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JP2004513651A - インスリン依存糖尿病に対する患者の体質分析方法、装置とプライマの組 - Google Patents

インスリン依存糖尿病に対する患者の体質分析方法、装置とプライマの組 Download PDF

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JP2004513651A JP2002543022A JP2002543022A JP2004513651A JP 2004513651 A JP2004513651 A JP 2004513651A JP 2002543022 A JP2002543022 A JP 2002543022A JP 2002543022 A JP2002543022 A JP 2002543022A JP 2004513651 A JP2004513651 A JP 2004513651A
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Biomerieux SA
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Abstract

【課題】インスリン依存糖尿病に対する患者の遺伝的素因分析方法、実施に適した装置およびかかる方法に適した増幅プライマの組。
【解決手段】疾患に対する患者の感受性に固有の少なくとも一つのプローブ、前記疾患に対する前記患者の防御性に固有の少なくとも一つのプローブ、と前記疾患に対する前記患者の中立に固有の少なくとも一つのプローブ、のように選択されたプローブを同時に存在させて、対象の少なくとも一つの多形性領域の増幅から得られた、少なくとも一つのアンプリコン型を含む液体標本を所望の疾患に関連づけ、また実現された交雑を発現させる。

Description

【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明はインスリン依存糖尿病と呼ばれる少なくとも1つの疾患に対する患者の遺伝的素因の分析方法に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
タイプ1の糖尿病(またはインスリン依存糖尿病)は遺伝的素因のある個体において発生する自己免疫過程の所産として、膵臓内でインスリンを生産するランゲルハンスβ細胞の消失を特徴とする疾患である。環境要因と並んで、素因の遺伝的成分が認められる。
【0003】
【従来の技術】
それぞれの個体は祖先から受け継いだ、固有の全遺伝形質を有する。この特定の遺伝的背景が時として一部の疾患の発現および/または進展に活発に関与することがある:病原要因による感染(例えば、AIDSウィルス)、自己免疫疾患(例えば、リューマチ)。HLA抗原(Human Leukocyte Antigens)を暗号化する遺伝子をはじめとする組織適合性大複合体(CMH)の遺伝子は下記のような自己免疫病理の進展に主要な役割を果たす:
・臓器に固有でない病理、例えば、リューマチ性多発関節炎(Lawrence,1970;Stastny,1978;Khan,1979;Stastny,1983;Gregersen,1986;Gegersen,1987;Stastny,1988;Todd,1988;Wordsworth,1989;Nepom,1989;Hiraiwa,1990;Nepom,1991)または強直性脊椎炎(Brewerton,1973;Schlosstein,1973;Benjamin,1990)、または
・臓器固有、より詳細にはインスリン依存糖尿病に組み合わされた膵臓などの内分泌腺(Komulainen,1999;Kulmala,2000)。
【0004】
インスリン依存糖尿病になりやすい遺伝成分の大きな部分はHLA遺伝子座(IDDM1)、そしてもっと詳細にはHLA−DQB1遺伝子に結合された主要なマーカに結びつけることができる。文献のデータは現在、感受性対立遺伝子(S対立遺伝子)、保護対立遺伝子(P対立遺伝子)、中立対立遺伝子(N対立遺伝子)などの国際命名法に記載の(45)のHLA−DQB1対立遺伝子の中でもっとも一般的なものの考察を可能にする(www.anthonynolan.com/HIG/seq/nuc;2000年10月)。これは主として白人の母の集団について有効性が確認されたデータである。今のところ、分子レベルの説明はHLA−DQタンパク質のβ鎖のアミノ酸57の領域に見られる多形現象にある(Todd et al.,1988)。後述の表1は位置57にあるこのアミノ酸の種類に応じたインスリン依存糖尿病の状態をまとめたものである:
【表1】
Figure 2004513651
表1:位置57のアミノ酸の種類に応じたインスリン依存糖尿病の状態
【0005】
それぞれの遺伝子型は2つの対立遺伝子の組み合わせに対応する。したがって、それぞれの標本にタイプ1の糖尿病の素因の遺伝子型が対応する:SS、PP、NN、SP、SNまたはNP。この分子レベルの説明は遺伝子型が、一般的に効果用量と呼ばれるゼロ、1つ、または2つの感受性対立遺伝子を含んでいるとき病気の段階的重さの所見とも整合する。
【0006】
現在、インスリン依存糖尿病に関して、Cinekらの論文がある、“Screening for the IDDM high−risk genotype.A rapid microtitre plate mtehod unsing serum as source of DNA”,Tissue Antigens,2000,56,4,344−349。この刊行物はインスリン依存糖尿病への遺伝的素因尾分析試験開発の利益を強調している。このチームは関係する対立遺伝子に関して完全な技法によって血清から開始する手法を選択した(いくつかのHLA−DQB1対立遺伝子だけでなくいくつかのHLA−DQA1対立遺伝子といくつかのHLA−DRB1*04対立遺伝子)。
【0007】
血清の使用はかさぶた班から開始する手順よりも便利ではない。くわえて、彼らの技法は下記の点で複雑である:
・彼らはHLA−DQB1対立遺伝子とHLA−DQA対立遺伝子の、ついでHLA−DRB1*04対立遺伝子の2段階で分析を実施している、
・彼らは63℃の交雑温度、63℃ついで18から25℃の洗浄温度での捕捉プローブ固定およびストレプタビジン・ペルオキシダーゼ、(SPDO)による2段階の発見のための複雑な技術を使用している。
同様に、この技法は用量効果の検出が全く不可能であるが、それはインスリン依存糖尿病への患者の遺伝的素因に大きな影響をもっている。
【0008】
最後に、これらの試験は輸血センターや特定の専門病院などのHLA遺伝子研究を専門とするセンターでしか実施できない。したがって、この同定には標本の輸送と、かなり重い技術の使用が必要である。したがって、次のようなマイナスの結果が数多くある:
・標本紛失のおそれ
・この同定に時間がかかる
・前記同定のコストが比較的高い
・役務供与に対する依頼者の監視がない。
【0009】
【発明が解決しようとする課題】
請求された分析方法は実施面でもっと簡易化され、アンプリコン(amplicons)の調製後、2時間未満と、もっと迅速で、コストが低い。
このため、本発明は自己免疫疾患の患者の遺伝的素因の分析方法において、
・疾患に対する患者の感受性に固有の少なくとも1つのプローブ、
・前記疾患に対する前記患者の防御性に固有の少なくとも1つのプローブ、と
・前記疾患に対する前記患者の中立に固有の少なくとも1つのプローブ、
のように選択されたプローブを同時に存在させて、対象の少なくとも1つの多形性領域の増幅から得られた、少なくとも1つのアンプリコン型を含む液体標本を所望の疾患に関連づけることをもってなり、
また実現された交雑を明らかにすることをもってなる方法に関するものである。
【0010】
【課題を解決するための手段】
有利には、この方法はインスリン依存糖尿病への患者の遺伝的素因の分析を可能にする。
変型実施態様によれば、インスリン依存糖尿病の検出に用いたプローブは次のように定義される:
・感受性についてHLA−DQB1*0201とHLA−DQB1*0202とHLA−DQB1*0302対立遺伝子に固有の少なくとも1つのプローブ、
・防御性についてHLA−DQB1*0301、HLA−DQB1*0602とHLA−DQB1*0603対立遺伝子に固有の少なくとも1つのプローブ、および
・中立性についてインスリン依存糖尿病に関連する他の対立遺伝子に固有の少なくとも1つのプローブ。
【0011】
変型実施態様によれば、インスリン依存糖尿病の検出に用いたプローブは次のように定義される:
・感受性についてHLA−DQB1*0201、HLA−DQB1*0202、HLA−DQB1*0203,HLA−DQB1*0302、HLA−DQB1*0304、HLA−DQB1*0305、HLA−DQB1*0307とHLA−DQB1*0308対立遺伝子に固有の少なくとも1つのプローブ、
・防御性についてHLA−DQB1*03011、HLA−DQB1*03012、HLA−DQB1*03032、HLA−DQB1*03033、HLA−DQB1*0304、HLA−DQB1*0306、HLA−DQB1*0308、HLA−DQB1*0309、HLA−DQB1*0310,HLA−DQB1*0602、HLA−DQB1*0603、HLA−DQB1*0608、hl0610、HLA−DQB1*06111、HLA−DQB1*06112、HLA−DQB1*0612、」HLA−DQB1*0613、HLA−DQB1*0614とHLA−DQB1*0616対立遺伝子に固有の少なくとも1つのプローブ、および
・中立性についてHLA−DQB1*0306、HLA−DQB1*0401、HLA−DQB1*0402、HLA−DQB1*05011、HLA−DQB1*05012、HLA−DQB1*0502、HLA−DQB1*05031、HLA−DQB1*05032、HLA−DQB1*06011、HLA−DQB1*06012、HLA−DQB1*06013、HLA−DQB1*06051、HLA−DQB1*06052、HLA−DQB1*0606、HLA−DQB1*0609、HLA−DQB1*06112と、HLA−DQB1*00612対立遺伝子に固有の少なくともつのプローブ。
【0012】
より詳細には、上述のすべての変型において、インスリン依存糖尿病に対する感受性を検出するために使用されたプローブは次のように定義される:
・HLA−DQB1*0201、HLA−DQB1*0202とHLA−DQB1*0203対立遺伝子に固有のプローブ、および
・HLA−DQB1*0302、HLA−DQB1*0304、HLA−DQB1*0305、HLA−DQB1*0307とHLA−DQB1*0308対立遺伝子に固有のプローブ。
この最後の場合について、インスリン依存糖尿病に対する感受性を検出するために使用されたプローブは下記の配列から取られた連続する少なくとも10個の(10)アミノ酸で構成される:
・SEQ ID NO5(TCTTgTgAgCAgAAgC)、および
・SEQ ID NO6(CCgCCTgCCgCCgA)。
【0013】
より詳細には、上述のすべての変型において、インスリン依存糖尿病に対する防御性を検出するために使用されたプローブは次のように定義される:
・HLA−DQB1*03011、HLA−DQB1*03012、HLA−DQB1*0304とHLA−DQB1*0309対立遺伝子に固有のプローブ、および
・HLA−DQB1*03011、HLA−DQB1*03012、HLA−DQB1*03032、HLA−DQB1*03033、HLA−DQB1*0306、HLA−DQB1*0309とHLA−DQB1*0310対立遺伝子に固有のプローブ、および
・HLA−DQB1*0308、HLA−DQB1*0602、HLA−DQB1*0603、HLA−DQB1*0608、HLA−DQB1*0610、HLA−DQB1*06111、HLA−DQB1*06112、HLA−DQB1*0612、HLA−DQB1*0613、HLA−DQB1*0614とHLA−DQB1*0616対立遺伝子に固有のプローブ。
この最後の場合について、インスリン依存糖尿病に対する防御性を検出するために使用されたプローブは下記の配列から取られた連続する少なくとも10個の(10)アミノ酸で構成される:
・SEQ ID NO7(AggggACCCgggCggA)
・SEQ ID NO8(gACgTggAggTgACC)、および
・SEQ ID NO9(gCCgCCTgACgCCg)。
【0014】
より詳細には、上述のすべての変型において、インスリン依存糖尿病に対する中立性を検出するために使用されたプローブは次のように定義される:
・HLA−DQB1*0306、HLA−DQB1*0401とHLA−DQB1*0402対立遺伝子に固有のプローブ、
・HLA−DQB1*05011、HLA−DQB1*05012、HLA−DQB1*0502、HLA−DQB1*05031とHLA−DQB1*05032対立遺伝子に固有のプローブ、
・HLA−DQB1*06011、HLA−DQB1*06012とHLA−DQB1*06013対立遺伝子に固有のプローブ、
および
・HLA−DQB1*06051、HLA−DQB1*06052、HLA−DQB1*0606、HLA−DQB1*0609、HLA−DQB1*06112とHLA−DQB1*0612対立遺伝子に固有のプローブ。
この最後の場合について、インスリン依存糖尿病に対する中立性を検出するために使用されたプローブは下記の配列から取られた連続する少なくとも10個の(10)アミノ酸で構成される:
・SEQ ID NO10(ggggCCCgggCgTC)、
・SEQ ID NO11(AggAggACgTgCgC)、
・SEQ ID NO12(TCTTgTAACCAgATAC)、および
・SEQ ID NO13(ggTggACACCgTATgCAg)。
【0015】
すべての例において、すべてのHLA−DQB1対立遺伝子の検出を可能にするために、HLA−DQB1遺伝子全体と交雑することができる、少なくとも1つの正の対照プローブが使用された。
くわえて、同一のプローブの塩基の最大38.89%、好適には最大20%がイノシンなどの、少なくとも1つの類似の塩基によって置換される。かかる数値は、1999年6月20日と2000年12月6日付けの優先権の下に番号PCTFR00/01385で出願人が出願した、先立つ特許出願から演繹できる。類似の塩基の定義は明細書の続きに記載されている。
【0016】
上述のような、自己免疫疾患の患者の遺伝的素因の分析方法に先立って、HLA−DQB1に関連する1つまたは複数の対象多形領域の少なくとも増幅が実施される。
好適には、アンプリコンも同じくビオチン化されるように、増幅プライマはビオチン化される。増幅に先立って、好適にはかさぶた班の形で、採取された生物標本は核酸を抽出するために処理される。
この核酸の抽出は、続いて増幅の前に使用されるトリホスフィト・デオキシリボヌクレオチド(dNPT)をすでに含んでいる反応混合物内で実施され、その後保温される。
この最後の場合、保温の後、反応混合物の中にトリホスフィト・デオキシリボヌクレオチド(dNPT)を添加し、これは後に増幅の際にも使用される。
【0017】
【発明の実施の形態】
本発明は、その第1の変型実施態様によれば、固有プローブのそれぞれのタイプが、他のプローブとは独立して、微小滴定プレートのプイなどの、独立した室内に固定される、上述のような方法の実施を可能にする装置にも関するものである。
【0018】
第2の変型実施態様によれば、インスリン依存糖尿病に対する感受性または防御性を検出するために使用されるそれぞれのタイプのプローブはこの感受性とこの防御性を検出するために使用される他のプローブとは独立して、微小滴定プレートのプイなどの、独立した室内に固定され、インスリン依存糖尿病に対する中立性を検出するために使用異なるタイプのプローブのすべてまたは一部は微小滴定プレートの少なくとも1つのプイ内に固定される。
【0019】
第3の変型実施態様によれば、少なくとも2つのタイプの異なる固有プローブが、その間に相互作用なしに、微小滴定プレートの同じプイなどの、独立した同じ室内に固定される。
【0020】
第四の変型実施態様によれば、インスリン依存糖尿病に対する感受性または防御性または中立性を検出するために使用されるプローブのタイプの全体が微小滴定プレートのプイなどの、唯一かつ同一の室内に固定される。
微小滴定プレートの同じプイなどの1つの室が、感受性または防御性の検出に使用されるプローブのタイプを1つしか含んでいない場合、装置によって実現された交雑を明らかにする方法は、酵素反応を利用する非局所的比色検出によって実施される。例えば、これはそれぞれのタイプのプローブとペロキシダーゼの間に実現された交雑の検出とすることができる。
微小滴定プレートの同じプイなどの1つの室が、感受性または防御性の検出に使用される少なくとも2つのプローブのタイプを含んでいる場合、装置によって実現された交雑を明らかにする方法は、局所的比色検出によって実施される。例えば、これは蛍光または放射能によるそれぞれのタイプのプローブとアンプリコンの間に実現された交雑の検出とすることができる。
【0021】
本発明は最後に、プライマSEQ ID NO2と組み合わせてプライマSEQ ID NO1を使用することをもってなる、インスリン依存糖尿病に対する患者の遺伝的素因の分析方法において使用するためのHLADQB1遺伝子に対応する配列の増幅を可能にするプライマの組に関するものである。
好適にはプライマは5’のビオチン化物である。
くわえて、インスリン依存糖尿病に対する患者の遺伝的素因の分析のために、HLA−DQB1遺伝子に対応する配列の交雑を可能にする捕捉プローブはプローブ5’に位置するアミノまたはビオチン分岐を介して微小滴定プレートのプイの底、またはビードの上に固定される。
上述の例は説明のための例としてあげたものであり、非制限的である。それらは本発明の理解を助けるものである。
【0022】
本発明は迅速で安価な遺伝疾患検出方法に関するものである。この新規な技術はすべての遺伝病に、とくにリューマチ性多発関節炎、関節強直脊椎関節炎、インスリン依存糖尿病およびその他の自己免疫疾患、例えば、リュウマチの診察の際に認められる膠原病(狼瘡、硬皮、・・・)にも使用できる。
これは少なくとも1つの遺伝子の同時分析を可能にする分子生物学の技法による、特定の疾患に対する個体の遺伝的素因の分析のための方法である。この方法は、1つまたは複数の遺伝子に結びつけられる、1つの疾患あるいは関連がある疾患全体についての個体の遺伝的素因の分析に有利に適用することができる。この方法は特定の自己免疫疾患、すなわち1つの臓器、この場合には膵臓に関連がある、インスリン依存糖尿病に対する個体の遺伝的素因の分析に応用できる。
【0023】
この方法の利点は、(診断、予測および治療方針などの)臨床的に意味のある関連情報の完全な全体を、多重であるが単一の試験によって、一段階で得られることにある。この方法は複数の過程に分けられる:
1)個体の生物学的採取標本から核酸を抽出、
2)病理に対する遺伝的素因に関連する多形性が指摘された対象領域の増幅、および
3)所与の対立遺伝子または対立遺伝子群の正確な分析を可能にする分子プローブの組を使用する交雑反応全体を用いる、アンプリコンの同時分析。
【I−定義】
【0024】
「室」とは:
・第1の場合、その液体、または存在する場合、隣接する1つまたは複数の室の領域に存在する別の液体の、他の分画との相互作用なしにある液体のある量、
・第2の場合、その、あるいはそれらの液体のそれぞれがその液体、または存在する場合、隣接する1つまたは複数の室の領域に存在する別の液体の、他の分画との相互作用なしに同じ液体の、あるいは異なる液体の、複数の同一または相互に異なる量、
の受納を可能にする、平坦または凹型の、すなわち陥凹を形成するいっさいの個体の媒体を意味するものとする。
【0025】
第1の場合の数百マイクロリットルから第2の場合の0.5ナノリットルに至ることがある液体の量のこれらの保持を実現を可能にする装置、ならびにかかる装置が利用する方法と装置によって方法と共に実現される媒体は番号FR00/14691で、出願人によって2000年11月15日出願された特許出願にすでに詳しく記載されている。
【0026】
第2の場合、単一の室に配分された液体の異なる量はきわめて少量で、一般的に1マイクロリットル未満で、前記室の表面にスポットを形成する。1滴当たりの溶液の量は0.5ナノリットルから1マイクロリットルの間に、好適には1ナノリットルから200ナノリットルの間に含まれる。
【0027】
上述の定義に用いられた、「固体媒体」という用語は、分析物、この場合には核酸をその上に固定できるすべての材料を含む。化学的修飾の有無を問わず天然、合成材料を固体媒体として用いることができる、とくに高分子、例えば、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリアクリル、ポリアミドあるいは芳香族ビニルモノマー系のコポリマー、α−不飽和またはβ−不飽和酸のアルキルエステル、不飽和カルボキシル酸エステル、塩化ビニリデン、ジエンまたはニトリル基内に存在する化合物(アクリロニトリル);塩化ビニルとプロピレンのポリマー、塩化ビニルと酢酸ビニルのポリマー、スチレンまたはスチレン置換誘導体系のコポリマー;ナイロン、ニトロセルローズなどの合成繊維;珪素、ガラス、セラミック、石英などの無機材料;ラテックス;磁気粒子;金属誘導体、などを使用することができる。
【0028】
本発明による媒体は、非限定的に、微小滴定プレート、ホイル、管、プイ、粒子あるいはシリカまたは珪素の、通常「ウェハ」と呼ばれる、タブレットなどの平坦な媒体の形を取ることができる。好適には媒体の少なくとも一部は珪素のウェハあるいは微小滴定プレートのプイの底のように平坦である。好適には、この室は微小滴定プレートのプイで構成される。
【0029】
固体媒体は用途分野と1つまたは複数の分析物を含む溶液の種類に応じて親水性および/または疎水性とする。例えば、貯蔵には親水性区域が用いられ、前記親水性区域は疎水性区域で限定して、スポットの直径を管理しやすくする。
【0030】
「交雑検出」はマーキング反応体よって標識をつけたポリヌクレオチドの使用を意味するものとする。マーキング反応体とは、検出可能な信号を直接または間接に発生するトレーサーを意味する。これらのトレーサーには次のものが含まれるが、それらに限定されるものではない:
・酵素、例えば、比色、蛍光、発光によって、付加された、適切な基質の存在の元に検出可能な信号を発生する西洋わさびのペロキシダーゼ、アルカリン・フォスフェターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコース−6−フォスフェート・デジドロゲナーゼ、あるいは
・発色団、例えば、蛍光、発光、着色化合物、あるいは
・電子顕微鏡で、あるいは伝導性、電流、電圧あるいはインピーダンス測定などのそれらの電気特性によって検出できる電子密度の基、あるいは
・回折、表面プラスモン共鳴、接触角度変動などの光学的方法または原子力の分光測光、トンネル効果などの物理的方法によって検出可能な基、または
・放射性分子、例えば、32P、35Sまたは125I。
好適には、トレーサーは立体化学的占有空間が小さい蛍光化合物、例えば、フルオレセイン、ダンシル、IR(Li−COR Inc,Lincoln NE,USA)、Cy5とCy3(Randolph J.B.and al.Nucleic Acids Res.,25(14),p2923−2929,1997)型の発色団およびそれらの誘導体である。立体化学的占有空間が小さいとは、分子量が1000g/モル未満であることを意味する。
【0031】
必要ならば前処理した、標的核酸と、さらに官能化したポリヌクレオチドを発生し、マーキング反応体でこのポリヌクレオチドを標識付けし、ついで前記標識付けしたポリヌクレオチドを検出するように官能化したヌクレオチドとの接触が行われる標的内のこの標的核酸の検出方法。
前処理とは標的核酸に手を食われることを可能にする標本処理の異なる過程、例えば、溶解、流動化、濃縮を意味する。
【0032】
「中立性についてインスリン依存糖尿病に関連づけられた他の対立遺伝子に固有の少なくとも1つのプローブ」はHLA−DQB1を構成する対立遺伝子、インスリン依存糖尿病に対する感受性または防御性の対立遺伝子を構成すると定義されなかった対立遺伝子の全体または一部に固有の少なくとも1つのプローブを意味するものとする。一般的に、認識された対立遺伝子の有病率に応じてプローブを選択する;したがって、ある対立遺伝子が優勢であるほど、それは中立性の固有プローブの領域に含められる。
それはまた、単独に、あるいは先述のプローブの少なくとも1つとの組み合わせにおいて、HLA−DR3および/またはHLA−DR4を構成する対立遺伝子の全体または一部の少なくとも1つの固有プローブとすることができる。したがって、数多くの論文が影響を持ち得るこれらのハロータイプを明らかにしている。
・Park Y.S.,She J.X.,Noble J.A.,Erlich H.A.&Einsenbarth G.S.,Tissue Antigens 2001:57:185−191:“Transcracial evidence for the influence of the homologous HLA DR−DQ haplotype on transmission of HLA DR4 haplotypes to diabetic children”,
・Kockum I.,Sanjeevi C.B.,Eastman S.,Landin−Olsson M.,Dahlquist G.,Lernmark A,et al.,European Journal of Immunogenetics 26,361−372:“Complex interactin between HLA DR and DQ in conferring risk for childhood type 1 diabetes”,
・Undlien D.E.,Kockum I.,Ronningen K.S.,Lowe R.,Sanjeevi C.B.,Graham J.,Lie B.A.,Akselsen H.E.,Lernmark A.and Thorsby E.,Tissue Antigens 1999:54,543−551:“HLA associations in type A diabetes among patients not carrying high−risk DR3−DQ2 or DR4−DQ8 haplotypes”,
・Donner H.,Seidl C.,Van der Auwera B.,Braun J., Siegmund T.,Herwig J.,Weets I.,The Belgian Diabetes Registry,Usadel K.H.&Badenhoop K.,Tissue Antigens 2000:55:271−274:“HLA−DRB1*04 and susceptibility to type 1 diabetes mellitus in a German/Belgian family and German case−control study”,
・Redondo M.J.,Kawasaki E.,Mulgrew C.L.,Noble J.A.,Erlich H.A.,Freed B.M.,Lie B.A.,Thorsby E.,Einsenbarth G.S.,Undlien D.E.,Kockum I.&Ronningen K.S.,The Journal of Clinical Endocrinology&Metabolism,2000:Vol.55, No 10:3793−3797:“DR−and DQ−Associated Protection from Type 1A Diabetes:Compraison of DRB1*1401 and DQA1*0102−DQB1*0602”。
【0033】
「増幅」は母体の役割を果たす標的核酸に作用する酵素増幅反応によって官能基化したポリヌクレオチドが発生することを意味する。一方ではLewisの論文(1992. Genetic Engieering News,12,p.1−9)、他方ではAbramson&Myers の論文(1993.Curr.Opin.Biotechnol.,4,p.41−47)が標的増幅の実例を示している。酵素増幅技法は例えば、NASBA(Nucleic Acid Sequence Based Amplification)、TMA(Transcription Mediated Amplification),RT−PCR(Reverse Transcriptase−Polymetrase Chain Reactin),PCR(Polymerase Chain Reaction),SDA(Strand Displacement Amplification)あるいはLCR(Ligase Chain Reaction)技法の中から選択することができる。
【0034】
「類似塩基」とは一般的にポリヌクレオチド内に組み込まれた修飾されたヌクレオチドを意味するものとする。ポリヌクレオチドは、場合によって、少なくとも1つの修飾ヌクレオチド、例えば、イノシン、メチル−5−デオキシシチジン、ジメチルアミノ−5−デオキシウリジン、デオキシウリジン、ジアミノ−2,6−プリン、ボウロモ−5−デオキシウリジン、ネブラリンあるいは交雑を可能にする他のいっさいの修飾塩基などの、修飾塩基を含む少なくとも1つのヌクレオチドを含む少なくとも2つのデオシキリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの連鎖で構成される。これらのポリヌクレオチドは下記の領域で修飾することもできる:
・ヌクレオチド間結合、例えば、ホスホロチオエート、H−ホスホネート、アルキル−ホスホネート、あるいは
・骨格、例えば、α−オリゴヌクレオチド(FR−A−2.607.507)あるいはPNA(M.Egholm et al.,J.Am.Chem.Soc.,114,p1895−1897,1992)あるいは2’−アルキル・リボース。
これらの修飾のそれぞれは組み合わせることもできる。ポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチド、天然核酸またはその断片の1つ、例えば、DNA、ロボソームRNA、メッセンジャーRNA、転位RNA、酵素増幅技法によって得られた核酸とすることができる。
【II−標本の配分】
【0035】
1)デオシキリボ核酸(DNA)抽出:
A−全血液標本から
EDTA(テトラ酢酸エチレン・ジアミン)、クエン酸塩またはヘパリンなどの抗凝血剤上に採取した全血液標本からのDNA抽出の従来の様々な手順を使用することができる。例えば、フェノール抽出過程による、あるいは赤色細胞の、ついで白色細胞の溶解の過程(Kimura et al.,1992)による手順とすることができる。
実際には、1つの実施態様によれば、この抽出は全く従来通りに実現される。事実、あとからポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などの増幅法によって増幅できる試料を得ることができる任意のDNA抽出手法を用いることができる。細胞を溶解、核酸を抽出ついで精製するこれらの技法は通常遺伝子分析に推奨されるもの、あるいはQIANGEN S.A.の QIAmp Blood Kit(登録商標)などの市販の物質を使用する迅速な技法である。
【0036】
B−乾燥血液班から
乾燥血液班からの様々なDNA抽出手法は文献に記載されている。
まず第1の技法は Jinks et al.,Hum.Genet.1989,81:363−366のものである。これはSchleicher&Schuell no.903の紙の上に血液を付着させることから成る。血液班は数時間の間18から25℃の間の温度で乾燥される。直径3mm4つのタブレットを打ち抜き、1.5mlの管内に置いて、30μlのメタノールを加えて固定し、ついで蒸発を実施する。つづいて60μlの水を加え、15分間煮沸する。15分間10,000gで遠心分離する。最後に、次の過程、PCRによる増幅のために上澄みを採取する。
【0037】
第2の技法はHezard et al.,Thrombosis Research,1997,88,1,59−66のものである。EDTA(テトラ酢酸エチレン・ジアミン)、クエン酸塩またはヘパリンの上に血液を採集し、濾紙(Guthrie)上にそれを付着させる。直径1ミリのタブレットを50μlの反応混合物内に直接置いて、つぎに増幅する。94℃で15分間保温する。そして最後にTaqポリメラーゼを添加し、PCRで増幅する。
【0038】
最後に、2000年から、Molecular Innovations Inc.社は、第3の技法として、増幅管の内部自体に位置づけられる、DNA抽出システムを市販している(Xtra Amp(登録商標)Extraction System,Molecular Innovations Inc.Ref.660)。血液班からDNAを抽出するために、この製品を評価した。血液はSchleicher&Schuell紙 ref.322187の上に付着させたEDTAまたはACDから採取した。直径3mmタブレットを75μlのLyis Bufferを含む1.5mlのマイクロ管内に置いた。18から25℃の温度で10分間保温する。ついで、12,000gで5分間遠心分離する。ついで上澄みを採取し、Xtra Amp(登録商標)内にそれを移す。数回吸引、吐出し、ついで上澄みを取り除く。200μlのWash Bufferで3回線上する。その後、PCRによる増幅のための45μlの反応混合物と5μlのAmp Enhance Bufferを添加する。最後に、通常の増幅プログラムに3サイクルを加えて増幅する。
【0039】
上述の3つの手順で、HLA−DQB1の増幅ともに、およそ50%のケースについて、本発明に従って開発されたELOSA(Enzyme Linked OligoSorbent Assay)試験で利用可能な優れた結果が認められた。このELOS技法は出願人の特許EP−B−0,486,661および論文F.Mallet et al.,Journal of Clinical Microbiology,June 1993,p.1444−1449に記載されている。
【0040】
それにもかかわらず、血液班からの抽出手順、堅牢で日常的な分析用途のために不可欠な手順を開発した方がよい。したがって、下記を以て成る第4の技法が出願人によって開発された:
・Schleicher&Schuell紙No.903(ref.322187)の上に付着させたEDTA上の血液採集
・Schleicher&Schuellパンチによる血液班の打ち抜き(直径3ミリのタブレット)
・血液班の都度、5分間HCl 0.25Nによるパンチの除染(DNA除去)
・タブレットを0.5mlのPCR管内に置く
・10倍に濃縮した(10×)増幅緩衝液5μl、0.5μlのdNTP(200mM)混合物とH2Oqsq50μlを含む反応混合物50μlを添加
・100℃で15分間保温(サーモサイクラーの使用が推奨される)
・タブレット取り出し
・従来の水切り遠心分離器による1,000gで短時間遠心分離
・増幅反応のために25μlの上澄みを採取
【0041】
意外なことに、それぞれのタブレットの上に存在する血液を取り込んだ反応媒質はデオシキリボヌクレオチド・トリフォスフェート(dNTP)、すなわちdATP、dCTP、dGTPとdTTPを含んでいる。これは当業者が高温からむしろ保護しようとする生物分子である。しかるに、出願人によって開発された手順では、前記反応媒質はつぎに15分間100℃の温度にかけられる。出願人の技法によって抽出された核酸でつぎに得られた増幅結果は先に述べた3つの技法で得られたものよりはるかに効果的である。
【0042】
2)HLA−DQB1アンプリコンの調製
すべての例において、使用されたプライマは文献に記載のプライマである(XIth HLA Workshop Primers;Kimura,1992)。下の表2はHLA−DQB1遺伝子に対応する対象遺伝子座の増幅を可能にする2つのプライマを示している。したがって、これら2つのプライマはこの遺伝子を縁取っている。
【表2】
Figure 2004513651
表2:HLA−DQB1の増幅のためのプライマ
【0043】
A−全血液標本から
反応混合物は下記の各種の成分を含んでいる:
・緩衝液10X(Perkin Elmer,ref.N808−0171)       5μl
・dNTPs200mM(Pharmacia,ref.27−2094)     0.5μl(最終0.2mM)
・プライマ混合物(それぞれ30μM)          0.5μl(最終0.3mM)
・Taqポリメラーゼ(AmpliTaq,
Perkin Elmer,ref.N808−0171、5U/μl)     0.3μl(1.5U)
・DNA(約100ng/μl)             5μl(約500ng)、および
・HO                     q.s.p.50μl
くわえて、増幅プログラムは下記の通りである:
・95℃で2分、ついで
・連続35サイクル、各サイクルごとに次の過程:
95℃で30秒
55℃で30秒
72℃で30秒
・72℃で7分
ついで、反応生成物を保存したいときは、得られたばかりのアンプリコンを含む管を9℃の温度に維持する。
【0044】
B−乾燥血液班から
反応混合物は下記の各種の成分を含んでいる:
・緩衝液10X(Perkin Elmer,ref.27−2094)      5μl
・dNTPs200mM(Pharmacia,ref.N808−0171)      0.5μl
・プライマ混合物(それぞれ30μM)          0.5μl(最終0.3mM)
・Taqポリメラーゼ(AmpliTaq,
Perkin Elmer,ref.N808−0171、5U/μl)     0.3μl(1.5U)
・DNA(約100ng/μl)             25μl、および
・HO                     q.s.p.50μl
くわえて、増幅プログラムは下記の通りである:
・95℃で2分、ついで
・連続35サイクル、各サイクルごとに次の過程:
95℃で30秒
55℃で30秒
72℃で30秒
・72℃で7分
ついで、反応生成物を保存したいときは、得られたばかりのアンプリコンを含む管を9℃の温度に維持する。
【III−本発明によって得られたアンプリコンの分析】
【0045】
1゜)インスリン依存糖尿病に対する患者の遺伝的素因の分析装置
ELOSA試験の原理にもとづく装置は比色検出のためにペロキシダーゼ(POD)に結合された検出プローブを備えた、微小滴定プレートから延伸した8つのプイのバレッタの形で、HLA−DQB1マーカの分析のために実現された。
A−捕捉プローブ
これら8つのプイのそれぞれの中に、捕捉の固有プローブを使用した。これらのプローブは実際は、出願人によって出願された特許US−A−5,510,084およびEP−B−0.549.776に記載のような、5’でアミン化された分岐を有する合成オリゴヌクレオチドである。特殊な構造のこの5’でアミン化された分岐がプレートの底でプローブの固定を可能にする。したがって、以下に指定しない場合でも、使用したプローブの5’末端が、この分岐を有するものとする。
【0046】
プイの部位での捕捉プローブの配分は表3に示した、他方で表3のそれぞれの捕捉プローブについて可能な標的対立遺伝子は下記の表4に示した。
【表3】
Figure 2004513651
表3:プイの部位での捕捉プローブの配分
【表4】
Figure 2004513651
表4:それぞれの捕捉プローブについて可能な標的対立遺伝子
【0047】
表3において、プイC+はHLA−DQB1*遺伝子のすべての対立遺伝子の検出を可能にする正の対照(SEQ ID NO3)を含んでいて、そのため増幅が表1に記載のSEQ ID NO1とSEQ ID NO2プライマの間に含まれる対象領域に正しく関わるように制御することが可能になる。負の対照(SEQ ID NO4)は診断目標がなく、特定の規格を満たすためだけに存在する。この配列はHLAに全く固有ではなく、HLA遺伝子に見つけられない偶然的配列に対応する。
【0048】
SEQ ID NO5とSEQ ID NO13の間に含まれる他のプローブは、反対に、病気に対する、もっと正確にはインスリン依存糖尿病に対する患者の遺伝的素因の診断目的を有する。
ここで分かるように、SEQ ID NO5のプローブは病気に対する、すなわちインスリン依存糖尿病に対する感受性を検出するプローブである。それはこの疾患に対するこの感受性の重要な対立遺伝子、すなわちHLA−DQB1*0201とHLA−DQB1*0202対立遺伝子に固有である。これらの重要な対立遺伝子は表4では太字で示した。
同様に、SEQ ID NO6プローブもインスリン依存糖尿病に対する感受性を検出するプローブである。それはこの疾患に対するこの感受性の重要な対立遺伝子、すなわちHLA−DQB1*0302対立遺伝子に固有である。
【0049】
SEQ ID NO7プローブは病気に対する、すなわちインスリン依存糖尿病に対する防御性を検出するプローブである。それはこの疾患に対するこの防御性の重要な対立遺伝子、すなわちHLA−DQB1*0602とHLA−DQB1*0603対立遺伝子に固有である。
同様に、SEQ ID NO8プローブもインスリン依存糖尿病に対する防御性を検出するプローブである。それはこの疾患に対するこの防御性の重要な対立遺伝子、すなわちその形HLA−DQB1*03011とHLA−DQB1*03012とを問わず、HLA−DQB1*0301対立遺伝子に固有である。
【0050】
SEQ ID NO9プローブもインスリン依存糖尿病に対する防御性を検出するプローブである、なぜならそれも、その形HLA−DQB1*03011とHLA−DQB1*03012とを問わず、HLA−DQB1*0301対立遺伝子の検出を可能にするからである。このプローブの利点は、かなり頻繁で、位置57の領域でのその配列に関して防御性的でなければならないHLA−DQB1*HLA−DQB1:03032遺伝子の検出を可能にすることである。
ここで、一方がインスリン依存糖尿病に対する感受性で他方が防御性である、2つのプローブSEQ ID NO6とSEQ ID NO7はHLA−DQB1*0308対立遺伝子の検出を可能にする。なお、この対立遺伝子はきわめてまれである。したがって、それを見つける確率はきわめて小さく、HLA−DQB1*0308同型接合体とHLA−DQB1*0308にぶつかる確率はほとんどゼロである。同様に、同じ推論を一方のインスリン依存糖尿病に対する感受性で他方が防御性である、2つのプローブSEQ ID NO6とSEQ ID NO8に適用することができる。それらは両者共にHLA−DQB1*0304対立遺伝子の検出を可能にする。
この2つの場合において、2つのプローブが、一方が感受性を他方が防御性を、検出するのに何の問題もない、なぜなら有病率があまりにも低いからである。
【0051】
B−検出プローブ
これはペロキシダーゼ(POD)に結合された、5’にアミン化された分岐を備えたオリゴヌクレオチドである。表5はその構造を明らかにしている。
【表5】
Figure 2004513651
表5:使用した捕捉プローブに適合した検出プローブ
もちろん、この検出プローブは表3と4に示したSEQ ID NO3とSEQ ID NO5からSEQ ID NO13の捕捉プローブに掛かる可能性のある標的アンプリコン全体と相補的になるように選択される。
【0052】
C−操作法:
第1に、標的調製は次の過程から成る:
・アンプリコン全体(50μl)を1.5mlのマイクロ管内に移す
・試薬R2(NaOH 2N)5μlを添加
・十分均質化する
・18℃から25℃の間に含まれる温度で5分間保温する
・後述の成分の交雑緩衝液1mlを添加
・後述の成分の、検出プローブ50μlを添加、そして
・十分均質化する。
交雑緩衝液の成分は:
・pH6.8の燐酸ナトリウム0.1M
・0.5M NaCl,2%(p/v)ポリエチレングリコール4000
・0.65%(p/v)tween20、0.1%(p/v)ゼラチン
・サケの精子の音波処理DNA0.14g/L
・BND(農薬またはブロモ・ニトロ・ジオクサン)0.2g/L、および
・0.01g/Lのシプロフロクサシン。
SEQ ID NO14(D4−POD)検出プローブは0.5%(p/v)ウシの血清アルブミンと0.5%(p/v)フェノールの存在の元でpH7.0の5mMホスフェート緩衝液に希釈される。
【0053】
第2に、標的の交雑は次のように実現される:
・バレットR1の8つのプイのそれぞれの中に、混合物100μlを配分する
・自己接着ホイルで覆う、そして
・37℃(37±1℃)で1時間保温
【0054】
第3に、交雑しなかった標的がある場合にそれを除去することを可能にし、H2Oで1/20に希釈したColor0洗浄緩衝液500μlで3回洗浄することをもってなる洗浄。<<Color0>>は1%(p/v)tween20を添加したPBSを20倍濃縮した溶液を意味するものとする。
【0055】
第4に、検出はどの捕捉プローブが標的オリゴヌクレオチドを交雑したかを決定することを目的とする。それは次の仕方で実現される:
・プイのそれぞれの中に、即時調合した基質の溶液100μlを添加−5μlのColor2内にColor1の1タブレット
・暗闇で、18℃から25℃の温度で20分間保温
・Color1を50μl添加、そして
・492nmでの吸収を読み取る。
<<Color1>>はO−フェニレンジアミン・ジヒドロクロライド(OPD)を意味するものとする;<<Color2>>は0.1M燐酸ナトリウム、0.05Mコハク酸、0.03%H2O2を意味するものとする、また<<Color3>>は1.8N H2SO4を意味するものとする。
【0056】
第5に、解釈は前章で確立された検出に応じてインスリン依存糖尿病に対する患者の真の遺伝的素因の決定を可能にする。この検証は:
・一方では、光学密度(D.O.)が0.8を超えなければならない、正の対照SEQ ID NO3(C+)の陽性を検証し、D.O.が0.05未満でなければならない負の対照SEQ ID NO4(C−)の陰性を検証し)、
・他方で、プローブSEQ ID NO5からSEQ ID NO13によって同定された2つの対立遺伝子に対応する遺伝子型を決定する、
ことを提案している。
【0057】
上述の場合、ペロキシダーゼは適切な基質、例えば、OPDが存在するときにオリゴヌクレオチドとの交雑が実現されたかをそれぞれのプローブについて明らかにすることができる酵素である。この基質は可溶性なので、信号の延長があるだろう。この場合、ある患者が同型接合体であるか異型接合体であるかを、あるいはその対立遺伝子がインスリン依存糖尿病に対して感受性、防御性および/または中立性であるかを決定できるためには、室によって、あるいはもっと容易には、プイによって捕捉プローブを埋め込まなければならない。これはインスリン依存糖尿病に対して感受性(SEQ ID NO5と6)あるいは防御(SEQ ID NO7,8と9)が関わるプローブについて言える。一方、この疾患に対して中性(SEQ ID NO10,11,12と13)が関与するプローブについて、それらをまとめることは全く可能である。
これが当てはまらないのは、使用した基質が沈殿性であるか、検出プローブ(SEQ ID NO14)が蛍光性である場合である。これらの場合、感受性(SEQ ID NO5と6)あるいは防御(SEQ ID NO7,8と9)のプローブであっても、同一の室内またはプイ内に複数個のプローブを埋め込むことができる。実際、もっともコンパクトな配置において、感受性、防御または中立のすべてのプローブは同一の室またはプイ内にあってもよく、それは捕捉オリゴヌクレオチドのプロットの重なりなしに異なるタイプのプローブをまとめることができる操作員の容易さだけに依存する。先に明らかにしたごとく、かかる媒体を実現することができる、かかる装置は番号FR00/14691で出願人が2000年11月15日に出願した特許出願にすでに詳しく記載されている。
【0058】
2゜)本発明による分析実例:
A−第1の標本:
以下の表6はそれぞれのプイに第1の被験患者の標本の分画を入れたバレットR1で得られた結果を示している。
【表6】
Figure 2004513651
表6:第1の標本についてバレットR1で得られた結果
【0059】
分析は下記の通りである:
−SEQ ID NO3プローブは陽性である:HLA−DQB1遺伝子の増幅と交雑試験は正確に機能した、
−SEQ ID NO5プローブは陽性である:HLA−DQB1*0201またはHLA−DQB1*0202またはHLA−DQB1*0203対立遺伝子は存在する、
−SEQ ID NO6プローブは陽性である:HLA−DQB1*0302またはHLA−DQB1*0304またはHLA−DQB1*0305またはHLA−DQB1*0307またはHLA−DQB1*0308対立遺伝子は存在する、および
−他のプローブは陰性である。
結論として、この患者はインスリン依存糖尿病に対する感受性の2つの対立遺伝子を有する確率が高い。高い確率とは感受性のHLA−DQB1*0302対立遺伝子の罹患率が中立性の対立遺伝子であるHLA−DQB1*0304またはHLA−DQB1*0305またはHLA−DQB1*0307またはHLA−DQB1*0308対立遺伝子のそれよりはるかに高いことを意味するものとする。
これら2つのHLA−DQB1は遺伝子レベルで同定された、この第1の標本のHLA類型化は実際:
−HLA−DQB1*02、および
−HLA−DQB1*0302、である。
【0060】
B−第2の標本
以下の表7はそれぞれのプイに第2の被験患者の標本の分画を入れたバレットR1で得られた結果を示している。
【表7】
Figure 2004513651
表7:第2の標本についてバレットR1で得られた結果
【0061】
分析は下記の通りである:
−SEQ ID NO3プローブは陽性である:HLA−DQB1遺伝子の増幅と交雑試験は正確に機能した、
−SEQ ID NO5プローブは陽性である:HLA−DQB1*0201またはHLA−DQB1*0202またはHLA−DQB1*0203対立遺伝子は存在する、
−SEQ ID NO8プローブは陽性である:HLA−DQB1*03011またはHLA−DQB1*03012またはHLA−DQB1*0304またはHLA−DQB1*0309対立遺伝子は存在する、および
−他のプローブは陰性である。
結論として、この患者はインスリン依存糖尿病に対する感受性の対立遺伝子と防御対立遺伝子を有する確率が高い。高い確率とは感受性のHLA−DQB1*03011およびHLA−DQB1*03012対立遺伝子の罹患率が中立性の対立遺伝子であるHLA−DQB1*0304またはHLA−DQB1*0309対立遺伝子のそれよりはるかに高いことを意味するものとする。
これら2つのHLA−DQB1は遺伝子レベルで同定された、この第一の標本のHLA類型化は実際:
−HLA−DQB1*02、および
−HLA−DQB1*0301、である。
【0062】
C−第3の標本
以下の表8はそれぞれのプイに第2の被験患者の標本の分画を入れたバレットR1で得られた結果を示している。
【表8】
Figure 2004513651
表8:第3の標本についてバレットR1で得られた結果
【0063】
分析は下記の通りである:
−SEQ ID NO3プローブは陽性である:HLA−DQB1遺伝子の増幅と交雑試験は正確に機能した、
−SEQ ID NO5プローブは陽性である:HLA−DQB1*0201またはHLA−DQB1*0202またはHLA−DQB1*0203対立遺伝子は存在する、
−SEQ ID NO10から13プローブは陽性である:HLA−DQB1*0306またはHLA−DQB1*0401またはHLA−DQB1*0402またはHLA−DQB1*05011またはHLA−DQB1*05012またはHLA−DQB1*0502またはHLA−DQB1*05031またはHLA−DQB1*05032またはHLA−DQB1*06011またはHLA−DQB1*06012またはHLA−DQB1*06013またはHLA−DQB1*06051またはHLA−DQB1*06052またはHLA−DQB1*0606またはHLA−DQB1*0609またはHLA−DQB1*06112またはHLA−DQB1*0612対立遺伝子は存在する、および
−他のプローブは陰性である。
結論として、この患者はインスリン依存糖尿病に対する感受性の対立遺伝子と中立性対立遺伝子を有する確率が高い。中立性対立遺伝子があると分かった時点から、本発明による分析の枠内でより正確にそれを決定する重要性はわずかしかない。
これら2つのHLA−DQB1は遺伝子レベルで同定された、この第一の{ママ}標本のHLA類型化は実際:
−HLA−DQB1*02、および
−HLA−DQB1*0501、である。
【0064】
【IV−本発明を改善するための他の非制限的手法】
1゜)ビオチン化プライマとのPCRアンプリコンの使用:
A−ビオチン化プライマ:
5’へのビオチン化プライマの組み込みによってビオチン化PCRアンプリコンと共にインスリン依存糖尿病に対する患者の遺伝的素因の分析装置(第III章、1゜))のために使用した捕捉固有プローブの組を利用することも可能である、下記の表9参照。
【表9】
Figure 2004513651
表9:HLA−DQB1遺伝子増幅のためのビオチン化プライマ
増幅条件は上述のものと同一であるが、操作法は異なっている。
【0065】
B−ビオチン化プライマでの操作法
第1に、標的調製は次の過程から成る:
・アンプリコン全体(50μl)を1.5mlのマイクロ管内に移す
・試薬NaOH 2Nの5μlを添加
・十分均質化する
・18℃から25℃の間に含まれる温度で5分間保温する
・上述の成分の交雑緩衝液1mlを添加、そして
・十分均質化する。
交雑緩衝液の成分は:
・pH6.8の燐酸ナトリウム0.1M
・0.5M NaCl,2%(p/v)ポリエチレングリコール4000
・0.65%(p/v)tween20、0.1%(p/v)ゼラチン
・サケの精子の音波処理DNA0.14g/L
・BND(農薬またはブロモ・ニトロ・ジオクサン)0.2g/L、および
・0.01g/Lのシプロフロクサシン。
SEQ ID NO14(D4−POD)検出プローブは0.5%(p/v)ウシの血清アルブミンと0.5%(p/v)フェノールの存在の元でpH7.6の5mMホスフェート緩衝液に希釈される。
【0066】
第2に、標的の交雑は次のように実現される:
・バレットR1の8つのプイのそれぞれの中に、混合物100μlを配分する
・自己接着ホイルで覆う、そして
・37℃(37±1℃)で1時間保温
【0067】
第3に、交雑しなかった標的がある場合にそれを除去することを可能にし、H2Oで1/20に希釈したColor 0洗浄緩衝液500μlで3回洗浄することをもってなる洗浄。
【0068】
第4に、検出はどの捕捉プローブが標的オリゴヌクレオチドを交雑したかを決定することを目的とする。それは次の仕方で実現される:
・7.2のpHで、0.1%Tween20、0.02%ウシの血清アルブミンとともにPBS緩衝液内に1/10,000に希釈したペロキシダーゼ(SPOD、Roche、ref.1089153)に結合したストレプタビヂン結合溶液100μlを添加
・暗闇で、18℃から25℃の温度で30分間保温
・洗浄緩衝液500μlで3回洗浄−Color0,H2O内に1/20に希釈、
・プイのそれぞれの中に、即時調合した基質100μlを添加−5mlのColor2内にColor1の1タブレット
・暗闇で、18℃から25℃の温度で20分間保温
・Color1を50μl添加、そして
・492nmでの吸収を読み取る。
<<Color0,>>、<<Color1>>、<<Color2>>と<<Color3>>は前節に記載のものと同一である。
【0069】
第5に、解釈は前章で確立された検出に応じてインスリン依存糖尿病に対する患者の真の遺伝的素因の決定を可能にする。この検証は:
・一方では、光学密度(D.O.)が0.8を超えなければならない、正の対照SEQ ID NO 3(C+)の陽性を検証し、D.O.が0.05未満でなければならない負の対照SEQ ID NO4(C−)の陰性を検証し)、
・他方で、プローブSEQ ID NO5からSEQ ID NO13によって同定された2つの対立遺伝子に対応する遺伝子型を決定する、
ことを提案している。
この手順は追加の過程があるので、長く、やや複雑であるが弱いプローブ、とくにSEQ ID NO6についてより強い信号が認められる。
【0070】
ところで、以下の表10はビオチン化および非ビオチン化アンプリコンの間に認められる結果の差を示している。
【表10】
Figure 2004513651
表10:HLA−DQB1*0302/0605異型接合体系列で得られたDO(×1000)の値
ここで、先述のごとく、プレートの底で検出プローブの固定を可能にする、5’でアミン化された分岐は、ビオチン化アンプリコンについてはもはや使用されていないが、それは捕捉されたアンプリコンの上に存在するビオチンに固定できるようになるペロキシダーゼに組み合わされたストレプタビヂン共役溶液が用いられるからである。
【0071】
2゜)ビード上に吸収された捕捉プローブの使用
例えば、SEQ ID NO6のプローブが存在するプイに固有の信号を増加させるために、直径0.1mmのポリスチレンのビード100μlの懸濁によって、<コーティング>とも呼ばれる被覆を用いることが可能である。これらのビードはPolysciences社(Warrington(PA)USA−ref.:00876)からのものであり、5’にビオチニル化された形で調製されたSEQ ID NO6の捕捉の固有オリゴヌクレオチドによって感作されたSigma社(Saint−Louis(MO)USA−ref.:A9275)によって製造されたアビジン分子によって被覆されている。この場合、ビオチンが存在するので、SEQ ID NO6捕捉固有オリゴヌクレオチドは連結分岐を持たない。
【0072】
A−ビードの調製
1−アビジン被覆ビードの調製
適切な仕方として:
・9.3のpHで50mMホウ酸塩緩衝液100μl内に、5mg/mlの濃度にアビジン溶液2.5μlを希釈、
・ビードの懸濁7.4μlを添加、そして
・37℃の温度で30分間保温する。
2−アビジンで被覆され、捕捉プローブを担持するビードの調製
さらに:
・ビオチニル化SEQ ID NO6プローブの5.1015分子を添加、
・37℃の温度で30分間保温、しなければならない。
【0073】
B−アビジンで被覆され、捕捉プローブを担持するビードによる被覆
被覆緩衝液(3X PBS)内で1/10の、感作されたビードの懸濁の希釈は、つぎにプイ当たり100μlの割合で使用される。アミン化されたプローブに使用された被覆条件、すなわち温度37℃で2時間または18から25℃の間に含まれる温度で15時間は、プイの底への固定に対しても変わらないままである。
この方法は、特定のプイ、例えば、配列SEQ ID NO6のプローブが存在するプイ内の信号を増加させること、したがって、当該プイの分析を容易にすることも可能にする。さらに、HLA−DQB1*0302異型体系列で、SEQ ID NO6プローブについて得られたD.O.(×1000)の値が与える結果は次の通りである:
・ビードなし:172、および
・ビードあり:689
【0074】
3゜)インスリン依存糖尿病に対して中立の対立遺伝子の固有捕捉プローブのための単独のプイの使用
捕捉のオリゴヌクレオチドに対する標的オリゴヌクレオチド交雑の検出を実施するためのペロキシダーゼの使用の場合、インスリン依存糖尿病に対する<<対立遺伝子の中立性>>の決定のために単独のプイを用いることができる。このときは、それぞれが個別に、優れた特異性を有する4つの捕捉の固有プローブ(SEQ ID NO10から13)全体が含まれる。
先に述べたごとく、例えば、96プイ形式の、微小滴定プレートの同じプイの底への多重貯蔵法の開発は、単独各唯一のプイ内への上述の4つのプローブのための別個の貯蔵を実現することを可能にする。
【0075】
4゜)インスリン依存糖尿病に関係する対立遺伝子全体に固有の捕捉プローブのための単独のプイの使用
微小滴定プレートの1つのプイの底の多重貯蔵法の開発は、同一のプイ内に、表3と4に先に述べた、捕捉非固有(SEQ ID NO3と4)と固有(SEQ ID NO5と13)の11のプローブの貯蔵を可能にする。単一のプイ内でのアンプリコンの交雑過程の実現は、様々な長所がある:
・試験の安全性の長所、11個のプローブが誤った陰性のリスクなしに標本のすべてのアンプリコンに同時に出会うことができるから、
・試験感受性の長所、なぜなら11個のプローブが標本のアンプリコン全体に出会うから
・大規模な試験を実施できる長所、ならびにプレート当たり96も標本を処理できる長所、これは追跡用途分野にはとくに有利である。
上述のごとく、他方でこの手法はプイの底の特異的交雑の局部的な発現を必要とする。例として、蛍光性の、あるいは蛍光マーカで発現できる分子を取り込んだアンプリコン検出のために蛍光を用いることが可能である。
同じ1つのプイ内の複数の貯蔵の利用の実施可能性試験も、比色発現によって、実施した。
【0076】
A−貯蔵:
被覆緩衝液またはコーティング(PBS 3X)naino 400−1000pモル/mlで、1および5μlの貯蔵で、捕捉の固有プローブ(アミン化バージョンの場合、SEQ ID NO10から13)の4つの手動貯蔵試験。37℃で15分から2時間の間、あるいは18から25℃の間に含まれる温度で15時間保温する。
B−洗浄:
希釈Color0で実施する。
C−標的の調製:
PCRアンプリコンは前節(III−1゜)−C)に記載のごとく調製した。
増幅管内で、次の過程を実施する:
・1μlの2N NaOHを展開してアンプリコン50μlの変性、
・18から25℃の間に含まれる温度で5分間保温、
・交雑緩衝液40μlの添加(SSPE 15X,2% PEG 4000、1.5%tween20,0.22%ゼラチン、0.032%音波処理DNA、農薬)
・共役溶液D4−PODを6μl添加(50pモル/ml;燐酸緩衝液5mM pH7.0−0.5%(p/v)ASB−0.5%(p/v)フェノール)。
D−交雑:
反応混合物全量を4つの貯蔵で感作したプイ内に移し、37℃から±1℃の温度で1時間保温する。
E−洗浄:
希釈Color0で実施する。
F−発現:
下記の過程を実施する:
・基質溶液100μl(Color2内に希釈したColor1)を添加
・暗闇で、18と25℃の間に含まれる温度で20分間、攪拌せずに現像
・陽性のプローブの場所の発色出現を観察、
・Color3を50μl添加して信号を定量化
・静かに攪拌して均質化、そして
・492nmで読み取る。
必要に応じて本明細書に組み込まれる参考文献
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Claims (26)

  1. 自己免疫疾患の患者の遺伝的素因の分析方法において、
    ・疾患に対する患者の感受性に固有の少なくとも1つのプローブ、
    ・前記疾患に対する前記患者の防御性に固有の少なくとも1つのプローブ、と
    ・前記疾患に対する前記患者の中立性に固有の少なくとも1つのプローブ、
    のように選択されたプローブを同時に存在させて、対象の少なくとも1つの多形性領域の増幅から得られた、少なくとも1つのアンプリコン型を含む液体標本を所望の疾患に関連づけることをもってなり、
    また実現された交雑を明らかにすることをもってなる方法。
  2. 自己免疫疾患がインスリン依存糖尿病である、請求項1に記載の方法。
  3. インスリン依存糖尿病の検出に用いたプローブが次のように定義される:
    ・感受性についてHLA−DQB1*0201とHLA−DQB1*0202とHLA−DQB1*0302対立遺伝子に固有の少なくとも1つのプローブ、
    ・防御性についてHLA−DQB1*0301、HLA−DQB1*0602とHLA−DQB1*0603対立遺伝子に固有の少なくとも1つのプローブ、および
    ・中立性についてインスリン依存糖尿病に関連する他の対立遺伝子に固有な少なくとも1つのプローブ、であることを特徴とする、請求項1または2のいずれか1つに記載の方法。
  4. インスリン依存糖尿病の検出に用いたプローブが次のように定義される:
    ・感受性についてHLA−DQB1*0201、HLA−DQB1*0202、HLA−DQB1*0203,HLA−DQB1*0302、HLA−DQB1*0304、HLA−DQB1*0305、HLA−DQB1*0307とHLA−DQB1*0308対立遺伝子に固有の少なくとも1つのプローブ、
    ・防御性についてHLA−DQB1*03011、HLA−DQB1*03012、HLA−DQB1*03032、HLA−DQB1*03033、HLA−DQB1*0304、HLA−DQB1*0306、HLA−DQB1*0308、HLA−DQB1*0309、HLA−DQB1*0310、HLA−DQB1*0602、HLA−DQB1*0603、HLA−DQB1*0608、HLA−DQB1*0610、HLA−DQB1*06111、HLA−DQB1*06112、HLA−DQB1*0612、HLA−DQB1*0613、HLA−DQB1*0614とHLA−DQB1*0616対立遺伝子に固有の少なくとも1つのプローブ、および
    ・中立性についてHLA−DQB1*0306、HLA−DQB1*0401、HLA−DQB1*0402、HLA−DQB1*05011、HLA−DQB1*05012、HLA−DQB1*0502、HLA−DQB1*05031、HLA−DQB1*05032、HLA−DQB1*06011、HLA−DQB1*06012、HLA−DQB1*06013、HLA−DQB1*06051、HLA−DQB1*06052、HLA−DQB1*0606、HLA−DQB1*0609、HLA−DQB1*06112と、HLA−DQB1*00612対立遺伝子に固有の少なくとも1つのプローブであることを特徴とする、請求項1から3のいずれか1つに記載の方法。
  5. インスリン依存糖尿病に対する感受性を検出するために使用されたプローブが次のように定義される:
    ・HLA−DQB1*0201、HLA−DQB1*0202とHLA−DQB1*0203対立遺伝子に固有のプローブ、および
    ・HLA−DQB1*0302、HLA−DQB1*0304、HLA−DQB1*0305、HLA−DQB1*0307とHLA−DQB1*0308対立遺伝子に固有のプローブであることを特徴とする、請求項1から4のいずれか1つに記載の方法。
  6. インスリン依存糖尿病に対する感受性を検出するために使用されたプローブが下記の配列から取られた連続する少なくとも10個の(10)アミノ酸で構成される:
    ・SEQ ID NO5(TCTTgTgAgCAgAAgC)、および
    ・SEQ ID NO6(CCgCCTgCCgCCgA)、
    であることを特徴とする、請求項5に記載の方法。
  7. インスリン依存糖尿病に対する防御性を検出するために使用されたプローブが次のように定義される:
    ・HLA−DQB1*03011、HLA−DQB1*03012、HLA−DQB1*0304とHLA−DQB1*0309対立遺伝子に固有のプローブ、および
    ・HLA−DQB1*03011、HLA−DQB1*03012、HLA−DQB1*03032、HLA−DQB1*03033、HLA−DQB1*0306、HLA−DQB1*0309とHLA−DQB1*0310対立遺伝子に固有のプローブ、および
    ・HLA−DQB1*0308、HLA−DQB1*0602、HLA−DQB1*0603、HLA−DQB1*0608、HLA−DQB1*0610、HLA−DQB1*06111、HLA−DQB1*06112、HLA−DQB1*0612、HLA−DQB1*0613、HLA−DQB1*0614とHLA−DQB1*0616対立遺伝子に固有のプローブ、
    であることを特徴とする、請求項1から6のいずれか1つに記載の方法。
  8. インスリン依存糖尿病に対する防御性を検出するために使用されたプローブが下記の配列から取られた連続する少なくとも10個の(10)アミノ酸で構成される:
    ・SEQ ID NO7(AggggACCCgggCggA)、
    ・SEQ ID NO8(gACgTggAggTgTACC)、および
    ・SEQ ID NO9(gCCgCCTgACgCCg)、
    であることを特徴とする、請求項7に記載の方法。
  9. インスリン依存糖尿病に対する中立性を検出するために使用されたプローブが次のように定義される:
    ・HLA−DQB1*0306、HLA−DQB1*0401とHLA−DQB1*0402対立遺伝子に固有のプローブ、
    ・HLA−DQB1*05011、HLA−DQB1*05012、HLA−DQB1*0502、HLA−DQB1*05031とHLA−DQB1*05032対立遺伝子に固有のプローブ、
    ・HLA−DQB1*06011、HLA−DQB1*06012とHLA−DQB1*06013対立遺伝子に固有のプローブ、および
    ・HLA−DQB1*06051、HLA−DQB1*06052、HLA−DQB1*0606、HLA−DQB1*0609、HLA−DQB1*06112とHLA−DQB1*0612対立遺伝子に固有のプローブ、
    であることを特徴とする、請求項1から8のいずれか1つに記載の方法。
  10. インスリン依存糖尿病に対する中立性を検出するために使用されたプローブが下記の配列から取られた連続する少なくとも10個の(10)アミノ酸で構成される:
    ・SEQ ID NO10(ggggCCCgggCgTC)、
    ・SEQ ID NO11(AggAggACgTgCgC)、
    ・SEQ ID NO12(TCTTgTAACCAgATAC)、および
    ・SEQ ID NO13(ggTggACACCgTATgCAg)、
    であることを特徴とする、請求項9に記載の方法。
  11. すべてのHLA−DQB1対立遺伝子の検出を可能にするために、HLA−DQB1遺伝子全体と交雑することができる、少なくとも1つの正の対照プローブが使用されることを特徴とする、請求項4から10のいずれか1つに記載の方法。
  12. 同一のプローブの塩基の最大38.89%、好適には最大20%がイノシンなどの、少なくとも1つの類似の塩基によって置換されることを特徴とする、請求項6、8、10または11のいずれか1つに記載の方法。
  13. 予め、HLA−DQB1に関連する1つまたは複数の対象多形領域の少なくとも1つの増幅が実施されることを特徴とする、請求項1から12のいずれか1つに記載の方法。
  14. アンプリコンも同じくビオチン化されるように、増幅プライマはビオチン化されることを特徴とする、請求項13に記載の方法。
  15. 増幅に先立って、好適にはかさぶた班の形で、採取された生物標本は核酸を抽出するために処理されることを特徴とする、請求項13または14のいずれか1つに記載の方法。
  16. 核酸の抽出が、続く増幅の前に使用されるトリホスフィト・デオキシリボヌクレオチド(dNPT)をすでに含んでいる反応混合物内で実施され、その後保温されることを特徴とする、請求項15に記載の方法。
  17. 反応混合物の中にトリホスフィト・デオキシリボヌクレオチド(dNPT)を添加し、それが後に増幅の際にも使用されることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
  18. 固有プローブのそれぞれのタイプが、他のプローブとは独立して、微小滴定プレートのプイ(puits)などの、独立した室内に固定されることを特徴とする、請求項1から17のいずれか1つに記載の方法を実施するための装置。
  19. インスリン依存糖尿病に対する感受性または防御性を検出するために使用されるそれぞれのタイプのプローブがこの感受性とこの防御性を検出するために使用される他のプローブとは独立して、微小滴定プレートのプイなどの、独立した室内に固定され、インスリン依存糖尿病に対する中立性を検出するために使用異なるタイプのプローブのすべてまたは一部が微小滴定プレートの少なくとも1つのプイ内に固定されることを特徴とする、請求項18に記載の装置。
  20. 少なくとも2つのタイプの異なる固有プローブが、その間に相互作用なしに、微小滴定プレートの同じプイなどの、独立した同じ室内に固定されることを特徴とする、請求項18または19のいずれか1つに記載の装置。
  21. インスリン依存糖尿病に対する感受性または防御性または中立性を検出するために使用されるプローブのタイプの全体が微小滴定プレートのプイなどの、唯一かつ同一の室内に固定されることを特徴とする、請求項18または19のいずれか1つに記載の装置。
  22. 例えば、ペルオキシダーゼによって、酵素反応を利用する非局所的比色発現であることを特徴とする、請求項18または19のいずれか1つに記載の装置で実現される交雑発現方法。
  23. 例えば、蛍光または放射能による、それぞれのタイプのプローブとアンプリコンの間に実現された交雑の局所的発現であることを特徴とする、請求項19から21のいずれか1つに記載の装置で実現される交雑発現方法。
  24. プライマSEQ ID NO2と組み合わせてプライマSEQ ID NO1を使用することをもってなる、インスリン依存糖尿病に対する患者の遺伝的素因の分析方法において使用するためのHLA−DQB1遺伝子に対応する配列の増幅を可能にするプライマ。
  25. 5’のビオチン化物であることを特徴とする、請求項25に記載のプライマ。
  26. インスリン依存糖尿病に対する患者の遺伝的素因の分析のために、HLA−DQB1遺伝子に対応する配列の交雑を可能にする捕捉プローブであって、プローブの5’に位置するアミノまたはビオチン分岐を介して微小滴定プレートのプイの底、またはビードの上に固定されることを特徴とする、プローブ。
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