JP2004514644A - 抗菌化合物および処方物 - Google Patents

Abstract

本発明は、鎖長に関し非水素原子２から３５個を有する主鎖を含み、この主鎖に共有カップリングしている少なくとも２個の嵩高な親油性基を有し、かつアニオン基よりも少なくとも１個多いカチオン基を有する分子を、微生物細胞膜を不安定化するための薬剤を製造する際に使用すること、および鎖長に関し非水素原子２から３５個を有する主鎖を含み、この主鎖に共有カップリングしている、少なくとも９個の非水素原子を含む１個の超嵩高な親油性基を有し、かつアニオン基よりも少なくとも２個多いカチオン基を有する分子を膜作用性抗菌剤として使用すること、ならびに特にはペプチド誘導体およびペプチド様化合物を含むペプチドであるこのような分子を用いる治療方法に関する。

Description

【０００１】
本発明は、生体活性分子、特に抗菌活性を示す小分子に関する。
ペプチドおよびその誘導体は以前から、治療的に重要な分子とみなされている。幅広い種類の生命体が、ペプチドをその宿主防御機構の一環として使用している。抗菌ペプチドは、細菌および哺乳動物の多様な種から単離されている［Ｌｅｈｒｅｒ，Ｒ．Ｉ．、Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ，Ａ．Ｋ．ａｎｄ　Ｇａｎｚ，Ｔ．（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１、１０５〜１２８］。一般に、これらのペプチドは、正味の正電荷を有しており、細菌細胞膜中の外側リン脂質二重層との相互作用により、両親媒性α−へリックスまたはβ−シート構造を形成する傾向を有する［Ｂｅｓａｌｌｅ，Ｒ．、Ｇｏｒｅａ，Ａ．、Ｓｈａｌｉｔ，Ｊ．、Ｍｅｔｇｅｒ，Ｊ．Ｗ．、Ｄａｓｓ，Ｃ．Ｄｅｓｉｄｅｒｉｏ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ　Ｆｒｉｄｋｉｎ，Ｍ．（１９９３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６　１２０３〜１２０９］。Ｌ群（溶菌）ペプチドとして分類されるいくつかのペプチドは、細菌細胞膜と相互作用して、おそらくイオン−チャネルまたは孔（ｐｏｒｅｓ）を形成し［Ｌｕｄｔｋｅ，Ｓ．Ｊ．、Ｈｅ，Ｋ．、Ｈｅｌｌｅｒ，Ｗ．Ｔ．、Ｈａｒｒｏｕｎ，Ｔ．Ａ．、Ｙａｎｇ，Ｌ．ａｎｄ　Ｈｕａｎｇ，Ｈ．Ｗ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３５　１３７２３〜１３７２８］、透過性を変えて、結果的に細胞溶解をもたらすと考えられているが、大抵の場合、抗生作用の詳細な分子機構は知られていない。
【０００２】
マガイニン（ｍａｇａｉｎｉｎ）は、ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）の皮膚に由来する抗細菌ペプチドであり、特に細菌を溶解させるので、Ｌ群抗生物質として分類されている；ハチ毒であるマストロパラン（ｍａｓｔｒｏｐａｒａｎ）などの他のペプチドには、この特異性がなく、これらは、真核細胞、さらに原核細胞を溶解し、Ｌ群毒素と称されている［Ｔｙｔｌｅｒ，Ｅ．Ｍ．、Ａｎａｎｔｈａｒａｍａｉａｈ，Ｇ．Ｍ．、Ｗａｌｋｅｒ，Ｄ．Ｅ．、Ｍｉｓｈｒａ，Ｖ．Ｋ．、Ｐａｌｇｕｎａｃｈａｒｉ，Ｍ．Ｎ．ａｎｄ　Ｓｅｇｒｅｓｔ，Ｊ．Ｐ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３４　４３９３〜４４０１］。
【０００３】
マガイニンおよびマストロパランと同様に、宿主防御ペプチドは、ガおよびハエ（ｃｅｃｒｏｐｉｎ）から、さらにカブトガニからも単離されている。捕食者を退けるためのこれらの宿主防御ペプチド、例えば毒素の直接作用は明らかである。抗生効果を示すペプチドの探索により、細胞毒性特性を有するとは予期されない他のタンパク質／ペプチドの同定がなされている。これらの１種はラクトフェリンであり、これは、弱い抗細菌効果も示す鉄輸送体である。
【０００４】
公知の抗菌ペプチドの多くは、１０個またはそれ以上、典型的には２０個またはそれ以上のアミノ酸を含み、通常はα−らせん形であるペプチドに、細菌細胞膜に広がって、孔を形成するに充分な長さを与えるために、この数のアミノ酸が必要である。そうした機構が、このようなペプチドの多くがその細胞毒性活性を及ぼす際に一般的に認められる方法である。
【０００５】
従来技術の抗菌ペプチドの合成は困難であり、典型的には、該当するペプチドを得るために培養および収穫することができる細菌または他の生命体により合成されるペプチドを必要とし、翻訳の直接的な生成物を単離した後に、通常は追加の処理ステップが必要である。活性ペプチドが比較的短いと確認されれば、これをアミノ酸で構成されるブロック（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋｓ）または利用可能なジ−またはトリ−ペプチドからの合成により、経済的に製造することができるであろう。加えて、短いペプチドは、生体輸送に関しても利点を示す。鼻腔路の毛細血管を通しての吸入および吸収などにより、注射の必要なしに投与することができる抗生物質に対する要求が高まっている。したがって、本発明の目的は、生体に、該当するペプチドをコードする核酸で生命体を形質転換する必要なしに合成することができるほど小さく、様々に異なる投与の方法を提示する生体活性、特に抗菌、具体的には抗細菌性の分子を提供することである。
【０００６】
広範囲に使用されている公知の薬剤に対して耐性を示す細菌株の数が増加していることから、新規抗生物質の探索は、特に緊急性を呈している。医薬品、さらに農業、環境保護および食品安全性の各分野で作用している薬剤は常に、新しい抗菌剤を必要としていて、複数の異なる抗菌製剤で所定の集団または場所を処置して、望ましくない細菌を効果的に除去する必要がある。
【０００７】
すべてのペプチドは、ヒトまたは動物体内で酵素的に分解されやすく、このことは、とりわけ短いペプチドに当てはまる。したがって、基本となるペプチドの生物活性を維持または増強するが、より大きい循環半減期を有するペプチド誘導体またはペプチド様物質が特に有利であり、このような化合物の提供が、本発明のもう１つの課題を構成している。ペプチド様物質および他の有機分子は、非発酵方法により、大量に容易に合成することができる。
【０００８】
活性ペプチドを同定するためには、コンビナトリアルライブラリーが使用されている（Ｂｌｏｎｄｅｌｌｅ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ　ａｌ．［１９９４］Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ．３８、Ｎｏ．１０、２２８０〜２２８６）。この方法により非常に数多くのペプチドをスクリーニングすることができるが、他のペプチドと比較しての１つのペプチドの活性の背後にある理由は明確ではない。特定の配列については活性を示す変則的な結果は、一群の分子の探索を鼓舞するかも知れないが、全体としては、最良の治療用候補分子を示さない。加えて、コンビナトリアル化学を用いると、往々にして、どの化合物が実際に生じるかを正確に知ることは難しく、製造された化合物の実体を確認するためには、骨の折れる試験および分析が必要である。配列またはサイズに依存しない、核となる活性モチーフを同定したい場合には、コンビナトリアル技術は不適当である。したがって、典型的にはモノマーから分子を構築する際に使用される化学は、生じうる分子の種類を限定するように、むしろシンプルでなければならない。
【０００９】
今回の場合には、本発明者は、毒性を制限し、比較的簡単な製造ならびに活性分子の投与経路に関する柔軟性を可能にしつつ、所望の治療的活性および一般的抗菌活性を提供するためにどのような構造成分が必要とされるかを調査することに努めていた。使用する技術は、干草の山の中に１本の針を探すことに似た、何千もの、いや何百万もの分子の目的の定まらない製造および分析よりはむしろ、合理的なデザインに基づいていた。本発明者は、前記で検討した所望の特性を有する分子を提供することに必要かつ充分な重要モチーフおよびそれらの成分を同定することに努めて来た。このようなアプローチが有効であることが判明し、特に、このアプローチは、おそらく合成することができて、好ましくは酵素による分解に対して耐性のある、即ち非誘導体化ペプチドではない最も小さく、単純な分子の同定を可能にすることにおいて役立つ。
【００１０】
意外にも、アミノ酸４個またはそれ未満に等しい小さい分子は、充分に嵩高く親油性のカチオン基を有する場合には、良好な生体活性を示すことが判明した。以前には、比較的大きな分子、典型的には長鎖のペプチドのみが、所望する治療活性を示すと考えられていて、その仕方の結果として、このような分子は、細胞膜に対してその作用を及ぼすと信じられていた。これらの小さい分子が良好な選択性を示す、即ち、これらは、微生物に対しては毒性を有するが、宿主の真核細胞に対しては、あるとしても、非常に低い毒性活性しかないことは、特に驚くべきことである。
【００１１】
したがって、本発明の一態様では、鎖長に非水素原子２から３５個、典型的には４から３５個、好ましくは４から２０個、さらに好ましくは４から１２個、例えば６から９個を有する主鎖（ｂａｃｋｂｏｎｅ）を含み、この主鎖に共有結合している少なくとも２個の嵩高な親油性基を有し、しかもアニオン基よりも少なくとも１個多いカチオン基を有する生体活性分子が、治療で、例えば抗菌剤、特に抗細菌剤として使用するために提供される。
【００１２】
この定義は、短い未修飾のペプチドを含むが、遺伝的にコードされるアミノ酸２０種から選択されるアミノ酸のみを含有し、かつ嵩高なまたは親油性のＮ末端またはＣ末端修飾を有しないようなペプチドは、本発明のこの態様の範囲内には含まれない。本発明の目的は、活性なペプチドフラグメント自体を同定することではなく、化学合成により調製することができる安定で、活性な分子を提供することである。
【００１３】
このような抗菌分子はさらに、例えば農業または家庭内または産業の場面において、微生物汚染を受けやすい物質のための滅菌剤としての非治療的な利用を有する。したがって、さらなる態様では、本発明は、鎖長に関し非水素原子２から３５個、典型的には４から３５個、好ましくは４から２０個、さらに好ましくは４から１２個、例えば６から９個を有する主鎖を含み、この主鎖に共有結合している少なくとも２個の嵩高な親油性基を有し、かつアニオン基よりも少なくとも１個多いカチオン基を有する生体活性分子を抗菌剤として、特に抗細菌剤として使用することを提供する。
【００１４】
これらの分子は、抗菌活性を示し、特にこれらは、直接的な膜−作用機構を介して細胞毒効果を及ぼすので、膜作用性抗菌剤と称することができる。これらの分子は、細胞膜を溶解するか、不安定化するか、さらにはこれに孔を開ける。このことは、標的細胞、例えば細胞表面受容体のタンパク質性成分に作用するか、これと相互作用する薬剤以上に、著しい治療上の優越性を呈示する。突然変異は、標的タンパク質の新しい形をもたらして、結果的に抗生物質耐性を生じさせうるが、脂質膜にとり過激な変化が生じて細胞毒性効果を防ぐようになることは、まずほとんどない。溶解作用は極めて迅速な細胞死をもたらし、したがって、細菌が増殖する機会を得る前に、細菌を殺してしまうという利点を有する。加えて、これらの分子は、標的微生物を死滅させるか、害する他の有用な特性、例えば、タンパク質合成を阻害する能力を有し、したがって、これらは、マルチ標的活性を有しうる。
【００１５】
したがって、本発明はさらに、鎖長に関し非水素原子２から３５個、典型的には４から３５個、好ましくは４から２０個、さらに好ましくは４から１２個、例えば６から９個を有する主鎖を含み、この主鎖に共有結合している少なくとも２個の嵩高な親油性基を有し、かつアニオン基よりも少なくとも１個多いカチオン基を有する生体活性分子を、膜作用性の抗菌活性を有する薬剤を製造する際の使用を提供する。この作用の様式は、本発明の分子は、併用療法の一環として、他の活性な抗菌剤と組み合わせて投与することができるが、これらはさらに、それ自体で、即ち、治療方式において唯一の抗菌剤として投与することもできることを意味している。このことは例えば、外向きフラックスポンプ（ｅｆｆｌｕｘ ｐｕｍｐ）阻害剤として作用し、主剤の抗菌剤とともに同時投与され、往々にしてそれ自体だけでは抗菌活性を有しない分子と対照的である。
【００１６】
したがって、本発明の好ましい実施形態では、微生物の細胞膜を不安定化し、かつ／または透過性にさせるための薬剤の製造において、本明細書に定義された分子の使用が提供される。言い換えると、微生物細胞膜を不安定化する使用のために、これらの分子を提供する。「不安定化」とは、これらに限らないが、膜を薄くすること、水、イオンまたは代謝物質などの膜透過性を高めること（典型的には、チャンネルを伴わない）を含む、正常な三次元的脂質二分子構造の撹乱を意味し、これはさらに、細菌の呼吸系を損なう。抗菌ペプチドにより惹起される細菌溶解のメカニズムは、ＳｉｔａｒａｍおよびＮａｇａｒａｊ（Ｎ．Ｓｉｔａｒａｍ　ａｎｄ　Ｒ．Ｎａｇａｒａｊ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｐｈｙｓ．Ａｃｔａ　ｖｏｌ　１４６２　１９９９、ｐ．２９〜５４）およびＳｈａｉ（Ｙ．Ｓｈａｉ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ　ｖｏｌ　１４６２　１９９９、ｐ．５５〜７０）により広く概説されている。不安定化により、細胞は死滅させられるか、または弱体化されて、そのため成長するか、または増殖することはほとんどない。
【００１７】
先に論じたように、今回、本発明者らは、分子に治療的（抗菌）活性と同時に低い毒性という望ましい特性を付与する分子の機能的および構造的モチーフを同定することに鋭意努めてきた。本発明の好ましい実施態様において、第３のタイプの基をさらに分子内に発見したが、初めの２つのタイプは、正に荷電した基と、嵩高な親油性基である。この第３の基は、カルボニル、またはスルホン、チオカルボニルまたはイミンなどといった同様の極性基である。このような基は、水素結合の受容基であり、分子の主鎖の一部として簡単に発見することができ、例えばペプチドまたは他の主鎖で見られるアミド結合であり、他の主鎖は、分子に所望の極性を与えるエステルまたはチオエステル結合を含んでもよい。
【００１８】
主鎖の「鎖長」とは、主鎖中の相互に最も離れている２個の原子間にある原子数で示される、最短の距離のことである。相互に最も離れている２個の原子とは、最も多い数の共有結合により相互に分離されているもののことである。したがって、相互に最も離れている２個の原子のうちの一方から、他方へと至るまでに、さらに６個の原子を通過する必要がある場合には、主鎖は鎖長に関し原子８個を有する。水素原子は、主鎖の原子とはみなさず、主鎖は典型的には、炭素、窒素または酸素、場合によってはイオウまたはリン原子を含む。主鎖は線状、分枝鎖、環状または多環状であってよい。
【００１９】
主鎖は、１個または複数の環状基を有してよいが、前記で定義した嵩高な親油性基は、主鎖の一部を形成するものとはみなされない。主鎖は通常、原子の中断されていない鎖（１個または複数の閉環（ｒｉｎｇ）を形成する鎖も含む）の形成により特徴付けられ、この鎖には、嵩高で親油性の基およびカチオン基が結合している。「中断されていない」とは、嵩高な親油性基が主鎖原子の鎖を中断するのではなく主鎖に結合してそれとともに主鎖が連続していることを意味する。好ましくは、主鎖の原子は線状鎖または分枝鎖を形成する。
【００２０】
したがって、次の分子は、前記で定義した主鎖の鎖長を算出するための方法に従うと、鎖長に関し原子８個を含む主鎖を有する。
【００２１】
【化１】

【００２２】
次の分子も、原子８個を含む主鎖を有する；後記のように、カチオン基部分を形成する原子は、主鎖の一部であってよい。
【００２３】
【化２】

【００２４】
１個または複数の嵩高な親油性基が直接に主鎖と結合していて、結果的にただ１個の原子が、定義された嵩高な親油性基と主鎖との一部である場合には、主鎖は典型的には、４個未満の原子のみを含む。このような仕方で原子が共有されている場合、この原子は機能的には、嵩高な親油性基の一部であり、主鎖の原子としては数えられない。このような分子を下式に示す；この分子はしたがって、原子２個を含む主鎖を有する。
【００２５】
【化３】

【００２６】
「嵩高な親油性基」とは、典型的には、少なくとも１個の閉環系を包含する、少なくとも４個、好ましくは少なくとも５個、さらに好ましくは少なくとも６個の非水素原子を有する非荷電の基を意味する。便宜上、このような基を本明細書では、場合によって簡略に「嵩高な」基とも称する。分子中に存在する１個または複数の嵩高な親油性基は、原子５個または６個からなる２個またはそれ以上の閉環を有してもよく、都合上、２個またはそれ以上のこれらの環は縮合しているか、架橋している。好ましくは、少なくとも１個の嵩高な親油性基は、遺伝的にコードされるアミノ酸２０種のいずれかのアミノ酸の未修飾Ｒ基に由来しない。その特性において三次元的な基であることから、芳香族の嵩高な親油性基が好ましい。上記基が、１個または複数の環を含有しない場合には、これは好ましくは分枝しているであろう。
【００２７】
官能基（例えば荷電基または嵩高な基）の位置決定はそれほど重要ではないことが判明している。嵩高な親油性基は全体として、分子の活性に対して複合的な影響を有する。したがって、比較的小さな基が、むしろ大きな基と一緒になって、２個の適度なサイズの嵩高な基と同様の活性をもたらしうる。したがって、分子中に存在する最小の嵩高な基の例は、ｔ−ブチル基２個であるが、このような基または同様のサイズの基が１つ存在する場合には、第２のより大きな嵩高な基が包含されるのが好ましい。
【００２８】
本明細書で定義される分子用の嵩高な基の好ましい下限はしたがって、１個のｔ−ブチル基または同等の基（僅かに大きいが、例えばトリメチルシリル）および１個の６員環、例えばシクロヘキシルまたはフェニル基である。嵩高な基の階層は、アミノ酸の次のリストで例示することができ、これは、最も小さく嵩高で、活性な：ｔ−ブチルグリシン、フェニルアラニン、シクロヘキシルアラニン、トリプトファン、ｔ−ブチルフェニルアラニン、ビフェニルアラニンに始まり、最も大きく嵩高で、活性なトリｔ−ブチルトリプトファンである。当業者の読者は、このような基が、様々なサイズの例として与えられていて、類似の嵩である他の基も、分子の活性に著しく影響を及ぼすことなく置換基として使用することができることは認識されるであろう。
【００２９】
好ましくは、上記分子は、フェニル基のサイズまたはそれ以上の、即ち６員環または同等の基（例えば−ＣＨ_２Ｃ（ＣＨ_３）_３）を有する２個の基を含む。特に好ましくは、一方の嵩高な基はフェニル基（または同等の基）またはそれより大きいもの、即ち、６個またはそれ以上の非水素原子を有し、他方は、例えば、それぞれ１０個、１１個および１３個の非水素原子を有するトリプトファン、ｔ−ブチルフェニルアラニンまたはビフェニルアラニンのＲ基によりもたらされるような９個またはそれ以上の非水素原子を有する。分子の嵩高な基の必要数および性質は、微生物のタイプによって異なり、通常は、グラム陰性菌よりもグラム陽性菌に対してかなり活性な既定の分子では、微生物の種類によって異なることを忘れてはならない。
【００３０】
「カチオン基」とは、ｐＨ７．０で正味の正電荷を有する基、あるいは生理的条件下に、ｐＨ７．０で有効正電荷を有する基をもたらしうるこのような基の前駆体を意味している。このような前駆体基は当業界で公知である。同様に「アニオン基」は、ｐＨ７．０で有効負電荷を有するものか、その前駆体である。正電荷は、細胞膜を構成し、負に荷電しているリン脂質をひきつけ、これと相互作用するために重要である。このカチオン官能性をもたらす適当な化学基には、アンモニウム、グアニジノ、イミダゾリウム、スルホニウムまたはホスホニウム基またはテトラゾールを含むものが挙げられる。
【００３１】
カチオン性基は、嵩高な親油性基の一部として包含されていてよく、例えば、５’−アミノエチルトリプトファンなどの修飾されたトリプトファン基であってよい（ＲＳＰ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄｓ　Ａｎａｌｏｇｕｅｓ　Ｉｎｃ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡから側鎖ＢｏｃおよびＮ−αＦＭＯＣ誘導体として入手可能）。分子がｐＨ７．０にある場合に、実際に正電荷を担持している原子は、主鎖から離れていてもよい。例えば、アルギニンのＲ基を考えると、この場合、Ｒ基全体が、カチオン基であると考えられ、グアニジノ基とα炭素原子とを結合している原子はしたがって、カチオン基の一部であって、主鎖の一部ではないと考えられる。
【００３２】
例えば、Ａｒｇ−Ｔｒｐ　ＯＢｚ分子、すなわちそのＣ末端がベンゾイルエステルの形成により修飾されているこのジペプチドは、アルギニンのＲ基により供給されるカチオン基１個および遊離のＮ末端に１個を有する。アニオンＣ末端が修飾されているため、分子は、アニオン基よりも２個余分のカチオン基を有する、即ち追加のカチオン基２個を有する。同様に、例えばシクロヘキシルカルボキシレート基により、Ｎ末端が修飾された場合には、カチオン基は「失われる」であろう。
【００３３】
Ｃ末端の修飾を介して分子のカチオン性を高めることとなる基はさらに、前記の例のように、嵩高な親油性基ももたらすこともできる。
窒素原子、例えばペプチドのＮ末端でカチオン性アンモニウム基の一部を形成する窒素原子は、主鎖原子の１個であってよい。したがって、カチオン基は、主鎖の一部を形成するか、これに結合してよい。
【００３４】
本発明により使用するための分子は典型的には、１個または複数、好ましくは２個またはそれ以上のカチオン分子を有するが、存在するカチオン基およびアニオン基の両方の数を考慮することが重要である。例えば、トリ−ペプチドのＴｒｐ−Ａｒｇ−Ｔｒｐは２個のカチオン基を有し、これは、アルギニンのＲ基およびＮ末端基により供給されている。しかしながら、アニオンＣ末端は、修飾されていないため、分子は全体としては、アニオン基よりも１個だけ多いカチオン基を有する。
【００３５】
本明細書を通して、遺伝的にコードされるアミノ酸に関してよく知られている３文字および１文字コードを使用する。
本発明の生体活性分子は、好ましくは２個またはそれ以上の嵩高な親油性基および２個またはそれ以上の追加のカチオン基を含む（「追加の」とは、アニオン基と比較において、分子中に存在する余分のカチオン基の数を示すために使用される）。本発明者らは、２個の追加のカチオン基および２個の嵩高な親油性基の存在を、特に活性な分子を提供する１つのモチーフとして同定したが、さらなる嵩高な基および／またはカチオン基が存在してもよい。
【００３６】
あるいは、少なくとも３個の嵩高な親油性基および少なくとも１個の追加のカチオン基、例えば３個の嵩高な親油性基および１個の追加のカチオン基を含む分子もまた、良好な活性を有することが判明していて、これは、もう１つのとりわけ好ましいモチーフである。カチオン性または嵩高さは単独では、所望の活性をもたらさない。同様に、分子中の３個の追加のカチオン基と、たった１個の嵩高な親油性基とでは、その嵩高な親油性基が「超」嵩高でかつ親油性でない限り、所望のレベルの生体活性をもたらさない。
【００３７】
理論に拘束されることは望まないが、「超嵩高で親油性の基」は、２個の通常の嵩高な親油性基と同様の影響を分子に及ぼしていると思われる。「超嵩高で親油性の基」とは、それぞれ４個またはそれ以上の非水素原子を有する１個または複数の閉環系、好ましくは２個またはそれ以上の閉環系を含む少なくとも９個、典型的には少なくとも１０個もしくは１１個、好ましくは少なくとも１２個もしくは１３個、さらに好ましくは１５個もしくは１８個の非水素原子を有する基を意味する。例えばトリ−ｔ−ブチルトリプトファン、ジ−ｔ−ブチルトリプトファンまたはＰＭＣ（２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル）修飾されたトリプトファンまたはアダマンチルアラニンのＲ基である。超嵩高な基は好ましくは少なくとも、ｔ−ブチル基に結合している１個の６員環、例えばｔ−ブチルフェニル基の同等基を含む。２個の縮合している、または特には非縮合の５または６員環、例えばナフチル、ジフェニルメチル、ビフェニルまたはより大きな基を含む基がさらに好ましい。
【００３８】
したがって、さらなる態様では、本発明は、治療で、例えば抗菌剤として、特に抗細菌剤として使用するための、鎖長に関し非水素原子２から３５個、典型的には４から３５個、好ましくは４から２０個、さらに好ましくは４から１２個、例えば６〜９個からなる主鎖を含み、主鎖に共有結合している、少なくとも１個の超嵩高な親油性基を有し、アニオン基よりも少なくとも２個多いカチオン基を有する生体活性分子を提供する。前記のように、これらの分子は、膜作用性抗菌剤である。
【００３９】
本発明のさらなる態様は、これらの分子の非治療的薬剤としての使用を含む；これらの分子の一般的な抗菌活性を利用する適切な非治療的使用については、本明細書で検討している。
これらの分子は、また前記のように、主鎖に共有結合している１個または複数の通常の嵩高な親油性基を含んでもよい。
【００４０】
前記の生体活性分子のうちで、アミノ酸１〜４個、好ましくはアミノ酸２個もしくは３個、簡便にはアミノ酸４個を含むペプチドが好ましい。アミノ酸は、遺伝的にコードされるアミノ酸、修飾された遺伝的にコードされるアミノ酸あるいは天然に生じるか、生じない、修飾もしくは未修飾の遺伝的にコードされないアミノ酸であってもよい。αアミノ酸ばかりでなくβおよびγアミノ酸もまた「アミノ酸」の用語の範囲内に含まれる。ペプチドは事実上、環式であってもよい。「ペプチド」の用語には、デプシペプチド（ｄｅｐｓｉ ｐｅｐｔｉｄｅ）も含まれる。
【００４１】
典型的には、これらのペプチドまたはペプチド由来分子は、Ｎ−および／またはＣ−末端修飾基を包含する。嵩高な親油性基は、アミノ酸残基のＲ基によってもたらされていてよく、かつ／またはＮ−またはＣ−末端の修飾基の一部であってよい。カチオン基は、遊離のＮ−末端基、アミノ酸Ｒ基またはＮまたはＣ末端修飾基の一部であってよい。Ｃ末端は、好ましくは修飾されていて、例えばアミド化またはさらに好ましくはエステル化されている。アミノ酸「Ｒ基」の用語の使用は、当業界では充分に理解されるであろうし、α−炭素原子に結合している様々な基、例えばアラニンではメチル基に言及するために、本明細書を通して一貫して使用している。
【００４２】
したがって、本明細書で記載している生体活性分子に関する好ましいタイプの主鎖は、ペプチドのもしくはペプチド様の主鎖である。ペプチド主鎖は、
【００４３】
【化４】

【００４４】
結合、ペプチド結合またはアミド結合により特徴付けられる。ペプチド主鎖は、少なくとも１つのこのようなペプチド結合を包含する。ペプチド結合で終わっている主鎖、例えばアミド化カルボキシル基は、この基にのみに基づくならば、ペプチド主鎖とは考えられない。したがって、ペプチド主鎖と分類されるには、主鎖は、１個または複数の内部ペプチド結合を有しているべきである。
【００４５】
ペプチド主鎖は、１個または複数の内部ペプチド結合によって特徴付けられるが、ペプチドは、各アミノ酸残基を結合するペプチド結合を有するであろう。
したがって、少なくとも１つのアミド結合は残っているが、１つまたは複数のアミド結合が、替わりのリンカーに置換されている化合物は、前記で定義されたようなペプチド主鎖を有するが、この化合物は全体としては、ペプチドではなく、ペプチド様物質である。
【００４６】
ペプチド類似（ペプチド様）主鎖は、適切な主鎖のもう１つの群であり、例えば、これらは、全体としての分子に、加水分解酵素に対する抵抗性をもたらすために好ましい。ペプチド様の主鎖は通常、線状であるか、ペプチド主鎖に似た縮合環式基の線状列である。
ペプチド様化合物は典型的には、そのペプチド同等物の極性、三次元的サイズおよび機能性（生体活性）の保持により特徴付けられるが、その場合、ペプチド結合は、往々にしてさらに安定な結合により置換されている。「安定な」とは、加水分解酵素による酵素分解に対して、より抵抗性があることを意味している。通常、アミド結合に代わる結合（アミド結合の代理）は、アミド結合の多くの特性、例えばコンホメーション、立体的な嵩高さ、静電的特性、水素結合の可能性などを維持している。「Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓｉｇｎ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」の第１４章（Ｋｒｏｇｓｇａａｒｄ、Ｌａｒｓｅｎ，Ｌｉｌｊｅｆｏｒｓ　ａｎｄ　Ｍａｄｓｅｎ（Ｅｄｓ）１９９６、Ｈｏｒｗｏｏｄ　Ａｃａｄ．Ｐｕｂ）は、ペプチド様化合物の設計および合成に関する従来技術の一般的な検討を提供している。分子が、酵素の特異的活性部位よりもむしろ膜と反応する本発明の場合には、親和性および有効性または基質機能を正確に模倣することに関して記載された問題のいくつかは関係がなく、ペプチド様物質（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）は、所定のペプチド構造または必要な官能基のモチーフをベースに容易に調製することができる。適切なアミド結合の代理には、次の群が挙げられる：Ｎ−アルキル化（Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｒ．ｅｔ　ａｌ．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ．、１９９５、４６，４７）、レトロ−逆アミド（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｅ ａｍｉｄｅ）（ Ｃｈｏｒｅｖ，ＭおよびＧｏｏｄｍａｎ，Ｍ．、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ、１９９３、２６、２６６）、チオアミド（Ｓｈｅｒｍａｎ　Ｄ．Ｂ．ａｎｄ　Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９０、１１２、４３３）、チオエステル、ホスホネート、ケトメチレン（Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｒ．Ｖ．ａｎｄ　Ｋｉｍ，Ｈ．Ｏ．Ｊ．Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ．、１９９５、６０、５１０７）、ヒドロキシメチレン、フルオロビニル（Ａｌｌｍｅｎｄｉｎｇｅｒ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ．、Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．、１９９０、３１、７２９７）、ビニル、メチレンアミノ（Ｓａｓａｋｉ，Ｙ　ａｎｄ　Ａｂｅ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９９７　４５、１３）、メチレンチオ（Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、１９９３、１３、１９）、アルカン（Ｌａｖｉｅｌｌｅ，Ｓ．ｅｔ．ａｌ．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ．、１９９３、４２、２７０）およびスルホンアミド（Ｌｕｉｓｉ，Ｇ．ｅｔ　ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．１９９３、３４、２３９１）。
【００４７】
本発明のペプチド様化合物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）は、アミノ酸とサイズおよび機能においてほぼ等しい、１個または複数、好ましくは２個または３個の同一とみなしうるサブユニットを有してよい。したがって本明細書においては「アミノ酸」なる用語は、簡便には、ペプチド様化合物の等価サブユニットに言及するために使用することもできる。さらに、ペプチド様化合物は、アミノ酸のＲ基に等しい基を有してもよく、修飾されたＲ基を含む適切なＲ基およびＮおよびＣ末端の修飾基に関する本明細書での検討は、必要な変更を加えれば、ペプチド様化合物にも当てはまる。
【００４８】
前記で挙げた文献で検討されているように、アミド結合の置換と同様に、ペプチド様化合物は、ジ−またはトリペプチド様構造による、さらに大きな構造の基の置換を含んでもよく、この場合には、アゾール由来の類似物といったペプチド結合を含む類似基を、ジペプチド置換基として使用することができる。しかしながら、アミド結合が上記のように置換されているペプチド様化合物、したがってペプチド様主鎖が好ましい。
【００４９】
適切なペプチド様化合物には、還元されたペプチドが含まれ、この際、還元剤、例えばボラン、または水素化アルミニウムリチウムなどの水素化物試薬での処理により、アミド結合は還元されて、メチレンアミンになっている。このような還元は、分子の全体的なカチオン性を高めるという追加の利点を伴う。
他のペプチド様化合物には、例えばアミド官能化ポリグリシンのステップ合成により生じるペプトイド（ｐｅｐｔｏｉｄ）が含まれる。いくつかのペプチド様主鎖は、過メチル化されているペプチドなどのそのペプチド前駆体から容易に入手することができ、適切な方法は、Ｏｓｔｒｅｓｈ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．（ｉｎ　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９４）９１、１１１３８〜１１１４２）により記載されている。強塩基性条件が、Ｏ−メチル化よりもＮ−メチル化に有利であり、ペプチド結合およびＮ−末端窒素中の窒素原子のいくつかまたはすべてのメチル化をもたらす。
【００５０】
好ましいペプチド様主鎖としては、ポリエステル、ポリアミンおよびこれらの誘導体、さらに置換されたアルカンおよびアルケンが挙げられる。ペプチド様化合物は、好ましくは、前記のように修飾されていてもよいＮおよびＣ末端を有する。
ペプチドおよびペプチド様化合物は、通常、鎖長として４から２０個、好ましくは７から１６個の原子を含む主鎖を有する。これらの範囲の上限の主鎖を有する分子は、通常、βおよび／またはγアミノ酸またはその同等物を含む。
【００５１】
本発明により抗菌剤として使用するためのペプチドは典型的には、２個または３個のアミノ酸を含み、そのうちの少なくとも１個はカチオンＲ基を有する。このカチオン官能性をもたらす遺伝的にコードされる適切なアミノ酸はしたがって、リジン、アルギニンおよびヒスチジンであろうし、カチオンＲ基をもたらす遺伝的にコードされないアミノ酸および修飾アミノ酸には、ホモリジン、オルニチン、ジアミノ酪酸、ジアミノピメリン酸、ジアミノプロピオン酸およびホモアルギニン、さらにトリメチリジンおよびトリメチルオルニチンなどのリジン、アルギニンおよびヒスチジンの類似物が挙げられる。
【００５２】
アミノ酸残基の１個または複数が、必要とされる嵩高な親油性基のうちの１個を提供するＲ基を有することもある。遺伝的にコードされるアミノ酸のうちで、トリプトファン、フェニルアラニンおよびチロシンが特に適切であり、ロイシン、イソロイシンおよびメチオニンも使用することができる。トリプトファンがその２個の縮合環構造と追加の嵩高さにより、特に好ましいが、チロシンの極性もまた役立つ。天然に生じうる非遺伝的アミノ酸およびトリプトファン、フェニルアラニンおよびチロシン類似体および、嵩高な親油性Ｒ基を含むように修飾されているアミノ酸も使用することができる。このようなすべての修飾されたアミノ酸および未修飾のアミノ酸を簡単に、「嵩高な親油性アミノ酸」と称することもできる。
【００５３】
閉環系は典型的には、炭素原子から構成されていて、場合によってはさらに、窒素、酸素またはイオウ原子も含む。特に好ましいアミノ酸は、置換または非置換のインドールを含む。Ｒ基は好ましくは、三次元的である。嵩高な親油性Ｒ基を含む好ましいアミノ酸として、アダマンチルアラニン、３−ベンゾチエニルアラニン、４，４’−ビフェニルアラニン、３，３−ジフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、２，６−ジクロロベンジルチロシン、シクロヘキシルチロシン、７−ベンジルオキシトリプトファン、トリ−ｔ−ブチルトリプトファン、ホモトリプトファン、３−（−アントラセニル）−Ｌ−アラニン、Ｌ−ｐ−イソプロピルフェニルアラニン、Ｌ−チロキシン、３，３’，５−トリヨード−Ｌ−チロニン、トリヨード−チロシンが挙げられる。
【００５４】
親油性分子間の相互作用は、親油性分子と水との間の相互作用よりも強力であるためとはいうよりは、親油性分子と水との間の相互作用が、水分子自体の間のかなり強力な相互作用を壊すために、親油性分子は、水溶液中でその同種と会合するものである。したがって、嵩高な親油性Ｒ基は、多くの極性官能基を有するべきでなく、例えば４個以下、好ましくは２個またはそれ未満を有するべきである。このような基は、水性環境との結合相互作用を高めて、分子の親油性を低下させる。例えば、嵩高な親油性基の成分として、同じ数の非水素原子を有し、類似の全体サイズを有するにも関わらず、ピリジル基よりもフェニル基が好ましい。しかしながら、嵩高な親油性基中にヒドロキシル基が存在すると、活性が高まり、特に比較的長いペプチドおよびペプチド様化合物では、１個または複数の嵩高な親油性基は、好ましくは１個もしくは２個の極性基、特にヒドロキシ基を含む。したがって、フェノール系の基などの両親媒性基は、殊に比較的長い分子では、特に有効な嵩高く親油性の基である。
【００５５】
非遺伝的な嵩高な親油性のアミノ酸には、修飾されたトリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニン基、特に、インドール環の１−、２−、５−および／または７−位で、好ましくは１−または２−位で置換されているトリプトファン基、例えば５’−ヒドロキシトリプトファンが含まれる。嵩高な親油性特性を有する様々な他のアミノ酸誘導体が、当業者には知られている。
【００５６】
適切なアミノ酸としては、チロキシンおよび次の市販されているアミノ酸およびその誘導体が挙げられる：
Ｌ−３−ベンゾチエニルアラニン、ＣＡＳ＝７２１２０−７１−９（Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ）、Ｄ−３−ベンゾチエニルアラニン、ＣＡＳ＝１１１１３９−５５−０（Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ）、Ｌ−４，４’−ビフェニルアラニン（Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ）、Ｄ−４，４’−ビフェニルアラニン（Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ）、Ｌ−４−ブロモフェニルアラニン、ＣＡＳ＝２４２５０−８４−８（Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ）、Ｄ−４−ブロモフェニルアラニン、ＣＡＳ＝６２５６１−７４−４（Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ）、Ｌ−２−クロロフェニルアラニン、ＣＡＳ＝１０３６１６−８９−３（Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ）、Ｄ−２−クロロフェニルアラニン、ＣＡＳ＝８０１２６−５０−７（Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ）、Ｌ−３−クロロフェニルアラニン、ＣＡＳ＝８０１２６−５１−８（Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ）、Ｄ−３−クロロフェニルアラニン、ＣＡＳ＝８０１２６−５２−９（Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ）、Ｌ−４−クロロフェニルアラニン、ＣＡＳ＝１４１７３−３９−８（Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ）、Ｄ−４−クロロフェニルアラニン、ＣＡＳ＝１４０９１−０８−８（Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ）、Ｌ−３−シアノフェニルアラニン、ＣＡＳ＝５７２１３−４８−６（Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ）、Ｄ−３−シアノフェニルアラニン（Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ）、Ｌ−４−シアノフェニルアラニン（Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ）、Ｄ−４−シアノフェニルアラニン（Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ）、Ｌ−３，４−ジクロロフェニルアラニン、ＣＡＳ＝５２７９４−９９−７（Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ）、Ｄ−３，４−ジクロロフェニルアラニン、ＣＡＳ＝５２７９４−９８−６（Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ）、Ｌ−３，３−ジフェニルアラニン（Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ）、Ｄ−３，３−ジフェニルアラニン（Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ）、Ｌ−ホモフェニルアラニン、ＣＡＳ＝９４３−７３−７（Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ）、Ｄ−ホモフェニルアラニン、ＣＡＳ＝８２７９５−５１−５（Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ）、Ｌ−２−インダニルグリシン（Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ）、Ｄ−２−インダニルグリシン（Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ）、Ｌ−４−ヨードフェニルアラニン、ＣＡＳ＝２４２５０−８５−９（Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ）、Ｄ−４−ヨードフェニルアラニン、ＣＡＳ＝６２５６１−７５−５（Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ）、Ｌ−１−ナフチルアラニン、ＣＡＳ＝５５５１６−５４−６（Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ）、Ｄ−１−ナフチルアラニン、ＣＡＳ＝７８３０６−９２−０（Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ）、Ｌ−２−ナフチルアラニン、ＣＡＳ＝５８４３８−０３−２（Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ）、Ｄ−２−ナフチルアラニン、ＣＡＳ＝７６９８５−０９−６（Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ）、Ｌ−３−トリフルオロメチルフェニルアラニン、ＣＡＳ＝１４４６４−６８−７（Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ）、Ｄ−３−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ）、Ｌ−４−トリフルオロメチルフェニルアラニン、ＣＡＳ＝１１４９２６−３８−４（Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ）、Ｄ−４−トリフルオロメチルフェニルアラニン、ＣＡＳ＝１１４８７２−９９−０（Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ）、Ｂｏｃ−Ｄ−ホモフェニルアラニン（Ｎｅｏｓｙｓｔｅｍ　Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ）、Ｂｏｃ−Ｌ−ホモフェニルアラニン（Ｎｅｏｓｙｓｔｅｍ　Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ）、Ｆｍｏｃ−４−メチル−Ｄ−フェニルアラニン（Ｎｅｏｓｙｓｔｅｍ　Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ）、Ｆｍｏｃ−４−メチル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｎｅｏｓｙｓｔｅｍ　Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ）、２，６−ジクロロベンジルチロシン、ＣＡＳ＝４０２９８−７１−３（Ｓｅｎｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ベンジルチロシンＦｍｏｃ（Ｓｅｎｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、シクロヘキシルチロシンＦｍｏｃ（Ｓｅｎｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、Ｌ−３，５−ジヨードチロシン、ＣＡＳ＝３００−３９−０（Ｓｅｎｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、Ｄ−３，５−ジヨードチロシン（Ｓｅｎｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、Ｌ−３，５−ジブロモチロシン（Ｓｅｎｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、Ｄ−３，５−ジブロモチロシン（Ｓｅｎｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、Ｌ−ｔ−ブチルチロシン（Ｓｅｎｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、Ｌ−ｔ−ブチルチロシン（Ｓｅｎｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、Ｎ−アセチルホモトリプトファン（Ｔｏｒｏｎｔｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、７−ベンジルオキシトリプトファン（Ｔｏｒｏｎｔｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、ホモトリプトファン（Ｔｏｒｏｎｔｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、３−（−アントラセニル）−Ｌ−アラニンＢｏｃ（またはＦｍｏｃ）（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、３−（３，５−ジブロモ−４−クロロフェニル）−Ｌ−アラニン（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、３−（３，５−ジブロモ−４−クロロフェニル）−Ｄ−アラニン（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、３−（２−キノイル）−Ｌ−アラニンＢｏｃ（またはＦｍｏｃ）（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、３−（２−キノイル）−Ｄ−アラニンＢｏｃ（またはＦｍｏｃ）（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、２−インダニル−Ｌ−グリシンＢｏｃ（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、２−インダニル−Ｄ−グリシンＢｏｃ（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ｌ−ｐ−ｔ−ブトキシフェニルグリシンＦｍｏｃ（ＲＳＰ）、Ｌ−２−ｔ−ブトキシフェニルアラニンＦｍｏｃ（ＲＳＰ）、Ｌ−３−ｔ−ブトキシフェニルアラニンＦｍｏｃ（ＲＳＰ）、Ｌ−ホモチロシン、Ｏ−ｔ−ブチルエーテルＦｍｏｃ（ＲＳＰ）、Ｌ−ｐ−ｔ−ブトキシメチルフェニルアラニンＦｍｏｃ（ＲＳＰ）、Ｌ−ｐ−メチルフェニルアラニンＦｍｏｃ（ＲＳＰ）、Ｌ−ｐ−エチルフェニルアラニンＦｍｏｃ（ＲＳＰ）、Ｌ−ｐ−イソ−プロピルフェニルアラニンＦｍｏｃ（ＲＳＰ）、Ｌ−ｐ−メトキシフェニルアラニンＦｍｏｃ（ＲＳＰ）、Ｌ−ｐ（ｔＢｕ−チオ）フェニルアラニンＦｍｏｃ（ＲＳＰ）、Ｌ−ｐ−（Ｔｒｔ−チオメチル）フェニルアラニンＦｍｏｃ（ＲＳＰ）、Ｌ−ｐ−ヒドロキシメチル−フェニルアラニン、Ｏ−ｔ−ブチル（ＲＳＰ）、Ｌ−ｐ−ベンゾイルフェニルアラニン（Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＣｈｅｍＴｅｃｈ）、Ｄ−ｐ−ベンゾイルフェニルアラニン（Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＣｈｅｍＴｅｃｈ）、Ｏ−ベンジル−Ｌ−ホモセリンＢｏｃ（Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＣｈｅｍＴｅｃｈ）、Ｏ−ベンジル−Ｄ−ホモセリンＢｏｃ（Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＣｈｅｍＴｅｃｈ）、Ｌ−β−１−ナフチル−アラニン（Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＣｈｅｍＴｅｃｈ）、Ｄ−β−１−ナフチル−アラニン（Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＣｈｅｍＴｅｃｈ）、Ｌ−ペンタ−フルオロフェニルアラニンＢｏｃ（Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＣｈｅｍＴｅｃｈ）、Ｄ−ペンタ−フルオロフェニルアラニンＢｏｃ（Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＣｈｅｍＴｅｃｈ）、Ｄ−ペンタ−フルオロフェニルアラニンＦｍｏｃ（Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＣｈｅｍＴｅｃｈ）、３，５−ジヨード−Ｌ−チロシンＦｍｏｃ（Ｂｏｃ）（Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＣｈｅｍＴｅｃｈ）、Ｌ−チロキシンＮａ、ＣＡＳ＝６１０６−０７−６（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）、３，３’，５−トリヨード−Ｌ−チロシンＮａ、ＣＡＳ＝５５−０６−１（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）。
【００５７】
意外にも、標準の化学的保護基が、アミノ酸Ｒ基に結合すると、適切な嵩高な親油性基をもたらしうることが判明した。このように修飾されたＲ基は、好ましい嵩高な親油性基を構成する。適切なアミノ酸保護基は当業界でよく知られており、これらにはＰｍｃ（２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル）、Ｍｔｒ（４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル）およびＰｂｆ（２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフランスルホニル）が含まれ、これらは簡単に、芳香族アミノ酸、例えばＰｈｅ、ＴｒｐおよびＴｙｒの嵩高さおよび親油性を高めうる。さらに、ｔ−ブチル基も、幅広いアミノ酸のための一般的な保護基であり、特に、芳香族残基を修飾する場合には、前記のように、嵩高な親油性基をもたらしうる。Ｚ−基（カルボキシベンジル）は、嵩高な親油性基を提供するために使用することができるもう１つの保護基である。
【００５８】
先に定義したような嵩高な親油性基はさらに、Ｎ末端の修飾基によってもたらされうる。このような嵩高な親油性のＮ末端修飾は好ましくは、５員環または６員環を含み、これは、アルキルまたはアリール、例えばシクロヘキシルカルボキシレートまたはベンジルカルボキシレートであってもよい。嵩高な親油性Ｎ末端修飾基は、２個またはそれ以上の縮合環を包含してよく、そのうちの１個以上は、５員環、例えばアダマンチルまたはインドールであってもよい。加えて、許容し難いレベルの毒性（即ち、溶血活性）を引き起こし、殺菌性よりもむしろ静菌性を有するペプチドを与えるその傾向のゆえに、Ｆｍｏｃは、可能な嵩高な親油性Ｎ末端修飾から除外される。Ｎ末端アセチル基も同様の理由で好ましくない。
【００５９】
Ｎ末端を修飾し、嵩高な親油性基をもたらすために使用することができる適切な分子として次が挙げられる：
シス−ビシクロ［３．３．０］オクタン−２−カルボン酸、［１８２０９−４３−３］（Ａｌｄｒｉｃｈ）；アビエチン酸［５１４−１０−３］（Ａｌｄｒｉｃｈ）；ウルソール酸、［７７−５２−１］（Ａｌｄｒｉｃｈ）；（１，２−メタノフラーレンＣ_６０）−６１−カルボン酸［１５５１１６−１９−１］（Ｆｌｕｋａ）；キュバン−１，４−ジカルボン酸ジメチル、［２９４１２−６２−２］（Ｆｌｕｋａ）；２−ノルボルナン酢酸、［１００７−０１−８］（Ａｌｄｒｉｃｈ）；４−ペンチルビシクロ［２．２．２］オクタン−１−カルボン酸、［７３１５２−７０−２］（Ａｌｄｒｉｃｈ）；アダマンチル酢酸；３−ノルアダマンタンカルボン酸［１６２００−５３−６］（Ａｌｄｒｉｃｈ）；９−フルオレン酢酸、［６２８４−８０−６］（Ａｌｄｒｉｃｈ）；シス−デカヒドロ−１−ナフトール、［３６１５９−４７−４］（Ａｌｄｒｉｃｈ）；９−エチル−ビシクロ［３．３．１］ノナン−９−オール、［２１９１５−３３−３］（Ａｌｄｒｉｃｈ）；３−キヌクリジノール、［１６１９−３４−７］（Ａｌｄｒｉｃｈ）；［［（１Ｓ）−エンド］−（−）−ボルネオール、［４６４−４５−９］（Ａｌｄｒｉｃｈ）；（１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ，５Ｓ）−（−）−イソピノカンフェオール、［２５４６５−６５−０］（Ａｌｄｒｉｃｈ）；デヒドロアビエチルアミン［１４４６−６１−３］（Ａｌｄｒｉｃｈ）；（±）−３−アミノキヌクリジン［６５３０−０９−２］（Ａｌｄｒｉｃｈ）；（Ｒ）−（＋）−ボルニルアミン、［３２５１１−３４−５］（Ａｌｄｒｉｃｈ）；１，３，３−トリメチル−６−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクタン［５３４６０−４６−１］（Ａｌｄｒｉｃｈ）；１−アダマンチルアミン、［７６８−９４−５］（Ａｌｄｒｉｃｈ）；９−アミノフルオレン、［５９７８−７５−６］（Ａｌｄｒｉｃｈ）；（１Ｒ）−（−）−１０−カンフルスルホン酸、［３５９６３−２０−３］（Ａｌｄｒｉｃｈ）；５−イソキノリンスルホン酸、［２７６５５−４０−９］（Ａｌｄｒｉｃｈ）；２−キノリンチオール、［２６３７−３７−８］（Ａｌｄｒｉｃｈ）；８−メルカプトメントン、［３８４６２−２２−５］（Ａｌｄｒｉｃｈ）が含まれる。
【００６０】
嵩高な親油性基をもたらすＮ−末端修飾はしたがって典型的には、Ｎ末端アミンに直接結合して、モノ−、ジ−および、可能であればカチオン性のトリアルキル化Ｎ末端アミンを形成しうる嵩高な親油性基「Ｒ」を含む。代わりに、このＲ基は、結合基（ｌｉｎｋｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）、例えばカルボニル基（ＲＣＯ）、具体的にはアダマンチルまたはベンジル、カルバメート（ＲＯＣＯ）を介して、または尿素（ＲＮＨＣＯ）または（Ｒ_２ＮＣＯ）を形成するリンカーを介して、あるいはスルホンアミド、ホウ素アミドまたはホスホンアミドを形成するリンカーによって結合していてもよい。さらに安定なペプチドが必要な場合には、スルホンアミドを形成するリンカーが特に有用である。嵩高な親油性基Ｒは、好ましくは飽和環式基、さらに好ましくは多環式基を含み、ここで、環式基は縮合しているか、架橋している。
【００６１】
前記で定義したような嵩高な親油性基はさらに、Ｃ−末端修飾基によってももたらされうる。適切なＣ−末端修飾には、例えばベンジルまたはシクロヘキシルエステルまたはアミドを形成するチオエステルまたは置換された１級もしくは２級アミドを含む、エステルの形成が挙げられる。通常、エステルが好ましい。他の嵩高な親油性Ｃ−末端基として、ナフチルアミンおよびフェニル−エチルアミンなどといった置換された芳香族アミンが含まれる。標準的なＣ−末端保護基も、また嵩高な親油性基をもたらしうる。
【００６２】
Ｃ−末端修飾はしたがって典型的には、Ｃ−末端のカルボキシ基に直接結合して、ケトンを形成することができる嵩高な親油性基「Ｒ」を含む。あるいは、Ｒ基は、結合基、例えばＣ−末端でエステルを形成する（ＯＲ）、それぞれＣ−末端に第１級および第２級のアミド基を形成する（ＮＨ−Ｒ）または（ＮＲ_２；ここで、２個のＲ基は、同じ基である必要はない）、またはホウ素のエステルまたは亜リン酸類似体を形成する基（Ｂ−（ＯＲ）_２）を介して結合していてもよい。Ｄａｅ（ジアミノエチル）は、嵩高な親油性基、例えばカルボベンゾオキシ（Ｚ）をＣ−末端に結合させるために使用することができるもう１つの結合基である。
【００６３】
Ｃ−末端修飾には、アニオン基を「脱離」させて、これにより分子全体のカチオン性を高めるという利点がある。したがって、カチオン性のＮ−末端は通常、嵩高な親油性基によってでなければ、修飾されないが、Ｃ−末端は典型的には、嵩高な親油性基の包含によって、さもなければ負の電荷を無効にするために、アミド化、または例えば嵩高ではないが親油性のエステル、例えばメチルエステルなどのアルキルエステルの形成のいずれかによって修飾される。このようにして、ペプチドＴｂｔ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＮＨ_２は、望ましい２個の嵩高な親油性基（ＴｂｔおよびＴｒｐによってもたらされる）ならびにＮ−末端およびアルギニンのＲ基に、いずれもアニオンＣ−末端によって「無効に」されていない２個のカチオン基を有する。
【００６４】
例えばベンジルエステルを形成する基など、ただ１個のしかも好ましくは６員の環を含む基といった中程度に嵩高なＣ末端基は、特に良好な治療特性を有するペプチドをもたらすことが判明していて、このような基を含むペプチドは、本発明による分子の好ましい群を構成する。
したがって、さらなる態様では、本発明は、少なくとも２個の嵩高な親油性基（または少なくとも１個の超嵩高な親油性基）を包含し、しかもアニオン基よりも少なくとも１個多いカチオン基を有する人工ペプチド（ペプチド誘導体）、鎖長に関し１から４個のアミノ酸、典型的には、２個、３個または４個のアミノ酸を有する人工ペプチドを提供する。好ましくは、このペプチドは少なくとも２個の嵩高な親油性基（または少なくとも１個の超嵩高な親油性基）およびアニオン基よりも少なくとも２個多いカチオン基、あるいは少なくとも３個の嵩高な親油性基およびアニオン基よりも少なくとも１個多いカチオン基を包含している。本発明により使用するための分子は好ましくは、ペプチド誘導体またはペプチド様化合物を含むペプチドであり、これらは好ましくは、非環式である。
【００６５】
上記ペプチドのペプチド様同等物は、本発明のもう１つの態様を構成している。このようなペプチド様分子は、１個以上の内部アミド結合を有してよく、したがってこのような分子の主鎖は、上記のように、ペプチド主鎖とみなすことができるであろうが、もっとも他のアミド結合または他の修飾の結果として、この分子は「ペプチド」ではない。
【００６６】
「嵩高な親油性」、「超嵩高な親油性」なる用語、さらにカチオン基およびアニオン基の定義は前記と同様である。これらの短いペプチドはＮおよび／またはＣ末端で修飾することが望ましい。遺伝的にコードされる２０種のアミノ酸から選ばれるアミノ酸のみを包含し、かつ嵩高で親油性であるＮまたはＣ末端の修飾のないペプチドは、本発明のこの態様の範囲内に含まれないことを示すために、上記ペプチドを「人工ペプチド」と称している。加えて、前記のように、許容し難いレベルの毒性（即ち、溶血活性）をもたらすその傾向のゆえに、Ｆｍｏｃを、嵩高な親油性の可能なＮ末端修飾から除外する。
【００６７】
基はどの程度、嵩高で親油性であってよいかについては、特に、分子の毒性が許容し難いレベルまで高まるということにより実質的な上限が存在する。このことは、分子の全体的なサイズおよび基の三次元性および基中の非水素原子すべての数、さらに全体としての分子内でのその位置、即ち、それが末端基であるか、内部基であるかなどのファクターに依存しうる。
【００６８】
本発明は、治療において使用するための一群の化合物および新規の生体活性分子自体を提供することと同様に、本発明で同定された機能的モチーフに基づいて薬剤を同定し、生産する方法も提供する。小さなペプチドといった非常に小さい分子は、優れた治療的、例えば抗菌活性を有するが、このような活性は、ある特定の数の嵩高な親油性基およびカチオン基の存在に依存していることが意外にも判明し、これらの官能基に関する適切なモチーフを、本明細書において定義している。これらのモチーフの同定は、抗菌分子を探して、それを調製するための極めて有用な方策を提供し、特に、従来の治療用抗菌薬剤よりも小さな分子を調製することを可能にする。可能性のある先導的薬剤化合物候補を同定して、場合によっては、さらに修飾して、活性を高めることができる。
【００６９】
したがって、もう１つの態様では、本発明は、鎖長に関し１から４個のアミノ酸を含み、アニオン基よりも少なくとも１個多いカチオン基を有し、かつ少なくとも２個の嵩高な親油性基または嵩高な親油性基をもたらすように修飾することができる基を有するペプチドを同定し、鎖長に関し２から３５個、典型的には４から３５個、好ましくは４から２０個、さらに好ましくは４から１２個、例えば６から９個の非水素原子を含む主鎖を有し、この主鎖に共有結合している少なくとも２個の嵩高な親油性基を有し、しかもアニオン基よりも少なくとも１個多いカチオン基を有する、このようなペプチドの誘導体またはペプチド様化合物を合成し、場合によっては、このようなペプチド、ペプチド誘導体またはペプチド様化合物を生理学的に許容される担体または賦形剤とともに配合することを含む、膜作用性抗菌剤を調製するための方法を提供する。
【００７０】
最初に同定される分子は、公知のペプチドのフラグメントまたは新たに合成されたフラグメントなどのペプチドであってもよい。このペプチドを、その生体活性に関して試験して、次いで合成ステップを行った後に、本発明のペプチド、誘導体またはペプチド様化合物を試験することができる。好ましくは、初めに同定されるペプチドは合成せずに、試験するものであって、本発明による分子の合成のための基盤を提供するだけである。この分子自体を試験して、本明細書に記載した教示に従い、さらに修飾することもできる。合成の前に、官能基の正確な性質および位置ならびに必要とされる合成段階を決定する設計プロセスが存在することもある。
【００７１】
さらに一般的には、本発明は、鎖長に関し２から３５個、典型的には４から３５個、好ましくは４から２０個、さらに好ましくは４から１２個、例えば６から９個の非水素原子を含む主鎖を有し、この主鎖に共有結合している少なくとも２個の嵩高な親油性基を有し、かつアニオン基よりも少なくとも１個多いカチオン基を有する化合物を同定し、このような化合物を合成し、場合によっては、このような化合物を生理学的に許容される担体または賦形剤とともに配合することを含む、抗菌剤または抗がん剤を調製するためのプロセスを提供する。
【００７２】
この方法は、ただ１個の超嵩高な親油性基を含む分子にも当てはまる。
１個または複数の鏡像異性アミノ酸を組み込むことにより、ペプチドの生体活性が著しく高まり、このようなペプチドは、酵素的加水分解に対する感受性も低減するであろうことが観察されている。分子中に存在する１個または複数のアミノ酸は、Ｄ−形であってもよく、例えばすべてのアミノ酸はＤ形であってよいか、交互の基がＤ形であってよいか、あるいはＤおよびＬ残基のブロックが存在してもよい。
【００７３】
ペプチドもしくはペプチド様化合物ではないが、本発明の生体活性分子の構造的および機能的特性を有する適切な化合物は、当業者には簡単に調製することができるものである。この場合、「主鎖」は典型的には、「足場」を提供していて、そこに、分子の活性をもたらすカチオン基および嵩高な親油性基、即ち官能基が結合している。ペプチド様分子に関しては上で述べており、これらは有用な治療化合物を提供しうるが、本発明はさらに、厳密には標準的なペプチド構造をベースとしない分子にも関する。
【００７４】
「主鎖」は単に、様々な官能基を一緒に結合する結合基であってよく、これは、カチオン基および嵩高な親油性基が細胞膜にひきつけられ、それを不安定化するという役割を果たさせるに必要なスペースを提供する。選択された特定の嵩高な親油性基およびカチオン基に応じて、その分子に化学的安定性を与えるためには特定の量の主鎖構造が必要であり、そうした検討は、当業者には熟知されていることである。このような分子の主鎖は、線状、分枝、環式または多環式、芳香族または脂肪族であってよく、可能な場合には、糖、糖アルコールまたはアミノ糖といった糖誘導体化合物、アミノグリコシド、グリコシド、アザ糖、イノシトール、マンニトール、スフィンゴシド、またはポリエステルまたはポリアミンをベースとしてよい。
【００７５】
主鎖は典型的には、炭素、窒素、酸素、イオウまたはリン原子を含むが、さらに置換されていてもよい。好ましくは、主鎖は安定であり、正常な生理的条件下ではむしろ反応的ではなく、酵素分解に対して抵抗性があり、荷電基または極性基をほとんど有しない。主鎖は好ましくは、生体適合性である。これらの非ペプチド様主鎖（即ち、ペプチドまたはペプチド様化合物ではない）は、非水素原子２〜３５個を含む主鎖の鎖長を有し、主鎖が多環式である場合、例えばシクロデキストリンである場合には、実際には、さらにかなり多い非水素原子を含む。好ましい主鎖は、鎖長に関し、非水素原子４から２４個、例えば７から１６個を含む。
【００７６】
合成の観点からは、多数の適切な非ペプチド様主鎖を簡単に、２つの群に分けることができ、一方は足場タイプの主鎖、典型的には、必要なカチオン基および嵩高な親油性基を包含するために充分な数の外肢点を有する単純な分子である。線状および環式糖、ポリオールおよびイノシトールがこのカテゴリーに入り、これには、そのヒドロキシ基が、嵩高な親油性基およびカチオン基の添加により修飾されたマンニトールを例に挙げることができる。このような分子は、２個以上の異なる成分を反応させることにより形成することができ、例えばアルギニンとマンデル酸とを反応させることによるエステルの形成により生じさせ得る。基本構造または主鎖足場をこのように生じさせることができ、該分子を場合によっては、さらなるカチオン基および嵩高な親油性基を包含するように修飾することもできる。これらの足場主鎖は好ましくは環式であり、さらに典型的には非水素原子６〜２０個、具体的には９〜１２個を含む４〜２０員の環が例示される。
【００７７】
足場分子の目的は、生体活性にとり必要な位置に、官能基、例えばカチオン基または嵩高な親油性基を与えることである。足場分子はしたがって、生体活性をもたらす基のトポロジーに制約を加えることができなければならない。このような適切な足場分子の１つは、限定された立体化学を伴う高次に官能化された小さな（５〜７員）環である［Ｌｕｔｈｍａｎ，Ｋ．ａｎｄ　Ｈａｃｋｓｅｌｌ，Ｕ．、Ａ　Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓｉｇｎ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｋｒｏｇｓｇａａｒｄ−Ｌａｒｓｅｎ、Ｌｉｌｊｅｆｏｒｓ　ａｎｄ　Ｍａｄｓｅｎ（Ｅｄｓ．）Ｈａｒｗｏｏｄ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９９６）９、３８６］。最終分子を調製するために、適切な保護された足場分子を選択する必要がある。合成は典型的には、次のように行う：初めに、好ましい基の１個を、典型的にはエステル、エーテル、アミドまたはアミン結合により足場に結合させ、次いで足場分子中の次の外肢点を脱保護して、前記のように、次の好ましい基と結合させる。必要な数の官能基が得られるまで、脱保護および結合のプロセスを繰り返す。保護および脱保護の技術は、当業者に充分に知られていて、文献でも見ることができる［Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．ａｎｄ　Ｗｕｔｓ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、２ｎｄ　ｅｄ．、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９１］。
【００７８】
足場分子の例およびその官能化された類似体を下式に示す。
【００７９】
【化５】

【００８０】
糖ベースの足場主鎖と同様に、トリ−およびテトラアザ大環式アミン（例えば１，４，７−トリアザシクロノナンおよび１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン）などの大環式アミンも特に好適であり、前記のように必要な官能基を組み込むためにＮ原子の所で、簡単に誘導体化される。
あるいは、上記分子は、同様のモノマーサブユニットから構築されてもよく、このような化合物は往々にして、前記のようなペプチド様化合物として分類される。
【００８１】
「インターロック」の「ジグソー」技術を使用して、即ち、典型的には、さらに官能基、即ちカチオン基または嵩高な親油性基を担持するばかりでなく分子の主鎖を形成することになる部分をそれぞれ含んでいる複数の反応性サブユニットを使用して、分子を組み立てることができる。生じた生体活性分子は、モノマーサブユニットの鎖を含む線状であるか、三次元的であってもよい環式または多環式構造をもたらす。このことは特に、類似のモノマーサブユニットの繰り返しを含まない、より複雑な分子の合成において、基本的な足場主鎖を修飾するための便利な選択肢を提供する。こうした技術は、当技術分野で周知である。
【００８２】
嵩高で親油性の適切な基およびカチオン基に関しては、上に記載していて、数多くの特異的な例を、ＮおよびＣ末端修飾およびアミノ酸Ｒ基に関して挙げている。同じおよび類似の嵩高な親油性基およびカチオン基が、非ペプチド様分子に包含されていてよい。非ペプチド様分子には特に適切な嵩高の親油性基が含まれる。
【００８３】
本発明に基づいて使用される生体活性分子は、例えばＭＢＣ値により測定されるような、標的病原菌に対する良好な活性と、溶血活性により測定されるような、比較的低い毒性とを兼ね備えていることが望ましい。したがって、そのような分子は好ましくは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対して、５０μｇ／ｍｌまたはそれ未満、さらに好ましくは２０μｇ／ｍｌまたはそれ未満のＭＢＣならびにＥＣ_５０≧５００μｇ／ｍｌ、好ましくは≧１０００μｇ／ｍｌの溶血活性を有する。
【００８４】
前記の分子の同定をもたらす原理が、鎖長に関しアミノ酸５個または６個を有するペプチドに基づいて、やや大きな生体活性分子を同定するために使用されてきた。この場合、良好な活性をもたらすと同定された嵩高な親油性基およびカチオン基のモチーフは、少なくとも２個の嵩高な親油性基、好ましくは３個のこのような基および少なくとも２個のカチオン基、好ましくは３個もしくは４個のこのような基である。嵩高で親油性の適切な基およびカチオン基は、より小さな分子に関連して上記と同様に定義される。
【００８５】
これらのペプチドはさらに、少なくとも１個の嵩高な親油性基またはカチオン基が、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、アルギニン、リジンまたはヒスチジンなどの遺伝的にコードされる嵩高な親油性の、またはカチオン性のアミノ酸によりもたらされていないことにおいて特徴付けられる。したがって、本明細書では簡便に、「人工的な嵩高な親油性基」または「人工的なカチオン基」と称されるこの基は、トリ−ｔ−ブチルトリプトファンなどの遺伝的にコードされない嵩高な親油性アミノ酸のＲ基により、あるいはホモアルギニンなどの遺伝的にコードされないカチオン性アミノ酸のＲ基によりもたらされうる。遺伝的にコードされない適切なアミノ酸は、天然に生じるものであるか、合成したものであってよく、本明細書では、より小さな分子に関して例示されている。人工的な嵩高な親油性基は簡便には、例えばＰＭＣまたは他の保護基で、遺伝的にコードされるか、遺伝的にコードされないアミノ酸のＲ基を修飾することによりもたらすこともできる。修飾されるアミノ酸自体が、トリプトファンなどのような嵩高な親油性アミノ酸であってもよい。この場合にも、適切な修飾された基は、より小さな分子に関連して先に検討している。
【００８６】
あるいは、さらに人工的な嵩高な親油性基は、本明細書で先に記載したようなＮまたはＣ末端修飾基によりもたらされうる。該ペプチドは、ＮおよびＣ末端の両方に、ＮまたはＣ末端のいずれかに嵩高な親油性基を包含してよいか、あるいは両末端のいずれにも包含しなくてよい。ただ１個の末端が、嵩高な親油性基を担持している場合には、これはＣ末端であることが望ましい。Ｃ末端が、前記のような嵩高な親油性基の包含により修飾されていない場合には、これは、ｐＨ７．０でＣ末端に通常は存在する負の荷電を除去するように修飾されていることが望ましい。適切なＣ末端修飾には、アミド化または嵩高な親油性基を含まないエステル、例えばメチルエステルなどの短鎖アルキルエステルの形成が含まれる。好ましくは、少なくとも１個の嵩高な親油性基は、人工的な嵩高な親油性基である。
【００８７】
人工的な嵩高な親油性基は好ましくは、遺伝的にコードされるいずれのアミノ酸の嵩高な親油性Ｒ基と少なくとも同程度に嵩高で親油性であるか、さもなければ、それよりも嵩高で親油性である。即ち、少なくともトリプトファンと同程度に嵩高で親油性である。嵩高性および親油性を高めると、高次に抗菌活性なペプチドが生じる。これらのペプチドの活性は、配列に無関係であると思われ、特定の官能基（カチオン基および嵩高な親油性基）の存在が、分子の細胞毒活性をもたらしている。
【００８８】
これらのペプチドは、好ましくは、個々のアミノ酸構成ブロックからペプチド合成の標準的方法により合成される。修飾された残基を合成の間に包含させることができるが、あるいは該残基を、ペプチド全体を合成した後に修飾することもできる。「人工的な嵩高な親油性基」または「人工的なカチオン基」を包含するいずれの残基のことはさておいて、遺伝的にコードされないアミノ酸または修飾されたアミノ酸が包含されていてよいが、該ペプチドは、いくつかのまたは多数の遺伝的にコードされる基を含むことが好ましい。人工的な嵩高の親油性基をもたらすために、合成後の修飾を使用することができる。
【００８９】
したがって、本発明のさらなる態様において、少なくとも２個の嵩高な親油性基および少なくとも２個のカチオン基を包含する、鎖長に関し５もしくは６個のアミノ酸を有する生体活性ペプチドを提供する。該ペプチドは、上記の嵩高な親油性基のうちの少なくとも１個が人工的な嵩高な親油性基であるか、あるいは該カチオン基のうちの少なくとも１個が人工的なカチオン基である。抗菌剤または抗がん剤ならびにこれを含有する薬剤組成物および他の組成物としてのこれらのペプチドの使用は、本発明のさらなる態様を構成している。遺伝的にコードされるアミノ酸のうちで、アルギニン、リジンおよびヒスチジンは、カチオン基であり、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ロイシン、イソロイシンおよびメチオニンは、嵩高な親油性基である。６個の残基が好ましく、アミノ酸が５個のみ存在する場合には、これらのうちの３個は、特性上、嵩高で親油性であることが好ましい。
【００９０】
上記ペプチドの構造的および機能的特徴を有するペプチド様化合物を調製することができ、これらは、抗菌剤および抗がん剤としてのそれらの使用とともに、本発明のさらなる態様を構成している。
上記５量体および６量体のペプチドおよびこれらを含有する組成物、とりわけ製薬組成物は、治療での、例えば抗がん剤または抗菌剤、特に抗細菌剤としての使用のための本発明のさらなる態様を構成している。前記のように、活性な抗菌剤には、非治療的使用の領域が存在し、これらの使用は、本発明のさらなる態様を構成している。
【００９１】
本発明のもう１つのさらなる態様では、すべての遺伝的にコードされるアミノ酸を包含する小さいペプチド群が、良好な生体活性とともに同定されている。したがって本発明は、未修飾のＮ末端を有し、鎖長に関し５または６個のアミノ酸を有する生体活性なペプチドを提供し、この際、すべてのアミノ酸が、特性上、カチオン性であるか、嵩高な親油性であり、少なくとも２個のアミノ酸が嵩高で親油性であり、少なくとも２個がカチオン性である。
【００９２】
このカテゴリーのペプチドを、実施例１および４に記載する。アルギニンを、遺伝的にコードされるカチオン性アミノ酸の例として、かつトリプトファンまたはチロシンを、遺伝的にコードされる嵩高な親油性アミノ酸として使用していることは理解されるであろう。他の遺伝的にコードされる嵩高な親油性の、かつカチオン性のアミノ酸は、既に前記している。トリプトファンおよび／またはアルギニンに代わって、他の遺伝的にコードされる嵩高な親油性アミノ酸を包含する実施例１および４のペプチドと同等の物も、本発明のこの態様の範囲内に含まれる。これらのペプチドのＣ末端は未修飾であるか、または嵩高および親油性ではない小さな基でアミド化またはエステル化されている。これらのペプチドを含有する製薬的組成物ならびに抗菌剤または抗がん剤としてのその使用は、本発明のさらなる態様を構成する。
【００９３】
本発明の分子は典型的には、抗菌、例えば抗細菌、抗ウイルスまたは抗真菌活性を有する。加えて、これらの分子は、抗がん活性を示し、これらの分子は、健康な真核細胞よりもガン細胞を選択的に溶解する。これらの分子は溶解性であり、かつ／または細胞膜の不安定化を引き起こし、よって透過性および細胞生存力に効果を及ぼし得る。これらの分子は、グラム陰性菌およびグラム陽性菌に対して活性であるが、グラム陽性菌に対して特に効果的であることが判明している。したがってこれらの使用、治療および薬剤は、グラム陽性菌感染の治療にとり好ましい。
【００９４】
これらの分子は、殺菌性であるかまたは静菌性であり、殺菌性分子が通常は好ましい。高いＭＢＣ値および低いＭＩＣ値は、静菌性分子を示している；例えばジペプチドＴｂｔＲ　ＯＭｅは、Ｅ．ｃｏｌｉに関して静菌性である。追加のカチオン基を包含するトリペプチドＲＴｂｔＲ　ＯＭｅは、殺菌性である。分子のカチオン性を高めることは、殺菌性分子をもたらすために使用できる手段になり、したがって、さらなる態様において本発明は、ペプチドの静菌活性に比較して、その殺菌活性を高める方法を含み、このペプチドは、ペプチド中に存在するカチオンの数を少なくとも１個増やすことにより、２〜４個のアミノ酸、アニオン基よりも少なくとも１個多いカチオン基および少なくとも１個の超嵩高な親油性基または少なくとも２個の嵩高な親油性基を有する。一般に、少なくとも２個、例えば３個または４個の追加のカチオン基の存在が、活性分子をもたらすが、埋め合わせのために嵩高な親油性基の数が増える場合には、カチオン性は低下しうる。
【００９５】
したがって本発明は、本明細書で記載の様々な分子を投与することにより、微生物感染を治療する方法を提供する。特に、微生物細胞膜を不安定化する方法を提供する。投与量は、すべての、または一定割合の標的微生物を死滅させるか、その増殖を防ぐか、その速度を遅くするか、さもなければ、人体へのその有害な効果を低減するための有効な量でなければならない。臨床医または患者は、感染に関わる１つまたはそれ以上のパラメーターまたは症状での改善を観察すべきである。投与は、予防的であってもよい。
【００９６】
本発明のペプチドは、慣用された方法のいずれでも合成することができる。一般には、存在する反応性の基（例えば、アミノ、チオールおよび／またはカルボキシル）を、合成全体を通して保護する。合成の最終ステップはしたがって、本発明の保護された誘導体の脱保護である。前記のように、本発明の特定のペプチドは、「保護基」を担持し、このことが高い細胞毒性の原因である。
【００９７】
ペプチドを構築する際には、原則として、Ｃ−末端またはＮ−末端のいずれから出発するが、Ｃ−末端から出発する手順が好ましい。
ペプチド合成の方法は当業界でよく知られているが、本発明では、固相支持体上で合成を実施するのが、特に簡便であり、このような支持体は当業界でよく知られている。
【００９８】
アミノ酸用の保護基の幅広い選択は公知であり、適切なアミン保護基として、カルボベンゾキシ（Ｚとも記載される）、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃとも記載される）、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）および９−フルオレニルメトキシ−カルボニル（Ｆｍｏｃとも記載される）が挙げられる。Ｃ−末端からペプチドを構築する場合には、アミン保護基は、追加される新規の各残基のα−アミノ基上に存在し、次のカップリングステップの前に選択的に除去する必要があることは、理解されるであろう。
【００９９】
例えば、使用可能なカルボキシル保護基として、ベンジル（Ｂｚｌ）、ｐ−ニトロベンジル（ＯＮｂ）、ペンタクロロフェニル（ＯＰＣｌＰ）、ペンタフルオロフェニル（ＯＰｆｐ）またはｔ−ブチル（ＯｔＢｕ）基などといった簡単に脱離されるエステル基、さらに、固体支持体上のカップリング基、例えばポリスチレンに結合しているメチル基が挙げられる。
【０１００】
チオール保護基として、ｐ−メトキシベンジル（Ｍｏｂ）、トリチル（Ｔｒｔ）およびアセトアミドメチル（Ａｃｍ）が挙げられる。
アミンおよびカルボキシルの保護基を脱離させるために、幅広い範囲の手順が存在する。しかしながらこれらは、使用される合成方法と調和すべきである。側鎖保護基は、次のカップリング段階に先立ち、一時的なα−アミノ保護基を脱離するために使用される条件に対して安定でなければならない。
【０１０１】
Ｂｏｃなどのアミン保護基およびｔＢｕなどのカルボキシル保護基は、例えばトリフルオロ酢酸での酸処理により、同時に脱離されることになろう。Ｔｒｔなどのチオール保護基は、ヨウ素などの酸化剤を使用して、選択的に脱離することができる。
本発明によるペプチドは、不完全な脱保護により、ペプチドの細胞毒活性を高める基を脱離して、調製することができる。あるいは修飾されたＲおよびＮ−およびＣ−末端基は、ペプチドの合成および関連する脱保護の後に、調製することができる。
【０１０２】
特に好ましい方法は、次式：Ｆｍｏｃ−アミノ酸−Ｏｐｆｐのアミノ酸誘導体を使用する合成を含むものである。
本発明のペプチド様化合物および他の生体活性分子を合成するための参考文献および技術は本明細書中に記載されており、したがって当業界でよく知られている。
【０１０３】
本明細書で定義したような１種または複数の小さな生体活性分子を適切な希釈剤、担体または賦形剤とともに混合されて含有する処方物は、本発明のさらなる態様を構成している。このような処方物は特に、製薬学的（獣医学も含む）目的または農業目的のために、または微生物汚染を受けやすい物質のための殺菌剤として、例えば食品工業で使用することができる。適切な希釈剤、賦形剤および担体は当業者に知られている。
【０１０４】
本明細書で定義したペプチドおよび他の分子は広い抗菌活性を発揮し、したがって、抗ウイルスおよび抗真菌剤としても適切であり、これは、製薬的応用および農業応用を有し、創傷治癒または殺精子剤の促進剤としての応用を有する。これらすべての使用は、本発明のさらなる態様を構成している。
ヒトまたは動物の患者に、本明細書で定義した１種または複数のペプチド、ペプチド様化合物または他の生体活性分子を投与することを含む、細菌、ウイルスまたは真菌の感染を治療または予防する方法またはガンを治療する方法は、本発明の更なる態様を構成している。
【０１０５】
本発明による組成物は例えば、口、鼻、腸管内、静脈内、腫瘍内または直腸の投与に適切な形で提供することができる。
本明細書で使用されているように、「製薬的」との用語には、本発明の獣医学的適用も含まれる。
本明細書で定義された活性化合物は、錠剤、被覆錠剤、鼻噴霧剤、溶液、エマルジョン、リポソーム、粉末、カプセルまたは持続放出性形態などの、投与の従来的な薬物学的形態で提供することができる。ペプチドは特に、局所投与、例えば糖尿病性潰瘍の治療に適している。これらの形態を調製するために、慣用された製薬的賦形剤、さらに通常の製造方法を使用することができる。例えば、１種または複数の活性成分を、公知の賦形剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはラクトースなどの希釈剤、コーンスターチまたはアルギン酸などの崩壊剤、デンプンまたはゼラチンなどの結合剤、ステアリン酸マグネシウムまたはタルクなどの滑剤および／またはカルボキシポリメチレン、カルボキシメチルセルロース、酢酸フタル酸セルロースまたは酢酸ポリビニルなどの持続放出を得るための薬剤とともに混合することにより、錠剤を製造することができる。
【０１０６】
これらの錠剤は所望の場合には、いくつかの層からなっていてよい。錠剤と同様の方法で得られた核を、錠剤を被覆するために一般に使用される薬剤、例えばポリビニルピロリドンまたはシェラック、アラビアゴム、タルク、二酸化チタンまたは糖で被覆することにより、被覆錠剤を製造することができる。持続放出を得るために、または不相容性を回避するために、核も、いくつかの層からなっていてよい。持続性放出を得るために、錠剤の被覆も、いくつかの層からなっていてよく、この場合、錠剤に関して前記の賦形剤を使用することができる。
【０１０７】
臓器特異性キャリヤシステムを使用することもできる。
例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸塩などの防腐剤またはＥＤＴＡなどの安定剤を添加することなどにより、従来の方法で、注射溶液を製造することができる。これらの溶液を次いで、注射バイアルまたはアンプルに充填する。
好ましい投与方法である鼻噴霧は、同様に水溶液に処方して、エアゾール噴射剤を有するか、手動圧縮のための手段を備えている噴霧容器に充填することができる。例えば、活性成分と、ラクトースまたはソルビトールなどの不活性担体とを混合し、この混合物をゼラチンカプセルに充填することにより、１種または複数の活性成分を含有するカプセルを製造することができる。
【０１０８】
活性成分または活性成分の組み合わせと、天然脂質またはポリエチレングリコールまたはその誘導体などの、この目的で考えられる慣用の担体とを混合することにより、例えば、適切な座薬を製造することができる。
活性分子を含有する投薬単位は好ましくは、抗菌剤０．１〜１０ｍｇ、例えば１〜５ｍｇを含有する。上記製薬的組成物は追加として、他の抗菌ペプチドなどといった他の細胞毒性薬剤を含む他の活性成分を含んでもよい。他の活性成分として、様々なタイプの抗生物質、サイトカイン、例えばＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、ＣＳＦおよび成長因子、免疫調節剤、化学療法剤、例えばシスプラチンまたは抗体が挙げられる。
【０１０９】
生体活性分子は、局所用組成物で使用される場合には、一般に少なくとも０．１重量％の量で存在する。多くの場合、１．０重量％よりも多い量でペプチドを使用する必要はない。
このような組成物を全身的に（筋肉内、静脈内、腹腔内）使用する際には、活性分子は少なくとも約５μｇ／ｍｌの生体活性分子の血清レベルが達成される量で存在する。一般に、その血清レベルは、５００μｇ／ｍｌを超える必要はない。好ましい血清レベルは、約１００μｇ／ｍｌである。このような血清レベルは１から約１０ｍｇ／ｋｇの投薬用量で、全身投与される組成物中に生体活性分子を加えることにより、達成することができる。一般に、該分子を、１００ｍｇ／ｋｇを上回る用量で投与する必要はない。
【０１１０】
存在する生細菌の数を低減するか、細菌成長または増殖を抑制するために、環境または農業用地または産物、さらに食料および食料生産場所を、本明細書で定義した１種または複数の生体活性分子で処理する方法は、本発明の更なる態様を構成している。
【０１１１】
【実施例】
以下、本発明を、限定的に解するべきでない以下の実施例および図面についてさらに記載する。
以下の実施例は、上記に議論した原理を実証する。便宜上、カチオン性アミノ酸はアルギニンで代表され、嵩高な親油性アミノ酸は、トリプトファン、チロシンおよびトリ−ｔｅｒｔ．−ブチルトリプトファン（超嵩高な親油性）で代表される。同様の電荷または嵩高な親油性を有する他の残基は、これらのアミノ酸の代わりに使用できることが明らかである。Ｎ末端およびＣ末端の修飾基は、さらなる嵩高な親油性基を提供する。
【０１１２】
抗菌性の効力は、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）および最小殺菌濃度（ＭＢＣ）として、ともにμｇ／ｍｌで代表的なグラム陰性菌およびグラム陽性菌であるＥ．ｃｏｌｉおよびＳ．ａｕｒｅｕｓについて決定された。細胞毒性は、ＥＣ５０（赤血球の５０％溶解に必要なペプチド量）として決定された。
ＭＩＣ（最小発育阻止濃度）試験
使用された細菌株は：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２， Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ ２５９２３， ＭＲＳＡ ＡＴＣＣ ３３５９１およびＭＲＳＥ ＡＴＣＣ ２７６２６であった。すべての株は、−７０℃で貯蔵された。細菌は、２％バクト　ペプトン水（Ｄｉｆｃｏ１８０７−１７−４）中で成長させた。すべてのテストは、対数成長期中期にある細菌を用いて行った。細菌株に対するペプチドの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の決定は、１％バクト　ペプトン水中で行われた。２×１０^６ＣＦＵ／ｍｌの接種を用いる標準微量希釈技術を使用した。すべてのアッセイは、二連で行った。ペプチドはプラスに帯電しており、このためプラスチック製ウェルに付着できるため、我々はＨＰＬＣによって溶液中のペプチドの実際の濃度を制御した。プラスチックウェルに該溶液を添加する前後で、ペプチド濃度に差は何らなかった。ＭＢＣテストは、同様の方法で行った。
溶血性アッセイ
ペプチドの溶血性の活性は、新鮮なヒトの赤血球を用いて決定した。８ｍｌの血液を健康なヒトから採取した。４ｍｌの血液は、ヘパリンを最終濃度が１０Ｕ／ｍｌになるように含むポリカーボネート管に移され、残り４ｍｌの血液は、最終濃度が１５％ＥＤＴＡとなるようにＥＤＴＡを含むガラス管に移された。赤血球は、１５００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって、ヘパリン処理された血液から分離され、血漿およびバッフィコートを除去するためリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。細胞ペレットを、ＰＢＳに再懸濁し、４ｍｌの最終容量とした。ペプチドは、２ｍｇ／ｍｌおよび０．１ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈された。ペプチドは、さらに、表１５に記載されている濃度に希釈した。おのおの試験管に、ＰＢＳが最初に添加され、ついでＲＢＣおよびペプチド溶液が添加された。ＥＤＴＡで処理された血液におけるヘマトクリットは、３０分後にＳｙｓｍｅｘ Ｋ−１０００で決定され、また再懸濁されたＲＢＣは１０％ヘマトクリットに希釈された。ＰＢＳ中のＲＢＣ（１％）は、ペプチドと一緒におよびペプチドなしで（表１５）、３７°で１時間、振盪機でインキュベートし、次いで、４０００ｒｐｍで５分間、遠心分離した。上清は慎重に新たなポリカーボネート管に移し、上清の吸光度を５４０ｎｍで測定した。ベースラインの溶血は、ＰＢＳの存在のもとに放出されるヘモグロビンであり、１００％溶血は、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の存在下に放出されるヘモグロビンであった。
【０１１３】
【実施例１】
一連のペプチドは、Ａｄｖａｎｃｅ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ社製の固相多重ペプチド合成装置ＭＢＳ ３９６上で、カルボキシレートのマイナス電荷を避けるためのＣ末端アミド化を伴うＡｒｇ−Ｔｒｐのコンビネーションを用いて調製される。これらのペプチドの抗菌活性を以下の表１に示す。
【０１１４】
【表１】

【０１１５】
カッコ内の数値は、トリプトファン残基の一個以上がＰＭＣ基によって修飾されたペプチドを表している。
【０１１６】
【実施例２】
ペプチドの２番目のシリーズは、Ｃ末端のエステル化および／またはＮ末端のアシル化を伴い、溶液においてＡｒｇ／Ｔｒｐ（Ｔｂｔ）またはＴｒｐ（Ｔｂｔ）／Ａｒｇモチーフを組み込む手動の合成により調製した。ペプチドの２番目のセットは、少数の構成ブロック（すなわち、Ｂｏｃ ＲＷ ＯＢｚ， Ｂｏｃ ＷＥ ＯＭｅおよび Ｂｏｃ ＴｂｔＲ ＯＭｅ）の調製ならびにこれらのブロックを、（Ｎ末端で）アミノ酸追加、Ｎ末端アシル化および／またはＣ末端の修飾（ジアミノエタン誘導体を作ることによるＣ末端におけるカチオン部位の調製）で修飾することに基づきデザインされた。
【０１１７】
Ｂｏｃ 除去のための一般操作
Ｂｏｃで保護されたペプチドは、試薬Ｋ^ｉ中に溶解され、かつ室温で６０−９０分間撹拌された。反応混合物に、最少量のジエチルエーテル^１に溶解したｐ−トルエンスルホン酸（２．０−２．５当量）の溶液が添加され、乳白色混合物は、生成物を完全に析出させるため、冷蔵庫内で一晩冷却した。エーテル層を抜き去り、残留物をジエチルエーテル^１で粉末まで粉砕し、次いで真空中で蒸発させた。粗生成物は、生物的試験に先立ちＰＲ−ＨＲＬＣで精製するか、あるいはさらに精製を行うことなく次段階で使用した。
【０１１８】
Ｂｏｃ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ（ＫＰ−２−１）
Ｂｏｃ−Ｄ−Ａｒｇ−ＯＨ 塩酸（８５５ｍｇ， ２．７５ｍｍｏｌ）、Ｈ−Ｄ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ 塩酸 （８３２ｍｇ， ２．５ｍｍｏｌ）， ＨＯＢｔ（１３７８ｍｇ， ９ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（２．０５ｍｌ， １２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５ｍｌ）およびジクロロメタン（１ｍｌ）溶液に、氷上で冷却し攪拌しながらＨＢＴＵ（１１３８ｍｇ，３ｍｍｏｌ）が１０分かけて少しずつ添加された。混合物は氷上で１時間撹拌され、４０ｍｌジクロロメタンを添加し、次いで有機相を、３×４０ｍｌ飽和ＮａＨＣＯ_３、２×３０ｍｌ ５％クエン酸、５０ｍｌ水および２×３０ｍｌ塩水で次々と洗浄した。蒸発させて白色固体を得た。
【０１１９】
Ｈ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ（ＫＰ−２−２−１）
Ｂｏｃ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ（１．２９ｇ， ２．２ｍｍｏｌ）は、基本手順に記載されたように試薬Ｋで処理した。エーテル層を除去した後、蒸発させて０．８５ｇの黄色みがかった固体を得た。
Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ（ＫＰ−１−２）
Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ−ＯＨ（７９２ｍｇ， ２．７５ｍｍｏｌ）、Ｈ−Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ 塩酸 （８３２ｍｇ， ２．５ｍｍｏｌ）， ＨＯＢｔ（１３７８ｍｇ， ９ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（２．０５ｍｌ， １２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（６ｍｌ）およびジクロロメタン（３ｍｌ）溶液に、ＨＢＴＵ（１１３８ｍｇ，３ｍｍｏｌ）が氷上で冷却し攪拌しながら１０分かけて少しずつ添加された。混合物は氷上で４５分間、さらに室温４５分間撹拌された。ＫＰ−２−１に記載されたように、ワークアップ（ｗｏｒｋｕｐ）を実施した。蒸発して１．７ｇの黄色みがかった固体を得た。
【０１２０】
Ｈ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ（ＫＰ−４−１）
Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ（１．０ｇ， １．５ｍｍｏｌ）は、基本手順に記載されたように試薬Ｋで処理された。エーテル層を除去した後、蒸発して１．０７ｇのベージュ色固体を得た。
Ｂｏｃ−Ｌ−Ｔｒｐ−Ｌ−Ａｒｇ−ＯＭｅ（ＫＰ−３−２）
Ｂｏｃ−Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＨ（７６１ｍｇ， ２．５ｍｍｏｌ）、Ｈ−Ｌ−Ａｒｇ−ＯＭｅ 二塩酸 （７１８ｍｇ， ２．７５ｍｍｏｌ）， ＨＯＢｔ（１３７８ｍｇ， ９ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（２．０５ｍｌ， １２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５ｍｌ）およびジクロロメタン（２ｍｌ）溶液に、ＨＢＴＵ（１１３８ｍｇ，３ｍｍｏｌ）が氷上で冷却し攪拌しながら１０分かけて少しずつ添加された。混合物は氷上で１時間撹拌され、４０ｍｌの酢酸エチルが添加され、次いで有機相は、３×４０ｍｌ飽和ＮａＨＣＯ_３、２×３０ｍｌ ５％クエン酸、５０ｍｌ水および２×３０ｍｌ塩水で次々と洗浄された。蒸発して白色固体、１．１ｇを得た。
【０１２１】
Ｈ−Ｌ−Ｔｒｐ−Ｌ−Ａｒｇ−ＯＭｅ（ＫＰ−５−１）
Ｂｏｃ−Ｌ−Ｔｒｐ−Ｌ−Ａｒｇ−ＯＭｅ（１．１ｇ， ２．１５ｍｍｏｌ）は、基本手順に記載されたように試薬Ｋで処理された。エーテル層を除去した後、蒸発して１．２３ｇの黄色みがかった固体を得た。
Ｂｏｃ−Ｌ−Ｔｒｐ−Ｌ−Ｔｒｐ−Ｌ−Ａｒｇ−ＯＭｅ（ＫＰ−６−１）
Ｂｏｃ−Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＨ（８７ｍｇ， ０．２９ｍｍｏｌ）、Ｈ−Ｌ−Ｔｒｐ−Ｌ−Ａｒｇ−ＯＭｅ ジ−ｐ−トルエンスルホン酸（２２６ｍｇ， ０．３ｍｍｏｌ）， ＨＯＢｔ（１５８ｍｇ， １．０３ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（２３５μｌ， １．３７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍｌ）溶液に、ＨＢＴＵ（１３０ｍｇ，０．３４ｍｍｏｌ）が氷上で冷却し攪拌しながら１０分かけて少しずつ添加された。混合物は氷上で８０分間撹拌され、５ｍｌのジクロロメタンが添加され、次いで有機相は、３×５ｍｌ飽和ＮａＨＣＯ_３、２×５ｍｌ ５％クエン酸、５ｍｌ水および５ｍｌ塩水で次々と洗浄された。蒸発させて、０．０５ｇの黄色油状物を得たが、このものは微量の生成物を含むことがＴｌｃにより判定された。プールされた水相は３×１５ｍｌ酢酸エチルで抽出し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥して、蒸発させ０．１７ｇの黄色油状物を得た。この油状物はさらに精製することなく次の段階で使用された。
【０１２２】
Ｈ−Ｌ−Ｔｒｐ−Ｌ−Ｔｒｐ−Ｌ−Ａｒｇ−ＯＭｅ （ＫＰ−８−１）
Ｂｏｃ−Ｌ−Ｔｒｐ−Ｌ−Ｔｒｐ−Ｌ−Ａｒｇ−ＯＭｅ（０．１４ｇ， 約０．２ｍｍｏｌ）は、基本手順に記載されたように試薬Ｋで処理された。生成物はｐ−トルエンスルホン酸を添加されることなくジエチルエーテルの添加により析出した。
Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｔｒｐ−Ｌ−Ａｒｇ−ＯＭｅ（ＫＰ−１１−１）
Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ−ＯＨ（６４ｍｇ， ０．２２ｍｍｏｌ）、Ｈ−Ｌ−Ｔｒｐ−Ｌ−Ａｒｇ−ＯＭｅ ジ−ｐ−トルエンスルホン酸（１７５ｍｇ， ０．２３ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１２８ｍｇ， ０．８３ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１８１μｌ， １．１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍｌ）溶液に、ＨＢＴＵ（１０６ｍｇ， ０．２８ｍｍｏｌ）が氷上で冷却し攪拌しながら１０分かけて少しずつ添加された。混合物は氷上で２時間、室温で３０分間撹拌され、１０ｍｌの酢酸エチルが添加され、次いで有機相はＫＰ−３−２に記載されたように洗浄された。ワークアップ後、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって判定したところ有機層には所望の生成物は全く含まれていなかった。プールされた水相は３×１５ｍｌの酢酸エチルで抽出され、蒸発させて０．１ｇの黄色油状物を得た。この油状物はさらに精製することなく次の段階で使用した。
【０１２３】
Ｈ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｔｒｐ−Ｌ−Ａｒｇ−ＯＭｅ（ＫＰ−１３−１）
Ｂｏｃ−Ｌ−Ｔｒｐ−Ｌ−Ｔｒｐ−Ｌ−Ａｒｇ−ＯＭｅ（０．１４ｇ， 約０．２ｍｍｏｌ）は、基本手順に記載されたように試薬Ｋで処理された。生成物はｐ−トルエンスルホン酸を添加されることなくジエチルエーテルの添加により析出した。エーテル層を除去した後、蒸発させて０．１ｇの白色固体を得た。
【０１２４】
Ｂｏｃ−Ｌ−Ｔｒｐ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ（ＫＰ−１２−１）
Ｂｏｃ−Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＨ（８８ｍｇ， ０．２９ｍｍｏｌ）、Ｈ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ ジ−ｐ−トルエンスルホン酸（２５５ｍｇ， ０．３ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１５８ｍｇ， １．０３ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（２３５μｌ， １．３７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍｌ）溶液に、ＨＢＴＵ（１３０ｍｇ， ０．３４ｍｍｏｌ）が氷上で冷却し攪拌しながら１０分かけて少しずつ添加された。混合物は氷上で２時間、室温で３０分間撹拌され、１０ｍｌの酢酸エチルが添加され、次いで有機相はＫＰ−３−２に記載されたように洗浄した。蒸発して０．２３ｇの黄色油状物を得た。
【０１２５】
Ｈ−Ｌ−Ｔｒｐ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ（ＫＰ−１４−１）
Ｂｏｃ−Ｌ−Ｔｒｐ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ（０．２３ｇ， 約０．３ｍｍｏｌ）は、ＫＰ−８−１に記載されたように試薬Ｋで処理された。エーテル層を除去した後、蒸発させて０．２ｇの白色固体を得た。
Ｂｏｃ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ（ＫＰ−１５−１）
Ｂｏｃ−Ｄ−Ｔｒｐ−ＯＨ（９０ｍｇ， ０．２９ｍｍｏｌ）、Ｈ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ ジ−ｐ−トルエンスルホン酸（２５１ｍｇ， ０．３ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１５８ｍｇ， １．０３ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（２３５μｌ， １．３７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５ｍｌ）溶液に、ＨＢＴＵ（１３０ｍｇ， ０．３４ｍｍｏｌ）が氷上で冷却し攪拌しながら１０分かけて少しずつ添加された。混合物は氷上で４０分間撹拌され、ワークアップがＫＰ−２−１に記載されているように実施された。蒸発させて０．２４ｇの黄色固体を得た。
【０１２６】
Ｈ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ（ＫＰ−１６−１）
Ｂｏｃ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ（０．２４ｇ， 約０．３ｍｍｏｌ）は、基本手順に記載されたように試薬Ｋで処理された。エーテル層を除去した後、蒸発させて０．１７ｇのベージュ色固体を得た。
Ｂｏｃ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ（ＫＰ−２−１−２）
Ｂｏｃ−Ｄ−Ｔｒｐ−ＯＨ（１６２ｍｇ， ０．５３ｍｍｏｌ）、Ｈ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ ジ−ｐ−トルエンスルホン酸（４６４ｍｇ， ０．５６ｍｍｏｌ）， ＨＯＢｔ（２９２ｍｇ， １．９ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（４．４ｍｌ， ２５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５ｍｌ）およびジクロロメタン（１ｍｌ）溶液に、ＨＢＴＵ（２４１ｍｇ， ０．６４ｍｍｏｌ）が氷上で冷却し攪拌しながら１０分かけて少しずつ添加された。混合物は氷上で７０分間撹拌され、１０ｍｌジクロロメタンが添加され、次いで有機相は、３×１０ｍｌ飽和ＮａＨＣＯ_３、４×１０ｍｌ ５％クエン酸（過量のＤＩＰＥＡが添加されているため酸性水相まで）、２×１０ｍｌ水および２×１０ｍｌ塩水で次々と洗浄した。蒸発させて０．４２ｇの粗生成物を得た。
【０１２７】
Ｈ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ（ＫＰ−２−１−３）
Ｂｏｃ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ （０．３８ｇ， 約０．４ｍｍｏｌ）は、基本手順に記載されたように試薬Ｋで処理された。エーテル層を除去した後、蒸発させて０．３ｇのベージュ色固体を得た。
Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＨ （ＫＰ−１０−２）
Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＨ（３００ｍｇ， ０．５ｍｍｏｌ）の５ｍｌメタノール／水（１９：１）溶液に、Ｐｄ−１０％活性炭（５３ｍｇ， ０．０５ｍｍｏｌ）が添加された。混合物は、水素雰囲気（１ａｔｍ）で一晩撹拌され、セライト５４５の薄層を通して濾過され、そして蒸発させて赤い油状物を得た。油状物はとろ火で水に溶解し、凍結乾燥して３８３ｍｇのピンク色粉末を得た。
【０１２８】
Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｔｒｐ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ（ＫＰ−１７−１）
Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＨ 塩酸（１００ｍｇ， ０．２０ｍｍｏｌ）、Ｈ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌジ−ｐ−トルエンスルホン酸（１７５ｍｇ， ０．２１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１１０ｍｇ， ０．７２ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（１６４μｌ， ０．９６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍｌ）溶液に、ＨＢＴＵ（９１ｍｇ， ０．２４ｍｍｏｌ）が氷上で冷却し攪拌しながら１０分かけて少しずつ添加された。混合物は氷上で３時間撹拌され、さらにＫＰ−３−２に記載されたようなワークアップが実施された。
【０１２９】
Ｈ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｔｒｐ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ（ＫＰ−１９−１）
Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｔｒｐ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ （約０．２ｍｍｏｌ）は、ＫＰ−８−１に記載されたように試薬Ｋで処理された。エーテル層の完全な除去は、物質の損失なしに実施することが困難であり、このため、おそらくピンク色の粗生成物はかなりの量のＴＦＡを含んでいた。
【０１３０】
Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ（ＫＰ−１８−１）
Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＨ 塩酸（１００ｍｇ， ０．２０ｍｍｏｌ）、Ｈ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌジ−ｐ−トルエンスルホン酸（１７５ｍｇ， ０．２１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１１０ｍｇ， ０．７２ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１６４μｌ， ０．９６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍｌ）溶液に、ＨＢＴＵ（９１ｍｇ， ０．２４ｍｍｏｌ）が氷上で冷却し攪拌しながら１０分かけて少しずつ添加された。混合物は氷上で３時間撹拌され、さらにＫＰ−３−２に記載されたようなワークアップが実施された。ワークアップ後、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって判定したところ有機層は所望の生成物を少量のみ含んでいた。プールされた水相は３×１５ｍｌ酢酸エチルで抽出され、蒸発させて粗生成物を得た。
【０１３１】
Ｈ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ（ＫＰ−２０−１）
Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ（約０．２ｍｍｏｌ）は、ＫＰ−８−１に記載されたように試薬Ｋで処理された。エーテル層の完全な除去は、物質の損失なしに実施することが困難であり、このため、おそらく粗生成物はかなりの量のＴＦＡを含んでいた。
【０１３２】
Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｔｒｐ−Ｌ−Ｔｒｐ−Ｌ−Ａｒｇ−ＯＭｅ（ＫＰ−２１−１）
Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＨ 塩酸（１００ｍｇ， ０．２０ｍｍｏｌ）、Ｈ−Ｌ−Ｔｒｐ−Ｌ−Ａｒｇ−ＯＭｅジ−ｐ−トルエンスルホン酸（１７１ｍｇ， ０．２３ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１１０ｍｇ， ０．７２ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１６４μｌ， ０．９６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍｌ）溶液に、ＨＢＴＵ（９１ｍｇ， ０．２４ｍｍｏｌ）が氷上で冷却し攪拌しながら１０分かけて少しずつ添加された。混合物は氷上で３時間撹拌され、さらにＫＰ−３−２に記載されたようなワークアップが実施された。ワークアップ後、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって判定したところ有機層は所望の生成物を少量しか含んでいなかった。プールされた水相は３×１５ｍｌ酢酸エチルで抽出され、蒸発させて０．１６ｇの黄色油状物を得た。
【０１３３】
Ｈ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｔｒｐ−Ｌ−Ｔｒｐ−Ｌ−Ａｒｇ−ＯＭｅ（ＫＰ−２２−１）
Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｔｒｐ−Ｌ−Ｔｒｐ−Ｌ−Ａｒｇ−ＯＭｅ（０．１６ｇ、約０．１８ｍｍｏｌ）は、ＫＰ−８−１に記載されたように試薬Ｋで処理された。エーテル層を除去した後、蒸発させて０．１２ｇのピンク色固体を得た。
Ｉｎｄ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−ＯＭｅ
３−インドリル酢酸（０．２８９ｍｍｏｌ）は、Ｂｏｃ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−ＯＭｅについて記載されているように、Ｈ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−ＯＭｅ（１．０６当量）、トリエチルアミン（２．０１当量）およびＨＢＴＵ（１．１０当量）で処理された。メタノールを溶媒として使用した。反応は、９ｍｌの飽和塩化ナトリウムを添加することにより失活された。水相は３×７ｍｌ酢酸エチルで抽出され、次いで有機相は４ｍｌの２Ｍ塩酸、４ｍｌの水および４ｍｌの５％炭酸水素ナトリウムで洗浄した。有機相は、前記の洗浄工程を１回繰り返したのち、５ｍｌの飽和塩化ナトリウムで乾燥して、次いで蒸発させて０．１１ｇの白色固体を得た。粗生成物はＲＰ−ＨＰＬＣで精製された。
^１Ｈ ＮＭＲ（アセトニトリル−ｄ_３）：δ＝１．３４（２Ｈ，ｍ）、１．５２（１Ｈ，ｍ）、１．７１（１Ｈ，ｍ）、２．８９（５Ｈ，ｍ）、３．０５（１Ｈ，ｍ）、３．１５（１Ｈ，ｍ）、４．３４（１Ｈ，ｍ）、４．４８（１Ｈ，ｍ）、６．０１（４Ｈ，ｂｓ）、６．４２（１Ｈ，ｂｓ）、６．８８−７．５０（１２Ｈ，ｍｓ）、９．１０（１Ｈ，ｓ）、９．２２（１Ｈ，ｓ）。
【０１３４】
Ｃｈｘ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−ＯＭｅ
シクロヘキサンカルボン酸（０．２９７ｍｍｏｌ）が、Ｈ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−ＯＭｅ（１．０３当量）、トリエチルアミン（１．９６当量）およびＨＢＴＵ（１．０５当量）で、Ｂｏｃ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−ＯＭｅについて記載されているように処理された。メタノールを溶媒として使用した。失活およびワークアップは、Ｉｎｄ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−ＯＭｅに記載されたように実施して、０．１０ｇの白色固体を得た。粗生成物はＲＰ−ＨＰＬＣで精製された。
【０１３５】
Ｂｏｃ−Ｔｂｔ−Ａｒｇ−ＯＭｅ
Ｂｏｃ−Ｔｂｔ−ＯＨ（０．４７３５ｇ， １．０ｍｍｏｌ）、Ｈ−Ａｒｇ−ＯＭｅ 二塩酸（０．２７４１ｇ， １．０５ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．４８７２ｇ， ３．６１ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．８２０ｍｌ， ４．７９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ／ジクロロメタン（１４ｍｌ）の溶液が、攪拌しながら氷／水浴中で冷却される。ＨＢＴＵ（０．４５６０ｇ， １．２ｍｍｏｌ）が少しずつ１０分かけて添加される。混合物は３０分間撹拌され、次いで冷却浴は除去される。反応混合物は、カルボン酸成分が少しも残らなくなるまで、室温で撹拌される（ＴｌｃシステムＡ）。混合物は油状になるまで蒸発させて、２０ｍｌジクロロメタンを添加し、次いで有機相は、３×２０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム、２×１５ｍｌの５％クエン酸、２５ｍｌの水、２×１５ｍｌの飽和塩化ナトリウムで次々と洗浄され、蒸発させて０．８０ｇの白色固体を得る。
【０１３６】
Ｈ−Ｔｂｔ−Ａｒｇ−ＯＭｅ
Ｂｏｃ−Ｔｂｔ−Ａｒｇ−ＯＭｅ（０．９０ｍｍｏｌ）は、基本手順に記載されたように試薬Ｋで処理された。エーテル層を除去した後、蒸発させて０．２４ｇの白色固体を得た。粗生成物は、ＲＰ−ＨＰＬＣで精製した。
Ｂｏｃ−Ａｒｇ−Ｔｂｔ−Ａｒｇ−ＯＭｅ
Ｈ−Ｔｂｔ−Ａｒｇ−ＯＭｅのジ−ｐ−トルエンスルホン酸塩（０．２４ｇ， ０．２７０ｍｍｏｌ）、Ｂｏｃ−Ａｒｇ−ＯＨ（０．０９３３ｇ， ０．３３５ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．０４４２ｇ， ０．３２７ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．１１３ｍｌ，０．８１１ｍｍｏｌ）およびＨＢＴＵ（０．１２３１ｇ， ０．３２５ｍｍｏｌ）がアセトニトリル（２．２ｍｌ，ＨＰＬＣ等級）中に溶解され、室温で撹拌された。１時間後、出発物質は未だ残っていた（ＴｌｃシステムＡ）。３当量のトリエチルアミンが添加され、反応混合物は、もう１時間撹拌された。失活およびワークアップは、Ｂｏｃ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−ＯＭｅに記載されたように実施された。粗油状物は、ジクロロメタンと共蒸発させて、０．２３ｇの白色固体を得た。粗生成物は、さらに精製することなく使用された。
【０１３７】
Ｈ−Ａｒｇ−Ｔｂｔ−Ａｒｇ−ＯＭｅ
粗Ｂｏｃ−Ａｒｇ−Ｔｂｔ−Ａｒｇ−ＯＭｅは試薬Ｋの４．０５ｍｌに溶解して、基本手順に記載されたように開裂を行った。粗生成物は生物学試験に先立ちＲＰ−ＨＲＬＣによって精製された。
Ｂｏｃ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ
Ｂｏｃ−Ａｒｇ−ＯＨとＨ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌとを、Ｂｏｃ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−ＯＭｅに記載されているように結合させた。Ｎ−メチルモルフォリンを塩基として使用した。粗生成物はＲＰ−ＨＰＬＣで精製した。
【０１３８】
Ｈ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ
粗Ｂｏｃ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ（１．２３ｍｍｏｌ）を試薬Ｋの１８．３ｍｌに溶解して、基本手順に記載されたように開裂を行った。粗生成物はさらに精製することなく使用された。
Ｉｎｄ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ
３−インドリル酢酸（０．０４５０ｇ、０．２５７ｍｍｏｌ）が、Ｂｏｃ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−ＯＭｅに記載されているように、Ｈ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌジ−ｐ−トルエンスルホン酸塩、ＨＢＴＵおよびトリエチルアミン（６当量）で処理された。アセトニトリルを溶媒として使用した。粗生成物は、０．１９ｇの白色固体として分離された。
【０１３９】
Ｃｈｘ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ
シクロヘキサンカルボン酸（０．００３１ｍｌ， ０．２６６ｍｍｏｌ）が、Ｂｏｃ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−ＯＭｅに記載されているように、Ｈ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ、ジ−ｐ−トルエンスルホン酸塩、ＨＢＴＵおよびトリエチルアミン（６当量）で処理された。アセトニトリルを溶媒として使用した。粗生成物は、０．１７ｇの白色固体として分離された。
【０１４０】
Ｉｎｄ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＯＨ
粗Ｉｎｄ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌは、一般的な方法に記載されているように、水素化され、黄色油状物が得られた。
Ｃｈｘ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＯＨ
粗Ｃｈｘ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌは、一般的な方法に記載されているように、水素化され、黄色油状物が得られた。
【０１４１】
Ｂｏｃ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＯＨ（Ｂ８７）
粗Ｂｏｃ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌは、一般的な方法に記載されているように、水素化され、０．７２ｇの黄色油状物が得られた。
Ｂｏｃ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｄａｅ−Ｚ
Ｂｏｃ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＯＨ（１．２６５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ／ジクロロメタン（１２ｍｌ、１：１）溶液に、攪拌しながらＨＯＢｔ（０．６２０２ｇ， ４．５９０ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（１．０４０ｍｌ， ６．０７５ｍｍｏｌ）およびＮ−Ｚ−ジアミノエタン塩酸（０．３０８８ｇ、１．３３９ｍｍｏｌ）が添加された。ＨＢＴＵ（０．５７７２ｇ， １．５２２ｍｍｏｌ）が少しずつ５分かけて添加された。反応混合物は室温で３時間４５分撹拌され、蒸発させて暗黄色油状物となった。油状物は２０ｍｌの酢酸エチルに溶解し、３ｍｌの２Ｍ塩酸、５ｍｌの水、５ｍｌの５％炭酸水素ナトリウム、５ｍｌの水で次々と洗浄された。得られた暗黄色溶液は、硫酸マグネシウム上で乾燥され、蒸発させると油状物になった。ヘプタン中では粉砕できず、油状物は蒸発させて０．８６ｇの茶色がかった固体を得た。
【０１４２】
Ｈ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｄａｅ−Ｚ
Ｂｏｃ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｄａｅ−Ｚ（０．５４４ｍｍｏｌ）は試薬Ｋ（６．８ｍｌＴＦＡ）に溶解され、室温で１時間１０分撹拌された。反応混合物は少容量まで蒸発させて、ｐ−トルエンスルホン酸（０．３２ｇ）のジエチルエーテル（２０ｍｌ）溶液が添加された。乳白色混合物は冷蔵庫内で一晩冷却され、生成物を完全に析出させた。エーテル層を抜き去り、残存物は、真空下で蒸発させて白色粉末を得た。粗生成物は、ＲＰ−ＨＰＬＣで精製した。
【０１４３】
Ｉｎｄ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｄａｅ−Ｚ
３−インドリル酢酸（０．０２６５ｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）が、Ｂｏｃ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−ＯＭｅについて記載されているように、Ｈ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｄａｅ−Ｚジ−ｐ−トルエンスルホン酸塩、ＨＢＴＵ（１．２当量）およびトリエチルアミン（５当量）で処理された。アセトニトリル（１．４ｍｌ）およびＤＭＦ（０．６ｍｌ）は、アセトニトリル中でジペプチドアナログが溶解しにくいことから、溶媒として使用された。粗生成物は、０．１２ｇの白色固体として分離された。
略語
Ａｒｇ　　アルギニン
Ｂｏｃ　　ｔ−ブチロキシカルボニル
Ｃｈｘ　　シクロヘキサンカルボン酸
Ｄａｅ　　ジアミノエタン
ＤＩＰＥＡ　ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ　　Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド
ＥＳＭＳ　 エレクトロスプレー（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ）質量分析法
ＨＢＴＵ　　Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム　　　　　ヘキサフルオロリン酸
ＨＯＢｔ　 １−ヒドロキシベンゾトリアゾール
Ｉｎｄ　　３−インドリル酢酸
ＭＢＣ　　最小殺菌濃度
ＭＩＣ　　最小発育阻止濃度
ＲＰ−ＨＰＬＣ 　逆相高性能液体クロマトグラフィー
Ｔｂｔ　　２，５，７−トリ−ｔ−ブチルトリプトファン
ＴＦＡ　　トリフルオロ酢酸
Ｔｒｐ　　トリプトファン
Ｚ　　　ベンジロキシカルボニル
文献
１）　Ｇｕｙ， Ｃ． Ａ．．； Ｆｉｅｌｄｓ， Ｇ． Ｂ． Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９９７， ２８９， ６７−８３
２）　Ｌｏｔｔ， Ｒ． Ｓ．； Ｃｈａｕｈａｎ， Ｖ． Ｓ．； Ｓｔａｍｍｅｒ， Ｃ． Ｈ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １９７９， ４９５−４９６
備考
ｉ　試薬Ｋはフェノール（５％， ｗ／ｖ）、水（５％ ｖ／ｖ）、チオアニソール（５％ ｖ／ｖ）、エタンジチオール（２．％ ｖ／ｖ）およびトリフルオロ酢酸（８２．５％ ｖ／ｖ）からなる。ペプチド １ ｍｍｏｌｅ当たり１．５ｍｌの試薬が、Ｂｏｃ基の開裂に使用される。
ｉｉ　ジエチルエーテルにあるｐ−トルエンスルホン酸の添加は、結果として、ペプチドのトルエンスルホン酸塩の形成をもたらす。１個の遊離アミノ官能基あるいはグアニジン官能基を含むペプチドは、モノｐ−トルエンスルホン酸塩などを形成すると信じられている。
【０１４４】
生成物の同定は、ＥＳＭＳを用いて実施され、その結果を表２に示す。
【０１４５】
【表２】

【０１４６】
カップリングおよび脱保護反応の化学収率は測定されていなかった。生成物の同定はＥＳＭＳを用いて行われた。精製は半分取的Ｃ１８カラム上で、移動相として水およびアセトニトリル（ともに０．０１％ＴＦＡが添加される）を用いるＲＰ−ＨＰＬＣにより行われた。精製されたサンプルのペプチド含量は、分析用Ｃ１８カラムを用いるＲＰ−ＨＰＬＣで確証された。
【０１４７】
これらのペプチドの抗菌活性は、以下の表３〜５に示される。
【０１４８】
【表３】

【０１４９】
【表４】

【０１５０】
【表５】

【０１５１】
Ｔｂｔを含む２つのペプチドを例外として、実施例１および２のいずれのペプチドも測定可能な溶血を示さない（すなわちＥＣ５０＞１０００μｇ／ｍｌ）。ジペプチド、Ｔｂｔ−Ａｒｇ−ＯＭｅは３６０μｇ／ｍｌのＥＣ５０を有していたが、しかし驚くべきことに、トリペプチドのＡｒｇ−Ｔｂｔ−Ａｒｇ−ＯＭｅは、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ａｕｒｅｕｓの双方に対してより高い活性を有しているにもかかわらず、ＥＣ５０が７２０μｇ／ｍｌと、より低い毒性であった。アルギニンは好ましいものの、リジンは抗菌活性を著しく失うことなく使用できる。フェニルアラニンは、より小さいそのサイズのため、トリプトファンよりも活性が低い。
【０１５２】
【実施例３】
ペプチドＡｒｇ−（２−Ｎａｌ）−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−（２−Ｎａｌ）ＮＨ_２（ここで（２−Ｎａｌ）は２−ナフチルアラニンである）が調製され、下記の表６に示されるように、ある範囲の臨床的に重要な病原体に対して試験された。
ペプチドは、９０５０ ミリポア　自動ペプチドシンセサイザー上で、Ｆｍｏｃの保護およびペンタフルオロフェニル（Ｐｆｐ）エステルを用いる活性化、またはカップリング試薬ＨＡＴＵ（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）を用いるその場での活性化を利用して製造された。ペンタフルオロフェニルエステルとのカップリングの場合、１−ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）が反応を触媒するために添加され、さらにカップリング試薬ＨＡＴＵを使用する場合、反応はＤＩＰＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）により塩基触媒された。反応性側鎖を有するすべてのアミノ酸は、酸に不安定な保護基で保護され、スカベンジャーを含むＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）による処理により開裂された。（下記のスカベンジャー混合物を参照）。それと同時にペプチドは、ＴＦＡ溶液の処理によって固体担体から切り離された。
Ａ）固体担体への１番目のアミノ酸の付着
固体担体ＰＡＣ−ＰＥＧ−ＰＳ（ペプチド酸−ポリエチレングリコール−ポリスチレン樹脂）（１当量）は、Ｆｍｏｃ−（２−Ｎａｌ）−ＯＰｆｐ（５当量）およびＤＭＡＰ（ジメチルアミノピリジン）（１当量）とともに、小容量のＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）中で混合し、３０分間膨潤させるために放置した。次いで、溶液をゆっくりと４時間半撹拌した。その後固体担体上に残存する水酸基すべてをアセチル化するために、Ａｃ_２Ｏ（無水酢酸）（２．５当量）およびＤＭＡＰ（０．１当量）が溶液に添加された。該溶液は、次いでもう１時間撹拌された。Ｃ末端アミノ酸が付着する固体担体は、濾過によって分離され、さらにフィルター上でＤＭＦで数回洗浄された。その後、該固体担体は、９０５０ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを用いるターゲットペプチドの合成に使用された。
Ｂ）ニンヒドリンテスト／カイザー（Ｋａｉｓｅｒ’ｓ）テスト
１ｍｇ未満のペプチド−樹脂複合体は、５％ニンヒドリンのエタノール溶液、エタノール（２０ｍｌ）中のフェノール（８０ｇ）溶液、および乾燥、蒸留したピリジン溶液の同じ小容量で処理された。反応混合物を２分間、１１０℃で加熱し、顕微鏡で観察した。（このテストでは、黄色の反応混合物は、充分にアセチル化したことを示し、一方、青い溶液は未だ遊離アミノ基があることを示す。）
Ｃ）酸不安定性保護基の開裂
酸不安定な保護基の開裂および固体担体からのペプチドの切断は、２％アニソール、２％エタンジチオール（ＥＤＴ）、２％水および２％フェノールのＴＦＡ混合物を用いて、僅か４時間の開裂時間で行なわれた。固体担体は、その後、濾過により除去され、ペプチドはジエチルエーテル中で析出した。ＴＦＡを含むエーテル溶液は、パスツールピペットを用いて除去され、ペプチドはジエチレンエーテルで数回洗浄され、高真空下で乾燥された。
Ｄ）精製
前記ペプチドは、Ｃ１８逆層カラム（＊）、および移動相として水およびアセトニトリル（ともに０．１％ＴＦＡが添加される）を使用するＨＰＬＣで精製された。ペプチドのフラクションの検出に選択された波長は２５４ｎｍであった。
（＊）ＰｒｅＰａｋＲ カートリッジ ２５×１００ｍｍ。ＤｅｌｔａＰａｋ^ＴＭ Ｃ１８ １５μｍ １００Å（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
Ｅ）分析
ペプチドは、分析用ＨＰＬＣ Ｃ−１８逆層カラム上で移動相として水およびアセトニトリル（ともに０．１％ＴＦＡ添加される）を使用して、不純物の分析をおこなった。ペプチドの分子量は、陽イオンエレクトロスプレー質量分析法（ＶＧ Ｑｕａｔｔｒｏ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ）で決定された。
下記から選択される、合成に使用されたアミノ酸誘導体

アミノ酸誘導体は、Ｂａｃｈｅｍ， ＭｉｌｌｉＧｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ 社（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）かるいはＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社のいずれかから購入した。
【０１５３】
【表６】

【０１５４】
ＭＲＳＡ＝メチシリン耐性黄色ブドウ球菌
ＭＲＳＥ＝メチシリン耐性表皮ブドウ球菌
【０１５５】
【実施例４】
さらなる一連のペプチドが、嵩高な親油性基の異なるサイズおよび分子におけるそれらの相対的な位置の影響を調べるために、設計されて作製された。
以下のほとんどのペプチドは、同じ出発原料、ＲＯＢｚｌから製造された。１つの方法が、次の２段階法によってＢｏｃＲからＲＯＢｚｌを製造するために開発された。
【０１５６】
出発原料のＲｏＢｚｌから、ペプチドはアミド基形成およびＮ末端基の脱保護に関する標準的２段階プロトコルを用いて作製された。
「超嵩高な基」、すなわち１個だけ非常に大きい嵩高な親油基を有するペプチドをテストするため、ジペプチドメチルエステル（ＸＲＯＭｅ）が調製された。一例として、ＴｂｔＲ ＯＭｅの合成は上記実施例２に記載されている。類似方法が他のメチルエステルの製造に使用された。
【０１５７】
ＭＩＣ（μｇ／ｍ）として測定された、種々のペプチドの抗菌活性は、下記の表７に示す。
【０１５８】
【表７】

【０１５９】
力価の組：５００、３００、２００、１５０、１００、５０、５０、３７．５、３０、２５、１２．５、５、４、２および１
これらのペプチドはいずれも赤血球に対して測定可能な毒性を有していなかった。
【０１６０】
【実施例５】
ヘキサペプチドおよびテトラペプチドのもう一つのグループが、前記実施例で記載されたように、固相多重ペプチド合成装置ＭＢＳ ３９６で調製された。これらはＥ． ｃｏｌｉおよびＳ． ａｕｒｅｕｓに対してテストされ、これらの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を下記の表８に示す。最初のカラムはμｇ／ｍｌでの数値であり、二番目のカラムはμＭ／ｍｌである。アラニン残基が、「スペーサー」として含められ、活性に対する長さの影響を調べられた。
【０１６１】
【表８】

【０１６２】
このデータは、特に超嵩高なＰｍｃ基を有するペプチドに関して、グラム陽性菌に対して優れた活性を示している。データは、また実際の配列が大して意味を持たないことも示している。驚くことにしかも利点からして、より小さいペプチドがより活性である（ＷＢＲＲおよびＷＢＲＲＡＡ参照）。
【０１６３】
【実施例６】
本明細書で記載されたペプチドを調製する際に使用される、あるいは使用に好適なペプチドカップリング、脱保護および精製のための基本手順が以下に記載される。
ペプチドカップリング　基本手順
合成
Ｎ−Ｂｏｃ保護アミノ酸誘導体（１．０５当量）およびＣ末端保護（メチルエステル、ベンジルエステル、ビフェニルメチルエステルかまたはβ−ナフチルアミドとして、そのいずれかで）されたアミノ酸誘導体（１．００当量）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）（１．２当量）が、反応容器に添加された。ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（２．４当量）およびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（５ｍｌ／ｍｍｏｌ Ｎ−Ｂｏｃ保護アミノ酸）を添加して、すべての成分が溶解するまで反応混合物を撹拌した。Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）（１．２当量）が少量ずつ添加され、反応混合物は１時間振盪された。
【０１６４】
抽出およびワークアップ
１ｍｍｏｌバッチからの反応混合物は酢酸エチル（１６ｍｌ）で希釈し、１２ｍｌの５％クエン酸と５ｍｌ塩水との混合物で２回洗浄した。得られた有機相は６ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムと２ｍｌ塩水との混合液で２回洗浄した。
Ｎ−Ｂｏｃ 保護ペプチドの開裂
好適な手順は、これらの先の実施例に記載されている。
【０１６５】
精製と分析
ペプチドは、移動相として水およびアセトニトリルの混合液（０．１％ＴＦＡを含む）を使用し、ＲＰ−ＨＰＬＣ Ｃ１８カラム（Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ Ｃ１８， １００Å， １５μｍ， ２５×１００ｍｍ， Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｍｉｌｆｏｒｄ， ＭＡ， ＵＳＡ）で、２５４ｎｍでのＵＶ検出を行い、精製された。すべてのペプチドは、移動相として水およびアセトニトリルの混合物（０．１％ＴＦＡを含む）を使用して、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ Ｃ１８カラム（Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ Ｃ１８， １００Å， ５μｍ， ３．９×１５０ｍｍ， Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で、不純物について分析された。すべてのペプチドの純度は、９６％より上であることがわかった。ペプチドの完全な状態は、ＶＧ Ｑｕａｔｔｒｏ ４重極質量スペクトロメーター（ＶＧ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｓ．， ＵＫ）を用いる陽イオンエレクトロスプレーイオン化質量分析法でチェックされた。
【０１６６】
【実施例７】
Ｈ−Ａｒｇ−ＯＢｚｌ の調製（Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，ＭおよびＢｏｄａｎｓｚｋｙ，Ａ、「Ｔｈｅ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（１９９４） Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， ｐ． ３０−３１に倣った。）
Ｂｏｃ−Ａｒｇ−ＯＨ（２．５ｍｍｏｌ）のメタノール（２０ｍｌ）溶液に、水（２ｍｌ）を添加した。該溶液はＣｓ_２ＣＯ_３の２０％水溶液で中和され、その後、乾燥するまで真空中で蒸発させた。残存する水は、トルエンの添加と蒸発を繰り返されることによって除去された。Ｂｏｃ−アルギニンのセシウム塩（固体）は、ＤＭＦ（２５ｍｌ）および臭化ベンジル（３ｍｍｏｌ）で処理され、室温で６時間撹拌された。ＤＭＦは減圧下、除去され、生成物はアセトン中に溶解され、濾過された。濾液は真空中で蒸発させ、生成物は９５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（４ｍｌ）で処理された。結果として得られる生成物、Ｈ−Ａｒｇ−ＯＢｚｌは、ジエチルエーテルを用いてピペット吸引して（ｂｙ ｔｉｔｕｒａｔｉｏｎ）分離された。Ｈ−Ａｒｇ−ＯＢｚｌの塩は、パラ−トルエンスルホン酸（５ｍｍｏｌ）のエーテル溶液で生成物を処理することにより分離された。
Ｈ−Ａｒｇ−ＯＢｉｐ の調製（Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，ＭおよびＢｏｄａｎｓｚｋｙ，Ａ「Ｔｈｅ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（１９９４） Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， ｐ． ３０−３１に倣った。）
Ｂｏｃ−Ａｒｇ−ＯＨ（２．５ｍｍｏｌ）のメタノール（２０ｍｌ）溶液に水（２ｍｌ）を添加した。該溶液はＣｓ_２ＣＯ_３の２０％水溶液で中和され、その後、乾燥するまで真空中で蒸発させた。残存する水は、トルエンの添加と蒸発を繰り返されることによって除去された。Ｂｏｃ−アルギニンのセシウム塩（固体）は、ＤＭＦ（２５ｍｌ）、ビフェニルメチルクロリド（３ｍｍｏｌ）およびヨウ化カリウム（１ｍｍｏｌ）で処理され、そして室温で６時間撹拌された。ＤＭＦは真空中で除去され、生成物はアセトン中に溶解され、濾過された。濾液は真空中で蒸発され、生成物は９５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（４ｍｌ）で処理された。結果として得られる生成物、Ｈ−Ａｒｇ−ＯＢｉｐはジエチルエーテルを用いて、ピペット吸引して分離された。Ｈ−Ａｒｇ−ＯＢｉｐ塩は、パラ−トルエンスルホン酸（５ｍｍｏｌ）のエーテル溶液で生成物を処理することにより分離された。
【０１６７】
【実施例８】
Ｃ末端が修飾された下記ジペプチドもまた作製し、評価した。便宜のため、これらの化学的構造を以下に示す。
【０１６８】
【化６】

【０１６９】
【表９】

【０１７０】
【実施例９】
ＫＷＯＢｚｌに基づくペプチド様化合物が製造され、望ましい構造モチーフが存在すればペプチド構造が活性には要求されないことを証明するため、試験された。
【０１７１】
【化７】

【０１７２】
最初の化合物は、フランスのＮｅｏｓｙｓｔｅｍｓから得られた。二番目の化合物は、インドール酢酸から標準技術（その酸と臭化ベンジルとのエステル化をＣｓ塩が介在する）を用いて製造され、さらに標準カップリング手順を用いて、ｄｉＢｏｃリジンにカップリングさせた。
【０１７３】
【表１０】

【０１７４】
これらの結果は、エステル誘導体が少なくともそれらのペプチド等価物と同じくらいに活性であることを示し、カルボニル基の利点を例証している。
【０１７５】
【実施例１０】
また、アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）カタログから入手できる下記ジフェニルエチレンジアミンもテストされ、そしてすべてがＳ． ａｕｒｅｕｓに対する２５０μｇ／ｍｌのＭＩＣを有していた。
【０１７６】
【化８】

【０１７７】
【実施例１１】
修飾された単一の超嵩高なアミノ酸からなる下記分子を作製し、これらの抗菌活性をテストした。
【０１７８】
【化９】

【０１７９】
Ｂｏｃ−Ｔｂｔ−Ｄａｂ−Ｚ：
１２ｍｌのＤＭＦ／ＣＨ_２Ｃｌ_２（１：１）にあるＢｏｃ−Ｔｂｔ−ＯＨ（０．７５１０ｇ， １．６ｍｍｏｌ）、Ｎ−Ｚ−１，４−ジアミノブタン一塩酸（０．４３２３ｇ、１．７ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．８７１５ｇ， ５．７ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（１．６３ｍｌ， ９．５ｍｍｏｌ）の混合物は、氷／水浴中で撹拌され、ＨＢＴＵ（０．７２２０ｇ， １．９ｍｍｏｌ）が少量ずつ１０分かけて添加された。混合物は、さらに３０分間撹拌され、次いで冷却浴が取り除かれ、撹拌を２時間半続けた。反応混合物は、真空中で蒸発された。得られる液状油状物は、ジクロロメタンに溶解され、続いて３×５ｍｌ飽和ＮａＨＣＯ_３、２×５ｍｌ １０％クエン酸，１０ｍｌ水および５ｍｌ飽和ＮａＣｌで抽出され、次にＭｇＳＯ_４上で乾燥され、明るい黄色油状物に蒸発された。油状物は、水で粉砕され、真空下で乾燥された。フラッシュクロマトグラフィー（６％ ＭｅＯＨ−ＣＨＣｌ_３）による粗生成物の精製により、０．９６ｇ（８９％）の表題化合物を生じた。
【０１８０】
Ｂｏｃ−Ｔｂｔ−Ｄａｅ−ＺおよびＢｏｃ−Ｔｂｔ−Ｄａｈ−Ｚは、Ｂｏｃ−Ｔｂｔ−Ｄａｂ−Ｚの記載と同一の手順で調製された。粗生成物はほとんど定量的収量で得られ、そしてフラッシュ（ｆｌａｓｈ）クロマトグラフィーによる精製は必要なかった。
Ｚ保護基の除去は、メタノール／水（１９：１）中の１０％Ｐｄ活性炭上で、一晩水素化（１ａｔｍ）することにより行った。触媒は、セライトを通して濾過することで除去された。真空下での溶媒の蒸発により黄色油状物として遊離アミンを得た。Ｂｏｃ保護基は、試薬Ｋで処理することで除去された。真空下で反応混合物を蒸発したのち、油状残留物をジエチルエーテルのｐ−トルエンスルホン酸で処理することで脱保護されたＢｏｃ−ジアミンが、白色固体として分離された。粗生成物は、ＲＰ−ＨＰＬＣで精製され、そして凍結乾燥して白色固体を得た。
略語
Ｔｂｔ： β−（２，５，７−トリ−ｔｅｒｔ−ブチルインドール−３−イル）アラニン
Ｄａｅ： １，２−ジアミノエタン
Ｄａｂ： １，４−ジアミノブタン
Ｄａｈ： １，６−ジアミノヘキサン
【０１８１】
【表１１】

【０１８２】
【実施例１２】
嵩高な親油基と極性残基との組合せを具体化する、いくつかのオリジナル構造は、シクロペンタジエンといった安価な原料から、たやすく入手可能である。このような化合物の２つは、図Ａに示され、すでに、シクロヘキサンベースを基礎とする土台の汎用性が証明されている。実際、嵩高なまたは極性基の添加順序の単純な変化が、２つの異なる生成物１および２を導く。
【０１８３】
【化１０】

【０１８４】
化合物１の製造のため辿る合成経路は、化合物２の製造にも適用され得るもので、下記の図Ｂに示される。
【０１８５】
【化１１】

【０１８６】
シクロペンタジエン３が、一重項酸素（光増感剤としてローズベンガルの存在下で酸素の光分解によってその位置で発生する）と反応し、相当するエンドパーオキサイドを生じた。このパーオキサイドは、分離されないが、しかし、反応混合物に存在するチオ尿素によって直接還元されて、全体収率が４８％で、所望のシス−ジオール４となった。ピリジンおよびＤＭＡＰの存在下に過量の臭化ブロムアセチルを用いて、シス−ジオール４のエステル化により、４０％収率で、所望のジエステル５が得られた。ジエステル５がさらに先の中間体６への次の転換は、フタルイミドアニオン・カリウムを用いて、求核置換によって円滑に達成された。アルケン６はその後、古典的なオスミウム触媒の条件下、α面からジヒドロキシル化され、実質的に定量的な収量で所望のジオール７を得た。ジオール７から最終生成物１への転換は、７とインドールカルボン酸とのＤＣＣ−介在によるカップリング、それに続く熱エタノール中でのヒドラジン水和物によるフタルイミド保護基の脱保護によってもたらされた。２を製造するために逆の順序が辿られた。
【０１８７】
この多目的に使えるシーケンスは、種々の類似物の調製に対し、嵩高で極性の基の添加順番を変更し、シクロペンタン骨格を置換する４個のヒドロキシ基の相対的な空間的配置を変え、さらに嵩高な極性基の大きさおよび特質を変えることにより、取り替えることも可能である。この戦略は図３に示されるいくつかの構造によって描かれるが、しかし、これは決して完全なリストではない。
【０１８８】
【化１２】

【０１８９】
実験手順
１，３−ジヒドロキシ−４−シクロペンテンの調製
【０１９０】
【化１３】

【０１９１】
【表１２】

【０１９２】
チオ尿素（５．０３ｇ； ０．６８当量）およびローズベンガル（１９７ｍｇ； ０．００２当量）の蒸留メタノール（１．８Ｌ）溶液に、新たに蒸留したシクロペンタジエン（１当量） ８ｍｌが０℃で添加された。酸素を溶液に通した。２時間後、４５０Ｗの水銀電球で照射され、酸素の流入は２時間にわたって維持された。次いで溶液は暗所に保管され、酸素は一晩止められた。混合物は２００ｍｌに濃縮され、活性炭およびセライトＲを通して着色がなくなるまで複数回濾過された。その後、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥され、溶媒は加熱することなく、減圧下で除去された。粗生成物は水平蒸留（１１５℃、１０^−４ｍｂａｒ）によって精製され、黄色の低融点固体、３．５２５ｇ（３６％収率）を得た。
【０１９３】
ＮＭＲ Ｈ^１ ＤＭＳＯ ３００ＭＨｚ δ （ｐｐｍ）（多重度）： １．５３（ｄｔ）； ２．８２（ｄｔ）； ４．６７（ｄ）； ５．１６（ｓ）； ６．０３（ｓ）
ジブロモ−ジエステル調製
【０１９４】
【化１４】

【０１９５】
【表１３】

【０１９６】
７．０５ｇ（１当量）のジオールおよび４６．６２ｇ（３当量）の臭化酢酸ブロミド（ｂｒｏｍｏａｃｅｔｉｃ ｂｒｏｍｉｄｅ）のジクロロメタン溶液２５０ｍｌに、１７．０４ｍｌ（３当量）のピリジンと７００ｍｇ（０．０８当量）のＤＭＡＰが０℃で添加された。溶液は室温まで暖められ、撹拌しながら一晩保持された。その後、７００ｍｌのＤＣＭが添加され、有機相は７０ｍｌの３Ｍ ＨＣｌ、１４０ｍｌのＮＡＨＣＯ_３飽和溶液、１４０ｍｌの水で洗浄された。その有機相は、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥され、濾過され、溶媒は減圧下で除去された。粗生成物は、フラッシュクロマトグラフィー（ＡｃＯＥｔ／ＥＰ ３５：７５）で精製され、９．７６ｇ（４０．６％収率）の無色液体を得た。
【０１９７】
ＮＭＲ Ｈ^１ ＣＤＣｌ_３ ３００ＭＨｚ δ （ｐｐｍ）（多重度）： １．８ （ｄｔ）； ２．８９（ｄｔ）； ３．９１（ｓ）； ５．５８（ｄｄ）； ６．１３（ｓ）
ジフタルイミド−ジエステルの調製
【０１９８】
【化１５】

【０１９９】
【表１４】

【０２００】
１．３１１ｇ（１当量）のジブロモ化合物および１．７８ｇ（２．５当量）のフタルアミドカリウムのＤＭＳＯ溶液３０ｍｌが、環流下に一晩保持された。混合物は、２５０ｍｌのジエチルエーテルで希釈され、１５０ｍｌの塩水で３回洗浄された。有機相をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥され、濾過され、そして溶媒を減圧下で除去した。粗生成物は、フラッシュクロマトグラフィー（ＡｃＯＥｔ／ＥＰ ８０：２０）で精製され、１．２４ｇ（６８．８％収率）の白色固体を得た。
【０２０１】
ＮＭＲ Ｈ^１ ＣＤＣｌ_３ ３００ＭＨｚ δ （ｐｐｍ）（多重度）： １．８５（ｄｔ）； ２．８７（ｄｔ）； ４．４２（ｄ）； ５．６１（ｄｄ）； ６．１１（ｓ）； ７．８５（ｍ）

【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、正常（非処理）Ｅ．ｃｏｌｉの電子顕微鏡写真である。
【図２】図２は、本明細書に記載されたペプチドの一つ、ＷＲＷＲＷＲで処理されたＥ．ｃｏｌｉの電子顕微鏡写真である。処理された細菌は、細胞質物質がなく、これらの細胞膜は（細胞壁成分と同様に）破壊され、溶菌メカニズムを明らかに示す。

Claims (34)

1. 鎖長に関し非水素原子２から３５個を有する主鎖を含み、主鎖に共有結合している少なくとも２個の嵩高な親油性基を有し、かつアニオン基よりも少なくとも１個多いカチオン基を有する分子の、微生物細胞膜を不安定化するための薬剤を製造する際の使用。
2. 鎖長に関し非水素原子２から３５個を有する主鎖を含み、主鎖に共有結合している少なくとも２個の嵩高な親油性基を有し、かつアニオン基よりも少なくとも１個多いカチオン基を有する分子の、膜作用性抗菌剤としての使用。
3. 前記分子が、アニオン基よりも少なくとも２個多いカチオン基を有する、請求項１または２に記載の使用。
4. 前記分子が、少なくとも３個の嵩高な親油性基を有する、請求項１または２に記載の使用。
5. 嵩高な親油性基がそれぞれ、少なくとも５個の非水素原子を含む、前記請求項のいずれかに記載の使用。
6. 少なくとも１個の嵩高な親油性基が、少なくとも６個の非水素原子からなる閉環を包含する、前記請求項のいずれかに記載の使用。
7. 前記分子が２個の嵩高な親油性基を有し、そのそれぞれが、少なくとも６個の非水素原子からなる閉環を包含する、請求項６に記載の使用。
8. 前記分子の嵩高な親油性基の１つが、６個またはそれ以上の非水素原子を包含し、第２の嵩高な親油性基が１０個またはそれ以上の非水素原子を包含する、請求項５に記載の使用。
9. 鎖長に関し非水素原子２から３５個を有する主鎖を含み、主鎖に共有結合している、少なくとも９個の非水素原子を含む超嵩高な親油性基１個を有し、アニオン基よりも少なくとも２個多いカチオン基を有する分子の、微生物細胞膜を不安定化するための薬剤を製造する際の使用。
10. 鎖長に関し非水素原子２から３５個を有する主鎖を含み、主鎖に共有結合している、少なくとも９個の非水素原子を含む超嵩高な親油性基１個を有し、アニオン基よりも少なくとも２個多いカチオン基を有する分子の、膜作用性抗菌剤としての使用。
11. 前記の超嵩高な親油性基が、少なくとも１１個の非水素原子を含む、請求項９または１０に記載の使用。
12. 前記の超嵩高な親油性基が、少なくとも１３個の非水素原子を含む、請求項１１に記載の使用。
13. 前記の超嵩高な基が、５個またはそれ以上の非水素原子からなる１個または複数の閉環を包含する、請求項９または１０に記載の使用。
14. 前記の超嵩高な基が、５個またはそれ以上の非水素原子からなる２個の閉環を包含する、請求項１３に記載の使用。
15. 前記主鎖が、鎖長に関し非水素原子４から３５個を有する、前記請求項のいずれかに記載の使用。
16. 前記主鎖が、鎖長に関し非水素原子４〜２０個を有する、請求項１５に記載の使用。
17. 前記主鎖が、鎖長に関し非水素原子４から１２個を有する、請求項１６に記載の使用。
18. 前記主鎖が線状である、前記請求項のいずれかに記載の使用。
19. 前記主鎖が、１個または複数の極性基を含む、請求項１８に記載の使用。
20. 前記主鎖が、１個または複数のカルボニル基、スルホン基またはイミン基を含む、請求項１８に記載の使用。
21. 前記主鎖が、１個または複数のアミド結合を含む、請求項２０に記載の使用。
22. 前記主鎖が、各機能性サブユニット間のアミド結合から構成されている、請求項２１に記載の使用。
23. 前記分子が、ペプチド誘導体またはペプチド様物質を含むペプチドである、請求項１８に記載の使用。
24. 前記分子がもはや負の電荷を有しないようにＣ末端で修飾される、請求項２３に記載の使用。
25. 前記Ｃ末端が、アミド化またはエステル化されている、請求項２４に記載の使用。
26. 前記Ｃ末端修飾基が、嵩高な親油性基である、請求項２４または２５に記載の使用。
27. 前記分子が、アミノ酸または同等サブユニット１から４個を包含する、ペプチド誘導体またはペプチド様物質を含むペプチドである、請求項２３から２６までのいずれか一項に記載の使用。
28. １個または複数のアミノ酸または同等Ｒ基が、嵩高な親油性基である、請求項２７に記載の使用。
29. １個または複数のアミノ酸または同等Ｒ基が、カチオン基である、請求項２８に記載の使用。
30. 前記主鎖が、環状の足場を包含する、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用。
31. 前記主鎖が、単糖類または大環状アミンを包含する、請求項３０に記載の使用。
32. 微生物に感染しているか、微生物に感染する危険にさらされている患者において、微生物細胞膜を不安定化する方法であって、該患者に、前記請求項のいずれかで定義された分子を投与することを含む方法。
33. 未修飾のＮ末端を有し、すべてのアミノ酸が、実質的にカチオン性であるか、または嵩高で親油性であり、しかも少なくとも２個のアミノ酸が嵩高で親油性であり、少なくとも２個がカチオン性である、鎖長に関しアミノ酸５または６個を有する生体活性ペプチド。
34. 少なくとも２個の嵩高な親油性基および少なくとも２個のカチオン基を包含し、該嵩高な親油性基の少なくとも１個が人工的な嵩高な親油性基であるか、あるいは該カチオン基の少なくとも１個が人工的なカチオン基である、鎖長に関しアミノ酸５または６個を有する生体活性ペプチド。

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