JP2004502645A - 免疫調節製剤及びその使用方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、個体の免疫調節のための新規組成物及び方法を提供する。免疫調節は、免疫調節ポリヌクレオチド/マイクロキャリア(IMP/MC)複合体の投与によって達成される。IMP/MC複合体は共有結合していても、又は非共有結合していてもよく、そして非生物分解性マイクロキャリア又はナノキャリアと結合した少なくとも1つの免疫刺激配列を含んで成るポリヌクレオチドを特徴とする。
Description
【0001】
関連出願に対するクロスリファレンス
本出願は、引用によってその全体が本明細書に組み入れられる、2000年3月10日に出願された米国仮特許出願第60/188,577号の優先権の利益を主張する。
【0002】
技術分野
本発明は、免疫刺激オリゴヌクレオチド配列(ISS)を含んで成る免疫調節組成物に関する。特に、本発明は、非生物分解性微粒子と結合したISSを含んで成る免疫調節組成物に関する。これはまた、少なくとも1つの免疫応答を調節するポリヌクレオチド/マイクロキャリア複合体の投与にも関する。
【0003】
背景技術
感染又は他の抗原に対する曝露に対して生じる免疫応答の型は、一般には応答に関与するTヘルパー(Th)細胞のサブセットにより識別され得る。Th1のサブセットは、古典的な細胞媒介性機能、例えば、遅延型過敏症及び細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の活性化、の原因であるのに対し、Th2のサブセットは、B細胞活性化のためのヘルパーとしてより効果的に機能する。抗原に対する免疫応答の型は、一般には抗原に応答する細胞により生成されるサイトカインにより影響を受ける。Th1細胞及びTh2細胞により分泌されるサイトカインにおける差異は、これら2つのサブセットの異なる生物学的機能を反映すると考えられている。例えば、Romagnani(2000) Ann. Allergy Asthma Immunol. 85:9−18を参照のこと。
【0004】
Th1サブセットがウイルス感染、細胞内病原及び腫瘍細胞体に応答するために特に適切であると思われるのは、それがCTLを活性化するIL−2及びIFN−γを分泌するためである。Th2のサブセットが、好き勝手に生きている細菌及び寄生虫に対する応答にさらに適切であり、そしてアレルギー性反応を媒介すると思われるのは、IL−4及びIL−5が、それぞれIgE産生及び好酸球の活性化を誘導することが知られているためである。一般には、Th1細胞及びTh2細胞は、異なるパターンのサイトカインを分泌し、従って、ある型の応答は、他の型の応答の活性を緩和し得る。Th1/Th2のバランスの変化は、例えば、アレルギー応答を、あるいは、CTL応答の増大を生じ得る。
【0005】
多くの感染病、例えば、結核及びマラリアにとって、Th2型応答は、感染に対する予防的価値がほとんどない。標的抗原由来の低分子ペプチドを用いるワクチンの案及び潜在的に感染性である未処理ウイルス粒子の使用を避ける、他の現在使用されている抗原性物質は、治療効果を達成するために必要な免疫応答を常に誘発するわけではない。治療上で有効なヒト免疫不全ウイルス(HIV)ワクチンがないことは、この失敗の不幸な例である。タンパク質を基にしたワクチンは典型的に、高力価であるが、有意な細胞性免疫のない中和抗体によって特徴づけられる、Th2型免疫応答を誘導する。
【0006】
更に、抗体応答のうちの複数の型は、ある徴候において、最も顕著にはIgE抗体の応答がアナフィラキシーショックをもたらしうるアレルギーにおいて不適当である。通常、アレルギー応答はまた、Th2型免疫応答に関与する。アレルギー応答、例えばアレルギー性喘息のものは、アレルゲンの曝露から数秒〜数分以内に発生し、そして細胞の脱顆粒を特徴とする初期相の応答、及びアレルゲンの曝露から4〜24時間後に発生し、そしてアレルゲンが曝露された部位への好酸球の浸潤を特徴とする後期相の応答を特徴とする。具体的には、アレルギー応答の初期相の間に、アレルゲンは好塩基球及び肥満細胞上でIgE抗体を架橋し、続いて脱顆粒及びその後のヒスタミン及び他の炎症媒介物の肥満細胞及び好塩基球からの放出の引き金を引く。後期相の応答の間、好酸球はアレルゲンの曝露部位(組織の損傷及び機能障害が生じた場所)に浸潤する。
【0007】
アレルギー性疾患のための抗原免疫療法は、小さいが、徐々に量が増大する抗原の皮下注射を含む。その様な免疫化処置には、IgE媒介型アナフィラキシーを誘導する危険性が存在し、そしてこれはアレルギー性の後期相応答のサイトカイン媒介型事象を有効に処理しない。今までのところ、このアプローチはわずかに限定された成功をもたらしている。
【0008】
一般的に免疫刺激配列又は「ISS」として知られている、あるDNA配列の投与は、Th1関連サイトカインの分泌によって示されるように、Th1型に偏った免疫応答を誘導する。免疫刺激ポリヌクレオチドと抗原の投与は、投与される抗原に対するTh1型の免疫応答をもたらす。Roman et al.(1997) Nature Med. 3:849−854. 例えば、エスケリッチャ・コリ(Escherichia coli, E coli)のβガラクトシダーゼ(β−gal)/生理食塩水又はアジュバントのミョウバンを皮内注射されたマウスは、特異的なIgG1及びIgE抗体、並びにIL−4及びIL−5は分泌したが、IFN−γを分泌しなかったCD4+細胞を産生することによって応答し、T細胞が支配的にTh2サブセットのものであったことを示した。しかしながら、β−Galをコードし、かつISSを含むプラスミドDNA(生理食塩水中)を皮内に(又はtyne skin scratch applicatorで)注射されたマウスは、IgG2a抗体、ならびにIFN−γを分泌したがIL−4及びIL−5を分泌しなかったCD4+細胞を産生することにより応答し、T細胞が支配的にTh1のサブセットのものであることを示した。更に、プラスミドDNAを注射されたマウスによる特異的なIgEの産生は、66〜75%減少した。Raz et al. (1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:5141−5145. 通常、裸のDNAの免疫に対する応答は、Th1型の応答であることを示す、抗原刺激されたCD4+T細胞によるIL−2、TNFα及びIFN−γの産生によって特徴づけられる。これはIgE産生の減少により示されるようにアレルギー及び喘息の処置において特に重要である。Th1型の免疫応答を刺激する免疫刺激ポリヌクレオチドの能力は、細菌性抗原、ウイルス抗原及びアレルゲンによって証明されている(例えば、WO98/55495を参照のこと)。
【0009】
微粒子(SEPHAROSE(商標)ビーズ)に結合したISS含有オリゴヌクレオチドは、in vitroで免疫刺激活性を有することがこれまでに示されている(Liang et al., (1996), J. Clin. Invest. 98:1119−1129)。しかしながら、近年の結果は、金、ラテックス及び磁気粒子に結合したISS含有オリゴヌクレオチドが、ISS含有オリゴヌクレオチドに応じて増殖する、7TD1細胞の増殖を刺激するのに活性でないことを示している(Manzel et al.(1999) Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 9:459−464)。
【0010】
ISSを記載している他の引用文献は:
【表1】
【表2】
【0011】
更に、Godard et al. (1995)Eur. J. Biochem. 232:404−410は、ポリイソヘキシルシアノアクリラートのナノ粒子と結合したコレステロール修飾型のアンチセンスオリゴヌクレオチドを開示している。
【0012】
本明細書に列記されている全ての特許、特許出願、及び刊行物は、引用によってその全体が本明細書に組み入れられる。
【0013】
本発明の開示
本発明は、個体、特にヒトの個体において免疫応答を修飾するための新規組成物及び方法に関する。
【0014】
1つの観点において、本発明は免疫調節ポリヌクレオチド/マイクロキャリア(IMP/MC)複合体を含んで成る組成物に関する。IMP/MC複合体は非生物分解性マイクロキャリア(MC)と結合した免疫刺激配列(IMP)を含んで成るポリヌクレオチド(IMP)を含んで成るが、但し、MCは金、ラテックス又は磁気性のものである場合、当該結合はビオチン/アビジン(又はビオチン/ストレプトアビジン)を介する以外のものである。IMPは、複合体においてマイクロキャリアと共有結合的に又は非共有結合的に結合してもよく、そしてIMPは複合体の形成を容易にするために修飾されることがある。IMP/MC複合体において使用されるマイクロキャリアは、液相のマイクロキャリア又は固相のマイクロキャリアであってもよい。マイクロキャリアは、通常サイズが約100μm未満であり、そしてサイズが約10nm〜約10μm又は約25nm〜5μmであってもよい。ある態様において、本発明の組成物はIMP/MC複合体及び医薬として許容される補形剤を含んで成る。ある態様において、本発明の組成物は、抗原を含まないIMP/MC複合体、すなわち抗原と結合(直接的又は間接的のいずれか)していないIMP/MC複合体を含んで成る。
【0015】
別の観点において、本発明は個体の免疫応答を調節する方法であって、個体に対し、前記個体において免疫応答を調節するのに十分な量のIMP/MC複合体を投与することを含んで成る方法、に関する。本発明の方法に従う免疫調節は、Th2型の免疫応答に関連する疾患(例えば、アレルギー又はアレルギー誘導型の喘息)に苦しむ者を含む個体、ワクチン、例えば治療用ワクチン(例えばアレルギーのエピトープ、放線菌のエピトープ、又は腫瘍関連型のエピトープ)又は予防用ワクチンを受けている個体、ガンを有する個体、感染病を有する個体及び感染因子に曝露される恐れのある個体に対して実施され得る。
【0016】
更なる観点において、本発明は、個体におけるインターフェロンガンマ(IFN−γ)を増大する方法であって、当該個体に対し有効量のIMP/MC複合体を投与することを含んで成る方法、に関する。本発明に従うIMP/MC複合体の投与は、個体のIFN−γを増大する。これらの方法に適した対象者は、特発性肺線維症(IPF)、強皮症、皮膚性放射線誘導型線維症、肝線維症、例えば住血吸虫症誘導型肝線維症、腎線維症並びにIFN−γの投与によって改善され得る他の症状を有する個体を含む。
【0017】
別の観点において、本発明は個体におけるIFN−αを増大する方法であって、有効量のIMP/MC複合体を個体に投与することを含んで成る方法、に関する。本発明に従うIMP/MC複合体の投与は、個体のIFN−αレベルを増大する。これらの方法に適した対象者は、IFN−αの投与に応答する疾患、例えばウイルスの感染症及びガン、を有する個体を含む。
【0018】
別の観点において、本発明は、感染病の1又は複数の症状を緩和する方法であって、感染病を有する個体に対し、有効量のIMP/MC複合体を投与することを含んで成る方法、に関する。本発明に従うIMP/MC複合体の投与は、感染病の1又は複数の症状を緩和する。本発明に従い処置されうる感染病は、細胞内病原によって生じる感染病(例えば放線菌性疾患、マラリア、リーシュマニア症、トキソプラズマ症、住血吸虫症又は肝吸虫症)を含み、そしてウイルス病を含んでもよく、又は排除してもよい。
【0019】
本発明は更に、本発明の方法を実施するためのキットに関する。本発明のキットは、個体の免疫調節における、例えば当該個体がTh2型の免疫応答に関連する疾患(例えば、アレルギー又はアレルギー誘導型の喘息)に苦しみ、ワクチン、例えば治療用ワクチン(例えばアレルギーエピトープ、放線菌のエピトープ、又は腫瘍関連型エピトープ)又は予防用ワクチンを受け、ガンに苦しみ、感染病に苦しみ、又は感染因子に曝露される恐れがある場合の、IMP/MC複合体の使用ためのIMP/MC複合体の説明書を含んで成る容器を含んで成る。
【0020】
本発明の実施形態
我々は、個体、特にヒトにおける免疫応答を調節するための新規組成物及び方法を発見した。本発明の組成物は、非生物分解性マイクロキャリア(MC)と複合した免疫調節ポリヌクレオチド(IMP)を含んで成る。我々は、ナノメーター規模のマイクロキャリア(50〜200nmの直径のビーズ)と組み合わせた免疫調節ポリヌクレオチドが、ヒトの細胞を含む免疫細胞を効率的に調節することを発見した。小さいマイクロキャリア(約1〜4.5μm、2.0μm又は約1.5μm未満の直径)と組み合わせたIMPも、ヒト細胞を免疫調節した。我々の発見が特に注目されるべきものであるのは、ヒト細胞が、当業界で公知の様に、一般的に使用される研究動物、例えばマウス由来の細胞より、IMPによる免疫調節に耐性があると思われるためである。
【0021】
IMP/MC複合体は、抗原を含んでいても、又は排除していてもよい。いくつかの態様において、本発明は、抗原を含まないIMP/MC複合体、すなわち抗原と結合(直接的又は間接的のいずれか)していないIMP/MC複合体を含んで成る組成物を提供する。他の態様において、本発明は、1又は複数の抗原と混合したIMP/MC複合体を含んで成る組成物を提供する。他の態様において、本発明は、抗原と結合したIMP/MC複合体を含んで成る組成物を提供する。
【0022】
我々は更に、非生物分解性ナノキャリア粒子を含んで成る共有結合型のIMP/MC複合体が高度に活性な免疫調節物質であることを発見した。従来技術は、非生物分解性の微粒子及びナノ粒子と強固に結合した免疫刺激オリゴヌクレオチドが有効でないことを示唆している(Manzel et al., 上記)。当業界におけるこの理解を考慮して、我々は、我々の結果が当業者にとって驚くべきものであり、そして予期されないものであると考える。
【0023】
本発明の免疫調節ポリヌクレオチド/マイクロキャリア(IMP/MC)複合体は、共有結合していても、又は非共有結合していてもよく、そして水不溶性のマイクロキャリア(例えば、約10μm未満のサイズのキャリア)を含んで成る。マイクロキャリアは固相(例えば、ポリスチレンビーズ)であっても、又は液相(例えばリポソーム、ミセル、又は油−水の乳濁液中の油滴)であってもよい。IMPは、MCと結合させ、又はそれを強化するように修飾されることがある(例えば、共有結合的な架橋のための遊離スルフヒドリルの組込又は疎水性部分の挿入、例えば、疎水性結合の場合、コレステロール)。
【0024】
本発明は、共有結合型のIMP/MC複合体を形成するために非生物分解性のマイクロキャリアと共有結合したIMPを含んで成る新規組成物を提供する。IMPとMCの間の結合は直接的であってもよく(例えば、IMP及びMC上のスルフヒドリル間のジスルフィド結合を介する)、あるいは構成成分が、IMPとMCに対する結合を分離する、1又は複数の分子の架橋部分によって結合されることもある。
【0025】
更に提供されるものとして、非共有結合型のIMP/MC複合体を提供するために、マイクロキャリアと非共有結合したIMPを含んで成る組成物がある。非共有結合型のIMP/MC複合体は、通常、マイクロキャリアと結合せしめるように修飾されているIMPを含んで成る(例えば、油又は脂質を基にしたマイクロキャリアと疎水性結合をさせるための、コレステロール部分の挿入による)。
【0026】
本発明はまた、個体に対しIMP/MC複合体を投与することによって、個体における免疫応答を調節する方法を提供する。
【0027】
更に提供されるものとして、本発明の方法を実施するためのキットがある。当該キットは、対象者における免疫調節のためのIMP/MC複合体の投与のための説明書及びIMP/MC複合体を含んで成る包装又は容器を含んで成る。
【0028】
一般的技術
本発明の実施は、特に断らない限り、当業者の技術の範囲内にある、分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の常用の技術を用いる。その様な技術は、文献、例えば
【表3】
において完全に説明されている。
【0029】
定義
本明細書で使用する場合、単数形(「a」、「an」、「the」)は特に断らない限り、複数の言及を含む。例えば(「an」)ISSは1又は複数のISSを含む。
【0030】
本明細書で交換可能に使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖DNA(ssDNA)、二本鎖DNA(dsDNA)、一本鎖RNA(ssRNA)及び二本鎖RNA(dsRNA)、修飾されたオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオシド、又はこれらの組み合わせを含む。オリゴヌクレオチドは、直鎖状又は環状の構造であってもよく、又はオリゴヌクレオチドは、直鎖状及び環状のセグメントの両方を含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドは、一般に、ホスホジエステル結合を介して連結したヌクレオシドのポリマーであるが、別の結合、例えばホスホロチオエートエステルもオリゴヌクレオチドにおいて使用され得る。ヌクレオシドは、糖に結合したプリン(アデニンもしくはグアニン又はそれらの誘導体)又はピリミジン(チミン、シトシン、もしくはウラシル、又はそれらの誘導体)塩基からなる。DNAにおける4つのヌクレオシド単位(又は塩基)は、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、及びデオキシシチジンと称される。ヌクレオチドは、ヌクレオシドのリン酸エステルである。
【0031】
用語「ISS」は、本明細書で使用する場合、in vitro、in vivo及び/又はex vivoで測定される場合に測定可能な免疫応答をもたらすオリゴヌクレオチド配列を言及する。測定可能な免疫応答の例は、限定しないが、抗原特異的抗体産生、サイトカインの分泌、リンパ球群、例えば、NK細胞、CD4+Tリンパ球、CD8+Tリンパ球、Bリンパ球等の活性化又は増殖を含む。好ましくは、ISS配列は、Th1型応答を優先的に活性化する。本発明における使用のためのポリヌクレオチドは、少なくとも1つのISSを含む。本明細書で使用する場合、「ISS」は、ISS含有ポリヌクレオチドのための省略された用語でもある。
【0032】
用語「免疫調節ポリヌクレオチド」又は「IMP」は、本明細書で使用する場合、少なくとも1つのISSを含んで成るポリヌクレオチドを言及する。ある態様において、IMPはISSである。
【0033】
用語「非生物分解性」は、本明細書で使用する場合、正常な哺乳類の生理学的条件下で分解されない、又は浸蝕されないマイクロキャリアを言及する。一般的に、マイクロキャリアは、それが正常なヒトの血清中での37℃での72時間のインキュベーション後に分解されない(すなわち、その体積及び/又は平均のポリマーの長さの5%も失われない)場合、非生物分解性であるとみなされる。
【0034】
用語「マイクロキャリア」は、水不溶性であり、且つ約100μm未満、好ましくは約50〜60μm未満、好ましくは約10μm未満、好ましくは約5,2.5、2又は1.5μm未満、のサイズを有する、粒子組成物を言及する。マイクロキャリアは、約1μm未満、好ましくは約500nm未満のサイズを有するマイクロキャリアである、「ナノキャリア」を含む。マイクロキャリアは、固相の粒子、例えば生物学的適合性のある天然のポリマー、合成ポリマー又は合成コポリマーから形成される粒子を含むが、アガロース又は架橋されたアガロースから形成されたマイクロキャリアは、本明細書のマイクロキャリアの定義を含んでいても、又はそれから除外されていてもよい。固相のマイクロキャリアは、哺乳類の生理学的条件下で非浸蝕性及び/又は非分解性のポリマー又は他の材料、例えばポリスチレン、ポリプロピレン、シリカ、セラミック、ポリアクリルアミド、金、ラテックス、ハイドロキシアパタイト、デキストラン、並びに強磁性及び常磁性材料、から形成される。マイクロキャリアは更に、リポソーム、抗原を含まないiscom(免疫刺激複合体。コレステロール、及びリン脂質、アジュバント活性サポニンの安定な複合体である)、あるいは水中油又は油の乳濁液における水中油に見られる小滴又はミセルの様な、油又は脂質を基にしたものであってもよい。マイクロキャリアは典型的に球状の形であるが、球状から逸脱しているマイクロキャリアも許容される(例えば、長円形、竿状、等)。それらの不溶性の性質(水に関する)に起因して、マイクロキャリアは、水及び水を基にした(水性の)溶液から濾過することができる。
【0035】
マイクロキャリアの「サイズ」は、一般的に製造業者によって述べられている、粒子の「設計サイズ」又は意図されるサイズである。サイズは、直接的に測定される寸法、例えば平均又は最大直径であってもよく、又は間接的なアッセイ、例えば濾過スクリーニングアッセイによって決定されてもよい。マイクロキャリアのサイズの直接的な測定は、典型的に、顕微鏡、通常光学顕微鏡又は走査型電子顕微鏡(SEM)によって、既知のサイズの粒子と比較して、又はマイクロメータを参照することによって実施される。サイズの軽微な変化が、製造工程の間に生じる場合、測定値が、マイクロキャリアが規定の測定値の±約5〜10%であることを示すならば、マイクロキャリアは規定のサイズであるとみなされる。サイズの特徴は、動的光散乱によって決定されうる。あるいは、マイクロキャリアのサイズは、濾過スクリーニングアッセイによって決定によって決定されうる。マイクロキャリアは、少なくとも97%の粒子が、規定のサイズの「スクリーン形」フィルター(すなわち、保持された粒子がフィルターの表面上にあるフィルター、例えばポリカーボネート又はポリエーテルスルホンフィルターであり、これに対し、「デプスフィルター」は、保持された粒子がフィルター内に引っかかる)を通過する場合に規定のサイズ未満である。マイクロキャリアは、少なくとも約97%のマイクロキャリアが、規定のサイズのスクリーン形フィルターによって保持される場合、規定のサイズより大きい。従って、約10μm〜約10nmのマイクロキャリアの、少なくとも約97%が、10μmの孔のスクリーンフィルターを通過し、そして10nmのスクリーンフィルターによって保持される。
【0036】
上述の議論が示唆するように、マイクロキャリアのためのサイズ又はサイズ範囲に対する言及は、規定のサイズ及び/又はサイズ範囲のおおよその変動及び概算を暗に含む。これは、サイズ及び/又はサイズ範囲を言及する場合の、用語「約」の使用によって反映され、そして、「約」について言及していない、サイズ又はサイズ範囲の言及は、サイズ及び/又はサイズ範囲が正確であることを意味しない。
【0037】
用語「免疫調節ポリヌクレオチド/マイクロキャリア複合体」又は「IMP/MC複合体」は、本発明のISS含有ポリヌクレオチドとマイクロキャリアとの複合体を言及する。当該複合体の成分は、共有結合していても、又は非共有結合していてもよい。非共有結合は、任意な非共有結合力によって、例えば疎水性相互作用、イオン(静電的)結合、水素結合及び/又はファンデルワールス引力によって媒介されうる。疎水性結合の場合、当該結合は、一般的にIMPと共有結合した疎水性部分(例えば、コレステロール)を介する。
【0038】
用語「免疫調節」又は「免疫応答の調節」は、本明細書で使用する場合、免疫刺激及び免疫抑制効果を含む。免疫調節は、主に、全体的な免疫応答における定性的な変化であるが、定量的な変化は、免疫調節と一緒に生じてもよい。本発明に従い免疫調節される免疫応答は、「Th2型」免疫応答ではなく、「Th1型」の免疫応答へと推移するものである。Th1型の応答は、典型的に細胞性免疫系(例えば、細胞傷害性リンパ球)の応答であると考えられるが、Th2型の応答は、通常「体液性」であるか、又は抗体を基にしている。Th1型の免疫応答は通常、抗原に対する「遅延型過敏症」によって特徴づけられ、そしてTh1関連サイトカイン、例えば、IFN−γ、IL−2、IL−12、及びTNF−β、並びにIFN−α及びIL−6のレベルの増大によって、生化学的なレベルで検出されうるが、IL−6はTh2型免疫応答にも関連していることがある。Th1型免疫応答は、通常細胞傷害性リンパ球(CTL)の産生及び低レベル又は一過性の抗体の産生と関連している。Th2型免疫応答は、通常高レベルの抗体産生、例えばIgEの産生、全く産生されない又は最低限産生されるCTL、並びにTh2関連型サイトカイン、例えばIL−4の発現、と関連している。従って、本発明に従う免疫調節は、例えば、本発明の方法に従い処置された個体における、未処置のものと比較した場合のIFN−γの増大及び/又はIgEの産生の低下によって認識されうる。
【0039】
用語「接合体」は、ISS含有ポリヌクレオチドと抗原とが結合した複合体を言及する。その様な接合体の結合は、共有結合及び/又は非共有結合を含む。
【0040】
用語「抗原」は、抗体又はT細胞抗原受容体によって特異的に認識及び結合される物質を意味する。抗原は、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、多糖類、複合多糖、糖類、ガングリオシド、脂質及びリン脂質;それらの部分、ならびにそれらの組み合わせを含み得る。抗原は、天然に存在するものであってもよく、又は合成物であってもよい。ISSとの投与に適した抗原は、B細胞又はT細胞の抗原特異的応答を誘発し得る任意な分子を含む。好ましくは、抗原は、当該抗原に特異的な抗体応答を誘発する。ハプテンは、「抗原」の範囲内に含まれる。ハプテンは、それ自体は免疫原性ではないが、抗原決定基を含む免疫原性分子と接合した場合に免疫原性となる低分子量化合物である。小分子は、抗原性になるためにハプテン化される必要があり得る。好ましくは、本発明の抗原は、ペプチド、脂質(例えば、ステロール、脂肪酸、及びリン脂質)、多糖、例えばヘモフィルスインフルエンザワクチンにおいて使用されるようなもの、ガングリオシド及び糖タンパク質を含む。
【0041】
「アジュバント」は、免疫原性物質、例えば抗原に添加した場合に、混合物に曝露した際にレシピエントの宿主中の当該物質に対する免疫応答を非特異的に増し又は増強する物質を言及する。
【0042】
用語「ペプチド」は、当該ペプチドがハプテンであろうとなかろうと、生物学的応答、例えば、抗体産生又はサイトカイン活性をもたらすのに十分な長さ及び組成のポリペプチドである。典型的には、ペプチドは、少なくとも6アミノ酸残基の長さである。用語「ペプチド」は、修飾されたアミノ酸(天然又は非天然のいずれか)を更に含み、その様な修飾は、限定しないが、リン酸化、グリコシル化、ペグ化、脂質化及びメチル化を含む。
【0043】
「抗原性ペプチド」は、精製された天然のペプチド、合成ペプチド、組換えタンパク質、粗製タンパク質抽出物、弱毒化若しくは不活化ウイルス、細胞、微生物、又はその様なペプチドのフラグメントを含みうる。「抗原性ペプチド」又は「抗原ポリペプチド」は、従って、1又は複数の抗原性の特性を示すポリペプチドの全部又は一部を意味する。この様に、例えば「Amb a 1抗原性ポリペプチド」又は「Amb a 1ポリペプチド抗原」は、Amb a 1由来のアミノ酸配列であり、これは抗原性特性を示す(すなわち、抗体又はT細胞受容体と特異的に結合する)、全長配列、当該配列の一部、及び/又は当該配列の修飾物のいずれかである。
【0044】
「送達分子」又は「送達担体」は、特定の部位に対し、そして/あるいは特定の時期に関して、IMP/MC複合体の送達を容易にし、可能にし、そして/あるいは増強する化学的部分である。送達担体は、付加的に免疫応答を刺激することもあり、又は刺激しないこともある。
【0045】
「抗原に対するアレルギー応答」は、好酸球及び/又は抗原特異的IgEの発生並びにそららの結果による効果によって一般的に特徴づけられる免疫応答を意味する。当業界で周知な様に、IgEは肥満細胞及び好塩基球上のIgE受容体と結合する。IgEによって認識される抗原に対する後の曝露によって、当該抗原は肥満細胞及び好塩基球上のIgEを架橋し、これらの細胞の脱顆粒、例えば、限定しないがヒスタミン放出を招く。用語「抗原に対するアレルギー応答」、「アレルギー」、及び「アレルギー症状」は、本発明の方法のいくつかの利用に、等しく適切であると理解され、そして意図される。更に、本発明の方法が、アレルギー応答の予防及びこれまでに存在しているアレルギー症状の処置に等しく適切であるものを含むと理解され、そして意図される。
【0046】
本明細書で使用する場合、用語「アレルゲン」は、対象者に対する曝露によってアレルギー応答を誘発する、抗原又は分子の抗原性部分、通常タンパク質を意味する。典型的に、当該対象者は、例えば、発赤及び膨疹試験又は当業界で公知の任意な方法によって示されるような、アレルゲンに対するアレルギーである。分子は、対象者のごくわずかなサブセットでも、当該分子に対する曝露によってアレルギー性(例えば、IgE)の免疫応答を示している場合にアレルゲンであると称される。多くの単離されたアレルゲンが当業界で知られている。これらは、限定しないが、本明細書の表1に提示されているものを含む。
【0047】
用語「脱感作」は、対象者が感受性を示したアレルゲンの量を増大する投与方法を言及する。脱感作に使用されるアレルゲンの量の例は、当業界で知られており、例えばFornadley(1998)Otolaryngol. Clin. North Am. 31:111−127を参照のこと。
【0048】
「抗原特異的免疫治療」は、抗原に関与し、そして免疫応答の抗原特異的調節を発生させる免疫治療の任意な形態を言及する。アレルゲンの状況において、抗原特異的免疫治療は、限定しないが、脱感作治療を含む。
【0049】
「個体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳類、更に好ましくはヒトである。哺乳類は、限定しないが、ヒト、霊長類、家畜、猟の動物、齧歯類及びペットを含む。脊椎動物はまた、限定しないが、鳥類(すなわち、鳥類の個体)及び爬虫類(すなわち、爬虫類の個体)を含む。
【0050】
物質の「有効量」又は「十分量」は、有益な又は所望の結果、例えば臨床的な結果をもたらすのに十分な量であり、そしてその結果、「有効量」は、適用される状況に依存する。抗原に対する免疫応答を調節する組成物の投与の状況において、IMP/MC複合体の有効量は、抗原が単独で投与される場合に得られる免疫応答と比較されるような調節を達成するのに十分な量である。有効量は、1又は複数の投与で投与されうる。
【0051】
用語「同時投与」は、本明細書で使用する場合、免疫応答を調節するために、十分に近い時間で少なくとも2つの異なる物質を投与することを言及する。好ましくは、同時投与は、少なくとも2つの異なる物質の同時の投与を言及する。
【0052】
免疫応答、例えばTh1応答の「刺激」は、応答の誘発及び/又は増強に起因しうる応答の増大を意味する。
【0053】
「IgE関連疾患」は、部分的に、持続性であっても、又はそうでなくてもよい上昇したIgEレベルを特徴とする生理学的症状である。IgE関連疾患は、限定しないが、アレルギー及びアレルギー性反応、アレルギー関連疾患(後述)、喘息、鼻炎、結膜炎、蕁麻疹、ショック、膜翅目の咬傷アレルギー、及び薬物アレルギー、及び寄生虫感染、を含む。当該用語はまた、これらの疾患の関連症状を含む。一般的に、その様な疾患において、IgEは抗原特異的である。
【0054】
「アレルギー関連疾患」は、抗原特異的IgE免疫応答の効果から生じる疾患を意味する。その様な効果は、限定しないが、低血圧及びショックを含むことがある。アナフィラキシーは、循環に放出されたヒスタミンが、血管拡張並びに血管の透過性の増大をもたらし、その結果循環からの血漿の著しい損失を招く間の、アレルギー関連疾患の一例である。アナフィラキシーは、身体全体を通じて経験する関連性の効果を伴い、全身的に発生することがあり、そして特異的な標的組織又は器官に限定された反応を伴い、局所的に発生することもある。
【0055】
用語「ウイルス病」は、本明細書で使用する場合、ウイルスを、その病因学的物質として有する病気を言及する。ウイルス病の例は、B型肝炎、C型肝炎、インフルエンザ、後天性免疫不全症候群(AIDS)、及び帯状疱疹を含む。
【0056】
本明細書で使用され、そして当業界で周知な様に、「処置」は有益又は所望な結果、例えば臨床上の結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のために、有益又は所望な臨床上の結果は、限定しないが、1又は複数の症候の軽減又は回復、病気の範囲の縮小、病気の安定化した(すなわち、悪化しない)状態、病気の拡大の予防、病気の進行の遅延又は減速、病状の回復又は緩和、及び寛解(部分的又は全体的のいずれか)を含み、これらは検出可能又は検出不可能なもののいずれかである。「処置」は、処置を受けてなくても予期される生存と比較した場合に、生存を延長することを意味する。
【0057】
病気又は疾患の「緩和」は、未処置の病気と比較して、疾患又は病気の状態の範囲及び/又は不所望な臨床上の症状が弱められ、そして/あるいは進行の時間経過が遅延され又は延長されることを意味する。特にアレルギーの状況において、当業者に十分に理解されているように、緩和は、アレルゲンに対する免疫応答の調節によって生じうる。更に、緩和は、必ずしも一回の量の投与で生じる必要はないが、しばしば一連の投与によって生じる。従って、応答又は疾患を緩和するのに十分な量が、1又は複数の投与で投与され得る。
【0058】
IMP/MC複合体によって「誘発」される「抗体力価」、又は「抗体の量」は、IMP/MC複合体の投与後の時点で測定される所定の抗体の量を言及する。
【0059】
「Th1関連抗体」は、産生及び/又は増大がTh1免疫応答と関連している抗体である。例えばIgG2aはマウスのTh1関連抗体である。本発明の目的のために、Th1関連抗体の測定は、1又は複数のその様な抗体の測定であってもよい。例えば、ヒトにおける、Th1関連抗体の測定は、IgG1及び/又はIgG3の測定を伴うことがある。
【0060】
「Th2関連抗体」は、産生及び/又は増大がTh2免疫応答と関連している抗体である。例えばIgG1はマウスのTh2関連抗体である。本発明の目的のために、Th2関連抗体の測定は、1又は複数のその様な抗体の測定であってもよい。例えば、ヒトにおける、Th2関連抗体の測定は、IgG2及び/又はIgG4の測定を伴うことがある。
【0061】
機能又は活性、例えばサイトカイン産生、抗体産生、又はヒスタミン放出を「抑制」又は「阻害」することは、注目の条件又は要素を除いて他の点で同一の条件と比較した場合に、あるいは別の条件と比較した場合に、当該機能又は活性を低下することである。例えば、ヒスタミンの放出を抑制する抗原と一緒に投与される、又はそれを含むIMP/MC複合体は、例えば、抗原のみによって誘導されるヒスタミン放出と比較して、ヒスタミン放出を減少させた。
【0062】
本明細書で使用する場合、用語「含んで成る」及びその同族語は、それらの包括的な意味において使用され;すなわち、用語「含む」及びその相当する同族語と等しい。
【0063】
本発明の組成物
本発明は、個体における免疫応答を調節するための新規組成物を提供する。当該新規組成物は、非生物分解性マイクロキャリアと複合したISS含有ポリヌクレオチドを含んで成る免疫調節ポリヌクレオチド/マイクロキャリア(IMP/MC)複合体である。IMP/MC複合体は、当該複合体のIMP部分が、MCに対して直接的に又はリンカーを介して(すなわち、間接的に)共有結合している共有結合複合体であってもよく、又はそれらは非共有結合複合体であってもよい。
【0064】
免疫調節ポリヌクレオチド
本発明に従い、免疫調節ポリヌクレオチドは少なくとも1つのISSを含み、そして複数のISSを含んでいてもよい。ISSはポリヌクレオチド内で隣接していてもよく、又はそれらはポリヌクレオチド内の追加のヌクレオチド塩基によって分離されることもある。従って、IMPは、本明細書に記載の1又は複数の組み合わせ、例えば修飾されたものを含むことがある。ある態様において、IMPはISSから成る。
【0065】
ISSは、当業界で説明されており、そして免疫応答、例えばサイトカイン分泌、抗体産生、NK細胞活性化及びT細胞増殖の、様々な観点を示す標準的アッセイを用いて容易に同定され得る。例えば、
【表4】
を参照のこと。
【0066】
ISSは、6塩基又は塩基対以上の任意の長さのものであってもよく、そして通常配列5’−シトシン、グアニン−3’を含んで成り、好ましくは15塩基又は塩基対以上、より好ましくは20塩基又は塩基対以上の長さであってもよい。当業界で周知な様に、5’−シトシン、グアニン−3’配列のシトシンは、メチル化されていない。ISSはまた、配列5’−プリン、プリン、C、G、ピリミジン、ピリミジン、C、G−3’を含んで成ることがある。ISSはまた、配列5’−プリン、プリン、C、G、ピリミジン、ピリミジン、C、C−3’を含んで成ることがある。以下のポリヌクレオチド配列で示すように、ISSは、配列5’−T、C、G−3’を含んで成ることもある(すなわち1又は複数のものを含む)。いくつかの態様において、ISSは配列5’−C、G、ピリミジン、ピリミジン、C、G−3’(例えば、5’−CGTTCG−3’)を含んで成ることがある。いくつかの態様において、ISSは配列5’−C、G、ピリミジン、ピリミジン、C、G、プリン、プリン−3’を含んで成ることがある。いくつかの態様において、ISSは配列5’−プリン、プリン、C、G、ピリミジン、ピリミジン−3(例えば5’−AACGTT−3’)を含んで成ることがある。
【0067】
いくつかの態様において、ISSは配列5’−プリン、T、C、G、ピリミジン、ピリミジン−3’を含んで成ることがある。
【0068】
いくつかの態様において、ISSは以下の配列:
【表5】
のいずれかを含んで成ることがある。
【0069】
いくつかの態様において、ISSは以下の配列:
【表6】
のいずれかを含んで成ることがある。
【0070】
いくつかの態様において、ISSは以下の配列:
【表7】
(ここで、Bは5−ブロモシトシンである)のいずれかを含んで成ることがある。
【0071】
いくつかの態様において、ISSは以下の配列:
【表8】
(ここで、Bは5−ブロモシトシンである)のいずれかを含んで成ることがある。
【0072】
いくつかの態様において、免疫調節ポリヌクレオチドは、配列5’−TGACTGAACGTTCGAGATGA−3’(配列番号1)を含んで成る。他の態様において、ISSは配列:
【表9】
のいずれかを含んで成る。
【0073】
ISS及び/又はIMPは修飾を含んでいてもよい。ISSの修飾は、限定しないが、当業界で知られている任意な、3’OH又は5’OH基の修飾、ヌクレオチド塩基の修飾、糖成分の修飾、及びリン酸基の修飾を含む。様々なその様な修飾は後述する。
【0074】
ISS及び/又はIMPは一本鎖又は二本鎖DNA、及び一本鎖又は二本鎖RNA、あるいは他の修飾されたポリヌクレオチドであってもよい。ISSは、上述のモチーフ内に存在することがあり、又は当該モチーフを超えて広がることもある、1又は複数のパリンドローム領域を含んでいても、又は含んでいなくてもよい。ISSは、いくつかは本明細書に記載した、追加の隣接配列を含んで成ることがある。ISSは、天然の、又は修飾された、非天然の塩基を含むことがあり、そして修飾された糖、リン酸、及び/又は末端を含むことがある。例えば、リン酸の修飾は、限定しないが、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホラミデート(架橋有り又は架橋無し)、ホスホトリエステル、ホスホロジチオエートを含み、そして任意な組み合わせで使用され得る。他の非リン酸結合も使用され得る。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を含んで成る。当業界で知られている糖の修飾、例えば2’−アルコキシ−RNA類似体、2’−アミノ−RNA類似体及び2’−アルコキシ−又はアミノ−RNA/DNAキメラ及び本明細書に記載の他のものも、生成され、そして任意なリン酸の修飾と一緒に組み合わされうる。塩基の修飾の例は、限定しないが、ISSのC−5及び/又はC−6(例えば、5−ブロモシトシン、5−クロロシトシン、5−フルオロシトシン、5−ヨードシトシン)への電子吸引性部分の挿入を含む。例えば、国際特許出願番号WO99/62923を参照のこと。
【0075】
ISS及び/又はIMPは、限定しないが、酵素的方法、化学的方法、、及びより大きなオリゴヌクレオチド配列の分解、を含む、当業界で周知な技術及び核酸合成装置を用いて合成され得る。例えばAusubel et al. (1987);及びSambrook et al. (1989)を参照のこと。酵素的に構築された場合、個々の単位は、例えばリガーゼ、例えばT4 DNA又はRNAリガーゼを用いてライゲーションされ得る。米国特許第5,124,246号。オリゴヌクレオチドの分解は、米国特許第4,650,675号に例示されているように、ヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの曝露を介して達成され得る。
【0076】
ISS及び/又はIMPはまた、常用のポリヌクレオチド単離手段を用いて単離され得る。その様な手順は、限定しないが、剪断されたヌクレオチド配列を検出するためのゲノム又はcDNAライブラリーに対するプローブのハイブリダイゼーション、剪断された構造的特徴を検出するための発現ライブラリーの抗体スクリーニング及びポリメラーゼ連鎖反応による特定の天然配列の合成、を含む。
【0077】
環状IMPは単離され、組換え法を介して合成され、又は化学的に合成され得る。環状IMPが単離を介して、又は組換え法を介して得られる場合、IMPは、好ましくはプラスミドである。より小さな環状オリゴヌクレオチドの化学合成は、文献に記載される任意の方法を用いて実施され得る。例えば、Gao et al. (1995) Nucleic Acids Res.23:2025−2029;及びWang et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:2326−2333を参照のこと。
【0078】
オリゴヌクレオチド及び修飾されたオリゴヌクレオチドを生成するための技術は当業界で知られている。ホスホジエステル結合を含む、天然DNA又はRNAは、3’末端で固体支持体に付着した伸長しているオリゴヌクレオチドの5’−ヒドロキシ基に対する、適切なヌクレオシドホスホラミダイトの連続的なカップリング、それに続くリン酸トリエステルへの中間亜リン酸トリエステルの酸化によって通常合成される。一旦所望なオリゴヌクレオチド配列が合成されると、当該オリゴヌクレオチドは支持体から除去され、リン酸トリエステル基はリン酸ジエステルへと脱保護され、そしてヌクレオシド塩基は水性アンモニア又は他の塩基を用いて脱保護される。例えば、Beaucage (1993) ”Oligodeoxyribonuclotide Synthesis” in Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties (Agrawal, ed.) Humana Press, Totowa, NJ; Warner et al. (1984) DNA 3:401及び米国特許第4,458,066号を参照のこと。
【0079】
ISS及び/又はIMPはまた、リン酸修飾型オリゴヌクレオチドを含むことがある。修飾されたリン酸結合又は非リン酸結合を含むポリヌクレオチドの合成も当業界で知られている。総説のために、Matteucci (1997) ”Oligonucleotide Analogs: an Overview” in Oligonucleotides as Therapeutic Agents, (D. J. chadwick and G. Cardew, ed.) John Wiley and Sons, New York, NYを参照のこと。本発明のオリゴヌクレオチドにおいて糖又は糖類似体部分に結合し得る亜リン酸誘導体(又は修飾されたリン酸基)は、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等であってもよい。上記のリン酸類似体の調製、ならびにヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド、及びヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドへのそれらの組み込みも、本質的に公知であり、ここで詳細に記載する必要はない。Peyrottes et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24:1841−1848;Chaturvedi et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24:2318−2323;及びSchultz et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24:2966−2973。例えば、ホスホロチオエートリゴヌクレオチドの合成は、酸化段階が硫化段階で置換されることを除き、天然のオリゴヌクレオチドのために上述したものと類似である(Zon(1993) ”Oligodeoxynucloside Phosophorothioates” in Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties (Agrawal, ed.) Humana Press, pp. 165−190)。同様に、他のリン酸類似体、例えばホスホトリエステル(Miller et al. (1971) JACS 93:6657−6665)、非架橋性ホスホラミデート(Jager et al. (1988) Biochem.27:7247−7246)、N3’−P5’ホスホラミデート(Nelson et al. (1997) JOC 62:7278−7287)及びホスホロジチオエート(米国特許第5,453,496号)の合成も記載されている。他の亜リン酸を基にしていない、修飾されたオリゴヌクレオチドも使用され得る(Stirchak et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:6129−6141)。ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル骨格を有するオリゴヌクレオチドよりも免疫原性であることがあり、そして宿主へのインジェクション後の分解に対しさらに耐性があるようである。Braun et al. (1988) J.Immunol. 14:2084−2089;及びLatimer et al. (1995) Mol. Immunol. 32:1057−1064。
【0080】
本発明で使用されるISS含有ポリヌクレオチド及び/又はIMPは、リボヌクレオチド(唯一の又は主な糖成分としてリボースを含む)、デオキシリボヌクレオチド(主な糖成分としてデオキシリボースを含む)を含んで成ることがあり、又は当業界で知られているように、修飾された糖又は糖類似体がISS中に組み込まれることもある。従って、リボース及びデオキシリボースに加えて、糖部分は、ペントース、デオキシペントース、ヘキソース、デオキシヘキソース、グルコース、アラビノース、キシロース、リキソース、及び糖「類似体」シクロペンチル基であってもよい。糖は、ピラノシル型又はフラノシル型であり得る。ISSにおいて、糖部分は、好ましくは、リボース、デオキシリボース、アラビノース、又は2’−O−アルキルリボースのフラノシドであり、そして糖は、それぞれのヘテロ環状塩基に対し、α又はβアノマー配置のいずれかで結合され得る。糖の修飾は、限定しないが、2’−アルコキシ−RNA類似体、2’−アミノ−RNA類似体及び2’−アルコキシ−又はアミノ−RNA/DNAキメラを含む。これらの糖又は糖類似体及びそれぞれの「ヌクレオシド」(ここでこのような糖又は類似体は、ヘテロ環状塩基(核酸塩基)に結合している)の調製は、本質的に知られており、そしてその様な調製が任意の具体例に関与し得る程度以外にはここで記載する必要はない。ISS及び/又はIMPの調製において、糖の修飾が行われることもあり、そして任意なリン酸塩の修飾と組み合わされることもある。
【0081】
ISS及び/又はIMP中に組み込まれるヘテロ環状塩基、又は核酸塩基は、天然の主なプリン及びピリミジン塩基(すなわち、上述したようなウラシル又はチミン、シトシン、アデニン、及びグアニン)、並びに前記の主な塩基の天然及び合成の修飾物であってもよい。
【0082】
当業者は、種々のヘテロ環状塩基及び種々の糖部分(及び糖類似体)を含んで成る多数の「合成」非天然ヌクレオシドが当業界で利用可能であること、そして本発明の他の基準が満たされる限り、ISSが、天然の核酸の主な5つの塩基成分以外の1又は数個のヘテロ環状塩基を含み得ることを認識する。しかし、好ましくは、ISS中のヘテロ環状塩基は、限定しないがウラシル−5−イル、シトシン−5−イル、アデニン−7−イル、アデニン−8−イル、グアニン−7−イル、グアニン−8−イル、4−アミノピロロ[2,3−d]ピリミジン−5−イル、2−アミノ−4−オキソピロロ[2,3−d]ピリミジン−5−イル、2−アミノ−4−オキソピロロ[2,3−d]ピリミジン−3−イル基を含み、ここで、プリンは9位を介して、ピリミジンは1位を介して、ピロロピリミジンは7位を介して、そしてピラゾロピリミジンは1位を介して、ISSの糖部分に結合する。
【0083】
ISS及び/又はIMPは、例えば、公有されている国際特許出願WO99/62923に記載されているような、少なくとも1つの修飾された塩基を含んでなることがある。本明細書で使用する場合、用語「修飾された塩基」は、「塩基類似体」と同義語であり、例えば「修飾されたシトシン」は、「シトシン類似体」と同義語である。同様に、「修飾された」ヌクレオシド又はヌクレオチドは、本明細書では、ヌクレオシド又はヌクレオチド「類似体」と同義語であると定義される。塩基の修飾の例は、限定しないが、ISSのシトシンのC−5及び/又はC−6への、電子吸引性部分の挿入を含む。好ましくは、電子吸引性部分は、ハロゲンである。そのような修飾されたシトンンは、限定しないが、アザシトシン、5−ブロモシトシン、ブロモウラシル、5−クロロシトシン、塩素化シトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、5−フルオロシトシン、フルオロピリミジン、フルオロウラシル、5,6−ジヒドロシトシン、5−ヨードシトシン、ヒドロキシウレア、ヨードウラシル、5−ニトロシトシン、ウラシル、及び任意の他のピリミジン類似体又は修飾されたピリミジンを含むことがある。
【0084】
塩基を修飾したヌクレオシドの調製、及び前駆体として前記の塩基を修飾したヌクレオシドを用いる修飾されたオリゴヌクレオチドの合成は、例えば米国特許第4,910,300号、第4,948,882号、及び第5,093,232号に記載されている。これらの塩基を修飾したヌクレオシドは、それらが、化学合成によってオリゴヌクレオチドの末端又は内部の部位のいずれかに組み込まれ得るように設計されている。オリゴヌクレオチドの末端又は内部の部位のいずれかに存在している、その様な塩基を修飾したヌクレオシドは、ペプチド又は他の抗原の結合のための部位を務めることがある。それらの糖部分で修飾されたヌクレオシドも記載されており(限定しないが、例えば、米国特許第4,849,513号、第5,015,733号、第5,118,800号、第5,118,802号を含む)、そして同様に使用され得る。
【0085】
一部の態様において、IMPは、大体、次の長さ(塩基又は塩基対)のいずれかよりも短い:10,000;5,000;2,500;2,000;1,500;1,250;1,000;750;500;300;250;200;175;150;125;100;75;50;25;10。一部の態様において、IMPは、大体、次の長さ(塩基又は塩基対)のいずれかよりも長い:8;10;15;20;25;30;40;50;60;75;100;125;150;175;200;250;300;350;400;500;750;1,000;2,000;5,000;7,500;10,000;20,000;50,000。あるいは、ISSは、10,000;5,000;2,500;2,000;1,500;1,250;1,000;750;500;300;250;200;175;150;125;100;75;50;25;又は10の上限、及び独立して選択される、8;10;15;20;25;30;40;50;60;75;100;125;150;175;200;250;300;350;400;500;750;1,000;2,000;5,000;7,500の下限を有するサイズ範囲のいずれかであってもよいが、当該下限は、当該上限未満である。
【0086】
マイクロキャリア
本発明において有用なマイクロキャリアは、約100μ未満のサイズ、好ましくは約50〜60μ未満のサイズ、好ましくは約10μ未満のサイズであり、そして純水中で不溶性である。マイクロキャリアは、固相(例えばビーズ)又は液相(例えばリポソーム)であってもよい。固相のマイクロキャリアは典型的に「ビーズ」又は他のほぼ球状の粒子であるが、非球状粒子も本発明に含まれる。本発明で使用されるマイクロキャリアは、非生物分解性である。マイクロキャリアとしての使用について許容される、広範な固相材料は、非生物分解性液相マイクロキャリアを製造するための製剤及び方法のように、当業界で知られている。
【0087】
本発明の組成物又は方法における使用のためのマイクロキャリアは、通常約10μm未満のサイズであり(例えば、約10μm未満の平均直径を有し、又は少なくとも約97%の粒子が10μmのスクリーンフィルターを通過する)、そしてナノキャリア(すなわち、約1μm未満のサイズのキャリア)を含む。好ましくは、マイクロキャリアは、約9、7、5、2、又は1μmあるいは900、800、700、600、500、400、300、250、200、又は100nmの上限、及び独立して選択される約4、2、又は1μmあるいは800、600、500、400、300、250、200、150、100、50、25、又は10nmの下限の範囲内のサイズをもつものが選択されるが、当該下限は当該上限未満である。一部の態様において、マイクロキャリアは約1.0〜1.5μm、約1.0〜2.0μm又は約0.9〜1.6μmのサイズを有する。ある好ましい態様において、マイクロキャリアは、約10nm〜約5μm又は約25nm〜約4.5μm、約1μm、約1.2μm、約1.4μm、約1.5μm、約1.6μm、約1.8μm、約2.0μm、約2.5μm又は約4.5μmのサイズを有する。マイクロキャリアがナノキャリアである場合、好ましい態様は、約25〜約300nm、50〜約200nm,約50nm〜約200nmのナノキャリアを含む。
【0088】
マイクロキャリアの製造に適した広範な非生物分解性材料も公知であり、限定しないが、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ラテックス、金、及び強磁性又は常磁性材料を含む。ある態様は、金、ラテックス、及び/又は磁性ビーズを排除する。ある態様において、マイクロキャリアは、第2材料(例えば、ポリスチレン)に包まれる第1材料(例えば、磁性材料)から製造されることもある。
【0089】
液相マイクロキャリアは、リポソーム、ミセル、油滴及び他の液体又は油を基にした粒子を含む。通常、液相マイクロキャリアは、1又は複数の、非生物分解性の油又は脂質、例えば鉱油を包含する。1つの好ましい液相マイクロキャリアは、水中油乳濁液中の油滴である。1つの好ましい態様において、マイクロキャリアは、水性pHバッファー中での鉱油、トリオレイン酸ソルビタン、TWEEN 80(商標)の乳化によって調製される水中油乳濁液中の油滴である。
【0090】
抗原
抗原を含んで成る、又は抗原を含まないIMP/MC複合体、すなわち抗原と結合していないIMP/MC複合体が調製され得る。任意な抗原が、抗原を含んで成るIMP/MC複合体の調製に使用され得る。
【0091】
いくつかの態様において、抗原はアレルゲンである。組換えアレルゲンの例を表1に示す。多くのアレルゲンの調製が当業界で周知であり、限定しないが、ブタクサ花粉アレルゲン抗原E(Amb al)(Rafnar et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:1229−1236)、主要なチリダニアレルゲンDer pI及びDer PII (Chua et al. (1988)J. Exp. Med. 167:175−182;Chua et al. (1990)Int.Arch.Allergy Appl. Immunol.91:124−129)、シラカバ花粉Bet vl(Breiteneder et al. (1989)EMBO J. 8:1935−1938)、飼いネコアレルゲンFel dl(Rogers et al. (1993)Mol. Immunol. 30:559−568)、及び木の花粉からのタンパク質抗原(Elsayed et al. (1991) Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 204:17−31)の調製を含む。記載したように、木由来の抗原は公知であり、カバ、ネズ及びスギ由来のアレルゲンを含む。in vivoでの投与のための花粉の調製が報告されている。Malley (1989) J. Reprod. Immunol. 16:173−186。表1に示すように、一部の態様において、アレルゲンは、食物アレルゲン、例えばピーナッツアレルゲン、例えばAra h Iであり、そして、一部の態様において、アレルゲンは草の花粉、例えばライムギアレルゲン、例えばLol p 1である。表1は、使用され得るアレルゲンのリストを示す。
【表10】
【表11】
【表12】
【表13】
【0092】
一部の態様において、抗原は感染因子、例えば原生動物、細菌、真菌(単細胞及び多細胞のものを含む)、及びウィルスの感染因子由来である。適当なウイルス抗原の例は本明細書に記載されており、そして当業界で公知である。細菌は、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)及び百日咳菌(Bordetella pertussis)を含む。原生動物の感染因子は、マラリアの変形体、リーシュマニア種、トリパノソーマ種及び住血吸虫種を含む。真菌はカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)を含む。
【0093】
一部の態様において、抗原はウイルス抗原である。ウイルスポリペプチド抗原は、限定しないが、HIVタンパク質、例えばHIV gagタンパク質(限定しないが、膜固着(anchoring)(MA)タンパク質、コアキャプシド(CA)タンパク質及びヌクレオキャプシド(NC)タンパク質を含む)、HIVポリメラーゼ、インフルエンザウイルスマトリックス(M)タンパク質及びインフルエンザウイルスヌクレオキャプシド(NP)タンパク質、B型肝炎表面抗原(HBsAg)、B型肝炎コアタンパク質(HBcAg)、e型肝炎タンパク質(HBeAg)、B型肝炎DNAポリメラーゼ、C型肝炎抗原等を含む。インフルエンザワクチン接種を考察している引用文献は、
【表14】
を含む。抗原ポリペプチドの他の例は群又は亜群特異的抗原であり、これは、限定しないが、アデノウイルス、ヘルペス単純ウイルス、パピローマウイルス、呼吸器合胞体ウイルス及びポックスウイルスを含む、多くの感染因子に関して公知なものである。
【0094】
多くの抗原性ペプチド及びタンパク質が当業界で公知であり、且つ利用可能であり;他のものは、常用の技術を用いて同定されうる。腫瘍の形成に対する免疫化及び既存の腫瘍の処置のために、免疫調節ペプチドは、腫瘍細胞(生細胞又は照射された細胞)、腫瘍細胞抽出物、又は腫瘍抗原、例えばHer−2/neu、Mart1、ガン胎児抗原(CEA)、ガングリオシド、ヒト乳脂肪球(HMFG)、ムチン(MUC1)、MAGE抗原、BAGE抗原、GAGE抗原、gp100、前立腺特異的抗原(PSA)、及びチロシナーゼを含むことがある。免疫に基づいた避妊用ワクチンは、ISSと一緒に投与される精子タンパク質を含めることによって形成され得る。Lea et al. (1996) Biochem. Biophys. Acta 1307:263。
【0095】
弱毒化ウイルス及び不活性化ウイルスは、抗原としての本明細書での使用に適している。これらのウイルスの調製は当業界で周知であり、そして多くのものが市販されている(例えば、Physician’s Desk Reference (1998) 52nd edition, Medical Economics Company, inc.を参照のこと)。例えば、ポリオウイルスはIPOL(商標)(Pasteur Merieux Connaught)及びORIMUNE(商標)(Lederle Laboratories)として、A型肝炎ウイルスはVAQTA(商標)(Merck)として、麻疹ウイルスはATTENUVAX(商標)(Merck)として、ムンプスウイルスはMUMPSVAX(商標)(Merck)として、そして風疹ウイルスはMERUVAX(商標)II(Merck)として入手可能である。更に、弱毒化及び不活化ウイルス、例えば、HIV−1、HIV−2、単純ヘルペスウイルス、B型肝炎ウイルス、ロタウイルス、ヒト及び非ヒトパピローマウイルス及びスローブレインウイルスは、ペプチド抗原を提供し得る。
【0096】
一部の態様において、抗原はウイルスベクター、例えばワクシニア、アデノウイルス、及びカナリア痘瘡を含んで成る。
【0097】
抗原は、当業界で公知の精製技術を用いて、それらの供給源から単離されることがあり、又は、更に都合よくは、組換え法を用いて産生され得る。
【0098】
抗原性ペプチドは、精製された天然ペプチド、合成ペプチド、組換えタンパク質、粗製タンパク質抽出物、弱毒化ウイルス又は不活性化ウイルス、細胞、微生物、又はその様なペプチドのフラグメントを含むことがある。免疫調節ペプチドは、天然であっても、又は化学的若しくは酵素的に合成されてもよい。当業界で公知の化学合成の任意の方法が、適切である。液相ペプチド合成は、適当なサイズのペプチドの構築のために使用されることがあり、又は、ペプチドの化学的構築のために、固相合成が使用されることもある。Atherton et al.(1981) Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem. 362:833−839。タンパク質分解酵素もまた、ペプチドを産生するようにアミノ酸をカップリングするために利用され得る。Kullmann(1987) Enzymatic Peptide Synthesis, CRC Press,Inc.。あるいは、ペプチドは、細胞の生化学的機構を使用することによって、又は生物学的供給源からの単離によって得られ得る。組換えDNA技術は、ペプチドの産生のために使用され得る。Hames et al.(1987)Transcription and Translation:A Practical Approach, IRL Press。ペプチドはまた、アフィニティークロマトグラフィのような標準的技術を用いて単離され得る。
【0099】
好ましくは、抗原は、ペプチド、脂質(例えば、コレステロール以外のステロール、脂肪酸、及びリン脂質)、インフルエンザワクチンに使用されるような多糖、ガングリオシド及び糖タンパク質である。これらは、単離、並びに化学的方法及び酵素的方法を用いる合成を含む、当業界で公知の複数の方法を介して得られ得る。いくつかの場合において、例えば、多くのステロール、脂肪酸及びリン脂質の場合、分子の抗原部分は市販されている。
【0100】
対象組成物及び当該組成物を用いる方法において有用なウイルス抗原の例は、限定しないが、HIV抗原を含む。その様な抗原は、限定しないが、gp160、gp120及びgp41を含む、HIVエンベロープ糖タンパク質由来の抗原を含む。HIV遺伝子及び抗原に関する多くの配列が知られている。例えば、Los Alamos National Laboratory HIV Sequence Databaseは、HIVのヌクレオチド及びアミノ酸配列を回収し、預かりそして注釈をつけている。このデータベースは、インターネットを介して、http://hiv−web.lanl.gov./からアクセス可能であり、そして年刊の刊行物においては、Human Retroviruses and AIDS Compendium(例えば1998 edition)を参照のこと。
【0101】
感染因子由来の抗原は、当業界で公知の方法を用いて、例えば天然ウイルス又は細菌抽出物から、感染因子に感染した細胞から、精製したポリペプチドから、組換え的に産生したポリペプチド及び/又は合成ペプチドから得られることがある。
【0102】
IMP/MC複合体製剤は、限定しないが、サイトカイン、アジュバント及び抗体を含む、他の免疫治療物質を用いて調製されうる。これらのIMP/MC複合体製剤は、抗原を用いて、又は用いずに調製されうる。
【0103】
IMP/MC 複合体
IMP/MC複合体は、マイクロキャリアの表面に結合したIMPを含んで成り(すなわち、IMPがMCに包まれていない)、そして好ましくは各マイクロキャリアと結合したIMPの多数の分子を含んで成る。ある態様において、異なるIMPの混合物は、マイクロキャリアと複合体化されることがあり、その結果、当該マイクロキャリアは、1より大きいIMPの種類と結合する。IMPとMCとの間の結合は、共有結合であっても、又は非共有結合であってもよい。当業者によって理解されるように、IMPは修飾されても、又は誘導体化されてもよく、そしてマイクロキャリアの組成物は、IMP/MC複合体の形成に所望とされる、結合の所望な型を確保するために選択され、そして/あるいは修飾されることがある。
【0104】
共有結合したIMP/MC複合体は、当業界で公知の任意な共有結合的架橋技術を用いて結合されうる。典型的に、IMP部分は追加の部分(例えば、遊離アミン、カルボキシル又はスルフヒドリル基)を組み込むために、又はIMP部分がマイクロキャリアと結合し得る部位を提供するための、修飾された(例えば、ホスホロチオエート)ヌクレオチド塩基を組み込むために、修飾される。複合体のIMP部分とMC部分との間の結合は、IMPの3’又は5’末端において、又はIMPの内部にある、適当に修飾された塩基において生成されうる。マイクロキャリアは通常、共有結合が形成され得る部分を組み込むためにも修飾されるが、マイクロキャリア上に通常存在する官能基も利用されうる。IMP/MCは、共有結合複合体を形成せしめる条件下で(例えば、架橋剤の存在下で、又はIMPと共に共有結合を形成する活性部分を含んで成る活性マイクロキャリアの使用によって)、IMPをマイクロキャリアとインキュベートすることによって形成される。
【0105】
広範な架橋技術が当業界で知られており、そしてアミノ、カルボキシル及びスルフヒドリル基と反応性のある架橋剤を含む。当業者に自明の様に、架橋剤及び架橋プロトコールの選択は、IMP及びマイクロキャリアの配置並びにIMP/MC複合体の所望とされる最終的な配置に依存する。架橋剤は、同種二官能性又は異種二官能性のいずれであってもよい。同種二官能性架橋剤が使用される場合、当該架橋剤はIMP及びMC上の同じ部分を利用する(例えば、アルデヒド架橋剤は、共に1又は複数の遊離アミンを含んで成るIMP及びMCを共有結合するために使用され得る)。異種二官能性架橋剤は、IMPとMC上の異なる部分を利用し(例えばマレイミド−N−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、IMP上の遊離スルフヒドリル基及びMC上の遊離アミンを共有結合させるために使用され得る)、そしてマイクロキャリア間の結合の形成を最小化するのに好ましい。多くの場合において、マイクロキャリア上の第1架橋部分及びIMP上の第2架橋部分(ここで、第2架橋部分はマイクロキャリア上に存在しない)を介して架橋することが好ましい。IMP/MC複合体を生成する1つの好ましい方法は、異種二官能性架橋剤と一緒にインキュベートすることによってマイクロキャリアを「活性化」し、続いて、反応に適した条件下でIMPと活性化されたMCをインキュベートすることによってIMP/MC複合体を形成することによる。架橋剤は、反応部分間に「スペーサー」アームを組み込むことがあり、又は架橋剤の2つの反応部分が直接結合されることもある。
【0106】
1つの好ましい態様において、IMP部分は、マイクロキャリアと架橋するために、少なくとも1つの遊離スルフヒドリル(例えば、5’−チオールが修飾された塩基又はリンカーによって提供される)を含んで成り、一方、マイクロキャリアは遊離アミン基を含んで成る。これらの2つの基と反応性のある異種二官能性架橋剤(例えば、マレイミド基及びNHS−エステルを含んで成る架橋剤)、例えばスクシンイミジル4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシラートは、MCを活性化し、続いてIMPを架橋してIMP/MC複合体を形成するために使用される。
【0107】
非共有結合IMP/MC複合体は、一般的に結合対がIMPとMCを結合させるような場合と同様に、任意の非共有結合又は相互作用、例えばイオン(静電的)結合、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス引力、あるいは2又はそれ以上の異なる相互作用の組み合わせによって結合されうる。
【0108】
好ましい非共有結合IMP/MC複合体は、典型的に疎水性又は静電的(イオン性)相互作用、又はそれらの組み合わせによって複合体化される(例えば、IMPと、結合対を使用してMPに結合したポリヌクレオチドとの間の塩基対形成を介する)。ポリヌクレオチドの骨格の疎水性に起因して、複合体を形成するために疎水性の相互作用に依存するIMP/MC複合体は、高度に疎水性の部分を組み込むために、通常当該複合体のIMP部分の修飾を必要とする。好ましくは、疎水性部分は生物学的適合性で、非免疫原性のものであり、そしてその組成物が意図される個体において天然のものである(例えば、哺乳類、特にヒトにおいて見出される)。好ましい疎水性部分の例は、脂質、ステロイド、ステロール、例えばコレステロール、及びテルペンを含む。疎水性部分をIMPに結合させる方法は、当然、IMPの配置及び疎水性部分の同一性に依存する。疎水性部分は、IMPの任意の便利な部位、好ましくは5’又は3’末端のいずれかに挿入されることがあり;IMPにコレステロールを挿入する場合、コレステロール部分は、好ましくは、常用の化学反応を用いて、IMPの5’末端に挿入される(例えば、Godard et al. (1995)Eur. J. Biochem. 232:404−410を参照のこと)。好ましくは、疎水結合によって結合されるIMP/MC複合体における使用のためのマイクロキャリアは、疎水性材料、例えば油滴又は疎水性ポリマーから製造されるが、疎水性部分を組み込むよう修飾された親水性材料も同様に利用されうる。マイクロキャリアがリポソーム又は管腔を含んで成る他の液相マイクロキャリアである場合、IMP/MC複合体は、MC調製工程の間のIMPの封入を回避するために、MCの調製後にIMPとMCを混合することによって形成される。
【0109】
静電的結合によって結合した非共有結合型IMP/MC複合体は、典型的にポリヌクレオチド骨格の高度な負電荷性を利用する。従って、非共有結合したIMP/MC複合体における使用のためのマイクロキャリアは、生理学的pH(例えば、約pH6.8−7.4)で通常正に荷電している(例えば、陽イオン性)。マイクロキャリアは、本質的に正電荷を有するが、一般的に正電荷を有さない化合物から生成したマイクロキャリアは、正電荷(例えば、陽イオン性)となるように誘導体化され、又は他の方法で修飾され得る。例えば、マイクロキャリアを生成するために使用されるポリマーは、正に荷電した基、例えば第1級アミンを挿入するために誘導体化されうる。あるいは、正に荷電した化合物は、製造の間のマイクロキャリアの調製において組み込まれることがある。この様に、マイクロキャリアは正に荷電した部分を含んで成る。
【0110】
ヌクレオチドの塩基対形成によって結合した非共有結合性IMP/MC複合体は、常用の方法を用いて生成されうる。通常、塩基対合したIMP/MC複合体は、IMPと少なくとも部分的に相補性である、結合した、好ましくは共有結合したポリヌクレオチド(「捕獲(capture)ポリヌクレオチド」)を含んで成るマイクロキャリアを用いて生成されうる。IMPと捕獲ポリヌクレオチドとの間の相補性のセグメントは、好ましくは、少なくとも6、8、10又は15個連続した塩基対、更に好ましくは少なくとも20個連続した塩基対である。捕獲ヌクレオチドは、当業界で公知の任意な方法によってMCと結合されることがあり、そして好ましくは5’又は3’末端でIMPと共有結合する。
【0111】
他の態様において、結合対は、IMP/MC複合体においてIMPとMCを結合させるために使用され得る。結合対は、高い親和性(例えば約10−8未満のKd)で結合する受容体とリガンド、抗体と抗原(又はエピトープ)、又は任意な他の結合対であってもよい。好ましい結合対の1つの型は、非常に強固な複合体を形成するビオチンとストレプトアビジン、又はビオチンとアビジンであるが、一部の態様において、この結合の型は除外されることもある。IMP/MC複合体の結合を媒介するために結合対を用いる場合、IMPは典型的に、結合対の一方を用いて、共有結合によって誘導体化され、そしてMCは結合対の他方を用いて誘導体化される。2つの誘導体化された化合物の混合物は、IMP/MC複合体の形成をもたらす。
【0112】
多くのIMP/MC複合体の態様は抗原を含まず、そしていくつかの態様はIMP/MC複合体治療の対象である疾患又は病気と関連した抗原を除外する。更なる態様において、IMPはまた、1又は複数の抗原と結合する。抗原は、例えばWO98/16247に記載の様に、共有結合的及び/又は非共有結合的相互作用を含む様々な方法で、IMP/MC複合体のIMP部分とカップリングされうる。あるいは、抗原はマイクロキャリアと結合されうる(直接的又は間接的のいずれか)。
【0113】
IMPに結合した抗原を含んで成るIMP/MC複合体における抗原とIMPの間の結合は、IMPの3’又は5’末端において、あるいはIMPの内部にある適当に修飾された塩基において、生成されうる。抗原がペプチドであり、且つ適当な反応基(例えば、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル)を含む場合、それはシトシン残基のN4アミノ基と直接的に反応することがある。IMPにおけるシトシン残基の数及び位置に依存して、1又は複数の残基における特異的なカップリングが達成されうる。
【0114】
あるいは、当業界で公知のような、修飾されたヌクレオシド又はヌクレオチドは、IMPのいずれかの末端、又はその内側の部位において組み込まれることがある。これらは、脱ブロッキングされる場合に、注目の抗原上に存在することがあり、又はそれらに結合することがある種々の官能基と反応性である、ブロッキングされた官能基を含むことがある。
【0115】
抗原がペプチドである場合、接合体のこの部分は、固体支持体化学によってIMPの3’末端に結合され得る。例えば、IMP部分は、支持体上であらかじめ合成されているポリペプチド部分に付加され得る。Haralambidis et al. (1990a) Nucleic Acids Res. 18:493−499;及びHaralambidis et al. (1990b)Nucleic Acids Res. 18:501−505。あるいは、IMPは、3’末端から伸張している開裂可能なリンカーを通して固体支持体へ連結されるように合成され得る。支持体からISSの化学的開裂の際、末端チオール基が、オリゴヌクレオチドの3’末端に残されるか(Zuckermann et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:5305−5321;及びCorey et al. (1987) Science 238:1401−1403)、あるいは末端アミノ基が、オリゴヌクレオチドの3’末端に残される(Nelson et al. (19899 Nucleic Acids Res. 17:1781−1194)。ペプチドのアミノ基に対するアミノ修飾型IMPの接合は、Benoit et al. (1987) Neuromethods 6:43−72に記載のように実施され得る。ペプチドのカルボキシル基に対するチオール修飾型IMPの接合は、Sinha et al. (1991) Oligonucleotide Analogues:A Practical Approach, IRL Pressに記載のように実施され得る。ペプチドのシステイン残基のチオール側鎖に対する、付加されたマレイミドを有するオリゴヌクレオチドのカップリングもまた、記載されている。Tung et al. (1991) Bioconjug. Chem. 2:464−465。
【0116】
接合体のペプチド部分は、合成の間にオリゴヌクレオチドへ組み込まれたアミン、チオール、又はカルボキシル基を介して、IMPの5’末端へ結合され得る。好ましくは、オリゴヌクレオチドが固体支持体へ固定される間に、一方の末端において保護されたアミン、チオール又はカルボキシルを含んで成り、他方の末端においてホスホルアミダイトを含んで成る連結基は、5’ヒドロキシルと共有結合する。Agrawal et al. (1986) Nucleic Acids Res. 14:6227−6245;Connolly (1985) Nucleic Acids Res. 13:4485−4502;Kremsky et al. (1987)Nucleic Acids Res. 15:2891−2909;Connolly(1987)Nucleic Acids Res,15:3131−3139;Bischoff et al. (1987)Anal. Biochem. 164:336−344;Blanks et al. (1988)Nucleic Acids Res. 16:10283−10299;及び米国特許第4,849,513号、同第5,015,733号、同第5,118,800号、及び同第5,118,802号。脱保護に続いて、アミン、チオール及びカルボキシルの官能性は、ペプチドに対するオリゴヌクレオチドの共有結合のために使用され得る。Benoit et al. (1987);及びSinha et al. (1991)。
【0117】
IMP−抗原接合体も、非共有的相互作用、例えば、イオン結合、疎水性相互作用、水素結合及び/又はファンデルワールス引力によって形成され得る。
【0118】
非共有的に連結された接合体は、ビオチン−ストレプトアビジン複合体のような非共有的相互作用を含み得る。ビオチニル基は、例えば、ISSの修飾された塩基と結合され得る。Roget et al. (1989)Nucleic Acids Res. 17:7643−7651。ペプチド部分へのストレプトアビジン部分の組み込みは、ストレプトアビジンと接合したペプチドとビオチン化オリゴヌクレオチドとの非共有結合複合体の形成を可能にする。
【0119】
非共有結合的会合も、IMP及び抗原内の残基、例えば、荷電アミノ酸を含むイオン性相互作用を介して、又はオリゴヌクレオチド及び抗原の両方と相互作用し得る、荷電した残基を含むリンカー部分の使用を介して生じ得る。例えば、非共有結合的接合は、全体的に、負に荷電したISSと、ペプチドの正に荷電したアミノ酸残基、例えば、ポリリジン及びポリヒスチジン残基との間に生じ得る。
【0120】
IMPと抗原との間の非共有結合的接合は、天然のリガンドとしてDNAと相互作用する分子のDNA結合モチーフを介して生じ得る。例えば、そのようなDNA結合モチーフは、転写因子と抗DNA抗体において見出され得る。
【0121】
脂質へのIMPの結合は、標準的な方法を使用して形成され得る。これらの方法は、限定しないが、オリゴヌクレオチド−リン脂質接合体(Yanagawa et al. (1988) Nucleic Acids Symp. Ser. 19:189−192)、オリゴヌクレオチド−脂肪酸接合体(Grabarek et al. (1990) Anal. Biochem. 185:131−135;及びStaros et al. (1986) Anal Biochem. 156:220−222)、及びオリゴヌクレオチド−ステロール接合体の合成を含む。Boujrad et al. (1993)Proc. Natl Acad. Sci. USA 90:5728−5731。
【0122】
オリゴ糖に対するオリゴヌクレオチドの結合は、標準的な公知の方法を使用して形成され得る。これらの方法は、限定しないが、オリゴヌクレオチド−オリゴ糖接合体(ここで、オリゴ糖は、イムノグロブリンの一部である)を含む。O’Shannessy et al. (1985)J. Applied Biochem. 7:347−355。
【0123】
ペプチド又は抗原に対する環状IMPの結合は、いくつかの方法で形成され得る。環状IMPが組換え方法又は化学的方法を使用して合成される場合、修飾されたヌクレオシドが適切である。Ruth(1991)Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,IRL Press。次に、標準的な結合技術が、抗原又は他のペプチドに対し環状IMPを結合するために使用され得る。Goodchild(1990)Bioconjug. Chem. 1:165。環状IMPが単離される場合、又は組換え方法若しくは化学的方法を用いて合成される場合、結合は抗原又は他のペプチドに組み込まれている反応基(例えば、カルベン、ラジカル)を化学的活性化又は光活性化することによって形成され得る。
【0124】
オリゴヌクレオチドに対するペプチド及び他の分子の結合のためのさらなる方法は、米国特許第5,391,723号;Kessler(1992)「Nonradioactive labeling methods for nucleic acids」Kricka(ed.) Nonisotopic DNA Probe Techniques,Academic Press;及びGeoghegan et al. (1992)Bioconjug. Chem. 3:138−146において見出され得る。
【0125】
本発明の方法
本発明は、個体、好ましくは哺乳類、更に好ましくはヒトにおける免疫応答を調節する方法であって、免疫応答の所望な調節が達成されるように、個体に対し、IMP/MC複合体(典型的に、当該複合体及び医薬として許容される補形剤を含んで成る組成物中に存在)を投与することを含んで成る方法を提供する。免疫調節は、Th1型免疫応答を刺激し、そして/あるいはTh2型免疫応答を阻害し、又は低下させることを含むことがある。
【0126】
いくつかの態様において、免疫調節は、ある(すなわち、1又は複数の)Th1関連サイトカイン、例えばIFN−γ、IL−12及び/又はIFN−αを刺激することを含んで成る。いくつかの態様において、免疫調節は、ある(すなわち、1又は複数の)Th2関連サイトカイン、例えばIL−4及び/又はIL−5の産生を抑制することを含んで成る。これらの要因の測定は、当業界で標準的な方法を使用し、そして本明細書において論じてきた。
【0127】
本明細書に記載のように、IMP/MC複合体の投与は更に、1又は複数の追加の治療物質(すなわち、免疫系を介して働き、そして/あるいは免疫系に由来する物質)、例えば、限定しないがサイトカイン、アジュバント及び抗体の投与を含んで成ることがある。治療抗体の例は、ガンの状況において使用されるものを含む(例えば、抗腫瘍抗体)。その様な追加の免疫治療物質の投与は、本明細書に記載の全ての方法に適用する。
【0128】
一部の態様において、個体はTh2型免疫応答に関連する病気、例えばアレルギー又はアレルギー誘導型喘息に苦しんでいる。IMP/MC複合体の投与は、免疫調節をもたらし、その結果、アレルゲンに対する個体の応答と関連するTh2型応答の特徴の低下をもたらしうる、サイトカインと関連する1又は複数のTh1型応答のレベルを増大する。病気と関連するTh2型応答関連疾患を有する個体の免疫調節は、当該病気の1又は複数の症候の軽減又は改善をもたらす。病気がアレルギー又はアレルギー誘導型喘息である場合、1又は複数の症候の改善は、以下の鼻炎、アレルギー性結膜炎、IgEの循環レベル、ヒスタミンの循環レベル及び/又は「救急」の吸入器治療についての必要性(例えば、定量吸入器又は噴霧器によって投与される吸入用アルブテロール)のうちの1又は複数の軽減を含む。
【0129】
更なる態様において、本発明の免疫調節治療の対象となる個体は、ワクチン接種を受ける個体である。ワクチンは予防用ワクチン又は治療用ワクチンであってもよい。予防用ワクチンは、個体にとって危険性があり得る病気と関連する1又は複数のエピトープを含んで成る(例えば、百日咳の予防のためのワクチンの場合、百日咳菌の抗原)。治療用ワクチンは、個体に影響を及ぼす特定の病気と関連する、1又は複数のエピトープを含んで成り、例えば結核患者においては結核菌又はウシ結核菌表面抗原、アレルギーの対象となる個体においては、個体がアレルギーとなる抗原(すなわち、アレルギー脱感作治療)、ガン患者においては、ガンを有する個体に由来する腫瘍細胞(例えば、米国特許第5,484,596号に記載のもの)、又は腫瘍関連抗原、を含んで成る。IMP/MC複合体は、ワクチンと一緒に(例えば、同じ注射で、又は同時であるが、別々の注射で)与えられることもあり、又は、IMP/MC複合体は別々に(例えば、ワクチンの投与の少なくとも12時間前又はその後に)投与されることもある。一部の態様において、ワクチンの抗原は、IMP/MC複合体に対し、共有結合的又は非共有結合的のいずれかで連結した、IMPの一部である。ワクチン接種を受けている個体に対するIMP/MC複合体治療の投与は、IMP/MC複合体を含まないワクチン接種を受ける個体と比較して、Th1型応答に偏っている、ワクチンに対する免疫応答をもたらす。Th1型応答への偏りは、ワクチン中の抗原に対する遅延型過敏症(DTH)によって、IFN−γ及び他のTh1型応答関連サイトカインの増大、IFN−αの増大、ワクチンの抗原特異的CTLの産生、ワクチンの抗原に特異的なIgEの低レベル又はレベルの低下、ワクチンの抗原に特異的なTh2関連抗体の減少、及び/又はワクチンの抗原に特異的なTh1関連抗体の増大、によって認識されうる。治療用ワクチンの場合、IMP/MC複合体とワクチンの投与は、ワクチンの処置が意図される病気の症候の緩和をもたらす。当業者に自明な様に、正確な症候及びそれらの改善方法は、処置されることが求められる病気に依存する。例えば、治療用ワクチンが結核のためのものである場合、ワクチンによるIMP/MC複合体処置は、咳、胸膜又は胸壁の痛み、発熱、及び/又は当業界で知られている他の症候の低下をもたらす。ワクチンがアレルギーの脱感作治療で使用されるアレルゲンである場合、処置はアレルギーの1又は複数の軽減をもたらす(例えば、鼻炎、アレルギー性結膜炎、IgEの循環レベル、ヒスタミンの循環レベルの軽減)。
【0130】
本発明の他の態様は、既存の疾患又は病気、例えばガン又は感染病を有する個体の免疫調節治療に関する。ガンが免疫調節にとって魅力的な標的であるのは、多くのガンが、体内の他の細胞に見られない腫瘍関連及び/又は腫瘍特異的抗原を発現するためである。腫瘍細胞に対するTh1型応答の刺激は、免疫系による腫瘍細胞の直接的殺傷及び/又は第三者による殺傷をもたらし、ガン細胞の減少及び症候の軽減を導く。ガンを有する個体に対するIMP/MC複合体の投与は、腫瘍細胞に対するTh1型免疫応答の刺激をもたらす。その様な免疫応答は、細胞性免疫系細胞(例えば、CTL)又は体液性免疫系の成分の直接的作用によって、又は免疫系の標的となる細胞に近接した細胞上の第三者的効果によって、腫瘍細胞を殺傷し得る。
【0131】
本発明に従う免疫調節治療はまた、感染病、特に体液性免疫応答に耐性のある感染病(例えば、放線菌の感染及び細胞病原によって生じる疾患)を有する個体にとって有用である。免疫調節治療は、細胞内病原(例えば、細菌又は原虫)又は亜細胞病原(例えば、ウイルス)によって生じる感染病の処置に使用されることがある。IMP/MC複合体治療は、放線菌の病気、例えば結核(例えば、結核菌及び/又はウシ結核菌の感染症)、らい病(すなわち、らい菌の感染症)、マイコバクテリウム・マリーヌム(mycobacterium marinum)又はM. ウルセランス(M. ulcerans)の感染症に苦しむ個体に対し投与されうる。IMP/MC複合体治療は、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、特にヘルペス単純ウイルス、及びパピローマウイルスによる感染症を含むウイルス感染症の処置にも有用である。細胞内寄生虫、例えばマラリアによって生じる疾患(例えば、三日熱マラリア原虫(plasmodium vivax)、プラスモディウム・オバレ(P. ovale)、プラスモディウム・ファルシパルム(P. farciparum)及び/又はプラスモディウム・マラリア(P. malariae)による感染症)、リーシュマニア症(例えば、リーシュマニア・ドノバニ(Leishmania donovani)、リーシュマニア・トロピカ(L. tropica)、リーシュマニア・メキシカナ(L. mexicana)、リーシュマニア・ブラジリエンシス(L. braziliensis)、リーシュマニア・ペルビアナ(L. peruviana)、リーシュマニア・インファンタム(L. infantum)、リーシュマニア・カガシ(L. chagasi)及び/又はリーシュマニア・アエシオピカ(L. aethiopica)による感染症)、及びトキソプラズマ症(例えば、トキソプラズモシス・ゴンジイ(Toxoplasmosis gondii)による感染症)も、IMP/MC複合体治療から恩恵を受ける。IMP/MC治療はまた、寄生虫症、例えば、住血吸虫症(すなわち、住血吸虫(Schistosoma)属の住血吸虫、例えばエジプト住血吸虫、マンソン住血吸虫、日本住血吸虫、及びメコン住血吸虫による感染症)及び肝吸虫症(すなわち、クロノルキス・シネンシス(Clonorchis sinensis)による感染症)の処置にも有用である。感染病に苦しむ個体に対するIMP/MC複合体の投与は、感染病の1又は複数の症候の緩和をもたらす。いくつかの態様において、感染病はウイルス病ではない。
【0132】
本発明は更に、個体における少なくとも1つのTh1関連サイトカイン、例えばIL−2、IL−12、TNF−β、及びIFN−γを増大せしめる方法を提供する。一部の態様において、本発明は、有効量のIMP/MC複合体を個体に投与することによってIFN−γを増大させる方法を提供する。IFN−γレベルの増大が必要な個体は、IFN−γの投与に応答する病気を有するものである。その様な病気は、多くの炎症性疾患、例えば、限定しないが潰瘍性大腸炎を含む。その様な病気はまた、多くの繊維病、例えば、限定しないが特発性肺線維症(IPF)、強皮症、皮膚性放射線誘導型線維症、肝線維症、例えば住血吸虫症誘導型肝線維症、腎線維症並びにIFN−γの投与によって改善され得る他の症状を含む。本発明に従うIMP/MC複合体の投与は、IFN−γレベルの増大をもたらし、そして1又は複数の症候の緩和。1又は複数の症候の安定化、あるいはIFN−γに応答する病気の進行の予防(例えば、追加の病変又は症候の軽減又は排除)をもたらす。本発明の方法は、病気のための標準的な対処を構成する他の治療、例えばIPFにおける抗炎症剤の投与、例えば全身性コルチコステロイド治療(例えば、コルチゾン)と一緒に実施されうる。
【0133】
一部の態様において、本発明は個体、特にIFN−αレベルの増大が必要な個体において、IFN−αが増大するように、有効量のIMP/MC複合体を当該個体に対し投与することによって、IFN−αを増大させる方法を提供する。IFN−αの増大が必要な個体は、IFN−α、例えば組換えIFN−αの投与に応答する病気、例えば、限定しないがウイルス感染症及びガンを有する者である。
【0134】
更に提供されるものとして、IgE関連疾患を有する個体のIgEのレベル、特に血清レベルを、IgEのレベルが低下するように有効量のIMP/MC複合体を当該個体に対し投与することによって低下させる方法がある。IgEの減少は、IgE関連疾患の症候の緩和をもたらす。その様な症候は、アレルゲンに対する感受性の低下、アレルギーを有する個体におけるアレルギーの症候の低下、又はアレルギー性応答の重症度の低下における、アレルギーの症候、例えば鼻炎、結膜炎を含む。
【0135】
当業者に自明なように、本発明の方法の実施は、IMP/MC複合体が投与される特定の徴候のための、他の治療と組み合わせて実施されうる。例えば、IMP/MC複合体治療は、マラリア患者のための抗マラリア薬、例えばクロロキンとともに、リーシュマニア症の患者のための殺リーシュマニア薬、例えばペンタミジン及び/又はアロプリノールとともに、結核の患者のための抗放線菌薬、例えばイソニアジド、リファンピン及び/又はエタンブトールとともに、あるいはアトピー(アレルギー)の患者のためのアレルゲン脱感作治療とともに投与されうる。
【0136】
投与及び免疫応答の評価
IMP/MC複合体は、他の医薬並びに/あるいは免疫原性物質及び/又は免疫刺激物質と組み合わせて投与されることがあり、そして生理学的に許容されるその担体と組み合わされることがある。
【0137】
従って、IMP/MC複合体は他の免疫原性物質、例えば、限定しないがサイトカイン、アジュバント及び抗体と組み合わせて投与されることがある。
【0138】
ISS含有ポリヌクレオチドは、上述のもののいずれでもよい。配列番号1に示したように、好ましくは、投与されるISS含有ポリヌクレオチドは、配列5’−T、C、G−3’を含んで成る。好ましくは、投与されるISS含有ポリヌクレオチドは式5’プリン、プリン、C、G、ピリミジン、ピリミジン、C、G−3’を含んで成り;更に好ましくは配列5’−A、A、C、G、T、T、C、G−3’を含んで成る。別の好ましい態様は、配列番号1を使用する。
【0139】
免疫原性組成物と同様に、特定のIMP/MC複合体製剤の免疫学的な有効量及び投与方法は、個体、処置すべき全ての症状及び当業者に自明の他の因子に依存して変化し得る。考慮すべき因子は、抗原性、IMP/MC複合体がアジュバント又は送達分子と一緒に投与されるか、又はそれらと共有結合するか否か、投与経路及び投与されるべき量で免疫する回数、を含む。その様な因子は当業界で知られており、そして過度の実験をすることなく、その様な決定を行うことは、当業者に周知である。適当な用量範囲は、抗原に対する免疫応答の所望な調節を提供するものである。通常、用量は、IMP/MC複合体の全体的な量ではなく、患者に投与されるIMPの量によって決定される。送達されるIMPの量で示される、IMP/MC複合体の有用な用量範囲は、例えば、大体次のもののいずれかであってもよい:0.1〜100μg/kg、0.1〜50μg/kg、0.1〜25μg/kg、0.1〜10μg/kg、1〜500μg/kg、100〜400μg/kg、200〜300μg/kg、1〜100μg/kg、100〜200μg/kg、300〜400μg/kg、400〜500μg/kg。あるいは、用量範囲は、大体、次のもののいずれかであってもよい:0.1μg、0.25μg、0.5μg、1.0μg、2.0μg、5.0μg、10μg、25μg、50μg、75μg、100μg。従って、用量範囲は、大体、次の:0.1μg、0.25μg、0.5μg及び1.0μgのうちのいずれかの下限を有するもの;並びに、大体、次の:25μg、50μg及び100μgのうちのいずれかの上限を有するものであってもよい。各患者に与えられる絶対量は、薬理学的特性、例えば生物学的適合性、クリアランス率及び投与経路に依存する。
【0140】
特定のIMP/MC複合体製剤の有効量及び投与方法は、個々の患者及び病期及び当業者に自明の他の因子に基づいて変化しうる。特定の適用において有用な投与経路は、当業者に自明である。投与経路は、限定しないが、局所的、皮膚、経皮、経粘膜、表皮、非経口、消化管、及び鼻咽頭、並びに肺、例えば経気管支及び経肺胞を含む。適当な用量範囲は、血液レベルによって測定した場合に、約1〜10μMの組織濃度に達するのに十分なISS含有組成物を提供する用量範囲である。各患者に与えられる絶対量は、薬理学的特性、例えば生物学的適合性、クリアランス率、及び投与経路に依存する。
【0141】
本明細書に記載のように、APC及び高濃度のAPCを有する組織が、IMP/MC複合体にとって好ましい標的である。従って、哺乳類の皮膚及び/又は粘膜に対するIMP/MC複合体の投与が、APCが比較的高濃度で存在する場合に好ましい。
【0142】
本発明は、限定しないが、生理学的に許容されるインプラント、軟膏、クリーム、リンス及びゲルを含む、局所適用適したIMP/MC複合体製剤を提供する。局所投与は、例えば、送達系を分散せしめた包帯剤又は包帯によって、切開創又は開放創への送達系の直接投与、あるいは注目の部位に対する装置の経皮投与による。IMP/MC複合体を分散せしめたクリーム、リンス、ゲル、又は軟膏は、局所的な軟膏又は創傷充填剤としての使用に適切している。
【0143】
皮膚からの投与にとって好ましい経路は、最も低侵襲なものである。これらの中の好ましい手段は、経皮伝達、表皮投与及び皮下注射である。これらの手段の中で、表皮投与が、皮内組織に存在することが予測される、より高濃度のAPCにとって好ましい。
【0144】
経皮投与は、IMP/MC複合体が皮膚に浸透し、そして血流に侵入することを可能にし得る、クリーム、リンス、ゲルなどの適用によって達成される。経皮投与に適した組成物は、限定しないが、皮膚に直接適用されるか、又は保護担体、例えば経皮装置(いわゆる「パッチ」)へ組み込まれる医薬として許容される懸濁液、オイル、クリーム及び軟膏を含む。適当なクリーム、軟膏などの例は、例えば、Physician’s Desk Referenceで見出すことができる。
【0145】
経皮伝達の場合、イオントフォレーシスが適当な方法である。イオントフォレーシスによる伝達は、数日間又はぞれ以上の間、未破壊の皮膚を通して、その生成物を連続的に送達する市販の送達パッチを用いて達成され得る。この方法の使用は、比較的高濃度の医薬組成物の制御された伝達を可能にし、併用薬物の注入を許容し、そして吸収促進因子の同時使用を可能にする。
【0146】
この方法に使用するための例示的なパッチ製品は、General Medical Company(Los Angeles,CA)のLECTRO PATCHという商標の製品である。この製品は、中性pHに貯蔵電極を電気的に保持し、そして異なる濃度の用量を提供し、連続的に及び/又は周期的に投与するように適合され得る。パッチの調製及び使用は、引用によって本明細書に組み入れられる、LECTRO PATCH製品に添付された製造者の印刷した説明書に従い実施されるべきである。他の閉塞性のパッチ系も適している。
【0147】
経皮伝達のためには、低周波超音波送達もまた、適当な方法である。Mitragotri et al. (1995) Science 269:850−853。低周波超音波周波数(約1MHz)の適用は、治療組成物、例えば高分子量のものの、全般制御された送達を可能にする。
【0148】
表皮投与は、刺激物に対して免疫応答を引き起こすために十分に、表皮の最も外側の層を機械的又は化学的に刺激することを本質的に含む。具体的には、刺激は、刺激部位にAPCを誘引するのに十分であるべきである。
【0149】
例示的な機械的刺激手段は、皮膚を刺激し、そして刺激部位へAPCを誘引するために使用され得る多数の非常に小さな直径の短い尖叉を、尖叉の端から移されるIMP/MC複合体を取り込むように利用する。例えば、Pasteur Merieux(Lyon, France)によって製造されたMONO−VACC旧ツベルクリン試験は、IMP/MC複合体含有組成物の導入のために適切な装置を含む。
【0150】
当該装置(Swiftwater、PAのConnaught Laboratories,Inc.によって米国で販売されているもの)は、一方の末端にシリンジプランジャーを、他方の末端に尖叉ディスクを有するプラスチック容器から成る。尖叉ディスクは、表皮細胞の最も外側の層を単に引っ掻くだけの長さの、小さな直径の多数の尖叉を支持する。MONO−VACCキットの各尖叉は、旧ツベリクリンでコーティングされている;本発明において、各針は、IMP/MC複合体製剤の医薬組成物でコーティングされる。この装置の使用は、好ましくは、装置製品と一緒に含まれる製造者の書面による説明書に従う。この態様において使用され得る同様の装置は、アレルギー試験を実施するために現在使用されるものである。
【0151】
IMP/MC複合体の上皮投与に対する別の適切なアプローチは、表皮の最も外側の細胞を刺激する化学物質の使用により、十分な免疫応答を引き起こして領域に対してAPCを誘引することである。一例として、ケラチン分解剤、例えばNoxema CorporationによりNAIRの商標のもとで販売される市販の局所的な脱毛クリームにおいて使用されるサリチル酸、がある。このアプローチはまた、粘膜における上皮投与を達成するために使用され得る。化学的刺激物も、機械的刺激物(例えば、MONO−VACC型の尖叉も化学的刺激物でコーティングされた場合に生じるようなもの)とともに適用され得る。IMP/MC複合体は、更に化学的刺激剤物もまた含む担体中で懸濁されるか、又はそれらと一緒に同時投与されることがある。
【0152】
投与の非経口経路は、電気的(イオントフォレーシス)又は直接的な注射、例えば中心静脈系統への直接注射、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮内注射、又は皮下注射のような直接注入を含む。非経口投与に適したIMP/MC製剤は通常、USP水又は注射用水において調製され、そして更に、pH緩衝剤、塩充填剤、保存剤、及び他の医薬として許容される補形剤を含んで成ることもある。非経口注射のためのIMP/MC複合体は、注射のための、医薬として許容される滅菌等張溶液、例えば生理食塩水及びリン酸緩衝化生理食塩水において調製されることがある。
【0153】
投与の消化管経路は、限定しないが、摂取及び直腸を含む。本発明は、限定しないが、摂取のための医薬として許容される粉末、丸剤、又は液体及び直腸投与のための坐薬を含む、消化管投与に適したIMP/MC複合体を含む。当業者に自明なように、丸剤又は座薬は更に、組成物のためにかさを提供するよう、医薬として許容される固体、例えばデンプンを含んで成ることがある。
【0154】
鼻咽頭及び経肺投与は、吸入によって達成されるものを含み、そして送達経路、例えば経鼻、経気管支及び経肺胞経路を含む。本発明は、吸入による投与に適したIMP/MC複合体製剤を含み、これは、限定しないが、エアロゾルの形成のために液体懸濁物、及び、乾燥吸入送達系のためにエアロゾルを含む。IMP/MC複合体製剤の吸入投与に適した装置は、限定しないが、噴霧器、気化器、ネブライザー、及び乾燥粉末吸入送達装置を含む。
【0155】
送達経路の選択は、誘発される免疫応答を調節するのに使用され得る。例えば、IgG力価及びCTL活性は、インフルエンザウイルスベクターが筋肉内経路又は上皮(遺伝子銃)経路を介して投与された場合に同一であった;しかし、筋肉接種は主にIgG2Aを生成したのに対し、上皮経路はほとんどIgG1を生成した。Pertmer et al. (1996) J.Virol.70.6119−6125。従って、当業者は、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドを投与する異なる経路によって誘発される、免疫原性におけるわずかな差異を利用し得る。
【0156】
上文で言及した組成物及び投与の方法は、限定しないが、本発明のIMP/MC複合体製剤を投与する方法を説明することを意味する。種々の組成物及び装置を製造する方法は、当業者の能力の範囲内であり、本明細書中で詳細に記載しない。
【0157】
IMP/MC複合体製剤に対する免疫応答の分析(定性及び定量の両方)は、当業界で公知である任意の方法、例えば、限定しないが、抗原特異的抗体産生(特異的抗体のサブクラスの測定を含む)、リンパ球の特定の集団、例えばCD4+T細胞又はNK細胞の活性化、サイトカイン、例えばIFN−γ、IFN−α、IL−2、IL−4、IL−5、IL−10又はIL−12の産生及び/又はヒスタミンの放出の測定を含む。特異的抗体応答を測定するための方法は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を含み、そして当業界で周知である。CD4+T細胞のような特定の型のリンパ球の数の測定は、例えば、蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いて達成され得る。細胞傷害性アッセイは、例えば、Raz et al. (1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:9519−9523に記載のように実施され得る。サイトカインの濃度は、例えば、ELISAによって測定され得る。免疫原に対する免疫応答を評価するためのこれらのアッセイ及び他のアッセイは当業界で周知である。例えば、Selected Methods in Cellular Immunology (1980) Mishell及びShiigi, eds., W.H.Freeman and Co.を参照のこと。
【0158】
好ましくは、Th1型応答は刺激され、すなわち誘発され、そして/あるいは増強される。本発明に従う、Th1型の免疫応答の刺激は、ISSを用いずに処理したものと比較して、ISSで処理した細胞からのサイトカイン産生を測定することにより、in vitro又はex vivoで決定され得る。細胞のサイトカイン産生を決定する方法は、本明細書中に記載の方法、及び当業界で公知の任意のものを含む。ISS処理に応答して産生されるサイトカインの型は、細胞による、Th1型又はTh2型に偏った免疫応答を示す。本明細書中で使用する場合、用語「Th1型に偏った」サイトカイン産生は、刺激の無いなかでのこのようなサイトカインの産生と比較した場合の、刺激因子の存在下でのTh1型免疫応答に関連したサイトカインの測定可能な増加した産生を言及する。このようなTh1型に偏ったサイトカインの例は、限定しないが、IL−2、IL−12、及びIFN−γを含む。対照的に、「Th2型に偏ったサイトカイン」とは、Th2型免疫応答に関連したものを言及し、そして、限定しないが、IL−4、IL−5、IL−10、及びIL−13を含む。ISS活性の決定のために有用な細胞は、免疫系の細胞、宿主及び細胞株から単離される初代細胞、好ましくはAPC及びリンパ球、さらにより好ましくはマクロファージ及びT細胞を含む。
【0159】
Th1型免疫応答の刺激はまた、IMP/MC複合体製剤で処置した宿主において測定されることがあり、限定しないが、以下のことを含む当業界で公知の任意な方法によって決定され得る:(1)抗原の曝露の前及び後で測定したIL−4のレベルの低下;又は抗原で初回刺激したコントロール、又は初回刺激し、そして曝露したコントロール、ISSなしで処置したコントロールと比較した場合に、IMP/MC複合体で処理した宿主においてさらに低い(又は存在さえしない)レベルのIL−4又はIL−5の検出;(2)抗原の曝露の前及び後のIL−12、IL−18、及び/又はIFN(α、β、もしくはγ)のレベルの上昇;又は抗原で初回刺激したコントロール、又は初回刺激し、そして曝露したコントロール、ISSなしで処置したコントロールと比較して、IMP/MC複合体で処置した宿主におけるさらに高いレベルのIL−12、IL−18、及び/又はIFN(α、β、もしくはγ)の検出;(3)ISSなしで処置したコントロールと比較して、ISS−抗原処置宿主におけるIgG2a抗体産生;ならびに/あるいは(4)抗原の曝露の前及び後で測定した場合の抗原特異的IgEのレベルの低下;又は抗原で初回刺激したコントロール、又は初回刺激し、そして曝露したコントロール、ISSなしで処置したコントロールと比較して、IMP/MC複合体で処置した宿主においてより低い(又は存在さえしない)レベルの抗原特異的IgEの検出。これらの種々の決定は、APC及び/又はリンパ球、好ましくはマクロファージ及び/又はT細胞によって生成されるサイトカインを、in vitro又はex vivoで、本明細書中に記載される方法又は当業界で公知の任意の方法を用いて測定することによって行なわれ得る。これらの決定のうちのいくつかは、本明細書に記載の方法又は当業界で公知の任意な方法を用いて、抗原特異的抗体のクラス及び/又はサブクラスを測定することによって行われ得る。
【0160】
IMP/MC複合体処理に応答して産生される抗原特異的抗体のクラス及び/又はサブクラスは、細胞による、Th1型又はTh2型に偏った免疫応答を示す。本明細書中で使用する場合、用語「Th1型に偏った」抗体産生は、刺激の無いなかでのこのようなサイトカインの産生と比較した場合の、刺激因子の存在下でのTh1型免疫応答に関連する抗体(すなわち、Th1関連抗体)の測定可能な増加した産生を言及する。1又は複数のTh1関連抗体は、限定しないが、ヒトIgG1及び/又はIgG3(例えば、Widhe et al. (1998) Scand. J. Immunol. 47:575−581及びde Martino et al. (1999) Ann. Allergy Asthma Immunol 83:160−164を参照のこと)並びにマウスIgG2aを含む。対照的に、「Th2型に偏った抗体」は、Th2型免疫応答に関連するものを言及し、そして、限定しないが、ヒトIgG2、IgG4及び/又はIgE(例えば、Widhe et al. (1998) Scand. J. Immunol. 47:575−581及びde Martino et al. (1999) Ann. Allergy Asthma Imunol 83:160−164を参照のこと)並びにマウスIgG1及び/又はIgEを含む。
【0161】
IMP/MC複合体の投与の結果として生じる、Th1型に偏ったサイトカイン誘導は、細胞性免疫応答の増強、例えば、NK細胞、細胞傷害性キラー細胞、Th1ヘルパー及び記憶細胞により行なわれるもの、を発生させる。これらの応答は、ウイルス、真菌、原生動物、寄生体、細菌、アレルギー性疾患、及び喘息、ならびに腫瘍に対する防御的又は治療的ワクチン接種における使用に特に有益である。
【0162】
いくつかの態様において、Th2応答は抑制される。Th2応答の抑制は、例えば、Th2関連サイトカイン、例えばIL−4及びIL−5のレベルの低下、並びにIgEの減少及びアレルゲンに対するヒスタミン放出の減少、によって決定されうる。
【0163】
本発明のキット
本発明は、本発明の使用のためのキットを提供する。ある態様において、本発明のキットは、IMP/MC複合体を含んで成る1又は複数の容器及び、意図される処置(例えば、免疫調節、感染病の1又は複数の症候の緩和、IFN−γレベルの増大、IFN−αレベルの増大、又はIgE関連疾患の緩和)のための使用に関する、一般的に書面の説明書である説明書集を含んで成る1又は複数の容器を含んで成る。更なる態様において、本発明のキットは、IMP/MCを産生するための材料の容器、IMP/MC複合体を産生するための説明書、及び意図される処置のためのIMP/MC複合体の使用に関する説明書、を含んで成る。
【0164】
あらかじめ形成したIMP/MC複合体を含んで成るキットは、任意な常用の、適当な包装で包装されたIMP/MC複合体を含んで成る。例えば、IMP/MC複合体が乾燥製剤(例えば、凍結乾燥したもの又は乾燥粉末)である場合、弾力性のある栓を有するバイアルが通常使用され、その結果IMP/MC複合体は、弾力性のある栓を介して液体を注入することによって容易に懸濁されうる。弾力性のない、除去可能な封を有するアンプル(例えば、密封されたガラス)又は弾力性のある栓を有するアンプルは、IMP/MC複合体の液体製剤にとって最も都合よく使用される。更に考えられるものとして、特異的な装置、例えば吸入器、経鼻投与装置(例えば、噴霧器)、注入装置、例えばミニポンプとの併用のための包装がある。
【0165】
IMP/MC複合体の産生のための材料を含んで成るキットは、IMPとMCの別々の容器を通常含むが、ある態様においては、あらかじめ形成したMCよりもむしろ、MCを産生するための材料が供給される。この構成が好ましいのは、IMP/MC複合体が非共有結合によって連結される場合である。この構成がまた好ましいのは、IMP及びMCが異種二官能性架橋剤を介して架橋されうる場合であり;IMP又はMCのいずれかが、「活性」型で供給される(例えば、IMPと反応性のある部分が利用可能となるように、異種二官能性架橋剤と連結される)。
【0166】
液相のMCを含んで成るIMP/MC複合体のためのキットは、好ましくは、液相のMCを産生するための材料を含む、1又は複数の容器を含んで成る。例えば、水中油乳濁液のMCのためのIMP/MCキットは、油層及び水層を含む1又は複数の容器を含んで成ることがある。当該容器の中身は、MCを産生するために乳化され、これは、続いてIMP、好ましくは疎水性部分を組み込むように修飾されたIMPと混合されうる。その様な材料は、水中油乳濁液の産生のために、油及び水、又は透析されたリポソーム成分(例えば、リン脂質、コレステロール及び界面活性剤の混合物)の容器+水層(例えば、医薬として許容される水性緩衝液)の1又は複数の容器を含む。
【0167】
意図される処置のためのIMP/MC複合体の使用に関する説明書は、通常、意図される処置のための用量、投与計画、及び投与経路についての情報を含む。ISSの容器は、単位用量、バルクの包装(例えば、複数の用量の包装)又はサブユニットの用量であってもよい、本発明のキットにおいて提供される説明書は、ラベル又は添付文書(例えば、キットに含まれる用紙)上に典型的に記載された説明書であるが、機械が読み取り可能な説明書(例えば、磁気的又は光学的なストレージディスクも許容される。
【0168】
以下の例は、限定しないが、本発明を例示するために提供される。
【0169】
例
例1:非共有結合性の、液相 IMP/MC 複合体の製造
修飾したIMP及び液相MCを含んで成るIMP/MC複合体を製造し、そして複合体の形成について試験した。
【0170】
IMP(ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド 5’−TGACTGTGAACGTTCGAGATGA−3’)(配列番号1)は、ホスホラミダイト化学を用いて、IMPの5’末端に対するコレステロール分子の挿入によって修飾した。水中油乳濁液は、マイクロフルイダイザーを用いた、4.5%(w/v)スクアレン、0.5%(w/v)トリオレイン酸ソルビタン、0.5%(w/v)TWEEN(商標)80及び10mMクエン酸ナトリウム、pH6.5の混合物のホモジェナイゼーションによって生成した。乳濁液の試験は、乳濁液中の油滴が約160nmの平均直径を有していたことを明らかにした。
【0171】
乳濁液は、コレステロール修飾型IMP又は同一のIMPの非修飾型と混合され、続いて油層と水層を分離するために遠心された。RP−HPLCは、ヌクレオチド含量を決定するために、各層に由来する試料について行った。約75%のコレステロール修飾型IMPが油層において見られ、一方、100%の非修飾型IMPが水層において見られた。
【0172】
例2: IMP/MC 混合物による免疫調節
IMP(ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド 5’−TGACTGTGAACGTTCGAGATGA−3’)(配列番号1)又はコントロールオリゴヌクレオチド(ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド 5’−TGACTGTGAAGGTTAGAGATGA−3’)(配列番号9)の混合物は、硫酸誘導型ポリカーボネート微粒子又はナノ粒子(Polysciences, Inc.)と混合され、そしてマウスの脾臓細胞上で、免疫調節活性についてアッセイされた。
【0173】
BALB/cマウスの脾臓のフラグメントは、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で溶解したコラゲナーゼ/ディスパーゼ(0.1U/mL/0.8U/mL)で、37℃で45分間消化し、続いて、消化したフラグメントに力をかけて金属ふるいを通過させることによって機械的に分散された。分散した脾臓細胞は遠心によってペレット化され、続いて新鮮な培地(10%ウシ胎児血清と、50ユニット/mLのペニシリン、50μg/mLのストレプトマイシン、2mMのグルタミン、及び0.05mMβ−メルカプトエタノールを含むRPMI 1640)中で再懸濁された。
【0174】
4x105のマウスの脾臓細胞を96穴プレートの穴に分散させ、そして37℃で1時間インキュベートした。100μLの2x濃度の試験試料又はコントロールを添加し、そして当該細胞を更に24時間インキュベートした。培地を各穴から採集し、そしてELISAによってサイトカイン濃度について試験した。
【0175】
IFN−γが、サンドイッチELISAを用いてアッセイされた。マウスの脾臓細胞アッセイに由来する培地は、抗IFN−γモノクローナル抗体(Nunc)でコーティングしたマイクロタイタープレート中でインキュベートされた。結合したIFN−γは、ビオチン化した抗IFN−γ抗体及びストレプトアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ複合型二次抗体を用いて検出され、ペルオキシダーゼの存在下、色素原性のペルオキシダーゼ基質3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)で展開され、そしてEmax precision microplate reader(Molecular Devices)を用いて、450nmの吸光度を測定することによって定量された。
【0176】
IMPと混合した200nmのビーズは、マウスの脾臓細胞によるIL−12、IL−6及びIFN−γの分泌を実質的に増大させ、そしてIMPと混合した50nmのビーズは、IL−12及びIL−6の産生を増大させた。いくつかの非特異的活性を、コントロールオリゴヌクレオチドと混合した200nmのビーズは伴っていたが、これはIMP単独と比較した場合、刺激における増大を説明するのに不十分であった。更に、1μm及び4.5μmのマイクロキャリアも、サイトカインの産生を増大させた。表2〜4は、それぞれIL−12、IL−6及びIFN−γについてのアッセイの結果を要約する。
【表15】
【表16】
【表17】
【0177】
例3: IMP/NC 接合体によるマウス細胞の免疫調節
ポリスチレンビーズ(200nmの設計サイズ)と共有結合したIMPは、マウスの脾臓細胞上で、免疫調節活性について試験された。
【0178】
アミン誘導型ポリスチレンビーズは、Molecular Probes, Inc.,及びPolysciences, Inc.から入手した。3つのタイプのビーズを利用した:アミン誘導型ビーズ(Polysciences, Inc.,カタログ番号15699)、580nm及び605nmの励起/発光極大を有するフルオロフォアと結合したアミン誘導型ビーズ(”Red Beads”, Molecular Probes, Inc.,カタログ番号F8763)、及び505nm及び515nmの励起/発光極大を有するフルオロフォアと結合したアミン誘導型ビーズ(”Yellow Beads”, Molecular Probes, Inc.,カタログ番号F8764)は、取り扱い説明書に従い、スルホ−SMCC(スルホスクシンイミジル−4−(N−マレイミドメチル)シクロペンタン−1−カルボキシレート、Pierce Chemical Co.)を用いて活性化された。ビーズは、続いて、IMP、コントロールホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド 5’−TGACTGTGAAGGTTAGAGATGA−3’)(コントロールA)(配列番号9)、5’−TGACTGTGAACCTTAGAGATGA−3’(コントロールB)(配列番号10)、又は5’−TCACTCTCTTCCTTACTCTTCT−3’(コントロールC)(配列番号11)と結合され、又はNCのみのコントロールとしての使用のための、遊離マレイミド基をクエンチングするために処理した。
【0179】
IMP/NC複合体の免疫調節効果は、上文の例2に記載のように、マウスの脾臓細胞を用いてアッセイされた。IMP/NC複合体は、IL−12、IL−6及び/又はIFN−γの分泌の増大によって示されるように、マウスの脾臓細胞上で免疫調節を示したが、NCと接合したコントロールオリゴヌクレオチドは、サイトカインの分泌を刺激しなかった。IFN−γの分泌についてのデータは、表5に要約する。
【表18】
【0180】
例4: IMP/NC 接合体によるヒト細胞の免疫調節
ポリスチレンビーズ(200nmの設計サイズ)と共有結合したIMPは、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)上で、免疫調節活性について試験された。
【0181】
末梢血は、ヘパリン化シリンジを用いる静脈穿刺によって、ボランティアから回収した。血液は、FICOLL(商標)(Amersham Pharmacia Biotech)のクッション上で層状にし、そして遠心した。FICOLL(商標)の界面に位置するPBMCを回収し、続いて冷却したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を用いて2回洗浄した。細胞を再懸濁し、そして10%熱不活性化ヒトAB血清と50ユニット/mLのペニシリン、50μg/mLのストレプトマイシン、300μg/mLのグルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム、及び1xMEM非必須アミノ酸(NEAA)を含むRPMI 1640中で2x106細胞/mLで、24穴又は48穴プレート中で培養された。
【0182】
細胞は、試験試料(IMP/NC製剤又はコントロール)の存在下で24時間培養され、続いて細胞を含まない培地が各穴から回収され、そしてIFN−γ濃度についてアッセイされた。IFN−γは、BioSource International, Inc.のCYTOSCREEN(商標)ELISAキットを、取り扱い説明書に従い使用してアッセイした。
【0183】
IMP/NC複合体は、ヒトPBMCによるIFN−γの分泌を刺激した。結果を表6に要約する。
【表19】
【0184】
外国特許は、明瞭さ及び理解のための例示及び実施例によって多少詳細に記載されているが、当業者には、若干の変化及び修飾が実施されうることは自明である。従って、説明及び実施例は、特許請求の範囲によって表される本発明の範囲を限定するものとしてみなされるべきではない。
関連出願に対するクロスリファレンス
本出願は、引用によってその全体が本明細書に組み入れられる、2000年3月10日に出願された米国仮特許出願第60/188,577号の優先権の利益を主張する。
【0002】
技術分野
本発明は、免疫刺激オリゴヌクレオチド配列(ISS)を含んで成る免疫調節組成物に関する。特に、本発明は、非生物分解性微粒子と結合したISSを含んで成る免疫調節組成物に関する。これはまた、少なくとも1つの免疫応答を調節するポリヌクレオチド/マイクロキャリア複合体の投与にも関する。
【0003】
背景技術
感染又は他の抗原に対する曝露に対して生じる免疫応答の型は、一般には応答に関与するTヘルパー(Th)細胞のサブセットにより識別され得る。Th1のサブセットは、古典的な細胞媒介性機能、例えば、遅延型過敏症及び細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の活性化、の原因であるのに対し、Th2のサブセットは、B細胞活性化のためのヘルパーとしてより効果的に機能する。抗原に対する免疫応答の型は、一般には抗原に応答する細胞により生成されるサイトカインにより影響を受ける。Th1細胞及びTh2細胞により分泌されるサイトカインにおける差異は、これら2つのサブセットの異なる生物学的機能を反映すると考えられている。例えば、Romagnani(2000) Ann. Allergy Asthma Immunol. 85:9−18を参照のこと。
【0004】
Th1サブセットがウイルス感染、細胞内病原及び腫瘍細胞体に応答するために特に適切であると思われるのは、それがCTLを活性化するIL−2及びIFN−γを分泌するためである。Th2のサブセットが、好き勝手に生きている細菌及び寄生虫に対する応答にさらに適切であり、そしてアレルギー性反応を媒介すると思われるのは、IL−4及びIL−5が、それぞれIgE産生及び好酸球の活性化を誘導することが知られているためである。一般には、Th1細胞及びTh2細胞は、異なるパターンのサイトカインを分泌し、従って、ある型の応答は、他の型の応答の活性を緩和し得る。Th1/Th2のバランスの変化は、例えば、アレルギー応答を、あるいは、CTL応答の増大を生じ得る。
【0005】
多くの感染病、例えば、結核及びマラリアにとって、Th2型応答は、感染に対する予防的価値がほとんどない。標的抗原由来の低分子ペプチドを用いるワクチンの案及び潜在的に感染性である未処理ウイルス粒子の使用を避ける、他の現在使用されている抗原性物質は、治療効果を達成するために必要な免疫応答を常に誘発するわけではない。治療上で有効なヒト免疫不全ウイルス(HIV)ワクチンがないことは、この失敗の不幸な例である。タンパク質を基にしたワクチンは典型的に、高力価であるが、有意な細胞性免疫のない中和抗体によって特徴づけられる、Th2型免疫応答を誘導する。
【0006】
更に、抗体応答のうちの複数の型は、ある徴候において、最も顕著にはIgE抗体の応答がアナフィラキシーショックをもたらしうるアレルギーにおいて不適当である。通常、アレルギー応答はまた、Th2型免疫応答に関与する。アレルギー応答、例えばアレルギー性喘息のものは、アレルゲンの曝露から数秒〜数分以内に発生し、そして細胞の脱顆粒を特徴とする初期相の応答、及びアレルゲンの曝露から4〜24時間後に発生し、そしてアレルゲンが曝露された部位への好酸球の浸潤を特徴とする後期相の応答を特徴とする。具体的には、アレルギー応答の初期相の間に、アレルゲンは好塩基球及び肥満細胞上でIgE抗体を架橋し、続いて脱顆粒及びその後のヒスタミン及び他の炎症媒介物の肥満細胞及び好塩基球からの放出の引き金を引く。後期相の応答の間、好酸球はアレルゲンの曝露部位(組織の損傷及び機能障害が生じた場所)に浸潤する。
【0007】
アレルギー性疾患のための抗原免疫療法は、小さいが、徐々に量が増大する抗原の皮下注射を含む。その様な免疫化処置には、IgE媒介型アナフィラキシーを誘導する危険性が存在し、そしてこれはアレルギー性の後期相応答のサイトカイン媒介型事象を有効に処理しない。今までのところ、このアプローチはわずかに限定された成功をもたらしている。
【0008】
一般的に免疫刺激配列又は「ISS」として知られている、あるDNA配列の投与は、Th1関連サイトカインの分泌によって示されるように、Th1型に偏った免疫応答を誘導する。免疫刺激ポリヌクレオチドと抗原の投与は、投与される抗原に対するTh1型の免疫応答をもたらす。Roman et al.(1997) Nature Med. 3:849−854. 例えば、エスケリッチャ・コリ(Escherichia coli, E coli)のβガラクトシダーゼ(β−gal)/生理食塩水又はアジュバントのミョウバンを皮内注射されたマウスは、特異的なIgG1及びIgE抗体、並びにIL−4及びIL−5は分泌したが、IFN−γを分泌しなかったCD4+細胞を産生することによって応答し、T細胞が支配的にTh2サブセットのものであったことを示した。しかしながら、β−Galをコードし、かつISSを含むプラスミドDNA(生理食塩水中)を皮内に(又はtyne skin scratch applicatorで)注射されたマウスは、IgG2a抗体、ならびにIFN−γを分泌したがIL−4及びIL−5を分泌しなかったCD4+細胞を産生することにより応答し、T細胞が支配的にTh1のサブセットのものであることを示した。更に、プラスミドDNAを注射されたマウスによる特異的なIgEの産生は、66〜75%減少した。Raz et al. (1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:5141−5145. 通常、裸のDNAの免疫に対する応答は、Th1型の応答であることを示す、抗原刺激されたCD4+T細胞によるIL−2、TNFα及びIFN−γの産生によって特徴づけられる。これはIgE産生の減少により示されるようにアレルギー及び喘息の処置において特に重要である。Th1型の免疫応答を刺激する免疫刺激ポリヌクレオチドの能力は、細菌性抗原、ウイルス抗原及びアレルゲンによって証明されている(例えば、WO98/55495を参照のこと)。
【0009】
微粒子(SEPHAROSE(商標)ビーズ)に結合したISS含有オリゴヌクレオチドは、in vitroで免疫刺激活性を有することがこれまでに示されている(Liang et al., (1996), J. Clin. Invest. 98:1119−1129)。しかしながら、近年の結果は、金、ラテックス及び磁気粒子に結合したISS含有オリゴヌクレオチドが、ISS含有オリゴヌクレオチドに応じて増殖する、7TD1細胞の増殖を刺激するのに活性でないことを示している(Manzel et al.(1999) Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 9:459−464)。
【0010】
ISSを記載している他の引用文献は:
【表1】
【表2】
【0011】
更に、Godard et al. (1995)Eur. J. Biochem. 232:404−410は、ポリイソヘキシルシアノアクリラートのナノ粒子と結合したコレステロール修飾型のアンチセンスオリゴヌクレオチドを開示している。
【0012】
本明細書に列記されている全ての特許、特許出願、及び刊行物は、引用によってその全体が本明細書に組み入れられる。
【0013】
本発明の開示
本発明は、個体、特にヒトの個体において免疫応答を修飾するための新規組成物及び方法に関する。
【0014】
1つの観点において、本発明は免疫調節ポリヌクレオチド/マイクロキャリア(IMP/MC)複合体を含んで成る組成物に関する。IMP/MC複合体は非生物分解性マイクロキャリア(MC)と結合した免疫刺激配列(IMP)を含んで成るポリヌクレオチド(IMP)を含んで成るが、但し、MCは金、ラテックス又は磁気性のものである場合、当該結合はビオチン/アビジン(又はビオチン/ストレプトアビジン)を介する以外のものである。IMPは、複合体においてマイクロキャリアと共有結合的に又は非共有結合的に結合してもよく、そしてIMPは複合体の形成を容易にするために修飾されることがある。IMP/MC複合体において使用されるマイクロキャリアは、液相のマイクロキャリア又は固相のマイクロキャリアであってもよい。マイクロキャリアは、通常サイズが約100μm未満であり、そしてサイズが約10nm〜約10μm又は約25nm〜5μmであってもよい。ある態様において、本発明の組成物はIMP/MC複合体及び医薬として許容される補形剤を含んで成る。ある態様において、本発明の組成物は、抗原を含まないIMP/MC複合体、すなわち抗原と結合(直接的又は間接的のいずれか)していないIMP/MC複合体を含んで成る。
【0015】
別の観点において、本発明は個体の免疫応答を調節する方法であって、個体に対し、前記個体において免疫応答を調節するのに十分な量のIMP/MC複合体を投与することを含んで成る方法、に関する。本発明の方法に従う免疫調節は、Th2型の免疫応答に関連する疾患(例えば、アレルギー又はアレルギー誘導型の喘息)に苦しむ者を含む個体、ワクチン、例えば治療用ワクチン(例えばアレルギーのエピトープ、放線菌のエピトープ、又は腫瘍関連型のエピトープ)又は予防用ワクチンを受けている個体、ガンを有する個体、感染病を有する個体及び感染因子に曝露される恐れのある個体に対して実施され得る。
【0016】
更なる観点において、本発明は、個体におけるインターフェロンガンマ(IFN−γ)を増大する方法であって、当該個体に対し有効量のIMP/MC複合体を投与することを含んで成る方法、に関する。本発明に従うIMP/MC複合体の投与は、個体のIFN−γを増大する。これらの方法に適した対象者は、特発性肺線維症(IPF)、強皮症、皮膚性放射線誘導型線維症、肝線維症、例えば住血吸虫症誘導型肝線維症、腎線維症並びにIFN−γの投与によって改善され得る他の症状を有する個体を含む。
【0017】
別の観点において、本発明は個体におけるIFN−αを増大する方法であって、有効量のIMP/MC複合体を個体に投与することを含んで成る方法、に関する。本発明に従うIMP/MC複合体の投与は、個体のIFN−αレベルを増大する。これらの方法に適した対象者は、IFN−αの投与に応答する疾患、例えばウイルスの感染症及びガン、を有する個体を含む。
【0018】
別の観点において、本発明は、感染病の1又は複数の症状を緩和する方法であって、感染病を有する個体に対し、有効量のIMP/MC複合体を投与することを含んで成る方法、に関する。本発明に従うIMP/MC複合体の投与は、感染病の1又は複数の症状を緩和する。本発明に従い処置されうる感染病は、細胞内病原によって生じる感染病(例えば放線菌性疾患、マラリア、リーシュマニア症、トキソプラズマ症、住血吸虫症又は肝吸虫症)を含み、そしてウイルス病を含んでもよく、又は排除してもよい。
【0019】
本発明は更に、本発明の方法を実施するためのキットに関する。本発明のキットは、個体の免疫調節における、例えば当該個体がTh2型の免疫応答に関連する疾患(例えば、アレルギー又はアレルギー誘導型の喘息)に苦しみ、ワクチン、例えば治療用ワクチン(例えばアレルギーエピトープ、放線菌のエピトープ、又は腫瘍関連型エピトープ)又は予防用ワクチンを受け、ガンに苦しみ、感染病に苦しみ、又は感染因子に曝露される恐れがある場合の、IMP/MC複合体の使用ためのIMP/MC複合体の説明書を含んで成る容器を含んで成る。
【0020】
本発明の実施形態
我々は、個体、特にヒトにおける免疫応答を調節するための新規組成物及び方法を発見した。本発明の組成物は、非生物分解性マイクロキャリア(MC)と複合した免疫調節ポリヌクレオチド(IMP)を含んで成る。我々は、ナノメーター規模のマイクロキャリア(50〜200nmの直径のビーズ)と組み合わせた免疫調節ポリヌクレオチドが、ヒトの細胞を含む免疫細胞を効率的に調節することを発見した。小さいマイクロキャリア(約1〜4.5μm、2.0μm又は約1.5μm未満の直径)と組み合わせたIMPも、ヒト細胞を免疫調節した。我々の発見が特に注目されるべきものであるのは、ヒト細胞が、当業界で公知の様に、一般的に使用される研究動物、例えばマウス由来の細胞より、IMPによる免疫調節に耐性があると思われるためである。
【0021】
IMP/MC複合体は、抗原を含んでいても、又は排除していてもよい。いくつかの態様において、本発明は、抗原を含まないIMP/MC複合体、すなわち抗原と結合(直接的又は間接的のいずれか)していないIMP/MC複合体を含んで成る組成物を提供する。他の態様において、本発明は、1又は複数の抗原と混合したIMP/MC複合体を含んで成る組成物を提供する。他の態様において、本発明は、抗原と結合したIMP/MC複合体を含んで成る組成物を提供する。
【0022】
我々は更に、非生物分解性ナノキャリア粒子を含んで成る共有結合型のIMP/MC複合体が高度に活性な免疫調節物質であることを発見した。従来技術は、非生物分解性の微粒子及びナノ粒子と強固に結合した免疫刺激オリゴヌクレオチドが有効でないことを示唆している(Manzel et al., 上記)。当業界におけるこの理解を考慮して、我々は、我々の結果が当業者にとって驚くべきものであり、そして予期されないものであると考える。
【0023】
本発明の免疫調節ポリヌクレオチド/マイクロキャリア(IMP/MC)複合体は、共有結合していても、又は非共有結合していてもよく、そして水不溶性のマイクロキャリア(例えば、約10μm未満のサイズのキャリア)を含んで成る。マイクロキャリアは固相(例えば、ポリスチレンビーズ)であっても、又は液相(例えばリポソーム、ミセル、又は油−水の乳濁液中の油滴)であってもよい。IMPは、MCと結合させ、又はそれを強化するように修飾されることがある(例えば、共有結合的な架橋のための遊離スルフヒドリルの組込又は疎水性部分の挿入、例えば、疎水性結合の場合、コレステロール)。
【0024】
本発明は、共有結合型のIMP/MC複合体を形成するために非生物分解性のマイクロキャリアと共有結合したIMPを含んで成る新規組成物を提供する。IMPとMCの間の結合は直接的であってもよく(例えば、IMP及びMC上のスルフヒドリル間のジスルフィド結合を介する)、あるいは構成成分が、IMPとMCに対する結合を分離する、1又は複数の分子の架橋部分によって結合されることもある。
【0025】
更に提供されるものとして、非共有結合型のIMP/MC複合体を提供するために、マイクロキャリアと非共有結合したIMPを含んで成る組成物がある。非共有結合型のIMP/MC複合体は、通常、マイクロキャリアと結合せしめるように修飾されているIMPを含んで成る(例えば、油又は脂質を基にしたマイクロキャリアと疎水性結合をさせるための、コレステロール部分の挿入による)。
【0026】
本発明はまた、個体に対しIMP/MC複合体を投与することによって、個体における免疫応答を調節する方法を提供する。
【0027】
更に提供されるものとして、本発明の方法を実施するためのキットがある。当該キットは、対象者における免疫調節のためのIMP/MC複合体の投与のための説明書及びIMP/MC複合体を含んで成る包装又は容器を含んで成る。
【0028】
一般的技術
本発明の実施は、特に断らない限り、当業者の技術の範囲内にある、分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の常用の技術を用いる。その様な技術は、文献、例えば
【表3】
において完全に説明されている。
【0029】
定義
本明細書で使用する場合、単数形(「a」、「an」、「the」)は特に断らない限り、複数の言及を含む。例えば(「an」)ISSは1又は複数のISSを含む。
【0030】
本明細書で交換可能に使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖DNA(ssDNA)、二本鎖DNA(dsDNA)、一本鎖RNA(ssRNA)及び二本鎖RNA(dsRNA)、修飾されたオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオシド、又はこれらの組み合わせを含む。オリゴヌクレオチドは、直鎖状又は環状の構造であってもよく、又はオリゴヌクレオチドは、直鎖状及び環状のセグメントの両方を含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドは、一般に、ホスホジエステル結合を介して連結したヌクレオシドのポリマーであるが、別の結合、例えばホスホロチオエートエステルもオリゴヌクレオチドにおいて使用され得る。ヌクレオシドは、糖に結合したプリン(アデニンもしくはグアニン又はそれらの誘導体)又はピリミジン(チミン、シトシン、もしくはウラシル、又はそれらの誘導体)塩基からなる。DNAにおける4つのヌクレオシド単位(又は塩基)は、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、及びデオキシシチジンと称される。ヌクレオチドは、ヌクレオシドのリン酸エステルである。
【0031】
用語「ISS」は、本明細書で使用する場合、in vitro、in vivo及び/又はex vivoで測定される場合に測定可能な免疫応答をもたらすオリゴヌクレオチド配列を言及する。測定可能な免疫応答の例は、限定しないが、抗原特異的抗体産生、サイトカインの分泌、リンパ球群、例えば、NK細胞、CD4+Tリンパ球、CD8+Tリンパ球、Bリンパ球等の活性化又は増殖を含む。好ましくは、ISS配列は、Th1型応答を優先的に活性化する。本発明における使用のためのポリヌクレオチドは、少なくとも1つのISSを含む。本明細書で使用する場合、「ISS」は、ISS含有ポリヌクレオチドのための省略された用語でもある。
【0032】
用語「免疫調節ポリヌクレオチド」又は「IMP」は、本明細書で使用する場合、少なくとも1つのISSを含んで成るポリヌクレオチドを言及する。ある態様において、IMPはISSである。
【0033】
用語「非生物分解性」は、本明細書で使用する場合、正常な哺乳類の生理学的条件下で分解されない、又は浸蝕されないマイクロキャリアを言及する。一般的に、マイクロキャリアは、それが正常なヒトの血清中での37℃での72時間のインキュベーション後に分解されない(すなわち、その体積及び/又は平均のポリマーの長さの5%も失われない)場合、非生物分解性であるとみなされる。
【0034】
用語「マイクロキャリア」は、水不溶性であり、且つ約100μm未満、好ましくは約50〜60μm未満、好ましくは約10μm未満、好ましくは約5,2.5、2又は1.5μm未満、のサイズを有する、粒子組成物を言及する。マイクロキャリアは、約1μm未満、好ましくは約500nm未満のサイズを有するマイクロキャリアである、「ナノキャリア」を含む。マイクロキャリアは、固相の粒子、例えば生物学的適合性のある天然のポリマー、合成ポリマー又は合成コポリマーから形成される粒子を含むが、アガロース又は架橋されたアガロースから形成されたマイクロキャリアは、本明細書のマイクロキャリアの定義を含んでいても、又はそれから除外されていてもよい。固相のマイクロキャリアは、哺乳類の生理学的条件下で非浸蝕性及び/又は非分解性のポリマー又は他の材料、例えばポリスチレン、ポリプロピレン、シリカ、セラミック、ポリアクリルアミド、金、ラテックス、ハイドロキシアパタイト、デキストラン、並びに強磁性及び常磁性材料、から形成される。マイクロキャリアは更に、リポソーム、抗原を含まないiscom(免疫刺激複合体。コレステロール、及びリン脂質、アジュバント活性サポニンの安定な複合体である)、あるいは水中油又は油の乳濁液における水中油に見られる小滴又はミセルの様な、油又は脂質を基にしたものであってもよい。マイクロキャリアは典型的に球状の形であるが、球状から逸脱しているマイクロキャリアも許容される(例えば、長円形、竿状、等)。それらの不溶性の性質(水に関する)に起因して、マイクロキャリアは、水及び水を基にした(水性の)溶液から濾過することができる。
【0035】
マイクロキャリアの「サイズ」は、一般的に製造業者によって述べられている、粒子の「設計サイズ」又は意図されるサイズである。サイズは、直接的に測定される寸法、例えば平均又は最大直径であってもよく、又は間接的なアッセイ、例えば濾過スクリーニングアッセイによって決定されてもよい。マイクロキャリアのサイズの直接的な測定は、典型的に、顕微鏡、通常光学顕微鏡又は走査型電子顕微鏡(SEM)によって、既知のサイズの粒子と比較して、又はマイクロメータを参照することによって実施される。サイズの軽微な変化が、製造工程の間に生じる場合、測定値が、マイクロキャリアが規定の測定値の±約5〜10%であることを示すならば、マイクロキャリアは規定のサイズであるとみなされる。サイズの特徴は、動的光散乱によって決定されうる。あるいは、マイクロキャリアのサイズは、濾過スクリーニングアッセイによって決定によって決定されうる。マイクロキャリアは、少なくとも97%の粒子が、規定のサイズの「スクリーン形」フィルター(すなわち、保持された粒子がフィルターの表面上にあるフィルター、例えばポリカーボネート又はポリエーテルスルホンフィルターであり、これに対し、「デプスフィルター」は、保持された粒子がフィルター内に引っかかる)を通過する場合に規定のサイズ未満である。マイクロキャリアは、少なくとも約97%のマイクロキャリアが、規定のサイズのスクリーン形フィルターによって保持される場合、規定のサイズより大きい。従って、約10μm〜約10nmのマイクロキャリアの、少なくとも約97%が、10μmの孔のスクリーンフィルターを通過し、そして10nmのスクリーンフィルターによって保持される。
【0036】
上述の議論が示唆するように、マイクロキャリアのためのサイズ又はサイズ範囲に対する言及は、規定のサイズ及び/又はサイズ範囲のおおよその変動及び概算を暗に含む。これは、サイズ及び/又はサイズ範囲を言及する場合の、用語「約」の使用によって反映され、そして、「約」について言及していない、サイズ又はサイズ範囲の言及は、サイズ及び/又はサイズ範囲が正確であることを意味しない。
【0037】
用語「免疫調節ポリヌクレオチド/マイクロキャリア複合体」又は「IMP/MC複合体」は、本発明のISS含有ポリヌクレオチドとマイクロキャリアとの複合体を言及する。当該複合体の成分は、共有結合していても、又は非共有結合していてもよい。非共有結合は、任意な非共有結合力によって、例えば疎水性相互作用、イオン(静電的)結合、水素結合及び/又はファンデルワールス引力によって媒介されうる。疎水性結合の場合、当該結合は、一般的にIMPと共有結合した疎水性部分(例えば、コレステロール)を介する。
【0038】
用語「免疫調節」又は「免疫応答の調節」は、本明細書で使用する場合、免疫刺激及び免疫抑制効果を含む。免疫調節は、主に、全体的な免疫応答における定性的な変化であるが、定量的な変化は、免疫調節と一緒に生じてもよい。本発明に従い免疫調節される免疫応答は、「Th2型」免疫応答ではなく、「Th1型」の免疫応答へと推移するものである。Th1型の応答は、典型的に細胞性免疫系(例えば、細胞傷害性リンパ球)の応答であると考えられるが、Th2型の応答は、通常「体液性」であるか、又は抗体を基にしている。Th1型の免疫応答は通常、抗原に対する「遅延型過敏症」によって特徴づけられ、そしてTh1関連サイトカイン、例えば、IFN−γ、IL−2、IL−12、及びTNF−β、並びにIFN−α及びIL−6のレベルの増大によって、生化学的なレベルで検出されうるが、IL−6はTh2型免疫応答にも関連していることがある。Th1型免疫応答は、通常細胞傷害性リンパ球(CTL)の産生及び低レベル又は一過性の抗体の産生と関連している。Th2型免疫応答は、通常高レベルの抗体産生、例えばIgEの産生、全く産生されない又は最低限産生されるCTL、並びにTh2関連型サイトカイン、例えばIL−4の発現、と関連している。従って、本発明に従う免疫調節は、例えば、本発明の方法に従い処置された個体における、未処置のものと比較した場合のIFN−γの増大及び/又はIgEの産生の低下によって認識されうる。
【0039】
用語「接合体」は、ISS含有ポリヌクレオチドと抗原とが結合した複合体を言及する。その様な接合体の結合は、共有結合及び/又は非共有結合を含む。
【0040】
用語「抗原」は、抗体又はT細胞抗原受容体によって特異的に認識及び結合される物質を意味する。抗原は、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、多糖類、複合多糖、糖類、ガングリオシド、脂質及びリン脂質;それらの部分、ならびにそれらの組み合わせを含み得る。抗原は、天然に存在するものであってもよく、又は合成物であってもよい。ISSとの投与に適した抗原は、B細胞又はT細胞の抗原特異的応答を誘発し得る任意な分子を含む。好ましくは、抗原は、当該抗原に特異的な抗体応答を誘発する。ハプテンは、「抗原」の範囲内に含まれる。ハプテンは、それ自体は免疫原性ではないが、抗原決定基を含む免疫原性分子と接合した場合に免疫原性となる低分子量化合物である。小分子は、抗原性になるためにハプテン化される必要があり得る。好ましくは、本発明の抗原は、ペプチド、脂質(例えば、ステロール、脂肪酸、及びリン脂質)、多糖、例えばヘモフィルスインフルエンザワクチンにおいて使用されるようなもの、ガングリオシド及び糖タンパク質を含む。
【0041】
「アジュバント」は、免疫原性物質、例えば抗原に添加した場合に、混合物に曝露した際にレシピエントの宿主中の当該物質に対する免疫応答を非特異的に増し又は増強する物質を言及する。
【0042】
用語「ペプチド」は、当該ペプチドがハプテンであろうとなかろうと、生物学的応答、例えば、抗体産生又はサイトカイン活性をもたらすのに十分な長さ及び組成のポリペプチドである。典型的には、ペプチドは、少なくとも6アミノ酸残基の長さである。用語「ペプチド」は、修飾されたアミノ酸(天然又は非天然のいずれか)を更に含み、その様な修飾は、限定しないが、リン酸化、グリコシル化、ペグ化、脂質化及びメチル化を含む。
【0043】
「抗原性ペプチド」は、精製された天然のペプチド、合成ペプチド、組換えタンパク質、粗製タンパク質抽出物、弱毒化若しくは不活化ウイルス、細胞、微生物、又はその様なペプチドのフラグメントを含みうる。「抗原性ペプチド」又は「抗原ポリペプチド」は、従って、1又は複数の抗原性の特性を示すポリペプチドの全部又は一部を意味する。この様に、例えば「Amb a 1抗原性ポリペプチド」又は「Amb a 1ポリペプチド抗原」は、Amb a 1由来のアミノ酸配列であり、これは抗原性特性を示す(すなわち、抗体又はT細胞受容体と特異的に結合する)、全長配列、当該配列の一部、及び/又は当該配列の修飾物のいずれかである。
【0044】
「送達分子」又は「送達担体」は、特定の部位に対し、そして/あるいは特定の時期に関して、IMP/MC複合体の送達を容易にし、可能にし、そして/あるいは増強する化学的部分である。送達担体は、付加的に免疫応答を刺激することもあり、又は刺激しないこともある。
【0045】
「抗原に対するアレルギー応答」は、好酸球及び/又は抗原特異的IgEの発生並びにそららの結果による効果によって一般的に特徴づけられる免疫応答を意味する。当業界で周知な様に、IgEは肥満細胞及び好塩基球上のIgE受容体と結合する。IgEによって認識される抗原に対する後の曝露によって、当該抗原は肥満細胞及び好塩基球上のIgEを架橋し、これらの細胞の脱顆粒、例えば、限定しないがヒスタミン放出を招く。用語「抗原に対するアレルギー応答」、「アレルギー」、及び「アレルギー症状」は、本発明の方法のいくつかの利用に、等しく適切であると理解され、そして意図される。更に、本発明の方法が、アレルギー応答の予防及びこれまでに存在しているアレルギー症状の処置に等しく適切であるものを含むと理解され、そして意図される。
【0046】
本明細書で使用する場合、用語「アレルゲン」は、対象者に対する曝露によってアレルギー応答を誘発する、抗原又は分子の抗原性部分、通常タンパク質を意味する。典型的に、当該対象者は、例えば、発赤及び膨疹試験又は当業界で公知の任意な方法によって示されるような、アレルゲンに対するアレルギーである。分子は、対象者のごくわずかなサブセットでも、当該分子に対する曝露によってアレルギー性(例えば、IgE)の免疫応答を示している場合にアレルゲンであると称される。多くの単離されたアレルゲンが当業界で知られている。これらは、限定しないが、本明細書の表1に提示されているものを含む。
【0047】
用語「脱感作」は、対象者が感受性を示したアレルゲンの量を増大する投与方法を言及する。脱感作に使用されるアレルゲンの量の例は、当業界で知られており、例えばFornadley(1998)Otolaryngol. Clin. North Am. 31:111−127を参照のこと。
【0048】
「抗原特異的免疫治療」は、抗原に関与し、そして免疫応答の抗原特異的調節を発生させる免疫治療の任意な形態を言及する。アレルゲンの状況において、抗原特異的免疫治療は、限定しないが、脱感作治療を含む。
【0049】
「個体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳類、更に好ましくはヒトである。哺乳類は、限定しないが、ヒト、霊長類、家畜、猟の動物、齧歯類及びペットを含む。脊椎動物はまた、限定しないが、鳥類(すなわち、鳥類の個体)及び爬虫類(すなわち、爬虫類の個体)を含む。
【0050】
物質の「有効量」又は「十分量」は、有益な又は所望の結果、例えば臨床的な結果をもたらすのに十分な量であり、そしてその結果、「有効量」は、適用される状況に依存する。抗原に対する免疫応答を調節する組成物の投与の状況において、IMP/MC複合体の有効量は、抗原が単独で投与される場合に得られる免疫応答と比較されるような調節を達成するのに十分な量である。有効量は、1又は複数の投与で投与されうる。
【0051】
用語「同時投与」は、本明細書で使用する場合、免疫応答を調節するために、十分に近い時間で少なくとも2つの異なる物質を投与することを言及する。好ましくは、同時投与は、少なくとも2つの異なる物質の同時の投与を言及する。
【0052】
免疫応答、例えばTh1応答の「刺激」は、応答の誘発及び/又は増強に起因しうる応答の増大を意味する。
【0053】
「IgE関連疾患」は、部分的に、持続性であっても、又はそうでなくてもよい上昇したIgEレベルを特徴とする生理学的症状である。IgE関連疾患は、限定しないが、アレルギー及びアレルギー性反応、アレルギー関連疾患(後述)、喘息、鼻炎、結膜炎、蕁麻疹、ショック、膜翅目の咬傷アレルギー、及び薬物アレルギー、及び寄生虫感染、を含む。当該用語はまた、これらの疾患の関連症状を含む。一般的に、その様な疾患において、IgEは抗原特異的である。
【0054】
「アレルギー関連疾患」は、抗原特異的IgE免疫応答の効果から生じる疾患を意味する。その様な効果は、限定しないが、低血圧及びショックを含むことがある。アナフィラキシーは、循環に放出されたヒスタミンが、血管拡張並びに血管の透過性の増大をもたらし、その結果循環からの血漿の著しい損失を招く間の、アレルギー関連疾患の一例である。アナフィラキシーは、身体全体を通じて経験する関連性の効果を伴い、全身的に発生することがあり、そして特異的な標的組織又は器官に限定された反応を伴い、局所的に発生することもある。
【0055】
用語「ウイルス病」は、本明細書で使用する場合、ウイルスを、その病因学的物質として有する病気を言及する。ウイルス病の例は、B型肝炎、C型肝炎、インフルエンザ、後天性免疫不全症候群(AIDS)、及び帯状疱疹を含む。
【0056】
本明細書で使用され、そして当業界で周知な様に、「処置」は有益又は所望な結果、例えば臨床上の結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のために、有益又は所望な臨床上の結果は、限定しないが、1又は複数の症候の軽減又は回復、病気の範囲の縮小、病気の安定化した(すなわち、悪化しない)状態、病気の拡大の予防、病気の進行の遅延又は減速、病状の回復又は緩和、及び寛解(部分的又は全体的のいずれか)を含み、これらは検出可能又は検出不可能なもののいずれかである。「処置」は、処置を受けてなくても予期される生存と比較した場合に、生存を延長することを意味する。
【0057】
病気又は疾患の「緩和」は、未処置の病気と比較して、疾患又は病気の状態の範囲及び/又は不所望な臨床上の症状が弱められ、そして/あるいは進行の時間経過が遅延され又は延長されることを意味する。特にアレルギーの状況において、当業者に十分に理解されているように、緩和は、アレルゲンに対する免疫応答の調節によって生じうる。更に、緩和は、必ずしも一回の量の投与で生じる必要はないが、しばしば一連の投与によって生じる。従って、応答又は疾患を緩和するのに十分な量が、1又は複数の投与で投与され得る。
【0058】
IMP/MC複合体によって「誘発」される「抗体力価」、又は「抗体の量」は、IMP/MC複合体の投与後の時点で測定される所定の抗体の量を言及する。
【0059】
「Th1関連抗体」は、産生及び/又は増大がTh1免疫応答と関連している抗体である。例えばIgG2aはマウスのTh1関連抗体である。本発明の目的のために、Th1関連抗体の測定は、1又は複数のその様な抗体の測定であってもよい。例えば、ヒトにおける、Th1関連抗体の測定は、IgG1及び/又はIgG3の測定を伴うことがある。
【0060】
「Th2関連抗体」は、産生及び/又は増大がTh2免疫応答と関連している抗体である。例えばIgG1はマウスのTh2関連抗体である。本発明の目的のために、Th2関連抗体の測定は、1又は複数のその様な抗体の測定であってもよい。例えば、ヒトにおける、Th2関連抗体の測定は、IgG2及び/又はIgG4の測定を伴うことがある。
【0061】
機能又は活性、例えばサイトカイン産生、抗体産生、又はヒスタミン放出を「抑制」又は「阻害」することは、注目の条件又は要素を除いて他の点で同一の条件と比較した場合に、あるいは別の条件と比較した場合に、当該機能又は活性を低下することである。例えば、ヒスタミンの放出を抑制する抗原と一緒に投与される、又はそれを含むIMP/MC複合体は、例えば、抗原のみによって誘導されるヒスタミン放出と比較して、ヒスタミン放出を減少させた。
【0062】
本明細書で使用する場合、用語「含んで成る」及びその同族語は、それらの包括的な意味において使用され;すなわち、用語「含む」及びその相当する同族語と等しい。
【0063】
本発明の組成物
本発明は、個体における免疫応答を調節するための新規組成物を提供する。当該新規組成物は、非生物分解性マイクロキャリアと複合したISS含有ポリヌクレオチドを含んで成る免疫調節ポリヌクレオチド/マイクロキャリア(IMP/MC)複合体である。IMP/MC複合体は、当該複合体のIMP部分が、MCに対して直接的に又はリンカーを介して(すなわち、間接的に)共有結合している共有結合複合体であってもよく、又はそれらは非共有結合複合体であってもよい。
【0064】
免疫調節ポリヌクレオチド
本発明に従い、免疫調節ポリヌクレオチドは少なくとも1つのISSを含み、そして複数のISSを含んでいてもよい。ISSはポリヌクレオチド内で隣接していてもよく、又はそれらはポリヌクレオチド内の追加のヌクレオチド塩基によって分離されることもある。従って、IMPは、本明細書に記載の1又は複数の組み合わせ、例えば修飾されたものを含むことがある。ある態様において、IMPはISSから成る。
【0065】
ISSは、当業界で説明されており、そして免疫応答、例えばサイトカイン分泌、抗体産生、NK細胞活性化及びT細胞増殖の、様々な観点を示す標準的アッセイを用いて容易に同定され得る。例えば、
【表4】
を参照のこと。
【0066】
ISSは、6塩基又は塩基対以上の任意の長さのものであってもよく、そして通常配列5’−シトシン、グアニン−3’を含んで成り、好ましくは15塩基又は塩基対以上、より好ましくは20塩基又は塩基対以上の長さであってもよい。当業界で周知な様に、5’−シトシン、グアニン−3’配列のシトシンは、メチル化されていない。ISSはまた、配列5’−プリン、プリン、C、G、ピリミジン、ピリミジン、C、G−3’を含んで成ることがある。ISSはまた、配列5’−プリン、プリン、C、G、ピリミジン、ピリミジン、C、C−3’を含んで成ることがある。以下のポリヌクレオチド配列で示すように、ISSは、配列5’−T、C、G−3’を含んで成ることもある(すなわち1又は複数のものを含む)。いくつかの態様において、ISSは配列5’−C、G、ピリミジン、ピリミジン、C、G−3’(例えば、5’−CGTTCG−3’)を含んで成ることがある。いくつかの態様において、ISSは配列5’−C、G、ピリミジン、ピリミジン、C、G、プリン、プリン−3’を含んで成ることがある。いくつかの態様において、ISSは配列5’−プリン、プリン、C、G、ピリミジン、ピリミジン−3(例えば5’−AACGTT−3’)を含んで成ることがある。
【0067】
いくつかの態様において、ISSは配列5’−プリン、T、C、G、ピリミジン、ピリミジン−3’を含んで成ることがある。
【0068】
いくつかの態様において、ISSは以下の配列:
【表5】
のいずれかを含んで成ることがある。
【0069】
いくつかの態様において、ISSは以下の配列:
【表6】
のいずれかを含んで成ることがある。
【0070】
いくつかの態様において、ISSは以下の配列:
【表7】
(ここで、Bは5−ブロモシトシンである)のいずれかを含んで成ることがある。
【0071】
いくつかの態様において、ISSは以下の配列:
【表8】
(ここで、Bは5−ブロモシトシンである)のいずれかを含んで成ることがある。
【0072】
いくつかの態様において、免疫調節ポリヌクレオチドは、配列5’−TGACTGAACGTTCGAGATGA−3’(配列番号1)を含んで成る。他の態様において、ISSは配列:
【表9】
のいずれかを含んで成る。
【0073】
ISS及び/又はIMPは修飾を含んでいてもよい。ISSの修飾は、限定しないが、当業界で知られている任意な、3’OH又は5’OH基の修飾、ヌクレオチド塩基の修飾、糖成分の修飾、及びリン酸基の修飾を含む。様々なその様な修飾は後述する。
【0074】
ISS及び/又はIMPは一本鎖又は二本鎖DNA、及び一本鎖又は二本鎖RNA、あるいは他の修飾されたポリヌクレオチドであってもよい。ISSは、上述のモチーフ内に存在することがあり、又は当該モチーフを超えて広がることもある、1又は複数のパリンドローム領域を含んでいても、又は含んでいなくてもよい。ISSは、いくつかは本明細書に記載した、追加の隣接配列を含んで成ることがある。ISSは、天然の、又は修飾された、非天然の塩基を含むことがあり、そして修飾された糖、リン酸、及び/又は末端を含むことがある。例えば、リン酸の修飾は、限定しないが、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホラミデート(架橋有り又は架橋無し)、ホスホトリエステル、ホスホロジチオエートを含み、そして任意な組み合わせで使用され得る。他の非リン酸結合も使用され得る。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を含んで成る。当業界で知られている糖の修飾、例えば2’−アルコキシ−RNA類似体、2’−アミノ−RNA類似体及び2’−アルコキシ−又はアミノ−RNA/DNAキメラ及び本明細書に記載の他のものも、生成され、そして任意なリン酸の修飾と一緒に組み合わされうる。塩基の修飾の例は、限定しないが、ISSのC−5及び/又はC−6(例えば、5−ブロモシトシン、5−クロロシトシン、5−フルオロシトシン、5−ヨードシトシン)への電子吸引性部分の挿入を含む。例えば、国際特許出願番号WO99/62923を参照のこと。
【0075】
ISS及び/又はIMPは、限定しないが、酵素的方法、化学的方法、、及びより大きなオリゴヌクレオチド配列の分解、を含む、当業界で周知な技術及び核酸合成装置を用いて合成され得る。例えばAusubel et al. (1987);及びSambrook et al. (1989)を参照のこと。酵素的に構築された場合、個々の単位は、例えばリガーゼ、例えばT4 DNA又はRNAリガーゼを用いてライゲーションされ得る。米国特許第5,124,246号。オリゴヌクレオチドの分解は、米国特許第4,650,675号に例示されているように、ヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの曝露を介して達成され得る。
【0076】
ISS及び/又はIMPはまた、常用のポリヌクレオチド単離手段を用いて単離され得る。その様な手順は、限定しないが、剪断されたヌクレオチド配列を検出するためのゲノム又はcDNAライブラリーに対するプローブのハイブリダイゼーション、剪断された構造的特徴を検出するための発現ライブラリーの抗体スクリーニング及びポリメラーゼ連鎖反応による特定の天然配列の合成、を含む。
【0077】
環状IMPは単離され、組換え法を介して合成され、又は化学的に合成され得る。環状IMPが単離を介して、又は組換え法を介して得られる場合、IMPは、好ましくはプラスミドである。より小さな環状オリゴヌクレオチドの化学合成は、文献に記載される任意の方法を用いて実施され得る。例えば、Gao et al. (1995) Nucleic Acids Res.23:2025−2029;及びWang et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:2326−2333を参照のこと。
【0078】
オリゴヌクレオチド及び修飾されたオリゴヌクレオチドを生成するための技術は当業界で知られている。ホスホジエステル結合を含む、天然DNA又はRNAは、3’末端で固体支持体に付着した伸長しているオリゴヌクレオチドの5’−ヒドロキシ基に対する、適切なヌクレオシドホスホラミダイトの連続的なカップリング、それに続くリン酸トリエステルへの中間亜リン酸トリエステルの酸化によって通常合成される。一旦所望なオリゴヌクレオチド配列が合成されると、当該オリゴヌクレオチドは支持体から除去され、リン酸トリエステル基はリン酸ジエステルへと脱保護され、そしてヌクレオシド塩基は水性アンモニア又は他の塩基を用いて脱保護される。例えば、Beaucage (1993) ”Oligodeoxyribonuclotide Synthesis” in Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties (Agrawal, ed.) Humana Press, Totowa, NJ; Warner et al. (1984) DNA 3:401及び米国特許第4,458,066号を参照のこと。
【0079】
ISS及び/又はIMPはまた、リン酸修飾型オリゴヌクレオチドを含むことがある。修飾されたリン酸結合又は非リン酸結合を含むポリヌクレオチドの合成も当業界で知られている。総説のために、Matteucci (1997) ”Oligonucleotide Analogs: an Overview” in Oligonucleotides as Therapeutic Agents, (D. J. chadwick and G. Cardew, ed.) John Wiley and Sons, New York, NYを参照のこと。本発明のオリゴヌクレオチドにおいて糖又は糖類似体部分に結合し得る亜リン酸誘導体(又は修飾されたリン酸基)は、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等であってもよい。上記のリン酸類似体の調製、ならびにヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド、及びヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドへのそれらの組み込みも、本質的に公知であり、ここで詳細に記載する必要はない。Peyrottes et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24:1841−1848;Chaturvedi et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24:2318−2323;及びSchultz et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24:2966−2973。例えば、ホスホロチオエートリゴヌクレオチドの合成は、酸化段階が硫化段階で置換されることを除き、天然のオリゴヌクレオチドのために上述したものと類似である(Zon(1993) ”Oligodeoxynucloside Phosophorothioates” in Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties (Agrawal, ed.) Humana Press, pp. 165−190)。同様に、他のリン酸類似体、例えばホスホトリエステル(Miller et al. (1971) JACS 93:6657−6665)、非架橋性ホスホラミデート(Jager et al. (1988) Biochem.27:7247−7246)、N3’−P5’ホスホラミデート(Nelson et al. (1997) JOC 62:7278−7287)及びホスホロジチオエート(米国特許第5,453,496号)の合成も記載されている。他の亜リン酸を基にしていない、修飾されたオリゴヌクレオチドも使用され得る(Stirchak et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:6129−6141)。ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル骨格を有するオリゴヌクレオチドよりも免疫原性であることがあり、そして宿主へのインジェクション後の分解に対しさらに耐性があるようである。Braun et al. (1988) J.Immunol. 14:2084−2089;及びLatimer et al. (1995) Mol. Immunol. 32:1057−1064。
【0080】
本発明で使用されるISS含有ポリヌクレオチド及び/又はIMPは、リボヌクレオチド(唯一の又は主な糖成分としてリボースを含む)、デオキシリボヌクレオチド(主な糖成分としてデオキシリボースを含む)を含んで成ることがあり、又は当業界で知られているように、修飾された糖又は糖類似体がISS中に組み込まれることもある。従って、リボース及びデオキシリボースに加えて、糖部分は、ペントース、デオキシペントース、ヘキソース、デオキシヘキソース、グルコース、アラビノース、キシロース、リキソース、及び糖「類似体」シクロペンチル基であってもよい。糖は、ピラノシル型又はフラノシル型であり得る。ISSにおいて、糖部分は、好ましくは、リボース、デオキシリボース、アラビノース、又は2’−O−アルキルリボースのフラノシドであり、そして糖は、それぞれのヘテロ環状塩基に対し、α又はβアノマー配置のいずれかで結合され得る。糖の修飾は、限定しないが、2’−アルコキシ−RNA類似体、2’−アミノ−RNA類似体及び2’−アルコキシ−又はアミノ−RNA/DNAキメラを含む。これらの糖又は糖類似体及びそれぞれの「ヌクレオシド」(ここでこのような糖又は類似体は、ヘテロ環状塩基(核酸塩基)に結合している)の調製は、本質的に知られており、そしてその様な調製が任意の具体例に関与し得る程度以外にはここで記載する必要はない。ISS及び/又はIMPの調製において、糖の修飾が行われることもあり、そして任意なリン酸塩の修飾と組み合わされることもある。
【0081】
ISS及び/又はIMP中に組み込まれるヘテロ環状塩基、又は核酸塩基は、天然の主なプリン及びピリミジン塩基(すなわち、上述したようなウラシル又はチミン、シトシン、アデニン、及びグアニン)、並びに前記の主な塩基の天然及び合成の修飾物であってもよい。
【0082】
当業者は、種々のヘテロ環状塩基及び種々の糖部分(及び糖類似体)を含んで成る多数の「合成」非天然ヌクレオシドが当業界で利用可能であること、そして本発明の他の基準が満たされる限り、ISSが、天然の核酸の主な5つの塩基成分以外の1又は数個のヘテロ環状塩基を含み得ることを認識する。しかし、好ましくは、ISS中のヘテロ環状塩基は、限定しないがウラシル−5−イル、シトシン−5−イル、アデニン−7−イル、アデニン−8−イル、グアニン−7−イル、グアニン−8−イル、4−アミノピロロ[2,3−d]ピリミジン−5−イル、2−アミノ−4−オキソピロロ[2,3−d]ピリミジン−5−イル、2−アミノ−4−オキソピロロ[2,3−d]ピリミジン−3−イル基を含み、ここで、プリンは9位を介して、ピリミジンは1位を介して、ピロロピリミジンは7位を介して、そしてピラゾロピリミジンは1位を介して、ISSの糖部分に結合する。
【0083】
ISS及び/又はIMPは、例えば、公有されている国際特許出願WO99/62923に記載されているような、少なくとも1つの修飾された塩基を含んでなることがある。本明細書で使用する場合、用語「修飾された塩基」は、「塩基類似体」と同義語であり、例えば「修飾されたシトシン」は、「シトシン類似体」と同義語である。同様に、「修飾された」ヌクレオシド又はヌクレオチドは、本明細書では、ヌクレオシド又はヌクレオチド「類似体」と同義語であると定義される。塩基の修飾の例は、限定しないが、ISSのシトシンのC−5及び/又はC−6への、電子吸引性部分の挿入を含む。好ましくは、電子吸引性部分は、ハロゲンである。そのような修飾されたシトンンは、限定しないが、アザシトシン、5−ブロモシトシン、ブロモウラシル、5−クロロシトシン、塩素化シトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、5−フルオロシトシン、フルオロピリミジン、フルオロウラシル、5,6−ジヒドロシトシン、5−ヨードシトシン、ヒドロキシウレア、ヨードウラシル、5−ニトロシトシン、ウラシル、及び任意の他のピリミジン類似体又は修飾されたピリミジンを含むことがある。
【0084】
塩基を修飾したヌクレオシドの調製、及び前駆体として前記の塩基を修飾したヌクレオシドを用いる修飾されたオリゴヌクレオチドの合成は、例えば米国特許第4,910,300号、第4,948,882号、及び第5,093,232号に記載されている。これらの塩基を修飾したヌクレオシドは、それらが、化学合成によってオリゴヌクレオチドの末端又は内部の部位のいずれかに組み込まれ得るように設計されている。オリゴヌクレオチドの末端又は内部の部位のいずれかに存在している、その様な塩基を修飾したヌクレオシドは、ペプチド又は他の抗原の結合のための部位を務めることがある。それらの糖部分で修飾されたヌクレオシドも記載されており(限定しないが、例えば、米国特許第4,849,513号、第5,015,733号、第5,118,800号、第5,118,802号を含む)、そして同様に使用され得る。
【0085】
一部の態様において、IMPは、大体、次の長さ(塩基又は塩基対)のいずれかよりも短い:10,000;5,000;2,500;2,000;1,500;1,250;1,000;750;500;300;250;200;175;150;125;100;75;50;25;10。一部の態様において、IMPは、大体、次の長さ(塩基又は塩基対)のいずれかよりも長い:8;10;15;20;25;30;40;50;60;75;100;125;150;175;200;250;300;350;400;500;750;1,000;2,000;5,000;7,500;10,000;20,000;50,000。あるいは、ISSは、10,000;5,000;2,500;2,000;1,500;1,250;1,000;750;500;300;250;200;175;150;125;100;75;50;25;又は10の上限、及び独立して選択される、8;10;15;20;25;30;40;50;60;75;100;125;150;175;200;250;300;350;400;500;750;1,000;2,000;5,000;7,500の下限を有するサイズ範囲のいずれかであってもよいが、当該下限は、当該上限未満である。
【0086】
マイクロキャリア
本発明において有用なマイクロキャリアは、約100μ未満のサイズ、好ましくは約50〜60μ未満のサイズ、好ましくは約10μ未満のサイズであり、そして純水中で不溶性である。マイクロキャリアは、固相(例えばビーズ)又は液相(例えばリポソーム)であってもよい。固相のマイクロキャリアは典型的に「ビーズ」又は他のほぼ球状の粒子であるが、非球状粒子も本発明に含まれる。本発明で使用されるマイクロキャリアは、非生物分解性である。マイクロキャリアとしての使用について許容される、広範な固相材料は、非生物分解性液相マイクロキャリアを製造するための製剤及び方法のように、当業界で知られている。
【0087】
本発明の組成物又は方法における使用のためのマイクロキャリアは、通常約10μm未満のサイズであり(例えば、約10μm未満の平均直径を有し、又は少なくとも約97%の粒子が10μmのスクリーンフィルターを通過する)、そしてナノキャリア(すなわち、約1μm未満のサイズのキャリア)を含む。好ましくは、マイクロキャリアは、約9、7、5、2、又は1μmあるいは900、800、700、600、500、400、300、250、200、又は100nmの上限、及び独立して選択される約4、2、又は1μmあるいは800、600、500、400、300、250、200、150、100、50、25、又は10nmの下限の範囲内のサイズをもつものが選択されるが、当該下限は当該上限未満である。一部の態様において、マイクロキャリアは約1.0〜1.5μm、約1.0〜2.0μm又は約0.9〜1.6μmのサイズを有する。ある好ましい態様において、マイクロキャリアは、約10nm〜約5μm又は約25nm〜約4.5μm、約1μm、約1.2μm、約1.4μm、約1.5μm、約1.6μm、約1.8μm、約2.0μm、約2.5μm又は約4.5μmのサイズを有する。マイクロキャリアがナノキャリアである場合、好ましい態様は、約25〜約300nm、50〜約200nm,約50nm〜約200nmのナノキャリアを含む。
【0088】
マイクロキャリアの製造に適した広範な非生物分解性材料も公知であり、限定しないが、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ラテックス、金、及び強磁性又は常磁性材料を含む。ある態様は、金、ラテックス、及び/又は磁性ビーズを排除する。ある態様において、マイクロキャリアは、第2材料(例えば、ポリスチレン)に包まれる第1材料(例えば、磁性材料)から製造されることもある。
【0089】
液相マイクロキャリアは、リポソーム、ミセル、油滴及び他の液体又は油を基にした粒子を含む。通常、液相マイクロキャリアは、1又は複数の、非生物分解性の油又は脂質、例えば鉱油を包含する。1つの好ましい液相マイクロキャリアは、水中油乳濁液中の油滴である。1つの好ましい態様において、マイクロキャリアは、水性pHバッファー中での鉱油、トリオレイン酸ソルビタン、TWEEN 80(商標)の乳化によって調製される水中油乳濁液中の油滴である。
【0090】
抗原
抗原を含んで成る、又は抗原を含まないIMP/MC複合体、すなわち抗原と結合していないIMP/MC複合体が調製され得る。任意な抗原が、抗原を含んで成るIMP/MC複合体の調製に使用され得る。
【0091】
いくつかの態様において、抗原はアレルゲンである。組換えアレルゲンの例を表1に示す。多くのアレルゲンの調製が当業界で周知であり、限定しないが、ブタクサ花粉アレルゲン抗原E(Amb al)(Rafnar et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:1229−1236)、主要なチリダニアレルゲンDer pI及びDer PII (Chua et al. (1988)J. Exp. Med. 167:175−182;Chua et al. (1990)Int.Arch.Allergy Appl. Immunol.91:124−129)、シラカバ花粉Bet vl(Breiteneder et al. (1989)EMBO J. 8:1935−1938)、飼いネコアレルゲンFel dl(Rogers et al. (1993)Mol. Immunol. 30:559−568)、及び木の花粉からのタンパク質抗原(Elsayed et al. (1991) Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 204:17−31)の調製を含む。記載したように、木由来の抗原は公知であり、カバ、ネズ及びスギ由来のアレルゲンを含む。in vivoでの投与のための花粉の調製が報告されている。Malley (1989) J. Reprod. Immunol. 16:173−186。表1に示すように、一部の態様において、アレルゲンは、食物アレルゲン、例えばピーナッツアレルゲン、例えばAra h Iであり、そして、一部の態様において、アレルゲンは草の花粉、例えばライムギアレルゲン、例えばLol p 1である。表1は、使用され得るアレルゲンのリストを示す。
【表10】
【表11】
【表12】
【表13】
【0092】
一部の態様において、抗原は感染因子、例えば原生動物、細菌、真菌(単細胞及び多細胞のものを含む)、及びウィルスの感染因子由来である。適当なウイルス抗原の例は本明細書に記載されており、そして当業界で公知である。細菌は、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)及び百日咳菌(Bordetella pertussis)を含む。原生動物の感染因子は、マラリアの変形体、リーシュマニア種、トリパノソーマ種及び住血吸虫種を含む。真菌はカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)を含む。
【0093】
一部の態様において、抗原はウイルス抗原である。ウイルスポリペプチド抗原は、限定しないが、HIVタンパク質、例えばHIV gagタンパク質(限定しないが、膜固着(anchoring)(MA)タンパク質、コアキャプシド(CA)タンパク質及びヌクレオキャプシド(NC)タンパク質を含む)、HIVポリメラーゼ、インフルエンザウイルスマトリックス(M)タンパク質及びインフルエンザウイルスヌクレオキャプシド(NP)タンパク質、B型肝炎表面抗原(HBsAg)、B型肝炎コアタンパク質(HBcAg)、e型肝炎タンパク質(HBeAg)、B型肝炎DNAポリメラーゼ、C型肝炎抗原等を含む。インフルエンザワクチン接種を考察している引用文献は、
【表14】
を含む。抗原ポリペプチドの他の例は群又は亜群特異的抗原であり、これは、限定しないが、アデノウイルス、ヘルペス単純ウイルス、パピローマウイルス、呼吸器合胞体ウイルス及びポックスウイルスを含む、多くの感染因子に関して公知なものである。
【0094】
多くの抗原性ペプチド及びタンパク質が当業界で公知であり、且つ利用可能であり;他のものは、常用の技術を用いて同定されうる。腫瘍の形成に対する免疫化及び既存の腫瘍の処置のために、免疫調節ペプチドは、腫瘍細胞(生細胞又は照射された細胞)、腫瘍細胞抽出物、又は腫瘍抗原、例えばHer−2/neu、Mart1、ガン胎児抗原(CEA)、ガングリオシド、ヒト乳脂肪球(HMFG)、ムチン(MUC1)、MAGE抗原、BAGE抗原、GAGE抗原、gp100、前立腺特異的抗原(PSA)、及びチロシナーゼを含むことがある。免疫に基づいた避妊用ワクチンは、ISSと一緒に投与される精子タンパク質を含めることによって形成され得る。Lea et al. (1996) Biochem. Biophys. Acta 1307:263。
【0095】
弱毒化ウイルス及び不活性化ウイルスは、抗原としての本明細書での使用に適している。これらのウイルスの調製は当業界で周知であり、そして多くのものが市販されている(例えば、Physician’s Desk Reference (1998) 52nd edition, Medical Economics Company, inc.を参照のこと)。例えば、ポリオウイルスはIPOL(商標)(Pasteur Merieux Connaught)及びORIMUNE(商標)(Lederle Laboratories)として、A型肝炎ウイルスはVAQTA(商標)(Merck)として、麻疹ウイルスはATTENUVAX(商標)(Merck)として、ムンプスウイルスはMUMPSVAX(商標)(Merck)として、そして風疹ウイルスはMERUVAX(商標)II(Merck)として入手可能である。更に、弱毒化及び不活化ウイルス、例えば、HIV−1、HIV−2、単純ヘルペスウイルス、B型肝炎ウイルス、ロタウイルス、ヒト及び非ヒトパピローマウイルス及びスローブレインウイルスは、ペプチド抗原を提供し得る。
【0096】
一部の態様において、抗原はウイルスベクター、例えばワクシニア、アデノウイルス、及びカナリア痘瘡を含んで成る。
【0097】
抗原は、当業界で公知の精製技術を用いて、それらの供給源から単離されることがあり、又は、更に都合よくは、組換え法を用いて産生され得る。
【0098】
抗原性ペプチドは、精製された天然ペプチド、合成ペプチド、組換えタンパク質、粗製タンパク質抽出物、弱毒化ウイルス又は不活性化ウイルス、細胞、微生物、又はその様なペプチドのフラグメントを含むことがある。免疫調節ペプチドは、天然であっても、又は化学的若しくは酵素的に合成されてもよい。当業界で公知の化学合成の任意の方法が、適切である。液相ペプチド合成は、適当なサイズのペプチドの構築のために使用されることがあり、又は、ペプチドの化学的構築のために、固相合成が使用されることもある。Atherton et al.(1981) Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem. 362:833−839。タンパク質分解酵素もまた、ペプチドを産生するようにアミノ酸をカップリングするために利用され得る。Kullmann(1987) Enzymatic Peptide Synthesis, CRC Press,Inc.。あるいは、ペプチドは、細胞の生化学的機構を使用することによって、又は生物学的供給源からの単離によって得られ得る。組換えDNA技術は、ペプチドの産生のために使用され得る。Hames et al.(1987)Transcription and Translation:A Practical Approach, IRL Press。ペプチドはまた、アフィニティークロマトグラフィのような標準的技術を用いて単離され得る。
【0099】
好ましくは、抗原は、ペプチド、脂質(例えば、コレステロール以外のステロール、脂肪酸、及びリン脂質)、インフルエンザワクチンに使用されるような多糖、ガングリオシド及び糖タンパク質である。これらは、単離、並びに化学的方法及び酵素的方法を用いる合成を含む、当業界で公知の複数の方法を介して得られ得る。いくつかの場合において、例えば、多くのステロール、脂肪酸及びリン脂質の場合、分子の抗原部分は市販されている。
【0100】
対象組成物及び当該組成物を用いる方法において有用なウイルス抗原の例は、限定しないが、HIV抗原を含む。その様な抗原は、限定しないが、gp160、gp120及びgp41を含む、HIVエンベロープ糖タンパク質由来の抗原を含む。HIV遺伝子及び抗原に関する多くの配列が知られている。例えば、Los Alamos National Laboratory HIV Sequence Databaseは、HIVのヌクレオチド及びアミノ酸配列を回収し、預かりそして注釈をつけている。このデータベースは、インターネットを介して、http://hiv−web.lanl.gov./からアクセス可能であり、そして年刊の刊行物においては、Human Retroviruses and AIDS Compendium(例えば1998 edition)を参照のこと。
【0101】
感染因子由来の抗原は、当業界で公知の方法を用いて、例えば天然ウイルス又は細菌抽出物から、感染因子に感染した細胞から、精製したポリペプチドから、組換え的に産生したポリペプチド及び/又は合成ペプチドから得られることがある。
【0102】
IMP/MC複合体製剤は、限定しないが、サイトカイン、アジュバント及び抗体を含む、他の免疫治療物質を用いて調製されうる。これらのIMP/MC複合体製剤は、抗原を用いて、又は用いずに調製されうる。
【0103】
IMP/MC 複合体
IMP/MC複合体は、マイクロキャリアの表面に結合したIMPを含んで成り(すなわち、IMPがMCに包まれていない)、そして好ましくは各マイクロキャリアと結合したIMPの多数の分子を含んで成る。ある態様において、異なるIMPの混合物は、マイクロキャリアと複合体化されることがあり、その結果、当該マイクロキャリアは、1より大きいIMPの種類と結合する。IMPとMCとの間の結合は、共有結合であっても、又は非共有結合であってもよい。当業者によって理解されるように、IMPは修飾されても、又は誘導体化されてもよく、そしてマイクロキャリアの組成物は、IMP/MC複合体の形成に所望とされる、結合の所望な型を確保するために選択され、そして/あるいは修飾されることがある。
【0104】
共有結合したIMP/MC複合体は、当業界で公知の任意な共有結合的架橋技術を用いて結合されうる。典型的に、IMP部分は追加の部分(例えば、遊離アミン、カルボキシル又はスルフヒドリル基)を組み込むために、又はIMP部分がマイクロキャリアと結合し得る部位を提供するための、修飾された(例えば、ホスホロチオエート)ヌクレオチド塩基を組み込むために、修飾される。複合体のIMP部分とMC部分との間の結合は、IMPの3’又は5’末端において、又はIMPの内部にある、適当に修飾された塩基において生成されうる。マイクロキャリアは通常、共有結合が形成され得る部分を組み込むためにも修飾されるが、マイクロキャリア上に通常存在する官能基も利用されうる。IMP/MCは、共有結合複合体を形成せしめる条件下で(例えば、架橋剤の存在下で、又はIMPと共に共有結合を形成する活性部分を含んで成る活性マイクロキャリアの使用によって)、IMPをマイクロキャリアとインキュベートすることによって形成される。
【0105】
広範な架橋技術が当業界で知られており、そしてアミノ、カルボキシル及びスルフヒドリル基と反応性のある架橋剤を含む。当業者に自明の様に、架橋剤及び架橋プロトコールの選択は、IMP及びマイクロキャリアの配置並びにIMP/MC複合体の所望とされる最終的な配置に依存する。架橋剤は、同種二官能性又は異種二官能性のいずれであってもよい。同種二官能性架橋剤が使用される場合、当該架橋剤はIMP及びMC上の同じ部分を利用する(例えば、アルデヒド架橋剤は、共に1又は複数の遊離アミンを含んで成るIMP及びMCを共有結合するために使用され得る)。異種二官能性架橋剤は、IMPとMC上の異なる部分を利用し(例えばマレイミド−N−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、IMP上の遊離スルフヒドリル基及びMC上の遊離アミンを共有結合させるために使用され得る)、そしてマイクロキャリア間の結合の形成を最小化するのに好ましい。多くの場合において、マイクロキャリア上の第1架橋部分及びIMP上の第2架橋部分(ここで、第2架橋部分はマイクロキャリア上に存在しない)を介して架橋することが好ましい。IMP/MC複合体を生成する1つの好ましい方法は、異種二官能性架橋剤と一緒にインキュベートすることによってマイクロキャリアを「活性化」し、続いて、反応に適した条件下でIMPと活性化されたMCをインキュベートすることによってIMP/MC複合体を形成することによる。架橋剤は、反応部分間に「スペーサー」アームを組み込むことがあり、又は架橋剤の2つの反応部分が直接結合されることもある。
【0106】
1つの好ましい態様において、IMP部分は、マイクロキャリアと架橋するために、少なくとも1つの遊離スルフヒドリル(例えば、5’−チオールが修飾された塩基又はリンカーによって提供される)を含んで成り、一方、マイクロキャリアは遊離アミン基を含んで成る。これらの2つの基と反応性のある異種二官能性架橋剤(例えば、マレイミド基及びNHS−エステルを含んで成る架橋剤)、例えばスクシンイミジル4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシラートは、MCを活性化し、続いてIMPを架橋してIMP/MC複合体を形成するために使用される。
【0107】
非共有結合IMP/MC複合体は、一般的に結合対がIMPとMCを結合させるような場合と同様に、任意の非共有結合又は相互作用、例えばイオン(静電的)結合、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス引力、あるいは2又はそれ以上の異なる相互作用の組み合わせによって結合されうる。
【0108】
好ましい非共有結合IMP/MC複合体は、典型的に疎水性又は静電的(イオン性)相互作用、又はそれらの組み合わせによって複合体化される(例えば、IMPと、結合対を使用してMPに結合したポリヌクレオチドとの間の塩基対形成を介する)。ポリヌクレオチドの骨格の疎水性に起因して、複合体を形成するために疎水性の相互作用に依存するIMP/MC複合体は、高度に疎水性の部分を組み込むために、通常当該複合体のIMP部分の修飾を必要とする。好ましくは、疎水性部分は生物学的適合性で、非免疫原性のものであり、そしてその組成物が意図される個体において天然のものである(例えば、哺乳類、特にヒトにおいて見出される)。好ましい疎水性部分の例は、脂質、ステロイド、ステロール、例えばコレステロール、及びテルペンを含む。疎水性部分をIMPに結合させる方法は、当然、IMPの配置及び疎水性部分の同一性に依存する。疎水性部分は、IMPの任意の便利な部位、好ましくは5’又は3’末端のいずれかに挿入されることがあり;IMPにコレステロールを挿入する場合、コレステロール部分は、好ましくは、常用の化学反応を用いて、IMPの5’末端に挿入される(例えば、Godard et al. (1995)Eur. J. Biochem. 232:404−410を参照のこと)。好ましくは、疎水結合によって結合されるIMP/MC複合体における使用のためのマイクロキャリアは、疎水性材料、例えば油滴又は疎水性ポリマーから製造されるが、疎水性部分を組み込むよう修飾された親水性材料も同様に利用されうる。マイクロキャリアがリポソーム又は管腔を含んで成る他の液相マイクロキャリアである場合、IMP/MC複合体は、MC調製工程の間のIMPの封入を回避するために、MCの調製後にIMPとMCを混合することによって形成される。
【0109】
静電的結合によって結合した非共有結合型IMP/MC複合体は、典型的にポリヌクレオチド骨格の高度な負電荷性を利用する。従って、非共有結合したIMP/MC複合体における使用のためのマイクロキャリアは、生理学的pH(例えば、約pH6.8−7.4)で通常正に荷電している(例えば、陽イオン性)。マイクロキャリアは、本質的に正電荷を有するが、一般的に正電荷を有さない化合物から生成したマイクロキャリアは、正電荷(例えば、陽イオン性)となるように誘導体化され、又は他の方法で修飾され得る。例えば、マイクロキャリアを生成するために使用されるポリマーは、正に荷電した基、例えば第1級アミンを挿入するために誘導体化されうる。あるいは、正に荷電した化合物は、製造の間のマイクロキャリアの調製において組み込まれることがある。この様に、マイクロキャリアは正に荷電した部分を含んで成る。
【0110】
ヌクレオチドの塩基対形成によって結合した非共有結合性IMP/MC複合体は、常用の方法を用いて生成されうる。通常、塩基対合したIMP/MC複合体は、IMPと少なくとも部分的に相補性である、結合した、好ましくは共有結合したポリヌクレオチド(「捕獲(capture)ポリヌクレオチド」)を含んで成るマイクロキャリアを用いて生成されうる。IMPと捕獲ポリヌクレオチドとの間の相補性のセグメントは、好ましくは、少なくとも6、8、10又は15個連続した塩基対、更に好ましくは少なくとも20個連続した塩基対である。捕獲ヌクレオチドは、当業界で公知の任意な方法によってMCと結合されることがあり、そして好ましくは5’又は3’末端でIMPと共有結合する。
【0111】
他の態様において、結合対は、IMP/MC複合体においてIMPとMCを結合させるために使用され得る。結合対は、高い親和性(例えば約10−8未満のKd)で結合する受容体とリガンド、抗体と抗原(又はエピトープ)、又は任意な他の結合対であってもよい。好ましい結合対の1つの型は、非常に強固な複合体を形成するビオチンとストレプトアビジン、又はビオチンとアビジンであるが、一部の態様において、この結合の型は除外されることもある。IMP/MC複合体の結合を媒介するために結合対を用いる場合、IMPは典型的に、結合対の一方を用いて、共有結合によって誘導体化され、そしてMCは結合対の他方を用いて誘導体化される。2つの誘導体化された化合物の混合物は、IMP/MC複合体の形成をもたらす。
【0112】
多くのIMP/MC複合体の態様は抗原を含まず、そしていくつかの態様はIMP/MC複合体治療の対象である疾患又は病気と関連した抗原を除外する。更なる態様において、IMPはまた、1又は複数の抗原と結合する。抗原は、例えばWO98/16247に記載の様に、共有結合的及び/又は非共有結合的相互作用を含む様々な方法で、IMP/MC複合体のIMP部分とカップリングされうる。あるいは、抗原はマイクロキャリアと結合されうる(直接的又は間接的のいずれか)。
【0113】
IMPに結合した抗原を含んで成るIMP/MC複合体における抗原とIMPの間の結合は、IMPの3’又は5’末端において、あるいはIMPの内部にある適当に修飾された塩基において、生成されうる。抗原がペプチドであり、且つ適当な反応基(例えば、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル)を含む場合、それはシトシン残基のN4アミノ基と直接的に反応することがある。IMPにおけるシトシン残基の数及び位置に依存して、1又は複数の残基における特異的なカップリングが達成されうる。
【0114】
あるいは、当業界で公知のような、修飾されたヌクレオシド又はヌクレオチドは、IMPのいずれかの末端、又はその内側の部位において組み込まれることがある。これらは、脱ブロッキングされる場合に、注目の抗原上に存在することがあり、又はそれらに結合することがある種々の官能基と反応性である、ブロッキングされた官能基を含むことがある。
【0115】
抗原がペプチドである場合、接合体のこの部分は、固体支持体化学によってIMPの3’末端に結合され得る。例えば、IMP部分は、支持体上であらかじめ合成されているポリペプチド部分に付加され得る。Haralambidis et al. (1990a) Nucleic Acids Res. 18:493−499;及びHaralambidis et al. (1990b)Nucleic Acids Res. 18:501−505。あるいは、IMPは、3’末端から伸張している開裂可能なリンカーを通して固体支持体へ連結されるように合成され得る。支持体からISSの化学的開裂の際、末端チオール基が、オリゴヌクレオチドの3’末端に残されるか(Zuckermann et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:5305−5321;及びCorey et al. (1987) Science 238:1401−1403)、あるいは末端アミノ基が、オリゴヌクレオチドの3’末端に残される(Nelson et al. (19899 Nucleic Acids Res. 17:1781−1194)。ペプチドのアミノ基に対するアミノ修飾型IMPの接合は、Benoit et al. (1987) Neuromethods 6:43−72に記載のように実施され得る。ペプチドのカルボキシル基に対するチオール修飾型IMPの接合は、Sinha et al. (1991) Oligonucleotide Analogues:A Practical Approach, IRL Pressに記載のように実施され得る。ペプチドのシステイン残基のチオール側鎖に対する、付加されたマレイミドを有するオリゴヌクレオチドのカップリングもまた、記載されている。Tung et al. (1991) Bioconjug. Chem. 2:464−465。
【0116】
接合体のペプチド部分は、合成の間にオリゴヌクレオチドへ組み込まれたアミン、チオール、又はカルボキシル基を介して、IMPの5’末端へ結合され得る。好ましくは、オリゴヌクレオチドが固体支持体へ固定される間に、一方の末端において保護されたアミン、チオール又はカルボキシルを含んで成り、他方の末端においてホスホルアミダイトを含んで成る連結基は、5’ヒドロキシルと共有結合する。Agrawal et al. (1986) Nucleic Acids Res. 14:6227−6245;Connolly (1985) Nucleic Acids Res. 13:4485−4502;Kremsky et al. (1987)Nucleic Acids Res. 15:2891−2909;Connolly(1987)Nucleic Acids Res,15:3131−3139;Bischoff et al. (1987)Anal. Biochem. 164:336−344;Blanks et al. (1988)Nucleic Acids Res. 16:10283−10299;及び米国特許第4,849,513号、同第5,015,733号、同第5,118,800号、及び同第5,118,802号。脱保護に続いて、アミン、チオール及びカルボキシルの官能性は、ペプチドに対するオリゴヌクレオチドの共有結合のために使用され得る。Benoit et al. (1987);及びSinha et al. (1991)。
【0117】
IMP−抗原接合体も、非共有的相互作用、例えば、イオン結合、疎水性相互作用、水素結合及び/又はファンデルワールス引力によって形成され得る。
【0118】
非共有的に連結された接合体は、ビオチン−ストレプトアビジン複合体のような非共有的相互作用を含み得る。ビオチニル基は、例えば、ISSの修飾された塩基と結合され得る。Roget et al. (1989)Nucleic Acids Res. 17:7643−7651。ペプチド部分へのストレプトアビジン部分の組み込みは、ストレプトアビジンと接合したペプチドとビオチン化オリゴヌクレオチドとの非共有結合複合体の形成を可能にする。
【0119】
非共有結合的会合も、IMP及び抗原内の残基、例えば、荷電アミノ酸を含むイオン性相互作用を介して、又はオリゴヌクレオチド及び抗原の両方と相互作用し得る、荷電した残基を含むリンカー部分の使用を介して生じ得る。例えば、非共有結合的接合は、全体的に、負に荷電したISSと、ペプチドの正に荷電したアミノ酸残基、例えば、ポリリジン及びポリヒスチジン残基との間に生じ得る。
【0120】
IMPと抗原との間の非共有結合的接合は、天然のリガンドとしてDNAと相互作用する分子のDNA結合モチーフを介して生じ得る。例えば、そのようなDNA結合モチーフは、転写因子と抗DNA抗体において見出され得る。
【0121】
脂質へのIMPの結合は、標準的な方法を使用して形成され得る。これらの方法は、限定しないが、オリゴヌクレオチド−リン脂質接合体(Yanagawa et al. (1988) Nucleic Acids Symp. Ser. 19:189−192)、オリゴヌクレオチド−脂肪酸接合体(Grabarek et al. (1990) Anal. Biochem. 185:131−135;及びStaros et al. (1986) Anal Biochem. 156:220−222)、及びオリゴヌクレオチド−ステロール接合体の合成を含む。Boujrad et al. (1993)Proc. Natl Acad. Sci. USA 90:5728−5731。
【0122】
オリゴ糖に対するオリゴヌクレオチドの結合は、標準的な公知の方法を使用して形成され得る。これらの方法は、限定しないが、オリゴヌクレオチド−オリゴ糖接合体(ここで、オリゴ糖は、イムノグロブリンの一部である)を含む。O’Shannessy et al. (1985)J. Applied Biochem. 7:347−355。
【0123】
ペプチド又は抗原に対する環状IMPの結合は、いくつかの方法で形成され得る。環状IMPが組換え方法又は化学的方法を使用して合成される場合、修飾されたヌクレオシドが適切である。Ruth(1991)Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,IRL Press。次に、標準的な結合技術が、抗原又は他のペプチドに対し環状IMPを結合するために使用され得る。Goodchild(1990)Bioconjug. Chem. 1:165。環状IMPが単離される場合、又は組換え方法若しくは化学的方法を用いて合成される場合、結合は抗原又は他のペプチドに組み込まれている反応基(例えば、カルベン、ラジカル)を化学的活性化又は光活性化することによって形成され得る。
【0124】
オリゴヌクレオチドに対するペプチド及び他の分子の結合のためのさらなる方法は、米国特許第5,391,723号;Kessler(1992)「Nonradioactive labeling methods for nucleic acids」Kricka(ed.) Nonisotopic DNA Probe Techniques,Academic Press;及びGeoghegan et al. (1992)Bioconjug. Chem. 3:138−146において見出され得る。
【0125】
本発明の方法
本発明は、個体、好ましくは哺乳類、更に好ましくはヒトにおける免疫応答を調節する方法であって、免疫応答の所望な調節が達成されるように、個体に対し、IMP/MC複合体(典型的に、当該複合体及び医薬として許容される補形剤を含んで成る組成物中に存在)を投与することを含んで成る方法を提供する。免疫調節は、Th1型免疫応答を刺激し、そして/あるいはTh2型免疫応答を阻害し、又は低下させることを含むことがある。
【0126】
いくつかの態様において、免疫調節は、ある(すなわち、1又は複数の)Th1関連サイトカイン、例えばIFN−γ、IL−12及び/又はIFN−αを刺激することを含んで成る。いくつかの態様において、免疫調節は、ある(すなわち、1又は複数の)Th2関連サイトカイン、例えばIL−4及び/又はIL−5の産生を抑制することを含んで成る。これらの要因の測定は、当業界で標準的な方法を使用し、そして本明細書において論じてきた。
【0127】
本明細書に記載のように、IMP/MC複合体の投与は更に、1又は複数の追加の治療物質(すなわち、免疫系を介して働き、そして/あるいは免疫系に由来する物質)、例えば、限定しないがサイトカイン、アジュバント及び抗体の投与を含んで成ることがある。治療抗体の例は、ガンの状況において使用されるものを含む(例えば、抗腫瘍抗体)。その様な追加の免疫治療物質の投与は、本明細書に記載の全ての方法に適用する。
【0128】
一部の態様において、個体はTh2型免疫応答に関連する病気、例えばアレルギー又はアレルギー誘導型喘息に苦しんでいる。IMP/MC複合体の投与は、免疫調節をもたらし、その結果、アレルゲンに対する個体の応答と関連するTh2型応答の特徴の低下をもたらしうる、サイトカインと関連する1又は複数のTh1型応答のレベルを増大する。病気と関連するTh2型応答関連疾患を有する個体の免疫調節は、当該病気の1又は複数の症候の軽減又は改善をもたらす。病気がアレルギー又はアレルギー誘導型喘息である場合、1又は複数の症候の改善は、以下の鼻炎、アレルギー性結膜炎、IgEの循環レベル、ヒスタミンの循環レベル及び/又は「救急」の吸入器治療についての必要性(例えば、定量吸入器又は噴霧器によって投与される吸入用アルブテロール)のうちの1又は複数の軽減を含む。
【0129】
更なる態様において、本発明の免疫調節治療の対象となる個体は、ワクチン接種を受ける個体である。ワクチンは予防用ワクチン又は治療用ワクチンであってもよい。予防用ワクチンは、個体にとって危険性があり得る病気と関連する1又は複数のエピトープを含んで成る(例えば、百日咳の予防のためのワクチンの場合、百日咳菌の抗原)。治療用ワクチンは、個体に影響を及ぼす特定の病気と関連する、1又は複数のエピトープを含んで成り、例えば結核患者においては結核菌又はウシ結核菌表面抗原、アレルギーの対象となる個体においては、個体がアレルギーとなる抗原(すなわち、アレルギー脱感作治療)、ガン患者においては、ガンを有する個体に由来する腫瘍細胞(例えば、米国特許第5,484,596号に記載のもの)、又は腫瘍関連抗原、を含んで成る。IMP/MC複合体は、ワクチンと一緒に(例えば、同じ注射で、又は同時であるが、別々の注射で)与えられることもあり、又は、IMP/MC複合体は別々に(例えば、ワクチンの投与の少なくとも12時間前又はその後に)投与されることもある。一部の態様において、ワクチンの抗原は、IMP/MC複合体に対し、共有結合的又は非共有結合的のいずれかで連結した、IMPの一部である。ワクチン接種を受けている個体に対するIMP/MC複合体治療の投与は、IMP/MC複合体を含まないワクチン接種を受ける個体と比較して、Th1型応答に偏っている、ワクチンに対する免疫応答をもたらす。Th1型応答への偏りは、ワクチン中の抗原に対する遅延型過敏症(DTH)によって、IFN−γ及び他のTh1型応答関連サイトカインの増大、IFN−αの増大、ワクチンの抗原特異的CTLの産生、ワクチンの抗原に特異的なIgEの低レベル又はレベルの低下、ワクチンの抗原に特異的なTh2関連抗体の減少、及び/又はワクチンの抗原に特異的なTh1関連抗体の増大、によって認識されうる。治療用ワクチンの場合、IMP/MC複合体とワクチンの投与は、ワクチンの処置が意図される病気の症候の緩和をもたらす。当業者に自明な様に、正確な症候及びそれらの改善方法は、処置されることが求められる病気に依存する。例えば、治療用ワクチンが結核のためのものである場合、ワクチンによるIMP/MC複合体処置は、咳、胸膜又は胸壁の痛み、発熱、及び/又は当業界で知られている他の症候の低下をもたらす。ワクチンがアレルギーの脱感作治療で使用されるアレルゲンである場合、処置はアレルギーの1又は複数の軽減をもたらす(例えば、鼻炎、アレルギー性結膜炎、IgEの循環レベル、ヒスタミンの循環レベルの軽減)。
【0130】
本発明の他の態様は、既存の疾患又は病気、例えばガン又は感染病を有する個体の免疫調節治療に関する。ガンが免疫調節にとって魅力的な標的であるのは、多くのガンが、体内の他の細胞に見られない腫瘍関連及び/又は腫瘍特異的抗原を発現するためである。腫瘍細胞に対するTh1型応答の刺激は、免疫系による腫瘍細胞の直接的殺傷及び/又は第三者による殺傷をもたらし、ガン細胞の減少及び症候の軽減を導く。ガンを有する個体に対するIMP/MC複合体の投与は、腫瘍細胞に対するTh1型免疫応答の刺激をもたらす。その様な免疫応答は、細胞性免疫系細胞(例えば、CTL)又は体液性免疫系の成分の直接的作用によって、又は免疫系の標的となる細胞に近接した細胞上の第三者的効果によって、腫瘍細胞を殺傷し得る。
【0131】
本発明に従う免疫調節治療はまた、感染病、特に体液性免疫応答に耐性のある感染病(例えば、放線菌の感染及び細胞病原によって生じる疾患)を有する個体にとって有用である。免疫調節治療は、細胞内病原(例えば、細菌又は原虫)又は亜細胞病原(例えば、ウイルス)によって生じる感染病の処置に使用されることがある。IMP/MC複合体治療は、放線菌の病気、例えば結核(例えば、結核菌及び/又はウシ結核菌の感染症)、らい病(すなわち、らい菌の感染症)、マイコバクテリウム・マリーヌム(mycobacterium marinum)又はM. ウルセランス(M. ulcerans)の感染症に苦しむ個体に対し投与されうる。IMP/MC複合体治療は、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、特にヘルペス単純ウイルス、及びパピローマウイルスによる感染症を含むウイルス感染症の処置にも有用である。細胞内寄生虫、例えばマラリアによって生じる疾患(例えば、三日熱マラリア原虫(plasmodium vivax)、プラスモディウム・オバレ(P. ovale)、プラスモディウム・ファルシパルム(P. farciparum)及び/又はプラスモディウム・マラリア(P. malariae)による感染症)、リーシュマニア症(例えば、リーシュマニア・ドノバニ(Leishmania donovani)、リーシュマニア・トロピカ(L. tropica)、リーシュマニア・メキシカナ(L. mexicana)、リーシュマニア・ブラジリエンシス(L. braziliensis)、リーシュマニア・ペルビアナ(L. peruviana)、リーシュマニア・インファンタム(L. infantum)、リーシュマニア・カガシ(L. chagasi)及び/又はリーシュマニア・アエシオピカ(L. aethiopica)による感染症)、及びトキソプラズマ症(例えば、トキソプラズモシス・ゴンジイ(Toxoplasmosis gondii)による感染症)も、IMP/MC複合体治療から恩恵を受ける。IMP/MC治療はまた、寄生虫症、例えば、住血吸虫症(すなわち、住血吸虫(Schistosoma)属の住血吸虫、例えばエジプト住血吸虫、マンソン住血吸虫、日本住血吸虫、及びメコン住血吸虫による感染症)及び肝吸虫症(すなわち、クロノルキス・シネンシス(Clonorchis sinensis)による感染症)の処置にも有用である。感染病に苦しむ個体に対するIMP/MC複合体の投与は、感染病の1又は複数の症候の緩和をもたらす。いくつかの態様において、感染病はウイルス病ではない。
【0132】
本発明は更に、個体における少なくとも1つのTh1関連サイトカイン、例えばIL−2、IL−12、TNF−β、及びIFN−γを増大せしめる方法を提供する。一部の態様において、本発明は、有効量のIMP/MC複合体を個体に投与することによってIFN−γを増大させる方法を提供する。IFN−γレベルの増大が必要な個体は、IFN−γの投与に応答する病気を有するものである。その様な病気は、多くの炎症性疾患、例えば、限定しないが潰瘍性大腸炎を含む。その様な病気はまた、多くの繊維病、例えば、限定しないが特発性肺線維症(IPF)、強皮症、皮膚性放射線誘導型線維症、肝線維症、例えば住血吸虫症誘導型肝線維症、腎線維症並びにIFN−γの投与によって改善され得る他の症状を含む。本発明に従うIMP/MC複合体の投与は、IFN−γレベルの増大をもたらし、そして1又は複数の症候の緩和。1又は複数の症候の安定化、あるいはIFN−γに応答する病気の進行の予防(例えば、追加の病変又は症候の軽減又は排除)をもたらす。本発明の方法は、病気のための標準的な対処を構成する他の治療、例えばIPFにおける抗炎症剤の投与、例えば全身性コルチコステロイド治療(例えば、コルチゾン)と一緒に実施されうる。
【0133】
一部の態様において、本発明は個体、特にIFN−αレベルの増大が必要な個体において、IFN−αが増大するように、有効量のIMP/MC複合体を当該個体に対し投与することによって、IFN−αを増大させる方法を提供する。IFN−αの増大が必要な個体は、IFN−α、例えば組換えIFN−αの投与に応答する病気、例えば、限定しないがウイルス感染症及びガンを有する者である。
【0134】
更に提供されるものとして、IgE関連疾患を有する個体のIgEのレベル、特に血清レベルを、IgEのレベルが低下するように有効量のIMP/MC複合体を当該個体に対し投与することによって低下させる方法がある。IgEの減少は、IgE関連疾患の症候の緩和をもたらす。その様な症候は、アレルゲンに対する感受性の低下、アレルギーを有する個体におけるアレルギーの症候の低下、又はアレルギー性応答の重症度の低下における、アレルギーの症候、例えば鼻炎、結膜炎を含む。
【0135】
当業者に自明なように、本発明の方法の実施は、IMP/MC複合体が投与される特定の徴候のための、他の治療と組み合わせて実施されうる。例えば、IMP/MC複合体治療は、マラリア患者のための抗マラリア薬、例えばクロロキンとともに、リーシュマニア症の患者のための殺リーシュマニア薬、例えばペンタミジン及び/又はアロプリノールとともに、結核の患者のための抗放線菌薬、例えばイソニアジド、リファンピン及び/又はエタンブトールとともに、あるいはアトピー(アレルギー)の患者のためのアレルゲン脱感作治療とともに投与されうる。
【0136】
投与及び免疫応答の評価
IMP/MC複合体は、他の医薬並びに/あるいは免疫原性物質及び/又は免疫刺激物質と組み合わせて投与されることがあり、そして生理学的に許容されるその担体と組み合わされることがある。
【0137】
従って、IMP/MC複合体は他の免疫原性物質、例えば、限定しないがサイトカイン、アジュバント及び抗体と組み合わせて投与されることがある。
【0138】
ISS含有ポリヌクレオチドは、上述のもののいずれでもよい。配列番号1に示したように、好ましくは、投与されるISS含有ポリヌクレオチドは、配列5’−T、C、G−3’を含んで成る。好ましくは、投与されるISS含有ポリヌクレオチドは式5’プリン、プリン、C、G、ピリミジン、ピリミジン、C、G−3’を含んで成り;更に好ましくは配列5’−A、A、C、G、T、T、C、G−3’を含んで成る。別の好ましい態様は、配列番号1を使用する。
【0139】
免疫原性組成物と同様に、特定のIMP/MC複合体製剤の免疫学的な有効量及び投与方法は、個体、処置すべき全ての症状及び当業者に自明の他の因子に依存して変化し得る。考慮すべき因子は、抗原性、IMP/MC複合体がアジュバント又は送達分子と一緒に投与されるか、又はそれらと共有結合するか否か、投与経路及び投与されるべき量で免疫する回数、を含む。その様な因子は当業界で知られており、そして過度の実験をすることなく、その様な決定を行うことは、当業者に周知である。適当な用量範囲は、抗原に対する免疫応答の所望な調節を提供するものである。通常、用量は、IMP/MC複合体の全体的な量ではなく、患者に投与されるIMPの量によって決定される。送達されるIMPの量で示される、IMP/MC複合体の有用な用量範囲は、例えば、大体次のもののいずれかであってもよい:0.1〜100μg/kg、0.1〜50μg/kg、0.1〜25μg/kg、0.1〜10μg/kg、1〜500μg/kg、100〜400μg/kg、200〜300μg/kg、1〜100μg/kg、100〜200μg/kg、300〜400μg/kg、400〜500μg/kg。あるいは、用量範囲は、大体、次のもののいずれかであってもよい:0.1μg、0.25μg、0.5μg、1.0μg、2.0μg、5.0μg、10μg、25μg、50μg、75μg、100μg。従って、用量範囲は、大体、次の:0.1μg、0.25μg、0.5μg及び1.0μgのうちのいずれかの下限を有するもの;並びに、大体、次の:25μg、50μg及び100μgのうちのいずれかの上限を有するものであってもよい。各患者に与えられる絶対量は、薬理学的特性、例えば生物学的適合性、クリアランス率及び投与経路に依存する。
【0140】
特定のIMP/MC複合体製剤の有効量及び投与方法は、個々の患者及び病期及び当業者に自明の他の因子に基づいて変化しうる。特定の適用において有用な投与経路は、当業者に自明である。投与経路は、限定しないが、局所的、皮膚、経皮、経粘膜、表皮、非経口、消化管、及び鼻咽頭、並びに肺、例えば経気管支及び経肺胞を含む。適当な用量範囲は、血液レベルによって測定した場合に、約1〜10μMの組織濃度に達するのに十分なISS含有組成物を提供する用量範囲である。各患者に与えられる絶対量は、薬理学的特性、例えば生物学的適合性、クリアランス率、及び投与経路に依存する。
【0141】
本明細書に記載のように、APC及び高濃度のAPCを有する組織が、IMP/MC複合体にとって好ましい標的である。従って、哺乳類の皮膚及び/又は粘膜に対するIMP/MC複合体の投与が、APCが比較的高濃度で存在する場合に好ましい。
【0142】
本発明は、限定しないが、生理学的に許容されるインプラント、軟膏、クリーム、リンス及びゲルを含む、局所適用適したIMP/MC複合体製剤を提供する。局所投与は、例えば、送達系を分散せしめた包帯剤又は包帯によって、切開創又は開放創への送達系の直接投与、あるいは注目の部位に対する装置の経皮投与による。IMP/MC複合体を分散せしめたクリーム、リンス、ゲル、又は軟膏は、局所的な軟膏又は創傷充填剤としての使用に適切している。
【0143】
皮膚からの投与にとって好ましい経路は、最も低侵襲なものである。これらの中の好ましい手段は、経皮伝達、表皮投与及び皮下注射である。これらの手段の中で、表皮投与が、皮内組織に存在することが予測される、より高濃度のAPCにとって好ましい。
【0144】
経皮投与は、IMP/MC複合体が皮膚に浸透し、そして血流に侵入することを可能にし得る、クリーム、リンス、ゲルなどの適用によって達成される。経皮投与に適した組成物は、限定しないが、皮膚に直接適用されるか、又は保護担体、例えば経皮装置(いわゆる「パッチ」)へ組み込まれる医薬として許容される懸濁液、オイル、クリーム及び軟膏を含む。適当なクリーム、軟膏などの例は、例えば、Physician’s Desk Referenceで見出すことができる。
【0145】
経皮伝達の場合、イオントフォレーシスが適当な方法である。イオントフォレーシスによる伝達は、数日間又はぞれ以上の間、未破壊の皮膚を通して、その生成物を連続的に送達する市販の送達パッチを用いて達成され得る。この方法の使用は、比較的高濃度の医薬組成物の制御された伝達を可能にし、併用薬物の注入を許容し、そして吸収促進因子の同時使用を可能にする。
【0146】
この方法に使用するための例示的なパッチ製品は、General Medical Company(Los Angeles,CA)のLECTRO PATCHという商標の製品である。この製品は、中性pHに貯蔵電極を電気的に保持し、そして異なる濃度の用量を提供し、連続的に及び/又は周期的に投与するように適合され得る。パッチの調製及び使用は、引用によって本明細書に組み入れられる、LECTRO PATCH製品に添付された製造者の印刷した説明書に従い実施されるべきである。他の閉塞性のパッチ系も適している。
【0147】
経皮伝達のためには、低周波超音波送達もまた、適当な方法である。Mitragotri et al. (1995) Science 269:850−853。低周波超音波周波数(約1MHz)の適用は、治療組成物、例えば高分子量のものの、全般制御された送達を可能にする。
【0148】
表皮投与は、刺激物に対して免疫応答を引き起こすために十分に、表皮の最も外側の層を機械的又は化学的に刺激することを本質的に含む。具体的には、刺激は、刺激部位にAPCを誘引するのに十分であるべきである。
【0149】
例示的な機械的刺激手段は、皮膚を刺激し、そして刺激部位へAPCを誘引するために使用され得る多数の非常に小さな直径の短い尖叉を、尖叉の端から移されるIMP/MC複合体を取り込むように利用する。例えば、Pasteur Merieux(Lyon, France)によって製造されたMONO−VACC旧ツベルクリン試験は、IMP/MC複合体含有組成物の導入のために適切な装置を含む。
【0150】
当該装置(Swiftwater、PAのConnaught Laboratories,Inc.によって米国で販売されているもの)は、一方の末端にシリンジプランジャーを、他方の末端に尖叉ディスクを有するプラスチック容器から成る。尖叉ディスクは、表皮細胞の最も外側の層を単に引っ掻くだけの長さの、小さな直径の多数の尖叉を支持する。MONO−VACCキットの各尖叉は、旧ツベリクリンでコーティングされている;本発明において、各針は、IMP/MC複合体製剤の医薬組成物でコーティングされる。この装置の使用は、好ましくは、装置製品と一緒に含まれる製造者の書面による説明書に従う。この態様において使用され得る同様の装置は、アレルギー試験を実施するために現在使用されるものである。
【0151】
IMP/MC複合体の上皮投与に対する別の適切なアプローチは、表皮の最も外側の細胞を刺激する化学物質の使用により、十分な免疫応答を引き起こして領域に対してAPCを誘引することである。一例として、ケラチン分解剤、例えばNoxema CorporationによりNAIRの商標のもとで販売される市販の局所的な脱毛クリームにおいて使用されるサリチル酸、がある。このアプローチはまた、粘膜における上皮投与を達成するために使用され得る。化学的刺激物も、機械的刺激物(例えば、MONO−VACC型の尖叉も化学的刺激物でコーティングされた場合に生じるようなもの)とともに適用され得る。IMP/MC複合体は、更に化学的刺激剤物もまた含む担体中で懸濁されるか、又はそれらと一緒に同時投与されることがある。
【0152】
投与の非経口経路は、電気的(イオントフォレーシス)又は直接的な注射、例えば中心静脈系統への直接注射、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮内注射、又は皮下注射のような直接注入を含む。非経口投与に適したIMP/MC製剤は通常、USP水又は注射用水において調製され、そして更に、pH緩衝剤、塩充填剤、保存剤、及び他の医薬として許容される補形剤を含んで成ることもある。非経口注射のためのIMP/MC複合体は、注射のための、医薬として許容される滅菌等張溶液、例えば生理食塩水及びリン酸緩衝化生理食塩水において調製されることがある。
【0153】
投与の消化管経路は、限定しないが、摂取及び直腸を含む。本発明は、限定しないが、摂取のための医薬として許容される粉末、丸剤、又は液体及び直腸投与のための坐薬を含む、消化管投与に適したIMP/MC複合体を含む。当業者に自明なように、丸剤又は座薬は更に、組成物のためにかさを提供するよう、医薬として許容される固体、例えばデンプンを含んで成ることがある。
【0154】
鼻咽頭及び経肺投与は、吸入によって達成されるものを含み、そして送達経路、例えば経鼻、経気管支及び経肺胞経路を含む。本発明は、吸入による投与に適したIMP/MC複合体製剤を含み、これは、限定しないが、エアロゾルの形成のために液体懸濁物、及び、乾燥吸入送達系のためにエアロゾルを含む。IMP/MC複合体製剤の吸入投与に適した装置は、限定しないが、噴霧器、気化器、ネブライザー、及び乾燥粉末吸入送達装置を含む。
【0155】
送達経路の選択は、誘発される免疫応答を調節するのに使用され得る。例えば、IgG力価及びCTL活性は、インフルエンザウイルスベクターが筋肉内経路又は上皮(遺伝子銃)経路を介して投与された場合に同一であった;しかし、筋肉接種は主にIgG2Aを生成したのに対し、上皮経路はほとんどIgG1を生成した。Pertmer et al. (1996) J.Virol.70.6119−6125。従って、当業者は、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドを投与する異なる経路によって誘発される、免疫原性におけるわずかな差異を利用し得る。
【0156】
上文で言及した組成物及び投与の方法は、限定しないが、本発明のIMP/MC複合体製剤を投与する方法を説明することを意味する。種々の組成物及び装置を製造する方法は、当業者の能力の範囲内であり、本明細書中で詳細に記載しない。
【0157】
IMP/MC複合体製剤に対する免疫応答の分析(定性及び定量の両方)は、当業界で公知である任意の方法、例えば、限定しないが、抗原特異的抗体産生(特異的抗体のサブクラスの測定を含む)、リンパ球の特定の集団、例えばCD4+T細胞又はNK細胞の活性化、サイトカイン、例えばIFN−γ、IFN−α、IL−2、IL−4、IL−5、IL−10又はIL−12の産生及び/又はヒスタミンの放出の測定を含む。特異的抗体応答を測定するための方法は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を含み、そして当業界で周知である。CD4+T細胞のような特定の型のリンパ球の数の測定は、例えば、蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いて達成され得る。細胞傷害性アッセイは、例えば、Raz et al. (1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:9519−9523に記載のように実施され得る。サイトカインの濃度は、例えば、ELISAによって測定され得る。免疫原に対する免疫応答を評価するためのこれらのアッセイ及び他のアッセイは当業界で周知である。例えば、Selected Methods in Cellular Immunology (1980) Mishell及びShiigi, eds., W.H.Freeman and Co.を参照のこと。
【0158】
好ましくは、Th1型応答は刺激され、すなわち誘発され、そして/あるいは増強される。本発明に従う、Th1型の免疫応答の刺激は、ISSを用いずに処理したものと比較して、ISSで処理した細胞からのサイトカイン産生を測定することにより、in vitro又はex vivoで決定され得る。細胞のサイトカイン産生を決定する方法は、本明細書中に記載の方法、及び当業界で公知の任意のものを含む。ISS処理に応答して産生されるサイトカインの型は、細胞による、Th1型又はTh2型に偏った免疫応答を示す。本明細書中で使用する場合、用語「Th1型に偏った」サイトカイン産生は、刺激の無いなかでのこのようなサイトカインの産生と比較した場合の、刺激因子の存在下でのTh1型免疫応答に関連したサイトカインの測定可能な増加した産生を言及する。このようなTh1型に偏ったサイトカインの例は、限定しないが、IL−2、IL−12、及びIFN−γを含む。対照的に、「Th2型に偏ったサイトカイン」とは、Th2型免疫応答に関連したものを言及し、そして、限定しないが、IL−4、IL−5、IL−10、及びIL−13を含む。ISS活性の決定のために有用な細胞は、免疫系の細胞、宿主及び細胞株から単離される初代細胞、好ましくはAPC及びリンパ球、さらにより好ましくはマクロファージ及びT細胞を含む。
【0159】
Th1型免疫応答の刺激はまた、IMP/MC複合体製剤で処置した宿主において測定されることがあり、限定しないが、以下のことを含む当業界で公知の任意な方法によって決定され得る:(1)抗原の曝露の前及び後で測定したIL−4のレベルの低下;又は抗原で初回刺激したコントロール、又は初回刺激し、そして曝露したコントロール、ISSなしで処置したコントロールと比較した場合に、IMP/MC複合体で処理した宿主においてさらに低い(又は存在さえしない)レベルのIL−4又はIL−5の検出;(2)抗原の曝露の前及び後のIL−12、IL−18、及び/又はIFN(α、β、もしくはγ)のレベルの上昇;又は抗原で初回刺激したコントロール、又は初回刺激し、そして曝露したコントロール、ISSなしで処置したコントロールと比較して、IMP/MC複合体で処置した宿主におけるさらに高いレベルのIL−12、IL−18、及び/又はIFN(α、β、もしくはγ)の検出;(3)ISSなしで処置したコントロールと比較して、ISS−抗原処置宿主におけるIgG2a抗体産生;ならびに/あるいは(4)抗原の曝露の前及び後で測定した場合の抗原特異的IgEのレベルの低下;又は抗原で初回刺激したコントロール、又は初回刺激し、そして曝露したコントロール、ISSなしで処置したコントロールと比較して、IMP/MC複合体で処置した宿主においてより低い(又は存在さえしない)レベルの抗原特異的IgEの検出。これらの種々の決定は、APC及び/又はリンパ球、好ましくはマクロファージ及び/又はT細胞によって生成されるサイトカインを、in vitro又はex vivoで、本明細書中に記載される方法又は当業界で公知の任意の方法を用いて測定することによって行なわれ得る。これらの決定のうちのいくつかは、本明細書に記載の方法又は当業界で公知の任意な方法を用いて、抗原特異的抗体のクラス及び/又はサブクラスを測定することによって行われ得る。
【0160】
IMP/MC複合体処理に応答して産生される抗原特異的抗体のクラス及び/又はサブクラスは、細胞による、Th1型又はTh2型に偏った免疫応答を示す。本明細書中で使用する場合、用語「Th1型に偏った」抗体産生は、刺激の無いなかでのこのようなサイトカインの産生と比較した場合の、刺激因子の存在下でのTh1型免疫応答に関連する抗体(すなわち、Th1関連抗体)の測定可能な増加した産生を言及する。1又は複数のTh1関連抗体は、限定しないが、ヒトIgG1及び/又はIgG3(例えば、Widhe et al. (1998) Scand. J. Immunol. 47:575−581及びde Martino et al. (1999) Ann. Allergy Asthma Immunol 83:160−164を参照のこと)並びにマウスIgG2aを含む。対照的に、「Th2型に偏った抗体」は、Th2型免疫応答に関連するものを言及し、そして、限定しないが、ヒトIgG2、IgG4及び/又はIgE(例えば、Widhe et al. (1998) Scand. J. Immunol. 47:575−581及びde Martino et al. (1999) Ann. Allergy Asthma Imunol 83:160−164を参照のこと)並びにマウスIgG1及び/又はIgEを含む。
【0161】
IMP/MC複合体の投与の結果として生じる、Th1型に偏ったサイトカイン誘導は、細胞性免疫応答の増強、例えば、NK細胞、細胞傷害性キラー細胞、Th1ヘルパー及び記憶細胞により行なわれるもの、を発生させる。これらの応答は、ウイルス、真菌、原生動物、寄生体、細菌、アレルギー性疾患、及び喘息、ならびに腫瘍に対する防御的又は治療的ワクチン接種における使用に特に有益である。
【0162】
いくつかの態様において、Th2応答は抑制される。Th2応答の抑制は、例えば、Th2関連サイトカイン、例えばIL−4及びIL−5のレベルの低下、並びにIgEの減少及びアレルゲンに対するヒスタミン放出の減少、によって決定されうる。
【0163】
本発明のキット
本発明は、本発明の使用のためのキットを提供する。ある態様において、本発明のキットは、IMP/MC複合体を含んで成る1又は複数の容器及び、意図される処置(例えば、免疫調節、感染病の1又は複数の症候の緩和、IFN−γレベルの増大、IFN−αレベルの増大、又はIgE関連疾患の緩和)のための使用に関する、一般的に書面の説明書である説明書集を含んで成る1又は複数の容器を含んで成る。更なる態様において、本発明のキットは、IMP/MCを産生するための材料の容器、IMP/MC複合体を産生するための説明書、及び意図される処置のためのIMP/MC複合体の使用に関する説明書、を含んで成る。
【0164】
あらかじめ形成したIMP/MC複合体を含んで成るキットは、任意な常用の、適当な包装で包装されたIMP/MC複合体を含んで成る。例えば、IMP/MC複合体が乾燥製剤(例えば、凍結乾燥したもの又は乾燥粉末)である場合、弾力性のある栓を有するバイアルが通常使用され、その結果IMP/MC複合体は、弾力性のある栓を介して液体を注入することによって容易に懸濁されうる。弾力性のない、除去可能な封を有するアンプル(例えば、密封されたガラス)又は弾力性のある栓を有するアンプルは、IMP/MC複合体の液体製剤にとって最も都合よく使用される。更に考えられるものとして、特異的な装置、例えば吸入器、経鼻投与装置(例えば、噴霧器)、注入装置、例えばミニポンプとの併用のための包装がある。
【0165】
IMP/MC複合体の産生のための材料を含んで成るキットは、IMPとMCの別々の容器を通常含むが、ある態様においては、あらかじめ形成したMCよりもむしろ、MCを産生するための材料が供給される。この構成が好ましいのは、IMP/MC複合体が非共有結合によって連結される場合である。この構成がまた好ましいのは、IMP及びMCが異種二官能性架橋剤を介して架橋されうる場合であり;IMP又はMCのいずれかが、「活性」型で供給される(例えば、IMPと反応性のある部分が利用可能となるように、異種二官能性架橋剤と連結される)。
【0166】
液相のMCを含んで成るIMP/MC複合体のためのキットは、好ましくは、液相のMCを産生するための材料を含む、1又は複数の容器を含んで成る。例えば、水中油乳濁液のMCのためのIMP/MCキットは、油層及び水層を含む1又は複数の容器を含んで成ることがある。当該容器の中身は、MCを産生するために乳化され、これは、続いてIMP、好ましくは疎水性部分を組み込むように修飾されたIMPと混合されうる。その様な材料は、水中油乳濁液の産生のために、油及び水、又は透析されたリポソーム成分(例えば、リン脂質、コレステロール及び界面活性剤の混合物)の容器+水層(例えば、医薬として許容される水性緩衝液)の1又は複数の容器を含む。
【0167】
意図される処置のためのIMP/MC複合体の使用に関する説明書は、通常、意図される処置のための用量、投与計画、及び投与経路についての情報を含む。ISSの容器は、単位用量、バルクの包装(例えば、複数の用量の包装)又はサブユニットの用量であってもよい、本発明のキットにおいて提供される説明書は、ラベル又は添付文書(例えば、キットに含まれる用紙)上に典型的に記載された説明書であるが、機械が読み取り可能な説明書(例えば、磁気的又は光学的なストレージディスクも許容される。
【0168】
以下の例は、限定しないが、本発明を例示するために提供される。
【0169】
例
例1:非共有結合性の、液相 IMP/MC 複合体の製造
修飾したIMP及び液相MCを含んで成るIMP/MC複合体を製造し、そして複合体の形成について試験した。
【0170】
IMP(ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド 5’−TGACTGTGAACGTTCGAGATGA−3’)(配列番号1)は、ホスホラミダイト化学を用いて、IMPの5’末端に対するコレステロール分子の挿入によって修飾した。水中油乳濁液は、マイクロフルイダイザーを用いた、4.5%(w/v)スクアレン、0.5%(w/v)トリオレイン酸ソルビタン、0.5%(w/v)TWEEN(商標)80及び10mMクエン酸ナトリウム、pH6.5の混合物のホモジェナイゼーションによって生成した。乳濁液の試験は、乳濁液中の油滴が約160nmの平均直径を有していたことを明らかにした。
【0171】
乳濁液は、コレステロール修飾型IMP又は同一のIMPの非修飾型と混合され、続いて油層と水層を分離するために遠心された。RP−HPLCは、ヌクレオチド含量を決定するために、各層に由来する試料について行った。約75%のコレステロール修飾型IMPが油層において見られ、一方、100%の非修飾型IMPが水層において見られた。
【0172】
例2: IMP/MC 混合物による免疫調節
IMP(ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド 5’−TGACTGTGAACGTTCGAGATGA−3’)(配列番号1)又はコントロールオリゴヌクレオチド(ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド 5’−TGACTGTGAAGGTTAGAGATGA−3’)(配列番号9)の混合物は、硫酸誘導型ポリカーボネート微粒子又はナノ粒子(Polysciences, Inc.)と混合され、そしてマウスの脾臓細胞上で、免疫調節活性についてアッセイされた。
【0173】
BALB/cマウスの脾臓のフラグメントは、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で溶解したコラゲナーゼ/ディスパーゼ(0.1U/mL/0.8U/mL)で、37℃で45分間消化し、続いて、消化したフラグメントに力をかけて金属ふるいを通過させることによって機械的に分散された。分散した脾臓細胞は遠心によってペレット化され、続いて新鮮な培地(10%ウシ胎児血清と、50ユニット/mLのペニシリン、50μg/mLのストレプトマイシン、2mMのグルタミン、及び0.05mMβ−メルカプトエタノールを含むRPMI 1640)中で再懸濁された。
【0174】
4x105のマウスの脾臓細胞を96穴プレートの穴に分散させ、そして37℃で1時間インキュベートした。100μLの2x濃度の試験試料又はコントロールを添加し、そして当該細胞を更に24時間インキュベートした。培地を各穴から採集し、そしてELISAによってサイトカイン濃度について試験した。
【0175】
IFN−γが、サンドイッチELISAを用いてアッセイされた。マウスの脾臓細胞アッセイに由来する培地は、抗IFN−γモノクローナル抗体(Nunc)でコーティングしたマイクロタイタープレート中でインキュベートされた。結合したIFN−γは、ビオチン化した抗IFN−γ抗体及びストレプトアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ複合型二次抗体を用いて検出され、ペルオキシダーゼの存在下、色素原性のペルオキシダーゼ基質3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)で展開され、そしてEmax precision microplate reader(Molecular Devices)を用いて、450nmの吸光度を測定することによって定量された。
【0176】
IMPと混合した200nmのビーズは、マウスの脾臓細胞によるIL−12、IL−6及びIFN−γの分泌を実質的に増大させ、そしてIMPと混合した50nmのビーズは、IL−12及びIL−6の産生を増大させた。いくつかの非特異的活性を、コントロールオリゴヌクレオチドと混合した200nmのビーズは伴っていたが、これはIMP単独と比較した場合、刺激における増大を説明するのに不十分であった。更に、1μm及び4.5μmのマイクロキャリアも、サイトカインの産生を増大させた。表2〜4は、それぞれIL−12、IL−6及びIFN−γについてのアッセイの結果を要約する。
【表15】
【表16】
【表17】
【0177】
例3: IMP/NC 接合体によるマウス細胞の免疫調節
ポリスチレンビーズ(200nmの設計サイズ)と共有結合したIMPは、マウスの脾臓細胞上で、免疫調節活性について試験された。
【0178】
アミン誘導型ポリスチレンビーズは、Molecular Probes, Inc.,及びPolysciences, Inc.から入手した。3つのタイプのビーズを利用した:アミン誘導型ビーズ(Polysciences, Inc.,カタログ番号15699)、580nm及び605nmの励起/発光極大を有するフルオロフォアと結合したアミン誘導型ビーズ(”Red Beads”, Molecular Probes, Inc.,カタログ番号F8763)、及び505nm及び515nmの励起/発光極大を有するフルオロフォアと結合したアミン誘導型ビーズ(”Yellow Beads”, Molecular Probes, Inc.,カタログ番号F8764)は、取り扱い説明書に従い、スルホ−SMCC(スルホスクシンイミジル−4−(N−マレイミドメチル)シクロペンタン−1−カルボキシレート、Pierce Chemical Co.)を用いて活性化された。ビーズは、続いて、IMP、コントロールホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド 5’−TGACTGTGAAGGTTAGAGATGA−3’)(コントロールA)(配列番号9)、5’−TGACTGTGAACCTTAGAGATGA−3’(コントロールB)(配列番号10)、又は5’−TCACTCTCTTCCTTACTCTTCT−3’(コントロールC)(配列番号11)と結合され、又はNCのみのコントロールとしての使用のための、遊離マレイミド基をクエンチングするために処理した。
【0179】
IMP/NC複合体の免疫調節効果は、上文の例2に記載のように、マウスの脾臓細胞を用いてアッセイされた。IMP/NC複合体は、IL−12、IL−6及び/又はIFN−γの分泌の増大によって示されるように、マウスの脾臓細胞上で免疫調節を示したが、NCと接合したコントロールオリゴヌクレオチドは、サイトカインの分泌を刺激しなかった。IFN−γの分泌についてのデータは、表5に要約する。
【表18】
【0180】
例4: IMP/NC 接合体によるヒト細胞の免疫調節
ポリスチレンビーズ(200nmの設計サイズ)と共有結合したIMPは、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)上で、免疫調節活性について試験された。
【0181】
末梢血は、ヘパリン化シリンジを用いる静脈穿刺によって、ボランティアから回収した。血液は、FICOLL(商標)(Amersham Pharmacia Biotech)のクッション上で層状にし、そして遠心した。FICOLL(商標)の界面に位置するPBMCを回収し、続いて冷却したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を用いて2回洗浄した。細胞を再懸濁し、そして10%熱不活性化ヒトAB血清と50ユニット/mLのペニシリン、50μg/mLのストレプトマイシン、300μg/mLのグルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム、及び1xMEM非必須アミノ酸(NEAA)を含むRPMI 1640中で2x106細胞/mLで、24穴又は48穴プレート中で培養された。
【0182】
細胞は、試験試料(IMP/NC製剤又はコントロール)の存在下で24時間培養され、続いて細胞を含まない培地が各穴から回収され、そしてIFN−γ濃度についてアッセイされた。IFN−γは、BioSource International, Inc.のCYTOSCREEN(商標)ELISAキットを、取り扱い説明書に従い使用してアッセイした。
【0183】
IMP/NC複合体は、ヒトPBMCによるIFN−γの分泌を刺激した。結果を表6に要約する。
【表19】
【0184】
外国特許は、明瞭さ及び理解のための例示及び実施例によって多少詳細に記載されているが、当業者には、若干の変化及び修飾が実施されうることは自明である。従って、説明及び実施例は、特許請求の範囲によって表される本発明の範囲を限定するものとしてみなされるべきではない。
Claims (66)
- 非生物分解性マイクロキャリア(MC)と結合した免疫刺激配列(ISS)を含んで成るポリヌクレオチドを含んで成る、免疫調節ポリヌクレオチド/マイクロキャリア(IMP/MC)複合体であって、ISSが配列5’−C,G−3’を含んで成り、但し、MCが金、ラテックス又は磁気性のものである場合、結合はビオチン/アビジン以外のものである、複合体。
- 前記ポリヌクレオチドが前記マイクロキャリアと共有結合している、請求項1に記載のIMP/MC複合体。
- 前記ポリヌクレオチドが前記マイクロキャリアと非共有結合している、請求項1に記載のIMP/MC複合体。
- 前記マイクロキャリアが液相のマイクロキャリアである、請求項1に記載のIMP/MC複合体。
- 前記マイクロキャリアが固相のマイクロキャリアである、請求項1に記載のIMP/MC複合体。
- 前記マイクロキャリアが10nm〜10μmのサイズである、請求項1に記載のIMP/MC複合体。
- 前記マイクロキャリアが25nm〜5μmのサイズである、請求項1に記載のIMP/MC複合体。
- 抗原を含まない、請求項1に記載のIMP/MC複合体。
- ISSが配列5’−T,C,G−3’を含んで成る、請求項1に記載のIMP/MC複合体。
- ISSが配列5’−プリン、プリン、C、G、ピリミジン、ピリミジン、C、G−3’を含んで成る、請求項1に記載のIMP/MC複合体。
- ISSが配列番号1を含んで成る、請求項1に記載のIMP/MC複合体。
- 個体の免疫応答を調節する方法であって、前記個体の免疫応答を調節するのに十分な量の、免疫調節ポリヌクレオチド/マイクロキャリア(IMP/MC)複合体を個体に投与することを含んで成り、前記MCが非生物分解性MCであり、そしてISSが配列5’−C,G−3’を含んで成る、方法。
- 前記マイクロキャリアが固相のマイクロキャリアである、請求項12に記載の方法。
- 前記マイクロキャリアが液相のマイクロキャリアである、請求項12に記載の方法。
- IMP/MC複合体が共有結合している、請求項12に記載の方法。
- IMP/MC複合体が非共有結合している、請求項12に記載の方法。
- 前記マイクロキャリアが約10μm未満のサイズである、請求項12に記載の方法。
- 前記複合体が抗原を含まない、請求項12に記載の方法。
- Th1型免疫応答が刺激される、請求項12に記載の方法。
- Th2型免疫応答が抑制される、請求項12に記載の方法。
- ISSが配列5’−T,C,G−3’を含んで成る、請求項12に記載の方法。
- ISSが配列5’−プリン、プリン、C、G、ピリミジン、ピリミジン、C、G−3’を含んで成る、請求項12に記載の方法。
- ISSが配列番号1を含んで成る、請求項12に記載の方法。
- 個体のインターフェロン−ガンマ(IFN−γ)を増大する方法であって、有効量の免疫調節ポリヌクレオチド/マイクロキャリア(IMP/MC)複合体を前記個体に投与することを含んで成り、前記MCが非生物分解性MCであり、ISSが配列5’−C,G−3’を含んで成り、そして有効量が、前記個体のIFN−γを増大せしめるのに十分な量である、方法。
- 前記個体が特発性肺線維症を有する、請求項24に記載の方法。
- 前記マイクロキャリアが固相のマイクロキャリアである、請求項24に記載の方法。
- 前記マイクロキャリアが液相のマイクロキャリアである、請求項24に記載の方法。
- IMP/MC複合体が共有結合している、請求項24に記載の方法。
- IMP/MC複合体が非共有結合している、請求項24に記載の方法。
- 前記マイクロキャリアが約10μm未満のサイズである、請求項24に記載の方法。
- 前記複合体が抗原を含まない、請求項24に記載の方法。
- ISSが配列5’−T,C,G−3’を含んで成る、請求項24に記載の方法。
- ISSが配列5’−プリン、プリン、C、G、ピリミジン、ピリミジン、C、G−3’を含んで成る、請求項24に記載の方法。
- ISSが配列番号1を含んで成る、請求項24に記載の方法。
- 個体のインターフェロン−アルファ(IFN−α)を増大する方法であって、有効量の免疫調節ポリヌクレオチド/マイクロキャリア(IMP/MC)複合体を前記個体に投与することを含んで成り、前記MCが非生物分解性MCであり、ISSが配列5’−C,G−3’を含んで成り、そして有効量が、前記個体のIFN−αを増大せしめるのに十分な量である、方法。
- 前記個体がウイルス感染している、請求項35に記載の方法。
- 前記マイクロキャリアが固相のマイクロキャリアである、請求項35に記載の方法。
- 前記マイクロキャリアが液相のマイクロキャリアである、請求項35に記載の方法。
- IMP/MC複合体が共有結合している、請求項35に記載の方法。
- IMP/MC複合体が非共有結合している、請求項35に記載の方法。
- 前記マイクロキャリアが約10μm未満のサイズである、請求項35に記載の方法。
- 前記複合体が抗原を含まない、請求項35に記載の方法。
- ISSが配列5’−T,C,G−3’を含んで成る、請求項35に記載の方法。
- ISSが配列5’−プリン、プリン、C、G、ピリミジン、ピリミジン、C、G−3’を含んで成る、請求項35に記載の方法。
- ISSが配列番号1を含んで成る、請求項35に記載の方法。
- 個体のIgEのレベルを低下させる方法であって、有効量の免疫調節ポリヌクレオチド/マイクロキャリア(IMP/MC)複合体を個体に投与することを含んで成り、前記MCが非生物分解性MCであり、ISSが配列5’−C,G−3’を含んで成り、そして有効量が、前記個体のIgEレベルを低下せしめるのに十分な量である、方法。
- 前記マイクロキャリアが固相のマイクロキャリアである、請求項46に記載の方法。
- 前記マイクロキャリアが液相のマイクロキャリアである、請求項46に記載の方法。
- IMP/MC複合体が共有結合している、請求項46に記載の方法。
- IMP/MC複合体が非共有結合している、請求項46に記載の方法。
- 前記マイクロキャリアが約10μm未満のサイズである、請求項46に記載の方法。
- 前記複合体が抗原を含まない、請求項46に記載の方法。
- ISSが配列5’−T,C,G−3’を含んで成る、請求項46に記載の方法。
- ISSが配列5’−プリン、プリン、C、G、ピリミジン、ピリミジン、C、G−3’を含んで成る、請求項46に記載の方法。
- ISSが配列番号1を含んで成る、請求項46に記載の方法。
- 免疫調節ポリヌクレオチド/マイクロキャリア(IMP/MC)複合体を含んで成る容器を含んで成るキットであって、ここで、前記MCは非生物分解性MCであり、ISSは配列5’−C,G−3’を含んで成る;そして、個体の免疫調節におけるIMP/MC複合体の使用のための説明書を含んで成るキット。
- 前記ポリヌクレオチドが前記マイクロキャリアと共有結合している、請求項56に記載のキット。
- 前記ポリヌクレオチドが前記マイクロキャリアと非共有結合している、請求項56に記載のキット。
- 前記マイクロキャリアが液相のマイクロキャリアである、請求項56に記載のキット。
- 前記マイクロキャリアが固相のマイクロキャリアである、請求項56に記載のキット。
- 前記マイクロキャリアが10nm〜10μmのサイズである、請求項56に記載のキット。
- 前記マイクロキャリアが25nm〜5μmのサイズである、請求項56に記載のキット。
- 前記複合体が抗原を含まない、請求項56に記載のキット。
- ISSが配列5’−T,C,G−3’を含んで成る、請求項56に記載のキット。
- ISSが配列5’−プリン、プリン、C、G、ピリミジン、ピリミジン、C、G−3’を含んで成る、請求項56に記載のキット。
- ISSが配列番号1を含んで成る、請求項56に記載のキット。
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