JP2004510960A - 肥満および糖尿病におけるインスリン抵抗性を治療する方法 - Google Patents

Abstract

患者、特に肥満および／またはＩＩ型糖尿病に伴うインスリン抵抗性を有する患者におけるインスリン抵抗性を低下させるのに有用な化合物を同定する方法を開示する。本発明の方法を使用して同定した化合物を投与することにより、特に、メラノコルチン刺激ホルモン（ＭＳＨ）生物活性に対するアンタゴニストを投与することにより、患者でインスリン抵抗性を低下させる方法も開示する。

Description

【０００１】
（発明の分野）
本発明は、肥満の非ヒト動物モデル、肥満およびＩＩ型糖尿病におけるインスリン抵抗性の制御に使用する化合物を同定する方法を研究・開発するためのそのような動物の使用方法、ならびにそのような化合物を投与することにより肥満およびＩＩ型糖尿病におけるインスリン抵抗性を治療する方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
糖尿病およびそれに関連する症状は、全世界、特に米国での主要な健康上の懸念事項であり、罹患および死亡の一因となっている。インスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）はＩＩ型糖尿病とも呼ばれており、先進国では主要な糖尿病のタイプである。多くの環境的および遺伝的要素が米国でのＮＩＤＤＭリスクに寄与しているが、長期にわたる肥満は明らかに最も大きなリスクファクターである。しかし、これに関連する分子的基礎はまだ十分には理解されておらず、その結果、有効な治療的介入手段がない。
【０００３】
多くの肥満患者では、糖尿病を発症する前に、インスリンの作用に対し末梢抵抗性が生じる。肥満におけるインスリン抵抗性の分子的基礎は集中的な研究の対象とされてきているが、まだ解明されていない。肥満により誘導されるインスリン抵抗性を示す肥満のマウスモデルから、肥満とインスリン抵抗性の関係の成分およびメカニズムに対する洞察が得られている。様々の肥満のマウスモデルの分子的基礎に一連のメカニズムが含まれているが、これらはすべて、肥満の開始前か開始後に、糖尿病を発症する。
【０００４】
ヒトおよび齧歯類における肥満は、一般に、インスリン抵抗性（すなわち、所与の投与量のインスリンに対して予想された反応より小さい反応を示す）と関連している（レロイスら（ＬｅＲｏｉｔｈ　ｅｔ　ａｌ．）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｍｅｌｌｉｔｕｓ：ａ　Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　ａｎｄ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｔｅｘｔ（リッピンコット−ラーベン（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ）、フィラデルフィア、１９９６）；デフロンゾら（ＤｅＦｒｏｎｚｏ　ｅｔ　ａｌ．）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｃａｒｅ第１５巻、３１８〜６８ページ（１９９２）；リフキンら（Ｒｉｆｋｉｎ　ｅｔ　ａｌ．）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｍｅｌｌｉｔｕｓ（エルセビエ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、ニューヨーク、１９９０）。肥満とインスリン抵抗性を関連づけるメカニズムはまだ判っていない。肥満により誘導されるインスリン抵抗性の可能性のあるメカニズム上の基礎に関する研究により、多数の潜在的な部位が明らかとなっており、インスリン非感受性を説明する唯一の基本的なメカニズムはないようである（リフキンら（Ｒｉｆｋｉｎ　ｅｔ　ａｌ．）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｍｅｌｌｉｔｕｓ（エルセビエ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、ニューヨーク、１９９０）。インスリンの分泌および作用のいずれもが損なわれ得る。したがって、解剖学的レベル、細胞レベルおよび分子レベルでの部位は、膵臓のβ細胞ならびに肝臓、脂肪および筋肉内の膜キャリアおよび代謝経路調節酵素である。インスリン分泌不全の例は、インスリン非依存型糖尿病を有する肥満の齧歯類モデルであるＺｕｃｋｅｒ糖尿病脂肪（ｆａ／ｆａ）ラットに見出すことができ、このモデルでは膵ランゲルハンス島でのトリグリセリドの過剰蓄積によりβ細胞が徐々に枯渇する（リーら（Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ．）、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ　第９１巻、１０８７８〜８２ページ（１９９４）；シマブクロら（Ｓｈｉｍａｂｕｋｕｒｏ　ｅｔ　ａｌ．）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ　第９５巻、２４９８〜５０２ページ（１９９８））。インスリンの作用は、インスリン感受性キャリアもしくは経路、またはインスリン受容体で直接を含む、いくつかの様式で損なわれる。過去の研究から、インスリン感受性のグルコース輸送体（Ｇｌｕｔ−４）の量的制御がインスリン抵抗性の一因である可能性が示唆されている。しかし、この因子のみではおそらく、インスリン抵抗性の程度を説明するには不十分である。例えば、Ｇｌｕｔ−４を欠く突然変異マウスは軽度の高インスリン血症しか発症しない（カッツら（Ｋａｔｚ　ｅｔ　ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ第３７７巻、１５１〜５ページ（１９９５））。より最近の研究は、インスリン受容体それ自体のレベルおよび２型糖尿病での受容体後の事象、具体的には、インスリン受容体固有の触媒活性および下流でのシグナリングでの欠陥に焦点を当てている。インスリン受容体（ＩＲ）およびインスリン受容体基質１（ＩＲＳ−１）の両方についてのチロシンリン酸化の低下が、２型糖尿病の動物およびヒトのいずれでも認められている（ル・マルシャン・ブリュステルら（Ｌｅ　Ｍａｒｃｈａｎｄ−Ｂｒｕｓｔｅｌ　ｅｔ　ａｌ．）、Ｊ　Ｒｅｃｅｐｔ　Ｓｉｇｎａｌ　Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ　Ｒｅｓ第１９巻、２１７〜２８ページ（１９９９））。重要なことに、これは、主要なインスリン感受性組織、すなわち、筋肉、脂肪および肝臓のすべてで起こる。マウスでＩＲＳ−２が破壊されると、末梢のインスリンシグナリングと膵臓のβ細胞の機能の両方が損なわれる（ウィザースら（Ｗｉｔｈｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ第３９１巻、９００〜４ページ（１９９８））。ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ　３キナーゼ）の活性化は、インスリンに応答して非常に大きく影響を受けることが明らかとなった（ケロウズら（Ｋｅｒｏｕｚ　ｅｔ　ａｌ．）、Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ第１００巻、３１６４〜７２ページ（１９９７））。肝臓におけるインスリンによる遺伝子発現の制御は、グルコキナーゼおよびホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）の遺伝子に関して損なわれる（フリードマンら（Ｆｒｉｅｄｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．）、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ第２７２巻、３１４７５〜８１ページ（１９９７））。インスリンの作用に対するモジュレータは腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αであり、これはインスリン受容体のチロシンキナーゼ活性に対する阻害能によりインスリンを阻害する（ファインスタインら（Ｆｅｉｎｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ．）、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ第２６８巻、２６０５５〜８ページ（１９９３））。ＴＮＦ−αの機能を欠くマウスは、肥満により誘導されるインスリン抵抗性から保護される（ウイサルら（Ｕｙｓａｌ　ｅｔ　ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ第３８９巻、６１０〜４ページ（１９９７））。インスリン感受性の別のモジュレータは、インスリンシグナリングの負のレギュレータとして作用するタンパク質チロシンホスファターゼ−１Ｂ（ＰＴＰ−１Ｂ）である（シシレリら（Ｃｉｃｉｒｅｌｌｉ　ｅｔ　ａｌ．）、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ　第８７巻、５５１４〜８ページ（１９９０））。ＰＴＰ−１Ｂを欠くマウスは興味深いことに、インスリンに対する感受性はより高いが、肥満には抵抗性である（エルチェブリら（Ｅｌｃｈｅｂｌｙ　ｅｔ　ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ第２８３巻、１５４４〜８ページ（１９９９））。より最近の研究は、核ホルモン受容体ファミリーのメンバーであるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）に焦点が当てられている（オーワークス（Ａｕｗｅｒｘ）、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ第４２巻、１０３３〜４９ページ（１９９９））。ヒトにおけるＰＰＡＲγの突然変異から、この分子がヒトにおける正常なインスリン感受性に必要な分子であることが示唆されている（バロソら（Ｂａｒｒｏｓｏ　ｅｔ　ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ第４０２巻、８８０〜３ページ（１９９９））。現時点では、ヒトの肥満におけるインスリン抵抗性がＰＰＡＲγシグナリングの障害によるものであるかどうかは明らかではない。今明らかなことは、インスリン受容体のシグナリング能の低下が、肥満により誘導されるインスリン抵抗性の重要な要素であり得るということである。
【０００５】
細胞内の代謝酵素レベルでは、肥満におけるインスリン抵抗性は、インスリンで刺激されることが知られている経路（すなわち、解糖および脂質形成）の重要な酵素の活性の上昇と、通常インスリンで抑制される経路の重要な酵素の活性の上昇とからなると思われる（ベルフィオレら（Ｂｅｌｆｉｏｒｅ　ｅｔ　ａｌ．）、Ｉｎｔ　Ｊ　Ｏｂｅｓ第３巻、３０１〜２３ページ（１９７９））。このようにインスリンが異化経路の酵素を抑制できないことは、脂肪組織での基礎脂質分解の促進、筋肉からのアミノ酸放出の増加、および肝臓の重要な糖新生酵素の活性の上昇に現れている。
【０００６】
上記のように、遺伝的な肥満−糖尿病症候群のいくつかのマウスモデルが存在する（ヘルバーグら（Ｈｅｒｂｅｒｇ，ｅｔ　ａｌ．）、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ第２６巻、５９〜９９ページ（１９７７））。これらのモデルは特徴的に、程度、発現のタイミング、理由は異なるが、高血糖症、高インスリン血症、および肥満を有している。黄色肥満マウス（Ａ^ｙ／ａ）では、アグーチ座のドミナント変異により、アグーチタンパク質の異所性の偏在性の発現が生じ、その結果、成人で発症した肥満およびインスリン非依存型糖尿病と似た状態となる（ミチャウドら（Ｍｉｃｈａｕｄ　ｅｔ　ａｌ．）、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ第９１巻、２５６２〜６ページ（１９９４））。肥満（ｏｂｅｓｅ）（ｏｂ／ｏｂ）（ザングら（Ｚｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ第３７２巻、４２５〜３２ページ（１９９４））、糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ）（ｄｂ／ｄｂ）（タータグリアら（Ｔａｒｔａｇｌｉａ　ｅｔ　ａｌ．）、Ｃｅｌｌ第８３巻、１２６３〜７１ページ（１９９５））、太り（ｆａｔ）（ｃｐｅ／ｃｐｅ）（ナガートら（Ｎａｇｇｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ．）、Ｎａｔ　Ｇｅｎｅｔ第１０巻、１３５〜４２ページ（１９９５））およびずんぐりした樽状の太り（ｔｕｂｂｙ）（ｔｕｂ／ｔｕｂ）（クレインら（Ｋｌｅｙｎ　ｅｔ　ａｌ．）、Ｃｅｌｌ第８５巻、２８１〜９０ページ（１９９６）；ノーベン・トラウスら（Ｎｏｂｅｎ−Ｔｒａｕｔｈ　ｅｔ　ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ第３８０巻、５３４〜８ページ（１９９６））は単一劣性遺伝子の変異、すなわち、それぞれレプチン、レプチン受容体、カルボキシペプチダーゼＥ、および樽状（ｔｕｂｂｙ−ｌｉｋｅ）タンパク質をコードする新しい遺伝子ファミリーのメンバーの変異である。ｏｂｅｓｅマウスは、高血糖症、耐糖能低下、血漿インスリンの上昇という糖尿病様症候群を有している。糖尿病症候群は肥満発症後に発症し、おそらく、肥満の結果として起こる。ｄｉａｂｅｔｅｓマウスでは、２週令で血漿インスリンが上昇し、その後３〜４週令で肥満を発症する。血糖値は４〜８週令で上昇する。ｆａｔマウスは、ランゲルハンス島の肥大および過形成と共に、一生を通して高インスリン血症を有するが、高血糖症は一時的である。ｔｕｂｂｙマウスでは、明らかな肥満の兆候が認められる前に、血漿インスリンが上昇し、ランゲルハンス島が肥大するが、ここで血中グルコースは正常である。
【０００７】
上記のように、肥満におけるインスリン抵抗性に対する分子的基礎は知られていない。レプチン欠損ｏｂ／ｏｂ変異体でインスリン抵抗性が起こることから、レプチン濃度の上昇でこれを説明することはできない。したがって、肥満で認められるインスリン抵抗性を媒介する肥満における何らかの他の分子「シグナル」が存在するはずである。
【０００８】
このような長年切望されていたがまだ解決されていない、糖尿病の負の作用を予防または減少させる簡単かつ有効な方法に対する要求に直面して、研究者らはこの数十年にわたり、文字通り数億ドルをかけて、糖尿病の治療および／または予防に使用し得る化合物を研究してきた。グルコースを変化させることが糖尿病の発症と重症度に影響を与える可能性があり、肥満におけるインスリン抵抗性の調節にも同様な影響を与える可能性がある。この後者のアプローチは糖尿病に比べて、理解が進んでいない分野であった。本発明は、肥満におけるインスリン抵抗性を制御することによる糖尿病の予防および／または治療を対象とする。
【０００９】
（発明の概要）
本発明の一実施形態は、肥満およびＩＩ型糖尿病におけるインスリン抵抗性の制御に有用な化合物を同定する方法に関する。この方法は、（ａ）Ｐｏｍｃ座の２本の対立遺伝子内に遺伝子改変を有する遺伝子改変した非ヒト動物に、メラノサイト刺激ホルモン（ＭＳＨ）生物活性を有する化合物を投与する工程であって、前記遺伝子改変の結果前記動物ではプロオピオメラノコルチン（Ｐｏｍｃ）ペプチド活性が存在せず、かつＭＳＨ活性を有する化合物の投与により動物でインスリン抵抗性が誘導される工程と、（ｂ）非ヒト動物モデルに、評価すべき化合物を投与する工程と、（ｃ）（ｂ）の化合物が存在しないときと比べて非ヒト動物でインスリン抵抗性を低下させる（ｂ）からの化合物を選択する工程と、からなる。
【００１０】
一実施形態では、遺伝子改変はＰｏｍｃ座のヌクレオチドの欠失、挿入、置換および逆位からなる群から選択される。別の実施形態では、遺伝子改変はＰｏｍｃ座の２本の対立遺伝子内の核酸配列の欠失であり、この欠失により動物がＰｏｍｃペプチドを発現しなくなる。別の実施形態では、遺伝子改変はＰｏｍｃのエキソン３またはＰｏｍｃ座の２本の対立遺伝子によるＰｏｍｃペプチドの発現を妨げるのに十分なＰｏｍｃのエキソン３の一部分からなる核酸配列の欠失である。別の実施形態では、動物はマウスであり、遺伝子改変はゲノムからのＰｏｍｃのエキソン３（配列番号７）の欠失である。
【００１１】
一態様において、工程（ａ）のＭＳＨ生物活性を有する化合物は、ＭＳＨ、ＭＳＨの生物活性断片、ＭＳＨのホモログ、ＭＳＨのペプチドミメティック、ＭＳＨの非ペプチドミメティック、およびＭＳＨタンパク質またはその断片からなる融合タンパク質、からなる群から選択される。別の態様では、ＭＳＨ生物活性を有する（ａ）の化合物はα−ＭＳＨである。
【００１２】
一態様において、評価すべき（ｂ）の化合物はＭＳＨ生物活性に対するアンタゴニストである。別の態様では、評価すべき（ｂ）の化合物は、ＭＳＨ生物活性を有する（ａ）の化合物を投与する工程の前に投与する。
【００１３】
本発明の別の実施形態は、哺乳類でインスリン抵抗性を低下させる方法であって、インスリン抵抗性を有する哺乳類に、メラノコルチン刺激ホルモン（ＭＳＨ）生物活性に対するアンタゴニストを含む治療用組成物を投与することからなり、アンタゴニストが哺乳類でインスリン抵抗性を低下させる方法に関する。一態様において、メラノコルチン刺激ホルモン（ＭＳＨ）のアンタゴニストは、ＭＳＨアンタゴニスト作用を有するＭＳＨの断片、ＭＳＨアンタゴニスト作用を有するＭＳＨのホモログ、ＭＳＨアンタゴニスト作用を有するＭＳＨのペプチドミメティック、ＭＳＨアンタゴニスト作用を有するＭＳＨの非ペプチドミメティック、および、ＭＳＨアンタゴニスト化合物のいずれかからなる融合タンパク質、からなる群から選択される。別の態様では、ＭＳＨのアンタゴニストはＭＳＨに結合する可溶性ＭＳＨ受容体またはその断片である。別の態様では、ＭＳＨのアンタゴニストは、ＭＳＨに選択的に結合し、それによりＭＳＨの活性を低下させまたは阻止する抗体である。他の態様では、ＭＳＨのアンタゴニストは、ＭＳＨの受容体に選択的に結合し、ＭＳＨの受容体への結合能を低下させまたは阻止する抗体である。
【００１４】
治療用組成物は、経皮的、局所的および非経口的を含むがこれらに限定されない任意の好適な経路で投与し得る。一態様において、治療用組成物は放出制御製剤として投与する。一態様において、ＭＳＨアンタゴニストは動物の体重１ｋｇ当たり約０．１μｇから約１０ｍｇの投与量で投与する。
【００１５】
本発明の別の実施形態は、哺乳類のインスリン抵抗性を伴う糖尿病を治療する方法であって、インスリン抵抗性と糖尿病を有する哺乳類に、メラノコルチン刺激ホルモン（ＭＳＨ）生物活性に対するアンタゴニストを含む治療用組成物を投与することからなり、アンタゴニストは哺乳類でインスリン抵抗性を低下させる方法に関する。
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本発明は一般に、肥満および糖尿病に伴うインスリン抵抗性を低下させる化合物を同定する方法、およびインスリン抵抗性を低下させる治療を必要とする哺乳類でインスリン抵抗性を低下させる方法に関する。本発明はまた、インスリン抵抗性を伴う糖尿病の治療も対象とする。本発明は、以前に記載されている肥満の動物モデルとは対照的に、肥満の非ヒト動物モデルが、肥満により誘導されるインスリン抵抗性および糖尿病から保護されるという、驚くべき本発明者らの発見に基づいている。肥満と糖尿病との密接な関係を考えると、糖尿病に抵抗性の肥満変異体は、この２つの状態の独特な分離を示している。より具体的には、本発明者らは、肥満の遺伝マウスモデルであるＰＯＭＣヌルマウスを作製した（ヤスウェンら（Ｙａｓｗｅｎ　ｅｔ　ａｌ．）、Ｎａｔ　Ｍｅｄ第５巻、１０６６〜１０７０ページ（１９９９））。このＰＯＭＣヌルマウスは、驚くべきことに本発明者らが発見したものであるが、肥満により誘導される２型糖尿病から保護され、インスリンに感受性である。ＰＯＭＣヌルマウスは既に、１９９９年８月１２日出願の「Ｎｏｎ−Ｈｕｍａｎ　Ａｎｉｍａｌ　Ｍｏｄｅｌ　ｆｏｒ　Ｏｂｅｓｉｔｙ　ａｎｄ　Ｕｓｅｓ　Ｔｈｅｒｅｏｆ」という発明の名称の米国特許出願第０９／３７４，８２７号、１９９８年１２月９日出願の「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ　Ｏｂｅｓｉｔｙ」という発明の名称の米国特許仮出願第６０／１１１，５８１号、１９９９年７月２９日出願の「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ　Ｂｏｄｙ　Ｗｅｉｇｈｔ　ａｎｄ　Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｔｈｅｒｅｔｏ」という発明の名称の米国特許仮出願第６０／１４６，３０６号に記載されており、それぞれその全体を本願明細書に援用する。しかし、本発明以前には、ＰＯＭＣヌル変異マウスがインスリン抵抗性でないことも糖尿病傾向にないことも知られていなかったので、上記のように、このような発見は驚くべきものであった。本発明者らはさらに、メラノコルチン刺激ホルモン（ＭＳＨ）をＰＯＭＣヌルマウスに投与すると、マウスでインスリン抵抗性が誘導されることも発見した。これは、動物をインスリン抵抗性から保護するのが、マウスモデルでのＭＳＨの欠如であると示唆している。ここで、このマウスモデルを使用して、インスリン抵抗性および糖尿病に関係する生化学的および分子的メカニズムを研究し、動物でインスリン抵抗性を低下させる化合物および／またはＩＩ型糖尿病の症状を減少させる化合物を同定し得る。さらに、本発明者らは、ＭＳＨの生物活性に対する拮抗を使用して、個体のインスリン抵抗性を低下し得、これは、インスリン抵抗性を伴う糖尿病の治療に有益であることを示す証拠を提供した。実際に、本発明に続き、カツキら（Ｋａｔｓｕｋｉ　ｅｔ　ａｌ．）は、肥満したヒトでα−ＭＳＨの血漿濃度の上昇がインスリン抵抗性と相関することを示した（カツキら（Ｋａｔｓｕｋｉ　ｅｔ　ａｌ．）、２０００年１０月、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｂｅｓｉｔｙ第２４巻、１２６０〜１２６４ページ））。
【００１７】
上記のように、本発明者らは、肥満モデルであるＰｏｍｃ変異マウスの開発および特徴づけを開示した。このモデルは、驚くべきことに、他の肥満マウスモデルと同様にインスリン抵抗性であるのではなく、インスリン感受性であることが発見され、肥満およびインスリン抵抗性に寄与する因子を分析するのに有用な動物モデルを提供する。Ｐｏｍｃ変異マウスを遺伝子操作し、Ｐｏｍｃ遺伝子の常染色体の劣性ヌル対立遺伝子（すなわちｐｏｍｃ）を有するようにした。このマウスは、Ｐｏｍｃ座がコードするすべてのペプチドホルモンを欠いている。本発明者らは、Ｐｏｍｃペプチドを欠くマウスは肥満しており、副腎発達の欠陥があり、色素沈着の変化があることを発見した。この表現型は、最近同定されたヒトＰｏｍｃ変異体（クルドら（Ｋｒｕｄｅ，ｅｔ　ａｌ．）、Ｎａｔ　Ｇｅｎｅｔ第１９巻、１５５〜７ページ（１９９８））と同様である。脂質代謝の調節異常に加えて、ＰＯＭＣ欠失マウスでは摂餌量の増加が認められた。
【００１８】
本発明者らが安定なα−ＭＳＨアゴニストで末梢から変異マウスを処理したとき、これらのマウスでは２週間後に過剰体重の４０％超の体重減少が認められたが、野生型の非肥満マウスでは有意な体重の減少は認められなかった。本発明者らは、ＰＯＭＣヌルマウスでの体重の変化は摂餌行動によってのみ制御されているのではなく、メラノコルチンの中枢作用と末梢作用の両方によって制御されていることを示した。
【００１９】
本発明に有用な遺伝子改変非ヒト動物は、動物（例えば、ヘテロ接合性変異動物）でのプロオピオメラノコルチン（Ｐｏｍｃ）ペプチドの作用（活性）が低下する、Ｐｏｍｃ座の少なくとも１本の対立遺伝子内に遺伝子改変を有する。一実施形態では、遺伝子改変は、動物でＰｏｍｃペプチドの作用を低下させる、Ｐｏｍｃ座のヌクレオチドの欠失、挿入、置換および／または逆位を含むが、これらに限定されるものではない。遺伝子改変は、Ｐｏｍｃペプチドの作用を低下させる、Ｐｏｍｃ座のエキソン３を含むまたはエキソン３内の改変、および／またはＰｏｍｃペプチドの作用を低下させるエキソン３以外のＰｏｍｃ座の領域（例えば、Ｐｏｍｃ座のエキソン１、エキソン２および／または制御領域）の改変とすることが可能である。好ましい実施形態では、遺伝子改変は、動物によるＰｏｍｃペプチドの発現が低下する、Ｐｏｍｃ座の少なくとも１本の対立遺伝子内の核酸配列の欠失である。別の実施形態では、動物はＰｏｍｃ座の２本の対立遺伝子（すなわち、両方の対立遺伝子）内に遺伝子改変を有し、遺伝子改変の結果、その動物でＰｏｍｃペプチドの作用がなくなる（例えば、ホモ接合性変異動物）。好ましくは、遺伝子改変は、Ｐｏｍｃ座の両方の対立遺伝子内の核酸配列の欠失であり、欠失の結果、その動物によるＰｏｍｃペプチドの発現がなくなる。
【００２０】
メラノコルチンを含むプロオピオメラノコルチン（Ｐｏｍｃ）ペプチド；アドレノコルチコトロピン（ＡＣＴＨ）；α−、β−およびγ−メラノサイト刺激ホルモン（ＭＳＨ）；およびオピオイド受容体リガンドβ−エンドルフィン；は、色素沈着、副腎皮質機能、エネルギー貯蔵の制御、ならびに免疫、中枢神経および末梢循環系での役割を含む多様な生物活性を有している（スミス　エー・アイら（Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｉ．ｅｔ　ａｌ．）、Ｅｎｄｏｃｒ　Ｒｅｖ第９巻、１５９〜１７９ページ（１９８８））；ケーニヒ（Ｋｏｅｎｉｇ）、「Ｐｅｐｔｉｄｅ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｈｏｒｍｏｎｅｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ａｃｔｉｖｉｔｙ，ａ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｍａｎｕａｌ」（ニューヨーク州ワインハイム（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；ＮＹ）、１９９３）。本願明細書で使用する場合「Ｐｏｍｃペプチド」とは、Ｐｏｍｃ座でコードされる１種または複数の任意のＰｏｍｃペプチドを包括的に意味する。ＭＳＨなどの具体的なＰｏｍｃペプチドを意味することを意図する場合には、具体的なペプチドの名称を使用する。非常に多様な動物（すなわち、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、マカク、両生類など）の天然のＰｏｍｃペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列が当該技術分野で知られている。このような配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋなどのタンパク質または核酸データベースに見出し得る。そのようなＰｏｍｃペプチド（すなわち、アミノ酸）配列のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号としては、アクセッション番号第ＮＰ＿０００９３０号または第ＣＡＡ２４７５４号（ヒト）；アクセッション番号第Ｐ０６２９７号（ウサギ）、アクセッション番号第Ｐ０１１９４号（ラット）；アクセッション番号第Ｐ０１１９３号（マウス）；アクセッション番号第Ｐ０１１９１号（ヒツジ）；およびアクセッション番号第Ｐ０１１９０号（ウシ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。そのようなＰｏｍｃ核酸配列のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号としては、アクセッション番号第ＮＭ０００９３９号（ヒト）；アクセッション番号第ＡＨ００５３１９号（マウス）；アクセッション番号第Ｊ０００１６号、第Ｊ０００１９号、第Ｊ０００２１号（ウシ）；アクセッション番号第Ｓ７３５１９号（ブタ）；第Ｓ５７９８２号（ヒツジ）；およびアクセッション番号第ＡＨ００２２３２号（ラット）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。マウスＰｏｍｃ座のエキソン１、２および３はそれぞれ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号第Ｊ００６１０号、第Ｊ００６１１号および第Ｊ００６１２号として識別されている。
【００２１】
本願明細書で使用する場合、本発明の遺伝子改変および使用に適する非ヒト動物とは、ヒト以外の霊長類および齧歯類などの脊椎動物門哺乳類のヒト以外のメンバーを含む、Ｐｏｍｃ座を操作し得る任意の非ヒト動物である。好ましくは、このような非ヒト動物は齧歯類、より好ましくはマウスである。Ｐｏｍｃペプチド発現が低下したまたはなくなった遺伝子改変マウスについては、実施例のセクションで詳述する（例えば、実施例１参照）。
【００２２】
本発明によれば、本願明細書に記載の好ましい非ヒト動物のいずれかのなどの「遺伝子改変」動物は、所望の結果（例えば、Ｐｏｍｃペプチドの作用の低下）が得られるように、正常型（すなわち、野生型または天然型）から改変（すなわち、変異または変化）させたゲノムを有している。動物の遺伝子改変は一般に、胚細胞およびＤＮＡ（例えば、Ｐｏｍｃ座からなるＤＮＡ）の操作を含む、分子遺伝技術および細胞技術を使用して実施する。このような技術は一般に、「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ」（ホーガンら（Ｈｏｇａｎ　ｅｔ　ａｌ．）、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、１９９４）、この文献全体を本願明細書に援用する）にマウスについて開示されている。さらに、分子技術によるマウスの遺伝子改変技術は、実施例のセクションに詳述する。
【００２３】
遺伝子改変非ヒト動物には、改変により動物中で所望の効果（すなわち、Ｐｏｍｃペプチドの作用の低下）が得られるように、核酸分子を改変（すなわち、変異；例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、置換、および／または逆位により）した非ヒト動物を含み得る。本願明細書で使用する場合、遺伝子発現、遺伝子の機能および遺伝産物（すなわち、遺伝子によりコードされるタンパク質）の機能を低下させる遺伝子改変は、遺伝子の不活化（完全または部分）、欠失、妨害、抑制、下方制御と呼ぶことが可能である。例えば、このような遺伝子がコードするタンパク質の機能を低下させる遺伝子の遺伝子改変は、遺伝子または遺伝子内のエキソンの部分的または完全な欠失（すなわち、遺伝子は存在せず、したがって、タンパク質は産生されない）；タンパク質の翻訳が不完全になるか、翻訳されなくなる遺伝子の変異（例えば、欠失、置換、挿入および／または逆位）（例えば、フレームシフトを起こして正しいタンパク質が発現されなくなる変異、タンパク質またはタンパク質の少なくとも一部が発現されないような遺伝子の１つまたは複数のエキソンの変異、あるいは、タンパク質が発現されないかまたは発現が減少するような制御領域の変異）；あるいはタンパク質の天然の機能を低下させるかまたはなくす遺伝子の変異（例えば、生物活性または作用が低下したまたはないタンパク質が発現される）の結果であり得る。
【００２４】
本発明によれば、非ヒト動物の遺伝子改変の結果、Ｐｏｍｃペプチドの作用が低下する（すなわち、低下、抑制、下方制御される）。このような遺伝子改変には、特に動物（またはその動物の祖先）の発達の胚発生段階で行われる改変を含む、動物のゲノムの任意の種類の改変が含まれる。このような改変については上記してある。本発明によれば、Ｐｏｍｃペプチドの「作用」（または活性）の低下とは、ペプチドの生物活性の低下（例えば、インビボのホルモン活性の低下）；ペプチドの阻害または分解（すなわち、ペプチドは発現されるが、遺伝子改変の結果、阻害または分解される）；ペプチド発現の低下または停止（すなわち、完全なまたは部分的な遺伝子の欠失、置換、挿入、など）を含むＰｏｍｃペプチドの１つまたは複数の機能の低下が生じる、非ヒト動物での任意の遺伝子改変を意味する。例えば、Ｐｏｍｃペプチドの作用は、このペプチドの産生を阻止または低下させるか、ペプチドをコードしている遺伝子または遺伝子の一部を「ノックアウト」するか、ペプチド活性を低下させるか、あるいはペプチド活性を阻害することにより低下させ得る。
【００２５】
本発明の一実施形態では、本発明の非ヒト動物は、Ｐｏｍｃ座の１本（すなわちヘテロ接合体）または両方（すなわちホモ接合体）の対立遺伝子内の核酸配列を改変することにより遺伝子改変される、そのような改変には、Ｐｏｍｃ座の１本または複数のヌクレオチド内の欠失、挿入、置換および／または逆位が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。一実施形態では、遺伝子改変は、動物でのＰｏｍｃペプチドの作用が低下する、Ｐｏｍｃ座のエキソン３を含む核酸配列での改変である。別の実施形態では、遺伝子改変は、動物でのＰｏｍｃペプチドの作用が低下する、エキソン３以外のＰｏｍｃ座の領域での改変である。このような他の領域には、Ｐｏｍｃ座のエキソン１、エキソン２または制御領域が含まれる。本発明によれば、遺伝子の制御領域は、プロモーター、エンハンサー、転写終結配列、翻訳を調節する配列および複製開始点を含む、核酸分子の発現を調節する任意の制御配列を含む。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態では、本発明の非ヒト動物は、Ｐｏｍｃ座の１本または両方の対立遺伝子内の核酸配列の欠失により遺伝子改変し、欠失の結果、動物によるＰｏｍｃペプチドの発現がそれぞれ、低下するかなくなる。改変の結果Ｐｏｍｃ活性がなくなるようにＰｏｍｃ座の両方の対立遺伝子を改変した動物は、ヌル変異体またはＰＯＭＣヌル変異体と呼ぶことが可能である。一実施形態では、遺伝子改変はＰｏｍｃのエキソン３を含む核酸配列の欠失である。別の実施形態では、遺伝子改変はＰｏｍｃのエキソン３の欠失である。さらに別の実施形態では、遺伝子改変は、動物のＰｏｍｃ座の少なくとも１本の対立遺伝子、より好ましくは両方の対立遺伝子によるＰｏｍｃペプチドの発現を減少または妨げるのに十分なＰｏｍｃのエキソン３の一部の欠失である。
【００２７】
本発明の一実施形態では、本願明細書ではＰＯＭＣホモ接合性変異マウスまたはＰＯＭＣヌル変異マウスとも称する、遺伝子改変した非ヒト動物はマウスである。この実施形態では、遺伝子改変は好ましくは、ゲノムからの配列番号７を含む核酸配列の欠失であるが、上記のＰｏｍｃ座の任意の遺伝子改変が本発明に包含される。配列番号７は、マウス（すなわち、Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ）のＰｏｍｃ座のエキソン３を表し、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号第Ｊ００６１２号としてＧｅｎＢａｎｋデータベースで見出すことが可能である。配列番号７は本願明細書で配列番号８として表すアミノ酸配列をコードする。好ましくは、マウスでの遺伝子改変はゲノムからのＰｏｍｃのエキソン３（配列番号７）の欠失である。
【００２８】
本発明の遺伝子改変した非ヒト動物は、その動物でのＰｏｍｃペプチド作用の低下または消失により生じるいくつかの表現型によって特徴づけることが可能である。このような表現型特性には、肥満、副腎発達の欠陥、および／または色素沈着の変化が含まれる。さらに、本発明者らは、このように遺伝子改変した非ヒト動物は、この動物の野生型同胞と比べて、血清レプチン濃度がかなり上昇していることを発見した。遺伝子改変に伴う他の表現型特性には、その動物の野生型同胞と比べて摂餌量が増加すること、および／またはその動物の野生型同胞と比べて、コルチコステロン、アルドステロン、およびエピネフリンの群から選択したホルモンの血清レベルがかなり低下することが含まれる。本発明で最も重要なことに、遺伝子改変に伴う表現型特性は、動物の一生を通してグルコースおよびインスリン濃度が正常であること、およびインスリン負荷試験の間に血糖制御応答が阻害されることも含む。
【００２９】
本願明細書で使用する場合、野生型同胞または野生型同腹仔とは、本願明細書に記載の遺伝子改変動物と同じまたは遺伝的に同一の親から生まれた、好ましくは、本願明細書に記載の遺伝子改変動物と同腹の仔として生まれたが、Ｐｏｍｃ座の遺伝子改変対立遺伝子を受け継いでいない動物である。このような動物は本質的に正常な動物であり、本願明細書に記載の方法で年齢の対応する対照として使用し得る。
【００３０】
本発明によれば、非ヒト動物は所望の効果（すなわち、動物でのＰｏｍｃペプチドの作用の低下）が生じる任意の方法で遺伝子改変し得る。このような方法は一般に分子技術であり、動物のＰｏｍｃペプチドの作用を低下させるのに十分な、動物のＰｏｍｃ座の少なくとも一部の任意の欠失、動物のＰｏｍｃ座の少なくとも一部への非Ｐｏｍｃ配列の任意の挿入、あるいは任意の非Ｐｏｍｃ配列または変異Ｐｏｍｃ配列を有する動物のＰｏｍｃ座の少なくとも一部の任意の置換を含むが、これらに限定されるものではない。例えば、動物（または胚細胞）のゲノムのＰｏｍｃ座を、その動物または細胞のＰｏｍｃ座の少なくとも１本の対立遺伝子に、Ｐｏｍｃ遺伝子の少なくとも一部分をコードする単離核酸分子を挿入することにより、遺伝子改変し得る。Ｐｏｍｃ遺伝子のこの単離部分の少なくとも一部を（その部分の欠失、その部分の他の非Ｐｏｍｃ配列での置換、またはＰｏｍｃの部分への非Ｐｏｍｃ配列の挿入により）変異させ、単離された核酸分子がその動物または細胞の内因性Ｐｏｍｃ座に挿入されると、その動物または細胞では、上記のようにＰｏｍｃペプチドの作用が低下するかまたはなくなるようにする。別の例として、本発明の一実施形態では、ネズミＰｏｍｃ遺伝子をコードする単離核酸配列を有する単離核酸分子（例えば、ターゲティングベクター）を胚幹（ＥＳ）細胞のゲノムに挿入することにより、遺伝子改変マウスを作製する。この単離核酸配列では、ネズミＰｏｍｃ遺伝子のエキソン３が欠失し、非Ｐｏｍｃ核酸配列（例えば、ネオマイシンカセットなどのマーカー配列）で置換されている。単離核酸分子は好ましくは、単離核酸分子を胚幹（ＥＳ）細胞に注入したときに該分子が細胞のゲノムに、好ましくは内因性のＰｏｍｃ座に組み込まれる（すなわち、ターゲット組込み）ように設計する。
【００３１】
単離核酸分子をゲノムにターゲット組込みする技術は当該技術分野で知られており、例えば、「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ」（前掲）に記載されている。例えば、単離核酸分子は、宿主ゲノムに組み込まれるように設計したターゲティングベクターに、遺伝子操作によって組み込むことが可能である。本発明によれば、ターゲティングベクターは、次の３つの特徴を有する核酸分子と定義される：（１）標的座での相同組換えを刺激する、宿主ゲノムの標的座からのゲノム配列、（２）所望の表現型を得るのに十分な標的座からのゲノム配列内の所望の遺伝子改変、および（３）選択マーカー（例えば、Ｇ４１８、ネオマイシン、ヒグロマイシン耐性カセットなどの、抗生物質耐性カセット）。そのようなターゲティングベクターは当該技術分野で周知である。ターゲティングベクターの単離核酸分子をＥＳ細胞に導入した後、単離核酸分子を相同的に組み込んだＥＳ細胞をマウスの胚盤胞に注入し、キメラマウスを作製する。これらのマウスを次いで、所望のマウスのバックグラウンドに交配し、生殖細胞系を介して変異遺伝子を伝達するものを検出する。生殖細胞系伝達系のヘテロ接合性子孫を交配させて、ホモ接合性子孫を得る。
【００３２】
１つまたは複数の変異Ｐｏｍｃ対立遺伝子を有するマウスは、ＤＮＡを評価する任意の好適な方法を使用して同定し得る。例えば、記載されているように、遺伝子型をＰＣＲで分析し、サザンブロット分析で確認し得る（サンブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８８年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、コールド・スプリング・ハーバー出版局、コールド・スプリング・ハーバー研究所、米国ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）またはＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８９）および補遺）。
【００３３】
本発明によれば、本発明での使用に適した（例えば、本発明のターゲティングベクターに使用するのに適した）単離核酸分子は、一般に、組換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、クローニング）または化学合成を使用して作製される。所望の核酸配列（例えば、改変または非改変のＰｏｍｃ座）からなるＤＮＡは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術または他のクローニング技術により作製し得る。鋳型は中枢神経系または脳下垂体組織から単離したゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーとすることが可能である。このような方法は当該技術分野で周知である（サンブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．）前掲）。
【００３４】
本発明に有用な単離核酸分子は、改変が所望の効果を生み出すようなヌクレオチド挿入、欠失および置換（例えば、核酸相同体）（例えば、核酸分子を動物のゲノムに組み込んだときに、その動物でＰＯＭＣ作用が低下するのに十分なＰｏｍｃ遺伝子の一部分の欠失または置換）により、改変し得る。Ｐｏｍｃペプチドをコードする単離核酸分子は縮重を含み得る。本願明細書で使用する場合、ヌクレオチドの縮重とは、１つのアミノ酸が異なる複数のヌクレオチドコドンによってコードされる現象のことを指す。したがって、本発明のＰｏｍｃペプチドをコードする核酸分子の核酸配列は縮重により変化し得る。
【００３５】
本発明の一実施形態は、肥満および特にインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）またはＩＩ型糖尿病におけるインスリン抵抗性を制御するのに使用するための化合物、特にＭＳＨ生物活性に対するアンタゴニストを同定する方法に関する。そのような方法には、インスリン抵抗性が誘導されている本発明の遺伝子改変した非ヒト動物（すなわち、ＰＯＭＣヌル変異体）において、評価すべき化合物をインスリン抵抗性低下能についてスクリーニングすることを含む。このような方法で同定した化合物は、患者のインスリン抵抗性を低下させる方法に有用であり、これも本発明の別の実施形態である。このような方法はインビトロで（例えば、遺伝子改変動物の細胞、組織、または体液を使用して）またはインビボで（例えば、本発明の遺伝子改変動物に調節性化合物を投与し、このような化合物の効果をインビボで評価することにより）実施し得る。この方法で同定された制御化合物はインスリン抵抗性（すなわち肥満動物またはＩＩ型糖尿病動物）を有する動物のインスリン抵抗性を阻害するのに有用であり、動物の体重過剰に関連する障害または状態に対してさらなる有益な治療効果を有する可能性がある。
【００３６】
一態様において、そのような方法は、（ａ）Ｐｏｍｃ座の２本（両方）の対立遺伝子内に遺伝子改変を有する遺伝子改変した非ヒト動物の細胞、組織または体液を採取する工程であって、この遺伝子改変の結果、動物のＰｏｍｃペプチド活性が消失している工程と、（ｂ）インスリン抵抗性の制御能について評価すべき化合物の存在下および非存在下で、または評価すべき化合物を動物に投与した後に、遺伝子改変した非ヒト動物からの細胞、組織または体液を、遺伝子改変した非ヒト動物の野生型同胞からの細胞、組織または体液と比較する工程とを含む。採取する工程は、動物から細胞、組織および／または体液を採取する周知の方法のいずれかを使用して行われるが、検討すべき組織および実施すべき実験の状態によって決まる。例えば、細胞は生検、剥離または洗浄により採取し得、組織は手術、生検または剥離で採取し得、体液は回収、スワイプ（ｓｗｉｐｉｎｇ）または洗浄により採取し得る。
【００３７】
比較する工程は、評価すべき組織および実験の目標に適したアッセイにより行われる。例えば、本発明の遺伝子改変した非ヒト動物の細胞、組織および／または体液について実施できる好適なアッセイとしては、細胞、組織または体液の形態学的検査；細胞、組織または体液の組織学的検査；動物におけるＰｏｍｃペプチドの生物活性の評価；動物における遊離脂肪酸代謝の評価；動物における脂肪分解および脂肪酸除去（ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ）の評価；インスリン、グルカゴンおよびグルコース濃度の評価；動物の体重増加または体重減少の評価；動物におけるホルモン濃度の評価；動物における血液生化学の評価；が挙げられるが、これらに限定されるものではない。様々なこのようなアッセイが当該技術分野で知られている。
【００３８】
別の態様では、本発明の方法は、（ａ）Ｐｏｍｃ座の２本（両方）の対立遺伝子内に遺伝子改変を有する遺伝子改変した非ヒト動物に、メラノコルチン刺激ホルモン（ＭＳＨ）生物活性を有する化合物を投与する工程であって、遺伝子改変の結果動物のＰｏｍｃペプチド活性が消失し、かつこの化合物の投与により、他の反対因子の不在下で、動物でインスリン抵抗性が誘導される工程と、（ｂ）（ａ）のＭＳＨ生物活性を有する化合物の投与の前、投与と同時、または投与の後に、評価すべき化合物を動物に投与する工程と、（ｃ）（ｂ）の化合物を投与しないときと比べて、動物でインスリン抵抗性を低下させる（ｂ）の化合物を選択する工程とを含む。
【００３９】
本発明の方法の１つの工程は、ホモ接合性Ｐｏｍｃ変異体である遺伝子改変した非ヒト動物に、メラノサイト刺激ホルモン（ＭＳＨ）の生物活性を有する化合物を投与する工程であって、このような化合物の投与によって、前記動物でインスリン抵抗性が誘導される工程を含む。本発明によれば、一般に、ＭＳＨペプチドあるいはそのホモログまたはミメティックなどのタンパク質の生物活性または生物作用とは、インビボ（すなわち、タンパク質の自然な生理学的環境）またはインビトロ（すなわち、実験室の条件下）で測定または観察される、天然のタンパク質に起因するタンパク質（またはミメティック）が示すかまたは実施する任意の機能のことを指す。特に、本発明の対象であるＭＳＨの生物活性は、ＰＯＭＣヌル変異マウスでインスリン抵抗性を誘導するＭＳＨの能力を含む。
【００４０】
本発明によれば、インスリン感受性の低下とも記述し得る「インスリン抵抗性」とは、インスリンの作用についての予め「予想した」または「正常な」値と比較して、インスリンの作用に対する体の組織の感受性が低下していることを指す。より具体的には、インスリン抵抗性は、外因性または内因性インスリンのいずれかに対する生物学的応答が損なわれていることと定義される。インスリン抵抗性またはインスリン感受性の低下が存在すると、体は膵臓からインスリンをより大量に分泌することによってこの抵抗性に打ち勝とうとする。この高インスリン血症（血中インスリン濃度が高い）の代償状態を、インスリン抵抗性存在のマーカーとして使用し得る。インスリン抵抗性から生じた高インスリン濃度は、コレステロールやトリグリセリドを含む血中脂質の異常の原因となる。
【００４１】
インスリン抵抗性の存在を検出するために様々な手順が開発されてきた。このような手順には、正常域血糖インスリンクランプによる測定、最小モデルによる測定、空腹時インスリン濃度の測定が含まれるが、これらに限定されるものではない。簡単に述べると、正常域血糖インスリンクランプ法では、外因性のインスリンを注入して、空腹時のインスリン濃度より高い一定の血漿インスリン濃度を維持し、一方、グルコースを様々な速度で注入してグルコースを基礎濃度に固定する。このグルコース注入は、５分ごとに測定した血漿グルコースに基づいた速度で、留置カテーテルを介して送達する。血漿グルコース濃度が基礎値未満に低下したときに、グルコースの注入速度を上昇させて、血漿グルコース濃度を基礎濃度まで戻し、またこの逆も行う。経時的に注入したグルコースの総量（Ｍ値）をグルコース代謝に対するインスリンの作用の指標とする。単位時間当たりに注入すべきグルコースが多いと、患者のインスリンに対する感受性がより高い。反対に、インスリン抵抗性の患者では、基礎血漿グルコース濃度を維持するのに必要とするグルコースはかなり少ない。
【００４２】
最小モデルでは、静注による耐糖能試験の間に留置カテーテルから頻回にグルコースおよびインスリンをサンプリングする。結果をコンピュータモデルに入力し、コンピュータモデルでインスリン感受性の指標である値（Ｓ_ｉと呼ぶ）が得られる。グルコースに反応した急性のインスリンの放出（ＡＩＲ）もこの試験で決定する。
【００４３】
空腹時インスリン濃度の測定は一般に、一晩絶食した状態で実施する。空腹時インスリン濃度とクランプ技術で測定したインスリンの作用との間には有意な相関関係がある。さらに、正常のグルコース濃度の状態での非常に高い血漿インスリン値はインスリン抵抗性を反映している可能性が非常に高いということは一般に正しい。
【００４４】
したがって、本発明の方法によれば、インスリン抵抗性の上昇（例えば、インスリン感受性の低下）またはインスリン抵抗性の低下（インスリン感受性の上昇）は、以前の測定値、その動物について確立されている一般的な対照の測定値、またはその動物について確立されている予想「正常」測定値と比べて、その動物のインスリンに反応する能力が変化していることを指す。インスリン抵抗性または感受性の上昇または低下は、インスリン感受性／抵抗性を測定する任意の好適な方法で決定されるインスリンに対する反応の任意の検出可能な変化とし得る。
【００４５】
好ましくは、ＭＳＨ生物活性を有する化合物（例えば、ＭＳＨおよびＭＳＨのアゴニスト）は、１つまたは複数の以下の特性または同定特性を有する任意の化合物である：（１）ＭＳＨ受容体への結合能および（２）脂質分解促進能および／または脂肪細胞による脂肪酸の取込み能を阻害する能力。本発明の方法の工程（ａ）で使用するための特に好ましいＭＳＨ化合物には、天然の（すなわちプロトタイプ）のＭＳＨ（例えば、アゴニスト）に比べて、実質的に同等、より好ましくはより増強された特性または同定特性を有する、天然のＭＳＨペプチドのホモログおよびミメティックが含まれる。このような特性または同定特性には、（１）ＭＳＨペプチド受容体に対する増強された結合能、（２）延長された血清半減期（すなわち、強化された生理的状態での安定性）および／または（３）増強された、脂質分解促進能および／または脂肪細胞による脂肪酸の取込み阻害能が含まれ得る。
【００４６】
一実施形態では、ＭＳＨ生物活性を有する化合物は、本願明細書に配列番号１（ＥＨＦＲＷ）で示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有する任意のペプチド、またはそのホモログもしくはミメティックであり得る。他の実施形態では、ＭＳＨ生物活性を有する好ましい化合物には、メラノコルチン刺激ホルモンペプチド、そのようなペプチドの断片、そのようなペプチドを含む融合タンパク質、ならびにＭＳＨペプチドのホモログ、そのようなペプチドのミメティック（ペプチドまたは非ペプチド）、およびそのようなペプチドの医薬品の塩（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　ｓａｌｔ）を含むＭＳＨアゴニストが含まれるが、これら限定されるものではない。好ましいメラノサイト刺激ホルモン（ＭＳＨ）としては、α−ＭＳＨ、β−ＭＳＨおよびγ−ＭＳＨ、そのようなペプチドの断片、そのようなペプチドのホモログ、そのようなペプチドのミメティック（ペプチドまたは非ペプチド）、そのようなペプチドを含む融合タンパク質、およびそのようなペプチドの任意の医薬品の塩を含む。
【００４７】
ヒトのα−ＭＳＨのアミノ酸配列は、
Ａｃ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＮＨ_２
であり、本願明細書では配列番号２で表す。アミノ酸配列決定および核酸配列決定の技術は完全に誤差がないわけではなく、本願明細書で示すかまたは言及する配列はいずれも、最良でも、本発明に有用なＭＳＨペプチド、ホモログ、ペプチドミメティック、そのようなペプチドをコードする核酸配列の見かけの配列を表していることに留意されたい。
【００４８】
ＭＳＨ生物活性を有する化合物を投与する工程の前、工程と同時、工程の後に実施し得る本発明の方法の別の工程は、遺伝子改変した非ヒト動物に評価すべき制御化合物を投与する工程を含む。本発明によれば、本発明の方法で制御活性を評価すべき好適な化合物は、好ましくは、少なくともインスリン抵抗性を制御するそのような化合物の能力について未知の制御活性またはまだ決定されていないレベルの制御活性を有する化合物を含む。本発明の方法で試験する特に好ましい推定の制御化合物としては、ＭＳＨ生物活性の任意のアンタゴニストが含まれ、ＭＳＨアンタゴニスト活性を有するＭＳＨのホモログ、ＭＳＨアンタゴニスト活性を有するＭＳＨのペプチドまたは非ペプチドミメティック、ＭＳＨアンタゴニストペプチドを含む融合タンパク質、またはそのようなペプチド、断片、ホモログ、ペプチドミメティック、その融合タンパク質をコードする組換え核酸分子が含まれ得る。好適な制御化合物には、ＭＳＨアンタゴニスト活性を有する小分子または薬剤などの任意の化合物（すなわち必ずしも構造的にＭＳＨに類似している必要はない）も含まれ得る。
【００４９】
本発明によれば、用語「化合物」とは、以下の化合物、すなわち、ペプチド、公知のペプチドの断片（生物学的に活性な断片と不活性な断片の両方を含む）、そのようなペプチドのホモログ、そのようなペプチドのミメティック（ペプチドまたは非ペプチド）、そのようなペプチドを含む融合タンパク質、およびそのようなペプチドの医薬品の塩、ならびに任意の小分子および薬剤のいずれも含む。さらに、本発明の制御化合物に有用なペプチドは、特に調剤したときに、２量体、３量体、４量体、および他の多量体として存在し得る。そのような多量体は本発明の範囲に含まれる。本願明細書で使用する場合、本発明のＰｏｍｃペプチドと関連して使用される「類似体」という用語は、一般に、Ｐｏｍｃペプチドの任意のホモログまたはミメティック（ペプチドまたは非ペプチド）を意味する。Ｐｏｍｃ遺伝子およびタンパク質と関連して本願明細書に使用されている用語（例えば、「化合物」、「類似体」、「ホモログ」、「ミメティック」）は、特定のＰｏｍｃ遺伝子およびタンパク質（例えば、ＭＳＨペプチド、ＭＳＨ化合物、ＭＳＨ類似体など）と同様に使用し得る。ホモログおよびミメティックについては下記に詳述する。類似体にはプロトタイプＰｏｍｃペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストの両方が含まれ得る。
【００５０】
本願明細書で使用する場合、句「ＭＳＨアゴニストリガンド」または「ＭＳＨアゴニスト」は、ＭＳＨ受容体（すなわち、生理的条件下などで、ＭＳＨと自然に結合する受容体）と相互作用し、観察し得る反応を誘起する任意の化合物を指す。より具体的には、ＭＳＨアゴニストには、ＭＳＨ受容体に選択的に結合し、活性化する、またはＭＳＨ受容体の活性化を増強するタンパク質、ペプチド、核酸、抗体またはその抗原結合断片、炭水化物をベースとする化合物、脂質をベースとする化合物、天然の有機化合物、合成の有機化合物または他の化合物（例えば、任意の薬剤設計の生成物）が含まれ得るが、これらに限定されるものではなく、最も一般的には、天然のアゴニストであるＭＳＨと同様な方法で（例えば、ＭＳＨ受容体との相互作用／結合および／または直接的または間接的なＭＳＨ受容体の活性化により）、天然のＭＳＨ受容体の生物活性をアゴナイズ（例えば、刺激、誘導、上昇、増強）するＭＳＨ能力により特徴づけられる合成ＭＳＨを含むＭＳＨのホモログまたはミメティックを含む。１つのＭＳＨ受容体に対するアゴニストの作用は、ある組織の種類では望ましくない結果をもたらし、別の組織の種類では有益な結果をもたらすことがある。しかし、アゴニストという用語は、天然のＭＳＨリガンド、ＭＳＨのＭＳＨ受容体に対する作用と実質的に同様にＭＳＨ受容体に作用するリガンドの能力を指すことを意図する。
【００５１】
句「ＭＳＨアンタゴニストリガンド」または「ＭＳＨアンタゴニスト」は、上記のようにＭＳＨアゴニストの作用を阻害する任意の化合物を指す。より具体的には、ＭＳＨアンタゴニストはＭＳＨ受容体と結合して、天然のアゴニストＭＳＨの受容体に対する作用に拮抗する（例えば、相対する、逆の、反対する）ような形で受容体の生物活性を低下（例えば、減少、阻害、阻止、逆転、改変）させ得る。ＭＳＨアンタゴニストはＭＳＨアゴニスト（例えば、ＭＳＨ）に直接作用して、ＭＳＨがその受容体に結合して受容体を活性化させる能力を減少させるかまたは阻止する、あるいはＭＳＨの消失を生じさせることが可能である。そのような化合物には、選択的に受容体に結合し、（例えば、受容体または受容体の天然もしくは合成のアゴニストに結合することにより）天然または合成のアゴニストリガンドによる受容体へのアクセスを阻止する、あるいはＭＳＨ受容体の活性を減少させもしくは阻害するタンパク質、ペプチド、核酸、抗体またはその抗原結合断片、炭水化物ベースの化合物、脂質ベースの化合物、天然の有機化合物、合成の有機化合物、可溶性ＭＳＨ受容体または他の化合物（例えば、薬剤設計の任意の生成物）、または受容体を阻止するもしくは受容体の生物活性を改変する薬剤設計の医薬品が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。一般に、アンタゴニストという用語は、天然のＭＳＨリガンド、ＭＳＨまたは合成のＭＳＨアゴニストまたはＭＳＨホモログの、ＭＳＨ受容体に対する作用に拮抗するようにＭＳＨ受容体（またはＭＳＨ）に作用する、リガンドの能力を指す。
【００５２】
本発明によれば、アゴニストおよびアンタゴニストリガンドには、ＭＳＨ受容体（すなわち、ＭＣ１−Ｒ、ＭＣ２−Ｒ、ＭＣ３−Ｒ、ＭＣ４−ＲおよびＭＣ５−Ｒを含むが、これらに限定されるものではない任意のＭＳＨ受容体）の制御に関して上述した特性を有する任意の制御リガンドまたは化合物を含み得る。アゴニストは強くても、弱くてもよく、その中間の多くのレベルがあってよい。アンタゴニストも強くても、弱くてもよい。一部のアンタゴニストは「混合された」アゴニスト／アンタゴニスト特性を有する可能性がある。
【００５３】
本願明細書で使用する場合、「ホモログ」という用語は、天然のペプチドにわずかな修飾を行ったぶんだけ天然ペプチド（すなわちプロトタイプ）とは異なるが天然型の基本的なペプチドと側鎖構造を保持しているペプチドを指す。そのような変化には、１つまたは少数のアミノ酸側鎖で起こる変化；欠失（例えば、先端が切れた（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ペプチド）、挿入および／または置換を含む、１つまたは少数のアミノ酸の変化；１つまたは少数の原子の立体化学の変化；および／またはメチル化、グリコシル化、ホスホリル化、アセチル化、ミリストイル化、プレニル化、パルミテート化、アミド化および／またはグリコシルホスファチジルイノシトールの付加を含む軽度の誘導体化；が含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましくはホモログは、上記の天然ペプチド（すなわち、アゴニスト）と比べて、増強されたまたは実質的に同様の特性を有するが、天然ペプチドの活性に拮抗する特性を有するペプチド（すなわちアンタゴニスト）も本発明のある実施形態に包含される。
【００５４】
Ｐｏｍｃペプチドのホモログ（例えば、ＭＳＨのホモログ）は天然の対立遺伝子の変異または天然の変異の結果生じるものであり得る。Ｐｏｍｃペプチド（またはＰｏｍｃペプチドを含むタンパク質）をコードする核酸の天然の対立遺伝子の変異体は、Ｐｏｍｃペプチドをコードする遺伝子と本質的に同じゲノムの遺伝子座にあるが、例えば突然変異または組換えによって生じた天然の変異のため、同様であるが同一ではない配列を有する遺伝子である。対立遺伝子変異体は一般に、比較する遺伝子によりコードされるタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードする。１つのクラスの対立遺伝子変異体は、同じタンパク質をコードするが、遺伝コードの縮重によって核酸配列は異なる。対立遺伝子変異体は、遺伝子の５’または３’非翻訳領域（例えば、制御調整領域）の改変も含み得る。対立遺伝子変異体は当業者には周知である。
【００５５】
ホモログは、単離した天然タンパク質に対する直接修飾、直接的なタンパク質合成、あるいは、例えば無作為または標的化変異生成を行う従来の技術または組換えＤＮＡ技術を使用する、タンパク質をコードする核酸配列の改変、を含むがこれらに限定されるものではない、タンパク質作製のための当該技術分野で公知の技術を使用して作製し得る。
【００５６】
ミメティックとは、多くの場合、天然ペプチドの基本構造と類似の基本構造を有するためにおよび／または天然ペプチドの顕著な生物特性を有するために、天然ペプチドの生物活性を模倣し得る、任意のペプチドまたは非ペプチド化合物を指す。ミメティックには、天然ペプチドと側鎖類似性がないなどのプロトタイプからの実質的な修飾（例えば、分解されやすさを低減する修飾など）を有するペプチド；抗イディオタイプ抗体および／または触媒抗体、またはその断片；単離タンパク質の非タンパク質部分（例えば、炭水化物構造）；または、例えば核酸やコンビナトリアルケミストリーで同定される薬剤を含む合成または天然の有機分子；が含まれ得るが、これらの限定されるものではない。そのようなミメティックは、当該技術分野で公知の種々の方法を使用して、設計、選択および／または同定し得る。ミメティックまたは本発明に有用な他の治療用化合物の設計に有用な薬剤設計の様々な方法は、モーリクら（Ｍａｕｌｉｋ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９７年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、ウィレイ・リス社（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．）に開示されており、その全体を本願明細書に援用する。
【００５７】
ＰＯＭＣミメティック（例えば、ＭＳＨミメティック）は、例えば、分子多様性戦略（大きな、化学的に多様な分子ライブラリーの迅速な構築を可能にする関連戦略を組み合わせたもの）、天然または合成化合物のライブラリー、特に化学またはコンビナトリアルライブラリー（すなわち、配列またはサイズが異なるが、類似の構成要素を有する化合物のライブラリー）から、あるいは合理的な、指向性または無作為薬剤設計により得られる。例については、モーリクら（Ｍａｕｌｉｋ　ｅｔ　ａｌ．）上記参照のこと。
【００５８】
分子多様性戦略では、大きな化合物ライブラリーを、例えば、ペプチド、オリゴヌクレオチド、炭水化物および／または合成有機分子から、生物学的、酵素的および／または化学的方法を用いて合成する。分子多様性戦略を開発する際の重要なパラメータには、サブユニット多様性、分子サイズ、およびライブラリーの多様性が含まれる。そのようなライブラリーをスクリーニングする一般的な目標は、組合せ選択を逐次適用し、所望の標的に対する高親和性リガンドを得、次いで無作為または指向性設計戦略によりリード分子を最適化することである。分子多様性の方法については、モーリクら（Ｍａｕｌｉｋ　ｅｔ　ａｌ．）前掲に詳述されている。
【００５９】
モーリクら（Ｍａｕｌｉｋ　ｅｔ　ａｌ．）は、例えば、適切に選択した断片の断片ライブラリーから新規分子を作製する方法を使用者が指示する指向性設計；使用者が遺伝または他のアルゴリズムを使用して、断片またはその組合せを無作為に変異させ、それと同時に候補リガンドの適合性を評価する選択基準を適用する無作為デザイン；および使用者が三次元の受容体構造と小さな断片プローブとの間の相互作用エネルギーを計算した後、好ましいプローブ部位を結合させるグリッドベース法；も開示している。
【００６０】
本発明の方法で使用するかまたは評価するための好ましいＰＯＭＣ類似体（ホモログまたはミメティック）には、メラノコルチンのＰＯＭＣ類似体（アゴニストまたはアンタゴニスト）が含まれる。本発明の方法で評価するための特に好ましいＰＯＭＣ類似体には、ＭＳＨタンパク質（ペプチド）の類似体が含まれる。Ｐｏｍｃペプチドおよび特にメラノコルチンの多数の類似体（ホモログおよびミメティック）は既に当該技術分野で記述されており、それらはすべて本発明の方法での使用に含まれるものとする。例えば、そのような類似体は、ハドリーら（Ｈａｄｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８６年、「α−Ｍｅｌａｎｏｔｒｏｐｉｎ　ａｎａｌｏｇｓ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｎｅｕｒａｌ　ａｎｄ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、ティー・ダブリュー・ムーディ（Ｔ．Ｗ．Ｍｏｏｄｙ）編、プレナムパブリッシング社（Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｕｂｌ．Ｃｏｒｐ．）、ニューヨーク、４５〜５６ページ、ルビー（Ｈｒｕｂｙ）の米国特許第４，６４９，１９１号、ルビーら（Ｈｒｕｂｙ　ｅｔ　ａｌ．）の米国特許第４，９１８，０５５号、ルビーら（Ｈｒｕｂｙ　ｅｔ　ａｌ．）の米国特許第５，６７４，８３９号、ハドリーら（Ｈａｄｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ．）の米国特許第５，６８３，９８１号、ルビーら（Ｈｒｕｂｙ　ｅｔ　ａｌ．）の米国特許第５，７１４，５７６号、およびルビーら（Ｈｒｕｂｙ　ｅｔ　ａｌ．）の米国特許第５，７３１，４０８号に開示されており、これらはそれぞれその全体を、特に、それらに開示されているメラノコルチンの類似体、特にＭＳＨ類似体の構造ならびにそのような類似体を作製する方法に関して、本願明細書に援用する。本発明の方法に使用するのに好適なＭＳＨアゴニスト類似体は、［Ａｃ−Ｃｙｓ^４，Ｄ−Ｐｈｅ^７，Ｃｙｓ^１０］α−ＭＳＨ）であるが、本発明がこの特定のＭＳＨ類似体に限定されないことは当業者には明らかであろう。
【００６１】
当該技術分野で公知のＭＳＨ類似体の一部には以下の類似体が含まれるが、これらに限定されるものではない。
（ａ）（１）Ｍｅｔ^４のＮｌｅによる置換、（２）Ｌ−Ｐｈｅ^７のＤ−Ｐｈｅ^７による置換、（３）４位と１０位の間の環化；および／または（４）類似体の１０位のＬｙｓ^１１の存在を含むがこれらに限定されない修飾を有する、α−ＭＳＨのコア配列、Ｍｅｔ^４−Ｇｌｕ^５−Ｈｉｓ^６−Ｐｈｅ^７−Ａｒｇ^８−Ｔｒｐ^９−Ｇｌｙ^ｌ０（配列番号２の４位〜１０位）の環状および直鎖状α−ＭＳＨ断片類似体（ルビーら（Ｈｒｕｂｙ　ｅｔ　ａｌ．）の米国特許第５，６７４，８３９号および第５，７１４，５７６号、前掲、参照）；
【００６２】
（ｂ）一般式：Ａｃ−［Ｎｌｅ^４，Ｘ_ａａ ^５，Ｈｉｓ^６，Ｘ_ａａ ^７，Ａｒｇ^７，Ｔｒｐ^９，Ｘ_ａａ ^１０］−ＮＨ_２（配列番号３）を有する直鎖状および環状α−ＭＳＨ類似体であって、
式中、Ｘ_ａａ ^５はＧｌｕまたはＡｓｐのいずれかであり、Ｘ_ａａ ^７はＰｈｅまたはＤ−Ｐｈｅであり、Ｘ_ａａ ^１０は二塩基アミノ酸、リシン、オルニチン、２，４−ジアミノ酪酸または２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）であり、
環化は４位と１０位の間である、直鎖状および環状α−ＭＳＨ類似体（ルビーら（Ｈｒｕｂｙ　ｅｔ　ａｌ．）の米国特許第５，６７４，８３９号および第５，７１４，５７６号、前掲、参照）；
【００６３】
（ｃ）Ｍｅｔ^４およびＧｌｙ^１０のＣｙｓアミノ酸による偽活性中心置換を用いたα−ＭＳＨの環状類似体、Ａｃ−［Ｃｙｓ^４，Ｃｙｓ^１０］α−ＭＳＨ_１−１３ＮＨ_２（ルビーら（Ｈｒｕｂｙ　ｅｔ　ａｌ．）の米国特許第５，６７４，８３９号および第５，７１４，５７６号、前掲、参照）；
【００６４】
（ｄ）式：Ｒ_ｌ−Ｗ−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ_２の直鎖類似体であって、
式中、
Ｒ_１はＡｃ−Ｇｌｙ−、Ａｃ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−、Ａｃ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−およびＡｃ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−からなる群から選択され；
Ｗは−Ｈｉｓ−および−Ｄ−Ｈｉｓ−からなる群から選択され；
Ｘは−Ｐｈｅ−、−Ｄ−Ｐｈｅ−、−Ｔｙｒ、−Ｄ−Ｔｙｒ−、（−ｐＮＯ_２）Ｄ−Ｐｈｅ^７’−からなる群から選択され；
Ｙは−Ａｒｇ−および−Ｄ−Ａｒｇ−からなる群から選択され；
Ｚは−Ｔｒｐ−および−Ｄ−Ｔｒｐ−からなる群から選択され；
Ｒ_２は−ＮＨ_２、−Ｇｌｙ−ＮＨ_２、および−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＮＨ_２からなる群から選択される；直鎖状類似体、（ルビーら（Ｈｒｕｂｙ　ｅｔ　ａｌ．）の米国特許第４，９１８，０５５号、前掲、参照）；
【００６５】
（ｅ）式：Ａｃ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｍ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＮＨ_２（配列番号４）を有する直鎖状α−ＭＳＨ類似体であって、式中、ＭはＭｅｔ、ＮｌｅおよびＣｙｓからなる群から選択される直鎖状α−ＭＳＨ類似体（ルビーら（Ｈｒｕｂｙ　ｅｔ　ａｌ．）の米国特許第４，９１８，０５５号、前掲、参照）；
【００６６】
（ｆ）［Ｎｌｅ^４，Ｄ−Ｐｈｅ^７］−α−ＭＳＨ；
［Ｎｌｅ^４，Ｄ−Ｐｈｅ^７］−α−ＭＳＨ_４−１０；
［Ｎｌｅ^４，Ｄ−Ｐｈｅ^７］−α−ＭＳＨ_４−１１；
［Ｎｌｅ^４，Ｄ−Ｐｈｅ^７，Ｄ−Ｔｒｐ^９］−α−ＭＳＨ_４−ｌｌ；および
［Ｎｌｅ^４，Ｄ−Ｐｈｅ^７］−α−ＭＳＨ_４−９；からなる群から選択した直鎖状α−ＭＳＨ類似体（ルビーら（Ｈｒｕｂｙ　ｅｔ　ａｌ．）の米国特許第４，９１８，０５５号、前掲、参照）；および
【００６７】
（ｇ）一般式：
【化１】

を有するα−ＭＳＨの環状架橋類似体であって、
式中、
ＡＡ^５は、側鎖にオメガアミノ基またはカルボキシル基を有するＬ−またはＤ−アミノ酸、例えば、α，γ−ジアミノプロピオン酸、α，γ−ジアミノ酪酸、Ｏｒｎ、Ｌｙｓ、α，β−アミノアジピン酸、α−アミノピメリン酸、またはより高級なホモログ、ＧｌｕまたはＡｓｐであってよく；
ＡＡ^１０は、ジアミノプロピオン酸、α，γ−ジアミノ酪酸、Ｏｒｎ、Ｌｙｓ、α，β−アミノアジピン酸、α−アミノピメリン酸、またはより高級なホモログ、ＧｌｕまたはＡｓｐであってよく；
Ｒ_１はα−ＭＳＨ_１−１３ＮＨ_２、α−ＭＳＨ_１−１２ＮＨ_２、α−ＭＳＨ_１−１１ＮＨ_２、α−ＭＳＨ_４−１３ＮＨ_２、またはα−ＭＳＨ_４−１０ＮＨ_２を表し；
ＡＡ^１１は、側鎖にオメガアミノ基またはカルボキシル基を有するＬ−またはＤ−アミノ酸例えば、α，β−ジアミノプロピオン酸、α，γ−ジアミノ酪酸、Ｏｒｎ、Ｌｙｓ、α−アミノアジピン酸、α−アミノピメリン酸、またはより高級なホモログ、ＧｌｕまたはＡｓｐであってよく；
Ｒ_２はα−ＭＳＨ_１−１３ＮＨ_２、α−ＭＳＨ_１−１２ＮＨ_２、α−ＭＳＨ_１−１１ＮＨ_２、α−ＭＳＨ_４−１３ＮＨ_２、またはα−ＭＳＨ_４−１０ＮＨ_２を表し；
Ｘｘｘは、それぞれがＬ−またはＤ−立体配置の１から５個のａ−アミノ酸残基または直鎖もしくは分岐鎖スペーサであってよい；
α−ＭＳＨの環状架橋類似体（ハドリーら（Ｈａｄｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ．）の米国特許第５，６８３，９８１号、前掲、参照）。
【００６８】
α−ＭＳＨアンタゴニストとして特に有用でありうるＭＳＨ類似体（ルビーら（Ｈｒｕｂｙ　ｅｔ　ａｌ．）の米国特許第４，６４９，１９１号、前掲、参照）には、
（ａ）一般式：
【００６９】
【化２】

を有する環状類似体（ハドリーら（Ｈａｄｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ．）の米国特許第５，７３１，４０８号、前掲、参照）と、
（ｂ）（１）一般式：
【００７０】
【化３】

（式中、Ｒ^１は置換または非置換の芳香族基であり；
Ｒ^２は水素またはメチル基であり；
Ｒ^３はカルボン酸、カルボキサミド、ヒドロキシメチルまたはアルデヒド基であり；
Ｒ^４はグルタミン酸、アラニン、アミノ酪酸、バリン、ロイシンまたはイソロイシンであり；
Ｒ^５はヒスチジン、グルタミン酸、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンであり；
Ｒ^６およびＲ^７は、同じであっても異なっていてもよく、水素、メチルまたは１〜５個の炭素原子を有する低級アルキルであり；
Ｒ^８およびＲ^９、同じであっても異なっていてもよく、水素、メチルまたは１〜５個の炭素原子を有する低級アルキルであり；
ＸおよびＹはイオウ、メチレン、ＳＯまたはＳＯ_２であり；
Ｚは−ＮＨ_２、
【００７１】
【化４】

であり；
ｎは２以上の整数である）；または
（２）一般式：
【００７２】
【化５】

（式中、
Ｒ^１はフェニル、インドール、ｐ−ヒドロキシフェニル、ｐ−アミノフェニル、イミダゾール、１−ナフチルアダマンチルまたはアルキルフェニル、２−ナフチルであり；
Ｒ^２は水素またはメチル基であり；
Ｒ^３はカルボン酸、カルボキサミド、ヒドロキシメチルまたはアルデヒド基であり；
ＸおよびＹはイオウ、メチレン、ＳＯまたはＳＯ_２であり；
Ｚは−ＮＨ_２、
【００７３】
【化６】

であり；
ｎは２以上の整数であり；この化合物の環化部分はこの化合物と中枢神経系の受容体との反応性に適するように立体配座が制限されている）と
を有する環状類似体（ルビーら（Ｈｒｕｂｙ　ｅｔ　ａｌ．）の米国特許第４，６４９，１９１号、前掲、参照）を含むが、これらに限定されるものではない。
【００７４】
本発明の一態様では、ＭＳＨアゴニストまたはアンタゴニストとして有用な化合物は、抗体またはその抗原結合断片である。一態様において、抗体は、受容体が活性化されるように選択的にＭＳＨ受容体に結合し、したがって、そのような抗体はＭＳＨアゴニストとみなされる。別の実施形態では、抗体は、天然または合成アゴニストリガンドの受容体への結合を妨げるかあるいは受容体の活性化を阻害するように選択的にＭＳＨ受容体に結合し、そのような抗体はＭＳＨアンタゴニストである。代替的に、ＭＳＨアンタゴニスト抗体は、ＭＳＨアゴニストの受容体への結合を阻止または阻害するか、かつ／またはＭＳＨアゴニストが血流中から除去されるように、ＭＳＨアゴニストに結合し得る。本願明細書で使用する場合、句「選択的に結合する」とは、１つのタンパク質が別のタンパク質（例えば、抗体、その断片、または抗原に対する結合パートナー）と特異的に結合し、任意の標準アッセイ（例えば、イムノアッセイ）で測定したその結合のレベルがアッセイのバックグラウンド対照より統計学的に有意に高いことを指す。例えば、イムノアッセイを実施する場合、対照は一般に抗体または抗原結合断片のみを含んだ（すなわち、抗原は含まない）反応ウェル／管からなり、抗原の存在しないときの抗体またはその抗原結合断片による反応性（例えば、ウェルへの非特異的な結合）の量をバックグラウンドとみなす。結合は、エンザイムイムノアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）、イムノブロットアッセイなどを含む当該技術分野で標準的な様々な方法を使用して測定し得る。
【００７５】
本発明の単離抗体には、そのような抗体または様々な程度に精製してある抗体を含む血清を含み得る。本発明の全抗体はポリクローナル、モノクローナル、１価または２価とすることが可能である。あるいは、１つまたは複数の抗体ドメインがトランケートされたまたは存在しない抗原結合断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ）_２断片）などの全抗体の機能性等価物、ならびに単鎖抗体または複数のエピトープに結合し得る抗体（例えば、二重特異性抗体）あるいは１つまたは複数の異なる抗原に結合し得る抗体（例えば、二重特異性または多重特異性抗体）を含む遺伝子組換え抗体またはその抗原結合断片も本発明に使用することが可能である。
【００７６】
本発明の遺伝子組換え抗体には、抗体の可変領域および／または定常領域をコードするＤＮＡの操作および再発現を含む標準的な組換えＤＮＡ技術により作製されるものが含まれる。具体的な例には、抗体のＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌドメインが抗体の残りの部分と源を異にするキメラ抗体、および少なくとも１つのＣＤＲ配列および任意選択で少なくとも１つの可変領域枠組みアミノ酸が１つの源に由来し、可変領域および定常領域（適当な場合）の残りの部分は他の源に由来するＣＤＲグラフト抗体（およびその抗原結合断片）が含まれる。キメラ抗体およびＣＤＲグラフト抗体の構築については、例えば、欧州特許出願公開公報ＥＰ−Ａ０１９４２７６、ＥＰ−Ａ０２３９４００、ＥＰ−Ａ０４５１２１６およびＥＰ−Ａ０４６０６１７に記載されている。
【００７７】
一般に、抗体の作製では、例えば、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、マウス、ラット、ニワトリなどを含むがこれらには限定されない適当な実験動物を、所望の抗体に対する抗原に曝露する。一般に、動物に注射した有効量の抗原で動物は免疫感作される。有効量の抗原とは、動物で抗体産生を誘導するのに必要な量を指す。次いで、動物の免疫系を所定の時間にわたり応答させる。免疫系の抗原に対する抗体の産生が認められるまで、免疫感作プロセスを繰り返す。抗原に特異的なポリクローナル抗体を得るためには、所望の抗体を含む動物から血清を採取する（ニワトリでは抗体は卵から採取し得る）。そのような血清は試薬として有用である。ポリクローナル抗体は、例えば、血清を硫酸アンモニウムで処理することにより、血清（または卵）からさらに精製し得る。
【００７８】
モノクローナル抗体はコーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、Ｎａｔｕｒｅ第２５６巻、４９５〜４９７ページ（１９７５）の方法で作製し得る。例えば、免疫感作した動物の脾臓（または任意の好適な組織）からＢリンパ球を回収し、次いで、骨髄腫細胞に融合させ、好適な培地中で連続培養し得るハイブリドーマ細胞の集団を得る。所望の抗体を産生するハイブリドーマを、ハイブリドーマが産生した抗体の所望の抗原への結合能を調べることにより選択する。
【００７９】
当業者には容易に理解されるように、例えばファージディスプレイ技術を使用する別の方法（例えば、米国特許第５９６９１０８号、米国特許第５５６５３３２号、米国特許第５８７１９０７号、米国特許第５８５８６５７号参照）または米国特許第５６２７０５２号の選択リンパ球抗体法も、本発明の抗体および／または抗原断片の作製に使用し得る。
【００８０】
本発明は、本発明のＭＳＨまたはＭＳＨ受容体に特異的に結合し、適切にこれを活性化または阻害するように設計された、ときに結合パートナーとも呼ばれる非抗体ポリペプチドにまで及ぶ。所定のリガンド特異性を有するそのようなポリペプチドの設計の例は、ベステら（Ｂｅｓｔｅ　ｅｔ　ａｌ．）が記載しており（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第９６巻、１８９８〜１９０３ページ（１９９９））、その全体を本願明細書に援用する。
【００８１】
本発明の別の態様では、ＭＳＨアンタゴニストとして有用な化合物は可溶性のＭＳＨ受容体（例えば、受容体の単離細胞外部分またはＭＳＨアゴニストに結合する部分または断片）である。米国特許第５，９０８，６０９号および第５，９３２，７７９号に開示されているように、各受容体のクローニングおよび特性付けが記載されており：ＭＣ１−ＲおよびＭＣ２−Ｒ（マウントジョイ（Ｍｏｕｎｔｊｏｙ）、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２５７巻、１２４８〜１２５１ページ；チャラニおよびウィクバーグ（Ｃｈｈａｊｌａｎｉ＆Ｗｉｋｂｅｒｇ）、１９９２、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．第３０９巻、４１７〜４２０ページ）；ＭＣ３−Ｒ（ロゼリ・レーファスら（Ｒｏｓｅｌｌｉ−Ｒｅｈｆｕｓｓ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第９０巻、８８５６〜８８６０ページ；ガンズら（Ｇａｎｔｚ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６８巻、８２４６〜８２５０ページ）；ＭＣ４−Ｒ（ガンズら（Ｇａｎｔｚ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９３、Ｊ　Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６８巻、１５１７４〜１５１７９ページ；マウントジョイら（Ｍｏｕｎｔｊｏｙ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９４、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏ．、第８巻、１２９８〜１３０８ページ）；およびＭＣ５−Ｒ（チャラニら（Ｃｈｈａｊｌａｎｉ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９３、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、第１９５巻、８６６〜８７３ページ；ガンズら（Ｇａｎｔｚ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９４、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、第２００巻、１２１４〜１２２０ページ）、それぞれの全体を本願明細書に援用する。したがって、上記各配列を使用して、本願明細書に記載の方法に使用するメラノコルチン受容体の１つまたは可溶性受容体部分を発現する細胞および細胞株を操作することが可能である。
【００８２】
本発明によれば、ペプチドおよびその類似体を含む単離または生物学的に純粋なタンパク質は、天然の環境から取り出したタンパク質である。したがって、「単離」および「生物学的に純粋な」は必ずしも、タンパク質が精製された程度を反映していない。本発明の単離タンパク質は天然源から得てもよいし、組換えＤＮＡ技術を使用して作製してもよいし、あるいは化学合成により作製してもよい。そのような方法は下記に詳述する。用語「（１つの）実体（ａまたはａｎ　ｅｎｔｉｔｙ）」とは、１つまたは複数のその実体を意味し、例えば、（１つの）化合物（ａ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ）とは、１つまたは複数の化合物あるいは少なくとも１つの化合物を指す。したがって、用語「ａ」または「ａｎ」、「１つまたは複数」および「少なくとも１つ」は本願明細書では互換的に使用し得る。また、用語「からなる、備える、有する、含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇおよびｈａｖｉｎｇ）は互換的に使用し得る。さらに、「からなる群から選択した」化合物とは、２つ以上の化合物の混合物（すなわち組合せ）を含む、以下のリストに挙げられた化合物の１つまたは複数のものを指す。
【００８３】
インスリン抵抗性の誘導に有用な化合物（すなわち、ＭＳＨ生物活性を有する化合物）および／または本発明の方法でインスリン抵抗性を低下させる能力を評価するのに有用な化合物は、ペプチドおよび／または非ペプチドミメティック、特にＰｏｍｃペプチドまたは非ペプチドミメティックに適した任意の方法で作製し得る。例えば、そのような方法には、溶液または固相ペプチド合成、または従来の溶液法で結合させたタンパク質断片からの溶液中での半合成などの、周知の化学的手順を含む。そのような方法は当該技術分野でよく知られており、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）、１９９７、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．第２８９巻、３〜１３ページ；ウェイドら（Ｗａｄｅ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９３、Ａｕｓｔｒａｌａｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．第３巻第６号、３３２〜３３６ページ；ワングら（Ｗｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９１、Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ第４７巻第１１〜１２号、１１２３〜１１２９ページ；カリーら（Ｃａｒｅｙ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９１、Ｃｉｂａ　Ｆｏｕｎｄ　Ｓｙｍｐ．第１５８巻、１８７〜２０３ページ；プラウら（Ｐｌａｕｅ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９０、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ第１８巻第３号、１４７〜１５７ページ；ボダンスキー（Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ）、１９８５、Ｉｎｔ．Ｊ　Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ．第２５巻第５号、４４９〜４７４ページ；またはエイチ　ダガスおよびシー　ペニー（Ｈ．Ｄｕｇａｓ　ａｎｄ　Ｃ．Ｐｅｎｎｅｙ）、ＢＩＯＯＲＧＡＮＩＣ　ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、（１９８１）５４〜９２ページなどの、この分野の一般的なテキストや論文に見出すことができ、これらはすべてその全体を本願明細書に援用する。例えば、ペプチドを、市販のペプチド合成装置および製造業者から供給された合成サイクルを使用した固相法で合成し得る。当業者なら、ＦＭＯＣ法およびＴＦＡ／スカベンジャ・クリーベージ混合物を使用しても、固相合成を実施し得ることが理解される。例えばＭＳＨ類似体を合成する方法は、ルビー（Ｈｒｕｂｙ）の米国特許第４，６４９，１９１号、前掲、ルビーら（Ｈｒｕｂｙ　ｅｔ　ａｌ．）の米国特許第４，９１８，０５５号、前掲、ルビーら（Ｈｒｕｂｙ　ｅｔ　ａｌ．）の米国特許第５，６７４，８３９号、前掲、ハドリーら（Ｈａｄｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ．）の米国特許第５，６８３，９８１号、前掲、ルビーら（Ｈｒｕｂｙ　ｅｔ　ａｌ．）の米国特許第５，７１４，５７６号、前掲、およびルビーら（Ｈｒｕｂｙ　ｅｔ　ａｌ．）の米国特許第５，７３１，４０８号、前掲に詳述されており、これらはすべてその全体を本願明細書に援用する。
【００８４】
大量のＰｏｍｃペプチドが望まれる場合には、ペプチド（またはそのペプチド類似体）は組換えＤＮＡ技術を使用しても生産できるが、この小さなサイズのタンパク質（すなわちペプチド）ではペプチド合成が通常はより好ましい。ペプチドは、ペプチドを生産するのに有効な条件下で、ペプチドを発現し得る細胞を培養し（すなわち、このペプチドをコードする組換え核酸分子を発現させ）、ペプチドを回収することにより組換えにより生産し得る。そのような技術は当該技術分野でよく知られており、例えば、サムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．）前掲に記載されている。
【００８５】
本発明の方法を実施するに際して、評価すべきまたは治療の目的で投与すべき、少なくとも１つのＭＳＨの生物活性を有する化合物または少なくとも１つの制御化合物をある量で、単独で、あるいは医薬として許容される塩と組み合わせて、かつ／または他の好適な担体（下記）と複合体にして含む、製剤を調製することが、必須ではないが有用である。そのような製剤は、非経口投与および経皮投与を含むがこれらに限定されない任意の投与経路用に製剤し得る。例えば、評価すべき製剤は、治療すべき動物が耐容できる賦形剤で製剤し得る。そのような賦形剤の例には、水、食塩水、リン酸緩衝溶液、リンガー溶液、デキストロース溶液、ハンクス溶液、ポリエチレングリコールを含む生理的に平衡な塩溶液、および他の生理的に平衡な塩の水溶液が含まれる。固定油、ゴマ油、オレイン酸エチル、トリグリセリドなどの非水性ベヒクルも使用し得る。
【００８６】
１つまたは複数の所望の化合物を含む製剤は、好ましくは可溶性の形で、活性化合物を一般に約０．１重量％〜９０重量％、より一般的には約０．１重量％〜１．０重量％含む。
【００８７】
本発明の一実施形態では、医薬として許容される担体には、投与した動物で製剤の半減期を延長させる別な化合物を含み得る。好適な担体には、放出制御ポリマーベヒクル、生分解性インプラント、リポソーム、細菌、ウイルス、他の細胞、油、エステルおよびグリコールが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００８８】
本発明の一実施形態では、製剤は、動物に製剤を徐放し得る放出制御組成物を含み得る。本願明細書で使用する放出制御組成物は、放出制御ベヒクル中に、本願明細書に記載の評価すべき制御化合物を含む。好適な放出制御ベヒクルには、生体適合性ポリマー、ポリマーマトリクス、カプセル、マイクロカプセル、マイクロ粒子、ボーラス製剤、浸透圧ポンプ、拡散デバイス、リポソーム、リポスフェア、経皮送達系を含むが、これらに限定されるものではない。本発明の他の放出制御組成物には、動物に投与する際に、インサイチュで固体またはゲルを形成する液体が含まれる。好ましい放出制御組成物は生分解（すなわち、生体分解性）である。
【００８９】
本発明によれば、有効な投与プロトコール（すなわち、有効な様式で、制御化合物またはそのような化合物からなる製剤を投与すること）は、動物に無毒であって、好適な期間にわたり１回または複数回投与したときに動物のインスリン抵抗性（または感受性）をかなり変化させると正当に予期される好適な用量パラメータおよび投与様式を含む。本発明の遺伝子改変した非ヒト動物でインスリン抵抗性を調節する化合物の能力を評価するための、好適な用量および投与プロトコールを作成することは、十分当業者に可能である。有効な用量パラメータは、特定の動物および状態のために、当該技術分野で標準的な方法を使用して決定することが可能である。そのような方法には、例えば、化合物の投与に伴う生存率、副作用（すなわち毒性）および他の健康上の要因の決定が含まれる。
【００９０】
本発明の化合物または製剤の投与様式には、動物、特に動物の組織内のメラノコルチン受容体に組成物を送達する任意の投与方法が含まれる。そのような投与様式には、経口、経鼻、局所、経皮、直腸内および非経口経路が含まれるが、これらに限定されるものではない。非経口経路には、皮下、皮内、静脈内、腹腔内および筋肉内経路が含まれるが、これらに限定されるものではない。一実施形態では、投与経路は、ローション、クリーム、パッチ、注射およびインプラントデバイス（例えば、ノルプラント（Ｎｏｒｐｌａｎｔ）と同様なもの）、あるいは他の放出制御担体によるなど、局所または経皮投与によるものである。
【００９１】
化合物または製剤を、評価すべきペプチド化合物をコードする核酸分子の形で患者に送達する場合、核酸分子は、（ａ）裸の（すなわちウイルスコートまたは細胞膜にパッケージされていない）核酸分子（例えば、ウォルフら（Ｗｏｌｆｆ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ第２４７巻、１４６５〜１４６８ページに教示されたものなどの、裸のＤＮＡまたはＲＮＡ分子）を投与すること；（ｂ）組換えウイルスとしてリポソーム送達ベヒクル中または組換え細胞（すなわち核酸分子をウイルスまたは細胞ベヒクルで送達する）にパッケージした核酸分子を投与すること；あるいは（ｃ）リポソーム送達ベヒクルに封入した組換え核酸分子を投与すること；を含むが、これらに限定されるものではない様々な方法で患者に送達し得る。
【００９２】
本発明の化合物を同定する方法の最後の工程は、工程（ｂ）の化合物が存在しないときと比べて非ヒト動物でインスリン抵抗性を低下させる工程（ｂ）からの化合物を選択する工程である。本発明者らは、ＭＳＨの投与により、本発明の遺伝子改変したＰＯＭＣヌル変異体でインスリン抵抗性を誘導し得ることを発見したため、この作用を妨げるかまたは逆転させる能力を有する化合物を選択し得る。インスリン抵抗性（または感受性）は、インスリン負荷試験中の血糖値の測定（例えば、実施例２参照）、または本願明細書に上記の他の好適な方法を含むが、これらに限定されない、当該技術分野で公知の任意の好適な方法で測定し得る。インスリン抵抗性に関連する生物学的プロセスを測定または評価する他の方法は、形態分析により膵臓のβ細胞量について、およびインビボでのグルコースで刺激されたインスリンの放出を分析することによりβ細胞の機能について、変異株をアッセイすること；変異株由来の筋肉、脂肪組織および肝臓のインスリン受容体を、組織膜上の数、結合親和性、チロシンキナーゼ活性およびリン酸化の状態についてアッセイすること；ならびにＩＲＳ−１およびＩＲＳ−２のリン酸化、ＰＥＰＣＫ、ＰＩ３キナーゼ、ＭＡＰキナーゼの活性化と、ＴＮＦ−α、ＰＴＰ−１ＢおよびＰＰＡＲγの発現を決定することによりインスリン受容体シグナリング経路を分析すること；を含むが、これらに限定されるものではない。ＭＳＨの生物活性を有する化合物を投与することにより誘導されるインスリン抵抗性を減少させるかまたは防ぐ（すなわち、制御化合物の存在しない場合と比べて）制御化合物を、肥満動物および／またはＩＩ型糖尿病を有する動物などの、インスリン抵抗性を有する動物でインスリン抵抗性を低下させる能力を有する制御化合物として選択する。本発明の方法に使用し得る別の調節は、ヘテロ接合性Ｐｏｍｃ変異体および野生型マウスを含み、制御化合物がｐｏｍｃ座、特にＭＳＨの作用に関係することを確認するために使用し得る。
【００９３】
本発明の別の実施形態は、哺乳類のインスリン抵抗性を低下させるかまたは哺乳類の糖尿病を予防または治療する方法に関し、そのような方法は、インスリン抵抗性を有する哺乳類に、メラノコルチン刺激ホルモン（ＭＳＨ）生物活性に対するアンタゴニストを含む治療用組成物を投与することからなり、該アンタゴニストは前記哺乳類のインスリン抵抗性を低下させる。本願明細書ではこれまで、インスリン抵抗性およびインスリン抵抗性の測定方法について述べてきた。本発明によれば、患者の「インスリン抵抗性を低下させる」という句は、以前のインスリン抵抗性のレベル、またはその患者もしくは種、年齢、人種、またはその他の要因に基づく一般的な患者に対して確立されている標準対照レベルと比べて検出可能な任意のインスリン抵抗性の低下を指す。インスリン抵抗性に関連する障害（例えば、ＩＩ型糖尿病）などの障害を「治療する」とは、障害を有する患者の障害を低減または改善することを意味し、障害を「予防する」とは、障害が顕性化する前に、障害に罹るリスクを有する患者で障害を止めることを指す。好ましくは、障害または障害を発症する可能性を、最適には、患者がその障害（例えば、過剰な脂肪の蓄積が脂肪組織に貯蔵される）またはその状態に伴う不快なかつ／もしくは変化した機能および有害な状態にならないまたはそれを発症しなくなる程度まで、低減させる。
【００９４】
本発明の方法は、メラノコルチン刺激ホルモン（ＭＳＨ）生物活性に対するアンタゴニストの使用を含む。ＭＳＨ生物活性に対するアンタゴニストについては本願明細書に既に詳述しており、タンパク質、ペプチド、核酸、抗体またはその抗原結合断片、炭水化物をベースとする化合物、脂質をベースとする化合物、天然の有機化合物、合成により得られた有機化合物、可溶性ＭＳＨ受容体、あるいは（例えば、受容体または受容体に対する天然もしくは合成のアゴニストのいずれかに結合することにより）受容体に選択的に結合して、天然もしくは合成のアゴニストリガンドの受容体へのアクセスを阻止するかまたはＭＳＨ受容体の活性を低下させるもしくは阻害する他の化合物（例えば、薬剤設計の任意の医薬品）；あるいは受容体をブロックするかまたは受容体の生物活性を変化させる薬剤設計の医薬品を含むが、これらに限定されるものではない。好ましくは、ＭＳＨ生物活性に対するアンタゴニストである化合物を単独で、または、患者が糖尿病である場合には、インスリン抵抗性を低下させるかまたは糖尿病を治療するのに有用な１つまたは複数の追加の化合物と組み合わせて含む治療用組成物を、その組成物が動物の血流中に残存する時間を延長させるように投与するよう処方する。したがって、本発明の治療用組成物は一般に、医薬として許容される担体、好ましくは、本発明の組成物を動物のメラノコルチン受容体に送達し得、ある場合には、動物の血流中での組成物の作用を延長し得る担体を含む。
【００９５】
例えば、本発明の治療用組成物（すなわち製剤）は、治療すべき動物が耐容できる賦形剤で製剤し得る。そのような賦形剤の例には、水、食塩水、リン酸緩衝溶液、リンガー液、デキストロース溶液、ハンクス溶液、ポリエチレングリコールを含有する生理的に平衡な塩溶液、および他の水性の生理的に平衡な塩溶液が含まれる。固定油、ゴマ油、オレイン酸エチル、トリグリセリドなどの非水性ベヒクルも使用し得る。他の有用な製剤には、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、デキストランなどの粘度増強剤を含む懸濁液が含まれる。賦形剤は、等張性および化学的安定性を増強する物質やバッファなどの添加剤を微量に含むことが可能である。バッファの例には、リン酸バッファ、重炭酸バッファ、トリスバッファが含まれ、保存料の例には、チメロサール、ｍまたはｏ−クレゾール、ホルマリンおよびベンジルアルコールが含まれる。標準的な製剤は、注射用の液体か、または注射用の懸濁液もしくは溶液として好適な液体に入れることが可能な固体かのいずれかとすることが可能である。したがって、非液体製剤では、賦形剤は、デキストロース、ヒト血清アルブミン、保存料などからなることが可能であり、これに、投与前に、滅菌した水または食塩水を加えることが可能である。
【００９６】
好ましい徐放性組成物については本願明細書にすでに述べた。
１種または複数の所望の化合物からなる組成物は、好ましくは可溶性の形で、活性化合物を一般に約０．１重量％から９０重量％、より好ましくは、約０．１重量％から約５０重量％、さらに好ましくは約０．１重量％から約２５重量％、さらに好ましくは約０．１重量％から約１０重量％、さらに好ましくは約０．１重量％から１．０重量％含む。
【００９７】
本発明の一態様では、経皮パッチを使用して本発明の治療用組成物を送達し得る。そのようなパッチは、皮膚の表皮表面を横切り、末梢循環に入る化合物の送達（すなわち、移動）を増強するための追加の化合物（例えばＤＭＳＯ）を含み得る。
【００９８】
本発明の好ましい放出制御組成物は、毒性パラメータに基づいて数日から数カ月の期間にわたってインスリン抵抗性を低下させる製剤の治療レベルを維持するのに十分な一定の速度で、本発明の製剤を動物の血中に放出し得る。本発明の放出制御型製剤は、好ましくは少なくとも約６時間、より好ましくは少なくとも約２４時間、さらに好ましくは少なくとも７日間にわたり、インスリン抵抗性を制御し得る。
【００９９】
本発明によれば、有効な投与プロトコール（すなわち、ＭＳＨ生物活性に対するアンタゴニストである化合物またはそのような化合物を含む治療用組成物を有効な方法で投与すること）は、好適な期間にわたって１回または複数回投与したときに、動物でインスリン抵抗性を制御する、好適な用量パラメータおよび投与様式からなる。一実施形態では、有効な投与プロトコールにより、ＭＳＨアンタゴニスト化合物の初回投与後の少なくとも約２週間以内に、より好ましくは少なくとも１週間以内に、より好ましくは少なくとも３日以内に、さらに好ましくはＭＳＨアンタゴニスト化合物の初回投与の少なくとも２４時間以内に、動物でインスリン抵抗性の測定可能な低下が得られる。
【０１００】
有効な用量パラメータは、特定の動物および状態に対して、当該技術分野で標準的な方法を使用して決定することが可能である。そのような方法には、例えば、動物でのインスリン抵抗性の制御に関連するかまたはそれに追加される生存率、副作用（すなわち、毒性）および他の健康上の要因の決定が含まれる。特に、インスリン抵抗性の調節に使用するときの本発明の治療用組成物の用量パラメータの有効性は、反応率を評価することによって決定し得る。そのような反応率とは、患者集団中でインスリン抵抗性の検出可能な低下として反応した治療患者の割合、または治療開始前の患者のインスリンに対する反応の以前の測定値と比べて、特定の患者の要求に応えることおよび／または患者が健康上のリスクを生じないことに十分であると当業者がみなすレベルまでの各患者のインスリンに対する反応を意味し得る。反応は、例えば、経時的にインスリン抵抗性／感受性を測定することおよび／またはインスリン機能の他の指標、例えば、β細胞量、インスリン受容体数および／または機能などの変化を測定することによって決定し得る。
【０１０１】
本発明の治療用組成物の投与様式には、動物の末梢循環または中枢循環に組成物を送達する任意の投与方法が含まれる。そのような投与様式は、経口、経鼻、局所、経皮、直腸内、および非経口経路、ならびに組織への直接注射やカテーテルによる送達を含み得るが、これらに限定されるものではない。非経口経路には、皮下、皮内、静脈内、腹腔内および筋肉内経路が含まれ得る。一実施形態では、投与経路は、ローション、クリーム、パッチ、注射、インプラントデバイス（例えば、ノルプラント（Ｎｏｒｐｌａｎｔ）と同様なもの）、あるいは他の放出制御担体によるなど、局所または経皮投与によるものである。好ましい投与経路には、経皮送達およびインプラントデバイスまたは他の放出制御担体を介した送達が含まれる。特に好ましい投与経路には、任意の非経口経路を含む、全身循環に組成物を直接送達する（例えば、注射による）任意の経路が含まれる。当業者は、投与経路、薬剤担体もしくは賦形剤、および投与量に関して本願明細書中に提供したガイダンスを使用して、例えば、皮膚疾患（例えば、ビタリゴ（ｖｉｔａｌｉｇｏ）または皮膚炎）の治療用に使用するＭＳＨについて既に記載されている真皮組織への組成物の単なる送達とは異なり、本発明の組成物をメラノコルチン受容体に送達して、動物でインスリン抵抗性に作用する投与プロトコールを選択することができることに留意する。ＭＳＨおよびその類似体の局所および経皮送達については本発明に先だって記載されている（例えば、ノードランド（Ｎｏｒｄｌｕｎｄ）の米国特許第４，８７４，７４４号またはルビーら（Ｈｒｕｂｙ　ｅｔ　ａｌ．）の米国特許第４，６４９，１９１号）が、そのような方法は、真皮での疾患の治療を対象としており、したがって、そのような方法は、皮膚の真皮にＭＳＨを送達するのに適した投与量プロトコール、担体および投与方法を教示しているが、インスリン抵抗性およびそれに伴う糖尿病の予防および／または治療のためのＭＳＨアゴニストの送達に適した投与量、担体および／または投与方法は記載していなかった。例えば、これらの方法は典型的に、本発明の方法で顕著な効果が得られることが期待される濃度よりかなり低いＭＳＨの濃度範囲（例えば１０^−１０、１０^−１１）を示唆していた。
【０１０２】
本発明によれば、好適または有効な単回投与量は、好適な期間にわたり１回または複数回投与したときに、患者のインスリン抵抗性／感受性の測定できる変化（例えば、インスリン感受性の低下）を引き起こし得る投与量である。好適または有効な単回投与量は、好適な期間にわたって１回または複数回投与したときに、治療開始前に得られたインスリン抵抗性の測定値と比べて、患者のインスリン抵抗性の測定可能な変化を引き起こし得る投与量とすることも可能である。投与量は、インスリン抵抗性の重症度、患者が顕性糖尿病を有しているかいないか、および／または特定の患者が経験した任意の他の関連したまたは関連しない健康上の要素を含む、治療中の患者の状態によって変化し得る。典型的に、本発明の方法は、患者の体重１ｋｇ当たり約０．１μｇから約１００ｍｇ、好ましくは患者の体重１ｋｇ当たり約０．１μｇから約１０ｍｇ、より好ましくは患者の体重１ｋｇ当たり約０．１μｇから約１μｇ、より好ましくは患者の体重１ｋｇ当たり約１μｇから約１０ｍｇの投与量でＭＳＨアンタゴニスト活性を有する化合物を投与することからなる。より好ましい単回投与量は患者の体重１ｋｇ当たり約４０μｇから約１ｍｇである。ヒト成人（すなわち、７５ｋｇのヒト）の典型的な１日投与量は、約１ミリグラムから約１００ミリグラムである。投与経路に関わらず、患者で達成する化合物の好ましい循環量は、患者の体重１ｋｇ当たり約０．１μｇから患者の体重１ｋｇ当たり約１０μｇ、より好ましくは、患者の体重１ｋｇ当たり約０．１μｇから体重１ｋｇ当たり約１０μｇ、より好ましくは体重１ｋｇ当たり約０．１μｇから体重１ｋｇ当たり約１μｇである。この方法の実施に際し、この化合物またはこの化合物を含む治療用組成物は１日当たり１回または複数回で投与し得る。この治療法では、長期にわたる投与が必要とされることがある。投与量当たりの量または投与する総量は、医師が決定し、患者の体重、患者の年齢および全般的健康状態、化合物に対する患者の耐容性などの要因によって異なる。
【０１０３】
本発明の方法では、ＭＳＨのアゴニストおよびアンタゴニストを含む治療用化合物ならびにそのような化合物からなる組成物を、任意の生物、特に霊長類、齧歯類、家畜類および家庭用ペットを含むがこれらに限定されない脊椎動物門哺乳類の任意のメンバーに投与し得る。家畜類には、食用にされる哺乳類および有用な製品を作り出す哺乳類（例えば、羊毛生産のためのヒツジ）が含まれる。治療する好ましい哺乳類はヒトである。好ましくは、本発明の方法を使用して治療する哺乳類は、インスリン抵抗性および／またはインスリン抵抗性を伴う糖尿病（例えば、インスリン非依存型糖尿病）を有しているか、その発症のリスクを有している。そのような個体を同定する方法および基準は当該技術分野で周知である。
【０１０４】
本発明によれば、句「ＩＩ型糖尿病」、「２型糖尿病」、「インスリン非依存型糖尿病」および「ＮＩＤＤＭ」は同じ状態を指す。ＮＩＤＤＭを有する個体は、診断時に典型的に体重が過剰であるか肥満しており、糖尿を示すがケトン尿は示さず、多尿症および多渇症は無いか軽度であり、体重の減少はほとんどまたはまったくない。２型糖尿病の検査は典型的に、血液試料を抜き取り、血中のグルコース（糖）の濃度を測定することから成る。無作為グルコース試験では、血液試料を任意の時点で採取し、検査し得る。正常な無作為グルコース濃度は７０〜１１０ｍｇ／ｄｌである。米国糖尿病学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）によると、２００ｍｇ／ｄｌを超えた無作為グルコース濃度は、糖尿病を示す。空腹時血糖試験では、少なくとも８時間（水以外の）飲食を行わなかった後に、血液試料を採取する。通常、朝食前の早朝に血液試料を取る。米国糖尿病学会によると、１２５ｍｇ／ｄｌを超える空腹時血糖値が２回得られると、糖尿病を示す。空腹時血糖試験は糖尿病の診断に使用される最も一般的な試験である。経口耐糖能試験では、最初に空腹時血糖を得る。次に、甘い砂糖を含んだ飲料を飲むように依頼される。次いで、次の２時間の間、３０分毎に血糖値を得る。２時間の時点で血糖値が１４０ｍｇ／ｄｌ未満であれば、正常とみなされる。２時間の時点で血糖値が２００ｍｇ／ｄｌを超えると糖尿病であることを示す。２時間の時点で血糖値が１４０〜２００ｍｇ／ｄｌであれば、耐糖能の何らかの障害を示す。
本発明の様々な態様を以下の実施例に示すが、これらの実施例は例示のためのものであって、本発明の範囲を限定する意図のものではない。
【０１０５】
（実施例）
実施例１
以下の実施例は本発明に使用するＰＯＭＣヌル変異マウスの作製について記載し、Ｐｏｍｃペプチドが中枢性メカニズムと末梢性メカニズムの両方を介して体重の制御に関連していることを示す。
【０１０６】
すべてのプロオピオメラノコルチン（Ｐｏｍｃ）由来のペプチドを欠いた変異マウス系統を作製するために、本発明者らは、第３エキソン全体をネオマイシン耐性カセットで置き換えたターゲティングベクターを設計した（ノタケら（（Ｎｏｔａｋｅ　ｅｔ　ａｌ．）１９８３年、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ第１５６巻６７〜７１ページ；その全体を本願明細書に援用する）。簡単に述べると、ＥｃｏＲＩ消化した１２９／ＳｖＥｖゲノムＤＮＡをラムダＦｉｘＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングした。得られたライブラリーを、マウスＰｏｍｃｌ配列のエキソン３からの０．３ｋｂのＰＣＲ断片でスクリーニングし、マウスＰｏｍｃｌ座を含む９．５ｋｂ断片を有するクローンを単離した。ターゲティングベクター用に、第３エキソンを含むＫｎｐＩ−ＰｓｔＩ断片を欠失させた。この結果、プレ−プロ−タンパク質の翻訳開始点の後のアミノ酸に対する４４個のコドン以外あるいはＰＯＭＣタンパク質のアミノ酸の最初の１８個のコドン以外がすべて除かれる。ターゲティングベクター（２０μｇ）を使用して、１０^７個のＲＷ４ＥＳ細胞（Ｇｅｎｏｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）をエレクトロポレーションした。（ホーガンら（Ｈｏｇａｎ　ｅｔ　ａｌ．）「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ」，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９９４））に記載のように、変異した対立遺伝子を相同的に組み込んだＥＳ細胞をＣ５７ＢＬ／６胚盤胞に注射した。キメラマウスを１２９／ＳｖＥｖＴａｃの雌と交配させた。ヘテロ接合性の子孫を交配させて、ホモ接合性の変異マウスを得た。サムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．）、前掲）記載のように、遺伝子型をＰＣＲで分析し、サザンブロット分析で確認した。
【０１０７】
図１Ａは、マウスＰｏｍｃ座の、ターゲティングベクター、および相同組換え後のＰｏｍｃ座の予想構造の概略図および制限地図を示す。０．４ｋｂのプローブ断片を野生型対立遺伝子の９．５ｋｂＥｃｏＲＩ断片および変異対立遺伝子の３．２ｋｇ断片にハイブリダイズする（図１Ｂも参照のこと）。示した制限部位はＥｃｏＲＩ（Ｅ）、ＫｐｎＩ（Ｋ）およびＰｓｔＩ（Ｐ）である。図１Ｂは、Ｆ_２の同腹仔からのテールＤＮＡのサザンブロット分析を示している。使用したプローブは０．４ｋｂのＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ断片である（図１Ａ参照）。図１Ｃは、Ｆ_２の雄性同腹仔の血清ＡＣＴＨ濃度のＲＩＡ分析を示している（測定は３回、各遺伝子型でマウス１匹で実施）（下記に詳述する）。
【０１０８】
欠失させたＰＯＭＣ対立遺伝子構築体をエレクトロポレーションで胚幹（ＥＳ）細胞に導入し、そこからマウスの生殖系列に導入して、株Ｐｏｍｃ^{ｔｍ２ｕｔｅ}を得た。この変異を近交系１２９／ＳｖＥｖバックグラウンドに戻し交雑すると、劣性変異について予想される頻度の４分の１の割合（野生型３９、ヘテロ接合体８０、変異体１０）でヘテロ接合性の親からホモ接合性Ｐｏｍｃ変異体が生まれ、胚由来Ｐｏｍｃペプチドのすべての同時欠損は動物のほんの一部でしか、出生前の発達の間の生存に適合しないことを示している。
【０１０９】
ＰＯＭＣヌルマウスの雌は妊性であり、ヘテロ接合性の子と野生型の子を満期まで孕むが、ＰＯＭＣヌルマウスの雄は生殖能力を有していない。ヘテロ接合性のＰＯＭＣの雄をホモ接合性のＰＯＭＣ変異体の雌と交配させると、ホモ接合性変異体の子孫は出生後２〜３時間以内に死亡するが、ヘテロ接合性変異体の子孫は死亡しない。
【０１１０】
出生後１カ月の間、ホモ接合性変異体は野生型の同腹仔と表面上は識別できない。２カ月目、Ｐｏｍｃペプチドを欠くマウスでは、可視的に体重が増加し始め、出生後３カ月目までに、その体重は野生型同腹仔の約２倍となる（図２Ａ；各遺伝子型について雄性マウスの体重を測定した；２カ月目、ｎ＝４、Ｐ＜０．０００５；３カ月目、ｎ＝３、Ｐ＜０．００５）。体重増加と共に、軽度であるが有意な体長の増加（図２Ｂ；３〜４カ月齢の雌性マウスで測定（鼻先から尾まで）、各遺伝子型６匹（Ｐ＜０．００１））と血清レプチン濃度の大きな上昇（図２Ｃ）の両方が認められる。後者の実験では、６〜８カ月齢の個々の雄性および雌性マウスの眼窩後方から採取した血液試料から、血清レプチン濃度を決定した（２回）。平均体重は、野生型マウスでは３０．９ｇ、ヘテロ接合体では３１．７ｇ、ホモ接合体では５５．９ｇであった。しかし、興味深いことに、ヘテロ接合性マウスでは血清レプチン濃度は上昇するが、体重増加は認められない。体重が正常なヘテロ結合体でレプチン濃度が上昇することは、レプチン濃度とＰｏｍｃペプチド濃度の間に恒常性バランスがあることを示唆している。Ｐｏｍｃペプチド濃度の低下はレプチンの上昇で補償される。そのような関係のメカニズムおよび重要性から、パラクリン・フィードバック・ループが示唆される。
【０１１１】
飼育用高脂肪餌で飼育したＰｏｍｃ変異マウスでは標準餌で飼育したマウスに比べて体重増加が速かったことも注目された。野生型および変異体の雌（試験群当たり３匹）は、標準餌または繁殖用餌（それぞれ、脂質４．５％および９％）のいずれかを無制限に摂取できるようにした。図２Ｄおよび２Ｅは１週間の体重の変化（２Ｄ）および摂餌量（２Ｅ）を示している。「高脂肪餌」群の摂餌量は３匹全部についてまとめて測定した。図２Ｄは、変異マウスでは高脂肪餌で標準餌に比べて１週間で体重増加が３グラム多かった（３．８ｇ対０．８ｇ）が、野生型マウスでは高脂肪餌で標準餌に比べて体重増加が０．２ｇ多かった（０．７ｇ対０．５ｇ）ことを示している。図２Ｅは、Ｐｏｍｃ変異体の摂餌量が高脂肪餌で２．４ｇ増加した（３０．３ｇ対３２．７ｇ）が、野生型同腹仔の摂餌量は高脂肪餌で２．２ｇ減少した（２３．５ｇ対２１．３ｇ）ことを示している。いずれの餌の状態でも、ＰＯＭＣを欠く変異マウスでは野生型同腹仔と比べて摂餌量が増加した。これらの結果は、ＰＯＭＣ由来のペプチドは摂餌および体の食物貯蔵のいずれをも媒介することを示唆している。野生型マウスは餌によって摂餌を制御しており、すなわち、高カロリーの供給物では摂餌量を減らし、体重を一定に保つよう代謝（食物の貯蔵対消費）を調節している。対照的に、ＰＯＭＣを欠くマウスでは、これらの点のいずれにも欠陥があり、その結果、体重が増加する。すなわち、摂餌量が増加し、食餌脂肪を異化する能力に欠けている。
【０１１２】
ＰＯＭＣヌル変異マウスと野生型マウスの間の別の目に見える違いは、変異マウスで黄色の色素沈着が認められることであり（データは示さず）、これは特に腹部で顕著である。メラノサイトのＭＣ１−Ｒは通常α−ＭＳＨで刺激され、ユーメラニン（黒／褐色）色素を合成する（バーチルら（Ｂｕｒｃｈｉｌｌ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８６年、Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．）。Ａ^ｙマウスで過剰発現されるアグーチ−シグナリングタンパク質（ＡＳＰ）によるＭＣ１−Ｒの拮抗作用により、全身に黄色の毛色が生じる（リューら（Ｌｕ　ｅｔ　ａｌ．）１９９４年、Ｎａｔｕｒｅ第３７１巻、７９９〜８０２ページ）。劣性の黄色マウス（ｅ／ｅ）（ロビンズら（Ｒｏｂｂｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９３年、Ｃｅｌｌ　第７２巻、８２７〜８３４ページ）およびウシ（ジョエルジら（Ｊｏｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９６年、Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ　第７巻、３１７〜３１８ページ）のＭｃｌｒ遺伝子での機能損失（ｌｏｓｓ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ）変異によりそれぞれ、黄色の毛色と赤色の毛色を生じる。ＰＯＭＣヌル変異を有するヒトの患者でも同様に、赤毛となる（クルドら（Ｋｒｕｄｅ　ｅｔ　ａｌ．）前掲）。ＰＯＭＣヌルマウスでは、色素沈着の変化はわずかであり、側部および腹部を覆う毛は野生型の同腹仔よりもより黄色く、背中の毛の先端は薄黄色である。変異体でのこれらの色素沈着の変化は成体期にはさらに顕著となる。マウスでは、リガンド（Ｐｏｍｃ）が欠損してもＭＣ１−Ｒの欠損または拮抗に一致する表現型は得られないということから、このメラノコルチン受容体に対しては別のリガンドが存在することが示唆される。あるいは、この結果は、受容体のリガンド非依存性の構成的活性があれば、説明することが可能である。
【０１１３】
次に、ＡＣＴＨの完全欠損が副腎機能に与える影響を決定した。血清コルチコステロン濃度（図３Ａ）は、６〜７カ月齢のマウス（野生型ｎ＝７、ヘテロ接合体ｎ＝６、変異体ｎ＝５）の眼窩後方から採取した血液試料からＲＩＡで測定した。血清アルドステロン濃度（図３Ｂ）は、７〜８カ月齢のマウス（野生型ｎ＝１、ヘテロ接合体ｎ＝２、変異体ｎ＝３）の体幹血液試料で測定した。血漿カテコールアミン濃度（図３Ｃ〜３Ｅ）は、７〜８カ月齢のマウス（野生型マウスｎ＝４、変異マウスｎ＝３）の体幹血液試料で測定した。
【０１１４】
図１Ｃは、Ｆ_２の雄性同腹仔の血清ＡＣＴＨ濃度のＲＩＡ分析（測定は３回、各表現型で１匹について実施）を示している。血液は眼窩後方より採取し、供給業者の指示に従って（アイシーエヌ（ＩＣＮ）、コルチコステロン；インクスター（ＩｎｃＳｔａｒ）、ＡＣＴＨ；リンコ（Ｌｉｎｃｏ）、レプチン）、血清をＲＩＡで分析した。図１Ｃは、変異動物のＡＣＴＨ濃度がそのアッセイの感度より低いことを示し、全Ｐｏｍｃペプチドのコード領域が欠失されていることを示している。
【０１１５】
採血中にマウスにかなりのストレスがあるにもかかわらず、血清コルチコステロンおよびアルドステロン濃度は検出限界より低く（図３Ａおよび３Ｂ）、副腎皮質の機能にはＰＯＭＣ由来のペプチドが絶対的に必要であることが示される。ここで、繰り返しになるが、ヘテロ接合体は遺伝子量効果を示し、Ｐｏｍｃペプチドによる微細に調整された制御を示唆している。血漿カテコールアミンの基礎濃度を測定すると（図３Ｃ〜３Ｅ）、エピネフリンはＰｏｍｃ変異体で野生型マウスより有意に低かった（図３Ｃ；ｐ＜０．００６）が、ノルエピネフリン濃度は有意には変わらず（図３Ｄ；ｐ＜０．２７）、ドーパミン濃度は野生型と比べて変異体でわずかに上昇していた（図３Ｅ；ｐ＜０．０６）。副腎髄質の機能不全の場合には、カテコールアミンを発現する他のクロム親和性組織で産生が上昇し、補償する。しかし、エピネフリンはほぼ副腎髄質でのみ産生される。エピネフリンの有意な減少は、ＰＯＭＣ欠損マウスに副腎髄質の重度の機能障害および／または欠損があることを示している。副腎を見つけるのは不可能であることが分かった。すなわち、変異マウスには肉眼で認められる副腎はなかった。組織学的分析のために、腎臓周囲の脂肪体から組織を採取し、直ちにホルマリンに入れた。切片（厚さ５μｍ）作製および染色は、アメリカン・ヒストラボ社，メリーランド州ガイサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）が実施した。腎臓周囲の副腎組織を含むと思われる脂肪体の組織学的検査により、未発達の副腎髄質または副腎皮質を連想させる組織の領域が明らかになった（データは示さず）。しかし、カテコールアミン合成の主要な酵素（ＰＮＭＴおよびＴＨ）に対する抗体による免疫組織化学染色は陰性であった（データは示さず）。
【０１１６】
ＰＯＭＣヌルマウスに正常な副腎構造がないことは、副腎の発達におけるＰＯＭＣ由来のペプチドの重要な役割を示している。下垂体起源のＰＯＭＣアドレノコルチコトロピン（ＡＣＴＨ）は副腎のＭＣ２−Ｒに対する唯一の公知のリガンドである。リガンド（ＡＣＴＨ）の損失によりこの受容体（ＭＣ２−Ｒ）を発現する組織がなくなることは驚くべきことである。理論に束縛されることなく、本発明者らは、ＡＣＴＨとは別のＰＯＭＣ因子が副腎の発達で栄養要素としての役割を果たして可能性が高いと考えている。候補ペプチドは、ＰＯＭＣのＮ末端非γ−ＭＳＨ（Ｎ−ＰＯＭＣ_１−２８、Ｎ−ＰＯＭＣ_２−５９）由来のペプチドであり、これらは副腎発達の生理的調節に関係していた（エスティバリズら（Ｅｓｔｉｖａｒｉｚ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８２年、Ｎａｔｕｒｅ第２９７巻、４１９〜４２２ページ）。このことは、候補ペプチドでＰＯＭＣヌルマウスを再構築することにより調べ得る。この時点で、副腎髄質の欠損がＰｏｍｃペプチド、副腎皮質構造、または副腎皮質因子（すなわちコルチコステロン）の欠損の結果であるかを決定することもできる。
【０１１７】
肥満、副腎機能不全および色素沈着の変化の表現型から、ＰＯＭＣヌルマウスは、ヒトＰＯＭＣヌル症候群のモデルとなる。ヒトＰＯＭＣ欠損患者およびマウスのＰｏｍｃ変異体では、ホモ接合体は正常範囲の体重および大きさで生まれてくる。ヒトについて報告された症例では、肥満は４〜５カ月から始まり（クルドら（Ｋｒｕｄｅ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９８年、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．第１９巻、１５５〜１５７ページ）、ＰＯＭＣヌルマウスでは１カ月で始まる。肥満のこの経時変化は、プロホルモン・プロセシング酵素であるカルポキシペプチダーゼを欠くｆａｔ／ｆａｔマウスで見られるものと同様である（ナガートら（Ｎａｇｇｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９５年、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．第１０巻、１３５〜１４２ページ）。ＰＯＭＣのプロセシングの欠陥により、ｆａｔ／ｆａｔ表現型の肥満成分を説明することが可能である。
【０１１８】
ヒトＰＯＭＣ欠損患者では、ＡＣＴＨの欠損により副腎皮質機能低下（ｈｙｐｏｃｏｒｔｉｓｏｌｉｓｍ）が生じ、治療しなければ、死亡する。本発明者らは、中等度のストレス条件でも、ＰＯＭＣヌルマウスで血清中にコルチコステロンを検出することはできなかった。ヒトとは対照的に、母胎のコルチコステロンで発達したが内因性のコルチコステロンはないマウスは生存可能である。コルチコトロピン放出因子ＣＲＨを欠くマウスでも同様な観察がなされており、コルチコステロン濃度が非常に低いにもかかわらず正常に発達する（マグリアら（Ｍｕｇｌｉａ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９５年、Ｎａｔｕｒｅ第３７３巻、４２７〜４３２ページ）。ＣＲＨヌルの雌から得られた子孫と同様に、ＰＯＭＣヌル変異体からのホモ接合性子孫は生後数時間以内に死亡する。これは、おそらく、ＣＲＨヌル変異体について示されているように、コルチコステロンの欠損により肺の成熟が不十分なためであろう。
【０１１９】
コルチコステロンが摂餌量を増加させ（テンペルら（Ｔｅｍｐｅｌ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９４年、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．第６巻、４７９〜５０１ページ）、エネルギー消費を低下させる（ストラックら（Ｓｔｒａｃｋ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９５年、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．第２６８巻、Ｒ１２０９〜１２０６ページ）ことは知られている。ＰＯＭＣヌルマウスは検出可能なコルチコステロンは有していないが、肥満している。これは今までのところ、コルチコステロンの存在しないところで肥満が起こる唯一の状態である。ネズミの肥満の他のすべての形では、コルチコステロン濃度は正常であるか、上昇している。実際、レプチン欠損マウスにおける過剰の肥満は、主としてこのマウスにおける副腎皮質機能亢進（ｈｙｐｅｒｃｏｒｔｉｓｏｌｉｓｍ）に起因し、副腎摘出によりｌｅｐ^ｏｂ／ｌｅｐ^ｏｂマウスでの過剰な肥満の発症が抑えられる（ソロモンら（Ｓｏｌｏｍｏｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９７３年、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ第９３巻、５１０〜５１２ページおよびトクヤマら（Ｔｏｋｕｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８９年、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．第２５７巻、Ｅ１３９〜１４４）。
【０１２０】
ＰＯＭＣ欠損マウスでのメラノコルチン受容体に対するリガンドの欠損は、それぞれ受容体ＭＣ３−Ｒ、ＭＣ４−ＲまたはＭＣ１−Ｒを欠くマウスで認められる作用を完全にまたは部分的に再現している。予備的分析で、ＰＯＭＣ欠損マウスは、ＭＣ５−Ｒを欠く変異マウスで認められる撥水および温度調節の欠陥も再現している（データ示さず）。この結果は、Ｐｏｍｃペプチドが少なくとも一部のＭＣ５−Ｒが媒介する機能の生理的リガンドであることを強く示している。
【０１２１】
実施例２
以下の実施例は、ＰＯＭＣヌルマウスは肥満により誘導されるインスリン抵抗性の発達から保護されていること、およびメラノコルチン刺激ホルモン（ＭＳＨ）をマウスに投与するとマウスの血糖調節がほぼ正常になることを示す。
【０１２２】
ＰＯＭＣヌル変異体における正常なグルコースおよびインスリン濃度
図４（Ａ）から（Ｄ）に示す実験で、１群当たり５匹の５カ月齢の雌について、朝（供餌状態）または一晩絶食後（空腹）のいずれかに、血糖値および血漿インスリン濃度を測定した。マウスはＰＯＭＣヌル変異体（−／−）、ヘテロ接合性（＋／−）および野生型（＋／＋）同腹仔であった。ｏｂ／ｏｂ変異体および野生型またはヘテロ接合性（＋／？）同腹仔を対照として使用した。血糖値は、バイエルグルコメータエリート（Ｂａｙｅｒ　Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ　Ｅｌｉｔｅ）で測定し、血漿インスリン濃度はＬｉｎｃｏ　ＲＩＡキットで測定した。この結果は、ＰＯＭＣヌル変異体は、ヘテロ接合性および野生型対照と比較して、グルコースおよびインスリン濃度が正常であることを示している。
【０１２３】
ＰＯＭＣヌル変異体での一生を通じた正常血糖
ＰＯＭＣヌル変異体が一生のどの時点で高血糖であるかを調べるために、種々の月齢（３、５および７カ月）でグルコース濃度を調べた。この結果を図５に示す。ＰＯＭＣヌル変異体の血糖値はいずれの時点でも正常値の範囲から逸脱することはなかった。
【０１２４】
インスリン負荷試験中のＰＯＭＣヌル変異体での血糖制御応答の欠如
図６に示すこの実験では、１群当たり５匹の５カ月齢の雌から朝に餌を取り上げた。６時間後に、マウスにインスリン（ヒトインスリン、１単位／ｋｇ、腹腔内）を注射した。指示した時点で血液を採取し、グルコメータを使用してグルコースを測定した。この結果は、野生型マウスとヘテロ接合性マウスの間で血糖値に有意差はないを示している。しかし、インスリンを注射してから最初の６０分後以降（８０分：Ｐ＜０．０５；１２０分：Ｐ＜０．０００１；１８０分：Ｐ＜０．０００１）には、グルコース濃度はＰＯＭＣ変異体で野生型同腹仔に比べて有意に低かった。
【０１２５】
コルチコステロンの補充は糖尿病を誘導しない
図７に示す実験では、１群当たり５匹のＰＯＭＣヌル変異体および野生型の同腹仔の雌に、コルチコステロン（２５μｇ／ｍＬ）含む飲料水か、または追加に何も含まない飲料水を、３カ月齢から３カ月半与えた。コルチコステロン補充の前後に血糖値を測定した。この結果は、コルチコステロンを補充しても動物で糖尿病を誘導することはないことを示し、ヌル変異マウスでのコルチコステロンの減少は、マウスにおけるインスリン抵抗性または糖尿病の欠如の原因にはならないことを示唆している。
【０１２６】
コルチコステロン補充は逆制御（Ｃｏｕｎｔｅｒｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ）応答を正常化しない
図８に示す次の実験では、コルチコステロン補充後にインスリン負荷試験（ＩＴＴ）を実施したとき、野生型と変異体のいずれでも血糖値は、未処理群のレベルまでは低下せず、その結果ＰＯＭＣヌル変異体は低血糖で死亡することはないと決定された。しかし、ＰＯＭＣ変異体は、コルチコステロン補充がないときと同様に、野生型マウスよりも逆制御応答が遅延する。
【０１２７】
ＭＳＨは血糖制御応答をほぼ正常化する
図９に示すこの実験では、１群当たり５匹の野生型およびＰＯＭＣ変異体の、４〜６カ月齢の雌性マウスでグルコースを測定した。マウスは５時間絶食させた。各遺伝子型（野生型＋／＋および変異体−／−）に、（１）食塩水０．１ｍＬ、腹腔内；（２）１μｇのα−ＭＳＨを含む食塩水０．１ｍＬ、腹腔内；または（３）１μｇのＡＣＴＨを含む食塩水０．１ｍＬ、皮下のいずれかを与えた。
【０１２８】
１時間後、全マウスにヒトインスリン（体重１ｇ当たり０．５ｍＩＵ）を腹腔内注射し、図示した間隔で尾の切れ目から採取した血液でグルコースを測定した。この結果は、ＭＳＨ再構築ＰＯＭＣ変異体とその野生型同腹仔では血糖値に有意差がないことを示している。ＰＯＭＣ野生型と（１）食塩水または（２）ＡＣＴＨを投与した変異体との間でのみ有意差が認められた（食塩水投与した野生型対変異体、９０分：Ｐ＜０．０５、１２０分：Ｐ＜０．０１、１８０分：Ｐ＜０．０５；ＡＣＴＨ投与した野生型対変異体、９０分：Ｐ＜０．０１、１２０分：Ｐ＜０．０５、１８０分：Ｐ＜０．０５）。
【０１２９】
要約すると、マウスではヒトと同様に、肥満にインスリン抵抗性ＩＩ型糖尿病が随伴することが多い。本発明者らは、ＰＯＭＣヌル変異マウス、その野生型およびヘテロ接合性同腹仔と、比較のために、ｏｂ／ｏｂ変異マウスおよびその同腹仔とで、血糖値と血漿インスリン濃度を測定した。ｐｏｍｃ変異体では、供餌および絶食のいずれの状態でもグルコースおよびインスリン濃度は正常範囲であり、ｏｂ／ｏｂ変異体は、予想された高血糖および高インスリン血症を示した（図４（Ａ）から（Ｄ））。
【０１３０】
ＰＯＭＣヌルマウスは摂餌および絶食のいずれの状態でも、循環血中のグルコースおよびインスリン濃度は正常である。上記の結果は、ＰＯＭＣペプチドが遺伝的に存在しないにより、肥満に伴うインスリン抵抗性の発症を予防し得ることを示している。この保護の可能性のある基本は、（１）膵臓におけるインスリンの産生、（２）筋肉、脂肪組織、肝臓などのインスリン感受性組織におけるインスリンシグナリングおよび（３）脂肪組織および肝臓における脂質代謝である。α−ＭＳＨの末梢投与によりＰＯＭＣマウスでＭＳＨが回復すると、マウスで血糖制御能が回復し、このことはＭＳＨの生物活性が肥満および糖尿病におけるインスリン抵抗性に寄与していることを示している。
【０１３１】
本発明の様々な実施形態について詳述してきたが、これらの実施形態の変形形態および適応形態があることは当業者には明らかである。しかし、そのような変形形態および適応形態も本発明の範囲内であることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
マウスＰｏｍｃ座、ターゲティングベクター、および相同組換え後のＰｏｍｃ座の予想構造の概略図および制限地図である。
【図１Ｂ】
Ｆ_２の同腹仔からのテールＤＮＡのサザンブロット分析のスキャン像を示す図である。
【図１Ｃ】
Ｆ_２の雄性同腹仔の血清ＡＣＴＨ濃度のＲＩＡ分析を示す棒グラフである。
【図２Ａ】
野生型および変異型のＰＯＭＣ遺伝子型の雄性マウスの体重測定から得た線グラフである。
【図２Ｂ】
変異ＰＯＭＣマウスが線形成長が増加することを示す棒グラフである。
【図２Ｃ】
ＰＯＭＣヌルマウスで血清レプチン濃度が上昇することを示す棒グラフである。
【図２Ｄ】
標準餌または高脂肪餌を与えたＰＯＭＣヌルマウスおよび野生型マウスの体重の変化を示す棒グラフである。
【図２Ｅ】
標準餌または高脂肪餌を与えたＰＯＭＣヌルマウスおよび野生型マウスの摂餌量を示す棒グラフである。
【図３Ａ】
変異ＰＯＭＣマウスのコルチコステロン濃度がＲＩＡの検出限度より低かったことを示す棒グラフである。
【図３Ｂ】
変異型ＰＯＭＣマウスのアルドステロン濃度がＲＩＡの検出限度より低かったことを示す棒グラフである。
【図３Ｃ】
野生型マウスに比べて変異ＰＯＭＣマウスでエピネフリン濃度が有意に低いことを示す棒グラフである。
【図３Ｄ】
野生型マウスに比べ変異型ＰＯＭＣマウスでノルエピネフリン濃度が有意には異ならないことを示す棒グラフである。
【図３Ｅ】
野生型マウスに比べて変異型ＰＯＭＣマウスでドーパミン濃度がわずかに高いことを示す棒グラフである。
【図４】（Ａ）給餌状態でのＰＯＭＣヌル変異マウスおよび対照マウスの血糖値を示す棒グラフである。（Ｂ）給餌状態でのＰＯＭＣヌル変異マウスおよび対照マウスのインスリン濃度を示す棒グラフである。（Ｃ）空腹状態でのＰＯＭＣヌル変異マウスおよび対照マウスの血糖値を示す棒グラフである。（Ｄ）空腹状態でのＰＯＭＣヌル変異マウスおよび対照マウスのインスリン濃度を示す棒グラフである。
【図５】
ＰＯＭＣヌル変異体の血糖値を経時的に示す線グラフである。
【図６】
ＰＯＭＣヌル変異体のインスリン負荷試験の間の血糖値を示す線グラフである。
【図７】
ＰＯＭＣヌル変異体の血糖に対するコルチコステロン投与の影響を示す棒グラフである。
【図８】（Ａ）ＰＯＭＣヌル変異体でのインスリン負荷試験中の血糖に対するコルチコステロン投与の影響を示す線グラフである。（Ｂ）ＰＯＭＣヌル変異体でのインスリン負荷試験中の血糖に対するコルチコステロン投与の影響を示す線グラフである。
【図９】
ＰＯＭＣヌル変異体でのインスリン負荷試験中の血糖に対するＭＳＨおよびＡＣＴＨ投与の影響を示す線グラフである。

Claims (20)

1. 肥満およびＩＩ型糖尿病におけるインスリン抵抗性の制御に有用な化合物を同定する方法であって、
   （ａ）Ｐｏｍｃ座の２本の対立遺伝子内に遺伝子改変を有する遺伝子改変した非ヒト動物に、メラノサイト刺激ホルモン（ＭＳＨ）生物活性を有する化合物を投与する工程であって、前記遺伝子改変の結果前記動物ではプロオピオメラノコルチン（Ｐｏｍｃ）ペプチド活性が存在せず、かつ前記ＭＳＨ活性を有する化合物の投与により前記動物でインスリン抵抗性が誘導される工程と、
   （ｂ）前記非ヒト動物モデルに、評価すべき化合物を投与する工程と、
   （ｃ）（ｂ）の化合物が存在しないときと比べて前記非ヒト動物でインスリン抵抗性を低下させる（ｂ）からの化合物を選択する工程と
   からなる方法。
2. 前記遺伝子改変が、前記Ｐｏｍｃ座のヌクレオチドの欠失、挿入、置換および逆位からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
3. 前記遺伝子改変が前記Ｐｏｍｃ座の２本の対立遺伝子内の核酸配列の欠失であり、前記欠失により前記動物がＰｏｍｃペプチドを発現しなくなる請求項１に記載の方法。
4. 前記遺伝子改変が、Ｐｏｍｃのエキソン３またはＰｏｍｃ座の２本の対立遺伝子によるＰｏｍｃペプチドの発現を妨げるのに十分なＰｏｍｃのエキソン３の一部分からなる核酸配列の欠失である請求項１に記載の方法。
5. 前記動物がマウスであり、かつ前記遺伝子改変がゲノムからの前記Ｐｏｍｃのエキソン３（配列番号７）の欠失である請求項１に記載の方法。
6. 前記ＭＳＨ生物活性を有する化合物が、ＭＳＨ、ＭＳＨの生物活性断片、ＭＳＨのホモログ、ＭＳＨのペプチドミメティック、ＭＳＨの非ペプチドミメティック、および、ＭＳＨタンパク質またはその断片からなる融合タンパク質、からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
7. 前記ＭＳＨの生物活性を有する（ａ）の化合物がα−ＭＳＨである請求項１に記載の方法。
8. 前記評価すべき（ｂ）の化合物がＭＳＨ生物活性に対するアンタゴニストである請求項１に記載の方法。
9. 前記評価すべき（ｂ）の化合物を、前記ＭＳＨ生物活性を有する（ａ）の化合物を投与する工程の前に投与する請求項１に記載の方法。
10. 哺乳類のインスリン抵抗性を低下させる方法であって、インスリン抵抗性を有する前記哺乳類に、メラノコルチン刺激ホルモン（ＭＳＨ）生物活性に対するアンタゴニストを含む治療用組成物を投与することからなり、前記アンタゴニストが前記哺乳類のインスリン抵抗性を低下させる方法。
11. 前記メラノコルチン刺激ホルモン（ＭＳＨ）のアンタゴニストが、ＭＳＨアンタゴニスト作用を有するＭＳＨの断片、ＭＳＨアンタゴニスト作用を有するＭＳＨのホモログ、ＭＳＨアンタゴニスト作用を有するＭＳＨのペプチドミメティック、ＭＳＨアンタゴニスト作用を有するＭＳＨの非ペプチドミメティック、および、前記ＭＳＨアンタゴニスト化合物のいずれかからなる融合タンパク質、からなる群から選択される請求項１０に記載の方法。
12. 前記ＭＳＨのアンタゴニストがＭＳＨに結合する可溶性ＭＳＨ受容体またはその断片である請求項１０に記載の方法。
13. 前記ＭＳＨのアンタゴニストが、ＭＳＨに選択的に結合し、それによりＭＳＨの活性を低下させまたは阻止する抗体である請求項１０に記載の方法。
14. 前記ＭＳＨのアンタゴニストが、ＭＳＨの受容体に選択的に結合し、それにより前記ＭＳＨの受容体への結合能を低下させまたは阻止する抗体である請求項１０に記載の方法。
15. 前記治療用組成物を経皮的に投与する請求項１０に記載の方法。
16. 前記治療用組成物を局所的に投与する請求項１０に記載の方法。
17. 前記治療用組成物を非経口的に投与する請求項１０に記載の方法。
18. 前記治療用組成物を制御放出製剤で投与する請求項１０に記載の方法。
19. メラノコルチン刺激ホルモン生物活性の前記アンタゴニストを前記動物の体重１ｋｇ当たり約０．１μｇから約１０ｍｇの投与量で投与する請求項１０に記載の方法。
20. 哺乳類のインスリン抵抗性を伴う糖尿病を治療する方法であって、インスリン抵抗性と糖尿病を有する前記哺乳類に、メラノコルチン刺激ホルモン（ＭＳＨ）生物活性に対するアンタゴニストを含む治療用組成物を投与することからなり、前記アンタゴニストが前記哺乳類でインスリン抵抗性を低下させる方法。

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