＶ Ｇａｇ、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ Ｐｏｌ、ＨＩＶ Ｅｎｖ、ＨＩＶ ＶＬＰ、麻疹融合タンパク質、麻疹血球凝集素、麻疹核タンパク質、インフルエンザ血球凝集素、それらの変異体、およびそれらの部分配列からなる群より選択される一つまたは複数の免疫原を発現する組換えポックスウイルスベクターを含む治療的有効量の組成物を続いて投与する段階をさらに含む、請求項７記載の方法。
9. 一つまたは複数の免疫原が、ＨＩＶ Ｇａｇ、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ Ｐｏｌ、ＨＩＶ Ｅｎｖ、ＨＩＶ ＶＬＰ、それらの変異体、およびそれらの部分配列からなる群より選択される、請求項７記載の方法。
10. ＨＩＶ Ｇａｇ、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ Ｐｏｌ、ＨＩＶ Ｅｎｖ、ＨＩＶ ＶＬＰ、麻疹融合タンパク質、麻疹血球凝集素、麻疹核タンパク質、インフルエンザ血球凝集素、それらの変異体、およびそれらの部分配列からなる群より選択される一つまたは複数の免疫原を発現する治療的有効量の組換えポックスウイルスベクターを続いて投与する段階をさらに含む、請求項７記載の方法。
11. ベクターが、ＨＩＶ Ｇａｇ、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ Ｐｏｌ、ＨＩＶ Ｅｎｖ、ＨＩＶ ＶＬＰ、それらの変異体、およびそれらの部分配列からなる群より選択される一つまたは複数の免疫原を発現する、請求項７記載の方法。
12. 配列番号：１のＤＮＡ配列を含むベクター。
13. ＨＩＶ Ｇａｇ、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ Ｐｏｌ、ＨＩＶ Ｅｎｖ、ＨＩＶ ＶＬＰ、麻疹融合タンパク質、麻疹血球凝集素、麻疹核タンパク質、インフルエンザ選択性血球凝集素（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、インフルエンザ膜貫通血球凝集素、それらの変異体、およびそれらの部分配列からなる群より選択される一つまたは複数の免疫原をコードするワクチン挿入物をさらに含み、選択的に少なくとも１つのＣ３ｄ遺伝子を含む、請求項１２記載のベクター。
14. 一つまたは複数の免疫原が、ＨＩＶ Ｇａｇ、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ Ｐｏｌ、ＨＩＶ Ｅｎｖ、ＨＩＶ ＶＬＰ、それらの変異体、およびそれらの部分配列からなる群より選択される、請求項１２記載のベクター。
15. 配列番号：２のＤＮＡ配列を含むベクター。
16. ＨＩＶ Ｇａｇ、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ Ｐｏｌ、ＨＩＶ Ｅｎｖ、ＨＩＶ ＶＬＰ、麻疹融合タンパク質、麻疹血球凝集素、麻疹核タンパク質、インフルエンザ選択性血球凝集素、インフルエンザ膜貫通血球凝集素、それらの変異体、およびそれらの部分配列からなる群より選択される一つまたは複数の免疫原をコードするワクチン挿入物をさらに含み、選択的に少なくとも１つのＣ３ｄ遺伝子を含む、請求項１５記載のベクター。
17. 一つまたは複数の免疫原が、ＨＩＶ Ｇａｇ、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ Ｐｏｌ、ＨＩＶ Ｅｎｖ、ＨＩＶ ＶＬＰ、それらの変異体、およびそれらの部分配列からなる群より選択される、請求項１５記載のベクター。
18. 配列番号：３のＤＮＡ配列を含むベクター。
19. ＨＩＶ Ｇａｇ、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ Ｐｏｌ、ＨＩＶ Ｅｎｖ、ＨＩＶ ＶＬＰ、麻疹融合タンパク質、麻疹血球凝集素、麻疹核タンパク質、インフルエンザ選択性血球凝集素、インフルエンザ膜貫通血球凝集素、それらの変異体、およびそれらの部分配列からなる群より選択される一つまたは複数の免疫原をコードするワクチン挿入物をさらに含み、選択的に少なくとも１つのＣ３ｄ遺伝子を含む、請求項１８記載のベクター。
20. 一つまたは複数の免疫原が、ＨＩＶ Ｇａｇ、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ Ｐｏｌ、ＨＩＶ Ｅｎｖ、ＨＩＶ ＶＬＰ、それらの変異体、およびそれらの部分配列からなる群より選択される、請求項１８記載のベクター。
21. 配列番号：４のＤＮＡ配列を含むベクター。
22. ＨＩＶ Ｇａｇ、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ Ｐｏｌ、ＨＩＶ Ｅｎｖ、ＨＩＶ ＶＬＰ、麻疹融合タンパク質、麻疹血球凝集素、麻疹核タンパク質、インフルエンザから選択された血球凝集素、インフルエンザ膜貫通血球凝集素、それらの変異体、およびそれらの部分配列からなる群より選択される一つまたは複数の免疫原をコードするワクチン挿入物をさらに含み、選択的に少なくとも１つのＣ３ｄ遺伝子を含む、請求項２１記載のベクター。
23. 一つまたは複数の免疫原が、ＨＩＶ Ｇａｇ、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ Ｐｏｌ、ＨＩＶ Ｅｎｖ、ＨＩＶ ＶＬＰ、それらの変異体、およびそれらの部分配列からなる群より選択される、請求項２１記載のベクター。
24. 配列番号：５のＤＮＡ配列を含むベクター。
25. ＨＩＶ Ｇａｇ、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ Ｐｏｌ、ＨＩＶ Ｅｎｖ、ＨＩＶ ＶＬＰ、麻疹融合タンパク質、麻疹血球凝集素、麻疹核タンパク質、インフルエンザから選択された血球凝集素、インフルエンザ膜貫通血球凝集素、それらの変異体、およびそれらの部分配列からなる群より選択される一つまたは複数の免疫原をコードするワクチン挿入物をさらに含み、選択的に少なくとも１つのＣ３ｄ遺伝子を含む、請求項２４記載のベクター。
26. 一つまたは複数の免疫原が、ＨＩＶ Ｇａｇ、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ Ｐｏｌ、ＨＩＶ Ｅｎｖ、ＨＩＶ ＶＬＰ、それらの変異体、およびそれらの部分配列からなる群より選択される、請求項２４記載のベクター。
27. 患者を免疫化または治療する方法であり、以下の段階を含む方法：
    ベクターが配列番号：１、２、３、４、および５から選択される配列を含む核酸であり、治療的有効量の組成物の投与が筋肉内経路または皮内経路を通る、ベクターを含む治療的有効量の生理学的に許容される組成物を投与する段階。
28. ベクターが、ＨＩＶ Ｇａｇ、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ Ｐｏｌ、ＨＩＶ Ｅｎｖ、ＨＩＶ ＶＬＰ、麻疹融合タンパク質、麻疹血球凝集素、麻疹核タンパク質、インフルエンザ血球凝集素、それらの変異体、およびそれらの部分配列からなる群より選択される一つまたは複数の免疫原、ならびに選択的に少なくとも１つのＣ３ｄ遺伝子を発現する、請求項２７記載の方法。
29. ベクターが、ＨＩＶ Ｇａｇ、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ Ｐｏｌ、ＨＩＶ Ｅｎｖ、ＨＩＶ ＶＬＰ、それらの変異体、およびそれらの部分配列からなる群より選択される一つまたは複数の免疫原を発現する、請求項２７記載の方法。
30. ＨＩＶ Ｇａｇ、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ Ｐｏｌ、ＨＩＶ Ｅｎｖ、ＨＩＶ ＶＬＰ、麻疹融合タンパク質、麻疹血球凝集素、麻疹核タンパク質、インフルエンザ血球凝集素、それらの変異体、およびそれらの部分配列からなる群より選択される一つまたは複数の免疫原を発現する治療的有効量の組換えポックスウイルスベクターを続いて投与する段階をさらに含む、請求項２７記載の方法。
31. ベクターが、ＨＩＶ Ｇａｇ、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ Ｐｏｌ、ＨＩＶ Ｅｎｖ、ＨＩＶ ＶＬＰ、それらの変異体、およびそれらの部分配列からなる群より選択される一つまたは複数の免疫原を発現する、請求項２７記載の方法。
32. 請求項２９記載のベクターを含む治療的有効量の組成物を投与する段階を含む、免疫化または治療を必要とする患者を免疫化または治療する方法。

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