JP2004510730A - 非経口的投与可能な制御放出微粒子調製物 - Google Patents

Abstract

好ましくはアミロペクチン含有澱粉から構成された、非経口的投与可能な生物分解性微粒子調製物。この調製物は、濃度−時間曲線から注射後の最初の２４時間中の曲線下の面積と問題の曲線下の面積との比の形で決定して、注射後の最初の２４時間中に全放出量の２５％未満の活性物質放出量を示す。

Description

【０００１】
【技術分野】
本発明は、生物学的活性物質の投与のためのガレヌス処方物（ｇａｌｅｎｉｃ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）、より正確には、生物学的活性物質、特に薬剤の非経口的投与を意図した調節放出のための微粒子の分野にある。
【０００２】
【発明の背景】
多くの薬剤は注射により投与しなければならない。なぜならば、それらを例えば経口的もしくは経鼻的にまたは直腸経路で投与すると、分解を受けるかまたは不充分に吸収されるからである。非経口的使用を意図した薬剤処方物は、ヒトに対する使用の取締り当局によって認可されるために、多数の必要条件を満たさなければならない。従って、それは生体親和性および生物分解性でなければならず、そして全ての使用物質およびそれらの分解産物は無毒性でなければならない。加えて、注射を意図した粒状薬剤は、注射針を通過するのに充分小さいことが必要であり、これは好ましくは粒状薬剤が２００μｍよりも小さい必要があることを意味する。薬剤は調製物においてその製造もしくは貯蔵中または投与後に大きな程度で分解してはならず、そして生物学的活性形態で再現性ある動力学をもって放出されるべきである。
【０００３】
生体親和性、および無害な最終産物への生物分解性の必要条件を満たすポリマーの一つのクラスは、乳酸、グリコール酸およびこれらの混合物に基づく線状ポリエステルである。これらのポリマーは、以下にＰＬＧＡとも呼ばれる。ＰＬＧＡはエステル加水分解により乳酸およびグリコール酸に分解され、そして優れた生体親和性を有することが示されている。さらに、ＰＬＧＡの無害な性質は、これらのポリマーに基づく幾つかの非経口的遅延放出調製物が米国食品医薬品局を含む取締り当局によって認可されることで例証することができる。
【０００４】
現在市販されているＰＬＧＡに基づく非経口的投与可能な遅延放出製品としては、Ｄｅｃａｐｅｐｔｙｌ ^ＴＭ （Ｉｂｓｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｐｒｏｓｔａｐ ＳＲ ^ＴＭ （Ｌｅｄｅｒｌｅ）、Ｄｅｃａｐｅｐｔｙｌ（登録商標） Ｄｅｐｏｔ （Ｆｅｒｒｉｎｇ） および Ｚｏｌａｄｅｘ（登録商標） （Ｚｅｎｅｃａ） が挙げられる。これらの調製物中の薬剤は全てペプチドである。換言すれば、それらは比較的低い重合度を有するポリマーに縮合したアミノ酸から構成されており、そしてそれらは充分に明らかにされた三次元構造を有していない。次にこのことは、通常これらの製品の製造中に比較的厳しい条件の使用を可能にする。例えば、押し出しおよび後続の粉砕を利用することができるが、これらの技術はタンパク質に関してはたぶん許容されないだろう。なぜならば、タンパク質は一般的にいって、このような厳しい条件に耐えないからである。
【０００５】
従って、タンパク質に対しても制御放出調製物の要望がある。タンパク質は、それらもアミノ酸からなる点でペプチドに類似するが、その分子はより大きく、そして大部分のタンパク質は、生物学的活性および免疫原性を含むそれらの特性の多くに関して、充分に明らかにされた三次元構造に依存している。それらの三次元構造は比較的容易に、例えば高温、表面誘導変性および多くの場合に有機溶剤にさらされることによって破壊されうる。従って、本来はタンパク質の遅延放出のための優れた材料であるＰＬＧＡの使用に関する極めて重大な欠点は、有機溶剤を用いてこのＰＬＧＡを溶解する必要があることであり、タンパク質の安定性が損なわれるという危険、そしてタンパク質の立体配座の変化が患者の免疫学的反応をもたらし、この反応が阻害性抗体の形成による治療的効果の損失および毒性副作用の双方を生じうるという危険が付随する。複合タンパク質がその三次元構造を全ての点で保持しているかどうかを確実に決定することは著しく困難なので、タンパク質を立体配座の変化を誘導するかもしれない条件にさらすのを避けることは極めて重要である。
【０００６】
製造工程中のタンパク質の不安定性に関するこの固有の問題を避けるために、ＰＬＧＡ技術の改変をめざした熱心な努力にもかかわらず、この分野における進歩は極めて遅かった。その主な理由はたぶん、大部分のタンパク質の三次元構造が、用いられる製造条件に耐えるためには、またＰＬＧＡマトリックスの分解により形成される化学的酸性環境に耐えるためには、あまりにも敏感であることでる。科学文献は有機溶剤にさらすためにＰＬＧＡ微小球の製造における安定性の問題に関する多数の記載を含んでいる。ＰＬＧＡマトリックスが分解する際に形成される酸性環境の一例として、約４０μｍの直径を有するＰＬＧＡ微小球のｐＨ値が１．５まで下がり、これは多くの治療上有用なタンパク質を変性させるか、そうでなければ損傷を与えるのに全く充分であることが最近示された（Ｆｕ ら， Ｖｉｓｕａｌ Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ Ａｃｉｄｉｃ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ｗｉｔｈｉｎ Ｄｅｇｒａｄｉｎｇ Ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ） （ＰＬＧＡ） Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌ． １７， Ｎｏ． １， ２０００， １００−１０６）。微小球がより大きな直径を有するならば、酸性分解産物の拡散消失がより困難になり、そして自触媒反応が強められるという事実のためにｐＨ値はさらに低下すると予想することができる。
【０００７】
タンパク質およびペプチドのような水溶性物質のカプセル封入に現在最も普通に用いられる技術は、多相エマルジョン系の使用である。薬剤物質は水溶液または緩衝液に溶解され、続いて溶解したポリマーを含有する水非混和性有機溶剤と混合される。内相として水相を有するエマルジョンが形成される。異なる種類の乳化剤および激しい混合が、この第一エマルジョンの生成にしばしば用いられる。次いでこのエマルジョンは、激しく撹拌しながら、水／油／水型の三相エマルジョンを生成する別のポリマー、例えばポリビニルアルコールを含む別の液体、通常は水に移される。微小球は次に何らかの手段で硬化される。最も普通の手段は、低沸点を有する有機溶剤、典型的にはジクロロメタンを利用し、そして溶剤を留去することである。有機溶剤が水と完全に非混和性でないならば、より多くの水を三相エマルジョンに加えることにより、連続抽出手法を使用することができる。この一般的手法に関する多数の変法も文献に記載されている。一定の場合、一次エマルジョンは非水相、例えばシリコーン油と混合される。固体薬剤材料を、溶解した材料の代わりに用いることもできる。
【０００８】
タンパク質を含有するＰＬＧＡ微小球は ＷＯ−Ａ１−９０１３７８０ に記載されており、その主要な態様は、タンパク質における高い生物学的活性を保存する目的で、微小球の製造中に極めて低い温度を用いることである。カプセル封入されたスーパーオキシドの不同変化のための活性は測定されるが、粒子から放出された部分についてだけである。この方法は、ヒト成長ホルモンをＰＬＧＡ含有塩化メチレンに分散させ、微細液滴を凍結させるために、得られた分散液を液体窒素層の下にある凍結エタノールの容器に噴入し、そしてこれらの液滴をエタノール上の窒素中に沈降させることによる、ＷＯ−Ａ１−９４１２１５８ におけるヒト成長ホルモン含有ＰＬＧＡ微小球の製造に用いられている。続いてエタノールを解凍すると微小球はエタノール中に沈み始め、そこで塩化メチレンがエタノール中に抽出され、そして微小球が硬化される。この方法を用いると、タンパク質をＰＬＧＡ微小球に封入するための他の大部分の方法よりも良好にタンパク質の安定性を保持することができ、そしてまた最近、ある製品が米国の取締り当局によって認可された。しかしながら、これは他のタンパク質についてまだ明確に実証されておらず、そして封入された生物学的活性物質がＰＬＧＡマトリックスの分解中に極めて低いｐＨにさらされるという問題が残っている。
【０００９】
ＰＬＧＡによるカプセル封入に基づく上記の方法において、活性物質は依然として有機溶剤にさらされ、そしてこれは一般的にいって、タンパク質の安定性にとって有害である。さらに、これらの論じたエマルジョン方法は複雑であり、そして工業的規模に拡大しようとする何れの試みにおいても、たぶん問題となる。そのうえ、これらの方法の多くに利用される有機溶剤の多くは環境問題に関連しており、そしてＰＬＧＡポリマーに対するその高い親和性はその除去を困難にする。
【００１０】
生物学的活性物質が微小球マトリックスの生物分解中に化学的酸性環境にさらされ、そして製造工程中に有機溶剤にさらされることによって生じる上記の問題を解決しようとする多数の試みが記載されている。分解中の酸性環境を避けるために、微小球のマトリックスとしてのＰＬＧＡを、化学的に中性の分解産物を生成するポリマーに換えようとする試みがなされており、そして生物学的活性物質が有機溶剤にさらされるのを避けるために、あらかじめ微小球を製造しておき、それらをいったん加工および乾燥してしまったときにだけ、生物学的活性物質を負荷しようとする試みが行われており、または微小球の製造中に有機溶剤を除外または制限しようとする試みがなされている。
【００１１】
一例として、比較的低分子量の高度分枝状澱粉（マルトデキストリン、平均分子量約５，０００Ｄａ）は、この澱粉を微小球に固化することのできる形態に変換するためにアクリル基との共有結合により改変され、得られたポリアクリル澱粉は、外相としてトルエン／クロロホルム（４：１）を含むエマルジョン中でのラジカル重合により粒状形態に変換された（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙａｃｒｙｌ Ｓｔａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｓ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇｓ， Ａｒｔｕｒｓｓｏｎ ら， Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ， ７３， １５０７−１５１３， １９８４）。タンパク質をこれらの微小球中に閉じ込めることはできたが、製造条件はエマルジョンの製造に際して生物学的活性物質を有機溶剤および高い剪断力の両者にさらす。得られた微小球が酵素的に溶解されると、そのｐＨは中性に保持されると予想することができる。得られた微小球は多くの理由で非経口的投与、特に反復非経口的投与には適しない。数ある中で最も重要なことは、澱粉マトリックス（Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ ＩＶ， Ｆａｃｔｏｒｓ Ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙａｃｒｙｌ Ｓｔａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ， Ｌａａｋｓｏ ら， Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ７５， ９６２−９６７， １９８６）、および澱粉分子を架橋する合成ポリマー鎖の両者の生物分解性が不完全で、かつ極めて遅いことである。さらに、これらの微小球は持続放出のために組織への注射に適するにはあまりにも小さすぎ、直径＜２μｍである。なぜならば、組織マクロファージがそれらを容易に貪食できるからである。高度分枝状澱粉にアクリル基を結合させるために、潜在的に生物分解性のエステル基を導入することによって分解速度および分解度を高めようとする試みは、意図した結果を引き起こすのに失敗し、そしてこれらのポリアクリル澱粉微小球でさえも、かなりの時間にわたってあまりにもゆっくりと、かつ不完全に分解された（ＢＩＯＤＥＧＲＡＤＡＢＬＥ ＭＩＣＲＯＳＰＨＥＲＥＳ： Ｓｏｍｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｐｏｌｙａｃｒｙｌ Ｓｔａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｐｒｅｐａｒｅｄ ｆｒｏｍ Ａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ Ｅｓｔｅｒｉｆｉｅｄ Ｓｔａｒｃｈ， Ｌａａｋｓｏ および Ｓｊｏｅｈｏｌｍ， １９８７ （７６）， ｐｐ． ９３５−９３９， Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．）。
【００１２】
ポリアクリルデキストランが二相水性系中で製造された（Ｓｔｅｎｅｋｅｓ ら， Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｅｘｔｒａｎ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ ｉｎ ａｎ Ａｌｌ−Ａｑｕｅｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ： Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｏｎ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｖｏｌ． １５， Ｎｏ． ４， １９９８， ５５７−５６１、および Ｆｒａｎｓｓｅｎ および Ｈｅｎｎｉｎｋ， Ａ ｎｏｖｅｌ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｕｓｉｎｇ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔｓ， Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ １６８， １−７， １９９８）。この手法モードを用いると、生物学的活性物質が有機溶剤にさらされるのが防止されるが、その他については、上記のポリアクリル澱粉微小球について説明した特性と同等の特性を微小球が獲得し、このことがそれらを反復非経口的投与には不適当にする。ヒトが特定のデキストラン分解酵素を持たないことを念頭に置けば、分解速度はポリアクリル澱粉微小球よりもいっそう遅いに違いない。デキストランの使用は重大なアレルギー反応の一定の危険とも関連する。
【００１３】
非化学的に改変された澱粉を用い、外相として油を用いる澱粉微小球の製造が記載されている（ＵＳ ４，７１３，２４９； Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ， Ｕ．， Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚｅｄ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｓｐｈｅｒｅｓ ｆｏｒ ｓｌｏｗ ｒｅｌｅａｓｅ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ， １９８５ （１１２）， １１６−１２８； Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ， Ｕ．， Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚｅｄ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｓｐｈｅｒｅｓ ａｓ ａ ｓｌｏｗ ｒｅｌｅａｓｅ ｍａｔｒｉｘ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ， Ｂｉｏ−ｍａｔｅｒｉａｌｓ ５：１００−１０４， １９８４）。これらの場合に微小球はアセトン中での沈殿により固化され、これは生物学的活性物質を有機溶剤にさらすこと、および澱粉が物理的架橋により固化する自然の傾向を製造工程中に利用しないことの双方に導く。これは次には澱粉が水に再懸濁されたのち、そして体液にさらされたときに、このような架橋を形成しようとするであろうから、固有の不安定性を有する微小球に導く。油中水滴型エマルジョンを得るためには高い剪断力を必要とし、そして形成された微小球は、非経口的持続放出に適するためにはあまりにも小さすぎる。
【００１４】
ＥＰ ２１３３０３ Ａ２ には、澱粉が物理的架橋の形成により固化する自然の能力を利用し、そして生物学的活性物質を有機溶剤にさらすのを避ける目的で、これらの微小球中に物質を固定化することを利用して、特に化学的に改変されていない澱粉の微小球を二相水性系中で製造することが記載されている。明らかにされた澱粉品質と組み合わせたこの記載された方法は、完全に生物分解性の粒子を生じない。得られた粒子もまた、記載された澱粉品質があまりにも多量の外来植物性タンパク質を含有するので、注射に、特に長期間にわたる反復注射には適しない。この特許により教示されたこととは対照的に、驚くべきことに、二相水性系の形成に要求されるよりも著しく高いポリマー濃度を用いるならば、生物学的活性分子の著しく良好な収率およびより高い負荷量を得ることができ、そしてこれが安定で非凝集性の微小球を得るための条件およびそれらの粒度分布に関しても利益をもたらすことを見出した。記載された熱処理は敏感な巨大分子には使用することができず、そして同じことはエタノールまたはアセトンを用いる乾燥を含む工程にも当てはまる。
【００１５】
二相水性系中で微小球を製造する別法が記載されている。ＵＳ ５ ９８１ ７１９ においては、生物学的活性巨大分子をこの巨大分子の等電点に近接したｐＨでポリマーと混合し、そしてエネルギー、好ましくは熱の供給により微小球を安定化することによって微粒子が製造される。調製物中の巨大分子、すなわち生物学的活性物質の最低割合は４０％であり、これは大部分の用途にとって高すぎ、そして微粒子の用量があまりにも低くなるので、活性物質の注射量がはなはだ不確実になる。この製造方法は温和であり、そして閉じ込められた生物学的活性物質の生物学的活性を保持できると記載されているとしても、微粒子は加熱により安定化され、そして挙げられた実施例において、加熱は少なくとも５８℃に３０分間、多くの場合７０〜９０℃に同等の時間行われ、これが敏感なタンパク質によって耐えられると予想することはできず、その生物学的活性は三次元構造に依存しており、そしてタンパク質が製造工程に耐えた場合であっても、小さいが、それにもかかわらず取るに足らなくはないタンパク質の立体配座の変化が起こる危険が依然として存在する。外相としては二つのポリマー、一般的にポリビニルピロリドンおよびＰＥＧの組み合わせが常に用いられ、これは、これら両物質を再現性があり、かつ信頼できる手段で微小球から洗浄除去しなければならない点で製造工程を複雑にする。形成された微粒子は、例えば皮下注射後の非経口的持続放出に適するためにはあまりにも小さい（実施例には直径０．１μｍ未満の値が示されている）。なぜならば、マクロファージ（これらは粒子の貪食を専門とし、そして組織に存在する細胞である）は、５〜１０、たぶん２０μｍまでの微小球を容易に貪食することができ、そして貪食された粒子は細胞内のリソソームに局在化され、そこで粒子および生物学的活性物質の両者が分解され、そうすると治療効果が失われる。極めて小さな粒径もまた、濾過のような望ましい方法を使用できないので、微小球の加工をいっそう複雑にする。同等のことは ＵＳ ５ ８４９ ８８４ にも当てはまる。
【００１６】
ＵＳ ５ ５７８ ７０９ および ＥＰ ０ ６８８ ４２９ Ｂ１ には、巨大分子微粒子溶液の製造に二相水性系を用い、そして脱水した巨大分子を化学的または熱的に架橋させて微粒子を形成することが記載されている。生物学的活性巨大分子を化学的に架橋させることは、それ自体にとってまたは微粒子マトリックスにとっても全く望ましくない。なぜならば、この種の化学的改変は多くの重大な欠点を有し、例えば敏感なタンパク質の生物活性が低下し、そしてタンパク質の新たな抗原決定基に対する免疫反応を誘導する危険があり、製品の安全性を調査する広範な毒物学的研究が必要になるからである。グルタルアルデヒドとの化学的架橋によって製造された微粒子は以前に知られているが、ヒトへの非経口的反復投与には一般的に不適当と考えられる。ＵＳ ５ ５７８ ７０９ に記載された微粒子は一般的な表現で ＵＳ ５ ９８１ ７１９ について説明したのと同じ欠点をこうむり、製造条件は敏感なタンパク質を化学的改変または有害な温度にさらすことによって不適当であり、そして微小球の粒度分布は非経口的持続放出には狭すぎ、かつ微小球の製造後の工程を複雑にする。
【００１７】
ＷＯ ９７／１４４０８ には、生物学的活性物質が有機溶剤にさらされることのない、非経口的投与後の持続放出用の微粒子を製造するためにエアサスペンジョン技術を使用することが記載されている。しかしながら、この刊行物は本発明に係る方法およびそれにより得ることのできる新規な微粒子に向けた手引きを与えていない。
【００１８】
ＵＳ ５ ４７０ ５８２ においては、有機溶剤を用いて微小球それ自体を最初に製造し、次いで、有機溶剤が既に除去されている後段階で巨大分子を負荷する２段階方法により、ＰＬＧＡから構成され、かつ巨大分子を含有する微小球が製造される。この手法は、あまりにも低い生物学的活性物質含有量、一般的に１〜２％に導き、そして注射直後に放出される極めて大きな画分に導き、これは極めてしばしば全く不適当である。このあまりにも急速な初期放出量は、１％の負荷量と仮定しても既に極めて高く、そして微小球中の活性物質含有量がより高ければ、よりいっそう顕著になる。ＰＬＧＡマトリックスが分解すると、ｐＨは敏感な巨大分子には一般的に許容されないレベルまで下がる。
【００１９】
（ポリ）ペプチドの放出パターンを制御する方法が ＵＳ ５，７７６，８８５ に開示されており、この放出は、それらの不溶性付加塩の形成によって行われる。換言すれば、そこに開示された技術は、水不溶性ペプチドがその水溶性誘導体よりも劣った程度で放出されるという事実に基づいており、これは、一般的に水溶性物質の放出を適切に制御するために本発明において用いられる技術とは、まるで反対である。
【００２０】
本発明によって示される技術の最前線を説明するためには、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ｖｏｌ． ２， Ｎｏ． ７， Ｊｕｌｙ １９９６， ｐｐ ７９５−７９９ がより適切である。この文献は、本発明がなされた前のマイクロカプセル封入ヒト成長ホルモンのインビボ放出に関する最良の結果が最初の１２時間以内に本質的に放出された結果の約３０重量％であったことを示している。このような放出プロフィールは多数の副作用および低い治療効果を伴うことが認められている。
【００２１】
澱粉が微粒子のための理論的に極めて適切な、おそらく理想的でさえあるマトリックス材料であることは、長い間知られている。なぜならば、澱粉は有機溶剤に溶解する必要がなく、自然に固化する傾向を有するからであり、そして体内には澱粉を内在性の天然物質に、最後にはグルコースに分解できる酵素があるからであり、そして内在性グリコーゲンとの類似性により、澱粉は非免疫原性であることが示されているからである。熱心な努力にもかかわらず、非経口的使用に適する微粒子の製造を可能にする特性を有する澱粉、およびタンパク質のような敏感な生物学的活性物質が閉じ込められるようになるのを可能にする温和な条件下で、完全に生物分解性の微粒子の製造を可能にする条件は、以前に記載されたことがない。
【００２２】
澱粉顆粒は、それらを非経口的注射にとって不適当にする不純物、例えば澱粉タンパク質を当然に含有している。精製が不充分な澱粉が故意でなく付着する場合、例えば多くの型の作業グローブに安定化された澱粉顆粒が振りかけられる操作において起こりうるように、極めて重大な二次的効果が生じることがある。澱粉顆粒もまた、許容される時間幅以内に完全に生物分解されないという理由で、反復非経口的投与には本質的に適しない。
【００２３】
酸加水分解され精製された澱粉で製造された澱粉微小球は、ヒトへの非経口的投与に用いられている。これらの微小球は強アルカリ性条件下にエピクロルヒドリンで化学的に架橋させることにより製造された。のちに澱粉によって獲得されたこの化学的改変は低下した生物分解性に導き、従って微小球はα−アミラーゼのような内在性酵素によって完全に溶解することができるが、最終産物としてのグルコースに完全には変換されない。製造方法または得られた微小球のどちらも、敏感なタンパク質の固定化に適しもしなければ、本質的に加水分解アミロースに基づくこのような酸加水分解澱粉も、完全に生物分解性の澱粉の製造、またはタンパク質のような生物学的活性物質を高い負荷量で含有する澱粉微小球の製造には適しない。
【００２４】
ヒドロキシエチル澱粉（ＨＥＳ）はヒトに高い用量で代用血漿として非経口的に投与される。ＨＥＳは、概してもっぱら高度分枝状アミロペクチン、いわゆる「ワックス様メイズ」からなる澱粉からの澱粉顆粒によって製造され、分子量分布を低下させるために酸加水分解され、続いてアルカリ性条件下でヒドロキシエチル化され、そして約２００，０００Ｄａの平均分子量を得るために再度酸加水分解される。こののち、濾過、アセトンでの抽出および噴霧乾燥が行われる。ヒドロキシエチル化の目的は、未改変アミロペクチンがα−アミロースにより極めて急速に分解され、その循環滞留時間が約１０分なので、効果の持続時間を延長することである。ＨＥＳは生物学的活性物質を含有する完全に生分解性の微小球の製造には適しない。なぜならば、化学的改変が生物分解の速度および完全性をかなり低下させ、そして澱粉が非共有結合架橋の形成により固化する自然の傾向の消失をもたらすからである。さらに、ＨＥＳの高濃度溶液は微小球の製造に使用できるためにはあまりにも粘調すぎるようになる。これらの高い用量でのＨＥＳの使用は非経口的使用可能な澱粉を製造できることを示しているが、ＨＥＳは化学的架橋または有機溶剤での沈殿を行わずには微粒子の製造に使用できない。
【００２５】
ＷＯ ９９／００４２５ には、表面関連タンパク質の澱粉顆粒を一掃するために広い最適ｐＨを有する耐熱性タンパク質分解酵素の使用が記載されている。得られた顆粒は非経口的投与には適しない。なぜならば、それらは顆粒中に存在する澱粉タンパク質をなお含有しており、そして添加したタンパク質分解酵素の残留物が顆粒中に残されるという危険があるからである。これらの顆粒もまた、非経口的投与可能な澱粉微小球を二相水性系中で製造するためには適しない。なぜならば、それらは溶解されたのちでさえ、充分高い濃度で使用できるにためには悪い分子量分布を有し、そして微小球が得られたとしても、それらはたぶん完全に生物分解性ではないからである。
【００２６】
錠剤を製造するためのより良好な澱粉を製造する目的で、剪断作用を用いて澱粉の分子量分布を改変することが ＵＳ ５，４５５，３４２ および ＷＯ ９３／２１００８ に記載されている。得られた澱粉は澱粉タンパク質（これらは剪断作用ののちに変性された形態で存在するかもしれない）の高い含有量のために非経口的投与には適さず、そしてこの得られた澱粉もまた、非経口的投与のための生物分解性澱粉微小球の製造、またはこのような澱粉微小球を製造するための二相水性系中での使用には適しない。剪断作用は ＷＯ ９６／１００４２ に開示されているように、ヒドロキシエチル澱粉の製造にも用いられている。しかしながら同様の理由で、このようなヒドロキシエチル澱粉は上記で言及したように非経口的投与または微小球の製造の何れにも適しない。
【００２７】
従って、下記の特色を有する非経口的投与可能な微粒子の製造方法および微粒子が著しく望ましいであろう：
・　有機溶剤に敏感または不安定な生物学的活性物質、すなわち主として水溶性物質を、それらの生物学的活性を保持しながら微粒子中に閉じ込めるのを可能にする方法；
・　その方法により、生物学的活性物質が有機溶剤、高温または高剪断力にさらされることがなく、そしてそれらの生物学的活性の保持を可能にする条件下で該物質を閉じ込めることができる方法；
・　非経口的投与可能な調製物に、敏感な生物学的活性物質でさえも高く負荷するのを可能にする方法；
・　その方法により、実質的に完全に生物分解性で生体親和性の調製物を製造することができ、この調製物が非経口的注射に適し、そしてそれが分解すると化学的に中性の内在性物質が形成される方法；
・　その方法により、組織マクロファージの貪食作用を避ける目的で、２０μｍを超える、好ましくは３０μｍを超える大きさを有する非経口的注射可能な調製物を製造することができ、そして調製物の製造中の加工を簡単にする方法；
【００２８】
・　制御、持続または遅延放出のための調製物の製造における中間生成物として微粒子を使用することができ、そして閉じ込められた生物学的物質の化学的安定性および生物学的活性の厳格な品質管理を可能にする、生物学的活性物質を含有する微粒子の製造方法；
・　実質的に完全に生物分解性の澱粉微粒子の製造に適する非経口的に許容される澱粉を利用する方法；
・　非経口的注射に適し、分解すると化学的に中性の内在性物質を形成する実質的に完全に生物分解性で生体親和性の微粒状調製物；
・　生物学的活性物質を含有し、そしてエアサスペンジョン技術による被覆に適する粒度分布を有し、かつこの目的に充分な機械的強度を有する微粒状調製物；
・　非経口的投与後に制御された放出を与える、生物学的活性物質を含有する被覆微粒状調製物。
これらのような目的および他の目的は、以下に定義する本発明により達成される。
【００２９】
【発明の詳述】
本発明は、新規な微粒子調製物に関する。より具体的には、本発明は、生物分解性であり、有機溶剤に敏感または不安定な生物学的活性物質を含有し、そしてこの物質を哺乳類、特にヒトに非経口的に投与することを意図した微粒子調製物に関する。この非経口的投与は、微粒子が主として注射に意図されることを意味する。
【００３０】
微粒子は主として注射に意図されるので、１０〜２００μｍ、一般的に２０〜１００μｍ、特に２０〜８０μｍの範囲内の平均直径を有する粒子を製造することが特に問題である。本発明に関して「微粒子」という表現は、この技術で公知の一定の大きさの粒子のための一般的名称として用いられる。微粒子の一つのタイプは大部分において球形を有する微小球のタイプであるが、微粒子という用語はこのような理想的な球形からのずれを包含することができる。この技術で公知のマイクロカプセルという表現も、公知技術による微粒子という表現によって包含される。
【００３１】
本発明の一つの態様によれば、本発明は、調製物が、濃度−時間曲線から注射後の最初の２４時間中の曲線下の面積と問題の曲線下の面積との比の形で決定して、注射後の最初の２４時間中に全放出量の２５％未満である活性物質の放出量を示す、有機溶剤に敏感または不安定である生物学的活性物質を含有する非経口的投与可能な生物分解性微粒子調製物を提供する。
【００３２】
注射後の最初の２４時間中の放出量は、全放出量の好ましくは２０％未満、より好ましくは１５重量％未満、よりいっそう好ましくは１０重量％未満、最も好ましくは５重量％未満であるべきである。
【００３３】
本発明の別の態様によれば、本発明は、注射後の最初の４８時間中に生物学的活性物質の最高血漿または血清濃度が注射後４８時間を超えた時点における生物学的活性物質の最高濃度の３００％未満である活性物質の放出量を示す、上記タイプの微粒子調製物を提供する。
上記の最高濃度は、問題の最高濃度の好ましくは２００％未満、より好ましくは１００％未満である。
本発明のさらに別の態様によれば、最後に述べた調製物は、本発明の第一の態様による調製物について定義した放出量を示す。
【００３４】
本発明のさらにもう一つの態様は、微粒子が、８５重量％を超えるアミロペクチン含有量（その少なくとも８０重量％は１０〜１０，０００ｋＤａの範囲内の平均分子量を有する）を有する澱粉から実質的に構成されており、澱粉が澱粉の乾燥重量１ｇ当たり５０μｇ未満のアミノ酸窒素含有量を有し、澱粉分子間の共有化学架橋結合を含まず、そして生物学的活性物質の生体利用率が問題の物質を可溶性形態で静脈内に注射したときに得られる生体利用率の少なくとも３５％である活性物質の放出量を示す、上記タイプの微粒子調製物によって示される。
上記の生体利用率は、生物学的活性物質を静脈内に注射したときに得られる生体利用率の好ましくは少なくとも４５％、より好ましくは少なくとも５０％である。
【００３５】
本発明の別の態様は、微粒子が、８５重量％を超えるアミロペクチン含有量（その少なくとも８０重量％は１０〜１０，０００ｋＤａの範囲内の平均分子量を有する）を有する澱粉から実質的に構成されており、澱粉が澱粉の乾燥重量１ｇ当たり５０μｇ未満のアミノ酸窒素含有量を有し、澱粉分子間の共有化学架橋結合を含まず、そして選択した７日の期間が注射後の最初の２４時間を含まないことを条件として、任意の連続７日の期間中に起こる放出において、生物学的活性物質の最高血漿または血清濃度を上記の７日の期間中の平均濃度で割り算した商が少なくとも５であることを特徴とする活性物質の放出量を示す、上記タイプの微粒子調製物によって示される。
上記の放出量は、好ましくは４倍未満、より好ましくは３倍未満、最も好ましくは２倍未満である。
【００３６】
さらに別の態様によれば、本発明は、微粒子が、８５重量％を超えるアミロペクチン含有量（その少なくとも８０重量％は１０〜１０，０００ｋＤａの範囲内の平均分子量を有する）を有する澱粉から実質的に構成されており、澱粉が澱粉の乾燥重量１ｇ当たり５０μｇ未満のアミノ酸窒素含有量を有し、澱粉分子間の共有化学架橋結合を含まず、そして問題の生物学的活性物質の平均滞留時間が少なくとも４日である生物学的活性物質の放出量を示す、上記タイプの微粒子調製物を提供する。
上記の平均滞留時間は、好ましくは少なくとも７日、より好ましくは少なくとも９日、例えば少なくとも１１日、または特に少なくとも１３日である。
【００３７】
上記の本発明の態様について明記した特徴的様相は、任意の適切な組み合わせで組み合わせることができる。
より具体的には、本発明に係る微粒子調製物について明記した種々の特徴のための主要なファクターは、ＭＲＴ、バーストおよび生体利用率という用語である。
【００３８】
これらは下記のように定義することができる：
ＭＲＴ
制御放出のための調製物の目的は、活性材料の持続放出を得ることである。放出時間を定量するために使用できる一つの尺度は、平均滞留時間（ＭＲＴ）であり、これは薬物動態学内で認められた用語である。
ＭＲＴは体内に導入された分子が体内に滞在する平均時間である（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ． Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｍａｌｃｏｌｍ Ｒｏｗｌａｎｄ および Ｔｈｏｍａｓ Ｎ． Ｔｏｚｅｒ， 第２版， Ｌｅａ＆Ｆｅｂｉｇｅｒ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ Ｌｏｎｄｏｎ）。
【００３９】
ＭＲＴは血漿濃度データから下記の式を用いて計算することができる。
【数１】

式中、Ｃは血漿濃度であり、ｔは時間である。
【００４０】
バースト
非経口的使用のための制御放出調製物に共通する問題は、薬剤の大部分が体内に投与した直後の早期相の間に放出されることである。専門家の文献内でこれは「バースト効果」と呼ばれている。これは一般的に、薬剤が処方物の表面上にあるという事実、または処方物（これは微粒子からなっていてもよい）がはじけるという事実のためである。低いバースト効果が極めて望ましい。なぜならば、高濃度の薬剤は毒性があり、そしてさらに初期期間中に急速に消失する部分は不充分に利用され、これは意図した処置期間中の薬剤の治療的レベルを保持するためにより多くの薬剤を必要とすることを意味するからである。
バーストは、吸収される全画分のうちの、最初の２４時間中に吸収される薬剤のその画分と定義される。
【００４１】
数学的用語では、それは血漿濃度グラフから「曲線下の面積」の計算を用いて定義することができる。
【数２】

【００４２】
生体利用率
生体利用率は、供給された薬剤のどれほど多くの部分が投与部位から血中に活性形態で吸収されるかの尺度である。生体利用率は薬剤の静脈内供給量からのデータとしばしば比較され、それ故にこの場合は吸収障壁がなく、従って絶対的生体利用率と呼ばれる。
絶対的生体利用率は下記の式によって定義される：
【数３】

【００４３】
式中、ＡＵＣ_ｘは検査した処方物に関する曲線下の面積であり、ＡＵＣ_ｉｖは薬剤の静脈内供給量に関する曲線下の面積であり、Ｄ_ｘは処方物中の薬剤の量であり、Ｄ_ｉｖは静脈内の量である。
【００４４】
放出プロフィールおよび薬物動態学的パラメーターの決定は好ましくは動物実験によって実現される。最も適切な種は、ヒトとのその類似性のためにブタである。生物学的活性物質が試験中に生物学的活性物質の薬物動態学的パラメーターの決定に影響を与えるおそれのある免疫反応を誘導することがある場合には、例えば薬剤処置によって免疫反応の阻害を用いるべきである。これはこの技術分野内で公知であり、詳細は科学文献、例えば Ａｇｅｒｓｏｅ ら（Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ ４１ （１９９９） １−８）から得ることができる。
【００４５】
本発明に係る微粒子調製物は、
ａ）８５重量％を超えるアミロペクチン含有量を有し、材料の少なくとも８０重量％が１０〜１０，０００ｋＤａの範囲内となるように、好ましくは剪断作用により該アミロペクチンの分子量が低下されており、そして澱粉の乾燥重量１ｇ当たり５０μｇ未満のアミノ酸窒素含有量を有する澱粉を含む澱粉水溶液を調製し、この溶液の澱粉濃度が少なくとも２０重量％であり、
ｂ）生物学的活性物質と澱粉溶液とを、澱粉溶液中の該物質の溶液、エマルジョンまたは懸濁液の形態の組成物が形成されるような条件下で組み合わせ、
ｃ）段階ｂ）で得られた組成物を、二相水性系の形成能を有するポリマーの水溶液と混合し、その結果、該ポリマー溶液の外相中の内相として生物学的活性物質を含有する澱粉液滴のエマルジョンを形成し、ここで、澱粉液滴は好都合には微小球にとって望ましい大きさであり、
ｄ）段階ｃ）で得られた澱粉液滴を、澱粉の自然固化傾向によりゲル化させて澱粉粒子にし、
ｅ）澱粉粒子を乾燥し、そして
ｆ）場合により、好ましくはエアサスペンジョン法により、乾燥澱粉粒子に生体親和性および生物分解性ポリマーの放出制御性外皮を施すことを含む方法によって製造することができる。
【００４６】
この方法の重要な態様は、換言すれば、微粒子マトリックスとして一定タイプの澱粉を使用することである。特に適する澱粉およびその製造方法はスウェーデン特許出願第 ０００３６１６−０ に記載されている。これについての詳細は、換言すれば、このスウェーデン特許出願から得られるので、この点で、その内容は参照により本明細書本文に組み入れられる。別の有用な澱粉は本願と同日の出願日を有する同時係属中の「澱粉」と題するＰＣＴ出願に開示されている。
【００４７】
しかしながら、このような澱粉に関する最も重要な特色を以下に説明する。高い活性物質収率で完全に生物分解性の微粒子を二相水性系中で形成するため、および得られた澱粉微粒子が以下に説明する特性を有するために、澱粉は一般的に高度分枝状澱粉（これは澱粉顆粒において中性状態でアミロペクチンと呼ばれる）から主として構成されねばならない。澱粉はまた、所望の濃度およびゲル化速度の達成を可能にする分子量分布を有するべきである。
【００４８】
この文脈において「生物分解性」という用語は、微粒子が非経口的投与後に体内で溶解されて内在性物質、最後には例えばグルコースを形成することを意味する。生物分解性は、インビトロで適切な酵素、例えばアルファ−アミラーゼとのインキュベーションによって決定または検査することができる。この場合、インキュベーション期間中に酵素を多数回加えるのが適切であり、これによって活性酵素がインキュベーション混合物中に常に存在することが保証される。生物分解性は、微粒子を非経口的に、例えば皮下または筋肉内に注射し、そして組織を時間の関数として組織学的に検査することによって検査することもできる。
【００４９】
生物分解性澱粉微粒子は、通常２〜３週間以内、一般的に１週間以内に組織から消失する。澱粉微粒子が放出制御性外皮、例えば被覆剤で被覆されている場合には、生物分解性速度を決定するのは一般的にこの外皮であり、次にはこの速度はアルファ−アミラーゼが澱粉マトリックスを利用可能になるときを決定する。
【００５０】
生体親和性は、微粒子を非経口的に、例えば皮下または筋肉内に投与し、そして組織を組織学的に評価することによって検査することもでき、しばしばタンパク質である生物学的活性物質はそれ自体で、別の種に投与すると例えば免疫反応誘導能を有することを念頭に置くことが重要である。例えば、多数の組み換え産生ヒトタンパク質は試験動物において免疫反応を生じることがある。
【００５１】
さらに、澱粉は非経口的投与可能な調製物の製造に許容される純度を有しなければならない。生物学的活性物質の生物活性の保持を許す条件下でこの物質が混合されるのを可能にするために、澱粉は充分に高い濃度で充分に安定な溶液を形成できなければならず、これと同時に、さらに安定であると同時に生物分解性でもある微粒子を得るために、制御された手段で自然に固化できなければならない。高い濃度の澱粉は、生物学的活性物質が許容されない程度で外相または内相と外相との界面に分布するのを防止するためにも重要である。
【００５２】
澱粉の特性に関する多くの異なる態様は以下のとおりである。
澱粉は、澱粉の乾燥重量１ｇ当たり一般的に５０μｇ未満、好ましくは多くとも２０μｇ、より好ましくは多くとも１０μｇ、最も好ましくは多くとも５μｇのアミノ酸窒素の純度を有する。
【００５３】
上記のアミロペクチンの分子量は、材料の少なくとも８０重量％が１０〜１００００ｋＤａ、より好ましくは１００〜４０００ｋＤａ、よりいっそう好ましくは２００〜１０００ｋＤａ、最も好ましくは３００〜６００ｋＤａの範囲内になるように低下されることが好ましい。この文脈で興味深い別の範囲は１０〜１０００ｋＤａであろう。
【００５４】
加えて、澱粉は、９５重量％を超える、より好ましくは９８重量％を超える問題の低下した分子量のアミロペクチン含有量を有することが好ましい。もちろん澱粉は１００重量％のこのようなアミロペクチンから構成されていてもよい。
【００５５】
別の好ましい実施形態によれば、澱粉は水に２５重量％を超える濃度で溶解できるようなタイプのものである。これは一般的に、本来公知の技術によって水に溶解する能力を有すること、すなわち高められた温度、例えば約８０℃までの温度での通常の溶解を意味する。
【００５６】
もう一つの好ましい実施形態によれば、澱粉はヒドロキシエチル澱粉に見られるタイプの共有結合した余分の化学基を実質的に含まない。このことは一般的に、澱粉が天然澱粉に見られるタイプの基だけを本質的に含有し、そして例えばヒドロキシエチル澱粉のようには決して改変されていないことを意味する。
別の好ましい実施形態は、２５ＥＵ／ｇ未満のエンドトキシン含有量を有する澱粉を必要とする。
【００５７】
もう一つの好ましい実施形態は、１ｇ当たり１００個未満の微生物、しばしば１ｇ当たり１０個未満の微生物を含有する澱粉を必要とする。
さらに段階ｂ）における混合操作には、３：１〜１０，０００：１、好ましくは３：１〜１００：１の澱粉と生物学的活性物質との重量比を用いることが好都合である。
【００５８】
混合操作にとっては、段階ｃ）において二相水性系が形成される前に活性物質を澱粉溶液と混合することも事実である。活性物質は、例えば緩衝液に溶解した形態、または固体、無定形もしくは結晶の形態であってよく、そして適切な温度、一般的に室温（２０℃）〜４５℃、好ましくは高くとも３７℃であってよい。澱粉溶液を生物学的活性物質に加えることができ、その逆でもよい。この系に使用するのに適する生物学的活性物質、例えばタンパク質は一般的に巨大分子であるので、溶解した巨大分子の溶液を澱粉と混合する際に、巨大分子が一般的に内相または沈殿を示すエマルジョンを形成することが可能である。これは、生物学的活性物質がその生物活性を保持するか、または認め得るほどには失われないならば、全く満足すべきである。次いで撹拌によって均質な溶液、エマルジョンまたは懸濁液が生成され、撹拌は適切な技術を用いて行うことができる。このような技術はこの分野で周知であり、言及できる例は、磁気撹拌、プロペラ撹拌または一つまたはそれ以上の静的ミキサーの使用である。この場合、本発明の特に好ましい実施形態はプロペラ撹拌の使用によって示される。
【００５９】
澱粉微粒子の製造において、固体形態に変換され、そして生物学的活性物質が取り込まれる溶液中の澱粉濃度は、良好な特性を有する澱粉微粒子を形成させるために、少なくとも２０重量％であるべきである。正確にどの温度が個々の各場合に最も良く作用するかは、個々の各生物学的活性物質について簡単な手段で検定することができ、ここで、微粒子中の負荷量は個々の場合に要求される負荷量である。この文脈において、微粒子中に取り込まれる生物学的活性物質は二相系および澱粉のゲル化特性に影響を与えることがあり、これは個々の場合の最適条件を決定する目的で慣用の分取用実験も行われることを意味するということに注目すべきである。実験は一般的に、澱粉濃度が有利には少なくとも３０重量％、一定の特別の場合には少なくとも４０重量％であるべきであることを示す。最高限度としては、通常５０重量％、特に多くとも４５重量％を利用することができる。これらの高い澱粉濃度は、分子量が低下した高度分枝状澱粉の使用なくしては、通常は得ることができない。
【００６０】
二相水性系の形成を目的とする段階ｃ）において用いられるポリマーに関しては、内相としての澱粉と二相系を形成する能力を有する多数のポリマーについての、まさにこの技術分野内の情報が刊行されている。このような全てのポリマーは本発明の範囲内にあると考えるべきである。しかしながら、この文脈において特に適するポリマーはポリエチレングリコールである。このポリエチレングリコールは、好ましくは５〜３５ｋＤａ、より好ましくは１５〜２５ｋＤａ、特に約２０ｋＤａの平均分子量を有する。
【００６１】
ポリマーは水または水溶液（この表現は緩衝液をも包含する）中に適切な濃度で溶解され、そして適切な温度に温度調節される。この温度は、好ましくは４〜５０℃、より好ましくは１０〜４０℃、しばしば１０〜３７℃の範囲内にある。水溶液中のポリマー濃度は、少なくとも２０重量％、好ましくは少なくとも３０重量％、好都合には多くとも４５重量％であることが好都合である。特に好ましい範囲は３０〜４０重量％である。
【００６２】
段階ｃ）における混合操作は多くの異なる手段で、例えばプロペラ撹拌または少なくとも一つの静的ミキサーの使用によって行うことができる。混合は、通常４〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃、しばしば約３７℃の温度範囲内で行われる。バッチバイバッチ法においては、澱粉溶液をポリマー溶液に加えることができ、その逆であってもよい。静的ミキサーまたはブレンダーを利用する場合、この操作は、二つの溶液を二つの異なるパイプラインにポンプ輸送し、ブレンダーを含む共通パイプライン中に送ることによって行うことが好都合である。
【００６３】
油／水または水／油エマルジョンとは対照的に、水／水エマルジョンの相間には高い表面張力がないので、低い剪断力を用いてエマルジョンを形成することができ、この場合に液滴が一定の粒度分布に達するために克服されねばならないのは澱粉溶液の粘度である。大部分の場合、磁気またはプロペラ撹拌で充分である。大規模に、例えば製造すべき微粒子の量が５０ｇを超える場合には、いわゆるじゃま板を使用して、用いられる容器内のよりいっそう効果的な撹拌を得ることが好都合である。水／水エマルジョンを形成する別法は少なくとも一つの静的ミキサーを用いることであり、澱粉溶液を調節された速度で静的ミキサーが配置されたパイプ中にポンプ輸送することが好都合である。ポンプ輸送がこれらの条件下で一様な流速を与え、混合物を不必要に高い剪断力にさらさず、そして純度および望ましくない物質が漏洩しない点で非経口的調製物の製造に許容される限り、任意の型の適切なポンプを用いて行うことができる。静的ミキサーを用いてエマルジョンを生成させる場合にも、適切な撹拌器を備えた容器中で微粒子になる固化を起こさせることが一般的に有利である。
【００６４】
方法の好ましい実施形態は、段階ｅ）においてポリマー溶液を少なくとも２段階で組成物に加えることであり、ここで、エマルジョンが生成したかまたは生成し始めたのちに混合が行われる。
【００６５】
ポリマー溶液を多段階で加えること、および例えば用いられるポリマーの平均分子量および／または濃度を変えること（例えば内相中の澱粉濃度を高めるためにこれが望ましい場合）も、もちろん本発明の範囲内にある。
【００６６】
本発明に係る微粒子の製造において、アセトンのような有機溶剤での沈殿によるのではなく、澱粉がゲル化する自然の傾向または能力によって固化が起こることが不可欠である。前者の手順では、生物学的活性物質が有機溶剤にさらされることになり（これは多くの場合に許容されない）、そして安定な微粒子を制御された手段で得るために要求される物理的架橋結合の自然な形成が存在しないことになる。
【００６７】
微粒子の固化に関しては、取り込まれる生物学的活性物質にとって温和な条件下で固化が起こることが重要である。換言すれば、目下の物質に有害でない温度の使用が第一に問題である。この文脈において、驚くべきことに、このための基準および適切な粒度分布を有する安定な微粒子を形成するための基準は、固化中に二つ以上の温度または温度レベルを用いれば、より容易に満たすことができることが示された。二相系中での固化工程を、固化の最終相で用いられる温度よりも低い温度で開始させると、特に有利である。好ましい実施形態は、固化を１〜２０℃、好ましくは１〜１０℃、特に約４℃の範囲内で開始させ、そして２０〜５５℃、好ましくは２５〜４０℃、特に約３７℃の範囲内で終了させることを意味する。
【００６８】
選択された条件が正しいかまたは適切であるかの確認は、澱粉微粒子が望ましい粒度分布を有すること、後続の洗浄および乾燥操作中に安定であること、およびインビトロで完全に酵素的手段により実質的に溶解することの確認、および／または取り込まれた物質が効果的にカプセル封入されており、かつ生物活性を保持していることの確認によって得ることができる。最後に述べたことは通常クロマトグラフィー法を用いて、またはインビトロもしくはインビボで微粒子が温和な条件下で酵素的に溶解されたのちに、この技術内で確立された他の方法を用いて検査され、そして敏感な生物学的活性物質に対してたくましく信頼性ある製造工程を確保する際の重要な要素である。微粒子が温和な条件下で完全に溶解できることは大きな利点である。なぜならば、このことは、例えば微粒子の溶解に有機溶剤が必要な場合に通常認められる調製物誘導アーチファクト（これは、例えば微粒子がＰＬＧＡマトリックスから構成されている場合に事実である）を最小限にするからである。
【００６９】
外相および余分な活性物質を除去するために、形成された微粒子を適切な手段で洗浄することが好ましい。このような洗浄は濾過によって行うことが好都合であり、これは微粒子の良好な機械的安定性および適切な粒度分布によって可能にされる。遠心による洗浄、上澄み液の除去および洗浄剤への再懸濁も、しばしば適切であろう。各洗浄工程において１種またはそれ以上の適切な洗浄剤が用いられ、これは一般的に緩衝剤含有水溶液である。これに関して、必要に応じて微粒子の粒度分布を調節するため、例えば小さすぎる微粒子を除去し、そして一定の大きさを超える微粒子が最終生成物中に存在しないことを確保するために、篩分けを用いることもできる。
【００７０】
微粒子を適切な手段で、例えば噴霧乾燥、凍結乾燥または真空乾燥によって乾燥することができる。個々の場合にどの乾燥方法を選択するかは、封入された活性物質の生物学的活性の保持にとって何が最も適切であるかにしばしば依存する。工程の考慮事項、例えば能力および純度の面も、重要な意義を持つようになる。凍結乾燥は、正しく計画すれば封入された生物学的活性物質に関して特に温和なので、しばしば好ましい乾燥方法である。取り込まれた生物学的活性物質がその生物活性を保持していることは、この物質が温和な条件下で酵素的に溶解されたのちに、物質に適切な分析によって確立することができる。澱粉に関しての使用に適する酵素は、アルファ−アミラーゼおよびアミログルコシダーゼの単独または組み合わせであり、適切な場合に酵素が可能なプロテアーゼ（これはタンパク質を分解できる）を含まないことを確立することが重要である。プロテアーゼの存在は、この分野で公知の方法で、例えばコントロール実験において生物学的活性物質を混合し、そして微粒子の溶解に後で用いられる条件下で意図した酵素混合物と共にインキュベートしたのちに、常法によりその完全性を決定することによって検出することができる。調製物がプロテアーゼ粗雑物を含有することが認められた場合には、より高い純度を提供するかまたはプロテアーゼから精製された調製物で置き換えることができる。用いられる酵素は、微粒子中に取り込まれた、例えば組み換えタンパク質のような敏感な物質のアーチファクト分解を避けるために、例えば粗雑プロテアーゼからの精製を必要とすることがある。これはこの分野で公知の技術を用いて、例えば適切なクロマトグラフィー材料に結合したα_２−マクログロブリンでのクロマトグラフィーによって行うことができる。
【００７１】
微粒子の放出特性を改変するために、生体親和性および生物分解性のポリマーから生成した放出制御性の外皮を施すこともできる。この文脈において適切なポリマーの例は先行技術に見出され、乳酸およびグリコール酸のポリマー（ＰＬＧＡ）を特に挙げることができる。問題の外皮は好ましくはエアサスペンジョン技術を用いて施される。特に適するこの種の技術は ＷＯ ９７／１４４０８ に記載されており、従ってこれに関する詳細はこの刊行物から得ることができ、その内容は参照により本明細書本文に含められる。上記の方法により得られる澱粉微粒子は、上記のエアサスペンジョン技術によるコーティングに著しく良く適しており、得られた被覆微粒子は非経口的投与に特に良く適している。
【００７２】
製造した微粒子を使用する場合に、それらは放出制御性外皮で被覆されているかまたは被覆されておらず、乾燥微粒子は適切な媒質、具体的には注射を可能にする媒質に懸濁される。このような媒質およびこれらに関する工程はこの分野で周知であるので、ここでさらに詳細に説明する必要はないだろう。実際の注射は適切な針を通して、または針なし注射器を用いて投与することができる。微粒子を注射媒質に事前に再懸濁することなく、乾燥粉末用注射器を用いて注射することも可能である。
【００７３】
上記で論じた利点のほかに、上記の方法は次の利点を有する。すなわち、生物学的活性物質の収率が一般的に高いこと、活性物質の生物活性を保持しながら微粒子中の極めて高い活性物質含有量を得ることが可能であること、得られた微粒子がマクロファージによって貪食されるためには大きすぎ、そして細い針、例えば２３Ｇ〜２５Ｇを通して問題なしに注射できると共に粉末用注射器を用いて注射できるほど充分小さく、かつこのような性質を有するので、これらの微粒子が非経口的制御（例えば遅延または持続）放出に使用するための正しい粒度分布を有すること、および微粒子の分解に際して内在性で中性の分解産物が形成され、これによって活性物質が例えば極度に低いｐＨ値にさらされるのを防止できること。さらに、本方法それ自体は、精密な品質管理に特に良く適している。
【００７４】
本発明に係る調製物は、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよびポリサッカライド、または一般的に、例えば有機溶剤に敏感または不安定な他の薬剤または生物学的活性物質、主として水溶性物質に関して特に興味深い。組み換え産生タンパク質は生物学的活性物質の極めて興味深い一群である。ホルモン、特にヒト成長ホルモンまたは成長因子はこのような物質の興味深い群を示す。しかしながら一般的にいって、本発明はこのような物質の存在に限定されない。なぜならば、本発明の概念は非経口的投与に使用できる全ての生物学的活性物質に適用できるからである。従って敏感性または不安定性の問題との関係のほかに、本発明は、そうしなければ溶剤の除去が困難な場合、または毒物学的問題または他の環境問題が生じるかもしれない場合にも、特に興味深い。
【００７５】
使用すべき生物学的活性物質のクラスは、例えば組み換えタンパク質、グリコシル化組み換えタンパク質、ポリエチレングリコール化（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）組み換えタンパク質、成長因子、サイトカイン、血液凝固因子、モノクローナル抗体、ＬＨＲＨ類似体およびワクチンである。
【００７６】
物質の特定の例は、成長ホルモン、エリスロポエチンおよびその類似体、インターフェロン（α、β、γ）、血液凝固因子Ｖ〜ＸＩＩＩ、プロテインＣ、インスリンおよびその誘導体、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、インターロイキン、グルカゴン様ペプチド１または２、Ｃペプチド、レプチン、腫瘍壊死因子および上皮細胞成長因子である。
【００７７】
非タンパク質薬剤タイプの有用な生物学的活性物質は、次の群から選択することができる：
抗腫瘍剤、抗生物質、抗炎症剤、抗ヒスタミン剤、鎮静剤、筋肉弛緩剤、抗てんかん剤、抗抑うつ剤、抗アレルギー剤、気管支拡張剤、強心剤、抗不整脈剤、血管拡張剤、抗糖尿剤、抗凝固剤、止血剤、麻酔剤およびステロイド。
好ましい非タンパク質薬剤はシバミドである。
しかしながら、本発明に係る新規な微粒子調製物は上記の方法により製造できるものに限定されず、製造方法とは無関係に問題のタイプの全ての微粒子調製物を包含する。
【００７８】
さらに、微小球は、８５重量％を超えるアミロペクチン含有量（その少なくとも８０重量％は上記で定義した平均分子量を有する）を有し、澱粉の乾燥重量１ｇ当たり５０μｇ未満のアミノ酸含有量を有し、そして澱粉分子間に共有化学架橋結合を含まない澱粉から本質的に構成されていてよい。
問題の微粒子の基礎となる澱粉は、方法に関して上記で定義した澱粉タイプの一つであることが好ましい。
【００７９】
微粒子の変形によれば、微粒子中の生物学的物質の生物活性は、この物質が澱粉に取り込まれる前に示した生物活性の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％である。この生物活性は、最も好ましくは大部分が微粒子中で保持または保存されている。
さらに別の変形は、α−アミラーゼおよび／またはアミログルコシダーゼの存在下にインビトロで生物分解性である微粒子によって示される。
別の変形は、生物分解性であり、そして皮下または筋肉内投与ののちに組織から除去される微粒子によって示される。
【００８０】
微粒子の特に好ましい変形は、少なくとも１種のフィルム形成性の生体親和性および生物分解性ポリマーの放出制御性外皮を有する粒子によって示される。
このポリマーは好ましくはα−ヒドロキシ酸から製造されたホモポリマーまたはコポリマーおよび／またはα−ヒドロキシ酸の環状ダイマーであり、このα−ヒドロキシ酸は好ましくは乳酸およびグリコール酸から選択され、環状ダイマーは好ましくはグリコール化合物および乳酸化合物からなる群から選択される。
【００８１】
このような（例えばＰＬＧＡタイプの）ポリマーまたはダイマーは先行技術に正確に記載されており、従ってこれらのさらなる詳細は先行技術から得ることができる。
微小球のもう一つの好ましい変形は、もちろん上記で定義した方法（一般的方法またはこの方法の好ましい実施形態）によって得ることができるかまたは製造される微粒子によって示される。
【００８２】
活性物質を含有する微粒子の生物学的活性の決定に関しては、これを個々の各生物学的物質に適切な手段で行わねばならない。この決定を動物実験において行う場合には、澱粉微粒子中に取り込まれた生物学的活性物質の一定量を、場合によりこれらの微粒子を温和な条件下で予め酵素的に溶解したのちに注射し、そして生物学的応答を、適切な溶液中の同じ生物学的活性物質の相当量を注射したのちに得られる応答と比較する。評価をインビトロで、例えば試験管または細胞培養物で行う場合は、評価の前に澱粉微粒子を温和な条件下で酵素的に溶解することによって生物学的活性物質を完全に利用可能にすることが好ましく、そののちに活性を決定し、そして問題の生物学的活性物質の同一濃度を有するコントロール溶液の活性と比較する。何れの場合にも、評価は澱粉微粒子の分解産物の非特異的効果を含むべきである。
【００８３】
以下の非限定的な実施例を参照して本発明をさらに説明する。これらの実施例において、本文のその他と同様に別に述べない限り、示される％は重量％に関する。実施例１〜７は比較試験に関するが、実施例８〜１５は本発明を示す。
【００８４】
【実施例】
実施例１ａ〜１ｅ−ｂ
コントロール試験： ＥＰ ２１３３０３ Ａ２ による澱粉微小球の製造手順。これらのコントロール試験の目的は技術水準を示すことであった。澱粉濃度は一般的に５％、ＰＥＧ濃度は６％であった（平均分子量６ｋＤａ）。澱粉溶液（１０ｇ）をＰＥＧ溶液（５ｇ、７０℃に温度調節）に注ぎ、室温で撹拌しながら一夜安定化した。次いでこれらの材料を濾過できなかったので９５％エタノールに再懸濁させた。種々の段階中に分離した微小球の生成が観察された。そして可能だった場合には、回収後に生物分解性をインビトロでα−アミラーゼで分析した。最初に濾過による微小球の回収を試みたが、これが不可能だったので遠心分離（Ｓｏｒｆｖａｌｌ， ＳＳ３４、５分、１０，０００ｒｐｍ、２０℃）を採用し、上澄み液を抜き取り、１０ｍｌの９５％エタノールを加えた。
【００８５】
実施例１ａ
ジャガイモ澱粉からの澱粉微小球の製造
ジャガイモ澱粉（Ａｃｒｏｓ ｏｒｇａｎｉｃｓ， Ｌｏｔ Ｎｏ． Ａ０１３６４２３０１）は５％でさえも極めて高い粘度の透明溶液を形成した。一夜安定化したのち、分離した微小球は形成されず、むしろある種の沈殿が形成された。９５％エタノールで洗浄したのち、分離した澱粉微小球は認められず、むしろ硬質の粘調な塊が認められた。
【００８６】
実施例１ａ−ｂ
ＢＳＡを含有する澱粉微小球の製造
実施例１ａにより澱粉微小球を製造したが、二相系の生成前にタンパク質（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、２０％、０．１ｍｌ）を澱粉溶液と混合したことが異なっていた。一夜安定化したのち、分離した微小球は形成されず、むしろある種の沈殿が形成され、９５％エタノールで洗浄したのち、粘調な塊が得られたが、分離した澱粉微小球は観察されなかった。
【００８７】
実施例１ｂ
可溶性澱粉からの澱粉微小球の製造
可溶性澱粉（Ｂａｋｅｒ ＢＶ − Ｄｅｖｅｎｔｅｒ Ｈｏｌｌａｎｄｍ， Ｌｏｔ Ｎｏ． Ｍ２７６０２）は９５℃に加熱したときに幾分オパール様光彩を放つ溶液を与えた。一夜撹拌したのち、分離した微小球ではなくて、ある種の沈殿が形成された。９５％エタノールで洗浄したのち、分離した澱粉微小球を観察することはできず、小さな砂利様粒子の形態で沈殿した。乾燥したのち、用意した全５００ｍｇの澱粉から約４ｍｇの粒子が得られた。α−アミラーゼと共にインビトロでインキュベートしたところ、約６５％の澱粉マトリックスが抵抗性で、溶解しなかった。
【００８８】
実施例１ｂ−ｂ
可溶性澱粉から製造した澱粉微小球中へのＢＳＡの取り込み
二相系の生成前にＢＳＡ（２０％、０．１ｍｌ）を澱粉溶液と混合した以外は、実施例１ｂによる方法を繰り返した。一夜安定化したのち、分離した粒子が形成され、これを回収し、次いで生物分解性をインビトロでα−アミラーゼと共にインキュベートすることによって分析した。その結果、約５７％のマトリックスが可溶性であった。タンパク質収率は低く、微小球を部分的に溶解したのちに得られた濃度がＨＰＬＣ法のための標準曲線の最低基準よりも低かったので、定量できなかった。
【００８９】
実施例１ｃ
酸化した可溶性澱粉からの澱粉微小球の製造
澱粉（Ｐｅｒｆｅｃｔａｍｙｌ Ａ３１０８， Ｓｔａｄｅｘ）は９５℃に加熱したのち、透明溶液を形成した。一夜安定化したのち、分離した微小球は形成されず、試料中に固体物質を認めることは全くできなかった。
【００９０】
実施例１ｃ−ｂ
可溶性澱粉から製造した澱粉微小球中へのＢＳＡの取り込み
二相系の生成前にＢＳＡ（２０％、０．１ｍｌ）を澱粉溶液と混合した以外は、実施例１ｃによる方法を繰り返した。安定化したのち、澱粉とは似ていない沈殿が観察され、洗浄して乾燥したのち、約２ｍｇの固体物質が得られた。
【００９１】
実施例１ｄ
天然の高度分枝状澱粉（アミロペクチン）からの澱粉微小球の製造
天然アミロペクチン澱粉（Ｃｅｒｅｓｔａｒ ＳＦ ０４２０１）は９５℃に加熱すると透明で粘調な溶液を与えた。一夜撹拌したのち、分離した微小球を観察できなかったが、試料はある種の沈殿を生成した。９５％エタノールで洗浄したのち、試料は粘液質の集団となり、分離した澱粉微小球を含有していなかった。
【００９２】
実施例１ｄ−ｂ
天然の高度分枝状澱粉（アミロペクチン）から製造した澱粉微小球中へのＢＳＡの取り込み
二相系の生成前にＢＳＡ（２０％、０．１ｍｌ）を澱粉溶液と混合した以外は、実施例１ｄによる方法を繰り返した。安定化したのち、澱粉とは似ていない沈殿が観察され、洗浄して乾燥したのち、粘調な塊が得られた。
【００９３】
実施例１ｅ
酸加水分解して剪断したアミロペクチンからの澱粉微小球の製造
澱粉は本来、酸加水分解したワックス様メイズ（Ｃｅｒｅｓｔａｒ ０６０９０）からなり、そして二相水性系中での澱粉微小球の製造にいっそう適する分子量分布を与えるために、機械的剪断も行った。約９５℃に加熱したのち、透明溶液が得られた。一夜撹拌したのち、分離した微小球を観察できなかったが、試料はある種の沈殿からなっていた。９５％エタノールで洗浄したのち、分離した微小球を観察できなかったが、澱粉は小さな粒子を形成していた。
【００９４】
実施例１ｅ−ｂ
酸加水分解して剪断した澱粉（アミロペクチン）から製造した澱粉微小球中へのＢＳＡの取り込み
二相系の生成前にＢＳＡ（２０％、０．１ｍｌ）を澱粉溶液と混合した以外は、実施例１ｅによる方法を繰り返した。一夜安定化したのち、分離した微小球を観察できなかった。その一方で、極めて小さな粒子を観察できた。回収したのちに得られた量は少なかったので、正確な決定を行うことができなかった。
【００９５】
実施例２
アミロースからの澱粉微小球の製造
澱粉微小球のインビトロおよびインビボ生物分解性を分析する目的で、アミロース（Ｓｅｒｖａ から）から澱粉微小球を製造した。アミロースは手動製造を可能にするためにはあまりにも急速にゲル化するので、連続的製造を可能にする機械を用いた。この機械の中心ユニットは、澱粉を約１５０℃に急速加熱し、次いで約４５℃に冷却したのち、タンパク質溶液または緩衝液との混合を可能にする超音波ユニットである。澱粉溶液を蒸留水中で調製した。なぜならば、そうしないと超音波ユニットで加熱したときに褐色に変色するからである。澱粉はエンドウからの予備ゼラチン化アミロース（４％）からなり、繰り返し均質化したにもかかわらず、多数の塊が残った。流れを次のように調節した：澱粉（５ｍｌ／分）、トリス緩衝液、ｐＨ７．８（１．２ｍｌ／分）、およびＰＥＧ溶液（平均分子量３００，０００ＤａのＰＥＧ２．４重量％）、これは６．９％の塩化ナトリウムおよび１４．３％のマンニトールも含んでいた。微小球を室温で数時間、次いで遠心分離器中で一夜安定化した。微小球を遠心分離器中での逐次洗浄によって回収した：７０％エタノールで３回、１ｍＭの塩化カルシウムおよび０．０２％のナトリウムアジドを含む５ｍＭのリン酸塩緩衝食塩溶液（ｐＨ７．４）で３回、最後に９９．５％エタノールで３回。微小球を真空乾燥した。調製物中に若干の極めて小さな粒子があったので、これらを９９．５％エタノール中で３回沈降させることによって除去する試みを行ったが、これらが完全に除去される結果とはならなかった。合計９．５ｇの微粒子が得られ、沈降後に８．５ｇが残った。
【００９６】
粒度分布を Ｍａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ で決定し、広いことが認められ、最小微小球は約５μｍで、最大は１６０μｍを超えた。体積から計算した平均直径は２５μｍであった。微小球をα−アミロースと共に３７℃でインビトロで２週間インキュベートしたとき、約３０〜４０％の澱粉マトリックスが溶解された。
【００９７】
この比較例は、アミロースからの微小球の製造に伴う困難を示している。なぜならば、アミロースは均質溶液にするのが困難であり、溶解のために極めて高い温度が必要であり、そしてこれらの高温にかけると分解を受けやすく、そして極めて急速にゲル化するからである。この実施例はまた、得られた微小球が、製造直後および粒度分布を狭める試み後の両方で、あまりにも広い粒度分布を有し、そして皮下または筋肉内注射後の持続放出に良く適するためには１０μｍ未満の大きさを有する微小球の含有量があまりにも高いことを示している。この実施例はまた、インビトロで分析した生物分解性が、分析した時間にわたって不完全であることを示している。
【００９８】
実施例３
β−ラクトグロブリンを含有する澱粉微小球の製造
モデルタンパク質であるβ−ラクトグロブリンの固定化の有効性を分析するために、アミロース（Ｓｅｒｖａ）から澱粉微小球を製造した。このアミロースは完全手動製造を可能にするためにはあまりにも急速にゲル化するので、澱粉を約１５０℃に急速加熱し、次いで約４５℃に冷却したのち、タンパク質溶液または緩衝液との混合を可能にする超音波ユニットを備えた機械を用いた。澱粉溶液（１０％）を蒸留水中で調製し、流れを５ｇ／分に設定した。澱粉溶液（２．５ｍｌ）をプラスチックビーカーに集め、温度が５０〜７０℃に低下したときにタンパク質溶液（０．６ｍｌ、緩衝液中８．３％）を澱粉溶液に磁気撹拌しながら加えた。大まかにいって、その直後に第一のＰＥＧ溶液（１０％、平均分子量２０，０００Ｄａ、３．０ｍｌ）を澱粉溶液に撹拌しながら加え、１分間撹拌したのち第二のＰＥＧ溶液（４０％、平均分子量２０，０００Ｄａ、１０ｍｌ）をエマルジョンに加え、これを室温で翌日まで放置して安定化した。充分なタンパク質負荷量を保持する微小球の能力を示すために、形成された微小球を二つの異なる方法で回収した。第一の洗浄方法は、緩衝液での遠心洗浄からなり、ほとんど全てのタンパク質が澱粉微小球から浸出する結果となった。また第二の回収方法では、微小球中のラクトグロブリン負荷量を高めるためにイソプロピルアルコールを用いた。この方法において、最初に７０％イソプロピルアルコールで３回、次いで１ｍＭの塩化カルシウムおよび０．０２％のナトリウムアジドを含む５ｍＭのリン酸塩緩衝食塩溶液で１回、次いで同じ緩衝液でもう１回、次いで同じ緩衝液中で撹拌しながら１時間放置、その後に同じ緩衝液で５回、最後に１００％イソプロピルアルコールで３回、洗浄を行った。次いで微小球を真空乾燥した。イソプロピルアルコール洗浄を用いたタンパク質負荷量は３．６％であった。これは理論収率の１８％に相当する。
【００９９】
数ある中で、この実施例は、アミロースからのタンパク質含有微小球の製造における重要な実施困難性を指摘している。なぜならば、澱粉溶液を完全に溶解するために極めて高い温度にかけねばならないからであり、澱粉がこれらの高温で容易に化学変化を行い、そして澱粉溶液が敏感なタンパク質と混合するのを可能にするため合理的に低い温度に冷却したのちにも、極めて急速にゲル化するからである。微小球の形成および微小球中へのタンパク質の閉じ込めを可能にするために二つの異なるＰＥＧ溶液の使用を必要とすることによって、製造はさらに複雑になる。もう一つの重大な欠点は、許容されるタンパク質負荷量を得るために、微小球の回収にイソプロピルアルコールの使用が必要なことである。なぜならば、たいていの敏感なタンパク質がイソプロピルアルコールまたは同様の有機溶剤にさらされるのに耐えないからである。このアミロースから製造された澱粉微小球は、インビトロまたはインビボのどちらでもα−アミロースによって完全には生物分解されない。
【０１００】
実施例４
エンドウからのアミロースの製造
澱粉顆粒からの浸出によってアミロースを製造した。ＮＵＴＲＩＯ−Ｐ−ｓｔａｒ ３３（３００ｇ、Ｎｏｒｄｆａｌｋ）を水（７２００ｇ）に懸濁させ、この懸濁液を７５℃に１時間加熱した。膨潤した顆粒を遠心分離によって除去し、得られた溶液を、最初に活性炭フィルター、次いでプレフィルター（Ｆｉｌｔｒｏｎ、１．５μｍ）、最後に滅菌フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、０．２μｍ）を通して濾過した。濾過した溶液を冷蔵庫内に一夜入れておくとアミロースが沈殿し、これを遠心分離によって回収した。得られた沈殿をエタノール（９５％、７００ｍｌ）で２回洗浄し、次いで真空乾燥した。約３０ｇのアミロースが得られた。
【０１０１】
実施例５
澱粉微小球のインビトロおよびインビボ生物分解性を分析する目的で、実施例４により調製したアミロースから澱粉微小球を製造した。アミロースは手動製造を可能にするためにはあまりにも急速にゲル化するので、連続的製造を可能にする機械を用いた。この機械の中心ユニットは、澱粉を約１５０℃に急速加熱し、次いで約４５℃に冷却したのち、タンパク質溶液または緩衝液との混合を可能にする超音波ユニットである。澱粉溶液を蒸留水中で調製した。なぜならば、そうしないと超音波ユニットで加熱したときに褐色に変色するからである。澱粉はエンドウの予備ゼラチン化アミロース（４％）からなり、繰り返し均質化したにもかかわらず、多数の塊が残った。流れを次のように調節した：澱粉（５ｍｌ／分）、トリス緩衝液、ｐＨ７．８（１．２ｍｌ／分）、およびＰＥＧ溶液（平均分子量３００，０００ＤａのＰＥＧ２．４重量％）、これは６．９％の塩化ナトリウムおよび１４．３％のマンニトールも含んでいた。微小球を室温で数時間、次いで遠心分離器中で一夜安定化した。微小球を遠心分離器中での逐次洗浄によって回収した：７０％エタノールで３回、１ｍＭの塩化カルシウムおよび０．０２％のナトリウムアジドを含む５ｍＭのリン酸塩緩衝食塩溶液、ｐＨ７．４で３回、最後に９９．５％エタノールで３回。微小球を真空乾燥した。調製物中に若干の極めて小さな粒子があったので、これらを９９．５％エタノール中で３回沈降させることによって除去する試みを行ったが、これらが完全に除去される結果とはならなかった。収量は沈降後に８．５ｇで、その間に１ｇの微小球が除去された。
【０１０２】
粒度分布を Ｍａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ で決定し、広いことが認められ、最小微小球は約５μｍで、最大は１６０μｍを超えた。体積から計算した平均直径は２５μｍであった。
【０１０３】
澱粉微小球の生物分解性をインビトロでα−アミロースと共にインキュベートすることによって分析した。分解は初期は急速で、１日後に約３５〜４５％が可溶性形態に変換された。その後に分解速度は減速し、６日後に約５０％が溶解された。その後の生物分解性は無視できるほどで、２５日後に依然として約５０％の澱粉微小球が未溶解形態のままであった。
【０１０４】
この比較例は、アミロースからの微小球の製造に伴う困難を示している。なぜならば、アミロースは均質溶液にするのが困難であり、溶解のために極めて高い温度が必要であり、そしてこれらの高温にかけると分解を受けやすく、そして極めて急速にゲル化するからである。この実施例はまた、得られた微小球が製造直後および粒度分布を狭める試み後の両方で、あまりにも広い粒度分布を有し、そして皮下または筋肉内注射後の持続放出に良く適するためには１０μｍ未満の大きさを有する微小球の含有量があまりにも高いことを示している。この実施例はまた、インビトロで分析した生物分解性が不完全であることを示している。
【０１０５】
実施例６
アミロースから製造した澱粉微小球のインビボ生物分解性の分析
実施例４でアミロースから製造した澱粉微粒子（３．０１ｍｇ）を、１００μｌの体積で、下垂体切除を受けた８匹の Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ 系ラットの首に皮下注射した。注射後８〜９日に、全てのラットの注射部位の皮下に小結節を検知することができた。注射後９日に解剖して巨視的検査を行ったところ、全てのラットの注射部位に小さな白い嚢胞が認められた。これらの巨視的変化を４％リン酸塩緩衝ホルムアルデヒドに固定化し、パラフィンワックスに包埋し、名目厚さ５μｍに切断し、ヘマトトキシンおよびエオシンで染色し、光学顕微鏡下に検査した。澱粉微小球を認めることのできたパラフィンワックス切片において、それらは巨細胞を含む顆粒化組織の区域によって取り囲まれた好エオシン小球として見え、この組織反応を皮下組織における慢性「肉芽種性」炎症と確認した。澱粉微小球はマクロファージの内部にも観察することができた。
この試験は、アミロースから製造した澱粉微小球が、注射後９日に皮下組織中に認められ、従ってその期間中に溶解されるには充分に生物分解されなかったこと、および何れの場合にも、ある割合の微小球がマクロファージによる貪食作用を可能にするのに充分小さかったことを示している。
【０１０６】
実施例７
アミロースから製造した澱粉微小球のインビボ生物分解性の分析
実施例４によりアミロースから製造した澱粉微粒子を、１０ｍｌのリン酸塩緩衝（５ｍＭ）生理食塩溶液（０．１５Ｍ）、ｐＨ７．２に懸濁させ、若いブタの脚に筋肉内注射した。２匹のブタに１２０ｍｇの澱粉微小球を与え、２匹のブタに６００ｍｇの澱粉微小球を与えた。動物を１４日目に犠牲にし、組織を巨視的変化について検査し、通常の包埋および染色工程ののち、顕微鏡的変化を検査した。１４日目に、微小球は組織中に用量に依存する程度で認められた。若干の微小球はマクロファージおよび巨細胞による貪食作用を受けており、細胞内に認められた。これは微小球の極めて遅い分解を示している。
この試験は、アミロースから製造した澱粉微小球が、注射後２週間に筋肉内組織中に認められることを示し、このことは、これらの微小球の生物分解性が極めて遅いことを示している。
【０１０７】
実施例７ｂ
澱粉微小球の生物分解性、および有機溶剤にさらすことなくタンパク質を取り込む澱粉微小球の能力を分析する目的で、ジャガイモからの酸加水分解アミロース（Ｒｅｐｐａｌ ＰＳＭ６０Ｕ）（低分子量成分を除去するためにこれを限外濾過に供した）から澱粉微小球を製造した。β−ラクトグロブリンをモデルタンパク質として用いた。澱粉濃度は２４％であり、４ｍｌのこの溶液を１．６ｍｌのタンパク質溶液（これは３７℃で５０ｍｇ／ｍｌの濃度を有する）と混合し、ＰＥＧ（平均分子量１００ｋＤａ、１５％、４ｍｌ）と混合し、撹拌してエマルジョンを形成した。微小球は室温で一夜撹拌する間に固化した。微小球は室温で一夜撹拌する間に固化した。
【０１０８】
緩衝液（５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．８）中で遠心洗浄する間に、全てのタンパク質が微小球から浸出した。イソプロピルアルコール、または最初に平均分子量１００，０００Ｄａの１５％ＰＥＧ、次いで平均分子量１０，０００Ｄａの４０％ＰＥＧ、最後にイソプロピルアルコールのシリーズを用いた場合だけ、１．５〜３％に相当するタンパク質を微小球中に認めることができた。微小球の生物分解性をインビトロで分析した。これは初期は急速で、２４時間後に約６０％のマトリックスが可溶性形態に変換された。その後に分解はやみ、７日後に約７０％のマトリックスがこれらの条件下で生物分解された。
若干のタンパク質負荷量を上記の微小球中で得るためには、タンパク質を有機溶剤で沈殿させる必要があった。これは敏感なタンパク質には許容されない方法である。得られた微小球もまた、インビトロで完全には生物分解性でなかった。
【０１０９】
実施例７ｃ
澱粉微小球の生物分解性、および有機溶剤にさらすことなくタンパク質を取り込む澱粉微小球の能力を分析する目的で、ジャガイモからの広範囲に加水分解したアミロース（Ｒｅｐｐａｌ ＰＳＭ２５， Ｒｅｐｐｅ， Ｇｌｙｋｏｓ． Ｖａｅｘｊｏｅ）から澱粉微小球を製造した。β−ラクトグロブリンをモデルタンパク質として用いた。澱粉濃度は２０％であり、４ｍｌのこの溶液を１．６ｍｌのタンパク質溶液（これは３７℃で５０ｍｇ／ｍｌの濃度を有する）と３７℃で混合した。微小球は室温で一夜撹拌する間に固化した。
【０１１０】
緩衝液（５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．８）中で遠心洗浄する間に、全てのタンパク質が微小球から浸出した。イソプロピルアルコール、または最初に平均分子量１００，０００Ｄａの１５％ＰＥＧ、次いで平均分子量１０，０００Ｄａの４０％ＰＥＧ、最後にイソプロピルアルコールのシリーズを用いた場合だけ、１．５〜２．５％に相当するタンパク質を微小球中に認めることができた。微小球の生物分解性をインビトロで分析した。これは初期は急速で、２４時間後に約５５％のマトリックスが可溶性形態に変換された。その後に分解はやみ、７日後に約７０％のマトリックスがこれらの条件下で生物分解された。
若干のタンパク質負荷量を上記の微小球中で得るためには、タンパク質を有機溶剤で沈殿させる必要があった。これは敏感なタンパク質には許容されない方法である。得られた微小球もまた、インビトロで完全には生物分解性でなかった。
【０１１１】
実施例８
剪断した高度分枝状澱粉から製造した澱粉微小球中への高負荷量のＢＳＡの固定化
平均分子量１６００ｋＤａの剪断した高度分枝状澱粉の澱粉溶液（４０％）、平均分子量２０，０００ＤａのＰＥＧ溶液（３８％）およびＢＳＡ溶液（１４％）を５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．３中で調製した。澱粉溶液の温度を５０〜５５℃に、ＰＥＧおよびＢＳＡの溶液の温度を約３３℃に調節した。澱粉溶液（２ｇ）をＢＳＡ溶液（０．７ｍｌ）と混合した。得られた溶液をスプレーポンプに取り付けたスプレーに抜き取った。ＰＥＧ溶液（２９ｇ）を別のスプレーポンプに取り付けた別のスプレーに入れた。澱粉／ＢＳＡおよびＰＥＧの混合物をスプレーポンプにより静的ミキサーを通してビーカー（ここでエマルジョンがプロペラ（１００ｒｐｍ）で撹拌される）にポンプ輸送することによって、澱粉微小球を製造した。工程のこの部分には、開始から全てが混合されるまで２分間かかった。ビーカー中での撹拌を１０分間続けさせ、次いで試料を４℃に変え、そこで試料を撹拌しながら約４時間放置した。その後に溶液のｐＨ値を約５．５に低下させ、この調製物を撹拌することなく３７℃で一夜放置した。澱粉微小球を Ａｍｉｃｏｎ（Ａｍｉｃｏｎ 限外濾過セル）で５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．５中で濾過することによって洗浄し、凍結乾燥した。
【０１１２】
タンパク質および澱粉の収率、およびタンパク質負荷量を決定するために、乾燥した微小球をα−アミロースおよびアミログルコシダーゼの酵素作用によって溶解した。タンパク質収率は９４％、澱粉収率は８９％、得られた負荷量は１０％であった。Ｍａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ で決定した平均粒径は９０μｍであり、３５μｍ未満の分布は１０％未満であった。α−アミロース、またはα−アミロースおよびアミログルコシダーゼと共にインキュベートすることにより、微小球は４８時間以内に完全に溶解された。
【０１１３】
この実施例は、タンパク質ＢＳＡを高い収率で固定化できること、および得られた微小球が高い負荷量のタンパク質を有することを示している。微小球は生物分解性である。なぜならば、微小球がα−アミラーゼによりインビトロで完全に溶解され、そして実際の抽出工程のためにアーチファクトを持ち込むことなく、固定化されたタンパク質の正確な化学的分析を可能にする温和な条件下でこの溶解を行うことができるからである。この実施例はまた、閉じ込められた全てのタンパク質を微小球の溶解後に回収できることを示している。
【０１１４】
実施例９
剪断した高度分枝状澱粉から製造した澱粉微小球中への高負荷量のＢＳＡの固定化
平均分子量１６００ｋＤａの剪断した高度分枝状澱粉の澱粉溶液（４０％）、ＰＥＧ溶液（３８％、平均分子量２０，０００Ｄａ）およびＢＳＡ溶液（１６％）を５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．３中で調製し、これらを用いてＢＳＡを含有する澱粉微小球を製造した。澱粉溶液の温度を５０〜５５℃に、ＰＥＧおよびＢＳＡの溶液の温度を約３０℃に調節した。澱粉微小球を ＩＫＡ 反応器（ＩＫＡ 実験室用反応器 ＬＲ２５０）中で製造した。澱粉溶液（２０ｇ）をＢＳＡ溶液（６．７ｍｌ）と混合した。ＰＥＧ溶液（２９０ｇ）を反応容器に撹拌しながら（１００ｒｐｍ）約６分間にポンプ輸送し、撹拌を約１５分間続けた。この調製物を４℃にし、撹拌しながら一夜間放置した。溶液のｐＨ値を約５．５に低下させ、３７℃に移し、そこで撹拌することなく約７時間放置した。ＢＳＡを含有する澱粉微小球を５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．５で洗浄し、凍結乾燥した。
【０１１５】
タンパク質および澱粉の収率、およびタンパク質負荷量を決定するために、乾燥した微小球をα−アミロースおよびアミログルコシダーゼの酵素作用によって溶解した。タンパク質収率は９９％、澱粉収率は９１％、得られた負荷量は１１．５％であった。Ｍａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ で決定した平均粒径は４８μｍであり、１７μｍ未満の分布は１０％未満であった。α−アミロース、またはα−アミロースおよびアミログルコシダーゼと共にインキュベートすることにより、微小球は４８時間以内に完全に溶解された。
【０１１６】
実施例１０
剪断した高度分枝状澱粉から製造した澱粉微小球中への高負荷量のＢＳＡの固定化
平均分子量１９３０ｋＤａの剪断した高度分枝状澱粉の澱粉溶液（２０％）、ＰＥＧ溶液（３８％、平均分子量２０，０００Ｄａ）およびＢＳＡ溶液（２０％）を５０ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．８中で調製した。澱粉溶液の温度を５０〜５５℃に、他の溶液の温度を約３７℃に調節した。澱粉溶液（３ｇ）をＢＳＡ溶液（０．７ｍｌ）と混合した。この混合物をシリンジに抜き取り、ビーカー中のＰＥＧ溶液（２８ｇ）に撹拌しながら加えた。この調製物を４℃に移し、そこで４時間放置し、その後に３７℃に移し、そこで一夜間放置した。ＳＢＡを含有する澱粉微小球を５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．５で洗浄し、凍結乾燥した。
【０１１７】
タンパク質および澱粉の収率、およびタンパク質負荷量を決定するために、乾燥した微小球をα−アミロースおよびアミログルコシダーゼの酵素作用によって溶解した。タンパク質収率は９１％、澱粉収率は９０％、得られた負荷量は１０．６％であった。Ｍａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ で決定した平均粒径は４４μｍであり、２１μｍ未満の分布は１０％未満であった。α−アミロース、またはα−アミロースおよびアミログルコシダーゼと共にインキュベートすることにより、微小球は４８時間以内に完全に溶解された。
【０１１８】
実施例１１
剪断した高度分枝状澱粉から高い澱粉濃度およびＰＥＧ濃度、および温度サイクルを用いて製造した澱粉微小球中への結晶質ｈＧＨの固定化
亜鉛ｈＧＨの結晶を ＥＰ ０ ５４０ ５８２ Ｂ１ により製造した。この結晶の懸濁液を、２ｍＭの酢酸亜鉛を含有する１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．４中で調製した。
【０１１９】
平均分子量３７８ｋＤａの剪断した高度分枝状澱粉から１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．４中で澱粉溶液（４０％）を調製し、平均分子量２０，０００ＤａのＰＥＧ溶液を３０％の濃度で調製した。これを１Ｍ ＨＣｌでｐＨ６．４に調節した。溶液の温度を次のように調節した：澱粉溶液は５０〜５５℃、ＰＥＧ溶液は３７℃、Ｚｎ−ｈＧＨ結晶の懸濁液は３７℃。４．９ｇの澱粉溶液を７ｍｌのＺｎ−ｈＧＨ結晶懸濁液に撹拌しながら加えた。約２０秒ののち、２８ｇのＰＥＧ溶液をスプレーポンプによって約６分間で加え、その間４００ｒｐｍで撹拌を続けた（Ｅｕｒｏｓｔａｒ デジタル）。直ちに微小球が形成し始め、約１５分後に３７℃から４℃に移し、そこで撹拌しながら４時間保持した。４時間の安定化ののち、微小球が安定であったので、３７℃に移し、そこで撹拌することなく一夜保持することがきた。得られた微小球を、３７℃で約１７〜２０時間安定化したのち、２ｍＭの酢酸亜鉛を含有する１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．４で Ａｍｉｃｏｎ で３回洗浄し、凍結乾燥した。
【０１２０】
タンパク質および澱粉の収率、タンパク質負荷量およびタンパク質の品質を決定するために、乾燥した微小球をα−アミロースおよびアミログルコシダーゼの酵素作用によって溶解した。タンパク質収率は９５．２％、澱粉収率は６８％、微小球中のタンパク質負荷量は２７．８％であった。Ｍａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ で決定した平均粒径は５９μｍであり、２９μｍ未満の分布は１０％未満であった。α−アミロース、またはα−アミロースおよびアミログルコシダーゼと共にインキュベートすることにより、微小球は４８時間以内に完全に溶解された。タンパク質のダイマー含有量は０．７５％、ポリマー含有量は＜０．１％であった。
【０１２１】
この試験は、本発明によれば、固体形態に変換されたタンパク質でさえも高い収率で固定化することができ、高い負荷量のタンパク質を有する澱粉微小球が生成する結果となることを示している。この試験はまた、得られた澱粉微小球を、実験的調製物に由来するアーチファクトを持ち込むことなく、固定化されたタンパク質の特性の厳しい品質管理を可能にする温和な条件下で溶解できること、およびタンパク質が工程中に分解されないことを示している。得られたタンパク質の品質はヒトへの非経口的投与に許容される。
【０１２２】
実施例１２
剪断した高度分枝状澱粉の澱粉微小球中へのＢＳＡの固定化およびインビボ生物分解性の分析
平均分子量１９３０ｋＤａの剪断した高度分枝状澱粉から、ＢＳＡを含有する澱粉微小球を次の条件下で製造した：澱粉（３０％、１００ｍｌ）をＰＥＧ（３８％、１４６６ｍｌ、平均分子量２０ｋＤａ）と混合し、最初に２０℃で６時間、次いで３７℃で一夜撹拌した。これらを０．６％ヒアルロン酸ナトリウム（分子量２０００ｋＤａ、Ｋｒａｅｂｅｒ ＧｍｂＨ， Ｈａｍｂｕｒｇ）からなる注射用ビヒクル中の３０ｍｇの用量でラットに皮下および筋肉内投与し、３日および７日後に注射部位の組織学的分析用標本を作製した。３日目に注射部位で細胞浸潤が観察され、これらの変化は７日までに既に消失していた。
この試験は、剪断した高度分枝状澱粉から製造した澱粉微小球がインビボで１週間以内に急速に生物分解されること、および組織が急速に正常化されることを示している。
【０１２３】
実施例１３
ブタにおける澱粉微小球の生物分解性の決定
平均分子量５２９ｋＤａの剪断した澱粉から澱粉微小球を製造した。澱粉を溶解後の濃度が３０％となるように１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．４に秤量して入れ、平均分子量２０のＰＥＧを溶解後の最終濃度が２７％となるように同じ緩衝液に秤量して入れた。次いでオートクレーブ処理によって溶液を調製した。ＩＫＡ 反応器中で Ｅｕｒｏｓｔａｒ デジタル撹拌制御装置（Ｌａｂａｓｃｏ）を用いて製造を行った。１４．３５ｇの澱粉溶液を製造に用い、溶解後にこれを５０℃で暖かく保持し、その後に２００ｇのＰＥＧ溶液を反応器に供給した。プロペラを用いて１６０ｒｐｍで撹拌することによってエマルジョンを形成し、８分後に撹拌速度を１４０ｒｐｍに、５時間後に１１０ｒｐｍに調節し、温度を２０℃に７時間、その後に３８℃に１７時間に設定した。次いで得られた澱粉微小球を３００ｍｌの水で４回洗浄し（Ａｍｉｃｏｎ 限外濾過装置 ８４００）、凍結乾燥した。乾燥した澱粉微小球を３８および１００μｍスクリーンを用いて篩分けした（Ｒｅｔｓｈ 篩分機）。篩分け前に得られた澱粉微小球の全量は３．６１ｇ（これは約８６％の収率に相当する）、篩分け後は２．５４ｇ（これは約５９％の収率に相当する）であった。
【０１２４】
注射用水中に０．１１％ヒアルロン酸ナトリウム、４％マンニトールを含む溶液の１ｍｌに澱粉微小球を再懸濁させ、１００ｍｇの微小球をブタに皮下注射した。注射部位の組織学的評価用標本を作製した。注射後７日に澱粉微小球を観察することができなかった。
この試験は、澱粉微小球が急速に分解され、１週間以内に注射部位から消失したことを示している。
【０１２５】
実施例１４
剪断した高度分枝状澱粉から温度サイクルを用いて製造した澱粉微小球中にｈＧＨを含有する澱粉微小球の製造、その被覆、およびブタへの非経口的投与後の閉じ込められたタンパク質を制御放出する微小球の能力の分析
結晶質ｈＧＨを含有する澱粉微小球を実施例１１により製造した。
得られた澱粉微小球を、ＷＯ ９７／１４４０８ に記載のエアサスペンジョン法により、異なる放出速度を得るために異なる外皮組成を用いてＰＬＧＡの放出制御性外皮で被覆した。ＰＬＧＡの次の混合物を用いた：バッチ１（−■−）は７５％ ＲＧ５０２Ｈ および２５％ ＲＧ７５６、バッチ２（−□−）は６０％ ＲＧ５０２Ｈ および４０％ ＲＧ７５６、バッチ３（−○−）は７５％ ＲＧ５０４Ｈ および２５％ ＲＧ７５６、バッチ４（−Δ−）は１００％ ＲＧ５０４Ｈ。
【０１２６】
ｈＧＨの薬物動態をブタにおいて分析し、その免疫系の反応性を、薬物動態に影響を与えるかもしれないヒト成長ホルモンに対する抗体の形成を避けるためにシクロスポリンＡ（２０ｍｇ／ｋｇ）、アザチオプリン（２ｍｇ／ｋｇ）およびプレドニゾロン（２ｍｇ／ｋｇ）の経口的投与によって抑制した。被覆微小球を１．２５ｍｇのｈＧＨ／ｋｇの用量で１９Ｇ針を用いて首に皮下投与した。各処方物について５匹のブタを研究した。注射前、および０．０２、０．０４、０．０８、０．１７、０．２５、０．３３日後に、その後は投与後２９日に研究が終了するまで毎日、血液サンプルを採取した。ｈＧＨ血清濃度を決定した。図１に、異なる処方物について得られたｈＧＨ血清濃度の平均値を示す。
【０１２７】
この試験は、ＰＬＧＡで被覆した澱粉微小球がブタへの非経口的投与後に制御され延長されたｈＧＨの放出を生じることを示している。得られたｈＧＨ濃度は一般的に上昇したレベルのインスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）（これはヒトにおける生物学的効果の指標である）を誘導する０．２ｎｇ／ｍｌのレベルを超えることを示している（図１）。（Ｐｕｔｎｅｙ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９８， ２：５４８−５５２）。この実施例はまた、ｈＧＨの薬物動態を被覆外皮の組成の変更によって有意に変更できることを示している。この実施例はさらに、以前に利用できた非経口的延長放出調製物と比較して、例外的に低い初期放出、いわゆるバーストを達成できることを示している。この試験はまた、高レベルの生体利用率を１９〜５２％の範囲で一般的に達成でき、そして初期放出、いわゆるバーストののちに生じる延長された放出期では７２〜９６％と例外的に高い割合で達成できることを示している。
血漿中のｈＧＨの分析は Ａｇｅｒｓｏｅ らに従って行った（Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ ４１ （１９９９））。
【０１２８】
実施例１５
下記の実施例は、異なる特性を有する二つの異なる処方物を混合することによって処方物を最適化できる方法を示す。
最初に、ヒト成長ホルモンを含有する澱粉微小球を、バッチ１およびバッチ２で得られる負荷量がそれぞれ７．７および７．６％とした以外は実施例１４により製造し、バッチ１を単一ポリマー ＲＧ５０２Ｈ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）で被覆し、用いた被覆用エマルジョンに炭酸亜鉛の固体粒子を混合して内部第三被覆を生成したが、その一方でバッチ２を７５％の ＲＧ５０２Ｈ および２５％の ＲＧ７５６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）からなるポリマー混合物で被覆した。
【０１２９】
微小球中に取り込まれたタンパク質の放出を、下垂体切除を受けたラット（ＭＯＬ：Ｗｉｓｔ）において研究した。０．１５％のヒアルロン酸、８０ｍＭのＮａＣｌ含有３０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４を含有する溶液に微小球を懸濁させた。動物に２００μｌの体積で１８Ｇ針を用いて首に皮下注射した。バッチ当たり５匹の動物に注射した。用量は７５０μｇのｈＧＨ／動物であった。血液サンプル（２５０μｌ）を二酸化炭素麻酔下に眼窩神経叢から採取した。血清を抽出し、−１８℃で保存した。血清サンプルを特異的成長ホルモン抗体に基づくＩＲＭＡ法によって分析した（Ｔａｎｄｈｅｍ−Ｒ ｈＧＨ， Ｈｙｂｒｉｔｅｃｈ）。
【０１３０】
バッチ１および２を動物モデルにおいて試験して分析し、そして血漿濃度曲線を編集したのち、バッチ１および２を同量で混合した場合に血漿曲線がどのように現れるかを計算した。各時点において二つのバッチの血漿濃度の平均値を取ることによって、値を個々に計算した。次いで両者の混合物を用いて上記の試験を繰り返した。得られた血漿濃度曲線を編集した。これは図２Ａおよび２Ｂにプロットされている。これは、異なる放出特性を有する二つのバッチを調節して混合することによって、所望の放出プロフィールおよび生物学的活性物質の血清または血漿濃度を得ることが可能であることを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】
異なった処方物（バッチ１、バッチ２、バッチ３およびバッチ４）について得られたｈＧＨ血漿濃度の平均値を示す。

Claims (38)

1. 調製物が、濃度−時間曲線から注射後の最初の２４時間中の曲線下の面積と所定の曲線下の面積との比の形で決定して、注射後の最初の２４時間中に全放出量の２５％未満である活性物質の放出量を示す、有機溶剤に敏感または不安定である生物学的活性物質を含有する非経口的投与可能な生物分解性微粒子調製物。
2. 注射後の最初の２４時間中の放出量が、全放出量の２０％未満、好ましくは１５％未満、より好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満である、請求項１に記載の調製物。
3. 調製物が、注射後の最初の４８時間中の生物学的活性物質の最高血漿または血清濃度が注射後４８時間を超えた時点における最高濃度の３００％未満である活性物質の放出量を示す、有機溶剤に敏感または不安定である生物学的活性物質を含有する非経口的投与可能な生物分解性微粒子調製物。
4. 最高濃度が、上記の最高濃度の２００％未満、好ましくは１００％未満である、請求項３に記載の調製物。
5. 請求項１または２で定義した放出量を示す、請求項３または４に記載の方法。
6. 微粒子が、８５重量％を超えるアミロペクチン含有量（その少なくとも８０重量％は１０〜１０，０００ｋＤａの範囲内の平均分子量を有する）を有する澱粉から実質的に構成されており、そして生物学的活性物質の生体利用率が所定の物質を可溶性形態で静脈内に注射したときに得られる生体利用率の少なくとも３５％である生物学的活性物質の放出量を示す、有機溶剤に敏感または不安定である生物学的活性物質を含有する非経口的投与可能な生物分解性微粒子調製物。
7. 澱粉が、澱粉の乾燥重量１ｇ当たり５０μｇ未満のアミノ酸窒素含有量を有し、そして澱粉分子間の共有化学架橋結合を含まない、請求項６に記載の調製物。
8. 生体利用率が、生物学的活性物質を静脈内に注射したときに得られる生体利用率の少なくとも４５％、好ましくは少なくとも５０％である、請求項６または７に記載の調製物。
9. 微粒子が、８５重量％を超えるアミロペクチン含有量（その少なくとも８０重量％は１０〜１０，０００ｋＤａの範囲内の平均分子量を有する）を有する澱粉から実質的に構成されており、そして任意の連続７日の期間中に起こる放出において、選択した７日の期間が注射後の最初の２４時間を含まないとことを条件として、生物学的活性物質の最高血清または血漿濃度を上記の７日の期間中の平均濃度で割り算した商が５未満であることを特徴とする活性物質の放出量を示す、有機溶剤に敏感または不安定である生物学的活性物質を含有する非経口的投与可能な生物分解性微粒子調製物。
10. 澱粉が、澱粉の乾燥重量１ｇ当たり５０μｇ未満のアミノ酸窒素含有量を有し、そして澱粉分子間の共有化学架橋結合を含まない、請求項９に記載の調製物。
11. 放出量が、４倍未満、好ましくは３倍未満、より好ましくは２倍未満である、請求項９または１０に記載の調製物。
12. 微粒子が、８５重量％を超えるアミロペクチン含有量（その少なくとも８０重量％は１０〜１０，０００ｋＤａの範囲内の平均分子量を有する）を有する澱粉から実質的に構成されており、そして生物学的活性物質の平均滞留時間が少なくとも４日である生物学的活性物質の放出量を示す、有機溶剤に敏感または不安定である生物学的活性物質を含有する非経口的投与可能な生物分解性微粒子調製物。
13. 澱粉が、澱粉の乾燥重量１ｇ当たり５０μｇ未満のアミノ酸窒素含有量を有し、そして澱粉分子間の共有化学架橋結合を含ない、請求項１２に記載の調製物。
14. 平均滞留時間が、少なくとも７日、好ましくは少なくとも９日、より好ましくは少なくとも１１日、最も好ましくは少なくとも１３日である、請求項１２または１３に記載の調製物。
15. 生物学的活性物質が水溶性物質である、請求項１〜１４の何れか１項に記載の調製物。
16. 生物学的活性物質が、タンパク質、ペプチドまたはポリヌクレオチド、好ましくはタンパク質である、請求項１〜１５の何れか１項に記載の調製物。
17. タンパク質が組み換え産生タンパク質である、請求項１６に記載の調製物。
18. 物質が、ホルモン、好ましくはヒト成長ホルモンである、請求項１６または１７に記載の調製物。
19. 物質が、成長因子、インスリン、エリスロポエチン、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、血液凝固因子Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ および ＸＩＩＩ、プロテインＣ、グルカゴン様ペプチド１または２、Ｃペプチド、上皮細胞成長ホルモン、ＬＨＲＨ類似体、シバミド、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、レプチンおよびインターロイキン、またはこれらの何れか一つの類似体または誘導体から選択され、この類似体または誘導体は親物質と本質的に同一の薬理学的活性またはそれと比較して改善された薬理学的活性を有する、請求項１６または１７に記載の調製物。
20. 微粒子が、８５重量％を超えるアミロペクチン含有量（その少なくとも８０重量％は１０〜１０，０００ｋＤａの範囲内の平均分子量を有する）を有し、澱粉の乾燥重量１ｇ当たり５０μｇ未満のアミノ酸窒素含有量を有し、そして澱粉分子間の共有化学架橋結合を含まない澱粉から実質的に構成されている、請求項１〜５の何れか１項に記載の調製物。
21. 平均分子量が、１００〜４０００ｋＤａ、好ましくは１００〜１０００ｋＤａの範囲内にある、請求項６〜１９の何れか１項に記載の調製物。
22. 平均分子量が、２００〜１０００ｋＤａ、好ましくは３００〜６００ｋＤａの範囲内にある、請求項２１に記載の調製物。
23. 生物学的物質の生物活性が、該物質が微粒子中に取り込まれる前に該物質が示した生物活性と比較して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％であり、最も好ましくは実質的に保持されている、請求項１〜２２の何れか１項に記載の調製物。
24. α−アミラーゼおよび／またはアミログルコシダーゼの存在下にインビトロで生物分解性である、請求項１〜２３の何れか１項に記載の調製物。
25. 生物分解性であり、そして皮下または筋肉内投与ののちに組織から除去される、請求項１〜２４の何れか１項に記載の調製物。
26. 少なくとも１種のフィルム形成性の生体親和性および生物分解性ポリマーの放出制御性外皮を有する、請求項１〜２５の何れか１項に記載の調製物。
27. ポリマーが、α−ヒドロキシ酸単位を含有するホモポリマーまたはコポリマーである、請求項２６に記載の調製物。
28. α−ヒドロキシ酸が、乳酸および／またはグリコール酸である、請求項２７に記載の調製物。
29. アミノ酸窒素含有量が、澱粉の乾燥重量１ｇ当たり多くとも２０μｇ、好ましくは多くとも１０μｇ、最も好ましくは多くとも５μｇのアミノ酸窒素である、請求項６〜２８の何れか１項に記載の調製物。
30. 澱粉が、インビトロでゲル化能を有する、請求項６〜２９の何れか１項に記載の調製物。
31. 澱粉が、エマルジョン系中、特に二相水性系中で微粒子形成能を示す、請求項６〜３０の何れか１項に記載の調製物。
32. 澱粉が、２５ＥＵ／ｇ未満のエンドトキシン含有量を有する、請求項６〜３１の何れか１項に記載の調製物。
33. 澱粉が、１ｇ当たり１００個未満、好ましくは１０個未満の微生物を含有する、請求項６〜３２の何れか１項に記載の調製物。
34. 微粒子が、１０〜２００μｍ、好ましくは２０〜１００μｍ、より好ましくは２０〜８０μｍの平均直径を有する、請求項１〜３３の何れか１項に記載の調製物。
35. ２３Ｇ針を用いて注射可能である、請求項１〜３４の何れか１項に記載の調製物。
36. ２５Ｇ針を用いて注射可能である、請求項３５に記載の調製物。
37. 乾燥粉末用注射器を用いて皮膚を通して注射可能である、請求項１〜３４の何れか１項に記載の調製物。
38. 動物実験、好ましくはブタ、特に免疫抑制ブタにおいて試験したときに、請求項１〜３７の何れか１項で定義した特性を有する調製物。

Images